BR112013021432B1 - processo de tratamento de um óleo vegetal e uso de uma enzima - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE TRATAMENTO DE UM ÓLEO VEGETAL E USO DE UMA ENZIMA. Em um aspecto, é fornecido um processo de tratamento de um óleo vegetal, compreendendo uma etapa de contato do óleo com uma enzima, em que a enzima é capaz de hidrolisar um estereoisômero a? ou b? de clorofila ou um derivado de clorofila.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está relacionada com o processamento industrial de produtos alimentares e produtos para a alimentação animal derivados de vegetais, especialmente óleos vegetais. A invenção pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a contaminação pela clorofila e derivados de clorofila.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A clorofila é um pigmento de cor verde amplamente encontrado em todo o reino vegetal. A clorofila é essencial para a fotossíntese e é um dos compostos de metal orgânico mais abundante encontrado na Terra. Assim, muitos produtos derivados de plantas, incluindo alimentos e rações, contêm quantidades significativas de clorofila.

[003] Por exemplo, os óleos vegetais derivados de sementes oleaginosas, tais como semente de soja, palma ou colza (canola), semente de algodão e amendoim, normalmente contêm alguma clorofila. No entanto, a presença de níveis elevados de pigmentos de clorofila nos óleos vegetais é geralmente indesejável. Isto é porque a clorofila dá uma cor verde indesejável e pode induzir a oxidação do óleo durante o armazenamento, conduzindo a uma deterioração do óleo.

[004] Diversos métodos têm sido utilizados com o intuito de remover a clorofila dos óleos vegetais. A clorofila pode ser removida durante diversas etapas do processo de produção do óleo de sementes, incluindo a trituração, extração do óleo, degomagem, tratamento cáustico e etapas de branqueamento. No entanto, a etapa de branqueamento é geralmente a mais significativa para reduzir os resíduos de clorofila até um nível aceitável. Durante o branqueamento, o óleo é aquecido e passado através de um adsorvente para remover a clorofila e outros compostos portadores de cor que impactam na aparência e/ou estabilidade do óleo acabado. O adsorvente usado na etapa de branqueamento é geralmente argila.

[005] Na indústria de processamento de óleo comestível, a utilização de tais etapas geralmente reduz os níveis de clorofila no óleo processado para entre 0,02 a 0,05 ppm. No entanto, a etapa de branqueamento aumenta o custo de processamento e reduz o rendimento de óleo devido à incorporação na argila branqueadora. O uso da argila pode remover diversos compostos desejáveis do óleo, tais como os carotenoides e tocoferol. Além disso, a utilização de argila é cara, o que é particularmente devido ao tratamento da argila utilizada (ou seja, dos resíduos), o que pode ser difícil e perigoso (propensa à autoignição) e, portanto, dispendioso de manusear. Assim, tentativas têm sido feitas para remover a clorofila do óleo por outros meios, por exemplo, usando a enzima clorofilase.

[006] Nas plantas, acredita-se que a clorofilase (clase) está envolvida na degradação de clorofila e catalisa a hidrólise de uma ligação éster na clorofila para originar clorofilida e fitol. O documento WO 2006009676 descreve um processo industrial em que a contaminação de clorofila pode ser reduzida em uma composição, tal como um óleo vegetal, pelo tratamento com clorofilases. O clorofilida solúvel em água que é produzida neste processo, também é de cor verde, mas pode ser removida por uma extração aquosa ou tratamento com sílica.

[007] A clorofila é frequentemente degradada parcialmente nas sementes utilizadas para a produção de óleo, bem como durante a extração do óleo a partir das sementes. Uma modificação comum é a perda do íon de magnésio a partir do anel de porfirina (clorina), para formar o derivado conhecido como feofitina (vide a Figura 1). A perda do íon magnésio altamente polar a partir do anel porfirina resulta em propriedades físico-químicas significativamente diferentes da feofitina em comparação com a clorofila. A feofitina é tipicamente mais abundante no óleo durante o processamento do que a clorofila. A feofitina tem uma cor esverdeada e pode ser removida do óleo por um processo análogo ao utilizado para a clorofila, por exemplo, conforme descrito no documento WO 2006009676 por uma reação de esterase catalisada por uma enzima possuindo uma atividade de feofitinase. Sob determinadas condições, algumas clorofilases são capazes de hidrolisar a feofitina, bem como a clorofila, e por isso são adequadas para a remoção de ambos contaminantes. Os produtos da hidrólise de feofitina são; feoforbídeo e o fitol de coloração vermelho/marrom. O feoforbídeo também pode ser produzido pela perda de um íon de magnésio a partir da clorofilida, ou seja, após a hidrólise da clorofila (vide a Figura 1). O WO 2006009676 ensina a remoção de feoforbídeo por um método análogo ao da clorofilida, por exemplo, pela extração aquosa ou adsorção em sílica.

[008] A feofitina pode ser adicionalmente degradada em pirofeofitina, tanto pela atividade de enzimas vegetais durante a colheita e armazenamento das sementes oleaginosas quanto pelas condições de processamento (por exemplo, calor) durante a refinação do óleo (vide “Behaviour of Chlorophyll Derivatives in Canola Oil Processing”, JAOCS, Vol, n°9 (setembro 1993), páginas 837-841). Um mecanismo possível é a hidrólise enzimática da ligação de éster metílico do anel isocíclico da feofitina seguido pela conversão não enzimática do intermediário instável em pirofeofitina. Uma enzima de 28-29 kDa a partir do Chenopodium album denominada de feoforbidase é supostamente capaz de catalisar uma reação análoga sobre o feoforbídeo, para produzir o derivado livre de fitol em pirofeofitina conhecida como pirofeoforbídeo (vide a Figura 1). O pirofeoforbídeo é menos polar do que o feoforbídeo resultando no pirofeoforbídeo com uma solubilidade diminuída em água e aumento da solubilidade em óleo em comparação com o feforbídeo.

[009] Dependendo das condições de processamento, a pirofeofitina pode ser mais abundante do que a feofitina e clorofila nos óleos vegetais durante o processamento (vide a Tabela 9 no volume 2,2 de Bailey’s Industrial Oil and Fat Products (2005), 6a edição, ed. por Fereidoon Shahidi, John Wiley & Sons). Isto é em parte devido à perda de magnésio a partir da clorofila durante a colheita e armazenamento do material vegetal. Se for utilizado um tratamento térmico (calor) prolongado a 90 °C ou mais, a quantidade de pirofeofitina no óleo tenderá a aumentar e pode ser superior a quantidade de feofitina. Os níveis de clorofila também são reduzidos pelo aquecimento das sementes oleaginosas antes da prensagem e extração, assim como a degomagem do óleo e tratamento alcalino durante o processo de refinação. Também tem sido observado que os fosfolipídeos no óleo podem complexar com o magnésio e reduzir assim a quantidade de clorofila. Assim, a clorofila é um contaminante relativamente menor em comparação com a pirofeofitina (e feofitina) em muitos óleos vegetais.

[010] Cada um dos quatro derivados de clorofila, clorofila a, b e feofitina a e b, existe como um par de epímeros determinados pela estereoquímica do H e COOCH3 em torno do número de carbonos 132 (numeração de acordo com o sistema IUPAC, marcado com asterisco na Figura 2). Assim, a clorofila a existe como o par de epímeros de clorofila a e clorofila a' e a clorofila b compreende as formas b e b'. Da mesma forma, a feofitina a compreende o par de epímero a e a' e a feofitina b compreende as formas b e b'. As formas principais (ou formas “prime” (')) possuem estereoquímica S e as formas minoritárias (ou formas “não prime”) possuem estereoquímica R sobre o átomo de carbono 132. A epimerização, por exemplo, da forma a em uma a’ e vice-versa, pode ocorrer sob determinadas condições por meio de um enol comum, tal como descrito em “Epimerization in the pheophytin a/a’ system”, Chemistry Letters (1984), 1411 - 1414. Em solução existe tipicamente um equilíbrio que determina a distribuição dos compostos prime e não prime da clorofila e isto é muitas vezes determinado por parâmetros físicos, tais como temperatura, pH, solvente e assim por diante.

[011] De um modo geral as enzimas normalmente atuam como catalisadores estereoespecíficos por possuírem atividade em apenas um estereoisômero. Análises anteriores sugeriram que as clorofilases possuem um elevado grau de estereoespecificidade catalisando apenas a hidrólise de formas não prime de compostos clorofila (vide “The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase" J. Biol. Chem. 267 (31) :22043-22047 (1992)).

[012] Nos métodos para a remoção de clorofila e derivados de clorofila a partir de óleos vegetais que empregam clorofilases ou enzimas relacionadas, a estereoespecificidade da enzima pode ser problemática. Em particular, dependendo da distribuição e equilíbrio dos estereoisômeros de clorofila no óleo, uma degradação completa dos componentes de clorofila pode ser muito difícil. Por exemplo, se uma proporção significativa da clorofila ou de um derivado de clorofila existe na forma prime, esta fração de derivados de clorofila presente no óleo pode ser resistente à degradação enzimática. Além disso, um grande número de enzimas apresenta atividade muito mais baixa sobre a pirofeofitina do que, por exemplo, sobre a feofitina.

[013] Este problema com os métodos existentes é ilustrado na Figura 3. A Figura 3 exibe a epimerização de feofitina a e a conversão de pirofeofitina. O pH de uma mistura de água/óleo vegetal bruto (compreendendo, por exemplo, cerca de 1-2% de água) é tipicamente por volta de 5,0 a cerca de 60 °C. Sob tais condições, a feofitina no óleo de soja bruto ou óleo de sementes de colza tem uma distribuição de epímero que é tipicamente de cerca de 70% de feofitina a (estereoisômero R) e 30% de feofitina a’ (estereoisômero S) e a isomerização entre os dois epímeros é lenta. Além disso, quantidades variáveis de pirofeofitina podem ser formadas dependendo das condições de reação. Se a enzima utilizada na reação é predominantemente ativa apenas sobre a feofitina a, uma proporção significativa de derivados de clorofila presente no óleo não pode ser diretamente hidrolisada pela enzima no pH não modificado.

[014] Há, portanto, a necessidade de um processo melhorado para a remoção de clorofila e derivados de clorofila, tais como pirofeofitina e feofitina a partir de óleos vegetais. Em particular, existe a necessidade de um processo que melhore a remoção das várias formas de clorofila e derivados de clorofila a partir do óleo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[015] Em um aspecto, a presente invenção fornece um processo de tratamento de um óleo vegetal, compreendendo uma etapa de contato do óleo com uma enzima, em que a enzima é capaz de hidrolisar um estereoisômero a’ ou b’ de clorofila ou um derivado de clorofila.

[016] Em um exemplo de realização, o estereoisômero a’ ou b’ compreende clorofila a’, feofitina a', clorofila b' ou feofitina b'. Preferencialmente, o estereoisômero é um estereoisômero a’ de clorofila ou um derivado de clorofila, por exemplo, clorofila a' ou feofitina a'.

[017] Em um exemplo de realização, a enzima tem uma razão de atividade sobre um estereoisômero a de clorofila ou um derivado de clorofila, em comparação com um estereoisômero a’ de clorofila ou derivado de clorofila, menor do que 10, menor do que 5, ou menor do que 2. Em um exemplo de realização alternativo, a enzima tem uma razão de atividade sobre um estereoisômero b de clorofila ou um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero b’ de clorofila ou ao derivado de clorofila, menor do que 10, menor do que 5, ou menor do que 2.

[018] Em um exemplo de realização, a pós o tratamento com a enzima o óleo compreende pelo menos 50% de estereoisômeros a de clorofila ou o derivado de clorofila, com base na quantidade total de estereoisômeros a e a' de clorofila ou derivado de clorofila no óleo. Em um exemplo de realização alternativo, a pós o tratamento com a enzima o óleo compreende pelo menos 50% de estereoisômeros b de clorofila ou o derivado de clorofila, com base na quantidade total de estereoisômeros b e b' de clorofila ou derivado de clorofila no óleo.

[019] Em outros exemplos de realização, a enzima tem uma razão de atividade sobre feofitina em relação a pirofeofitina menor do que 10, menor do que 8 ou menor do que 5.

[020] Em exemplos de realização adicionais, a enzima compreende atividade de clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase, ou seja, atividade hidrolítica sobre clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina.

[021] Em outros exemplos de realização, a enzima é derivada de Arabidopsis thaliana ou Ricinus communis. Por exemplo, a enzima pode compreender uma sequência de polipeptídeo, tal como definido na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13, ou um fragmento funcional ou variante da mesma.

[022] Preferencialmente, a enzima compreende uma sequência polipeptídica que possui pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13 ao longo de pelo menos 50 resíduos de aminoácidos. Em um exemplo de realização, a enzima compreende um polipeptídeo possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em outro exemplo de realização, a enzima compreende um polipeptídeo possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13.

[023] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um óleo vegetal obtido por um método de acordo com qualquer reivindicação anterior.

[024] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê o uso de uma enzima que é capaz de hidrolisar a clorofila ou um derivado de clorofila, para a remoção de um estereoisômero a' ou b' de clorofila ou derivado de clorofila a partir de um óleo vegetal.

[025] Conforme descrito na presente invenção, foram identificadas enzimas que exibem surpreendentemente atividade hidrolítica sobre as formas prime, bem como sobre as formas não prime dos derivados de clorofila. Além disso, tais enzimas também pode exibir um aumento da atividade hidrolítica sobre a pirofeofitina em comparação com enzimas utilizadas em métodos conhecidos. Tais enzimas podem ser utilizadas de maneira vantajosa para aumentar a remoção de diversos tipos de derivados de clorofila a partir de óleos vegetais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[026] A Figura 1 exibe as reações envolvendo a clorofila e seus derivados e enzimas utilizadas na presente invenção.

[027] A Figura 2 exibe a feofitina a, onde o C-132 de acordo com o sistema IUPAC de numeração está marcado com um asterisco.

[028] A Figura 3 exibe a epimerização das moléculas de feofitina a e a conversão em pirofeofitina a.

