CN103459606B - 加工方法 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明提供了用于处理植物油的方法，包括使所述油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a’或b’立体异构体。

Description

加工方法
技术领域
本发明涉及对植物性食品和饲料产品、尤其是植物油的工业加工。本发明可以用于减少或消除由叶绿素和叶绿素衍生物所致的污染。
背景技术
叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有明显量的叶绿素。
例如，源自含油种子(例如大豆、棕榈或油菜种子(卡诺拉油菜)、棉籽)的植物油和花生油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高水平的叶绿素色素。这是因为叶绿素赋予难看的绿色，并且可能在储存期间引起油的氧化，导致油变质。
已经采用各种方法旨在从植物油除去叶绿素。叶绿素可以在产油过程的多个阶段(包括种子破碎、油提取、脱胶、碱处理和漂白步骤)除去。然而，漂白步骤通常对于降低叶绿素残留物至可接受水平是最有效的。在漂白期间，将油加热并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。漂白步骤中所用的吸附剂通常为粘土。
在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素水平降至0.02至0.05ppm之间。然而，漂白步骤因漂白粘土的夹带作用而增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能从油中除去许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)。另外粘土的使用也昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，并且因而处理成本高。因而已进行了通过其他手段从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。
在植物中，认为叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。WO2006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水提取法或二氧化硅处理除去。
叶绿素通常在用于油生产的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为镁离子从卟啉(二氢卟酚)环丢失以形成称作脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。高极性镁离子从卟啉环中丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，并且可通过与针对叶绿素所用的类似方法从油中除去，例如WO2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可以因镁离子从脱植基叶绿素丢失(即叶绿素水解之后)而生成(参见图1)。WO2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。
脱镁叶绿素还可能因含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者因精制油期间的加工条件(即热)而进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of ChlorophyllDerivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS，Vol，no.9(Sept.1993)pages837-841(“芥花油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学家协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素的碳环上甲酯键的酶促水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶促转化。据报道，来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够对脱镁叶绿酸催化类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图1)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低的水溶解度和增加的油溶解度。
取决于加工条件，焦脱镁叶绿素可能在加工期间在植物油中比脱镁叶绿素和叶绿素二者更丰富(参见Table9in volume2.2.of Bailey’s Industrial Oil and FatProducts(2005)，6th edition，Ed.by Fereidoon Shahidi，John Wiley&Sons(由FereidoonShahidi编辑、约翰威立父子出版公司于2005年出版的《贝雷工业油脂产品》，第6版，第2.2.卷的表9))。这部分地因为在植物材料收获和储存期间镁从叶绿素丢失。如果使用在90℃或更高温度延长的热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能增加并且可能高于脱镁叶绿素的量。也通过压榨和提取之前加热含油种子以及精制过程期间油脱胶和碱处理来降低叶绿素水平。还观察到油中的磷脂可以与镁络合并因而减少叶绿素的量。因而与许多植物油中的焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对微量的污染物。
四种叶绿素衍生物(叶绿素a和b以及脱镁叶绿素a和b)中的每一个均以一对差向异构体的方式存在，所述差向异构体由碳原子编号132(根据IUPAC系统编号，在图2中用星号标出)周围的H和COOCH3的立体结构决定。因此，叶绿素a以叶绿素a和叶绿素a′的差向异构体对存在，并且叶绿素b包含b和b′形式。同样地，脱镁叶绿素a包含差向异构体a和a对，并且脱镁叶绿素b包含b和b′形式。撇号(′)形式具有围绕碳132原子的S-立体结构，而非撇号形式具有围绕碳132原子的R-立体结构。差向异构化，例如，从a形式转变成a′形式并且反之亦然，在某些情况下可以通过常见烯醇而发生，如“Epimerization in the pheophytin a/a′system”，Chemistry letters(1984)，1411-1414(“脱镁叶绿素a/a′体系中的差向异构化作用”，《化学快报》，1984年，第1411-1414页)中所描述。在溶液中，通常存在指示撇形式和非撇形式叶绿素化合物的分布的平衡状态，并且这经常由物理参数诸如温度、pH、溶剂等决定。
一般来说，酶通常因仅对一种立体异构体具有活性而充当立体特异性催化剂。前面的分析表明叶绿素酶具有高度的立体特异性，仅催化非撇形式的叶绿素化合物水解(参见“The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase”J.Biol.Chem.267(31)：22043-22047(1992)(“叶绿素和叶绿素酶之间的立体特异性相互作用”，《生物化学杂志》，第267卷第31期，第22043-22047页，1992年))。
在采用叶绿素酶相关酶从植物油中移除叶绿素和叶绿素衍生物的方法中，酶的立体特异性可能带来麻烦。具体地讲，根据油中叶绿素立体异构体的分配和平衡状态，完全降解叶绿素组分可能是非常困难的。例如，如果明显比例的叶绿素或叶绿素衍生物以撇形式存在，那么油中存在的这部分叶绿素衍生物可能抵抗酶促降解。此外，多种酶对焦脱镁叶绿素显示出比例如对脱镁叶绿素低得多的活性。
伴随现有方法的这个问题在图3中示出。图3显示脱镁叶绿素a的差向异构化作用以及向焦脱镁叶绿素的转化。水/粗制植物油混合物(如包含约1-2％的水)的pH在约60℃通常为约5.0。在此类条件下，粗制大豆油或菜籽油中脱镁叶绿素a的差向异构体分布通常为约70％脱镁叶绿素a(R-立体异构体)和30％脱镁叶绿素a′(S-立体异构体)，并且这两种差向异构体之间的异构化缓慢。此外，根据反应条件，可以形成可变量的焦脱镁叶绿素。如果反应中所用的酶仅对脱镁叶绿素a优势地有活性，则油中存在的明显比例的叶绿素衍生物不能在pH未调整时由酶直接水解。
因此需要从植物油中除去叶绿素和叶绿素衍生物(诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)的改进方法。具体地讲，需要增墙从油中移除各种形式的叶绿素和叶绿素衍生物的方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于处理植物油的方法，包括使植物油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a′或b′立体异构体。
在一个实施例中，a′或b′立体异构体包括叶绿素a′、脱镁叶绿素a′、叶绿素b′或脱镁叶绿素b′。优选的立体异构体为叶绿素或叶绿素衍生物的a′立体异构体，如叶绿素a′或脱镁叶绿素a′。
在一个实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的a′立体异构体相比，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的a立体异构体具有小于10、小于5或小于2的活性比率。在一个可供选择的实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的b′立体异构体相比，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的b立体异构体具有小于10、小于5或小于2的活性比率。
在一个实施例中，用酶处理后，所述油包含按油中叶绿素或叶绿素衍生物的a和a′立体异构体的总量，至少50％的叶绿素或叶绿素衍生物的a立体异构体。在一个可供选择的实施例中，用酶处理后，所述油包含按油中的叶绿素或叶绿素衍生物的b和b′立体异构体的总量，至少50％的叶绿素或叶绿素衍生物的b立体异构体。
在另外的实施例中，与焦脱镁叶绿素相比，该酶对脱镁叶绿素具有小于10、小于8或小于5的活性比率。
在另外的实施例中，该酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性，即对叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素的水解活性。
在另外的实施例中，该酶衍生自拟南芥(Arabidopsis thaliana)或蓖麻(Ricinuscommunis)。例如，所述酶可以包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13中所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体。
优选地，该酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13在至少50个氨基酸残基范围内具有至少75％的序列同一性的多肽序列。在一个实施例中，该酶包含与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的多肽。在另一个实施例中，该酶包含与SEQ ID NO：13具有至少90％序列同一性的多肽。
在另外的方面，本发明提供了可根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的植物油。
在另外的方面，本发明提供了能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶从植物油中除去叶绿素或叶绿素衍生物的a′或b′立体异构体的用途。
如本文所述，已鉴定到令人惊讶地对撇形式以及非撇形式叶绿素衍生物显示水解活性的酶。此外，与已知方法中所用的酶相比，此类酶还可以显示对焦脱镁叶绿素增强的水解活性。此类酶能够有利地用来增强从植物油移除各种形式的叶绿素衍生物。
附图说明
图1显示涉及本发明中所用的叶绿素和衍生物以及酶的反应。
图2显示脱镁叶绿素a，其中根据IUPAC编号系统用星号标出C-132。
图3显示脱镁叶绿素a分子的差向异构化作用以及向焦脱镁叶绿素a的转化。
