JP2002520620A - タンパク質−捕捉剤のアレイおよびその使用方法 - Google Patents

タンパク質−捕捉剤のアレイおよびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 生物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントである複数のタンパク質の同時検出に有用なタンパク質−捕捉剤のアレイが、提供される。特に、種々の抗体アレイが記載される。タンパク質−捕捉剤のアレイを作製しそして使用する両方の方法もまた、開示される。本発明のアレイは、特に、種々のプロテオミクス適用（細胞におけるタンパク質の発現および修飾のパターンの評価を含む）に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （ａ）発明の分野 本発明は、一般的に、タンパク質−捕捉剤のアレイ、ならびにサンプル中の多
数のタンパク質の並列検出および分析のための方法に関する。より詳細には、本
発明は、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内タンパク質レベルでの測
定に関する。
【０００２】 （ｂ）関連分野の説明 遺伝子活性を評価するため、ならびに疾患プロセスおよび薬物効果の生物学的
プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミク
スに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能のより直
接的かつ有望な考察を提供する。プロテオミクスは、メッセンジャーＲＮＡレベ
ルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出しそして定量すること
による、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。プロテオミクスはまた、
タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用、およびタンパク質の細胞内
での局在を含む、ゲノムにコードされない事象の研究を含む。細胞により発現さ
れたタンパク質の構造、機能、または活性レベルもまた興味深い。基本的に、プ
ロテオミクスは、細胞内に含まれるかまたは細胞によって分泌される全タンパク
質の状態の、一部または全ての研究を含む。
【０００３】 多数の最も重要な細胞プロセスは、遺伝子発現の状態によってではなく、細胞
のタンパク質状態によって調節されるので、タンパク質レベルでの遺伝子発現の
研究は重要である。また、細胞のタンパク質含有量は、薬物発見の試みに非常に
関連する。なぜなら、ほとんどの薬物は、タンパク質標的に対して活性であるよ
うに設計されるからである。
【０００４】 細胞のｍＲＮＡ量の測定は、細胞のタンパク質含有量の間接的かつ不完全な評
価のみを提供する。細胞内で産生される活性なタンパク質レベルは、しばしば、
生成されたｍＲＮＡ量以外の要因によって決定される。例えば、タンパク質の成
熟およびタンパク質の分解の両方は、細胞内で能動的に制御され、そしてタンパ
ク質の活性状態は、翻訳後修飾によって調節され得る。ｍＲＮＡ転写量をタンパ
ク質の量と比較する研究は、その２つの間の限られた相関関係（約０．４３〜０
．４８の係数）のみを見出すに過ぎなかった（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：１８５３−１８６１，１９
９８）。さらに、化学的および酵素的な分解に起因する、サンプル中のＲＮＡの
極端な不安定性は、タンパク質レベルでの遺伝子発現の評価をｍＲＮＡレベルで
の評価よりもより実用的にする。プロテオーム分析のための現在の技術は、種々
のタンパク質分離技術に続いて、その分離したタンパク質の同定に基づく。最も
一般的な方法は、２Ｄ−ゲル電気泳動、続いて「ゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）」での
タンパク質分解消化そして質量分析に基く。あるいは、エドマン法が、配列決定
のために使用され得る。この２Ｄ−ゲル技術は、大きなサンプルサイズを必要と
し、時間がかかり、そして一般に、ヒト細胞によって発現されたタンパク質の重
要な画分を再現可能に分離するその能力において制限される。若干大きな形式の
２Ｄ−ゲルを含む技術は、伝統的な２Ｄ−ゲル技術よりも、より大量のタンパク
質を分離するゲルを生じ得るが、再現性はなお乏しく、そして９５％を超えるス
ポットは、利用可能な配列決定技術の感度についての制限に起因して、配列決定
され得ない。電気泳動技術はまた、大量のタンパク質の方への偏りによって悩ま
される。溶液中の分析物の存在についての標準的なアッセイ（例えば、診断のた
めに一般的に使用されるアッセイ）は、例えば、標的化される抗原に対して惹起
された抗体の使用を含む。当該分野において公知の多重分析物アッセイ（ｍｕｌ
ｔｉａｎａｌｙｔｅ ａｓｓａｙ）は、複数の抗体の使用を含み、そして複数の
分析物についてのアッセイに指向される。しかし、これらの多重分析物アッセイ
は、細胞または細胞集団の全体または部分的なタンパク質含有量をアッセイする
ことに指向されていなかった。さらに、このような標準的な抗体アッセイアプロ
ーチを、ヒト細胞の推定１００，０００以上の異なるタンパク質の画分およびそ
れらの種々の改変状態の分析に順応させるために必要とされるサンプルサイズは
、法外に大きい。多数のタンパク質が同時にアッセイされるべき場合、抗体アッ
セイの自動化および／または小型化が必要とされる。巨視的イムノアッセイおよ
びアフィニティー精製に使用される材料、表面コーティング、および検出方法は
、小型化されたタンパク質アレイの形成または製造に容易に転位可能ではない。
【０００５】 小型化ＤＮＡチップ技術が開発されており（例えば、米国特許第５，４１２，
０８７号、同第５，４４５，９３４号、および第５，７４４，３０５号を参照の
こと）、そして現在、ｍＲＮＡレベルで遺伝子発現のスクリーニングのために活
用されている。これらのチップを使用して、どの遺伝子が、異なる型の細胞によ
って、および異なる条件に応答に応答して発現されるかを決定し得る。しかし、
ＮＤＡバイオチップ技術は、抗体アッセイのようなタンパク質結合アッセイに振
替可能ではない。なぜなら、ＤＮＡバイオチップに使用される化学および材料は
、タンパク質を用いる用途に容易に振り替え可能ではないからである。１００℃
までの温度に耐えるＤＮＡのような核酸は、活性を損失せずに乾燥および再水和
され得、そしてその活性を維持しながら、ガラスのような材料によって支持され
る有機接着層に、物理的または化学的に直接結合され得る。対照的に、抗体のよ
うなタンパク質は、好ましくは、水和されたままであり、そして周囲温度で、支
持材料の物理的および化学的性質に感受性である。それゆえ、液体−固体界面で
のタンパク質活性の維持は、核酸に使用されるストラテジーとは全体的に異なる
固定化ストラテジーを必要とする。この界面での抗体または他のタンパク質の適
切な配向は、相互作用する分子とのそれらの活性部位の接触性を確実にすること
が望ましい。チップおよび減少した特徴サイズの小型化とともに、非接触性に対
する接触性の比、および不活性な抗体もしくはタンパク質に対する活性な抗体も
しくはタンパク質の比は、漸増的に関連しそして重要になる。
【０００６】 従って、生物中の細胞または細胞集団によって発現される多数のタンパク質（
細胞（単数または複数）によって発現されるタンパク質のセットの全てまでを含
む）を並行してアッセイする能力の必要性が存在する。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、タンパク質捕捉剤のアレイ、および生物中の細胞または細胞集団に
よって発現される多数のタンパク質（細胞の全タンパク質含量までを含む）を並
行してアッセイする必要性を満たすその使用方法に関する。
【０００８】 １つの実施態様において、本発明は、以下：基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）；こ
の基板の表面のいくらかまたは全てを被覆する、少なくとも１つの有機薄膜；お
よび有機薄膜によって被覆されたこの基板の表面の既知の部分の領域に別個に配
置された複数のパッチを含むタンパク質捕捉剤のアレイを提供し、ここで、（ｉ
）各パッチが、該有機薄膜上に固定されたタンパク質捕捉剤を包含し、ここで、
所定のパッチのこのタンパク質捕捉剤が、生物体の細胞または細胞集団の特定の
発現産物またはそのフラグメントを結合し得；そして（ｉｉ）このアレイが、複
数の異なるタンパク質捕捉剤を包含し、それらの各々は、生物中の細胞または細
胞集団の異なる発現産物またはそのフラグメントを結合し得る。
【０００９】 第２の実施態様において、本発明は、本発明のタンパク質捕捉剤のアレイ、お
よび生物中の細胞もしくは細胞集団の発現産物である複数の異なるタンパク質も
しくはそのフラグメントの両方を含む結合したタンパク質のアレイを提供し、こ
こでこの異なるタンパク質の各々は、このアレイの別々のパッチ上のタンパク質
捕捉剤に結合される。
【００１０】 本発明のタンパク質捕捉剤のアレイを使用する方法もまた提供される。本発明
の１つの実施態様において、サンプル中の複数の異なるタンパク質（これは、生
物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントである）を並行し
てアッセイする方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：サンプル
を、タンパク質結合に適した条件下で、本発明のタンパク質捕捉剤のアレイに送
達する第１の工程であって、ここで、アッセイされるタンパク質の各々が、この
アレイ上の少なくとも１つのパッチのこのタンパク質捕捉剤の結合パートナーで
ある工程。最終工程は、このアレイの各々のパッチに結合されたタンパク質の存
在またはその量について、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで検出する工
程を包含する。この方法は、必要に応じてさらに、このアレイの少なくとも１つ
のパッチに結合したタンパク質をさらに特徴づける工程を包含する。
【００１１】 本発明の別の実施態様において、生物中の細胞または細胞集団のタンパク質の
発現パターンを決定するために方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含
する：細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントを含有するサンプ
ルを、本発明タンパク質捕捉剤のアレイに、タンパク質結合に適した条件下で送
達する第１の工程。最終工程は、このアレイの各々のパッチに結合されたタンパ
ク質の存在または量を、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで検出する工程
を包含する。代替の実施態様において、２つの細胞または細胞集団のタンパク質
発現パターンを比較するための同様の方法もまた提供される。
【００１２】 本発明のなお別の実施態様において、生物における細胞または細胞の集団の発
現産物またはそのフラグメントである、サンプル中の複数の異なるタンパク質に
ついて並行してアッセイする代替方法が提供される。この実施態様の方法は、サ
ンプルを、異なるタンパク質−捕捉剤の空間的に個別のパッチのアレイと、タン
パク質結合に適した条件下で接触させる第１の工程を包含し、ここで、アッセイ
されるタンパク質の各々は、このアレイ上の少なくとも１つのパッチのタンパク
質−捕捉剤の結合パートナーである。この方法の最後の工程は、このアレイの各
パッチに結合したタンパク質の存在または量について、直接的または間接的のい
ずれかで検出する工程を包含する。
【００１３】 なおさらなる実施態様において、タンパク質−捕捉剤のアレイを生成する方法
が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：タンパク質−捕捉剤のライブ
ラリーからタンパク質−捕捉剤を選択する工程であって、ここでこのタンパク質
−捕捉剤は、このタンパク質に対するそれらの結合親和性によって、細胞抽出物
または体液から選択される、工程；この選択されたタンパク質−捕捉剤の複数の
精製サンプルを生成する工程；および各異なる精製サンプルのタンパク質−捕捉
剤を、基板表面上の別々のパッチ上の有機薄膜上に固定して、基板の表面の個別
の公知の領域上のタンパク質−捕捉剤の複数のパッチを形成する工程。
【００１４】 代替の実施態様において、本発明は、タンパク質−捕捉剤のアレイを産生する
ための方法を提供し、この方法は、タンパク質−捕捉剤のライブラリーからタン
パク質−捕捉剤を選択する第１の工程を包含し、ここでこのタンパク質−捕捉剤
は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現産物またはそのフラグメントであるタンパ
ク質に対するそれらの結合親和性によって選択される。この方法の第２の工程は
、第１の工程において選択されるタンパク質−捕捉剤の複数の精製サンプルを生
成する工程を包含する。第３の工程は、各々の異なる精製サンプルのタンパク質
−捕捉剤を、基板表面上の別々のパッチ上の有機薄層上に固定して、基板の表面
の個別の公知の領域上のタンパク質−捕捉剤の複数のパッチを形成する工程を包
含する。
【００１５】 （発明の詳細な説明） 多分析物分析ならびに細胞中のタンパク質発現および改変の分析に有用な、種
々のタンパク質−捕捉剤のアレイおよび方法が、本発明によって提供される。
【００１６】 （ａ）定義 用語「タンパク質−捕捉剤」とは、タンパク質をそれ自体に結合し得る分子ま
たは多分子複合体を意味する。タンパク質−捕捉剤は、好ましくは、実質的に特
異的な様式で、それらの結合パートナーを結合する。約１０-6未満の解離定数（
ＫD）を有するタンパク質−捕捉剤が好ましい。このタンパク質−捕捉剤は、最
も代表的には、タンパク質またはポリヌクレオチドのような生体分子である。こ
の生体分子は、必要に応じて、天然に存在する生体分子、組換え生体分子、また
は合成生体分子であり得る。抗体または抗体フラグメントは、タンパク質−捕捉
剤として非常に適切である。抗原もまた、タンパク質−捕捉剤として作用し得る
。なぜなら、それらは、抗体を結合し得るからである。タンパク質リガンドを結
合するレセプターは、可能なタンパク質−捕捉剤の別の例である。例えば、タン
パク質−捕捉剤は、非共有相互作用を通じてそれらの結合パートナーとのみ相互
作用する薬剤に限定されないことが理解される。タンパク質−捕捉剤はまた、必
要に応じて、それらが結合するタンパク質に共有結合され得る。例えば、このタ
ンパク質−捕捉剤は、結合後にその結合パートナーに光架橋され得る。
【００１７】 用語「結合パートナー」とは、好ましくは実質的に特異的な様式で、特定のタ
ンパク質−捕捉剤によって結合されるタンパク質を意味する。いくつかの場合に
おいて、このタンパク質−捕捉剤は、細胞性タンパク質または細胞外タンパク質
であり得、そしてこの結合パートナーは、インビボで正常に結合される実体であ
り得る。しかし、他の実施態様において、この結合パートナーは、タンパク質ま
たはペプチドであり得、ここでタンパク質−捕捉剤が選択される（インビトロま
たはインビボ選択を通じて）か、または惹起される（抗体の場合）。結合パート
ナーは、１より多いタンパク質−捕捉剤によって共有され得る。例えば、種々の
ポリクローナル抗体によって結合される結合パートナーは、多数の異なるエピト
ープを保有し得る。あるタンパク質−捕捉剤はまた、例えば、結合パートナーが
同じエピトープを共有する場合に、多くの結合パートナーに結合し得る。
【００１８】 「タンパク質」とは、ペプチド結合によってともに架橋されたアミノ酸残基の
ポリマーを意味する。本明細書中で使用される場合、この用語は、任意のサイズ
、構造または機能の、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドをいう。しか
し、代表的には、タンパク質は、少なくとも６アミノ酸長である。好ましくは、
このタンパク質が短いペプチドである場合、少なくとも約１０アミノ酸残基長で
ある。タンパク質は、天然に存在するか、組換え体であるか、もしくは合成物で
あるか、またはこれらの組み合わせであり得る。タンパク質はまた、天然に存在
するタンパク質またはペプチドのちょうどのフラグメントであり得る。タンパク
質は、単一の分子であり得るか、または複数の分子の複合体であり得る。用語タ
ンパク質はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の
人工的な化学アナログである、アミノ酸ポリマーに適用され得る。１つ以上のア
ミノ酸残基が「不自然な」アミノ酸であり、任意の天然に存在するアミノ酸に対
応しないアミノ酸ポリマーはまた、本明細書中で用語「タンパク質」の使用によ
って包含される。
【００１９】 「タンパク質のフラグメント」とは、別のタンパク質の部分であるタンパク質
を意味する。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養された細胞から単離さ
れた全長タンパク質を設計することによって得られるポリペプチドであり得る。
タンパク質のフラグメントは、代表的には、少なくとも６アミノ酸を含む。より
代表的には、このフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸を含む。好ましくは
、このフラグメントは、少なくとも約１６アミノ酸を含む。
【００２０】 「発現産物」は、タンパク質のような生体分子であり、これは、生物中の遺伝
子が発現される場合に生成される。発現産物は、必要に応じて、翻訳後修飾を含
み得る。
【００２１】 用語「抗体」とは、天然であっても部分的もしくは全体的に合成的に生成され
ていてもよい、イムノグロブリンを意味する。特異的結合能力を維持するその全
ての誘導体もまた、この用語に含まれる。この用語はまた、イムノグロブリン結
合ドメインに相同であるかまたは大部分相同である結合ドメインを有する任意の
タンパク質を包含する。これらのタンパク質は、天然の供給源、または部分的も
しくは全体的に合成的に生成されたもの由来であり得る。抗体は、モノクローナ
ルまたはポリクローナルであり得る。この抗体は、任意のイムノグロブリンクラ
スのメンバーであり得、これは、以下のヒトクラスのいずれかを含む：ＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ。しかし、ＩｇＧクラスの誘導体が、本
発明において好ましい。
【００２２】 用語「抗体フラグメント」とは、全長未満である抗体の任意の誘導体をいう。
好ましくは、この抗体フラグメントは、全長抗体の特異的結合能力の少なくとも
有意な部分を保持する。抗体フラグメントの例としては、以下が挙げられるがこ
れらに限定されない：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄ
ｓＦｖダイアボディ、およびＦｄフラグメント。この抗体フラグメントは、任意
の手段によって生成され得る。例えば、この抗体フラグメントは、インタクトな
抗体のフラグメント化によって酵素的または化学的に生成され得るか、または部
分抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に生成され得る。あるいは、この抗
体フラグメントは、全体的または部分的に合成的に生成され得る。この抗体フラ
グメントは、必要に応じて、単鎖抗体フラグメントであり得る。あるいは、この
フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によってともに連結される複数の鎖
を含み得る。このフラグメントはまた、必要に応じて、多分子複合体であり得る
。機能的抗体フラグメントは、代表的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、
そしてより代表的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００２３】 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカーによって互いに共有的に接続
された、可変軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）のみからなる組換え抗体フラグ
メントである。ＶLまたはＶHのいずれかは、ＮＨ2末端ドメインであり得る。こ
のポリペプチドリンカーは、２つの可変ドメインが、深刻な立体干渉を伴わずに
架橋される限りは、可変長および組成であり得る。代表的には、このリンカーは
、可溶性について分散したいくつかのグルタミン酸またはリジン残基とともに、
おもにグリシンおよびセリン残基のストレッチから構成される。「ダイアボディ
」は、二量体ｓｃＦｖである。ダイアボディの成分は、代表的には、ほとんどの
ｓｃＦｖより短いペプチドリンカーを有し、そして二量体として会合するための
優先度を示す。
【００２４】 「Ｆｖ」フラグメントは、非共有相互作用によってともに保持される１つのＶ H および１つのＶLドメインからなる。用語「ｄｓＦｖ」は、ＶH−ＶL対を安定化
するように、操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖをいうために本明
細書中で使用される。
【００２５】 「Ｆ（ａｂ’）2」フラグメントは、ｐＨ４．０〜４．５にて酵素ペプシンを
用いる消化によってイムノグロブリン（代表的には、ＩｇＧ）から得られるもの
と本質的に等価な抗体フラグメントである。このフラグメントは、組換え的に生
成され得る。
【００２６】 「Ｆａｂ」フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおいて２つの重鎖
片を結合するジスルフィド架橋（単数または複数）の還元によって得られるもの
と本質的に等価な抗体フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、組換え的
に生成され得る。
【００２７】 「Ｆａｂ」フラグメントは、酵素パパインを用いるイムノグロブリン（代表的
には、ＩｇＧ）の消化によって得られるものと本質的に等価な抗体フラグメント
である。このＦａｂフラグメントは、組換え的に生成され得る。このＦａｂフラ
グメントの重鎖セグメントは、Ｆｄ片である。
【００２８】 「生物中の細胞の集団」とは、単一の生物中の１より多い細胞のコレクション
または単一の生物にもともと由来する１より多い細胞のコレクションを意味する
。このコレクション中の細胞は、好ましくは、同じ型の全てである。これらは全
て、例えば、生物中の同じ組織由来であり得る。最も好ましくは、集団中の細胞
の全てにおける遺伝子発現は、同一であるか、またはほぼ同一である。
【００２９】 「タンパク質結合に適した条件」とは、固定されたタンパク質−捕捉剤と溶液
中のその結合パートナーとの間に生じる結合を可能にする条件（塩濃度、ｐＨ、
界面活性剤、タンパク質濃度、温度などの点において）を意味する。好ましくは
、この条件は、有意な量の非特異的タンパク質結合が生じるに寛容ではない。
【００３０】 「体液」は、生物または生物の組織から抽出されるか、排出されるか、または
分泌される、任意の液体物質であり得る。体液は、細胞を含む必要はない。本発
明に関連する体液としては、全血、血清、尿、血漿、脳脊椎液、涙、滑液、およ
び羊水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】 「アレイ」は、基板上のパターンにおける実体の配置である。このパターンは
、代表的には、２次元パターンであるが、このパターンはまた、３次元パターン
であってもよい。
【００３２】 「タンパク質−捕捉剤のパッチ」とは、基板の表面上に固定化されたタンパク
質−捕捉剤の個別の領域を意味する。このパッチは、幾何学的形状であり得るか
または不規則的な形状であり得る。例えば、このパッチは、四角の形状であり得
るが、それは必要ではない。
【００３３】 「プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」とは、プロテオーム（ｐｒｏｔ
ｅｏｍｅ）またはプロテオームのいくつかの画分のいずれかの研究または特徴づ
けを意味する。「プロテオーム」は、細胞または細胞の集団の細胞内タンパク質
およびこの細胞または細胞の集団によって分泌されるタンパク質の全コレクショ
ンである。この特徴づけは、最も代表的には、細胞によって発現されているタン
パク質の存在および通常は質の測定を含む。タンパク質の機能、構造特徴（例え
ば、翻訳後修飾）、およびその細胞内の配置もまた、研究され得る。「機能的プ
ロテオミクス」とは、細胞または細胞の集団のタンパク質発現産物の機能的特徴
、活性レベル、および構造特徴の研究をいう。
【００３４】 用語「基板」とは、本発明のアレイの、バルクの、基礎であり、かつコア材料
をいう。
【００３５】 用語「微細加工」および「微細製造（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）は
ともに、微細構造（ミリメートル以下のスケールの特徴サイズを有する構造）の
作製において有用な任意の数の技術をいう。このような技術としては、レーザー
切除、電着、物理的蒸着および化学的蒸着、写真平板、ならびに湿潤化学および
乾燥エッチングが挙げられるが、これらに限定されない。注入成形およびＬＩＧ
