KR100959831B1 - 패턴인식형 다중생물분자 검출판 - Google Patents

패턴인식형 다중생물분자 검출판 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물분자, 특히 병원성 미생물을 검출하는 검출판에 관한 것으로, 그 중에서도 다양한 표적을 하나의 검출판으로 검출할 수 있고, 시료와의 반응 후 상기 검출판에 나타나는 신호의 패턴(pattern)을 인식하여 병원성 미생물을 판별하는 것을 특징으로 하는 검출판 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 본 발명은 동일한 조건 하에서 다양한 특이적 생물분자프로브와 반응함으로써, 검출판 별로 반응조건이 다름에 따라 발생할 수 있는 분석 상의 오류를 근원적으로 예방할 수 있다. 그리고, 아종의 분류나 그 밖에 유전학적 염기 서열 또는 아미노산 서열이 거의 유사한 경우라도, 특이적 생물분자프로브를 적절히 선택하고 각 표적 생물분자에 대해 고유한 패턴을 분석 비교함으로써, 판별의 정확성이나 재현성을 현저히 제고하는 장점이 있다. 나아가 검출판 제조과정에서의 교란이나, 시료와의 반응시 일어날 수 있는 불균일성 등으로 인한 분석결과 상의 오류 가능성을, 상기 표준 생물분자프로브와의 상대값을 취함으로써 획기적으로 낮출 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 패턴인식형 다중생물분자 검출판에서 발생하는 신호를 수치화하고 이를 색으로 표현함으로써 분석 경험이 적은 초보자도 쉽게 검출이 가능하고, 둘 이상의 표적 생물분자가 함유된 시료라도 패턴에 의해 분석이 가능한 장점이 있다.
패턴인식, 검출판, 생물분자프로브, 병원성 미생물

Description

패턴인식형 다중생물분자 검출판 {Pattern-Recognition Type Plate Detecting Multi-Biomolecule}
본 발명은 생물분자, 특히 병원성 미생물을 검출하는 검출판에 관한 것으로, 그 중에서도 다양한 표적을 하나의 검출판으로 검출할 수 있고, 시료와의 반응 후 상기 검출판에 나타나는 신호의 패턴(pattern)을 인식하여 병원성 미생물과 같은 표적 생물분자를 판별하는 것을 특징으로 하는 검출판에 관한 것이다.
생물분자 검출판이란 효소나 항체와 같은 단백질이나 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산 등의 생물분자를 고체 기판 상에 매우 높은 밀도로 배열, 고정화한 것으로, 효소-기질 반응, 항원-항체 반응 또는 핵산의 혼성화(hybridization) 반응 메커니즘을 이용하여 단시간에 많은 정보를 얻는 분석도구로 널리 사용되고 있다.
이러한 생물분자 검출판의 제작방법을 보다 자세히 설명하면, 일반적으로 표면에 화학기가 처리된 유리와 같은 슬라이드 위에 생물체로부터 분리 정제하거나 화학적으로 합성된 생물분자프로브(probe)를 핀을 이용하여 집적하고, 고정화 반응을 통해 공유 결합을 형성하여 검출판을 제작한다. 그 후에 보통 형광 마커 등에 의해서 표지된 시료를 그 위에서 반응시켜서 반응에 참여하지 않은 시료를 제거하 고, 스캐너로 형광 이미지를 얻고, 그 이미지를 수치화 프로그램을 이용하여 상대적인 형광 세기로 수치화하여 데이터를 분석하게 된다. 이때 기판상에 고정화되는 생물분자프로브는 표적 생물분자에 특이적인(specific) 프로브와 일정 범위의 생물분자에 대하여는 항상 반응이 일어나는 양성(positive) 대조군 생물분자프로브로 분류된다.
종래에는 주로 단일 또는 수개의 프로브를 사용하여 검출판을 제작함으로써 표적 미생물의 판별을 위해 여러 검출판을 사용해야 하는 불편함이 있었다. 뿐만 아니라, 아종의 분류나 그 밖에 유전학적 염기 서열 또는 아미노산 서열이 거의 같은 경우 비특이적인 혼성화 반응이 빈번히 일어나 이로 인해 표적 생물분자 검출의 정확성이나 재현성이 떨어지는 문제점 또한 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 각 표적 생물분자에 특이적으로 반응하는 각기 다른 특이적 생물분자프로브 다수 열과, 이러한 특이적 생물분자프로브와의 상동성이 낮은 서로 동일한 표준 생물분자프로브 다수 열을 포함하고, 상기 특이적 생물분자프로브 열과 표준 생물분자프로브 열은 교대로 배열되어 광 조사시 상기 생물분자프로브들로부터 발생하는 신호의 패턴을 분석하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 다중생물분자 검출판을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 패턴인식형 생물분자 검출판은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,
1 내지 3 열의 대조군 생물분자프로브;
상기 대조군 생물분자프로브와 평행하고 각각 상이한 2 내지 100 열의 특이적 생물분자프로브; 및
상기 대조군 생물분자프로브 및 특이적 생물분자프로브와 평행하고 각 대조군 생물분자프로브 또는 특이적 생물분자프로브와 교대로 배열되는 동일한 표준 생물분자프로브 열들
을 기판 상에 포함하고,
상기 각 열은 일정한 간격을 갖는 2 내지 10 개의 생물분자프로브를 포함하 고,
상기 생물분자프로브로부터 발생한 신호의 패턴을 분석하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 생물분자프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), cDNA, 단백질, 탄수화물 및 대사산물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 생물분자는 병원성 미생물에서 유래될 수 있다.
또한, 상기 각 특이적 생물분자프로브는 인접한 표준 생물분자프로브들의 중앙에 위치할 수 있다.
또한, 상기 병원성 미생물은 Bacillus , Camphylobacter , Clostridium , Escherichia, Legionella , Listeria , Salmonella , Shigella , Staphylococcus , Vibrio , 및 Yersinia로 이루어진 군에서 선택된 속의 미생물일 수 있다.
또한, 상기 병원성 미생물은 Escherichia coli , Escherichia coli O157 : H7 , Listeria monocytogenes , Salmonella choleraesuis , Salmonella enteritidis , Shigella dysenteriae , Staphylococcus aureus , Vibrio cholerae , Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus , Yersinia enterocolitica , Bacillus cereus, Campylobacter jejuni , Clostridium botulinum , Clostrium perfringens , Enterobacteriaceae, Legionella pneumophila , Listeria innocua , Salmonella paratyphi, Salmonella typhi , Salmonella typhimurium , Shigella boydiim , Shigella flexneri , Shigella sonnei , Staphylococcus aureus , Vibrio alginolyticus, Vibrio fluvialis , Vibrio furnissii , Vibrio mimicus , Vibrio harvey, Vibrio campbelli , Vibrio ordalli , 및 Vibrio metschnikovii로 이루어진 군에서 선택된 미생물일 수 있다.