图4显示氨基酸序列和核苷酸序列，所述序列显示叶绿素酶基因与组氨酸标签和凝血酶位点融合。
图5显示大肠杆菌(E.coli.)表达载体pET28-TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦(Triticum aestivum)的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
图6显示了显示叶绿素酶基因与AprE信号序列和AGK序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图7显示枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达载体pBN-TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
图8显示了显示叶绿素酶基因与AprE启动子直接融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图9显示枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达载体pBN-Spe-TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
图10显示了显示叶绿素酶基因与Cel A信号序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图11显示变铅青链霉菌(S.lividans)表达载体pKB-TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
图12显示拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图13显示拟南芥叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图14显示甜橙(Citrus sinensis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图15显示普通小麦叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图16显示普通小麦叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图17显示甘蓝(Brassica oleracea)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图18显示甘蓝叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图19显示甘蓝叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图20显示玉蜀黍(Zea Mays)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
图21显示玉蜀黍叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图22显示毛竹(Phyllostachys edulis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。
图23显示藜叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。
图24显示蓖麻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
图25显示大豆(Glycine max)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。
图26显示银杏(Ginkgo biloba)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
图27显示发财树(Pachira macrocarpa)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
图28显示毛果杨(Populus trichocarpa)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
图29显示高梁(Sorghum bicolor)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。
图30显示高粱叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图31显示葡萄(Vitis vinifera)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。
图32显示小立碗藓(Physcomitrella patens)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：21)。
图33显示耧斗菜(Aquilegia)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。
图34显示二穗短柄草(Brachypodium distachyon)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQID NO：23)。
图35显示蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。
图36显示蒌叶(Piper betle)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。
图37显示百脉根(Lotus japonicus)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图38显示籼稻(Oryza sativa Indica)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图39显示粳稻(Oryza sativa Japonica)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。
图40显示粳稻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图41显示北美云杉(Picea sitchensis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图42显示衣藻(Chlamydomonas)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图43显示植物叶绿素酶以及本文所述的衣藻叶绿素酶(CHL_CHL)的系谱树。
图44显示含有衍生自各种物种的重组叶绿素酶的大肠杆菌提取物的蛋白质印迹分析。泳道1：BAM_CHL CoRe112。泳道2：CIT_CHLCoRe113A。泳道3：ARA_CHL CoRe114A。泳道4：CB_CHL CoRe127。泳道5：GlyMax_CHL CoRe133。泳道6：Sor_CHL CoRe134。泳道7：ARA_CHL2CoRe135。泳道8：BRA_CHL1CoRe136。与上述缩写相对应的酶的源物种的定义参见下表1和表2。
图45显示含有衍生自各种物种的重组叶绿素酶的大肠杆菌提取物的蛋白质印迹分析。泳道1：SORG_CHL CoRe137A。泳道2：TRI_CHL2CoRe138A。泳道3：ZEA_CHL2CoRe139。泳道4：TRI_CHL CoRe20。泳道5：BRACH_CHL CoRe156。泳道6：PIP_CHL CoRe158。泳道7：PICEA_CHL CoRe163。泳道8：载体对照。与上述缩写相对应的酶的源物种的定义参见下表1和表2。
图46显示衍生自各种物种的重组酶对脱镁叶绿素a的活性，如用每种酶处理后在各时间点处以ppm计的总脱镁叶绿素a(脱镁叶绿素a+a′)水平表示。
图47显示衍生自各种物种的重组酶对脱镁叶绿素a的活性，如用每种酶处理后在各时间点处以ppm计的焦脱镁叶绿素a水平表示。
图48显示基于处理后油样品中脱镁叶绿素a和脱镁叶绿素a′立体异构体的总量计，用衍生自各种物种的重组酶处理后油样品中脱镁叶绿素的a立体异构体的百分比。
图49显示使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，指示与如下物质相关的峰编号：1＝脱植基叶绿素b；2＝脱植基叶绿素a；3＝新叶黄素；3’＝新叶黄素异构体；4＝新色素；5＝紫黄素；6＝黄体呋喃素；7＝玉米黄二呋喃素；8＝花黄素；8’＝花黄素异构体；9＝玉米黄呋喃素；10＝叶黄素；10′＝叶黄素异构体；10″＝叶黄素异构体；11＝脱镁叶绿酸b；12＝脱镁叶绿酸a；13＝叶绿素b；13′＝叶绿素b’；14＝叶绿素a；14′＝叶绿素a’；15＝脱镁叶绿素b；15′＝脱镁叶绿素b’；16＝β-胡萝卜素；17＝脱镁叶绿素a；17′＝脱镁叶绿素a’；18＝焦脱镁叶绿素b；19＝焦脱镁叶绿素a。
图50显示根据本发明的一个实施例的精制油方法的图示。
图51显示脱镁叶绿酸a和a’的底物浓度的对数在1/2小时后随ARA_CHL2(拟南芥叶绿素酶)剂量的变化。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及处理植物油的方法。通常，例如在叶绿素和/或叶绿素衍生物作为污染物存在的情况下，使用该方法从油中除去叶绿素和/或叶绿素衍生物，或者降低油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的水平。
叶绿素和叶绿素衍生物
所谓“叶绿素衍生物”通常意指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为分子中存在卟啉(二氢卟酚)环。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素在颜色上比叶绿素更呈偏褐色。因而油中叶绿素和叶绿素衍生物的存在，可以给予这种油难看的绿色、淡绿色或褐色。在一个实施例中，可以进行本方法以除去或降低油中存在的绿色或褐色。因此，本方法可称为漂白或脱色方法。
该方法中所用的酶可以水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾巴。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素则呈红棕色。在一些实施例中，也可能期望除去这些不含叶绿醇的衍生物以及降低油的绿色/红色/褐色。因此，在本发明的一个实施例中，该方法还可包括除去或降低油中不含叶绿醇的叶绿素衍生物水平的步骤。该方法可以涉及漂白或脱色以除去油的绿色和/或红色/褐色。
叶绿素或叶绿素衍生物可以为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。以类似方式，当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素时，覆盖a和b形式。
如本文所述，叶绿素和叶绿素衍生物可以作为一对差向异构体存在，所述差向异构体由碳原子编号132(根据IUPAC系统编号，在图2中用星号标出)周围的立体化学决定。因此，叶绿素a以叶绿素a和叶绿素a′的差向异构体对存在，并且叶绿素b包含b和b′形式。脱镁叶绿素a包括差向异构体a和a′，并且脱镁叶绿素b包括b和b′形式。撇号(′)形式具有围绕碳132原子的S-立体结构，而非撇号形式具有围绕碳132原子的R-立体结构。当在本文中普遍使用时，术语“叶绿素和叶绿素衍生物”包括撇形式和非撇形式两者。
植物油
可以根据本方法处理任何植物油，以除去由叶绿素和/或叶绿素衍生物引起的不期望的污染。油可以来自任何类型的植物，以及来自植物的任何部分，包括整株植物、叶、茎、花、根、植物原生质体、种子和植物细胞及其相同后代。可以本发明方法处理的产品的来源植物种类包括高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。它包括多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子状态。