Ａ（Ｘ線平板、電着、および成形）のような関連技術もまた含まれる。これらの
技術のほとんどは、もともと、半導体、超小型電子技術、および超小型電子機械
システム（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ：ＭＥＭＳ）において使用するために開発されているが、本発明にも同様に適
用可能である。
【００３６】 用語「コーティング」とは、基板の表面上に天然に形成されるかまたは合成的
に形成されるか、あるいは基板の表面に適用されるかのいずれかである層を意味
する。例えば、基板（例えば、シリコン（またはケイ素））の空気への曝露は、
曝露された基板の酸化を生じる。シリコンから作製された基板の場合において、
酸化ケイ素コーティングは、空気に対する曝露の際に、基板上に形成される。他
の場合において、このコーティングは、基板に由来せず、そして機械的、物理的
、電気的、または化学的手段を介して、表面上に配置され得る。この型のコーテ
ィングの例は、シリコンまたはポリマー基板に適用される金属コーティング、あ
るいは、シリコン基板に適用される窒化ケイ素である。コーティングは任意の厚
さであり得るが、代表的には、このコーティングは、基板より薄い厚さを有する
。
【００３７】 「内部層」は、第１のコーティングと基板との間に位置するさらなるコーティ
ングまたは層である。複数の内部層は、必要に応じてともに使用され得る。代表
的な内部層の主な目的は、第１のコーティングと基板との間の接着を補助するこ
とである。１つのこのような例は、金コーティングをシリコンまたはガラス表面
に接着することを助けるためのチタン内部層またはクロム内部層の使用である。
しかし、内部層の他の可能な機能もまた予測される。例えば、いくつかの内部層
は、アレイの検出システムにおける役割を実行し得る（例えば、半導体または不
伝導基板と不伝導コーティングとの間の金属層）。
【００３８】 「有機薄層」は、基板、または存在する場合、基板上のコーティングに適用さ
れている有機分子の薄層である。代表的には、有機薄層は、約２０ｎｍ未満の厚
さである。必要に応じて、有機薄層は、約１０ｎｍ未満の厚さであり得る。有機
薄層は、無秩序であっても、順序良く並べられていてもよい。例えば、有機薄層
は、非晶質（例えば、化学吸着またはスピンコートされた（ｓｐｉｎ−ｃｏｒｔ
ｅｄ）ポリマー）であり得るかまたは高度に組織化され得る（例えば、ラングミ
ュア−ブロジェット膜または自己集合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｍｂｌｅｄ）単層）で
あり得る。有機薄層は、不均一であっても、均一であってもよい。単層である有
機薄層が好ましい。脂質二重層または単層が、好ましい有機薄層である。必要に
応じて、この有機薄層は、１より多い形態の有機薄層の組み合わせを含み得る。
例えば、有機薄層は、自己集合単層の頂部に、脂質二重層を含み得る。ヒドロゲ
ルもまた、有機薄層を構成し得る。この有機薄層は、代表的には、その表面上に
露出された官能基を有し、これは、基板の表面状態または基板上のコーティング
を、任意の数の方法において増強するように作用する。例えば、この有機薄層の
露出された官能基は、代表的には、アレイのパッチへのタンパク質−捕捉剤の結
合または共有固定化に有用である。あるいは、この有機薄層は、表面上への分子
の非特異的結合を減少させる官能基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）を保有し得る。他の露出された官能基は、この薄層を、基板の表面またはコー
ティングへとつなぐように作用する。この有機薄層の特定の官能基はまた、表面
とともに使用されるべき特定の検出技術を可能にするように設計され得る。ある
いは、この有機薄層は、基板の表面または基板の表面上のコーティングとの接触
の際に生じるタンパク質−捕捉剤またはタンパク質−捕捉剤によって結合される
べきタンパク質の不活化を防止する目的を提供し得る。
【００３９】 「単層」は、単一分子の密な有機薄膜である。単層は、無秩序であり得るかま
たは秩序付けられ得る。単層は、必要に応じて、ポリ非イオン性ポリマー、ポリ
イオン性ポリマー、またはブロック−コポリマーのような高分子化合物であり得
る。例えば、単層は、ポリリジンのようなポリ（アミノ酸）から構成され得るが
、自己集合単層である単層が、最も好ましい。自己集合単層の一方の表面は、代
表的には、基板（または、存在するならば、基板のコーティング）表面に化学吸
着されるかまたは物理吸着される有機分子の末端の化学的官能基から構成される
。単層の適切な官能基の例としては、負に荷電した表面での使用についてはポリ
−Ｌ−リジンの正に荷電したアミノ基、および金表面での使用についてはチオー
ルが挙げられる。代表的に、自己集合単層の他方の表面は露出され、そして任意
の数の化学的官能基（末端基）を有し得る。好ましくは、自己集合単層の分子は
、高度に秩序付けられている。
【００４０】 「自己集合単層」は、分子の自発性アセンブリにより作製された単層である。
自己集合単層は、秩序付けられ得るか、無秩序であり得るか、または短距離〜長
距離のオーダーを示し得る。
【００４１】 「アフィニティータグ」は、タンパク質−捕捉剤を、有機薄膜の露出された官
能基に、直接的もしくは間接的に固定化し得る官能部分である。好ましくは、ア
フィニティータグは、部位特異的な固定化を可能にし、従って、タンパク質−捕
捉剤の有機薄膜への配向性を増大する。場合によっては、アフィニティータグは
、単純な化学的官能基であり得る。他の可能性としては、アミノ酸、ポリ（アミ
ノ酸）タグ、または全長タンパク質が挙げられる。なお、他の可能性としては、
炭水化物および核酸が挙げられる。例えば、アフィニティータグは、有機薄膜上
の官能基として作用する別のポリヌクレオチド、またはアダプターとして作用す
る別のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得る。ア
フィニティータグはまた、合成化学部分であり得る。各パッチの有機薄膜が、脂
質二重層または脂質単層を含む場合、膜アンカーが適切なアフィニティータグで
ある。アフィニティータグは、タンパク質−捕捉剤に、共有結合的にかまたは非
共有結合的に結合され得る。例えば、アフィニティータグが、タンパク質−捕捉
剤に共有結合される場合、これは、化学的結合を介してかまたは融合タンパク質
として結合され得る。アフィニティータグはまた、切断可能な連結を介して、タ
ンパク質−捕捉剤に結合され得る。あるいは、アフィニティータグは、タンパク
質−捕捉剤と直接的に接触し得ない。代わりに、アフィニティータグは、アダプ
ターによりタンパク質−捕捉剤から分離され得る。アフィニティータグは、有機
薄膜にタンパク質−捕捉剤を、非共有結合的相互作用または共有結合のいずれか
を介して固定化し得る。
【００４２】 「アダプター」は、本発明の目的のために、アフィニティータグをタンパク質
−捕捉剤に連結する任意の実体である。アダプターは、必ずしも必要ではないが
、アフィニティータグおよびタンパク質−捕捉剤の両方に非共有結合的に結合さ
れた別個の分子であり得る。代わりに、アダプターは、アフィニティータグもし
くはタンパク質−捕捉剤、またはその両方に共有結合され得る（例えば、化学的
結合を介してかまたは融合タンパク質として）。全長タンパク質、ポリぺプチド
、またはペプチドのようなタンパク質は、代表的なアダプターである。他の可能
性のあるアダプターとしては、炭水化物または核酸が挙げられる。
【００４３】 用語「融合タンパク質」は、２つ以上のポリぺプチドからなるタンパク質をい
う。これらのポリぺプチドは、代表的には、それらの天然状態では結合されてい
ないが、単一の連続したポリぺプチドを形成させるために、それらの個々のアミ
ノ末端およびカルボキシ末端によりペプチド結合を介して結合される。２つ以上
のポリぺプチド成分は、直接的に、またはペプチドリンカー／スペーサーを介し
て間接的にのいずれかで結合され得ることが理解される。
【００４４】 用語「正常な生理学的状態」は、代表的には、生きている生物体または細胞の
内部の状態を意味する。いくつかの器官または生物体は、極度な状態を提供する
ことが理解されているが、生物体内部および細胞内部の環境は、通常、ｐＨ７付
近（すなわち、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）を変動し、主な溶媒として水を含み、
そして０℃より高く５０℃未満の温度で存在する。種々の塩の濃度は、参考とし
て使用される器官、生物体、細胞、または細胞区画に依存することが理解される
。
【００４５】 （（ｂ）本発明のアレイ） 本発明は、生物体の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントで
ある複数のタンパク質を結合し得る、タンパク質−捕捉剤のアレイに関し、それ
ゆえ、遺伝子発現をタンパク質レベルで評価するために使用され得る。代表的に
、このアレイは、基板表面を被覆する有機薄膜上に固定された、マイクロメータ
ー規模の、２次元パターンのタンパク質−捕捉剤パッチを含む。
【００４６】 本発明の１つの実施態様において、タンパク質−捕捉剤のアレイは、基板、こ
の基板表面のある程度または全てを被覆する少なくとも１つの有機薄膜、ならび
に有機薄膜で覆われた基板表面部分上の別個の既知の領域に配置された複数のパ
ッチを含み、ここで、（ｉ）各パッチは、有機薄膜上に固定されたタンパク質−
捕捉剤を含み、ここで、所定のパッチのこのタンパク質−捕捉剤は、生物体の細
胞または細胞集団の特定の発現産物またはそのフラグメントを結合し得、そして
（ｉｉ）このアレイは、複数の異なるタンパク質−捕捉剤を含み、これらの各々
は、その細胞または細胞集団の異なる発現産物またはそのフラグメントを結合し
得る。
【００４７】 タンパク質−捕捉剤は、好ましくは、直接的にかまたは間接的にかのいずれか
で、アレイのパッチに共有結合により固定化される。ほとんどの場合、アレイは
、少なくとも約１０個のパッチを含む。好ましい実施態様において、アレイは、
少なくとも約５０個のパッチを含む。特に好ましい実施態様において、アレイは
、少なくとも約１００個のパッチを含む。代替の好ましい実施態様において、タ
ンパク質−捕捉剤のアレイは、１０3、１０4、または１０5個より多いパッチを
含み得る。
【００４８】 各パッチによって被覆された基板表面の面積は、好ましくは、わずか０．２５
ｍｍ2にすぎない。好ましくは、各パッチで被覆された基板表面の面積は、約１
μｍ2と約１０，０００μｍ2との間である。特に好ましい実施態様において、各
パッチは、基板表面の約１００μｍ2〜約２，５００μｍ2の面積を被覆する。代
替の実施態様において、アレイ上のパッチは、基板表面の約２，５００ｎｍ2ほ
ど小さい面積を被覆し得るが、このような小サイズのパッチは、一般的に、アレ
イの使用のためには必要ない。
【００４９】 アレイのパッチは、任意の幾何学的形状であり得る。例えば、パッチは、短形
または円形であり得る。アレイのパッチはまた、不揃いな形状であり得る。パッ
チは、必要に応じて、基礎をなす基板の中央面（ｍｅｄｉａｎ ｐｌａｎｅ）か
ら増大される。
【００５０】 アレイのパッチを隔てる距離は、変動し得る。好ましくは、アレイのパッチは
、隣接するパッチと約１μｍ〜約５００μｍ隔てられる。代表的には、パッチを
隔てる距離は、パッチが約１０μｍの寸法より大きい場合、おおよそ、アレイ上
のパッチの直径または横の長さに比例する。パッチサイズが小さい場合、パッチ
を隔てる距離は、代表的に、パッチの寸法より大きい。アレイの好ましい実施態
様において、アレイのパッチは、基板表面上の約１ｃｍ2以内の面積中に全てが
含まれる。アレイの１つの好ましい実施態様において、それゆえ、アレイは、基
板表面上の約１ｃｍ2以内の総面積中に１００個以上のパッチを含む。あるいは
、特に好ましいアレイは、約１ｃｍ2以内の総面積中に１０3個以上のパッチを含
む。好ましいアレイは、必要に応じて、基板表面上の約１ｃｍ2以下の面積内に
１０4個もしくは１０5個またはそれ以上のパッチをなお含み得る。本発明の他の
実施態様において、アレイの全てのパッチは、基板表面上の約１ｍｍ2以下の面
積内に含まれる。
【００５１】 代表的に、１つの型のタンパク質−捕捉剤のみが、アレイの単一のパッチ上に
存在する。１つより多い型のタンパク質−捕捉剤が、単一のパッチ上に存在する
場合、そのパッチの全てのタンパク質−補足薬剤は、共通の結合パートナーを共
有せねばならない。例えば、パッチは、同じ抗原に対する種々のポリクローナル
抗体を含み得る（潜在的に、抗体は、同じ抗原上の異なるエピトープを結合し得
るが）。
【００５２】 本発明のアレイは、かなり多数の複数の異なるタンパク質−捕捉剤を有し得る
。代表的に、アレイは、少なくとも約１０個の異なるタンパク質−捕捉剤を含む
。好ましくは、アレイは、少なくとも約５０個の異なるタンパク質−捕捉剤を含
む。さらに好ましくは、アレイは、少なくとも約１００個の異なるタンパク質−
捕捉剤を含む。あるいは、好ましいアレイは、約１０3個より多い異なるタンパ
ク質−捕捉剤、または約１０4個より多い異なるタンパク質−捕捉剤を含む。ア
レイは、さらに、必要に応じて、約１０5個を超える異なるタンパク質−補足薬
剤を含み得る。
【００５３】 アレイ上の異なるタンパク質−捕捉剤の数は、所望の適用に依存して変動する
。例えば、アレイが、患者の腫瘍または他の罹患した組織の状態を評価する診断
用ツールとして使用されるべき場合、アレイ上のタンパク質−捕捉剤の必要な結
合パートナーは、発現が疾患状態の指標であることが公知のタンパク質のみに制
限されるので、約１００個より少ない異なるタンパク質−捕捉剤を含むアレイで
十分であり得る。しかし、アレイが、細胞のタンパク質の総含有量の有意な部分
を測定するために使用される場合、アレイは、好ましくは、少なくとも約１０，
０００個の異なるタンパク質−捕捉剤を含む。あるいは、種々のヒト転写因子の
量の研究のようなより制限されたプロテオミクス研究は、例えば、約１００個の
異なるタンパク質−捕捉剤のアレイのみを必要とし得る。
【００５４】 アレイの１つの実施態様において、アレイの各パッチは、異なるタンパク質−
捕捉剤を含む。例えば、約１００個のパッチを含むアレイは、約１００個の異な
るタンパク質−捕捉剤を含み得る。同様に、約１０，０００個のパッチのアレイ
は、約１０，０００個の異なるタンパク質−捕捉剤を含み得る。しかし、代替の
実施態様において、各々の異なるタンパク質−捕捉剤が、アレイ上の１個より多
い別々のパッチに固定化される。例えば、各々の異なるタンパク質−捕捉剤は、
必要に応じて、２〜６個の異なるパッチ上に存在し得る。それゆえ、本発明のア
レイは、約３，０００個のタンパク質−捕捉剤パッチを含み得るが、各々の異な
るタンパク質−捕捉剤が３つの異なるパッチ上に存在するので、約１，０００個
のみの異なるタンパク質−捕捉剤を含み得る。
【００５５】 代表的に、アレイ上の複数の異なるタンパク質−捕捉剤に結合され得る、異な
るタンパク質の数は、少なくとも約１０である。しかし、アレイ上の複数の異な
るタンパク質−捕捉剤は、より多くの数の異なるタンパク質（例えば、少なくと
も約５０または少なくとも約１００）を結合し得ることが好ましい。なおさらに
好ましい実施態様において、アレイ上の複数の異なるタンパク質は、少なくとも
約１０3のタンパク質を結合し得る。細胞の全タンパク質含量またはその重要な
画分をアッセイすることが所望される場合のような、いくつかの適用のために、
この複数のタンパク質−捕捉剤が、少なくとも約１０4の異なるタンパク質また
は少なくとも約１０5の異なるタンパク質でさえも結合可能であるアレイが、最
も好ましい。本発明の１つの実施態様において、アレイ上のこの複数のタンパク
質−捕捉剤の結合パートナーは、単一の生物体の細胞または細胞集団の、発現産
物全体であるタンパク質あるいはそのフラグメントである。この発現産物は、任
意の大きさまたは機能のタンパク質（ペプチドを含む）であり得る。これらは、
細胞内タンパク質または細胞外タンパク質であり得る。この発現産物は、単細胞
生物由来または多細胞生物由来であり得る。この生物は、植物または動物であり
得る。本発明の好ましい実施態様において、この結合パートナーは、ヒト発現産
物またはそのフラグメントである。
【００５６】 本発明の１つの実施態様において、アレイのタンパク質−捕捉剤の結合パート
ナーは、全てのタンパク質（ペプチドを含む）の無作為に選択されたサブセット
（これらのタンパク質は、所定の生物の細胞または細胞集団によって発現される
）であり得るか、あるいはこれらのタンパク質の全てのフラグメントのサブセッ
トであり得る。従って、アレイのタンパク質−捕捉剤の結合パートナーは、必要
に応じて、単一の生物由来の異なるタンパク質の広範な分布を示す。
【００５７】 アレイ上のいくつかのまたは全てのタンパク質−捕捉剤の結合パートナーは、
必ずしも既知である必要はない。このアレイのタンパク質−捕捉剤の結合パート
ナーは、未知の機能のタンパク質またはペプチドであり得る。例えば、このアレ
イの異なるタンパク質−捕捉剤は、その多くが正体および／または機能が未知で
ある、単一の細胞型由来の広範な細胞性タンパク質を一緒に結合する。
【００５８】 本発明の別の実施態様において、アレイ上のタンパク質−捕捉剤の結合パート
ナーは、関連するタンパク質である。このタンパク質−捕捉剤によって結合され
る異なるタンパク質は、必要に応じて、同じタンパク質ファミリーのメンバーで
あり得る。アレイのタンパク質−捕捉剤の異なる結合パートナーは、機能的に関
連するか、または機能的に関連することがただ疑われるだけかのいずれかであり
得る。このアレイのタンパク質−捕捉剤によって結合される異なるタンパク質は
また、構造または配列において類似性を共有するか、あるいは構造または配列に
おいて類似性を共有することが単に疑われるタンパク質であり得る。例えば，こ
のアレイ上のタンパク質−捕捉剤の結合パートナーは全て、必要に応じて、成長
因子レセプター、ホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、カテコールア
ミンレセプター、アミノ酸誘導体レセプター、サイトカインレセプター、細胞外
マトリクスレセプター、抗体、レクチン、サイトカイン、セルピン、プロテアー
ゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ｒａｓ様ＧＴＰアーゼ、加水分解酵素、ステロ
イドホルモンレセプター、転写因子、熱ショック転写因子、ＤＮＡ結合タンパク
質、ジンクフィンガータンパク質、ロイシンジッパータンパク質、ホメオドメイ
ンタンパク質、細胞内シグナル伝達モジュレーターおよびエフェクター、アポト
ーシス関連因子、ＤＮＡ合成因子、ＤＮＡ修復因子、ＤＮＡ組換え因子、細胞表
面抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）プロテアーゼまたはＨＩＶプロテアーゼで
あり得る。
【００５９】 本発明の代替的実施態様において、アレイのタンパク質−捕捉剤の結合パート
ナーであるタンパク質は、生物の細胞または細胞集団の発現産物のフラグメント
であり得る。
【００６０】 アレイ上のタンパク質−捕捉剤は、タンパク質を結合し、そしてタンパク質を
アレイ上のタンパク質−捕捉剤の部位に固定させる能力を有する、任意の分子ま
たは分子の複合体であり得る。好ましくは、このタンパク質−捕捉剤は、その結
合パートナーを実質的に特異的な様式で結合する。従って、このタンパク質−捕
捉剤は、必要に応じて、細胞におけるその天然の機能が、別のタンパク質（例え
ば、抗体またはレセプター）を特異的に結合することであるタンパク質であり得
る。あるいは、代わりにタンパク質−捕捉剤は、タンパク質を特異的に結合する
、部分的または全体的に、合成タンパク質あるいは組換えタンパク質であり得る
。あるいは、このタンパク質−捕捉剤は、変異誘発されたライブラリー、無作為
化されたライブラリー、または完全に無作為かつ合成のライブラリーから、特定
のタンパク質またはペプチド標的に対するその結合親和性によって、インビトロ
で選択されたタンパク質であり得る。使用される選択方法は、必要に応じて、リ
ボソームディスプレイまたはファージディスプレイのようなディスプレイ方法で
あり得る（以下を参照のこと）。あるいは、このインビトロ選択によって得られ
るタンパク質−捕捉剤は、タンパク質標的を特異的に結合するＤＮＡまたはＲＮ
Ａアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）であり得る（例えば：Ｐｏｔｙｒａｉｌｏら、
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０：３４１９−２５，１９９８；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４２７２−７，１９９８
；Ｆｕｋｕｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，（３７
）：２３７−８，１９９７）。あるいは、このインビトロ選択されたタンパク質
−捕捉剤は、ポリペプチドであり得る（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０２，
１９９７）。代替的な実施態様において、タンパク質−捕捉剤は、コンビナトリ
アルケミストリーライブラリーから選択されるか、または生物から単離される、
低分子であり得る。
【００６１】 しかし、アレイの好ましい実施態様において、タンパク質−捕捉剤は、タンパ
ク質である。特に好ましい実施態様において、タンパク質−捕捉剤は、抗体また
は抗体フラグメントである。抗体部分が本明細書中に例示されるが、本発明のア
レイおよび方法が、他のタンパク質−捕捉剤と共に有利に利用され得ることが理
解される。
【００６２】 アレイの抗体または抗体フラグメントは、必要に応じて、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグ
メント、ｄｓＦｖ二重抗体、Ｆｄフラグメント、全長の抗原特異的ポリクローナ
ル抗体、または全長のモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施態様におい
て、アレイのタンパク質−捕捉剤は、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント
または単鎖Ｆｖである。抗体または抗体フラグメントは、公知の、よく特徴づけ
られたタンパク質に対する、モノクローナル抗体（市販の抗体でさえ）であり得
る。あるいは、抗体フラグメントは、ファージディスプレイ法を使用するライブ
ラリーからの選択によって誘導される。抗体フラグメントが公知のタンパク質に
対する結合親和性に基づく選択によって個々に誘導される場合、この抗体フラグ
メントの結合パートナーは、公知である。本発明の代替的な実施態様において、
抗体フラグメントは、細胞抽出物または体液の（代表的には、固定化された）タ
ンパク質に対する結合親和性に基づく選択を包含する、ファージディスプレイ法
によって誘導される。この実施態様において、アレイの抗体フラグメントのいく
つかまたは多くは、未知の正体および／または機能のタンパク質を結合する。
【００６３】 複数の発現産物、またはそのフラグメントを結合するためのタンパク質−捕捉
剤のアレイを使用する際に、結合されたタンパク質のアレイが作製される。従っ
て、本発明の別の実施態様は、（ａ）本発明のタンパク質−捕捉剤のアレイおよ
び（ｂ）生物の細胞または細胞集団の、発現産物あるいはそのフラグメントであ
る、複数の異なるタンパク質を含む、結合されたタンパク質のアレイを提供する
。ここで、各々の異なるタンパク質は、アレイの別々のパッチ上のタンパク質−
捕捉剤に結合される。好ましくは、各々のこの異なるタンパク質は、タンパク質
−捕捉剤に非共有結合的に結合される。
【００６４】 （（Ｃ）基板、コーティング、および有機薄膜） アレイの基板は、有機または無機、生物学的または非生物学的のいすれかであ
り得るか、あるいはこれらの材料の任意の組み合わせであり得る。１つの実施態
様において、基板は、透明または半透明である。パッチが位置する基板表面の部
位は、好ましくは、平面であり、そして堅固または半堅固である。しかし、本発
明のアレイは、必ずしも、平面または全体的に二次元である必要はない。有意な
位相特徴は、パッチ周辺、パッチ間、またはパッチの下の基板表面上に存在し得
る。例えば、壁または他の障壁は、アレイのパッチを隔て得る。多くの材料が、
本発明のアレイの実施態様における基板としての使用に適切である。例えば、本
発明のアレイの基板は、シリコン、シリカ、石英、ガラス、制御細孔ガラス、カ
ーボン、アルミナ、二酸化チタン、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化ケイ素、
ゼオライト、およびヒ化ガリウムからなる群より選択される材料を含み得る。金
、白金、アルミニウム、銅、チタン、およびこれらの合金のような多くの金属も
また、アレイの基板の選択肢である。さらに、多くのセラミックおよびポリマー
もまた、基板として使用され得る。基板として使用され得るポリマーとしては、
以下を含むが、これらに限定されない：ポリスチレン；ポリ（テトラ）フルオロ
エチレン（ＰＴＦＥ）；ポリフッ化ビニリデン；ポリカーボネート；ポリメタク
リル酸メチル；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリ（エーテルエー
テル）ケトン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラ
クチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）；
ポリプロピルエチレン、ポリエチレン；ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（Ｈ
ＥＭＡ）；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；および
ブロックコポリマー。アレイのための好ましい基板は、シリコン、シリカ、ガラ
ス、およびポリマーを含む。パッチが位置する基板はまた、任意の上記基板材料
の組み合わせであり得る。本発明のアレイは、必要に応じて、基板とそのパッチ
の有機薄膜との間にコーティングをさらに含み得る。このコーティングは、基板
上で形成されるか、基板に適用されるかのいずれかであり得る。基板は、例えば
、物理蒸着（ＰＶＤ）、プラズマ強化化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）、または熱処理に
基づく、薄膜技術を使用することによって、コーティングを用いて改変され得る
。あるいは、プラズマ曝露を使用して、基板を直接的に活性化または改変し、そ
してコーティングを作製し得る。例えば、プラズマエッチング手段を使用して、
ポリマー表面を酸化し（例えば、ポリスチレンまたはポリエチレンに、ヒドロキ
シル、カルボン酸、アルデヒドなどのような極性官能基を曝露する）、この表面
は、次いでコーティングとして作用する。コーティングは、必要に応じて金属薄
膜である。可能な金属膜としては、アルミニウム、クロム、チタン、タンタル、
ニッケル、ステンレス鋼、亜鉛、鉛、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、カドミ
ウム、タングステン、コバルト、およびこれらの合金または酸化物が挙げられる
。好ましい実施態様において、金属薄膜は、貴金属薄膜である。コーティングに
使用され得る貴金属としては、金、白金、銀および銅が挙げられるが、これらに
限定されない。特定の好ましい実施態様において、コーティングは、金または金
の合金を含む。電子ビーム蒸着は、基板の表面上に金の薄いコーティングを提供
するために使用され得る。好ましい実施態様において、金属薄膜は、厚さ約５０
ｎｍ〜約５００ｎｍである。代替的な実施態様において、金属薄膜は、厚さ約１
ｎｍ〜約１μｍである。
【００６５】 代替的な実施態様において、コーティングは、シリコン、二酸化珪素、二酸化
チタン、酸化タンタル、窒化珪素、水素化珪素、酸化インジウムスズ（ｉｎｄｉ
ｕｍ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ）、酸化マグネシウム、アルミナ、ガラス、ヒドロキ
シル化表面、およびポリマーからなる群より選択される組成物を含む。
【００６６】 本発明のアレイの１つの実施態様において、コーティングの表面は、原子的に
平らである。この実施態様において、コーティング表面の平均あらさは、少なく
とも２５μｍ2の面積について約５Å未満である。好ましい実施態様において、
コーティング表面の平均あらさは、少なくとも２５μｍ2の面積について約３Å
未満である。超平面コーティングは、必要に応じて、Ｈｅｇｎｅｒら、Ｓｕｒｆ
ａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、２９１：３９−４６およびＷａｇｎｅｒら
、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９５、１１：３８６７−３８７５（これら両方が、本
明細書中に参考として援用される）に記載のように、鋳型ストリッピング加工（
ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）表面であり得る。
【００６７】 多くのアレイのコーティングは上記コーティングと基板との間に少なくとも１
つの接着層の付加が必要であることが意図される。代表的には、この接着層は、
少なくとも６Åの厚さであり、そしてより厚くてもよい。例えば、シリコンウエ
ハと金コーティングとの間には、チタン層またはクロム層が望ましくあり得る。
代替的な実施態様において、エポキシ接着剤（例えば、Ｅｐｏ−ｔｅｋ ３７７
（登録商標）、Ｅｐｏ−ｔｅｋ ３０１−２（登録商標）（Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
））は、基板へのコーティングの接着を補助するために好適であり得る。どの材
料が接着層に使用されるべきかに関する決定は、一旦基板およびコーティングの
両方について材料が選択されれば、当業者には明らかである。他の実施態様にお
いて、さらなる接着メディエータまたは接着中間層は、アレイの光学的特性（例
えば、検出目的の導波管）を改善するために必要であり得る。
【００６８】 基板上のコーティング（存在する場合）の沈着および形成は、その上に有機薄
膜が形成される前に行われる。いくつかの異なる型のコーティングが表面上で組
み合わせられ得る。このコーティングは、基板表面全体またはそのわずかな部分
を覆い得る。コーティングのパターンは、タンパク質捕捉剤を固定化するために
使用される有機薄膜のパターンと同一でもよいし、そうでなくともよい。本発明
の１つの実施態様において、このコーティングは、タンパク質捕捉剤のパッチの
部分でのみ、その基板表面を覆う。有機薄膜適合性である基板表面上のコーティ
ングパッチの形成のために有用な技術は、当業者に周知である。例えば、基板上
のコーティングのパッチは、必要に応じて、写真平版法、微小成形法（ＰＣＴ公
開ＷＯ９６／２９６２９）、湿潤化学エッチングまたはドライエッチング、また
はこれらの任意の組み合わせにより製作され得る。タンパク質捕捉剤のパッチの
各々が存在する有機薄膜は、基板自体の上または基板を覆うコーティング上のい
ずれかに層を形成する。パッチのタンパク質捕捉剤が固定化される有機薄膜は、
好ましくは、約２０ｎｍ厚さ未満である。本発明のいくつかの実施態様において
、パッチの各々の有機薄膜は、約１０ｎｍ厚さ未満であり得る。
【００６９】 種々の異なる有機薄膜が本発明における使用に適切であり得る。有機薄膜を形
成するための方法としては、表面からのインサイチュ成長、物理吸着、スピンコ
ーティング、化学吸着、自己アセンブリ、または気相からのプラズマ起動重合に
よる沈着が挙げられる。例えば、デキストランのような材料から構成されるヒド
ロゲルは、アレイのパッチの上の適切な有機薄膜として働き得る。本発明の１つ
の好適な実施態様において、この有機薄膜は脂質二重層であり得る。別の好まし
い実施態様において、アレイのパッチの各々の有機薄膜は、単層である。負に荷
電した基板またはコーティング上に吸着したポリアルギニンまたはポリリジンの
単層は有機薄膜についての１つの選択肢である。別の選択肢は、束縛されたポリ
マー鎖の無秩序な単層である。特定の好ましい実施態様において、この有機薄膜
は、自己集合単層である。この有機薄膜は、最も好ましくは、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分
子を含む自己集合単層である。ここで、Ｒはスペーサーであり、Ｘは、表面にＲ
を結合させる官能基であり、そしてＹは、単層上にタンパク質捕捉剤を結合させ
るための官能基である。別の好ましい実施態様において、自己集合単層は、式（
Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子から構成され、ここでａおよびｂは、独立して、１以上の
整数であり、そしてＸ、ＲおよびＹは、上記で規定されたとおりである。別の好
ましい実施態様において、この有機薄膜は、有機層の組み合わせ（例えば、式Ｘ
−Ｒ−Ｙの分子の自己集合単層の上部に固定化された脂質二重層の組み合わせ）
を含む。別の例としては、ポリリジンの単層はまた、必要に応じて、式Ｘ−Ｒ−
Ｙの分子の自己集合単層と組み合わされ得る（米国特許第５，６２９，２１３号
を参照のこと）。
【００７０】 全ての場合において、このコーティング（またはコーティングがない場合は基
板自体）は、その表面上に有機薄膜の化学吸着または物理吸着と適合性でなけれ
ばならない。例えば、パッチが、基板と式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子の単層との間のコー
ティングを含む場合、このコーティングは、適切な官能基Ｘが利用可能である材
料から構成されなければならないことが理解される（以下を参照のこと）。この
ようなコーティングが全く存在しない場合、基板は、適切な官能基Ｘが利用可能
である材料から構成されなければならないことが理解される。
【００７１】 本発明の好適な実施態様において、基板表面の領域、またはコーティング表面
（タンパク質捕捉剤のパッチとは別である）は有機薄膜を有さない。代替的な実
施態様において、有機薄膜は、タンパク質捕捉剤のパッチにより覆われた基板表
面、またはコーティング表面（存在する場合）の領域を超えて延びる。例えば、
必要に応じて、アレイの表面全体は、タンパク質捕捉剤の複数の空間的に異なる
パッチが存在する有機薄膜により覆われ得る。アレイの表面全体を覆う有機薄膜
は、均質であってもよいし、必要に応じて、異なるタンパク質捕捉剤のパッチの
固定化において有用な、異なる露出された官能基のパッチを含んでいてもよい。
なお別の代替的な実施態様において、タンパク質捕捉剤のパッチの間の基板表面
またはコーティング表面（コーティングが存在する場合）の領域は、タンパク質
捕捉剤のパッチの有機薄膜とは異なる型の有機被膜を除いた有機薄膜で覆われる
。例えば、タンパク質捕捉剤のパッチ間の表面は、タンパク質および他の分析物
についての低い非特異的結合特性によって特徴づけられる有機薄膜でコーティン
グされ得る。
【００７２】 種々の技術を用いて、基板の表面上、または基板のコーティング表面上での有
機薄膜のパッチを生成し得る。これらの技術は当業者に周知であり、そして有機
薄膜、基板、およびコーティング（存在する場合）の性質に依存して変化する。
この技術はまた、基底基板（ｕｄｅｒｌｙｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の構造
および基板に存在する任意のコーティングのパターンに依存して変化する。例え
ば、有機薄膜と非常に反応性のコーティングのパッチは、基板表面上に既に作製
されていてもよい。有機薄膜のパッチのアレイは、必要に応じて、微小流体印刷
（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、マイクロスタンピング（
ｍｉｃｒｏｓｔａｍｐｉｎｇ；米国特許第５，５１２，１３１号および同第５，
７３１，１５２号）、または微小密着印刷（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ ｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ；μＣＰ）（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２９６２９）により作製され得る
。反応性単層パッチへのタンパク質捕捉剤の引き続く固定化は、薬剤の二次元ア
レイを生じる。インクジェットプリンタのヘッドは、単層Ｘ−Ｒ−Ｙ分子、もし
くはそれらの成分、または基板もしくはコーティングの表面上でのｎｍからμｍ
縮尺まで他の有機薄膜層成分を印刷するための別の選択肢を提供する（Ｌｅｍｍ
ｏら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９７、６９：５４３−５５１；米国特許第５，
８４３，７６７号および同第５，８３７，８６０号）。いくつかの場合では、キ
ャピラリー分配に基づく市販のアレイ（例えば、Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡからのＯｍｎｉＧｒｉｄTMおよびＩｎｔｅ
ｌｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ
からのＨｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）もまた、
アレイの空間的に異なる領域に有機薄膜の成分を指向させる際に有用であり得る
。
【００７３】 有機薄膜（例えば、自己集合単層）上に固定化されたタンパク質捕捉剤のパッ
チ間の拡散境界は、構造的パターン（物理的境界）またはオーソゴナル湿潤挙動
（化学的境界）を有する表面官能基として一体化され得る。例えば、基板材料ま
たはフォトレジストの壁を使用して、他のパッチのいくつかまたは全てのパッチ
からパッチのいくつかを互いに分離し得る。あるいは、異なる湿潤性を有する非
生体反応性有機薄膜（例えば、単層）を用いて、互いからパッチを分離し得る。
【００７４】 本発明の好ましい実施態様において、タンパク質捕捉剤のパッチの各々は、上
記で規定されたように、式Ｘ−Ｒ−Ｙ分子の自己集合単層を含み、そしてこのパ
ッチは、単層を含まない表面により互いから分離される。
【００７５】 図１は、タンパク質捕捉剤と反応性であるパッチのアレイの一例の平面図を示
す。このアレイに関して、多くのパッチ１５が基板３の表面を覆う。
【００７６】 図２は、図１のアレイのパッチ１５の詳細な横断面を示す。この図は、基板３
上でのコーティング５の使用を示す。接着中間層６もまた、パッチに含まれる。
パッチの上には、自己集合単層７が存在する。
【００７７】 図３は、図１のアレイのパッチ１５の１列の横断面を示す。この図はまた、ア
レイの上のカバー２の使用を示す。カバー２の使用は、アレイの上を通過する溶
液のための入口ポート１６および出口ポート１７を作製する。
【００７８】 種々の化学的部分は、本発明のアレイにおいて式Ｘ−Ｒ−Ｙの単層分子として
機能し得る。しかし、３つの大きなクラスの単層形成が、好ましくは、アレイの
パッチに対して高密度の反応性ω官能基を露出するために使用される：（ｉ）ヒ
ドロキシル化および非ヒドロキシル化表面に対するアルキルシロキサン単層（「
シラン」）（例えば、米国特許第５，４０５，７６６号、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／
３８７２６、米国特許第５，４１２，０８７号、および米国特許第５，６８８，
６４２号に教示されるように）；（ｉｉ）貴金属（好ましくはＡｕ（ＩＩＩ））
に対するアルキルチオール／ジアルキルジスルフィド単層（例えば、Ａｌｌａｒ
ａら、米国特許第４，６９０，７１５号；Ｂａｍｄａｄら、米国特許第５，６２
０，８５０号；Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、１
９９６、７０：２０５２−２０６６に記載されるような）；ならびに（ｉｉｉ）
酸素非含有不動態化シリコンに対するアルキル単層形成（例えば、Ｌｉｎｆｏｒ
ｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５、１１７：３１４５−３１５５
、Ｗａｇｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、１９９７、１１９：１８９−２０１、米国特許第５，４２９，７０８号に
教示されるように）。しかし、当業者は、多くの可能な部分が、基板、コーティ
ング、およびアフィニティータグの選択に主に依存して、Ｘ、Ｒ、および／また
はＹと置換され得ることを認識する。単層の多くの例は、Ｕｌｍａｎ、Ａｎ Ｉ
ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｉｌ
ｍｓ：Ｆｒｏｍ Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ ｔｏ Ｓｅｌｆ Ａｓ
ｓｅｍｂｌｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載される。
【００７９】 １つの実施態様において、単層は、式（Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子を含む。ここで
ａおよびｂは、独立して、１〜約２００の整数である。好適な実施態様において
、ａおよびｂは、独立して、１〜約８０の整数である。より好適な実施態様にお
いて、ａおよびｂは、独立して、１または２である。最も好適な実施態様におい
て、ａおよびｂは、ともに１である（式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子）。
【００８０】 本発明のアレイのパッチが、式（Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子の自己集合単層を含む
場合、Ｒは、必要に応じて、約１〜約４００炭素長の直鎖状または分枝状炭化水
素鎖を含み得る。炭素水素鎖は、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アル
キニル基、シクロアルキル基、アルカリール基、アラルキル基、またはそれらの
任意の組み合わせが含まれ得る。ａおよびｂはともに１である場合は、Ｒは、代
表的には、約３〜約３０炭素長のアルキル鎖である。好適な実施態様において、
ａおよびｂがともに１である場合、Ｒは、約８〜約２２炭素長のアルキル鎖であ
り、そして必要に応じて、直鎖アルカンである。しかし、代替実施態様において
、Ｒは、約２〜約４００の炭素長の直鎖状または分枝状炭化水素鎖を容易に含み
得、そして少なくとも１つのヘテロ原子により中断され得ることも意図される。
中断するヘテロ原子の群としては、以下が挙げられる：−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、
−ＣＯＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−ＣＳＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−Ｓ−、−
ＳＯ−、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−（ここで、ｎ＝１〜２０である）、−（ＣＦ2） n −（ここで、ｎ＝１〜２２である）など。あるいは、Ｒの１つ以上の水素部分
は、重水素と置換され得る。代替的なあまり好ましくない実施態様において、Ｒ
は、約４００炭素長を超え得る。
【００８１】 Ｘは、基板の表面（存在する場合は、コーティング）上への単層の化学吸着ま
たは物理吸着を提供する任意の基として選択され得る。基板またはコーティング
が金属または金属合金である場合、少なくとも単層への組み込みの前に、Ｘは、
１つの実施態様において、非対称的または対称的な、ジスルフィド、スルフィド
、ジセレニド、セレニド、チオール、イソニトリル、セレノール、三価のリン化
合物、イソチオシアネート、イソシアネート、キサンタネート、チオカルバメー
ト、ホスフィン、アミン、チオ酸またはジチオ酸であるように選択され得る。こ
の実施態様は、貴金属（例えば、金、銀または白金）であるコーティングまたは
基板が使用される場合に、特に好適である。
【００８２】 アレイの基板が、シリコン、酸化珪素、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウ
ム、アルミナ、石英、ガラス、またはシリカのような材料である場合、本発明の
１つの実施態様のアレイは、上記の単層に組み込む前にモノハロシラン、ジハロ
シラン、トリハロシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシランまたはモ
ノアルコキシシランであるＸを含む。これらのシランの中でも、トリクロロシラ
ンおよびトリアルコキシシランが特に好適である。
【００８３】 本発明の好適な実施態様において、基板は、シリコン、二酸化ケイ素、酸化イ
ンジウムスズ、アルミナ、ガラス、および二酸化チタンからなる群より選択され
；そしてＸは、上記の単層に組み込まれる前に、モノハロシラン、ジハロシラン
、トリハロシラン、トリクロロシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシ
ラン、モノアルコキシシラン、カルボン酸、およびホスフェートからなる群より
選択される。
【００８４】 本発明の別の好適な実施態様において、アレイの基板はシリコンであり、そし
てＸはオレフィンである。
【００８５】 本発明のなお別の好適な実施態様において、コーティング（コーティングが存
在しない場合、基板）は二酸化チタンまたは酸化タンタルであり、そしてＸは、
ホスフェートである。他の実施態様において、基板の表面（またはその上のコー
ティング）は、例えば、酸化チタン、酸化タンタル、酸化インジウムスズ、酸化
マグネシウム、アルミナのような材料から構成され、ここでＸは、カルボン酸ま
たはアルキルリン酸である。あるいは、アレイの基板表面（またはその上のコー
ティング）が銅である場合、Ｘは、必要に応じてヒドロキサム酸であり得る。
【００８６】 本発明で使用される基板がポリマーである場合、多くの場合では、基板上のコ
ーティング（例えば、銅コーティング）は、アレイに含まれる。コーティングの
ための適切な官能基Ｘは、アレイにおける使用のために選択される。ポリマー基
板を含む代替的な実施態様において、このポリマーの表面は、単層形成のために
所望の表面官能基を露出するようにプラズマ修飾（ｐｌａｅｍａ−ｍｏｄｉｆｙ
）されていてもよい。例えば、ＥＰ ７８０４２３号は、プラズマ露出表面に対
してアルケンＸ官能基を有する単層分子の使用を記載する。ポリマーから構成さ
れる本発明のアレイについてのなお別の可能性は、単層が形成されるポリマー表
面が適切に官能基化された前駆体分子のコポリマー化により官能基化されること
である。
【００８７】 別の可能性は、単層へ組み込まれる前に、Ｘがフリーラジカル生成部分であり
得ることである。この官能基は、単層が形成される表面が水素化シリコン表面で
ある場合に、特に適切である。あり得るフリーラジカル生成部分としては、ジア
シルペルオキシド、ペルオキシド、およびアゾ化合物が挙げられるが、これらに
限定されない。あるいは、不飽和部分（例えば、置換されていないアルケン、ア
ルキン、シアノ化合物およびイソニトリル化合物）は、Ｘとの反応が紫外線、赤
外線、可視光線、またはマイクロ波の照射により達成される場合に、Ｘのために
使用され得る。
【００８８】 代替的な実施態様において、単層に組み込まれる前に、Ｘは、ヒドロキシル基
、カルボニル基、ビニル基、スルホニル基、ホスホリル基、水素化シリコン基、
またはアミノ基であり得る。
【００８９】 単層の成分、Ｙは、単層上へのタンパク質−捕捉剤の結合を担う官能基である
。本発明の好適な実施態様において、Ｙ基は、タンパク質−捕捉剤（またはその
アフィニティータグ）に関して高度に反応性である（活性化される）か、または
そのような活性化形態に容易に変換されるかのいずれかである。好適な実施態様
において、Ｙとタンパク質−捕捉剤とのカップリングは、タンパク質−捕捉剤が
その結合パートナーと結合する能力に対して有害ではない通常の生理学的条件下
で容易に生じる。官能基Ｙは、タンパク質−捕捉剤（または存在する場合は、そ
のアフィニティータグ）と共有結合または非共有結合のいずれかを形成し得る。
好適な実施態様において、官能基Ｙは、タンパク質−捕捉剤またはそのアフィニ
ティータグと共有結合を形成する。タンパク質−捕捉剤のＹへの結合（アフィニ
ティータグの有無に拘わらず）の後に、Ｙの化学的性質が変化し得ることが理解
される。タンパク質−捕捉剤の結合に際して、Ｙは、有機薄膜から除去すらされ
得る。
【００９０】 本発明のアレイの１つの実施態様において、Ｙは、インサイチュで活性化され
る官能基である。この型の官能基についての可能性は、非常に単純な部分（例え
ば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、カルボニル基
、メチル基、メチレン基、アルケン基、アルキン基、カーボネート基、ヨウ化ア
リール基、またはビニル基）が挙げられるが、これらに限定されない。活性化の
適切な様式は、当業者に明らかである。あるいは、Ｙは、タンパク質−捕捉剤を
捕捉するに十分活性化される前に光活性化を必要とする官能基を含み得る。
【００９１】 本発明のアレイの特に好適な実施態様において、Ｙは、単層形成と適合性であ
り、かつタンパク質捕捉剤および／またはアフィニティータグと反応する前にイ
ンサイチュ活性化を必要としない、複雑かつ高度に反応性の官能基部分である。
このようなＹの可能性としては、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９６、７０：
２０５２−２０６６）、ニトリロトリ酢酸（米国特許第５，６２０，８５０号）
、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、活性
化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロリド、ト
リフルオロメチルジアジリジン、ピリジルスルフィド、Ｎ−アシルイミダゾール
、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカーボネート
、アリールアジド、無水物、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシア
ネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼンおよびビオチンが
挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】 図４は、基板３上の単層の１例を示す。この例において、基板３は、ガラスを
含む。この単層は、マレイミジル官能基Ｙを有するのでチオール反応性である。
【００９３】 図５は、シリコンである基板３上の単層の別の例を示す。しかし、この場合に
おいて、薄膜金コーティング５は、基板３の表面を覆う。また、チタン接着中間
層６を用いて、基板３に対してコーティング５を接着する。この単層は、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジル官能基Ｙを有するので、アミノ反応性である。
【００９４】 別の実施態様において、アレイの官能基Ｙは、単純な官能基部分の群から選択
される。可能なＹと官能基としては、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ
Ｒ、−ＲＳＲ−、−ＰＯ4 -3、−ＯＳＯ3 -2、−ＳＯ3 -、−ＣＯＯ-、−ＳＯＯ-、
−ＣＯＮＲ2、−ＣＮ、−ＮＲ2などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】 本発明の単層分子は、必要に応じて、部分的に表面上でアセンブルされ得る。
言い換えれば、単層は、基板の表面（またはコーティング）に対して式Ｘ−Ｒ−
Ｙの分子の化学吸着または物理吸着により構築される必要は必ずしもない。代わ
りに、１つの実施態様において、Ｘは、最初に、基板の表面（またはコーティン
グ）単独に対して化学吸着または物理吸着され得る。次いで、ＲまたはＲの単な
る個々の成分ですら、適切な化学反応によりＸに結合され得る。表面上に既に固
定化されたＸ部分へのスペーサーＲの付加を完了させる際に、Ｙは、適切な共有
結合により単層分子の末端に結合され得る。
【００９６】 所定のパッチ上の自己集合単層分子が全て、互いに同一であることが必要であ
るわけではない。いくつかのパッチは、混合した単層を含み得る。例えば、個々
のパッチの単層は、必要に応じて、先に記載されるように、式Ｘ−Ｒ−Ｙの少な
くとも２つの異なる分子を含み得る。この第２のＸ−Ｒ−Ｙ分子は、第１の結合
パートナーと同じ結合パートナーを有する、同じタンパク質−捕捉剤に固定化さ
れてもよいし、異なるタンパク質−捕捉剤に固定化されてもよい。さらに、パッ
チの単層分子Ｘ−Ｒ−Ｙのいくつかは、タンパク質−捕捉剤に結合することがで
きなくてもよい。
【００９７】 本発明の別の代替的実施態様の場合、アレイ上の個々のパッチの混合された自
己集合単層は、以前に記載された式Ｘ−Ｒ−Ｙ、および式Ｘ−ＲーＶの分子の両
分子を含み得る。ここで、Ｒはスペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合する官
能基であり、そしてＶは、タンパク質と生体適合性であり、そしてタンパク質の
非特異的結合に耐性である部分である。例えば、Ｖは、ヒドロキシル部分、サッ
カリド部分、またはオリゴ／ポリエチレングリコール部分からなり得る（ＥＰ公
開公報７８０４２３）。
【００９８】 本発明のなお別の実施態様では、このアレイは、任意のタンパク質捕捉剤のな
い基板またはコーティングの表面上の有機薄膜の少なくとも１つの不活性パッチ
を含む。例えば、不活性パッチは、必要に応じて、式Ｘ−Ｒ−Ｖの分子の単層を
含み得る。ここで、Ｒは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合する官能基
であり、そしてＶは、タンパク質の非特異的結合に耐性な部分である。この不活
性パッチは、コントロールパッチとして役目を果たし得るか、またはバックグラ
ウンド結合測定に有用であり得る。単層分子の特性にかかわらず、いくつかのア
レイにおいて、個々のパッチ単層の分子間架橋を提供するために望ましいかもし
れない。一般に、架橋は、単層にさらなる安定性を与える。このような方法は、
当業者に周知である（例えば、Ｕｌｍａｎ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｏ Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｉｌｍｓ：Ｆｒｏｍ Ｌａｎｇ
ｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ ｔｏ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照のこと）。
【００９９】 パッチ上の単層の形成の完了後、このタンパク質捕捉剤は、Ｙ−官能基との相
互作用を通じて単層に付着され得る。いかなるタンパク質捕捉剤との反応にも失
敗するＹ−官能基は、好ましくはアレイの使用の前にクエンチされる。
【０１００】 （（ｄ）アフィニティータグおよびタンパク質捕捉剤の固定化） 好ましい実施態様において、アレイのタンパク質固定化パッチは、有機薄膜上
へのタンパク質捕捉剤の固定化を増大させるアフィニティータグをさらに含む。
このアレイのタンパク質捕捉剤上のアフィニティータグの使用は、代表的にはい
くつかの利点を提供する。アフィニティータグは、有機薄膜が以前に記載された
Ｘ−Ｒ−Ｙ単層である場合、有機薄膜上の官能基（例えば、Ｙ）とのタンパク質
捕捉剤の増大された結合または反応を与え得る。この増強効果は、動力学的かま
たは熱力学的のいずれかであり得る。アレイのパッチにおいて用いられるアフィ
ニティータグ／薄膜の組み合わせは、好ましくはタンパク質の安定性または機能
に有害である過酷な反応条件を必要としない様式でタンパク質捕捉剤の固定化を
可能にする。ほとんどの実施態様において、水性の生物学的緩衝液における有機
薄層への固定が理想である。
【０１０１】 アフィニティータグはまた、好ましくは、指定された部位またはタンパク質捕
捉剤の位置に特異的である有機薄膜上の固定（部位特異的固定化）を提供する。
これを生じるために、タンパク質捕捉剤へのアフィニティータグの付着は、部位
特異的でなければならない。部位特異的固定化は、薬剤のタンパク質結合部位（
例えば、抗体部分の抗原結合部位）が、溶液中のリガンドに到達可能なままであ
ることを確実にするのを助ける。アフィニティータグを通じての固定化の別の利
点は、複数の、異なるタンパク質捕捉剤を共に用いる通常の固定化ストラテジー
を可能にすることである。
【０１０２】 このアフィニティータグは、必要に応じて、共有的または非共有的のいずれか
で、タンパク質捕捉剤に直接付着される。しかし、代替の実施態様において、こ
のアフィニティータグは、タンパク質捕捉剤に共有的または非共有的のいずれか
で付着されるアダプターに、共有的または非共有的のいずれかで付着される。
【０１０３】 好ましい実施態様において、このアフィニティータグは、少なくとも１つのア
ミノ酸を含む。このアフィニティータグは、有機薄膜の官能基と反応性である少
なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。あるいは、このアフィ
ニティータグは、有機薄膜と反応性である単一のアミノ酸であり得る。有機薄膜
と反応性であり得る可能なアミノ酸の例は、システイン、リジン、ヒスチジン、
アルギニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、セリ
ン、スレオニン、およびグルタミンを含む。ポリペプチドまたはアミノ酸アフィ
ニティータグは、好ましくは、タンパク質捕捉剤が、抗体または抗体フラグメン
トのようなタンパク質である場合、タンパク質捕捉剤と共に融合タンパク質とし
て発現される。アミノ酸アフィニティータグは、自己集合単層分子のＹ官能基の
ような有機薄膜の官能基と相互作用し得る、単一のアミノ酸または一連のアミノ
酸のいずれかを提供する。アミノ酸アフィニティータグは、組換えタンパク質に
容易に導入され得、単層のＹ−官能基か、または別の有機薄層上の官能基に共有
結合することによって方向づけられた固定化を容易にする。
【０１０４】 このアフィニティータグは、必要に応じてポリ（アミノ酸）タグを含み得る。
ポリ（アミノ酸）タグは、約２〜約１００残基の単一アミノ酸を含むポリペプチ
ド（必要に応じて、他のアミノ酸の残基によってさえぎられる）である。例えば
、アフィニティータグは、ポリシステイン、ポリリジン、ポリアルギニン、また
はポリヒスチジンを含むみ得る。アミノ酸タグは、好ましくは、例えば、ヒスチ
ジン、リジン、アルギニン、システイン、グルタミン、チロシン、またはこれら
の任意の組み合わせのような２〜２０残基の単一のアミノ酸から構成される。好
ましい実施態様に従って、１〜２０アミノ酸のアミノ酸タグは、チオエーテル結
合のための少なくとも１〜１０のシステイン；またはアミド結合のための少なく
とも１〜１０のリジン；あるいは隣接するジカルボニル基に結合するための少な
くとも１〜１０のアルギニンを含む。当業者は、有機薄膜上の所定の官能基に適
切なアフィニティータグを容易に対にし得る。
【０１０５】 アミノ酸タグの位置は、タンパク質であるタンパク質捕捉剤の、アミノ末端ま
たはカルボキシ末端であり得るか、あるいはタンパク質捕捉剤のタンパク質結合
領域（例えば、固定化抗体部分の抗原結合領域）が、タンパク質結合のために接
近し得る位置である限り中間の任意の場所であり得る。選択されるタンパク質捕
捉剤と両立し得る場合に、タンパク質精製のために導入されるアフィニティータ
グは、好ましくは組換えタンパク質のＣ末端に優先的に配置されて、完全長タン
パク質のみが、タンパク質精製の間に単離されることを確実にする。例えば、イ
ンタクトな抗体が、アレイ上で用いられる場合、抗体上のアフィニティータグの
付着部分は、好ましくは抗体のエフェクター（Ｆｃ）領域のＣ末端に配置される
。ｓｃＦｖが、アレイ上で用いられる場合、アフィニティータグの付着部分はま
た、好ましくは分子のＣ末端に配置される。
【０１０６】 アフィニティータグはまた、１以上の非天然のアミノ酸を含み得る。非天然の
アミノ酸は、停止コドン（すなわち、アンバー）を認識するサプレッサーｔＲＮ
Ａを用いて導入され得る（Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：
１８２−１８８；Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．，１９９１，
２０２：３０１−３３６；Ｃｌｏａｄら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３
：１０３３−１０３８）。ｔＲＮＡは、化学的にアミノアシル化されて、特定の
結合化学（すなわち、ケトン修飾、光反応基）を用いての使用のために化学的に
変化させた（「非天然」）アミノ酸を含む。
【０１０７】 別の実施態様において、このアフィニティータグは、インタクトなタンパク質
（例えば、限定はされないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、抗体、ア
ビジン、またはストレプトアビジン）を含み得る。
【０１０８】 タンパク質捕捉剤がタンパク質であり、そしてアフィニティータグ（例えば、
ポリ（アミノ酸）タグ）がタンパク質、または単一のアミノ酸である場合、この
アフィニティータグは、好ましくは融合タンパク質を産生することによって、タ
ンパク質捕捉剤に付着される。あるいは、当業者に公知のタンパク質合成または
タンパク質連結技術が、用いられ得る。例えば、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）媒
介タンパク質連結は、必要に応じてタンパク質捕捉剤にアフィニティータグを付
着させるために用いられ得る（Ｍａｔｈｙｓら、Ｇｅｎｅ，２３１：１−１３，
１９９９；Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７：２２５６−２
２６４，１９９８）。
【０１０９】 当該分野で公知の他のタンパク質結合技術および固定技術は、タンパク質捕捉
剤にアフィニティータグを付着する目的のために適合され得る。例えば、アレイ
の別の実施態様において、このアフィニティータグは、目的のタンパク質捕捉剤
に化学的に結合される有機生体結合体であり得る。ビオチンまたは抗原は、タン
パク質に化学的に架橋され得る。
【０１１０】 あるいは、単純な官能基部分（例えば、チオールまたはアミン）をアレイ上の
タンパク質捕捉剤として作用するタンパク質の表面に付着する化学的架橋剤が、
用いられ得る。
【０１１１】 本発明の別の実施態様において、各々のパッチの有機薄膜は、少なくとも部分
的に、脂質単層または二重層を含み、そしてアフィニティータグは、膜アンカー
を含む。
【０１１２】 図６は、本発明のアレイの１つの実施態様について、パッチの詳細な断面を示
す。この実施態様において、タンパク質捕捉剤１０は、基板３上の単層７上に固
定される。アフィニティータグ８は、単層７にタンパク質捕捉剤１０を連結する
。単層７は、中間層６によって基板３から分離されるコーティング５上に形成さ
れる。
【０１１３】 本発明の別の実施態様において、アフィニティータグは、タンパク質捕捉剤を
有機薄膜上に固定するために用いられない。タンパク質捕捉剤自身に固有である
アミノ酸または他の分子（例えば、糖質部分）が、代わりとして用いられて、タ
ンパク質捕捉剤を有機薄膜の反応基につなぎ得る。好ましい実施態様において、
この固定化は、タンパク質捕捉剤上の固定化部位の位置に関して部位特異的であ
る。例えば、抗体のペプシン消化、続いて１価のＦａｂ’フラグメント間のジス
ルフィドの選択的還元によって生成されるＦａｂ’フラグメントの重鎖部分のＣ
末端領域上のスルフヒドリル基は、アフィニティータグとして用いられ得る。あ
るいは、インタクトな抗体のＦｃ部分上の糖質部分は穏和な条件下で酸化されて
、単層上にヒドラジド活性化Ｙ基との反応を介して単層上の抗体を固定化するた
めに適切なアルデヒド基になり得る。部位特異的な様式においていかなるアフィ
ニティータグも伴わないタンパク質捕捉剤の固定化の例は、Ｄａｍｍｅｒら、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ Ｊ．，７０：２４３７−２４４１，１９９６および特定の実施例
（以下の実施例５−７）に見出され得る。
【０１１４】 アレイ上の少なくともいくつかの異なるパッチのタンパク質捕捉剤は、お互い
に異なるので、異なる溶液（各々異なる（好ましくは）アフィニティータグ化タ
ンパク質捕捉剤を含む）は、それらの個々のパッチに送達されなければならない
。タンパク質捕捉剤の溶液は、当該分野で周知であり、そして市販さえされてい
るアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を介して適切なパッチに移され得る。例えば、
ミクロキャピラリーに基づく分配システムが使用され得る。これらの分配システ
ムは、好ましくは自動化され、そしてコンピューターを使用される自動キャピラ
リーシステムを備えるミクロアレイヤーの記載および一例のための組みたて説明
書は、ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ａ
ｒｒａｙ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ
／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにてインターネット上に
見出され得る。タンパク質捕捉剤を含む溶液を薬剤反応性パッチに移すための他
のミクロプリント技術の使用もまた可能である。インクジェットプリンターヘッ
ドはまた、必要に応じて、薬剤反応性パッチへのタンパク質捕捉剤の正確な送達
のために用いられ得る。パッチ上にタンパク質捕捉剤を堆積するために有用な技
術の、代表的な、制限することのない開示は、例えば、米国特許第５，７３１，
１５２号（スタンプ器具）、同第５，８０７，５２２号（キャピラリー分配装置
）、同第５，８３７，８６０号（インクジェットプリント技術、Ｈａｍｉｌｔｏ
ｎ２２００ロボットピペット送達システム）および同第５，８４３，７６７号（
Ｈａｍｉｌｔｏｎ２２００ロボットピペット送達システム）に見出され得る（全
てが本明細書中で参考として援用される）。
【０１１５】 （（ｅ）アダプター） 本発明のアレイの別の実施態様は、このアレイのパッチ上のタンパク質捕捉剤
にアフィニティータグを連結するアダプターを含む。タンパク質捕捉剤がタンパ
ク質である場合、アダプターの使用によって与えられる基板（すなわちコーティ
ング）の表面からのタンパク質捕捉剤のさらなる間隔は、特に有利である。なぜ
ならば、タンパク質は、表面不活化する傾向にあることが公知であるからである
。このアダプターもまた、必要に応じて、いくつかの更なる利点を与え得る。例
えば、このアダプターは、アフィニティータグへのタンパク質捕捉剤の付着を容
易にするのに役立ち得る。別の実施態様において、このアダプターは、アレイを
用いる特定の検出技術の使用を容易にするのに役立ち得る。当業者は、所定のア
フィニティータグに適切なアダプターを選択し得る。例えば、このアフィニティ
ータグがストレプトアビジンである場合、アダプターは、固定化されるべきタン
パク質捕捉剤に化学的に結合されるビオチンであり得る。
【０１１６】 １つの実施態様において、このアダプターはタンパク質を含む。別の実施態様
において、アフィニティータグ、アダプター、およびタンパク質捕捉剤は、共に
融合タンパク質を含む。このような融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術
を用いて容易に発現され得る。タンパク質であるアダプターは、目的のタンパク
質捕捉剤の溶解度を増加させるために、および基板またはコーティングの表面と
タンパク質捕捉剤との間の距離を増加させるために特に有用である。タンパク質
アダプターの使用はまた、アレイ上への固定化の前のアフィニティー結合によっ
てタンパク質精製の準備工程を容易にするのに非常に有用であり得る。可能なア
ダプタータンパク質の例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
、マルトース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、チオレドキシン、グリー
ン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。ＧＦＰはまた、表面結合の定量化のために
用いられ得る。好ましい実施態様において、タンパク質捕捉剤が、Ｆｃ領域を含
む抗体部分である場合、このアダプターは、プロテインＧ、プロテインＡ、また
は組換えタンパク質Ａ／Ｇ（プロテインＡ由来の４つのＦｃ結合ドメインおよび
プロテインＧ由来の２つを含む、非病原性型のＢａｃｉｌｌｕｓから分泌される
遺伝子融合産物）のようなポリペプチドである。
【０１１７】 図７は、１つの特定の実施態様の本発明のアレイ上のパッチの断面を示す。こ
のパッチは、アフィニティータグ８およびアダプター９の両方を介して単層７上
に固定されるタンパク質捕捉剤１０を備える。この単層７は、コーティング５上
にある。中間層６は、コーティング５と基板３の間に用いられる。
【０１１８】 （（ｆ）アレイのタンパク質捕捉剤の調製） アレイ上で用いられるタンパク質捕捉剤は、当業者に公知の任意の種々の手段
によって生成され得る。本発明の好ましい実施態様において、このタンパク質捕
捉剤はタンパク質であり、そして特に好ましい実施態様において、タンパク質捕
捉剤は、抗体または抗体フラグメントである。従って、これらの型の可能なタン
パク質捕捉剤を調製する方法が、本明細書中で強調される。
【０１１９】 本発明のアレイへの固定化の準備において、抗体部分あるいはタンパク質また
はポリペプチドである任意の他のタンパク質捕捉剤は、必要に応じて、インビボ
もしくはインビトロのいずれかで組換えＤＮＡから発現され得る。抗体または抗
体フラグメントあるいは他のタンパク質捕捉剤のｃＤＮＡは、発現ベクター（こ
れらの多くの例は市販されている）中にクローン化され、そして発現に適切な生
物の細胞中に導入される。広範囲の宿主細胞および発現系は、抗体および抗体フ
ラグメント、または他のタンパク質（これらは、アレイ上のタンパク質捕捉剤と
しての役割を果たす）を産生するために用いられ得る。インビボでの発現は、細
菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、植物（例えば、Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、下等真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または高等真核生物（例えば、バキュロウイル
ス感染昆虫細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞）中でなされ得る。インビトロで発現
のために、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ配列は、インビトロで結合した転写／翻訳
系（例えば：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現株（好ましくはプロテアーゼ欠損株
）由来のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ３０溶解物、；コムギ胚芽溶解
物；網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐａｎｖｅｒａ
））において直接用いられる。最適な発現のための生物の選択は、所望の翻訳後
の修飾（すなわち、グリコシル化、脂質修飾）の程度に依存する。発現系の選択
はまた、他の問題（例えば、インタクトな抗体が、産生されるか、または抗体の
１つのみのフラグメント（およびどちらかのフラグメント）であるか）に依存す
る。なぜならば、ジスルフィド結合の形成は、宿主細胞の選択によって影響され
るからである。当業者は、どの宿主細胞型が、所望のタンパク質捕捉剤および適
用に最も適切かを容易に選択し得る。
【０１２０】 アフィニティータグおよびアダプターをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクタ
ー中へ操作され得、その結果、目的のタンパク質捕捉剤は、アフィニティータグ
およびアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ配列の５’または３’のいずれ
かの側にインフレームにクローン化され得る。
【０１２１】 発現されたタンパク質補足剤は、市販の樹脂を用いるアフィニティークロマト
グラフィーによって精製される。
【０１２２】 好ましくは、複数のタンパク質捕捉剤の生成は、クローニングからタンパク質
発現およびタンパク質精製までの並行プロセシングを伴う。目的のタンパク質捕
捉剤についてのｃＤＮＡは、テンプレートとしてｃＤＮＡライブラリーまたは発
現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを用いてＰＣＲによって増幅される。タンパク質
のインビボ発現のために、ｃＤＮＡは、市販の発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｎ
ｏｖａｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローン化され得、そして発現のために
適切な生物（上記を参照のこと）中に導入され得る。インビトロ発現のために、
ＰＣＲ増幅されるＤＮＡ配列は、インビトロで結合された転写／翻訳系（上記を
参照のこと）において直接用いられる。
【０１２３】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに基づくタンパク質発現は、一般に、活性
について広範な翻訳後の修飾を必要としない可溶性タンパク質を選択する方法で
ある。膜タンパク質の細胞外または細胞内ドメインは、発現および精製のための
タンパク質アダプターに融合される。
【０１２４】 この全体のアプローチは、９６ウェルアッセイプレートを用いて行われ得る。
ＰＣＲ反応は、標準的な条件下で実行される。オリゴヌクレオチドプライマーは
、発現ベクター中への容易なクローニングのために固有の制限部位を含む。ある
いは、ＴＡクローニング系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が、用いられ得る。この発現ベ
クターは、アフィニティータグおよびタンパク質アダプターについての配列を含
む。ＰＣＲ産物は、発現ベクター（誘導プロモーター下）中に連結され、そして
カルシウム依存形質転換によって適切なコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ株（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１、ＳＧ１３００９（ｌｏｎ−）：を
含む株）中に導入される。形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細
胞はプレートされ、そして個々のコロニーが、９６アレイブロック中に移される
。培養物は、対数期中期まで増殖され、発現を誘導され、そして細胞が遠心分離
によって収集される。細胞は再懸濁される。これはリゾチームおよび急速な冷凍
／解凍サイクルまたは超音波処理によって破壊された膜を含む。細胞破片は、遠
心分離によって除去され、そして上清は、９６チューブアレイに移される。適切
なアフィニティーマトリックスが添加され、目的のタンパク質捕捉剤が結合され