또한, 상기 대조군 생물분자프로브는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 특이적 생물분자프로브는 서열번호 2 내지 21로 이루어지는 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 표준 생물분자프로브는 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 표준 생물분자프로브와 특이적 생물분자프로브의 상동성은 5 내지 80 %인 것이 바람직하다.
또한, 상기 본 발명의 생물분자 검출판은 동시에 2 내지 100 개의 표적 생물분자를 검출할 수 있다.
한편, 본 발명의 패턴인식에 의한 생물분자 검출방법은
(A) 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 청구항의 패턴인식형 생물분자 검출판에 마커로 표지된 시료를 반응시키는 단계;
(B) 상기 패턴인식형 생물분자 검출판에 자극을 가하여 각 생물분자프로브로부터 발생하는 신호 또는 이를 측정한 측정값을 집합한 실측패턴을 수득하는 단계; 및
(C) 상기 실측패턴을 각 생물분자 또는 그 조합에 대한 대비패턴과 비교하여 가장 유사한 대비패턴을 선정하고 그 대비패턴이 가리키는 생물분자 또는 그 조합 을 판별하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (C)의 유사한 대비패턴 선정은
(C-1) 상기 실측패턴을 구성하는 측정값 중 상기 특이적 생물분자프로브에 대응하는 측정값만을 추출하는 단계;
(C-2) 상기 추출된 측정값 중 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 측정값의 평균인 제 1 평균값을 구하는 단계;
(C-3) 상기 제 1 평균값의 총합 또는 최대값으로 상기 제 1 평균값들을 나눈 환산값을 구하는 단계; 및
(C-4) 상기 환산값을 상기 대비패턴의 환산값과 비교하는 단계
를 통해 이루어질 수 있다.
또한, 상기 단계 (C-1)은
(C-1') 상기 실측패턴을 구성하는 측정값 중 상기 특이적 생물분자프로브에 대응하는 측정값을, 상기 특이적 생물분자프로브에 인접한 상기 표준 생물분자프로브에 대응하는 측정값들의 평균인 제 2 평균값으로 나눈 값 또는 그 역수인 보정값을 구하는 단계
이고, 상기 단계 (C-2)는
(C-2') 상기 보정값 중 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 보정값의 평균인 제 1 평균값을 구하는 단계
일 수 있다.
또한, 상기 대비패턴의 수득, 단계 (C)의 유사한 대비패턴 선정, 또는 상기 대비패턴의 수득 및 단계 (C)의 유사한 대비패턴 선정은 신경망 알고리즘을 통해 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (B) 이후 단계 (C) 이전에,
(D) 상기 실측패턴 또는 대비패턴을 구성하는 측정값 또는 환산값을 그 크기에 따라 미리 정해진 색으로 표시하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (D)를 거친 실측패턴 또는 대비패턴에, 측정값 또는 환산값의 크기에 대한 좌표축을 추가하여 3차원적으로 표시하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (B)의 자극은 에너지, 바람직하게는 광에너지일 수 있다.
또한, 상기 단계 (B)의 신호는 형광일 수 있다.
한편, 본 발명의 패턴인식에 의한 생물분자 검출프로세스는
(Ⅰ) 상기 패턴인식형 생물분자 검출판에 마커로 표지된 시료를 반응시킨 후 자극을 가하여 각 생물분자프로브로부터 발생하는 신호를 측정한 측정값의 집합인 실측패턴을 입력받는 단계;
(Ⅱ) 상기 실측패턴 중 특이적 생물분자프로브로부터의 측정값을 표적 생물분자 또는 그 조합에 대해 미리 저장된 대비패턴들 중 특이적 생물분자프로브에의 해당값과 비교하는 단계; 및
(Ⅲ) 상기 실측패턴이 상기 대비패턴들 중 각 대비패턴일 확률을 상기 표적 생물분자 또는 그 조합에 대해 출력하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 패턴인식에 의한 생물분자 검출프로세스는 프로그램의 형태로 컴퓨터에서 실행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판은 각각의 생물분자에 특이적 반응을 일으키는 다수의 생물분자프로브를 하나의 검출판에 집적함으로써, 종래 표적 생물분자의 판별을 위해 하나 또는 소수의 종류의 특이적 생물분자프로브만 집적된 검출판을 여러 개 사용해야 했던 문제점을 극복할 수 있다.
뿐만 아니라, 동일한 조건 하에서 다양한 특이적 생물분자프로브와 반응함으로써, 검출판 별로 반응조건이 다름에 따라 발생할 수 있는 분석 상의 오류를 근원적으로 예방할 수 있다.
그리고, 아종의 분류나 그 밖에 유전학적 염기 서열 또는 아미노산 서열이 거의 유사한 경우라도, 특이적 생물분자프로브를 적절히 선택하고 각 표적 생물분자에 대해 고유한 패턴을 분석 비교함으로써, 판별의 정확성이나 재현성을 현저히 제고하는 장점이 있다.
나아가 검출판 제조과정에서의 교란이나, 시료와의 반응시 일어날 수 있는 불균일성 등으로 인한 분석결과 상의 오류 가능성을, 상기 표준 생물분자프로브와의 상대값을 취함으로써 획기적으로 낮출 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 패턴인식형 다중생물분자 검출판에서 발생하는 신호를 수치화하고 이를 색으로 표현함으로써 분석 경험이 적은 초보자도 쉽게 검출이 가 능하고, 둘 이상의 표적 생물분자가 함유된 시료라도 패턴에 의해 분석할 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에서 하기 용어는 다음의 의미로 사용된다.
우선 '생물분자'는 바이러스, 미생물 및 동식물세포로부터 유래하는 핵산이나 단백질, 항원 등의 생체분자를 총칭하는 것으로 상기 세포 자체와 이러한 생물분자를 인공적으로 합성하여 제조된 상기 생물분자를 포함한다.
그리고, '생물분자프로브'는 상기 생물분자를 주재(主材)로 한 탐침(probe)를 가리킨다.
다음으로, '표준 생물분자프로브'는 표적 생물분자와의 교차 반응을 일으키지 않으며, 실험상의 오류 보정, 정량분석의 기준 제공을 위해 사용되는 생물분자프로브를 일컫는다.
또한, '실측패턴'이란 본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판에 광과 같은 일정한 자극을 가하여 발현되는 신호, 또는 이를 측정한 측정값이나 상기 측정값의 환산값을 집합한 것을 말한다.
그리고, '대비패턴'이란 상기 실측패턴과의 대조, 비교를 위해 미리 알려진 각 생물분자 또는 상기 생물분자의 조합에 대해 상기 실측패턴과 같은 과정을 거쳐 수득한 패턴을 가리킨다.
본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판은 대조군 생물분자프로브 열, 특이적 생물분자프로브 열 및 표준 생물분자프로브 열을 기판 상에 포함한다. 그리 고, 각 열은 일정한 간격을 갖는 2 내지 10 개의 생물분자프로브를 포함한다.
