JP5127718B2 - 複雑な組成を有する生物学的起源のサンプル中の1種若しくはそれ以上の被検体の測定方法およびその使用 - Google Patents
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Description
異的結合は前記測定領域それら自身では起こらないことが暗黙のうちに想定される。こうした影響は記述される方法の助けを借りれば考慮に入れられ得ないからである。捕捉アレイの場合には、測定領域に塗布された化合物の十分に定義された組成、すなわち通常は測定領域内の標準的形態の認識要素で、前述の要件は、とりわけ、アッセイで使用される前記認識要素ならびに結合および検出試薬を慎重に選択することにより、実質的に満たされ得る。
[発明の詳細な記述]
本発明により、固体支持体上の空間的に分離されたすなわち個別の測定領域は、そこに塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル若しくは塗布された照合試薬(例えば蛍光標識アルブミンのような)若しくは較正試薬またはそれらの塗布された混合物により占有される閉鎖された領域により定義する。前記領域はいかなる幾何学的外形も有しうる(例えば、円形、長方形、三角形、楕円形などでありうる)。
(1)生物学的起源かつ複雑な組成の1種若しくはそれ以上のサンプルを提供する段階、(2)最低1種の固体支持体を提供する段階、
(3)希釈若しくは未希釈の形態の、生物学的起源かつ複雑な組成の少量の前記サンプルを、前記固体支持体上に直接、若しくは付着促進層の前塗布後に該固体支持体上の前記付着促進層にのいずれかで、個別の部位に塗布して、それにより該最低1種の固体支持体上の個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイを生成する段階、
(4)個別の測定領域の最低1個のアレイを、生物学的起源かつ複雑な組成の塗布されたサンプル中の個別の測定領域中の検出されるべきかつ存在する被検体の特異的結合パートナーとしての1種若しくはそれ以上の結合試薬、および、場合によっては、必要とされる場合は1種若しくはそれ以上の検出試薬を含んでなる第一の溶液と接触させる段階(結合試薬および検出試薬は同時に若しくは連続して塗布されることが可能であり)、
(5)段階(4)で第一の溶液と接触された1個若しくはそれ以上のアレイの個別の測定領域から発する第一の光信号を空間分解様式で測定する段階、
(6)前記第一の光信号を記録する段階
を含んでなり、
添加される結合試薬、および、場合によっては添加される検出試薬との非特異的相互作用により生成される光信号である測定される第一の光信号の部分が、以下のさらなる段階:(7a)1種若しくはそれ以上の結合試薬および場合によっては段階(4)で添加される第一の溶液の1種若しくはそれ以上の検出試薬に加えて、前記結合試薬および場合によっては付加的に添加される検出試薬の特異的結合についての、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(このサンプルは個別の測定領域に塗布されている)中の検出されるべきかつ存在する前記被検体に対する競合体としての、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(このサンプルは個別の測定領域に塗布されている)中の検出されるべきかつ存在する被検体と同一の種類のものである既知の高濃度の化合物を含んでなる第二の溶液を、段階(3)で生成される個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイに塗布する段階、ならびに/または
(7b)前記1種若しくはそれ以上の結合試薬および場合によっては段階(4)で添加される第一の溶液の1種若しくはそれ以上の検出試薬に加えて、前記結合試薬および場合によっては付加的に添加される検出試薬の非特異的結合について、個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中に存在するサンプルマトリックスの物質と競合することの目的上、段階(3)で塗布されたサンプルのサンプルマトリックス中に存
在する物質と類似の種類のものである既知の高濃度の物質を含んでなる第三の溶液を、段階(3)で生成される個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイに塗布する段階、(8)段階(7a)で第二の溶液および/若しくは段階(7b)で第三の溶液と接触された1個若しくはそれ以上のアレイの個別の測定領域から発する第二および/若しくは第三の光信号を空間分解様式で測定する段階、
(9)前記第二および/若しくは第三の光信号を記録する段階、ならびに
前記第一ならびに第二および/若しくは第三の光信号を比較する段階
を実施することにより測定されることを特徴とする、
生物学的起源かつ複雑な組成の1種若しくはそれ以上のサンプル中の1種若しくはそれ以上の被検体の検出方法に関する。
。こうした手順は、例えば癌に冒されている生物体を検査するために非常に重要である。
らの取り出し、ならびに多様な試薬によるその後の処理若しくは刺激および/または多様な外的条件下で培養すること(例えばUV光による照射、熱ショックなどの影響を研究するため)によってもまた生成しうる。
くはアセチル化若しくはグリコシル化の程度と称する。リン酸化の程度、メチル化の程度、アセチル化の程度およびグリコシル化の程度は、化合物の活性化の程度という包括的用語の下で合わせうる。しかしながら、化合物の活性化の程度は化合物の他の化学修飾された形態もまた指すことがある。本発明の方法は、発現されるタンパク質の活性化の程度を測定するためにもまたとりわけ適する。
ナログ(例えばPNA)ならびに人工的塩基を有するそれらの誘導体を含んでなる化合物の群から選択されうる。
第二の溶液の、特異的結合パートナーとしての結合試薬、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(このサンプルは個別の測定領域に塗布されている)中の検出されるべきかつ存在する被検体と同一の種類の化合物、および任意の検出試薬、ならびに/若しくは
第三の溶液の、特異的結合パートナーとしての結合試薬、個別の測定領域に段階(3)で塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプルのサンプルマトリックス中に存在する物質と類似の種類のものである物質、および任意の検出試薬を、各場合に相互と前インキュベートし、ならびに、前記第一、第二若しくは第三の溶液をその後、単一添加段階にて測定領域の前記アレイと接触する。
質に標準として添加されている測定領域を含んでなる場合が有利である。測定領域のアレイが、検出されるべき被検体と同一の種類のものである多様な既知濃度の化合物が、塗布される物質に標準として添加されている、多数の測定領域を含んでなり、こうした測定領域の数および前記多様な既知濃度のレベルが、本発明の方法の請求項1に記載の段階(4)による特異的結合パートナーとしての結合試薬および場合によっては同様の検出試薬を含有する第一の溶液を添加することの単一段階、ならびに請求項1に記載のその後の段階(5)および(6)によって、アレイ中の検出されるべき前記被検体の未知濃度を測定するための較正曲線を生成するために十分であるという事実がここでとりわけ好ましい。再度、結合試薬および任意の検出試薬が、本発明の方法の段階(4)により、単一の添加段階若しくは適切な場合は間に実施される洗浄段階を伴う別個の下位段階で添加されることがここで可能である。ここで被検体測定のための標準が添加されている材料は、例えば、使用される緩衝溶液の成分、アルブミン(とりわけウシ血清アルブミン)、免疫グロブリン若しくは希釈血清のようなサンプルマトリックスに類似の添加された化合物のみを含みうる。
