KR100580631B1 - 산화막을 갖는 기판, 그를 이용한 표적 물질 검출 방법 및광학적 센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산화막을 갖는 것을 특징으로 하는 표적 물질을 광학적으로 검출하는데 사용되는 기판, 그를 이용한 표적 물질의 검출 방법 및 그를 포함하는 광학적 센서를 제공한다. 본 발명의 기판을 이용하면, 기판을 이용하는 분석 방법에 있어서 강화된 검출신호를 얻을 수 있다.
산화막, 마이크로어레이
Description
도 1은 본 발명의 산화막이 형성된 기판을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 커플링제로서 GAPS 또는 GAPDES를 사용한 경우 산화막의 두께가 신호의 강도에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 3은 1,000Å 두께로 형성된 산화막을 갖는 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용하여 얻어지는 신호의 강도를 나타내는 도면이다.
도 4는 1.000Å 두께로 형성된 산화막을 갖는 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하여 GAPDH 유전자 시료를 검출 방법에 사용한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 산화막이 형성되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하여 GAPDH 유전자 시료를 검출 방법에 사용한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 산화막을 갖는 기판, 그를 이용한 표적 물질의 검출 방법 및 그를 포함하는 광학적 센서에 관한 것이다.
종래 생물화학적 분석 방법에는 기판에 특정한 물질을 고정화하고, 그에 특이적으로 결합하는 표적 물질을 결합시킴으로써 표적 물질을 검출 또는 분석하는 방법이 알려져 있었다. 이러한 분석 방법에는 ELISA를 이용한 방법 및 마이크로어레이를 이용한 방법이 포함된다. 이러한 분석 방법은 일반적으로, 기판 상에 특정한 화합물(일반적으로 프로브 화합물이라 한다)을 고정화하고, 이에 특이적으로 결합하는 표적 물질을 포함하는 시료를 반응시킨다. 이때 상기 표적 물질은 표지 또는 표지되어 있지 않을 수 있다. 다음으로, 상기 프로브 화합물과 표적 물질의 특이적 반응을 검출가능한 신호로 변환하여 검출하는 과정을 거친다. 상기 신호에는 광학적 및 전기적 신호가 포함된다. 광학적 신호를 검출하는 경우, 보통 여기광을 상기 프로브 화합물과 표적 물질의 반응물에 조사하고, 그로부터 방사되는 방사광을 측정함으로써 표적 물질의 존재 여부를 검출한다.
특히 최근에는 마이크로어레이를 이용한 분석 방법이 널리 이용되고 있다. 마이크로어레이는 특정 분자가 기판 상에 일정한 면적에 고밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다. 이러한 마이크로어레이에는 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 마이크로어레이가 포함된다. "폴리뉴클레오티드 마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성하거나, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법(스팟팅(spotting) 법이라고도 한다)에 의하여 고정화될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다.
종래 광학적 분석 방법에 사용되는 기판은 통상 기판의 표면에 아무런 처리가 되어 있지 않거나, 얻어지는 신호의 민감도(signal-to-noise)를 높이기 위하여 격자를 사용한 경우가 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,483,096호에는 원형 격자 구조(circular grating structure)를 사용함으로써, 여기광과 방사광을 분리함으로써 신호의 민감도를 증가시키는 방법을 제공하고 있다.
그러나, 이러한 종래 기술은 격자를 형성시키는 데에 많은 비용이 소요되며, 측정되는 방사광은 가이드된 방사광으로서 그 강도가 상대적으로 낮다는 문제점이 있었다. 따라서, 신호의 민감도를 높여야하는 요구는 여전히 남아 있었다. 이에 본 발명자들은 예의 연구하던 중 예기치 않게 기판 상에 산화막을 형성시킴으로써 신호의 강도를 증가시킬 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 산화막을 갖는 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 산화막을 갖는 기판을 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 기판을 포함하는 광학적 센서를 제공하는 것이다.