본 발명의 검출판을 구성하는 세 종류의 생물분자프로브 열 중 대조군 생물분자프로브 열은 병원성 미생물의 16S rDNA 중 보존영역 (conserved region)처럼 일군의 생물분자 중 일정한 생물분자로 프로브가 제작되어 일정 범위의 표적 생물분자와는 항상 반응이 일어나므로, 레이블링 반응의 성공 여부를 확인하기 위해 사용된다. 즉, 상기 대조군 생물분자프로브 열에서 신호가 관찰되지 않으면 해당 검출판의 측정값은 분석에서 제외하는 것이 바람직하다.
이러한 대조군 생물분자프로브는 상기 특이적 생물분자프로브와 비교하여 일측 말단에 위치하는 것이 레이블링 반응의 성공 여부를 확인하는 데 간편하므로 바람직하다. 그리고, 그 갯수는 1 내지 3 열이 바람직한데, 3 열을 초과하면 불필요한 중복으로 인해 검출판의 면적만 낭비하고 제조단가를 상승시키는 결과를 초래한다.
본 발명의 검출판을 구성하는 또 다른 생물분자프로브는 특이적 생물분자프로브이다. 상기 특이적 생물분자프로브는 병원성 미생물의 16S rDNA 중 가변영역 (variable region)처럼 분석하고자 하는 시료 중의 표적 생물분자와 특이적으로 반응하며, 이러한 반응은 효소-기질 반응이나 핵산의 혼성화 반응 또는 항원-항체 반응 등을 들 수 있다.
본 발명의 검출판에는 각기 다른 2 내지 100 열의 특이적 생물분자프로브가 구비될 수 있다. 이들 특이적 생물분자프로브는 분석하고자 하는 대상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 특히 본 발명에서 목적하는 유전학적 염기 서열이나 아미 노산 서열이 거의 같은 경우의 분석을 위해, 같은 표적 생물분자를 검출할 수 있는 둘 이상의 특이적 생물분자프로브를 인접 배열하고 전체적인 패턴을 분석하는 것이 바람직하다.
보다 자세히 설명하면, 하나의 표적 생물분자를 검출할 수 있는 두 개의 특이적 생물분자프로브가 존재한다고 가정할 때, 아종의 표적 생물분자에 대해 첫째 특이적 생물분자프로브의 신호와 둘째 특이적 생물분자프로브의 신호는 서로 다를 것이며, 이들 특이적 생물분자프로브 외에 본 발명의 검출판 위에 존재하는 다른 특이적 생물분자프로브에서의 신호와 조합한 패턴을 분석하면 아종의 경우도 판별이 가능하다.
본 발명에서 특이적 생물분자프로브 열은 상기 대조군 생물분자프로브 열과 평행하게 배열하는 것이 분석하기에 용이한 패턴을 얻는 데 도움을 준다. 그리고, 상기 특이적 생물분자프로브 열의 갯수는 2 내지 100 열이 바람직한데, 열이 하나인 경우 종래기술에서와 같이 하나의 시료를 여러 검출판에 적용해야 하는 불편함이 있고, 서로 다른 검출판에서 시료와 반응이 일어남에 따라 반응조건이 달라질 경우 분석결과에 영향을 미치게 되는 단점이 있다. 그리고, 특이적 생물분자프로브의 열의 갯수가 100 개를 초과하면 검출판의 크기가 지나치게 커지고 시료의 양도 많이 필요할 뿐만 아니라, 분석의 복잡성도 지나치게 증가하는 문제점이 있다.
한편, 본 발명의 검출판에는 추가로 표준 생물분자프로브 열이 구비된다. 상기 표준 생물분자프로브는 상기 특이적 생물분자프로브와 교차 혼성화 반응을 일으키지 않을 정도로 상동성이 낮은 것이 바람직하며, 5 내지 80 %의 상동성을 갖는 것이 보다 바람직하고, 5 내지 50 %의 상동성을 갖는 것이 특히 바람직하다. 상동성이 80 %를 초과하면 특이적 생물분자프로브와 교차 혼성화 반응이 일어날 수 있어 바람직하지 않다.
이러한 표준 프로브는 특이적 생물분자프로브나 대조군 생물분자프로브와 교차 혼성화 반응하지 않으며, 중합효소 연쇄반응 (PCR)에도 참여하지 않으므로 특이적 생물분자프로브에 대하여 표준화된 정량적 기준을 제공할 수 있다. 또한 상기 표준 생물분자프로브는 특이적 생물분자프로브의 표적 생물분자에 사용되는 형광 마커와 유사한 물질로 형광 표지될 수 있으므로 1 회의 레이블링과 스캐닝에 의하여 정량적 분석이 가능하다. 또한 혼성화 반응 등에 있어서 교란에 의한 국부적 변이 (regional variation)를 검출하고, 그에 기초하여 특이적 생물분자프로브의 측정값을 보정하는 기준이 될 수도 있다.
상기 각 열은 시험결과 얻을 수 있는 패턴을 용이하게 분석할 수 있도록, 서로 평행하게 배열되는 것이 바람직하다. 그리고, 앞서 언급했던 바와 같이 레이블링의 성공 여부를 쉽게 확인하기 위해 대조군 생물분자프로브는 특이적 생물분자프로브에 비해 일측 말단에 구비되는 것이 더욱 바람직하다. 나아가, 정량적 분석의 기준 및 국부적 변이의 보정 기준을 위해 상기 표준 생물분자프로브는 상기 대조군 생물분자프로브 또는 특이적 생물분자프로브와 교대로 배열되는 것이 바람직하고, 양 말단에는 표준 생물분자프로브가 위치하는 것이 보다 바람직하다.
상기 각 열은 반복실험에 의한 재현성 확인의 효과를 거둘 수 있고 통계학적 의미를 가지며 2 차원적 패턴 형성을 통해 패턴 분석의 유의성을 제고하기 위해 일 정한 간격을 갖는 2 내지 10 개의 생물분자프로브를 포함할 수 있다. 동일한 생물분자프로브 열이 하나의 생물분자프로브만으로 이루어진 경우 전술한 반복실험의 효과를 거둘 수 없고, 생물분자프로브의 갯수가 10 개를 초과하는 경우 검출판의 크기가 지나치게 커지고 시료의 양도 많이 필요할 뿐만 아니라, 분석의 복잡성도 지나치게 증가하는 문제점이 있다.
상기와 같이 제작된 패턴인식형 생물분자 검출판에 마커로 표지된 시료를 반응시킨 다음 상기 검출판에 광을 조사하여 신호를 검출한 측정값을 상기 각 생물분자프로브의 위치에 대응시키고 이를 집합시킨 실측패턴을 분석함으로써 표적 생물분자를 정성, 정량적으로 판별할 수 있다.
구체적으로, 표적 생물분자의 판별은 상기 실측패턴을 각 생물분자에 대한 대비패턴과 비교하여 가장 유사한 대비패턴을 선정함으로써 이루어진다.