して使用される化合物の濃度(その濃度は、好ましくは塗布されるべき第二の溶液中で使用されるべきである)は、測定領域で期待されるべき前記被検体の表面濃度、ならびに前記被検体とそれぞれそれらの結合および検出試薬の間の結合反応の平衡定数に依存する。結合試薬は、典型的には供給元から得られるストック溶液の100倍しないし1000倍希釈である。抗体の場合、こうしたストック溶液は、1〜10μMからの範囲の濃度に対応する典型的に0.5〜1mg/mlの含量で入手可能である。検出試薬は、結合試薬がそうであるところの匹敵する濃度範囲すなわち典型的に1〜10nMで使用する。競合実験の場合、競合体(例えばリン酸化ペプチドエピトープ)は、結合試薬の濃度の最低10倍、より良好には100倍過剰で使用する。生物学的起源かつ複雑な組成のサンプルのサンプルマトリックス中に存在する物質と類似の種類のものである、非特異的結合の競合体として使用される物質(例えばアルブミン、免疫グロブリン若しくは希釈血清)は、典型的にはこれらの(本発明の方法の段階(7b)による)第三の溶液の10μg/mlから500μg/mlまでの総タンパク質含量を伴い使用する。
被検体の(相対および/若しくは絶対)濃度または(相対および/若しくは絶対)量の好ましくは20%未満、とりわけ好ましくは10%未満の差違が測定され得るという事実を特徴とする。
しない断片化された天然および合成のDNA(とりわけポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのため)、ならびにまた例えばポリエチレングリコール若しくはデキストランのような荷電していないがしかし親水性のポリマーの群から選択しうる。
を可能にする。すなわち、例えば、例えば異なる生物体からの多様なサンプル(例えば列に対応する)を、多様な希釈(例えば行に対応する)でアレイの行および列に塗布しうる。異なるサンプル容器中の固定されたサンプルを含有する測定領域の多様なアレイをその後、多様なアレイ中の多様な固定された被検体を測定するための結合試薬および適切な場合は検出試薬を含有する、多様な第一および/または第二若しくは第三の溶液と接触させうる。事実上制限されない数の多様な実験を実施するために支持体のこうした変形を使用し得ることが明らかである。
。さらに、少なくとも入射励起光若しくは測定光の波長で本質的に光透過性という要件を満たす前記素材が好ましい。
−固体支持体が、少なくとも入射励起光の波長で本質的に光透過性でありかつ層(a)より低い屈折率を有する第二の層(b)上に、少なくとも入射励起光の波長で本質的に光透過性である第一の層(a)をもつ光薄膜導波路を含んでなり、
−光源の励起光が前記層(a)に刻印されたグレーティング構造(c)によって層(a)にカップリングされ、
−前記励起光が、前記層(a)上で直接か若しくは前記層(a)上の付着促進層を介する仲介によるかのいずれかで配置される測定領域への誘導波として誘導され、および
発光が可能でありかつ前記層(a)に誘導される光のエバネッセント場で励起されて発光を生じる化合物の発光事象が空間分解様式で測定される
ことを特徴とする。
クロアレイは、
−固体支持体、
−各場合で、希釈若しくは未希釈の形態の生物学的起源かつ複雑な組成の少量のサンプルが直接か若しくは付着促進層を介する仲介によるかのいずれかで固定されている、第一の多数の個別の測定領域
を含んでなり、
少なくとも第二の多数の測定領域が固体支持体上の前記アレイに提供され、その測定領域で、検出されるべき被検体と同一の種類の物質が、生物学的起源かつ複雑な組成の塗布されたサンプル中の第一の多数の個別の測定領域中の検出されるべきかつ存在する被検体、および前記第二の多数の個別の測定領域中に存在する検出されるべき前記被検体と同一の種類の物質の特異的結合パートナーとしての1種若しくはそれ以上の結合試薬、ならびに場合によっては、必要とされる場合は1種若しくはそれ以上の検出試薬(結合試薬および検出試薬は同時に若しくは連続して塗布されることが可能である)を含んでなる第一の溶液と、前記マイクロアレイを接触することによって適する異なる濃度で固定され、ならびに第一の溶液と接触されている1個若しくはそれ以上のアレイの個別の測定領域から発している第一の光信号のその後の空間分解測定、ならびに複雑な組成の固定されたサンプル中の定量的に検出されるべきかつ存在する前記被検体の較正曲線を生成するために前記第一の光信号を記録すること、
ことを特徴とする。
−生物学的起源かつ複雑な組成の1種若しくはそれ以上のサンプルを提供する段階、
−複雑な組成のサンプル中の検出されるべき被検体と同一の種類の多様な濃度の物質の多数の溶液を提供する段階、
−最低1個の固体支持体を提供する段階、
−希釈若しくは未希釈の形態の生物学的起源かつ複雑な組成の少量のサンプルを、固体支持体上に直接、若しくは付着促進層の前塗布後に前記固体支持体上の前記付着促進層にのいずれかで個別の部位に塗布することにより、マイクロアレイの一部として第一の多数の個別の測定領域を生成する段階、
−各場合で、複雑な組成のサンプル中の検出されるべき被検体と同一の種類の物質の多様な濃度の少量の多数の溶液を塗布することにより、前記マイクロアレイの一部として第二の多数の個別の測定領域を生成する段階、
−生物学的起源かつ複雑な組成の塗布されたサンプル中の第一の多数の個別の測定領域中の検出されるべきかつ存在する被検体の特異的結合パートナーとしての1種若しくはそれ以上の結合試薬、および検出されるべき前記被検体と同一の種類の物質(この物質は第二の多数の個別の測定領域に存在し)、ならびに場合によっては、必要とされる場合は1種若しくはそれ以上の検出試薬(結合試薬および検出試薬が同時に若しくは連続して塗布されることが可能である)を含んでなる第一の溶液と、該マイクロアレイを接触する段階、−該マイクロアレイの前記第一および第二の多数の個別の測定領域から発する第一の光信号を空間分解様式で測定する段階、前記第一の多数の個別の測定領域からの前記第一の光信号を、該第一の溶液をその接触することに特徴的なシグナルとして記録する段階、該第二の多数の個別の測定領域からの第一の光信号を、第一の溶液をその接触することに特徴的なシグナルとして、複雑な組成のサンプル中に存在する被検体と同一の種類の物質(その物質は前記測定領域中に存在する)の濃度の関数として記録する段階、
−必要とされる場合はバックグラウンドシグナルの前減算および適する照合後に、第二の多数の個別の測定領域からの記録された光信号から、複雑な組成のサンプル中の検出されるべき被検体の較正曲線を生成する段階、
第一の多数の個別の測定領域からの記録された第一の光信号を、必要とされる場合はバックグラウンドシグナルの前減算および適する照合後に、特定の被検体の較正曲線と比較することにより、複雑な組成のサンプル中の検出されるべきかつ存在する被検体を定量的に測定する段階
を含んでなる、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の1種若しくはそれ以上の被検体の定量的測定方法に関する。
