PL212929B1 - Pochodna cytarabiny, jej zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ta pochodna - Google Patents

Pochodna cytarabiny, jej zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ta pochodna

Info

Publication number
PL212929B1
PL212929B1 PL376327A PL37632703A PL212929B1 PL 212929 B1 PL212929 B1 PL 212929B1 PL 376327 A PL376327 A PL 376327A PL 37632703 A PL37632703 A PL 37632703A PL 212929 B1 PL212929 B1 PL 212929B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
liver
hours
arac
minutes
Prior art date
Application number
PL376327A
Other languages
English (en)
Other versions
PL376327A1 (pl
Inventor
Serge H. Boyer
Mark D. Erion
Original Assignee
Metabasis Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metabasis Therapeutics Inc filed Critical Metabasis Therapeutics Inc
Publication of PL376327A1 publication Critical patent/PL376327A1/pl
Publication of PL212929B1 publication Critical patent/PL212929B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/65742—Esters of oxyacids of phosphorus non-condensed with carbocyclic rings or heterocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest pewien nowy cykliczny diester 1,3-propano-1-arylodiolu monofosforanu cytarabiny (araCMP), jego zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca go. Dokładniej, wynalazek dotyczy cyklicznego diestru 1,3-propano-1-(4-pirydylo)diolu monofosforanu cytarabiny (araCMP), który ma konfigurację stereochemiczną cis.
AraC jest analogiem deoksycytydyny transportowanym do komórek za pomocą przenośników nukleozydów i fosforylowanym przez kinazy nukleozydowe i nukleotydowe z wytworzeniem aktywnego metabolitu trifosforanu araC (araCTP). Jest on jednym spośród najskuteczniejszych leków stosowanych w leczeniu ostrej białaczki nielimfoblastycznej, ale nieskutecznym w leczeniu raka wątrobowokomórkowego („HCC) ponieważ niezbędne kinazy nukleozydowe ulegają niewielkiej ekspresji w wątrobie (Arner i in. Pharmacol. Ther. 67(2):155-86, (1995); Ruiz van Haperen i in. Semin. Oncol. 22 Suppl 11(4):35-41, (1995)). Jednakże, kinaza ta występuje w dużych ilościach w narządach o toksyczności docelowej (np. szpik kostny), co prowadzi do toksyczności ograniczającej dawki. Cykliczne proleki araC oferują potencjalna poprawę skuteczności araC w wątrobie poprzez dostarczanie araCTP w większym stężeniu do komórek wątrobowych i HCC eksponujących CYP3A4. Oczekuje się, że dostarczanie araC w postaci monofosforanu, araCMP, ominie ograniczenia kinazy deoksycytydyny, dezaminazy deoksycytydyny, oraz transportu zarówno w prawidłowych jak i w odpornych komórkach nowotworowych. Przewiduje się więc, że araCMP cyklicznych diestrów 1,3-propanodioli będą charakteryzować sie zwiększonym działaniem przeciwnowotworowym w wątrobie, w porównaniu z araC, przy zmniejszeniu toksyczności na pozawątrobowy układ krwiotwórczy, która prowadzi do ograniczającej dawki supresji szpiku obserwowanej u człowieka (patrz US 6312662).
Obecne sposoby leczenia słabo wpływają na zapalenie wątroby i nowotwór wątroby z uwagi na ograniczające dawki pozawątrobowe efekty uboczne lub niewystarczające stężenie środków chemioterapeutycznych w tkankach docelowych. Ograniczenia w obecnie stosowanych metodach obejmują nasycenie lekiem, złożoność procesu wytwarzania i wynikają z charakterystyki produktu sprzężenia oraz zmniejszenie aktywności receptorów. Tak więc, nadal potrzebna jest droga podawania leków takich jak araC do wątroby.
Krótki opis rysunków
Fig. 1a. Przedstawia poziom araCTP w wątrobie gdy związek A i związek B podaje się w dawce 100 mg/kg CE samcom myszy NIH Swiss za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia w bolusie i.p. w czasie 0.
Fig. 1b. Przedstawia poziom proleku w osoczu gdy związek A i związek B podaje się w dawce 100 mg/kg CE samcom myszy NIH Swiss za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia w bolusie i.p. w czasie 0.
Fig. 1c. Przedstawia poziom araC w osoczu gdy związek A i związek B podaje się w dawce 100 mg/kg CE samcom myszy NIH Swiss za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia w bolusie i.p. w czasie 0.
Fig. 2a. Przedstawia poziom araCTP w wątrobie po podaniu związku A, związku B, lub związku C w ciągłym wlewie i.v.
Fig. 2b. Przedstawia odpowiedź wątrobowego araCTP na dawkę po podaniu związku A lub związku B.
Fig. 3a. Przedstawia masę ciała, wyrażoną jako odsetek masy początkowej, jako funkcję w czasie, u myszy traktowanych przez 5 dni araC w dawkach 30-1000 mg/kg CE za pomocą codziennego zastrzyku dootrzewnowo.
Fig. 3b. Przedstawia masę ciała, wyrażoną jako odsetek masy początkowej, jako funkcję w czasie u myszy traktowanych przez 5 dni związkiem C w dawkach 30-1000 mg/kg CE za pomocą codziennego zastrzyku dootrzewnowo.
Fig. 4a. Przedstawia wyniki hematologiczne po 5-dniowym traktowaniu araC lub związkiem C w porównaniu z solą fizjologiczną. Jądrzaste komórki szpiku.
Fig. 4b. Przedstawia wyniki hematologiczne po 5-dniowym traktowaniu araC lub związkiem C w porównaniu z solą fizjologiczną. Komórki wielojądrowe krwi obwodowej (PMN).
Fig. 4c. Przedstawia wyniki hematologiczne po 5-dniowym traktowaniu araC lub związkiem C w porównaniu z solą fizjologiczną. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej.
Fig. 4d. Przedstawia wyniki hematologiczne po 5-dniowym traktowaniu araC lub związkiem C w porównaniu z solą fizjologiczną.
PL 212 929 B1
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze III:
NHj
’Ό
Wzór III lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
Wynalazek dotyczy także związku określonego powyżej stosowanego do leczenia choroby wybranej spośród nowotworu wątroby, nowotworu okrężnicy oraz wirusowego zakażenia wątroby.
Korzystnie, chorobą jest nowotwór wątrobowokomórkowy.
Korzystnie, chorobą jest nowotwór jelita grubego.
Przedmiotem wynalazku jest także związek określony powyżej stosowany do zapobiegania nawrotom nowotworu wybranego z nowotworu wątroby lub nowotworu jelita, po leczeniu zachowawczym lub operacyjnym tego nowotworu u zwierzęcia.
Korzystnie, zwierzę jest bez nowotworu.
Korzystnie, zwierzę jest w remisji nowotworowej i podawanie związku o wzorze III zapobiega dalszemu rozwoju tego nowotworu.
Wynalazek dotyczy także związku określonego powyżej stosowanego do zwiększania wskaźnika terapeutycznego cytarabiny w leczeniu choroby wybranej z nowotworu wątroby lub nowotworu jelita.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie skuteczną ilość związku określonego powyżej i farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik.
Definicje
Poniższe terminy stosowane w tym opisie, o ile nie określono tego inaczej, będą miały następujące znaczenia.
Termin izomeria „cis” odnosi sie do wzajemnego położenia grupy V i grupy M na 6-członowym pierścieniu. Poniższy wzór przedstawia izomerię cis.
W przypadku innego izomeru cis podstawniki V i M znajdują się nad płaszczyzną cząsteczki. Poniższy wzór przedstawia izomerię cis.
Terminy „konfiguracja typu S” „izomer S” i „prolek S” oznaczają bezwzględną konfigurację S atomu węgla C'. Poniższy wzór przedstawia izomerię typu S.
PL 212 929 B1
Terminy „konfiguracja typu R”, „izomer R” i „prolek R” oznaczają bezwzględną konfigurację R atomu węgla C'. Poniższy wzór przedstawia izomerię typu R.
Termin „procentowy nadmiar enancjomeryczny (% nadmiar enencjomeryczny)” oznacza czystość optyczną. Do obliczania jego wartości stosuje się następujący wzór:
Mjaxloo=%R-%s
[R] + [S] w którym [R] oznacza ilość izomeru R i [S] oznacza ilość izomeru S. Powyższy wzór umożliwia obliczanie % nadmiaru enencjomerycznego gdy R stanowi izomer dominujący.
Termin „centrum chiralności” odnosi się do:
Termin „d.e.” oznacza nadmiar diastereomeryczny. Do obliczania jego wartości stosuje się następujący wzór:
[cis] - [trans]
[cis] + [trans]
Χ100 = %[cis]-%[trans]
Termin „diastereoizomery” oznacza związki posiadające dwa lub więcej centrów asymetrii, o takich samych podstawnikach i poddawanych takim samym typom reakcji chemicznych, przy czym diasteroizomery mają różne właściwości fizyczne, podstawniki zajmują różne względne pozycje w przestrzeni, jak również charakteryzują się różnymi właściwościami biologicznymi.
Termin „racemiczny” oznacza związek lub mieszaninę złożoną z równych ilości enancjomerycznych postaci cząsteczki, która nie jest optycznie czynna.
Termin „enancjomer” oznacza parę cząsteczek, które ze względu na budowę pozostają do siebie jak przedmiot i odbicie w lustrze.
Termin „atom fluorowca” oznacza chlorek, bromek, jodek lub fluorek.
Termin „alkil” oznacza nasyconą grupę alifatyczna, obejmuje grupy o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu oraz grupy cykliczne. Odpowiednie grupy alkilowe obejmują metyl, etyl, izopropyl i cyklopropyl.
Termin „aryl” oznacza grupę aromatyczną, zawierającą 5-6 atomów w pierścieniu. Odpowiednie grupy arylowe obejmują fenyl, furanyl, pirydyl i tienyl. Grupy arylowe mogą być podstawione.
Termin „aryloksy” oznacza grupę arylo-O-.
Stosowany tu termin „niższy” w odniesieniu do rodników lub związków organicznych, odpowiednio oznacza zawartość do 10 atomów węgla, korzystnie do 6 i korzystnie jeden do czterech atomów węgla. Grupy te mogą być prostołańcuchowe, rozgałęzione lub cykliczne.
Termin „ewentualnie podstawiony” lub „podstawiony” obejmuje grupy arylowe podstawione przez jeden do dwóch podstawników, niezależnie wybranych spośród takich jak niższy alkil, niższy aryl i atomy fluorowca. Korzystnie podstawniki wybiera się z grupy obejmującej atomy fluorowce.
Termin „farmaceutycznie dopuszczalna sól” obejmuje sole związków o wzorze I i ich proleki, powstałe w wyniku połączenia związku według wynalazku i organicznego lub nieorganicznego kwasu lub zasady. Odpowiednie kwasy obejmują kwas octowy, kwas adypinowy, kwas benzenosulfonowy, kwas (+)-7,7-dimetylo-2-oksobicykio[2,2,1]heptano-1-metanosulfonowy, kwas cytrynowy, kwas 1,2-etanodisulfonowy, kwas dodecylosulfonowy, kwas fumarowy, kwas glukoheptonowy, kwas glukonowy, kwas glukuronowy, kwas hipurowy, chlorowodorek kwasu hemietanolowego, HBr, HCl, HI, kwas
PL 212 929 B1
2-hydroksyetanosulfonowy, kwas mlekowy, kwas laktobionowy, kwas maleinowy, kwas metanosulfonowy, kwas metylobromowy, kwas metylosiarkowy, kwas 2-naftalenosulfonowy, kwas azotowy, kwas oleinowy, kwas 4,4'-metyleno-bis[3-hydroksy-2-naftaIenokarboksylowy], kwas fosforowy, kwas poligalakturonowy, kwas stearynowy, kwas bursztynowy, kwas siarkowy, kwas sulfosalicylowy, kwas garbnikowy, kwas winowy, kwas tereftalowy oraz kwas p-toluenosulfonowy.
Stosowany tu termin „prolek” oznacza dowolny związek M, który po wprowadzeniu do układu biologicznego, przekształca się w związek biologicznie czynny, w wyniku samorzutnej reakcji chemicznej, reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy, i/lub metabolicznych reakcji chemicznych lub ich kombinacji. Standardowe proleki tworzy się, przyłączając grupy do związanych z lekiem grup funkcyjnych, np. HO-, HS-, HOOC-, R2N-, które następnie ulegają odszczepieniu in vivo. Standardowe proleki obejmują między innymi estry karboksylanowe, w których grupa oznacza alkil, aryl, aryloalkil acyloksyalkil, alkoksykarbonylooksyalkil, jak również estry hydroksylowe, tiole i aminy, w których grupą przyłączoną jest grupa acylowa, alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, fosforan lub siarczan. Nie należy ograniczać się jedynie do przedstawionych grup, ponieważ są one przykładowe i fachowiec w dziedzinie może wytworzyć inne znane odmiany proleków. Proleki muszą ulegać transformacjom chemicznym w celu wytworzenia związku biologicznie czynnego lub jego prekursora. W pewnych przypadkach, prolek jest biologicznie czynny, zazwyczaj w mniejszym stopniu niż sam lek i służy do zwiększenia efektywności leku lub bezpieczeństwa jego stosowania, poprzez ulepszoną biodostępność po podaniu doustnym, farmakodynamiczny okres półtrwania, itp. Związki biologicznie czynne obejmują, np. środki przeciwnowotworowe i środki przeciwwirusowe. Pewne proleki cytarabiny, np. N4-acylowana cytarabina (Wechter i in., J. Med. Chem. 19(8), 1013 (1976)), w których acylowaną grupę stanowi palmitoil lub behanoil, zwiększają rozpuszczalność w lipidach i transport przez błony, jak również zmniejszają odaminowanie przez dezaminazę cytydynową. Przy N4 mogą również znajdować się inne grupy takie jak alkiliden (tj., grupa iminowa). Grupy te usuwa się in vivo w celu wytworzenia 4-aminocytarabiny. Podobne proleki można wytworzyć dla proleków według wynalazku.
Termin „cykliczny ester 1',3'-propylowy”, „cykliczny ester 1,3-propylowy, „cykliczny ester 1',3'-propanylowy i „cykliczny ester 1,3-propanylowy” oznacza:
Termin „4-pirydyl”, „piryd-4-yl” i „4-pirydynyl” oznacza:
Termin „5'-tlen” oznacza atom tlenu w poniższym wzorze:
PL 212 929 B1
Termin „rozpuszczalnik heteroarylowy zawierający atom N'' oznacza grupę heteroarylową, zawierającą 1-3 atomów azotu w pierścieniu, o 4<pka<6 oraz dowolną mieszaninę z rozpuszczalnikami heteroarylowymi nie zawierającymi atomu N.
Termin „N-hydroksy(zawierający atom azotu)heteroaryl” oznacza heteroaryl zawierający atom N, w którym grupa hydroksylowa jest przyłączona do atomu azotu. Przykładem jest N-hydroksybenzotriazol.
Termin „heteroaryl zawierający N'' oznacza grupę heteroarylową zawierająca 1-3 atomów azotu w pierścieniu i przyłączonych poprzez atom węgla.
Termin „grupa elektronoakceptorowa” jest znany w dziedzinie i oznacza tendencję podstawnika do przyciągania elektronów walencyjnych sąsiadujących atomów, co oznacza, że podstawnik jest elektroujemny w stosunku do sąsiadujących atomów. Ocenę ilościową poziomu zdolności do przyciągania elektronów przedstawia stała Hammett'a sigma (σ). Ta dobrze znana stała jest opisana w wielu odsyłaczach literaturowych, na przykład, J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 wydanie) str. 251-259. Wartości stałej Hammett'a są na ogół ujemne dla grup elektronodonorowych (σρ = -0,66 dla NH2) oraz dodatnie dla grup elektronoakceptorowych (σρ = 0,78 dla grupy nitrowej), σρ wskazując podstawienie w pozycji para. Przykładowe grupy elektronoakceptorowe obejmują nitro, karbonyl, aldehyd, sulfonyl, trifluorometyl, -CN, chlorek, itp.
Termin „grupa opuszczająca” oznacza części cząsteczki substratu, która podczas odszczepiania w reakcji nie zawiera atomu fosforu, który dostarczono do wiązania podczas reakcji.
Termin „P450 odnosi się do cytochromu P-450. W wątrobie i innych tkankach zawierających enzymy cytochromu P450 stwierdzono ich obecność w dużych ilościach. Za oksydację cyklicznego fosfonianu według wynalazku odpowiadają konkretne izoenzymy P450 w taki sposób, że ostatecznie powstaje wolny fosfonian lub fosforan. Obecność enzymów P450 stwierdzono w tkankach i komórkach wszystkich ssaków.
Termin „tkanki, w których ulega ekspresji P450 odnosi się do wątroby i do podobnych tkanek i komórek zawierających izoenzym CYP3A4 lub jakikolwiek inny izoenzym P450, o którym wiadomo, że utlenia cykliczne proleki według wynalazku. Według DeWaziers i in. (J. Pharm. Exp. Ther., 253, 387-394 (1990), u ludzi CYP3A4 znajduje się w następujących tkankach (określono za pomocą techniki immunoblotting i/lub pomiarów enzymatycznych):
Tkanki % aktywności wątroby
Wątroba 100
Dwunastnica 50 jelito czcze 30 jelito cienkie 10 okrężnica <5 (wykryto jedynie izoenzym P450) żołądek <5 przełyk <5 nerka nie wykrywalna
Termin „choroby tkanek, w których ulega ekspresji P450” odnosi się do chorób, w których funkcja tkanek, w których ulega ekspresji P450 ulega upośledzeniu, tak, że tkanki te są już niezdolne do pełnienia ich funkcji metabolicznych. Może to prowadzić albo do nadmiernego wytwarzania lub zmniejszenia ilości końcowych produktów biochemicznych. Choroby te mogą obejmować takie choroby wątroby jak pierwotne lub przerzutowe nowotwory wątroby (np. HCC), zwłóknienie lub marskość wątroby; choroby, które mogą dotyczyć wątroby, ale mogą także dotyczyć innych tkanek, w których ulega ekspresji P450 mogą obejmować takie jak pierwotny lub przerzutowy rak jelita grubego, hiperlipidemia, cukrzyca oraz zakażenia wirusowe i pasożytnicze.
Termin „ewentualnie zabezpieczona cytarabina” odnosi sie do zabezpieczenia grup 2' i 3' hydroksylowych i atomu azotu 4 cytarabiny przez standardowe grupy zabezpieczające.
Termin „wzmożenie odnosi sie do zwiększenia lub ulepszenia konkretnej właściwości.
Termin „wzbogacenie odnosi się do zwiększenia ilości konkretnego izomeru wytwarzanego w reakcji.
Termin „podawane jednocześnie” odnosi się do podawania jednego leku w tym samym lub prawie tym samym czasie, w którym podaje się inny lek. Korzystnie, leki podaje sie w przeciągu 30 minut od siebie.
PL 212 929 B1
Termin „wskaźnik terapeutyczny („TI”) odnosi się do stosunku dawki leku lub proleku, która wywołuje korzystną terapeutycznie odpowiedź do dawki, która wywołuje odpowiedź niepożądaną taką jak zgon, wzrost markerów wskazujących na toksyczność, i/lub farmakologiczne efekty uboczne.
Termin „remisja odnosi się do złagodzenia lub zmniejszenia intensywności objawów choroby.
Termin „bez obecności nowotworu odnosi sie do braku dowodów wskazujących na obecność nowotworów złośliwych (raków) lub przerzutów w jakiejkolwiek tkance lub narządzie.
W tym opisie i zastrzeżeniach patentowych autorzy odnoszą się do poniższych, dobrze znanych, środków chemicznych. Podano także skróty i powszechnie stosowane nazwy.
CH2CI2; dichlorometan lub chlorek metylenu
DCM; dichlorometan lub chlorek metylenu (-)-DIP-Cl; (-)-3-chlorodiizopinokamfejboran
DMAP; 4-dimetyloaminopirydyna
DMF; dimetyloformamid
DMPU; 1,3-dimetyIo-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pirymidynon
DMSO; sulfotlenek dimetylu
HCl; kwas chlorowodorowy
KI; jodek potasu
MgSO4; siarczan magnezu
MTBE; eter t-butylometylowy
NaCl; chlorek sodu
NaOH; wodorotlenek sodu
P450; cytochrom P-450;
PyBOP; heksafluorofosforan benzotriazol-1-yloksytripirolidynofosfoniowy
TBDMSCl TBSCl; t-butylodimetylochlorosilan
TBS; TBDMS; t-butylodimetylosilil
TEA; trietyloamina
THF; tetrahydrofuran
TMSCl; chlorotrimetylosilan
5'-O-cis-[4-(4-pirydylo)-1,3,2-dioksafosforyno-2-okso-2-ylo]cytozyno-3-D-arabinofuranozyd; 2(1H)-pirymidynon, 4-amino-1-[5-O-cis-[2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforynalo-2-ylo]-3-D-arabinofuranozyl]
W tym opisie i zastrzeżeniach patentowych autorzy odnoszą się do poniższego, dobrze znanego, leku. Podano także skróty i powszechnie stosowane nazwy.
Cytarabina; 1-(3-D-arabinofuranozylo)cytozyna; araC
Wynalazek dotyczy związku o wzorze III i jego zastosowań w leczeniu chorób wątroby. W jednym aspekcie, do chorób wątroby należą zakażenia wirusowe i raki wątroby. Zgodnie z innym aspektem, rak wątroby oznacza raka wątrobowokomórkowego. W innym aspekcie, rak wątroby oznacza raka jelita grubego.
Bardzo niewiele sposobów okazało sie skutecznych w leczeniu raka wątroby. U niewielkiego odsetka pacjentów z bardzo nielicznymi, dobrze wyodrębnionymi guzami, ablacja chirurgiczna, krioablacja i nastrzykiwanie etanolem, wykazały pewien stopień skuteczności w leczeniu pacjentów. Jednakże, u większości pacjentów poddawanych tym sposobom leczenia ostatecznie występują nawroty nowotworu. Zgodnie z innym aspektem, wynalazku dotyczy także zapobiegania nawrotom nowotworów z ekspresją P450 u pacjentów poddanych leczeniu zachowawczemu lub chirurgicznemu.
Sposób leczenia nawrotów nowotworu
Pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym identyfikuje się i monitoruje stosując różnorodne techniki, obejmujące ultrasonografię, tomografię komputerową (CT), rezonans magnetyczny, angiografię i biopsję. Stosowany w diagnostyce poziom alfafetoproteiny (AFP) może być dobrym wskaźnikiem aktywności przeciwnowotworowej, szczególnie u pacjentów z wyjściowo wysokim poziomem AFP. Techniki te są często przydatne w stwierdzaniu opcji terapeutycznych i określaniu wskazań u pacjenta. Opcje terapeutyczne obejmują, ortotopowy przeszczep wątroby (OLT), resekcję chirurgiczną, przezskórne nastrzykiwanie różnymi środkami (w tym, alkoholem), krioterapię, chemioterapię dotętniczą, dotętniczą chemioembolizację za pomocą cewnika (TACE), chemioterapię ogólnoustrojową, radioterapię, immunoterapię i leczenie hormonalne. Zazwyczaj nie da się zdiagnozować guzów < 1 cm. U pacjentów poddawanych zabiegowi chirurgicznemu (OLT lub resekcji chirurgicznej) po zabiegu może nie być żadnych widocznych dowodów istnienia guzów. Podobnie, pacjenci poddawani
PL 212 929 B1 leczeniu nieoperacyjnemu jak np. ablacji (etanolem, mikrofalami, prądem o częstotliwości radiowej) i TACE mogą także wykazywać znaczące zmniejszenie sie rozmiarów guza i wydawać się całkowicie bez obecności nowotworu. Pacjentów można także leczyć za pomocą mikrosfer (radiologicznie znakowanych Itrem-90 szklanych mikrokuleczek), nośników leku takich jak mikrocząstki składających się z żelaza, które można umieścić w nowotworze za pomocą zewnętrznych magnesów, bezpośrednie zastrzyki ze środków chemioterapeutycznych, np. cisplatyny w żelu, leków działających wybiórczo na guzy HCC takich jak doksorubicyna oraz zastosowanie środków chemicznych (jak doksorubicyna) w ablacji etanolem. Pod kątem potencjalnego wstępnego leczenia układowego rozpatruje się także inne środki chemioterapeutyczne, takie jak środki przeciwko angiogenezie, inhibitory syntetazy tymidylanowej (np. tymitaq), inhibitory polimeryzacji tubuliny (np. T67), różne inhibitory topoizomerazy I, np. leki z klasy tekanu takie jak eksatekan, różne połączenia leków obejmujące połączenie cisplatyny, interferonu, adriamycyny i 5-FU.
Wszystkie sposoby leczenia HCC wiążą się z dużą ilością nawrotów. Przyczyna nawrotu raka może być jedna lub więcej. Przykładowo, wtórne przerzuty do wątroby istniejące już w czasie zabiegu operacyjnego pozostają często niewykryte ze względu na wymiary (< 1 cm). Rokowanie pacjentów z naciekiem żyły wrotnej lub wątrobowej jest słabe, ponieważ nowotwór może rozsiać się do innych płatów wątroby. Te mikroprzerzuty powiększają swoje wymiary dzięki proliferacji i są szczególnie podatne na związek według wynalazku. Drugą przyczyną, która może prowadzić do nawrotu choroby jest niecałkowita resekcja lub ablacja guza pierwotnego (guzów pierwotnych). Trzecia przyczyna dotyczy stanu wątroby (marskość, zakażenie wirusowe), który może sprzyjać ryzyku wystąpienia „nowych”guzów pierwotnych, z których niektóre mogą być obecne, lecz niewykryte, już w czasie leczenia.
W celu zapobiegania lub opóźnienia wystąpienia nawrotu nowotworu, autorzy zakładają stosowanie związków według wynalazku przed, podczas lub po jednym z powyższych sposobów leczenia. Leczenie obejmuje podawanie związku według wynalazku pacjentowi z HCC w jednym do 10 cyklach, korzystnie, w trzech do sześciu cyklach w ciągu roku lub dwóch lat. Cykl obejmuje przebieg leczenia, który okazał sie skuteczny w spowolnieniu lub zapobieganiu rozrostowi guza. Leczenie obejmuje ciągły wlew proleku przez 7-14 dni, z następującym co najmniej 14-dniowym okresem bez leku (jeden cykl). Pacjentów monitoruje się w miarę upływu czasu. Proleki powodują wydłużenia czasu bez obecności nowotworu, wydłużenie czasu przeżycia, i/lub poprawę jakości życia.
Sposób leczenia białaczki
W leczeniu różnych białaczek stosuje się cytarabinę. Zazwyczaj, cytarabinę podaje się w daw2 kach 100 do 200 mg/m2/dobę albo we wlewie ciągłym przez okres do 7 dni z następczym kilkutygodniowym okresem bez podawania leku w wyniku supresji szpiku wywołanej przez cytarabinę. W leczeniu pacjentów z białaczką zazwyczaj stosuje się trzy lub więcej cykli. Z różnych przyczyn stosuje 2 się schematy podawania leku w wysokich dawkach (np. 3 g/m2). Większy całkowity poziom leku jest wymagany z uwagi na szybki metabolizm cytarabiny obejmujący głównie dezaminację araC do nieaktywnego metabolitu araU. W leczeniu nowotworów za pomocą leków przeciwnowotworowych zależnych od cyklu komórkowego, takich jak cytarabina, za optymalne uważa się przedłużone podawanie leku. Cytarabina jest co najmniej częściowo skuteczna z powodu zdolności do hamowania syntezy DNA albo ze względu na zdolność hamowania polimerazy DNA i/albo powodowania zakończenia łańcucha narastającej nici DNA po wbudowaniu się w nią, katalizowanym przez polimerazę DNA. Jako inhibitor syntezy DNA, araC przejawia największe działanie cytotoksyczne podczas fazy S cyklu komórkowego, być może z uwagi na konieczność wbudowania się w DNA i większą aktywność enzymów anabolicznych podczas fazy S. W konsekwencji, czas trwania wystawienia komórek na działanie araC jest w bezpośredniej korelacji ze śmiercią komórek, ponieważ dłuższy okres wystawienia komórek na działanie związku umożliwia wbudowanie się araC do DNA większego odsetka komórek w czasie ich przechodzenia przez fazę S.