在优选的实施例中，油可以包括植物油，包括从含油种子或含油果实加工的油(例如，诸如卡诺拉(油菜籽)油的种子油以及诸如棕榈油的果油)。合适的油的例子包括米糠、大豆、卡诺拉油菜(油菜籽)、棕榈、橄榄、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻、辣木或向日葵。本发明的方法可结合加工精油(例如来自果实种子油，例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些)的方法使用。本发明的方法可结合加工高磷油(例如大豆油)的方法使用。优选地，所述的油为粗制植物油。
油中的叶绿素和叶绿素衍生物
叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以作为污染物在油中，或作为加工产品中不期望的组分天然存。叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以在油中以任何水平存中。通常，叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以作为天然污染物在油中以基于油的总重量计0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)的浓度存在。在另一些实施例中，叶绿素和/或叶绿素衍生物可以在油中以基于油的总重量计0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg的浓度存在。
不含叶绿醇的叶绿素衍生物也可以存在于油中。例如，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以在油中以任何水平存在。通常，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素在根据本发明方法采用酶处理前或处理后可以在油中以基于油的总重量计0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)的浓度存在。在另一些实施例中，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以在组合物中以基于组合物的总重量计0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg的浓度存在。
水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶
本发明的方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物、特别是它们的撇形式立体异构体(如a′或b′)的酶接触的步骤。通常，“水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键，例如裂解叶绿素或叶绿素衍生物中来自二氢卟酚环的叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地也在水相中具有酯酶或水解酶活性。
因而该酶可以是例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。在另一些实施例中，两种或更多种酶可以用于该方法中，每种酶具有不同的底物特异性。例如，该方法可以包括选自叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶的两种或三种酶的组合使用。
任何具有能够水解叶绿素或叶绿素衍生物(尤其是它们的撇形式立体异构体)的活性的多肽可以用作本发明过程中的酶。所谓“酶”，旨在涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式立体异构体(如a′或b′)具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。可以使用任何分离的、重组的或合成的或嵌合的(或合成和重组的组合)多肽。
在本发明的实施例中，该酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a′或b′立体异构体。也就是说，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的撇(′)形式具有水解活性。所述撇(′)标号指的是叶绿素或叶绿素衍生物中碳原子编号132周围的立体结构。
因此，本发明的实施例中可以被水解的叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式包括叶绿素a′、叶绿素b′、脱镁叶绿素a′和脱镁叶绿素b′。优选地，所述酶能够水解a类叶绿素衍生物的至少撇形式，即叶绿素a′或脱镁叶绿素a′。
通常，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式也具有水解活性。本发明中所用的酶可能具有降低的立体特异性，即，本文所用的酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式的特异性低于其他已知的叶绿素酶(例如普通小麦叶绿素酶，参见SEQ ID NO：4)。
在一个实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式(如a′或b′)立体异构体，该酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式(如a或b)立体异构体具有小于100的活性比率。优选地，该活性比率小于50、小于10、小于5、小于3、小于2、小于1.5、小于1或小于0.5。所谓“活性比率”，意指在相同条件下，与非撇形式相比，酶对撇形式的相对活性。因此，活性比率可以通过测定(a)酶对非撇形式立体异构体的水解活性，以及(b)酶对相应撇形式立体异构体的水解活性，再将(a)除以(b)来确定。因此，低的活性比率表明对撇形式的活性相对较高。
水解活性可以例如使用下述方法来确定。通常，活性比率可以在不支持差向异构化(即在撇形式和非撇形式异构体之间转变)的条件下确定。例如，活性比率可以通过测量在pH为5.0至5.5的条件下在含有大于0.5ppm的脱镁叶绿素、约2％的水的原油中对撇形式和非撇形式异构体的水解活性来确定。在一个实施例中，酶对脱镁叶绿素a或脱镁叶绿素a’的水解活性在初始底物浓度的一半处进行计算(参见如实例4)。
在另一个实施例中，与焦脱镁叶绿素相比，该酶对脱镁叶绿素具有小于80、小于50、小于10、小于8、小于7或小于5的活性比率。例如，该酶可能具有0.1至10、1至10或1至5的脱镁叶绿素酶对焦脱镁叶绿素酶的活性比率。可以通过使用下述方法测定相同条件下的脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性，并用脱镁叶绿素酶活性除以焦脱镁叶绿素酶活性，由此计算出脱镁叶绿素酶对焦脱镁叶绿素酶的活性比率。上述比率范围内的活性比率可以针对脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的相应种类，如脱镁叶绿素a(包括a和a形式)对焦脱镁叶绿素a来确定。
酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定
可以使用任何合适的分析技术，例如基于本文所述的测定法来检测对叶绿素或叶绿素衍生物(包括它们的撇形式和非撇形式)的水解活性。例如，可以使用基于荧光的技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将待测试其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在底物存在的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物水平。合适的底物包括如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素，包括它们的a和b以及撇形式和非撇形式。可以检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿素和/或叶绿醇。
用于检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解的测定方法在例如以下文献中公开：AliKhamessan et al.(1994)，Journal of Chemical Technology&Biotechnology，60(1)，pages73-81(Ali Khamessan等人，1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷第1期，第73-81页)；Klein and Vishniac(1961)，J.Biol.Chem.236：2544-2547(Klein和Vishniac，1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页)；以及Kiani et al.(2006)，Analytical Biochemistry353：93-98(Kiani等人，2006年，《分析生物化学》，第353卷，第93-98页)。
作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入某种酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，测定法可以按Hornero-Mendez et al.(2005)，Food Research International38(8-9)：1067-1072(Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8-9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可以使用以下测定法：
向pH7.0的170μl mM HEPES中添加溶解于丙酮中的20μl0.3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于pH7.0的50mM HEPES中。将10μl酶溶液添加到190μl底物溶液以引发反应，并在40℃温育各种时间段。通过添加350μl丙酮终止反应。离心(在18,000g下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(ii)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的量。可以通过HPLC分析区分叶绿素和叶绿素衍生物的撇形式和非撇形式，如图49中所示。
将1单位酶活性定义为例如采用本文所述的测定方法，在40℃每分钟水解1微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。
在一些优选的实施例中，基于例如通过本文所述测定方法确定的每克纯化酶的活性单位计，本方法中所用的酶具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。优选地，基于每克纯化酶的活性单位计，所述酶具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或至少50000U/g的对叶绿素或叶绿素衍生物(如，叶绿素a′、叶绿素b′、脱镁叶绿素a′或脱镁叶绿素b′)的撇形式(如a′或b′)立体异构体的水解活性。
在一个另外的实施例中，对叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性可以使用如EP10159327.5中所述的方法确定。
叶绿素酶
在一个实施例中，该酶能够水解叶绿素的至少一种撇形式(如a′或b′)立体异构体。也可以在本方法中使用催化叶绿素a′或b′酯键的水解从而生成脱植基叶绿素a′或b′和叶绿醇的多肽。在一个实施例中，该酶是采用酶命名分类法(E.C.3.1.1.14)进行分类的叶绿素酶。可使用分离的、重组的或合成的或嵌合的(合成和重组的组合)多肽(例如酶或催化性抗体)，参见例如Marchler-Bauer(2003)Nucleic Acids Res.31：383-387(Marchler-Bauer，2003年，《核酸研究》，第31卷，第383-387页)。
在一个实施例中，该酶可以衍生自拟南芥。例如，该酶可以是包含SEQ ID NO：2的序列(参见图13)的多肽。
在另一个实施例中，叶绿素酶衍生自蓖麻子，如衍生自蓖麻。例如，叶绿素酶可以是包含SEQ ID NO：13序列(参见图24)的多肽。
本文还提供包含如SEQ ID NO：1至31中任一者定义的多肽序列、以及它们的功能性片段和变体的酶，如下所述。
变体和片段