[029] A Figura 4 exibe sequências de aminoácidos e de nucleotídeos que mostram a fusão de um gene clorofilase a um marcador His tag e sítio de trombina.

[030] A Figura 5 exibe uma representação esquemática de um vetor de expressão em E. coli: pET28-TRI_CHL contendo o gene TRI_CHL que codifica uma enzima clorofilase de Triticum aestivum (n° de acesso no banco de dados BT009214).

[031] A Figura 6 exibe sequências de aminoácidos e de nucleotídeos que mostram a fusão de um gene clorofilase a uma sequência sinal AprE e uma sequência AGK.

[032] A Figura 7 exibe uma representação esquemática de um vetor de expressão em B. subtitiles pBN-TRI_CHL contendo o gene TRI_CHL que codifica uma enzima clorofilase de Triticum aestivum (n° de acesso no banco de dados BT009214).

[033] A Figura 8 exibe sequências de aminoácidos e de nucleotídeos que mostram a fusão de um gene clorofilase diretamente a um promotor AprE.

[034] A Figura 9 exibe uma representação esquemática de um vetor de expressão em B. subtitiles pBN-Spe-TRI_CHL contendo o gene TRI_CHL que codifica uma enzima clorofilase de Triticum aestivum (n° de acesso no banco de dados BT009214).

[035] A Figura 10 exibe sequências de aminoácidos e de nucleotídeos que mostram a fusão de um gene clorofilase à sequência sinal Cel A.

[036] A Figura 11 exibe uma representação esquemática de um vetor de expressão em S. lividans: pKB-TRI_CHL contendo o gene TRI_CHL que codifica uma enzima clorofilase de Triticum aestivum (nº de acesso no banco de dados BT009214).

[037] A Figura 12 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1).

[038] A Figura 13 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2).

[039] A Figura 14 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Citrus sinensis (SEQ ID NO: 3).

[040] A Figura 15 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Triticum aestivum (SEQ ID NO: 4).

[041] A Figura 16 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Triticum aestivum (SEQ ID NO: 5).

[042] A Figura 17 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Brassica oleracea (SEQ ID NO: 6).

[043] A Figura 18 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Brassica oleracea (SEQ ID NO: 7).

[044] A Figura19exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Brassica oleracea (SEQ ID NO: 8).

[045] A Figura20exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Zea Mays (SEQ ID NO: 9).

[046] AFigura21exibeasequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Zea Mays (SEQ ID NO: 10).

[047] AFigura22exibeasequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Phyllostachys edulis (SEQ ID NO: 11).

[048] AFigura23exibeasequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Chenopodium album (SEQ ID NO: 12).

[049] A Figura24exibea sequência deaminoácidosdeuma clorofilase de Ricinus communis (SEQ ID NO: 13).

[050] A Figura25exibea sequência deaminoácidosdeuma clorofilase de Glycine max (SEQ ID NO: 14).

[051] A Figura26exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Ginkgo biloba (SEQ ID NO: 15).

[052] A Figura27exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Pachira macrocarpa (SEQ ID NO: 16).

[053] A Figura28exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Populus trichocarpa (SEQ ID NO: 17).

[054] A Figura29exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 18).

[055] A Figura30exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 19).

[056] A Figura31exibea sequênciadeaminoácidosdeuma clorofilase de Vitis vinifera (SEQ ID NO: 20).

[057] A Figura 32 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 21).

[058] A Figura33exibea sequência deaminoácidosde uma clorofilase de uma Aquilegia (SEQ ID NO: 22).

[059] A Figura 34 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Brachypodium distachyon (SEQ ID NO: 23).

[060] A Figura 35 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Medicago truncatula (SEQ ID NO: 24).

[061] A Figura 36 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Piper betle (SEQ ID NO: 25).

[062] A Figura 37 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Lotus japonicus (SEQ ID NO: 26).

[063] A Figura 38 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Oryza sativa (SEQ ID NO: 27).

[064] A Figura 39 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Oryza sativa Japonica (SEQ ID NO: 28).

[065] A Figura 40 exibe a sequência de aminoácidos de uma clorofilase de Oryza sativa Japonica (SEQ ID NO: 29).

[066] A Figura41exibea sequênciade aminoácidosdeuma clorofilase de Picea sitchensis (SEQ ID NO: 30).

[067] A Figura42exibea sequênciade aminoácidosdeuma clorofilase de Chlamydomonas (SEQ ID NO: 31).

[068] A Figura 43 exibe uma árvore filogenética das clorofilases de plantas e a clorofilase de Chlamydomonas (CHL_CHL) descritas na presente invenção.

[069] A Figura 44 exibe uma análise de Western blot de extratos de E. coli contendo clorofilases recombinantes derivadas de diversas espécies. Pista 1: BAM_CHL CoRe 112. Pista 2: CIT_CHL CoRe 113A. Pista 3: ARA_CHL CoRe 114A. Pista 4: CB_CHL CoRe 127. Pista 5: GlyMax_CHL CoRe 133. Pista 6: Sor_CHL CoRe 134. Pista 7: ARA_CHL2 CoRe 135. Pista 8: BRA_CHL1 CoRe 136. Vide as Tabelas 1 e 2 abaixo para as definições de espécies de origem das enzimas correspondentes às abreviaturas acima.

[070] A Figura 45 exibe uma análise de Western blot de extratos de E. coli contendo clorofilases recombinantes derivadas de diversas espécies. Pista 1: SORG_CHL CoRe 137A. Pista 2: TRI_CHL2 CoRe 138A. Pista 3: ZEA_CHL2 CoRe 139. Pista 4: TRI_CHL CoRe 20. Pista 5: BRACH_CHL CoRe 156. Pista 6: PIP_CHL CoRe 158. Pista 7: PICEA_CHL CoRe 163. Pista 8: Vetor de controle. Vide as Tabelas 1 e 2 abaixo para as definições de espécies de origem das enzimas correspondentes às abreviaturas acima.

[071] A Figura 46 exibe a atividade de enzimas recombinantes derivadas de diversas espécies sobre a feofitina a, conforme demonstrado por pelos níveis de feofitina total (feofitina a + a') em ppm remanescentes em diversos tempos após o tratamento com cada uma das enzimas.

[072] A Figura 47 exibe a atividade de enzimas recombinantes derivadas de diversas espécies sobre a feofitina a, conforme demonstrado por pelos níveis de pirofeofitina a em ppm remanescentes em diversos tempos após o tratamento com cada uma das enzimas.

[073] A Figura 48 exibe a porcentagem de estereoisômeros de feofitina em uma amostra de óleo após o tratamento com as enzimas recombinantes derivadas de várias espécies, com base na quantidade total de estereoisômeros de feofitina a e feofitina a' na amostra de óleo após o tratamento.

[074] A Figura 49 exibe um cromatograma de HPLC utilizando a detecção de absorbância (430 nm), indicando os picos numerados associados com: 1= clorofilida b, 2 = clorofilida a; 3 = neoxantina, 3' = isômero da neoxantina, 4 = neocromo; 5 = violaxantina, 6 = luteoxantina ; 7 = auroxantina, 8 = anteraxantina, 8' = isômero da anteraxantina; 9 = mutatoxantina; 10 = luteína, 10' = isômero da luteína, 10'' = isômero da luteína; 11 = feoforbídeo b, 12 = feoforbídeo a; 13 = clorofila b, 13' = clorofila b', 14 = clorofila a, 14' = clorofila a'; 15 = feofitina b, 15' = feofitina b', 16 = β-caroteno, 17 = feofitina a; 17' = feofitina a'; 18 = pirofeofitina b; 19 = pirofeofitina a.

[075] A Figura 50 mostra uma representação esquemática de um processo de refinação de óleo de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.

[076] A Figura 51 exibe o logaritmo da concentração do substrato para feofitina a e a’ após % hora como uma função da dosagem de ARA_CHL2 (clorofilase de Arabidopsis).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[077] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de tratamento de um óleo vegetal. Normalmente, o processo é usado para remover a clorofila e/ou derivados de clorofila a partir do óleo, ou reduzir o nível de derivados de clorofila e/ou clorofila no óleo, por exemplo, onde a clorofila e/ou derivados de clorofila estão presentes como contaminantes.

CLOROFILA E DERIVADOS DE CLOROFILA

[078] Por “derivado de clorofila” defini-se tipicamente compostos que compreendem tanto um anel de porfirina (clorina) e um grupo fitol (cauda), incluindo os derivados contendo fitol livres de magnésio tal como a feofitina e pirofeofitina. A clorofila e derivados de clorofila (contendo fitol) são tipicamente de cor esverdeada, como um resultado do anel de porfirina (clorina) presente na molécula. A perda de magnésio a partir do anel de porfirina significa que feofitina e pirofeofitina são de coloração mais acastanhada do que a clorofila. Assim, a presença de clorofila e derivados de clorofila em um óleo, pode originar um óleo de coloração indesejável verde, esverdeada ou acastanhada. Em um exemplo de realização, o processo da presente invenção pode ser realizado de modo a remover ou reduzir a coloração verde ou castanha presente no óleo. Consequentemente o processo da presente invenção pode ser designado como um processo de branqueamento ou descoloração.

[079] As enzimas utilizadas no processo podem hidrolisar a clorofila e derivados de clorofila contendo fitol para clivar a cauda fitol a partir do anel de clorina. A hidrólise de clorofila e de derivados de clorofila resulta tipicamente em compostos como clorofilida, feoforbídeo e pirofeoforbídeo que são derivados de clorofila livres de fitol. Estes compostos contêm ainda o anel de porfirina que possuem coloração, sendo a clorofilida verde e o feoforbídeo e pirofeoforbídeo de cor marrom avermelhada. Em alguns exemplos de realização, também pode ser desejável remover estes derivados livres de fitol para reduzir a coloração verde/vermelho/castanha no óleo. Deste modo, em um exemplo de realização da invenção, o processo pode compreender ainda uma etapa de remoção ou redução do nível de derivados de clorofila livres de fitol no óleo. O processo pode envolver o branqueamento ou descoloração para remover a cor verde e/ou vermelha e/ou castanha do óleo.

[080] A clorofila ou derivado de clorofila pode ser as formas a ou b. Assim, conforme utilizado no presente, o termo “clorofila” inclui as clorofilas a e b. De modo semelhante, ambas as formas, a e b, são abrangidas quando se faz referência a feofitina, pirofeofitina, clorofilida, feoforbídeo e pirofeoforbídeo.

[081] Conforme descrito na presente invenção, a clorofila e os derivados de clorofila podem existir como um par de epímeros determinados pela estereoquímica em torno do carbono C-132 (numeração de acordo com o sistema IUPAC, marcado com um asterisco na Figura 2). Assim, a clorofila a existe como o par de epímeros de clorofila a e clorofila a' e a clorofila b compreende as formas b e b'. A feofitina a compreende o par de epímeros a e a' e a feofitina b compreende as formas b e b'. As formas prime (') possuem estereoquímica S e as formas não prime possuem estereoquímica R sobre o átomo de carbono 132. Quando utilizado de modo geral, o termo “clorofila e derivados de clorofila” abrange ambas as formas; prime e não prime.

ÓLEOS VEGETAIS

[082] Qualquer óleo vegetal pode ser tratado de acordo com o presente processo a fim de eliminar a contaminação indesejável pela clorofila e/ou derivados de clorofila. O óleo pode ser derivado de qualquer tipo de vegetal, e a partir de qualquer parte de uma planta, incluindo plantas inteiras, folhas, caules, flores, raízes, protoplastos de plantas, sementes e células vegetais e progênies das mesmas. A classe de plantas a partir das quais os produtos podem ser tratados pelo processo da presente invenção inclui a de plantas superiores, incluindo plantas angiospérmicas (monocotiledôneas e dicotiledôneas) bem como gimnospermas. Isto inclui plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo poliploides, diploides, haploides e estados hemizigotos.

[083] Em exemplos de realização preferidos, o óleo pode compreender um óleo vegetal, incluindo óleos processados a partir de sementes ou frutos oleaginosos (por exemplo, óleos de sementes oleaginosas tais como de canola (colza), e óleos de frutas e palma). Exemplos de óleos adequados incluem de farelo de arroz, soja, canola (colza), palma, azeite, semente de algodão, milho, caroço de palma, coco, amendoim, gergelim, girassol ou Moringa. O processo da invenção pode ser utilizado em conjunto com os métodos para o processamento de óleos essenciais, por exemplo, aqueles a partir de óleos de sementes de fruta, por exemplo, de uva, damasco, borragem, etc. O processo da invenção pode ser utilizado em conjunto com os métodos para o processamento de óleos com alto teor de fósforo (por exemplo, óleo de soja). Preferencialmente o óleo é um óleo vegetal bruto. CLOROFILA E DERIVADOS DE CLOROFILA EM ÓLEO

[084] A clorofila e/ou derivados de clorofila (por exemplo, clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina) pode estar naturalmente presente no óleo, como um contaminante, ou como um componente indesejável em produto processado. A clorofila e/ou derivados de clorofila (por exemplo, clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina) podem estar presentes em qualquer nível no óleo. Tipicamente, a clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina pode(m) estar presente(s) como um contaminante natural no óleo em uma concentração compreendida entre 0,001 e 1000 mg/kg (0,001-1000 ppm, de 10-7 a 10-1 % em peso), baseado no peso total do óleo. Em outros exemplos de realização, a clorofila e/ou derivados de clorofila pode(m) estar presente(s) no óleo em uma concentração de 0,1 a 100; de 0,5 a 50; de 1 a 50; de 1 a 30 ou de 1 a 10 mg/kg, com base no peso total do óleo.