U pacjentów leczonych araC w większych dawkach lub przez przedłużony okres czasu występuje ryzyko różnych, związanych z araC, efektów toksycznych. Ponadto, niektórzy pacjenci mogą być szczególnie narażeni na toksyczność cytarabiny, np. pacjenci z upośledzoną czynnością wątroby, starsi. Toksyczność cytarabiny polega m.in. na supresji szpiku, owrzodzeniach nabłonka przewodu pokarmowego, wewnątrzwątrobowym zastoju żółci i zapaleniu trzustki, zaburzeniu czynności mózgu i móżdżku, oraz zapaleniu spojówek.
W założeniu autorów związek według wynalazku ma zmniejszyć niektóre z tych ograniczających dawkowanie efektów toksycznych. W szczególności, araC, wytwarzana i uwalniana z wątroby po aktywacji związku zapewni sposób osiągnięcia działania przeciwbiałaczkowego przy mniejszej toksyczPL 212 929 B1 ności. Związki według wynalazku pozwalają na osiągnięcie stanu na stabilnym poziomie bez wysokich pików mogących spowodować efekty toksyczności takie jak zaburzenie czynności mózgu i móżdżku czy zapalenie spojówek. Prolek zapewnia także sposób podawania cytarabiny, który zmniejsza występowanie efektów ubocznych powiązanych z miejscem wstrzyknięcia. Przedłużone uwalnianie cytarabiny z proleku może zmienić schemat dawkowania z wlewu ciągłego na podawanie dożylne w bolusie lub krótkotrwały wlew s.c., i.m., podawanie doustne, itp.. Przy leczeniu nadal może wystąpić supresja szpiku.
W celu zmniejszenia wpływu supresji szpiku przez proleki można stosować różnorodne mechanizmy, obejmujące przerwę w podawaniu leku, przeszczep szpiku kostnego, lub środki zwiększające aktywację krwiotwórczych komórek szpiku, np. IL-3, GM-CSF, G-CSF, epoetyna).
Zwiększony wskaźnik terapeutyczny
Z prawie wszystkimi środkami przeciwnowotworowymi związanych jest kilka efektów toksycznych. Próbując zmniejszyć te toksyczne efekty podczas leczenia pierwotnych lub wtórnych nowotworów wątroby, czasem podaje się leki bezpośrednio do żyły wrotnej w celu zwiększenia wystawienia wątroby na lek. Ponieważ z lekami przeciwnowotworowymi wiążą się zazwyczaj znaczące efekty uboczne, podawanie miejscowe umożliwia większy wychwyt wątrobowy, a tym samym zmniejszenie pozawątrobowych efektów toksycznych. W celu dalszego zwiększenia wychwytu wątrobowego, czasem stosuje sie chemioembolizację w połączeniu z wlewem leku do tętnicy wątrobowej. Wysoka swoistość proleków względem wątroby w tym wynalazku sugeruje, że układowe efekty uboczne będą podobnie zminimalizowane za pomocą tego podejścia z nowym prolekiem.
Ponadto, pierwotne i wtórne nowotwory wątroby są szczególnie odporne zarówno na chemioterapię jak i na radioterapię. Chociaż mechanizm tej oporności nie jest całkowicie zrozumiały, może wynikać on ze zwiększoną ilością produktów genów wątrobowych, która prowadzi do szybkiego metabolizmu i/lub usuwania środków chemioterapeutycznych. Ponadto, wątroba, która na ogół jest związana z metabolizmem ksenobiotyków i wytwarzaniem cytotoksycznych związków pośrednich, w swojej naturze jest wyposażona w wiele mechanizmów ochronnych tak, aby zminimalizować uszkodzenie przez te związki pośrednie. Przykładowo, stężenie wewnątrzkomórkowe glutationu jest bardzo duże w wątrobie w stosunku do innych tkanek przypuszczalnie po to, aby związki pośrednie zdolne do alkilowania białek i DNA ulegały detoksykacji w szybkiej reakcji wewnątrzkomórkowej. W konsekwencji, ze względu na te mechanizmy, wątroba może być odporna na środki chemioterapeutyczne, a zatem do osiągnięcia powodzenia terapeutycznego może wymagać większego niż normalnie stężenia środka przeciwnowotworowego. Większe stężenia wątrobowe wymagają większych dawek leku, co zazwyczaj wywołuje pozawątrobowe efekty toksyczne.
Związek według wynalazku może znacznie zwiększać wskaźnik terapeutyczny („TI”) cytarabiny. W wielu przypadkach, zwiększony TI jest wynikiem wysokiej swoistości względem wątroby. Przykładowo, cytarabina w niewielkim stopniu ulega fosforylacji w wątrobie z uwagi na niski poziom kinaz. Jednakże, kinaza ulega dużej ekspresji w narządach docelowych toksyczności (np. w szpiku kostnym), co prowadzi do związanych z tym, ograniczających dawki efektów toksycznych. Tak więc, cykliczne proleki araC oferują możliwość zwiększenia skuteczności araC w wątrobie poprzez wybiórcze dostarczanie araC w o wiele większym stężeniu do komórek wątrobowych i HCC eksponujących CYP3A4.
Wysoka swoistość przekształcania proleku w wątrobie sugeruje, że produkt uboczny przekształcania proleku zasadniczo także powstaje w wątrobie. Zgodnie z tym, efekty toksyczne związane z produktem ubocznym są minimalne, ponieważ produkt uboczny często ulega szybkim reakcjom detoksykacji, które albo eliminują albo minimalizują toksyczność produktu ubocznego. Przykładowo, reakcje pomiędzy produktem ubocznym i związkami i/lub białkami występującymi w hepatocytach (np. glutation i α,β-nienasycona olefina wytwarzane przy rozkładzie proleku). Ponadto, enzymy występujące w wątrobie mogą także powodować dalsze przetwarzanie produktu ubocznego w nietoksyczny związek (np. utlenianie i/lub sulfonowanie hydroksypirydyny, lub redukcję α,β-nienasyconego ketonu, itp.). Ponadto, międzycząsteczkowe reakcje obejmujące reakcje cyklizacji pomiędzy grupą reaktywną i α,β-nienasyconym związkiem zawierającym karbonyl wytwarzanym przy rozkładzie proleku mogą zminimalizować toksyczność produktu ubocznego.
Cytotoksyczność proleków łatwo oszacować stosując linie komórkowe bez aktywności P450 (np. bez aktywności CYP3A4).
Zwiększony TI można także osiągnąć podając większą ilość biologicznie aktywnego środka do wątroby w stosunku do równoważnika dawki leku macierzystego. Zwiększony poziom biologicznie
PL 212 929 B1 aktywnego środka w wątrobie osiąga sie podając proleki razem ze środkami indukującymi aktywność P450, np. aktywność CYP3A4 (np. rifampicyna, glukokortykoidy, fenobarbital, erytromycyna).
Sposób poprawy trwałości proleku.
Trwałość związku w układach biologicznych jest kluczowa dla opracowania proleku cytotoksycznego leku takiego jak cytarabina. Przykładowo, brak trwałości względem enzymów występujących w osoczu spowoduje rozpad aktywnego związku w osoczu zamiast w tkance docelowej, w której ulega ekspresji CYP3A4 a w konsekwencji, zmniejszy spodziewany TI osiągany za pomocą stosowania proleku. Podobnie, brak wewnętrznej trwałości w środowisku wodnym doprowadzi do rozpadu proleku nie tylko w osoczu ale w jakimkolwiek narządzie, do którego może dostać się prolek, również w tym przypadku prowadząc do zmniejszenia TI. Ponadto, brak trwałości może utrudniać opracowywanie leku ponieważ trudniejsze będzie utworzenie ostatecznego preparatu aktywnego związku, szczególnie jeśli ma być on stosowany pozajelitowo. W jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiol proleków araCMP w celu poprawy ogólnej trwałości proleków araCMP.
Trwałość proleków łatwo określić przez monitorowanie rozkładu proleków w płynach biologicznych, takich jak osocze, i buforowane roztwory o różnych pH i z różnymi środkami buforującymi.
Poprawa farmakodynamicznego okresu półtrwania.
Za pomocą metodologii nowych proleków można wydłużyć farmakodynamiczny okres półtrwania cytarabiny w wyniku zarówno zdolności do wytwarzania leku przez dłuższy okres czasu jak i w pewnych przypadkach dłuższy farmakokinetyczny okres półtrwania proleku. Obie właściwości mogą niezależnie umożliwiać utrzymanie terapeutycznego poziomu leku przez dłuższy okres czasu prowadząc w efekcie do poprawy farmakodynamicznego okresu półtrwania. Farmakodynamiczny okres półtrwania można przedłużyć hamując metabolizm lub szlaki eliminacji leku macierzystego. W przypadku niektórych leków, proleki według wynalazku są zdolne do hamowania metabolizmu lub szlaków eliminacji leku macierzystego, a tym samym mogą występować u zwierzęcia przez długi okres czasu. Przykładowo, cytarabina jest substratem enzymu metabolicznego dezaminazy cytydyny, konwertującym cytydynę do urydyny, a sama cytarabina przekształca się do arabinofuranozylouracylu. Jednakże, proleki araCMP nie są substratami dla tego enzymu a w konsekwencji prowadzą do dłuższego farmakodynamicznego okresu półtrwania cytarabiny w porównaniu z cytarabiną podawaną bezpośrednio.
Powszechną drogą eliminacji leków fosforanowych są nerki i transporter, który rozpoznaje związki anionowe. Całkowita eliminacja z krążenia leków zawierających fosforan często występuje zaledwie kilka minut po podaniu leku. Związek według wynalazku spowalnia eliminację leku usuwając ujemne ładunki aż do momentu po utlenianiu i hydrolizie w wątrobie i podobnych tkankach.
Preparaty
Związek według wynalazku podaje się w ogólnej dawce dobowej około 0,1 mg/kg do około 100 mg/kg, korzystnie od około 1 mg/kg do około 30 mg/kg. Najkorzystniejszy zakres dawkowania wynosi około 10 mg/kg/dobę. Dawkę tę można podawać w postaci tylu dawek podzielonych w ilu jest to dogodne.
Stosowany w połączeniu z innymi środkami przeciwwirusowymi lub środkami przeciwnowotworowymi, związek według wynalazku można podawać jako dawkę dobową lub jako odpowiednią część dawki dobowej (np. bid, dwa razy dziennie). Podawanie proleku może wystąpić w lub około czasu, w którym podaje się inny środek przeciwwirusowy lub przeciwnowotworowy lub w innym czasie. Związek według wynalazku można stosować w schemacie wielolekowym, także znanym jako terapia łączona lub 'terapia koktajl', w której, wiele środków można podawać razem, oddzielnie w tym samym czasie lub w różnych przedziałach czasu, lub podawać kolejno. Związek według wynalazku można podawać po toku leczenia innym środkiem, podczas leczenia innym środkiem, podawać jako część schematu terapeutycznego, lub można podawać przed leczeniem innym środkiem w programie terapeutycznym.
Związek według wynalazku można łączyć z różnymi środkami w celu dalszego zwiększenia skuteczności i/lub zmniejszenia toksyczności związanej z cytarabiną. Można sobie wyobrazić różne połączenia, które zwiększałyby skuteczność terapii. Połączenie leków o znanej skuteczności przeciwnowotworowej mogłoby pomóc w leczeniu przerzutów, które wydostały się poza wątrobę i nie odpowiadają na leczenie prolekiem. Takie środki obejmują leki wybrane spośród takich jak grupa dobrze znanych środków chemioterapeutycznych, obejmująca inhibitory syntezy DNA (inhibitory polimerazy DNA, inhibitory szlaku de novo pirymidyny (np. inhibitory syntetazy tymidylanowej, inhibitory dehydrogenazy dihydroorotanowej, inhibitory karbamoilotransferazy asparaginianowej), antagoniści kwasu foliowego (np. inhibitory reduktazy dihydrofolianu, inhibitory syntetazy folianopoliglutaminianowej), inhibitory
PL 212 929 B1 biosyntezy puryn (inhibitory dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, inhibitory formylotransferazy glycynoamidoworybonukleotydowej, inhibitory reduktazy difosforanu rybonukleosydu, inhibitory biosyntezy poliaminy (np. inhibitory dekarboksylazy S-adenozylo-1-metioniny, dekarboksylazy ornityny, spermidyna/N-acetylotransferaza sperminy), antybiotyki przeciwnowotworowe, alkaloidy roślinne, inhibitory transferazy farnezylu, inhibitory topoizomerazy, leki pochodne platyny, leki przeciw angiogenezie, inhibitory polimerazy tubuliny, itp.
W założeniu autorów do łączenia ze związkiem według wynalazku odpowiednie są różne dobrze znane klasy leków, obejmujące epipodofilotoksyny, kamptotecyny, antracykliny, antrapirazole, analogi kombretastatyny, antybiotyki enediny, taksany.
W jednym aspekcie, preferuje się jeśli epipodofilotoksyny obejmują etopozyd, tenipozyd, NK-611, GL- 331 i azatoksynę. W jednym aspekcie epipodofilotoksynami są etopozyd i tenipozyd. W jednym aspekcie preferuje się jeśli kamptotecyny obejmują kamptotecynę, topotekan, irynotekan (CPT-11), lurtotekan (GI 147211), 9-aminokamptotecyna, GG-211, DX-8951F, SKF 107874 i SKF 108025. W innym aspekcie, kamptotecyny obejmują kamptotecynę, topotekan, irynotekan, lurtotekan i 9-aminokamptotecynę. Zgodnie z innym aspektem, kamptotecyny obejmują topotekan i irynotekan. W jednym aspekcie, taksany obejmują paklitaksel, docetaksel i FCE- 28161. Zgodnie z innym aspektem, taksany obejmują paklitaksel. W jednym aspekcie, kombretastatyny obejmują kombretastatynę A-4 i opisany (S,S) analog dioksolanu (Bioorg. Med. Chem. Lett. 88: 1997-2000 (1998). W jednym aspekcie, antrapirazole obejmują mitoksantron, piroksantron i losoksantron. W jednym aspekcie, antracykliny obejmują doksorubicynę, daunorubicynę, idarubicynę, pirarubicynę, plikamycynę, walrubicynę, daktynomycynę i epirubicynę. Zgodnie z innym aspektem, antracyklinami są doksorubicyna, pirarubicyna, epirubicyna i idarubicyna. Zgodnie z innym aspektem, antracykliny obejmują pirarubicynę i doksorubicynę. W jednym aspekcie, antybiotyki enediny obejmują neokarzynostatynę, kalicheamycynę i esperamycynę. Zgodnie z innym aspektem, antybiotyki Enediny obejmują neokarzynostatynę i kalicheamycynę, dynemycynę. W jednym aspekcie, stosuje się leki uszkadzające DNA takie jak środki alkilujące (iperyty azotowe, azirydyny), nitrozomoczniki i kompleksy metali. W jednym aspekcie, korzystna jest mitomycyna. W jednym aspekcie, kompleksy platyny obejmują cisplatynę, nedaplatynę, miriplatynę i karboplatynę. W jednym aspekcie środki alkilujące obejmują cyklofosfamid, ifosfamid. W jednym aspekcie, nitrozomoczniki obejmują karmustynę (BCNU), temozolomid. W korzystnym aspekcie, inhibitory zależne od cyklu komórkowego korzystnie obejmują 5-FU, doksyflurydynę, gemcytabinę, kladribinę, fludarabinę. W jednym aspekcie, antagoniści kwasu foliowego obejmują metotreksat. Zgodnie z innym aspektem, leki przeciwnowotworowe przydatne w połączeniu ze związkami według wynalazku obejmują busulfan, tiotepa, melfalan, luroteca.
W jednym aspekcie, stosuje się środki o działaniu synergistycznym z cytarabiną. Środki te obejmują środki alkilujące takie jak cyklofosfamid, ifosfamid, karmustyna (BCNU), cisplatyna, merkaptopuryna, tioguanina, metotreksat, 6-tioguanina i 3-deazaurydyna.
Zgodnie z innym aspektem, związek według wynalazku łączy się z lekami, o których wiadomo, że stymulują postępowanie cyklu komórkowego do fazy S, co tym samym uwrażliwia komórki na proleki według wynalazku.
Zgodnie z innym aspektem, związek według wynalazku łączy się z lekami, o których wiadomo, że stymulują apoptozę. Leki te obejmują inhibitory kaspazy 3.
Terapia łączona obejmuje podawanie gospodarzowi środków albo osobno albo jednocześnie. W jednym aspekcie, prolek podaje się jednocześnie z lekiem przeciwnowotworowym. Leki te można podawać w tym samym rozczynniku lub oddzielnie. Oba leki można podawać pozajelitowo (w tym podskórnie, domięśniowo, dożylnie i doskórnie), lub innymi metodami, w tym doustnie, doodbytniczo, donosowo, miejscowo, dopochwowo i przezskórnie. W jednym aspekcie, oba środki podaje sie jednocześnie albo w tej samej kapsułce albo jako oddzielne pigułki. Zgodnie z innym aspektem, oba środki podaje sie podczas posiłku (tuż przed lub tuż po karmieniu). Zgodnie z innym aspektem, połączenie leków podaje się w różnych okresach czasu. W jednym aspekcie, podawanie leku oddziela się w czasie ale podczas trwania cyklu leczenia. Zgodnie z innym aspektem, jeden lek podaje się podczas przerwy w podawaniu drugiego leku.
Środki przeciwnowotworowe lub środki przeciwwirusowe i związki według wynalazku można podawać oddzielnie lub można podawać jednocześnie. Odpowiednie środki przeciwnowotworowe obejmują busulfan, karboplatynę, cisplatynę, miriplatynę, temozolomid, tiotepa, melfalan, ifosfamid, cyklofosfamid, chlorambucyl, doksorabicynę, daunorubicynę, epirubicynę, idarubicynę, plikamycynę, walrubicynę, daktynomycynę, gemcytabinę, fluksurydynę, fluorouracyl, merkaptopurynę, tioguaninę,
PL 212 929 B1 metotreksat, mitomycynę, etopozyd, paklitaksel, docetaksel, irynotekan, topotekan, etopozyd, tenipozyd, nedaplatynę, karmustynę, doksyflurydynę, kladribinę, fludarabinę, azatoksynę, kamptotecynę, lurtotekan, 9-aminokamptotecynę, pirarubinę, neokarzynostatynę, kalicheamycynę, esperamycynę i luroteca.
Do celów wynalazku, związki można podawać różnorodnymi sposobami, w tym, doustnie, pozajelitowo, inhalacyjnie, w spreju, miejscowo, lub doodbytniczo w preparatach zawierających farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, środki wspomagające i rozczynniki. Stosowany tu termin pozajelitowe obejmuje podawanie podskórnie, dożylnie, domięśniowo i dotętniczo za pomocą różnorodnych technik wlewu. Stosowane tu wstrzyknięcia dotętniczo i dożylnie obejmują podawanie przez cewniki. Na ogół preferuje się podawanie dożylnie.
Farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują octan, adypinian, benzenosulfonian, bromek, kamforosulfonian, chlorek, cytrynian, 1,2-etanodisulfonian, estolan, fumaran, D-glicero-D-gulo-heptanonian, glukonian, glukaronian, hipuran, monochlorowodorek półetanolan półhydrat, bromowodorek, chlorowodorek, jodek, 2-hydroksyetanosulfonian, mleczan, laktobionian, maleinian, mesylan, metylobromek, metylosiarczan, napsylan, azotan, oleinian, pamonian, fosforan, poligalakturonian, stearynian, bursztynian, siarczan, sulfosalicylan, taninian, winian, terftalan, tosylan i trietiodyd (triethiodide).
Kompozycje farmaceutyczne zawierające aktywny składnik mogą być w jakiejkolwiek postaci odpowiedniej do podawania zamierzonym sposobem. Do stosowania doustnie można wytworzyć np. tabletki, kołaczyki, pastylki do ssania, zawiesiny wodne lub olejowe, dyspergujące proszki lub granulki, emulsje, twarde lub miękkie kapsułki, syropy lub eliksiry. Kompozycje przeznaczone do podawania doustnie można wytworzyć według jakiejkolwiek, znanej w dziedzinie metody wytwarzania kompozycji farmaceutycznych i takie kompozycje mogą zawierać jeden lub więcej środków obejmujących środki słodzące, środki smakowe, środki barwiące i środki konserwujące, w celu wytworzenia preparatu o przyjemnym smaku. Dopuszcza sie tabletki zawierające aktywny składnik w mieszance z nietoksycznym farmaceutycznie dopuszczalnym rozczynnikiem, odpowiednim do wytwarzania tabletek. Rozczynniki te mogą być, np. obojętnymi rozcieńczalnikami, takimi jak węglan wapnia lub sodu, laktoza, fosforan wapnia lub sodu; środki granulujące i rozsadzające, takie jak skrobia kukurydziana, lub kwas alginowy; środki wiążące, takie jak skrobia, żelatyna lub guma arabska; i środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk. Tabletki mogą być w postaci drażetek lub mogą być powlekane znanymi technikami obejmującymi mikroenkapsulację w celu opóźnienia rozpadu i adsorpcji w przewodzie pokarmowym, a tym samym zapewniają przedłużone działanie przez dłuższy okres czasu. Przykładowo można stosować składnik opóźniający działanie taki jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu, sam lub z woskiem.
Preparaty do stosowania doustnie mogą być także przedstawione w postaci twardych kapsułek żelatynowych, w których aktywny składnik miesza się z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem, np. fosforanem wapnia lub kaolinem, lub w postaci miękkich kapsułek żelatynowych, w których aktywny składnik miesza sie z medium wodnym lub olejowym, takim jak olej arachidowy, ciekła parafina lub oliwa z oliwek.
Wodne zawiesiny zawierają aktywne substancje w mieszance z rozczynnikami odpowiednimi do wytwarzania wodnych zawiesin. Rozczynniki takie obejmują środek zawieszający, taki jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, alginian sodu, poliwinylopirolidon, guma tragakantowa i guma arabska oraz środki zwilżające lub rozsadzające takie jak naturalnie występujące fosfatydy (np. lecytyna), produkt kondensacji tlenku alkilenu z kwasem tłuszczowym (np. stearynian polioksyetylenu), produkt kondensacji tlenku etylenu z długołańcuchowym alkoholem alifatycznym (np. heptadekaetylenoksycetanolem), produkt kondensacji tlenku etylenu z częściowym estrem pochodzącym od kwasu tłuszczowego i bezwodnika heksytolu (np. polioksyetylenowany monooleinian sorbitolu). Wodne zawiesiny mogą także zawierać jeden lub więcej środków konserwujących takich jak p-hydroksybenzoesan etylu lub n-propylu, jeden lub więcej środków barwiących, jeden lub więcej środków smakowych i jeden lub więcej środków słodzących, takich jak sacharoza lub sacharyna.
Zawiesiny olejowe można komponować za pomocą aktywnego składnika zawieszającego w oleju roślinnym, takim jak olej arachidowy, oliwa z oliwek, olej sezamowy lub olej kokosowy, lub w oleju mineralnym takim jak ciekła parafina. Zawiesiny doustne mogą zawierać środek zagęszczający, taki jak wosk pszczeli, parafina twarda lub alkohol cetylowy. Środki słodzące, takie jak te przedstawione powyżej i środki smakowe można dodawać z wytworzeniem preparatu doustnego o przyPL 212 929 B1 jemnym smaku. Kompozycje te można zabezpieczyć przez dodanie przeciwutleniacza takiego jak kwas askorbinowy.
Dyspergujące proszki i granulki odpowiednie do otrzymywania wodnej zawiesiny przez dodanie wody zapewniają otrzymanie aktywnego składnika w mieszance ze środkiem rozsadzającym lub zwilżającym, środkiem zawieszającym, i jednym lub więcej środkami konserwującymi. Odpowiednie środki zwilżające lub rozsadzające i emulgatory przedstawiono w powyższych przykładach. Występować mogą także dodatkowe rozczynniki, np. słodzące, smakowe i środki barwiące.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą także być w postaci emulsji oleju w wodzie. Fazą olejową może być olej roślinny, taki jak oliwa z oliwek lub olej arachidowy, olej mineralny, taki jak ciekła parafina, lub ich mieszanina. Odpowiednie środki emulgujące obejmują naturalnie występujące gumy, takie jak guma arabska i guma tragakantowa, naturalnie występujące fosfatydy, takie jak lecytyna sojowa, estry lub częściowe estry pochodzące od kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, takich jak monooleinian sorbitolu, oraz produkty kondensacji tych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, takim jak polioksyetylenowany monooleinian sorbitolu. Emulsja może także zawierać środki słodzące i smakowe.
Syropy i eliksiry można komponować za pomocą środków słodzących, takich jak glicerol, sorbitol lub sacharoza. Preparaty takie mogą także zawierać środek łagodzący, środek konserwujący, środek smakowy lub barwiący.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą występować w postaci sterylnych preparatów do wstrzykiwania, takich jak sterylne wodne lub olejowe zawiesiny do wstrzykiwania. Zawiesiny te można komponować znanymi technikami stosując odpowiednie, wyżej wymienione, środki zwilżające lub rozsadzające i emulgatory. Tymi sterylnymi preparatami do wstrzykiwania mogą także być sterylne roztwory do wstrzykiwania lub zawiesiny, albo w nietoksycznym dopuszczalnym do stosowania pozajelitowo rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, takim jak roztwór w 1,3-butanodiolu albo wytworzone w postaci liofilizowanego proszku. Pośród dopuszczalnych do stosowania rozczynników i rozpuszczalników są woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto, sterylne oleje utwardzone można zazwyczaj stosować jako rozpuszczalnik lub medium zawieszające. Do tego celu można stosować dowolny niedrażniący olej utwardzony w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Ponadto, kwasy tłuszczowe takie jak kwas oleinowy można również stosować w wytwarzaniu preparatów do zastrzyków.
Ilość aktywnego składnika, który można łączyć z nośnikiem w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie się zmieniać zależnie od leczonego osobnika i konkretnego sposobu podawania. Przykładowo preparat przedłużonego działania przeznaczony do podawania doustnie dla ludzi może zawierać 20 do 2000 μmol (w przybliżeniu 10 do 1000 mg) składnika aktywnego związanego z odpowiednim i nośnikiem w dogodnej ilości, który może zmieniać sie od około 5 do około 95% całkowitej kompozycji. Korzystne jest wytworzenie kompozycji farmaceutycznej, w łatwych do odmierzenia ilościach do podawania. Przykładowo, wodny roztwór przeznaczony do wlewu dożylnego powinien zawierać od około 0,05 do około 50 μmol (w przybliżeniu 0,025 do 25 mg) aktywnego składnika na mililitr roztworu w celu umożliwienia wlewu odpowiedniej objętości z szybkością około 30 ml/godzinę.
Jak wskazano powyżej, odpowiednie do podawania doustnie preparaty według wynalazku mogą występować w postaci oddzielnych jednostek takich jak kapsułki, kapsułki z opłatka lub tabletki, z których każda zawiera wstępnie określona ilość aktywnego składnika; w postaci proszku lub granulek; w postaci roztworu lub zawiesiny w wodzie lub płynie niewodnym; lub w postaci płynnej emulsji olej w wodzie lub woda w oleju. Aktywny składnik można także podawać w postaci bolusa, powidełka lub pasty.