상기 대비패턴은 미리 알려진 표적 생물분자 또는 그 조합에 대해 본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판으로 분석한 결과를 다량 반복 수득한 다음, 이를 신경망 알고리즘을 통해 학습시켜 얻은 패턴을 가리킨다. 그리고, 상기 대비패턴과의 유사성 판단 역시 신경망 알고리즘을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 특정 특이적 생물분자프로브와 그에 인접한 표준 생물분자프로브와의 측정값을 이용하여 시료의 표적 생물분자를 정량적으로 분석하거나, 실험상의 오류에 기한 국부적 변이도 보정할 수 있다.
한편, 상기 생물분자프로브는 올리고뉴클레오티드, cDNA, 단백질, 탄수화물 및 대사산물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여기서, 생물분자프로브가 올리 고뉴클레오티드나 cDNA인 경우 표적 생물분자와 핵산 혼성화 반응이 일어날 수 있고, 단백질인 경우 표적 생물분자와 효소-기질 반응 또는 항원-항체 반응이 일어날 수 있다.
특히, 본 발명의 생물분자는 병원성 미생물에서 유래된 것을 주요 관심사로 한다. 상기 병원성 미생물은 Bacillus , Camphylobacter , Clostridium , Escherichia, Legionella , Listeria , Salmonella , Shigella , Staphylococcus , Vibrio, 및 Yersinia로 이루어진 군에서 선택된 속의 미생물인 것을 대상으로 하고, 보다 구체적으로 Escherichia coli , Escherichia coli O157 : H7 , Listeria monocytogenes, Salmonella choleraesuis , Salmonella enteritidis , Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Clostrium perfringens, Enterobacteriaceae, Legionella pneumophila, Listeria innocua, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium , Shigella boydiim , Shigella flexneri , Shigella sonnei, Staphylococcus aureus , Vibrio alginolyticus , Vibrio fluvialis , Vibrio furnissii, Vibrio mimicus , Vibrio harvey , Vibrio campbelli , Vibrio ordalli , 및 Vibrio metschnikovii로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
나아가, 본 발명의 검출판에 포함되는 상기 대조군 생물분자프로브는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 특이적 생물분자프로브는 서열번호 2 내지 21로 이루어지는 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드를 포 함하는 것이 바람직하고, 상기 표준 생물분자프로브는 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다.
Figure 112008004577296-pat00001
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴인식형 생물분자 검출판의 구조를 보인 도면이다. 그러나, 본 발명의 패턴인식형 생물분자 검출판이 도 1의 구조에 한정되는 것은 아니다. 도 1을 참조하면, 황색 스팟(spot)이 표준 생물분자프로브이고, 청색 스팟은 대조군 생물분자프로브이고, 적색 스팟은 특이적 생물분자프로브를 나타낸 것이다. 네 개의 표준 생물분자프로브가 각각의 특이적 생물분자프로브를 정사각형 모양으로 둘러싸고 있는 모양을 기본 구조로 하여 반복되고 하나의 표준 생물분자프로브 열은 5 개의 생물분자프로브로 구성되며, 독립 실험의 정량적 분석을 위한 보정과 실험의 균일성, 통계적 의미를 부여하기 위해 사용한다. 청색 스팟으로 표시된 대조군 생물분자프로브는 실제 대조 프로브이며 가장 왼쪽 열에 4개가 반복하여 배열된다. 적색 스팟으로 표시된 특이적 생물분자프로브는 실제 표적 생물분자와 반응하는 캡처 프로브이며, 제 2 열부터 제 21 열까지 4개씩 반복된다. 도 1에는 하나의 검출판 패턴 당 표준 생물분자프로브가 110 개, 대조군 생물분자프로브가 4개, 특이적 생물분자프로브가 84 개로 총 198 개의 생물분자프로브 스팟이 사용되며 필요시 하나의 슬라이드에 2 개 이상의 패턴으로 구성함으로써 위치에 따른 실험 상 결과를 비교 분석할 수도 있다.
본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판을 이용한 생물분자의 검출방법은 상기 검출판에 마커(marker)로 표지된 시료를 반응시키는 단계로부터 시작된다. 상기 마커는 이후 분석시 가해지는 자극에 대해 검출가능한 신호를 방출시키는 형태라면 제한이 없으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 사용되는 형광마커를 포함한다. 그리고, 상기 반응은 올리고뉴클레오티드의 혼성화 반응, 효소-기질 반응, 항원-항체 반응을 포함한다.
상기 반응이 완료되면 상기 패턴인식형 다중생물분자 검출판에 자극을 가하고, 상기 자극에 대해 각 생물분자프로브로부터 발생하는 신호 또는 이를 측정한 측정값을 집합한 실측패턴을 수득한다.
상기 자극은 이에 대해 검출가능한 신호를 방출시킬 수 있는 형태라면 제한이 없으며, 일반적으로 에너지 특히 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 사용되는 특정 파장의 광에너지를 포함한다. 그리고, 이러한 자극에 대해 각 생물분자프로브로부터 발생하는 신호는 검출이 가능한 형태라면 제한이 없으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 사용되는 형광을 포함한다.
또한, 상기 실측패턴은 상기 신호 또는 이를 측정하여 수치화한 측정값이나 환산값을 일정한 원칙, 예컨대 상기 각 생물분자프로브의 위치에 대응시켜 배열함으로써 수득된다.
이렇게 수득한 상기 실측패턴은 미리 준비된 별도의 대비패턴과 비교하여 가장 유사한 대비패턴이 가리키는 생물분자를 판별함으로써 목적하는 생물분자를 검출해내게 된다.
상기 대비패턴은 미리 알려진 생물분자 또는 상기 생물분자들이 조합된 시료에 대해 상기 실측패턴의 수득과정과 동일한 과정을 거쳐 수득한 패턴으로서, 상기 실측패턴과의 비교를 위해 준비된다. 분석의 정확성 제고를 위해 동일한 표적 생물분자에 대해 3 내지 10 회 반복실험하여 재현성을 확인하는 것이 바람직하며, 신경망 알고리즘으로 학습시켜 데이터베이스를 구축하는 것이 보다 바람직하다.
종래의 일반적인 생물분자 검출판은 하나의 특정한 표적 생물분자를 검출하도록 제작되었다. 그러나, 아종과 같이 유전학적 염기서열이 거의 유사하거나 아미노산 서열이 거의 유사한 경우에는 정확한 판별이 곤란하였다.
하지만, 본 발명에서처럼 하나의 검출판에 종류가 다른 복수 개의 특이적 생물분자프로브를 구비한 경우, 특정 표적 생물분자는 그에 대응되는 특이적 생물분자프로브 이외의 다른 특이적 생물분자프로브들과도 일정하고 재현성 있는 수준의 반응을 일으킴으로써 전체적으로 고유한 패턴을 형성하게 된다.