の細胞発現プロファイルを生じさせることならびにそれらの比較のため、分、時間、日、週、月若しくは年の期間にわたるこうした発現プロファイルの発生を研究するため、mRNA、タンパク質、ペプチド若しくは低分子量有機(メッセンジャー)物質のような生物学的および化学的マーカー物質を測定するため、ならびにまた、製薬学的製品研究および開発、ヒトおよび家畜の診断、農薬製品研究および開発、症候性および前駆症状性植物診断、製薬学的製品開発における患者の層別において抗体、抗原、病原体若しくは細菌を検出するため、ならびに、治療的医薬品の選択のため、とりわけ食品分析および環境分析において病原体、有害物質および病原生物、とりわけサルモネラ、プリオン、ウイルスおよび細菌を検出するための定量および/若しくは定性分析のための、本発明のマイクロアレイおよび/若しくは生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の1種若しくはそれ以上の被検体の本発明の定量的測定方法の使用を含んでなる。
以下の例示的態様において、検出されるべき被検体は、細胞内Aktシグナル経路のマーカータンパク質「Akt」、およびこのタンパク質の2種の異なって活性化された(リン酸化)形態である。Aktはタンパク質キナーゼであり、そして例えばグルコース代謝、細胞の成長、細胞分化およびプログラムされた細胞死(アポトーシス)のような多数の生理学的過程で重要な役割を演じている。Aktは多様なアミノ酸側鎖、とりわけセリン473およびトレオニン308のリン酸化を介して活性化される。前記Aktシグナル経路の誤調節およびそれから生じるプログラムされた細胞死の阻害は癌の発症において決定的役割を演じており、その結果としてこのマーカータンパク質は治療上非常に興味深い。
各場合で幅14mm×長さ57mm×厚さ0.7mmの寸法を有する、本発明の方法に使用される固体支持体は、各場合で、本質的に光透過性の層(b)としてガラス支持体(AF45)および本質的に光透過性の層(a)としてそれに塗布された厚さ150nmの五酸化タンタルの高度に屈折性の層を含んでなる薄膜導波路として設計されている。前記ガラス支持体中で、その長さに平行に、9mmで間隔を空けられた2個の表面レリーフグレーティング(グレーティング周期:318nm、グレーティング深さ:(12±2)nm)を変調する。前記高度に屈折性の層の後塗布の間に、高度に屈折性の層(a)に光をカップリングするための回折格子として使用されるはずであるこれらの構造を、五酸化タンタル層の表面に移す。
被検体への非特異的結合により引き起こされるシグナル部分を測定するための競合実験(下を参照されたい)のため、被検体としての生物学的起源かつ複雑な組成の固定したサンプル中の検出されるべきかつ存在するAkt(「内因性Akt」)の溶液中の競合体として、精製Akt(Pharmacia Italia Spa、イタリア・ミラノ)を使用する。前記精製Aktは、塗布されるべき多様な組成の異なる固定溶液中の添加によって較正曲線を生成するのにもまた使用する。
る。多様な総タンパク質濃度の得られる溶液は、研究されるべき生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(他の添加された補助物質を含まない)を表す。
ることにより不動態化する。測定領域がその上に生成された支持体を水(18MΩ・cm)で洗浄し、そして最後に窒素流中で乾燥し、そして本発明の検出方法を実施するまで4℃で保存する。
本発明の方法をさらに実施するため、測定領域のアレイを提供された支持体を、各場合で、測定領域のアレイがその中に配置された6個のサンプル容器(各場合の内容量:15μl)の直線的配置を生成するために上部分と結合する。サンプル容器のこうした配置は、国際特許出願第WO 01/43875号および同第WO 02/103331号明細書(それらの内容は本発明の一部としてそっくりそのままここに組込まれる)に記述される。
第一の下位段階で、測定領域のアレイを、(リン酸化されたおよびリン酸化されない形態の間を識別することなく)全Aktを検出するための結合試薬としての一次抗体(「抗Akt」(#9272))、リン酸化P−Akt(Ser473)を検出するための「抗P−Akt(Ser473)」(#9271)、リン酸化P−Akt(Thr308)を検出するための「抗P−Akt(Thr308)」(#9275)(全部の抗体はCell Signaling Technologies、米国ビバリーから)の溶液と、各場合に、アッセイ緩衝液中ストック溶液の500倍希釈(およそ5nMに対応する)中で、サンプル容器中室温で一夜インキュベートする。
対応して、被検体検出は、同様にその上に存在する測定領域のアレイを伴う固体支持体への添加の2個の下位段階で、使用される結合試薬、および適切な場合は付加的な検出試薬への特異的結合に対する被検体と同一の種類の競合体の存在下で実施する。すなわち、第一に、結合試薬の溶液(「抗Akt」、「抗P−Akt(Ser473)」若しくは「抗P−Akt(Thr308)」、各場合でおよそ5nM)を、各場合で約20倍過剰のAkt(100nMに対応する5μg/ml)と前インキュベートする。被検体特異的抗体の全部の抗原結合部位は、ここで、対応する競合体により占有されることが期待され、その結果として、結合試薬の特異的結合部位は測定領域中の被検体分子との反応にもはや利用可能でない。こうして調製したAkt含有溶液をその後、4.1.の第一の下位段階に類似の様式で、各場合に、4.1.で使用した測定領域のアレイのような測定領域の別のしかし同一のアレイをもつ別のサンプル容器に導入し、そしてそれと一夜インキュベートし、次いで洗浄段階、検出試薬を添加することのその後の下位段階、および4.1.に記述されるところのさらなる下位段階が後に続く。本節4.2.による手順は本発明の方法の下位段階(7a)に対応する。
4.1.および4.2.に類似の様式で、被検体検出を、サンプルマトリックス中に存在する物質に同一若しくは可能な限り類似でありかつ結合試薬の非特異的結合について測定領域中に固定されたサンプルマトリックス成分の競合体として使用する、結合試薬に付加的に添加される物質の存在下で実施する。この目的上、結合試薬の溶液(「抗Akt」、「抗P−Akt(Ser473)」若しくは「抗P−Akt(Thr308)」、各場合でおよそ5nM)を、各場合で0.1mg/mlラット血清と前インキュベートする。こうして調製した血清含有溶液をその後、4.1.の第一の下位段階に類似の様式で、各場合に、4.1.で使用した測定領域のアレイのような測定領域の別のしかし同一のアレイをもつ別のサンプル容器に導入し、そしてそれと一夜インキュベートし、次いで洗浄段階、検出試薬を添加することのその後の下位段階、および4.1.に記述されるところのさらなる下位段階が後に続く。本節4.3.による手順は本発明の方法の下位段階(7b)に対応する。
測定領域の多様なアレイからの蛍光シグナルは、ZeptoREADERTM(Zeptosens AG、CH−4108 スイス・ヴィッテルスヴィル)を使用して連続してかつ自動で測定する。この光学系は、国際特許出願第PCT/EP 01/10012号明細書(本出願の一部としてそっくりそのままここに組込まれる)により詳細に記述されている。
測定領域(スポット)からの蛍光シグナルは画像解析ソフトウェア(ZeptoVIEWTM、Pro 2.0 リリース2.0、Zeptosens AG、CH−4108
ヴィッテルスヴィル)の助けを借りて測定し、これによりその隣接環境での各スポットの平均シグナル強度および平均局所バックグラウンドシグナル強度を決定する。バックグラウンド補正した平均の正味のシグナル強度を、問題のスポットの平均測定総シグナル強度から平均局所バックグラウンドシグナルを減算することにより、各スポットについて決定する。
7.1.全Akt含量の測定
7.1.1.Aktを検出するための較正曲線
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