Tabletkę można wytworzyć przez prasowanie lub formowanie, ewentualnie z jednym lub więcej dodatkowymi składnikami. Tabletki prasowane można wytworzyć za pomocą prasowania w odpowiedniej tabletkarce aktywnego składnika w postaci wolno płynącej takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie mieszać ze spoiwem (np. powidonem, żelatyną, hydroksypropylometylocelulozą), środkiem poślizgowym, obojętnym rozcieńczalnikiem, środkiem konserwującym, substancją rozsadzającą (np. glikolan sodowej skrobi, usieciowany powidon, usieciowana sól sodowa karboksymetylocelulozy) środkiem powierzchniowoaktywnym lub dyspergującym. Formowane tabletki można wykonać przez odlewanie w odpowiedniej maszynie mieszaniny sproszkowanego związku nawilżonej obojętnym płynnym rozcieńczalnikiem. Tabletki mogą ewentualnie być powlekane lub z rowkiem i można je komponować tak, aby wytworzyć wolne uwalnianie lub kontrolowane uwalnianie aktywnego składnika tam
PL 212 929 B1 stosowanego, np. hydroksypropylometyloceluloza w zmiennych proporcjach z wytworzeniem pożądanego profilu uwalniania. Tabletki można ewentualnie powlekać w taki sposób, aby spowodować uwalnianie środka aktywnego w innej niż żołądek części przewodu pokarmowego. Jest to szczególnie korzystne przy związkach o wzorze I gdy takie związki są wrażliwe na hydrolizę w obecności kwasu.
Preparaty odpowiednie do podawania miejscowego w jamie ustnej obejmują pastylki do ssania zawierające aktywny składnik w aromatyzowanej bazie, zazwyczaj sacharozie i gumie arabskiej lub gumie tragankowej; pastylki zawierające aktywny składnik w obojętnej bazie takiej jak żelatyna i gliceryna, lub sacharoza i guma arabska; oraz płyny do płukania ust zawierające aktywny składnik w odpowiednim ciekłym nośniku.
Preparaty do podawania doodbytniczo mogą występować w postaci czopka z odpowiednią bazą zawierającą np. masło kakaowe lub salicylan.
Preparaty odpowiednie do podawania dopochwowo mogą występować w postaci pessariów, tamponów, kremów, żelów, past, pianek lub preparatów w spraju zawierających oprócz aktywnego składnika takie nośniki, o których wiadomo, że są odpowiednie w dziedzinie.
Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowo obejmują wodne i niewodne izotoniczne sterylne roztwory do wstrzykiwania, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które zapewniają izotoniczność preparatu względem krwi danego biorcy; oraz wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą obejmować emulgatory i środki zagęszczające. Preparaty mogą występować w uszczelnionych pojemnikach z dawką jednostkową lub wieloma dawkami, np. ampułkach i fiolkach, oraz można przechowywać w stanie liofilizowanym (odparowanym ze stanu zamrożenia) wymagającym tylko dodania sterylnego ciekłego nośnika, np. wody do wstrzyknięć, bezpośrednio przed użyciem. Roztwory i zawiesiny do wstrzyknięć można wytworzyć ze sterylnych proszków, granulek i tabletek uprzednio opisanych rodzajów.
Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowo można podawać we wlewie ciągłym poprzez pompę z cewnikiem lub za pomocą kroplówki. Ciągły wlew obejmuje wlew za pomocą zewnętrznej pompy. Wlewy można wykonywać za pomocą sposobu Hickmana lub PICC lub jakiegokolwiek innego odpowiedniego sposobu podawania preparatu albo pozajelitowo albo dożylnie.
Korzystne jednostkowe postacie dawkowanie preparatów to takie, które zawierają lek w dawce dobowej lub jednostce, poddawce, lub odpowiedniej jej części.
Jednakże, jasnym jest, że konkretny poziom dawkowania dla jakiegokolwiek danego pacjenta będzie zależał od różnych czynników m.in. od aktywności konkretnego stosowanego związku; wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci i diety leczonego osobnika; czasu i sposobu podawania; szybkości wydalania; innych leków, które podawano uprzednio; i stanu zaawansowania danej choroby poddawanej leczeniu, co jest również jasne w dziedzinie.
Związki wytwarzane według wynalazku
Związkami wytworzonymi oraz związkami pośrednimi według wynalazku są 6-członowe cykliczne diestry fosforanowe, proleki araCMP przedstawione wzorem I:
Wzór I w którym:
M i V znajdują się w pozycji cis względem siebie i MH oznacza cytarabinę;
atom tlenu znajdujący się w pozycji 5' cytarabiny przyłączony jest do atomu fosforu;
V oznacza 4-pirydyl;
oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne proleki i sole.
1.0 Synteza czynnika fosforylującego:
Do wytwarzania 1,3-dioli znane są różne syntetyczne metody, które są podzielone na dwa następujące typy:
1) Synteza racemicznego 1-(arylo)propano-1,3-diolu;
2) Synteza enancjowzbogaconych 1-(arylo)propano-1,3-dioli.
PL 212 929 B1
1.1. Synteza racemicznego 1-(arylo)propano-1,3-diolu: związki 1,3-dihydroksylowe można zsyntetyzować kilkoma znanymi w literaturze metodami. Do syntezy racemicznych 1-(arylo)propano-1,3dioli stosowane są podstawione aldehydy aromatyczne, w reakcji addycji enolanu litu octanu alkilu i następnie poprzez redukcję estru (droga A) (Turner, J. Org. Chem. 55:4744 (1990)). Alternatywnie, reakcje addycji arylowego związku Grignard'a do 1-hydroksypropan-3-alu także prowadzą do powstania 1-(arylo-podstawionych)propano-1,3-dioli (droga B). Metoda ta umożliwia konwersję różnych podstawionych halogenków arylu do 1-(arylo-podstawionych)-1,3-propanodioli (Coppi, i in., J. Org. Chem. 53:911 (1988)). Halogenki arylu można także stosować do syntezy 1-podstawionych propanodioli w reakcji sprzęgania Heck'a 1,3-dioks-4-enu, następnie przez redukcję i hydrolizę (Sakamoto, i in., Tetrahedron Lett. 33:6845 (1992)). Pirydylowe, chinolinowe, izochinolinowe pochodne propano-3-olu można utlenić do (1-podstawionych)-1,3-dioli w reakcji tworzenia
N-tlenku, następnie przez przegrupowanie w środowisku bezwodnika octowego (droga C) (Yamamoto, i in., Tetrahedron 37:1871 (1981)). Ponadto, różne aldehydy aromatyczne można poddać konwersji do (1-podstawionych)-1,3-dioli w reakcji addycji winylowych związków Grignard'a, następnie w reakcji hydroborowania (droga D).
1
V = aryl, R = alkil, R1 = benzyl, M = Mg lub Li, X = halogenek lub nie istnieje.
1.2. Synteza enancjowzbogaconych 1-(arylo)propano-1,3-dioli:
Różne znane metody rozdzielania alkoholi drugorzędowych z wykorzystaniem reakcji chemicznych lub enzymatycznych można stosować do otrzymywania enancjomerów dioli (Harada, i in., tetrahedron Lett. 28:4843 (1987)). Katalizowana przez metal przejściowy reakcja uwodornienia podstawionego kwasu 3-arylo-3-oksopropionowego lub estrów stanowi efektywną metodę wytwarzania izomerów R lub S β-hydroksykwasów lub estrów o wysokiej czystości enancjomerycznej (Comprehensive Asymmetric Catalysis, Jacobsen, E. N., Pfaltz, A., Yamamoto, H. (Eds), Springer, (1999); Asymmetric Catalysis in Organic Synthesis, Noyori, R., John Wiley, (1994)). Wytworzone β-hydroksykwasy lub estry można następnie zredukować z wytworzeniem pożąd anych 1-(arylo)propano-1,3-dioli o wysokim nadmiarze enancjomerycznym. (droga A). β-ketokwasowe lub estrowe substraty do reakcji wysokociśnieniowego uwodornienia lub reakcji przeniesienia wodoru można wytworzyć, stosując różne metody, takie jak kondensacja acetofenonu z węglanem dimetylu w obecności zasady (Chu, i in., J. Het Chem. 22:1033 (1985)), kondensacja estru (Turner, i in., J. Org. Chem. 54:4229 (1989)) lub z halogenku arylu (Kobayashi, i in., Tetrahedron Lett. 27:4745 (1986)). Alternatywnie, 1,3-diole o wysokiej czystości enancjomerycznej można wytworzyć w reakcji enancjoselektywnej redukcji borowodorem pochodnych β-hydroksyetyloaryloketonu lub β-ketokwasu (droga B) (Ramachandran, i in., Tetrahedron Lett. 38:761 (1997)). Według innej metody, dostępne w handlu alkohole cynamonowe można przekształcić w epoksyalkohole w katalitycznej reakcji asymetrycznej epoksydacji. Otrzymane epoksyalkohole redukuje się z zastosowaniem Red-Al, z wytworzeniem 1,3-dioli o wysokim nadmiarze enancjomerycznym (droga C) (Gao, i in., J. Org. Chem. 53:4081 (1980)). Enancjoselektywna kondensacja aldolowa stanowi kolejną dobrze opisaną metodę syntezy 1,3-utlenionycn związków funkcyjnych o wysokim nadmiarze enancjomerycznym, w której substancjami wyjściowymi są aldehydy aromatyczne, (droga D) (Mukaiyama, Org. React. 28:203 (1982)).
PL 212 929 B1
V = aryl, R = alkil lub H, R1 = -CH2OH, CO2R
Dla celów wynalazku ketoester - związek pośredni wytwarza się z 4-acetylopirydyny o wzorze A. C' wskazuje atom węgla będący metinowym centrum chiralności w końcowym związku według wynalazku.
Związek o wzorze A poddaje się reakcji z węglanem dimetylu z wytworzeniem estru metylowego kwasu oksopropanowego. Centrum chiralności tworzy się, stosując metodę przeniesienia wodoru Noyori'ego (Fujii i in., J. Am. Chem. Soc. 118 (10): 2521-2 (1996)). Ester kwasu oksypropanowego poddaje się reakcji redukcji w obecności enancjowzbogaconego katalizatora rutenowego (10) do hydroksyestrowego związku pośredniego, który następnie redukuje się z wykorzystaniem borowodorku sodu do enancjowzbogaconego 1,3-propanodiolu, opisanego następującym wzorem B:
Centrum chiralności na atomie węgla C' ustala się na tym etapie procesu i wartość nadmiaru enancjomerycznego utrzymuje się przez pozostałe etapy.
1.3. Synteza czynnika fosforylującego
Innym aspektem wynalazku jest wytwarzanie czynników fosforylujących o wzorze C:
w którym:
L oznacza grupę opuszczającą, wybraną spośród takich jak atom fluorowce, grupy aryloksy podstawione przez 1-3 grup elektroakceptorowych.
PL 212 929 B1
Grupy L i 4-pirydyl znajdują się w pozycji trans względem siebie.
Związki o wzorze C występują w postaci mieszaniny racemicznej lub mają konfigurację S przy atomie węgla C' lub konfigurację R przy atomie węgla C'.
Ogólną syntezę czynnika fosforylującego o wzorze C przeprowadza się poprzez poddanie reakcji 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu z dichlorofosforanem o wzorze CI2P(O)-L. W pewnym aspekcie, grupy opuszczające L wybiera sie spośród takich jak atom fluorowca i grupy aryloksy podstawione przez 1-3 grup elektroakceptorowych. Zgodnie z innym aspektem, grupami opuszczającymi są fluorowce, takie jak atom chloru lub atom bromu, i (podstawione)aryloksy, takie jak chlorofenoksy, dichlorofenoksy lub nitrofenoksy. Zgodnie z innym aspektem, grupami opuszczającymi są, takie jak atom chloru, 4-chlorofenoksy, 3,5-dichlorofenoksy, 2,4-dichlorofenoksy i 4-nitrofenoksy. Dichlorofosforan, w którym L oznacza aryloksy, syntetyzuje się poprzez poddanie reakcji podstawionych fenoli z chlorkiem fosforylu (Rathore i in., Indian J. Chern B 32(10), 1066 (1993)).
Enancjowzbogacony aktywowany czynnik fosforylujący wytwarza się w reakcji fosforylacji enancjowzbogaconego 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu z dichlorofosforanami o wzorze L-P(O)Cl2 w obecności zasady (Ferroni i in., J. Org. Chem. 64(13), 4943 (1999)). W pewnym aspekcie, do roztworu dichlorofosforanu w wybranym rozpuszczalniku kolejno dodaje się roztwór diolu i zasadę. Zgodnie z innym aspektem, roztwór diolu i zasady oraz inny roztwór zawierający dichlorofosforan w takim samym rozpuszczalniku lub w innym rozpuszczalniku, jednocześnie dodaje się do wybranego rozpuszczalnika. Zgodnie z innym aspektem, roztwór diolu dodaje się do roztworu czynnika fosforowego a następnie dodaje się zasadę. Typowymi rozpuszczalnikami stosowanymi w reakcji fosforylacji diolu są polarne aprotonowe rozpuszczalniki, które wykazują niską reaktywność wobec dichlorofosforanów i rozpuszczają diol lub dichlorofosforan. W pewnym aspekcie, rozpuszczalnikami stosowanymi do reakcji fosforylacji są dichlorometan, THF, acetonitryl, pirydyna, tetraalkilomoczniki, fosforany trialkilu lub heksaalkilofosforamidy. Zgodnie z innym aspektem, rozpuszczalnikami są dichlorometan, THF, acetonitryl, pirydyna, DMPU, DMEU, tetrametylomocznik, trimetylofosforan lub heksametylofosforamid. W czasie reakcji utrzymuje się niską temperaturę, szczególnie podczas początkowej fazy reakcji, która jest egzotermiczna, w celu zapobieżenia rozkładowi reagentów. W pewnym aspekcie, temperaturę utrzymuje się poniżej temperatury pokojowej w zakresie -20°C do 10°C. W pewnym aspekcie, kontroluje sie reakcję egzotermiczną, temperaturę reakcji powoli podnosi sie do temperatury pokojowej, w celu całkowitego przeprowadzenia reakcji powstawania czynnika fosforanowego. Zgodnie z innym aspektem, utrzymuje się taką samą temperaturę, aż do zakończenia reakcji, aby zapobiec rozkładowi reagentów. Z uwagi na stereogeniczne własności atomu fosforu, reakcja dichlorofosforanu z diolem w opisanych powyżej warunkach reakcji daje mieszaninę izomerów cis i trans, z niewielka przewagą ilości izomeru cis. Typowo stosunek ilości izomerów cis/trans zawiera się w zakresie od 50/50 do 60/40. Izomery cis i trans oddziela się, stosując połączenie metody chromatografii kolumnowej i/lub krystalizacji. W kolejnym aspekcie stwierdzono, że gdy wydzielony izomer cis czynnika (4-nitrofenoksy)fosforylującego ogrzewano z solą 4-nitrofenolu, to > 85% wydzielonego czynnika fosforylującego stanowił izomer trans. Według innego aspektu stwierdzono, że gdy wydzieloną mieszaninę izomerów cis i trans czynnika (4-nitrofenoksy)fosforylującego ogrzewano z solą 4-nitrofenolu, w takim samym rozpuszczalniku, jak użyto w etapie reakcji fosforylacji lub w innym rozpuszczalniku, to > 85% wydzielonego czynnika fosforylującego stanowił izomer trans. Ponadto stwierdzono, nie jest konieczne uprzednie oddzielanie mieszaniny by osiągnąć wzbogacenie. Dodanie soli zawierającej fenolową grupę opuszczającą do surowej mieszaniny reakcyjnej, w której wytwarzano aryloksylowy czynnik fosforylujący diolu umożliwia wzbogacenie w izomer trans związku o wzorze C, w takim samym stosunku jaki otrzymano podczas wzbogacanie wydzielonej mieszaniny czynnika fosforylującego. Podobnie, podczas ogrzewania równomolowej mieszaniny izomerów cis i trans chlorofosforanu o wzorze C (L = Cl), można wydzielić tylko izomer trans. Fenolan wytwarza się w reakcji odpowiedniego fenolu z zasadą, korzystnie z trialkiloaminą, heterocyklem zawierającym atom azotu lub z sodem. W pewnym aspekcie, zasadami są trietyloamina, diizopropyloetyloamina, pirydyna, DABCO, DBU, wodorek sodu lub metal alkaliczny. Zgodnie z innym aspektem, zasadami są trietyloamina, DBU lub fenolan sodu. Etap wzbogacania można prowadzić w temperaturze pokojowej, lecz na ogół ogrzanie do temperatury zmniejsza czasy reakcji, korzystnie w zakresie 40°C do 70°C. Podczas gdy konwersja aryloksylowego czynnika fosforylującego wymaga dodania odpowiedniej soli fenolanowej, konwersja chlorofosforanów chiralnych dioli nie wymaga dodatkowego zastosowania rozpuszczalnych chlorków, ponieważ podczas tworzenia chlorofosforanu z korzystną zasadą powstają dwa równoważniki jonów chlorkowych. W pewnym aspekcie, po zakończeniu fosforylacji diolu, mieszaninę reakcyjną ogrzewa
PL 212 929 B1 się, korzystnie w zakresie od 40°C do 70°C, w celu całkowitego przekształcenia izomeru cis w izomer trans. Według innego aspektu utrzymuje się taką samą temperaturę, jak użyto w czasie dodawania reagentów.
Zachowanie chiralności atomu węgla C' ma podstawowe znaczenie dla otrzymywania enancjowzbogaconego czynnika fosforylującego z enancjowzbogaconych dioli. Częściową racemizację obserwowano w przypadku 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu, w którym, stosując opisane warunki początkowy nadmiar enencjomeryczny wynoszący 98% dla diolu zmniejszył się do < 85% w wydzielonym fosforylującym czynniku trans. W pewnym aspekcie według wynalazku, stwierdzono, że zastosowanie rozpuszczalników heteroarylowych zawierających atom N pozwala na otrzymanie czynnika fosforylującego o czystości optycznej izomeru trans większej niż 95% nadmiar enencjomeryczny. W pewnym aspekcie, rozpuszczalnikami heteroarylowymi zawierającymi atom N są ewentualnie podstawione pirydyny, chinoliny i pirazyny. Zgodnie z innym aspektem, rozpuszczalnikami heteroarylowymi zawierającymi atom N są ewentualnie podstawione pirydyny. Zgodnie z innym aspektem, rozpuszczalnikiem heteroarylowym zawierającym atom N jest pirydyna. W kolejnym aspekcie wynalazku, stwierdzono, że powstawanie soli enancjowzbogaconego 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu przed dodaniem dichlorofosforanu lub chlorku fosforylu i późniejsze dodanie zasady pomaga zapobiec epimeryzacji atomu węgla C' bez konieczności stosowania rozpuszczalników heteroarylowych zawierających atom N. W pewnym aspekcie, sole 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu powstają w reakcji 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu z kwasem organicznym lub mineralnym o pKa<2. Zgodnie z innym aspektem, sole powstają w reakcji z kwasami mineralnymi o pka<1. Zgodnie z innym aspektem, solami są chlorowodorek i bromowodorek. Izomery cis i trans oddziela się, stosując połączenie metody chromatografii kolumnowej i/lub krystalizacji. Jednakże, stwierdzono, że po etapie wzbogacania, oddzielanie izomeru trans było znacznie uproszczone, z wytworzeniem czynnika fosforylującego o wysokiej czystości, izomer trans > 95% i nadmiar enencjomeryczny > 95%. W pewnym aspekcie wydziela się fosforylujący czynnik trans. Zgodnie z innym aspektem, czynnik fosforylujący utrzymuje się w roztworze i stosuje się w reakcji fosforylacji nukleozydów bez oczyszczania. Względną konfigurację atomu fosforu określa się 31 na podstawie porównania z widmem 31p NMR. Wartość przesunięcia chemicznego ekwatorialnej grupy fosforyloksylowej (izomer trans) dioksafosforinanu jest w kierunku większego pola niż jednego spośród izomerów aksjalnych (Verkade, i in., J. Org. Chem. 42, 1549(1977)).
2.0. Synteza proleków cis araCMP
W syntezie proleków cis o wzorze I, grupa proleku może być wprowadzona na różnych etapach syntezy. Najczęściej cykliczne fosforany wprowadza się w późniejszym etapie, ze względu na powszechną wrażliwość tych grup na różne warunki reakcji. Syntezę można także prowadzić, stosując zabezpieczoną lub niezabezpieczoną cytarabinę. Pojedyncze stereoizomery proleków cis można otrzymać poprzez rozdzielenie diastereoizomerów, stosując połączenie metod chromatografii kolumnowej i/lub krystalizacji, lub podczas enancjospecyficznej syntezy, z zastosowaniem enancjowzbogaconych czynników fosforylujące.
2.1. Zabezpieczanie cytarabiny
W literaturze (np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3116282; Shen i in., J. Org. Chem. 30: 835-838 (1965); Hessler, J. Org. Chem. 41(10): 1828-1831(1976)) opisano różne preparaty araC (Merck Index 11-th Edition, nr 2790) oraz ich analogi, przy czym są one znane w dziedzinie.
Cytarabina jest także dostępna w handlu, ze źródeł obejmujących między innymi, Shanghai Freeman International Trading Co., Brantford, Sigma, Fluka i Sunray Pharmaceuticals.
Według ogólnej procedury reakcję fosforylacji zabezpieczonej cytarabiny przeprowadza sie poprzez poddanie reakcji związku pośredniego odpowiednio zabezpieczonej cytarabiny z zasadą i poddanie reakcji wytworzonego alkoholanu z czynnikiem fosforylującym. Zabezpieczoną cytarabinę można wytworzyć sposobem znanym w dziedzinie, stosując jedną spośród wielu opisanych metod zabezpieczania nukleozydów (Greene T.W., Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)). Nukleozyd zabezpiecza się, pozostawiając bez ochrony grupę 5'-hydroksylową z którą ma się związać grupa fosforanowa, jednocześnie zabezpieczając wszystkie pozostałe grupy hydroksylowe oraz inne grupy funkcyjne nukleozydu, które mogą przeszkadzać w etapie fosforylacji lub prowadzić do powstania regioizomerów. W pewnym aspekcie, wybrane grupy zabezpieczające są odporne na działanie silnych zasad, np. etery i etery sililowe. W kolejnym aspekcie, grupy zabezpieczające są ewentualnie podstawione eterami MOM, MEM oraz eterami trialkilosililowymi. Zgodnie z innym aspektem, grupą zabezpieczającą jest eter t-butylodimetylosililowy. Dalsze zabezpieczenie wiąże się z maskowaniem atomu azotu 4-N-cytarabiny w celu wyeliminowania protonów kwasowych.
PL 212 929 B1
W pewnym aspekcie wybrane grupy zabezpieczające atom N wybiera się spośród takich jak formamidyny dialkilowe, iminy monoalkilowe i iminy monoarylowe. W pewnym aspekcie iminą monoalkilową jest benzyloimina i iminą monoarylową jest fenyloimina. Zgodnie z innym aspektem, grupą zabezpieczajacą atom N jest symetryczna dialkiloformamidyna wybrana spośród takich jak dimetyloformamidyna i dietyloformamidyna.
W pewnym aspekcie, zabezpieczenie cytarabiny przeprowadza się, stosując następującą 4-etapową procedurę. Cytarabinę traktuje się chlorkiem benzoilu w DMPU, z wytworzeniem estru benzoesanowego. Ester ogrzewa sie z chlorkiem tert-butylodimetylosililu, uzyskując mieszaninę związków disililowych i monosililowych. Surową mieszaninę traktuje się etanolowym roztworem hydrazyny w celu rozkładu estru. Po obróbce wodnej i oczyszczaniu produktu w postaci chlorowodorku, uzyskano pożądaną 2',3'-disililocytarabinę jako pojedynczą jednostkę. Następnie związek zmieszano z acetalem dimetylowym dimetyloformamidu, z wytworzeniem zabezpieczonego związku formamidynowego cytarabiny jak pokazano we wzorze D:
2.2. Fosforylacja zabezpieczonej cytarabiny
Tworzenie alkoholanu z odsłoniętej grupy hydroksylowej, znajdującej się na odpowiednio zabezpieczonej cytarabinie, uzyskuje się w reakcji z zasadą w aprotonowym rozpuszczalniku, który nie jest wrażliwy na obecność zasad, takim jak THF, formamidy dialkilowe i cykliczne, eter, toluen oraz mieszaniny tych rozpuszczalników. W pewnym aspekcie, rozpuszczalnikami są takie jak DMF, DMA, DBF, N-metylopirolidyna, THF i mieszanina tych rozpuszczalników.
W reakcji fosforylacji nukleozydów oraz związków nienukleozydowych z cyklicznymi i acyklicznymi czynnikami fosforylującymi stosuje sie wiele różnych zasad. Np. trialkiloaminy, takie jak trietyloamina (Roodsari i in., J. Org. Chem. 64(21), 7727 (1999)) lub diizopropyloetyloamina (Meeki in., J. Am. Chem. Soc. 110(7), 2317 (1988)); heterocykliczne aminy zawierające azot, takie jak pirydyna (Hoefler i in., Tetrahedron 56(11), 1485 (2000)), N-metyloimidazol (Vankayalapati i in., J. Chem. Soc. Perk T114, 2187(2000)), 1,2,4-triazol (Takaku i in., Chem. Lett. (5), 699 (1986)) lub imidazol (Dyatkina i in., Tetrahedron Lett. 35(13), 1961 (1994)); zasady metaloorganiczne, takie jak t-butanolan potasu (Postel i in., J.CKarbohyd. Chem. 19(2), 171 (2000)), butylolit (Torneiro i in., J. Org. Chem. 62(18), 6344 (1977)), chlorek t-butylomagnezu (Hayakawa i in., Tetrahedron Lett. 28(20), 2259 (1987)) lub LDA (Aleksiuk i in., J. Chem. Soc. Chem. Comm. (1), 11 (1993)); zasady nieorganiczne, takie jak fluorek cezu (Takaku i in., Nippon Kagaku Kaishi (10), 1968 (1985)), wodorek sodu (Hanaoka i in., Heterocycles 23(11), 2927 (1985)), jodek sodu (Stromberg i in., J. Nucleos. Nucleot. 6(5), 815 (1987)), jod (Stromberg i in., J. Nucleos. Nucleot. 6(5), 815 (1987)) lub wodorotlenek sodu (Attanasi i in., Phosphorus Sulfur 35(1-2), 63 (1988)); metal taki jak miedź (Bhatia i in., Tetrahedron Lett. 28(3), 271 (1987)). Jednakże, gdy próbowano prowadzić reakcję sprzęgania czynnika fosforylującego o wzorze C, stosując uprzednio opisane metody nie obserwowano reakcji lub racemizacji przy atomie fosforu stanowiącym centrum chiralności. Szczególnie, nie obserwowano reakcji z zasadami, uprzednio stosowanymi w reakcji z podstawionym cyklicznym czynnikiem fosforylującym z wytworzeniem odpowiedniego cyklicznego fosforanu z dużą wydajnością, takimi jak wodorek sodu (Thuong i in., Bull Soc. Chim. Fr. 667 (1974)), pirydyna (Ayral-Kaloustian i in., Carbohydr. Res. 187(1991)), butylolit (Hulst i in., Tetrahedron Lett. 1339 (1993)), DBU (Merckling i in., Tetrahedron Lett. 2217 (1996)), trietyloamina (Hadvary i in., Helv. Chim. Acta, 1986, 69(8), 1862), N-metyloimidazol (Li i in., Tetrahedron Lett. 6615 (2001)) Iub metanolan sodu (Gorenstein i in., J. Am. Chem. Soc. 5077 (1980)). W pewnym aspekcie według wynalazku, stwierdzono, że zastosowanie odczynników Grignard'a wspomaga reakcję fosforylacji z jednoczesną minimalna epimeryzacją centrum fosforowego. W pew20
PL 212 929 B1 nym aspekcie, odczynnikami Grignard'a są alkilowe i arylowe związki Grignard'a. Zgodnie z innym aspektem, odczynnikami Grignard'a są halogenki t-butylomagnezu i halogenki fenylomagnezu. Według innego aspektu, odczynnikami Grignard'a są chlorek t-butylomagnezu i chlorek fenylomagnezu.
W innym aspekcie wynalazku alkoholany magnezu stosuje się w celu wytworzenia 5'-alkoholanu magnezu cytarabiny. W pewnym aspekcie alkoholany magnezu wybiera się spośród takich jak Mg(O-t-Bu)2 i Mg(O-iPr)2.