[085] Derivados de clorofila livres de fitol podem também estar presentes no óleo. Por exemplo, a clorofilida, pirofeoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo podem estar presentes em qualquer nível no óleo. Normalmente a clorofilida, pirofeoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo podem estar presentes no óleo, antes ou depois do tratamento com uma enzima de acordo com o método da presente invenção, a em uma concentração compreendida entre 0,001 e 1000 mg/kg (0,001-1000 ppm, 10-7 a 10-1 % em peso), com base no peso total do óleo. Em outros exemplos de realização, o clorofilida, pirofeoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo pode(m) estar presente(s) na composição em uma concentração de 0,1 a 100, de 0,5 a 50, de 1 a 50, de 1 a 30 ou de 1 a 10 mg/kg com base no peso total da composição. ENZIMAS HIDROLISANTES DE CLOROFILA OU DE DERIVADOS DE CLOROFILA

[086] O processo da presente invenção compreende uma etapa de colocar o óleo em contato com uma enzima que é capaz de hidrolisar a clorofila ou um derivado de clorofila, particularmente estereoisômeros prime (por exemplo, a' ou b') dos mesmos. Normalmente “hidrolisar a clorofila ou um derivado de clorofila” significa a hidrólise de uma ligação éster na clorofila ou derivado de clorofila (contendo fitol), por exemplo, clivar um grupo fitol a partir do anel de clorina na clorofila ou derivado de clorofila. Assim, a enzima, normalmente, possui uma atividade de esterase ouhidrolase. Preferencialmente, a enzima possui atividade de esterase ou hidrolase em uma fase de óleo, e, opcionalmente, também em uma fase aquosa.

[087] Assim, a enzima pode, por exemplo, ser uma clorofilase, feofitinase ou pirofeofitinase. Preferencialmente, a enzima é capaz de hidrolisar, pelo menos, uma, pelo menos duas ou todas as três dentre clorofila, feofitina e pirofeofitina. Em um exemplo de realização particularmente preferido, a enzima tem atividade de clorofilase, feofitinase e pirofeofitinase. Em exemplos de realização adicionais, duas ou mais enzimas podem ser utilizadas no método, em que cada enzima tem uma especificidade de substrato diferente. Por exemplo, o método pode compreender a utilização combinada de duas ou três enzimas selecionadas a partir de uma clorofilase, uma feofitinase e uma pirofeofitinase.

[088] Qualquer polipeptídeo que possui uma atividade que pode hidrolisar a clorofila ou um derivado de clorofila, em especial estereoisômeros prime dos mesmos, pode ser usado como enzima no processo da invenção. Por “enzima” pretende-se abranger qualquer polipeptídeo que possua atividade hidrolítica sobre estereoisômeros prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila ou derivado de clorofila, incluindo, por exemplo, fragmentos da enzima, e etc. Qualquer polipeptídeo isolado, recombinante ou sintético ou quimérico (ou uma combinação de sintético e recombinante) pode ser utilizado.

[089] Em exemplos de realização da presente invenção, a enzima é capaz de hidrolisar um estereoisômero a’ ou b’ de clorofila ou um derivado de clorofila. Isto significa que a enzima tem atividade hidrolítica sobre uma forma prime (') de clorofila ou derivado de clorofila. A designação prime (') refere-se a estereoquímica em torno do número de carbono 132 na clorofila ou derivado de clorofila.

[090] Assim, as formas prime de clorofila ou derivados de clorofila que podem ser hidrolisadas em exemplos de realização da presente invenção incluem; clorofila a', clorofila b', feofitina a' e feofitina b'. Preferencialmente, a enzima é capaz de hidrolisar, pelo menos, uma forma prime de um tipo derivado de clorofila, ou seja, clorofila a' ou feofitina a'.

[091] Normalmente, a enzima também tem atividade hidrolítica sobre formas não prime de clorofila ou de derivados de clorofila. As enzimas utilizadas na presente invenção podem ter estereoespecificidade reduzida, ou seja, as enzimas utilizadas na presente invenção são menos específicas para as formas não prime de clorofila ou de derivados de clorofila do que outras clorofilases conhecidas (tal como a clorofilase de Triticum aestivum, vide a SEQ ID NO: 4).

[092] Em um exemplo de realização, a enzima tem uma razão de atividade sobre um estereoisômero não prime (por exemplo, a ou b) de clorofila ou de um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila ou ao derivado de clorofila, inferior a 100. De preferência, a razão de atividade é menor do que 50, menor do que 10, menor do que 5, menor do que 3, menor do que 2, menor do que 1,5, menor do que 1 ou menor do que 0,5. “Razão de atividade” significa a atividade relativa da enzima sobre a forma prime em relação à atividade sobre a forma não prime sob as mesmas condições. Assim, a razão de atividade pode ser obtida pela determinação da (a) atividade hidrolítica da enzima sobre um estereoisômero não prime, e (b) atividade hidrolítica da enzima sobre um estereoisômero prime correspondente, e dividindo (a) por (b). Uma baixa razão de atividade é, portanto, indicativo de uma atividade relativamente alta sobre as formas prime.

[093] A atividade hidrolítica pode ser determinada, por exemplo, utilizando os métodos descritos a seguir. Normalmente, a razão de atividade pode ser determinada em condições que não favorecem a epimerização (ou seja, a transição entre isômeros prime e não prime). Por exemplo, a razão de atividade pode ser determinada pela medição da atividade hidrolítica sobre isômeros prime e não prime na forma de um óleo bruto com mais de 0,5 ppm de feofitina, e cerca de 2% de água e um pH de 5,0 a 5,5. Em um exemplo de realização, a atividade hidrolítica da enzima sobre a feofitina a ou feofitina a' é calculada na metade da concentração do substrato original (vide, por exemplo, o Exemplo 4)

[094] Em outros exemplos de realização, a enzima tem uma razão de atividade sobre feofitina em relação a pirofeofitina menor do que 10, menor do que 8 ou menor do que 5. Por exemplo, a enzima pode ter uma razão de atividade sobre feofitinase em relação a pirofeofitinase de 0,1 a 10, de 1 a 10 ou de 1 a 5. A razão de atividade sobre feofitinase em relação a pirofeofitinase pode ser calculada pela determinação da atividade de feofitinase e da atividade de pirofeofitinase sob as mesmas condições utilizando os métodos descritos a baixo, e dividindo a atividade da feofitinase pela atividade pirofeofitinase. As razões de atividade dentro dos intervalos de relações divulgados acima podem ser determinadas com relação às espécies correspondentes de feofitina e pirofeofitina, por exemplo, feofitina a (compreendendo tanto a forma a como a’) para pirofeofitina a. ENSAIO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA (CLOROFILASE, FEOFITINASE OU PlROFEOFITINASE)

[095] A atividade hidrolítica da clorofila ou de um derivado de clorofila, inclusive nas formas prime e não prime da mesma, pode ser detectada utilizando qualquer técnica de ensaio adequada, por exemplo, uma baseada em um ensaio descrito na presente invenção. Por exemplo, a atividade hidrolítica pode ser detectada utilizando técnicas baseadas na fluorescência. Em um ensaio adequado, um polipeptídeo a ser testado que possui atividade hidrolítica sobre a clorofila ou derivado de clorofila é incubado na presença de um substrato, e os níveis de produto ou substrato são monitorados pela medição da fluorescência. Os substratos adequados incluem, por exemplo, clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina, incluindo a e b e as formas prime e não prime das mesmas. Os produtos que podem ser detectados incluem clorofilida, feoforbídeo, pirofeoforbídeo e/ou fitol.

[096] Métodos de ensaio para detectar a hidrólise da clorofila ou de um derivado de clorofila são divulgados, por exemplo, em Ali Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 60(1), págs. 73 - 81; Klein e Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236: 2544-2547; e Kiani et al. (2006), Analytical Biochemistry 353: 93-98.

[097] Alternativamente, um ensaio adequado pode se basear na detecção por HPLC e quantificação dos níveis de substrato ou produto após a adição de uma enzima putativa, por exemplo, baseado nas técnicas descritas a seguir. Em um exemplo de realização, o ensaio pode ser realizado conforme descrito em barro-Mendez, et al. (2005), Food Research International 38 (8-9): 1067-1072. Em outro exemplo de realização, o ensaio a seguir pode ser usado: 170 μL de HEPES, pH 7,0 são adicionados a 20 μL de clorofila, feofitina ou pirofeofitina a 0,3 mM dissolvida em acetona. A enzima é dissolvida em 50 mM de HEPES, pH 7,0. 10 μL da solução de enzima são adicionados a 190 μL de solução de substrato para iniciar a reação e a incubação é realizada a 40 °C durante diversos intervalos de tempo. A reação foi parada pela adição de 350 μL de acetona. Após a centrifugação (2 min a 18.000 g), o sobrenadante foi analisado por HPLC, e as quantidades de (i) clorofila e clorofilida; (ii) feofitina e feofordídeo ou (iii) pirofeofitina e pirofeoforbídeo foram determinadas. As formas prime e não prime de clorofila e derivados de clorofila podem ser distinguidas pela análise de HPLC, conforme mostrado na FIG. 49.

[098] Uma unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa um micromole de substrato (por exemplo, clorofila, feofitina ou pirofeofitina) por minuto a 40 °C, por exemplo, em um método de ensaio conforme descrito na presente invenção.

[099] Em exemplos de realização preferidos, a enzima utilizada no presente método tem uma atividade de clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase de pelo menos 1000 U/g, pelo menos 5,000 U/g, pelo menos, 10000 U/g, ou pelo menos, 50000 U/g; com base nas unidades de atividade por grama de enzima purificada, por exemplo, tal como determinado por um método de ensaio descrito na presente invenção. Preferencialmente, a enzima tem uma atividade hidrolítica de pelo menos 1000 U/g, pelo menos 5,000 U/g, pelo menos, 10000 U/g, ou pelo menos 50000 U/g, com base nas unidades de atividade por grama de enzima purificada, sobre um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila ou de um derivado de clorofila (por exemplo clorofila a', clorofila b', feofitina a' ou feofitina b').

[0100] Em outro exemplo de realização, a atividade hidrolítica da clorofila ou de um derivado de clorofila pode ser determinada utilizando um método tal como descrito na EP 10159327.5. CLOROFILASES

[0101] Em um exemplo de realização, a enzima é capaz de hidrolisar pelo menos um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila. Um polipeptídeo que catalisa a hidrólise de uma ligação éster da clorofila a' ou b' para originar uma clorofilida a' ou b' e fitol pode ser usado no processo. Em um exemplo de realização, a enzima é uma enzima clorofilase classificada sob a classificação e nomenclatura de enzimas (EC 3.1.1.14). Um polipeptídeo isolado, recombinante ou sintético ou quimérico (uma combinação de sintético e recombinante) (por exemplo, enzima ou anticorpo catalítico) pode ser utilizado, vide, por exemplo, Marchler-Bauer (2003) Nucleic Acids Res. 31: 383-387.

[0102] Em um exemplo de realização, a enzima pode ser derivada da Arabidopsis thaliana. Por exemplo, a enzima pode ser um polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2 (vide a Figura 13).

[0103] Em outro exemplo de realização, a clorofilase é derivada de mamona, por exemplo, a partir do Ricinus communis. Por exemplo, a clorofilase pode ser um polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 (vide a Figura 24).

[0104] Além disso, são fornecidas enzimas que compreendem uma sequência de polipeptídeos conforme definido em qualquer uma das SEQ ID NO: de 1 a 31, bem como fragmentos funcionais e variantes das mesmas, tal como descrito abaixo. VARIANTES E FRAGMENTOS

[0105] Variantes funcionais e fragmentos de sequências conhecidos que hidrolisam as formas prime de clorofila ou derivados de clorofila podem também ser empregados na presente invenção. Por “funcional” significa que o fragmento ou variante retém uma atividade hidrolítica detectável sobre um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila ou de um derivado de clorofila. Normalmente, estas variantes e fragmentos mostram homologia com uma sequência fonte de clorofilase, feofitinase ou pirofeofitinase, por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos fonte de clorofilase, feofitinase ou pirofeofitinase, por exemplo, a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13, por exemplo, ao longo de uma região de cerca de pelo menos 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ou 1000 ou mais resíduos, ou ao longo de todo o comprimento da sequência.

[0106] A porcentagem de identidade de sequência pode ser determinada pela análise com um algoritmo de comparação de sequências ou pela inspeção visual. Em um aspecto, o algoritmo de comparação de sequências é um algoritmo BLAST, por exemplo, um algoritmo BLAST versão 2.2.2.

[0107] Outras enzimas que possuem atividade sobre as formas prime de clorofila ou de um derivado de clorofila adequadas para a utilização no processo podem ser identificadas pela determinação da presença de motivos de sequência conservados presentes, por exemplo, nas sequências conhecidas de clorofilase, feofitinase ou pirofeofitinase. Por exemplo, o motivo GHSRG (SEQ ID NO: 32), contendo o sítio ativo Ser é altamente conservado nas sequências de clorofilases. Em alguns exemplos de realização, uma enzima para uso na presente invenção pode compreender tal sequência. As sequências de polipeptídeos que possuem atividade adequada podem ser identificadas pela pesquisa em bases de dados de genomas, por exemplo, a base de dados de metagenômica microbiana (JGI-DOE, EUA), para a presença destes motivos. ISOLAMENTO E PRODUÇÃO DE ENZIMAS

[0108] As enzimas para a utilização na presente invenção podem ser isoladas de suas fontes naturais ou podem ser produzidas, por exemplo, utilizando técnicas de DNA recombinante. As sequências de nucleotídeos codificantes de polipeptídeos com atividade de clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase podem ser isoladas ou construídas e utilizadas para a produção dos polipeptídeos correspondentes.

[0109] Por exemplo, um DNA genômico e/ou biblioteca de cDNA pode(m) ser construído(s) com o DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo produtor do polipeptídeo. Se a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é conhecida, sondas de oligonucleotídeos marcadas podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar os clones que codificam o polipeptídeo a partir da biblioteca genômica preparada a partir do organismo. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeos marcada contendo sequências homólogas a outro gene do polipeptídeo conhecido poderia ser usada para identificar os clones codificantes do polipeptídeo. Neste último caso, são utilizadas condições de hibridação e lavagem de mais baixa estringência.