各場合で、測定領域の2区分を、キナーゼAktの較正曲線を生成するために測定領域の同一アレイに提供する(図1を参照されたい)。すなわち、
区分1:0.1mg/ml BSAを付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号1〜9をもつアレイ行IおよびII、
区分2:0.1mg/mlラット血清を付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号13〜21をもつアレイ行IIIおよびIV。
異なるサンプルマトリックスをもつ固定溶液を使用して確立した較正曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を試験するため、結合試薬としての「抗Akt」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMの濃度に対応する5μg/ml)との混合物を、最初に研究したアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第二のサンプル容器に導入し、そして4.2.で記述されたとおり前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたAktへの抗体の特異的結合による引き起こされるシグナルの部分が完全に消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる非特異的結合の部分を確認するため、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3.の手順により、前述の第一および第二のアレイと再度同一の測定領域の配置の第三のアレイをもつ第三のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたAktへの特異的結合により生成されるシグナルの部分が保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
ラット心組織から調製した生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の全Akt含量の検出を、測定領域内容番号25ないし31により示される測定領域のセグメントで実施する。前記測定領域を生成するために生成した固定溶液は同一ストック溶液からであり、そして、希釈(節3.を参照されたい)により多様な総タンパク質濃度(0.025mg/mlと0.5mg/mlの間)に調節した。
シグナル値を比較することにより、(840±70)ng/mlに決定し得る。84%という達成される回収率若しくは8%という精度は、アッセイでの80〜120%の回収率若しくは20%以上の精度という一般に耐えられる限界の範囲内にある。本実施例は、従って、被検体の測定が良好なアッセイの正確性および精度を伴い実施し得ることを示す。高い回収値は、同様に、(タンパク質マトリックスとしての)固定溶液に添加した0.1mg/ml BSAを含む測定領域で生成される測定曲線が、ラット心組織ライセートを含有する溶液から調製したスポットのデータを較正するのに十分に適することを確認する。
サンプルマトリックスとしてのラット心組織に基づく固定溶液を使用して生成された測定領域からの測定曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を決定するため、結合試薬としての「抗Akt」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMの濃度に対応する5μg/ml)との混合物を、当初研究したアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第二のサンプル容器に導入し、そして4.2.で記述されたとおり前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたAktへの抗体の特異的結合により引き起こされるシグナルの部分は完全に消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる非特異的結合の部分を確認するために、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3の手順に従い、再度、前述の第一および第二のアレイと同一の測定領域の配置の第三のアレイをもつ第三のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたAktへの特異的結合により生成されるシグナルの部分が保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
7.2.1.P−Akt(Ser473)を検出するための較正曲線
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
リン酸化された形態P−Akt(Ser473)を測定するための較正曲線は、Aktの上述された測定の様式で同一測定領域の区分を使用することにより確立する。
区分1:0.1mg/ml BSAを付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号1〜9をもつアレイ行IおよびII、
区分2:0.1mg/mlラット血清を付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号13〜21をもつアレイ行IIIおよびIV。
異なるサンプルマトリックスをもつ固定溶液を使用して確立された較正曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を試験するために、結合試薬としての「抗P−Akt(Ser473)」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMに対応する5μg/ml)との混合物を、以前に研究されたアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第五のサンプル容器に導入し、そして4.2.に記述されたとおり、前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Ser473)への抗体の特異的結合により引き起こされるシグナルの部分は消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる非特異的結合の
部分を確認するため、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3の手順に従い、再度前述のアレイと同一の測定領域の配置の第六のアレイをもつ第六のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Ser473)への特異的結合により生成されるシグナルの部分は保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
ラット心組織から調製した生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中のP−Akt(Ser473)含量の検出を、測定領域内容番号25ないし31により示される測定領域の区分で実施する。前記測定領域を生成するために生成した固定溶液は同一ストック溶液からであり、そして多様な総タンパク質濃度(0.025mg/mlと0.5mg/mlの間)への希釈(節3.を参照されたい)により調節した。