、そして非特異的に結合したタンパク質が、１２〜９６ピン吸引装置および遠心
分離を用いて繰り返し洗浄することによって除去される。あるいは、磁性アフィ
ニティービーズおよびろ過装置（Ｑｉａｇｅｎ）が用いられ得る。このタンパク
質は溶出され、そして新しい９６ウェルアレイに移される。タンパク質濃度が決
定され、そして各タンパク質捕捉剤のアリコートが、ニトロセルロースフィルタ
ー上にスポットされ、そしてタンパク質捕捉剤上のアフィニティータグに対する
抗体を用いるウェスタン分析によって検証される。各サンプルの純度は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよび銀染色、または質量分析法によって評価される。次いで、この
タンパク質捕捉剤は、急速冷凍され、そして−８０℃で保存される。
【０１２５】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、抗体または抗体フラ
グメントのようなグリコシル化タンパク質捕捉剤の産生を可能にする。Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける産生のために、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉための上記のアプローチは、形質転換および細胞溶解に
ついてのわずかな修飾と共に用いられ得る。
【０１２６】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換は、酢酸リチ
ウムによってであり、細胞溶解は、細胞壁の溶菌酵素（ｌｙｔｉｃａｓｅ）消化
、次いで凍結−融解か、超音波処理か、またはガラスビーズ抽出のいずれかによ
ってである。翻訳後の修飾の変化は、異なる酵母株（すなわち、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いることに
よって得られ得る。
【０１２７】 バキュロウイルス系の１つの局面は、得られ得る翻訳後の修飾のアレイである
が、抗体およびバキュロウイルスにおいて産生される他のタンパク質は、哺乳動
物細胞によって生成される構造とは非常に異なる糖質構造を含む。このバキュロ
ウイルス感染化昆虫細胞系は、ウイルスのクローン化、高力価ストックを得るこ
とおよび液体昆虫細胞懸濁液（ＳＦ９、ＳＦ２１のような細胞）の感染を必要と
する。
【０１２８】 哺乳動物細胞に基づく発現は、トランスフェクションおよび細胞株のクローニ
ングを必要とする。リンパ球または非リンパ球のいずれかは、抗体および抗体フ
ラグメントの調製に用いられ得る。抗体のような可溶性タンパク質は、培地から
収集されるが、分子内結合タンパク質または膜結合タンパク質は、細胞溶解（界
面活性剤可溶化、凍結−融解のいずれか）を必要とする。次いで、タンパク質捕
捉剤は精製され得る。これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉについて記載
された手順に類似する。
【０１２９】 インビトロでの翻訳について、選り抜きの系は、プロテアーゼ欠損株およびＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ過剰発現株由来のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ溶解
物である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ溶解物は、効率的なタンパク質発
現（３０−５０μｇ／ｍｌ溶解物）を提供する。全プロセスは、９６ウェルアレ
イにおいて行われる。抗体遺伝子または他の目的のタンパク質捕捉剤遺伝子は、
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む遺伝子特異的配列および結合部位
ならびにアフィニティータグをコードする配列を含むオリゴヌクレオチドを用い
るＰＣＲによって増幅される。あるいは、アダプタータンパク質は、ＰＣＲによ
って目的の遺伝子に融合され得る。増幅されたＤＮＡは、素早い分析のために事
前クローニングなしでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ溶解物中で直接転写お
よび翻訳され得る。次いで、この抗体フラグメントまたは他のタンパク質は、ア
フィニティーマトリックスに結合することによって単離され、そして上記のよう
に処理される。
【０１３０】 使用され得る代替的なインビトロ翻訳系としては、小麦麦芽抽出物および網状
赤血球抽出物が挙げられる。膜タンパク質または翻訳後修飾されたタンパク質の
インビトロ合成は、ミクロソームとの組み合わせにおける網状赤血球溶解産物を
必要とする。
【０１３１】 本発明の１つの実施態様において、アレイ上のタンパク質捕捉剤は、モノクロ
ーナル抗体である。特定のタンパク質標的に対するモノクローナル抗体の産生は
、標準的なハイブリドーマ技術を使用して慣習的である。実際、多数のモノクロ
ーナル抗体が市販されている。モノクローナル抗体のアレイの調製および使用は
、以下の特定の実施例（実施例８）において説明される。
【０１３２】 細胞融合によるかもしくは継続した細胞株に由来して抗体または抗体フラグメ
ントを得ることに対する代替として、抗体部分が、バクテリオファージ中で発現
され得る。このような抗体ファージディスプレイ技術は、当業者に周知である。
バクテリオファージ発現系は、重鎖配列および軽鎖配列の無作為な組換えを可能
にし、これによって、所望の抗原に対して選択され得る抗体配列のライブラリー
が作製される。この発現系は、バクテリオファージλ、またはより好ましくは糸
状ファージに基づき得る。バクテリオファージ発現系を使用して、Ｆａｂフラグ
メント、ＶH−ＶL対を安定化させるための操作された分子間ジスルフィド結合を
有するＦｖ’（ｄｓＦｖ’）、ｓｃＦｖ、または二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）フ
ラグメントを発現し得る。
【０１３３】 ファージディスプレイライブラリーの抗体遺伝子は、予備免疫したドナー由来
であり得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、タンパク質の混合
物（例えば、ヒトＴ細胞の溶解産物）で予め免疫されたマウスの脾臓から調製さ
れるディスプレイライブラリーであり得る。必要に応じて、免疫化を使用して、
特定のタンパク質のセット（例えば、ヒトＴ細胞において見出されるタンパク質
）に対して反応性であるより多くの組換え抗体を含むように、ライブラリーを偏
向し得る。あるいは、ライブラリー抗体は、未処理ライブラリーまたは合成ライ
ブラリー由来であり得る。未処理ライブラリーは、外部抗原に接触されたことの
ないマウスの脾臓から構築されている。合成ライブラリーにおいて、抗体配列の
一部（代表的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループに対応するこれらの領域）
は、変異誘発または無作為化されている。ファージディスプレイ方法は、ファー
ジコートタンパク質（ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、またはｐＶＩＩＩ）のうちの１つをコ
ードする遺伝子に対する融合物として、ファージゲノム中に抗体遺伝子のライブ
ラリーをバッチクローニング（ｂａｔｃｈ−ｃｌｏｎｉｎｇ）することを包含す
る。ｐＩＩＩファージタンパク質遺伝子が好ましい。融合産物が発現される場合
、これは成熟ファージ外被に組込まれる。結果として、抗体は、ファージの表面
上で融合物として提示され、そして標的タンパク質上での結合、および従って選
択について利用可能である。一旦、標的タンパク質に対して所望の親和性を有す
る抗体コートタンパク質融合物を保有するとしてファージ粒子が選択されると、
提示された抗体に対応するファージ粒子内の遺伝物質が、増幅および配列決定さ
れ得るか、または別な方法で分析され得る。
【０１３４】 好ましい実施態様においては、ファージミドが、ファージディスプレイ手順に
おける発現ベクターとして使用される。ファージミドは、適切なクローニング部
位を有する遺伝子ＩＩＩおよびファージパッケージングシグナルを保有し、そし
て宿主の複製起点およびファージの複製起点の両方を含む、小さなプラスミドベ
クターである。ファージミドは、完全なファージを産生し得ない。なぜなら、遺
伝子ＩＩＩ融合物は、ファージミド上にコードされるファージ遺伝子のみである
からである。生存可能なファージは、欠損した複製起点を含むヘルパーファージ
と共にファージミドを含有する細胞を感染することによって、産生され得る。ヘ
ルパーファージタンパク質のすべておよび遺伝子ＩＩＩ−ｒＡｂ融合物を含む、
ハイブリッドファージが出現する。出現したファージは、ファージミドＤＮＡの
みを含む。本発明の好ましい実施態様において、本発明のアレイのためのタンパ
ク質捕捉剤を調製するファージディスプレイ方法において使用される組換え抗体
は、ファージミドベクター上で、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質に
対する遺伝的融合物として発現される。例えば、単鎖Ｆｖフラグメントをコード
する抗体の可変領域は、ファージミド上で遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ末端
に融合され得る。あるいは、抗体フラグメント配列は、最初の２つのＮ末端ドメ
インを欠失している短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｐＩＩＩ配列のアミノ末端に
融合され得る。抗体−ｐＩＩＩ融合物をコードするファージミドＤＮＡは、好ま
しくは、Ｍ１３ＫＯ７、またはＶＣＳ−Ｍ１３のようなヘルパーファージ（これ
は、すべての構造的ファージタンパク質を供給する）を使用して、ファージ粒子
内にパッケージングされる。
【０１３５】 ファージ上でＦａｂフラグメントを提示させるために、軽鎖または重鎖（Ｆｄ
）のいずれかを、そのＣ末端を介してｐＩＩＩに融合する。パートナー鎖は、ｐ
ＩＩＩへのいかなる融合も伴うことなく発現され、その結果、両鎖は会合してイ
ンタクトなＦａｂフラグメントを形成するのに関与し得る。
【０１３６】 標的タンパク質を結合しないこれらのファージ粒子から標的タンパク質を結合
するこれらのファージ粒子を識別する、任意の選択方法が使用され得る。これら
の選択方法はまた、選択されたファージの回収を可能としなければならない。最
も代表的には、ファージ粒子は、固定された標的タンパク質上で選択される。当
業者に公知のいくつかのファージ選択ストラテジーとしては、以下が挙げられる
：固定された抗原上でのパンニング；特異的溶出を使用する、固定された抗原上
でのパンニング；ビオチン化抗原を使用し、次いでストレプトアビジン樹脂また
はストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズ上で選択すること；アフィニ
ティ精製；ウェスタンブロットでの選択（未知の抗原または精製することが困難
な抗原のために特に有用）；インビボ選択；および開通器選択。選択されたファ
ージ粒子が、選択回の間に増幅される場合、複数反復回の選択が、必要に応じて
実施され得る。
【０１３７】 溶出技術は、選択される選択プロセスに依存して変更するが、代表的な溶出技
術としては、以下の溶液の１つを用いる洗浄が挙げられる：ＨＣｌもしくはグリ
シン緩衝液；トリエチルアミンのような塩基性溶液；カオトロピック試薬；イオ
ン強度を増大した溶液；またはＤＴＴ（ビオチンが、ジスルフィド架橋によって
抗原に連結されてる場合）。他の代表的な溶出方法としては、抗体と遺伝子ＩＩ
Ｉとの間に操作されたプロテアーゼ部位を酵素的に切断すること、または過剰な
抗原、もしくはこの抗原に対する過剰な抗体と、結合について競合させることに
よることが挙げられる。従って、抗体フラグメントのアレイを生成するための方
法は、ファージディスプレイライブラリー由来の抗体フラグメントを発現する組
換えバクテリオファージをまず選択する工程を包含する。組換えバクテリオファ
ージは、生物の１つの細胞もしくは細胞集団の、発現産物であるタンパク質また
はそのフラグメントへのアフィニティ結合によって選択される。（反復回の選択
が可能であるが、これは任意である。）次に、第一の工程において選択されたバ
クテリオファージ由来の抗体フラグメントの少なくとも１つの精製サンプルを生
成する。この抗体生成工程は、代表的に、選択されたバクテリオファージを用い
てＥ．ｃｏｌｉ細胞を感染させることを伴う。ヘルパーファージの非存在下で、
次いで、選択されたバクテリオファージは、ファージの子孫を産生することなく
発現性プラスミドとして複製する。あるいは、選択された組換えバクテリオファ
ージの抗体フラグメント遺伝子が単離され、増殖され、次いで適切な発現系にお
いて発現される。いずれにしても、増幅後に、選択かつ増幅された組換えバクテ
リオファージの発現された抗体フラグメントが、単離および精製される。この方
法の第３の工程において、ファージディスプレイ選択および精製された抗体フラ
グメントの産生の先の工程が、異なる結合対を有する異なる抗体の所望の複数の
精製サンプルが生成されるまで、先と同じく、同じ細胞または細胞集団の発現産
物である異なるタンパク質またはそのフラグメントへのアフィニティ結合を使用
して、繰り返される。この方法の最終工程において、各々異なる精製サンプルの
抗体フラグメントは、基板表面上の個々のパッチの有機薄膜上に固定されて、有
機薄膜によって被覆される基板表面の散在した既知領域で、抗体フラグメントの
複数のパッチを形成する。
【０１３８】 例えば、既知のタンパク質標的に対する抗体フラグメントを有する抗体アレイ
を生成するために、ＤＮＡデータベースにおいて同定される既知のタンパク質標
的のオープンリーディングフレームを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、
そしてインビトロで転写および翻訳して、タンパク質を生成する。ここで、組換
えバクテリオファージが発現する単鎖抗体フラグメントが選択される。一旦、選
択されると、選択されたバクテリオファージの抗体フラグメント配列が増幅され
（代表的には、ポリメラーゼ連鎖方法を使用して）、そして所望の発現系中に再
クローニングされる。発現された抗体フラグメントは精製され、次いで、基板上
の有機薄膜上にプリントされて、高密度アレイを形成する。
【０１３９】 本発明の別の実施態様において、タンパク質捕捉剤のライブラリー由来のタン
パク質捕捉剤をまず選択する工程を包含する、タンパク質捕捉剤のアレイを生成
するための方法が提供され、ここでこのタンパク質捕捉剤は、細胞抽出物または
体液由来のタンパク質に対するそれらのアフィニティ結合によって選択される。
好ましくは、このタンパク質は細胞抽出物由来である。細胞抽出物または体液由
来のタンパク質は、代表的に、選択する工程の前に固定される。固定化の適切な
方法（例えば、樹脂へのタンパク質の架橋）は、当業者に周知である。この方法
の次の工程は、選択されたタンパク質捕捉剤の複数の精製サンプルを生成するこ
とを包含する。各々異なる精製サンプルのタンパク質捕捉剤は、基板の表面上の
個々のパッチの有機薄膜に固定されて、有機薄膜によって被覆された基板表面の
散在した既知領域に、タンパク質捕捉剤の複数のパッチを形成する。
【０１４０】 このアレイ調製の方法はまた、必要に応じて、ライブラリーから特定のタンパ
ク質（例えば、第２の細胞抽出物のタンパク質）を結合するタンパク質捕捉剤を
排除することによって、タンパク質捕捉剤のライブラリーを偏向する、さらなる
工程を包含する。ここで、排除されるタンパク質捕捉剤は、それらの特定のタン
パク質に対するそれらの結合親和性によってライブラリーから除去される。ライ
ブラリーを偏向するこの工程は、必要に応じて、選択する工程の後にタンパク質
へのアフィニティ結合によって起こり得るが、より代表的には、これはこの選択
する工程の前に起こる。選択する工程および偏向する工程の順序は、この方法で
用いられる選択手順および溶出手順の性質に依存する。当業者は、適切な一連の
工程を容易に決定し得る。
【０１４１】 タンパク質捕捉剤のライブラリーを偏向する任意の工程の１つの実施態様では
、ライブラリーを偏向して、一般のタンパク質または目的でないタンパク質を認
識するタンパク質捕捉剤を排除する。これは、代表的に、架橋した目的でないタ
ンパク質を含有する親和性表面（例えば、クロマトグラフィーカラム）にライブ
ラリーを通過させることによって達成される。この親和性表面と反応しなかった
タンパク質捕捉剤を含有する「貫流物（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）」を、収集す
る。この手順は、目的のタンパク質またはアッセイされる細胞に対して特異的な
タンパク質を結合するタンパク質捕捉剤について、ライブラリーを富化する。例
えば、ライブラリーが特定の細胞型（例えば、ヒトＴ細胞）由来である場合、こ
のライブラリーを、必要に応じて、ヒト線維芽細胞または細菌タンパク質の溶解
産物から調製されるタンパク質を含む親和性表面にそれを通過させることによっ
て偏向して、繊維芽細胞中に特異的に存在するタンパク質を結合するタンパク質
捕捉剤についてライブラリーを富化し得る。
【０１４２】 上記のタンパク質捕捉剤のアレイを調製する方法の好ましい実施態様において
、タンパク質捕捉剤は、組換えバクテリオファージの表面に提示された抗体フラ
グメントであり、そしてタンパク質捕捉剤のライブラリーは、ファージディスプ
レイライブラリーである。従って、抗体アレイを生成する方法は、ファージディ
スプレイライブラリー由来の抗体フラグメントを発現する組換えバクテリオファ
ージをまず選択する工程を包含する。ここで、バクテリオファージは、体液また
はより好ましくは細胞抽出物の固定されたタンパク質へのアフィニティ結合によ
って選択される。この方法の次の工程は、選択された組換えバクテリオファージ
によって発現される抗体フラグメントの複数の精製サンプルを生成することを包
含する。好ましくは、細胞抽出物の１０００を超えるタンパク質に特異的に結合
する抗体フラグメントが、この様式で生成される。この方法の最終工程において
、各々異なる精製サンプルの抗体フラグメントが、基板表面の個々のパッチの有
機薄膜に固定されて、基板表面の散在した既知領域に抗体フラグメントの複数の
パッチを形成する。この方法の１つの特定の実施例を、以下の実施例６に概説す
る。また、この方法は、必要に応じて、ファージディスプレイライブラリーから
特定のタンパク質（例えば、第２の細胞抽出物のタンパク質）を結合する抗体フ
ラグメントを提示するバクテリオファージを排除することによって、このライブ
ラリーを偏向するさらなる工程も包含する。排除されるバクテリオファージは、
それらの提示された抗体フラグメントの特定のタンパク質への結合親和性によっ
て、ライブラリーから除去される。
【０１４３】 例えば、抗体アレイを調製する方法は、必要に応じて、以前にヒトＴ細胞の溶
解産物で免疫されたマウスの脾臓から単離されたＲＮＡから調製されるファージ
ディスプレイラリーを用いて開始する。次いで、このファージライブラリーを、
表面または樹脂に架橋されているバックグラウンド細胞（例えば、ヒト繊維芽細
胞）の溶解産物由来のタンパク質を含む、カラムまたは親和性表面に通過させる
。次いで、第１のカラム／親和性表面からの貫流物溶液に残存するファージを、
ヒトＴ細胞の溶解産物から調製された架橋タンパク質を含む、第２の親和性表面
（例えばクロマトグラフィーカラム）に通過させる。次いで、第２のカラム／親
和性表面からの貫流物溶液を捨てる。なぜなら、この溶液は、第２の親和性表面
と反応しなかった組換え抗体を提示するファージを含むからである。次いで、第
２の親和性表面と特異的に反応しかつ第２の親和性表面に結合したままであるフ
ァージを、溶出によって収集する。溶出は、より低いｐＨ（２．０）、イオン強
度の増大、または提示された組換え抗体とファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質と
の間に遺伝子操作された特異的タンパク質分解切断部位によるタンパク質分解性
放出によって達成され得る。この方法の次の工程において、溶出したファージを
、プレーティングすることによって隔離したプラークに分離させ、次いで、個々
の培養物を増殖させる。個々の培養物由来のペリプラズム画分を調製し、そして
対応する組換え抗体を精製する。次いで、精製された組換え抗体を、２−Ｄアレ
イ上の個々のパッチに分配し、ここでこれらは有機薄膜に固定される。
【０１４４】 タンパク質捕捉剤が細胞抽出物または体液のタンパク質に対して選択される、
タンパク質捕捉剤のアレイを調製する方法は、アレイの結合パートナーのすべて
が最初に既知であるとは限らないタンパク質捕捉剤のアレイを作製する。この型
のアレイに対するタンパク質の結合によって提供される第１の情報は、タンパク
質のアバンダンスのパターンに含まれる。一旦、コントロールのタンパク質発現
パターンに対するタンパク質発現パターンの比較によって、アレイ上に目的とす
るパッチが同定されると（例えば、特定の条件のセットへの細胞の暴露後に、ア
レイのパッチに結合するタンパク質の量において有意な増加が存在することが観
察され得る）、アレイ上の特定のパッチに結合するタンパク質リガンド正体が、
タンパク質リガンドのアフィニティ精製、次いでミクロシークエンシングおよび
／または質量分析法などによって評価され得る。
【０１４５】 タンパク質捕捉剤のアレイを生成するための代替の方法は、以下の工程を包含
する：タンパク質捕捉剤のライブラリーからタンパク質捕捉剤を選択する工程で
あって、ここでタンパク質捕捉剤は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーによって発現さ
れるタンパク質に対するそれらの結合親和性によって選択される、工程；選択さ
れたタンパク質捕捉剤の複数の精製サンプルを生成する工程；および、各々異な
る精製タンパク質捕捉剤を、基板の表面上の個々のパッチの有機薄膜に固定して
、有機薄膜によって被覆される基板表面の散在した既知領域に複数のパッチを形
成する工程。
【０１４６】 この方法はまた、必要に応じて、タンパク質捕捉剤のライブラリーから特定の
タンパク質（例えば、細胞抽出物のタンパク質）を結合するタンパク質捕捉剤を
排除することによって、タンパク質捕捉剤のライブラリーを偏向するさらなる工
程を包含し、ここで排除されるタンパク質捕捉剤は、この特定のタンパク質への
それらのアフィニティ結合によってこのライブラリーから除去される。多くの場
合、タンパク質捕捉剤のライブラリーからタンパク質捕捉剤を取り去るために使
用されるタンパク質は、固定される。ライブラリーを偏向するこの工程は、必要
に応じて、選択する工程の後に、ｃＤＮＡ発現ライブラリーによって発現される
タンパク質に対するアフィニティ結合によって起こるが、より代表的には、これ
はこの選択する工程の前に起こる。これらの工程の順序は、選択する工程および
溶出する工程の性質に依存する。当業者は、適切な一連の工程を容易に決定し得
る。タンパク質捕捉剤のライブラリーを偏向する任意の工程では、ライブラリー
を必要に応じて偏向して、一般のタンパク質または目的でないタンパク質を認識
するタンパク質捕捉剤を排除する（先の実施態様について、上記されたように）
。好ましくは、この方法はさらに、どの個々の選択されたタンパク質捕捉剤が、
ｃＤＮＡ発現ライブラリーによって発現されるどの個々のタンパク質と結合する
かを同定する、さらなる工程を包含する。
【０１４７】 この方法の別の好ましい実施態様において、タンパク質捕捉剤は、組換えバク
テリオファージの表面に提示された抗体フラグメントであり、そしてタンパク質
捕捉剤のライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。
【０１４８】 例えば、抗体のアレイを調製する方法の１つの例は、必要に応じて、以前にヒ
トＴ細胞の溶解産物で免疫されたマウスの脾臓から単離されたＲＮＡから調製さ
れるファージディスプレイライブラリーを用いて開始する。次いで、ファージラ
イブラリーを、表面または樹脂に架橋されているバックグラウンド細胞（例えば
、ヒト繊維芽細胞）の溶解産物由来のタンパク質を含む、カラムまたは親和性表
面に通過させる。次いで、第１のカラム／親和性表面からの貫流物溶液に残存す
るファージを収集する。ヒトＴ細胞から単離されたメッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）に由来するｃＤＮＡ発現ライブラリーが調製され、ここで、発現ライブラリー
から発現されたタンパク質は、発現タグ（例えば、６ヒスチジンタグ）と遺伝的
に融合される。ライブラリーは拡大され、そして標識されたタンパク質が集合的
に発現および精製される。ｃＤＮＡ発現ライブラリー由来の精製され、標識され
たタンパク質のプールは、親和性表面（例えば、クロマトグラフィーカラム）に
架橋される。第１の親和性表面またはカラムを通過したファージディスプレイラ
イブラリーを、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの固定されたタンパク質を保有する親
和性表面に通過させる。親和性表面と反応しなかった組換え抗体を提示するファ
ージを含む貫流物溶液を捨てる。親和性表面と特異的に反応するファージを、ｐ
Ｈを低下させること（２．０）によって達成される溶出によって収集する。ｃＤ
