CN117362369B - 一锅法合成核苷二磷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一锅法合成核苷二磷酸的方法，其中，包括：1)向核苷的磷酸三乙酯溶液中加入三氯氧磷反应；2)将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中；其中，核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：(8～20)：(8～20)，磷酸三乙酯作为溶剂使用。本发明方法步骤简单，一锅法即可完成二磷酸的形成，成本低，绿色环保，节能低耗，具有较高的产业化应用前景。

Description

一锅法合成核苷二磷酸
技术领域
本发明涉及化学合成技术领域，具体涉及一锅法合成核苷二磷酸。
背景技术
信使核糖核酸(mRNA)的5’端帽子结构(Five-prime cap)(m7GpppN)是在1970年代被发现的，它的存在赋予了mRNA稳定性并使其能够有效翻译。在真核细胞中，除了识别蛋白质合成的起始之外，5’端帽子结构还充当从5’到3’外切核酸酶切割的保护基团，同时也是募集蛋白质因子以进行前体mRNA剪接、聚腺苷酸化和核输出的唯一标识符，它也充当募集起始因子的锚点。甚至，在病毒与固有免疫的博弈中5’端帽子结构也极为重要。因为固有免疫系统对没有5’端帽子结构的RNA具有较高的敏锐度，因此很多病毒进化出了丰富多样的加帽策略。而对这些病毒mRNA的加帽机制研究，已拓展出诸如高效体外RNA加帽系统和自扩增mRNA技术，大大促进了科研型与治疗型mRNA的大规模生产。另外，RNA加帽酶的应用也使微生物转录组的测序和量化成为可能。
根据甲基化修饰的程度不同分为3种帽结构：Cap 0、Cap 1和Cap 2。真核生物的mRNA加帽过程需要多种加帽酶的参与。体外转录制备mRNA，常见的加帽方法包括酶法加帽和共转录加帽。酶法加帽(Enzymatic capping)是基于真核细胞内的加帽原理，酶法加帽反应以体外转录后产物、NTPs、SAM等为底物，利用牛痘病毒加帽酶(Vaccinia CappingEnzyme，VCE)可直接形成帽结构Cap 0。其中牛痘病毒加帽酶具有三种酶活性，包括RNA三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和鸟嘌呤N-7甲基转移酶；在2’-O-甲基转移酶的催化下，可进一步形成帽结构Cap 1或Cap 2。酶法加帽率接近100％，但由于反应过程依赖加帽酶和其他供体，且工艺流程繁琐，不利于工业化生产。共转录加帽(Cotranscribed capping)是在体外转录反应体系中添加帽类似物，在转录起始引入帽类似物，转录完成即可获得带帽结构的mRNA。
二磷酸RNA是加帽过程的起始物料，目前市场上售价及其昂贵，之所以昂贵在因其合成存在大量的难点，而mRNA技术需要快速发展的话其下游原料的合成必须得取得突破性的成果。目前化学合成方法基本上是以下合成路线，采用了3步反应获得二磷酸鸟苷。
该反应步骤相对比较复杂，不利于工业化生成，因此需要寻找一种高效、绿色节能环保的路线。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一锅法合成核苷二磷酸或其盐的方法，采用三氯氧磷得到单磷酸核苷后，不需要后处理，然后加入磷酸和三辛胺的磷酸三乙酯溶液加入进行二磷酸反应得到核苷的二磷酸；特别的当监测核苷的量少于10％～5％时，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液；当监测核苷单磷酸的量少于20％～30％时，淬灭反应会获得更好的结果。
具体的，本发明提供了一种一锅法合成核苷二磷酸或其盐的方法，其中，包括：
1)向核苷的磷酸三乙酯溶液中加入三氯氧磷反应；
2)将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中；
其中，核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：(8～20)：(8～20)，磷酸三乙酯作为溶剂使用。
在一些实施例中，所述磷酸和三辛胺具有相等或相近的摩尔量。
在一些实施例中，所述核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：(10～15)：(10～15)。
在一些实施例中，所述核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：10：10、1：11：11、1：12：12、1：13：13、1：14：14或1：15：15。
在一些实施例中，核苷与三氯氧磷的摩尔比为1：(2～6)。
在一些实施例中，核苷与三氯氧磷的摩尔比为1：(3～4)。
在一些实施例中，核苷与三氯氧磷的摩尔比为1：3、1：4、1：5或1：6。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为-10℃～10℃。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为-5℃～5℃。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为0℃。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应时间为0.5小时～2.5小时。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应时间为1小时～2.2小时。