[0110] Alternativamente, os clones codificantes do polipeptídeo poderiam ser identificados pela inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformando bactérias negativas para aquela enzima com a biblioteca de DNA genômico resultante, e depois semeando as bactérias transformadas em placas de ágar contendo uma enzima inibida pelo polipeptídeo, permitindo assim que os clones expressando o polipeptídeo sejam identificados.

[0111] Em outro exemplo alternativo, a sequência de nucleotídeos codificante do polipeptídeo pode ser preparada sinteticamente por métodos padronizados e estabelecidos, por exemplo, o método de fosforoamidita descrito por Beucage SL et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, págs. 18591869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método da fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

[0112] A sequência de nucleotídeos pode ser de origem mista genômica e sintética, de origem mista sintética e de cDNA, ou de origem mista genômica e de cDNA, preparada pela ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (conforme o caso) de acordo com técnicas padronizadas. Cada fragmento ligado corresponde a várias partes de toda a sequência de nucleotídeos. A sequência de DNA também pode ser preparada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers específicos, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.683.202 ou em Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, págs 487-491).

[0113] O termo “sequência de nucleotídeos”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou sequência de polinucleotídeos, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados destas (tais como porções das mesmas). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, que pode ser de dupla- fita ou fita simples seja esta representando a fita sense ou antisense.

[0114] Normalmente, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase é preparada utilizando técnicas de DNA recombinante. Entretanto, em um exemplo de realização alternativo da invenção, a sequência de nucleotídeos pode ser sintetizada, totalmente ou em parte, por meio de métodos químicos conhecidos no estado da técnica (vide Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232). MODIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE ENZIMAS

[0115] Uma vez que uma sequência nucleotídica codificante da enzima foi isolada, ou uma sequência nucleotídica codificante de uma enzima putativa tenha sido identificada, pode ser desejável modificar a sequência de nucleotídeos selecionada, por exemplo, pode ser desejável mutar a sequência de modo a preparar uma enzima de acordo com a presente invenção.

[0116] As mutações podem ser introduzidas utilizando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeos que flanqueiam os sítios de mutação desejados. Um método adequado é divulgado em Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método de introdução de mutações em sequências nucleotídicas codificantes de enzimas é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).

[0117] Em vez da mutagênese sítio-dirigida, tal como descrito acima, pode-se introduzir mutações ao acaso, por exemplo, utilizando um kit comercial, tal como o kit de mutagênese por PCR “GeneMorph PCR mutagenesis kit” da Stratagene ou o kit de mutagênese aleatória por PCR “Diversify PCR random mutagenesis kit” da Clontech. A EP 0583265 refere-se a métodos de otimização da mutagênese baseada em PCR, que também pode ser combinada com o uso de análogos de DNA mutagênicos, tais como os descritos na EP 0866796. As tecnologias de “PCR propensa a erro” são adequadas para a produção de variantes de enzimas que hidrolisam a clorofila e/ou derivados de clorofila com características preferidas. O documento WO0206457 refere-se a evolução molecular de lipases.

[0118] Um terceiro método para a obtenção de novas sequências é fragmentar sequências nucleotídicas não idênticas, utilizando qualquer número de enzimas de restrição ou uma enzima tal como a DNase I, e remontando as sequências nucleotídicas completas que codificam as proteínas funcionais. Alternativamente pode-se utilizar uma ou várias sequências nucleotídicas não idênticas e introduzir mutações durante a remontagem da sequência de nucleotídeos completa. As tecnologias de Embaralhamento de DNA (DNA Shuffling) são adequadas para a produção de variantes de enzimas com características preferidas. Os métodos adequados para realizar o “embaralhamento” (ou shuffling) podem ser encontrados nas publicações EP0752008, EP1138763, EP1103606. A técnica de embaralhamento (shuffling) também pode ser combinada com outras formas de mutagênese de DNA, conforme descrito na Patente US 6.180.406 e documento WO 01/34835.

[0119] Assim, é possível produzir várias mutações sítio-dirigidas ou aleatórias dentro de uma sequência de nucleotídeos, tanto in vivo como in vitro, e posteriormente selecionar a sequência que apresenta funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado por diversos meios. Usando os métodos de recombinação mediada exo e in silico (vide o documento WO 00/58517, as patentes US 6.344.328, US 6.361.974), por exemplo, a evolução molecular pode ser realizada sempre que a variante produzida retém muito baixa homologia com as enzimas ou proteínas conhecidas. Tais variantes obtidas dessa forma podem ter analogia estrutural significativa com as enzimas clorofilase, feofitinase ou pirofeofitinase conhecidas, mas possuem muito baixa homologia na sequência de aminoácido.

[0120] Como um exemplo não limitante, além das mutações ou variantes naturais, uma sequência de polinucleotídeos pode ser recombinada tanto com sequencias do tipo selvagem como com qualquer outra sequência mutante ou variante natural para a produção de novos variantes. Tais novas variantes também podem ser selecionadas para uma funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado.

[0121] A aplicação dos métodos de evolução molecular mencionados acima e métodos similares permite a identificação e seleção de variantes das enzimas da presente invenção, que possuem características preferenciais sem qualquer conhecimento prévio da estrutura ou função da proteína e permite a produção de mutações ou variantes não previsíveis, porém benéficas.Há numerosos exemplos da aplicação da evolução molecular no estado da técnica para a otimização ou alteração de atividade enzimática, tais exemplos incluem, mas não estão limitados a uma ou mais das seguintes: expressão e/ou atividade otimizada em uma célula hospedeira ou in vitro, atividade enzimática aumentada, especificidade do produto e/ou substrato alterada, aumento ou diminuição da estabilidade estrutural ou enzimática, atividade/especificidade enzimática alterada nas condições ambientais preferenciais, por exemplo, temperatura, pH, substrato.

[0122] Como será evidente para um técnico no assunto, com a utilização de ferramentas de evolução molecular uma enzima pode ser alterada para melhorar a funcionalidade da enzima. Adequadamente, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima (por exemplo, uma clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase) utilizada na presente invenção pode codificar uma enzima variante, ou seja, a enzima variante pode conter pelo menos uma substituição, deleção ou adição de aminoácidos quando comparada com uma enzima parental. As enzimas variantes retêm, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade com a enzima parental. As enzimas parentais adequadas podem incluir qualquer enzima com atividade hidrolítica sobre as formas prime de clorofila e/ou derivado de clorofila.

SEQUÊNCIAS POLIPEPTÍDICAS

[0123] A presente invenção também abrange a utilização de sequências de aminoácidos codificadas por uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima para uso em qualquer um dos métodos e/ou utilizações da presente invenção.

[0124] Conforme utilizado no presente, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou “proteína”. Em alguns casos, o termo “sequência de aminoácido” é sinônimo do termo “peptídeo”. A sequência de aminoácido pode ser preparada/isolada a partir de uma fonte adequada, ou pode ser produzida de forma sintética, ou ela pode ser preparada pelo uso de técnicas de DNA recombinante. Adequadamente, as sequências de aminoácidos podem ser obtidas a partir dos polipeptídeos isolados ensinados na presente invenção por técnicas convencionais.

[0125] Um método apropriado para a determinação das sequências de aminoácidos a partir de polipeptídeos isolados é descrito a seguir. O polipeptídeo purificado pode ser liofilizado e 100 μg do material liofilizado podem ser dissolvidos em 50 μL de uma mistura de ureia a 8M e 0,4 M de hidrogenocarbonato de amônio, pH 8,4. A proteína dissolvida pode ser desnaturada e reduzida durante 15 minutos a 50 °C, seguido pela sobreposição com nitrogênio e adição de 5 μL de ditiotreitol 45 mM. Após o resfriamento até a temperatura ambiente, 5 μL de iodoacetamida 100 mM podem ser acrescentados aos resíduos de cisteína para serem derivatizados durante 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro, sob nitrogênio.

[0126] 135 μL de água e 5 μg de endoproteinase Lys-C em 5 mL de água podem ser adicionados a mistura de reação acima e a digestão pode ser realizada a 37 °C sob nitrogênio durante 24 horas. Os peptídeos resultantes podem ser separados por HPLC de fase reversa em uma coluna C18 VYDAC (0,46x15cm, 10 μm, The Separation Group, Califórnia, EUA) utilizando solvente A: TFA 0,1% em água e solvente B: TFA 0,1% em acetonitrila. Os peptídeos selecionados podem ser recromatografados em uma coluna Develosil C18 utilizando o mesmo sistema de solvente, antes do sequenciamento N-terminal. O sequenciamento pode ser feito utilizando um sequenciador Applied Biosystems 476A utilizando ciclos rápidos líquidos pulsados de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Califórnia, EUA). COMPARAÇÃO DE SEQUÊNCIA

[0127] No presente, o termo “homólogo” significa uma entidade que possui uma determinada homologia com as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos em questão. Na presente invenção, o termo “homologia” pode ser equiparado ao termo “identidade”. As sequências de aminoácidos e/ou de nucleotídeos homólogas deverão fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que mantém a atividade funcional e/ou atividade aumenta da enzima.

[0128] No presente contexto, entende-se como sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 75, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência em questão. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos e etc. tal como a sequência de aminoácido em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0129] No presente contexto, entende-se como sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de nucleotídeos que pode ser pelo menos 75, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos 95 ou 98% idêntica à sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo da presente invenção (a sequência em questão). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas sequências que codificam os sítios ativos etc. tal como a sequência em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0130] As comparações de homologia podem ser conduzidas visualmente, ou de modo mais geral, com o auxílio de programas de comparação de sequências disponíveis. Estes programas para computadores disponíveis no mercado podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências. A % de homologia pode ser calculada sobre sequências contíguas, ou seja, uma sequência está alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de alinhamento “ungapped” (sem lacunas). Normalmente, tais alinhamentos ungapped são realizados apenas sobre um número relativamente pequeno de resíduos.

[0131] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele não consegue levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências de outra forma idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam colocados fora do alinhamento, resultando assim em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência é projetada para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação (escore) da homologia global. Isto é obtido por meio da inserção de gaps (lacunas) no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia local.

[0132] No entanto, estes métodos mais complexos atribuem “gap penalties” (ou seja, penalidades para a introdução de lacunas) para cada lacuna presente no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o mínimo de lacunas possível (refletindo o maior parentesco entre as duas sequências comparadas) irá obter uma pontuação mais elevada do que um alinhamento com muitas lacunas. A “penalidade para lacuna afim” (affine gap cost) é normalmente usada para penalizar de forma relativamente alta a existência de uma lacuna e atribuir uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacuna mais usado. Penalidades de lacunas altas, irão, naturalmente, produzir alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades para lacunas sejam modificadas. No entanto, é preferível usar os valores padrões pré-estabelecidos quando se utiliza tais softwares para comparações de sequências.

[0133] O cálculo da % de homologia máxima, portanto, em primeiro lugar requer a produção de um alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades para lacuna. Um programa de computador adequado para a realização de tal alinhamento é Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.). Exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados, ao pacote BLAST (vide Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed - Capítulo 18), e FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410). Ambos, BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (vide Ausubel et al., 1999, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, é preferível utilizar o programa Vector NTI Advance™ 11. Uma nova ferramenta, chamada de “BLAST 2 Sequences” também está disponível para comparar sequências de proteínas e nucleotídeos (vide, FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8).

[0134] Embora a % de homologia final possa ser mensurada em termos de identidade, o processo de alinhamento em si normalmente não é baseado em uma comparação de pares do tipo “tudo ou nada”. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada para atribuir a pontuação para cada comparação de par em par com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz comumente utilizada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para a suíte de programas BLAST. Os programas Vector NTI usam geralmente valores padrões públicos ou, se fornecido, uma tabela de comparação de símbolos personalizada (consulte o manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferível usar os valores predefinidos (default) para o pacote Vector NTI Advance™ 11.

[0135] Alternativamente, a porcentagem de homologias pode ser calculada usando o recurso de alinhamento múltiplo no Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1) 237-244). Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a % de homologia, e preferencialmente a % de identidade de sequência. O software normalmente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0136] As penalidades para lacunas (gap penalties) devem ser usadas quando é feita a determinação da identidade de sequência, em seguida, os seguintes parâmetros predefinidos para o programa são usados para o alinhamento em pares. Por exemplo, os seguintes parâmetros são os parâmetros predefinidos atuais de alinhamento em pares para o BLAST 2:

[0137] Em um exemplo de realização, preferencialmente a identidade de sequência para as sequências de nucleotídeos e/ou sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando BLAST2 (blastn) com os parâmetros de pontuação definidos acima.

[0138] Para os fins da presente invenção, o grau de identidade é baseado no número de elementos de sequência que são iguais. O grau de identidade, de acordo com a presente invenção, para as sequências de aminoácidos pode ser convenientemente determinado utilizando programas de computador conhecidos no estado da técnica, tal como o Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.). Para o alinhamento em pares os parâmetros de pontuação (escore) utilizados são de preferência BLOSUM62 com penalidade por existência de lacuna (Gap existence penalty) de 11 e penalidade por extensão de lacuna (Gap extension penalty) de 1.

[0139] Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos é determinado ao longo de pelo menos 20 nucleotídeoscontíguos,preferencialmenteaolongodepelomenos30 nucleotídeoscontíguos,preferencialmenteaolongodepelomenos40 nucleotídeos contíguos, mais preferencialmente ao longo de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, e mais preferencialmente ao longo de pelo menos 60 nucleotídeos contíguos, e preferivelmente ao longo de pelo menos 100 nucleotídeos contíguos. Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos pode ser determinado ao longo de toda a sequência. MUTAÇÕES DE AMINOÁCIDOS

[0140] As sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na similaridade da polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, contanto que a atividade de ligação secundária da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem a lisina e arginina; e aminoácidos com cabeça polar não carregada possuindo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem a leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0141] Substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e, preferencialmente na mesma linha na terceira coluna, podem ser substituídos entre si:

[0142] A presente invenção também abrange substituições homólogas (substituição e reposição são ambas utilizadas para designar a troca de um resíduo de aminoácido existente por um resíduo alternativo) que podem ocorrer, ou seja, substituições comparáveis (like-for-like), tais como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar e etc. Também pode ocorrer uma substituição não homóloga, ou seja, de uma classe de resíduo para outra classe ou, alternativamente, a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (designada a seguir como Z), ornitina ácido diaminobutírico (designada a seguir como B), ornitina norleucina (designada a seguir como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina. Também podem ser feitas substituições por aminoácidos não naturais.