나아가, 하나의 표적 생물분자에 대해 반응성이 높은 프로브를, 서열을 달리하여 둘 이상 구비함으로써 성질이 비슷한 표적 생물분자도 구분해낼 수 있다.
본 발명은 미리 알려진 생물분자 또는 상기 생물분자들이 조합된 시료에 대해 상기 실측패턴의 수득과정과 동일한 과정을 거쳐, 비교의 기준이 되는 대비패턴을 먼저 준비한 다음, 미지의 시료로부터 수득한 실측패턴을 상기 대비패턴과 비교, 즉 패턴과 패턴을 비교함으로써, 미지의 시료 속에 포함된 생물분자를 판별해내는 것이 가장 큰 특징이다.
한편, 상기 실측패턴과 대비패턴의 비교는 상기 특이적 생물분자프로브의 측정값을 기초로 수득한 변환값만을 이용하여 이루어질 수도 있다.
패턴 간의 비교 분석 경험이 많은 전문가라면 형광 이미지와 같은 신호만으로 이루어진 패턴으로도 정확한 판별이 가능하겠으나, 분석 경험이 적은 초보자는 이러한 신호 패턴으로 판별이 어렵다. 특히, 시료 내에 두 종류 이상의 생물분자가 함유된 경우에는 전문가라 할지라도 높은 정확도로 판별하기가 쉽지 않다. 이 경우 상기 측정값 또는 이를 기초로 수득한 변환값을 컴퓨터로 하여금 비교하게 함으로써 분석의 정확도를 제고할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 검출판에 가해진 자극에 의해 각 생물분자프로브로부터 발생하는 신호를 수치화한 측정값 중 표준 생물분자프로브나 대조군 생물분자프로브는 제외하고 특이적 생물분자프로브에 대응하는 측정값만을 추출한 후, 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 측정값의 평균인 제 1 평균값을 구한다. 그 다음, 상기 제 1 평균값들의 총합 또는 이들 중 최대값으로 상기 제 1 평균값들을 나눈 환산값을 구하고, 대비패턴에 대해서도 동일하게 제 1 평균값 및 환산값을 구한 후, 상기 실측패턴 상의 환산값과 대비패턴의 환산값을 비교하는 것이 보다 바람직하다.
이러한 조작은 이후에 설명할 컴퓨터 프로그램에 의한 생물분자 판별시 수치를 정규화(normalization)함으로써 데이터 처리를 보다 간편하게 할 수 있도록 한다.
나아가, 본 발명의 검출판 제작 또는 시료와의 반응시 일어날 수 있는 국부적 교란, 예컨대 어레이어 핀에서의 모세관 효과의 불균일성, 반응조건의 국부적 차이, 기타 물리화학적 영향으로 인해 특정 특이적 생물분자프로브에서의 측정값이 동일한 특이적 생물분자프로브들로부터의 측정값과 심한 편차를 보이는 경우, 종래에는 당해 측정값을 분석에서 배제할 수 밖에 없었다. 그러나, 본 발명에서는 국부적 교란이 발생한 특이적 생물분자프로브에서의 측정값 자체 대신 주변의 표준 생물분자프로브와의 상대값을 취함으로써 이를 분석에 포함시킬 수 있다. 이는 어떤 이유로 분석 가능한 시료의 양이 극히 적거나, 반복실험이 곤란한 경우 크게 도움이 될 수 있다.
구체적으로, 특정 특이적 생물분자프로브에 대응하는 측정값을, 상기 특이적 생물분자프로브에 인접한 표준 생물분자프로브에 대응하는 측정값들의 평균인 제 2 평균값으로 나눈 값 또는 그 역수인 보정값을 구하고, 이 보정값 중 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 보정값의 평균인 상기 제 1 평균값을 구하는 과정을 거친다.
이상의 과정을 거침으로써, 검출판 중 일정 영역에 교란이 발생하더라도 당해 영역 내의 특이적 생물분자프로브 뿐만 아니라 표준 생물분자프로브도 영향을 받았을 것이므로, 이 둘 간의 상대값을 분석에 활용함으로써 상기 교란에 따른 오류의 영향을 줄일 수 있다.
이렇게 구한 측정값 또는 환산값은 컴퓨터를 통해 바로 분석에 활용될 수 있는데, 구체적으로 미리 알려진 생물분자 또는 그 조합에 대해 반복실험하여 복수 개의 대비패턴을 수득하고 이로부터 측정값 또는 환산값을 수득하여 이를 데이터베이스화한 후, 미지의 시료로부터 수득한 실측패턴의 측정값 또는 환산값과 비교함으로써 상기 시료 내의 표적 생물분자를 판별할 수 있다.
특히 공지의 신경망 알고리즘을 이용한 프로그램에 의해 측정값을 입력하기만 하면 시료 내 표적 생물분자(들)을 판별하는 것이 가능하다.
구체적으로, 미리 알려진 표적 생물분자에 대해 대비패턴을 수득한 후 여기서 특이적 생물분자프로브에 대한 측정값 또는 그 환산값을 입력하고 학습시키는 과정을 신경망 알고리즘을 통해 반복함으로써 당해 프로그램은 상기 표적 생물분자에 대응되는 대비패턴에 대한 정보를 구축하게 된다. 다른 표적 생물분자 및 표적 생물분자들의 조합에 대해서도 동일한 과정을 거침으로써 상기 프로그램의 분석 스펙트럼을 확대할 수 있고, 동일한 표적 생물분자 또는 표적 생물분자들의 조합에 대해 신뢰할 수 있을 정도의 반복실험을 수행함으로써 상기 프로그램의 정확도를 제고할 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 수치화된 측정값 또는 환산값은 그 크기에 따라 미리 정해진 색으로 표시함으로써 종래 신호를 직접 분석하는 경우에 비해 판독성을 제고시킬 수도 있다.
도 4는 도 2 및 도 3의 형광 신호 이미지데이터 중 특이적 생물분자프로브만을 추출하고 그로부터의 형광 정도를 수치화한 후 상기 수치 자체 또는 그 환산값을 그 크기에 따라 미리 정해진 색으로 전환하여 표시한 것이다. 도 4에서 생물분자 검출판의 각 특이적 생물분자프로브로부터 얻어지는 신호는 그 상대적 배열 순서대로 위치되고 그에 해당하는 수치의 실제 데이터 행렬로 전환되며, 구성된 데이터 행렬은 각 수치들을 그 크기에 대응되는 색채로 표시된다. 이러한 과정을 거침으로써, 분석 경험이 적은 초보자라도 용이하게 표적 생물분자를 판별할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예
실시예 : 생물분자 검출판의 제작
상기 표 1의 생물분자프로브를 도 1과 같이 고정화시켜 본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판을 제작하였다. 상기 특이적 생물분자프로브 (서열번호 2 내지 21)는 16S rDNA의 가변영역으로부터 설계되었으며, 대조군 생물분자프로브 (서열번호 1)는 16S rDNA의 보존영역을 인식하도록 설계되었다. 그리고, 표준 생물분자프로브 (서열번호 22)는 다른 표적 생물분자와의 교차 혼성화를 방지하기 위해 일반적인 미생물에서 발견되지 않는 염기서열을 인위적으로 설계하였다.