본 발명은 산화막을 갖는 것을 특징으로 하는 표적 물질을 광학적으로 검출하는데 사용되는 기판을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 표적 물질을 광학적으로 검출하는데 사용되는 기판이면 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 기판은 예를 들면, 마이크로어레이 및 ELISA 용 기판이 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판의 재질은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것이 사용될 수 있다. 상기 기판의 재질은 예를 들면, 보로실리케이트 유리 및 보로알루미노실리케이트를 포함한 유리, 실리콘 및 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드 및 폴리스티렌과 같은 플라스틱 물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 산화막은 사용되는 여기광의 파장에 따라 달라질 수 있다. 상기 산화막의 두께는 바람직하게는, 500-1500 Å이다. 이러한 산화막을 기판 상에 형성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 산화막을 형성시키는 방법의 일예는, 실리콘 재질의 기판 상에 융합 실리카(fused silica)(SiO2)를 플라마 증기 증착법(PECVD)에 의하여 침적시키는 것이다. 산화막을 형성시키는 방법의 또다른 일예는, 실리콘 재질의 기판 상에 융합 실리카(fused silica)(SiO2)를 스핀 코팅에 의하여 균일하게 코팅하는 것이다. 이러한 산화막은 여기광의 강도를 증가시키기 위하여 사용되는 것이다. 산화막이 여기광의 강도를 증가시키는 기작은 산화막의 표면으로부터 반사되는 여기광과 상기 산화막을 통과하여 굴절된 다음 기판에 의하여 반사되는 여기광이 보강 간섭을 일으킴으로써 이루어지는 것으로 여겨지나, 이러한 이론에 한정되는 것은 아니다. 도 1은 본 발명의 산화막(4)을 갖는 기판(2)의 일예를 도식적으로 나타낸 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 기판에 프로브 물질을 고정화하는 단계;
상기 고정화된 프로브 물질에 표적 물질을 반응시키는 단계;
상기 반응물에 여기광을 조사하는 단계; 및
상기 여기광에 의하여 상기 반응물로부터 방사되는 방사광을 측정하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 기판은 표적 물질의 광학적 검출 방법에 사용되는 기판이면 어느 것이 사용될 수 있다. 여기서 "광학적 검출 방법"이란, 프로브 물질과 표적 물질의 특이적 반응을 광학적 신호로 변환하고, 이 광학적 신호를 측정함으로써 표적물질을 검출하는 방법을 말한다. 상기 기판에는 예를 들면, 폴리 뉴클레오티드 및 단백질 마이크로어레이용 기판이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 "프로브 물질"이란 기판 상에 고정화되어 표적 물질과 특이적으로 결합하는 물질을 말한다. 상기 프로브 물질에는 예를 들면, 표적 물질이 폴리뉴클레오티드인 경우 그와 상보적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 표적 물질이 단백질인 경우 그와 특이적으로 결합하는 리간드, 항원, 또는 항체 등이 될 수 있다. 본 발명의 표적물질은 광학적 활성 물질로 표지되어 있거나 그렇지 않을 수 있다. 광학적 활성 물질로 표지되어 있지 않을 경우에는, 상기 표적물질과 특이적으로 결합하고 광학적 물질로 표지되어 있을 수 있다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신(fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 기판을 포함하는 광학적 표적 물질 센서를 제공한다. 본 발명의 광학적 표적 물질 센서는 바람직하게는, 본 발명의 상기 기판; 감지될 표적 물질을 침적시키는 수단; 여기광을 조사하는 수단; 및 상기 여기광에 의하여 표적 물질로부터 방사되는 방사광을 검출하는 수단을 포함하는 것일 수 있다. 여기에서 감지될 표적 물질을 침적시키는 수단은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, nl 또는 ㎕ 단위 소량의 시료를 주입하는 자동피펫 및 흡입 수단 등이 포함될 수 있다. 상기 여기광을 조사하는 수단 및 방사광을 검출하는 수단은 광원과 그를 검출하기 위한 검출기를 말하는 것으로, 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서 실리콘 기판 상에 500 ∼ 2000 Å의 두께의 SiO2 층을 형성하고, 커플링제를 결합시킨 다음, 포르브 폴리뉴클레오티드를 고정화한 마이크로어레이를 제조하였다. 다음으로, 산화막 두께가 검출되는 신호에 미치는 영향을 확인하기 위하여 제조된 각각의 마이크로어레이에 대하여 표지된 표적 핵산을 반응시킨 다음 여기광을 가하고, 그로부터 발생하는 방사광을 측정하였다.
