CZ20032005A3

CZ20032005A3 - Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase

Info

Publication number: CZ20032005A3
Application number: CZ20032005A
Authority: CZ
Inventors: Steven S. Carroll; Malcolm Maccoss; David B. Olsen; Balkrishen Bhat; Neelima Bhat; Phillip Dan Cook; Anne B. Eldrup; Thazha P. Prakash; Marija Prhavc; Quanlai Song
Original assignee: Merck & Co., Inc.; Isis Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2001-01-22
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2004-04-14
Also published as: EP1355916B1; JP2004532184A; EP1707571A1; PE20020823A1; WO2002057287A3; CA2434386C; HUP0400726A3; HK1066014A1; EP2399588A1; EP1539188A4; US7202224B2; US20060264390A1; US7125855B2; BR0206614A; EA200300819A1; CY1109012T1; CA2433878C; NO20033289D0; CN1498221A; AU2002243791B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů, jejich syntézy a jejich použití jako inhibitorů RNA-dependentní virové RNA-polymerázy. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou inhibitory RNA-dependentní RNA-virové replikace a jsou vhodné pro léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce. Zvláště se hodí jako inhibitory NS5B-polymerázy viru hepatitidy C (HCV), jako inhibitory HCV replikace a pro léčbu infekce hepatitidy (virového zánětu jater) typu C.

Dosavadní stav techniky

Infekce viru hepatitidy C (HCV) je hlavním zdravotním problémem, vedoucím k chronickému onemocnění jater, jako je cirhóza a hepatocelulární karcinom, u podstatného počtu infikovaných jedinců, který se odhaduje na 2 až 15 % světové populace. V samotných Spojených Státech se podle údajů úřadu U.S. Center for Disease Control odhaduje 4,5 miliónů infikovaných lidí. Podle Světové zdravotnické organizace je celosvětově více než 200 miliónů infikovaných jedinců, přičemž každý rok jsou infikovány 3 až 4 milióny lidí. Po infikování přibližně u 20 % lidí virus zmizí, ale u ostatních HCV přežívá v játrech. U 10 až 20 % chronicky nakažených jedinců nakonec vznikají cirhóza nebo rakovina, ničící játra. Virové onemocnění se přenáší parenterálně infikovanou krví a krevními produkty, kontaminovanými jehlami či sexuálně a rovněž vertikálně od infikovaných matek nebo matek přenašeček na plod. Současné léčby HCV infekce, které se omezují na imunoterapii rekombinantním interferonem alfa buď samotným, nebo v kombinaci s nukleosidovým analogem ribavirinem, mají omezený klinický účinek. Nadto vůči HCV neexistují vakcíny. Z těchto důvodů je naléhavě

potřebné vytvořit zlepšená léčebná činidla pro účinnou léčbu chronické infekce HCV.

Dosavadná stav techniky, týkající se léčby infekce HCV, byl shrnut v následujících publikacích, které lze uvést jako odkazy: B. Dymock se spoluautory: Novel approaches to the treatment of hepatitis C virus infection, Antiviral Chemistry & Chemotherapy 11, 79-96, 2000; H. Rosen se spoluautory: Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies, Molecular Medicine Today 5, 393-399, 1999; D. Moradpour se spoluautory: Current and evolving therapies for hepatitis C, European J. Gastroénterol. Hepatol 11, 1189-1202, 1999; R. Bartenschlager: Candidate Targets for Hepatitis C Virus-Specific Antiviral Therapy, Intervirology 40, 378-393, 1997; G. M. Lauer a B. D. Walker: Hepatitis C Virus Infection, N. Engl. J. Med. 345, 41-52, 2001;

B. W. Dymock: Emerging Therapies for hepatitis C virus infection, Emerging Drugs 6, 13-42, 2001; a C. Crabb: Hard-Won Advances Spark Excitement about Hepatitis C, Science 506-507, 2001. Obsahy těchto publikací jsou zde uvedeny v celé své úplnosti jako odkaz.

K léčbě HCV infekcí byly použity různé přístupy, zahrnující inhibici virové serinproteinázy (NS3 proteázy), helikázy a RNA-dependentní RNA-polymerázy (NS5B), stejně jako vývoj vakcíny.

Virion HCV je opouzdřený RNA virus s pozitivním (kódujícím) vláknem RNA, mající genomovou sekvenci jednoduchého oligoribonukleotidu o přibližně 9 600 bázch, která kóduje polyprotein, tvořený přibližně 3 010 aminokyselinami. Proteinový produkt genu HCV sestává ze strukturních proteinů C, E1 a E2 a z nestrukturních proteinů NS2, NS3, NS4A a NS4B, a NS5A a NS5B. Nestrukturní (NS) proteiny zřejmě poskytují katalytický aparát pro virovou replikaci. Proteáza NS3 uvolňuje NS5B, RNA-dependentní RNA-polymerázu z polyproteinového řetězce. NS5B polymeráza viru HCV je vyžadována pro syntézu • ·

dvouvláknové RNA z jednovláknové virové RNA, která slouží jako templát v replikačním cyklu HCV. NS5B polymeráza je tedy považována za klíčovou složku replikačního komplexu HCV (viz K. Ishi se spoluautory: Expression of Hepatitis C Virus NS5B Protein: Characterization of Its RNA Polymerase Activity and RNA Binding, Hepatology 29, 1227-1235, 1999 a V. Lohmann se spoluautory,

Biochemical and Kinetic Analyses of NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase of the Hepatitis C Virus, Virology 249, 108-118, 1998). Inhibice NS5B polymerázy HCV zabraňuje vytváření dvojvláknové RNA viru HCV a představuje proto atraktivní přístup k vývoji antivirové léčby specifické vůči HCV.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu a jejich určité deriváty jsou účinnými inhibitory RNA-dependentní RNA-virové replikace a zejména, replikace HCV. 5Ctrifosfátové deriváty těchto nukleosidových sloučenin jsou inhibitory RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zvláště NS5B polymerázy HCV. Nynější nukleosidové sloučeniny a jejich deriváty jsou vhodné k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště infekce HCV.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnutí nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů, které jsou vhodné jako inhibitory RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zejména jako inhibitory NS5B polymerázy HCV.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů, které jsou vhodné jako inhibitory replikace RNA-dependentního RNA-viru a zejména jako inhibitory replikace viru hepatitidy C.

• ·

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů, které jsou vhodné k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce a zejména k léčbě infekce HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, obsahujících nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, obsahujících nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu, pro použití jako inhibitory RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zejména jako inhibitory NS5B polymerázy HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, které obsahují nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu, pro použití jako inhibitory RNA-dependentní RNA-virové replikace a zejména jako inhibitory replikace HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, obsahujících nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu, pro použití k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště k léčbě infekce HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, obsahujících nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu v kombinaci s dalšími činidly účinnými vůči RNA-dependentnímu RNA-viru a zvláště vůči HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu inhibice RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zvláště inhibice NS5B polymerázy HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu léčby RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště léčby infekce HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu léčby RNA-dependentní RNA-virové infekce v kombinaci s dalšími činidly účinnými vůči RNA-dependentnímU RNA-viru a zvláště léčby infekce HCV v kombinaci s dalšími činidly účinnými vůči HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů a farmaceutických prostředků s jejich obsahem pro použití jako léčiva k inhibici RNA-dependentní RNA-virové replikace a/nebo pro léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště pro inhibici replikace HCV a/nebo pro léčbu infekce HCV.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití nukleosidových sloučenin a jejich určitých derivátů podle předkládaného vynálezu, stejně jako farmaceutických prostředků s jejich obsahem pro výrobu léčiva k inhibici RNA-dependentní RNA-virové replikace a/nebo k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště pro inhibici replikace HCV a/nebo pro léčbu infekce HCV.

Tyto a další předměty předkládaného vynálezu budou zřejmější z podrobného popisu, který následuje.

Předkládaný vynález se týká sloučenin o strukturním vzorci I, který má následující stereochemické uspořádání:

(O nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole;

přičemž R¹ je C₂.₄alkenyl, C₂.₄ alkynyl nebo C_V4 alkyl, kde alkyl je buď nesubstituovaný, nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C_V4 alkoxyskupinou, C_V4 alkylthioskupinou, nebo 1-3 fluorovými atomy;

R² je atom vodíku, fluoru, hydroxyskupina, merkaptoskupina, CV4 alkoxyskupina, nebo CV4 alkyl; nebo R¹ a R² společně s uhlíkovým atomem, na nějž jsou připojeny, vytvářejí 3-6 členný nasycený monocyklický kruhový systém, volitelně obsahující heteroatom, zvolený z atomu kyslíku, síry a NC0_₄ alkylu;

R³ a R⁴ jsou každý nezávisle zvolené ze skupiny, sestávají z vodíkového atomu kyanoskupiny, azidoskupiny, halogenu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, aminoskupiny, C^alkoxyskupiny, C₂.₄alkenylu, C₂.₄alkynylu a C₁.₄alkylu, kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C₁.₄alkoxyskupinou, C_V4alkylthioskupinou nebo 1-3 atomy fluoru;

R⁵ je vodíkový atom, C₁.₁₀alkylkarbonyl, P₃O₉H₄, P₂O₆H₃ nebo P(O)R¹³R¹⁴;

- 7 R⁶ a R⁷ jsou každý nezávisle vodíkový atom, methylová skupina, hydroxymethylová skupina nebo fluormethylová skupina;

R⁸ je vodíkový atom, C₁.₄alkyl, C₂.₄alkynyl, halogenový atom, kyanoskupina, karboxyskupina, C₁.₄alkyloxykarbonylová skupina, azidoskupina, aminoskupina, C₁.₄alkylaminoskupina, diíC^alkyOaminoskupina, hydroxyskupina, C.,.₆alkoxyskupina, C^g alky Ithioskupi na, C^galkylsulfonylová skupina, (C^ alkyl)₀.₂aminomethylová skupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, C₁.₄alkylu a C^alkoxylu;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, nitroskupina, C13alkyl, NHCONH2, CONR¹²R¹², CSNR¹²R¹², COOR¹²· C(=NH)NH2, hydroxyskupina, C^alkoxyskupina, aminoskupina,

C^alkylaminoskupina, dKC^alkyljaminoskupina, halogenový atom, (1,3-oxazol-2-yl), (1,3-thiazol-2-yl), nebo (imidazol-2-yl); kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 3 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, aminoskupiny, hydroxyskupiny, karboxyskupiny a (\₃ alkoxyskupiny;

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, hydroxyskupina, halogenový atom, C₁.₄alkoxyskupína, aminoskupina,

C₁_₄alkylaminoskupina, di(C₁.₄alkyl)aminoskupina, C₃.₆cykloalkylaminoskupina, di(C₃.₆cykloalkyl)aminoskupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, C₁.₄alkylu a C^alkoxyskupiny;

každý R¹²je nezávisle vodíkový atom nebo C₁.₆alkyl; a

- 8 R¹³ a R¹⁴ jsou každý nezávisle hydroxyskupina, OCH₂CH₂SC(=O) C₁.₄alkyl, OCH₂O(C=O)OC₁.₄alkyl, NHCHMeC02Me (kde Me = methyl), OCH₂(C₁.₄alkyl)O(C=O) C^alkyl,

O(CH₂)₉CH₃ nebo OCO(CH₂)₁₄CH₃ .

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl a R⁴ je vodíkový atom nebo R⁴je β-methyl a R¹ je vodíkový atom, R² a R³ jsou α-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁵, R⁷, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.

Sloučeniny podle vzorce I jsou vhodné jako inhibitory RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zvláště NS5B polymerázy HCV. Jsou také inhibitory RNA-dependentní RNA-virové replikace a zejména replikace HCV. Jsou vhodné pro léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště pro léčbu infekce HCV.

Do rozsahu předkládaného vynálezu rovněž patří farmaceutické prostředky, obsahující sloučeniny samotné nebo v kombinaci s jinými činidly, která jsou aktivní vůči RNA-dependentnímu RNA viru a zvláště vůči HCV, stejně jako způsoby inhibice RNA-dependentní RNA-virové replikace a způsoby léčby RNA-dependentní RNA-virové infekce.

Podrobný popis vynálezu

·· ····

nebo jejích farmaceuticky přijatelné sole;

R² je atom vodíku, fluoru, hydroxyskupina, merkaptoskupina, Cv4 alkoxyskupina, nebo CV4 alkyl; nebo R¹ a R² společně s uhlíkovým atomem, na nějž jsou připojeny, vytvářejí 3-6 členný nasycený monocyklický kruhový systém, volitelně obsahující heteroatom, zvolený z atomu kyslíku, síry a NC0.₄ alkylu;

R³ a R⁴ jsou každý nezávisle zvolené ze skupiny, sestávají z vodíkového atomu kyanoskupiny, azidoskupiny, halogenu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, aminoskupiny, C₁.₄alkoxyskupiny, C₂.₄alkenylu, C₂.₄alkynylu a C₁.₄alkylu, kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C₁.₄alkoxyskupinou, C_V4alkylthioskupinou nebo 1-3 atomy fluoru;

R⁵ je vodíkový atom, C₁.₁₀alkylkarbonyl, P₃O_gH₄, P₂O₆H₃ nebo P(O)R¹³R¹⁴;

- 10 ·· ····

R⁶ a R⁷ jsou každý nezávisle vodíkový atom, methylová skupina, hydroxymethylová skupina nebo fluormethylová skupina;

R⁸ je vodíkový atom, C^alkyl, C₂.₄alkynyl, halogenový atom, kyanoskupina, karboxyskupina, C,.₄alkyloxykarbonylová skupina, azidoskupina, aminoskupina, C₁.₄alkylaminoskupina, di(C₁.₄alky1)aminoskupina, hydroxyskupina, C₁.₆alkoxyskupina, alkyIthioskupina,

C^galkýlsulfonylová skupina, (C_V4 alkyl)₀.₂aminomethylová skupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, C₁.₄alkylu a C₁.₄alkoxylu;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, nitroskupina, C1.3alkyl, NHCONH2, CONR¹²R¹², CSNR¹²R¹², COOR¹²' C(=NH)NH2, hydroxyskupina, C₁.₃alkoxyskupina, aminoskupina, C^alkylaminoskupina, difC^alkylJaminoskupina, halogenový atom, (1,3-oxazol-2-yl), (1,3-thiazol-2-yl), nebo (imidazol-2-yI); kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 3 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, aminoskupiny, hydroxyskupiny, karboxyskupiny a 0^3 alkoxyskupiny;

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, hydroxyskupina, halogenový atom, C^alkoxyskupina, aminoskupina, C₁_₄alkylaminoskupina, di(C₁.₄alkyl)aminoskupina_: C₃.₆cykloalkyl- aminoskupina, di(C₃.₆cykloalkyl)aminoskupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskuspiny, aminoskupiny, C₁.₄alkylu a C₁.₄alkoxyskupiny;

každý R¹²je nezávisle vodíkový atom nebo C.,.₆alkyl; a

• · • ··· • · ·· ····

R¹³ a R¹⁴ jsou každý nezávisle hydroxyskupina, OCH₂CH₂SC(=O) C₁_₄alkyl, OCH₂O(C=O)OC₁.₄alkyl, NHCHMeC02Me )kde Me = methyl), OCH₂(C₁.₄alkyl)O(C=O) C₄.₄alkyl,

Ao'^/^r^/^S(CH₂)r_lC^H3 ^r

O(CH₂)₉CH₃ ^neb° OCO(CH₂)₁₄CH₃ .

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl a R⁴ je vodíkový atom nebo R⁴je β-methyl a R¹ je vodíkový atom, R² a R³ jsou α-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁶, R⁷, R^s a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.

Sloučeniny podle vzorce I jsou vhodné jako inhibitory RNA-dependentní virové RNA-polymerázy jsou také inhibitory RNA-dependentní RNA-virové replikace a jsou vhodné k léčbě RNAdependentní RNA-virové infekce.

V jednom ztělesnění jsou sloučeninami o strukturním vzorci I sloučeniny o strukturním vzorci II:

nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole;

kde R¹ je C₁.₃alkyl, přičemž alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C^alkoxylem, C₁.₃alkylthioskupinou nebo 1-3 atomy fluoru;

- 12 ·· ·· • · · • · ··· • · · · ·

• 9 · • · · • · · • · · · • · ·· ·· ····

R² je hydroxyskupina, fluorová skupina nebo C₁.₃alkoxyskupina;

R³ je vodíkový atom, halogenový atom, hydroxyskupina, aminoskupina nebo C₁.₃alkoxyskupina;

R⁵ je vodíkový atom, P₃O₉H₄, P₂O₆H₃ nebo PO₃H₂;

R⁸ je vodíkový atom, aminoskupina nebo C₁.₄alkylaminoskupina;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, methylová skupina, halogenový atom nebo CONH₂; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, halogenový atom, hydroxyskupina, aminoskupina, C^alkylaminoskupina, di(C₁.₄alkyl)aminoskupina nebo C₃.₆cykloalkylaminoskupina;

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl, R² a R³ jsou a-.hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.

Ve druhém ztělesnění sloučenin o strukturním vzorci I jsou jsou předkládány sloučeniny o strukturním vzorci II, kde:

R¹ je methyl, fluormethyl, hydroxymethyl, difluormethyl, trifIuormethyI nebo aminomethyl;

R² je hydroxyskupina, fluoroskupina nebo methoxyskupina;

R³ je vodíkový atom, fluoroskupina, hydroxyskupina, aminoskupina nebo methoxyskupina;

R⁵je vodíkový atom nebo P₃O₉H₄;

R⁸je vodíkový atom nebo aminoskupina;

R¹° a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, fluoroskupina, hydroxyskupina nebo aminoskupina;

• · s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl, R² a R³ jsou cc-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.

Ilustrativními, ne však omezujícími příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu o strukturním vzorci I, které jsou vhodné jako inhibitory RNA-dependentní virové RNA polymerázy jsou následující látky:

4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-arbinofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-methylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin,

4-dimethylamino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-cyklopro'pylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidin,

4-amino-7-(2-C-vinyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ď]pyrimidin,

4-amino-7-(2-C-hydroxymethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin,

4-amino-7-(2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-amino-5-methy 1-7-(2-C-methyl-p-D-ri bofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-karboxylová kyselina,

4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin,

4-amino-5-chlor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin,

4-amino-5-fluor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

- 14 • · • · • · · • · ··· • · · • · · · • · · · · ·· ···· • · · · • · · · • · · · · • · · · · ·· ··

2,4-d iam i no-7-(2-C-methy Ι-β-D-ri bof uranosy l)-7H-py rrolo[2,3-c/] py ri m i d i η 2-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin, 2-amino-4-cyklopropylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/] py ri m i d i n,

2-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin-4(3H)-on,

4-amino-7-(2-C-ethyl-P-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-amino-7-(2-C,2-O-dimethyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin,

7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin-4(3H)-on,

2-amino-5-methyl-7-(2-C,2-0-dimethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-ď|pyrimidin,

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-á]pyrimidin,

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-p-D-arabinofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin,

4-amino-2-fluor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin,

4-amino-7-(3-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin, 4-amino-7-{3-C-methyl-p-D-xylofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin, 4-amino-7-(2,4-di-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin, a

4-amino-7-(3-deoxy-3-fluor-2-C-methy1-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrro)o[2,3-c/]pyri m id i n; a odpovídající 5'-trifosfáty;

nebo farmaceuticky přijatelné sole takových látek.

Dalším dokreslením předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, zvolené ze skupiny, sestávající z:

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-arabinofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-ď|pyrimidinu,

- 15 4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-amino-7-(2-C-fluormethyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-amino-5-methyl-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidinu,

4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ďjpyrimidinu,

4-amino-5-chlor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu,

4-amino-5-fluor-7-(2-Č-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu, a

4-amino-7-(2-C,2-O-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-ď]pyriiTiidinu, a odpovídajících 5'- trifosfátů;

nebo farmaceuticky přijatelné sole takových sloučenin.

V jednom ztělesnění předkládaného vynálezu jsou nukleosidové sloučeniny podle tohoto vynálezu vhodné jako inhibitory virové RNA-polymerázy, dependentní (závislé) na pozitivní (kódující) jednovláknové RNA, inhibitory RNA-virové replikace dependentní na pozitivní (kódující) jednovláknové RNA a/nebo pro léčbu RNA-virové infekce dependentní na pozitivní (kódující) jednovláknové RNA. V třídě podle tohoto ztělesnění je na pozitivní jednovláknové RNA dependentním RNA-virem virus Flaviviridae nebo virus Picornaviridae. V podtřídě uvedené třídy je virem Picornaviridae rinovirus, poliovirus (virus poIiomyeIitidy), nebo virus hepatitidy A. V druhé podtřídě uvedené třídy je virus Flaviviridae zvolený ze skupiny, sestávající z viru hepatitidy C, viru žluté zimnice, viru dengue, viru Západního Nilu (West Nile virus), viru japonské encefalitidy, virus Banzi a viru hovězí virové diarey, průjmu (BVDV). V podtřídě této podtřídy je virem Flaviviridae virus hepatitidy C.

- 16 Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu inhibice RNA-dependentní virové RNA-polymerázy, způsobu inhibice RNA-dependentní RNA-virové replikace a/nebo způsobu léčby RNA-dependentní RNA-virové infekce u savce, který to potřebuje, zahrnujícího podávání léčebně účinného množství sloučeniny o strukturním vzorci I takovému savci.

V jednom ztělesnění tohoto aspektu předkládaného vynálezu je RNA-dependentní virovou RNA-polymerázou na pozitivní jednovláknové RNA dependentní virová RNA-polymeráza. Ve třídě tohoto ztělesnění je na pozitivní jednovláknové RNA dependentní virovou RNA-polymerázou flaviviridální virová polymeráza nebo picornaviridální virová polymeráza.

V podtřídě této třídy je picornaviridální virovou polymerázou rinovirová polymeráza, poliovirová polymeráza nebo polymeráza viru hepatitidy A.

V druhé podtřídě této třídy je flaviviridální virová polymeráza zvolena ze skupiny sestávající z polymerázy viru hepatitidy C, polymerázy žluté zimnice, polymerázy viru dengue, polymerázy viru Západního Nilu, polymerázy viru japonské encefalitidy, polymerázy viru Banzi a polymerázy viru hovězí virové diarey (průjmu) (BVDV). V podtřídě této podtřídy je pak virovou flaviviridální polymerázou polymeráza viru hepatitidy C.

V druhém ztělesnění tohoto aspektu předkládaného vynálezu je RNA-dependentní RNA-virovou replikací na pozitivní jednovláknové RNA dependentní RNA-virová replikace. Ve třídě tohoto ztělesnění je na pozitivní jednovláknové RNA dependentní RNA-virovou replikací flaviviridální virová replikace nebo picornaviridální virová replikace. V podtřídě této třídy je picornaviridální virovou replikací rinovirová replikace, poliovirová replikace nebo replikace viru hepatitidy A. V druhé podtřídě této třídy je flaviviridální virová replikace zvolena ze skupiny sestávající z replikace viru hepatitidy C, replikace žluté zimnice, replikace viru dengue, replikace viru Západního Nilu, replikace viru

- 17 ·· ·· ···· • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ·· • ·· ······ · • · · · · · ······ 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 japonské encefalitidy, replikace viru Banzi a replikace viru hovězí virové diarey (BVDV). V podtřídě této podtřídy je flaviviridální virovou replikací replikace viru hepatitidy C.

