JP2003004740A - 抗原抗体反応の判定方法 - Google Patents
抗原抗体反応の判定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 非特異的凝集反応が起こったか否かにかかわ
らず、正確な測定結果を得ることができる免疫学的測定
方法を確立することができる判定方法を提供する。 【解決手段】 抗原又は抗体を、前記抗原又は抗体に対
応する抗体又は抗原を用いて測定する抗原抗体反応の判
定方法であって、前記測定は２度行うものであり、予め
抗原又は抗体を前記抗原又は抗体に対する抗体又は抗原
と反応させる中和反応を行った場合と、予め中和反応を
行わなかった場合との、抗原抗体反応の度合を比較する
ことにより、特異的反応であるか非特異的反応であるか
を判定することを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
らず、正確な測定結果を得ることができる免疫学的測定
方法を確立することができる判定方法を提供する。 【解決手段】 抗原又は抗体を、前記抗原又は抗体に対
応する抗体又は抗原を用いて測定する抗原抗体反応の判
定方法であって、前記測定は２度行うものであり、予め
抗原又は抗体を前記抗原又は抗体に対する抗体又は抗原
と反応させる中和反応を行った場合と、予め中和反応を
行わなかった場合との、抗原抗体反応の度合を比較する
ことにより、特異的反応であるか非特異的反応であるか
を判定することを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定の分
野に属する。更に詳しくは、本発明は、抗原抗体反応を
利用した測定を行うに際して、その測定結果の簡便かつ
精度の高い判定方法を提供しようとするものである。 【０００２】 【従来の技術】抗原抗体反応は、微量成分の検出のため
に、日常的に利用されている。免疫学的測定方法におい
ては、測定された結果が抗原抗体反応によるかどうかを
判定することが重要な意味を有する。例えば、特開平０
２−８０９５６号公報には、免疫凝集反応の確認方法が
記載され、スライド上等の基体表面上にて、凝集反応試
薬と混合し、抗原−抗体反応の結果生じる凝集像を観察
し、判定して、その後、ｐＨを３．０以下、若しくは
９．０以上に変化させ、またイオン濃度を０．５Ｍ以上
とし、高濃度のカオトオロピックイオンを含む化学物質
を添加する。凝集が乖離するかどうかで、非特異凝集か
どうかを確認する方法が開示されている。 【０００３】また、特表平１１−５１１２５５号公報に
は、ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固定材
料を含む試薬を形成し、固相材料に結合してＩｇＭ抗体
からＩｇＧ抗体から乖離を起こすのに充分低いｐＨとす
る方法が開示されている。 【０００４】抗原抗体反応を利用する免疫学的方法は、
特異的な抗原−抗体反応を利用するため、測定特異性の
高い方法であるが、検体の状態等により、非特異的凝集
反応を起こす場合があり、この場合には、測定結果に誤
差が生じる場合がある。 【０００５】このような問題を解決するため、抗原抗体
反応か非特異的凝集反応かを確認する手段として、上記
の例では、起こった反応が抗原抗体反応であった場合の
抗原抗体反応の乖離条件（ｐＨの変化、イオン強度、カ
オトロピックイオンの変化等）により、判定している
が、このような方法においては、抗原抗体反応以外の非
特異的な反応の場合も乖離が起こる場合があり、抗原抗
体反応かどうかを判定できないことがある。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記に鑑み、本発明
は、非特異的凝集反応等が起こったか否かにかかわら
ず、正確な測定結果を得ることができる免疫学的測定方
法を確立することができる判定方法を提供することを目
的とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、抗原又は抗体
を、前記抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を用いて
測定する抗原抗体反応の判定方法であって、前記測定は
２度行うものであり、予め抗原又は抗体を前記抗原又は
抗体に対する抗体又は抗原と反応させる中和反応を行っ
た場合と、予め中和反応を行わなかった場合との、抗原
抗体反応の度合を比較することにより、特異的反応であ
るか非特異的反応であるかを判定することを特徴とする
抗原抗体反応の判定方法である。以下に本発明を詳述す
る。 【０００８】本発明において、測定用の、また、中和反
応用の抗原としては特に限定されず、例えば、蛋白質抗
原、脂質抗原、ハプテン、ハプテンをキャリア（たとえ
ばＢＳＡのような蛋白質）に結合させたもの等、免疫測
定法に用いることが可能であれば、その性状は問わな
い。 【０００９】測定用の、また、中和反応用の抗体として
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれ
もが用いることが可能であり、また、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ’等のその酵素消化断片を使用するこ
ともできる。測定用の抗原又は抗体は、不溶性担体に担
持されていてもいなくてもよいが、測定の簡便さより不
溶性担体に担持されていることが好ましい。上記不溶性
担体としては特に限定されないが、着色ラテックス等が
好適に用いられる。 【００１０】本発明の測定系は、ラテックス懸濁液、緩
衝液等の構成を問わない。すなわち、緩衝液、ラテック
ス懸濁液等２種類以上になっている場合でも、またラテ
ックス懸濁液１種類の場合でも本発明を妨げるものでは
ない。 【００１１】本発明においては、中和率も数値に限定は
ない。判定を容易にするためには，判定基準として中和
率を５０％以上の高値とできるほうが好ましいが、力価
の高い抗体、精製度の高い抗原等が手に入りにくい場合