Według innego aspektu według wynalazku, do roztworu alkoholanu wytworzonego z jednej spośród uprzednio opisanych zasad można dodać kwasy Lewis'a, w celu zarówno wymiany karbokationu alkoholanu i/lub modulowania reaktywności utworzonego alkoholanu względem czynnika fosforylujacego. Przykłady kwasów Lewis'a obejmują sole metali alkalicznych, metali ziem rzadkich lub metali przejściowych. W pewnym aspekcie, kwasami Lewis'a są sole magnezu, wapnia, cezu, glinu lub ceru. Zgodnie z innym aspektem, kwasami Lewis'a sa chlorek magnezu, bromek magnezu i jodek magnezu.
W pewnym aspekcie, warunki reakcji syntezy związków o wzorze I obejmują początkowo wytworzenie alkoholanu z wykorzystaniem odczynika Grignard'a lub jednej spośród innych zasad oraz soli magnezu, następnie dodanie czynnika fosforylującego o wzorze C do roztworu nukleozydu, zarówno w postaci roztworu, na ogół w takim samym rozpuszczalniku lecz nie koniecznie, jak i bezpośrednio w postaci ciała stałego. Zgodnie z innym aspektem, roztwór alkoholanu dodaje się do roztworu czynnika fosforylującego. W pewnym aspekcie, temperatury reakcji tworzenia alkoholanu z zasadą znajduja się w zakresie -78°C do 40°C. W pewnym aspekcie, temperatury są wybrane z zakresu -20°C do 25°C. Zgodnie z innym aspektem, temperatury stosowane w reakcji fosforylacji są wybrane z zakresu -10°C do 70°C. Zgodnie z innym aspektem, temperatury są wybrane z zakresu 10°C do 40°C.
Zabezpieczone proleki wytwarza się sposobem powyżej opisanym, po czym poddaje się reakcji odbezpieczania w celu usunięcia wszystkich grup zabezpieczających, stosując jedną spośród wielu metod znanych w dziedzinie (Greene T.W., Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)), uwzględniając trwałość proleku fosforanowego. W pewnym aspekcie, odczynniki odbezpieczające obejmują fluorki, stosowane do usuwania sililowych grup zabezpieczających, kwasy mineralne lub organiczne do usuwania kwasowych labilnych grup zabezpieczających, takich jak silil i/lub ketal oraz grup zabezpieczających atom N, jeśli są obecne. Zgodnie z innym aspektem, odczynnikami są TBAF, roztwory kwasu chlorowodorowego i wodne roztwory TFA. Według kolejnego aspektu, czynnikami odbezpieczającymi są roztwory kwasu chlorowodorowego. Oddzielanie i oczyszczanie końcowych proleków, jak również wszystkich związków pośrednich, przeprowadza się, stosując połączenie metody chromatografii kolumnowej i/lub krystalizacji, z uzyskaniem związków o wzorze I.
Kolejnym aspektem według wynalazku są metody syntezy pojedynczych izomerów związków o wzorze I. Z uwagi na obecność centrum chiralności przy atomie węgla C' w cząsteczce cyklicznego czynnika fosforanowego, atom węgla może przyjmować dwie wyraźne orientacje, mianowicie R lub S. Tak więc, czynnik o wzorze C trans-fosforanowy może przyjmować zarówno konfigurację S-trans lub R-trans i oba te odczynniki stanowią enancjomery. Dlatego też, w reakcji syntezy czynnika fosforylującego z mieszaniny racemicznej dioli uzyskuje się mieszaninę izomerów R-trans i S-trans. Związki te można rozdzielić, stosując połączenie metody chromatografii kolumnowej i/lub krystalizacji. Alternatywnie, fosforylacja alkoholanu nukleozydu z wykorzystaniem enancjowzbogaconego czynnika trans-fosforanowego prowadzi do powstania pojedynczego, enancjowzbogaconego proleku cis. Tak więc, w reakcji czynnika C'-S-trans-fosforanowego, wytworzonego z diolu o wzorze B powstaje prolek C'-S-cis o wzorze III, podczas gdy w reakcji z czynnikiem C'-R-trans-fosforanowym wytwarza się prolek C'-R-cis.
Zgodnie z innym aspektem, zależnie od szybkości epimeryzacji czynnika cis-fosforanowego w czynnik transfosforanowy w porównaniu z szybkością reakcji cytarabiny z czynnikiem trans-fosforanowym, stwierdzono, że czynnik cis-fosforylujący wciąż prowadzi do wytworzenia proleku cis cytarabiny. Według tego aspektu, czynnik cis-fosforylujący epimeryzuje w czynnik trans-fosforanowy ze śladową ilością grup opuszczających wytwarzanych podczas powstawania małej ilości proleku. Następnie, cytarabina reaguje z czynnikiem trans-fosforanowym wytwarzanym in-situ z wytworzeniem proleku cis. Zgodnie z innym aspektem, cytarabinę poddaje się reakcji z surową mieszaniną czynnika fosforylującego w celu wytworzenia proleku cis. W pewnym aspekcie, surową mieszaninę czynnika fosforylującego wzbogaca się w izomer trans. Według innego aspektu czynnik fosforylujący stosuje się bez etapu V wzbogacania.
2.3. Fosforylacja niezabezpieczonej cytarabiny
Alternatywnie, prolek cytarabiny można zsyntetyzować bez uprzedniego zabezpieczenia, stosując warunki reakcji, w których następuje selektywna fosforylacja pierwszorzędowych grup
PL 212 929 B1 hydroksylowych. Dobrze opracowane jest selektywne 5'-acylowanie nukleozydów takich jak araC z wykorzystaniem chlorków acylu (Gish i in., J. Med. Chem. 14, 1159 (1971)). Jednakże, zarówno czynniki fosforylujace, które są uważane za bardziej reaktywne, jak również reakcja ze stosowanym rozpuszczalnikiem (DMF) przypuszczalnie mogą zmniejszyć regioselektywność oraz wydajność. W pewnym aspekcie wynalazku stwierdzono, że reakcja czynnika fosforylującego o wzorze C z niezabezpieczoną cytarabiną prowadzi do wytworzenia 5'-cis-fosforanu proleku o wzorze I z dużą wydajnością, regioselektywnością i stereoselektywnością. W kolejnym aspekcie wydzielony czynnik fosforylujący dodaje się do roztworu cytarabiny. Według innego aspektu cytarabinę dodaje się do roztworu czynnika fosforylującego. Podobnie, reakcja czynnika S-trans-fosforylującego, wytworzonego z S-diolu o wzorze B, prowadzi do wytworzenia proleku S-cis o wzorze III, podczas gdy czynnik R-trans-fosforylujący daje prolek R-cis. Z uwagi na słabą rozpuszczalność niezabezpieczonych nukleozydów w powszechnie stosowanych rozpuszczalnikach oraz fosforylującym, konieczne jest stosowanie rozpuszczalników o dużej wartości stałej diele ktrycznej, charakteryzujących się małą reaktywnością z czynnikiem fosforylującym. Przykładami takich rozpuszczalników są tetraalkilomoczniki. W pewnym aspekcie, rozpuszczalnikami są DMPU, tetrametylomocznik, DMEU, trimetylofosforan lub heksametylofosforamid.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Synteza 3-okso-3-(piryd-4-ylo)propanonianu metylu (1)
Do trójszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 50 I zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, płaszcz grzejny i wlot na azot, wprowadzono THF (8 I) i t-butanolan potasu (5 kg, 44,6 mola) oraz dodatkową ilość THF (18 I). Następnie dodano 4-acetylopirydynę (2,5 kg, 20,6 mola), czemu towarzyszył wzrost temperatury, i węglan dimetylu (3,75 I, 44,5 mola). Po zakończeniu dodawania, temperatura mieszaniny wynosiła powyżej 40°C. Całość mieszano bez ogrzewania przez 2,5 godziny, po czym temperaturę zwiększono do około 55°C. Następnie mieszaninę ogrzewano w temperaturze 57-60°C przez 3 godziny. Proces monitorowano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Ogrzewanie przerwano i mieszaninę pozostawiono do powolnego ochłodzenia przez noc (15 godzin). Następnie mieszaninę przesączono przez lejek Buchner'a o średnicy 45 cm. Ciało stałe, enolan potasu ketoestru, ponownie wprowadzono do kolby o pojemności 50 I i rozcieńczono wodnym roztworem kwasu octowego (3 I kwasu octowego w 15 I wody). Kwaśną mieszaninę ekstrahowano eterem t-butylometylowym (MTBE) (1 x 16 l, 1 x 12 I). Warstwy organiczne połączono i przemyto wodnym roztworem węglanu sodu (Na2CO3) (1750 g w 12,5 I wody), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (NaHCO3) (8 I) i solanką (8 I). Do suszenia połączonych warstw organicznych przez noc (15 godzin) stosowano siarczan magnezu (MgSO4) (500 g). Osuszony roztwór organiczny przesączono i rozpuszczalnik usunięto na wyparce obrotowej, uzyskując 6,4 kg produktu. Produkt zaczął się wytrącać po usunięciu około połowy ilości rozpuszczalnika. Uzyskaną zawiesinę, mieszając chłodzono w łaźni lodowej przez 2 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto MTBE (500 ml) i suszono w piecu próżniowym w temperaturze 20°C w ciągu 15 godzin, uzyskując 2425 g (wydajność 60%) ketoestru i w postaci jasnożółtego ciała stałego.
Ług macierzysty MTBE zatężono do objętości około 1 I. Uzyskaną zawiesinę chłodzono w łaźni lodowej przez 1 godzinę. Ciało stałe odsączono, przemyto MTBE (2 x 150 ml) i osuszono w piecu próżniowym, uzyskując 240 g (6%) drugiej porcji produktu.
Warunki TLC: postęp reakcji monitorowano, stosując płytki z żelu krzemionkowego 60 firmy
Merck, 2,5 x 7,5 cm, 250 μm; lampę UV; rozpuszczalnik THF/heksan 1:2. Rf substancji wyjściowej = 0,25; Rf produktu =0,3
PL 212 929 B1
P r z y k ł a d 2. Synteza (S) (-)-3-hydroksy-3-(pirydyn-4-ylo)propanonianu metylu (2)
Trójszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 22 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, osłonę czujnika temperatury/termometr, wkraplacz (1 I) i naczynie oziębiające (puste) przepłukano azotem, napełniono kwasem mrówkowym (877 g) i ochłodzono w łaźni lodowej. Do wkraplacza wprowadzono trietyloaminę (TEA) (755 g) i powoli dodawano w ciągu 50 minut do mieszanego kwasu mrówkowego. Reakcja była egzotermiczna z umiarkowanym dymieniem, które wydzielało się do końca dodawania. Po zakończeniu dodawania, usunięto łaźnie chłodzącą i mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dimetyloformamidem (DMF) (5,0 I). Do mieszaniny dodano ketoester 1 (2648 g) w jednej porcji oraz dodatkową ilość 0,5 I DMF, co zapoczątkowało przebieg reakcji endotermicznej. Temperatura obniżyła się do około 5°C, w której to ketoester 1 nie rozpuszczał się. Kolbę zaopatrzono w płaszcz grzejny, całość mieszano i ogrzewano stopniowo do temperatury 16°C w celu rozpuszczenia wszystkich części stałych. Chiralny katalizator rutenowy (18,8 g) (10) dodano w jednej porcji i całość mieszano i ogrzewano do temperatury 55°C w ciągu 1 godziny. Uzyskany ciemny roztwór mieszano w temperaturze 55°C przez 16 godzin. W celu monitorowania postępu reakcji stosowano metodę TLC. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa Buchi R152 w wysokiej próżni, temperatura łaźni = 60°C), z uzyskaniem 3574 g brunatnego oleju. Olej rozpuszczono w dichlorometanie (10 I) i wprowadzono do nieprzenośnego rozdzielacza o pojemności 5 galonów. Ciemny roztwór przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (3,0 I) i następnie fazę wodną ponownie ekstrahowano dichlorometanem (3,0 I). Połączone ekstrakty organiczne osuszono nad MgSO4 (300 g), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 3362 g brunatnego oleju (125% wydajności teo1 retycznej, zawierał DMF, co oznaczono w czasie pomiarów NMR). Pomiary 1H NMR związku według tego oraz kolejnych przykładów przeprowadzono na spektrometrze VARIAN GEMINI-200 MHz. Próbki rozpuszczono we wskazanym rozpuszczalniku i przesunięcia chemiczne odnoszą się do pozostałego rozpuszczalnika.
Warunki TLC: postęp reakcji monitorowano, stosując płytki z żelu krzemionkowego 60 firmy Merck, 2,5 x 7,5 cm, 250 μm; lampa UV: 5% MeOH w CH2CI2: czas retencji substancji wyjściowej = 0,44; Rf produktu = 0,15 1H NMR (CDCla): δ 2,73(d, 2H, J = 1,5Hz), 3,73(s, 3H), 4, 35(s, 1H), 5,11-5,19(m, 1H), 7,31(d, 2H, J = 6,6Hz), 8,53(d, 2H, J = 6,0Hz)
Nadmiar enencjomeryczny (ee) = 87% izomeru S (oznaczono metodą HPLC).
Warunki HPLC:
Kolumna: Chiralpak AD, 0,46 x 25 cm; faza ruchoma = etanol:heksan 10:90, eluowanie izokratyczne; szybkość przepływu = 1,5 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 pl. Detekcja UV przy długości fali 254 nm; czas retencji: R-hydroksyester = 19,9 minuty; S-hydroksyester = 21,7 minuty
P r z y k ł a d 3: Synteza S-(-)-1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu (3)
Czteroszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 22 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, osłonę czujnika temperatury/termometr, wkraplacz (2 I), skraplacz i naczynie oziębiające (puste) przepłukano azotem, po czym kolejno wprowadzono do borowodorek sodu (419 g) i 1-butanol (9,0 I). Surowy hydroksyester (2) rozpuszczono w 1-butanolu (1,0 I, objętość całkowita roztworu = 3,2 I).
PL 212 929 B1
Jedną czwarta część IC (800 ml) roztworu hydroksyestru w ciągu 90 minut powoli dodawano do mieszanej zawiesiny borowodorku sodu. Temperatura zwiększyła się od 19°C do 32°C i wystąpiło umiarkowane wydzielanie gazu. Całość mieszano przez 45 minut i temperatura osiągnęła wartość 36°C. Drugą czwartą część roztworu hydroksyestru powoli dodawano w ciągu 45 minut z jednoczesnym podwyższaniem temperatury od 36 do 52°C. Całość mieszano przez 20 minut i temperatura osiągnęła wartość 57°C. Mieszaninę ochłodzono do 40°C, stosując łaźnię lodową, po czym ciągu 45 minut dodawano trzecią czwartą część roztworu hydroksyestru. Ponownie temperatura zwiększyła się od 38 do 51°C. Całość mieszano przez 20 minut, przy czym temperatura osiągnęła wartość 57°C. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 38°C, ostatnią czwartą część roztworu hydroksyestru dodawano w ciągu 25 minut, nie obserwując wyraźnej reakcji egzotermicznej. Całość mieszano przez 40 minut w temperaturze 45°C, następnie kolbę zaopatrzono w płaszcz grzejny i mieszany układ ogrzano do temperatury 80°C w ciągu 2,5 godziny. Całość mieszano w temperaturze 80-85°C przez 3 godziny. Mieszaninę w ciągu 12 godzin stopniowo ochłodzono do temperatury otoczenia. Ponownie zastosowano metodę TLC do monitorowania postępu reakcji. Reakcję zatrzymano, dodając wodny roztwór węglanu potasu (20 % wagowo, 5,2 I) i całość mieszano przez 10 minut. Warstwy oddzielono, warstwę butanolu przemyto wodnym roztworem węglanu potasu (20% wagowo, 2,6 I) i roztworem chlorku sodu (15% wagowo, 1,3 I). Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka obrotowa Buchi R152, wysoka próżnia, temperatura łaźni 60°C), uzyskując żółte ciało półstałe. Do kolby wyparki wprowadzono acetonitryl (3 I) i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Acetonitryl (9 I) ponownie wprowadzono do kolby wyparki i uzyskaną zawiesinę mieszano (obracając na wyparce obrotowej) w temperaturze 60°C (temperatura łaźni 65°C, ciśnienie atmosferyczne) przez 15 minut. Gorącą zawiesinę przesączono przez warstwę SiO2 (Celite 521) (250 g w postaci zawiesiny w 1 l acetonitrylu umieszczono na lejku Buchner'a o średnicy 24 cm). Przesącz częściowo zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem (zebrano 4 I destylatu) i uzyskaną zawiesinę ogrzewano pod ciśnieniem atmosferycznym na wyparce obrotowej w celu rozpuszczenia wszystkich części stałych (temperatura łaźni = 65°C). Źródło ogrzewania usunięto i uzyskany roztwór mieszano na wyparce obrotowej przez 16 godzin, stopniowo oziębiając do temperatury otoczenia. Uzyskaną mieszaninę przesączono, zebrane ciało stałe przemyto acetonitrylem (2 x 200 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 55°C, 4 godziny), uzyskując (3,436 g, 39%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.
Temperatura topnienia = 98-100°C
Nadmiar enencjomeryczny (ee) = 98% izomeru S (oznaczono metodą HPLC).
Warunki HPLC: kolumna: Chiralpak AD, 0,46 x 25 cm; faza ruchoma = etanol:heksan 10:90, eluowanie Izokratyczne; szybkość przepływu = 1,5 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μΐ. Detekcja UV przy długości fali 254 nm; czas retencji: diol R = 12,7 minuty; diol S = 14 minut
P r z y k ł a d 4. Synteza ( 4S)-(-)-trans-4-(4-pirydylo)-2-(4-nitrofenoksy)-2-okso-1,3,2-dioksafosforinanu (4)
Do okrągłodennej kolby o pojemności 1 I, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i wlot na azot, wprowadzono diol 3 (100 g, 0,65 mola) i pirydynę (500 ml). Całość energicznie mieszano w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia diolu 3. Rozpuszczalność związku 3 była zmniejszona w wyniku obecności TEA. Oddzielną trójszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 3 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo oraz 1 I wkraplacz i wlot na azot, napełniono 4-nitrofenylodichlorofosforanem (166,4 g, 0,65 mola), umieszczono w łaźni lodowej, po czym przez wkraplacz wprowadzono pirydynę (500 ml). Całość mieszano w temperaturze łaźni lodowej przez 15 minut.
Po całkowitym rozpuszczeniu związku 3 (około 0,5 godziny), dodano TEA (190 ml, 1,36 mola), lekko mętny, żółto-brunatny roztwór przeniesiono do wkraplacza na kolbie o pojemności 3 I i dodawano w ciągu 2 godzin 40 minut do zimnego roztworu dichiorofosforanu. Ponieważ reakcja była egzo24
PL 212 929 B1 termiczna, szybkość dodawania utrzymywano na takim poziomie, aby temperatura reakcji nie przekroczyła 6°C. Po zakończeniu dodawania, łaźnię lodową zastąpiono łaźnią wodną o temperaturze pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny.
Jednocześnie, do oddzielnej trójszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 3 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo, wkraplacz o pojemności 250 ml i wlot na azot wprowadzono wodorek sodu (15 g, 0,38 mola) i THF (100 ml), po czym wkraplacz wypełniono roztworem 4-nitrofenolu (67,5 g, 0,49 mola) w THF (100 ml). Następnie kolbę umieszczono w łaźni lodowej i powoli do zimnej zawiesiny wodorku sodu dodano roztwór nitrofenolu. Podczas dodawania nitrofenolu utrzymywano temperaturę < 40°C. Zakończenie wydzielania się gazu wskazało ukończenie dodawania. Uzyskana jasnopomarańczową zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
Po zakończeniu reakcji diol (3)-dichlorofosforan, co oznaczono metodą HPLC, ciemną zawiesinę poddano filtracji próżniowej. Aparaturę szklaną i osad na filtrze (TEA-HCl) przepłukano THF (100 ml), połączono przesącze i płuczki, po czym całość wylano do pomarańczowj zawiesiny 4-nitrofenolanu sodu. Następnie uzyskaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 40°C przez 4 godziny i równowagę cis/trans monitorowano metodą HPLC. Płaszcz grzejny usunięto i całość mieszano w temperaturze pokojowej. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez warstwę SiO2 (Celite 521, 1,3 cm (0,5 cala)), aparaturę szklaną i Celite przepłukano 200 ml dichlorometanu. Połączone przesącze i płuczki zatężono na wyparce obrotowej w temperaturze 30 - 35°C pod zmniejszonym ciśnieniem (pompa olejowa). Uzyskaną gęstą, czarna, pienistą smołę rozpuszczono w 1,0 M roztworze wodnym HCl (1,5 I) i octanie etylu (800 ml), następnie przeniesiono do rozdzielacza o pojemności 4 I i rozdzielono fazy. Warstwę octanu etylu przemyto dodatkową ilością 300 ml 1,0 M roztworu wodnego HCl. Do połączonych warstw wodnych dodano dichlorometan (750 ml) i energicznie mieszając roztwór ostrożnie zobojętniono, dodając stały wodorowęglan sodu do pH 10 o wartości pomiędzy 7 i 8. Roztwór ponownie przeniesiono do rozdzielacza o pojemności 4 l i warstwy oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (750 ml) i połączone warstwy organiczne osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono do suchej masy. Osuszoną pozostałość mieszano w postaci zawiesiny w izopropanolu (200 ml), po czym przesączono, uzyskując 190 g fosforanu 4.
Surowy produkt 4 rozpuszczono w dichlorometanie (600 ml), mieszano przez 10 minut w obecności 10 g węgla aktywnego (Darco) i przesączono poprzez SiO2 (Celite 521, 1,3 cm (0,5 cala)). Kolbę i Celite przepłukano dichlorometanem (150 ml), połączone przesącze i płuczki ponownie zatężono do suchej masy. Uzyskane ciało stałe sproszkowano i mieszano w temperaturze 50°C w postaci zawiesiny w izopropanolu (250 ml). Po 1 godzinie zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej, potem do temperatury łaźni lodowej i przesączono. Ciało stałe suszono przez 16 godzin w piecu próżniowym w temperaturze 55°C, uzyskując 154,6 g (70%) fosforanu 4 w postaci beżowego ciała stałego.
Temperatura topnienia = 140-142°C
Skręcalność właściwa= -80,350° (c = 1,0, MeOH)
Warunki HPLC: kolumna: Chiralpak AD, 0,46 x 25 cm; faza ruchoma = 2-propanol:heksan 50:50, eluowanie izokratyczne; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μ|.
Detekcja UV przy długości fali 254 nm; czas retencji = 6,6 minuty, 99+% trans
Nadmiar enencjomeryczny (ee) = 99+% 1H NMR(DMSO-d6): δ 2,23-2,29(m, 2H), 4,56-4,71(m, 2H), 5,88-5,95(m, 1H), 7,44(d, 2H, J = 5,8Hz), 7,59(d, 2H, J = 9,2Hz), 8,34(d, 2H, J = 9,4Hz), 8,63(d, 2H J = 5,8Hz)
P r z y k ł a d 5. Synteza 5'-O-benzoilocytarabiny (5)
Czteroszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 12 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo i wlot na azot napełniono cytarabiną (500 g, 2,06 mola) i DMPU (1 l), z wytworzeniem gęstego ale
PL 212 929 B1 mieszalnego roztworu. Następnie w jednej porcji dodano roztwór HCl w dioksanie (617 ml, 2,47 mola), ze wzrostem temperatury do 52°C. Całość mieszano przez 2 godziny i ochłodzono do temperatury 27°C. Następnie dodano chlorek benzoilu (578 g, 4,11 mola) i całość mieszano w temperaturze otoczenia przez 22 godziny ze wzrostem temperatury do 34°C podczas pierwszych 30 minut. Po 2,5 godziny temperaturę obniżono do 25°C. Do mieszaniny dodano wodę (2,5 I) i całość mieszano przez 30 minut ze wzrostem temperatury do 37°C. Warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (2 x 1 I). Połączone warstwy organiczne ekstrahowano 10% (objętościowo) wodnym roztworem HCl (2 x 500 ml). Połączone warstwy wodne wprowadzono do kolby o pojemności 12 I, rozcieńczono wodą (1,5 I) i ochłodzono w łaźni lodowej. Wartość pH uregulowano do 10, dodając 30% (wagowo) wodny roztwór NaOH (850 ml). Podczas 30 minut zobojętnienia, temperatura mieszaniny wzrosła z 14°C do 21°C. Osad zaczął wytrącać się przy pH 3. Mieszaninę pozostawiono w łaźni lodowej i uzyskaną gęsta zawiesinę mieszano przez 8 godzin. Ciało stałe zebrano na lejku Buchner'a o średnicy 24 cm. Osad na filtrze przemyto wodą (2 I) i częściowo osuszono na lejku przez noc. Uzyskane ciało stałe suszono w piecu próżniowym w temperaturze 70°C w ciągu 18 godzin, uzyskując 659 g (wydajność 92%) 5'-O-benzoilocytarabiny (5). Zawartość wody zmierzona metodą Karla Fischer'a była zbyt duża, więc produkt poddano krystalizacji. Kolbę o pojemności 12 I napełniono związkiem (5), metanolem (5 I) oraz etanolem (3 I) i po wymieszaniu mieszaninę zagęszczono. Mieszaninę ogrzano do temperatury wrzenia, uzyskując klarowny żółty roztwór. Mieszaninę poddano destylacji pod ciśnieniem atmosferycznym do zebrania 2 I destylatu. Następnie dodano etanol (2 I) i destylację kontynuowano do zebrania jeszcze 1 I destylatu. Pod koniec procesu destylacji temperatura wynosiła 79°C. Ogrzewanie przerwano, mieszaninę ochłodzono do temperatury 21°C i mieszano przez 19 godzin. Ciało stałe odsączono, przemyto etanolem (1 I) i suszono w piecu próżniowym w temperaturze 70°C w ciągu 36 godzin, uzyskując 508 g (71%) związku 5 w postaci białego krystalicznego ciała stałego.
Warunki HPLC: kolumna: Zorbax Eclipse XDB-C8; rozpuszczalnik A = 5% roztwór acetonitrylu w 20 mM buforowym roztworze fosforanu sodu; rozpuszczaInik B = 80% roztwór acetonitrylu w wodzie; gradient stężeń; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 pi. Detekcja UV przy długości fali 270 nm; czas retencji =4,3 minuty
P r z y k ł a d 6. Synteza 5'-O-benzoilo-2',3'-di-O-TBS-cytarabiny(6):
Do czteroszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 12 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo, skraplacz i wlot na azot, wprowadzono pirydynę (703 ml, 8,64 mola), DMF (1 I) i związek (5). Całość mieszano przez 5 minut. Dodanie związku (5) do rozpuszczalnika ułatwia rozpuszczenie. Następnie dodano chlorek t-butylodimetylosililu (TBSCl) oraz DMF (500 ml). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 93°C ± 1°C przez 44 godziny, sporadycznie monitorując przebieg reakcji metodą HPLC. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 51°C i dodano metanol (250 ml) w celu neutralizacji nieprzereagowanego TBSCl. Całość mieszano przez 4,5 godziny, po czym dodano wodę (2 I). Po wymieszaniu przez 40 dodatkowe minut, mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (2 I). Górną warstwę organiczną przemyto 10% wodnym roztworem HCl (2 x 2 l), 7% wodnym roztworem NaHCO3 (2 x 2 l) oraz 10% wodnym roztworem NaCl (2 I). Warstwę organiczną osuszono nad MgSO4 i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto na wyparce obrotowej, uzyskując surowy produkt (6) w postaci gęstego czarnego oleju o masie 1,3 kg. Produkt użyto w następnych reakcjach bez dalszego oczyszczania.