Ve třetím ztělesnění tohoto aspektu předkládaného vynálezu je RNA-dependentní RNA-virovou infekcí na pozitivní jednovláknové RNA dependentní RNA-virová infekce. Ve třídě tohoto ztělesnění je na pozitivní jednovláknové RNA dependentní RNA-virovou infekcí flaviviridální virová infekce nebo picornaviridální virová infekce. V podtřídě této třídy je picornaviridální virovou infekcí rinovirová infekce, poliovirová infekce nebo infekce viru hepatitidy A. V druhé podtřídě této třídy je flaviviridální virová infekce zvolena ze skupiny, sestávající z infekce viru hepatitidy C, infekce žluté zimnice, infekce viru dengue, infekce viru Západního Nilu, infekce viru japonské encefalitidy, infekce viru Banzi a infekce viru hovězí virové diarey (BVDV). V podtřídě této podtřídy je flaviviridální virovou infekcí infekce viru hepatitidy C.

V předkládané přihlášce vynálezu mají následující výrazy tyto významy:

Výše uváděné alkylové skupiny zahrnují takové alkylové skupiny, které mají označenou délku buď v uspořádání rovného, nebo rozvětveného řetězce. Příkladem takových alkylových skupin jsou methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sekundární butyi, terciární butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, isohexyl a podobně.

Výraz alkenyl by měl označovat alkeny s rovným nebo rozvětveným řetězcem, tvořené celkem 2 až 6 uhlíkovými atomy, nebo jakýmkoliv počtem uhlíkových atomů, patřícím do uvedeného rozmezí (například ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl a podobně).

- 18 • · · ·

Výraz cykloalkyl by měl označovat cyklické kruhy alkanů, tvořené celkem 3 až 8 uhlíkovými atomy, nebo jakýmkoliv počtem uhlíkových atomů, patřícím do uvedeného rozmezí (například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl nebo cyklooktyl).

Výraz cykloheteroalkyl zahrnuje nearomatické heterocykly, obsahující jeden nebo dva heteroatomy, zvolené z dusíku, kyslíku a síry. Příklady 4-6 členných cykloheteroalkylů zahrnují azetidinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, morfolinyl, thiamorfolinyl, imidazolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiofenyl, piperazinyl a podobně.

Výraz alkoxyl se týká alkoxidů s rovným nebo rozvětveným řetězcem o stanoveném počtu uhlíkových atomů (například C₁.₄alkoxyl), nebo o jakémkoliv počtu uhlíkových atomů, který spadá do uvedeného rozmezí [tj. methoxyl (MeO-), ethoxyl, isopropoxyl a podobně].

Výraz alkylthioskupina se týká alkylsulfidů s rovným nebo rozvětveným řetězcem o výše uvedeném počtu uhlíkových atomů (například C.,_₄alkyIthioskupina) nebo o jakémkoliv počtu uhlíkových atomů, který spadá do uvedeného rozmezí [tj. methylthioskupina (MeS-), ethylthioskupina, isopropylskupina a podobně].

Výraz alkylaminoskupina se týká alkylaminů s rovným nebo rozvětveným řetězcem o výše uvedeném počtu uhlíkových atomů (například C^alkylaminoskupina), nebo o jakémkoliv počtu uhlíkových atomů, který spadá do uvedeného rozmezí [tj. methylaminoskupina, ethylaminoskupina, isopropylaminoskupina, t-butylaminoskupina a podobně].

Výraz alkylsulfonyl se týká alkylsulfonů s rovným nebo rozvětveným řetězcem o výše uvedeném počtu uhlíkových atomů (například CL ₆alkyIsulfonyl, nebo o jakémkoliv počtu uhlíkových atomů,

- 19 • ·

který spadá do uvedeného rozmezí [tj. methylsulfonyl (MeSO₂_), ethylsulfonyl, isopropylsulfonyl a podobně].

Výraz alkyloxykarbonyl se týká esterů odvozených od derivátů karboxylových kyselin podle předkládaného vynálezu s rovným nebo rozvětveným řetězcem o výše uvedeném počtu uhlíkových atomů (například C₁.₄alkyloxykarbonyl), nebo o jakémkoliv počtu uhlíkových atomů, který spadá do uvedeného rozmezí [tj. methoxykarbonyl (MeOCO-), ethyloxykarbonyl nebo butyloxykarbonyl].

Výraz aryl zahrnuje fenyl, naftyl a pyridyl. Arylová skupina je volitelně substituována jednou až třemi skupinami nezávisle zvolenými z C₁_₄alkylu, halogenu, kyanoskupiny, nitroskupiny, trifluormethylové skupiny, C₁.₄alkoxylu a C₁.₄alkylthioskupiny.

Výraz halogen zahrnuje halogenové atomy fluoru, chloru, bromu ajodu.

Výraz substituovaný by měl být chápán jako zahrnující násobné stupně substituce uvedeným substituentem. Pokud jsou předkládány nebo nárokovány násobné částice substituentu, může být substituovaná sloučenina nezávisle substituována prostřednictvím jedné nebo více z předkládaných nebo nárokovaných částic substituentu, jednoduše nebo násobně.

Výraz 5'-trifosfát se týká esterového derivátu kyseliny trifosforečné, vázaného na 5'-hydroxylovou skupinu nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu, majícího následující obecný strukturní vzorec III:

kde substituenty R¹ až R¹¹ odpovídají výše uvedené definici. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou také zamýšleny jako zahrnující farmaceuticky přijatelné sole trifosfátového esteru, stejně jako farmaceuticky přijatelné sole 5'-monofosfátových a 5'-difosfátových esterových derivátů o strukturních vzorcích IV a V:

Výraz 5'-(S-acyl-2-thioethyl)fosfát, neboli ŠATE označuje monoesterový nebo diesterový derivát 5'-monofosfátnukleosidového derivátu podle předkládaného vynálezu o strukturních vzorcích VI a VII, stejně jako farmaceuticky přijatelné sole monoesteru.

O

Výraz prostředek, jako ve výrazu farmaceutický prostředek, je používán k zahrnutí produktu, obsahujícího aktivní přísadu (přísady) a inertní přísadu (přísady), které tvoří nosič, stejně jako jakéhokoliv produktu, který je přímo nebo nepřímo výsledkem kombinace, komplexace nebo agregace kterýchkoliv dvou či více z přísad, nebo výsledkem disociace jedné nebo více z přísad, nebo výsledkem jiných typů reakcí či interakcí jedné či více z přísad. V souhlasu s tím farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují jakýkoliv prostředek vytvořený smísením sloučeniny podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelného nosiče.

Výraz podávání sloučeniny by měl být chápán jako způsob poskytnutí sloučeniny podle tohoto vynálezu, nebo prekursoru sloučeniny podle tohotovynálezu, jedinci, který to potřebuje.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu inhibování NS5B polymerázy HCV, inhibování replikace HCV nebo léčby infekce HCV sloučeninou podle předkládaného vynálezu v kombinaci s jedním nebo více z činidel, vhodných pro léčbu infekce HCV. Taková činidla, která jsou aktivní vůči HCV, zahrnují, ne však výlučně, ribavirin, levovirin, viramidin, thymosin a-1, interferon-a, interferon a s navázaným polyethylenglykolem (PEG-interferon-α), kombinaci interferonu a a ribavirinu, kombinaci PEG-interferonu-α a ribavirinu,

kombinaci interferonu α a levovirinu a kombinaci PEG-interferonu-α. a levovirinu.

Interferon-α zahrnuje, ne však výlučně, rekombinantní interferon-a2a (jako je interferon Roferon, dostupný od firmy Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ), PEG-interferon-a.2a (Pegasys™), interferon-a.2b (jako interferon Intron-A, dostupný od firmy Schering Corp., Kenilworth, NJ), PEG-interferon-a2b (Peglntron™), rekombinantní souhlasný (consensus) interferon (jako interferon alphacon-1) a vyčištěný produkt interferonu-cc.

Rekombinantní souhlasný interferon firmy Amgen má značkové jméno Infergen®. Levovirin je L-enantiomer ribavirinu, který vykazoval podobnou imunomodulační aktivitu jako ribavirin. Viramidin představuje analog ribavirinu, předložený ve WO 01/60 379 (ICN Pharmaceuticals).

Podle způsobu uvedeného v předkládaném vynálezu mohou být jednotlivé složky kombinace podávány v průběhu léčby odděleně v různých časech, nebo souběžně, v oddělených formách nebo ve formě jediné kombinace. Nynější vynález by tedy měl být chápán jako zahrnující veškeré takové režimy souběžné nebo střídavé léčby a ve shodě s tím je třeba vykládat výraz podávání. Bude zřejmé, že škála kombinací sloučenin podle tohoto vynálezu s dalšími činidly, vhodnými pro léčbu infekce HCV, zahrnuje v principu jakoukoliv kombinaci s jakýmkoliv farmaceutickým prostředkem pro léčbu infekce HCV.

Pokud je sloučenina podle předkládaného vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelná sůl používána v kombinaci s druhým léčebným činidlem účinným vůči HCV, může být dávka každé sloučeniny bud stejná jako v případě, že je sloučenina použita samotná, nebo může být odlišná.

O 3

- 23 v > 9 3 O © 3 5

3 © 3 0

O 3 © 7

3 0 3 í>'.» O

O

3 0

O 3 3 . O ·

3 ·' O o :· o »

K léčbě infekce HCV mohou být.sloučeniny podle předkládaného vynálezu rovněž podávány v kombinaci s činidlem, kterým je inhibitor N3S serinproteázy HCV. N3S .serinproteáza HCV je důležitým virovým enzymem a byla popsána jako vynikající cíl pro inhibici replikace HCV. Jak inhibitory N3S proteázy HCV na bázi substrátu, tak i tyto inhibitory na bázi jiné sloučeniny jsou popsány ve WO 98/22 496, WO 98/46 630, WO 99/07 733, WO 99/07 734, WO 99/38 888, WO 99/50 230, WO 99/64 442, WO 00/09 543, WO 00/59 929 a GB-2 337 262. N3S proteáza HCV jako cíl pro vývoj inhibitorů replikace HCV a pro léčbu infekce HCV je diskutována v práci B. W. Dymocka, Emerging therapies for hepatitis C virus infection, Emerging Drugs 6, 13-42, 2001.

Ribavirin, levovirin a viramidin mohou projevovat své účinky vůči HCV modulací nitrobuněčných zásob (poolu) guaninových nukleotidů prostřednictvím inhibice nitrobuněčného enzymu inosinmonofosfátdehydrogenázy (IMPDH). IMPDH je enzym limitující rychlost biosyntézy guaninových nukleotidů de novo. Ribavarin se nitrobuněčně snado fosforyiuje a monofosfátový derivát je inhibitorem IMPDH. Inhibice IMPDH tedy představuje jiný užitečný cíl pro objevení inhibitorů replikace HCV. Sloučeniny podle předkládaného- vynálezu mohou tedy být podávány v kombinaci s inhibitorem IMPDH, jako je VX-497, který je předložen ve WO 97/41 211 a ve WO 01/00 622 (Vertex); s jiným inhibitorem IMPDH, jaký byl například předložen ve WO 00/25 780 (Bristol-Myers Squibb); nebo s mofetilem mykofénolátu (viz A. C. Allison a E. M. Eugui, Agents Action 44 (dodatek), 165, 1993. - =

Pro léčbu infekce HCV mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu také , podávány v kombinaci s antivirovým činidlem amantadinem (1 -aminoadamantanem) (úplný‘popis tohoto činidla je uveden v práci J. Kirschbauma, Anál. Profileš Drug Subš; '12, 1-36, 1983). rr- 24 -

Výraz farmaceuticky přijatelný znamená, že nosič, ředidlo, nebo pomocná látka musejí být kompatibilní (slučitelné) s ostatními přísadami v prostředku a nesmějí příjemce takového prostředku poškozovat.

V předkládaném vynálezu jsou zahrnuty také farmaceutické prostředky, obsahující nukleosidové sloučeniny a jejich deriváty podle předkládaného vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem. Jiným příkladem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek vyrobený kombinací kterékoliv ze sloučenin popsaných výše a farmaceuticky přijatelného nosiče. Jiným dokreslením tohoto vynálezu je způsob výroby farmaceutického prostředeku, zahrnujícím kombinaci kterékoliv ze sloučenin popsaných výše a farmaceuticky přijatelného nosiče.

V předkládaném vynálezu jsou zahrnuty také farmaceutické prostředky, vhodné pro inhibici RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zejména NS5B polymerázy HCV, které obsahují účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutické prostředky vhodné pro léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště infekce HCV jsou rovněž zahrnuty v předkládaném vynálezu, stejně jako způsob inhibování RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a zvláště NS5B polymerázy HCV, a také způsob léčby RNA-dependentní RNA-virové replikace, zejména pak replikace HCV. Nadto je předkládaný vynález zaměřen na farmaceutické prostředky, obsahující léčebně účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu v kombinaci s léčebně účinným množstvím jiného činidla, účinného vůči RNA-dependentnímu RNA-viru a zvláště vůči HCV.

Činidla účinná vůči HCV zahrnují, ne však výlučně ribavirin, levovirin, viramidin, thymosin a-1, inhibitor NS3 serinproteázy HCV, interferon-a, interferon-α s navázaným PEG (PEG-interferon-α), zahrnují

- 25 kombinaci interferonu-α a ribavirinu, kombinaci PEG-interferonu-α a ribavirinu, kombinaci interferonu-α a levovirinu a kombinaci PEG-interferonu-α a levovirinu. Interferon-α zahrnuje, ne však výlučně, rekombinantní interferon-a2a (jako je interferon Roferon, dostupný od firmy Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ), interferon-a2b (jako interferon Intron-A, dostupný od firmy Schering Corp., Kenilworth, NJ), PEG interferon-a2b (Peglntron™) rekombinantní souhlasný (consensus) interferon a vyčištěný produkt interferonu-α. Pokud se týká diskuze o ribavirinu a jeho aktivitě vůči HCV, viz práce J. O. Saunderse a S. A. Raybucka, Inosine Therapeutic Potential, Ann. Rep. Med. Chem. 35, 201-210,2000.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje použití nukleosidových sloučenin a jejich derivátů a farmaceutických prostředků, které je obsahují, pro výrobu léčiva k inhibování RNA-dependentní RNA-virové replikace, zejména replikace HCV, a/nebo k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce, zejména infekce HCV. Ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje nukleosidové sloučeniny, jejich deriváty a farmaceutické prostředky obsahující tyto látky, pro použití jako léčivo k inhibování RNA-dependentní RNA-virové replikace, zejména replikace HCV, a/nebo k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce a zvláště infekce HCV.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují jako aktivní přísadu sloučeninu o strukturním vzorci I, nebo farmaceuticky přijatelnou sůl takové sloučeniny a mohou rovněž obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič a volitelně další léčebné přísady.

Takové prostředky zahrnují prostředky vhodné pro orální, rektální, místní, parenterální podání (včetně subkutánního, intramuskulárního a

intravenózního podání), okulární (oftalmické), pulmonární (inhalace nosem nebo ústy), nebo nasální podávání, ačkoliv nejvhodnější cesta podání v jakémkoliv danném případě bude závislá na povaze a závažnosti léčeného stavu a na povaze aktivní přísady. Ty mohou být . výhodně přítomny v jednotkové formě dávkování a mohou být výhodně připraveny jakýmkoliv z postupů, dobře známých v oboru farmacie.

Při praktickém použití mohou být sloučeniny o strukturním vzorci I * kombinovány jako aktivní přísada v těsné směsi s farmaceutickým nosičem a to podle běžných farmaceutických slučovacích postupů. Nosič může nabývat velkého množství různých forem v závislosti na formě přípravku požadované pro podávání, například orální nebo parenterální (včetně intravenózní). Při přípravě prostředků pro orální formu dávkování lze v případě tekutých orálních prostředků, jako jsou například suspenze, léčebné nápoje a roztoky, použít jakákoliv obvyklá farmaceutická média (nosná prostředí), jako například vodu, glykoly, oleje, alkoholy, příchutě, konzervační látky, barviva a podobně; a v případě pevných orálních prostředků, jako jsou například prášky, tvrdé a měkké tobolky a tablety, lze použít nosiče jako jsou škroby, cukry, mikrokrystalická celulóza, ředidla, granulující činidla, lubrikanty (kluzná činidla), pojivá, dezintegrační činidla (rozvolňovadla) a podobně, přičemž pevným orálním prostředkům se dává přednost před tekutými > prostředky.

Vzhledem ke snadnosti podávání představují tablety a tobolky nejvýhodnější orální formu jednotky dávkování a v tomto případě se %

obvykle používají pevné farmaceutické nosiče. Pokud je to žádoucí, mohou být tablety potahovány standardními vodnými nebo nevodnými postupy. Takové prostředky a přípravky by měly obsahovat alespoň 0,1 % aktivní sloučeniny. Procentní množství aktivní sloučeniny se v takových prostředcích ovšem může lišit a výhodně může představovat přibližně 2 % až 60 % hmotností jednotky dávkování. Množství aktivní

- 27 ··

sloučeniny je v takových léčebně výhodných prostředcích takové, aby bylo získáno účinné dávkování. Aktivní sloučeniny mohou být rovněž podávány intranasálně, jako například tekutě kapky nebo spreje.

Tablety, pilulky, tobolky a podobně mohou také obsahovat pojivo, jako tragakantovou gumu, klovatinu, kukuřičný škrob nebo želatinu; přídavné látky jako fosforečnan vápenatý; rozvolňovací činidlo jako kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselinu alginovou; lubrikační (kluzné) činidlo jako stearát hořečnatý a a sladidlo jako sacharózu, laktózu nebo sacharin. Pokud je formou jednotky dávkování tobolka, může kromě materiálu výše uvedeného typu obsahovat tekutý nosič, jako je olej.

Jako potahovací látky, nebo látky pozměňující fyzikální formu jednotky dávkování, mohou být přítomné různé další materiály. Tablety mohou být například povlékány šelakem, cukrem nebo oběma těmito látkami. Sirup nebo léčebný nápoj může kromě aktivní přísady obsahovat sladidlo jako sacharózu, konzervační látky jako methylparaben a propylparaben a rovněž barviva a příchutě, jako jsou třešňová nebo pomerančová příchuť.

Sloučeniny o strukturním vzorci I mohou být podávány také parenterálně. Roztoky nebo suspenze těchto aktivních sloučenin mohou být připraveny ve vodě vhodně smíchané s povrchově aktivní látkou, jako je hydroxypropylcelulóza. V glycerolu, tekutých polyethylenglykolech a ve směsích takových látek v olejích mohou být rovněž připraveny disperze. Za běžných podmínek skladování a použití takové přípravky rovněž obsahují konzervační látku k prevenci růstu mikroorganismů.

Farmaceutické formy, vhodné pro injekční použití, zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro aktuální přípravu

sterilních injikovatelných roztoků nebo disperzí. Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být tekutá v takovém rozsahu, aby ji bylo možné snadno aplikovat injekční stříkačkou. Musí být stálá za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna vůči kontaminaci mikroorganismy, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium, obsahující například vodu, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a tekutý polyethylenglykol), vhodné směsi takových látek a rostlinné oleje.

K poskytnutí účinné dávky sloučeniny podle předkládaného vynálezu savci a zejména člověku může být použit jakýkoliv vhodný způsob podávání. Je tedy možné použít například orální, rektální, místní, parenterální, okulární, pulmonární, nasální a podobný způsob podávání. Formy dávkování zahrnují tablety, pastilky, disperze, suspenze, roztoky, tobolky, krémy, masti, aerosoly a podobně. S výhodou se sloučeniny o strukturním vzorci I podávají orál^ně^--·'''^

Rozsah dávkování pro orální podávárú sé u lidí pohybuje od 0,01 do 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti v dělených dávkách. V jednom ztělesnění je rozsah dávkování od 0,1 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti v dělených dávkách. V jiném ztělesnění je rozsah dávkování od 0,5 do 20 mg/kg tělesné hmotnosti v dělených dávkách. Pro orální podávání jsou prostředky s výhodou poskytnuty ve formě tablet nebo tobolek, obsahujících 1,0 až 1 000 mg aktivní přísady, zvláště 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 750, 800, 900, 1 000 mg aktivní přísady pro symptomatickou úpravu dávkování u léčeného pacienta.

Použitá účinná dávka aktivního činidla se může lišit v závislosti na konkrétní použité sloučenině, na způsobu podávání, na léčeném stavu a na závažnosti léčeného stavu. Taková dávka může být snadno

- 29 44 44 · ·· ·· 4444

4 4 44 4 4 ·· · • · ··· · · · · · · • · 4 ·· ·· · · · · ·

4444 444 4444

4 4 444 44 44 44 stanovena odborníkem v oboru. Dávkovači režim může být upraven pro poskytnutí optimální léčebné odpovědi.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují jedno nebo více z asymetrických center a mohou se tedy vyskytovat jako racemáty, racemické směsi, samostatné enantiomery, diastereomerní směsi a jako jednotlivé diastereomery. Předkládaný vynález je zamýšlen k zahrnutí nukleosidových sloučenin, majících ' stereochemickou konfiguraci pětičlenného furanosového kruhu β-D, jak je znázorněno na níže uvedeném strukturním vzorci. To znamená, že se jedná o nukleosidové sloučeniny, jejichž substituenty na uhlíku v poloze 1 a v poloze 4 (C-1 a C-4) pětičlenného furanosového kruhu mají β-stereochemickou konfiguraci (orientaci horní, jak je znázorněno tučnou čarou).

Některé ze zde popsaných sloučenin obsahují olefinové dvojné vazby a pokud není stanoveno jinak, předpokládá se, že zahrnují geometrické izomery typu E i Z.

Některé ze zde popsaných sloučenin mohou existovat jako tautomery, jako například keto-enolové tautomery. Mezi sloučeniny o strukturním vzorci I patří jak individuální tautomery, tak i jejich směsi. Příklad keto-enolových tautomerů, které patří mezí sloučeniny podle předkládaného vynálezu, je uveden níže:

Sloučeniny o strukturním vzorci I mohou být rozděleny na příslušné jednotlivé diastereoizomery například trakční krystalizací z vhodného rozpouštědla, například methanolu nebo ethylacetátu či ze směsi obou těchto rozpouštědel, nebo prostřednictvím chirální chromatografie, využívající opticky aktivní stacionární fáze.

Alternativně může být kterýkoliv stereoizomer sloučeniny o strukturním vzorci I získán stereospecifickou syntézou za použití opticky čistých výchozích materiálů, nebo reakčních činidel o známé konfiguraci.

Stereochemické uspořádání substituentů v polohách C-2 a C-3 furanosového kruhu sloučenin podle předkládaného vynálezu o strukturním vzorci I je znázorněno vlnovkami, které naznačují, že substituenty R¹, R², R³ a R⁴ mohou mít buď konfiguraci a (substituent dolní) nebo β (substituent horní), a to nezávisle na sobě. Vyznačení stereochemického uspořádání tučnou čarou jako v polohách C-1 a C-4 furanosového kruhu určuje, že substituent má konfiguraci β (substituent horní).