[0143] As sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer outros dois resíduos de aminoácidos da sequência, incluindo grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila, além de espaçadores de aminoácidos como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma de variação adicional envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptóide, e será bem compreendido pelos técnicos hábeis no assunto. Para que não restem dúvidas, “a forma peptóide” é usada para se referir a resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte carbono α está no átomo de nitrogênio do resíduo ao invés do carbono α. Processos para a preparação de peptídeos na forma peptóide são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, Simon RJ et al. PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13 (4), 132-134. SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS

[0144] As sequências de nucleotídeos para o uso na presente invenção, ou codificantes de um polipeptídeo possuindo as propriedades específicas definidas na presente invenção podem incluir nucleotídeos sintéticos ou modificados. Uma variedade de diferentes tipos de modificação de oligonucleotídeos é conhecida no estado da técnica. Dentre estes podemos incluir aqueles que possuem estruturas principais de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3’ e/ou 5’ da molécula. Para os propósitos da presente invenção, deve-se compreender que as sequências de nucleotídeos descritas no presente documento podem ser modificadas por qualquer método disponível no estado da técnica. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a atividade in vivo ou a vida útil das sequências de nucleotídeos.

[0145] A presente invenção também abrange o uso de sequências de nucleotídeos que são complementares às sequências discutidas na presente invenção, ou qualquer derivado ou fragmento derivado destas sequências. Se a sequência é complementar a um fragmento da mesma, então a sequência pode ser usada como uma sonda para identificar as sequências de codificação semelhantes em outros organismos, e etc.

[0146] Os polinucleotídeos que não são 100% homólogos às sequências da presente invenção, mas caem dentro do escopo da invenção podem ser obtidos de diversas maneiras. Outros variantes de sequências descritas no presente documento podem ser obtidos, por exemplo, por sondagens de bibliotecas de DNA feitas a partir de uma gama de indivíduos, por exemplo, indivíduos a partir de diferentes populações. Além disso, outros homólogos virais/bacterianos ou celulares, e particularmente homólogos celulares encontrados em células vegetais, podem ser obtidos e tais homólogos e fragmentos destes, em geral, serão capazes de se hibridizar seletivamente com as sequências exibidas na listagem de sequências da presente invenção. Tais sequências podem ser obtidas pela sondagem feita a partir de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas de DNA genômico de outras espécies vegetais, e tais sondagens de bibliotecas com as sondas compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências da lista sequência anexa em condições de média a alta estringência. Considerações semelhantes se aplicam para a obtenção de espécies homólogas e variantes alélicas das sequências de nucleotídeos ou polipeptídeos da invenção.

[0147] Variantes e cepas e espécies homólogas também podem ser obtidas usando a PCR degenerada (ou com “primers degenerados”) que utilizará primers projetados para atingir as sequências dentro das variantes e homólogas que codificam sequências de aminoácidos conservadas dentro das sequências da presente invenção. As sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, por meio do alinhamento das sequências de aminoácidos a partir das diversas variantes/homólogas. Os alinhamentos de sequência podem ser realizados pelo uso de softwares de computador conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é amplamente utilizado.

[0148] Os primers degenerados utilizados na PCR irão conter uma ou mais posições degeneradas e serão utilizados em condições de menor estringência do que aqueles usados para a clonagem de sequências com primers de sequência única contra sequências conhecidas.

[0149] Alternativamente, tais polinucleotídeos podem ser obtidos pela mutagênese sítio dirigida de sequências caracterizadas. Isto pode ser útil quando, por exemplo, alterações silenciosas na sequência do códon são necessárias para otimizar as preferências de uso de códon para uma célula hospedeira específica na qual as sequências de polinucleotídeos estão sendo expressas. Outras alterações na sequência podem ser desejadas, a fim de introduzir sítios para o reconhecimento de polipeptídeos de restrição, ou para alterar as propriedades ou funções dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos.

[0150] Os polinucleotídeos (sequências de nucleotídeos) da presente invenção podem ser usados para produzir um primer, por exemplo, um primer de PCR, um primer para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcada com um marcador que é revelado por meios convencionais utilizando marcadores radioativos ou não radioativos, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais primers, sondas e outros fragmentos serão de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 20, por exemplo, pelo menos, 25, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento, e são também abrangidos pelo termo polinucleotídeos da invenção conforme utilizado no presente.

[0151] Os polinucleotídeos, tal como polinucleotídeos de DNA e sondas de acordo com a invenção podem ser produzidos recombinantemente, sinteticamente, ou por qualquer método disponível para os técnicos hábeis no assunto. Eles também podem ser clonados por técnicas convencionais.

[0152] Normalmente, os primers serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma produção gradativa com um nucleotídeo de cada vez da sequência de ácido nucleico desejada. Técnicas para essa realização utilizando técnicas automatizadas estão disponíveis no estado da técnica.

[0153] Polinucleotídeos mais longos irão geralmente ser produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, usando uma técnica de clonagem baseada em PCR (reação em cadeia da polimerase). Isto envolve a produção de um par de primers (por exemplo, de cerca de 15 a 30 nucleotídeos) flanqueando uma região da sequência da enzima que se pretende clonar, colocar os primers em contato com o mRNA ou cDNA obtido a partir de uma célula vegetal, realizando uma reação em cadeia da polimerase sob condições que provocam a amplificação da região desejada, em seguida e feito o isolamento do fragmento amplificado (por exemplo, purificando a mistura da reação em uma gel de agarose) e a recuperação do DNA amplificado. Os primers podem ser projetados para conter sítios de reconhecimento de enzimas de restrição adequados de modo que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem apropriado. FORMULAÇÃO E DOSAGEM DE ENZIMA

[0154] As enzimas utilizadas nos métodos da invenção podem ser formuladas ou modificadas, por exemplo, quimicamente modificadas para aumentar a solubilidade em óleo, a estabilidade, a atividade ou para a imobilização. Por exemplo, as enzimas utilizadas nos métodos da invenção podem ser formuladas para se tornarem mais lipofílicas ou anfipáticas. Por exemplo, as enzimas utilizadas nos métodos da invenção podem ser encapsuladas, por exemplo, em lipossomas ou géis, tais como hidrogéis de alginato ou grânulos de alginato ou equivalentes. As enzimas utilizadas nos métodos da invenção podem ser formuladas em sistemas micelares, por exemplo, um meio micelar ternário (TMS) ou sistema micelar inverso (RMS). As enzimas utilizadas nos métodos da invenção podem ser formuladas conforme descrito em Yi (2002), J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol. 19, págs. 319-325.

[0155] As reações enzimáticas dos métodos da invenção, por exemplo, a etapa contatar o óleo com uma enzima que hidrolisa um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b') de clorofila ou de um derivado de clorofila pode ser realizada em um recipiente de reação ou em diversos recipientes de reação. Em um aspecto, as reações enzimáticas dos métodos da invenção são realizadas em uma unidade ou instalação de refinação de óleo vegetal.

[0156] O método da invenção pode ser praticado com enzimas imobilizadas, por exemplo, uma clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase imobilizada. A enzima pode ser imobilizada em qualquer suporte orgânico ou inorgânico. Exemplos de suportes inorgânicos incluem alumina, celite, Dowex-1 (cloreto), esferas de vidro e gel de sílica. Exemplos de suportes orgânicos incluem DEAE-celulose, hidrogéis de alginato ou esferas de alginato ou equivalentes. Em diversos aspectos da invenção, a imobilização da enzima pode ser otimizada pela adsorção física no suporte inorgânico. As enzimas utilizadas para a prática da invenção podem ser imobilizadas em diferentes meios, incluindo a água, solução tampão de Tris-HCl e um sistema micelar ternário contendo solução tampão de Tris-HCl, hexano e tensoativo. A enzima pode ser imobilizada em qualquer tipo de substrato, por exemplo, filtros, colunas, fibras, grânulos, coloides, géis, hidrogéis, malhas e outros substratos similares.

[0157] A enzima pode ser dosada dentro do óleo em qualquer quantidade adequada. Por exemplo, a enzima pode ser administrada em uma faixa de cerca de 0,001 a 10 U/g da composição, preferencialmente 0,01 a 1 U/g, por exemplo 0,01 a 0,1 U/g de óleo. Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 μmol de substrato (por exemplo, clorofila a ou b, feofitina a ou b e/ou pirofeofitina a ou b, ou um estereoisômero prime (por exemplo, a' ou b1)) por minuto a 40 °C, por exemplo, sob condições de ensaio, tal como descrito no J. Biol.Chem. (1961) 236: 2544-2547. CONDIÇÕES DE REAÇÃO DA ENZIMA

[0158] Em geral, o óleo pode ser incubado (ou misturado) com a enzima entre cerca de 5 °C a cerca de 100 °C, mais preferivelmente entre cerca de 10 °C a 90 °C, mais preferivelmente entre cerca de 15 °C a 80 °C, mais preferivelmente entre cerca de 20 °C até cerca de 75 °C.

[0159] Em temperaturas mais elevadas a feofitina é decomposta em pirofeofitina, que é geralmente menos preferida, pois algumas clorofilases são menos ativas sobre a pirofeofitina em comparação com a feofitina. Além disso, o produto da degradação pela clorofilase da pirofeofitina, o pirofeoforbídeo, é menos solúvel em água em comparação com feoforbídeo e, portanto, mais difícil de remover do óleo posteriormente. A velocidade da reação enzimática é aumentada em temperaturas mais elevadas, mas é favorável manter a conversão da feofitina em pirofeofitina a um mínimo.

[0160] Em vista do exposto acima, em exemplos de realização particularmente preferidos, o óleo é incubado com a enzima a abaixo de cerca de 80 °C, de preferência abaixo de cerca de 70 °C, preferencialmente aproximadamente a 68 °C ou abaixo disso, de preferência a cerca de 65 °C ou abaixo disso, para reduzir a quantidade de conversão de pirofeofitina. No entanto, a fim de manter uma boa velocidade de reação, é preferível manter a temperatura do óleo acima de 50 °C durante a incubação com a enzima. Consequentemente a faixas de temperatura preferidas para a incubação da enzima com o óleo inclui cerca de 50 °C e abaixo a cerca de 70 °C, cerca de 50 °C até cerca de 65 °C; e cerca de 55 °C até cerca de 65 °C.

[0161] Preferencialmente, a temperatura do óleo pode estar na temperatura de reação desejada quando a enzima é misturada com o mesmo. O óleo pode ser aquecido e/ou arrefecido para a temperatura desejada, antes e/ou durante a adição da enzima. Portanto, em um exemplo de realização, prevê-se que uma etapa do processo de acordo com a presente invenção pode ser o resfriamento e/ou aquecimento do óleo.

[0162] De maneira adequada, o tempo de reação (ou seja, o período de tempo em que a enzima é incubada com o óleo), preferencialmente com agitação, é por um período de tempo suficiente para permitir a hidrólise da clorofila e dos derivados de clorofila, especialmente sues estereoisômeros prime (por exemplo, a’ ou b’) para formar, por exemplo, fitol e clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo. Por exemplo, o tempo de reação pode ser de pelo menos cerca de 1 minuto, mais preferível pelo menos cerca de 5 minutos, e mais preferencialmente ainda pelo menos cerca de 10 minutos. Em alguns exemplos de realização, o tempo de reação pode estar compreendido entre cerca de 15 minutos a cerca de 6 horas, de preferência entre cerca de 15 minutos a cerca de 60 minutos, de preferência entre cerca de 30 a cerca de 120 minutos. Em alguns exemplos de realização, o tempo de reação pode ser de até 6 horas.

[0163] Preferencialmente, o processo é realizado entre cerca de pH 4,0 e cerca de pH 10,0; mais preferivelmente entre cerca de pH 5,0 e cerca de pH 10,0; mais preferivelmente entre cerca de pH 6,0 e cerca de pH 10,0; mais preferivelmente entre cerca de pH 5,0 e cerca de pH 7,0; com maior preferência entre cerca de pH 5,0 e cerca de pH 7,0; mais preferivelmente entre cerca de pH 6,5 e cerca de pH 7,0; por exemplo, um pH de aproximadamente 7,0 (ou seja, pH neutro). Em um exemplo de realização o processo é preferencialmente realizado entre um pH de cerca de 5,5 e 6,0.

[0164] Adequadamente, o teor de água no óleo quando incubado (ou misturado) com a enzima situa-se entre cerca de 0,5 a cerca de 5% de água, mais preferivelmente entre cerca de 1 a cerca de 3%; e mais preferivelmente entre cerca de 1,5 e cerca de 2%.