1. 기판 상에 산화막의 형성
기판은 실리콘 재질을 사용하였다. 셀크론사의 퍼니스 SVF-200 기기를 이용하여 열산화 방식(Thermal oxidation)으로 기판에 다양한 두께의 산화막을 형성하였다. 산화막의 두께는 500 ∼ 2000Å가 되도록 하였다.
산화막의 두께는 NANOMETTICS 사의 NANOSPEC Model AFT 200을 이용하여 측정하였다. NANOSPEC 장비는 실리콘 웨이퍼에 빛이 들어왔을 때 일부의 빛은 웨이퍼 산화막에 의하여 반사되고, 일부는 통과해서 실리콘에서 반사되는 원리를 이용하여 산화막의 두께를 측정하는 장비이다. 산화막의 두께는 산화막으로부터 반사된 빛과 실리콘에서 반사된 빛의 위상차이를 이용하여 측정한다. 산화막의 두께는 NANOSPEC 장비의 샘플 스테이지 위에 웨이퍼를 올려 놓고 웨이퍼 상의 5∼6 포인트에 대하여 측정된 평균 두께가 각 수치에 해당되는 것을 확인한 다음, 코팅에 이용하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
2. 형광 염료 물질의 코팅 및 산화막 두께가 형광 광도에 미치는 영향 확인
먼저, 표면 처리 전에 기판을 주의 깊게 세정하였다. 세정은 순수 아세톤과 물로 수행하고, 다음으로 과산화수소 및 황산(1:3)으로 이루어진 피란하(piranha) 용액을 사용하여 유기 오염물을 제거하였다. 마지막으로, 많은 양의 물과 아세톤으로 씻어 낸 다음, 건조하였다. 상기 기판 세정 과정은 반도체 제조 공정에서 이용되는 웨트 스테이션(wet station)을 이용하였으며, 피라나 용액은 황산조를 이용하였으며, 물로 씻어내는 과정은 QDR이라는 공정을 이용하였다. 각각의 기판을 테플론 재질의 실리콘 웨이퍼 캐리어에 고정하여 세정공정을 수행하였다. 세정이 끝난 기판은 스핀 드라이를 이용하여 건조하였다.
세정 직 후, 에탄올 중의 GAPS(감마-아미노프로필트리에톡시 실란)(γ-aminopropyltriethoxy silane) 용액(농도 20%(v/v)) 또는 GAPDES(감마-아미노프로필디에톡시 실란) 용액(농도 20%(v/v))을 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 CEE 사의 스핀 코터 모델 CEE 70을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120 ℃에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 건조가 완료된 기판은 실험을 위해 정사각형이나 직사각형으로 잘라 이용하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
상기 실란화 기판 상에 플루오레신(fluorescein)(0.05 g/ 10ml)을 코팅하였다. 플루오레신 코팅은 침지 방법으로 수행하였다. 먼저, DMF 용액에 플루오레신을 녹여 침지 용액(0.05g fluorescein/10 ml)을 제조하였다. 침지 용액과 기판을 반응 용기에 넣고 40 ℃에서 120 분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 침지 용액으로부터 기판을 꺼낸 다음 세정하였다. 세정은 DMF 3회, 메탄올 3회 수행하였으며, 각각의 1회 과정은 10분 동안 진행하였다. 세정이 끝난 기판은 건조한 뒤 기판에 반응한 플루오레신 양을 Axon 사의 GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 정량하였다. 스캐닝은 532 nm의 빛을 조사하고 570 nm에서 형광 강도를 측정하여 얻었다.
그 결과 산화막의 두께가 각각 10 Å, 500 Å, 1000 Å, 1500 Å 및 2000 Å이고 커플링제로서 GAPS를 사용한 경우, 형광 강도는 각각 90 a.u., 5600 a.u., 17600 a.u., 4000 a.u. 및 500 a.u.이었다. 또한, 산화막의 두께가 각각 10 Å, 500 Å, 1000 Å, 1500 Å 및 2000 Å이고 커플링제로서 GAPDES를 사용한 경우, 형광 강도는 각각 60 a.u., 3200 a.u., 9000 a.u., 4200 a.u. 및 600 a.u.이었다(도 2 참조). 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 형광강도는 산화막의 두께가 1000 Å일때가 가장 강하였으며, 산화막이 형성되지 않은 경우에 비하여 약 200 배 강하였다. 또한, 형광강도는 커플링제로서 GAPDES를 사용한 경우에 비하여 GAPS를 사용한 경우가 더 강하였다.