특이적 생물분자프로브 또는 대조군 생물분자프로브의 배치는 기존의 디자인과 달리 반복되는 4 개의 생물분자프로브를 사용하여 민감도를 높이고자 하였다. 또한 4 개의 표준 생물분자프로브가 한 개의 특이적 생물분자프로브 또는 대조군 생물분자프로브를 감싸고 있기 때문에 실험에서 국부적 변이 (regional variation)을 확인하기 쉽게 만들었다. 일측 말단 (가장 왼쪽)에 대조군 생물분자프로브를 위치시켜서 레이블링(labeling)의 성공 유무를 알기 쉽게 하였고, 특이적 생물분자프로브는 알파벳 순으로 배열함으로써 쉽게 확인할 수 있게 하였다. 나아가, 동시 실험을 위해서 한 검출판에 대해 동일한 형태가 반복되는 이중 칩 (dual chip) 형태로 디자인하였다. 그리고, 3' 말단이 6-원자 스페이서(spacer)를 둔 아민기로 수정된 각 프로브들은 알데히드기로 개질된 슬라이드 글래스 (Telechem. 미국) 상에 공유결합을 통해 고정화되었다.
프린트 용액의 조성은 3X SSC와 1.5M의 베타인 (betaine. N,N,N-trimethyl glycine. Sigma)으로 구성되어 있다. 생물분자의 어레이어는 Microssys 5100 microarrayerTM (Cartesian Technologies, Inc. 미국)을 사용하였고, 핀은 Chip Maker 2 pin (Telechem. 미국)을 이용하여 상대습도 74 %에서 제작하였다. 건조 후에 생물분자 검출판은 NaBH4 1.3 g을 PBS(Phosphate buffered saline. pH 7.4) 375 ㎖와 에탄올 125 ㎖의 혼합액에 녹여서 5 분간 담가 두어 반응되지 않은 작용기들을 환원시키고, 0.2 %의 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 용액과 증류수를 이용하여 결합되지 않은 생물분자들을 씻어 주었다. 그 후에 말려서 저장했다.
실험예 1 : 표적 생물분자의 제작
표준 생물분자프로브에 상보적인 염기서열을 갖는 표준 표적은 표 2와 같이 5' 말단을 Alexa fluor 647로 수정하여 합성하였다.
종류 및 명칭 서열
표준 표적 5'-Alexa fluor 647-TTTCCCTTGGGTTCCCTTGGG
범용 프라이머 24F TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGG
1392R CGATTACTAGCGATTCCGACTTCATG
실제 표적 생물분자는 표 2의 범용(universal) 프라이머를 50:1의 비율로 이용하여 비대칭(asymmetric) PCR 방법으로 증폭하였다. 주형(template)은 표 1의 각 미생물을 열처리한 후 정제하여 준비했다. 상기 PCR 반응 혼합물은 2 U의 Taq 폴리머라제와 3.5 M의 24F 프라이머와 0.07 M의 1392R 프라이머, 0.5 mM의 dATP, dCTP, 그리고 dGTP, 0.15 mM의 dTTP와 0.3 mM의 Alxea fluor 647로 수정된 dUTP와 1X Taq 버퍼에 증류수를 넣어 50 ㎕로 제작하였다.
그리고, 반응온도를 95 ℃에서 5 분 후에 95 ℃, 60 ℃, 72 ℃에서 각각 1 분씩 사이클로 30 회 반복 후, 72 ℃에서 5 분간 두었다. 그 후에 PCR 정제키트 (QIAquick)를 이용하여 정제하고, 에탄올 침전을 통해 농축한 후에 Alexa Fluor 647 DNA 레이블링키트 (Molecular probes)를 이용하여 레이블링하였다. 그 후에 PCR 정제키트 (QIAquick)를 이용하여 정제하고 UV 스펙트로포토미터를 이용하여 레이블링 효율을 측정하였다.
실험예 2 : 혼성화 반응 (1)
고정화된 본 발명 실시예의 다중생물분자 검출판은 3X SSC 예비 혼성화 용액(450 mM NaCl, 3 mM 소듐 시트레이트, 1 % 우혈청 알부민, 0.1 % SDS, pH 7.0)에 담그고 50 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 그 다음, 증류수와 에탄올로 씻어준 후 1500 rpm에서 3 분간 원심분리를 이용하여 건조시켰다. 시료로서 표 1의 표준 표적과 실험예 1에서 제작된 각각의 표적 생물분자를 1:9로 혼합하여 2X 혼성화 완충용액 (6X SSC, 0.4 mg/㎖ 우혈청 알부민, 0.2 % SDS)과 섞어서 본 발명의 검출판 위에 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮고, 8 시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 그 후에 1X SSC + 0.2 % SDS 용액과 0.1X SSC + 0.2 % SDS 용액, 그리고 0.1X SSC 용액에서 각각 5 분간 세척한 후에 1500 rpm에서 3 분간 원심분리기를 이용하여 상온에서 건조시켰다.
시험예 1 : 이미지 스캐닝 및 패턴 분석 (1)
실험예 2에서 혼성화 반응을 실시한 다음 레이저 스캐너 (ScanArrayliteTM, Packard Biosystem, 미국)를 사용하여 검출판의 형광 이미지를 스캐닝하였고, 그 결과를 도 2 및 도 3에 도시하였다. 도시된 실선 상자는 특이적 결합을 나타내며, 대부분의 균주가 자신의 특이적 생물분자프로브에 대해 특이적 결합을 나타냄을 확인할 수 있다.
도 3은 이러한 특이적 결합 외에 비특이적 결합 (점선 상자)까지 표시한 것으로 이러한 비특이적 결합까지 고려함으로써 본 발명의 주요한 특징인 패턴 간의 비교가 가능해진다.
다만, Salmonella enteritidis의 경우 특이적 결합이 약한 세기로 검출되는데, 이와 같이 특정 표적 생물분자에 대해 형광도와 같은 신호의 세기가 약한 경우라 할지라도, 당해 표적 생물분자에 대응하는 특이적 생물분자프로브 이외의 다른 특이적 생물분자프로브에서 나타나는 형광도 신호 모두를 고려한 패턴을 이용하면 검출의 정확도를 현저히 제고할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 앞서 신호가 약한 경우의 예로 든 Salmonella enteritidis의 이미지 패턴 (도 2의 (e) 참조)을 보면, 대조군 생물분자프로브에 해당하는 서열번호 1의 열, Salmonella choleraesuis에 대응하는 특이적 생물분자프로브인 서열번호 7 및 8의 열, Salmonella enteritidis에 대응하는 특이적 생물분자프로브인 서열번호 9의 열, 그리고 Shigella dysenteriae에 대응하는 특이적 생물분자프로브인 서열번호 11의 열에서 비교적 강한 형광이 발현된다.