在一些实施例中，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应时间为2小时。
在一些实施例中，向核苷的磷酸三乙酯溶液中加入三氯氧磷反应，当监测核苷的量少于10％～5％时，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中。
在一些实施例中，向核苷的磷酸三乙酯溶液中加入三氯氧磷反应，当监测核苷的量少于10％～5％时，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中；优选地，当监测核苷的量少于10％、9％、8％、7％、6％或5％时，优选地，核苷的量少于5％时，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中。核苷的量的量保留太多影响最终产率。
在一些实施例中，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中，当监测核苷单磷酸的量少于20％～30％时，淬灭反应。
在一些实施例中，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中，当监测核苷单磷酸的量少于20％、25％、30％时，优选少于25％时，淬灭反应。
在一些实施例中，所述核苷二磷酸具有如式I或I-1所示的结构：
R1和R2各自独立地选自氢、氘、C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选地被1个或多个氘、羟基、氨基、氰基、氧代、卤素取代；优选地，R1和R2各自独立地选自氢、氘或甲基；
Q为修饰或未修饰的嘧啶碱基或修饰或未修饰的嘌呤碱基。
在一些实施例中，所述核苷二磷酸具有如式I-1所示的结构：
其中R1、R2和Q具有本发明所述的定义。
在一些实施例中，Q为修饰或未修饰的鸟嘌呤碱基、修饰或未修饰的腺嘌呤碱基、修饰或未修饰的胞嘧啶碱基、修饰或未修饰的胸腺嘧啶碱基或修饰或未修饰的尿嘧啶碱基。
在一些实施例中，Q为修饰的鸟嘌呤碱基、未修饰的鸟嘌呤碱基、修饰的腺嘌呤碱基、未修饰的腺嘌呤碱基、修饰的胞嘧啶碱基、未修饰的胞嘧啶碱基、修饰的胸腺嘧啶碱基、未修饰的胸腺嘧啶碱基、修饰的尿嘧啶碱基或未修饰的尿嘧啶碱基。
在一些实施例中，所述核苷二磷酸具有以下结构：
有益效果
与现有技术相比，本发明采用一锅法即可获得二磷酸核苷，不但操作简便，而且因涉及物料简单、步骤少、后处理简单，使得最终成本低，符合绿色环保理念，为合成二磷酸核苷开辟了一种新思路，获得了较为理想的实验结果。
术语说明
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％,N+/-2％,N+/-3％,N+/-5％,N+/-7％,N+/-8％,N+/-10％,N+/-15％或N+/-20％值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。
除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。
除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
术语“任选”、“任选地”或“任意、“任意地”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现，并且该描述包括其中所述事件或情形出现的情况以及其中它不出现的情况。例如，“任选地被……取代”是指该取代可以存在或可以不存在。
术语“各自独立的”与“任意地”组合使用时，例如，“各自独立的任意地被…取代”表示具体选项之间互相不影响的被…或者不被…取代。
本发明所述的核苷包含天然存在的核苷、修饰的核苷。如本文所用，修饰的核苷是含有修饰的杂环碱基、修饰的糖部分或其组合的核苷。
术语“烷基”或“烷基基团”，表示含碳原子、饱和的直链或支链烃基基团。在一实施方案中，烷基基团含有1-6个碳原子，即C1-6烷基；在又一实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子，即C1-4烷基；还在一实施方案中，烷基基团含有1-3个碳原子，即C1-3烷基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基及其类似烷基。
1个或多个是指1、2、3、4或5个以上。
术语“取代”指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基。除非特别说明，某个取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的，即各个取代之间是相互独立地。本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。
本发明中，术语“修饰或未修饰的”作为碱基的前缀使用，如修饰或未修饰的嘧啶碱基、修饰或未修饰的嘌呤碱基、修饰或未修饰的鸟嘌呤碱基、修饰或未修饰的腺嘌呤碱基、修饰或未修饰的胞嘧啶碱基、修饰或未修饰的胸腺嘧啶碱基和修饰或未修饰的尿嘧啶碱基，包括修饰和未修饰两种情况，其中修饰的碱基可以是自然界存在的修饰碱基，例如胞嘧啶的5位有甲基或羟甲基修饰，也可以是人造碱基。在一些实施例中，所述修饰或未修饰的嘧啶碱基或修饰或未修饰的嘌呤碱基中的修饰为自然界存在的修饰。本发明中，所述修饰或未修饰的嘧啶碱基为修饰嘧啶碱基或未修饰嘧啶碱基；所述修饰或未修饰的嘌呤碱基为修饰嘌呤碱基或未修饰的嘌呤碱基。