水解叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式的已知序列的功能性变体和片段也可用于本发明。所谓“功能性”，是指所述片段或变体保留着对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式(如a′或b′)立体异构体的可检测水解活性。通常，此类变体和片段显示与来源叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列具有同源性，例如与来源叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶氨基酸序列，如与SEQ ID：2或SEQ ID NO：13，如在序列的至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个残基的区域范围内或在整个长度范围内具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
序列同一性的百分比可以用序列比较算法分析或通过肉眼检查确定。在一个方面，序列比较算法是BLAST算法，例如BLAST2.2.2版算法。
其他适用于本发明方法的对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式具有活性的酶，可以通过确定存在于例如已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列中的保守序列基序的存在性来鉴定。例如，包含丝氨酸活性位点的基序GHSRG(SEQ ID NO：32)在叶绿素酶序列中是高度保守的。在一些实施例中，本发明中使用的酶可以包含这种序列。具有合适活性的多肽序列可以通过搜索基因组数据库，例如微生物组宏基因组数据库(美国能源部联合基因组研究所(JGI-DOE，USA))中这些基序的存在来鉴定。
酶的分离和制备
适用于本发明的酶可以从它们的天然来源分离，或可以例如使用重组DNA技术制备。编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列可以分离或构建并且用于产生相应的多肽。
例如，可以使用来自产生该多肽的生物的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该多肽的氨基酸序列已知，则可以合成标记的寡核苷酸探针，并且将它用来鉴定来自从该生物制备的基因组库中的编码多肽的克隆(polypeptide-encodingclone)。或者，可以使用含有与另一个已知多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
或者，可以通过以下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化的细菌接种到含有被该多肽抑制的酶的琼脂上，从而导致鉴定表达该多肽的克隆。
在又一个另选方案中，编码该多肽的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如Beucage S.L.et al(1981)Tetrahedron Letters22，p1859-1869(Beucage S.L.等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所描述的亚磷酰胺方法，或Mattheset al(1984)EMBO J.3，p801-805(Matthes等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、复性、连接并克隆入适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US4,683,202或Saiki R K等人(Science(1988)239，pp487-491)(《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)所描述。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以来自基因组或者来自合成或者来自重组，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。
通常，编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可供选择的实施例中，可以使用本领域熟知的化学方法合成该核苷酸序列的全部或部分(参见Caruthers MH et al(1980)NucAcids Res Symp Ser215-23(Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第215-223页)和Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232(Horn T等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第225-232页))。
酶序列的修饰
一旦已经分离出编码酶的核苷酸序列，或者鉴定到推定性编码酶核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要突变该序列以制备本发明的酶。
可以使用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有分布所需突变位点旁侧的核苷酸序列。合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology(1984)2，p646-649(《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页))中公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151(《分析生物化学》，1989年，第180卷，第147-151页))中描述。
可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒，随机地引入突变，而不是如上所述进行定点诱变。EP0583265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(诸如EP0866796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适用于产生水解叶绿素和/或叶绿素衍生物的具有优选特性的酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新序列的第三种方法是，用任何数目的限制性内切核酸酶或者诸如DNA酶I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，并且然后重新组装出编码功能蛋白的完整核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列并在完整核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适用于产生具有优选特性的酶变体。进行“改组”的合适方法可以在EP0752008、EP1138763、EP1103606中找到。也可以将改组与其他形式的DNA诱变组合，如US6,180,406和WO01/34835中所描述。
因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列产生多个定点突变或随机突变，并且随后通过各种方法筛选所编码多肽的改进功能性。例如，采用计算机和离体介导的(insilico and exo mediated)重组方法(参见WO00/58517、US6,344,328、US6,361,974)，可以进行分子进化，其中所产生的变体保留与已知酶或蛋白质的非常低的同源性。由此获得的此类变体可以与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。
另外，作为一个非限制性例子，可以将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体重组，以产生新变体。也可以针对所编码的多肽的改善功能性筛选这种新变体。
上述的和类似的分子进化方法的应用，允许在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定并选择具有优选特性的本发明酶的变体，并允许产生不可预测但有利的突变或变体。在本领域中存在将分子进化用于优化或改变酶活性的许多例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种：优化宿主细胞中或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或减少酶或结构稳定性、优选环境条件(如温度、pH、底物)下改变的酶活性/特异性。
本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可以改变酶以改进其功能性。合适地，编码用于本发明的酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的核苷酸序列可以编码变体酶，即与亲本酶比较时，变体酶可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入。变体酶保留与亲本酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的同一性。合适的亲本酶可以包括对叶绿素和/或叶绿素衍生物的撇形式具有水解活性的任何酶。
多肽序列
本发明还涵盖由核苷酸序列编码的氨基酸序列的用途，所述核苷酸序列编码用于本发明方法和/或用途的任一者中的酶。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”同义。氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或可以合成制备或可以使用重组DNA技术制备。合适地，氨基酸序列可通过标准的技术从本文教导的分离多肽获得。
一种从分离的多肽确定氨基酸序列的合适方法如下。可以将纯化的多肽冷冻干燥，并可将100μg的冷冻干燥材料溶解于50μl的8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH8.4)的混合物中。可将溶解的蛋白质变性，并在覆盖氮气和加入5μl的45mM二硫苏糖醇后在50℃还原15分钟。冷却到室温后，可以加入5μl的100mM碘代乙酰胺，以让半胱氨酸残基在氮气下在暗处于室温衍生化15分钟。
可以向以上反应混合物加入135μl水和溶于5μl水的5μg内切蛋白酶Lys-C，然后可在氮气、37℃进行消化24小时。所得的多肽可以在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；美国加利福尼亚州分离集团(TheSeparation Group，California，USA))上使用溶剂A：溶于水的0.1％TFA和溶剂B：溶于乙腈的0.1％TFA通过反相HPLC分离。可以在N末端测序前，将选定的肽在Develosil C18上用相同的溶剂体系再进行色谱分离。可以根据厂商说明书(美国加利福尼亚州应用生物系统公司(Applied Biosystems，California，USA))使用AppliedBiosystems476A测序仪，采用脉冲液体快速循环进行测序。
序列比较
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应能提供和/或编码保留着功能活性和/或增强酶活性的多肽。