(0

	• ·	• ·	•	··	• ·		• ·· ·
•	•	Φ	• · ·	•	•	•	•
•	•	···	• ·	•	•	•	•
•
•	• • ·	• · • ·	• · • · ·	• • ·	• ··	•	• · • ·

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány ve formě farmaceuticky přijatelné sole. Výraz farmaceuticky přijatelná sůl se týká solí, připravených z farmaceuticky přijatelných netoxických baží nebo kyselin, zahrnujících anorganické či organické báze a anorganické či organické kyseliny. Sole bazických sloučenin, které jsou zahrnuty pod výraz farmaceuticky přijatelná sůl, se týkají netoxických solí sloučenin podle předkládaného vynálezu, které jsou obecně připraveny reakcí volné báze s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou.

Reprezentativní sole bazických sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují, ne však výlučně, následující sole: octan, benzensuifonát, benzoát, hydrogenuhličitan, hydrogensíran, hydrogenvinan (hydrogentartarát), boritan, bromid, kamsylát, uhličitan, chlorid, klavulanát, citrát, dihydrochlorid, edetát (sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové), edisylát, estolát, esylát, fumarát, gluceptát, glukonát, glutamát, glykollylarsanilát, hexylresorcinát, hydrabamin, hydrobromid, hydrochlorid, hydroxynaftoát, jodid, isothionát, laktát, laktobionát, laurát, malát, maleát, mandelát, mesylát, methylbromid, methyi.nitrát, methylsulfát, mukát, napsylát, nitrát (dusičnan), amoniovou sůl N-methylglukamínu, oleát, oxalát, pamoát (embonát), palmitát, panthotenát, fosfát/difosfát, polygalakturonát, salicylát, stearát, sulfát (síran), zásaditý octan, sukcinát, tannát, tartarát (vinan), teoklát, tosylát, triethyIjodid a valerát. Nadto pokud sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují kyselou částici, vhodné farmaceuticky přijatelné sole takových sloučenin zahrnují, ne však výlučně, sole odvozené od anorganických bází jako jsou hlinité, amonné, vápenaté, měďnaté, železité, železnaté, lithné, horečnaté, manganaté, manganité, draselné, sodné, zinečnaté a podobné sole. Zvláště se pak upřednostňují amonné, vápenaté, hořečnaté, draselné a sodné sole.

Sole, odvozené od farmaceuticky přijatelných netoxických bází, zahrnují sole primárních, sekundárních a terciárních aminů, cyklických ·· · ·· ·· ···· · 4 444444 · • · ··· · 4 4 · * 4 • · · ·· 4 · 4·· 4 4 aminů a zásaditých iontově výměnných pryskyřic jako jsou arginin, betain, kofein, cholin, Ν,Ν-dibenzylethylendiamin, diethylamin, 2-diethylaminoethanol, 2-dimethylaminoethanol, ethanolamin, ethylendiamin, N-ethylmorfolin, N-ethylpiperidiη, glukamin, glukosamin, histidin, hydrabamin, isopropylamin, lysin, methylglukamin, morfolin, piperazin, piperidin, polyaminové pryskyřice, prokain, puriny, theobromin, triethylamin, trimethylamin, tripropylamin, tromethamin a podobně.

V případě, že se u sloučenin podle předkládaného vynálezu vyskytují skupiny karboxylové kyseliny (-COOH) nebo alkoholové skupiny, mohou být použity také farmaceuticky přijatelné estery derivátů karboxylové kyseliny jako methylové, ethylové, pivaloyloxymethylové nebo acylové deriváty alkoholů, jako. acetát nebo maleát. Zahrnuty jsou takové estery a acylové skupiny, které jsou v oboru známé modifikací rozpustnosti nebo hydrolytických charakteristik, a to pro použití jako prostředky s prodlouženým uvolňováním nebo jako prekurzory.

Příprava nukleosidovych sloučenin a derivátů podle tohoto vynálezu

Nukleosidové sloučeniny a jejich deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny následujícími syntetickými postupy, které jsou v chemii nukleosidů a nukleotidů dobře známé a používané. Popis syntetických metod, používaných k výrobě sloučenin podle předkládaného vynálezu, lze nalézt v odkazu: Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, vydavatel L. B. Townsend, díl 1-3, Plenům Press, 1988, který je zde jako odkaz začleněn ve své úplnosti.

Reprezentativní obecný způsob výroby sloučenin podle předkládaného vynálezu je uveden níže na Schématu 1. Toto schéma znázorňuje syntézu sloučenin podle předkládaného vynálezu o

strukturním vzorci 1 -7, kde furanosový kruh má konfiguraci β-D-ribo. Výchozím materiálem je 3,5-bis-O-chráněný alkylfuranosid, jako methylfuranosid, o strukturním vzorci 1 -1. Hydroxylová skupina v poloze C-2 se poté oxiduje vhodným oxidačním činidlem jako je oxid chromový nebo chromové reakční činidlo, Dess-Martinúv perjodinan, nebo Swernovou oxidací k získání C-2 ketonu o strukturním vzorci 1 -2. Přídavkem Grignardova činidla, jako alkyl-, alkenyl-, nebo alkynylhořečnatého halogenidu (například methylMgBr, ethylMgBr, vinylMgBr, allylMgBr, ethynylMgBr) nebo alkyl-, alkenyl-, či alkyllithia, jako methyllithia, ke karbonylové dvojné vazbě sloučeniny 1 -2 ve vhodném organickém rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, diethylether a podobně, poskytne C-2 terciární alkohol o strukturním vzorci 1 -3. Dobře uvolnitelné skupiny (jako Cl, Br a I) se poté zavedou do (anomerní) polohy C-1 furanosového cukerného derivátu tak, že se na furanosid o vzorci 1 -3 působí halogenvodíkem ve vhodném organickém rozpouštědle, jako bromovodíkem v kyselině octové, k získání furanosilového halogenidu 1 -4 jako meziproduktu. Jako vhodná uvolnitelná skupina v následující reakci, ve které vzniká glykosidová (nukleosidová) vazba, může být použit C-1 sulfonát, jako methansulfonát (MeSO₂O-), trifluormethansulfonát (CF₃SO₂O-), nebo p-toluensulfonát (-OTs). Nukleosidová vazba se vytváří ovlivněním meziproduktu o strukturním vzorci 1 -4 kovovou solí (jako lithnou, sodnou, nebo draselnou solí) příslušně substituovaného 1/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu 1 -5, jako vhodné substituovaného 4-halogen1-/7-pyrrolo[2,3-djpyrimidinu, který může být vytvořen in šitu (místně) působením alkalického hydridu (jako hydridu sodného), alkalického hydroxidu (jako hydroxidu draselného), alkalického uhličitanu (jako uhličitanu draselného) nebo alkalického hexamethyldisilazidu (jako NaHMDS) ve vhodném bezvodém organickém rozpouštědle, jakým je acetonitril, tetrahydrofuran, 1-methyl-2-pyrrolidon nebo Ν,Ν-dimethylformamid (DMF). Vytěsňovací reakce může být katalyzována za použití

katalyzátoru fázového přenosu, jako TDA-1 nebo triethylbenzylamoniumchloridu, ve dvoufázovém systému (pevná látkakapalina nebo kapalina-kapalina). Volitelné chránící skupiny v chráněném nukleosidu o strukturním vzorci 1 -6 jsou potom odštěpeny známými postupy k odstranění ochranných skupin, jako jsou ty, popsané T. W. Greenem a P.G. M. Wutsem v: Protective Groups in Organic Synthesis, 3. vydání, vydavatelé John Wiley & Sons, 1999. Volitelné zavedení aminoskupiny do polohy 4 pyrrolo[2,3-djpyrimidinového jádra se provádí ovlivněním 4-halogenového meziproduktu 1 -6 vhodným aminem, jako alkoholickým roztokem amoniaku nebo kapalným amoniakem, k vytvoření primárního aminu v poloze C-4 (-NH₂), alkylaminem k vytvoření sekundárního aminu (-NHR), nebo dialkylaminu k vytvoření terciárního aminu (-NRR').

7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3H)onová sloučenina může být získána hydrolýzou sloučeniny 1 -6 vodnou bází, jako je vodný hydroxid sodný. Alkoholýza (jako methanolýza) sloučeniny 1 -6 poskytuje C-4 alkoxid (-OR), zatímco působením alkylmerkaptidu poskytuje C-4 alkylthio (-SR) derivát.

K získání požadovaných sloučenin podle předkládaného vynálezu mohou být vyžadovány i následné chemické úpravy, dobře známé odborníkům s běžnou znalostí postupů organické/lékarské chemie.

Schéma 1

Pgo-A/O

PgÓ OH 1-1 •OR

(X = Cl, Br, or I)

Pg = chránící skupina R = nižší alkyl

Schéma 1 (pokračování)

X = CI, Br, či I ^ps°' OH 1-4 ^ρ9°Α/^ονχ ^HX

X = Cl, Br, or I

1-6

1. odstranění Pg —-->

2. volitelná náhrada X prostřed. R^w

Příklady uvedené níže poskytují citace literatury, které obsahují podrobnosti přípravy konečných sloučenin nebo meziproduktů, používaných při výrobě konečných sloučenin podle předkládaného vynálezu. Nukleosidové sloučeniny podle předkládaného vynálezu se vyrábějí postupy, které jsou podrobně popsány v následujících příkladech. Tyto příklady nejsou zamýšleny jako omezující rozsah předkládaného vynálezu jakýmkoliv způsobem a ani by tak neměly být chápány.

Odborníkovi v oboru syntézy nukleosidů a nukleotidů bude snadno zřejmé, že k výrobě těchto a dalších sloučenin podle předkládaného vynálezu je možné použít známé varianty podmínek a způsobů následujících preparativních postupů. Pokud není uvedeno jinak, jsou veškeré údaje týkající se teploty ve stupních Celsia.

- 36 • ·

	• ·	• · ·		• ·	• · · ·
•	•	* · ·	•	• ·	•
•	• · ·	• ·	•	• ·	•
•	• · • ·	• · • · · · ·	•	• · ··	• · • ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-arabinofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K oxidu chromovému (1,57 g, 1,57 mmol) v dichlormethanu (DCM) (TO ml) byl při 0 °C přidán acetanhydrid (145 mg, 141 mmol) a poté pyridin (245 mg, 3,10 mmol). Směs byla míchána 15 minut a pak byl přidán roztok 7-[3,5-O-[1,1,3,3-tetrakis(1 -methyl ethy l)-1,3-disiloxandiyl]-3-D-ribofuranosyl]-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-aminu (příprava viz J. Am. Chem. Soc. 105, 4059, 1983) (508 mg, 1,00 mmol) v DCM (dichlormethanu) (3 ml). Výsledný roztok byl míchán 2 hodiny a poté byl vlit do ethylacetátu (10 ml) a následně byl zfiltrován přes silikagel za použití ethylacetátu jako eluentu. Spojené filtráty byly odpařeny pod vakuem, převedeny do soustavy diethylether/tetrahydrofuran (THF) (1:1, 20 ml), ochlazeny na -78 °C a poté byl po kapkách přidán methylmagnesiumbromid (3 mol.I'¹, v THF) (3,30 ml, 10 mmol). Směs byla míchána 10 minut při teplotě -78 °C, pak byla ponechána ohřát na teplotu místnosti a reakce byla zastavena přídavkem nasyceného vodného chloridu amonného (10 ml) a extrahována prostřednictvím DCM (20 ml).

- 37 Organická fáze byla odpařena pod vakuem a surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití 5% methanolu v dichlormethanu jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem. Výsledný olej byl převeden do THF (5 ml) a přidán byl tetrabutylamoniumfluorid (TBAF) na oxidu křemičitém, tedy silice (1,1 mmol/g na silice) (156 mg). Směs byla při teplotě místnosti míchána 30 minut, poté byla zfiltrována a odpařena pod vakuem. Surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití 10% methanolu v dichlormethanu jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadované sloučeniny (49 mg) ve formě bezbarvé pevné látky.

¹H NMR (DMS0-b₆): δ 1,08 (s, 3H), 3,67 (m, 2H), 3,74 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 5,19 (m, 1H), 5,23 (m, 1H), 5,48 (m, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 6,50 (m, 1H), 6,93 (bs, 2H), 7,33 (m, 1H), 8,02 (s, 1H).

Příklad 2

4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

Krok A:

3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-1 -O-methyl-a-D-ribofuranóza

Směs 2-O-acetyl-3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-1 -O-methyl-α-D-ribofuranózy (příprava viz Helv. Chim. Acta 78. 486, 1995) (52,4 g, 0,10 mol) v methanolovém roztoku K₂CO₃ (500 ml, nasycený při teplotě místnosti) byla míchána 45 minut při teplotě místnosti a poté byla zahuštěna za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek byl suspendován v CH₂CI₂ (500 ml), promyt vodou (600 ml + 5 x 200 ml) a solným roztokem (200 ml), vysušen nad síranem sodným, zfiltrován a zahuštěn k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (49,0 g) ve formě bezbarvého oleje, který byl bez dalšího čištění použit v kroku B, viz níže.

Ή NMR (DMSO-b₆): δ 3,28 (s, 3H, OCH₃), 3,5, (d, 2H, J₅₄= 4,5 Hz, H-5a, H-5b), 3,72 (dd, 1 H, J₃₄= 3,6 Hz, J₃₂= 6,6 Hz, H-3), 3,99 (ddd, 3H, J₂₁= 4,5 Hz, J_2OH.₂= 9,6 Hz, H-2), 4,07 (m, 1H, H-4), 4,50 (s, 2H, CH₂Ph), 4,52, 4,60 (2d, 2H, J_gem = 13,6 Hz, CH₂Ph), 4,54 (d, 1H, OH-2), 4,75 (d, 1H, H-1), 7,32-7,45, 7,52-7,57 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (DMSO-b₆): δ 55,40; 69,05; 69,74; 71,29; 72,02; 78,41; 81,45; 103,44; 127,83; 127,95; 129,05; 129,28; 131,27; 131,30; 133,22; 133,26; 133,55; 133,67; 135,45; 135,92.

Krok B: 3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-1 -O-methyl-cc-D-eryřňropentofuranos-2-ulóza

Do ledově studené suspenze Dess-Martinova perjodinanu (50,0 g, 118 mmol) v bezvodém CH₂CI₂ (350 ml) byl pod argonovou atmosférou po kapkách, v průběhu 30 minut, přidán roztok sloučeniny z kroku A (36,2 g, 75 mmol) v bezvodém CH₂CI₂ (200 ml). Reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě 0 °C a poté 3 dny při teplotě místnosti. Směs byla naředěna bezvodým oxidem ethylnatým (Et₂O, 600 ml) a vlita do ledově studené směsi Na₂S₂O₃.5H₂O (180 g) v nasyceném vodném hydrogenuhličitanu sodném (1400 ml). Po oddělení vrstev byla organická vrstva promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem

sodným (600 ml), vodou (800 ml) a solným roztokem (600 ml), vysušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a odpařena k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (34,2 g) ve formě bezbarvého oleje, který byl bez dalšího čištění použit v kroku C, viz níže.

Ή NMR (CDCI₃): δ 3,50 (s, 3H, OCH₃), 3,79 (dd, 1H, J_5a5b = 11,3 Hz, J_5a4 = 3,5 Hz, H-5a), 3,94 (dd, 1H, J_5b4 = 2,3 Hz, H-5b), 4,20 (dd, 1H, J₃₁= 1,3 Hz, J₃₄= 8,4 Hz, H-3), 4,37 (ddd, 1H, H-4), 4,58-4,69 (2d, 2H, J_gem = 13,0 Hz, CH₂Ph), 4,87 (d, 1H, H-1), 4,78, 5,03 (2D, 2H, J_gem = 12,5 Hz, CH₂Ph), 7,19-7,26, 7,31-7,42 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 55,72; 69,41; 69,81; 69,98; 77,49; 78,00; 9.8,54; 127,99; 128,06; 129,33; 129,38; 131,36; 131,72; 133,61; 133,63; 133,85; 133,97; 134,72; 135,32; 208,21.

Krok C: 3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-methyl-1 -O-methyl-ctD-ribofuranóza

K roztoku MeMgBr (Me = methyl, CH₃) v bezvodém Et₂O (0,48 mol.l'¹, 300 ml) byl při teplotě -55 °C po kapkách přidán roztok sloučeniny z kroku B (17,40 g, 36,2 mmol) v bezvodém Et₂O (125 ml). Reakční směs byla ponechána zahřát na -30 °C a byla míchána 7 hodin při teplotě -30 °C až -15 °C. Poté byla vlita do ledově studené vody (500 ml) a směs byla důkladně míchána 30 minut při teplotě místnosti. Tato směs byla zfiltrována přes vrstvu celitu (10 x 5 cm), který byl poté důkladně promyt Et₂O. Organická vrstva byla vysušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a zahuštěna. Získaný zbytek byl rozpuštěn v hexanech (cca 30 ml), nanesen na sloupec silikagelu (10 x 7 cm, předem balený v hexanech) a eluován hexany a soustavou hexany/ethylacetát (9:1) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (16,7 g) ve formě bezbarvého sirupu.

¹H NMR (CDCI₃): δ 1,36 (d, 3H, J_Me0H = 0,9 Hz, 2C-Me), 3,33 (q, 1H, OH), 3,41 (d, 1H, J₃₄ = 3,3 Hz), 3,46 (s, 3H, OCH₃), 3,66 (d, 2H, J₅₄= 3,7 Hz, H-5a, H-5b), 4,18 (zjevně q, 1H, H-4), 4,52 (s, 1H, H-1), 4,60 (s, 2H, CH₂Ph), 4,63, 4,81 (2,d, 2H, J_geni= 13,2 Hz, CH₂Ph), 7,19-7,26, 7,34-7,43 (2m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (CDCI₃): δ 24,88; 55,45: 69,95; 70,24; 70,88; 77,06; 82,18; 83,01; 107,63; 127,32; 129,36; 130,01; 130,32; 133,68; 133,78; 134,13; 134,18; 134,45; 134,58,

Krok D: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-methyl-3D-ribofuranosyl]-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K roztoku sloučeniny kroku C (9,42 g, 19 mmol) v bezvodém dichlormethanu (285 ml) byl po kapkách přidán HBr (5,7 mol.l'¹ v kyselině octové, 20 ml, 114 mmol). Výsledný roztok byl 1 hodinu míchán při teplotě 0 °C a poté 3 hodiny při teplotě místnosti, následně byl odpařen pod vakuem a společně odpařen s bezvodým toluenem (3 x 40 ml). Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v bezvodém acetonitrilu (50 ml) a přidán k roztoku sodné sole 4-chlor-1/-/-pyrrol o[2,3-cř] py ri m id i nu v acetonitrilu [vytvořené in sítu z 4-chlor-1 H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu, příprava viz J. Chem. Soc. 131, 1960; (8,76 g, 57 mmol) v bezvodém acetonitrilu (1 000 ml) a hydridu sodném (60% v minerálním oleji, 2,28 g, 57 mmol) po 4 hodinách důkladného míchání při teplotě místnosti]. Spojená směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti a poté byla odpařena do sucha. Zbytek byl resuspendován ve vodě (250 ml) a extrahován octanem ethylnatým (2 x 500 ml). Spojené extrakty byly promyty solným roztokem (300 ml) vysušeny nad síranem hořečnatým, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl čištěn na sloupci silikagelu (10 cm x 10 cm) za použití soustavy ethylacetát/hexan (1:3 a 1:2) jako

- 41 eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a poté odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (5,05 g) ve formě bezbarvé pěny.

¹H NMR (CDCI₃): 5 0,93 (s, 3H, CH₃), 3,09 (s, 1H, OH), 3,78 (dd, 1H, J₅.₅„ = 10,9 Hz, J₅.₄ = 2,5 Hz, H-5'), 3,99 (dd, 1H, J₅..₄ = 2,2 Hz, H-5), 4,23-4,34 (m, 2H, H-3', H-4'), 4,63, 4,70 (2d, 2H, J_gem = 12,7 Hz, CH₂Ph), 4,71, 4,80 (2d, 2H, J_gem = 12,1 Hz, C_H2Ph), 6,54 (d, 1H, J₅,₆ = 3,8 Hz, H-5), 7,23-7,44 (m, 10H, 2Ph).

¹³C NMR (CDCI₃): δ 21,31; 69,10; 70,41; 70,77; 79,56; 80,41;

81,05; 91,11; 100,57; 118,21; 127,04; 127,46; 127,57; 129,73; 129,77; '130,57; 130,99; 133,51; 133,99; 134,33; 134,38; 134,74; 135,21;

151,07; 151,15; 152,47.

Krok E: 4-chlor-7-(2-C-methyl-p-c/-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z kroku D (5,42 g, 8,8 mmol) v dichlormethanu (175 ml) byl při teplotě -78 °C po kapkách přidán chloridid boritý (1 mol.l'¹ v dichlormethanu, 88 ml, 88 mmol). Směs byla míchána 2,5 hodiny při teplotě -78 °C a poté 3 hodiny při teplotě -30 °C až -20 °C. Reakce byla zastavena přídavkem soustavy methanol/dichlormethan (1:1) (90 ml) a výsledná směs byla míchána 30 minut při -15 °C, pak byla při 0 °C neutralizována vodným roztokem amoniaku a při teplotě místnosti byla míchána 15 minut. Pevná látka byla odfiltrována a promyta soustavou CH₂CI/methanol (1:1, 250 ml). Spojené filtráty byly odpařeny a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu za použití CH₂CI₂ a gradientu soustavy CH₂CI₂/methanol (99:1, 98:2, 95:5 a 90:10) jako eluentu k získání požadované sloučeniny (1,73 g) ve formě bezbarvé pěny, která se účinkem CH₃CN (acetonitrilu) přeměnila v amorfní pevnou látku.

4

- 42 • 4 • 444

4 4

Ή NMR (DMSO-c/₆): δ 0,64 (s, 3H, CH₃), 3,61-3,71 (m, 1H, H-5'), 3,79-3,88 (m, 1H, H-5), 3,89-4,01 (m, 2H, H-3', H-4'), 5,15-5,23 (m, 3H, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 6,24, (s, 1H, H-1j, 6,72 (d, 1H, J₅₆ = 3,8 Hz, H-5), 8,13 (d, 1H, H-6), 8,65 (s, 1H, H-2).

¹³C NMR (DMSO-c/₆): δ 20,20; 59,95; 72,29; 79,37; 83,16; 91,53; 100,17; 117,63; 128,86; 151,13; 151,19; 151,45.

Krok F: 4-amino-7-(2-C-methyl-p-cf-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Ke sloučenině z kroku E (1,54 g, 5,1 mmol) byl přidán methanolový roztok amoniaku (nasycený při 0 °C; 150 ml). Směs byla zahřívána v nerezovém autoklávu 14 hodin při teplotě 85 °C, ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na sloupci silikagelu za použití soustavy CH₂CI₂/methanol (9:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bezbarvé pěny (0,8 g), která byla po ovlivnění acětonitrilem oddělena ve formě amorfní pevné látky. Amorfní pevná látka byla rekrystalizována ze soustavy methanol/acetonitril a její bod tání byl 222 °C.