Warunki HPLC: kolumna: Zorbax Eclipse XDB-C8; rozpuszczalnik A = 5% roztwór acetonitrylu w 20 mM buforowym roztworze fosforanu sodu; rozpuszczalnik B = 80% roztwór acetonitrylu w wodzie; gradient stężeń; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 pl. Detekcja UV przy długości fali 270 nm; czas retencji disililu = 10,1 minuty; czas retencji monosililu = 6,9 minuty
PL 212 929 B1
P r z y k ł a d 7. Synteza chlorowodorku 2',3'-di-O-TBS-cytarabiny (7)
Czteroszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 12 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, skraplacz z bełkotką azotu na górze, termoogniwo i płaszcz grzejny, wypełniono roztworem surowego związku (6) w etanolu (2,3 I) i hydrazyną (185 g, 5,76 mola). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C przez 15 godzin, monitorując postęp reakcji metodą HPLC. Płaszcz grzejny usunięto i mieszaninę ochłodzono do temperatury 35°C w czasie 2 godzin. Roztwór o ciemnym zabarwieniu wylano do 15% wodnego roztworu NH4Cl (4 I) i ekstrahowano octanem etylu (4 I). Fazę organiczną przemyto 15% wodnym roztworem NH4Cl (2 I), po czym odparowano na wyparce obrotowej, uzyskując gęsty olej. Pozostałość rozpuszczono w acetonitrylu (3 I) i przeniesiono do dużego rozdzielacza. Następnie dodano 10% roztwór HCl w wodzie (3 I) i całość mieszano przez 5 minut. Uzyskany mętną mieszaninę ekstrahowano heksanami (2 x 3 l). Po ekstrakcji heksanami obie fazy stały się klarowne. Niższą warstwę woda/acetonitryl, zawierającą związek (7) zatężano na wyparce obrotowej, do zebrania 3 I destylatu, po czym dodano wodę (3 I) i destylację kontynuowano do usunięcia dodatkowo około 500 ml rozpuszczalnika. Osad zaczął sie wytrącać po usunięciu 2 l rozpuszczalnika, z uzyskaniem gęstej zawiesiny, więc destylację zatrzymano. Ciało stałe odsączono na lejku Buchner'a o średnicy 24 cm i osad na filtrze przemyto 5% (objętościowo) roztworem acetonitrylu w wodzie (2 x 1 I). Wilgotne ciało stałe (2,6 kg) przeniesiono do kolby o pojemności 12 I i mieszano z 5% układem acetonitryl/woda (6 I) w ciągu 45 minut. Ciało stałe odsączono (powoli), przemyto wodą (1 I) i suszono w piecu próżniowym w temperaturze 65°C przez 46 godzin, uzyskując 644 g (wydajność 88%). 1
Czystość oznaczono metodą HPLC i 1H NMR (DMSO-d6): Surową substancję wprowadzono do kolby o pojemności 12 I, po czym dodano octan etylu (4 I), mieszaninę ogrzano do temperatury wrzenia w ciągu 1 godziny i utrzymywano w temperaturze wrzenia przez 1 godzinę. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C w ciągu 3 godzin. Uzyskane ciało stałe (7) odsączono, przemyto octanem etylu i suszono w piecu próżniowym w temperaturze 65°C przez 24 godziny, uzyskując białawe ciało stałe (335 g, 46%).
Ług macierzysty zobojętniono nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 i rozdzielono fazy. Fazę organiczną przemyto solanką, osuszono nad MgSO4 i odparowano na wyparce obrotowej, uzyskując 283 g gęstego, brunatnego oleju. Produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (1,1 kg), eluujac 2% układem MeOH/dichlorometan, następnie 15% układem MeOH/dichlorometan. Frakcje zawierając czysty produkt połączono i rozpuszczalnik odparowano. Uzyskaną pozostałość, 2',3'-di-O-TBScytarabinę w postaci wolnej zasady, suszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, uzyskując bursztynowe bezpostaciowe ciało stałe (171 g).
Warunki HPLC: kolumna: Zorbax Eclipse XDB-C8; rozpuszczalnik A = 5% roztwór acetonitrylu w 20 mM buforowym roztworze fosforanu sodu; rozpuszczalnik B = 80% roztwór acetonitrylu w wodzie; gradient stężeń; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 pl. Detekcja UV przy długości fali 270 nm; czas retencji =7,4 minuty
P r z y k ł a d 8. Synteza 2',3' -di-O-TBS-cytarabino-N,N-dimetyloformamidyny (8):
PL 212 929 B1
Do czteroszyjnej kolby o pojemności 12 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne wprowadzono związek (7) (333 g, 0,66 mola) i toluen (2 I). Następnie dodano roztwór NaHCO3 (110 g, 1,31 mola) w wodzie (2 I) i całość energicznie mieszano przez 15 minut. Ponieważ w mieszaninie wciąż obecna była duża ilość części stałych dodano octan etylu (2 I). Przy pH 8, w ciągu 5 minut, cały produkt rozpuszczono. Rozdzielono fazy, fazę organiczną przemyto 10% wodnym roztworem NaCl (1,5 I), osuszono nad MgSO4 i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto na wyparce obrotowej, uzyskując produkt w postaci wolnej zasady, jako białą piankę o masie 398 g (130% wydajności teoretycznej).
2',3'-di-O-TBS-cytarabinę w postaci wolnej zasady (uzyskaną po oczyszczaniu metoda chromatografii w przykładzie 7) dodano do kolby wyparki obrotowej, zawierającej powyżej otrzymaną wolną zasadę. Następnie dodano toluen (2 I) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C przez 1 godzinę, uzyskując klarowny, brunatny roztwór. Roztwór przeniesiono do czteroszyjnej kolby o pojemności 12 I. Do przepłukania kolby wyparki obrotowej zastosowano toluen (400 ml). Następnie dodano acetal dimetylowy DMF (158 g, 1,32 mola) i całość mieszano w temperaturze 20°C przez 21 godzin, przy czym przebieg reakcji monitorowano metodą TLC. Rozpuszczalnik usunięto na wyparce obrotowej, uzyskując gęsty olej, do którego dodano heksan (1 I) i następnie usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt suszono na wyparce obrotowej przez 2 godziny w temperaturze 60°C, lecz wciąż pozostawał w postaci lepkiego oleju. Do pozostałości dodano heksan (2 I) oraz dichlorometan (2 I) i całość mieszano w temperaturze 50°C, uzyskując klarowny, brunatny roztwór. Mieszaninę poddano destylacji pod ciśnieniem atmosferycznym do zebrania 2 I destylatu. Mieszaninę delikatnie ochłodzono i pozostały rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość suszono na wyparce obrotowej w ciągu 15 godzin, uzyskując produkt w postaci twardej pianki.
Produkt zeskrobano ze ścianek kolby i uzyskane swobodnie płynące ciało stałe suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 25°C, przez 24 godziny, uzyskując 527,6 g (98%) związku 8 w postaci brązowego ciała stałego.
Warunki TLC: postęp reakcji monitorowano, stosując płytki z żelu krzemionkowego 60 firmy
Merck, 2,5 x 7,5 cm, 250 μm; lampa UV: 10% MeOH w CH2CI2; Rf substancji wyjściowej = 0,4; Rf produktu = 0,7.
1H NMR (DMSO-d6): δ -0,27(s, 3H), -0,02(s, 3H). 0,11(s, 6H), 0,74 (s, 9H), 0,88(s, 9H), 3,02(s, 3H), 3,16(s,3H), 3,51-3,69(m, 2H), 3,80-3,85(m, 1H), 4,05-4,08(m, 2H), 4,95-5,03(m, 1H), 5,93-6,01(m, 2H), 7,67(d, 1H, J = 7,2Hz), 8,62 (s, 1H).
P r z y k ł a d 9. Synteza 2 (1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-li-D-arabinofuranozylu] (9)
Trójszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 12 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne, osłonę czujnika temperatury/termometr, wkraplacz (1 I) i łaźnię chłodzącą, przepłukano azotem, napełniono zabezpieczonym nukleozydem 8 (250 g, 0,47 mola) i THF (2,5 I). Mieszany roztwór ochłodzono do 4°C (łaźnia lodowa), po czym powoli dodawano w ciągu 1 godziny roztwór chlorku t-butylomagnezu (617 ml, 0,62 mola), utrzymując temperaturę < 8°C. Po zakończeniu dodawania, roztwór mieszano w temperaturze łaźni lodowej przez 1,25 godziny. Następnie dodano w jednej porcji czynnik fosforanowy (4) (262 g, 0,78 mola) i usunięto łaźnię chłodzącą. Całość mieszano w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Reakcję zatrzymano, dodając roztwór chlorku amonu (20% wagowo, 2,5 I) i rozcieńczono octanem etylu (2,5 I). Całość mieszano przez 5 minut w celu rozpuszczenia wszystkie reszty i oddzielono warstwy. Fazę wodną ponownie ekstrahowano octanem etylu (1,1 I) i połączone fazy organiczne przemyto roztworem chlorku sodu (15% wagowo, 1,6 I), osuszono nad MgSO4 (260 g), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 526 g ciemnopomarańczowego osadu, który poddano analizie metodą HPLC (patrz warunki HPLC A poniżej).
PL 212 929 B1
Do trójszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 12 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, osłonę czujnika temperatury/termometr, skraplacz z naczyniem wychwytującym/ bełkotką i płaszcz grzejny, wprowadzono surowy osad w postaci roztworu w metanolu (2,5 I) i roztwór HCl-dioksan (790 ml, 3,16 mola). Mieszany pomarańczowy roztwór ogrzewano do temperatury 50°C i mieszano w temperaturze 50-55°C przez 16 godzin, monitorując postęp reakcji metodą HPLC (patrz warunki HPLC B poniżej). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując gęstą pomarańczowąsubstancję smolistą. Kolbę do odparowywania (10 I) wyposażono w mieszadło zewnętrzne z zestawem i smołę podzielono pomiędzy wodę (800 ml) i octan etylu (800 ml). Następnie dodano w 2-5 g porcji wodorowęglan sodu w postaci stałej, całość mieszano do zakończenia wydzielania gazu i uzyskania pH fazy wodnej 7 (papierek wskaźnikowy pH o szerokim zakresie). Warstwy oddzielono i fazę wodną ekstrahowano ponownie octanem etylu (800 ml). Fazę wodną przesączono i wodę odparowano poprzez destylację azeotropową z etanolem pod zmniejszonym ciśnieniem (kolejno dodawano etanol w ilości 4 x 400 ml), z uzyskaniem 445 g mieszaniny brunatny olej/ciało stałe, z jednoczesnym stopniowym zastępowaniem wody przez etanol. Następnie dodano etanol (700 ml) i uzyskana zawiesinę mieszano (mieszadło zewnętrzne) w temperaturze otoczenia przez 2 godziny.
9.1. Uzyskaną mieszaninę przesączono, zebrane ciało stałe przemyto etanolem (2 x 50 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 55°C, 2 godziny), z uzyskaniem 199 g beżowego ciała stałego, zawierającego nieoznaczoną ilość NaCl. Substancję stałą przeniesiono do okrągłodennej kolby o pojemności 1 I, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne. Następnie dodano wodę (200 ml) i całość mieszano w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Mieszaninę przesączono, zebrane ciało stałe (9) przemyto wodą (2 x 25 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 50°C, 16 godzin). Wydajność = 109 g beżowego proszku (9), zawierającego około 10% NaCl.
9.2. Powyższy etanolowy przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując gęstą brunatną substancję smolistą. Smołę ogrzewając rozpuszczono w metanolu (200 ml) i uzyskany gęsty roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 16 godzin, z wytworzeniem osadu. Mieszanine przesączono i zebrane ciało stałe (9) przemyto metanolem (2 x 25 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 55°C, 16 godzin). Wydajność = 6,22 g białawego ciała stałego.
Produkt (9) według tego przykładu wydzielono dwoma oddzielnymi sposobami (9.1 i 9.2).
9.3. Oczyszczanie 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyIo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-e-D-arabinofuranozylu] (9)
Do trójszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 2 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, wprowadzono połączone porcje surowego produktu (9), otrzymane dwoma oddzielnymi sposobami oraz wodę (650 ml). Uzyskaną zawiesinę mieszano i porcjami dodawano stężony kwas chlorowodorowy do rozpuszczenia ciała stałego (wymagane 34 ml, pH = 3 oznaczone za pomocą papierka wskaźnikowego pH o szerokim zakresie. Na początku szybko dodano 20 ml HCl, a następnie resztę dodano w porcjach 5 x 2 ml i 4 x 1 ml. Pomarańczowy roztwór przesączono i ponownie wprowadzono do kolby. Następnie dodano wodorowęglan sodu w postaci stałej (36 g) w 2-3 g porcjach do uzyskania wartości pH fazy wodnej równej 6-7 (papierek wskaźnikowy pH o szerokim zakresie). Całość mieszano do zakończenia wydzielania gazu, po czym mieszano w temperaturze otoczenia przez 2 godziny i przesączono. Zebrane ciało stałe przemyto wodą (2 x 25 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 55°C, 16 godzin), uzyskując 133,0 g 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4--pirydynyIo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-e-D-arabinofuranozylu] w postaci żółtobeżowego ziarnistego ciała stałego (39,7%).
Analiza elementarna: wartości obliczone dla C27H21N4O8P: C, 46,09; H, 4,85; N, 12,65. Znalezione: C, 45,88; H, 4,72; N, 12,58.
PL 212 929 B1
Warunki HPLC: Kolumny: dwie następujące kolumny w połączeniu szeregowym; Agilent, Zorbax Eclipse XDB-C8,4,6 x 250 mm, 5 μm; rozpuszczalnik A = 20 mM buforowy roztwór fosforanu sodu w 11% układzie acetonitryl/woda; rozpuszczalnik B = 50% roztwór acetonitrylu w wodzie dejonizowanej; układ faz odwróconych; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μm. Detekcja UV przy długości fali 210 nm, temperatura kolumny 30°C; czas retencji = 13,4 minuty (izomer S); czas retencji = 14,1 minuty (izomer R) 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,15-2,27(m, 2H), 3,90-3,97(m, 3H), 4,24-4,58 (m, 4H), 5,58(d, 1H, J = 7,4Hz), 5,62-5,65(m, 2H), 5,71-5,79(m, 1H), 6,10(d, 1H, J = 3,6Hz), 7,08(s, 1H), 7,13(s, 1H), 7,42(d, 2H, J = 5,8Hz), 7,48 (d, 1H, J = 7,4Hz), 8,59(d, 2H, J = 6,0 Hz)
Warunki HPLC A:
Kolumna: Chiralpak AD, 0, 46 x 25 cm; faza ruchoma = etanol:heksan 10:90, eluowanie izokratyczne; szybkość przepływu = 1,5 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 pi. Detekcja UV przy długości fali 254 nm. Czas retencji 18,9 minuty.
Warunki HPLC B
Kolumna: Bondclone 10, C18, 300 x 3,9 mm; rozpuszczalnik A 10% roztwór acetonitrylu w 20 mM roztworze buforowym fosforanu potasu (pH 6,2), rozpuszczalnik B acetonitryl; gradient stężeń; szybkość przepływu =1,4 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μΐ. Detekcja UV przy długości fali 260 nm. Czas retencji =5,8 minuty
P r z y k ł a d 10. Synteza chiralnego katalizatora rutenowego (10)
Trójszyjną okrągłodenną kolbę o pojemności 3 I, zaopatrzoną w mieszadło zewnętrzne i osłonę czujnika temperatury/termometr przepłukano azotem i napełniono kompleksem rutenu (32,0 g), (1S,2S)-(+)-N-p-tosylo-1,2-difenyloetylenodiaminą (38,24 g) i izopropanolem (1,0 I). Następnie do mieszanej zawiesiny dodano trietyloaminę (30,0 ml) i zawartość ogrzewano do temperatury 80°C w ciągu 1 godziny. Uzyskany pomarańczowy roztwór mieszano w temperaturze 80°C przez 1 godzinę, następnie usunięto płaszcz grzejny i układ, mieszając ochłodzono do temperatury otoczenia w ciągu 45 minut. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując ciemnopomarańczowe ciało stałe. Następnie dodano metanol (320 ml) i mieszaną zawiesinę ogrzewano do temperatury 50°C. Całość mieszano w temperaturze 50°C przez 15 minut, po czym stopniowo chłodzono do temperatury otoczenia w czasie 30 minut. Całość mieszano w temperaturze łaźni lodowej jeszcze przez 30 minut, nastepnie przesączono. Zebrane ciało stałe przemyto metanolem (2 x 15 ml), wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 50°C, 1 godzina), uzyskując 53,1 g katalizatora w postaci pomarańczowego ciała stałego (wydajność 80%).
P r z y k ł a d 11. Synteza (4S)-(-)-(S)-(-)-(4-pirydylo)-2-(4-nitrofenoksy)-2-okso-1,3,2-dioksafosforinanu (4), z zastosowaniem chlorowodorku diolu
PL 212 929 B1
Do trójszyjnej okrągłodennej kolby o pojemności 1 I, zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, wkraplacz, termometr i wlot na N2, wprowadzono S-(-)-1-(piryd-4-ylo)propano-1,3-diol (25 g, 163,4 mmola) oraz octan etylu (250 ml) i uzyskaną zawiesinę potraktowano powoli 4 N roztworem HCl w dioksanie (43 ml, 176 mmoli) w ciągu 15 minut. Po wymieszaniu w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, tak szybko jak to możliwe dodano 4-nitrofenylodichlorofosforan (41,81 g, 163,4 mmola) w postaci ciała stałego w przepływającym N2. Wewnętrzną temperaturę mieszaniny reakcyjnej uregulowano do -10°C, stosując łaźnię chłodzącą z układem suchy lód-aceton. Utrzymując temperaturę reakcji < -5°C dodano roztwór trietyloaminy (57,76 g, 79 ml, 572 mmole) w octanie etylu (100 ml). Trzydzieści minut później, po zakończeniu dodawania roztworu trietyloaminy, usunięto łaźnię chłodzącą i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną przesączono w celu usunięcia chlorowodorku trietyloaminy, który przemyto octanem etylu (3 x 30 ml) aż przesącz wykazywał tylko słabą absorpcję. Przesącz odparowano do objętości 150-175 ml pod zmniejszonym ciśnieniem. Do zatężonego roztworu dodano 4-nitrofenol (7,5 g, 54,3 mmola) oraz trietyloaminę (9 ml) i uzyskaną pomarańczową mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Ciało stałe utworzone w mieszaninie reakcyjnej odsączono, przemyto octanem etylu (2 x 25 ml) oraz eterem metylo-t-butylowym (25 ml) i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 55°C, uzyskując 31,96 g (58,4%) pożadanego produktu. Dane analityczne są takie same jak według przykładu 4.
P r z y k ł a d 12: Synteza (4S)-(-)-trans-(4-pirydylo)-2-chloro-2-okso-1,3,2-dioksafosforinanu (11)
Do osuszonej w piecu okrągłodennej kolby o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, wprowadzono 3,49 g S-(-)-1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu, po czym dodano 60 ml acetonitrylu. Układ heterogeniczny mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i następnie powoli potraktowano 5,7 ml 4 M roztworu HCl w dioksanie w czasie 5 minut. Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono jednorazowo strzykawką 2,16 ml POCI3. W oddzielnej kolbie o pojemności 25 ml rozpuszczono 2,68 g DABCO w 15 ml acetonitrylu w atmosferze azotu i przenoszono za pomocą strzykawki lub wkraplacza do mieszaniny reakcyjnej w czasie 5 minut. Pod koniec dodawania roztworu DABCO zaobserwowano nieznaczne podwyższenie temperatury mieszaniny reakcyjnej (+10°C). Całość mieszano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia, przy czym mieszanina pozostała heterogeniczna. Małą próbkę mieszaniny reakcyjnej pobrano, szybko odparowano w strumieniu suchego N2 i pozostałość rozpuszczono w DMSO-d6 w celu 1 pomiaru widma 1H-NMR.
1H NMR (DMSO d6, Varian Gemini 200 MHz): C'-proton: izomer trans 5,85-5,75(d, 1H).
P r z y k ł a d 13. Synteza 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-3-D-arabinofuranozylu] (9)
PL 212 929 B1
Metoda A:
Do osuszonej w piecu okragłodennej kolby o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, wprowadzono 3,35 g chlorowodorku cytarabiny i 6,0 ml DMPU. Do tej kolby bezpośrednio przesączono mieszaninę reakcyjną z przykładu 12 i chlorowodorek DABCO szybko przemyto acetonitrylem (1 x 15 ml). Części lotne usunięto na wyparce obrotowej, z zastosowaniem pompy wodnej z ejektorem ssącym (temperatura łaźni < 35°C). Pozostały olej krótko utrzymywano w wysokiej próżni i mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 48 godzin. Mieszaninę reakcyjną poddano działaniu 100 ml MeOH i mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. pH mieszaniny reakcyjnej uregulowano do 7,0, stosując 25% roztwór (wagowo) NaOMe w metanolu (wymagane około 13 ml). Na tym etapie mieszanina reakcyjna była mętna. Analizy HPLC prowadzono w celu zapewnienia przebiegu reakcji do końca. Mieszaninę reakcyjną odparowano do suchej masy i pozostałość mieszano z 50 ml dichlorometanu w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Osad odsączono, przemyto chlorkiem metylenu (1 x 20 ml) i przeniesiono do kolby, mieszano ponownie z 50 ml dichlorometanu przez 15 minut i przesączono. Ciało stałe mieszano z 200 ml etanolu przez 1-2 godziny, przesączono i przemyto etanolem (2 x 10 ml). Przesącz odparowano do suchej masy, uzyskując 4,90 g białego ciała stałego. Otrzymane ciało stałe rozpuszczono w 10 ml H2O i mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, uzyskując ciało stałe, które odsączono, przemyto wodą (2 x 3 ml) i osuszono w piecu próżniowym, uzyskując związek 9, 1,38 g, (26%).
Metoda B:
Etap A: Synteza chlorowodorku cytarabiny
Do trójszyjnej kolby o pojemności 5 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne i termoogniwo, wprowadzono cytarabinę (500 g, 2,06 mola) i metanol (2,0 I). Zawiesinę ochłodzono do temperatury 2°C, następnie przepuszczono przez nią gazowy HCI, uzyskując bardzo gęstą mieszaninę, ogrzaną do temperatury 25°C. W celu ułatwienia mieszania, zawiesinę rozcieńczono metanolem (0,5 I). Ogółem dodano 108 g (2,96 mola) gazowego HCl. Całość mieszano przez 4 godziny w temperaturze 20°C następnie ciało stałe odsączono. Ciało stałe przemyto MTBE (3 x 250 ml) i suszono w piecu próżniowym w temperaturze 70°C, uzyskując 555 g (wydajność 96%) chlorowodorku cytarabiny w postaci kłaczkowatego, białego ciała stałego.
Etap B: Synteza 5'-O-cis-[4-(S)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]cytozyno-3-D-arabinofuranozydu
Osłonięte płaszczem, cylindryczne naczynie reakcyjne o pojemności 1 I, zaopatrzono w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo, i dwa wkraplacze (60 ml i 125 ml). Naczynie reakcyjne przepłukano azotem i napełniono DMPU (188 ml, 195,8 g). Mieszaną ciecz ochłodzono do temperatury -16°C (chłodzący cyrkulator Julabo F32).
Roztwór diolu: okrągłodenną kolbę o pojemności 250 ml zaopatrzoną w mieszadło magnetyczne i termometr, napełniono S-(-)-1-(piryd-4-ylo)-1,3-propanodiolem (50,0 g), DMPU (62,5 ml, 64,5 g) i pirydyną (25,8 g), po czym umieszczono w atmosferze azotu. Mieszaną zawartość ogrzewano do temperatury 40°C (łaźnia wodna) i mieszano w temperaturze 40-42°C do rozpuszczenia wszystkich części stałych (10 minut). Uzyskany jasnopomarańczowy roztwór ochłodzono do temperatury 22°C i wprowadzono do wkraplacza o pojemności 125 ml (objętość = 127 ml).
Roztwór POCI3: Kolbę Erlenmeyera o pojemności 125 ml napełniono acetonitrylem (22,9 g) i tlenochlorkiem fosforu (50,0 g). Po wymieszaniu, bezbarwny roztwór przeniesiono do wkraplacza o pojemności 60 ml (objętość = 60 ml).
Dwa roztwory jednocześnie dodawano do naczynia reakcyjnego o pojemności 1 l w ciągu 2,6 godziny, utrzymując temperaturę poniżej -11°C. Po zakończeniu dodawania, lepki jasnopomarańczowy roztwór mieszano, utrzymując temperaturę pomiędzy -11 i -17°C przez 1 godzinę. Pobrano próbkę mieszaniny reakcyjnej i sprawdzono postęp reakcji metodą HPLC (próbki poddano reakcji hydrolizy do cyklicznego kwasu fosforowego i analizowano metodą HPLC). Następnie dodano chlorowodorek cytarabiny (60,9 g), uzyskaną mieszaninę ogrzano do temperatury 5°C w ciągu 1 godziny i mieszano w temperaturze 4-6°C przez 87 godzin. Uzyskaną lepką mieszaninę reakcyjną codziennie próbkowano w celu analizy HPLC. Mieszając roztwór reakcyjny reakcję powoli zatrzymano, dodając roztwór NaOH (13% masa/objętość), z szybkością umożliwiającą utrzymanie temperatury < 20°C, do uzyskania pH roztworu o wartości 5,0 (wymagane 290 ml roztworu NaOH). Następnie dodano dichlorometan (450 ml) i dwufazowy układ mieszano w temperaturze 15-20°C w ciągu 30 minut, po czym zakończono mieszanie i mieszaninę pozostawiono do odstania przez 30 minut. Niższą warstwę organiczną oddzielono. Górną warstwę wodną dwukrotnie ekstrahowano większą ilością dichlorometanu (450 ml, 30 minut mieszania, 30 minut odstania)
PL 212 929 B1 (przypis 5). Naczynie reakcyjne zaopatrzono w sondę pH i dodawano roztwór NaOH (13% masa/objętość) w ciągu 10 minut do uzyskania pH 7,0 (wymagane 68 ml roztworu NaOH). W celu utrzymania temperatury poniżej 20°C płaszcz wypełniono cieczą oziębiającą (5°C). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 20 godzin, po czym ochłodzono do temperatury 5°C w ciągu 5 godzin (przypis 6). Mieszaninę przesączono, zebrane ciało stałe przemyto wodą (2 x 100 ml) i wysuszono do stałej masy (-30 in. Hg, 60°C, 18 godzin). Wydajność = 46,6 g jasnożółtego, drobnoziarnistego ciała stałego (wydajność 48%). Warunki HPLC dla syntezy chlorofosforanu:
Kolumna: Zorbax Eclipse XDB-C8, 4,6 x 250 mm, wymiary cząstki 5 μm; rozpuszczalnik A = 20 mM buforowy roztwór fosforanu sodu w 11% układzie acetonitryl/woda; rozpuszczalnik B = 50% roztwór acetonitrylu w wodzie dejonizowanej (gradient 100% A do 100% B w ciągu 15 minut); szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μ!. Detekcja UV przy długości fali 250 nm, temperatura kolumny 30°C.
Czas retencji =4,3 minuty
Warunki HPLC dla 5'-O-cis-[4-(6)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]cytozyno^-D-arabinofuranozydu:
Kolumny: Inertsil ODS-3, 4,6 x 150 mm, wymiary cząstki 3 μm; rozpuszczalnik A = 20 mM roztwór buforowy fosforanu amonu w układzie 5% acetonitryl/woda; rozpuszczalnik B acetonitryl (gradient (czas w minutach/%B w A%) : 0/0, 30/10, 40/40, 40,1/0, 50/0); szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; objętość nastrzyku = 50 μΚ Detekcja UV przy długości fali 210 nm, temperatura kolumny 30°C + 5°C.