在本说明书的语境中，同源序列意在包括这样的氨基酸序列，其可以与主题序列具有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在本说明书的语境中，同源序列意在包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。可以对连续序列计算％同源性，即一个序列与其他序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与其他序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，将大多数序列比较方法设计产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每一个空位赋予“空位罚分”，从而对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对该空位中每一个后续残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI AdvanceTM11(英杰公司(InvitrogenCorp.))。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)：BLAST软件包(参见Ausubelet al1999Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter18(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))和FASTA(Altschul etal1990J.Mol.Biol.403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999年，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，使用Vector NTI AdvanceTM11程序是优选的。称为BLAST2Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett1999174(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)和FEMSMicrobiol Lett1999177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页))。
尽管最终的同源性百分数(％)也可以就同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用VectorNTI AdvanceTM11程序包的默认值。
作为另外一种选择，同源性百分数可用Vector NTI AdvanceTM11(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多重比对特征来计算，该特征基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene73(1)，237-244(Higgins DG和Sharp PM，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244页))的算法。一旦该软件已经产生最佳比对结果，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。
如果确定序列同一性时使用空位罚分，则可优选地使用程序的默认参数于成对比对。例如，以下参数是BLAST2成对比对的当前默认参数：
在一个实施例中，优选地核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可以通过BLAST2(blastn)使用如上定义的评分参数设置确定。
出于本发明的目的，同一性的程度是基于相同的序列元件的数目。根据本发明氨基酸序列的同一性程度可合适地通过本领域已知的计算机程序例如Vector NTIAdvanceTM11(英杰公司(Invitrogen Corp.))确定。对于成对比对，所使用的评分参数优选地为BLOSUM62，其中空位存在罚分为11，空位延伸罚分为1。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸上测定。合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
氨基酸突变
序列还可以具有氨基酸残基的插入或置换，所述插入或置换产生沉默改变和导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。
可以例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可以彼此置换：
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代均用来指将现有的氨基酸残基用另选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。置换还可以由非天然氨基酸产生。
变体氨基酸序列可以包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371(Simon RJ等人，《美国国家科学院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371页)和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134(Horwell DC，《生物技术趋势》，1995年，第13卷第4期，第132-134页)。
核苷酸序列
用于在本发明中的核苷酸序列或者编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，可以在其中包含合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以提高核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但处于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可以获得植物细胞中存在的其他病毒/细菌或细胞同源物，特别是细胞同源物，此类同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。此类序列可以通过如下方式获得：探测从其他植物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并且在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针探测此类文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用下述引物，所述引物设计成靶向变体和同源物内部编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。
作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。为了引入限制多肽识别位点，或者为了改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能，可能需要其他的序列改变。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用来产生引物(例如PCR引物)、用于可变扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可以将该多核苷酸克隆入载体中。这类引物、探针和其他片段将具有至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸长度，并且也被本文所用的术语“本发明的多核苷酸”涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及到制备在需要克隆的酶序列区域旁侧分布的一对引物(例如约15至30个核苷酸的引物)，使引物与从植物细胞获得的mRNA或cDNA接触，在导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物来分离)并且回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
酶的配制和剂量
本发明方法中所用的酶可以进行配制或改性，例如化学改性，以提高油溶解度、稳定性、活性或用于固定。例如，本发明方法中所用的酶可以配制为两亲或更亲脂的。例如，本发明方法中所用的酶可以包埋在例如脂质体或凝胶，如藻酸盐水凝胶或藻酸盐微珠或等同物中。本发明方法中所用的酶可以在胶束体系，例如三元胶束(TMS)或反胶束体系(RMS)介质中配制。本发明方法中所用的酶可以如Yi(2002)J.of Molecular Catalysis B：Enzymatic，Vol.19，pgs319-325(Yi，2002年，《分子催化杂志，B辑：酶催化》，第19卷，第319-325页)中所述进行配制。
本发明方法的酶反应，如使油接触能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式(如a′或b′)立体异构体的酶的步骤，可以在一个反应容器或多个反应容器中完成。在一个方面，本发明方法的酶促反应在植物油精制设备或工厂中进行。
本发明的方法可以用固定化酶实施，例如固定化叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶。该酶可以固定在任何有机或无机载体上。示例性无机载体包括氧化铝、硅藻土、Dowex-1-氯化物、玻璃微珠和硅胶。示例性有机载体包括DEAE-纤维素、藻酸盐水凝胶或藻酸盐微珠或等同物。在本发明的各个方面，酶的固定化可以通过物理吸附于无机载体上而优化。用于实施本发明的酶可固定在不同的介质中，包括水、Tris-HCl缓冲溶液以及包含Tris-HCl缓冲溶液、己烷和表面活性剂的三元胶束体系。可以将酶固定至任何类型的基底，例如过滤器、纤维、柱、微珠、胶体、凝胶、水凝胶、网片等等。
酶可以按任何合适的量加入油中。例如，酶可以按约0.001至10U/g组合物，优选地0.01至1U/g，例如0.01至0.1U/g油的范围加入。将1个单位定义为如在J.Biol.Chem.(1961)236：2544-2547(《生物化学杂志》，1961年，第236卷，第2544-2547页)中所述的测定条件下，在40℃每分钟水解1μmol底物(如叶绿素a或b、脱镁叶绿素a或b和/或焦脱镁叶绿素a或b、或它们的撇形式(如a′或b′)立体异构体)的酶量。
酶反应条件
通常，油可以与酶在约5℃至约100℃之间，更优选地在10℃至约90℃之间，更优选地在约15℃至约80℃之间，更优选地在约20℃至约75℃之间温育(或混合)。
脱镁叶绿素在高温下分解为焦脱镁叶绿素，这通常是较不优选的，因为与脱镁叶绿素相比，一些叶绿素酶对焦脱镁叶绿素活性较低。此外，焦脱镁叶绿素的叶绿素酶降解产物焦脱镁叶绿素的水溶性比脱镁叶绿酸低，并且因此之后更难从油移除。酶反应速率在高温下增加，但有利于使脱镁叶绿素至焦脱镁叶绿素的转化保持为最小。
根据以上描述，在特别优选的实施例中，油与酶在低于约80℃，优选地低于约70℃，优选地约68℃或更低，优选地约65℃或更低的温度温育，以减少向焦脱镁叶绿素转化的量。然而，为了保持良好的反应速率，优选的是与酶温育期间保持油的温度高于50℃。因此，酶与油温育的优选温度范围包括约50℃至低于约70℃，约50℃至约65℃以及约55℃至约65℃。
优选地，当酶与油混合时，油的温度可以处于所需的反应温度。在酶加入之前和/或期间，可以将油加热和/或冷却至所需温度。因此，在一个实施例中，设想本发明方法的其他步骤可以是冷却和/或加热油。
反应时间(即酶与油温育的时间段，优选伴以搅拌)可适当地使叶绿素和叶绿素衍生物(尤其它们的撇形式(如a′或b′)立体异构体)的水解持续足够的时间，从而形成例如叶绿醇和脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸。例如，反应时间可以为至少约1分钟，更优选地至少约5分钟，更优选地至少约10分钟。在一些实施例中，反应时间可以在约15分钟至约6小时之间，优选地在约15分钟至约60分钟之间，优选地约30至约120分钟。在一些实施例中，反应时间可以为最多6小时。
优选地，在约pH4.0和约pH10.0之间，更优选地在约pH5.0和约pH10.0之间，更优选地在约pH6.0和约pH10.0之间，更优选地在约pH5.0和约pH7.0之间，更优选地在约pH5.0和约pH7.0之间，更优选地在约pH6.5和约pH7.0之间，例如在约pH7.0(即中性pH)下实施该方法。在一个实施例中，优选地在约pH5.5和pH6.0之间实施该方法。
与酶温育(或混合)时，油中的水含量可以适当地在约0.5至约5％水之间，更优选地在约1至约3％之间，并且更优选地在约1.5和约2％之间。
当使用固定化酶时，固定化酶的水活度可适当地在约0.2至约0.98的范围内，优选地在约0.4至约0.9之间，更优选地在约0.6至约0.8之间。
油的分离