¹H NMR (DMSO-ě₆): δ 0,62 (s, 3H, CH₃), 3,57-3,67 (m, 1H, H-5'), 3,75-3,97 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,00 (s, 1H, 2'-OH), 5,04 (d, 1H, J₃._oh,3· = 6,8 Hz, 3'-OH), 5,06 (t, 1H, J₅._OH,₅,₅„ = 5,1 Hz, 5'-OH), 6,11 (s, 1H, H-1'), 6,54 (d, 1H, J₅₆ = 3,6 Hz, H-5), 6,97 (br s, 2H, NH₂), 7,44 (d, 1H, H-6), 8,02 (s, 1H, H-2).

¹³C NMR (DMSO-c/₆): δ 20,26; 60,42; 72,72; 79,30; 82,75; 91,20; 100,13; 103,08; 121,96; 150,37; 152,33; 158,15.

LC-MS: nalezeno: 279,10 (M-H⁺); vypočteno pro C₁₂H₁₆N₄O₄ + H⁺: 279,11

Příklad 3

- 43 4-am i no-7-(2-C-ethyl-p-b-ri bofuranosy l)-7/-/-pyrrolo[2,3-djpyrimidin

Krok A: 3,5-bis-O-(2,4-díchlorfenylmethyl)-2-C-ethyl-1 -O-methyl-aD-ribofuranóza

K diethyletheru (300 ml) byl při teplotě -78 °C pomalu přidán EtMgBr (3,0 mol.!'¹, 16,6 ml, Et=ethyl) a poté po kapkách sloučenina z kroku B Příkladu 2 (4,80 g, 10,0 mmol) v bezvodém Et₂O (100 ml). Reakční směs byla 15 minut míchána při teplotě -78 °C, poté byla ponechána ohřát na -15 °C a míchána po dobu dalších 2 hodin. Následně byla vlita do míchané směsi vody (300 ml) a Et₂O (600 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad síranem hořečnatým a odpařena pod vakuem. Surový produkt byl vyčištěn na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan (1:2) jako eluentu. Podíly, obsahující produkt, byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (3,87 g) ve formě bezbarvého oleje.

Krok B: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-ethyl- β-D-ri bofuranosy l]-7/7-pyrrolo[2,3-b]py ri m id i n

K roztoku sloučeniny z kroku A (1,02 mg, 2,0 mmol) v dichlormethanu (40 ml) byl po kapkách při teplotě 0 °C přidán HBr (5,7 mol.I’¹) v kyselině octové (1,75 ml, 10,0 mmol). Výsledný roztok byl při teplotě místnosti míchán 2 hodiny, poté byl odpařen pod vakuem a

dvojnásobně společně odpařen z toluenu (10 ml). Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v acetonitrilu (10 ml) a přidán k důkladně míchané směsi 4-chlor-1 H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (307 mg, 2,0 mmol), hydroxidu draselného (337 mg, 6,0 mmol) a tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]aminu (130 mg, 0,4 mmol) v acetonitrilu (10 ml). Výsledná směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti a poté byla vlita do míchané směsi nasyceného chloridu amonného (100 ml) a ethylacetátu (100 ml). Organická vrstva byla oddělena, promyta solným roztokem (100 ml), vysušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a odpařena pod vakuem. Surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan (1:2) jako eluentu k poskytnutí požadovaného produktu (307 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok C: 4-chlor-7-(2-C-ethyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-djpyrimidin

K roztoku sloučeniny z kroku B (307 mg, 0,45 mmol) v dichlormethanu (8 ml) byl při teplotě -78 °C přidán chlorid boritý (1 mol.I’¹ v dichlormethanu) (4,50 ml, 4,50 mmol). Směs byla při této teplotě míchána 1 hodinu a poté 3 hodiny při teplotě -10 °C. Reakce byla zastavena přídavkem soustavy methanol/dichlormethan (1:1, 10 ml), míchána 30 minut při teplotě -15 °C a neutralizována přídavkem vodného hydroxidu amonného. Směs byla odpařena za sníženého tlaku a výsledný olej byl čištěn na silikagelu za použití soustavy methanol/dichlormethan (1:9) jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (112 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok D:

4-amino-7-(2-C-ethyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-djpyrimidin

Ke sloučenině z kroku C (50 mg, 0,16 mmol) byl přidán nasycený roztok amoniaku v methanolu (4 ml). Směs byla při teplotě 75 °C míchána 72 hodin v uzavřeném zásobníku, poté byla ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na silikagelu za použití soustavy methanol/dichlormethan jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (29 mg) ve formě bezbarvého prášku.

Ή NMR (200 MHz,DMSO-c/₆): δ 0,62 (t, 3H), 1,02 (m, 2H), 4,01-3,24 (m, 6H), 5,06 (m, 1H), 6,01 (s., 1H), 6,51 (d, 1H), 6,95 (s br, 2H), 6,70 (d, 1H), 7,99 (s, 1H).

LC-MS: nalezeno: 295,2 (M+H⁺); vypočteno pro C₁₃H₁₈N₄O₄+H⁺: 295,14

Příklad 4

2-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on

Krok A: 2-amino-4-chlor-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cí]pyrimidin

K ledově studenému roztoku produktu z z Příkladu 2, Kroku C (1,27 g, 2,57 mmol) v CH₂CI₂ (30 ml) byl po kapkách přidán HBr (5,7 mol.¹'¹ v kyselině octové, 3 ml). Reakční směs byla míchána 2 hodiny při

- 46 44 44 4-9 4« *· *♦·,·

9' 4 4 ’4'4 4 4 · 4 · '4 ••'•Ό » 4 '* · '4 ·,

4 '4 ·4· 4 '4 4 '4 4 4 9 14 '4 4 ^Γ· · '4 4 4 4 4 4 4 «4 ·· 444 44 4 4 4 4 teplotě místnosti, zahuštěna za sníženého tlaku a odpařena společně s toluenem (2x15 ml). Výsledný olej byl rozpuštěn v acetonitrilu (MeCN) (15 ml) a po kapkách přidán k dobře míchané směsi 2-amino-4-chlor-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (příprava viz Heterocycles 35, 825, 1993) (433 mg, 2,57 mmol), KOH (práškového, 85%) (0,51 g, 7,7 mmol), tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]aminu (165 μΙ, 0,51 mmol) v acetonitrilu (30 ml). Výsledná směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti, zfiltrována a odpařena. Získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy hexany/ethylacetát v poměrech 5:1, 3:1 a 2:1 jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bezbarvé pěny (0,65 g).

Krok B: 2-amino-4-chlor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7W-pyrrolo[2,3-o'jpyrimidin

K roztoku produktu z kroku A (630 mg, 1,0 mmol)·v CH₂CI₂ (20 ml) byl při teplotě -78 °C přidán chlorid boritý (1 mol.l'¹ v CH₂CI₂) (10 ml, 10 mmol). Směs byla 2 hodiny míchána při teplotě -78 °C a poté 2,5 hodiny při teplotě -20 °C. Reakce byla zastavena přídavkem soustavy CH₂CI₂/methanol (1:1, 10 ml), míchána 30 minut při -20 °C a neutralizována při teplotě 0 °C vodným roztokem amoniaku. Pevná látka byla zfiltrována, promyta soustavou CH₂CI₂/methanol (1:1) a spojený filtrát byl odpařen pod vakuem. Zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy CH₂CI₂/methanol (50:1 a 20:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bezbarvé pěny (250 mg).

Krok C: 2-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-djpyrimidin

Směs produktu z kroku B (90 mg, 0,3 mmol) ve vodném roztoku hydroxidu sodného (2 mol.l’¹, 9 ml) byla zahřívána k teplotě varu pod ·· '·♦ '♦♦Μ ·· 4 4 · 4 4

4 4 4 4·· • 4 4 4 '4 4 ·

4 4 .4 4 4 4 • 44 4 « · · ·4

- 47 zpětným chladičem (při refluxu) po dobu 5 hodin, poté byla neutralizována při 0 °C prostřednictvím vodného roztoku HCI (2 mol.l'¹) a odpařena do sucha, čištěním na sloupci silikagelu za použití soustavy CH₂CI₂/methanol (5:1) jako eluentu bylo získáno 70 mg v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky.

¹H NMR (200 MHz,CD₃OD); δ 0,86 (s, 3H), 3,79 (m, 1H), 3,90-4,05 (m, 3H), 6,06 (s, 1H), 6,42 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 3,7 Hz, 1H).

Příklad 5

2-amino-4-cyklopropylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)7W-pyrrolo-[2,3-c/]pyrimidin

Roztok 2-amino-4-chloro-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo-[2,3-cí]pyrimidinu (z Příkladu 4, kroku B) (21 mg, 0,07 mmol) v cyklopropylaminu (0,5 ml) byl zahříván 2 dny na teplotu 70 °C, poté byl odpařen na olejovitý zbytek a čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy CH₂CI₂/methanol, 20:1, jako eluentu, k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky (17 mg).

¹H NMR (200 MHz,CD₃CN): δ 0,61 (m, 2H), 0,81 (m, 2H), 0,85 (s, 3H), 2,83 (m, 1H), 3,74-3,86 (m, 1H), 3,93-4,03 (m, 2H), 4,11 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,02 (s, 1H), 6,49 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 7,0 (d, J = 3,7 Hz, 1H).

4 4		··	4 44	44		4 44 4
•	•	4	• 4 4 4	4	4	•
4	•	444	• 4 ·	4	•	>4
4
4	•	4 ·	• 4 4	4	•	4
• 4		··	• •4 4 4	• 4		.4 4

Příklad 6

4-amino-7-(2-C-methyI-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidin-5-karbonitril

Tato sloučenina byla připravena podle postupů, popsaných Y. Muraiem a spoluautory v Heterocycles 33, 391-404, 1992.

Příklad 7

4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo-[2,3-c/]pyrimidin-5-karboxamid

Příklad 8

9 9	0 0	0 0 9	00	··♦·
*	• 0	19 90 0	• 0	^!0
0	• 00 0	• · í*	0 0	9
0
•	• · ·	0· 0 '0	0 0	9
9 9	00	0 0 0 · 9	• »	'90

Obecný postup k získání prekursorové částice ŠATE

S-acyi-2-thioethylové (ŠATE) pronukleotidy jsou diskutovány C. R. Wagnerem a spoluautory v článku Pronucleotides: Toward the In Vivo Delivery of Antiviral and Anticancer Nucleotides, Med. Res. Rev. 20, 1-35, 2000, který je zde začleněn ve své úplnosti jako odkaz. SATEderiváty nukleosidu jsou uvedeny rovněž v US patentech č. 5 770 725; 5 849 905 a 6 020 482, jejichž obsahy jsou zde ve své úplnosti začleněny jako odkazy.

Bis-(S-acetyl-2-thioethyl)-N,N-diisopropylfosforamidit

2-merkaptoethanol (5 g, 64 mmol) byl rozpuštěn v 50 ml CH₂CI₂. K tomuto roztoku byl přidán triethylamin (7,67 ml, 57,6 mmol) a reakční směs byla ochlazena v ledové lázni na 0 °C. Po kapkách byl přidán v průběhu 10 minut anhydrid kyseliny octové (4,54 ml, 48 mmol) a reakční směs byla míchána 1 hodinu při 0 °C. Poté byla reakční směs ponechána v průběhu 2 hodin zahrát na teplotu místnosti. Následně byla naředěna 50 ml CH₂CI₂, promyta vodou (75 ml), 5% vodným roztokem NaHCO₃ (75 ml) a solným roztokem (75 ml). Organickál fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným a zahuštěna pod vakuem k poskytnutí oleje. Tento olej byl pak rozpuštěn v bezvodém THF (40 ml) a přidán byl bezvodý triethylamin (7,76 ml). K této směsi bylo přidáno aktivované molekulární síto (velikost otvorů 4 A) a směs byla ponechána 10 minut při teplotě místnosti. Pak byla ochlazena v ledové lázni na 0 °C a byl k ní přidán dichlorid diisopropylfosforamidu (6,47 g, 32,03 mmol). Reakční směs byla při teplotě 0 °C míchána po dobu 2 hodin pod inertní atmosférou. Poté byl k reakční směsi přidán hexan (40 ml) a vzniklá sraženina byla odfiltrována. Filtrát byl zahuštěn na jednu čtvrtinu svého objemu a čištěn chromatografií na sloupci silikagelu za použití hexanu s obsahem 3 % triethylaminu a rostoucího množství ethylacetátu (0 - 7 %)

- 50 ··. ·· ►' · ·* » ···· jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě oleje (2,36 g).

¹H NMR (CDCI₃): δ 1,17 (s, 6H), 1,21 (s, 6H), 2,36 (s, 6H), 3,14 (t, j = 6,44 Hz), 3,51-3,84 (m, 6H);

¹³C NMR (CDCI₃): δ 24,47; 24,61; 30,48; 42,85; 43,1; 61,88; 62,23; 195,26;

¹³P NMR (CDCI3): δ 146,96

Příklad 9

5'-trifosfátové deriváty

Nukleosidové 5'-trifosfáty podle předkládaného vynálezu byly připraveny podle obecných postupů, popsaných v Chem. Rev. 100, 2047,2000.

Příklad 10

Čištění a analýza čistoty 5'-trifosfátovych derivátů

Trifosfátové deriváty byly čištěny iontově výměnnou (AX) chromatografií za použití sloupce Mono Q o rozměru 30 x 100 mm (Pharmacia) a pufračního systému 50 mmol.l'¹ Tris o pH 8. Eluční gradienty byly typicky od 40 mmol.l’¹ NaCI do 0,8 mol.I’¹ NaCI ve dvou objemech sloupce při rychlosti 6,5 ml/minutu. Příslušné podíly, získané aniontovou výměnnou chromatografií, byly shromážděny a odsoleny prostřednictvím chromatografie na reverzní fázi (RP chromatografie) za použití sloupce Luna C18 250 x 21 mm (Phenomenex) a rychlosti toku 10 ml/minutu. Eluční gradienty byly obecně od 1% do 95% methanolu během 14 minut při stálé koncentraci triethylamoniumacetátu (TEAA) 5 mmol.l’¹).

• ·		··	• · ·	99		··♦·
•	•	•	'·» >· ·	·	•	'·
•	•	···	• · ·	9	•	*
•
•	•		• · ·	9	•	• ·
·«		>· ·	··· 99	9 9

Hmotová spektra čištěných trifosfátů byla stanovena hmotnostní spektrometrií při on-line HPLC na přístroji Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) MSD 1 100. Pro RP HPLC byl použit sloupec Phenomenex Luna (C18(2)) o rozměru 150 x 2 mm a chránící sloupec (guard column) o velikosti částic 3 pm. Pro stanovení byl používán patnáctiminutový lineární gradient 0 až 50 % acetonitrilu ve 20 mmol.I'¹ TEAA (triethylamoniumacetátu) o pH 7, vytvářený v sériích, s hmotnostní spektrální detekcí v režimu negativní ionizace. K vytvoření elektrospreje byly použity plynný dusík a pneumatický rozprašovač. Testováno bylo hmotností rozmezí od 150 do 900. Molekulové hmotnosti byly stanoveny za použití analytické sady HP Chemstation.

Čistota vyčištěných trifosfátů byla stanovována analytickou RP a AX HPLC. RP HPLC na sloupci Phenomenex Luna nebo Jupiter (250 x

4,6 mm) o velikosti částic 5 pm typicky probíhala v patnáctiminutovém gradientu 2 až 70% acetonitrilu v 100 mmol.I’¹ TEAA o pH 7. AX HPLC byla prováděna, na sloupci Mono Q (Pharmacia) o rozměrech 1,6 x 5 mm). Trifosfáty byly eluovány gradientem 0 až 0,4 mol.I¹ NaCl při stálé koncentraci 50 mmol.l'¹ Tris o pH 8. Čistota trifosfátů byla obecně větší než 80%.

Příklad 11

5'-monofosfátové deriváty

Nukleosid-5'-monofosfáty podle předkládaného vynálezu byly připraveny podle obecných postupů, popsaných v Tetrahedron Lett. 50, 5065, 1967.

Příklad 12

Charakterizace 5'-trifosfátovych derivátů hmotovou spektrometrií

- 52 • · • ··· ·· ···· • * · • · φ.

φ · · ’φ ·· ··

Hmotová spektra 5'-trifosfátů sloučenin podle předkládaného vynálezu byla stanovena tak, jak je popsáno v Příkladu 10. V následující Tabulce jsou uvedeny vypočítané a experimentálně zjištěné hmotnosti reprezentativních 5'-trifosfátů, připravených podle postupů z Příkladu 9. Čísla příkladů odpovídají mateřské sloučenině 5'-trifosfátu.

příklad	vypočítáno	zjištěno
1	520,0	519,9
2	520,0	520,0
3	534,0	534,0
4	536,0	536,0

Příklad 13 [4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidin]-5'-monofosfát

Ke sloučenině z kroku F Příklad 2 (14 mg, 0,05 mmol) (vysušené společným odpařením s pyridinem a několikanásobně s toluenem) byl přidán trimethylfosfát (0,5 ml). Tato směs byla míchána přes noc v utěsněném zásobníku. Poté byla ochlazena na 0 °C a pomocí injekční stříkačky byl přidán oxychlorid fosforu (7 μΙ, 0,075 mmol). Směs byla míchána 3 hodiny při 0 °C a pak byla reakce ukončena přídavkem hydrogenuhličitanu tetraethylamonia (TEAB, 1 mol.l'¹, 0,5 ml) a vody (5

• ·	'· ·	•	··	•	•	• · 9 9
• ·	•	'· * ·	9	9	•	’·
• ·	···	• ·	9	9	•	•

• ·	,· '·	• ·	•	9	•	Φ 9
··	• ·	·· ·	• ·	•	•	9 9

ml). Reakční směs byla čištěna a analyzována postupem, popsaným v Příkladu 10.

ES-MS (Electron spray mass spectrum): nalezeno 395,2 (M-H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₇N₄O7P-H⁺: 359,1

Příklad 14 [4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo-[2,3-c/]pyrimid in]-5'-difosfát

Sloučenina z Příkladu 2, Kroku F (56 mg, 0,20 mmol) (vysušena společným odpařením s pyridinem a několikanásobně s toluenem) byla přidána k trimethylfosfátu (uchovávanému nad síty) (0,1 ml). Směs byla míchána přes noc v utěsněném zásobníku. Poté byla ochlazena na 0 °C a za pomocí injekční stříkačky byl přidán oxychlorid fosforu (23 μΙ, 0,25 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C a poté byly přidány tributylamin (0,238 ml, 1,00 mmol) a tributylamoniumfosfát (vytvořený z kyseliny fosforečné a tributylaminu v pyridinu s následným opakovaným azeotropním odpařením s pyridinem a acetonitrilem) (1,0 mmol v 3,30 ml acetonitrilu). Směs byla míchána dalších 30 minut při 0 °C, poté byla uzavřená lahvička otevřena a reakce byla zastavena přídavkem TEAB (1 mol.I’¹, 1,0 ml) a vody (5 ml). Reakční směs byla čištěna a analyzována postupem popsaným v Příkladu 10.

ES-MS: nalezeno: 439,0 (M-H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₈N₄O₁₀P₂-H⁺: 439,04.

• ·	'9 9	9 · ·	9 9 .	9 9 9 9
• ·	9	• · 9	•	•	9	9
• ·	999	’· ·	•	•	9	9

• ·	• ·	• ·	9	.·	9	• ·
9 9	• ·	• · ·	9 9	• 9		9 9

Příklad 15 [4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo-[2,3-ď|pyrimid in]-5'-trifosfát

Sloučenina z Příkladu 2, Kroku F (20 mg, 0,07 mmol) (vysušená společným odpařením s pyridinem a několikanásobným společným odpařením s toluenem) byla přidána k trimethylfosfátu (uchovávanému nad síty) (0,4 ml). Směs byla míchána přes noc v utěsněném zásobníku. Poté byla ochlazena na 0 °C a za pomocí injekční stříkačky byl přidán oxychlorid fosforu (7 μΙ, 0,075 mmol). Směs byla míchána 3 hodiny při 0 °C a poté byly přidány tributylamin (0,083 ml, 0,35 mmol) a tributylamoníumpyrofosfát (127 mg, 0,35 mmol) a acetonitril (uchovávány nad síty) (0,25 ml). Směs byla míchána dalších 30 minut při 0 °C, poté * byla uzavřená lahvička otevřena a reakce byla zastavena přídavkem TEAB (1 mol.l'¹, 0,5 ml) a vody (5 ml). Reakční směs byla čištěna a analyzována postupem popsaným v Příkladu 10.

ES-MS: nalezeno: 519,0 (M-H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₉N₄O₁₃P₃-H⁺: 519,01.

Příklad 16

7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidin4(3H)-on

Ke sloučenině z Příkladu 2, Kroku E (59 mg, 0,18 mmol) byl přidán vodný roztok hydroxidu sodného (1 mol.l'¹). Směs byla zahřívána 1 hodinu k varu pod zpětným chladičem, ochlazena, neutralizována vodným roztokem HCI (2 mol.l'¹) a odpařena pod vakuem. Zbytek byl čištěn na silikagelu za použití soustavy dichlormethan/methanol (4:1) jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnuti požadovaného produktu (53 mg) ve formě bezbarvého oleje.

¹H NMR (CD₃CN): δ 0,70 (s, 3H), 3,34-4,15 (překrývající m, 7H), 6,16 (s, 1H), 6,57 (d, 3,6 Hz, 1H), 7,37 (d, 3,6 Hz, 1H), 8,83 (s, 1H).

Příklad 17

4-amino-5-chloro-7’(2-C-methyl-P-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cíjpy ri m id i n

HO

	• ·	··	• ··	··	····
•	•	•	·· ·	•	•	•	•
	•	• · '·	• ·	•	•	•	•
•
•	• ·'·	• · • ·	• · ···	• • ·	•	• ··	• · ··

K předem vychlazenému roztoku (0 °C) sloučeniny z Příkladu 2, kroku F (140 mg, 0,50 mmol) v DMF (2,5 ml) byl po kapkách přidán N-chlorsukcinimid (0,75 g, 0,55 mmol) v DMF (0,5 ml). Tento roztok byl míchán 1 hodinu při teplotě místnosti, reakce byla zastavena přídavkem methanolu (4 ml) a odpařena pod vakuem. Surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití soustavy methanol/dichlormethan (1:9) jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (55 mg) ve formě bezbarvé pevné látky.

¹H NMR (CD₃CN): δ 0,80 (s, 3H), 3,65-4,14 (překrývající m, 7H), 5,97 (s br, 2H), 6,17 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 8,16 (s, 1H).

ES-MS: nalezeno 315,0 (M+H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₅CIN₄O₄+H⁺: 315,09.

Příklad 18

4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin

K předem vychlazenému roztoku (0 °C) sloučeniny z Příkladu 2, kroku F (28,0 mg, 0,10 mmol) v DMF (0,5 ml) byl po kapkách přidán N-bromsukcinimid (0,018 g, 0,10 mmol) v DMF (0,5 ml). Tento roztok byl míchán 20 minut při teplotě 0 °C a poté 10 minut při teplotě místnosti.

	• 4	··	4 4 4	• 4		4444
•	•	•	·· · ·	4	•	4
•	4	444	• 4 4	4	4	4
•
•	4 4·	4 4 4 4	4 4 4 44 4 44	4 4 4	4	4 4 44

Reakce byla zastavena přídavkem methanolu (4 ml) a odpařena pod vakuem. Surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití soustavy methanol/dichlormethan (1:9) jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (13,0 mg) ve formě bezbarvé pevné látky.