においても、中和の有無が判別できれば本発明を妨げる
ものではない。 【００１２】本発明においては、予め検体を別の容器に
添加された、測定用の抗体又は抗原と同様の特異性をも
つ抗体又は抗原と接触させることにより、検体中の抗原
又は抗体を事前に消費させ、その後再び測定する。この
ような手段を取ることにより、確実に抗原・抗体が消費
されたかどうかを調べることができるため、特異性高く
また簡便に測定を行うことができる。 【００１３】 【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定さ
れるものではない。 （ＨＢｓ抗原測定時の判定） 【００１４】１ ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製 ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍＬに、
平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形
分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍＬとリン
酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ
６．６）、０．１Ｍ ＮａＣｌ 以下、緩衝液ともい
う）とを添加し、３７℃にて６０分攪拌した。次いで、
この液にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）
を１重量％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、以
下、０．０５ＭＰＢＳともいう）を添加し、３７℃にて
６０分間攪拌した後、４℃にて２０分間、１８０００ｒ
ｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３
回行った。得られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有する
０．０５ＭＰＢＳ１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁
した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．
１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ抗原感作ラテックス液（以下、
ラテックス懸濁液ともいう）を調製した。 【００１５】２ 測定 試薬として上記にて調製されたラテックス懸濁液を用
い、標準品としてＨＢｓ抗体標準血清（積水化学工業社
製）を用いた。ヒト血清としてＢ型肝炎ワクチン接種を
行ったヒトより得たヒト陽性血清（Ａ〜Ｃ）及びヒト陰
性血清（Ｄ〜Ｆ）を用いた。 【００１６】２．１ ＨＢｓ抗原液の調製 （１）精製ＨＢｓ抗原の希釈 精製ＨＢｓ抗原を、緩衝液を用いて中和率８０％程度と
なるように希釈して、１０μｇ／ｍＬの濃度の溶液（以
下、ＨＢｓ抗原希釈液ともいう）を調製した。 （２）中和の確認 上記試薬及び上記標準品を用いて、検体（標準品）、緩
衝液及びラテックス懸濁液を混合した後、３０秒から４
分３０秒後の波長７５０ｎｍでの吸光度の変化を測定
し、検量線とした。測定には日立７１５０形自動分析装
置を用いた。測定条件は、検体を２０μＬ、緩衝液を１
２０μＬ、ラテックス懸濁液を１２０μＬとした。標準
品：０、１５０、３００、６００、１２００ｍＩＵ／ｍ
Ｌの５点検量として測定した。結果を表１に示した。以
下の測定においては、これを検量線として用いた。 【００１７】 【表１】 【００１８】次に、標準品（１２００ＩＵ／ｍＬ）及び
標準品２００μＬにＨＢｓ抗原希釈液１０μＬを加えて
室温で３０分放置したものを検体として測定し、下記式
（１）に従って、中和率を求めた。結果を表２に示し
た。 【００１９】 【数１】 【００２０】 【表２】 【００２１】２．２ 検体の測定 （１）まず、ヒト血清（Ａ〜Ｆ）を検体として測定を行
った。 （２）次に、各ヒト血清（Ａ〜Ｆ）２００μＬにＨＢｓ
抗原希釈液１０μＬを添加し、タッチミキサーで良く攪
拌し、室温で３０分放置したものを検体として測定を行
った。 （３）（１）及び（２）の測定値より、上記式（１）に
従って、中和率を求めた。 結果を表３に示した。 【００２２】 【表３】 【００２３】通常判定では、３０ｍＩＵ／ｍＬ以上を陽
性（＋）と判定した。また、中和試験後は、１２００ｍ
ＩＵ／ｍＬでの中和率より、９０％以上の中和率の場合
を中和状態と判定した。 【００２４】表３に示したように、通常判定では陽性血
清Ａ〜Ｃ並びに陰性血清Ｄ及びＦについては誤りなく判
定したものの、陰性血清Ｅについて誤って陽性と判定し
た。しかし、中和後に判定を行うことにより６種類の血
清すべてにおいて正確に判定することができた。 【００２５】 【発明の効果】検体によっては非特異的凝集反応を起こ
すものもあってそのままでは陰性検体を陽性と誤判定す
る場合があるが、本発明による中和試験を行うことによ
って、より正確に測定を行うことができる。
野に属する。更に詳しくは、本発明は、抗原抗体反応を
利用した測定を行うに際して、その測定結果の簡便かつ
精度の高い判定方法を提供しようとするものである。 【０００２】 【従来の技術】抗原抗体反応は、微量成分の検出のため
に、日常的に利用されている。免疫学的測定方法におい
ては、測定された結果が抗原抗体反応によるかどうかを
判定することが重要な意味を有する。例えば、特開平０
２−８０９５６号公報には、免疫凝集反応の確認方法が
記載され、スライド上等の基体表面上にて、凝集反応試
薬と混合し、抗原−抗体反応の結果生じる凝集像を観察
し、判定して、その後、ｐＨを３．０以下、若しくは
９．０以上に変化させ、またイオン濃度を０．５Ｍ以上
とし、高濃度のカオトオロピックイオンを含む化学物質
を添加する。凝集が乖離するかどうかで、非特異凝集か