Czas retencji = 15,7 minuty
Etap C Oczyszczanie 5'-O-cis-[4-(S)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]cytozyno^-D-arabinofuranozydu
Procedura 1: Do trójszyjnej kolby o pojemności 1 I, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, termometr, wkraplacz i sondę pH wprowadzono surowy 5'-O-cis-[4-(5)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]cytozyno^-D-arabinofuranozyd (80 g, 0,18 mola) i wodę dejonizowaną (256 ml). pH mieszaniny wynosiło 5,16. Następnie w ciągu 10 minut dodano kroplami kwas siarkowy, 3,0 M (60,6 ml, 0,18 mola). W celu utrzymania temperatury pomiędzy 19-22°C 10°C zastosowano łaźnię chłodzącą. W wyniku reakcji otrzymano lekko mętny, żółty roztwór. Roztwór przesączono poprzez nylonowy filtr membranowy 0,45 μl (średnica 47 mm). Kolbę i przesącz przepłukano wodą (40 ml). Przesącz i popłuczyny ponownie wprowadzono do kolby o pojemności 1 l i uregulowano pH do 6,5, dodając 3 M NaOH (155 ml) i 3 M kwas siarkowy. Osad zaczął się wytrącać przy pH 5,1. Całość mieszano 2,5 godziny i odsączono ciało stałe. Kolbę i osad na filtrze przemyto wodą (2 x 80 ml) i przez noc suszono w piecu próżniowym (-30 in. Hg, 60°C, 18 godzin), z uzyskaniem 73,4 g 5'-O-cis-[4-(S)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]cytozyno^-D-arabinofuranozydu w postaci gruboziarnistego, jasnożółtego ciała stałego (wydajność 92%).
Procedura 2: Do trójszyjnej kolby o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne, termoogniwo, wkraplacz i sondę pH wprowadzono surowy 5'-O-cis-[4-(5)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-iIo]cytozyno^-D-arabinofuranozyd (16 g, 36,3 mmola) i wodę dejonizowaną (50 ml). Następnie dodawano kroplami wodny roztwór kwasu siarkowego, 3,0 M do uzyskania pH 2,5 (12 ml, 36,3 mmola) i utrzymywano temperaturę poniżej 22°C. Do mieszaniny w ciągu 20 minut dodawano metanol (160 ml), uzyskując biały osad. Zawiesinę mieszano w temperaturze 20°C przez 1,5 godziny, następnie odsączono ciało stałe. Ciało stałe przemyto metanolem (2 x 25 ml) i suszono w piecu próżniowym (-30 in. Hg, 60°C, 1,5 godziny), z uzyskaniem 18,89 g soli kwasu siarkowego.
Ciało stałe wprowadzono do trójszyjnej kolby o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w mieszadło zewnętrzne i sondę pH. Następnie dodano wodę (180 ml) i całość mieszano przez 10 minut w celu rozpuszczenia ciała stałego (pH = 2,7), po czym dodano monohydrat jednozasadowego fosforanu sodu (0,25 g, 1,81 mmola) i całość mieszano przez 5 minut. Roztwór przesączono przez Celite. Przesącz ponownie wprowadzono do kolby i dodawano 13% (masa/objętość) wodny roztwór NaOH do uzyskania pH 7,1. Uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze 20°C przez 3 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto wodą (2 x 15 ml) i suszono w piecu próżniowym (-30 in. Hg, 60°C, 16 godzin) do stałej masy, uzyskując 13,55 g (wydajność 85%) 5'-O-cis-[4-(S)-(piryd-4-ylo)-1,3,2-dioksafosforino-2-okso-2-ilo]-cytozyno^-D-arabinofuranozydu w postaci białawego, ziarnistego ciała stałego.
P r z y k ł a d 14: Synteza R-(+)-1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu
R-(+)-1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiol otrzymano sposobem przedstawionym w przykładzie 3, stosując enancjomer katalizatora 10 według przykładu 10
Temperatura topnienia = 98-100°C
PL 212 929 B1
Nadmiar enencjomeryczny (ee) = 98% izomeru R (oznaczono metodą HPLC).
Warunki HPLC: kolumna: Chiralpak AD, 0,46 x 25 cm; faza ruchoma = etanol/heksan 10:90, eluowanie izokratyczne; szybkość przepływu = 1,5 ml/minutę; objętość nastrzyku = 10 μΙ. Detekcja UV przy długości fali 254 nm; czas retencji: diol R = 12,7 minuty; diol S = 14 minut
P r z y k ł a d 15. Synteza (4R)-(+)-(4-pirydylo)-2-(4-nitrofenoksy)-2-okso-1,3,2-dioksafosforinanu (12)
Do mieszanego roztworu 4-nitrofenylodichlorofosforanu (9,2 g, 36 mmoli) w THF (100 ml) w temperaturze 0°C powoli w ciągu 30 minut dodawano pirydynę (7,9 ml, 98 mmoli). Całość mieszano przez 5 minut w temperaturze 0°C i powoli dodawano do roztworu R-(+)-1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu o 95,8% nadmiarze enencjomerycznym, 5 g, 32,7 mmola) i trietyloaminy (15,6 ml, 114 mmola) w THF (300 ml) w temperaturze 0°C w ciągu 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 2,5 godziny. Następnie dodano 4-nitrofenolan sodu (18,17g, 131 mmoli) i heterogeniczną pomarańczową mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 4,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C, reakcję zatrzymano nasyconym roztworem wodnym chlorku amonu (250 ml) i warstwy oddzielono. Części organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem chlorku amonu (200 ml) i połączone płuczyny wodne ponownie ekstrahowano dichlorometanem (100 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto 0,3 N wodnym roztworem wodorotlenku sodu (200 ml x 4) i osuszono nad siarczanem magnezu. Przesączony roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując olej, który wykrystalizował po odstaniu. Żółte ciało stałe krystalizowano z 100 ml 2-propanolu, uzyskując pożądany transfosforan (12) w postaci białego ciała stałego (nadmiar enencjomeryczny 95%, [a]D20 + 74,2(c 1,0, MeOH)).
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton/heksany 3/2; diol: czas retencji = 0,2, trans-fosforan: czas retencji = 0,6, cis-fosforan: czas retencji = 0,5.
Warunki HPLC izomeryzacji cis/izomer: kolumna = Zorbax Rx-C18 (4,6 x 250 mm); faza ruchoma = 35% acetonitryl/ 65% 20 mM bufor fosforanowy, pH 7,95; szybkość przepływu = 0,5 ml/minutę; detekcja UV, długość fali 250 nm; czasy retencji: izomer cis = 9,39 minuty, izomer trans = 10,11 minuty.
Warunki HPLC oznaczania nadmiaru enencjomerycznego: kolumna = Chiral Pak AD; faza ruchoma = 2-propanol-heksany 1:1; szybkość przepływu =1,0 ml/minutę; detekcja UV, długość fali 254 nm; czasy retencji w minutach: trans-fosforan = 7,02.
P r z y k ł a d 16. Synteza 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2S,4R)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2 ylo]-e-D-arabinofuranozylu] (13)
PL 212 929 B1
16.1. Etap fosforylacji
Do mieszanego roztworu związku 8 (2,4 g, 4,55 mmola) w THF (40 ml) w temperaturze pokojowej powoli dodano roztwór t-BuMgCl (1 M w THF, 6 ml, 6 mmoli). Po upływie 30 minut, dodano R-trans-fosforan 12 (1,84 g, 5,5 mmola) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C, reakcję zatrzymano nasyconym roztworem wodnym chlorku amonu i całość ekstrahowano octanem etylu (50 ml x 2). Połączone warstwy organiczne osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując acetonem z uzyskaniem pożądanego zabezpieczonego proleku w postaci białawego ciała stałego (2,19 g, 66%, temperatura topnienia: 142,0-145,0°C).
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton, trans-fosforan: czas retencji = 0,6, zabezpieczona ara-C: czas retencji = 0,2.
16.2. Etap odbezpieczania
Mieszany roztwór powyższego zabezpieczonego proleku w 70% TFA (20 ml) ogrzewano w temperaturze 60°C przez 16 godzin i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano metanol (30 ml) i zmieniono odczyn mieszaniny na słabo zasadowy, dodając węglan sodu. Mętny roztwór osuszono nad siarczanem magnezu i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując układem metanol-aceton (1:1), z uzyskaniem pożądanego proleku (13) w postaci białawego ciała stałego (1,06 g, 80%, 98% de, temperatura topnienia: 178,0-180,0°C).
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton-metanoi (1:1), zabezpieczona ara-C: czas retencji = 0,7, produkt: czas retencji = 0,3.
Warunki HPLC: kolumna = Zorbax Eclipse x DB-C8 4,6 x 150 mm; faza ruchoma = 20 mM bufor fosforanowy w 5% układzie acetonitryl-woda; szybkość przepływu = 1,0 ml/minutę; detekcja UV, długość fali 210 nm; czasy retencji w minutach: produkt = 10,60.
P r z y k ł a d 17: Synteza 2(1H)-pirymidynonu, (+)-kamforosulfonianu 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyio)-1,3,2-dioksafosforinan-2-yio]-e-D-arabinofuranozyiu]
Kwas (+)-kamforosulfonowy (232 mg, 1 mmol) dodano do zawiesiny 2(1 godzina)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyio)-1,3,2-dioksafosforinan-2-yio]-e-D-arabinofuranozyiu] (9, 400 mg, 0,91 mmoia) w metanoiu (8 ml). Uzyskany klarowny bezbarwny roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałą białą piankę roztarto octanem etyiu i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zawieszono w octanie etyiu i ogrzano do temperatury wrzenia. Po oziębianiu przez 1 godzinę, ciało stałe odsączono, przepłukano octanem etylu i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc w temperaturze 50°C, uzyskując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego (562 mg), temperatura topnienia 193°C Analiza elementarna (Robertson Mikrolit): wartości obliczone dla C17H21N4O8P.C10H16O4S.H2O: C, 46,95; H, 5,69; N, 8,11. Znaiezione: C, 47,22; H, 5,51; N, 7,81.
P r z y k ł a d 18: Synteza 2 (1H)-pirymidynonu, maieinianu 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyio)-1,3,2-dioksafosforinan-2-yio]-e-D-arabinofuranozyiu]
Produkt wytworzono sposobem przedstawionym w przykładzie 17, stosując kwas maleinowy (1,1 równoważnika)
Temperatura topnienia 140°C. Analiza elementarna (Robertson Mikroiit): wartości obiiczone dia C17H21N4O8P.C4H4O4.H2O. 0,5 C4H8O2: C, 44,67; H, 5,05; N-9,06. Znaiezione: C, 44,58; H, 4,61; N, 8,48.
P r z y k ł a d 19: Synteza 2(1H)-pirymidynonu, wodorosiarczanu 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyio)-1,3,2-dioksafosforinan-2-yio]- β-D-arabinofuranozyiu]
Do zawiesiny 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyio)-1,3,2-dioksafosforinan-2-yio]-3-D-arabinofuranozyiu] (9, 400 mg, 091 mmoi) w metanoiu (8 mi) dodano kwas siarkowy (89 mg, 091 mmol). Swobodnie płynące ciało stałe stało się lepkie i przylgnęło do ścian kolby. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze refluksu przez 15 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej i ciało stałe zeskrobano ze ścian kolby. Po wymieszaniu w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, białe swobodnie płynące ciało stałe odsączono, przepłukano metanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 20°C, uzyskując tytułowy związek (428 mg)
Temperatura topnienia 158°C. Analiza elementarna (Robertson Mikroiit): wartości obiiczone dia C17H21N4O8P.H2SO4.2 H2O: C-35,54; H, 4,74; N, 9,75. Znaiezione: C, 35,50; H, 4,73; N, 9,51.
PL 212 929 B1
P r z y k ł a d 20: Synteza 2(1H)-pirymidynonu, chlorowodorku 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-e-D-arabinofuranozylu]
N roztwór kwasu chlorowodorowego (228 μ|, 0,23 mmola) dodano do 2(1H)-pirymidynon, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-3-D-arabinofuranozylu] (9, 100,6 mg, 0,228 mmola) w kolbie. Następnie do częściowo rozpuszczonego ciała stałego dodano wodę (5 m|) oraz metano| (5 ml) i mieszaninę sonikowano. Klarowny bezbarwny roztwór przesączono poprzez filtr strzykawkowy 0,45 μm i przepłukano metanolem. Połączone przesącze zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość destylowano azeotropowo z acetonitrylem (2 x 10 m|). Pozostałość rozpuszczono w mieszaninie acetonitrylu i metanolu (1/1, 10 ml) i zatężono do suchej masy. Biały proszek osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 20°C, uzyskując tytułowy związek (78 mg).
Temperatura topnienia > 200°C. Analiza elementarna (Robertson Mikrolit): wartości obliczone dla C17H21N4O8P.HCl.H2O: C, 42,03; H, 4,77; N, 11,53; Cl, 7,30. Znalezione: C, 41,70; H, 4,84; N, 11,68; Cl, 7,45.
P r z y k ł a d 21: Synteza 2(1H)-pirymidynonu, L-winianu 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynyIo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-3-D-arabinofuranozylu]
Produkt wytworzono takim samym sposobem jak opisano w przykładzie 20, stosując 0,1 N roztwór kwasu L-winowego w wodzie.
Temperatura topnienia > 200°C. Analiza elementarna (Robertson Mikrolit): wartości obliczone dla C17H21N4O8P.C4H6O6.H2O.0,1 C2H3N: C = 41,57; H = 4,82; N = 9,38; Znalezione: C = 41,32; H = 5,03; N = 9,69.
P r z y k ł a d 22. Synteza racemicznego trans-4-(4-pirydylo)-2-(4-nitrofenoksy)-2-okso-1,3,2-dioksafosforinanu
Mieszaninę racemiczną 1-(4-pirydylo)-1,3-propanodiolu (4 g, 26,1 mmola) i trietyloaminy (12 ml, 86 mmoli) w THF dodano do roztworu 4-nitrofenylodichlorofosforanu (7,35 g, 28,7 mmola) w THF. Po wymieszaniu w temperaturze pokojowej przez noc, dodano 4-nitrofenolan sodu (10 g, 71,8 mmola) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 50°C przez 4 godziny. Reakcję w ochłodzonej mieszaninie zatrzymano, dodając nasycony roztwór chlorku amonu i ekstrahowano (3 x) octanem etylu. Połączone ekstrakty organiczne przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu i osuszono nad siarczanem sodu. Przesączony roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, dichlorometan/ etanol 95/5) 1H NMR (CDCI3, Varian Gemini 200 MHz): C'-proton: izomer cis 5,6-5,8(m, 1H); izomer trans 5,5-5,69(m, 1H).
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton/heksany 3/2; diol: czas retencji = 0,2, trans-fosforan: czas retencji = 0,6, cis-fosforan: czas retencji = 0,5.
Warunki HPLC dla izomeryzacji cis/trans: kolumna = Zorbax Rx-C18 (4,6 x 250 mm); faza ruchoma = 35% acetonitryl/ 65% 20 mM bufor fosforanowy, pH 7,95; szybkość przepływu = 0,5 ml/minutę; detekcja UV, długość fali 250 nm; czasy retencji: izomer cis = 9,39 minuty, izomer trans 10,11 minuty
P r z y k ł a d 23. Synteza 2(1H)-pirymidynonu, 4-amino-1-[5-O-cis-[2-oksydo-4-(4-pirydynyIo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-3-D-arabinofuranozylu]
23.1. Etap fosforylacji
Związek wytworzono sposobem podobnym do przedstawionego w przykładzie 16,1, stosując racemiczny trans-4-(4-pirydylo)-2-(4-nitrofenoksy)-2-okso-1,3,2-dioksafosforinan.
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton, trans-fosforan: czas retencji = 0,6, zabezpieczona ara-C: czas retencji = 0,2.
23.2. Etap odbezpieczania
Związek wytworzono sposobem podobnym do przedstawionego w przykładzie 16.2.
Warunki TLC: Płytki z żelu krzemionkowego, 250 μm; faza ruchoma = aceton-metanol (1:1), zabezpieczona ara-C: czas retencji = 0,7, produkt: czas retencji = 0,3.
Przykłady zastosowania sposobów według wynalazku obejmują powyżej przedstawione. Zrozumiałe, że powyższe metody są przykładowe i, że sposoby według wynalazku nie ograniczają się wyłącznie do przedstawionych przykładów.
Dla przejrzystości i skrótu wprowadzono odpowiednie oznaczenia: 2(1H)-pirymidynon, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4S)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioxfosforinan-2-ylo] (9) oznacza związek A, 2(1H)pirymidynon, 4-amino-1-[5-O-[(2R,4R)-2-oksydo-4-(4-pirydynylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]-3-D-arabinofuranozyl] (13) oznacza związek B, i 2(1H)-pirymidynon, 4-amino-1-[5-O-cis-[2-oksydo-4-(4-pirydy36
PL 212 929 B1 nylo)-1,3,2-dioksafosforinan-2-ylo]^-D-arabinofuranozyl] z przykładu 23 oznacza związek C w przykładach.
P r z y k ł a d y b i o l o g i c z n e
P r z y k ł a d A: Kinetyka enzymów w mikrosomach wątroby ludzkiej
W celu porównania aktywacji w ludzkiej tkance wątrobowa określono aktywację związku A i związku B do araCMP przez mikrosomy wątroby ludzkiej. Specyficzność CYP3A4 oszacowano stosując inhibitory farmakologiczne.
Metody:
Związek A i związek B inkubowano przez 5 minut z mieszaninami zawierającymi 2 mg/ml mikrosomów wątroby ludzkiej (In Vitro Technologies (IVT), nr kat. X00821, nr serii RQX, pula od 50 dawców różnej płci), 100 mM bufor fosforan potasu (Sigma, nr kat. P3786, nr serii 62H0619), pH 7,4,
1 mM NADPH (Calbiochem, nr kat. 481973, nr serii B38806). Mieszaniny reakcyjne wirowano przez minuty w temperaturze 37°C w mikserze Eppendorf Thermal Mixer 5436 przy 700 obrotach na minutę bez NADPH po czym reakcję zapoczątkowano dodając NADPH w stężeniu końcowym 1 mM. Reakcje zatrzymano dodając 5 minut później 112,5 μl metanolu, próbki wirowano przez 10 minut przy 14000 obrotach na minutę w wirówce Eppendorf i 150 μl sklarowanej cieczy odparowano do suchej masy stosując średnie ogrzewanie. Próbki ponownie zawieszono w 60 μl buforu dwujonowego (10 mM fosforan potasu, Fisher, nr kat. P286-1, nr serii 9152328A, 50 mM wodorotlenku tetrabutyloamoniowego, Aldrich, nr kat. 17878-0, nr serii 07030KO, pH uregulowano do 4,5 z zastosowaniem około 3,3 ml/l kwasu fosforowego, 85% w wodzie, Chempure, nr kat. 831-621, nr serii M224KBRR), wytrząsano, sonikowano przez około 30 sekund i wirowano przy 14000 obrotach na minutę przez około 10 sekund.
W celu ilościowej oceny aktywacja do araCMP, próbki zanalizowano metodą HPLC w fazach odwróconych (Hewlett Packard 1100). Pięćdziesiąt μl każdej próbki wstrzyknięto do kolumny Agilent C18 Zorbax SB-AQ z układem faz odwróconych (nr kat. 883975-914, 5 μm, 4,6 mm x 150 mm) z przedkolumną Alltech C-18 EPS (nr kat. 32607, 7,5 mm x 4,6 mm). Próbki wprowadzono z buforem dwujonowym (patrz powyżej) przy szybkości przepływu 1 ml/minutę, temperatura kolumny 40°C, i temperatura próbki 4°C. AraCMP eluowano izokratycznie przy czasie około 7 minut po czym przemywano 70% metanolem przez 2 minuty. Wypływ monitorowano metodą absorbancji UV przy 272 nm.
Badania hamowania przeprowadzono inkubując wstępnie z 0,1 μΜ do 100 μΜ troleandomycyna (TAG; Sigma T-6514, nr serii 81K1655) lub 0,01 μΜ do 10 μΜ ketokonazolem (KTZ; Research Biochemicals International, nr kat. K105, nr serii SJG-597A). Zarówno TAO jak i KTZ rozpuszczono w metanolu, zatem wszystkie próbki w tym kontrolne zawierały metanol w stężeniu końcowym 1% (objętościowo). W przypadku badania hamowania z zastosowaniem TAO, mikrosomy inkubowano wstępnie z TAO przez 30 minut w temperaturze 37°C bez substratu. Reakcje (objętość 100 μθ zapoczątkowano dodając substrat: 1000 μΜ związku A lub 1000 μΜ związku B oraz świeżą próbkę 1 mM NADPH. Ketokonazol nie wymagał tej procedury wstępnej inkubacji, tak więc reakcje przeprowadzono jak opisano powyżej dodając ketokonazol do mieszaniny reakcyjnej w trakcie dodania substratu.
Parametry kinetyczne przedstawiono jako średnią ± i odchylenie standardowe (n=2 lub 3 niezależne doświadczenia). Do obliczenia Vmax i Km użyto równanie Michaelisa-Menten, szybkość = Vmax[S]/[S] + Km, stosując Enzyme Kinetics Module v. 1.1 z Sigma Plot (SPSS, Inc.). Wewnętrzny klirens otrzymano dzieląc Vmax przez Km. Wartości IC50 dla badań hamowania określono metodą interpolacji połowy maksymalnego hamowania z wartościami IC50 wyrażonymi jako średnia ± odchylenie standardowe (n=2 lub 3 niezależne doświadczenia). Ki określono za pomocą równania Chenga i Prusoffa, Ki = IC50/1+ [substrat] /Km.
Wyniki:
Stosując mikrosomy wątroby ludzkiej nr serii RQX (tablica 1) stwierdzono, że związek A wykazał 2,6-krotnie większy klirens wewnętrzny niż związek B.
T a b l i c a 1. Parametry kinetyczne aktywacji związku A i związku B w mikrosomach wątroby człowieka
Związek A Związek B
Badane stężenia, mM 0,25, 0,5, 0,75, 1 0,5, 1, 3, 6
Vmax, nmol/minutę/mg 0,11 ± 0,02 0,13 ± 0,02
Km, mM 1,08 ±0,27 3,13 ± 0,51
Klirens, μl/minutę/mg 0,11 ± 0,02 0,042 ± 0,003
PL 212 929 B1
TAO hamował aktywację związku A i związku B przy wartościach IC50 0,9 ± 0,1 μΜ i 0,7 ± 10,4 μΜ odpowiednio dla związku A i związku B, (tablica 2). Całkowite hamowanie (99%) aktywacji związku A obserwowano przy 100 μΜ TAO. Najwyższe badane stężenie TAO ze związkiem B wynosiło 10 μΜ, które powodowało hamowanie 73 ± 2%. Wartości Ki TAO były podobne dla związku A i związku B, odpowiednio 0,5 ± 0,1 μΜ i 0,5 ± 0,3 μΜ.
Tak jak w przypadku TAO, KTZ hamował aktywację związku A i związku B. Wartości IC50 były niższe niż te dla TAO: 0,2 ± 0,1 μΜ zarówno dla związku A jak i związku B (tablica 2). Ponownie, przy 10 μΜ KTZ, obserwowano maksymalne hamowanie aktywacji związku A i związku B odpowiednio 96 ± 3% i 89 ± 1%. Wartości Ki wynosiły dla związku A 0,1 ± 0,03 μΜ i 0,1 ± 0,05 μΜ dla związku B.
T a b l i c a 2. Hamowanie aktywacji przez TAO I KTZ w mikrosomach wątroby człowieka
Związek Badane stęż. (μΜ) Inhibitor IC50 (μΜ) Ki (μΜ) % hamowania przy maksymalnym badanym stężeniu inhibitora
Związek A 1000 TAO 0,9 ± 0,1 0,5 ± 0,1 99% przy 100 μΜ (94% przy 10 μΜ)
Związek B 1000 TAO 0,7 ± 0,4 0,5 ± 0,3 73 ± 2% przy 10 μΜ
Związek A 1000 KTZ 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,03 96 ± 3% przy 10 μΜ
Związek B 1000 KTZ 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,05 89 ± 1% przy 10 μΜ
Wnioski:
Związek A i związek B są aktywowane do araCMP przez mikrosomy wątroby ludzkiej. Związek A aktywuje się w 2,6-krotnie większym stopniu niż związek B. Hamowanie przez KTZ i TAO aktywacji proleku sugeruje, że brał w tym udział CYP3A4.
P r z y k ł a d B: Efekt pojedynczej dawki na poziomie wątroby
Aktywację proleków in vivo zmierzono po dootrzewnowym podaniu myszom w bolusie.
Metody:
Normalnym niegłodzonym samcom myszy Swiss Webster (masa ciała 25 do 35 g, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wstrzyknięto dootrzewnowo związek A lub związek B w dawce odpowiednio 189 i 192 mg/kg, odpowiadającej równoważnikom molowym 100 mg/kg ara-C. W określonych punktach czasowych po zastrzyku, myszy znieczulono i skrwawiono przez nakłucie serca. Wyizolowano całą wątrobę i szybko zamrożono w ciekłym azocie, i homogenizowano stosując homogenizator Politron PT 10/35 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY) w 3 objętościach 10% (objętościowo) kwasu nadchlorowego (PCA). Po 5 minutach wirowania przy 2500 x g, 1 ml sklarowanej cieczy zobojętniono stosując 0,3 ml 3 M KOH/3 M KHCO3 i starannie wymieszano. Potem próbki wirowano przez 5 minut i uzyskane supernatanty potraktowano nadjodanem w celu usunięcia endogennych rybonukleotydów, które inaczej mogłyby przeszkadzać w wykrywaniu araCTP. W tym celu, 100 μl ekstraktu tkankowego inkubowano z 4 μl 0,5 M nadjodanu sodu (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, nr serii 08009 BU) i 10 μl 1,8 M metyloaminy (Aldrich nr serii 04526 DQ), pH 5,5) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano dodając 2 μl 1M L-ramnozę (Aldrich nr serii 06801 JS). Uzyskane próbki zanalizowano metodą HPLC jak opisano poniżej.
Do pomiaru araCTP w szpiku kostnym, próbki szpiku kostnego wypłukano z jam szpikowych kości udowych za pomocą 1,2 ml solanki do uprzednio zważonych probówek Eppendorfa. Po wirowaniu przez 20-30 sekund (mikrowirówka Eppendorf, 14000 obrotów na minutę) i usunięciu supernatantu, do osadów z komórek szpikowych dodano 12 objętości 3%: PCA (objętościowo). Potem próbki wytrząsano do chwili aż osad dobrze się rozpuścił i wirowano jak powyżej przez 10 minut. Dziewięćdziesiąt μl ekstrahowanego supernatantu zobojętniono do pH 7-8 stosując 30 μl 1 M KOH/1 M KHCO3 i ponownie odwirowano. Uzyskane supernatanty potraktowano nadjodanem jak powyżej.
Poziomy araCTP w wątrobie i szpiku kostnym określono metodą jonowymiennej HPLC (Hewlett Packard 1050) stosując kolumnę Whatman Partisil 5 SAX (5 μm, 4,6 x 250 mm). Próbki (50 μθ wstrzyknięto na kolumnę w 70% 10 mM buforze fosforanie amoniowym i 30% 1 M buforze fosforanie amoniowym, pH obu 3,5 i z zawartością 6% etanolu. Trifosforany nukleozydów eluowano z kolumny stosując liniowy gradient do 80% 1 M fosforanu amoniowego pH 3,5/6% buforu etanolowego, przy szybkości przepływu 1,25 ml/minutę. AraCTP wykrywano metodą absorbancji UV (280 nm) i zazwyczaj eluowano pomiędzy 12 i 13 minutą. Krzywą wzorcową uzyskano dodając araCTP w znanych
PL 212 929 B1 ilościach do ekstraktów PCA z kontrolnej wątroby lub szpiku kostnego przed zobojętnieniem, i właściwie przygotowując próbki HPLC.