이 중, 서열번호 1은 레이블링의 성공 여부에 대한 판단지표에 불과하므로 제외하고, 서열번호 7 및 8에 강한 형광이 발현되므로, Salmonella enteritidis을 일단 후보로 삼을 수 있다. 그리고, 도 2의 (d)에 나타난 바와 같이 서열번호 10에 형광이 나타나지 않으므로 Salmonella choleraesuis에는 해당하지 않는다. 또한, 서열번호 11 역시 도 2의 (f)에 나타난 바와 같이 서열번호 9에 형광이 나타나므로 Shigella dysenteriae에는 해당하지 않아, 결과적으로 도 2의 (d)에 도시된 패턴은 Salmonella enteritidis에 해당하는 것으로 결론내릴 수 있다.
한편, 분석 경험이 적은 초보자도 용이하게 데이터 분석이 가능하도록 상기 형광도 측정값에 미리 정해진 색채를 대응시킬 수 있다.
도 2 및 도 3의 이미지를 정량 데이터화하기 위해서 정량적 미세배열 분석소프트웨어 (Quantitative microarray analysis software, QuantArrayTM 2.0, Packard Biosystem, 미국)를 사용하였다.
도 4는 도 2 및 도 3의 실측패턴을 상기 소프트웨어에 의해 수치화된 측정값으로 변환하고, 이 중 특이적 생물분자프로브에 해당하는 측정값만을 추출한 후 그 크기에 따라 미리 정해진 색상을 대응시킨 후 2차원적으로 배열시킨 실측패턴이다.
이때 각 특이적 생물분자프로브로부터 나오는 신호는 하나의 격자로 표시되며 절대적인 형광도를 갖고 있다. 따라서 이러한 격자들의 전체적인 이미지는 형광도의 차이에 따라 구배를 이룬다. 절대적인 형광도의 값의 차이에 따른 구배는 오른쪽에 무지개 스펙트럼(spectrum)의 컬러막대로 표시된다. 모든 특이적 생물분자프로브의 신호 중에 가장 높은 값과 낮은 값을 기준으로 가장 높은 값이 막대의 가장 상위의 색깔(검붉은색)로 표시되고 가장 낮은 값이 가장 하위의 색깔(진한남색)로 표시된다. 따라서 모든 격자는 절대적인 형광도를 지니지만, 가장 높고 낮은 값을 기준으로 상대적인 컬러로 표시된다. 반면에 컬러바에는 형광도의 정도가 수치로 표시되기 때문에 정량적인 보기가 가능하다. 따라서, 진한남색에 가까울수록 신호가 검출되지 않은 것이며 붉은색에 가까울수록 신호의 세기가 강한 것이다. 즉 컬러로 나타나는 형광도 구배는 정량적인 수치에 대한 상대적인 표시이므로 원하는 표적 생물분자와 특이적 생물분자프로브와의 반응정도를 보여준다.
도 4를 통해 표적 생물분자와 특이적 생물분자프로브 사이의 반응 유무 및 그 정도를 정량적이면서 판독성 높은 결과로 구현함으로써 상기 표적 생물분자의 특이적 검출을 확인하였다.
도 5는 도 4의 수치화된 측정값을 집합한 실측패턴을 입력 받아 미리 저장된 대비패턴과 비교하고 상기 실측패턴이 상기 대비패턴들 중 각 대비패턴일 확률을 상기 표적 생물분자 또는 그 조합에 대해 출력하는 프로그램에 Escherichia coli의 실측패턴을 입력한 결과로서, 윗화면은 형광도의 환산값을, 아랫화면은 각 병원성 미생물에 해당할 확률을 나타낸다.
상기 대비패턴은 표 1의 각 병원성 미생물 당 5 회씩 실험예 2를 반복한 후 얻은 시험예 1의 형광도를 상기 프로그램에 입력하고 신경망 알고리즘을 통해 학습시켜 수득하였다. 상기 프로그램에 다시 표적 생물분자를 Escherichia coli로 하여 실험예 2를 거친 검출판으로부터 시험예 1을 통해 형광도를 수득하였다. 이렇게 수득한 형광도 중 특이적 생물분자프로브에 대응하는 형광도만을 추출하고, 이들 중 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 형광도의 평균인 제 1 평균값의 총합으로 상기 제 1 평균값을 나눈 환산값을 구하고, 이를 도 5의 윗화면에 표시하였다. 도 5의 윗화면에서는 Escherichia coli에 대한 형광도 뿐만 아니라 Shigella dysenteriae에 대한 형광도도 상대적으로 높게 나타나 정확하게 어느 병원성 미생물이 표적 생물분자인지 판별하기 어려웠으나, 신경망 알고리즘을 통한 상기 프로그램에 의하면 도 5의 아랫화면에 도시된 바와 같이 Escherichia coli일 확률이 100 %로 나타남을 알 수 있다. 특히, 다른 미생물에 비해 월등히 높은 값을 보일 뿐만 아니라, 형광도가 높게 나타난 Shigella dysenteriae에 대해서는 확률이 0 %로 나타나 패턴인식이라는 본 발명의 효용이 극명하게 드러난 것으로 볼 수 있다.
실험예 3 : 혼성화 반응 (2)
실험예 2와 동일한 과정을 거치되, 시료 중 표적 생물분자로 Staphylococcus aureus와 Vibrio parahaemolyticus를 동량 혼합하였다.
시험예 2 : 이미지 스캐닝 및 패턴 분석 (2)
실험예 3의 검출판을 시험예 1과 동일한 과정을 거쳐 형광 이미지 (도 6), 색상 이미지 (도 7), 및 프로그램 출력결과 (도 8)를 수득하였다.
두 가지의 표적 생물분자가 혼합되어 있어 도 2 및 도 3과 같이 한눈에 판별하기는 곤란하나, 도 8의 프로그램 출력결과를 보면 시료 중에 포함된 Staphylococcus aureus와 Vibrio parahaemolyticus의 확률이 다른 미생물에 비해 월등히 높음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 패턴인식형 생물분자 검출판, 그리고 이를 이용한 검출방법 및 상기 방법을 구현한 프로그램은 둘 이상의 표적 생물분자가 혼합된 시료에 대해서도 높은 정확성을 달성함을 확인할 수 있다.
시험예 3 : 국부적 교란을 고려한 패턴 분석
도 9는 Escherichia coli O157 : H7을 시료에 포함시킨 경우의 색상 이미지에 있어서, Shigella dysenteriae 특이적 생물분자프로브에 국부적 교란이 발생한 것을 도시한 것이다.
상기 도 9의 각 형광도를 인접한 표준 생물분자프로브에서의 형광도의 평균인 제 2 평균값으로 나눈 보정값을 구한 후, 상기 보정값 중 서로 동일한 특이적 생물분자프로브에 대응되는 보정값의 평균인 제 1 평균값을 구하고, 다시 상기 제 1 평균값의 총합으로 상기 제 1 평균값들을 나눈 환산값으로 표시한 것이 도 10이다.