濃度をさらに増大させることでさらなるシグナル増大は観察されない。
サンプルマトリックスとしてのラット心組織に基づく固定溶液を使用して生成された測定領域からの測定曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を決定するため、結合試薬としての「抗P−Akt(Ser473)」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMの濃度に対応する5μg/ml)との混合物を、当初研究したアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第五のサンプル容器に導入し、そして4.2.で記述されたとおり前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Ser473)への抗体の特異的結合により引き起こされるシグナルの部分は完全に消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる非特異的結合の部分を確認するために、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3の手順に従い、再度、前述の第一および第二のアレイと同一の測定領域の配置の第六のアレイをもつ第六のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Ser473)への特異的結合により生成されるシグナルの部分は保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
のいかなる有意の移動ももたらさず;ラット血清の存在および非存在下で測定される参照蛍光シグナルは、各場合に測定の正確性内で同一である。
7.3.1.P−Akt(Thr308)を検出するための較正曲線
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
リン酸化された形態P−Akt(Thr308)を測定するための較正曲線は、AktおよびP−Akt(Ser473)の上述された測定の様式で同一の測定領域の区分を使用することにより確立する。
区分1:0.1mg/ml BSAを付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号1〜9をもつアレイ行IおよびII、
区分2:0.1mg/mlラット血清を付加的に含有するスポッティング緩衝液中に、塗布される異なる濃度(0ng/mlと3000ng/mlの間)の精製Aktを含む、測定領域内容番号13〜21をもつアレイ行IIIおよびIV。精製Aktは完全にリン酸化されている、すなわちSer473およびThr308でリン酸化されていると想定する。
異なるサンプルマトリックスをもつ固定溶液を使用して確立された較正曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を試験するために、結合試薬としての「抗P−Akt(Thr308)」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMに対応する5μg/ml)との混合物を、以前に研究されたアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第八のサンプル容器に導入し、そして4.2.に記述されたとおり前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Thr308)への抗体の特異的結合により引き起こされるシグナルの部分は消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
中の白記号、固定溶液がラット血清を含有した測定領域からのシグナルは、その固定溶液が規定されるAkt濃度を別にしてBSAのみを含有した測定領域のシグナルより高い。約30ng/ml以上の濃度範囲でのみ、シグナルの低下が、結合試薬の溶液中の競合体としてのP−Akt(Thr308)の存在により、実験的に引き起こされるシグナル変動を超える。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる蛍光シグナルに対する非特異的結合の比率を確認するため、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体の溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3の手順に従い、再度前述のアレイと同一の測定領域の配置の第九のアレイをもつ第九のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Thr308)への特異的結合により生成されるシグナルの部分は保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
a)競合体の添加を伴わない結合試薬の使用
ラット心組織から調製した生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中のP−Akt(Thr308)含量の検出を、測定領域内容番号25ないし31により示される測定領域の区分で実施する。前記測定領域を生成するために生成した固定溶液は同一ストック溶液からであり、そして多様な総タンパク質濃度(0.025mg/mlと0.5mg/mlの間)への希釈(節3.を参照されたい)により調節した。
サンプルマトリックスとしてのラット心組織に基づく固定溶液を使用して生成された測定領域からの測定曲線に対する非特異的結合によるシグナルの比率を決定するため、結合試薬としての「抗P−Akt(Thr308)」抗体の溶液の、過剰のAkt(100nMの濃度に対応する5μg/ml)との混合物を、当初研究したアレイと同一の測定領域の配置をもつ別のアレイ上の第八のサンプル容器に導入し、そして4.3.で記述されたとおり前記測定領域と一夜インキュベートする。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Thr308)への抗体の特異的結合により引き起こされるシグナルの部分は完全に消失することが期待される一方、非特異的結合により引き起こされるシグナルの部分はそのままである。
ゼロである。
サンプルマトリックスの成分への結合試薬の結合により引き起こされる非特異的結合の部分を確認するために、0.1mg/mlの総タンパク質濃度をもつラット血清を抗体溶液に添加する。この溶液をその後、節4.3の手順に従い、再度、前述のアレイと同一の測定領域の配置の第九のアレイをもつ第九のサンプル容器に導入する。これらの条件下で、固定されたP−Akt(Thr308)への特異的結合により生成されるシグナルの部分は保持されることが期待される一方、サンプルマトリックスへの非特異的結合により生成されるシグナルの部分はほぼ消失することが期待される。
Claims (39)
- 以下の段階:
(1)生物学的起源かつ複雑な組成の1種若しくはそれ以上のサンプルを提供する段階、(2)最低1種の固体支持体を提供する段階、
(3)希釈若しくは未希釈の形態の、生物学的起源かつ複雑な組成の少量の前記サンプルを、前記固体支持体上に直接、若しくは付着促進層の前塗布後に該固体支持体上の前記付着促進層にのいずれかで、個別の部位に塗布して、それにより該最低1種の固体支持体上に個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイを生成する段階、