ＮＡ発現ライブラリー由来の細胞をプレーティングし、そしてコロニーのフィル
ターリフト（ｆｉｌｔｅｒ ｌｉｆｔ）を、ニトロセルロースフィルターまたは
荷電ナイロンフィルターを用いて作製する。フィルターの反応部位を標準的なブ
ロッキング溶液でブロックし、そして第２のカラムの溶出された選択されたバク
テリオファージを用いて、このフィルターを探索する。アルカリホスファターゼ
と結合体化された、バクテリオファージの遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質を認
識するモノクローナル抗体との反応によってファージを可視化する。フィルター
の反応部位を切り出し、そしてこのフィルター片からファージを溶出し、そして
個々に増殖させる。溶出したファージを、隔離されたプラークに分離し、次いで
、個々の培養物として増殖する。個々の培養物由来のペリプラズム画分を調製し
、そして対応する組換え抗体を精製する。次いで、精製された組換え抗体を２−
Ｄアレイ上の有機薄膜の個々のパッチに分配させる。サンプルをこのアレイと反
応させ、そして目的とする異なるアバンダンスのパターン（コントロールと比較
した場合）を有するタンパク質リガンドを同定する。フィルター上のファージ反
応部位に対応する、もともとのプレートのコロニーを増殖し、そしてそのｃＤＮ
Ａを含有するプラスミドを配列決定して、ファージの組換え抗体と反応性である
タンパク質リガンドを同定する。本発明のアレイの調製において、抗体フラグメ
ントについて使用される方法と類似するファージディスプレイ方法は、タンパク
質捕捉剤がタンパク質からなり、およびファージミドまたは代替のベクターに組
込まれるのに適切な大きさであり、そしてファージコートタンパク質との融合物
として発現される限り、抗体フラグメント以外のタンパク質捕捉剤について使用
され得る。非抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術は、代表的
に、可変領域を支持するいくつかの型タンパク質のホスト骨格構造を利用する。
例えば、β−シートタンパク質、α−ヘリックスハンドル（ｈａｎｄｌｅ）タン
パク質、および他の高度に拘束されたタンパク質構造が、ホスト骨格として使用
されている。
【０１４９】 代替のディスプレイベクターもまた、本発明のアレイ上にプリントされるタン
パク質捕捉剤（例えば、抗体部分）を生成するために使用され得る。ポリソーム
（安定な、タンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡの複合体）は、ディスプレイビヒ
クルとして生バクテリオファージで、組換え抗体フラグメントまたは他のタンパ
ク質を置き換えるために使用され得る（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７−４９４２、
１９９７）。ポリソームは、リボソームからの、新たに合成されかつ正確に折り
たたまれたタンパク質の放出を妨げることによって形成される。ポリソームライ
ブラリーの選択は、ポリソーム上に提示される抗体フラグメントまたは他のタン
パク質の標的タンパク質への結合に基づく。次いで、標的に対して所望の親和性
を有する、提示されたタンパク質または抗体をコードするｍＲＮＡが単離される
。ファージディスプレイで使用されるよりも、より大きなライブラリーがポリソ
ームディスプレイで使用され得る。
【０１５０】 本発明のアレイのタンパク質捕捉剤を調製する、さらに別の代替方法において
、λディスプレイ（Ｍｉｋａｗａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：２１−
３０、１９９６）、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．、１５：２９−３４、１９９７）、または真核生物細胞ディスプ
レイのような代替の選択のディスプレイ方法が代わりに使用され得る。
【０１５１】 さらに、ディスプレイ方法以外の選択方法もまた、本発明のアレイのためのタ
ンパク質捕捉剤の調製において使用され得る。上記に示したように、タンパク質
捕捉剤は、当業者に公知の任意のインビトロまたはインビボ選択手順によって獲
得され得る。本発明の１つの実施態様において、抗体および抗体フラグメント以
外のタンパク質捕捉剤が、細胞抽出物中のタンパク質においてバッチ選択（ｂａ
ｔｃｈ ｓｅｌｅｃｔ）される。このような手順は、プロテオミクス（ｐｒｏｔ
ｅｏｍｉｃｓ）における適用のために非常に適切なタンパク質捕捉剤の多様性を
生み出す。
【０１５２】 本発明の代替の実施態様において、タンパク質捕捉剤は、合成手段によって部
分的にかまたは完全に調製される。タンパク質捕捉剤がタンパク質である場合、
必要に応じて、ペプチド合成またはタンパク質連結の方法が使用されて、アミノ
酸またはポリペプチド基礎単位からタンパク質を構築し得る。ポリヌクレオチド
であるタンパク質捕捉剤は、合成的に容易に調製される。
【０１５３】 （ｇ）アレイの使用 本発明はまた、本発明のアレイの使用方法を提供する。一般的には、種々の適
用（タンパク質製剤（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）および診断薬を含む）について、
本発明の方法は、分析されるタンパク質を含むサンプルのアレイへの送達を含む
。そのサンプルのタンパク質が、適切な生物学的特異性を有するタンパク質捕捉
剤を含有するアレイのパッチと相互作用すること、およびそのパッチに固定化さ
れることが可能にされた後に、次いで、各々のパッチに結合するタンパク質の存
在および／または量が決定される。本発明のタンパク質捕捉剤のアレイの１つの
使用は、必要に応じて、２５ｍｍ2の全体表面積あたり約１〜１０マイクロリッ
トルの溶液容量を有するフローチャンバー（ｆｌｏｗｃｈａｍｂｅｒ）中に二次
元アレイを配置する工程を含み得る。フローチャンバー中のアレイを覆うカバー
は、好ましくは透明かまたは半透明である。１つの実施態様において、そのカバ
ーは、Ｐｙｒｅｘまたは石英ガラスを含み得る。他の実施態様において、そのカ
バーは、アレイに固定したタンパク質捕捉剤と溶液（例えば、細胞抽出物）中の
タンパク質との間の相互作用をモニターする検出系の一部であり得る。このフロ
ーチャンバーは、タンパク質活性を保存するための適切な水性溶液で満たされた
ままであるべきである。塩、温度、および他の条件が、正常な生理学的条件のそ
れらの条件と同様に、好ましく保たれる。溶液中のタンパク質は、所望されるよ
うにフローチャンバー中に流され得、そして固定化されたタンパク質捕捉剤との
それらの相互作用が決定され得る。タンパク質捕捉剤とその結合パートナーとの
間の結合が起こることを可能にするのに十分な時間が与えられなければならない
。これに必要な時間の総計は、その結合パートナーについてのタンパク質捕捉剤
の親和性の性質および強さに依存して変化する。特別な微量溶液ポンプ、バルブ
、または混合技術は、アレイへの溶液送達のために必要ではない。あるいは、タ
ンパク質含有溶液は、アレイの各パッチに、個々に送達され得る。例えば、１つ
の実施態様において、アレイ表面に対して垂直に配向される多数の溶液送達チャ
ンネルとアレイとの統合を可能にするような方法で、基板表面の領域は微小製作
され得、個々のタンパク質捕捉剤コートされたパッチの部位において、送達チャ
ンネルの各々の１つが終結する。
【０１５４】 アレイに送達されるサンプルは、代表的には液体である。本発明の好ましい実
施態様において、そのサンプルは、細胞抽出物または体液である。アッセイされ
るそのサンプルは、必要に応じて、タンパク質の複雑な混合物を含み得、それは
、アレイのタンパク質捕捉剤の結合パートナーではない多数のタンパク質を含む
。サンプル中の分析されるタンパク質が膜タンパク質であるならば、それらのタ
ンパク質は、代表的には、アレイへのサンプルの投与の前に、可溶化される必要
がある。サンプル中のアッセイされるタンパク質が、生物において細胞の集団に
よって分泌されるタンパク質である場合、体液に由来するサンプルが好ましい。
サンプル中のアッセイされるそのタンパク質が細胞内タンパク質である場合、細
胞内抽出物であるサンプルが好ましい。本発明の１つの実施態様において、アレ
イは、生物における細胞または細胞の集団の発現産物のフラグメントに結合する
タンパク質捕捉剤を含み得る。このような場合において、アッセイされるサンプ
ルにおけるタンパク質は、細胞抽出物または体液中のタンパク質の消化を行うこ
とによって調製され得た。このアレイの代替的な適用において、細胞の特定のフ
ラクションのみに由来のタンパク質は、サンプルにおける分析のために収集され
る。
【０１５５】 一般的に、アレイのタンパク質捕捉剤によって結合されるタンパク質を含む溶
液の送達は、必要に応じて、ブロッキング溶液の送達の前に、ブロッキング溶液
の送達の後に、またはブロッキング溶液の送達と同時になされ得る。ブロッキン
グ溶液は、アレイ上の非特異的結合の部位に付着するタンパク質または別の部分
を含む。例えば、ウシ血清アルブミンまたはミルクの溶液が、ブロッキング溶液
として使用され得る。
【０１５６】 アレイ上のあるパッチのタンパク質捕捉剤の意図された結合パートナーでない
（そして実際、別のパッチの意図された結合パートナーであり得る）サンプル中
のいくつかのタンパク質は、いくらかの程度なおパッチに結合し得ることが理解
される。好ましくは、この種の結合は、非常に少ない程度までしか生じない。ま
た、正しい結合パートナーがアッセイされる溶液中に存在する場合でさえ、その
結合パートナーは、１００％より少ない効率でそれらのタンパク質捕捉剤を含む
パッチに結合することが理解される。
【０１５７】 広範な検出方法が、本発明の方法に適用可能である。所望されるように、検出
は、定量的かまたは定性的のいずれかであり得る。本発明のアレイは、光学的な
検出方法（例えば、可視光または赤外線の範囲における吸収、化学発光（ｃｈｅ
ｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、および蛍光（寿命、偏光、蛍光相関分光法（
ＦＣＳ）、および蛍光共鳴エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）））と連動され得る。さ
らに、他の検出の様式（例えば、光学的導波管に基づく様式（ＰＣＴ公開（ＷＯ
９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号））、表面プラズモン
共鳴、表面電荷センサー、および表面力センサー）は、本発明の多くの実施態様
に適合可能である。あるいは、ブルースター角顕微鏡法（ＢＡＭ）（Ｓｃｈａａ
ｆら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，３：１１３１−１１３５（１９８７））および楕円偏
光法（米国特許第５，１４１，３１１号および同第５，１１６，１２１号；Ｋｉ
ｍ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２２：２６８２−２６８５（１９８４））
に基づく技術のような技術が適用され得る。水晶マイクロバランスおよび脱着プ
ロセス（例えば、米国特許第５，７１９，０６０号を参照のこと）は、本発明の
アレイの少なくともいくつかの実施態様に適切である他の代替的な検出手段をな
お提供する。本発明のいくつかのアレイおよび種々の非標識検出原理の両方に適
合可能である光学的バイオセンサー系の例（表面プラズモン共鳴、全内部反射蛍
光（ＴＩＲＦ）、ブルースター角顕微鏡法、光学的導波管光モード分光法（ＯＷ
ＬＳ）、表面電荷測定、および楕円偏光法を含む）は、米国特許第５，３１３，
２６４号に見出され得る。
【０１５８】 非標識検出方法が一般的に好ましいが、標識の使用を必要とする伝統的なイム
ノアッセイのために一般に使用される検出方法のいくつかの型は、本発明のアレ
イに適用され得る。これらの技術には、非競合イムノアッセイ、競合イムノアッ
セイ、および二重ラベル、比測定イムノアッセイが含まれる。これらの特定の技
術は、異なる特異性を有する異なるタンパク質捕捉剤の数が小さい（約１００未
満）場合に、主としてタンパク質捕捉剤のアレイを用いる使用に適切である。競
合的方法において、結合部位の占有は、間接的に決定される。この方法において
、アレイのタンパク質捕捉剤は、標識した展開剤に曝される。これは、代表的に
は、分析物または分析物アナログの標識したバージョンである。展開剤は、タン
パク質捕捉剤上の結合部位について分析物と競合する。異なるパッチ上のタンパ
ク質捕捉剤のフラクションの占有は、個々のパッチのタンパク質捕捉剤に対する
展開剤の結合によって決定され得る。非競合的方法において、結合部位の占有は
、直接的に決定され得る。この方法において、アレイのパッチは、結合分析物ま
たはタンパク質捕捉剤上の占有された結合部位のいずれかに結合し得る標識され
た展開剤に曝される。例えば、展開剤は、占有された部位に対して指向される標
識された抗体であり得る（すなわち、「サンドウィッチアッセイ」）。あるいは
、二重標識の、比測定のアプローチが取られ得、ここでタンパク質捕捉剤は、１
つめの標識で標識され、そして第２の展開剤は、第２の標識で標識される（Ｅｋ
ｉｎｓら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．，１９４：９１−１１
４，１９９０）。多くの異なる標識方法が、上述の技術において使用され得、こ
れらには、放射性同位元素法、酵素法、化学発光法、および蛍光法が含まれる。
蛍光法が好ましい。
【０１５９】 図８は、タンパク質分析物と、固定化されたタンパク質捕捉剤のアレイの相互
作用をモニターするために使用され得る、蛍光検出ユニットの１つの型の模式図
を示す。例示された検出ユニットにおいて、タンパク質捕捉剤２１のアレイは、
基板プレート２０上に配置される。１００Ｗ水銀アークランプ２５からの光は、
励起フィルター２４を通して、そしてビームスプリッター２３に方向付けられる
。次いで、その光は、レンズ２２（例えば、Ｍｉｃｒｏ Ｎｉｋｋｏｒ ５５ｍ
ｍ １：２：８レンズ）を通して、そしてアレイ２１に方向付けられる。アレイ
からの蛍光放射は、レンズ２２およびビームスプリッター２３を通って戻る。次
に放射フィルター２６の通過後に、その放射は冷却したＣＣＤカメラ２７（例え
ば、Ｓｌｏｗｓｃａｎ ＴＥ／ＣＣＤ−１０２４ＳＦ＆ＳＢ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））によって受信される。このカメラは、ＣＰＵ２
８と作動可能に接続されており、次いで、ＣＰＵ２８はＶＣＲ２９およびモニタ
ー３０に作動可能に接続されている。
【０１６０】 図９は、楕円偏光法に基づく代替的な検出方法の模式図を示す。楕円偏光法は
、反射光波の偏光状態における観察される変化から決定されるサンプルについて
の情報を許容する。タンパク質分析物の、パッチ上の固定化されたタンパク質捕
捉剤の層との相互作用は、表面から反射する直線偏光の光ビームの厚さの変化を
生じ、そしてその直線偏光の偏光状態を変化させる。このプロセスは、インサイ
チュで水相からモニターされ得、そして所望の場合、画像化モードでモニターさ
れ得る。代表的な設定において、単色光（例えば、Ｈｅ−Ｎｅレ−ザー、３０か
ら）は、直線偏光され（ポーラライザー３１）、そしてサンプルの表面に方向付
けられ、そして検出器３５によって検出される。補償器３２は、楕円偏光的に偏
光した反射ビームを直線偏光に変化させる。対応する角度は、アナライザー３３
によって決定され、次いで、タンパク質捕捉剤を用いるタンパク質の結合に際し
て変化する、楕円偏光のパラメーター、プサイおよびデルタに翻訳される。さら
なる情報は、Ａｚｚａｍら、Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌａｒｉ
ｚｅｄ Ｌｉｇｈｔ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９７７に見出され得る。
【０１６１】 本発明のアレイは、タンパク質製剤のために特に有用である。別々のパッチで
異なる特異性の有意な数のタンパク質捕捉剤を含むこれらのアレイは、生物中の
細胞または細胞の集団の発現産物であるか、またはそのフラグメントである有意
な数のタンパク質を結合し得るか、あるいはタンパク質製剤を含む適用における
使用について特に適切である。例えば、少なくとも約１０3および約１０5までの
異なるタンパク質捕捉剤（例えば、抗体または抗体フラグメント）を有するアレ
イは、特定の条件のセットの下で、細胞のタンパク質含量の高度に広範囲にわた
る像を提供し得る。
【０１６２】 本発明の１つの実施態様において、生物中の細胞または細胞の集団の発現産物
であるか、またはそのフラグメントであるサンプル中の複数の異なるタンパク質
について並行してアッセイする方法が提供され、これには、以下の工程が包含さ
れる：最初に、タンパク質結合に適切な条件下で、異なるタンパク質捕捉剤の空
間的に区別できるパッチのアレイにサンプルを送達する工程、ここでアッセイさ
れる各々のタンパク質は、アレイ上の少なくとも１つのパッチのタンパク質捕捉
剤の結合パートナーである；次に、必要に応じて、上記のアレイを洗浄して、結
合していないかまたは非特異的に結合したサンプルの成分をアレイから除去する
工程；および、最終工程において、直接的または間接的のいずれかで、各々のア
レイのパッチに結合したタンパク質の存在または量を検出する工程。
【０１６３】 本発明の別の実施態様において、生物中の細胞または細胞の集団の発現産物で
あるか、またはそのフラグメントであるサンプル中の複数の異なるタンパク質に
ついて並行してアッセイする方法は、最初に、タンパク質結合に適切な条件下で
、タンパク質捕捉剤の本発明のアレイにサンプルを送達する工程であり、ここで
アッセイされる各々のタンパク質は、アレイ上の少なくとも１つのパッチのタン
パク質捕捉剤の結合パートナーである工程を包含する。この最初の工程の後、こ
のアレイを液体で洗浄して、結合していないかまたは非特異的に結合したサンプ
ルの成分をアレイから除去する任意の工程が続き得る。最後に、直接的または間
接的のいずれかで、各々のパッチに結合したタンパク質の存在または量が検出さ
れる。
【０１６４】 本発明のアレイのタンパク質捕捉剤の種々の異なる実施態様は、生物中の細胞
または細胞の集団の発現産物であるか、またはそのフラグメントであるサンプル
中の複数の異なるタンパク質について並行してアッセイする方法において使用さ
れ得る。一般的に、これらの方法の好ましい実施態様は、本発明の好ましいアレ
イの使用を含む。例えば、この方法の好ましい実施態様において、タンパク質捕
捉剤は、抗体または抗体フラグメントである。並行して細胞内の複数のタンパク
質の異なる量または細胞のタンパク質発現パターンをアッセイするためのさらに
好ましい実施態様において、アレイ上の複数のパッチは、生物中の細胞または細
胞の集団の発現産物であるか、またはそのフラグメントである、少なくとも約１
００または少なくとも約１０3の異なるタンパク質に結合し得る。あるいは、本
方法において使用されるアレイ上の複数のパッチは、生物中の細胞または細胞の
集団の発現産物であるか、またはそのフラグメントである少なくとも約１０4の
異なるタンパク質に結合し得る。生物中の細胞または細胞の集団の発現産物であ
るか、またはそのフラグメントであるサンプル中の複数の異なるタンパク質につ
いて並行してアッセイする方法は、必要に応じて、アレイの少なくとも１つのパ
ッチに結合するタンパク質をさらに特徴付けするさらなる工程を包含する。この
工程は、代表的には、特定のパッチのタンパク質捕捉剤に結合するタンパク質の
性質を同定するために設計される。いくつかの場合において、結合タンパク質の
全体の同一性は、公知でないかもしれないし、そしてさらなる特徴付けの目的は
、結合するタンパク質の量、配列、構造、および／または活性の最初の同定であ
り得る。他の場合において、タンパク質の基本的な同一性は公知であり得るが、
翻訳後修飾、活性化状態、またはタンパク質の他のいくつかの特徴は公知でない
かもしれない。１つの実施態様において、タンパク質のさらなる特徴付けの工程
は、タンパク質の活性を測定する工程を含む。いくつかの場合においては、タン
パク質をさらに特徴付けする工程が実行される前に、パッチからタンパク質を除
去することが好ましくあり得るが、他の場合においては、なおパッチに結合され
ている間に、タンパク質はさらに特徴付けされ得る。なおさらなる実施態様にお
いて、タンパク質に結合するパッチのタンパク質捕捉剤は、細胞からタンパク質
を単離および／または精製するために使用され得る。次いで、精製されたサンプ
ルは、伝統的な手段（例えば、微量配列決定、質量分析など）を通して特徴付け
され得る。
【０１６５】 別の実施態様において、本発明は、生物中の細胞または細胞の集団のタンパク
質発現パターンを決定する方法を提供する。この方法は、最初に、タンパク質結
合に適切な条件下で、本発明のタンパク質捕捉剤のアレイに、細胞または細胞の
集団の発現産物またはそのフラグメントを含むサンプルを送達する工程を包含す
る。次いで、各々のパッチに結合するタンパク質の存在および／または量が、適
切な検出手段によって決定され得る。その検出は、直接的または間接的のいずれ
かであり得る。定量的な検出は、代表的には、この適用のために（および他のタ
ンパク質製剤の適用のために）好ましい。この方法は、好ましくは、アレイを洗
浄して、結合していないかまたは非特異的に結合したサンプルの成分をアレイか
ら除去する工程を包含する検出工程の前に、さらなる工程をさらに含む。アレイ
のパッチに結合するタンパク質の量は、必要に応じて、アレイの第２のパッチに
結合する第２のタンパク質の量と比較して決定され得る。生物中の細胞または細
胞の集団のタンパク質発現パターンを決定する方法は、必要に応じて、先に上記
に記載したように、アレイの少なくとも１つのパッチに結合するタンパク質をさ
らに特徴付けするさらなる工程を包含する。生物中の細胞または細胞の集団のタ
ンパク質発現パターンをアッセイする方法において、アレイのタンパク質捕捉剤
の多くの標的は、必要に応じて、未知の配列、同定、および／または機能の標的
であり得る。例えば、アレイの抗体は、多くの同定されていないタンパク質を含
む細胞抽出物の固定化タンパク質にアフィニティー結合することによって、ファ
ージディスプレイライブラリーを選択することによって調製され得てきた。アレ
イの特定のパッチ上にタンパク質捕捉剤によって結合するタンパク質が未知であ
るが、それが目的のタンパク質であるならば、そのタンパク質は、必要に応じて
、最初に細胞から問題のタンパク質を単離するためにアレイ上で使用された同じ
タンパク質捕捉剤を使用することによって、後で同定または特徴付けされ得る。
次いで、細胞から単離された結合パートナーは、直接的に機能についてアッセイ
され得るか、および／または配列決定され得る。
【０１６６】 タンパク質捕捉剤のアレイはまた、２つの細胞または細胞の集団のタンパク発
現パターンを比較するために使用され得る。この方法において、第１の細胞また
は細胞の集団の発現産物またはそのフラグメントを含むサンプルは、タンパク質
結合に適切な条件下で、本発明のタンパク質捕捉剤のアレイに送達される。類似
の様式において、第２のアレイへの、第２の細胞または細胞の集団の発現産物ま
たはそのフラグメントを含むサンプルは、第１のアレイと同一である第２のアレ
イに送達される。好ましくは、両方のアレイは、次いで、結合していないかまた
は非特異的に結合しているサンプルの成分をアレイから除去するために洗浄され
る。最終工程において、第１のアレイのパッチに結合する残存しているタンパク
質の量は、第２のアレイの対応するパッチに結合する残存しているタンパク質の
量と比較される。２つの細胞または細胞の集団の差示的なタンパク発現パターン
を決定することが所望されるならば、例えば、第１のアレイのパッチに結合する
タンパク質の量は、第２のアレイの対応するパッチに結合するタンパク質の量か
ら減算され得る。
【０１６７】 ２つの細胞または細胞の集団のタンパク質発現を比較する方法は、生物学的プ
ロセスの理解のために特に有用である。例えば、これらの方法を使用して、異な
る条件に曝された同一の細胞または密接に関連する細胞のタンパク質発現パター
ンが比較され得る。最も代表的には、１つの細胞または細胞の集団のタンパク質
含量は、コントロール細胞または細胞の集団のタンパク質含量と比較される。例
えば、本発明の１つの実施態様において、細胞または細胞の集団の１つは新生物
であり、そして他方の細胞は新生物ではない。別の実施態様において、アッセイ
される２つの細胞または細胞の集団の１つは、病原体に感染している。あるいは
、２つの細胞または細胞の集団の１つは、ストレッサーに曝され、そして他の細
胞または細胞の集団はコントロールとして働く。そのストレッサーは、必要に応
じて、化学的、環境的、または温度的であり得る。２つの細胞のうちの１つは、
必要に応じて、薬物または潜在的な薬物に曝され得、そしてそのタンパク質発現
パターンがコントロール細胞と比較され得る。
【０１６８】 タンパク質レベルでの差示的な遺伝子発現をアッセイするこのような方法は、
新規な潜在的な薬物標的の同定および確証において、ならびに薬物スクリーニン
グのために有用である。例えば、その方法は、腫瘍細胞において過剰発現される
が、正常細胞においては過剰発現されないタンパク質を同定するために使用され
得る。このタンパク質は、薬物介入のための標的であり得る。次いで、過剰発現
したタンパク質の作用に対するインヒビターが開発され得る。あるいは、過剰発
現を阻害するためのアンチセンスストラテジーが開発され得る。別の例において