도 10에 의하면 표준 생물분자프로브에서의 형광도를 이용하여 특이적 생물분자프로브에서의 형광도를 보정한 결과 도 4의 Escherichia coli O157 : H7 해당 결과와 거의 유사한 패턴을 수득함을 확인할 수 있다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판의 일실시예를 도시한 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 패턴인식형 다중생물분자 검출판을 사용하여 다양한 병원성 미생물을 검출한 형광 이미지를 촬영한 것이다.
도 4는 도 2 및 도 3의 형광 이미지를 대응되는 색상 이미지로 도시한 것이다.
도 5는 Escherichia coli를 포함한 시료의 경우, 환산값으로 표시한 형광도 및 본 발명의 패턴인식에 의한 생물분자 검출프로세스를 통해 예측한 각 병원성 미생물일 확률을 나타낸 화면이다.
도 6은 시료 중 표적 생물분자로 Staphylococcus aureus와 Vibrio parahaemolyticus를 동량 혼합한 경우의 형광 이미지를 촬영한 것이다.
도 7은 도 6의 형광 이미지를 대응되는 색상 이미지로 도시한 것이다.
도 8은 시료 중 표적 생물분자로 Staphylococcus aureus와 Vibrio parahaemolyticus를 동량 혼합한 경우 환산값으로 표시한 형광도 및 본 발명의 패턴인식에 의한 생물분자 검출프로세스를 통해 예측한 각 병원성 미생물일 확률을 나타낸 화면이다.
도 9는 국부적 교란이 발생한 색상 이미지를 도시한 것이다.
도 10은 표준 생물분자프로브와의 상대값으로 상기 도 9의 국부적 교란을 보정한 색상 이미지를 도시한 것이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION Wooseok Institute of Life & Science Co., Ltd. <120> Pattern-Recognition Type Plate Detecting Multi-Biomolecule <130> M07-6393 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control <400> 1 ggctgctggc acggagttag c 21 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Escherichia coli <400> 2 gaaggcacat tctcatctct gaaaac 26 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Escherichia coli O157:H7 <400> 3 cagcaaagaa gcaagcttct tcct 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Escherichia coli O157:H7 <400> 4 actcgtcagc aaagaagcaa gct 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Listeria monocytogenes <400> 5 gcatgcgcca cactttatca tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Listeria monocytogenes <400> 6 ccatctttca aaagcgtggc at 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Salmonella choleraesuis <400> 7 tgctgcggtt attaaccaca aca 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Salmonella choleraesuis <400> 8 gactcaagcc tgccagtttc ga 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Salmonella enteritidis <400> 9 aggcacaaat ccatctctgg attc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Shigella dysenteriae <400> 10 aggcaccctc gtatctctac aagg 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Shigella dysenteriae <400> 11 ccgccactcg tcagcaaagc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Staphylococcus aureus <400> 12 aactagctaa tgcagcgcgg at 22 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Staphylococcus aureus <400> 13 agatgtgcac agttacttac acatatgttc t 31 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Vibrio cholerae <400> 14 cctctaccgg gcaatttcc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Vibrio cholerae <400> 15 ctctaccggg caatttccca 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Vibrio parahaemolyticus <400> 16 cccgaaggtt cagataactc gttt 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Vibrio parahaemolyticus <400> 17 cgttatcgtt ccccgaagtt cagat 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Vibrio vulnificus <400> 18 aaacaagttt ctctgtgctg ccgc 24 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Vibrio vulnificus <400> 19 tgagccgaag ctatcatgcg g 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe1 for Yersinia enterocolitica <400> 20 gttattggcc ttcctcctcg ct 22 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe2 for Yersinia enterocolitica <400> 21 tgcgagtaac gtcaatccaa caa 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> standard probe <400> 22 cccaagggaa cccaagggaa a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> standard target <400> 23 tttcccttgg gttcccttgg g 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 <400> 24 tggctcagat tgaacgctgg cgg 23 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 25 cgattactag cgattccgac ttcatg 26

Claims (11)

  1. 각각 상이하고 서로 평행한 2 내지 100 열의 특이적 생물분자프로브(probe); 및
    상기 특이적 생물분자프로브 열과 평행하고 각 특이적 생물분자프로브 열과 교대로 배열되고 서로 동일한 표준 생물분자프로브 열들
    을 기판 상에 포함하고,
    상기 각 열은 일정한 간격을 갖는 2 내지 10 개의 생물분자프로브를 포함하고,
    상기 생물분자프로브로부터 발생한 신호의 패턴을 분석하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 패턴인식형 생물분자 검출판은 상기 특이적 생물분자프로브 열과 평행한 1 내지 3 열의 대조군 생물분자프로브 열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 생물분자프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), cDNA, 단백질, 탄수화물 및 대사산물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 패턴인식 형 생물분자 검출판.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 생물분자는 병원성 미생물에서 유래된 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 각 특이적 생물분자프로브는 인접한 표준 생물분자프로브들의 중앙에 위치하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 병원성 미생물은 Bacillus, Camphylobacter, Clostridium, Escherichia, Legionella, Listeria, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Vibrio, 및 Yersinia로 이루어진 군에서 선택된 속(genus)의 미생물인 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 병원성 미생물은 Escherichia coli , Escherichia coli O157 : H7 , Listeria monocytogenes , Salmonella choleraesuis , Salmonella enteritidis , Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Clostrium perfringens, Enterobacteriaceae, Legionella pneumophila, Listeria innocua, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi , Salmonella typhimurium , Shigella boydiim , Shigella flexneri , Shigella sonnei , Staphylococcus aureus , Vibrio alginolyticus, Vibrio fluvialis , Vibrio furnissii , Vibrio mimicus , Vibrio harvey, Vibrio campbelli , Vibrio ordalli , 및 Vibrio metschnikovii로 이루어진 군에서 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 대조군 생물분자프로브는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  9. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 특이적 생물분자프로브는 서열번호 2 내지 21로 이루어지는 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  10. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 표준 생물분자프로브는 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
  11. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 표준 생물분자프로브와 특이적 생물분자프로브의 상동성은 5 내지 80 %인 것을 특징으로 하는 패턴인식형 생물분자 검출판.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR200230956Y1 (ko) 2001-02-28 2001-07-03 (주)코스타 월드 진단용 바이오칩 셋
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
KR100376917B1 (ko) 2000-05-29 2003-03-26 (주)바이오니아 소화기 감염균들의 빠른 진단을 위한 프로브 및 이를이용한 ｄｎａ 칩 및 검출 방법
KR200230956Y1 (ko) 2001-02-28 2001-07-03 (주)코스타 월드 진단용 바이오칩 셋

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102565388A (zh) * 2012-01-16 2012-07-11 宁波天润生物药业有限公司 肥达氏试验卡

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