(4)個別の測定領域の最低1個のアレイを、生物学的起源かつ複雑な組成の塗布されたサンプル中の個別の測定領域中の検出されるべきかつ存在する被検体の特異的結合パートナーとしての1種若しくはそれ以上の結合試薬、および、必要とされる場合には、1種若しくはそれ以上の検出試薬を含んでなる第一の溶液と接触させる段階であって、結合試薬および検出試薬は同時に若しくは連続して塗布されることが可能である段階、
(5)段階(4)で第一の溶液と接触された1個若しくはそれ以上のアレイの個別の測定領域から発する第一の光信号を空間分解様式で測定する段階、
(6)前記第一の光信号を記録する段階
を含んでなり、
添加される結合試薬、および、場合によっては添加される検出試薬との非特異的相互作用により生成される光信号である測定される第一の光信号の部分が、以下のさらなる段階:(7a)1種若しくはそれ以上の結合試薬および場合によっては段階(4)で添加される第一の溶液の1種若しくはそれ以上の検出試薬に加えて、前記結合試薬および場合によっては付加的に添加される検出試薬の特異的結合についての、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプルであって個別の測定領域に塗布されているサンプル中の検出されるべきかつ存在する前記被検体に対する競合体としての、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプルであってこのサンプルは個別の測定領域に塗布されているサンプル中の検出されるべきかつ存在する被検体と同一の種類のものである既知の高濃度の化合物を含んでなる第二の溶液を、段階(3)で生成される個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイに塗布する段階、ならびに/または
(7b)前記1種若しくはそれ以上の結合試薬および場合によっては段階(4)で添加される第一の溶液の1種若しくはそれ以上の検出試薬に加えて、前記結合試薬および場合によっては付加的に添加される検出試薬の非特異的結合について、個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中に存在するサンプルマトリックスの物質と競合することの目的上、段階(3)で塗布されたサンプルのサンプルマトリックス中に存在する物質と類似の種類のものである既知の高濃度の物質を含んでなる第三の溶液を、段階(3)で生成される個別の測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイに塗布する段階、(8)段階(7a)の第二の溶液および/若しくは段階(7b)の第三の溶液と接触された1個若しくはそれ以上のアレイの個別の測定領域から発する第二および/若しくは第三の光信号を空間分解様式で測定する段階、
(9)前記第二および/若しくは第三の光信号を記録する段階、ならびに
(10)前記第一ならびに第二および/若しくは第三の光信号を比較する段階
を実施することにより測定されることを特徴とする、
生物学的起源かつ複雑な組成の1種若しくはそれ以上のサンプル中の1種若しくはそれ以上の被検体の検出方法。 - 生物学的起源かつ複雑な組成の前記サンプルが、細胞集団のライセート、細胞抽出液、体液および体液の成分により形成されるサンプルの群から選択され、
(1)前記サンプルが分画若しくは非分画サンプルであり、
(2)生物学的起源かつ複雑な組成の前記サンプルが、ヒト、動物、細菌および植物細胞を含んでなる群からの健全および/または罹病のおよび/または刺激されたおよび/また
は未処理の細胞から得られ、
(3)生物学的起源かつ複雑な組成の前記サンプルが、例えば器官、皮膚、毛髪、筋、脂肪若しくは骨組織のような動物若しくはヒト組織から得られた
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 単一の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成の分析されるべきサンプルの物質が、100細胞未満の物質に対応し、および/または100nl未満の容量を構成することを特徴とする、請求項1および2のいずれかに記載の方法。
- 個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の検出されるべきである被検体が、タンパク質およびそれらの翻訳後修飾されたタンパク質の形態、ならびにまた人工的に修飾若しくは発現されたタンパク質、モノ若しくはポリクローナル抗体および抗体フラグメント、ペプチド、無傷のタンパク質から生成されたペプチドフラグメント、糖ペプチド、レクチン、蛍光タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ビオチニル化タンパク質、ならびに/または多様に複合されたタンパク質、オリゴ糖ならびに核酸であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の被検体として検出されるべきであるタンパク質が、特異的結合パートナーとしてそれと接触される結合試薬、および場合によっては付加的な検出試薬の結合後に、請求項1に記載の段階(4)の経過において、生物学的起源かつ複雑な組成の前記塗布されたサンプル中のリン酸化および/若しくはグリコシル化、ならびに/またはメチル化および/若しくはアセチル化された形態でのそれらの存在により識別され、そして請求項1に記載の検出段階(5)で別個に検出されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の被検体として検出されるべきであるタンパク質が、特異的結合パートナーとしてそれと接触される結合試薬、および場合によっては付加的な検出試薬の結合後に、請求項1に記載の段階(4)の経過において、生物学的起源かつ複雑な組成の前記塗布されたサンプル中のリン酸化および/若しくはグリコシル化、ならびに/またはメチル化および/若しくはアセチル化された形態でのそれらの存在により識別されず、そして請求項1に記載の検出段階(5)で別個に検出されないことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 生物学的起源かつ複雑な組成の塗布されたサンプル中の個別の測定領域中の検出されるべきかつ存在する被検体の特異的結合パートナーとしての前記結合試薬が、タンパク質、ペプチド、酵素、酵素阻害剤、キナーゼ基質、アプタマー、合成ペプチド構造、糖ペプチド、ホルモン、補助因子、オリゴ糖、レクチン、抗体若しくはT細胞受容体に対する抗原、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、付加的な結合部位で官能性化されたタンパク質および/若しくはそれらの複合体形成パートナー、ならびに核酸アナログおよび人工的塩基を有するそれらの誘導体を含んでなる化合物の群から選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記検出試薬が:
(1)ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体および抗体フラグメント、核酸および核酸誘導体、ならびに人工的塩基、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンを有するそれらの誘導体を含んでなる第一群、または