、薬物または潜在的な薬物に曝された細胞または細胞の集団のタンパク質発現パ
ターンは、薬物に曝されていない細胞または細胞の集団のタンパク質発現パター
ンと比較され得る。この比較は、その薬物が標的タンパク質に対する所望の効果
（薬物の効力）を有したか否かに関して、および細胞または細胞の集団の他のタ
ンパク質もまた、影響を与えたか否か（薬物の特異性）に関して、洞察を与える
。
【０１６９】 本発明のアレイはまた、診断的適用のために適切であり、そして診断的デバイ
スにおける使用のために適切である。本発明のいくつかのアレイ上の高密度の抗
体は、多数の異なる抗体に基づく診断テストを、単一のバイオチップ上で構成さ
せることを可能にする。本発明のアレイ上のタンパク質捕捉剤は、組織（例えば
、腫瘍）における疾患状態の現状を評価するために使用され得る。ここで、その
組織の細胞における特定のタンパク質の発現レベルは、特定の型の疾患状態また
は疾患状態の段階を示すことが公知である。タンパク質発現の特定のパターンは
、疾患状態を示すことが以前に公知でなければ、本発明のタンパク質捕捉剤のア
レイは、この情報を確立するために最初に使用され得る。
【０１７０】 従って、１つの実施態様において、本発明は、生物の組織中の疾患状態を評価
するための方法を提供し、この方法は、最初に、本発明のタンパク質捕捉剤のア
レイを、評価される組織の細胞の発現産物またはそのフラグメントを含むサンプ
ルと接触させる工程を包含し、ここでその接触は、タンパク質結合に適切な条件
下で起こり、そしてここでそのアレイ上の複数のタンパク質捕捉剤の結合パート
ナーは、その組織の細胞の発現産物またはそのフラグメントであるタンパク質を
含み、そしてその発現レベルは、その疾患状態を示す。この方法は、次に、直接
的または間接的でのいずれかで、各々のパッチへのタンパク質の存在を検出する
工程を含む。好ましい実施態様において、この方法はさらに、アレイを洗浄して
、結合していないかまたは非特異的に結合したサンプルの成分をアレイから除去
する工程を包含する。このような方法において、そのアレイは、代表的には、細
胞におけるそれらの存在、非存在、または相対的な量が、疾患状態の特定の型ま
たは疾患状態の現状を示すことが公知であるタンパク質に結合するタンパク質捕
捉剤を含む。例えば、このような方法においてアッセイされる複数のタンパク質
は、ＨＥＲ２タンパク質または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のようなタンパク質
を含み得る。
【０１７１】 （（ｈ）実施例） 以下の特定の実施例は、本発明を例示することが意図される。そしてこれらは
、特許請求の範囲の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【０１７２】 （実施例１.写真平板技術による２次元アレイの作製） 本発明の好ましい実施態様において、２次元アレイを、標準的写真平板技術お
よび／または薄膜堆積を介して、基板材料上に作製する。代替的技術としては、
マイクロコンタクトプリンティングが挙げられる。通常、ＣＡＤパターンを、標
準的技術を使用してフォトマスクに移し、次いで標準的技術を用いて、このパタ
ーンをフォトレジストで被覆されたシリコンウェーハ上に移す。
【０１７３】 代表的な実施例において、側面の寸法が１０×１０ｍｍであるアレイ（「チッ
プ」）は、生物反応層の角型のパッチ（ここに、シリコン基板上の被覆として金
）を備え、これは各々０．１×０．１ｍｍのサイズであり、そして０．２ｍｍ間
隔の疎水性表面領域によって分離されている。直径４’’のＳｉ（１００）ウェ
ーハ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）をバルク材料として使
用する。Ｓｉ（１００）ウェーハを、まず、濃硫酸：３０％ Ｈ2Ｏ2の３：１混
合物中（９０℃、１０分）で洗浄し、脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）でリンスし、
最後に、１％ＨＦ水溶液で不動態化し、そして１５０℃で３０分間加温（ｓｉｎ
ｇｅ）して疎水性にする。次いでこのウェーハを、フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌ
ｅｙ １８１３）でスピンコート（ｓｐｉｎｃｏａｔ）し、９０℃で２５分間プ
レバックし（ｐｒｅｂａｃｋ）し、Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓコンタクトプリンターを
使用して露光し、そして標準的プロトコルに従って現像する。次いでこのウェー
ハを乾燥し、そして１１０℃で２５分間ポストバック（ｐｏｓｔｂａｃｋ）する
。次の工程において、このウェーハを、２０ｎｍの厚さのチタン層で下塗りし、
続いて２００ｎｍの厚い金の層で下塗りする。両方の層を、電子ビーム蒸発（５
Å／ｓ）を使用して蒸着させた。レジストストリッピングおよび短いプラズマ処
理の後、この金パッチを、さらに化学的に修飾して、所望の生物反応特性および
生物適合特性を達成し得る（下記の実施例３を参照のこと）。
【０１７４】 （実施例２．穴空きマスクを介しての堆積による２次元アレイの製造） 別の好ましい実施態様において、この金パッチのアレイを、基板と直接接触し
ている穴空きマスクを介しての薄膜堆積により作製する。代表的な実施例におい
て、Ｓｉ（１００）ウェーハを、まず、濃Ｈ2ＳＯ4：３０％ Ｈ2Ｏ2の３：１混
合物（９０℃、１０分）において洗浄し、脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）でリンス
し、最後に１％ＨＦ水溶液中で不動態化し、そして１５０℃で３０分間加温（ｓ
ｉｎｇｅ）して疎水性にする。次いで、このウェーハを、所望のパッチアレイの
ポジティブパターンを示す穴空きマスクと接触させる。次の工程において、この
ウェーハを、２０ｎｍの厚さのチタン層で下塗りし、続いて、２００ｎｍの厚い
金層で下塗りする。両方の層を、電子ビーム蒸発（５Å／ｓ）を使用して蒸着さ
せた。このマスクの除去後、この金パッチをさらに化学修飾して、所望の生物反
応特性および生物適合特性を達成し得る（以下の実施例３を参照のこと）。
【０１７５】 （実施例３．アミノ反応性単層分子の合成（Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｊ．、１９９６、７０：２０５２〜２０６６に概説される手順に続く）） 概説。1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ装置（１００
〜４００ＭＨｚ）で記録する。内部標準（（ＣＨ3）4Ｓｉ、δ＝０．００（1Ｈ
−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲ）に対する化学シフト（δ）をｐｐｍで記録する。
ＦＡＢ−ｍａｓｓスペクトルを、ＶＧ−ＳＡＢＳＥＱ装置（Ｃｓ+、２０ｋｅＶ
）で記録する。透過（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）赤外線スペクトルを、ＫＢｒ
中での分散として、ＦＴＩＲ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １６００ Ｓｅｒｉ
ｅｓ装置で得る。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、事前被覆したシリカゲ
ル６０ Ｆ２５４プレート（ＭＥＲＣＫ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＦＲＧ）上で実
行する。検出を、ＮＨ3蒸気下でＣｌ2／トルイジン、ＰｄＣｌ2およびＵＶ検出
を使用して行った。中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）をＬａｂｏｍａｔ
ｉｃ ＭＤ−８０（ＬＡＢＯＭＡＴＩＣ ＩＮＳＴＲ．ＡＧ、Ａｌｌｓｃｈｗｉ
ｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、Ｍｅｒｃｋからのシリカゲル６０（粒子サイ
ズ１５〜４０μｍ）を充填したＢｕｅｃｈｉカラム（４６０×３６ｍｍ；ＢＵＥ
ＣＨＩ、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実行する。
【０１７６】 （１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）（ＤＳＵ
）の合成。チオ硫酸ナトリウム（５５．３ｇ、３５０ｍｍｏｌ）を、５０％１，
４−ジオキサン水溶液（１０００ｍｌ）中の１１−ブロモウンデカン酸（９２．
８ｇ、３５０ｍｍｏｌ）懸濁物に添加する。この混合物を還流（９０℃）で２時
間、この中間体Ｂｕｎｔｅ塩への反応が完了する（透明溶液）するまで加熱する
。この対応するジスルフィドへの酸化を、ヨウ素を一部添加することによって、
この溶液が黄色から茶色を保持するまでインサイチュで行う。余剰のヨウ素を、
水中で１５％ピロ亜硫酸ナトリウムで再滴定する。ロータリーエバポレーション
による１，４−ジオキサンの除去後、クリーム状の懸濁物を濾過して、生成物１
１，１１’−ジチオビス（ウンデカン酸）を生じる。酢酸エチル／ＴＨＦからの
再結晶化は、白色塩（７３．４ｇ、９６．５％）を提供する：ｍｐ ９４℃；1
Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ ９５：５）：δ２．６９（
ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１．７
６−１．５７（ｍ，４Ｈ）、および１．４０−１．２９（ｍ，１２Ｈ）；ＦＡＢ
−ＭＳ（Ｃｓ+，２０ｋｅＶ）；ｍ／ｚ（相対的強度）４３４（１００，Ｍ+）。
Ｃ22Ｈ42Ｏ4Ｓ2についての分析計算値：Ｃ，６０．７９；Ｈ，９．７４；Ｓ，１
４．７５。実測値：Ｃ，６０．９５；Ｈ，９．８２；Ｓ，１４．７４。ＴＨＦ（
５０ｍｌ）中の１１，１１’−ジチオビス（ウンデカン酸）（１．０ｇ、２．３
ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７５ｇ、５ｍｍｏ
ｌ）を添加し、続いて０℃のＤＣＣ（１．０３ｇ、５ｍｍｏｌ）を添加する。こ
の反応混合物を２３℃に加温し、そして３６時間室温で撹拌した後、このジシク
ロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾過する。減圧下での溶媒の除去およびアセトン
／ヘキサンからの再結晶化は、１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウ
ンデカノエート）を白色固体として生じる。最終精製を、中圧液体クロマトグラ
フィー（９ｂａｒ）により、シリカゲル、および酢酸エチルとヘキサンの２：１
混合物を使用して達成する。この有機層を濃縮し、そして真空中で乾燥して１１
，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）を得る（１．１２
ｇ、７８％）：ｍｐ ９５℃；1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ２
．８３（ｓ，４Ｈ）２．６８（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．６０（ｔ，２
Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１．７８−１．６３（ｍ，４Ｈ）、および１．４３−１
．２９（ｍ，１２Ｈ）；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃｓ+，２０ｋｅＶ）；ｍ／ｚ（相対的
強度）５１４（１００）、６２８（８６、Ｍ+）。Ｃ30Ｈ48Ｎ2Ｏ8Ｓ2についての
分析計算値：Ｃ，５７．３０；Ｈ，７．６９；Ｎ，４．４５；Ｓ，１０．２０。
実測値：Ｃ，５７．３２；Ｈ，７．６０；Ｎ，４．３９；Ｓ，１０．２５。
【０１７７】 （実施例４．金上でのアミノ反応性単層の形成（Ｗａｎｇｅｒら、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｊ．、１９９６、７０：２０５２−２０６６の手順に続く））。
【０１７８】 １１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）（ＤＳＵ）
に基く単層を、この基板表面をクロロホルム中１ｍＭのＤＳＵの溶液に室温で１
時間浸漬することによって、実施例１および実施例２のもとに記載された基板の
Ａｕ（ＩＩＩ）表面上に堆積させ得る。１０容量の溶媒でのリンスの後、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジル末端化単層を、窒素流下で乾燥し、そしてすぐに、タ
ンパク質捕捉剤の固定化に使用する。
【０１７９】 （実施例５．培養された哺乳動物細胞から調製された可溶性タンパク質の濃度
を検出するための固定化Ｆａｂ’抗体フラグメントのアレイの形成および使用）
。
【０１８０】 ＩｇＧ抗体のコレクションを商業的供給源（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入する。この抗体をまず、固定化したプロテインＡへの
結合に基くアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。この抗体を結合
緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で
１：１に希釈する。固定化されたプロテインＡを含むゲルを含む２ｍｌミニカラ
ムを調製する。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９２）。このカラムを、１０ｍｌの結合緩衝液で平
衡化する。１０ｍｇ未満のイムノグロブリンを各２ｍｌミニカラムにアプライし
、そしてこのカラムを結合緩衝液で、２８０ｎｍの吸光度が０．０２未満である
まで洗浄する。結合したイムノグロブリンを０．１Ｍグリシン、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ２．８で溶出し、そしてすぐに１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０で中和して最終濃度５０ｍＭにし、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウム、０
．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析し、そして４℃で保存する。精製
したイムノグロブリンを、固定化したペプシンで消化する。ペプシンは、酸性の
エンドペプチダーゼであり、そして芳香族およびジカルボン酸であるＬ−アミノ
酸残基に有利に隣接するタンパク質を加水分解する。ペプシンでのＩｇＧの消化
は、インタクトなＦ（ａｂ’）2フラグメントを生じる。固定化したペプシンゲ
ルを消化緩衝液；２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で洗浄する。精製したＩ
ｇＧの１０ｍｇ／ｍｌの溶液を、この固定化したペプシンゲルに添加し、そして
３７℃で２時間インキュベートする。この反応を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．５の添加により中和し、そして遠心してこのゲルをペレットにする。上
清の液体を収集し、そして上記の固定化したプロテインＡカラムにアプライして
、Ｆｃおよび未消化ＩｇＧからＦ（ａｂ’）2フラグメントを分離する。プール
したＦ（ａｂ’）2を１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．２に対して透析し、そして４℃で保存する。プールした、溶出したＦ（ａｂ
’）2の量を２８０ｎｍのピーク領域吸光度により測定する。
【０１８１】 濃度１０ｍｇ／ｍｌの精製したＦ（ａｂ’）2フラグメントを、緩衝液（１０
ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエチ
ルアミン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中で３７℃で１時間還元する。この
Ｆａｂ’フラグメントを、未分裂のＦ（ａｂ’）2フラグメントから分離し、そ
してＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ｍr＝４６，０００〜５８，０００）
へのアプライにより濃縮する。プールしたＦａｂ’フラグメントを、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析する。還元し
たＦａｂ’フラグメントを１００μｇ／ｍｌに希釈し、そして曝露したアミノ反
応性官能基を含む生物反応性パッチ上に、計算機援用キャピラリーベースの微小
分配系（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ，ｃａｐｉｒａｌｌｙ−ｂａｓｅｄ ｍ
ｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（抗体固定手順については、Ｄ
ａｍｍｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７０：２４３７〜２４４１、１９９６を
参照のこと）。３０℃で３０分の固定化期間の後、このアレイを１０ｍＭリン酸
ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で徹底的に
リンスする。
【０１８２】 培養して増殖した形質転換されたヒト細胞を、低速遠心分離により収集し、氷
冷リン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）で手短かに洗浄し、次いでＤＮａｓｅ／ＲＮａｓ
ｅ（最終濃度、各々１０μｇ／ｍｌ）ならびにプロテアーゼインヒビター混合物
を含む氷冷低張緩衝液中に再懸濁する。細胞を微小遠心管に移し、５分間膨張さ
せ、そして液体窒素中での急速凍結および氷冷水中での解凍により溶解する。細
胞細片および沈殿物を高速遠心分離により除去し、そしてその上清を０．４５μ
ｍ濾過器を通すことにより清澄化する。清澄化した溶解物を、上記のＦａｂ’フ
ラグメントアレイにアプライし、そして３０℃で２時間インキュベートさせる。
結合後、このアレイを１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で徹底的に洗浄する。結合したタンパク質の位置およ
び量を光学的検出により決定する。
【０１８３】 （実施例６．培養された哺乳動物細胞から調製された可溶性タンパク質の濃度
を検出するための固定化抗体フラグメントのアレイの、形成および使用）。
【０１８４】 ｓｃＦｖ抗体フラグメントを発現する糸状ファージのコンビナトリアルライブ
ラリーを、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙおよび共同研究者；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、
Ｎａｔｕｒｅ、１９９０、３４８：５５２〜５５４；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３４９：２９３〜２９９の教示に基いて
作製する。手短かには、ｍＲＮＡをマウス脾臓から精製し、そしてそれを使用し
てｃＤＮＡライブラリーを構築する。このマウスの可変の、重鎖および軽鎖のイ
ムノグロブリン遺伝子の配列をコードするＰＣＲフラグメントを、この調製した
ｃＤＮＡから増幅する。この増幅したＰＣＲ生成物を、１５アミノ酸ペプチド（
Ｇｌｙ4ＳｅｒＧｌｙ2ＣｙｓＧｌｙＳｅｒＧｌｙ4Ｓｅｒ）（配列番号１）をコ
ードするＤＮＡのリンカー領域により結合し、そして生じた全長ＰＣＲフラグメ
ントを発現プラスミド（ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ）中にクローニングする。この発
現プラスミドにおいては、精製ペプチドタグ（Ｅ Ｔａｇ）がＨｉｓ6ペプチド
により置換されている（配列番号２）。エレクトロコンピテントＴＧ１ Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞を、エレクトロポレーションにより発現プラスミドで形質転換する。
ｐＣＡＮＴＡＢで形質転換された細胞を誘導し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ
での重複感染により、ｓｃＦｖフラグメントを発現する機能的糸状ファージを生
成する。細胞を抗生物質アンピシリン（このファージミドを有する細胞を選択す
るため）およびカナマイシン（Ｍ１３Ｋ０７に感染した細胞を選択するため）を
含むグルコース欠損培地上で増殖させる。グルコースの非存在下では、このファ
ージミド上に存在するｌａｃプロモーターはもはや抑制されず、そしてｓｃＦｖ
遺伝子３融合物の合成が始まる。細胞溶解物からのタンパク質を、９６ウェルプ
レートのウェルに吸収させる。
【０１８５】 培養して増殖した形質転換されたヒト細胞を低速遠心分離により収集し、そし
てその細胞を氷冷ＰＢＳで手短かに洗浄する。次いで、この洗浄された細胞をＤ
Ｎａｓｅ／ＲＮａｓｅ（最終濃度、各々１０μｇ／ｍｌ）ならびにプロテアーゼ
インヒビター混合物を含む氷冷低張緩衝液中に再懸濁し、５分間膨張させ、そし
て液体窒素中での急速凍結および氷冷水中での解凍により溶解する。細胞細片お
よび沈殿物を高速遠心分離により除去し、そしてその上清を０．４５μｍ濾過器
を通すことにより清澄化する。清澄化した溶解物を、希釈緩衝液（２０ｍＭ Ｐ
ＩＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０％、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２中で
１０μｇ／ｍｌに希釈し、そして９６プレートウェルにアプライする。３０℃で
１時間の固定化の後、このウェルをこの希釈緩衝液で洗浄し、次いで１０％脱脂
乾燥乳を含む希釈緩衝液でインキュベートして未反応部位をブロックする。ブロ
ック工程後、このウェルを希釈緩衝液で徹底的に洗浄する。
【０１８６】 提示される抗体を発現するファージを、遠心分離によりＥ．ｃｏｌｉ細胞から
分離し、次いで、１５％ｗ／ｖ ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌの添加に
続いて遠心分離により上清から沈殿させる。この精製したファージを３％脱脂乾
燥乳を含む希釈緩衝液中で再懸濁し、そして上記の固定化タンパク質を含むウェ
ルにアプライし、そして３７℃で２時間結合させ、続いてこの結合緩衝液で徹底
洗浄する。ファージをこのウェルから溶出緩衝液（ｐｕｒｇｅ ｂｕｆｆｅｒ）
（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、２．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０％
、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐ
Ｈ７．２）で徹底的に溶出させる。次いで、このウェルを、希釈緩衝液（２０ｍ
Ｍ ＰＩＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０％、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．
２）で徹底的に洗浄する。次いで、この溶出したファージ溶液を、吸収された抗
原を含む新しいウェルに再アプライし、そしてこのパニング濃縮を４回繰り返す
。最後に、このファージをウェルから、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、０．１％ ＣＨ
ＡＰＳ、１０％、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍ
Ｍ ＤＴＴ、ｐＨ７．２中、２ＭのＮａＣｌで溶出させる。溶出物を収集し、そ
して対数期のＴＧ１細胞と混合し、３７℃で１時間増殖させ、次いでアンピシリ
ンおよびグルコースを含むＳＯＢ培地上にプレートし、そして１２〜２４時間増
殖させる。
【０１８７】 個別のクローンを釣菌し、そしてＳＯＢ培地およびＭ１３Ｋ０７ヘルパーファ
ージを含む９６ウェルの２ｍｌブロックに整列させ、そして３７℃で振盪しつつ
８時間増殖させる。このファージを、遠心分離により細胞から分離し、そして上
記のＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させる。濃縮したファージを使用して、ＨＢ２１５
１をＥ．ｃｏｌｉに感染させる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１は、ｐＣＡＮＴＡＢ ５
ＥプラスミドのｓｃＦｖとファージ遺伝子３配列との間に位置するアンバー終
止コドンの読み通し（抑制）を可能にするサプレッサーｔＲＮＡを生成する。感
染したＨＢ２１５１細胞をアンピシリン、グルコース、およびナリジクス酸を含
む培地上で選択する。細胞を対数中期まで増殖させ、次いで遠心分離し、そして
グルコースを欠失する培地中で再懸濁し、そして増殖を続ける。可溶性ｓｃＦｖ
フラグメントは、細胞ペリプラズム中に蓄積する。ペリプラズム抽出物を、中程