どうかを確認する方法が開示されている。 【０００３】また、特表平１１−５１１２５５号公報に
は、ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固定材
料を含む試薬を形成し、固相材料に結合してＩｇＭ抗体
からＩｇＧ抗体から乖離を起こすのに充分低いｐＨとす
る方法が開示されている。 【０００４】抗原抗体反応を利用する免疫学的方法は、
特異的な抗原−抗体反応を利用するため、測定特異性の
高い方法であるが、検体の状態等により、非特異的凝集
反応を起こす場合があり、この場合には、測定結果に誤
差が生じる場合がある。 【０００５】このような問題を解決するため、抗原抗体
反応か非特異的凝集反応かを確認する手段として、上記
の例では、起こった反応が抗原抗体反応であった場合の
抗原抗体反応の乖離条件（ｐＨの変化、イオン強度、カ
オトロピックイオンの変化等）により、判定している
が、このような方法においては、抗原抗体反応以外の非
特異的な反応の場合も乖離が起こる場合があり、抗原抗
体反応かどうかを判定できないことがある。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記に鑑み、本発明
は、非特異的凝集反応等が起こったか否かにかかわら
ず、正確な測定結果を得ることができる免疫学的測定方
法を確立することができる判定方法を提供することを目
的とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、抗原又は抗体
を、前記抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を用いて
測定する抗原抗体反応の判定方法であって、前記測定は
２度行うものであり、予め抗原又は抗体を前記抗原又は
抗体に対する抗体又は抗原と反応させる中和反応を行っ
た場合と、予め中和反応を行わなかった場合との、抗原
抗体反応の度合を比較することにより、特異的反応であ
るか非特異的反応であるかを判定することを特徴とする
抗原抗体反応の判定方法である。以下に本発明を詳述す
る。 【０００８】本発明において、測定用の、また、中和反
応用の抗原としては特に限定されず、例えば、蛋白質抗
原、脂質抗原、ハプテン、ハプテンをキャリア（たとえ
ばＢＳＡのような蛋白質）に結合させたもの等、免疫測
定法に用いることが可能であれば、その性状は問わな
い。 【０００９】測定用の、また、中和反応用の抗体として
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれ
もが用いることが可能であり、また、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ’等のその酵素消化断片を使用するこ
ともできる。測定用の抗原又は抗体は、不溶性担体に担
持されていてもいなくてもよいが、測定の簡便さより不
溶性担体に担持されていることが好ましい。上記不溶性
担体としては特に限定されないが、着色ラテックス等が
好適に用いられる。 【００１０】本発明の測定系は、ラテックス懸濁液、緩
衝液等の構成を問わない。すなわち、緩衝液、ラテック
ス懸濁液等２種類以上になっている場合でも、またラテ
ックス懸濁液１種類の場合でも本発明を妨げるものでは
ない。 【００１１】本発明においては、中和率も数値に限定は
ない。判定を容易にするためには，判定基準として中和
率を５０％以上の高値とできるほうが好ましいが、力価
の高い抗体、精製度の高い抗原等が手に入りにくい場合
においても、中和の有無が判別できれば本発明を妨げる
ものではない。 【００１２】本発明においては、予め検体を別の容器に
添加された、測定用の抗体又は抗原と同様の特異性をも
つ抗体又は抗原と接触させることにより、検体中の抗原
又は抗体を事前に消費させ、その後再び測定する。この
ような手段を取ることにより、確実に抗原・抗体が消費
されたかどうかを調べることができるため、特異性高く
また簡便に測定を行うことができる。 【００１３】 【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定さ
れるものではない。 （ＨＢｓ抗原測定時の判定） 【００１４】１ ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製 ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍＬに、
平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形
分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍＬとリン
酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ
６．６）、０．１Ｍ ＮａＣｌ 以下、緩衝液ともい
う）とを添加し、３７℃にて６０分攪拌した。次いで、
この液にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）
を１重量％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、以
下、０．０５ＭＰＢＳともいう）を添加し、３７℃にて
６０分間攪拌した後、４℃にて２０分間、１８０００ｒ
ｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３
回行った。得られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有する
０．０５ＭＰＢＳ１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁
した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．