(2)質量標識および/若しくは発光標識を含んでなる第二群であって、前記質量若しくは発光標識は、結合試薬に結合されているかまたはそれに付加若しくは結合しているか、あるいは、(1)による検出試薬の第一群の検出試薬に結合されているか、または(1)による検出試薬の第一群の前記検出試薬に特異的方法で結合若しくは付加しているか、あるいは、個別の測定領域に塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中に存在する検出されるべき被検体と、特異的結合パートナーとしてそれに結合された結合試薬の間の複合体上で形成されるか、それに結合若しくは付加している、
から選択されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 第一の溶液の特異的結合パートナーとしての前記結合試薬および任意の検出試薬、ならびに/若しくは
第二の溶液の、特異的結合パートナーとしての結合試薬、生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(このサンプルは個別の測定領域に塗布されている)中の検出されるべきかつ存在する被検体と同一の種類の化合物、および任意の検出試薬、ならびに/若しくは
第三の溶液の、特異的結合パートナーとしての結合試薬、請求項1に記載の段階(3)で塗布されたサンプルのサンプルマトリックス中に存在する物質と類似の種類のものである物質、および任意の検出試薬が、各場合に相互と前インキュベートされ、ならびに、前記第一、第二若しくは第三の溶液がその後、単一添加段階にて測定領域の前記アレイと接触される
ことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 多様な被検体が、識別可能な検出試薬を測定領域の共有されるアレイに添加することにより前記アレイ中で検出されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 検出されるべき多様な被検体の数が識別可能な検出試薬の数に等しいことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 識別可能な検出試薬が、発光の励起波長および/若しくは放出波長が異なることを特徴とする、請求項10〜11のいずれかに記載の方法。
- 個別の測定領域の多数のアレイ中の多数の異なる被検体が、個別の測定領域の多様なアレイ上の多様な被検体を測定するために特異的結合パートナーとして多様な結合試薬を添加すること、および/または測定領域の前記アレイに識別可能な検出試薬を添加することにより検出されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 多様な結合試薬が、多様な被検体に対する特異的結合パートナーとして、検出されるべき各異なる被検体の多様なアレイに塗布されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- それに塗布される生物学的起源かつ複雑な組成のサンプルを含有する測定領域のアレイが、検出されるべき被検体と同一の種類のものである既知濃度の化合物が、塗布される物質に標準として添加されている、測定領域を含んでなることを特徴とする、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 測定領域のアレイが、検出されるべき被検体と同一の種類のものである多様な既知濃度の化合物が、塗布される物質に標準として添加されている、多数の測定領域を含んでなり、こうした測定領域の数および前記多様な既知濃度のレベルが、請求項1に記載の段階(4)による特異的結合パートナーとしての結合試薬および場合によっては同様に検出試薬を含有する第一の溶液を添加することの単一段階、ならびに請求項1に記載のその後の段階(5)および(6)によって、アレイ中の検出されるべき未知濃度の前記被検体を測定するための較正曲線を生成するために十分であることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 測定領域の複数の同一種類のアレイが固体支持体上に配置され、行および列の配置に関しての多様なアレイの測定領域の同一の位置が、同一種類のサンプルがそこに塗布されていることを意味することを特徴とする、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 段階(4)による第一の溶液が添加され、かつ、このアレイの測定領域からの第一の光信号が請求項1に記載の段階(5)および(6)により測定かつ記録され、ならびに、段階(7a)および(7b)による第二および/若しくは第三の溶液が添加され、かつ、問題のアレイの測定領域から発せられるシグナルが、該同一種類の多様な測定領域アレイ上で請求項1に記載の段階(8)および(9)によりその後測定かつ記録され、行および列の配置に関して多様なアレイの測定領域の同一の位置が、同一種類のサンプルがそこに塗布されていることを意味することを特徴とする、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 添加される結合試薬および場合によっては添加される検出試薬との非特異的相互作用により生成される光信号である請求項1に記載の測定された第一の光信号の部分が、段階(7a)による第二の溶液の添加後に段階(8)により測定される光信号および段階(4)による第一の溶液の添加後に段階(5)により測定される光信号の差違から決定されることを特徴とする、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 添加される結合試薬および場合によっては添加される検出試薬との非特異的相互作用により生成される光信号である請求項1に記載の測定された第一の光信号の部分が、段階(7b)による第三の溶液の添加後に段階(8)により測定される光信号および段階(4)による第一の溶液の添加後に段階(5)により測定される光信号の差違から決定されることを特徴とする、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル(そのサンプルは測定領域に塗布されている)中の被検体の濃度若しくは量が、前記測定領域について測定された光信号と、添加される結合試薬および場合によっては添加される検出試薬との非特異的相互作用により生成される光信号の部分の間の差違から、ならびに問題の被検体の較正曲線と前記差違を比較することにより決定されることを特徴とする、請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- 測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイに請求項1に記載の段階(7b)により塗布される第三の領域が、アルブミン、免疫グロブリンおよび希釈血清を含んでなる群からの物質を含んでなることを特徴とする、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体に塗布される付着促進層が、シラン、官能性化シラン、エポキシド、官能性化、荷電若しくは極性ポリマー、ならびに「自己組織化不動態若しくは官能性化単および多層」、チオール、アルキルホスフェートおよびアルキルホスホネート、ならびに多官能性ブロックコポリマーを含んでなる群の化合物を含んでなることを特徴とする、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- 