使用本发明的酶进行酶处理步骤后，在一个实施例中处理后的液体(例如油)以适当的装置(例如离心分离器)分离，从而得到加工油。在完成酶处理后，如有必要，加工油可以另外用水或有机或无机酸，例如乙酸、柠檬酸、磷酸、琥珀酸等等洗涤，或用盐溶液洗涤。
叶绿素和/或叶绿素衍生物移除
涉及酶处理的本发明方法通常减少油中叶绿素和/或叶绿素衍生物(特别是它们的撇形式(如a′或b′)立体异构体)的水平。例如，与处理前油中存在的叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素的浓度(按重量计)相比，该方法可以使叶绿素a或b、脱镁叶绿素a或b和/或焦脱镁叶绿素a或b或它们的撇形式(如a′或b′)立体异构体的浓度减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此在特定的实施例中，基于油的总重量，处理后油中叶绿素和/或叶绿素衍生物或它们的撇形式(如a′或b′)立体异构体的浓度可以小于100、小于50、小于30、小于10、小于5、小于1、小于0.5、小于0.1mg/kg或小于0.02mg/kg。
如果使用对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式具有立体特异性的酶，则在用酶处理后，与油中残余的非形式和撇形式立体异构体的总量相比，植物油通常包含比例下降的非撇形式立体异构体(参见实例3和下图48)。相比之下，在本发明的实施例中，本发明方法中所用的酶通常对叶绿素和叶绿素衍生物的非撇形式具有降低的立体特异性，即所述酶通常不仅能够水解撇形式，还能够水解非撇形式。因此，在本发明的处理步骤后，油中残余的非撇形式立体异构体的比例通常比使用立体特异性酶时下降得更少。
已经发现，在通常情况下，粗制油(如粗制大豆油或菜籽油)可以包含大约70％的非撇形式立体异构体(如脱镁叶绿素a)和30％的撇形式立体异构体(如脱镁叶绿素a′)。在一个实施例中，用酶处理后，基于油中叶绿素或叶绿素衍生物的非主要(如a和/或b)立体异构体和撇形式(如a′和/或a′)立体异构体的总量计，所述油包含至少50％的叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式(如a和/或b)立体异构体。更优选地，所述油在处理后包含至少55％、至少60％或至少65％的叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式立体异构体。
在一个实施例中，用酶处理后，基于油中脱镁叶绿素a和脱镁叶绿素a′的总量计，所述油包含至少50％、至少60％或至少65％的脱镁叶绿素a。在一个实施例中，用酶处理后，基于油中脱镁叶绿素b和脱镁叶绿素b′的总量计，所述油包含至少50％、至少60％或至少65％的脱镁叶绿素b。
在这些实施例中，通常条件可以是(例如)约20℃至约70℃(如约40℃或约60℃)，pH5至8(如约pH6.0或约pH7.0)并且水含量为1至3％(如约2％)。处理时间可以包括(例如)至少1小时，优选2小时或更多，更优选4小时或更多。
进一步加工步骤
在典型的植物油加工方法中，将油提取于己烷中，使粗制植物油脱胶，任选地经碱中和，漂白(使用例如粘土吸附，随后弃去粘土)，并且脱臭从而产生精制、漂白和脱臭的油或RBD油(参见图50)。对脱胶步骤的需要取决于磷含量和其他因素。本发明的方法可与基于己烷提取和/或酶辅助油提取的方法结合使用(参见Journal of Americal Oil Chemists’Society(2006)，83(11)，973-979(《美国油脂化学家协会杂志》，2006年，第83卷第11期，第973-979页))。通常，本发明的方法可以使用如Bailey’s Industrial Oil and FatProducts(2005)，6thedition，Ed.by Fereidoon Shahidi，John Wiley&Sons(《贝雷工业油脂产品》，2005年，第6版，Fereidoon Shahidi编辑，约翰威立父子出版公司)中所述的油加工步骤进行。
在本发明的实施例中，涉及使用能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的酶促反应可以在该方法的不同阶段进行，如图50中所示。在特定实施例中，酶在脱胶步骤前与油接触。在另一个实施例中，酶可以在水脱胶步骤期间与油接触。在另一个实施例中，酶与水脱胶油接触，但该接触在脱胶完成之前(如，在全脱胶或碱中和步骤之前)进行。
在用酶处理后，进一步加工步骤可帮助移除叶绿素和/或叶绿素衍生物的酶法水解产物。例如，进一步加工步骤可移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿素和/或叶绿醇。
脱胶
炼油中的脱胶步骤起到通过加入水来分离磷脂的作用。将通过脱胶沉淀的物质分离，并且进一步加工为卵磷脂的混合物。商业化卵磷脂，例如大豆卵磷脂和向日葵卵磷脂是半固态的或十分粘的物质。它们由极性脂质(主要是磷脂例如磷脂酰胆碱)与三甘油酯的微量组分的混合物组成。如本文所用，术语“脱胶”意指通过从油中移除磷脂来精制油。在一些实施例中，脱胶可以包括将磷脂(例如卵磷脂和磷脂)转化为可水化磷脂的步骤。
本发明的方法可使用任何脱胶工序，尤其是在脱胶步骤前叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触的实施例。合适的脱胶方法包括水脱胶法、ALCON油脱胶法(例如用于大豆)、safinco脱胶法、“超级脱胶”、超滤脱胶法、TOP脱胶法、联合脱胶法、干式脱胶法和ENZYMAXTM脱胶法。参见例如美国专利No.6,355,693、No.6，162,623、No.6,103,505、No.6,001,640、No.5,558,781、No.5,264,367、No.5,558,781、No.5,288,619、No.5,264,367、No.6,001,640、No.6,376,689、WO0229022、WO98118912等等。由本发明方法并入的各种脱胶工序在Bockisch，M.(1998)，Fats and Oils Handbook，The extraction of VegetableOils(Chapter5)，345-445，AOCS Press，Champaign，Illinois(Bockisch，M.，1998年，《油脂手册，植物油的提取》，第5章，第345-445页，美国伊利诺伊州尚佩恩的AOCS出版社)中描述。
水脱胶法通常指其中油与水(例如1至5重量％)温育以移除磷脂的步骤。通常，水法脱胶法可以在高温，如50至90℃进行。可搅拌油/水混合物例如5至60分钟，以允许磷脂分离进入水相，所述水相然后从油中除去。
也可以进行酸脱胶法。例如，可以在60至70℃下使油与酸(例如0.1至0.5％的50％的柠檬酸或苹果酸溶液)接触，混合，与1至5％的水接触，并且冷却至25至45℃。
随本发明方法使用的其他合适脱胶工序在WO2006/008508中描述。在一个实施例中，该方法包括使叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触，随后使用酰基转移酶进行酶法脱胶步骤，如WO2006/008508中所述。适用于本方法的酰基转移酶在WO2004/064537、WO2004/064987和WO2009/024736中也有所描述。可以使用任何具有酰基转移酶活性的酶(通常分类为E.C.2.3.1)，尤其包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X为以下氨基酸残基的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。在一个实施例中，酰基转移酶为具有Asn80Asp突变的突变型杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)成熟脂质酰基转移酶(GCAT)。
在另一个实施例中，该方法包括使用磷脂酶的脱胶步骤。可以使用具有例如磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)或磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)活性的任何酶，例如Lecitase或胰磷脂酶A2(丹麦诺维信公司(Novozymes，Denmark))。在一个实施例中，该方法包括将叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触，然后是使用磷脂酶的酶促脱胶步骤，例如使用如在US5,264,367、EP0622446、WO00/32758或Clausen(2001)“Enzymatic oil degumming by anovel microbial phospholipase，”Eur.J.Lipid Sci.Technol.103：333-340(“通过新型微生物磷脂酶进行酶法油脱胶”，《欧洲脂质科学和技术杂志》，第103卷，第333-340页)中所述的脱胶步骤。
在另一个实施例中，脱胶步骤可以为水脱胶步骤。在另一个实施例中，可以使用利用酶(例如磷脂酶C(IUB3.1.4.1))的酶促脱胶步骤。可以在脱胶步骤中使用的具有磷脂酶C活性的多肽在例如WO2008143679、WO2007092314、WO2007055735、WO2006009676和WO03089620中公开。适用于本发明中的合适磷脂酶C为得自美国马萨诸塞州剑桥维莱尼姆公司(Verenium Corporation，Cambridge，MA)的
酸处理/碱中和
在一些实施例中，在水脱胶后可以进行酸处理/碱中和步骤以进一步降低油中的磷脂水平。在另一个实施例中，可以进行包括酸处理/碱中和的单一脱胶步骤。此类方法通常称为全脱胶或碱炼。
已经发现，酸处理/碱中和步骤对于移除叶绿素的酶水解产物，例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素是特别有效的。因此，该步骤可以在酶处理步骤后的任何阶段进行。例如，此步骤可以包括加入酸例如磷酸，然后用碱例如氢氧化钠中和。在酸/碱中和处理后，将化合物例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素从油中萃取到水相中。
在此类方法中，通常首先将油与0.05至0.5重量％的浓磷酸例如在50至90℃的温度接触，并且混合以帮助沉淀磷脂。接触时间可以是例如10秒至30分钟。随后，例如在50至90℃的温度加入碱的水溶液(例如1至20％的氢氧化钠水溶液)，然后温育并且混合10秒至30分钟。然后可以将油加热至约90℃，并通过离心使含水皂相与油分离。
任选地，也可以使用例如氢氧化钠或水进行进一步洗涤步骤。
移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸
本发明的方法可以任选地涉及移除不含叶绿醇的叶绿素衍生物诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸(包括它们的撇形式和非撇形式)的步骤。由于本发明的酶对叶绿素或叶绿素衍生物的水解，此类产物可以存在于组合物中，或者可以作为污染物，或作为加工产物中的不需要组分天然存在。由于脱镁叶绿酸的分解，焦脱镁叶绿素也可以存在于组合物中，脱镁叶绿酸本身可以由具有脱镁叶绿素酶活性的酶对脱镁叶绿素的活性来产生，或者脱镁叶绿酸可以在叶绿素酶对叶绿素作用后由脱植基叶绿素形成(参见图1)。用于油精制的加工条件，尤其是加热可以促进主要组分焦脱镁叶绿素的形成，例如促进脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿素，焦脱镁叶绿素随后水解为焦脱镁叶绿素。
在一个实施例中，与酶处理之前和之后的任一含量或二者含量相比，本发明的方法减少了油中脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素的含量。在一些实施例中，在酶处理后脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素的浓度可以增加。通常，方法涉及移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素的步骤，使得此类产物的浓度低于酶处理后的浓度。优选地，将通过该酶促步骤产生的脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素从油中移除，使得这些产物在油中的最终含量低于酶处理前的含量。