度の浸透圧性ショックによりペレット化した細胞から調製する。この上清中に放
出された可溶性ｓｃＦｖを、Ｎｉ−ＮＴＡ活性化アガロースへのアフィニティー
結合により精製し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡで溶出する。
【０１８８】 精製したｓｃＦｖ抗体フラグメントを１００μｇ／ｍｌに希釈し、そして曝露
したアミノ反応性基を含む生物反応性パッチ上に、計算機援用キャピラリーベー
スの微小分配系（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ，ｃａｐｉｒａｌｌｙ−ｂａｓ
ｅｄ ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用してアプライす
る。３０℃で３０分の固定化期間の後、このアレイを１０ｍＭリン酸ナトリウム
、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で徹底的にリンスする
。
【０１８９】 培養して増殖した形質転換されたヒト細胞を、低速遠心分離により収集し、氷
冷ＰＢＳで手短かに洗浄し、次いでＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（最終濃度、各々１
０μｇ／ｍｌ）ならびにプロテアーゼインヒビター混合物を含む氷冷低張緩衝液
中に再懸濁する。細胞を微小遠心管に移し、５分間膨張させ、そして液体窒素中
での急速凍結および氷冷水中での解凍により溶解する。細胞細片および沈殿物を
高速遠心により除去し、そしてその上清を０．４５μｍ濾過器を通すことにより
清澄化する。清澄化した溶解物を、上記のｓｃＦｖフラグメントアレイにアプラ
イし、そして３０℃で２時間インキュベートさせる。結合後、このアレイを０．
１ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
０で徹底的に洗浄する。結合したタンパク質の位置および量を光学的検出により
決定する。
【０１９０】 結合のパターンを、コントロール細胞抽出物の希釈物を試験することにより経
験的に確立する。実験細胞からの抽出物を一連の濃度に希釈し、次いで、このア
レイに対して試験する。実験細胞溶解物中でのタンパク質発現パターンをコント
ロールサンプルにおけるタンパク質発現パターンと比較して、独自の発現プロフ
ィールを持つタンパク質を同定する。
【０１９１】 （実施例７．培養した哺乳動物細胞から調製された可溶性タンパク質の濃度の
検出のための、固定化されたモノクローナル抗体のアレイの形成および使用） モノクローナル抗体のコレクションを、未精製の腹水液か、またはプロテイン
Ａ、プロテインＧもしくはプロテインＬに対するクロマトグラフィーにより精製
した腹水液のいずれかとして、商業的供給源から購入する。未精製の腹水液から
の場合、これらの抗体を、このイムノグロブリンのサブクラスおよび種に適切な
ので、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧまたはＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａカラム（Ｐｈａｍａｃｉａ）を使用して、精製する。クロマトグラフィーの前
に、この腹水を等容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７
．４（ＰＢＳ）で希釈し、そして０．２２μｍ濾過器を通すことにより清澄化す
る。この濾過物を、ＰＢＳ中のカラム上にロードし、そしてこのカラムを２カラ
ム容量のＰＢＳで洗浄する。この抗体を１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、
ｐＨ２．７（プロテインＧについて）または１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０（
プロテインＡについて）で溶出する。この溶出物を１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に収集する。その最終ｐＨは７．５である。この抗体
を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、次いでプールし、そしてＰＢＳに
対して透析する。精製した抗体の種々のサンプルを、各々１００μｇ／ｍｌに希
釈する。各々の異なる抗体サンプルを、計算機援用キャピラリーベースの微小分
配系を使用して、アミノ反応性単層パッチのアレイの別々のパッチにアプライす
る（上記の実施例４を参照のこと）。３０℃で３０分の固定化期間の後、このア
レイを１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．０で徹底的にリンスする。
【０１９２】 培養して増殖した形質転換されたヒト細胞を、低速遠心分離により収集し、氷
冷ＰＢＳで手短かに洗浄し、そしてＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（最終濃度、各々１
０μｇ／ｍｌ）ならびにプロテアーゼインヒビター混合物を含む氷冷低張緩衝液
中に再懸濁する。細胞を微小遠心管に移し、５分間膨張させ、そして液体窒素中
での急速凍結および氷冷水中での解凍により溶解する。細胞細片および沈殿物を
高速遠心分離により除去し、そしてその上清を０．４５μｍ濾過器を通すことに
より清澄化する。清澄化した溶解物を、上記のモノクローナル抗体アレイにアプ
ライし、そして３０℃で２時間インキュベートさせる。結合後、このアレイを上
記の実施例６のように徹底的に洗浄する。結合したタンパク質の位置および量を
光学的検出により決定する。
【０１９３】 上記の明細書中に引用される全ての書類は、本明細書中で参考として援用され
る。さらに、同時継続中の米国特許出願「Ａｒｒａｙｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」（１９９０年７
月１４日出願、発明者Ｐｅｔｅｒ Ｗａｇｎｅｒ、Ｄａｎａ Ａｕｌｔ−Ｒｉｃ
ｈｅ、Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｎｏｃｋ、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ Ｉｔｉｎに対す
る識別番号２４４０６−０００４ Ｐ１）が、その全体が本明細書中で参考とし
て援用される。本発明の種々の改変および変化が、本発明の範囲および精神から
逸脱せずに、当業者に明らかである。本発明は特定の実施態様に関して記載して
いるが、特許請求される本発明がこのような特定の実施態様に過度に制限される
べきではないことが、理解されるべきである。実際、当業者に明らかである、本
発明を実行するために記載された様式の種々の改変が、上記の特許請求の範囲の
範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、タンパク質−捕捉剤に対して反応性のパッチのアレイの平面図を示す
。
【図２】 図２は、図１のアレイの個々のパッチの断面図を示す。
【図３】 図３は、図１のアレイの単層に覆われたパッチの列の断面図を示す。
【図４】 図４は、基板上のチオール反応性単層を示す。
【図５】 図５は、コートされた基板上のアミノ反応性単層を示す。
【図６】 図６は、アフィニティータグを介した単層にコートされた基板上のタンパク質
−捕捉剤の固定化を示す。
【図７】 図７は、アフィニティータグおよびアダプターを介した単層にコートされた基
板上のタンパク質−捕捉剤の固定化を示す。
【図８】 図８は、アレイのタンパク質−捕捉剤によるタンパク質の結合をモニターする
ために使用され得る蛍光検出ユニットの模式図を示す。
【図９】 図９は、アレイのタンパク質−捕捉剤によるタンパク質の結合をモニターする
ために使用され得る楕円偏光検出ユニットの模式図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 オルト−リシェ， ダナ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303， パロ アルト， ケイジョン ウェイ 972 (72)発明者 アイティン， クリスティアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025， メンロ パーク， ウエバーレー スト リート ナンバー３ 315

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質−捕捉剤のアレイであって、以下： （ａ）基板； （ｂ）該基板の表面のいくらかまたは全てを被覆する、少なくとも１つの有機薄
    膜；および （ｃ）有機薄膜によって被覆された該基板の表面の部分上の別個の既知の領域に
    配置された複数のパッチ、 を包含し、 ここで： （ｉ）各パッチが、該有機薄膜上に固定されたタンパク質−捕捉剤を包含し、
    ここで、所定のパッチの該タンパク質−捕捉剤が、生物中の細胞または細胞集団
    の特定の発現産物またはそのフラグメントを結合し得；そして （ｉｉ）該アレイが、複数の異なるタンパク質−捕捉剤を包含し、それらの各
    々は、細胞または細胞集団の異なる発現産物またはそのフラグメントを結合し得
    る、 タンパク質−捕捉剤のアレイ。
  2. 【請求項２】 少なくとも約１０個の前記パッチを包含する、請求項１に記
    載のアレイ。
  3. 【請求項３】 少なくとも約１００個の前記パッチを包含する、請求項２に
    記載のアレイ。
  4. 【請求項４】 少なくとも約１０3個の前記パッチを包含する、請求項３に
    記載のアレイ。
  5. 【請求項５】 少なくとも約１０の異なるタンパク質−捕捉剤を包含する、
    請求項１に記載のアレイ。
  6. 【請求項６】 少なくとも約１００の異なるタンパク質−捕捉剤を包含する
    、請求項５に記載のアレイ。
  7. 【請求項７】 少なくとも約１０００の異なるタンパク質−捕捉剤を包含す
    る、請求項６に記載のアレイ。
  8. 【請求項８】 前記パッチの各々で被覆された前記基板の表面積が、約０．
    ２５ｍｍ2以下である、請求項１に記載のアレイ。
  9. 【請求項９】 前記パッチの各々で被覆された前記基板の表面積が、約１μ
    ｍ2と約１０，０００μｍ2との間である、請求項８に記載のアレイ。
  10. 【請求項１０】 前記パッチが、前記基板の表面の約１ｃｍ2以下の面積に
    全て含まれる、請求項１に記載のアレイ。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質−捕捉剤が、タンパク質である、請求項１
    に記載のアレイ。
  12. 【請求項１２】 前記タンパク質−捕捉剤が、抗体または抗体フラグメント
    である、請求項１１に記載のアレイ。
  13. 【請求項１３】 前記抗体または抗体フラグメントが、ファージディスプレ
    イ法を使用する、ライブラリーからの選択によって誘導されている、請求項１２
    に記載のアレイ。
  14. 【請求項１４】 前記抗体または抗体フラグメントが、細胞抽出物または体
    液のタンパク質へのアフィニティー結合によって誘導されている、請求項１３に
    記載のアレイ。
  15. 【請求項１５】 前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体
    、Ｆａｂフラグメント、および単鎖Ｆｖからなる群から選択される、請求項１２
    に記載のアレイ。
  16. 【請求項１６】 前記アレイ上の前記有機薄膜が、約２０ｎｍより薄い厚さ
    である、請求項１に記載のアレイ。
  17. 【請求項１７】 前記アレイ上の前記有機薄膜が、単層を包含する、請求項
    １に記載のアレイ。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のアレイであって、前記単層が、以下の
    式の分子： （Ｘ）aＲ（Ｙ）b を包含する自己集合単層を包含し、 ここで、Ｒは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを前記表面に結合する官能基であり
    、Ｙは、前記タンパク質−捕捉剤を前記単層上に結合するための官能基であり、
    そしてａおよびｂは、独立して、整数である、アレイ。
  19. 【請求項１９】 ａおよびｂの両方が、１に等しい、請求項１８に記載のア
    レイ。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載のアレイであって、ここで： 前記基板が、シリコン、二酸化ケイ素、インジウムスズオキシド、アルミナ、
    ガラス、およびチタニアからなる群から選択され；そして Ｘが、前記単層に組み込まれる前に、モノハロシラン、ジハロシラン、トリハ
    ロシラン、トリクロロシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、モ
    ノアルコキシシラン、カルボン酸、およびリン酸からなる群から選択される、 アレイ。
  21. 【請求項２１】 前記基板がシリコンを包含し、そしてＸがオレフィンであ
    る、請求項１８に記載のアレイ。
  22. 【請求項２２】 前記基板がポリマーを包含する、請求項１に記載のアレイ
    。
  23. 【請求項２３】 前記基板と前記単層との間の少なくとも１つのコーティン
    グをさらに包含する請求項１８に記載のアレイであって、ここで、該コーティン
    グが、該基板上に形成されるか、または該基板上に適用される、アレイ。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載のアレイであって、ここで： 前記コーティングが、貴金属膜であり；そして Ｘが、前記単層に組み込まれる前に、非対称性もしくは対称性の、ジスルフィド
    、スルフィド、ジセレニド、セレニド、チオール、イソニトリル、セレノール、
    三価リン化合物、イソチオシアネート、イソシアネート、キサンタネート（ｘａ
    ｎｔｈａｎａｔｅ）、チオカルバメート、ホスフィン、アミン、チオ酸、および
    ジチオ酸からなる群から選択される官能基である、 アレイ。
  25. 【請求項２５】 前記コーティングがチタニアもしくは酸化タンタルであり
    、そしてＸがリン酸基である、請求項２３に記載のアレイ。
  26. 【請求項２６】 各タンパク質−捕捉剤が、アフィニティータグによって、
    前記有機薄膜上に固定されている、請求項１に記載のアレイ。
  27. 【請求項２７】 結合したタンパク質のアレイであって、以下： （ａ）請求項１に記載のアレイ；および （ｂ）生物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントである
    複数の異なるタンパク質であって、ここで、該異なるタンパク質の各々が、該ア
    レイの別々のパッチ上のタンパク質−捕捉剤に結合される、複数の異なるタンパ
    ク質、 を包含する、結合したタンパク質のアレイ。
  28. 【請求項２８】 請求項１に記載のアレイを包含する、診断用デバイス。
  29. 【請求項２９】 生物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグ
    メントであるサンプル中の複数の異なるタンパク質について、並行してアッセイ
    する方法であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを、異なるタンパク質−捕捉剤の空間的に別個のパッチのア
    レイに、タンパク質結合に適した条件下で送達する工程であって、ここで、アッ
    セイされる該タンパク質の各々が、該アレイ上の少なくとも１つのパッチの該タ
    ンパク質−捕捉剤の結合パートナーである、工程；および （ｂ）該アレイの各々のパッチに結合されたタンパク質の存在またはその量に
    ついて、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで検出する工程、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 生物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグ
    メントであるサンプル中の複数の異なるタンパク質について、並行してアッセイ
    する方法であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを、請求項１に記載のアレイに、タンパク質結合に適した条
    件下で送達する工程であって、ここで、アッセイされる該タンパク質の各々が、
    該アレイ上の少なくとも１つのパッチの該タンパク質−捕捉剤の結合パートナー
    である、工程；および （ｂ）該アレイの各々のパッチに結合されたタンパク質の存在またはその量に
    ついて、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで検出する工程、 を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の方法であって、該方法が、さらに、以
    下の工程： 前記アレイの少なくとも１つのパッチに結合したタンパク質をさらに特徴付ける
    工程、 を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 前記タンパク質をさらに特徴付ける前記工程が、該タンパ
    ク質の活性を測定することを包含する、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 生物中の細胞または細胞集団のタンパク質の発現パターン
    を決定するために方法であって、以下の工程： （ａ）該細胞または細胞集団の該発現産物またはそのフラグメントを含有する
    サンプルを、請求項１に記載のアレイに、タンパク質結合に適した条件下で送達
    する工程；および （ｂ）該アレイの各々のパッチに結合されたタンパク質の量を、直接的にかま
    たは間接的にかのいずれかで検出する工程、 を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 ２つの細胞または細胞集団のタンパク質発現パターンを比
    較する方法であって、以下の工程： （ａ）第一の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントを含有す
    るサンプルを、請求項１に記載の第一のアレイに、タンパク質結合に適した条件
    下で送達する工程； （ｂ）第二の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントを含有す
    るサンプルを、第二のアレイに送達する工程であって、ここで、該第二のアレイ
    は、該第一のアレイと同一である、工程； （ｃ）洗浄した、該第一のアレイおよび該第二のアレイ上の各々のパッチに結
    合されたタンパク質の量について、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで検
    出する工程；および （ｄ）該第一のアレイのパッチに結合されたタンパク質の量を、該第二のアレ
    イの対応するパッチに結合されたタンパク質の量と比較する工程、 を包含する、方法。
  35. 【請求項３５】 生物中の組織における疾患状態を評価する方法であって、
    以下の工程： （ａ）評価される組織の細胞の発現産物またはそのフラグメントを含有するサ
    ンプルを、請求項１に記載のアレイと、タンパク質結合に適切な条件下で接触さ
    せる工程であって、ここで、該アレイ上の複数のタンパク質−捕捉剤の結合パー
    トナーが、該組織の細胞の発現産物またはそのフラグメントであるタンパク質を
    含み、そしてそれらの発現レベルが、疾患状態の指標となる、工程；および （ｂ）該アレイの各々のパッチに結合されたタンパク質の量について、直接的
    にかまたは間接的に決定する工程、 を包含する、方法。
  36. 【請求項３６】 請求項１に記載のアレイを産生するための方法であって、
    以下の工程： （ａ）ファージディスプレイライブラリーから、抗体フラグメントを発現する
    組換えバクテリオファージを選択する工程であって、ここで、該組換えバクテリ
    オファージを、生物中の細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメント
    であるタンパク質へのアフィニティー結合により選択する、工程； （ｂ）工程（ａ）で選択されたバクテリオファージからの抗体フラグメントの
    、少なくとも１つの精製サンプルを産生する工程；および （ｃ）該生物からの細胞または細胞集団の発現産物またはそのフラグメントで
    ある異なるタンパク質、または第二のタンパク質のフラグメントを用いて、異な
    る結合対を有する異なる抗体フラグメントの所望の複数の精製サンプルが産生さ
    れるまで、工程（ａ）〜（ｂ）を反復する工程；および （ｄ）各々の異なる精製サンプルの抗体フラグメントを、基板表面の別々のパ
    ッチの有機薄膜上に固定化し、該基板表面の別個の既知の領域に、抗体フラグメ
    ントの複数のパッチを形成させる工程、 を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 タンパク質−捕捉剤のアレイを産生するための方法であっ
    て、以下の工程： （ａ）タンパク質−捕捉剤ライブラリーから、タンパク質−捕捉剤を選択する
    工程であって、ここで、該タンパク質−捕捉剤を、細胞抽出物または体液中のタ
    ンパク質に対するそれらの結合親和性によって選択する、工程； （ｂ）工程（ａ）の選択されたタンパク質−捕捉剤の複数の精製サンプルを産
    生する工程；および （ｃ）各々の異なる精製サンプルのタンパク質−捕捉剤を、基板表面の別々の
    パッチの有機薄膜上に固定化し、該基板表面の別個の既知の領域に、タンパク質
    −捕捉剤の複数のパッチを形成させる工程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 前記タンパク質−捕捉剤が、組換えバクテリオファージの
    表面に提示された抗体フラグメントであり、そして前記タンパク質−捕捉剤ライ
    ブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項３７に記載の方
    法。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の方法であって、さらに、以下の工程： 前記タンパク質−捕捉剤ライブラリーを、特定のタンパク質に結合するタンパ
    ク質−捕捉剤を該ライブラリーから排除することによって偏らせる工程であって
    、ここで、排除されるタンパク質−捕捉剤が、該特定のタンパク質への結合親和
    性によって、該ライブラリーから除去される、工程、 を包含する、方法。
  40. 【請求項４０】 前記特定のタンパク質が、第二の細胞抽出物または体液中
    のタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３７に記載の方法によって産生された、タンパク質
    −捕捉剤のアレイ。
  42. 【請求項４２】 タンパク質−捕捉剤のアレイを産生するための方法であっ
    て、以下の工程： （ａ）タンパク質−捕捉剤を、タンパク質−捕捉剤ライブラリーから選択する
    工程であって、ここで、該タンパク質−捕捉剤を、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの
    発現産物またはそのフラグメントであるタンパク質に対する結合親和性によって
    選択する、工程； （ｂ）工程（ａ）のタンパク質−捕捉剤の、複数の精製サンプルを産生する工
    程；および （ｃ）各々の異なる精製サンプルのタンパク質−捕捉剤を、基板表面の別々の
    パッチの有機薄膜上に固定化し、該基板表面の別個の既知の領域に、タンパク質
    −捕捉剤の複数のパッチを形成させる工程、 を包含する、方法。
  43. 【請求項４３】 前記タンパク質−捕捉剤が、組換えバクテリオファージの
    表面上に提示される抗体フラグメントであり、そして前記タンパク質−捕捉剤ラ
    イブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項４２に記載の
    方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４２に記載の方法であって、さらに、以下の工程： タンパク質−捕捉剤ライブラリーを、特定のタンパク質に結合するタンパク質
    −捕捉剤をライブラリーから排除することによって偏らせる工程であって、ここ
    で、排除されるタンパク質−捕捉剤が、該特定のタンパク質への結合親和性によ
    って、該ライブラリーから除去される、工程、 を包含する、方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４２に記載の方法によって産生された、タンパク質
    −捕捉剤のアレイ。
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