W celu uzyskania osocza, krew przeniesiono dc heparynizowanych probówek dla małych próbek i wirowano w mikrowirówce Eppendorf przy 14000 obrotach na minutę przez 2 minuty. Uzyskane osocze zebrano, umieszczono na suchym lodzie, i później przechowywano w temperaturze -20°C. W dniu analizy, białka wytrącono dodając do 100 μl osocza 1 ml acetonitrylu. Po 10 minutach wirowania (mikrowirówka Eppendorf, 14000 obrotów na minutę), supernatant usunięto i osuszono w urządzeniu Savant SpeedVac Plus SCI 10A. Próbki rozpuszczono w 110 μl buforu dla fazy ruchomej (20 mM KH2PO4, pH 4,5), sonikowano przez 5 minut, i wirowano przez 30 sekund. Supernatanty zanalizowano metodą HPLC z układem faz odwróconych (Hewlett Packard 1090) przy użyciu kolumny Alltech C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm). Po wstrzyknięciu 50 μl próbki w buforze dla fazy ruchomej, po 10 minutach stężenie acetonitrylu zwiększono do 10%, po czym do 50% po 15 minucie. Czasy elucji araC i proleków wynosiły odpowiednio około 3 i 19 minut. AraC i proleki wykryto określając absorbancję przy 280 nm i określono ilościowo stosując krzywe wzorcowe otrzymane z zastosowaniem próbek osocza ze związkami, poddanych procedurze jak powyżej.
Wyniki przedstawiono jako średnią ± standardowy błąd średniej. Dane zanalizowano metodą ANOVA z powtarzanymi pomiarami, po którym przeprowadzono test Tukey'a HSD post-hoc dla porównań w indywidualnych punktach czasowych, gdy to odpowiednie. Za istotną statystycznie uznano wartość p poniżej 0,05. Linie kropkowane na rysunkach wskazują LOQ (granica oznaczenia ilościowego) przy zastosowaniu wskazanej metody HPLC.
Wyniki:
Związek A i związek B dawały wysoki poziom araCTP w wątrobie (fig. 1a.), który osiągnął maksymalną wartość 60 minut po zastrzyku przy 69,89 ± 6,37 i 27,00 ± 4,04 nmola/g dla odpowiednio związku A i związku B. Związek A dawał znacznie (p<0,05) większy poziom araCTP w wątrobie niż związek B we wszystkich punktach czasowych z wyjątkiem 4 godziny. Poziom proleku w osoczu był podobny dla związku A i związku B (p<0,01; fig. 1b). Poziom araC w osoczu był wyższy u myszy, którym podawano związek A (p<0,01 dla 0,5, 1 i 2 godzin; fig. 1c), co skorelowane było bardziej z poziomem araCTP w wątrobie niż poziomem proleku w osoczu. Sugeruje to, że araC w osoczu może pochodzić raczej od araCTP z wątroby niż stanowić wynik degradacji proleku w osoczu. Poziom araCTP w szpiku kostnym był na poziomie lub poniżej poziomu oznaczenia ilościowego (3 nmole/g) we wszystkich próbkach co sugeruje skuteczne ukierunkowanie na wątrobę.
Wnioski:
Zarówno związek A jak i związek B prowadzi do uzyskania znaczącego poziomu araCTP w wątrobie po podawaniu w zastrzyku dootrzewnowym w bolusie. Związek A prowadzi do około 2-krotnie większego poziomu araCTP w wątrobie niż związek B. Nie wykryto AraCTP w szpiku kostnym zwierząt, którym podano którykolwiek spośród związków. Poziom proleku w osoczu był podobny dla obu proleków, lecz poziom araC w osoczu był około 2-krotnie wyższy dla związku A. Opierając się na względnej korelacji poziomu araC w osoczu do poziomu araCTP w wątrobie, przypuszcza się że araC w osoczu powstaje z wątrobowego araCTP prawdopodobnie w wyniku defosforylacji araCTP do ara i wycieku araC z komórek wątroby z powrotem do osocza.
P r z y k ł a d C: Poziom wątrobowego araCTP po dostarczeniu przez ciągły wlew dożylny.
Aktywacja proleków do araCTP i utrzymywanie poziomu araCTP w wątrobie określono u szczurów wyposażonych w urządzenia do dostarczania leku umożliwiające ciągły wlew dożylny.
Metody :
Samce szczurów Simonsen Albino (pochodzące od Sprague Dawley, z Simonsen Laboratories, Inc., Gilroy, CA) znieczulono zastrzykiem dootrzewnowym 0,25 ml mieszanki znieczulającej zawierającej 150 mg ketaminy („Vetamine, 100 mg/ml, Phoenix Scientific, Inc. St. Joseph, MD), 10 mg ksylazyny (100 mg/ml, Butler Company, Columbus, OH) i 5 mg morfiny (15 mg/ml, Marsam Pharmaceuticals, Inc., Cherry Hill, NJ) na 1,93 ml. Wypełniony solanką tępy cewnik z rurki PE-50 (Intramedic, Becton Dickinson, Sparks, MD) wprowadzono do żyły szyjnej, wyłoniono pomiędzy łopatkami i przyłączono do obrotowego podwiązanego układu do stałego wlewu (Lomir Biomedical, Inc., Malone, NY i Harvard Apparatus, Inc., South Natick, MA). Rurkę wypełniono heparynizowaną solanką i szczelnie zamknięto, a zwierzęta pozostawiono do rekonwalescencji na jeden do siedmiu dni. U tak przygotowanych zwierząt zastosowano następujące procedury wlewu: związek A: związek A podawano we wlewie w dawce 200 mg/kg/24 godziny równoważników araC (CE) przez 2, 4, 8, 16, 24 lub 48 godzin (n=4-5/grupę, z wyjątkiem grupy 48-godzinnej gdzie n=1) związek B: związek B podawano we wlewie
PL 212 929 B1 w dawce 200 mg/kg/24 godziny CE przez 2, 4, 8, 16, 24 lub 48 godzin (n=3-5/grupę). Ponadto, związek A podawano we wlewie w takiej samej dawce przez 4 godziny (n=3). Związek C: związek C podawano we wlewie w dawce 200 mg/kg/24 godziny CE przez 2, 4, 8, 16, 24 lub 48 godzin (n=3-5/grupę). Odpowiedź na dawkę: związek A podawano we wlewie w dawce 144 i 200 mg/kg/24 godziny CE przez 4 godziny (n=4-5/grupę). Związek B podawano we wlewie w dawce 50, 100 i 200 mg/kg/24 godziny CE przez 24 godziny (n=3-5/grupę).
Po trwającym różną ilość czasu wlewie zwierzęta uśpiono wstrzykując do cewnika opisaną powyżej mieszankę znieczulającą. Próbki krwi otrzymano poprzez nakłucie serca stosując igłę 3 o rozmiarze 23 dołączoną do powleczonej heparyną strzykawki na 3 cm3. Pobrano próbki wątroby i szybko zamrożono w ciekłym azocie posługując sie szczypcami do mrożenia i poddano procedurze takiej jak opisano w przykładzie B. Próbki zanalizowano pod kątem wątrobowego araCTP jak to opisano w przykładzie B. Zebrano próbki osocza oraz szpiku kostnego i zanalizowano pod kątem poziomu proleku w osoczu, araC w osoczu i araCTP w szpiku kostnym, tak jak to opisano w przykładzie B.
Wyniki:
Ciągły wlew związku A w dawce 200 mg/kg/24 godziny dawał przez 4 godziny stały poziom araCTP w wątrobie (12,84 i 1,50 nmola/g), który utrzymywał się na średnim poziomie 13 ± 1 nmola/g przez pozostałe 44 godziny (fig. 2a). W trakcie 48-godzinnego doświadczenia poziom proleku w osoczu był podobny dla wszystkich trzech związków w zakresie od 30-60 pM. Związek B i związek C dawały mniej araCTP w wątrobie niż związek A. Badania te przeprowadzono niezależnie; zatem, w celu przeprowadzenia kontroli na potencjalną zmienność doświadczenia, związek A podano jednej grupie zwierząt w badaniu z użyciem związku B. Poziom araCTP w wątrobie tych zwierząt, zmierzony po 4 godzinach wlewu, był podobny do poziomu otrzymanego w tym samym punkcie czasowym 48-godzinnego badania dla związku A, a poziom proleku w osoczu był identyczny dla dwóch związków, co sugeruje, że różnice w poziomie araCTP w wątrobie nie były spowodowane nieznaczną różnicą w farmakokinetyce. Poziom araCTP w szpiku kostnym był na poziomie lub poniżej poziomu oznaczenia ilościowego (3 nmole/g) we wszystkich próbkach.
Odpowiedź na dawkę w postaci poziomu araCTP w wątrobie badano przez okres 24-godzin podając we wlewie związek B w dawce 100 lub 50 mg/kg/24 godziny lub przez okres 4-godzin podając we wlewie związek A w dawce 144 mg/kg/24 godziny. Jak pokazano na fig. 2b, poziom araCTP w wątrobie był zależny od dawki dla obu proleków.
Wnioski:
Ciągły wlew związku A, B lub C prowadzi do istotnego i utrzymującego się poziomu araCTP w wątrobie. Podawanie związku A prowadzi do wyższego poziomu araCTP w wątrobie niż w przypadku związku B lub związku C o podobnych poziomach proleku w osoczu co sugeruje, że różnice spowodowane są raczej różnicą w stopniu aktywacji niż w farmakokinetyce.
P r z y k ł a d D: ukierunkowywanie na wątrobę
Specyficzność dostarczania araCTP, przez te aktywowane CYPSA proleki, do wątroby zmierzono in vivo porównując poziom araCTP w wątrobie z aktywnym metabolitem w innych narządach. W szczególności oceniano kierowanie do wątroby w porównaniu ze szpikiem kostnym ponieważ szpik kostny jest narządem, w którym objawia się toksyczność cytarabiny.
Metody:
Badania rozmieszczenia w tkankach przeprowadzono u myszy i szczurów, tak jak to opisano w przykładach B i C. W tych badaniach, aby ocenić kierowanie do wątroby pobrano w trakcie sekcji próbki wątroby, osocza i szpiku kostnego. W celu wykazania użyteczności jako środka kierującego do wątroby podobne badania przeprowadzono z zastosowaniem macierzystego związku, cytarabiny.
Wyniki przedstawiono jako średnią ± standardowy błąd średniej. Gdy to odpowiednie, z danych od punktu czasowego zero do ostatniego punktu czasowego badania obliczono AUC. Indeksy kierowania do wątroby (LTI) obliczono dzieląc AUC dla araCTP w wątrobie przez AUC dla araC w osoczu (LTI osocza) lub przez AUC dla araCTP w szpiku kostnym (LTI szpiku kostnego) dla każdego związku. W przypadku badań z wlewem ciągłym, stan ustalony poziomu araCTP podzielono przez stan ustalony poziomu araC w osoczu.
Wyniki:
Jak opisano w przykładzie B, gdy związek A, związek B, lub związek C podawano myszom lub szczurom w wątrobie wykrywano wysoki poziom araCTP. W tablicy 3 zreasumowano poziomy szczytowe oraz AUC w przypadku badań z dootrzewnowym zastrzykiem związków bolusie. Poziom araCTP w szpiku kostnym był na poziomie lub poniżej poziomu oznaczenia ilościowego (3 nmole/g) we
PL 212 929 B1 wszystkich badaniach, co sugeruje dobre kierowanie do wątroby. Natomiast, jeśli podobnym sposobem podawano dawkę 100 mg/kg cytarabiny wówczas w szpiku kostnym wykrywano wysoki (19 nmoli/g) poziom araCTP. Nie ma dowodu, że szpik kostny bezpośrednio aktywuje związki do araCMP; każdy potencjalny araCTP powstaje prawdopodobnie w wyniku aktywacji araC pobranego z osocza i fosforylowanego do araCTP w szpiku kostnym. W osoczu tych zwierząt wykrywa sie araC i wydaje się, że we wszystkich badaniach skorelowane jest to z poziomem araCTP w wątrobie. Jak pokazano w tablicy 3, po dootrzewnowym podaniu związku A lub związku B wartości AUC araC w osoczu u myszy i szczurów mieszczą się w zakresie od 3-22 μM*godzin. Oszacowanie indeksu kierowania do wątroby (LTI) przez porównanie ilości araCTP w wątrobie do ilości araC w osoczu w czasie trwania doświadczenia sugeruje 19,2-27-krotny stopień kierowania araCTP do wątroby w porównaniu do ekspozycji obwodowej. Wartości te są 100-krotnie wyższe od LTI dla cytarabiny. Wartości stanu ustalonego można podobnie porównać gdy związek A, związek B, lub związek C dostarcza się metodą ciągłego wlewu dożylnego (tablica 4). W tych badaniach LTI mieści się w zakresie od 5 ->12, co jest 1000krotnie powyżej LTI dla cytarabiny podawanej w 10-krotnie większej dawce.
T a b l i c a 3: Kierowanie do wątroby myszy pochodnej 4-pirydylowej (związek A, związek B) HepDirect proleków cytarabiny in vivo. Związki podano w dawce 100 mg (równoważniki cytarabiny)/kg stosując w pojedynczym zastrzyku dootrzewnowym
Związek araCTP w wątrobie pik przy 1 godzinie (nmol/g) araCTP w wątrobie AUC0-4 godzin (nmol/g *godzina) Prolek w osoczu AUC0,5-4 godzin (nmol/g *godzina) araC w osoczu AUC0-4 godzin (μΜ* godzina ) LTI (Wątroba/osocze) (nmol/g/nM)
Związek A Mysz 96 225 138 8,3 27
Związek A Mysz 70 149 156 7,6 19,5
Związek B Mysz 27 68 102 3,5 19,6
Związek A Szczur 267 422 147,1 21,9 19,2
AraC Mysz 7,6 <19,2 N/A 121,2 <0,2
T a b l i c a 4: Ciągły wlew pochodnej 4-pirydylowej (związek A, związek B lub związek C) HepDirect proleki cytarabiny u szczurów. Proleki podawano w dawkach 200 mg (równoważniki cytarabiny)/kg/dobę w ciągłym wlewie dożylnym. * AraC podawano w dawce 2000 mg/kg/dobę
Związek (badanie) araCTP w wątrobie przy 4 godzinach (nmol/g) araCTP w wątrobie przy 24 godzinach (nmol/g) Prolek w osoczu stan ustalony (μΜ) araC w osoczu stan ustalony (μΜ) LTI przy 24 godzinach (wątroba/osocze ) (nmol/g/μΜ)
Związek A 12,8 12,0 40-50 około 1,6 7,5
Związek B 6,4 5,9 25-35 <0,5 >12
Związek C 9,9 7,8 35-60 około 1,5 5
AraC* 2,3 przy 2 godz. <2,26 N/A około 300 <0,01
Wnioski:
Związek A, związek B i związek C skutecznie doprowadzały araCTP do wątroby zmniejszając ekspozycję obwodową o około 20 razy w przypadku podawania dootrzewnowego lub około 10 razy w przypadku podawania w ciągłym wlewie dożylnym. Stanowi to ulepszenie o 100-1000-razy w stosunku do araC.
P r z y k ł a d E: Stabilność w roztworze wodnym
Stabilność związków w roztworze wodnym zmierzono jako funkcję pH i stężenia buforu.
Metody:
Związek A i związek B rozpuszczono w wodzie w stężeniu 500 μΜ (0,23 mg/ml) jako roztwory podstawowe. Roztwory rozcieńczono (50 μΜ) inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze typu suchej łaźni Fisher Scientific (nr kat. 11-718-2) z próbkami zbieranymi co 24 godziny i przechowywano w temperaturze -80°C. Reakcje w próbkach osocza (100 μΓ> zatrzymano dodając 1 ml acetonitrylu. Gdy zebrano wszystkie próbki osocza, próbki rozmrożono, wirowano przez 10 minut przy 14000 obrotach na minutę w mikrowirówce Eppendorf, usunięto 1 ml supernatantu i odparowywano do suchej
PL 212 929 B1 masy przez 2 lub 3 godziny przy średnim ogrzewaniu (około 37°C). Przed wstrzyknięciem do kolumny do HPLC próbki ponownie zawieszono w 120 μl buforu dla fazy ruchomej.
Próbki zanalizowano w chromatografie HP1090 lub HP1100 (Hewlett Packard) HPLC stosując kolumnę C-18 Alltech Econosphere, 150 mm x 4,6 mm (nr kat. 70065), z przedkolumną C-18 Alltech Econosphere, 7,5 mm x 4,6 mm (nr kat. 96121). Próbki eluowano gradientem metanolu: 0% przez 5 minut, zwiększając potem do 10% w 10 minucie, 30% w 20 minucie, i 60% w 25 minucie. Na 10 minut przed kolejną iniekcją kolumnę pozostawiono do zrównoważenia w 0% metanolu. Szybkość przepływu wynosiła 1 ml/minutę, a temperatura kolumny wynosiła 40°C. Proleki eluowano około 19,5 minuty i monitorowano poprzez absorbancję UV przy 280 nm. W przypadku proleków w warunkach wodnych, zastosowano taką samą metodę z takim wyjątkiem, że gradient metanolu był taki jak następuje: 0% przez 5 minut, zwiększenie do 10% w 10 minucie, i 30% w 20 minucie przy czym prolek eluował około 20 minut.
Wyniki:
Zarówno związek A jak i związek B były całkiem stabilne w roztworze wodnym z t90 >6 dni w 10 mM fosforanie potasu (Pi), pH 7,4, i 10 mM cytrynianie, pH 5,0. Stabilność związku A również wynosiła >6 dni w 100 mM Pi, pH 7,4, lecz trwałość związku B była w tym buforze odrobinę mniejsza, z t90 = 4 dni. Stabilność obu związków zmniejszyła się w 100 mM cytrynianie, pH 5,0, z t90 wynoszącym 2 dni i 1,7 dni dla odpowiednio związku A i związku B.
Wnioski:
Stabilność proleków 4-pirydylowych jest całkiem dobra, lecz związki są odrobinę mniej stabilne przy niskim pH przy dużym stężeniu buforu.
P r z y k ł a d F: Rozpuszczalność
W celu zidentyfikowania potencjalnych preparatów do podawania in vivo określono rozpuszczalność związku A i związku B w rozmaitych warunkach.
Metody:
Rozpuszczalność związku A i związku B oszacowano w 0,5 M buforze fosforanowym (Pi) pH 8,0, 0,5 M buforze cytrynianowym pH 7,0 i 0,5 M buforze cytrynianowym pH 4,0. W przypadku każdego spośród tych trzech układów buforujących, roztwory nasycające związku A i związku B wytworzono w sposób następujący. 30 mg związku A i 150 mg związku B przeniesiono do oddzielnych fiolek 3 z przezroczystego szkła na 4 cm3 i do każdej fiolki dodano 1,0 ml buforu. Tak przygotowane fiolki szczelnie zamknięto i zrównoważono bębnując w temperaturze 25°C przez minimum 24 godziny. Pod koniec okresu inkubacji prolek, który nie był w roztworze usunięto z próbek filtrując poprzez nylonowy filtr strzykawkowy o wymiarze porów 0,45 μm.
Te rozcieńczone próbki testowano metodą HPLC według przykładu E.
Wyniki:
Rozpuszczalność związku A wynosiła 2,9 mg/ml w buforze o pH 8, 2,6 mg/ml przy pH 7,0 i 45,8 mg/ml przy pH 4,0. Rozpuszczalność związku B wynosiła 10,2 mg/ml w buforze o pH 8, 9,0 mg/ml przy pH 7,0 i 94,6 mg/ml przy pH 4,0.
Wnioski:
Zarówno związek A jak i związek B są względnie rozpuszczalne w roztwory o obojętnym pH przy czym rozpuszczalność związku B przekracza rozpuszczalność związku A. Rozpuszczalność obu związków zwiększa się znacznie po przygotowaniu w roztworze o pH < 4.
P r z y k ł a d G: Stabilność w osoczu
W celu zbadania czy związki będą stabilne in vivo określano stabilność związku A, związku B i związku C w osoczu w przeciągu 6 dni.
Metody:
Posłużono się połączonym ludzkim osoczem od kobiet i mężczyzn (Bioreclamation Inc., Hickville, NY, nr kat. HMPLNAHP, nr serii BRH02236) zawierającym jako antykoagulant heparynę, pH wszystkich próbek osocza wynosiło 8,3. Związek A i związek B rozpuszczono w wodzie w stężeniu 500 μΜ (0,23 mg/ml) jako roztwory podstawowe, rozcieńczono do 50 μΜ w próbkach osocza i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze typu suchej łaźni Fisher Scientific (nr kat. 11-718-2) z próbkami zebranymi co 24 godziny i przechowywano w temperaturze -80°C. Reakcję w próbkach (100 μθ zatrzymano dodając 1 ml acetonitrylu. Po zebraniu wszystkich próbek, próbki rozmrożono, wirowano przez 10 minut przy 14000 obrotach na minutę w mikrowirówce Eppendorf, usunięto 1 ml supernatantu i odparowywano do suchej masy przez 2 lub 3 godziny przy średnim ogrzewaniu (około 37°C). Przed analizą HPLC próbki ponownie zawieszono w 120 μl buforu dla fazy ruchomej. W przy42
PL 212 929 B1 padku próbek osocza, 40 μi iub 50 μi próbek wstrzyknięto na kolumnę opisaną w przykładzie E wraz z buforem dia fazy ruchomej, 20 mM buforem fosforanem potasu, pH 6,2 (Fisher Scientific, nr kat. P261-1, różne serie). Każdą inną analizę HPLC przeprowadzono tak jak to opisano w przykładzie E.
Wyniki:
Dla wszystkich związków t% w osoczu człowieka w temperaturze 37°C wynosił 6 ± 1/? dnia.
Wnioski:
Przy okresach półrozpadu w osoczu człowieka >1 dnia, nie oczekuje się aby związek A, związek B, i związek C ulegał znaczącej degradacji in vivo.
P r z y k ł a d H: Toksyczność ostra u szczura
Tolerancję i bezpieczeństwo związku A w dawce 2000 mg/kg/24 godziny oszacowano po 24 godzinach ciągłego wlewu dożylnego.
Metody:
Samce i samice szczurów Simonsen wyposażono w urządzenia do dostarczania leku umożliwiające ciągły wlew jak to opisano w przykładzie C. W dniu doświadczenia, szczury podłączono do uwięzi do stałego wlewu i umożliwiono swobodny dostęp do pożywienia i wody. Trzem samcom i trzem samicom szczura podano związek A w dawce 2000 mg/kg/24 godziny z szybkością przepływu 2,08 ml/kg/godzinę. Związek A rozpuszczono w ilości 42,5 mg/mi w wodzie i pH ureguiowano do 4 stosując 1M HCi. Osmolarność uregulowano do około 300 mOsm stosując 5M NaCi. Jako kontroia posłużyły 2 samce szczurów, którym podawano we wlewie solankę o pH 4 przez taki sam okres czasu. Wygląd i usposobienie szczurów monitorowano regularnie, a uwagi na temat ich zachowania rejestrowano co 1-3 godziny podczas dnia roboczego.
Zwierzęta znieczulono 5% izofiuranem w komorze odparowywacza Fiuotec 3 (Abbot Laboratories, NDC 0074- 3292-02) w 100% tlenie przy szybkości przepływu 1,5 do 2 litrów na minutę. Próbki krwi otrzymano w trakcie wlewu dożylnego poprzez nakłucie serca stosując igłę o rozmiarze 23 dołą3 czoną do powleczonej heparyną strzykawki na 3 cm3. Krew od każdego zwierzęcia podzielono pomiędzy probówki Microtainer zawierające K2-EDTA (Becton Dickinson, 36/5974) i probówki Microtainer z żelem oddzielającym dla surowicy (Becton Dickinson, 36/5956) i heparyną litową w ceiu zebrania osocza (Becton Dickinson, 36/5958). Jeśli to możliwe, z pęcherza usunięto mocz stosując igłę o roz3 miarze 23 dołączoną do strzykawki na 3 cm3. Próbki tkanki zebrano w następującej kolejności: wątroba, nerki, jelito cienkie, pęcherz i szpik kostny. W celu otrzymania reprezentatywnych próbek jelito cienkie podzielono na trzy równe części: dwunastnicę, jelito czcze i jelito cienkie; masę kałową usunięto ręcznie delikatnie przesuwając nacisk posługując się tępymi szczypczykami. W celu przeprowadzania badań histologicznych część każdej tkanki umieszczono w 10% buforowanej formaiinie. W ceiu oceny liczby komórek jądrzastych szpiku kostnego, próbki szpiku kostnego wypłukano z jam szpikowych z kości udowych stosując 1 mi PBS (bez Ca++ iub Mg++), dokładnie roztarto i wytrząsano w celu oddzielenia komórek.
Do zliczania komórek, 50 μi krwi potraktowanej EDTA lub wypłuczyn szpiku kostnego zawieszonego w PBS, zmieszano z odpowiednio 450 μi iub 950 μi roztworu do wybarwiania jąder komórkowych zawierającego 0,19 mg/mi fioietu krystaiicznego (Sigma nr C-1658, seria 112H3660) w 1 M kwasie octowym, i inkubowano w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut. Po krótkim wytrząsaniu, 10 μi próbki mieszaniny umieszczono w hemocytometerze i zliczono komórki posługując się mikroskopem Nikon Optiphot-2. Aby ocenić liczbę komórek jednojądrzastych (limfocytów i monocytów) i granulocytów obojętnochłonnych (PMN, w tym granulocyty typu neutrofiiowego, eozynofiiowego i bazofiiowego) próbki krwi zliczano stosując obiektyw 40x. Posiadające jądro komórki szpiku kostnego zliczano stosując obiektyw 10x.
Potraktowane EDTA próbki krwi przekazano do LabCorp (San Diego, CA) do anaiizy hematoiogicznej obejmującej określenie liczby erytrocytów i płytek krwi, poziomu hemoglobiny i hematokrytu. W LabCorp przeprowadzono także analizę chemii osocza. W ceiu wybarwienia skrawków tkanki hematoksyliną/eozyną oraz oceny histopatologicznej próbki tkanek od myszy doświadczalnych opatrzono kodem i przetransportowano w formaiinie do Comparative Biosciences (Mountain View, CA).
Wyniki:
Związek A był dobrze tolerowany w dużych dawkach bez znaczących różnic w zachowaniu pomiędzy zwierzętami otrzymującymi lek, otrzymującymi rozczynnik lub niczym nie traktowanymi zwierzętami kontrolnymi. W trakcie sekcji zauważono, że żołądki wszystkich poddanych perfuzji zwierząt były puste, lecz nie zaobserwowano żadnych innych różnic. Przed iub w trakcie procedury wiewu nie mierzono masy ciała ani zużycia pożywienia.
PL 212 929 B1
Krew, szpik kostny oraz skrawki tkanki badano pod kątem wielu parametrów. Jedną sprawą była hepatotoksyczność po ekspozycji na związek A w wysokim stężeniu lub widoczne toksyczności związane z preparatem. Jak opisano powyżej, w ciągu 24 godzin trwania doświadczenia nie zauważono widocznej toksyczności. Wszystkie parametry dotyczące chemii osocza i hematologii mieściły się na ogół w prawidłowych zakresach. Kilka próbek spowodowało zwiększenie obserwowanych wartości oddalonych w porównaniu z opublikowanymi w piśmiennictwie, lecz nie różniły się one od wartości dla niczym nie traktowanych zwierząt kontrolnych lub nie uznano je za związane z toksycznością. Spośród wszystkich badanych parametrów osocza, jedynie poziom triglicerydów osocza był wyższy niż prawidłowy.
W celu zbadania potencjalnego szybkiego wpływu na parametry hematologiczne zliczono liczbę jednojądrzastych komórek krwi, PMN oraz komórek szpiku kostnego. W tym krótkim okresie czasu nie oczekiwano wystąpienia znaczących lub zauważalnych różnic. I rzeczywiście, nie wykryto różnic w obrębie jednojądrzastych komórek krwi lub komórek PMN między zwierzętami niczym nie traktowanymi, otrzymującymi rozczynnik lub lek. Posiadające jądro komórki szpiku kostnego nie różniły się także między zwierzętami otrzymującymi rozczynnik i otrzymującymi lek.