本发明所述盐包括但不限于，钠盐、钾盐、钙盐等。可以是获得核苷二磷酸后实施成盐步骤，根据结构，也可以是在获得核苷二磷酸反应结束时，实施成盐步骤。
相等或相近的摩尔量是指，摩尔比约为1：1，在一些实施例中，相等或相近的摩尔量是指摩尔比为(0.6～1.4)：1；在一些实施例中，相等或相近的摩尔量是指摩尔比为(0.8～1.2)：1；在一些实施例中，相等或相近的摩尔量是指摩尔比为1：1；在一些实施例中，相等或相近的摩尔量是指摩尔比为0.6：1、0.7：1、0.8：1、0.9：1、1：1、1.1：1、1.2：1、1.3：1或1.4：1。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明实施例中的起始原料都是已知并有市售的，或者可以采用或按照本领域已报道的文献资料合成的。
下面提供实施例可以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1：((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-4-羟基-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸的合成
在磷酸三乙酯(50mL)中加入磷酸(32.96g，336.39mmol)，三辛胺(118.98g，336.39mmol)混合均匀，置于室温下搅拌过夜，获得溶液A，备用。
在2-甲氧基鸟苷(10g，33.64mmol)中加入磷酸三乙酯(100mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(三氯氧磷，15.49g，100.92mmol)，-5℃～0℃下反应4小时；当监测2-甲氧基鸟苷少于5％时，将预混的溶液A全部缓慢滴加入反应液，0℃下反应(约2小时)。当监测到2-甲氧基鸟苷单磷酸少于25％，加入2M三乙基碳酸氢铵溶液淬灭反应并搅拌20分钟，测定pH值为7左右即可停止加入，加入DCM(100mL)搅拌15分钟，分液，收集上层水相，下层有机相加入水(100mL)反萃取，合并水相，经离子交换树脂进行分离纯化，得到目标产品，白色固体(8.90g，产率：57.86％)。
LC-MS[M+H]+＝458.10。
实施例2：((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸的合成
在鸟苷(5.00g，17.65mmol)中加入磷酸三乙酯(50mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(4.06g,26.48mmol)，-5℃～0℃下反应3～4小时；当监测鸟苷少于5％时，将溶液A(参考实施例1制备方法，25mL)缓慢滴加入上述混合液，0℃下反应2小时。当监测鸟苷单磷酸少于25％时，加入2M三乙基碳酸氢铵溶液淬灭反应并搅拌20分钟，测定pH值为7左右即可停止加入，加入DCM(100mL)搅拌15分钟，分液，收集上层水相，下层有机相加入水(100mL)反萃取，合并水相，经离子交换树脂进行分离纯化，得到目标产品，白色固体(4.12g，产率：53％)。
LC-MS[M+H]+＝444.10。
实施例3：((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸的合成
在腺苷(5.00g，18.71mmol)中加入磷酸三乙酯(50mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(4.30g，28.06mmol)，-5℃到0℃下反应4小时；监测腺苷少于5％；缓慢滴加溶液A(参考实施例1的制备方法，25mL)入上述混合液，0℃下反应2小时；中控腺苷单磷酸少于25％；加入2M三乙基碳酸氢铵溶液淬灭反应并搅拌20分钟，测定pH值为7左右即可停止加入，加入DCM(100mL)搅拌15分钟，分液，收集上层水相，下层有机相加入水(100mL)反萃，分液，合并水相，经离子交换树脂进行分离纯化，即得到目标产品，白色固体(5.23g，产率：65％)。
LC-MS[M+H]+＝428.10。
实施例4：((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸的合成
在胞苷(5.00g,20.56mmol)中加入磷酸三乙酯(50mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(4.73g,30.84mmol)，-5℃到0℃下反应4小时；监测胞苷少于5％；缓慢滴加溶液A(参考实施例1的制备方法，25mL)入上述混合液，0℃下反应2小时；中控胞苷单磷酸少于25％；加入2M三乙基碳酸氢铵溶液淬灭反应并搅拌20分钟，测定pH值为7左右即可停止加入，加入DCM(100mL)搅拌15分钟，分液，收集上层水相1，下层有机相加入水(100mL)反萃，分液，收集上层水相2，合并2个水相，经离子交换树脂进行分离纯化，即可拿到产品为白色固体5.01g,产率为60.45％。
LC-MS[M+H]+＝404.10。
实施例5：((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸的合成