¹H NMR (CD₃CN): δ 0,69 (s, 3H), 3,46-4,00 (překrývající m, 7H), 5,83 (s br, 2H), 6,06 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 8,05 (s, 1H).

ES-MS: nalezeno 359,1 (M + H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₅BrN₄O₄+H⁺: 359,04

Příklad 19

2-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

NH₂

Směs 2-amino-4-chlor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ďj-pyrimidinu (z Příkladu 4, kroku B) (20 mg, 0,07 mmol) v ethanolu (1,0 ml), pyridinu (0,1 ml) a 10% palladium na uhlíku (Pd/C, 6 mg) byla míchána pod H₂ (při atmosferickém tlaku) přes noc při teplotě místnosti. Poté byla zfiltrována přes vrstvu celitu, který byl důkladně promyt ethanolem. Spojené filtráty byly odpařeny a čištěny na sloupci silikagelu za použití dichlormethanu/methanolu (20:1 a 10:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky (16 mg).

• ·· ·· · · • · ·

- 58 • · • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · ··· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · ·· ··

Ή NMR (200 MHz,CD₃OD): δ 0,86 (s, 3H, 2' C-Me), 3,82 (dd, J₅.₄. =

3,6 Hz, J₅.₅.. = 12,7 Hz, 1 Η, H-5'), 3,94-4,03 (m, 2H, H-5', H-4'), 4,10 (d, J₃.₄. = 8,8 Hz, 1H, H-3*), 6,02 (s, 1H, H-1¹), 6,41 (d, J₅₆ = 3,8 Hz, 1H, H-5), 7,39 (d, 1H, H-6), 8,43 (s, 1H, H-4).

ES-MS: 281,4 (MH⁺).

Příklad 20

2-am i no-5-methy 1-7-(2-C,2-O-dimethyl-β-D-ri bofuranosy 1)-7/-/pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin-4(3B)-on

Krok A: 2-amino-4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-Cmethyl-p-D-ribofuranosyl]-5-methyl-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K ledově studenému roztoku produktu z Příkladu 2, Kroku C (1,57 g, 3,16 mmol) v dichlormethanu (50 ml) po kapkách byl přidán HBr (5,7 moi.l’¹ v kyselině octové; 3,3 ml). Reakční směs byla míchána 1 hodinu při teplotě 0 °C a poté 2 hodiny při teplotě místnosti, zahuštěna pod vakuem a společně odpařena s toluenem (2 x 20 ml). Výsledný olej byl rozpuštěn v acetylnitrilu (20 ml) a po kapkách přidán k roztoku sodné sole 2-ami.no-4-chlor-5-methyl-1/7-pyrrolo[2,3-djpyrimidinu v acetonitrilu {vytvořené in šitu z 2-amino-4-chlor-5-methyl-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyrimidinu [příprava viz Liebigs Ann. Chem. 1984: 708-721 ] (1,13 g, 6,2 mmol) v bezvodém acetonitrilu (150 ml) a NaH (60% v minerálním oleji, 248 mg, i

- 59 3 · · 3 · 3

O 3

3

9 •3

O · · *

O 3 3

O 7 ·

3· · 3 3 3 0 3

7 ’ 3 3 O 3

3 3 3 3 3 O

7 3 3 0 0 3

3·· 3 · 3· 3 ·

6,2 mmol), po 2 hodinách důkladného míchání při teplotě místnosti}. Spojená směs byla míchána 24'hodin při „teplotě místnosti a poté byla odpařena do sucha. Zbytek byl resuspendován ve vodě (100 ml) a extrahován ethylacetátem (300 + 150 ml). Spojené extrakty byly promyty solným roztokem (100 ml), vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl čištěn na sloupci silikagelu (5x7 cm) za použití soustavy ethylacetát/hexan (0 až 30% ethylacetát v 5% krokovém gradientu) jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (0,96 g) ve formě bezbarvé pěny.

Krok B: 2-amino-4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C,2-Od i methyl-β-D-ribof uranosyl]-5-methyl-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K ledově studené směsi produktu z kroku A (475 mg, 0,7 mmol) v

THF (7 ml) byl přidán NaH (60% v minerálním oleji, 29 mg) a míchán 30 minut při 0 °C. Poté byl přidán CH₃I (48 μΙ) a reakční směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přídavkem methanolu a směs byla odpařena. Surový produkt byl čištěn na sloupci silikagelu (5 x 3,5 cm) za použití soustavy hexan/ethylacetát (9:1, 7:1, 5:1 a 3:1) jako eluentu. Podíly, obsahující produkt, byly spojeny k poskytnutí požadované sloučeniny (200 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok C: 2-amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C,2-Odimethyl-3-D-ribofuranosyl]-5-methyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3/-/)-on

Směs produktu z kroku B (200 mg, 0,3 mmol) v 1,4-dioxanu (15 ml) a vodném’NaOH'(2 mol.I'¹, 15 ml) byla v tlakové lahvi zahřívána přes noc na teplotu 135 °C. Poté byla směs ochlazena na 0 °C,

- 60 neutralizována vodným roztokem HCI (2 mol.l'¹) a odpařena do sucha. Surový produkt byl suspendován v methanolu, zfiltrován a pevná látka byla opět důkladně promyta methanolem. Spojené filtráty byly zahuštěny a zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu (5x5 cm) za použití soustavy dichlormethan/methanol (40:1, 30:1 a 20:1) jako eluentu k poskytnutí požadované sloučeniny (150 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok D: 2-amino-5-methyl-7-(2-C,2-0-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3/7)-on

Směs produktu z kroku C (64 mg, 0,1 mmol) v methanolu (5 ml) a Et₃N (triethylamin, 0,2 ml) a 10% Pd/C (24 mg) byla hydrogenována na Parrově hydrogenátoru při tlaku 344,7 kPa (50 psi) 1,5 dne při teplotě místnosti, poté byla zfiltrována přes vrstvu celitu, který byl důkladně promyt methanolem. Spojené filtráty byly odpařeny a zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu (3x4 cm) za použití soustavy CH₂CI₂/methanol (30:1, 20:1) jako eluentu k získání 2-amino-5-methyl-7-(5-O-benzyl-2-C,2-O-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidin-4(3H)~ onu. Tato sloučenina (37 mg) byla dále hydrogenována v ethanolu (2 ml) s 10% Pd/C a za atmosferického tlaku vodíku. Po míchání při teplotě místnosti v délce 2 dnů byla reakční smě zfiltrována přes vrstvu celitu, filtrát byl odpařen a surový produkt byl čištěn na sloupci silikagelu (1 x 7 cm) za použití soustavy CH₂CI₂/methanol (30:1, 20:1) jako eluentu k získání v nadpisu uvedené sloučeniny (12 mg) po lyofylizaci.

Ή NMR (200 MHz,CD₃OD): δ 0,81 (s, 3H, 2'C-Me), 2,16 (d, J_H._6C5._Me= 1,3 Hz, 3H, C5-Me), 3,41 (s, 3H, 2'-0Me), 3,67 (dd, J₅.₄, = 3,4 Hz, J₅,₅„ = 12,6 Hz, 1H, H-5'), 3,81-3,91 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 6,10 (s, 1H, H-1'), 6,66 (d, 1H, H-6).

ES-MS: 323,3 (M-H)⁺.

Příklad 21 ·· ·

- 61 4-amino-5-methyl-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin

Krok A: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-methyl3-D-ribofuranosyl]-5-methyl-7H-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin

K ledově chladnému roztoku produktu z Příkladu 2, Kroku C (1,06 g, 2,1 mmol) v dichlormethanu (30 ml) byl po kapkách přidán HBr (5,7 mol.I'¹ v kyselině octové; 2,2 ml). Tato reakční směs byla míchána 1 hodinu při 0 °C a poté 2 hodiny při teplotě místnosti, byla zahuštěna pod vakuem a společně odpařena s toluenem (2x15 ml). Výsledný olej byl rozpuštěn v acetonitrilu (10 ml) a po kapkách přidán do roztoku sodné sole 4-chlor-5-methyl-1 W-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu v acetonitrilu {vytvořenému in šitu z 4-chlor-5-methyl-1/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidínu, [příprava viz J. Med. Chem. 33, 1984, 1990], (0,62 g, 3,7 mmol) v bezvodém acetonitrilu (70 ml a NaH v 60% minerálním oleji, 148 mg,

3,7 mmol), po 2 hodinách důkladného míchání při teplotě místnosti}. Spojená směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti a poté byla odpařena do sucha. Zbytek byl resuspendován ve vodě (100 ml) a extrahován prostřednictvím ethylacetátu (250 + 100 ml). Spojené extrakty byly promyty solným roztokem (50 ml) vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl čištěn na sloupci silikagelu (5x5 cm) za použití gradientu soustavy hexan/ethylacetát (9:1, 5:1, 3:1) jako eluentu. Podíly, obsahující produkt, byly spojeny a

odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (0,87 g) ve formě bezbarvé pěny.

Krok B: 4-chlor-5-methyl-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ď]pyrim id i n

K roztoku sloučeniny z kroku A (0,87 g, 0,9 mmol) v dichlormethanu (30 m!) byl při teplotě - 78 °C po kapkách přidán chlorid boritý (1 mol.l'¹ v dichlormethanu, 9,0 ml, 9,0 mmol). Směs byla míchána 2,5 hodiny při - 78 °C a poté 3 hodiny při teplotě od -30 do -20 °C. Reakce byla zastavena přídavkem soustavy methanol/dichlormethan (1:1, 9 ml) a výsledná směs byla míchána 30 minut při -15 °C. Pak byla neutralizována vodným roztokem amoniaku při 0 °C a míchána 15 minut při teplotě místnosti. Pevná látka byla zfiltrována a promyta soustavou dichlormethan/methanol (1:1, 50 ml). Spojené filtráty byly odpařeny a zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu (5x5 cm) za použití dichlormethanu a gradientu soustavy dichlormethan/methanol (40:1 a 30:1) jako eluentu k poskytnutí požadované sloučeniny (0,22 g) ve formě bezbarvé pěny.

Krok C: 4-amino-5-methyl-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin

Ke sloučenině z kroku B (0,2 g, 0,64 mmol) byl přidán methanolový roztok amoniaku (nasycený při 0 °C; 40 ml). Směs byla zahřívána 14 hodin v nerezovém autoklávu na 100 °C, poté byla ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na sloupci silikagelu (5x5 cm) za použití gradientu soustavy dichlormethan/methanol (50:1, 30:1, 20:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky (0,12 g).

¹H NMR (DMSO-č/β): δ 0,60 (s, 3H, 2'C-Me), 2,26 (s, 3H, 5C-Me), 3,52-3,61 (m, 1H, H-5'), 3,70-3,88 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,00 (s, 1H, 2'-OH), 4,91-4,99 (m, 3H, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 6,04 (s, 1H, H-1'), 6,48 (br s, 2H, NH₂), 7,12 (s, 1H, H-6), 7,94 (s, 1H, H-2).

ES-MS: 295,2 (MH⁺).

Příklad 22

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin-5-ka.rboxylová kyselina

Sloučenina z Příkladu 6 (0,035 g, 0,11 mmol) byla rozpuštěna ve směsi vodného roztoku amoniaku (4 ml, 30 % hmotnostních) a nasyceného methanolového roztoku amoniaku (2 ml) a přidán byl roztok H₂O₂ ve vodě (2 ml, 35 % hmotnostních). Reakční směs byla míchána 18 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a získaný zbytek byl čištěn prostřednictvím HPLC na sloupci reverzní fáze (Altech Altima C-18, 10 x 299 mm, A = voda, B = acetonitril, 10 až 60 % B během 50 minut, rychlost toku 2 ml/minutu) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (0,015 g, 41 %) ve formě bílé pevné látky.

¹H NMR (CD₃OD): δ 0,85 (s, 3H, Me), 3,61 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,99-4,86 (m, 2H), 6,26 (s, 1H), 8,10 (s, 2H), 8,22 (s, 1H);

- 64 • · to · ¹³C NMR (CD₃OD): 20,13; 61,37; 73,79; 80,42; 84,01; 93,00; 102,66; 112,07; 130,07; 151,40; 152,74; 159,12; 169,30.

HRMS (FAB): vypočteno pro C₁₃H₁₇N₄O₆ ⁺ 325,1 148; nalezeno 325,1143.

Příklad 23

4-amino-7-(2-C-vinyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Krok A: 3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-vinyl-1 -O-methyl-cc-D-ribofuranóza

Heptahydrát chloridu čeřitého (50 g, 134,2 mmol) byl jemně rozdrcen v předem zahřáté třecí misce a převeden do baňky s kulatým dnem, doplněné mechanickým míchadlem. Baňka byla přes noc zahřívána pod vysokým vakuem na teplotu 160 °C. Vakuum bylo odstraněno pod argonovou atmosférou a baňka byla ochlazena na teplotu místnosti. Poté byl do baňky kanylou doplněn bezvodý THF (300 ml). Výsledná suspenze byla míchána při teplotě místnosti 4 hodiny a poté byla ochlazena na -78 °C. Přidán byl bromid vinylhořečnatý (1 mol.l·¹ v THF, 120 ml, 120 mmol) a míchání pokračovalo 2 hodiny při - 78 °C. K této suspenzi byl pak po kapkách, za stálého míchání přidán roztok 3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-1-O-methyl-cí-D-erythropentofuranóza-2-ulózy (14 g, 30 mmol) [z Příkladu 2 kroku B] v bezvodém THF

furanóza-2-ulózy (14 g, 30 mmol) [z Příkladu 2 kroku B] v bezvodém THF (100 ml). Reakce byla míchána 4 hodiny při - 78 °C, poté byla zastavena přídavkem nasyceného roztoku chloridu amonného a ponechána ohřát na teplotu místnosti. Směs byla zfiltrována přes vrstvu celitu a zbytek byl promyt Et₂O (2 x 500 ml). Organická vrstva byla oddělena a vodná vrstva byla extrahována Et₂O (2 x 200 ml). Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny do formy viskozního žlutého oleje. Olej byl čištěn bleskovou chromatografií (SiO₂, 10% ethylacetát v hexanech). V nadpisu uvedená sloučenina (6,7 g, 13,2 mmol) byla získána ve formě tmavě žlutého oleje.

Krok B: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-vinyl-,p-Dribofuranosyl]-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z kroku A (6,4 g, 12,6 mmol) v bezvodém dichlormethanu (150 ml) byl při teplotě -20 °C po kapkách přidán HBr (30% roztok v AcOH, 20 ml, 75,6 mmol). Výsledný roztok byl míchán 4 hodiny při teplotě od -10 °C do 0 °C, odpařen pod vakuem a společně odpařen s bezvodým toluenem (3 x 40 ml). Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v bezvodém acetonitrilu (100 ml) a při -20 °C přidán do roztoku sodné sole 4-ch.lor-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu (5,8 g, 37,8 mmol) v acetonitrilu (vytvořené za podmínek in šitu tak, jak je popsáno v Příkladu 2). Výsledná směs byla ponechána zahřát na teplotu místnosti a při této teplotě byla míchána 24 hodin. Pak byla směs odpařena do sucha, převedena do vody a extrahována ethylacetátem (2 x 300 ml).

Spojené extrakty byly vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surová směs byla čištěna bleskovou chromatografií (SiO₂, 10% ethylacetát v hexanech) a v nadpisu uvedená sloučenina (1,75 g) byla izolována ve formě bílé pěny.

Krok C: 4-amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-vinyl-p-D.ribofuranosyl]-7/7-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

Sloučenina z kroku B (80 mg) byla rozpuštěna v minimálním množství 1,4-dioxanu a umístěna do nerezové tlakové lahve. Ta byla vychlazena na teplotu -78 °C a poté byl přidán tekutý amoniak. Tlaková láhev byla utěsněna a 24 hodin zahřívána na 90 °C. Amoniak byl ponechán odpařit a zbytek byl zahuštěn do formy bílé pevné látky, která byla v dalším kroku použita bez dalšího čištění.

Krok D: 4-amino-7-(2-C-vinyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z kroku C (60 mg) v dichlormethanu byl při teplotě -78 °C po kapkách přidán chlorid boritý (1 mol.l'¹ v dichlormethanu). Směs byla míchána 2,5 hodiny při -78 °C a poté 3 hodiny při teplotě od -30 °C do -20 °C. Reakce byla zastavena přídavkem soustavy methanol/dichlormethan (1:1) a výsledná směs byla 30 minut míchána při teplotě -15 °C. Poté byla neutralizována při 0 °C vodným roztokem amoniaku a 15 minut míchána při teplotě místnosti. Pevná látka byla odfiltrována a . promyta soustavou methanol/dichlormethan (1:1). Spojené filtráty byly odpařeny a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií (SiO₂, 10% methanol v ethylacetátu, obsahujícím 0,1% triethylamin). Podíly s obsahem produktu byly odpařeny k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky (10 mg).

Ή NMR (DMSO-c/6): δ 3,6 (m, 1H, H-5'), 3,8 (m, 1H, H-5), 3,9 (m d, 1-H, H-4'), 4,3 (t, 1H, H-3'), 4,8-5,3 (m, 6H, CH=CH2, 2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 6,12 (s, 1H, H-1'), 6,59 (d, 1H, H-5), 7,1 (br s, 1H, NH₂), 7,43 (d, 1H, H-6), 8,01 (s, 1H, H-2).

ES-MS: nalezeno 291,1 (M-H'); vypočteno pro C₁₃H₁₆M₄O₄-H’:

291,2.

Příklad 24

4-amino-7-(2-C-hydroxymethyl-P-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Krok A: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-hydroxymethyl-p-D-ribofuranosyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z Příkladu 23, kroku B (300 mg, 0,48 mmol) v 1,4-dioxanu (5 ml) byly přidány N-methylmorfolin-N-oxid (300 mg, 2,56 mmol) a oxid osmičelý (4% roztok ve vodě, 0,3 ml). Směs.byla míchána 14 hodin ve tmě. Sraženina byla odstraněna filtrací přes vrstvu celitu, zředěna vodou (3x) a extrahována ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva byla vysušena nad síranem sodným a zahuštěna pod vakuem. Olejovitý zbytek byl převeden do dichlormethanu (5 ml) a míchán 12 hodin nad NalO₄ se silikagelem (3 g, 10% NaiO₄). Silikagel byl odstraněn filtrací a zbytek byl odpařen a převeden do absolutního ethanolu (5 ml). Roztok byl ochlazen v ledové lázni a poté byl po malých částech přidán borohydrid sodný (300 mg, 8 mmol). Výsledná směs byla míchána 4 hodiny při teplotě místnosti a naředěna ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou (2 x 20 ml), solným roztokem 20 ml a vysušena nad

síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií (SiO₂, 2:1 hexany/ethylacetát) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (160 mg, 0,25 mmol) ve formě bílých vloček.

Krok B: 4-amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-hydroxymethyl-p-D-ribofuranosyl]-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

Sloučenina z kroku A (150 mg, 0,23 mmol) byla rozpuštěna v minimálním množství 1,4-dioxanu (10 ml) a umístěna do nerezové tlakové nádoby. Ta byla ochlazena na -78 °C a poté byl přidán kapalný amoniak. Tlaková nádoba byla utěsněna a 24 hodin zahřívána na 90 °C. Amoniak byl ponechán odpařit a zbytek byl zahuštěn do formy bílé pevné látky, která byla v dalším kroku použita bez dalšího čištění.

Krok C: 4-amino-7-(2-C-hydroxymethyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-ďjpyrimidi'n

Sloučenina z kroku B (120 mg, 0,2 mmol) byla rozpuštěna v soustavě methanol/dichlormethan (1:1), přidáno bylo 10% palladium na uhlíku a suspenze byla míchána pod vodíkovou atmosférou 12 hodin. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes vrstvu celitu a promyt velkými množstvími methanolu. Spojené filtráty byty odpařeny pod vakuem a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií (SiO₂, 10% methanol v ethylacetátu obsahujícím 0,1% triethylamin) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (50 mg) ve formě bílého prášku.

Ή NMR (CD₃OD): δ 3,12 (d, 1H, CH₂'), 3,33 (d, 1H, CH₂), 3,82 (m, 1H, H-5¹), 3,99-4,1 (m, 2H, H-4', H-5), 4,3 (d, 1H, H-3'), 6,2 (s, 1H, H-1'), 6,58 (d, 1H, H-5), 7,45 (d, 1H, H-6), 8,05 (s, 1H, H-2).

LC-MS: nalezeno: 297,2 (M+H⁺); vypočteno pro C₁₂H₁₆N₄O₅+H⁺:

297,3.

• ·

Příklad 25

4-amino-7-(2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo [2,3-c/]py rim i d i n

Krok A: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethy1)-2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl]-7/7-pyrrolo[2,3-cí]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z Příkladu 24, kroku A (63 mg, 0,1 mmol) v bezvodém dichlormethanu (5 ml) byly pod argonovou atmosférou přidány 4-dimethyiaminopyridin (DMAP; 2 mg, 0,015 mmoi) a triethylamin (62 μ), 0,45 mmol). Roztok byl ochlazen v ledové lázni a byl k němu přidán p-toluensulfonylchlorid (30 mg, 0,15 mmol). Reakce byla míchána přes noc při teplotě místnosti, promyta hydrogenuhličitanem sodným (2 x 10 ml), vodou (10 ml), solným roztokem (10 ml), vysušena nad síranem sodným a zahuštěna pod vakuem na růžovou pevnou látku. Tato pevná látka byla rozpuštěna v bezvodém THF (5 mi) a ochlazena v ledové lázní. Přidán byl tetrabutylamoniumfluorid (1 mol.l'¹ roztok v THF, 1 ml, 1 mmol) a směs byla míchána 4 hodiny při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno pod vakuem, zbytek byl převeden do dichlormethanu a promyt hydrogenuhličitanem sodným (2 x 10 ml), vodou (10 ml) a solným roztokem (10 ml). Dichlormethanová vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zahuštěna pod vakuem a čištěna bleskovou chromatografií (SiO₂, 2:1 hexany/ethylacetát) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (20 mg ve formě bílé pevné látky).

• ·

Krok B: 4-amino-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C-fluormethyl-3-D-ribofuranosyl]-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

Sloučenina z kroku A (18 mg, 0,03 mmol) byla rozpuštěna v minimálním množství 1,4-dioxanu (10 ml) a umístěna do nerezové tlakové nádoby. Ta byla ochlazena na -78 °C a poté byl přidán kapalný amoniak. Tlaková nádoba byla utěsněna a 24 hodin zahřívána na 90 °C. Amoniak byl ponechán odpařit a zbytek byl zahuštěn do formy bílé pevné látky, která byla v dalším kroku použita bez dalšího čištění.

Krok C: 4-amino-7-(2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl) 7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

Sloučenina z kroku B (16 mg) byla rozpuštěna v soustavě methanol/dichlormethan (1:1), přidáno bylo 10% palladium na uhlíku a suspenze byla míchána pod vodíkovou atmosférou 12 hodin. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes vrstvu celitu a promyt velkými množstvími methanolu. Spojené filtráty byly odpařeny pod vakuem a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií (SiO₂, 10% methanol v ethylacetátu, obsahujícím 0,1% triethylamin) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (8 mg) ve formě bílého prášku.