例如，与脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸移除步骤前，即酶处理之前或之后，油中存在的脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸浓度(按重量计)相比，该方法可以降低脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸(包括它们的撇形式和非撇形式)的浓度至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此在特定的实施例中，按组合物(例如植物油)的总重量计，移除步骤后油中脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素的浓度可以低于100、低于50、低于30、低于10、低于5、低于1、低于0.5、低于0.1mg/kg、或低于0.02mg/kg。
本发明方法的优点是，反应产物例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素可以通过例如酸处理/碱中和步骤简单、轻松地从油中移除。因此，在优选的实施例中，叶绿素和叶绿素衍生物可以基本上从油中移除，而无需进一步加工步骤，例如粘土和/或二氧化硅处理和脱臭(如图50中所示的虚线框表示的)。
粘土处理
特别优选该方法不包括粘土处理步骤。避免使用粘土是有利的，原因前已述及，尤其是降低成本，减少因粘土粘附造成的油损失以及增加有效化合物例如类胡萝卜素和生育酚的保留。
在一些实施例中，方法可以在无粘土处理步骤和无脱臭步骤下进行，与涉及粘土处理的方法相比，这导致精制油中此类有用化合物浓度的增加。
二氧化硅处理
虽然并不总是需要，但在一些实施例中，该方法可以包括二氧化硅处理步骤，优选地在酶处理之后包括。例如，该方法可以包括使用本领域已知的无吸附剂或含少量吸附剂的二氧化硅精制装置和方法，例如使用TriSyl二氧化硅精制方法(美国马里兰州哥伦比亚的格雷斯戴维森公司(Grace Davison，Columbia，MD))或SORBSILRTM二氧化硅(美国伊利诺伊州乔利埃特的英力士二氧化硅公司(INEOS Silicas,Joliet,IL))。
二氧化硅处理步骤可用于移除油中的任何残余脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿素或其他极性组分。例如，在一些实施例中，二氧化硅处理步骤可以用作酸处理/碱中和(全脱胶或碱精制)步骤的替代步骤。
在一个实施例中，该方法包括两阶段二氧化硅处理，例如包括由其中移除二氧化硅的分离步骤分隔的两个二氧化硅处理步骤。二氧化硅处理可以在升高的温度，例如在高于约30℃、更优选地约50至150℃、约70至110℃、约80至100℃或约85至95℃、最优选地约90℃进行。
脱臭
在一些实施例中，该方法可以包括脱臭步骤，通常作为该方法中的最终精制步骤。在一个实施例中，脱臭是指油的蒸汽蒸馏，这通常移除挥发性气味和风味化合物、生育酚、甾醇、甾烷醇、类胡萝卜素以及其他营养物质。通常，将油在低压(例如0.1至1kPa)下加热至220至260℃以排除气体。将蒸汽(例如1-3重量％)经油吹过例如15至120分钟以移除挥发性化合物。可以收集含水馏出液。
在另一个实施例中，脱臭可以使用惰性气体(例如氮气)代替蒸汽进行。因此，脱臭步骤可以包括用惰性气体(例如氮气)进行气泡精炼或鼓泡，例如在A.V.Tsiadi etal“Nitrogen bubble refining of sunfloWer oil in shalloW pools”，Journal of theAmerican Oil Chemists′Society(2001)，Volume78(4)，pages381-385(A.V.Tsiadi等人，“在浅池中用氮气气泡精炼向日葵油”，《美国油脂化学家协会杂志》，2001年，第78卷，第4期，第381-385页)中所描述。可以收集通过油的气相并且任选地使其冷凝，和/或可将来自其中的挥发性化合提取到水相中。
在一些实施例中，本发明方法进行时无需粘土处理，但包括脱臭步骤。有用的化合物(例如类胡萝卜素、甾醇、甾烷醇和生育酚)可以至少部分地从油中萃取到馏出液(例如含水或含氮馏出液)中，所述馏出液得自脱臭步骤。该馏出液提供了化合物例如类胡萝卜素和生育酚的宝贵来源，而所述化合物在包括粘土处理的方法中可因夹带而至少部分地损耗。
生育酚在漂白期间的损失取决于漂白条件和所施用的粘土的类型，但已有报道在漂白步骤中生育酚去除达20-40％(K.Boki,M,Kubo,T.Wada，and T.Tamura,ibid,69,323(1992)(K.Boki、M，Kubo、T.Wada和T.Tamura，出处同上，第69卷，第323页，1992年))。已有报道在大豆油加工期间，漂白步骤中生育酚的损失达13％(S.Ramamurthi，A.R.McCurdy，andR.T.Tyler，in S.S.Koseoglu，K.C.Rhee，and R.F.Wilson，eds.，Proc.WorldConf.Oilseed Edible Oils Process，vol.1，AOCS Press，Champaign，Illinois，1998，pp.130-134(S.Ramamurthi、A.R.McCurdy和R.T.Tyler，S.S.Koseoglu、K.C.Rhee和R.F.Wilson编辑，《世界含油种子与食用油加工会议论文集》，第1卷，美国伊利诺伊州尚佩恩AOCS出版社，1998年，第130-134页))。
类胡萝卜素可能在粘土处理和非粘土处理油的脱臭步骤中从油中移除。通常，有颜色的类胡萝卜素的移除受到控制，以便产生具有在指定范围的值内的预定颜色的油。可以通过更改脱臭步骤而改变精制油中类胡萝卜素和其他挥发性化合物的含量。例如，在想要油中保持较高浓度类胡萝卜素的实施例中，脱臭步骤可以在较低温度(例如使用200℃或更低温度的蒸汽)进行。在此类实施例中，特别优选避免粘土处理步骤，由于这将导致精制油中较高浓度的类胡萝卜素。
进一步酶处理
在另一方面，本发明的方法还包括使用脂质酰基转移酶、磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶)、葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和其他植物细胞壁降解酶，以及混合酶制品和细胞裂解液。在可供选择的方面，本发明的方法可以结合其他方法，例如酶促处理(如使用糖酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和其他降解副活性)或化学方法(如己烷提取大豆油)实施。在一个实施例中，本发明的方法可以结合如WO2006031699中定义的方法实施。
现在将结合以下非限制性实例进一步说明本发明。
实例1
鉴定和克隆叶绿素酶
使用不同的方法(包括BLAST)搜索NCBI数据库，将几个序列鉴定为叶绿素酶或与叶绿素酶具有同源性的序列。所述序列的名称、它们的起源以及NCBI数据库登录号列于表1中。
表1：具有以下登录号和名称的本文所用叶绿素酶。
生物体 数据库登录号 CHL名称
拟南芥 AAGl2547 ARA_CHL
拟南芥 NP_199199 ARA_CHL2
甜橙 AAF59834 CIT_CHL
普通小麦 BT009214 TRI_CHL
普通小麦 BT008923 TRI_CHL2
甘蓝 AAN51935 BRA_CHL
甘蓝 AAN51933 BRA_CHLl
甘蓝 AAN51934 Brass_CHL2
玉米 ACN32030 ZEA_CHL
玉米 ACG44273 ZEA_CHL2
毛竹 FP092915 BAM_CHL
藜 Q9LE89 CHE_CHL
蓖麻 XP_002517075 CB_CHL
大豆 BAF43704 GlyMaX_CHL
银杏 AAP44978 Gin_CHL
发财树 ACO50429 PAC_CHL2
毛果杨 XP_002315752 POP_CHL
高梁 XP_002459848 Sor_CHL
高梁 XP_002445588 SORG_CHL
葡萄 XP_002273926 Vitis_CHL
小立碗藓 EDQ81786 PHYS_CHL
耧斗菜 AQU_CHL
二穗短柄草 ADDN01001446 BRACH_CHL
蒺藜苜蓿 ACJ85964 MED_CHL
蒌叶 ABI96085 PIP_CHL
百脉根 AK338339 LOTUS_CHL
籼稻 EEC66959 ORYI_CHL
粳稻 NP_001064620 ORYJl_CHL
粳稻 EEE50970 ORYJ2_CHL
北美云杉 ACN40275 PICEA_CHL
衣藻 XP_001695577 CHL_CHL
叶绿素酶序列
从NCBI数据库中搜索而鉴定的叶绿素酶序列在表1中列出，并且氨基酸序列在图12至42中显示(SEQ ID NO∶1至31)。选中的叶绿素酶氨基酸序列的多重序列比对显示分布在整个序列中的若干保守残基。包含丝氨酸活性位点的基序GHSRG(SEQ ID NO∶32)是高度保守的。这种比对产生如图43中所示的系谱树。
在大肠杆菌中的克隆
制备了编码表1中所示叶绿素酶的合成基因。每个基因均为大肠杆菌中的表达进行密码子优化。出于克隆的目的，基因在5′-端扩展以包含NheI限制位点，并且在3′-端扩展以包含XhoI限制位点。
用NheI和XhoI限制酶消化后，将合成DNA连接至用相同限制酶消化的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen公司)。该载体包括用于控制插入基因表达的T7启动子以及Lac操纵子。叶绿素酶基因以符合可读框方式与组氨酸标签和凝血酶切割位点融合以便纯化(图4中所示的例子)。将所得的构建体(例子pET28-TRI_CHL在图5中显示)转化入感受态大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen))，并且从转化的菌落中分离出质粒并进行核苷酸测序，以便验证正确的序列，并且全部融合均如预期。
在大肠杆菌中的表达
为了表达，将质粒转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)。将细胞在37℃于含有羧苄青霉素(50mg/ml)LB中培养，直到OD600为0.6-0.8。为了诱导，向培养物加入1mM IPTG，并在25℃温育另外20-24小时，随后通过离心收获细胞。通过超声处理使重组的叶绿素酶从细胞沉淀中释出，并通过离心除去细胞残片。
在枯草芽孢杆菌中的克隆
为了在枯草芽孢杆菌中克隆和表达，将编码叶绿素酶(表1)的合成基因针对枯草芽孢杆菌进行密码子优化。将基因克隆在两种不同的质粒中，一种用于细胞内表达，一种用于分泌到培养基中(细胞外表达)。
细胞外表达
将基因在5′-端扩展，以包含BssHII限制位点和用于符合可读框地融合到AprE信号序列的AprE信号序列的一部分，以及编码氨基酸A G K的序列，从而有利于信号序列切除。将基因在3’-端用PacI限制位点进行扩展。将经BssHII和PacI消化的基因连接至用相同限制酶消化的枯草芽孢杆菌表达载体pBN中。pBN载体包含AprE启动子和AprE信号序列。叶绿素酶基因与AprE信号序列的所得融合物的例子在图6中显示。将最终的构建体(例子pBN-TRI_CHL在图7中显示)转化入感受态大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen))，并且从转化的菌落中分离出质粒并进行核苷酸测序，以便验证正确的序列，并且全部融合均如预期。
为了表达，将质粒转化入表达宿主枯草芽孢杆菌BG6002中。将细胞在33℃于格兰特公司(Grant)的II号培养基中培养68小时。通过离心使细胞沉淀后，从培养基中分离重组的叶绿素酶。
细胞内表达
将基因在5’-端扩展，以包含SpeI限制位点，从而允许将基因直接与不具有AprE信号序列的枯草芽孢杆菌表达载体pBN中的AprE启动子融合。将基因在3’-端用HindlII限制位点进行扩展。叶绿素酶基因与AprE启动子的融合在图8中显示。将所得的构建体(例子pBN-Spe-TRI_CHL在图9中显示)转化入感受态大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen))，并且从转化的菌落中分离出质粒并进行核苷酸测序，以便验证正确的序列，并且全部融合均如预期。
为了表达，将质粒转化入表达宿主枯草芽孢杆菌BG6002中。将细胞在33℃于格兰特公司(Grant)的II号培养基中培养68小时。通过用1mg/ml的溶菌酶在30℃处理1小时，从培养物释出重组的叶绿素酶。通过离心除去细胞残片，并且从上清液回收叶绿素酶。
在变铅青链霉菌中的克隆