[0165] Quando é usada uma enzima imobilizada, a atividade de água da enzima imobilizada pode adequadamente estar na faixa de cerca de 0,2 a cerca de 0,98; de preferência entre cerca de 0,4 a cerca de 0,9, e mais preferivelmente entre cerca de 0,6 a cerca de 0,8. SEPARAÇÃO DE ÓLEO

[0166] Após uma etapa de tratamento enzimático utilizando uma enzima de acordo com a presente invenção, em um exemplo de realização o líquido tratado (por exemplo, óleo) é separado com um meio adequado, tal como com um separador centrífugo, e o óleo obtido é processado. Após a conclusão do tratamento com as enzimas, se necessário, o óleo pode ser adicionalmente processado, lavado com água ou ácido orgânico ou inorgânico, tal como, por exemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido succínico, e outros ácidos similares, ou com soluções salinas. REMOÇÃO DA CLOROFILA E/OU DERIVADO DE CLOROFILA

[0167] O processo da presente invenção envolve um tratamento com enzima e reduz tipicamente o nível de clorofila e/ou derivados de clorofila no óleo, especialmente os estereoisômeros prime (por exemplo, a’ ou b’) dos mesmos. Por exemplo, o processo pode reduzir a concentração de clorofila a ou b, feofitina a ou b e/ou pirofeofitina a ou b ou os seus estereoisômeros prime (por exemplo, a’ ou b’), em pelo menos 5%, pelo menos 10%; pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99%, em comparação com a concentração de clorofila, feofitina e/ou pirofeofitina (em peso) presente no óleo antes do tratamento. Assim, em exemplos de realização específicos, a concentração de clorofila e/ou derivados de clorofila, ou seus estereoisômeros prime (por exemplo, a’ ou b’) no óleo após o tratamento pode ser inferior a 100, inferior a 50, inferior a 30, inferior a 10, inferior a 5, inferior a 1, inferior a 0,5, inferior a 0,1 mg/kg ou inferior a 0,02 mg/kg, com base no peso total do óleo.

[0168] Se uma enzima que é estereoespecífica para formas não prime de clorofila ou derivados de clorofila é utilizada, após o tratamento com a enzima o óleo compreende, tipicamente, uma proporção reduzida de estereoisômeros não prime, em comparação com a quantidade total de estereoisômeros não prime e prime remanescentes no óleo (vide o Exemplo 3 e a Figura 48 abaixo). Em contrapartida, nos exemplos de realização da presente invenção, as enzimas utilizadas no presente método normalmente possuem estereoespecificidade reduzida para formas não prime de clorofila e derivados de clorofila, ou seja, as enzimas são tipicamente capazes de hidrolisar tanto as formas prime quanto as formas não prime. Consequentemente, depois de uma fase de tratamento da presente invenção, a proporção dos estereoisômeros não prime remanescente no óleo cai tipicamente para menos do que quando uma enzima estereoespecífica é usada.

[0169] Verificou-se que, sob condições típicas, os óleos brutos (por exemplo, óleo de soja bruto ou óleo de semente de colza bruto) podem compreender cerca de 70% de estereoisômeros não prime (por exemplo, feofitina a) e 30% de estereoisômeros prime (por exemplo, feofitina a'). Em um exemplo de realização, após o tratamento com a enzima o óleo compreende pelo menos 50% de estereoisômeros não prime (por exemplo, a e/ou b) de clorofila ou derivado de clorofila, com base na quantidade total de estereoisômeros não prime (por exemplo, a e/ou b) e prime (por exemplo, a' e/ou b') de clorofila ou derivado de clorofila no óleo. Mais preferivelmente, o óleo compreende pelo menos 55%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de estereoisômeros não prime de clorofila ou do derivado de clorofila após o tratamento.

[0170] Em um exemplo de realização, após o tratamento com a enzima o óleo compreende pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de feofitina a, com base na quantidade total de feofitina a e feofitina a’ no óleo. Em um exemplo de realização, após o tratamento com a enzima o óleo compreende pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de feofitina b, com base na quantidade total de feofitina b e feofitina b’ no óleo.

[0171] Nestes exemplos de realização, as condições típicas podem ser, por exemplo, cerca de 20 °C até cerca de cerca de 70 °C (por exemplo, cerca de 40 °C ou cerca de 60 °C), pH 5-8 (por exemplo, cerca de pH 6,0 ou cerca de pH 7,0) e teor de água de 1 a 3% (por exemplo cerca de 2%). O tempo de tratamento pode compreender, por exemplo, pelo menos 1 hora, preferivelmente 2 horas ou mais, mais preferencialmente de 4 horas ou mais. ETAPAS DE PROCESSAMENTO ADICIONAIS

[0172] Em um método de processamento de óleo vegetal típico, o óleo é extraído em hexano, o óleo vegetal bruto é degomado, opcionalmente neutralizado com cáustica, submetido ao branqueamento usando, por exemplo, adsorção em argila com subsequente descarte da argila, e desodorizado para produzir óleo refinado, branqueado e desodorizado ou RBD (vide a Figura 50). A necessidade da etapa de degomagem depende do teor de fósforo e de outros fatores. O processo da presente invenção pode ser utilizado em conjunto com processos de acordo com a extração com hexano e/ou extração de óleo auxiliado com enzima (vide, Journal of Americal Oil Chemists 'Society (2006), 83 (11), 973-979). Em geral, o processo da invenção pode ser realizado utilizando as etapas de processamento de óleo, tal como descrito em Bailey’s Industrial Oil and Fat Products (2005), 6a edição, ed. por Fereidoon Shahidi, John Wiley & Sons.

[0173] Em exemplos de realização da presente invenção, uma reação enzimática que envolve a aplicação da enzima capaz de hidrolisar uma clorofila ou um derivado de clorofila pode ser realizada em vários estágios neste processo, conforme mostrado na Figura 50. Em exemplos de realização específicos, a enzima é posta em contato com o óleo antes da etapa de degomagem. Em outro exemplo de realização, a enzima pode ser contatada com o óleo durante uma etapa de degomagem com água. Em outro exemplo de realização, a enzima é posta em contato com o óleo degomado com água, mas antes do processo de degomagem estar completo (por exemplo, antes da degomagem total ou da etapa de neutralização cáustica).

[0174] As etapas de processamento adicionais, após o tratamento com a enzima, podem auxiliar na remoção dos produtos da hidrólise enzimática de clorofila e/ou derivados de clorofila. Por exemplo, as etapas de processamento adicionais podem remover a clorofilida, feoforbídeo, pirofeoforbídeo e/ou fitol. DEGOMAGEM

[0175] A etapa de degomagem na refinação do óleo serve para separar os fosfatidos pela adição de água. O material precipitado pela degomagem é separado e processado para misturas de lecitinas. As lecitinas comerciais, tais como a lecitina de soja e lecitina de girassol, são materiais semisólidos ou muito viscosos. Eles consistem de uma mistura de lipídios polares, principalmente fosfolipídeos, tais como fosfatidilcolina com um componente menor de triglicerídeos. Assim, tal como utilizado na presente invenção, o termo “degomagem” significa que a refinação do óleo pela remoção de fosfolipídeos a partir do óleo. Em alguns exemplos de realização, a degomagem pode compreender uma etapa de conversão de fosfatídeos (tal como lecitina e fosfolipídeos) em fosfatídeos hidratáveis.

[0176] O processo da invenção pode ser utilizado em qualquer procedimento de degomagem, especialmente nos exemplos de realização em que a enzima que realiza a hidrólise de clorofila ou um derivado de clorofila é posta em contato com o óleo antes da etapa de degomagem. Assim, os métodos de degomagem adequados incluem a degomagem com água, degomagem de óleo ALCON (por exemplo, para a soja), degomagem safinco, “super degomagem,” degomagem UF, degomagem TOP, uni-degomagem, degomagem seca e degomagem ENZYMAX®. Vide, por exemplo, as Patentes US 6.355.693;6.162.623;6.103.505;6.001.640;5.558.781;5.264.367. 5.558.781; 5.288.619; 5.264.367; 6.001.640; 6.376.689; os documentos WO 0229022; WO 98118912; e similares. Diversos procedimentos de degomagem incorporados pelos métodos da invenção estão descritos em Bockisch, M. (1998), Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (Capítulo 5), 345-445, AOCS Press, Champaign, Illinois.

[0177] A degomagem com água refere-se tipicamente a uma etapa na qual o óleo é incubado com a água (por exemplo, 1 a 5% em peso), a fim de remover fosfatídeos. Normalmente, a degomagem com água pode ser realizada em alta temperatura, por exemplo, de 50 a 90 °C. A mistura óleo/água pode ser agitada, por exemplo, por 5 a 60 minutos para permitir a separação dos fosfatídeos para a fase aquosa, que é, então, removida do óleo.

[0178] A degomagem ácida também pode ser realizada. Por exemplo, o óleo pode ser posto em contato com ácido (por exemplo, 0,1 a 0,5% de uma solução de ácido cítrico ou málico a 50%) em 60 a 70 °C, misturado, contatado com 1 a 5% de água e resfriado a 25 a 45 °C.

[0179] Procedimentos de degomagem adicionais adequados para o uso com o processo da presente invenção estão descritos no documento WO 2006/008508. Em um exemplo de realização, o processo compreende o contato da enzimática que hidrolisa a clorofila ou derivado de clorofila com o óleo e, subsequentemente, a realização de uma etapa de degomagem enzimática utilizando uma aciltransferase conforme descrito no documento WO 2006/008508. As aciltransferases adequadas para a utilização no processo também estão descritas nos documentos WO 2004/064537, WO 2004/064987 e WO 2009/024736. Qualquer enzima que possui atividade de aciltransferase (geralmente classificada como EC 2.3.1) pode ser utilizada, em particular enzimas que compreendem na sequência de aminoácidos o motivo GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S. Em um exemplo de realização, a aciltransferase é uma é uma aciltransferase de lipídio madura de Aeromonas salmonicida mutante (GCAT) com uma mutação Asn80Asp.

[0180] Em outro exemplo de realização, o processo compreende uma etapa de degomagem usando uma fosfolipase. Qualquer enzima possuindo, por exemplo, atividade de uma fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) ou fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), pode ser usada, por exemplo, a Lecitase Ultra® ou fosfolipase A2 pancreática (Novozymes, Dinamarca). Em um exemplo de realização, o processo compreende o contato da enzima que hidrolisa a clorofila ou derivado de clorofila com o óleo antes de uma etapa de degomagem enzimática utilizando uma fosfolipase, por exemplo, utilizando a etapa de degomagem descrita na US 5.264.367, EP 0.622.446, WO 00/32758 ou Clausen (2001) “Enzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase” Eur.J. Lipid Sci. Technol. 103:333-340.

[0181] Em outro exemplo de realização, a etapa de degomagem pode ser uma etapa de degomagem com água. Em um exemplo de realização adicional, uma etapa de degomagem enzimática utilizando uma enzima tal como a fosfolipase C (IUB 3.1.4.1) pode ser utilizada. Os polipeptídeos com atividade de fosfolipase C, que podem ser utilizados em uma etapa de degomagem são revelados, por exemplo, no WO2008143679, WO2007092314,WO2007055735,WO2006009676 e WO03089620. Uma fosfolipase C adequada para a utilização na presente invenção é a Purifine®, disponível pela Verenium Corporation, Cambridge, MA. TRATAMENTO ÁCIDO / NEUTRALIZAÇÃO CÁUSTICA

[0182] Em alguns exemplos de realização, uma etapa de tratamento ácido/neutralização cáustica pode ser realizada a fim de reduzir ainda mais os níveis de fosfolipídeos no óleo após a degomagem com água. Em outro exemplo de realização, uma etapa de degomagem única compreendendo o tratamento ácido/neutralização cáustica pode ser realizada. Tais métodos são normalmente referidos como degomagem total ou refino alcalino.

[0183] Verificou-se que um tratamento ácido /etapa de neutralização cáustica é particularmente eficaz na remoção de produtos da hidrólise enzimática da clorofila, por exemplo, clorofilida, feoforbídeo e pirofeoforbídeo. Assim, esta etapa pode ser realizada em qualquer fase do processo após a etapa de tratamento com enzima. Por exemplo, tal etapa pode incluir a adição de um ácido, tal como ácido fosfórico, seguido pela neutralização com um álcali, tal como hidróxido de sódio. Após o tratamento ácido/neutralização cáustica os compostos, tais como clorofilida, feoforbídeo e pirofeoforbídeo são extraídos do óleo em uma fase aquosa.

[0184] Em tais métodos, o óleo é normalmente contatado primeiro com 0,05 a 0,5% em peso de ácido fosfórico concentrado, por exemplo, em uma temperatura de 50 a 90 °C, e misturados para ajudar a precipitar os fosfatídeos. O tempo de contato pode ser, por exemplo, de 10 segundos a 30 minutos. Posteriormente, uma solução aquosa de um álcali (por exemplo, hidróxido de sódio aquoso a 20%) é adicionada, por exemplo, a uma temperatura de 50 a 90 °C, seguido pela incubação e mistura durante 10 segundos a 30 minutos. O óleo pode em seguida ser aquecido a cerca de 90 °C e a fase aquosa de sabão separada do óleo por centrifugação.

[0185] Opcionalmente, também podem ser realizadas etapas adicionais de lavagem com, por exemplo, hidróxido de sódio ou água. REMOÇÃO DA CLOROFILIDA, FEOFORBÍDEO E PIROFEOFORBÍDEO

[0186] O método da presente invenção pode envolver opcionalmente uma etapa de remoção de derivados livres de fitol da clorofila tal como clorofilida, feoforbídeo e pirofeoforbídeo, incluindo as formas prime e não prime dos mesmos. Tais produtos podem estar presentes na composição devido à hidrólise da clorofila ou um derivado de clorofila pela enzima da invenção, ou podem estar naturalmente presentes como contaminantes, ou como um componente indesejável em um produto processado. O pirofeoforbídeo pode também estar presente na composição devido à quebra do feoforbídeo, o qual também pode ser produzido pela atividade de uma enzima possuindo atividade feofitinase sobre a feofitina, ou o feoforbídeo pode ser formado a partir da clorofilida após a ação da clorofilase sobre a clorofila (vide a Figura 1). As condições de processamento utilizadas no refino de óleo, em particular o calor, pode favorecer a formação de pirofeoforbídeo como um componente dominante, por exemplo, favorecer a conversão de feofitina em pirofeofitina, que é subsequentemente hidrolisada em pirofeoforbídeo.

[0187] Em um exemplo de realização, o processo da presente invenção reduz o nível de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo no óleo, em comparação com qualquer um ou ambos os níveis antes e depois do tratamento com a enzima. Assim, em alguns exemplos de realização a concentração de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo pode aumentar após o tratamento enzimático. Normalmente, o processo envolve uma etapa de remoção da clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo de modo que a concentração de tais produtos é inferior após o tratamento enzimático. Preferencialmente, o clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo produzido por esta etapa enzimática é removido do óleo, de tal modo que o nível final destes produtos no óleo é mais baixo do que antes do tratamento enzimático.