¹H NMR (DMSO-č/6): δ 3,6-3,7 (m, 1H, H-5'), 3,8-4,3 (m, 5H, H-5, H-4', H-3',CH₂), 5,12 (t, 1H, 5'-OH), 5,35 (d, 1H, 3'-OH), 5,48 (s, 1H, 2'-OH), 6,21 (s, 1H, H-T), 6,52 (d, 1H, H-5), 6,98 (br s, 2H, NH2), 7,44 (d, 1H, H-6), 8,02 (s, 1H, H-2).

¹⁹F NMR (DMSO-c/6): δ -230,2 (t).

ES-MS: nalezeno 299,1 (M+H⁺), vypočteno pro C₁₂H₁₅FN₄O₄+H⁺: 299,27.

Příklady 26 a 27

- 71 • · ·· « · · ······ ··· · · · · ·· · • · ··· · · · · · ·

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin a 4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-3-D-arabinofuranosyl) 7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Krok A: 7-[2,5-bis-O-(tert-butyIdimethylsilyl)-p-D-ribofuranosyI]-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin a 7-[3,5-bis-O-(tert-butyldimethy Isi lyl)-3-D-ribofuranosy l]-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyri m id in

K míchanému roztoku tubercidinu (5,0 g, '18,7 mmol) ve směsi pyridinu (7,5 ml) a dimethylformamidu (18,5 ml) byl přidán nitrát stříbra (6,36 g, 38,8 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byla ochlazena v ledové lázni, přidány byly THF (37,4 ml) a tert-butyIdimethylsilylchlorid (5,6 g, 37 mmol) a směs byla míchána další 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byla směs zfiltrována přes vrstvu celitu a promyta tetrahydrofuranem.

Filtrát a promývací roztoky byly naředěny etherem, obsahujícím malé množství chloroformu. Organická vrstva byla promyta následně hydrogenuhličitanem sodným a vodou (3 x 50 ml), vysušena nad bezvodým síranem sodným a zahuštěna. Pyridin byl odstraněn společným odpařením s toluenem a zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu za použití 5-7% methanolu v dichlormethanu jako eluentu. Výtěžek činil 3,0 g.

• · ·

- 72 ·· • · · · ·· · · • ·· ·· ···· ·· · · · · * • · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··

Krok B: 7-[2,5-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-p-D-ribofijranosyl]-4-[di-(4-methoxyfenyl)fenylmethyl]amino-7H-pyrrolo[2,3-d] pyri m id i n a 7-[3,5-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-p-D-ribofuranosyl]-4-[di-(4-methoxyfenyl)fenylmethyl]amino-7/7pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K roztoku směsi sloučenin z kroku A (3,0 g, 6,0 mmol) v bezvodém pyridinu (3% ml) byl přidán 4,4'-dimethoxytritylehlorid (2,8 g, 8,2 mmol) a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byla směs rozmělněna s vodným pyridinem a extrahována etherem. Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena nad bezvodým síranem sodným a zahuštěna do formy žluté pěny (5,6 g). Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu za použití 20 až 25% ethylacetátu v hexanech jako eluentu. Příslušné podíly byly spojeny a zahuštěny k poskytnutí 2', 5'-bis-O-(tert-butyldimethylsi lyl)em a 3',5'-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)em chráněných nukleosidů ve formě bezbarvé pěny (v množství 2,2 g a 1,0 g).

Krok C: 7-[2,5-bis-0-(tert-butyIdimethylsilyl)-3-O-tosyΙ-β-D-ribofuranosyl]-4-[di-(4-methoxyfenyl)fenylmethyl]amino-7H-pyrroI o[2,3-d] py ri m i d i n

Do ledově studeného roztoku 2', 5'-bis-0-(tert-buty Idimethylsilyl)em chráněného nukleosidu z kroku B (2,0 g, 2,5 mmol) v pyridinu (22 ml) byl přidán p-toluensulfonylchlorid (1,9 g, 9,8 mmol). Reakční směs byla míchána 4 dny při teplotě místnosti. Poté byla rozmělněna s vodným pyridinem (50%, 10 ml) a extrahována etherem (3 x 50 ml), obsahujícím malé množství dichlormethanu (10 ml). Organická vrstva byla promyta hydrogenuhličitanem sodným a vodou (3 x 30 ml). Pak byla organická vrstva promyta vodou, vysušena nad bezvodým síranem sodným a zahuštěna. Pyridin byl odstraněn společným odpařením s

- 73 ····

toluenem (3 x 25 ml). Zbytkový olej byl zfiltrován přes silikagel za použití soustavy hexan : ethylacetát (70:30) jako eluentu s výtěžkem

1.4 g.

Krok D: 4-[di-(4-methoxyfenyl)fenylmethyl]amino-7-[3-O-tosyl-p-D-ribofuranosyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Roztok sloučeniny z kroku C (1,0 g, 1,1 mmol) a THF (10 ml) byl minut míchán s tetrabutylamoniumfluoridem (1 mol.l'¹ roztok v THF,

2.5 ml). Směs byla ochlazena a zředěna etherem (50 ml). Roztok byl promyt vodou (3 x 50 ml), vysušen nad bezvodým síranem sodným a zahuštěn do formy oleje. Zbytek byl čištěn průchodem přes vrstvu silikagelu za použití soustavy hexan/ethylacetát (1:1) jako eluentu s výtěžkem 780 mg.

Krok E: 4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/pyrrolo[2,3-d]pyrimidin a 4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-β-D-arabino- furanosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Roztok CH₃Mgl (3,0 mol.l'¹ roztok, 3,0 ml)v bezvodém toluenu (3,75 ml) byl ochlazen v ledové lázni. Pak k němu byl přidán roztok sloučeniny z kroku D (500 mg, 0,8 mmol) v bezvodém toluenu (3,7 ml). Výsledná směs byla míchána 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Pak byla ochlazena, upravena vodným roztokem chloridu amonného a extrahována etherem (50 ml s obsahem 10 ml dichlormethanu). Organická vrstva byla oddělena, promyta solným roztokem (2 x 30 ml) a vodou (2 x 25 ml), vysušena nad bezvodým síranem sodným a zahuštěna na olej, který byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu za použití 4% methanolu v dichlormethanu k získání 2-C-a-methylsloučeniny (149 mg) a 2-C-3-methylsloučeniny (34 mg). Na tyto deriváty se odděleně působilo 80% kyselinou octovou a reakční

- 74 směsi byly míchány 2,5 hodiny při teplotě místnosti. Kyselina octová pak byla odstraněna opakovaným společným odpařením s ethanolem a toluenem. Zbytek byl rozdělen mezi chloroform a vodu. Vodná vrstva byla promyta chloroformem a zahuštěna. Odpařený zbytek byl čištěn na silikagelu za použití 5-10% methanolu v dichlormethanu jako eluentu k získání v nadpisu uvedených sloučenin ve formě bílých pevných látek.

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-djpyrimidin (9,0 mg):

¹H NMR (DMSO-d6): δ 0,74 (s 3H, CH₃), 1.77 (dd, 1H, H-3'), 2,08 (t, 1H, H-3), 3,59 (m, 1 Η, H-5'), 3,73 (m, 1H, H-5), 4,15 (m,1H, H-4'), 5,02 <t, 1H, OH-5'), 5,33 (s, 1H, OH-2'), 6,00 (s, 1H, H-1'), 6,54 (d, 1H, H-7), 6,95 (br s, 2H, NH₂), 7,47 (d, 1H, H-8), 8,00 (s, 1H, H-2 ES-MS: 263,1 [M-H],

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-p-D-arabinofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-djpyrimidin (15,0 mg):

Ή NMR (DMSO-d6): δ 1,23 (s 3H, CH₃), 2,08 (ddd, 2H, H-3' a 3), 3,57 (m, 2H, H-5¹ a 5), 4,06 (m, 1H, H-4), 5,10 (s,1H, OH-2'), 5,24 (t, 1H, OH-5'), 6,01 (s, 1 Η, H-1'), 6,49 (d, 1H, H-7), 6,89 (br s, 2H, NH₂), 7,35 (d, 1H, H-8), 8,01 (s, 1H, H-2);

ES-MS: 265,2 [M+Hj.

Příklad 28

4-am ino-7-(2,4-C-di methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-djpyrimidin ····

Krok A: 5-deoxy-1,2-O-isopropyliden-D-xylofuranóza

Sloučeniny 1,2-O-isopropyliden-D-xylofuranóza (38,4 g, 0,2 mmol), 4-dimethylaminopyridin (5 g) a triethylamin (55,7 ml, 0,4 mol) byly rozpuštěny v dichlormethanu (300 ml). Přidán byl p-toluensulfonylchlorid (38,13 g, 0,2 mol) a reakční směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byla vlita do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (500 ml) a došlo k rozdělení dvou vstev. Organická vrstva byla promyta vodným roztokem kyseliny citrónové (20%, 200 ml), vysušena nad síranem sodným a odpařena k poskytnutí pevné látky (70.0 g). Pevná látka byla rozpuštěna ve vysušeném THF (300 ml) a v průběhu 30 minut byl po částech přidán LiAIH₄ (16,0 g, 0,42 mol). Směs byla míchána15 h a v průběhu 30 minut byl po kapkách přidán ethylacetát (100 ml). Poté byla směs zfiltrována přes vrstvu silikagelu. Filtrát byl zahuštěn a výsledný olej byl chromatografován na silikagelu (ethylacetát/hexan 1:4) k poskytnutí produktu ve formě pevné látky (32,5 g).

Krok B: 3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-1 -O-methyl-4-oc-D-ribofuranóza

K dichlormethanu (1 000 ml) v ledově studené vodní lázni byly přidány oxid chromový (50 g, 0,5 mol), anhydrid kyseliny octové (50 ml, 0,53 mol) a pyridin (100 ml, 1,24 mol) a směs byla míchána 15 minut.

• ·

Přidána byla 5-deoxy-1,2-0-isopropyliden-D-xylofuranóza (32 g, 0,18 mol) v dichlormethanu (200 ml) a směs byla míchána 30 minut při téže teplotě. Pak byla reakční směs naředěna ethylacetátem (1 000 ml) a zfiltrována přes vrstvu silikagelu. Filtrát byl zahuštěn k poskytnutí žlutého oleje. Olej byl rozpuštěn v 1,4-dioxanu (1 000 ml) a formaldehydu (37%, 200 ml). Roztok byl ochlazen na 0°C a přidán byl pevný KOH (50 g). Směs byla míchána pres noc při teplotě místnosti a poté byla extrahována ethylacetátem (6 x 200 ml). Po zahuštění byl zbytek podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát) k poskytnutí produktu ve formě oleje (1,5 g). Olej byl rozpuštěn v

1-methyl-2-pyrrolidinonu (20 ml) a přidány byly 2,4-dichlorfenylmethylchlorid (4,0 g, 20,5 mmol) a NaH (60%, 0,8 g). Směs byla míchána přes noc a naředěna toluenem (100 mi). Poté byla směs promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (3 x 50 ml), vysušena nad síranem sodným a odpařena. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu (50 ml) a přidána byla HCI v dioxanu (4 mol.l'¹, 2 ml). Roztok byl míchán přes noc a odpařen. Zbytek byl chromatografován na silikagelu (ethylacetát/hexan 1:4) k poskytnutí požadovaného produktu ve formě oleje (2,01 g).

Krok C: 3,5-bis-0-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2,4-c//-C-methyl-1-0-methyl-a-D-ribofuranóza

Produkt (2,0 g, 4,0 mmol) z kroku B a Dess-Martinův perjodinát (2,0 g) v dichlormethanu (30 ml) byly míchány pres noc při teplotě místnosti a poté zahuštěny za sníženého tlaku. Zbytek byl rozmělněn s ether-etherem (50 ml) a zfiltrován. Filtrát byl promyt roztokem Na₂S₂O₃,5H₂O (2,5 g) v nasyceném vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), vysušen nad síranem hořečnatým, zfiltrován a odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém Et₂O (20 ml) a při teplotě -78 °C po kapkách přidán k roztoku CH₃MgBr v Et₂O (3 mol.l'¹, 10 ml). Reakční směs byla

·· ·· ponechána se ohřát na -30 °C a byla míchána 5 hodin při teplotě od -30 °C do -15 °C. Následně byla vlita do nasyceného vodného roztoku chloridu amonného (50 ml). Došlo k oddělení dvou vrstev a organická vrstva byla vysušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a zahuštěna. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát/hexan 1:9) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě sirupu (1,40 g).

Krok D: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2,4-di-C-methyl-3-D-ribofuranosyl]-7H-pyrrolo[2,3-b]pyrimidin

Ke sloučenině z kroku C (0,70 g, 1,3 mmol) byl přidán HBr (5,7 mol.l'¹ v kyselině octové, 2 ml). Výsledný roztok byl míchán 1 hodinu při teplotě místnosti, odpařen pod vakuem a společně odpařen s bezvodým toluenem (3 x 10 ml). 4-chlor-1-H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (0,5 g, 3,3 mmol) a práškový KOH (85%, 150 mg, 2,3 mmol) byly míchány 30 minut v 1-methyl-2-pyrrolidonu (5 ml) a směs byla společně odpařena s toluenem (10 ml). Výsledný roztok byl vlit do výše uvedeného brom-cukerného zbytku a směs byla míchána přes noc. Směs byla zředěna toluenem (50 ml), promyta vodou (3 x 50 ml) a zahuštěna za sníženého tlaku. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan (15:85) k získání pevné látky (270 mg).

Krok E: 4-amino-7-(2,4-C-dimethyl-p-D-ribofuranosyl)-7Hpyrrolo[2,3-ďjpyrimidin

Sloučenina z kroku D (270 mg) byla rozpuštěna v dioxanu (2 ml) a s kapalným amoniakem (20 g) byla přidána do nerezového autoklávu. Směs byla zahřívána 15hna 100 °C, pak byla ochlazena a odpařena. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát) k získání pevné látky (200 mg). Pevná látka (150 mg) a Pd/C (10%, 150 mg) v

- 78 • · • ··· methanolu (20 ml) byly protřepávány pod vodíkovou atmosférou (206,8 kPa) po dobu 3 hodin, pak byly zfiltrovány a odpařeny. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu (methanol/dichlormethan 1:9) k poskytnutí požadovaného produktu ve formě pevné látky (25 mg).

Ή NMR (DMSO-d6): δ 0,65 (s, 3H), 1,18 (s, 3H), 3,43 (m, 2H), 4,06 (d, 1H, 7=6,3 Hz), 4,87 (s, 1H), 5,26 (br, 1H), 5,08 (d, 1H, 7=6,3 Hz), 5,25 (t, 1H, 7=3,0 Hz), 6,17 (s, 1H), 6,54 (d, 1H, 7=3,5 Hz), 6,97 (s, br, 2H), 7,54 (d, 1H, 7=3,4 Hz), 8,02 (s, 1H).

13C NMR (DMSO-c/6): 518,19; 21,32; 65,38; 73,00; 79,33; 84,80; 90,66; 99,09; 102,41; 121,90; 149,58; 157,38.

LS-MS: nalezeno 295,1 (M+H⁺); vypočteno pro C₁₃H₁₈N₄O₄+H⁺:

295,1

Příklad 29

4-amino-7-(3-deoxy-3-fluor-2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7 /7-pyrrolo[2,3-d]pyri midin

Krok A: 3-deoxy-3-fluor-1 -O-methyl-5-O-toluoyl-cc-D-ribofuranóza

1,2-O-isopropyliden-D-xylofuranóza (9,0 g, 50 mmol) a p-toluoylchlorid (7,0 ml, 50 mmol) v pyridinu (50 ml) byly míchány po dobu 30 minut. Pak byla přidána voda (10 ml) a směs byla zahuštěna za i·.

- 79 sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v toluenu (500 ml) a roztok byl promyt vodou (200 ml) a nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (200 ml). Oddělily se dvě vrstvy a organická vrstva byla odpařena. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu (100 ml) a byla přidána HCI v dioxanu (4 mol.l'¹, 10 ml). Směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti a pak byla odpařena za sníženého tlaku. Výsledný olej byl podroben chromatogragii na silikagelu (ethylacetát/hexan 1:1) k poskytnutí oleje (10,1 g). Tento olej byl rozpuštěn v dichlormethanu (100 ml) a přidán byl diethylaminosulfurtrifluorid (DAST) (5,7 ml). Směs byla míchána přes noc a poté byla vlita do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml). Směs byla extrahována toluenem (2 x 50 ml) a spojené organické vrstvy byly zahuštěny. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát/hexan 15:85) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě oleje (1,50 g).

Krok B: 3-deoxy-3-fluor-2-C-methyl-1 -O-methyl-5-O-toluoyla-D-ribofuranóza

Produkt z kroku A (1,0 g, 3,5 mmol) a Dess-Martinův periodinan (2,5 g) v dichlormethanu (20 ml) byly míchány přes noc při teplotě místnosti a poté byly zahuštěny za sníženého tlaku. Zbytek byl rozmělněn s diethyletherem (50 ml) a zfiltrován. Filtrát byl promyt roztokem Na₂S₂O₃ . 5H₂O (12,5 g) v nasyceném vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml), vysušen nad síranem hořečnatým, zfiltrován a odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém THF (50 ml). Při -78 °C byly přidány chlorid titaničitý (3 ml) a bromid methylhořečnatý v ethyletheru (3 mol.l'¹, 10 ml) a směs byla míchána 2 hodiny při teplotě od -50 °C do -30 °C. Pak byla směs vlita do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml) a zfiltrována přes vrstvu celitu. Filtrát byl extrahován toluenem (100 ml) a odpařen. Zbytek byl • ·

- 80 ··· • · • · • · ·· ·· podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát/hexan 15:85) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě oleje (150 mg).

Krok C: 4-amino-7-(3-deoxy-3-fluor-2-C-methyl-3-D-ribofuranosy l)-7/7-pyrrolo[2,3-b]pyrimidin

Produkt z kroku B (150 mg, 0,5 mmol) byl rozpuštěn v HBr (30%) v kyselině octové (2 ml). Po jedné hodině byla směs odpařena za sníženého tlaku a společně odpařena s toluenem (10 ml). 4-chlor-1 H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (0,5 g, 3,3 mmol) a práškový KOH (85%, 150 mg, 2,3 mmol) byly 30 minut míchány v DMF (3 ml) a směs byla společně odpařena s toluenem (2 ml). Výsledný roztok byl vlit do roztoku výše uvedené brom-cukerné částice a směs byla míchána přes noc. Pak byla naředěna toluenem (50 ml), promyta vodou (3 x 50 ml) a zahuštěna za sníženého tlaku. Zbytek byl podroben chromatografii na silikagelu (ethylacetát/hexan 15:85) k poskytnutí oleje (60 mg). Tento olej byl rozpuštěn v dioxanu (2 ml) a s tekutým amoniakem (20 g) byl přidán do nerezového autoklávu. Směs byla zahřívána 18 hodin na 85 °C,.pak byla ochlazena a odpařena. Zbytek byl podroben chromatografii na - silikagelu (methanol/dichlormethan 1:9) k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě pevné látky (29 mg).

¹H NMR (DMSO-c/6): δ 0,81 (s, 3H), 3,75 (m, 2H), 4,16 (m, 1H), 5,09 (dd, 1H, J=53,2, 7,8 Hz), 5,26 (br, 1H), 5,77 (s, 1H), 6,15 (d, 1H, J=2,9 Hz), 6,59 (d, 1H, J=2,9 Hz), 7,02 (s, br, 2H), 7,39 (d, 1H, J=3,4 Hz), 8,06 (s, 1H).

¹³C NMR (DMSO-c/6): δ 19,40; 59,56; 77,24; 79,29; 90,15; 91,92; 99,88; 102,39; 121,17; 149,80; 151,77; 157,47.

19F NMR (DMSO-c/6): δ 14,66 (m).

LS-MS: nalezeno 283,1 (M+H⁺); vypočteno pro C₁₂H₁₅FN₄O₃+H⁺:

283,1.

·· ····

Příklad 30

4-amino-7-(2-C,2-O-dimethyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrro-

Krok A: 4-chlor-7-[3,5-bis-O-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C,2-O-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K předem ochlazenému (0 °C) roztoku sloučeniny z Příkladu 2, kroku D (618 mg, 1,0 mmol) v THF (8 ml) byl přidán methyljodid (709 mg, 5,0 mmol) a NaH (60% v minerálním oleji) (44 mg, 1,1 mmol). Výsledná směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti a poté byla vlita do míchané směsi nasyceného vodného roztoku chloridu amonného (50 ml) a dichlormethanu (50 ml). Organická vrstva byla promyta vodou (50 ml), vysušena nad síranem horečnatým a odpařena pod vakuem. Výsledný surový produkt byl čištěn na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (735 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok B: 4-amino-7-[3,5-bis-0-(2,4-dichlorfenylmethyl)-2-C,2-0-dimethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Ke sloučenině z kroku A (735 mg, 1,16 mmol) byl přidán methanolový roztok amoniaku (nasycený při 0 °C) (20 ml). Směs byla ·· ···· zahřívána přes noc v nerezovém autoklávu při 80 °C, pak byla ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (504 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Krok C: 4-amino-7-(2-C,'2-O-di-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidi n

Směs produktu z kroku C (64 mg, 0,1 mmol), methanolu (5 ml), triethylaminu (0,2 ml) a 10% Pd/C (61 mg) byla při teplotě místnosti hydrogenována přes noc v Parrově hydrogenátoru při tlaku 344,7 kPa. Směs pak byla zfiltrována přes vrstvu celitu, odpařena pod vakuem a zfiltrována přes vrstvu silikagelu za použití 2% methanolu v dichlormethanu jako eluentu. Požadovaný produkt byl shromážděn a odpařen pod vakuem. Sloučenina byla opětně rozpuštěna v methanolu (10 ml) a přidáno bylo Pd/C (61 mg). Směs byla dva týdny hydrogenována v Parrově hydrogenátoru při.teplotě místnosti a tlaku

379,2 kPa. Pak byla směs zfiltrována přes vrstvu celitu, odpařena pod vakuem a čištěna na silikagelu za použití 10% methanolu v dichlormethanu jako eluentu. Podíly obsahující produkt byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu (110 mg) ve formě bezbarvé pěny.

Ή NMR (DMSO-c/6): δ 0.68 (s, 3H), 3,40 (s, 3H), 3,55-3,99 (překrývající se m, 4H), 4,92 (d, 1H), 5,07 (t, 1H), 6,26 (s, 1H), 6,55 (d, 1H), 7,00 (s, br, 2H), 7,46 (d, 1H), 8,05 (s, 1H).

LS-MS: nalezeno 293,1 (M + H⁺); vypočteno pro C₁₂H₁₆N₄O₄+H⁺: 293,12.

Příklad 31

4-methylamino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Sloučenina z Příkladu 2, kroku E (200 mg, 0,67 mmol) byla přidána do methylaminu (5 ml, kondenzován v malém nerezovém autoklávu) a zahřívána 48 hodin na 85 °C, poté byla ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na silikagelu za použití ethanolu jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny, která byla oddělena po ovlivnění prostřednictvímní acetonitrilu ve formě amorfní pevné látky. Tato amorfní pevná látka byla rozpuštěna ve vodě a lyofilizována k poskytnutí bezbarvého prášku (144 mg).