１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ抗原感作ラテックス液（以下、
ラテックス懸濁液ともいう）を調製した。 【００１５】２ 測定 試薬として上記にて調製されたラテックス懸濁液を用
い、標準品としてＨＢｓ抗体標準血清（積水化学工業社
製）を用いた。ヒト血清としてＢ型肝炎ワクチン接種を
行ったヒトより得たヒト陽性血清（Ａ〜Ｃ）及びヒト陰
性血清（Ｄ〜Ｆ）を用いた。 【００１６】２．１ ＨＢｓ抗原液の調製 （１）精製ＨＢｓ抗原の希釈 精製ＨＢｓ抗原を、緩衝液を用いて中和率８０％程度と
なるように希釈して、１０μｇ／ｍＬの濃度の溶液（以
下、ＨＢｓ抗原希釈液ともいう）を調製した。 （２）中和の確認 上記試薬及び上記標準品を用いて、検体（標準品）、緩
衝液及びラテックス懸濁液を混合した後、３０秒から４
分３０秒後の波長７５０ｎｍでの吸光度の変化を測定
し、検量線とした。測定には日立７１５０形自動分析装
置を用いた。測定条件は、検体を２０μＬ、緩衝液を１
２０μＬ、ラテックス懸濁液を１２０μＬとした。標準
品：０、１５０、３００、６００、１２００ｍＩＵ／ｍ
Ｌの５点検量として測定した。結果を表１に示した。以
下の測定においては、これを検量線として用いた。 【００１７】 【表１】 【００１８】次に、標準品（１２００ＩＵ／ｍＬ）及び
標準品２００μＬにＨＢｓ抗原希釈液１０μＬを加えて
室温で３０分放置したものを検体として測定し、下記式
（１）に従って、中和率を求めた。結果を表２に示し
た。 【００１９】 【数１】 【００２０】 【表２】 【００２１】２．２ 検体の測定 （１）まず、ヒト血清（Ａ〜Ｆ）を検体として測定を行
った。 （２）次に、各ヒト血清（Ａ〜Ｆ）２００μＬにＨＢｓ
抗原希釈液１０μＬを添加し、タッチミキサーで良く攪
拌し、室温で３０分放置したものを検体として測定を行
った。 （３）（１）及び（２）の測定値より、上記式（１）に
従って、中和率を求めた。 結果を表３に示した。 【００２２】 【表３】 【００２３】通常判定では、３０ｍＩＵ／ｍＬ以上を陽
性（＋）と判定した。また、中和試験後は、１２００ｍ
ＩＵ／ｍＬでの中和率より、９０％以上の中和率の場合
を中和状態と判定した。 【００２４】表３に示したように、通常判定では陽性血
清Ａ〜Ｃ並びに陰性血清Ｄ及びＦについては誤りなく判
定したものの、陰性血清Ｅについて誤って陽性と判定し
た。しかし、中和後に判定を行うことにより６種類の血
清すべてにおいて正確に判定することができた。 【００２５】 【発明の効果】検体によっては非特異的凝集反応を起こ
すものもあってそのままでは陰性検体を陽性と誤判定す
る場合があるが、本発明による中和試験を行うことによ
って、より正確に測定を行うことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 抗原又は抗体を、前記抗原又は抗体に対
応する抗体又は抗原を用いて測定する抗原抗体反応の判
定方法であって、前記測定は２度行うものであり、予め
抗原又は抗体を前記抗原又は抗体に対する抗体又は抗原
と反応させる中和反応を行った場合と、予め中和反応を
行わなかった場合との、抗原抗体反応の度合を比較する
ことにより、特異的反応であるか非特異的反応であるか
を判定することを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001181923A JP2003004740A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 抗原抗体反応の判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001181923A JP2003004740A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 抗原抗体反応の判定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003004740A true JP2003004740A (ja) | 2003-01-08 |
Family
ID=19022117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001181923A Withdrawn JP2003004740A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 抗原抗体反応の判定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003004740A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009513958A (ja) * | 2005-10-29 | 2009-04-02 | バイエル・テクノロジー・サービシズ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 複雑な組成を有する生物学的起源のサンプル中の１種若しくはそれ以上の被検体の測定方法およびその使用 |
-
2001
- 2001-06-15 JP JP2001181923A patent/JP2003004740A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009513958A (ja) * | 2005-10-29 | 2009-04-02 | バイエル・テクノロジー・サービシズ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 複雑な組成を有する生物学的起源のサンプル中の１種若しくはそれ以上の被検体の測定方法およびその使用 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050518 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050722 |