[0188] Por exemplo, o processo pode reduzir a concentração de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo, incluindo as formas prime e não prime dos mesmos, em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99%, em comparação com a concentração de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo (em peso) presente no óleo antes da etapa de remoção da clorofilida,feoforbídeoe/ou pirofeoforbídeo,ouseja, antes ou apóso tratamentoenzimático.Assim, em exemplosderealização específicos,a concentração de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo no óleo após a etapa de remoção pode ser inferior a 100, inferior a 50, inferior a 30, inferior a 10, inferior a 5, inferior a 1, inferior a 0,5, inferior a 0,1 mg/kg, ou inferior a 0,02 mg/kg, com base no peso total da composição (por exemplo, um óleo vegetal).

[0189] É uma vantagem do presente processo que os produtos da reação, como clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo podem ser simplesmente e facilmente removidos do óleo por uma etapa, tal como pelo tratamento ácido/neutralização cáustica. Assim, em exemplos de realização preferidos a clorofila e derivados de clorofila podem ser substancialmente removidos a partir do óleo, sem a necessidade de etapas adicionais de processamento, tais como tratamento com argila e/ou sílica e desodorização (conforme indicado pelas caixas tracejadas exibidas na Figura 50). TRATAMENTO COM ARGILA

[0190] É particularmente preferido que o processo não inclua uma etapa de tratamento com argila. Evitar o uso da argila é vantajoso pelas razões descritas anteriormente, em particular, pela redução de custos, redução das perdas de óleo por meio da aderência à argila e aumento da retenção de compostos úteis como carotenoides e tocoferol.

[0191] Em alguns exemplos de realização, o processo pode ser realizado sem a etapa de tratamento com argila e nenhuma etapa de desodorização, resultando em um aumento da concentração de tais compostos úteis no óleo refinado, em comparação com um processo que envolve o tratamento com argila. TRATAMENTO COM SÍLICA

[0192] Embora não seja sempre necessário, em alguns exemplos de realização, o processo pode compreender uma etapa de tratamento da sílica, de preferência para o tratamento subsequente da enzima. Por exemplo, o método pode compreender o uso de um dispositivo de sílica livre de adsorvente ou com pouco adsorvente e processos de refinação que são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, utilizando os processos de refinação com Sílica TriSyl (Grace Davison, Columbia, MD), ou sílicas SORBSIL R® (INEOS Silicas, Joliet, IL).

[0193] A etapa de tratamento com sílica pode ser usada para remover qualquer remanescente de clorofilida, feoforbídeo e/ou pirofeoforbídeo ou outros componentes polares no óleo. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, uma etapa de tratamento com sílica pode ser utilizada como uma alternativa para a etapa de tratamento ácido/neutralização cáustica (degomagem total ou refinação alcalina).

[0194] Em um exemplo de realização, o processo compreende um tratamento de sílica em duas fases, por exemplo, compreendendo duas etapas de tratamento de sílica separadas por uma etapa de separação na qual a sílica é removida, por exemplo, uma etapa de filtração. O tratamento de sílica pode ser realizado em alta temperatura, por exemplo, acima de cerca de 30 °C, mais preferivelmente cerca de 50 a 150 °C, cerca de 70 a 110 °C, cerca de 80 a 100 °C ou cerca de 85 a 95 °C, mais preferencialmente a uma temperatura de aproximadamente 90 °C. DESODORIZAÇÃO

[0195] Em alguns exemplos de realização, o processo pode compreender uma etapa de desodorização, tipicamente como a etapa final no processo de refinação. Em um exemplo de realização, a desodorização refere- se a destilação de vapor do óleo, que tipicamente remove o odor volátil e compostos de sabor, tocoferol, esteróis estanóis e carotenoides e outros nutrientes. Normalmente, o óleo é aquecido a 220 a 260 °C, sob baixa pressão (por exemplo 0,1 a 1 kPa), para excluir o ar. O vapor (por exemplo, 1-3% por peso) é soprado através do óleo para remover os compostos voláteis, por exemplo, durante 15 a 120 minutos. O destilado aquoso pode ser coletado.

[0196] Em outro exemplo de realização, a desodorização pode ser realizada utilizando um gás inerte (por exemplo, o nitrogênio) em vez de vapor. Assim, a etapa de desodorização pode compreender a refinação ou aspersão por borbulhamento com um gás inerte (por exemplo, nitrogênio), por exemplo, conforme descrito por Tsiadi A.V. et al. em “Nitrogen bubble refining of sunflower oil in shallow pools”, Journal of Society of the American Oil Chemists (2001), Volume 78 (4), páginas 381-385. A fase gasosa que passou através do óleo pode ser coletada e opcionalmente condensada, e/ou os compostos orgânicos voláteis extraídos dela em uma fase aquosa.

[0197] Em alguns exemplos de realização, o processo da presente invenção é realizado sem tratamento com argila, mas compreende uma etapa de desodorização. Os compostos úteis (por exemplo, carotenoides, esteróis, estanóis e tocoferol) podem ser, pelo menos parcialmente, extraídos a partir do óleo em um destilado (por exemplo, um destilado aquoso ou de nitrogênio) obtido a partir da etapa de desodorização. Este destilado fornece uma valiosa fonte de tais compostos como carotenoides e tocoferóis, que podem ser, pelo menos parcialmente, perdidos pela incorporação por arraste em um processo que compreende o tratamento com argila.

[0198] A perda de tocoferol durante o branqueamento depende das condições de branqueamento e do tipo de argila aplicada, mas foram relatadas remoções de 20-40% de tocoferol na etapa de branqueamento (K. Boki, M, Kubo, T. Wada, e T. Tamura, ibid., 69, 323 (1992)). Durante o processamento do óleo de soja foi relatado uma perda de 13% de tocoferol na etapa de branqueamento (S. Ramamurthi, A. R. McCurdy, e R. T. Tyler, em: S. S. Koseoglu, K. C. Rhee, e R. F. Wilson, eds., Proc. World Conf. Oilseed Edible Oils Process, vol. 1, AOCS Press, Champaign, Illinois, 1998, págs. 130-134).

[0199] Os carotenoides podem ser removidos a partir do óleo durante a desodorização tanto no óleo tratado com argila quanto no óleo não tratado com argila. Normalmente, a remoção de carotenoides coloridos é controlada de modo a produzir um óleo que possua uma cor pré-determinada dentro de um intervalo de valores especificados. O nível de carotenoides e outros compostos voláteis no óleo refinado pode ser variado pela modificação da etapa de desodorização. Por exemplo, em um exemplo de realização em que é desejável manter uma concentração mais elevada de carotenoides no óleo, a etapa de desodorização pode ser realizada em uma temperatura mais baixa (por exemplo, utilizando vapor a 200 °C ou menos). Em tais exemplos de realização, é particularmente preferível evitar uma etapa de tratamento com argila, uma vez que isto irá resultar em uma maior concentração de carotenoides no óleo refinado. TRATAMENTOS ENZIMÁTICOS ADICIONAIS

[0200] Em aspectos adicionais, os processos da invenção compreendem ainda a utilização de lipídios aciltransferases, fosfolipases, proteases, fosfatases, fitases, xilanases, amilases (por exemplo, α-amilases), glucanases, poligalaturonases, galatolipases, celulases, hemicelulases, pectinases e outras enzimas que degradam a parede celular de células vegetais, bem como preparações de enzimas mistas e lisados celulares. Em aspectos alternativos, os processos da invenção podem ser praticados em conjunto com outros processos, por exemplo, tratamentos enzimáticos, por exemplo, com carbohidrases, incluindo celulase, hemicelulase e outras atividades degradantes colaterais, ou processos químicos, por exemplo, a extração de hexano do óleo de soja. Em um exemplo de realização, o método da presente invenção pode ser praticado em combinação com um método tal como definido no documento WO 2006031699.

[0201] A invenção será agora adicionalmente ilustrada com referência aos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO E CLONAGEM DE CLOROFILASES

[0202] Usando diferentes abordagens (incluindo o BLAST) para a pesquisa nos bancos de dados do NCBI, diversas sequências foram identificadas como clorofilases ou sequências possuindo homologia com as clorofilases. Os nomes das sequências, a sua origem e os números de acesso no banco de dados do NCBI estão listados na Tabela 1. TABELA 1 CLOROFILASES UTILIZADAS NA PRESENTE INVENÇÃO COM NÚMEROS DE ACESSO E NOMES

SEQUÊNCIAS DAS CLOROFILASES

[0203] As sequências das clorofilases identificadas a partir das pesquisas no banco de dados do NCBI estão listadas na Tabela 1 e as sequências de aminoácidos são apresentadas nas Figuras 12 a 42 (SEQ ID NOs: 1 a 31). O alinhamento múltiplo de sequência das sequências de aminoácidos selecionadas das clorofilases mostrou diversos resíduos conservados distribuídos pelas sequências. O motivo GHSRG (SEQ ID NO: 32), contendo o sítio ativo Ser é altamente conservado. O alinhamento resultou na árvore filogenética conforme mostrado na Figura 43. CLONAGEM EM E. COLI

[0204] Os genes sintéticos que codificam as clorofilases mostradas na Tabela 1 foram preparados. Cada gene foi códon-otimizado para a expressão em E. coli. Para fins de clonagem os genes foram estendidos na extremidade 5' para conter um sítio de restrição Nhel e na extremidade 3' para conter um sítio de restrição Xhol.

[0205] Após a digestão com as enzimas de restrição Nhel e Xhol o DNA sintético foi ligado ao vetor de expressão em E. coli; pET-28a(+) (Novagen) digerido com as mesmas enzimas de restrição. Este vetor inclui um promotor T7 com um operador Lac para controlar a expressão dos genes inseridos. Os genes das clorofilases foram fundidos no quadro de leitura em um marcador His-tag e um sítio de clivagem da trombina para purificação (exemplo mostrado na Figura 4). As construções resultantes (um exemplo pET28-TRI_CHL é mostrado na Figura 5), foram transformadas em células de E. coli competentes TOP10 (Invitrogen), e os plasmídeos foram isolados a partir das colônias transformadas e submetidos ao sequenciamento de nucleotídeos para verificar a sequência correta e que todas as fusões foram conforme esperado. EXPRESSÃO EM E. COLI

[0206] Para a expressão os plasmídeos foram transformados no hospedeiro de expressão E. coli BL21 (DE3) (Novagen). As células foram cultivadas a 37 °C em meio LB contendo carbenicilina (50mg/ml) até atingirem uma OD600 de 0,6-0,8. Para a indução da cultura foi adicionado 1 mM de IPTG e incubado a 25 °C durante mais 20-24 h antes da coleta das células por centrifugação. As clorofilases recombinantes foram liberadas a partir do sedimento celular por ultrasonicação e os restos celulares forma removidos por centrifugação. CLONAGEM EM B. SUBTILIS

[0207] Para a clonagem e expressão no B. subtilis os genes sintéticos que codificam as clorofilases (Tabela 1) foram códon-otimizados para o B. subtilis. Os genes foram clonados em dois plasmídeos diferentes, um para a expressão intracelular e um para a secreção no meio de cultura (expressão extracelular). EXPRESSÃO EXTRACELULAR

[0208] Os genes foram estendidos na extremidade 5' para conter um sítio de restrição para BssHII e parte de uma sequência sinal AprE para a fusão in frame com a sequência sinal AprE, bem como uma sequência que codifica os aminoácidos A G K para facilitar a clivagem da sequência sinal. Na extremidade 3' os genes foram estendidos com um sítio de restrição para Pacl. Os genes digeridos com BssHII e PacI foram ligados no vetor de expressão para B. subtilis pBN digerido com as mesmas enzimas de restrição. O vetor pBN contém um promotor AprE e uma sequência sinal AprE. Um exemplo da fusão resultante do gene da clorofilase com a sequência sinal AprE é mostrado na Figura 6. As construções finais (um exemplo pBN-TRI_CHL é mostrado na Figura 7), foram transformadas em células de E. coli competentes TOP10 (Invitrogen), e os plasmídeos foram isolados a partir das colônias transformadas e submetidos ao sequenciamento de nucleotídeos para verificar a sequência correta e que todas as fusões foram conforme esperado.

[0209] Para a expressão os plasmídeos foram transformados no hospedeiro de expressão B. subtilis BG6002. As células foram cultivadas a 33 °C em meio de Grant II durante 68 horas. As clorofilases recombinantes foram isoladas a partir do meio de cultura após a precipitação das células por centrifugação. EXPRESSÃO INTRACELULAR

[0210] Os genes foram estendidos na extremidade 5' para conter um sítio de restrição para SpeI para permitir a fusão dos genes diretamente no promotor AprE em um vetor de expressão para B. subtilis pBN sem a sequência sinal AprE. Na extremidade 3' os genes foram estendidos com um sítio de restrição para HindlII. A fusão de um gene da clorofilase ao promotor AprE é mostrada na Figura 8. As construções resultantes (um exemplo pBN- TRI_CHL é mostrado na Figura 9), foram transformadas em células de E. coli competentes TOP10 (Invitrogen), e os plasmídeos foram isolados a partir das colônias transformadas e submetidos ao sequenciamento de nucleotídeos para verificar a sequência correta e que todas as fusões foram conforme esperado.