¹H NMR (DMSO-c/6): δ 0.63 (s, 3H, CH₃), 3,32 (s, 3H, N CH₃), 3,58-3,67 (m, 1H, H-5j, 3,79-3,39 (m, 3H, H-5, H-4', H-3j, 5,03 (s, 1H, 2'-OH), 5,04-5,11 (1H, 3’-OH, 1H, 5'-OH), 6,14 (s, 1H, H-T), 6,58 (d, 1H, V3,6 Hz, H-5), 7,46 (d, 1H, H-6), 7,70 (br s, 1H, NH), 8,14 (s, 1H, H-2).

LS-MS: nalezeno 295,1 (M+H⁺); vypočteno pro C₁₃H₁₈N₄O₄+H⁺:

294,3.

Příklad 32

4-dimethylamino-7-(2-C-methyí-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin

Sloučenina z Příkladu 2, kroku E (200 mg, 0,67 mmol) byla přidána do dimethylaminu (5 ml, kondenzován v malém nerezovém autoklávu) a zahřívána 48 hodin na 85 °C, poté byla ochlazena a •odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na silikagelu za použití ethanolu jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny, která byla oddělena po ovlivnění prostřednictvímní acetonitrilu ve formě amorfní pevné látky. Tato amorfní pevná látka byla rozpuštěna ve vodě a lyofilizována k poskytnutí bezbarvého prášku (164 mg).

Ή NMR (DMSO-c/6): δ 0.64 (s, 3H, CH₃), 3,29 (s, 3H, N CH₃), 3,32 (s, 3H, N CH₃), 3,60-3,66 (m, 1H, H-5'), 3,77-3,97 (m, 3H, H-5, H-4', H-3'), 5,04 (s, 1H, 2'-OH), 5,06-5,11 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 6,21 (s, 1H, H-1'), 6,69 (d, 1H, J₅,₆=3,6 Hz, H-5), 7,55 (d, 1H, H-6), 8,13 (s, 1H, H-2).

LS-MS: nalezeno 309,3(M+H⁺); vypočteno pro C₁₄H₂₀N₄O₄+H⁺: 308,33.

Příklad 33

4-cyklopropylamino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Sloučenina z Příkladu 2, kroku E (200 mg, 0,67 mmol) byla přidána do cyklopropylaminu (5 ml, kondenzován v malém nerezovém autoklávu) a zahřívána 48 hodin na 85 °C, poté byla ochlazena a odpařena pod vakuem. Surová směs byla čištěna na silikagelu za použití’ ethanolu jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny, která byla oddělena po ovlivnění prostřednictvímní MěCN ve formě amorfní pevné látky. Tato amorfní pevná látka byla rozpuštěna ve vodě a lyofilizována k poskytnutí bezbarvého prášku (148 mg).

Ή NMR (DMSO-c/6): δ 0,51-0,58 (m, 2H), 0,64 (s, 3H, CH₃), 0,74-0,76 (m, 2H), 3,62-3,67 (m, 1H, H-5'), 3,79-3,82 (m, 3H, H-5), 3,92-3,96 (m, H-4', H-3'), 5,03 (s, 1H, 2'-OH), 5,05-5,10 (1H, 3'-OH, 1H, 5'-OH), 6,15 (s, 1H, H-1'), 7,48 (d, 1H, J_S6=3,6 Hz, H-5), 7,59 (d, 1H, H-6), 8,13 (s, 1H, H-2).

LS-MS: nalezeno 321,1(M+H⁺); vypočteno pro C₁₅H₂₀N₄O₄+H⁺:

320,3.

Příklad 34

4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-xylofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cř]py ri m i d i n

Krok A: 7-[2,5-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-3-D-ribofuranosyl]-4[(4-methoxyfenyl)difenylmethyl]-7H-pyrro1o[2,3-cf]pyrÍmidin a

7-[3,5-bis-O-(tert-butyldi-methylsilyl)-3-D-ribofuranosyl]-4[(4-methoxyfenyl)difenylmethyl]-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K roztoku směsi sloučenin z kroku A Příkladů 26 a 27 (0,32 g, 0,65 mmol) v bezvodém pyridinu (6 ml) byl přidán monomethoxytritylchlorid (0,30 g, 0,98 mmol) a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Pak byla směs zahuštěna a zbytek byl rozdělen mezi dichlormethan (70 ml) a vodu (20 ml). Organická vrstva byla promyta vodou a solným roztokem, vysušena nad síranem sodným a zahuštěna. Zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití 5-13% ethylacetátu v hexanech jako eluentu. Příslušné podíly byly spojeny a zahuštěny k získání 2',5'-bis-O-(řerř-butyldimethylsilyI)em a 3',5'-bis-0-(řerř-butyldimethylsilyl)em chráněných nukleosidů, v obou případech ve formě bezbarvé pěny (343 mg a 84 mg).

Krok B: 7-[2,5-bis-0-(řerř-butyldimethylsilyl)-p-D-eryf/?ro-pentofuranóz-3-ulosyl]-4-[(4-methoxyfenyl)difenylmethyl]amino-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K dobře míchané suspenzi oxidu chromového (91 mg, 0,91 mmol) v dichlormethanu (4 ml) byl při 0 °C přidán pyridin (147 μΙ, 1,82 mmol) a poté anhydrid kyseliny octové (86 μΙ, 0,91 mmol). Směs byla míchána 30

- 87 minut při teplotě místnosti. Poté byl přidán 2',5'-bis-O-(řerř-butyldimethylsilyl)em chráněný nukleosid z kroku A (343 mg, 0,45 mmol) v dichlormethanu (2,5 ml) a směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak byla vlita do ledově studeného ethylacetátu (10 ml) a zfiltrována přes krátký sloupec silikagelu za použití ethylacetátu jako eluentu. Filtrát byl odpařen a získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití hexanů a soustavy hexany/ethylacetát (7:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny (180 mg).

Krok C: 7-[2,5-bis-O-(řerř-butyldimethylsilyl)-3-C-methyl-p-D-ribofuranosyl]-4-[(4-methoxyfenyl)dífenylmethyl]amino-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin a 7-[2,5-bis-O-(řerř-butyldimethylsilyl)-3-C-methyl-p-D-xylofuranosyl]-4-[(4-methoxyfenyl)difenylmethyl]amino-7/-/-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidin

Ke směsi CH₃MgBr (3,0 mol.l'¹ roztok v etheru; 0,17 ml, 0,5 mmol) v bezvodých hexanech (1,5 ml) byl při teplotě místnosti po kapkách přidán roztok sloučeniny z kroku B (78 mg, 0,1 mmol) v bezvodých hexanech (0,5 ml). Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti byla reakční směs vlita do ledově studené vody (10 ml), naředěna ethylacetátem (20 ml) a zfiltrována přes vrstvu celitu, který pak byl důkladně promyt ethylacetátem. Došlo k oddělení vrstev a organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena nad síranem sodným a zahuštěna. Získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití 8-25% ethylacetátu v hexanech jako eluentu k poskytnutí 3-C-methylxylo-isomeru (60 mg) a 3-C-methylribo-isomeru (20 mg).

Krok D: 4-amino-7-(3-C-methyl-3-D-xylofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cf]pyrimidin

K ledově chladnému roztoku 3-C-methylxylo-isomeru z kroku C (60 mg, 0,08 mmol) v THF (2 ml) byl přidán TBAF (1 mol.1-1 roztok v THF;

0,32 ml, 0,32 mmol). Reakční směs byla míchána 5 hodin při teplotě místnosti, naředěna dichlormethanem (50 ml), promyta vodou (3 x 15 ml), vysušena a odpařena. Zbytek byl rozpuštěn v dioxanu (0,3 ml) a přidána byla 80% kyselina octová (3 ml). Reakční směs byla míchána 1 den při teplotě místnosti a poté odpařena. Zbytek byl společně odpařen s dioxanem, převeden do vody (50 mi) a promyt dichlormethanem (2 x 10 ml). Vodná vrstva byla zahuštěna a pak lyofilizována. Získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy dichlormethan/methanol (20:1 a 10:1) jako eluentu k poskytnutí v nadpisu uvedené sloučeniny po lyofilizaci ve formě bílé chmýřovité sloučeniny (10 mg).

Ή NMR (CD₃CN): 5 1,28 (s, 3H, CH₃), 3,56 (br s, 1H, OH), 3,78 (m, 3H, H-4', H-5', H-5), 4,10 (br s, 1H, OH), 4,44 (d, 1H, J₂.,.=3,9 Hz, H-2'), 5,58 (d, 1H, H-1'), 5,85 (br s, 2H, NH₂), 6,15 (br s, 1H, OH), 6,48 (d, 1H, H-6), 8,11 (s, 1 Η, H-2).

ES-MS: 281 [MH]⁺.

Příklad 35

4-amino-7-(3-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K získání v nadpisu uvedené sloučeniny (4 mg) byl ribo-isomer (20 mg) z Příkladu 32, Kroku C, zbaven ochranné skupiny za použití postupu, popsaného v Příkladu 32, Kroku D.

• ·

4444

- 89 • · • 4 • 444

4 ' ·· ¹H NMR (CD₃CN): 5 1,43 (s, 3H, CH₃), 3,28 (br s, 1H, OH), 3,58 (m, 2H, H-5', H-5), 3,99 (m, 1H, H-4'), 4,10 (br s, 1H, OH), 4,62 (d, 1H, 3,.=8,1 Hz, H-2'), 5,69 (d, 1H, H-1'), 5,88 (br s, 3H, OH, NH₂), 6,45 (br s, 1H, OH), 6,51 (d, 1 H, 3₆=3,7 Hz, H-5), 7,19 (d, 1H, H-6), 8,12 (s, 1H, H-2).

ES-MS: 281 [MH]⁺.

Příklad 36

2,4-diamino-7-(2-C-methy!-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

Směs produktu z Příkladu 4, Kroku B (24 mg) ve vodném roztoku amoniaku (30%, 10 ml) byla v nerezovém autoklávu přes noc zahřívána na teplotu 100 °C, poté byla ochlazena a odpařena. Získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy methylchlorid/methanol (10:1 a 5:1) jako eluentu k získání v nadpisu uvedené sloučeniny (15 mg).

¹H NMR (DMSO-c/6): δ 0.68 (s, 3H, CH₃), 3,48-3,58 (m, 1H, H-5'), 3,68-3,73 (m, 2H, H-5, H-4'), 3,84 (m, 1H, H-3'), 4,72 (s, 1H, 2'-OH), 4,97-5,03 (m, 2H, 3'-OH, 5'-OH), 5,45 (br s, 2H, NH₂), 6,00 (s, 1H, H-1'), 6,28 (d, 1H, J=3,7 Hz, H-5), 6,44 (br s, 1H, NH₂), 6,92 (d, 1H, J=3,7 Hz, H-6).

ES-MS: 294,1 (M-H⁺).

Příklad 37

4-amino-2-fluor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrro-

K roztoku HF/pyridinu (70%, 2 ml), naředěnému pyridinem (1 ml) při -30 °C, byla přidána sloučenina z Příkladu 36 (60 mg, 0,2 mmol) v 0,5 ml pyridinu a následně tert-butyInitrit (36 μΙ, 0,3 mmol). Míchání pokračovalo 5 minut při -25 °C a poté byl roztok vlit do ledově studené vody (5 ml), neutralizován 2 mol.l'¹ vodným roztokem NaOH a odpařen do sucha. Získaný zbytek byl čištěn na sloupci silikagelu za použití soustavy dichlormethan/methanol (20:1 a 10:1) jako eluentu k získání v nadpisu uvedené sloučeniny.

Příklad 38

4-amino-5-fluor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cřjpyrimidin

HO

O.

HÓ OH

Krok A: 4-acetylamino-7-(2,3,5-tri-O-acetyl-2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K roztoku sloučeniny z Příkladu 2, Kroku F (280 mg, 1,00 mmol) v pyridinu byl přidán anhydrid kyseliny octové (613 mg, 6,0 mmol). Výsledný roztok byl míchán přes noc při teplotě místnosti, odpařen pod vakuem a výsledná surová směs byla čištěna na silikagelu za použití soustavy acetát/hexan jako eluentu. Podíly, obsahující požadovaný produkt, byla spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu.

Krok B: 4-acetylamino-5-brom-7-(2,3,5-tri-0-acetyl-2-C-methyl-p-Dribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidin

K předem vychlazenému (0 °C) roztoku sloučeniny z Kroku A (460 mg, 1,00 mmol) v DMF byl přidán N-bromsukcinimid (178 mg, 1,0 mmol) v DMF. Výsledný roztok byl míchán 30 minut při 0 °C a poté dalších 30 minut při teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přídavkem methanolu a reakční směs byla odpařena pod vakuem, výsledná surová směs byla čištěna na silikagelu za použití soustavy ethylacetát/hexan jako eluentu.

v

Podíly, obsahující požadovaný produkt, byla spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu.

Krok C: 4-acetylamino-5-fluor-7-(2,3,5-tri-O-acetyl-2-C-methyl-3-Dribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin

K předem vychlazenému (0 °C) roztoku sloučeniny z Kroku B (529 mg, 1,00 mmol) v THF bylo přidáno butyllithium (2 mol.l'¹ v hexanech) (0,5 ml, 1,00 mmol). Výsledný roztok byl míchán 30 minut při -78 °C a reakce byla zastavena N-fluorbenzensulfonimidem (315 mg, 1,00 mmol) v THF. Výsledný roztok byl ponechán velmi pomalu přejít na teplotu

místnosti a poté byl vlit do míchané směsi nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a dichlormethanu. Organická fáze byla odpařena pod vakuem a přes noc ovlivňována při 55°C v uzavřeném zásobníku hydroxidem amonným. Výsledná surová směs byla čištěna na silikagelu za použití soustavy dichlormethan/methanol jako eluentu. Frakce s obsahem požadovaného produktu byly spojeny a odpařeny pod vakuem k poskytnutí požadovaného produktu.

BIOLOGICKÁ STANOVENÍ

Dále jsou popsána stanovení, používaná k měření inhibice NS5B polymerázy HCV a replikace HCV.

Účinnost sloučenin podle předkládaného vynálezu jako inhibitorů NS5B RNA-dependentní RNA-polymerázy (RdRp) HCV byla měřena v následujícím stanovení.

A. Stanovení inhibice NS5B polymerázy HCV:

Toto stanovení bylo použito k měření schopnosti nukleosidových derivátů podle předkládaného vynálezu inhibovat enzymovou aktivitu RNA-dependentní RNA-polymerázy (NS5B) viru hepatitidy C (HCV) na templátu heteromerní RNA.

Postup:

Poměry pufru pro stanovení: (50 μΙ -celkem/reakci) mmol.I'¹ Tris, pH 7,5 μΠΊοΙ.Ι’¹ EDTA mmol.l'¹ DTT (dithiothreitol)· mmol.l’¹ MgCI₂ mmol.l’¹ KCI

0,4 U/μΙ RNAsin (Promega, zásobní je 40 jednotek/μΙ)

0,75 pg t500 (500-nt RNA, vytvořená za použití T7 runoff transkripce sekvence z oblasti NS2/3 genomu hepatitidy C)

1,6 pg čištěné NSB5 hepatitidy C (vytvořené s 21 aminokyselinami C-koncově zkrácenými) pmol.l'¹ ATP, CTP, UTP, GTP (směs nukleosidtrifosfátů) [ct-³²P]-GTP nebo [ot-³³P]-GTP

Sloučeniny byly testovány při různých koncentracích až do konečné koncentrace 100 pmol.l'¹.

Připraven byl příslušný objem reakčního pufru, zahrnujícího enzym a templát t500. Nukleosidové deriváty podle předkládaného vynálezu byly pipetovány do jamek mikrotitrační destičky o 96 jamkách. Připravena byla také směs nukleosidtrifosfátů (NTP) včetně radioaktivně označeného GTP a napipetována do jamek mikrotitrační destičky o 96 jamkách. Reakce byla zahájena přidáním enzymově templátového reakčního roztoku a ponechána probíhat 1 až 2 hodiny při teplotě místnosti.

Tato reakce byla zastavena přídavkem 20 pl 0,5 mol.l'¹ roztoku EDTA o pH 8,0. Zahrnuty byly také srovnávací slepé reakce, u nichž byl ukončovací roztok přidán ke směsi NTP před přídavkem reakčního pufru.

μΙ reakční směsi bylo po ukončení reakce naneseno na filtrové kotouče DE81 (Whatman) a ponecháno uschnout po dobu 30 minut. Filtry byly promyty 0,3 mol.l'¹ roztokem mravenčanu amonného o pH 8 (150 ml/promytí až do té doby, než počet impulzů za minutu, tj. cpm, nebyl v objemu 1 ml promývacího roztoku menší než 100; obvykle 6 promytí). Filtry byly odečítány v 5 ml scintilační tekutiny za použití scintilačního počítače.

- 94 Procento inhibice bylo počítáno podle následující rovnice: procento inhibice = [1-(cpm v testované reakci - cpm ve slepé reakci)/cpm v kontrolní reakci - cpm ve slepé reakci)] x 100

Reprezentativní sloučeniny, testované ve stanovení NS5B polymerázy HCV, vykazovaly menší než 100 mikromolární IC₅₀.

B. Stanovení inhibice RNA replikace u HCV

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu byly také hodnoceny vzhledem ke schopnosti ovlivnit replikaci RNA viru hepatitidy C v kultivovaných jaterních buňkách (HuH-7), obsahujících subgenomový HCV replikon. Podrobnosti tohoto stanovení jsou popsány níže. Toto replikonové stanovení je modifikací postupu, popsaného V. Lohmannem, F. Kornerem, J. O. Kochem, U. Herianem, L. Theilmannem, a R. Bartenschlagerem: Replication of a Sub-genomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line, Science 285, 110, 1999.

Postup:

Stanovením prováděným in šitu bylo plotnové stanovení Ribonuclease protection, Scintilation Proximity based-plate assay, (SPA). 10 000 až 40 000 buněk bylo pěstováno v 100 až 200 μΙ média obsahujícího 0,8 mg/ml G418 v destičkách Cytostar o 96 jamkách (Amersham). Testované sloučeniny byly k buňkám přidávány v různých koncentracích až do 100 pmol.l'¹ v 1% DMSO (dimethylsulfoxidu) v čase 0 až 18 hodin a poté byly kultivovány 24 až 96 hodin. Buňky byly fixovány (20 minut, 10% formaldehyd), permeabilizovány (20 minut, 0,25% Triton X-100/fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, tj. PBS) a hybridizovány (přes noc, 50 °C) s jednovláknovou ³³P RNA-sondou komplementární k (+) vláknu NS5B (nebo jiným genům obsaženým v RNA virovém genomu). Poté byly buňky promyty, ovlivněny RNAázou

promyty, zahřátý na 65 °C a počítány v zařízení Top-Count. Inhibice replikace byla odečítána jako snížení impulzů za minutu (cpm).

Lidské jaterní buňky HuH-7, které byly zvoleny tak, aby obsahovaly subgenomický replikon, nesou cytoplasmatickou RNA sestávající z oblasti, regionu HCV, u kterého nedochází k 5' translaci (NTR, 5' non-translated region HCV) neomycinem volitelného markéru, EMCV IRES (internal ribosome entry site, vnitřní místo pro vstup ribosomu) a nestrukturní proteiny NS3 až NS5B viru hepatitidy C, po nichž následuje 3' NTR.

Reprezentativní sloučeniny, testované ve stanovení replikace, vykázaly menší než 100 mikromolární EC_S0.

Nukleosidové deriváty podle předkládaného vynálezu byly rovněž hodnoceny vzhledem k buněčné toxicitě a protivirové specifičnosti ve stanoveních popsaných níže.

C. Protistanovení (Counterscreens)

Schopnost nukleosidových derivátů podle předkládaného vynálezu inhibovat lidské DNA-polymerázy byla měřena v následujících stanoveních.

a, inhibice lidské DNA-polymerázy alfa a beta:

Reakční podmínky: reakční objem = 50 μΙ

Složky reakčního pufru: 200 mmol.l'¹ Tris-HCl, pH 7,5

200 μg/ml hovězí sérový albumin 100 mmol.l'¹ KCI

mmol.l'¹ β-merkaptoethanol 10 mmol.l'¹ MgCI₂1,6 umol.PdA, dG, dC, dTTP a-³³P-dATP

Enzym a templát: 0,05 mg/ml DNA templátu s chybějícími úseky z rybího spermatu

0,01 U/μΙ DNA-polymerázy alfa nebo beta • Příprava DNA templátu s chybějícími úseky z rybího spermatu:

μΙ 1 moi.l'¹ roztoku MgCI₂ se přidá k 500 μΙ aktivované DNA z rybího spermatu (USB 70076);

směs se zahřeje na 37 °C a přidá se 30 μ| exonukleázy III, 65 U/μΙ (Gibco BRL 18013-011);

inkubuje se 5 minut při 37 °C;

reakce se ukončí zahříváním na 65 °C po dobu 10 minut; alikvotní podíly o objemu 50 až 100 μΙ se nanesou na chromatografické sloupce Bio-spin 6 (Bio-Rad 732-6002), ekvilibrované 20 mmol.l'¹ Tris-HCI o pH 7,5;

eluují se odstředěním při 1 000 x g po dobu 4 minut;

eluát se shromáždí a ke stanovení koncentrace se měří jeho absorbance při 260 nm.

i

Templáty DNA byly naředěny do příslušného objemu pomocí 20 ’ mmol.l¹ Tris-HCI o pH 7,5 a enzym byl naředěn do příslušného objemu pomocí 20 mmol.l'¹ Tris-HCI s obsahem 2 mmol.l'¹ β-merkaptoethanolu a 100 mmol.l'¹ KCI. Templát a enzym byly pipetovány do mikrocentrifugačních zkumanek nebo do jamek 96-jamkové destičky. Slepé reakce bez přítomnosti enzymu a kontrolní reakce bez přítomnosti testované sloučeniny byly rovněž připraveny za použití pufru pro

A·· ···· • ··· • · «

- 97 naředění enzymu, respektive rozpouštědla testované sloučeniny. Reakce byla zahájena reakčním pufrem se sloučeninami, uvedenými výše. Tato reakce byla inkubována 1 hodinu při 37 °C. Poté byla zastavena přídavkem 20 μΙ 0,5 mol.l'¹ roztoku EDTA. 50 μΙ zastavené reakce bylo naneseno na filtrační kotouče Whatman DE81 a vysušeno vzduchem. Filtrační kotouče byly opakovaně promývány 150 ml 0,3 mol.l·¹ roztoku mravenčanu amonného o pH 8 do té doby, dokud v 1 ml promývacího roztoku nebylo méně než 100 cpm. Poté byly kotouče dvojnásobně promyty 150 ml absolutního ethanolu a jednou 150 ml bezvodého etheru, vysušeny a odečteny v 5 ml scintilační tekutiny.