在胸苷(10.00g，38.73mmol)中加入磷酸三乙酯(100mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(8.91g，58.09mmol)，-5℃到0℃下反应4小时；监测胸苷少于5％；缓慢滴加溶液A(25mL)入上述混合液，0℃下反应2小时；当监控胸苷单磷酸少于25％；加入2M三乙基碳酸氢铵溶液淬灭反应并搅拌20分钟，测定pH值为7左右即可停止加入，加入DCM(100mL)搅拌15分钟，分液，收集上层水相1，下层有机相加入水(100mL)反萃，分液，收集上层水相2，合并2个水相，经离子交换树脂进行分离纯化，即可得到目标产品，白色固体(9.91g，产率：61.00％)。
LC-MS[M+H]+＝419.10。
对比例1
在2-甲氧基鸟苷(10g，33.64mmol)中加入磷酸三乙酯(100mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(15.49g，100.92mmol)，-5℃～0℃下反应12小时，从监测可以看到有2-甲氧基鸟苷单磷酸产物生产，但是无2-甲氧基鸟苷二磷酸产物产生。
对比例2
在2-甲氧基鸟苷(10g，33.64mmol)中加入磷酸三乙酯(100mL)，置换氮气3次，在氮气氛围下加入POCl3(15.49g，100.92mmol)，-5℃～0℃下反应4小时；当监测2-甲氧基鸟苷少于5％时，将磷酸(32.96g，336.39mmol)与磷酸三乙酯(50mL)的混合液缓慢滴加入反应液，0℃下反应，监测到反应液中仅有2-甲氧基鸟苷单磷酸，基本无2-甲氧基鸟苷二磷酸产物产生。
对比例3
采用实施例1相同的步骤及物料比例，其中磷酸三乙酯(溶剂)和三辛胺(有机碱)、温度、加入溶液A后的反应时间用表1对应的参数代替。结果如表1中反应液HPLC含量％。
表1
结果：由以上试验可知，在本发明所述的反应中，当采用磷酸三乙酯作为溶剂，与三辛胺有机碱配合可获得更好的结果。
对比例4
采用实施例1相同的步骤及物料比例，其中温度、加入溶液A后的反应时间用表2对应的参数代替。结果如表2中反应液HPLC含量％。
表2
结果：由以上试验可知，在本发明所述的反应中，反应温度不宜高于10℃和低于-10℃；优选地，反应温度为-5℃～5℃，更优选地在0℃左右。生成二磷酸的反应时间不宜过长，一般2.5小时以下和0.5小时以上；优选地，反应时间为1～2.2小时，更优选地在2小时左右。
对比例5
采用实施例1相同的步骤、温度、时间及物料，其中核苷与磷酸、三辛胺的摩尔比例用表3对应的比例代替。结果如表3中反应液HPLC含量％。
表3
序号 核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比 反应液中目标产物HPLC含量％
5-1 1：10：10 72％
5-2 1：10：20 59％
5-3 1：20：10 70％
5-4 1：1：1 10％
5-4 1：5：5 37％
由上可知，如想获得较好收率的二磷酸产物，对于核苷、磷酸、三辛胺摩尔比例有一定的要求，从实验结果可知，核苷、磷酸、三辛胺摩尔比例在1：(8～20)：(8～20)时，可以通过本发明的一锅法合成核苷二磷酸产物，优选地；磷酸和三辛胺的摩尔量相等或相近；优选地，核苷、磷酸、三辛胺摩尔比例1：(10～15)：(10～15)；更优选地，核苷、磷酸、三辛胺摩尔比例1：10：10。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (8)

1.一种一锅法合成核苷二磷酸或其盐的方法，其中，包括：
1)向核苷的磷酸三乙酯溶液中加入三氯氧磷反应；当监测核苷的量少于10％～5％时，将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中；
2)将磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液加入1)的反应液中；所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为-10℃～10℃；反应时间为0.5小时～2.5小时；当监测核苷单磷酸的量少于20％～30％时，淬灭反应；
其中，核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：(8～20)：(8～20)，磷酸三乙酯作为溶剂使用；
核苷二磷酸具有以下结构：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸和三辛胺具有相等或相近的摩尔量；相等或相近的摩尔量是指摩尔比为(0.6～1.4)：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷、磷酸、三辛胺的摩尔比为1：(10～15)：(10～15)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，核苷与三氯氧磷的摩尔比为1：(2～6)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为-5℃～5℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应温度为0℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应时间为1小时～2.2小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸、三辛胺与磷酸三乙酯的混合溶液滴加入1)的反应液中，反应时间为2小时。
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