[0211] Para a expressão os plasmídeos foram transformados no hospedeiro de expressão B. subtilis BG6002. As células foram cultivadas a 33 °C em meio de Grant II durante 68 horas. As clorofilases recombinantes foram liberadas a partir das culturas pelo tratamento com 1 mg/mL de lisozima durante 1 h a 30 °C. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação e as clorofilases foram recuperadas a partir do sobrenadante. CLONAGEM EM S. LIVIDANS

[0212] Para a clonagem e expressão na S. lividans os genes sintéticos que codificam as clorofilases (Tabela 1) foram códon-otimizados para a S. lividans. Para os fins de clonagem os genes foram estendidos na extremidade 5' para conter um sítio de restrição Nhel e parte de uma sequência sinal Cel A para a fusão in frame com a sequência sinal Cel A. A extremidade 3' foi estendida para conter um sítio de restrição para BamHI. A fusão de um gene da clorofilase (TRI_CHL) à sequência sinal Cel A é mostrada na Figura 10. As construções resultantes (um exemplo pKB-TRI_CHL é mostrado na Figura 11), foram transformadas em células de E. coli competentes TOP10 (Invitrogen), e os plasmídeos foram isolados a partir das colônias transformadas e submetidos ao sequenciamento de nucleotídeos para verificar a sequência correta e que todas as fusões foram conforme esperado. EXPRESSÃO EM S. LIVIDANS

[0213] Para a expressão os plasmídeos foram transformados em protoplastos do hospedeiro de expressão S. lividans cepa g3s3. As células foram pré-cultivadas durante 48 horas a 30 °C em meio TSG suplementado com tiostreptona. As pré-culturas foram diluídas 10 vezes em meio de Strept Pdxn2 modificado e incubadas a 30 °C durante 96h. As clorofilases recombinantes foram isoladas a partir do meio de cultura após a precipitação das células por centrifugação. EXEMPLO 2 ATIVIDADE DE CLOROFILASES

[0214] Diversas clorofilases foram identificadas pela procura genômica conforme descrito acima e expressas em E. coli. Os extratos a partir das E. coli carregando os plasmídeos contendo o gene da clorofilase foram analisados quanto à atividade de feofitinase. O ensaio pode ser realizado conforme descrito na publicação EP10159327.5. Alternativamente a atividade de feofitinase pode ser determinada por um método conforme descrito acima, por exemplo, métodos baseados na HPLC. Os resultados são exibidos na Tabela 2.

[0215] A atividade de feofitinase pode ser determinada com base na hidrólise de uma feofitina em um tampão de reação, seguido pela medição da fluorescência do feoforbídeo a gerado. O ensaio também pode ser adaptado para empregar a pirofeofitina como substrato. 1U de atividade de enzima é definida como a hidrólise de 1 μmole de feofitina a ou pirofeofitina por minuto a 40 °C. TABELA 2 ATIVIDADE DE FEOFITINASE DE ENZIMAS

[0216] As enzimas descritas na Tabela 2 foram analisadas por western blot utilizando um anticorpo primário produzido em coelho contra TRI_CHL purificada. As Figuras 44 e 45 mostram que todas as enzimas a partir da Tabela 2 reagem com o anticorpo criado. EXEMPLO 3 HIDRÓLISE DE DERIVADOS DE CLOROFILA NOS ÓLEOS VEGETAIS

[0217] Algumas das enzimas foram testadas para a capacidade de degradar os componentes de clorofila em um sistema de óleo. A receita é exibida na Tabela 3. Óleo de colza bruto foi colocado em um vidro de Wheaton e aquecido com agitação magnética a 60 °C. Água e enzima são adicionadas. A amostra é tratada com a mistura de alto corte durante 20 segundos e incubadas a 60 °C com agitação magnética. As amostras são retiradas após 0,5, 2 e 4 horas de tempo de reação. As amostras são centrifugadas e analisadas por HPLC-MS. TABELA 3 RECEITA PARA TESTAR CLOROFILASES NO SISTEMA DE ÓLEO

[0218] Os níveis totais de feofitina a (feofitina a + a') tal como determinado pela HPLC-MS são mostrados na Fig. 46. A degradação da pirofeofitina a é mostrada na FIG. 47. Todas as cinco enzimas candidatas podem degradar a feofitina e pirofeofitina, mas especialmente a atividade sobre a pirofeofitina varia significativamente entre as cinco enzimas testadas.

[0219] Nas amostras de óleo tratadas com as clorofilases analisamos também a distribuição dos estereoisômeros feofitina a e a'. Surpreendentemente descobrimos grandes diferenças na distribuição, dependendo da enzima aplicada (vide a Figura 48). Para a BRA_CHL1 e TRI_CHL, a porcentagem de feofitina a cai para cerca da metade do nível inicial e enquanto a ARA_CHL2 e CB_CHL apresentam uma distribuição que é comparável com o controle e nível inicial. Mantendo a distribuição inicial dos estereoisômeros ao longo da reação é uma clara vantagem, pois isto significa que a velocidade de reação em geral não é dependente da epimerização de feofitina a' em a. Estes resultados também indicam que ARA_CHL2 e CB_CHL não são muito sensíveis aos grupos no C-132. Estas duas enzimas também demonstram uma atividade muito melhor sobre a pirofeofitina, que tem dois átomos de hidrogênio no C-132 (vide a Fig. 47.). ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO EM UM ENSAIO IN VITRO

[0220] As atividades relativas das enzimas referidas acima sobre a feofitina e pirofeofitina em um sistema de ensaio in vitro, por exemplo, conforme descrito na EP10159327.5, foram mensuradas. A Tabela 4 fornece a razão da atividade de feofitina em relação a de pirofeofitina. TABELA 4 RAZÃO DA ATIVIDADE DE FEOFITINA EM RELAÇÃO A PIROFEOFITINA

[0221] É evidente que a SORG_CHL tem uma atividade relativamente mais baixa sobre a pirofeofitina quando comparada com a TRI_CHL. A CB_CHL e ARA2_CHL mostram uma especificidade ao substrato diferente, que é muito melhor para a pirofeofitina. Estes resultados correlacionam-se com o que é mostrado nas Figuras 46 a 48. EXEMPLO 4 ATIVIDADE RELATIVA DE CLOROFILASES SOBRE A FEOFITINA A E A'

[0222] A dosagem de resposta das clorofilases no óleo de colza bruto foi testada de acordo com a receita na Tabela 5. TABELA 5

[0223] As amostras foram retiradas após %, 2 e 4 horas de tempo de reação e analisadas por HPLC-MS. A fim de comparar a atividade das diferentes clorofilases sobre os dois isômeros, a atividade da enzima em ambos os isômeros foi calculada em uma concentração de substrato que é a metade da concentração original. O logaritmo natural da concentração de substrato é representado em função da dosagem de enzima (unidades/g), tal como mostrado na Figura 51 para a clorofilase de Arabidopsis (ARA_CHL2).

[0224] Com base no gráfico da figura. 51, a atividade da enzima sobre a feofitina a e a' é calculada para a concentração de substrato que é metade da concentração original, tal como mostrado na Tabela 6. TABELA 6 CÁLCULO DA ATIVIDADE DA ARA-CHL2 SOBRE A FEOFITINA A E FEOFITINA A'

[0225] Com base na atividade enzimática na metade da concentração original de substrato, é possível comparar as diferentes enzimas sob as mesmas condições. Na Tabela 7 são comparados os resultados de duas clorofilases diferentes. TABELA 7 ATIVIDADE DA CLOROFILASE SOBRE OS ISÔMEROS A E A' DA FEOFITINA EM ÓLEO DE SEMENTE DE COLZA BRUTO

[0226] Os resultados na Tabela 7 indicam que a ARA_CHL2 tem quase a mesma atividade sobre os isômeros a e a' da feofitina. Isto está de acordo com as observações de que a razão entre os dois isômeros não se altera durante a degradação enzimática com ARA_CHL2 (vide a Fig. 48). Em contrapartida, a CB_CHL também mostra atividade hidrolítica significativa sobre a feofitina a'. Expresso em termos de uma razão de atividade sobre a feofitina a em relação a feofitina a' (ou seja, o inverso do que é mostrado na Tabela 7), a ARA_CHL2 tem uma razão de atividade de 1,05 e a CB_CHL tem uma razão de atividade de 2,44. CONCLUSÃO

[0227] Nós identificamos 31 sequências de clorofilase e, além disso, estas sequências foram clonadas e expressas em E. coli, B. subtilis ou S. lividans. Com base na expressão em E. coli nós detectamos atividade de feofitinase (Tabela 2), em quase metade das clorofilases identificadas e todas elas reagiram com anticorpos produzidos contra TRI_CHL (Figs. 44 e 45). Nos extratos de proteína sem atividade detectável de feofitinase não conseguimos detectar qualquer enzima clorofilase expressa com base nos ensaios de western blot utilizando anticorpos produzidos contra a TRI_CHL.

[0228] Ao testar a clorofilase candidata em aplicações de óleo encontramos grandes diferenças na especificidade para os substratos feofitina e pirofeofitina. A ARA_CHL2 e CB_CHL exibiram uma atividade muito melhor sobre a pirofeofitina quando comparadas com outras enzimas candidatas testadas (Fig. 47). Para estes dois candidatos observamos também que a razão de feofitina a em relação a a' não se alterou significativamente durante a incubação nos ensaios em óleo. Para os demais candidatos testados, observamos uma diminuição clara nessa razão durante a incubação. A atividade melhorada sobre a pirofeofitina para as enzimas ARA_CHL2 e CB_CHL no ensaio em óleo também foi mensurada no ensaio in vitro utilizando a feofitina e pirofeofitina como substratos (Tabela 4). ANÁLISE POR HPLC

[0229] Nos exemplos descritos na presente invenção os derivados de clorofila podem em geral ser quantificados por HPLC, de acordo com o seguinte método. De modo geral a análise por HPLC é realizada utilizando um método tal como descrito em “Determination of chlorophylls and carotenoids by high-performance liquid chromatography during olive lactic fermentation”, Journal of Chromatography, 585, 1991, 259-266.

[0230] A determinação de feofitina, feoforbídeo, pirofeofitina e pirofeoforbídeo é realizada por HPLC acoplada a um detector de arranjo de diodos. A coluna utilizada no método é embalada com material C18 e as clorofilas foram separadas por eluição por gradiente. Os picos são atribuídos utilizando padrões de clorofila A e B a partir da SigmaAldrich, por exemplo, com base no cromatograma de HPLC representativo do Journal of Chromatography, 585, 1991, 259-266 mostrado na Figura 49.

[0231] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são incorporadas ao presente pela referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos na presente invenção serão evidentes e óbvias para os técnicos hábeis no assunto sem se afastar do escopo e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação aos exemplos de realizações específicos preferidos, deve-se compreender que a presente invenção, conforme reivindicado, não deve ser indevidamente limitada a tais exemplos específicos. De fato, pretende-se que as várias modificações nas realizações da invenção que são óbvias para os técnicos hábeis nas áreas de bioquímica e biotecnologia ou afins, estejam inclusas no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (12)

1.PROCESSO DE TRATAMENTO DE UM ÓLEO VEGETAL, caracterizado por compreender uma etapa de contato do óleo com uma enzima, em que a enzima é capaz de hidrolisar um estereoisômero a’ ou b’ de clorofila ou um derivado de clorofila e em que a enzima é um polipeptídeo de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.

2.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo estereoisômero a’ ou b’ compreender clorofila a’, feofitina a’, clorofila b’ ou feofitina b’.

3.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela enzima ser capaz de hidrolisar um estereoisômero a’ de clorofila ou o derivado de clorofila.

4.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela enzima ter uma razão de atividade sobre (a) um estereoisômero a de clorofila ou um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero a’ de clorofila ou ao derivado de clorofila, ou (b) um estereoisômero b de clorofila ou um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero b’ de clorofila ou ao derivado de clorofila; menor do que 10.

5.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, após o tratamento com a enzima, o óleo compreender (a) pelo menos 50% de estereoisômeros a de clorofila ou do derivado de clorofila, com base na quantidade total de estereoisômeros a e a’ de clorofila ou do derivado de clorofila no óleo; ou (b) pelo menos 50% de estereoisômeros b de clorofila ou do derivado de clorofila, com base na quantidade total de estereoisômeros b e b’ de clorofila ou do derivado de clorofila no óleo.

6.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela enzima ter uma razão de atividade sobre feofitina em relação à pirofeofitina menor do que 10.

7.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela enzima compreender uma atividade de clorofilase, feofitinase e/ou pirofeofitinase.

8.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela enzima ser derivada de Ricinus communis.

9.USO DE UMA ENZIMA, que é capaz de hidrolisar clorofila ou um derivado de clorofila, caracterizado por ser para a remoção de um estereoisômero a’ ou b’ de clorofila ou do derivado de clorofila a partir de um óleo vegetal, em que a enzima possui uma atividade hidrolítica de pelo menos 1000 U/g, com base nas unidades de atividade por grama da enzima purificada, em um estereoisômero prime de clorofila ou um derivado de clorofila, e em que uma unidade de atividade de enzima é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa um micromol de substrato por minuto a 40°C, em que o ensaio para medir atividade hidrolítica é conforme a seguir: a)170 μL de HEPES 50 mM, pH 7,0, são adicionados a 20 μL de clorofila, feofitina ou pirofeofitina a 0,3 mM dissolvida em acetona; b)a enzima é dissolvida em 50 mM de HEPES, pH 7,0; c)10 μL de solução de enzima são adicionados a 190 μL de solução de substrato para iniciar a reação e a incubação é realizada a 40°C durante diversos intervalos de tempo; d)a reação é parada pela adição de 350 μL de acetona; e)após a centrifugação por 2 minutos a 18.000 g, o sobrenadante é analisado por HPLC, e as quantidades de (i) clorofila e clorofilida; (ii) feofitina e feoforbídeo ou (iii) pirofeofitina e pirofeoforbídeo são determinadas; em que a enzima é um polipeptídeo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:13.

10.USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela enzima ter uma razão de atividade sobre (a) um estereoisômero a de clorofila ou um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero a’ de clorofila ou ao derivado de clorofila; ou (b) um estereoisômero b de clorofila ou um derivado de clorofila em relação a um estereoisômero b’ de clorofila ou ao derivado de clorofila; menor do que 10.

11.USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pela enzima ter uma razão de atividade sobre feofitina em relação a pirofeofitina menor do que 10.

12.USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo estereoisômero a’ ou b’ compreender clorofila a’, feofitina a’, clorofila b’ ou feofitina b’.

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