Procento inhibice bylo počítáno podle následující rovnice: procento inhibice = [1-(cpm v testované reakci - cpm ve slepé reakci)/cpm v kontrolní reakci - cpm ve slepé reakci)] x 100

b. inhibice lidské DNA-polymerázy gamma:

Schopnost inhibice lidské DNA-polymerázy gamma byla měřena v reakcích, které zahrnovaly 0,5 ng/μΙ enzymu; 10 mmol.l'¹ dATP, dGTP, dCTP a TTP; 2 pCi/reakci [cc-³³P]-dATP a 0,4 pg/μΙ aktivované rybí spermatické DNA (získané od US Biochemical) v pufru, obsahujícím 20 mmol.l'¹ Tris o pH 8, 2 mmol.l'¹ β-merkaptoethanolu, 50 mmol.l'¹ KCI, 10 mmol.l'¹ MgCI₂ a 0,1 pg/μΙ hovězího sérového albuminu. Reakce byly ponechány probíhat 1 hodinu při 37 °C a byly ukončeny přídavkem 0,5 mol.l'¹ EDTA do konečné koncentrace 142 mmol.l'¹. Tvorba produktu byla kvantifikována aniontově výměnnou vazbou na filtr a scintilačním měřením. Sloučeniny byly testovány až do koncentrace 50 pmol.l'¹.

Schopnost nukleosidových derivátů podle předkládaného vynálezu inhibovat infekčnost HIV a rozšiřování HIV byla měřena v následujících stanoveních.

c. Stanovení infekčnosti HIV

Stanovení probíhala s variantou buněk HeLa Magi, exprimující jak CXCR4, tak i CCR5, zvolenou pro nízké pozadí β-galaktosidázové (β-gal) exprese. Buňky byly infikovány 48 hodin a produkce β-gai integrovaným HIV-1 LTR promotorem byla kvantifikována za pomoci chemiluminiscentního substrátu (Gaiactolight Plus, Tropix, Bedford, MA). Inhibitory byly titrovány (duplicitně) v dvojnásobných sériových náředěních, počínajících koncentrací 100 pmol.l'¹; procentní inhibice při každé koncentraci byla počítána ve vztahu ke kontrolní infekci.

d. Inhibice rozšiřování HIV

Schopnost sloučenin podle předkládaného vynálezu inhibovat rozšiřování viru lidské imunodeficience (HIV) byla měřena metodou popsanou v patentu US č. 5 413 999 (9. 5. 1995) a J. P. Vaccou se * spoluautory v Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 4096-4100, 1994, což je zde začleněno ve své úplnosti jako odkaz.

Nukleosidové deriváty podle předkládaného vynálezu byly také i

hodnoceny vzhledem ke své cytotoxicitě vůči kultivovaným jaterním » buňkám HuH-7, obsahujícím subgenomický replikon HCV, ve stanovení využívajícím buňky MTS, jak je popsáno ve stanovení uvedeném níže.

Buněčná linie HuH-7 je popsána H. Nakabayashím a spoluautory v Cancer Res. 42. 3858, 1982.

e. Stanovení cytotoxicity

- 99 ·· ·· > · · » · · · · ·« «···

Buněčné kultury byly připraveny ve vhodných médiích v koncentracích přibližně 1,5 x 10⁵ buněk/ml pro suspenzní kultury inkubované 3 dny a 5,0 x 10⁴ buněk/ml pro adherentní kultury, inkubované rovněž 3 dny. 99 μΙ buněčné kultury bylo převedeno do jamek destičky pro tkáňovou kultivaci o 96 jamkách a přidán byl 1 μΙ stonásobné konečné koncentrace testované sloučeniny v DMSO. Destičky byly inkubovány určené časové období při 37 °C a v přítomnosti 5% CO₂. Po uplynutí doby inkubace bylo přidáno 20 μΙ reakčního činidla CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay reagent, MTS (Promega) do každé jamky a destičky byly inkubovány při 37 °C po další časové období až do 3 hodin a za přítomnosti 5% CO₂.

Poté byly destičky protřepány k promíchání každé jamky a při vlnové délce 490 nm byla odečítána absorbance v zařízení pro odečet destiček. Standardní křivka buněk v suspenzní kultuře byla stanovena se známým počtem buněk těsně před přidáním reakčního činidla MTS. Metabolicky aktivní buňky redukují MTS na formazan. Formazan absorbuje při vlnové délce 490 nm. Absorbance při 490 nm v přítomnosti sloučeniny podle vynálezu byla srovnána s absorbancí buněk bez přídavku jakékoliv sloučeniny. Odkaz: A. H. Cory se spoluautory, Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in cuiture, Cancer Commun 3, 207, 1991.

Následující stanovení byla prováděna ke stanovení aktivity sloučeniny podle předkládaného vynálezu vůči jiným RNA-dependentním RNA-virům.

a. Stanovení protivirové aktivity sloučenin in vitro vůči rhinoviru (stanovení inhibice cytopatického účinku).

·· ·· · ·· 44 4444 ··· ·· · 4 ·· 4 • · 444 · 4 4 4 4 4

- 100 Podmínky stanovení jsou popsány v článku Sidwella a Huffmana Use of disposable microtissue culture plates for antiviral and interferon induction studies, Appl. Microbiol. 22, 797-801, 1971.

Viry:

Použit byl rhinovirus typu 2 (RV-2) kmene HGP, spolu s buňkami KB a mediem (0,1% NaHCO₃ bez přídavku antibiotik), jak je uvedeno v práci Sidwella a Huffmana. Virus, získaný z ATCC (Americké sbírky typů kultur, American type Culture Collection v Rockvillu, MD), pocházel z výtěru z krku dospělého muže s mírným akutním horečnatým onemocněním horních cest dýchacích.

Rhinovirus typu 9 (RV-9), kmene 211 a rhinovirus typu 14 (RV-14), kmene Tow, byly rovněž získány z ATCC v Rockvillu. RV-9 pocházel z výplachu z krku a RV-14 pocházel z výtěru z krku mladého dospělého člověka s onemocněním horních cest dýchacích. Oba tyto viry byly použity u buněk HeLa Ohio-1 (Dr. Fred Hayden, Univ. of VA), což byly lidské rakovinné buňky poševního epiteliálu. Jako růstové médium bylo použito MEM (Eaglovo minimální esenciální médium) s přídavkem 5% fetálního hovězího séra (FBS) a 0,1% NaHCO₃.

Mediem protivirového testu bylo u všech tří typů viru MEM s přídavkem 5% FBS, 0,1% NaHCO₃, 50 μς gentamicinu/ml a 10 mmol.l'¹MgCI₂.

Nejvyšší koncentrací, použitou v testování sloučenin podle předkládaného vynálezu, bylo 2 000 μg/ml. Virus byl na destičku přidán přibližně 5 minut po testované sloučenině. Současně probíhaly vlastní kontroly. Destičky byly inkubovány při 37 °C ve zvlhčovaném vzduchu za přítomnosti 5 % CO₂ . Cytotoxicita byla u kontrolních buněk sledována mikroskopicky, s ohledem na morfologické změny. Regresní analýza

101 -

údajů o cytopatickém účinku (CPE údajů), týkajících se viru a kontrolních údajů, týkajících se toxicity, poskytla ED₅₀ (50% účinnou dávku) a CC₅₀ (50% cytotoxickou koncentraci). Index selektivity (SI) byl počítán podle vzorce:

SI = CC₅₀/ED₅₀

b. Stanovení antivirové aktivity sloučenin in vitro vůči Dengue viru,

Banzi viru a viru žluté horečky (stanovení inhibice CPE).

Podrobnosti stanovení jsou poskytnuty v Sidwellově a Huffmanově odkazu, viz výše.

Viry:

Virus Dengue typu 2, kmen New Quinea, byl získán z Centra pro kontrolu nemocí (Center for Disease Control). Dvě linie ledvinných buněk opic afrického kočkodana byly použity ke kultivaci viru (Věro) a k provedení protivirového testování (MA-104). Virus žluté zimnice, kmen 17D, připravený z infikovaného myšího mozku a virus Banzi, kmen H 336, izolovaný ze séra horečnatého chlapce z Jižní Afriky, byly oba získány z ATCC. Buňky Věro byly použity s oběma těmito viry a pro stanovení.

Buňky a média:

Buňky MA-104 (Bio Whittaker, lne., Walkersville, MD) a buňky Věro (ATCC) byly použity v Médiu 199 s 5% FBS a 0,1% NaHCO₃ bez přídavku antibiotik.

Médiem pro stanovení virů Dengue, žluté zimnice a Banzi bylo MEM s 2% FBS, 0,18% NaHCO₃ a 50 gg gentamicinu/ml.

Testování antivirového působení sloučenin podle předkládaného vynálezu bylo prováděno podle odkazu za práci Sidwella a Huffmana a

- 102 podobně jako v případu protivirového působení vůči rhinoviru. Odpovídající odečty cytopatického účinku (CPE, cytopathic effect) byly u každého z uvedených virů získány po 5 až 6 dnech.

c. Stanovení antivirové aktivity sloučenin in vitro vůči viru West

Nile (stanovení inhibice CPE).

Podrobnosti stanovení jsou poskytnuty v odkazu na práci Sidwella a Huffmana, viz výše. Virus West Nile, izolát New York, získaný z vraního mozku, byl získán z Centra pro kontrolu chorob. Buňky Věro byly pěstovány a použity tak, jak bylo popsáno výše. Testovacím médiem bylo MEM s 1% FBS, 0,1% NaHC0₃ a 50 pg gentamicinu/ml.

Testování antivirového působení sloučenin podle předkládaného vynálezu bylo prováděno podle odkazu za práci Sidwella a Huffmana a podobně jako . v případu protivirového působení vůči rhinoviru. Odpovídající odečty cytopatického účinku (CPE, cytopathic effect) byly získány po 5 až 6 dnech.

d. Stanovení antivirové aktivity sloučenin in vitro vůči rhinoviru, viru žluté zimnice, viruDengue, viru Banzi a viru West Nile (stanovení absorbce neutrální červeně).

Po provedení stanovení inhibice CPE viz výše, byla použita další metoda cytopatické detekce, která je popsána v práci Microtiter Assay for Interferon: Microspectrophotometric Quantitation of Cytopathic Effect, Appl. Environ. Microbiol. 31. 35-38. 1976. K odečítání pokusných destiček byl používán odečítač mikrodestiček firmy Bio-Tek Instruments lne., model EL 309. Hodnoty ED₅₀ a GD₅₀ byly vypočítány tak, jak bylo uvedeno výše.

• ···

-103Příkladv farmaceutických prostředků

Jako specifické ztělesnění orálního prostředku s obsahem sloučeniny podle předkládaného vynálezu se formuje 50 mg sloučeniny z Příkladu 1 nebo Příkladu 2 s dostatečně jemně dělenou laktózou k poskytnutí celkového množství 580 až 590 mg k naplnění do tvrdé želatinové tobolky o velikosti O.

I když tento vynález byl popsán a ozřejměn ve vztahu ke svým specifickým ztělesněním, odborníci v oboru ocení, že lze učinit různé změny modifikace a náhrady, aniž by byi překročen rozsah nebo smysl předkládaného vynálezu. Například lze použít účinné dávkování, které je odlišné od upřednostňovaných dávek uváděných výše, a to v důsledku změn citlivosti lidí léčených z infekcí hepatitidy C o různé závažnosti. Podobně se může pozorovaná farmakologická odpověď lišit v závislosti na konkrétní zvolené aktivní sloučenině nebo v závislosti na tom, zda jsou přítomné farmaceutické nosiče, stejně jako na typu prostředku a použitém způsobu jeho podávání. Takové očekávané varianty nebo rozdíly ve výsledcích jsou předpokládány ve shodě s předměty a praxí podle předkládaného vynálezu. Předpokládá se tedy, že tento vynález bude omezován pouze rozsahem následujících nároků a že tyto nároky budou chápány tak široce, jak je přiměřené.

Zastupuje:

'^12003- QJDVS'

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina o strukturním vzorci I:

(0 nebo její farmaceuticky přijatelné sole;

přičemž R¹ je C₂.₄alkenyl, C₂.₄ alkynyl nebo C_V4 alkyl, kde alkyl je buď nesubstituovaný, nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, Ο_ν4 alkoxyskupinou, C_v4 alkylthioskupinou, nebo 1-3 fluorovými atomy;

R² je atom vodíku, fluoru,- hydroxyskupina, merkaptoskupina, C5.4 alkoxyskupina, nebo Ον4 alkyl; nebo R¹ a R² společně s uhlíkovým atomem, na nějž jsou připojeny, vytvářejí 3-6 členný nasycený monocyklický kruhový systém, volitelně obsahující heteroatom, zvolený z atomu kyslíku, síry a NC0.₄ alkylu;

R³ a R⁴ jsou každý nezávisle zvolené ze skupiny, sestávají z vodíkového atomu kyanoskupiny, azidoskupiny, halogenu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, aminoskupiny, C₁.₄alkoxyskupiny, C₂.₄alkenylu, C₂.₄alkynylu a C₁.₄alkylu, kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C₁.₄alkoxyskupinou, Ο₄.₄alkylthioskupinou nebo 1-3 atomy fluoru;

- 105 R⁵ je vodíkový atom, C₁.₁₀aikylkarbonyl, P₃O₉H₄, P₂O₆H₃ nebo

P(O)R¹³R¹⁴;

R⁶ a R⁷ jsou každý nezávisle vodíkový atom, methylová skupina, hydroxymethylová skupina nebo fluormethylová skupina;

R⁸ je vodíkový atom, C^alkyl, C₂.₄alkynyl, halogenový atom, kyanoskupina, karboxyskupina, C^alkyloxykarbonylová skupina, azidoskupina, aminoskupina, C.,.₄alkylaminoskupina, diíC^alkyljaminoskupina, hydroxyskupina, C^galkoxyskupina, 0_ν6alkylthioskupina, C^alkylšulfonylová skupina, (0_ν4 alkyl)₀.₂aminomethylová skupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, C^alkylu a C^alkoxylu;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, nitroskupina, C1.3alkyl, NHCONH2, CONR¹²R¹², CSNR¹²R¹², COOR¹²' C(=NH)NH2, hydroxyskupina, C₁.₃alkoxyskupina, aminoskupina,

C₁.₄alkylaminoskupina, diíC^alky^aminoskupina, halogenový atom, (1,3-oxazol-2-yl), (1,3-thiazol-2-yl), nebo (imidazol-2-yl); kde alkyl je nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 3 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, aminoskupiny, hydroxyskupiny, karboxyskupiny a Ο_ν3 alkoxyskupiny;

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, hydroxyskupina, halogenový atom, C^alkoxyskupina, aminoskupina,

C^alkylaminoskupina, diCC^alkyljaminoskupina, C₃.₆cykioalkylaminoskupina, di(C₃.₆cykloalkyl)aminoskupina nebo C₄.₆cykloheteroalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 2 skupinami, nezávisle zvolenými z halogenového atomu, hydroxyskupiny, aminoskupiny, C^alkylu a C^alkoxyskupiny;

- 106 každý R¹²je nezávisle vodíkový atom nebo C.,.₆alkyl; a

R¹³ a R¹⁴ jsou každý nezávisle hydroxyskupina, OCH₂CH₂SC(=O) C^alkyl, OCH₂O(C=O)OC₁.₄alkyl, NHCHMeCO2Me (kde Me = methyl), OCH₂(C₁.₄alkyl)O(C=O) C^alkyl,

Ao'^Y^S(CH₂)iiCH₃ ^O'~'y'^S(CH₂)₁₇CH₃O(CH₂)₉CH₃ nebo OCO(CH₂)₁₄CH₃ .

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl a R⁴ je vodíkový atom nebo R⁴je β-methyl a R¹ je vodíkový atom, R² a R³ jsou α-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.
2. Sloučenina podle nároku 1 o strukturním vzorci II:

nebo její farmaceuticky přijatelné sole;

kde R¹ je C₁.₃alkyl, přičemž alkyl je volitelně substituovaný hydroxyskupinou, aminoskupinou, C^alkoxylem, C^alkylthioskupinou nebo 1-3 atomy fluoru;

- 107 R² je hydroxyskupina, fluorová skupina nebo C.,.₄alkoxyskupina;

R^{3 *} je vodíkový atom, halogenový atom, hydroxyskupina, aminoskupina nebo C₁.₄alkoxyskupina;

R^{5 * *} je vodíkový atom, P₃O_gH₄, P₂O₆H₃ nebo PO₃H₂;

R⁸je vodíkový atom, aminoskupina nebo C₁.₄alkylaminoskupina;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, methylová skupina, halogenový atom nebo CONH₂; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, halogenový atom, hydroxyskupina, aminoskupina, C₁.₄alkylaminoskupina, d i (C ₁_₄alky I)aminoskupina nebo C₃.₆cykloalkylaminůskupina;

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl, R² a R³ jsou cú-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.
3. Sloučenina podle nároku 2, přičemž

R¹ je je methyl, fluormethyl, hydroxymethyl, difluormethyl, trifluormethyl nebo aminomethyl;

R² je hydroxyskupina, fluoroskupina nebo methoxyskupina;

R³ je vodíkový atom, fluoroskupina, hydroxyskupina, aminoskupina nebo methoxyskupina;

R⁵je vodíkový atom nebo P₃O₉H₄;

R⁸ je vodíkový atom nebo aminoskupina;

R⁹ je vodíkový atom, kyanoskupina, methylová skupina, halogenový atom nebo CONH₂; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou každý nezávisle vodíkový atom, fluoroskupina, hydroxyskupina nebo aminoskupina;

s tou výhradou, že pokud R¹ je β-methyl, R² a R³ jsou α-hydroxyskupiny, R¹⁰ je aminoskupina a R⁵, R⁸ a R¹¹ jsou vodíkový atom, potom R⁹ není kyanoskupinou nebo skupinou CONH₂.

- 108 -
4. Sloučenina podle nároku 1, zvolená ze skupiny, sestávající z: 4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-arbinofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-ď|pyrimidinu, 4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu, 4-methylamino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-tfjpyrimidinu,

4-dimethylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-cyklopropylamino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]-pyrimidinu,

4-ami no-7-(2-C-vi ny Ι-β-D-ri bofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]py rimidinu,

4-amino-7-(2-C-hydroxymethyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrÍmidinu,

4-amino-7-(2>C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrroIo[2,3-d]pyri midinu,

4-amino-5-methyl-7-(2-C-methyl-3’D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2₁3-d]pyrimidinu,

4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-karboxylové kyseliny,

4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu,

4-amino-5-chlor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu,

4-amino-5-fluor-7-(2-C-methy1-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-ď]pyrimidinu,

2,4-diamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

2-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyri midinu, 2-amino-4-cyklopropylamino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyri mid i nu,

2-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-onu,

-109-

4-amino-7-(2-C-ethy l-3-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyri midinu,

4-amino-7-(2-C_;2-O-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrirni dinu,

7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4(3W)-onu,

2-amino-5-methyl-7-(2-C,2-0-dimethyl^-D-ribofuranosyl)-7/7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidinu,

4-amino-7-(3-deoxy-2-C-methyl-p-D-arabinofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidinu,

4-amino-2-fluor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7W-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu,

47amino-7-(3-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ď]pyrimidinu, 4-amino-7-(3-C-methyl-p-D-xylofuranosyJ)-7/7-pyrrolo[2,3-ď]pyrimidinu, 4-amino-7-(2,4-di-C-methy Ι-β-D-ri bofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidinu, a

4-amino-7-(3-deoxy-3-fluor-2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu; a odpovídajících 5'-trifosfátů;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
5. Sloučenina podle nároku 4, zvolená ze skupiny, sestávající z: 4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-arabinofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-amino-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d] pyrimidinu,

4-amino-7-(2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidi nu,

4-amino-5-methyl-7-(2-C-methyl^-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-cř]pyrimidinu,

4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu,

-1104-amino-5-chlor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinu,

4-amino-5-fluor-7-(2-C-methyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-ď]pyrimidinu, a

4-amino-7-(2-C,2-O-dimethyl-3-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-c/]pyrimidinu, a odpovídajících 5'- trifosfátů;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
6. Sloučenina podle nároku 5, kterou je 4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-arabinofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin; nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
7. Sloučenina podle nároku 5, kterou je 4-amino-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin; nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
8. Sloučenina podle nároku 5, kterou je 4-amino-7-(2-C-fluormethyl-p-D-ribofuranosyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin; nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
9. Sloučenina podle nároku 5, kterou je 4-amino-5-chlor-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin; nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
10. Sloučenina podle nároku 5, kterou je 4-amino-5-brom-7-(2-C-methyl-p-D-ribofuranosyl)-7/-/-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin; nebo farmaceuticky přijatelná sůl takové sloučeniny.
11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

- 111 -

• · • · • · · ·'· • · · · • • • • · · • • · • • • • ·· • · • • · • • • • • • • · • • · • · • · • · • · · · · • · • ·

f !
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11, vyznačující se t í m , že je vhodný pro inhibici RNA-dependentní virové RNA-polymerázy, inhibici RNA-dependentní RNA-virové replikace a/nebo pro léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce.
13. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyznačující ►

se t í m , že uvedenou RNA-dependentní virovou RNA-polymerázou je NS5B polymeráza viru hepatitidy C, uvedenou RNA-dependentní RNA-virovou replikací je replikace viru hepatitidy C a uvedenou RNA-dependentní RNA-virovou infekcí je virová infekce hepatitidy C.
14. Způsob inhibice RNA-dependentní virové RNA-polymerázy a/nebo inhibice RNA-dependentní RNA-virové replikace, vyzná č^u j í’c í se t í m , že se savci, který potřebuje takovou inhibici, podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že f uvedenou RNA-dependentní virovou RNA-polymerázou je NS5B ' polymeráza viru hepatitidy C a uvedenou RNA-dependentní RNA-virovou replikací je replikace viru hepatitidy C.
16. Způsob léčby RNA-dependentní RNA-virové infekce, v y z n ač u j í c í s e t í m , že se savci, který potřebuje takovou léčbu, podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
17. Způsob podle nároku 16, v y z n a č u j í c í s e t í m , že RNA-dependentní RNA-virovou infekcí je virová infekce hepatitidy C.
18. Způsob podle nároku 17, v y z n a č u j í c í se t í m , že se používá v kombinaci s léčebně účinným množstvím jiného činidla, účinného vůči viru hepatitidy C.

·· ····
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jako uvedené činidlo, účinné vůči viru hepatitidy C, se použije ribavirin; levovirin; thymosin a-1; inhibitor NS3 serinproteázy; inhibitor inosinmonofosfátdehydrogenázy; interferon-α nebo interferon-a s navázaným polyethylenglykolem, samotný nebo v kombinaci s ribavirinem či levovirinem.
20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jako uvedené činidlo, účinné vůči viru hepatitidy C, se použije interferon-a nebo interferon-a s navázaným polyethylenglykolem, samotný nebo v kombinaci s ribavirinem.
21. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro inhibici RNA-dependentní virové RNA-polymerázy nebo pro inhibici RNA-dependentní RNA-virové replikace u savce.
22. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro· léčbu RNA-dependentní RNA-virové infekce u savce.
23. Použití podle nároku 22, přičemž uvedenou RNA-dependentní RNA-virovou infekcí je infekce hepatitidy C.
24. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva k inhibici RNA-dependentní virové RNA-polymerázy nebo k inhibici RNA-dependentní RNA-virové replikace u savce.
25. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčbě RNA-dependentní RNA-virové infekce u savce.
26. Použití podle nároku 25, přičemž RNA-dependentní RNA-virovou infekcí je infekce hepatitidy C.