3. 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조 및 산화막의 두께가 형광 강도에 미치는 영향
상기 2에서 제조된 산화막의 두께가 1000 Å이고 GAPS가 코팅된 기판 상에 프로브 폴리뉴클레오티드를 고정화하고, Cy-3로 표지된 표적 폴리뉴클레오티드를 혼성화 반응시킨 다음, 532 nm에서 형광을 측정하였다.
먼저, 프로브 폴리뉴크레오티드의 고정화는 상기 기판에 폴리뉴클레오치드를 스폿팅 공정에 의하여 수행하였다. 프로브 폴리뉴크레오티드를 100 mM NaHCO3 (pH 9.0) 용액에 첨가하고 교반하여 37 ℃에서 1 시간 동안 방치한 다음, 이를 스폿팅 용액으로 사용하였다. 상기 스폿팅 용액을 기판 위에 스폿팅한 후, 1 시간 동안 70 ℃의 40 % 상대습도의 습한 챔버(wet chamber)에서 방치하였다. 배경 노이즈의 제어(background control)에 필요한 공정, 즉 표적 핵산이 유리 표면에 부착하지 않도록 하기 위해 스폿팅되지 않은 위치의 기판 표면 아민기가 음전하를 띄도록 반응을 수행하고, 건조기에 보관하였다. 상기 제작된 기판, 즉 DNA 칩에 Cy-3로 표지된 표적 폴리뉴클레오티드를 혼성화 반응시킨 다음, 532 nm에서 형광을 측정하였다.
그 결과를 도 3과 4에 나타내었다. 도 3은 프로브 폴리뉴클레오티드로서 야생형과 돌연변이형 폴리뉴클레오티드(서열번호 1과 2)를 고정화하고, 여기에서 표적 폴리뉴클레오티드(서열번호 3)를 혼성화하여 얻은 결과이다. 도 3에서 빨간색은 완전매치 혼성화 결과이고, 노란색은 미스매치 혼성화 결과이다.
도 4는 프로브 폴리뉴클레오티드로서 MODY 3 당뇨병 관련 프로브 폴리뉴클레 오티드 (서열번호 4 내지 79)를 고정화하고, 여기에서 표적 폴리뉴클레오티드를 혼성화하여 얻은 결과이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) (GAPDH)를 코딩하는 유전자를 사용하였다. 도 5는 대조군으로서 산화막을 갖지 않는 기판을 이용한 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 산화막이 형성되지 않은 기판을 사용하는 경우는 산화막이 형성된 기판을 사용하는 경우(도 4 참조)에 비하여 현저히 낮은 신호를 얻었다.
본 실시예에서 나타낸 바와 같이, 산화막을 형성한 기판을 갖는 마이크로어레이를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 우수한 형광 신호를 얻을 수 있었다.
본 발명에 따른 산화막을 갖는 기판은 마이크로에레이 및 ELISA 기판에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 표적 물질의 검출 방법에 따르면, 높은 신호 강도(signal-to-noise)를 얻을 수 있어 높은 검출 민감도를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 광학적 센서에 의하면, 높은 민감도로 표적 물질을 검출하는데 사용할 수 있다.
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<223> probe oligonucleotide
<400> 79
ttgggggggc agt 13
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 산화막을 갖는 기판에 프로브 물질을 고정화하는 단계;상기 고정화된 프로브 물질에 광학적 활성물질로 표지되어 있는 표적 물질을 반응시키는 단계;상기 반응물에 여기광을 조사하는 단계; 및상기 여기광에 의하여 상기 반응물로부터 방사되는 방사광을 측정하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법으로서, 상기 산화막의 두께는 500-1500 Å인 방법.
- 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질인 방법.
- 두께가 500-1500 Å인 산화막을 갖는 기판;광학적 활성 물질로 표지되어 있는 감지될 표적 물질을 침적시키는 수단;여기광을 조사하는 수단; 및상기 여기광에 의하여 표적 물질로부터 방사되는 방사광을 검출하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적 표적 물질 센서.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질인 센서.
- 제8항에 있어서, 상기 기판의 재질은 실리콘 또는 유리인 센서.
- 제5항에 있어서, 상기 기판의 재질은 실리콘 또는 유리인 방법.
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