個別の測定領域間の領域が、結合若しくは検出試薬の非特異的結合を最小限にするために「不動態化される」、すなわち、前記結合試薬および/若しくは検出試薬に対し「化学的に中性」であるすなわちそれらを結合しない成分が、空間的に分離された測定領域の間に塗布されることを特徴とする、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、本質的に平面および/または非多孔質かつ/または少なくとも入射励起光若しくは測定光の波長で本質的に光透過性であることを特徴とする、請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、異なる光学特性をもつ複数の層を含んでなることを特徴とする、請求項1〜25のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が金属層を含んでなることを特徴とする、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも、直接若しくは付着促進層を介して測定領域と接触している固体支持体の層が、少なくとも入射励起光若しくは測定光の波長で本質的に光透過性であることを特徴とする、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、顕微鏡スライドガラス、マイクロタイタープレート、ナノタイタープレート、フィルター、メンブレンおよび微小構造化支持体を含んでなる群からの構成部品を含んでなることを特徴とする、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、連続的であるか若しくは個別の導波路領域に分割されるかのいずれかでありかつ1個若しくはそれ以上の層を含んでなる光導波路を含んでなることを特徴とする、請求項1〜29のいずれかに記載の方法。
- 励起光若しくは測定光が、1個若しくはそれ以上の多色若しくは単色光源から測定領域の1個若しくはそれ以上のアレイの1個若しくはそれ以上の測定領域に誘導され、かつ、前記測定領域からの光信号、および/または前記測定領域から発する光信号の変化若しくは差違が、空間分解様式で測定かつ記録されることを特徴とする、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 空間分解様式で測定されるべき光信号の変化若しくは差違が、測定領域に面する固体支持体の表面での若しくは前記固体支持体の前記表面から1μm未満の距離以内の有効屈折率の局所的差違に基づき、その局所的差違は、それに塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の個別の測定領域に存在する被検体への結合試薬および/若しくは検出試薬の結合により引き起こされることを特徴とする、請求項31に記載の方法。
- 空間分解様式で測定されるべき光信号の変化若しくは差違が、前記固体支持体の一部としての薄い金属層の表面プラズモンを生成するための共鳴状態の局所的差違に基づくことを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 固体支持体が、第二の本質的に光透過性の層(b)上に第一の本質的に光透過性の層(a)を有する光薄膜導波路を含んでなり、層(a)が層(b)より高い屈折率を有しかつ直接か若しくは付着促進層を介する仲介によるかのいずれかで測定領域と接触することを特徴とする、請求項30〜33のいずれかに記載の方法。
- 1個若しくはそれ以上の光源からの励起光若しくは測定光が、プリズムカプラ、相互と接触にもたらされた光導波路をもちかつ重なるエバネッセント場を有するエバネッセントカプラ、導波層の一端側の前に配置された集束レンズ、好ましくは筒状レンズを伴う端面カプラ、およびグレーティングカプラの群から選択される1個若しくはそれ以上の光カップリング要素により固体支持体の導波層にカップリングされ、前記励起光若しくは測定光が、好ましくは、あるグレーティング周期およびグレーティング深さを有する表面レリーフグレーティングとして前記導波層中に刻印される1個若しくはそれ以上のグレーティング構造(c)の助けを借りて該固体支持体の導波層にカップリングされることを特徴とする、請求項30〜33のいずれかに記載の方法。
- 空間分解様式で測定されるべき光信号の変化若しくは差違が、固体支持体の導波層中に刻印されたグレーティング構造によって前記導波層に1個若しくはそれ以上の光源の励起光若しくは測定光をカップリングするための共鳴状態の局所的差違に基づくことを特徴とする、請求項33〜35のいずれかに記載の方法。
- 空間分解様式で測定されるべき光信号の変化若しくは差違が、そこに塗布された生物学的起源かつ複雑な組成のサンプル中の個別の測定領域に存在する被検体への結合試薬および/若しくは検出試薬の結合により引き起こされる1個若しくはそれ以上の発光事象の局所的差違若しくは変化に基づくことを特徴とする、請求項1〜36のいずれかに記載の方法。
- −固体支持体が、少なくとも入射励起光の波長で本質的に光透過性でありかつ層(a)より低い屈折率を有する第二の層(b)上に、少なくとも入射励起光の波長で本質的に光透過性である第一の層(a)をもつ光薄膜導波路を含んでなり、
−光源の励起光が前記層(a)に刻印されたグレーティング構造(c)によって層(a)にカップリングされ、
−前記励起光が、前記層(a)上で直接か若しくは前記層(a)上の付着促進層を介する仲介によるかのいずれかで配置される測定領域へ誘導波として誘導され、および
発光が可能でありかつ前記層(a)に誘導される光のエバネッセント場で励起されて発光を生じる化合物の発光事象が空間分解様式で測定される
ことを特徴とする、請求項31〜37のいずれかに記載の方法。 - 製薬学的研究、コンビナトリアル化学、臨床および前臨床開発における有効性決定のための薬物ライブラリーのスクリーニングの過程で化学的、生化学的若しくは生物学的被検体を測定するため、生物学的若しくは化学的マーカー物質(「バイオマーカー」)を同定、検証およびモニターするため、プロテオミクス研究およびシステム生物学においてシグナル伝達経路を同定かつ検証するため、アフィニティースクリーニングおよびとりわけ抗体スクリーニングのため、リアルタイム結合研究、ならびにアフィニティースクリーニングおよび研究における反応速度論パラメータを決定するため、定性的および定量的被検体測定のため、とりわけDNAおよびRNA分析ならびに例えば一塩基多形のようなゲノム若しくはプロテオーム中のゲノム若しくはプロテオームの差違の決定のため、タンパク質−DNAの相互作用を測定するため、mRNA発現およびタンパク質(生)合成の制御機構を決定するため、毒性研究を産み出すため、および発現プロファイルを決定するため、とりわけ外的刺激を伴うおよび伴わない罹病のおよび健全な細胞集団の細胞発現プロファイルを生じさせることならびにそれらの比較のため、分、時間、日、週、月若しくは年の期間にわたるこうした発現プロファイルの発生を研究するため、mRNA、タンパク質、ペプチド若しくは低分子量有機(メッセンジャー)物質のような生物学的および化学的マーカー物質を測定するため、ならびにまた、製薬学的製品研究および開発、ヒトおよび家畜の診断、農薬製品研究および開発、症候性および前駆症状性植物診断、製薬学的製品開発における患者の層別において抗体、抗原、病原体若しくは細菌を検出するため、ならびに、治療的医薬品の選択のため、とりわけ食品分析および環境分析において病原体、有害物質および病原生物、とりわけサルモネラ、プリオン、ウイルスおよび細菌を検出するための定量および/若しくは定性分析のための、請求項1〜38のいずれかに記載の方法。
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