为了在变铅青链霉菌中克隆和表达，将编码叶绿素酶(表1)的合成基因针对变铅青链霉菌进行密码子优化。出于克隆的目的，将基因在5’-端扩展，以包含NheI限制位点和用于与Cel A信号序列符合可读框地融合的Cel A信号序列的一部分。扩展3’-端以包含BamHI限制位点。叶绿素酶基因(TRI_CHL)与Cel A信号序列的融合在图10中显示。将所得的构建体(例子pKB-TRI_CHL在图11中显示)转化入感受态大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen))，并且从转化的菌落中分离出质粒并进行核苷酸测序，以便验证正确的序列，并且全部融合均如预期。
在变铅青链霉菌中的表达
为了表达，将质粒转化入表达宿主变铅青链霉菌菌株g3s3的原生质体中。将细胞在30℃于补充硫链丝菌素的TSG培养基中预培养48小时。在Strept Pdxn2改良培养基中将预培养物稀释10倍，然后在30℃温育96小时。通过离心使细胞沉淀后，从培养基中分离重组的叶绿素酶。
实例2
叶绿素酶的活性
通过如上所述的基因组挖掘鉴定了多种叶绿素酶并在大肠杆菌中表达它们。针对脱镁叶绿素酶活性，分析来自具有包含叶绿素酶基因的质粒的大肠杆菌的提取物。所述分析测定可以如EP10159327.5中所述进行。或者，脱镁叶绿素酶活性可以通过如上文所述的方法(如基于HPLC的方法)确定。表2中显示结果。
脱镁叶绿素酶活性可以基于在反应缓冲液中水解脱镁叶绿素a，然后对生成的脱镁叶绿酸a进行荧光测定来确定。这种测定法也可能适于采用焦脱镁叶绿素作为底物。将1U酶活性定义为在40℃每分钟水解1μmol脱镁叶绿素a或焦脱镁叶绿素。
表2：酶的脱镁叶绿素酶活性
酶 酵素 活性U/mL
BAM_CHL CoRe112 0，32
CIT_CHL CoRe113-A 0，25
ARA_CHL CoRe114-A 5，19
CB_CHL CoRe127 0，10
GlyMax_CHL Core133 0，010
Sor_CHL Core134 6，14
ARA_CHL2 Core135 0，94
BRA_CHL1 Core136 1，21
SORG_CHL CoRe137-A 0，78
TRI_CHL2 Core138-A 0，19
ZEA_CHL2 Core139 0，03
TRI_CHL CoRe20 0，18
BRACH_CHL CoRe156 1，50
PIP_CHL CoRe158 0，01
PICEA_CHL CoRe163 0，05
对照 空载体 0，000
通过蛋白质印迹分析采用兔体内针对纯化的TRI_CHL所产生的第一抗体来分析表2中所述的酶。图44和45显示来自表2的所有酶与产生的抗体反应。
实例3
植物油中叶绿素衍生物的水解
测试了一些酶降解油体系中叶绿素组分的能力。表3中显示配方。在惠顿(Wheaton)玻璃杯中称量粗制油菜籽油，并伴以磁力搅拌加热至60℃。加入水和酶。采用高剪切混合将样品处理20秒，随后在60℃伴以磁力搅拌进行温育。在0.5、2和4小时反应时间后取出样品。将样品离心并通过HPLC-MS进行分析。
表3：用于测试油体系中叶绿素酶的配方
图46中显示如通过HPLC-MS所确定的脱镁叶绿素a(脱镁叶绿素a+a′)的总含量。图47中显示焦脱镁叶绿素a的降解。所有5种候选酶均能够降解脱镁叶绿素和脱镁叶绿素，但对焦脱镁叶绿素的活性尤其在5种受试酶之间明显变动。
在用叶绿素酶处理过的油样品中，还分析脱镁叶绿素立体异构体a和a′的分布。令人惊讶地，取决于所施加的酶，我们发现这种分配的巨大差异(参见图48)。对于BRA_CHL1和TRI_CHL，脱镁叶绿素a的百分比降到约初始含量的一半，然而ARA_CHL2和CB_CHL表现出与对照和初始含量相当的分布。在整个反应过程中保持立体异构体的初始分布具有明显的优势，因为这意味着总反应速率不依赖于脱镁叶绿素a′至a的差向异构化。这些发现还表明ARA_CHL2和CB_CHL对C-132处的基团不是十分敏感。这两种酶还显示对C-132处具备2个氢原子的焦脱镁叶绿素具有好得多的活性(参见图47)。
体外测定中的底物特异性
在体外测定系统中测量了上述酶对脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的相对活性，例如如EP10159327.5中所述。表4给出脱镁叶绿素活性相对于焦脱镁叶绿素活性的比率。
表4：脱镁叶绿素活性相对于焦脱镁叶绿素活性的比率
酶 脱镁叶绿素相对于焦脱镁叶绿素的活性比率
SORG_CHL 173
ARA_CHL2 4
CB_CHL 4
TRI_CHL 45
显然，与TRL_CHL相比，SORG_CHL对焦脱镁叶绿素具有相对较低的活性。CB_CHL和ARA2_CHL显示不同的底物特异性，该特异性朝着焦脱镁叶绿素大为改善。这些发现与图46至48中所示的内容相互关联。
实例4
叶绿素酶对脱镁叶绿素a和a’的相对活性
根据表5中的配方测试粗制油菜籽油中叶绿素酶的剂量反应。
表5
在1/2、2和4小时反应时间后取出样品，并通过HPLC-MS进行分析。为了比较不同叶绿素酶对两种异构体的活性，在底物浓度为初始浓度的一半时计算对两种异构体的酶活性。将底物浓度的自然对数随酶剂量(U/g)的变化绘成图，如图51中针对拟南芥叶绿素酶(ARA_CHL2)所示。
根据图51中的曲线图，在底物浓度为初始浓度的一半时计算酶对脱镁叶绿素a和a’的活性，如表6中所示。
表6：计算ARA-CHL2对脱镁叶绿素a和脱镁叶绿素a’的活性
根据在初始底物浓度的一半处的酶活性，可以在相同的条件下比较不同的酶。在表7中，比较来自两种不同的叶绿素酶的结果。
表7：叶绿素酶对粗制菜籽油中的脱镁叶绿素a和a’异构体的活性
脱镁叶绿素_a’ 脱镁叶绿素_a 相对活性
酶 μg/U/h μg/U/h a′/a
ARA_CHL2，CoRe135 574 605 0，95
CB_CHL，CoRe127-A 141 343 0，41
表7的结果表明，ARA_CHL2对脱镁叶绿素a和a’异构体具有几乎相同的活性。这与以下观察到一致：在用ARA_CHL2进行酶促降解期间两种异构体之间的比率不变(参见图48)。相比之下，CB_CHL也显示对脱镁叶绿素a’的显著水解活性。以对脱镁叶绿素a较之对脱镁叶绿素a′的活性的比率表示(即表7中所示的倒数)，ARA_CHL2具有1.05的活性比率，并且CB_CHL具有2.44的活性比率。
结论
本发明鉴定了31种叶绿素酶序列，此外将它们在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或变铅青链霉菌中克隆和表达。根据大肠杆菌中的表达，在接近一半的经鉴定的叶绿素酶中检测到脱镁叶绿素酶活性(表2)，并且所有这些叶绿素酶均与针对TRI_CHL所产生的抗体反应(图44和45)。在不具有可检测的脱镁叶绿素酶活性的蛋白质提取物中，不能基于使用以针对TRI_CHL所产生的抗体的蛋白质印迹来检测任何表达的叶绿素酶。
当测试油应用中的候选叶绿素酶时，发现主要存在对于脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素底物的特异性的差异。与其他测试的候选酶相比，ARA_CHL2和CB_CHL对焦脱镁叶绿素显示好得多的活性(图47)。对于这两种候选酶，还观察到在油试验中温育期间脱镁叶绿素a相对a′的比率未显著改变。对于其他待测试的候选酶，观察到该比率在温育期间明显下降。在使用脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素作为底物的体外测定中，还测量到在油测定中ARA_CHL2和CB_CHL朝着焦脱镁叶绿素的改善活性(表4)。
HPLC分析
在本文的实例中，叶绿素衍生物通常可以根据以下方法通过HPLC分析进行定量。使用通常根据“Determination of chlorophylls andcarotenoids by high-performanceliquid chromatography during olive lactic fermentation”，Journal ofChromatography，585，1991，259-266(“在橄榄乳酸发酵期间通过高效液相色谱测定叶绿素和类胡萝卜素”，《色谱杂志》，第585卷，1991年，第259-266页)中描述的方法进行HPLC分析。
通过连接到二极管阵列检测器的HPLC对脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸进行测定。该方法采用的色谱柱填充有C18材料，叶绿素通过梯度洗脱分离。使用得自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)的叶绿素A和B标准品对峰进行归属，例如根据图49中显示的代表性HPLC色谱图(摘自Journal of Chromatography，585，1991，259-266(《色谱杂志》，第585卷，1991年，第259-266页))。
上面说明书中提及的所有出版物均以引用的方式并入本文。在不背离本发明的精神和范围的前提下，所述的本发明方法和系统的各种修改形式和变型形式对于本领域技术人员将显而易见。尽管本发明已结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。

Claims (13)

1.一种用于处理植物油的方法，包括使所述油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a'或b'立体异构体，并且其中所述酶是通过使用编码SEQ ID NO:13的多肽序列的核苷酸序列产生的，其中所述叶绿素衍生物是脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述a'或b'立体异构体包括叶绿素a'、脱镁叶绿素a'、叶绿素b'或脱镁叶绿素b'。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述酶能够水解叶绿素或所述叶绿素衍生物的a'立体异构体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中与叶绿素或叶绿素衍生物的a'立体异构体相比，所述酶对(a)叶绿素或所述叶绿素衍生物的a立体异构体的活性比率；或者与叶绿素或叶绿素衍生物的b'立体异构体相比，所述酶对(b)叶绿素或所述叶绿素衍生物的b立体异构体的活性比率小于10。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在用所述酶处理后，所述油包含(a)基于所述油中的叶绿素或所述叶绿素衍生物的a和a'立体异构体的总量，至少50％的叶绿素或所述叶绿素衍生物的a立体异构体；或者(b)基于所述油中的叶绿素或所述叶绿素衍生物的b和b'立体异构体的总量，至少50％的叶绿素或所述叶绿素衍生物的b立体异构体。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中与焦脱镁叶绿素相比，所述酶对脱镁叶绿素具有小于10的活性比率。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶包含氨基酸序列GHSRG(SEQ ID NO:32)。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶衍生自蓖麻。
10.能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶用于从植物油中除去叶绿素或所述叶绿素衍生物的a'或b'立体异构体的用途，其中所述酶是通过使用编码SEQ ID NO:13的多肽序列的核苷酸序列产生的，其中所述叶绿素衍生物是脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。
11.根据权利要求10所述的用途，其中与叶绿素或所述叶绿素衍生物的a'立体异构体相比，所述酶对(a)叶绿素或叶绿素衍生物的a立体异构体的活性比率；或者与叶绿素或所述叶绿素衍生物的b'立体异构体相比，所述酶对(b)叶绿素或叶绿素衍生物的b立体异构体的活性比率小于10。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的用途，其中与焦脱镁叶绿素相比，所述酶对脱镁叶绿素具有小于10的活性比率。
13.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述a'或b'立体异构体包括叶绿素a'、脱镁叶绿素a'、叶绿素b'或脱镁叶绿素b'。
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