Wszystkie próbki tkanki wątroby, nerki, jelita cienkiego (dwunastnica, jelito czcze, jelito cienkie) oraz pęcherza moczowego oceniane były przez patologa. W żadnej spośród próbek nie zauważono znaczących zmian histopatologicznych.
Wnioski:
Związek A podawany w ciągłym wlewie dożylnym w wysokich dawkach co najmniej przez pierwsze 24 godziny był dobrze tolerowany przez szczury.
P r z y k ł a d I: Farmakologia bezpiecznego stosowania związku w badaniu 5-dniowym u myszy
Bezpieczeństwo związku C w stosunku do bezpieczeństwa macierzystego związku araC oceniano u normalnych samców myszy w 5-dniowym badaniu z podawaniem powtarzanych dawek.
Metody:
AraC zakupiono z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, nr kat. C1768, nr serii 39H5962). Związek C i araC rozpuszczono w sterylnej solance fizjologicznej. Roztwory podstawowe przygotowywano codziennie z uprzednio zważonego leku. Wszystkie stężenia, z wyjątkiem najwyższych, uzyskano przez rozcieńczenie roztworów podstawowych stosując dodatkową sterylną solankę. Każdy lek, którego nie wykorzystano natychmiast, umieszczono w chłodni i zastosowano w ciągu 24 godzin. Wszystkie proleki dawkowano w molowych równoważnikach cytarabiny (CE).
Samcom myszy NIH Swiss Webster (masa ciała 25 do 33 g, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wstrzykiwano dootrzewnowo związek C-araC lub rozczynnik jeden raz dziennie w dniach 0-4, około 3 do 4 godzin po rozpoczęciu w wiwarium fazy jasnej cyklu. Dawki dla związku C wynosiły 1000, 300, 100 i 30-mg/kg równoważników nukleozydu/dobę (odpowiadające dawce 1848, 554, 185 i 55,4 mg/kg/dobę) podczas gdy araC podawano w dawce 100, 30, 10 i 3 mg/kg/dobę. Rozczynnikiem była solanka. Masy ciała rejestrowano w dniach 0-4 bezpośrednio przed podaniem związku i w dniu 5 przed uśmierceniem. Wszystkie myszy uśmiercono w dniu 5 (23-25 godzin po ostatniej dawce dootrzewnowej) przez skrwawienie przy znieczuleniu halotanem oraz późniejsze przemieszczenie kręgów szyjnych. Krew każdego zwierzęcia zanalizowano pod kątem chemii krwi i parametrów hematologicznych tak jak to opisano w przykładzie H. Wyizolowano wątroby i utrwalono w 10% formalinie zbuforowanej do odczynu obojętnego, szpik kostny wypłukano z prawej kości udowej stosując 1 ml PBS bez wapnia lub magnezu, a liczbę komórek posiadających jądro zmierzono tak jak w przykładzie H.
Potraktowane EDTA próbki krwi przekazano do LabCorp (LabCorp, San Diego, CA) do analizy hematologicznej obejmującej określenie liczby erytrocytów i płytek krwi, poziomu hemoglobiny i hematokrytu. W LabCorp przeprowadzono także analizę chemii osocza. W celu wybarwienia skrawków tkanki hematoksyliną/eozyną oraz oceny histopatologicznej próbki tkanek od myszy otrzymujących rozczynnik lub 100 mg/kg araC lub 1000 mg/kg CE związku C opatrzono kodem i przetransportowano w formalinie do Comparative Biosciences (Mountain View, CA). Kody próbek w badaniach histopatologicznych były takie jak następuje: nr 1-7, związek C 1000 mg/kg/dobę; nr 33-40, araC 100 mg/kg/dobę; nr 65-72, rozczynnik - solanka.
Wyniki przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy dla 5-8 zwierząt w grupie dla dawki. W przypadku wybranych parametrów hematologicznych, dane dla każdego zwierzęcia przedstawiono także jako % średniej z grupy rozczynnikowej. Analizę statystyczną przeprowadzono jednoczynnikową metodą ANOVA, po której przeprowadzono test Dunnetta post-hoc pod kątem różnic pomiędzy grupą
PL 212 929 B1 kontrolną i grupami otrzymującymi dawki wielokrotne. Za istotną statystycznie uznano wartość p poniżej 0,05.
Wyniki:
Myszom wstrzykiwano dootrzewnowo związek C lub araC w różnych dawkach przez 5 dni i uśmiercono je 24 godziny po otrzymaniu ostatniej dawki. W oparciu o ocenę zachowania i ogólnego wyglądu nie stwierdzono, że żadna z myszy nie zachorowała w sposób widoczny. Chociaż araC przy najwyższej dawce spowodował postępujący i istotny statystycznie spadek masy ciała (fig. 3a, 100 mg/kg/dobę), związek C nie wykazał żadnego znaczącego wpływu, nawet w najwyższej dawce (1000 mg/kg/dobę równoważników nukleozydu) (fig. 3b).
W dawce 30 i 100 mg/kg/dobę, araC powodował znaczny spadek liczby komórek posiadających szpik kostny, krążących PMN, komórek jednojądrzastych i płytek krwi (fig. 4). Przy najwyższej dawce araC, komórkowość szpiku kostnego spadła do 11% wartości obserwowanej u zwierząt otrzymujących rozczynnik. W celu zmniejszenia liczby posiadających jądro komórek szpiku kostnego potrzebna była 30-krotnie większa dawka związku C (1000 mg/kg/dobę równoważników nukleozydu) (fig. 4a). W odróżnieniu od araC, związek C w żadnej dawce nie wpływał na liczbę PMN, komórek jednojądrzastych lub płytek krwi (fig. 4b-d).
AraC i związek C miały znaczny wpływ na parametry czerwonych krwinek, lecz przy 10-krotnie wyższych dawkach. AraC znacznie zmniejszał liczbę erytrocytów, poziom hematokrytu i hemoglobiny przy dwóch najwyższych dawkach, 30 i 100 mg/kg/dobę. Nieznaczny spadek hematokrytu obserwowano także przy podaniu araC w dawce 10 mg/kg/dobę. Związek C miał podobny wpływ na te parametry, lecz przy 10-krotnie wyższych dawkach.
Analiza chemii osocza wskazała, że na większość analitów nie miał wpływu żaden związek. Specyficznie, parametry w teście czynnościowym wątroby (bilirubina, AST i ALT) były podobne u zwierząt otrzymujących rozczynnik, araC lub związek C. Jedynie przy najwyższej dawce araC poziom zasadowej fosfataza był znacznie obniżony. Poziom albuminy i BUM pozostawał niezmieniony dla każdego doświadczenia. AraC w najwyższej dawce (100 mg/kg/dobę) obniżył poziom kreatyniny i glukozy. AraC w dawce 30 mg/kg/dobę i związek C w dawce 1000 mg/kg/dobę zmniejszył poziom glukozy. Jedynym obserwowanym wpływem związku C na jakikolwiek parametr chemii osocza był nieznaczny lecz znaczący wpływ związku C na poziom glukozy.
Histopatolog z Comparative Biosciences ocenił utrwalone w formalinie próbki wątroby, nerki i jelita cienkiego myszy otrzymujących rozczynnik lub 100 mg/kg araCor 1000 mg/kg CE związku C i w żadnej z próbek nie stwierdził zmian związanych z toksycznością
Wnioski:
Związek C był < 30-krotnie bezpieczniejszy niż araC w 5-dniowym doświadczeniu z powtarzanym podawaniem dawek pod kątem parametrów hematologicznych dotyczących posiadających jądro komórek szpiku kostnego, obwodowych PMN i komórek jednojądrzastych. Ani w przypadku związku C ani jego macierzystego związku, araC nie zaobserwowano hepatotoksyczności.
Powyżej udokumentowano przydatność związku o wzorze III (Związku A, izomer R, cis), w porównaniu do Związku B oraz związku racemicznego (Związek C). Na podstawie danych zamieszczonych powyżej Związek A aktywuje się 2,6 raza bardziej niż Związek B. Dodatkowo, Związek A wytwarza znacznie wyższe poziomy araCTP w wątrobie niż Związek B. Ponadto podanie Związku A powoduje większe poziomy araCTP w wątrobie w porównaniu ze Związkami B i C, z podobnymi poziomami proleków w osoczu, co sugeruje, że różnice wynikają z szybkości aktywacji a nie z farmakokinetyki. Taka zwiększona aktywacja Związku A w wątrobie w stosunku do jego izomeru - Związku B - oraz racematu (Związku C) oraz wynikające z tego zwiększone stężenie araCTP w tkance wątroby ma ogromne konsekwencje w praktyce i stanowi nieoczekiwany poziom wynalazczy.
W wyniku przeprowadzonych testów stwierdzono, że Związek A jest dobrze tolerowany przez szczury przy ciągłym wlewie w dużych dawkach przez co najmniej pierwsze 24 godziny (przykład H). Fakt, że Związek C jest ponad 30 razy bezpieczniejszy niż araC, dostarcza jedynie dodatkowego poparcia na bezpieczeństwo Związku A, związku który jest dobrze tolerowany i jest lepiej aktywowany niż Związek B czy Związek C.

Claims (9)

1. Związek o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
2. Związek określony zastrzeżeniem 1 stosowany do leczenia choroby wybranej spośród nowotworu wątroby, nowotworu okrężnicy oraz wirusowego zakażenia wątroby.
3. Związek według zastrz. 2, znamienny tym, że chorobą jest nowotwór wątrobowokomórkowy.
4. Związek według zastrz. 2, znamienny tym, że chorobą jest nowotwór jelita grubego.
5. Związek określony zastrzeżeniem 1 stosowany do zapobiegania nawrotom nowotworu wybranego z nowotworu wątroby lub nowotworu jelita, po leczeniu zachowawczym lub operacyjnym tego nowotworu u zwierzęcia.
6. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że zwierzę jest bez nowotworu.
7. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że zwierzę jest w remisji nowotworowej i podawanie związku o wzorze III zapobiega dalszemu rozwoju tego nowotworu.
8. Związek określony zastrzeżeniem 1 stosowany do zwiększania wskaźnika terapeutycznego cytarabiny w leczeniu choroby wybranej z nowotworu wątroby lub nowotworu jelita.
9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie skuteczną ilość związku określonego zastrzeżeniem 1; i farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik.
PL 212 929 B1
Rysunki
Fig. 1a
Czas do pobrania próbki (godziny)
Pig. la: Poziom araCTP w wątrobie, po podaniu samcom myszy NIH Swiss związku A i związku B w dawce 100 mg/kg CE za pomocą pojedynczego dootrzewnowego wstrzyknięcia w bolusie w czasie 0.
PL 212 929 B1
Fig. Ib
Poziom proleku w osoczu
Czas do pobrania próbki (godziny)
Fig. Ib: Poziom proleku w osoczu, po podaniu samcom myszy NIH Swiss związku A i związku B w dawce 100 mg/kg CE za pomocą- pojedynczego dootrzewnowego wstrzyknięcia w bolusie w czasie 0.
PL 212 929 B1
Fig. 1c
W ara-C w osoczu
Czas do pobrania próbki (godziny)
Fig. Ic: Poziom AraC w osoczu, po podaniu samcom myszy NIH Swiss związku A i związku B w dawce 100 mg/kg CE za pomocą pojedynczego dootrzewnowego wstrzyknięcia w bolusie w czasie 0.
PL 212 929 B1
Fig. 2a
O 8 16 24 32 40 48
Czas trwania wlewu (godziny) zw._ A *· zw. B zw. C
Fig. 2a: Poziom ara-CTP w wątrobie u szczura po podaniu proleku w ciągłym wlewie dożylnym. Zmiany w czasie poziomu araCTP w wątrobie w dwóch niezależnych badaniach określających aktywację związku A, B lub C.
PL 212 929 B1
PL 212 929 B1
PL 212 929 B1
Fig. 3b
Procent zmiany w stosunku do dnia
Dni
Fig.. 3b: Masa ciała wyrażona jako procent masy początkowej w funkcji czasu u myszy traktowanych związkiem C w dawkach 30-1000 mg/kg CE przez 5 dni za pomocą codziennego zastrzyku dootrzewnowego.
PL 212 929 B1
Fig. 4a
Komórki szpiku- kostnego (miliony/kość udowa)
1 10 100 1000
Dawka (mg/kg CE)
Fig. 4a: Wyniki hematologiczne po 5-dniowym podawaniu araC (puste koła) związku C (wypełnione kwadraty).
* wskazuje p<O,G5 w porównaniu z rozczynnikiem. J§drzaste komórki szpiku kostnego.
PL 212 929 B1
Fig, 4b
Komórki wielojądrzaste krwi obwodowej (tysiące/jil krwi)
1 10 100 1000 Dawka (mg/kg CE)
Fig. 4b: Wyniki hematologiczne po 5-dniowym podawaniu araC (puste kola) lub związku C (wypełnione koła) w porównaniu z solą fizjologiczną (wypełnione kwadraty). * wskazuje p<0,05 w porównaniu z rozczynnikiem.
Komórki wielojądrzaste krwi obwodowej (PMN).
PL 212 929 B1
Fig. 4c
Komórki jednojądrzaste {tysi3.ee/jjl krwi)
Dawka (mg/kg CE)
Fig. 4c: Wyniki hematologii po 5-dniowym podawaniu araC (puste koła) lub związku C (wypełnione koła) w porównaniu z solą fizjologiczną (wypełnione kwadraty).
* wskazuje p<0,05 w porównaniu z rozczynnikiem. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej.
PL 212 929 B1
Fig. 4d
Płytki krwi (tysiące/nl krwi)
Fig. 4d: Wyniki hematologii po 5-dniowym podawaniu^araC, (puste koła) lub związku C (wypełnione koła) w porównaniu z solą fizjologiczną (wypełnione kwadraty).
* wskazuje p<0,05 w porównaniu z rozczynnikiem. Płytki krwi.
PL376327A 2002-10-31 2003-10-31 Pochodna cytarabiny, jej zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ta pochodna PL212929B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42321102P 2002-10-31 2002-10-31
US42325902P 2002-10-31 2002-10-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL376327A1 PL376327A1 (pl) 2005-12-27
PL212929B1 true PL212929B1 (pl) 2012-12-31

Family

ID=32314479

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL376327A PL212929B1 (pl) 2002-10-31 2003-10-31 Pochodna cytarabiny, jej zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ta pochodna
PL03376474A PL376474A1 (pl) 2002-10-31 2003-10-31 Nowe cykliczne diestry fosforanowe 1,3-propano-1-arylodioli i ich zastosowanie do wytwarzania proleków

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL03376474A PL376474A1 (pl) 2002-10-31 2003-10-31 Nowe cykliczne diestry fosforanowe 1,3-propano-1-arylodioli i ich zastosowanie do wytwarzania proleków

Country Status (13)

Country Link
US (4) US7151092B2 (pl)
EP (2) EP1556398B1 (pl)
JP (2) JP4689274B2 (pl)
KR (2) KR101115210B1 (pl)
AT (1) ATE442375T1 (pl)
AU (2) AU2003286816B2 (pl)
BR (2) BR0315795A (pl)
CA (2) CA2503729C (pl)
DE (1) DE60329211D1 (pl)
IL (2) IL167984A (pl)
MX (2) MXPA05004503A (pl)
PL (2) PL212929B1 (pl)
WO (2) WO2004041837A1 (pl)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312662B1 (en) * 1998-03-06 2001-11-06 Metabasis Therapeutics, Inc. Prodrugs phosphorus-containing compounds
EP2223927B1 (en) * 2002-05-13 2014-10-15 Metabasis Therapeutics, Inc. Salts of a phosphonic acid based prodrug of PMEA
WO2003095665A2 (en) * 2002-05-13 2003-11-20 Metabasis Therapeutics, Inc. Pmea and pmpa cyclic producing synthesis
BR0315795A (pt) 2002-10-31 2005-09-13 Metabasis Therapeutics Inc Pró-medicamentos de monofosfato de citarabina
US20050182252A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Reddy K. R. Novel 2'-C-methyl nucleoside derivatives
CA2565966A1 (en) * 2004-06-08 2005-12-29 Metabasis Therapeutics, Inc. Lewis acid mediated synthesis of cyclic esters
WO2007022073A2 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Merck & Co., Inc. Novel 2'-c-methyl and 4'-c-methyl nucleoside derivatives
US20070241502A1 (en) * 2006-04-14 2007-10-18 Campbell Darrell C Poker game and apparatus for play thereof
US7584968B2 (en) * 2006-04-14 2009-09-08 Seven Generations, Inc. Poker game and apparatus for play thereof
AR069740A1 (es) * 2007-11-29 2010-02-17 Metabasis Therapeutics Inc Compuestos nucleosidos antivirales
BRPI0821106A2 (pt) * 2007-11-29 2015-06-16 Ligand Pharm Inc Pró-fármacos de nucleosídeo e usos dos mesmos
EP2279011B1 (en) 2008-04-30 2017-10-25 Siemens Medical Solutions USA, Inc. Substrate based pet imaging agents
CN101787064B (zh) * 2009-01-23 2013-03-13 高峰 阿糖胞苷衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途
JP5631414B2 (ja) * 2010-01-15 2014-11-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ ホスホ置換アルコキシアミン化合物
WO2011113174A1 (zh) * 2010-03-15 2011-09-22 Gao Feng 阿糖胞苷衍生物及其在抗癌抗肿瘤中的用途
RU2732440C2 (ru) * 2013-06-24 2020-09-16 Кэнбас Ко., Лтд. Пептиды и пептидомиметики для комбинированного применения и лечения в субпопуляциях пациентов с раковыми заболеваниями
GB201317166D0 (en) * 2013-09-27 2013-11-06 Astex Therapeutics Ltd Pharmaceutical compounds
AU2015217221A1 (en) 2014-02-13 2016-08-11 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and their uses
CN106687118A (zh) 2014-07-02 2017-05-17 配体药物公司 前药化合物及其用途
AU2016301188A1 (en) 2015-08-06 2018-02-15 Chimerix, Inc. Pyrrolopyrimidine nucleosides and analogs thereof useful as antiviral agents
US11058701B2 (en) 2015-12-03 2021-07-13 Biosight Ltd. Cytarabine conjugates for cancer therapy
US12071450B2 (en) 2015-12-03 2024-08-27 Biosight Ltd. Salts of conjugates for cancer therapy
AU2016362239B2 (en) * 2015-12-03 2021-03-25 BioCytara Ltd. Salts of conjugates for cancer therapy
US12064445B2 (en) 2015-12-03 2024-08-20 Biosight Ltd. Cytarabine conjugates for cancer therapy
JP6775591B2 (ja) * 2016-09-20 2020-10-28 株式会社島津製作所 両親媒性ブロックポリマーを用いた薬剤内包分子集合体
ES3011607T3 (en) 2017-09-21 2025-04-07 Chimerix Inc Morphic forms of 4-amino-7-(3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2-methyl-7h-pyrrolo(2,3-d)pyrimidine-5-carboxamide and uses thereof
CN109956985A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 肝递送阿糖胞苷前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用
CA3087932A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Acetal compounds and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL222157A (pl) * 1956-12-20
US3116282A (en) * 1960-04-27 1963-12-31 Upjohn Co Pyrimidine nucleosides and process
US3328388A (en) 1964-09-02 1967-06-27 Merck & Co Inc Arabinofuranosyl pyrimidines and methods of preparing same
US4440740A (en) * 1982-04-26 1984-04-03 Merck & Co., Inc. α-Keto aldehydes as enhancing agents of gastro-intestinal drug absorption
US4579849A (en) 1984-04-06 1986-04-01 Merck & Co., Inc. N-alkylguanine acyclonucleosides as antiviral agents
FR2562543B1 (fr) * 1984-04-10 1987-09-25 Elf Aquitaine Nouveaux phosphonites cycliques, leur preparation et applications
US4749694A (en) * 1984-04-26 1988-06-07 Merck & Co., Inc. Novel lysine esters used as absorption
US4537772A (en) * 1984-05-02 1985-08-27 Merck & Co., Inc. Enhancing absorption of drugs from gastrointestinal tract using acylcarnitines
NL8403224A (nl) 1984-10-24 1986-05-16 Oce Andeno Bv Dioxafosforinanen, de bereiding ervan en de toepassing voor het splitsen van optisch actieve verbindingen.
US4729989A (en) * 1985-06-28 1988-03-08 Merck & Co., Inc. Enhancement of absorption of drugs from gastrointestinal tract using choline ester salts
US4822773A (en) * 1985-06-28 1989-04-18 Merck & Co., Inc. Enhancement of absorption of drugs from gastrointestinal tract using choline ester salts
US4973579A (en) * 1985-06-28 1990-11-27 Merck & Co., Inc. Enhancment of absorption of drugs from gastrointestinal tract using choline ester salts
US4731360A (en) * 1985-08-16 1988-03-15 Merck & Co., Inc. Acylcarnitines as absorption-enhancing agents for drug delivery through mucous membranes of the nasal, buccal, sublingual and vaginal compartments
US4692441A (en) * 1985-08-16 1987-09-08 Merck & Co., Inc. Chorine esters as absorption-enhancing agents for drug delivery through mucous membranes of the nasal, buccal, sublingual and vaginal cavities
US4847298A (en) * 1985-08-16 1989-07-11 Merck & Co., Inc. Acylcarnitines as absorption-enhancing agents for drug delivery through mucous membranes of the nasal, buccal, sublingual and vaginal compartments
US4963525A (en) * 1985-08-16 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Acylcarnitines as absorption-enhancing agents for drug delivery through mucous membranes of the nasal, buccal, sublingual and vaginal compartments
US4963556A (en) * 1985-08-16 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Choline esters as absorption-enhancing agents for drug delivery through mucous membranes of the nasal, buccal, sublingual and vaginal cavities
US5159067A (en) * 1987-01-28 1992-10-27 University Of Georgia Research Foundation Inc. 5'-Diphosphohexose nucleoside pharmaceutical compositions
US5077280A (en) * 1988-04-12 1991-12-31 Brown University Research Foundation Treatment of viral infections
EP0338372A3 (en) 1988-04-22 1991-10-09 American Cyanamid Company Solubilized pro-drugs
CA1334752C (en) 1988-08-02 1995-03-14 Ryozo Sakoda Drug effect-enhancing agent for antitumor drug
US5658889A (en) * 1989-01-24 1997-08-19 Gensia Pharmaceuticals, Inc. Method and compounds for aica riboside delivery and for lowering blood glucose
US5118672A (en) * 1989-07-10 1992-06-02 University Of Georgia Research Foundation 5'-diphosphohexose nucleoside pharmaceutical compositions
EP0533833B1 (en) 1990-06-13 1995-12-20 GLAZIER, Arnold Phosphorous produgs
EP0481214B1 (en) * 1990-09-14 1998-06-24 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Prodrugs of phosphonates
WO1993016388A1 (en) * 1992-02-13 1993-08-19 The Uab Research Foundation Method of detecting and monitoring levels of 3'-amino-3'-deoxythymidine in body fluids and antibodies for same
GB2266527A (en) 1992-03-17 1993-11-03 Merck & Co Inc Substituted azetidinones useful in the treatment of leukemia
GB2266525A (en) 1992-03-17 1993-11-03 Merck & Co Inc Substituted cephalosporin sulfone compositions useful in the treatment of leukemia
AU685128B2 (en) 1993-05-21 1998-01-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The New procedure to block the replication of reverse transcriptase dependent viruses by the use of inhibitors of deoxynucleotides synthesis
ATE199906T1 (de) * 1993-06-29 2001-04-15 Mitsubishi Chem Corp Phosphonat-nukleotid ester-derivate
US5567689A (en) * 1993-08-13 1996-10-22 The Uab Research Foundation Methods for increasing uridine levels with L-nucleosides
CA2171550C (en) * 1993-09-10 2008-08-26 Raymond F. Schinazi Nucleosides with anti-hepatitis b virus activity
FR2709754B1 (fr) 1993-09-10 1995-12-01 Centre Nat Rech Scient Composés 2' ou 3'-déoxy- et 2', 3'-didéoxy-beta-L-pentofuranonucléosides, procédé de préparation et application thérapeutique, notamment anti-virale.
US20020120130A1 (en) * 1993-09-10 2002-08-29 Gilles Gosselin 2' or 3' -deoxy and 2', 3' -dideoxy-beta-L-pentofuranonucleo-side compounds, method of preparation and application in therapy, especially as anti- viral agents
EP0719273B1 (en) 1993-09-17 2010-11-03 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
US5437772A (en) 1993-11-01 1995-08-01 The Electrosynthesis Co., Inc. Portable lead detector
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
US6143864A (en) * 1994-06-28 2000-11-07 Merck & Co., Inc. Peptides
DE69520360T2 (de) 1994-07-04 2001-08-09 Takeda Chemical Industries, Ltd. Phosphonsäure verbindungen imre herstellung und verwendung
US5665713A (en) * 1995-04-12 1997-09-09 Procter & Gamble Company Pharmaceutical composition for inhibiting the growth of viruses and cancers
PT831852E (pt) * 1995-06-07 2007-02-28 Uab Research Foundation Nucleósidos com actividade anti-vírus da hepatite b
ATE253920T1 (de) 1995-07-17 2003-11-15 Cephalon Inc Phosphor enthaltende hemmer von cystein- und serin-proteasen
US5750493A (en) * 1995-08-30 1998-05-12 Raymond F. Schinazi Method to improve the biological and antiviral activity of protease inhibitors
RU2111970C1 (ru) 1996-06-25 1998-05-27 Иван Игоревич Федоров 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды
US6177404B1 (en) * 1996-10-15 2001-01-23 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5948750A (en) * 1996-10-30 1999-09-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
DE69819311T2 (de) * 1997-03-07 2004-07-29 Metabasis Therapeutics Inc., San Diego Neue benzimidazol inhibitoren der fructose-1,6-bisphosphatase
US6284748B1 (en) * 1997-03-07 2001-09-04 Metabasis Therapeutics, Inc. Purine inhibitors of fructose 1,6-bisphosphatase
US6054587A (en) * 1997-03-07 2000-04-25 Metabasis Therapeutics, Inc. Indole and azaindole inhibitors of fructose-1,6-bisphosphatase
US6130504A (en) * 1997-07-11 2000-10-10 Sharp Kabushiki Kaisha Plasma addressing display device and method for producing the same
US6391305B1 (en) * 1997-09-10 2002-05-21 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20020115596A1 (en) * 1997-10-27 2002-08-22 Merk & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6312662B1 (en) * 1998-03-06 2001-11-06 Metabasis Therapeutics, Inc. Prodrugs phosphorus-containing compounds
CA2322487C (en) * 1998-03-06 2010-07-20 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel prodrugs for phosphorus-containing compounds
CA2335617C (en) * 1998-06-24 2009-12-15 Novirio Pharmaceuticals Limited Use of 3'-azido-2',3'-dideoxyuridine in combination with further anti-hiv drugs for the manufacture of a medicament for the treatment of hiv
IT1305313B1 (it) * 1998-07-17 2001-05-04 Colla Paolo 3,4 - diidro- 6- benzil-4-oxopirimidine sostituite e relativo processodi produzione e impiego nella terapia delle infezioni da hiv-1.
US6444652B1 (en) * 1998-08-10 2002-09-03 Novirio Pharmaceuticals Limited β-L-2'-deoxy-nucleosides for the treatment of hepatitis B
PT2415776T (pt) * 1998-08-10 2016-07-07 Novartis Ag Beta-l-2'-desoxi-nucleosidos para o tratamento da hepatite b
KR100818845B1 (ko) * 1998-09-09 2008-04-01 메타베이시스 테라퓨틱스, 인크. 신규한 프럭토스 1,6-비스포스파타제의 헤테로방향족 억제제
WO2000026225A2 (en) * 1998-11-05 2000-05-11 Centre National De La Recherche Scientifique Nucleosides with anti-hepatitis b virus activity
US6407077B1 (en) * 1998-11-05 2002-06-18 Emory University β-L nucleosides for the treatment of HIV infection
MXPA01008937A (es) 1999-03-05 2004-04-05 Metabasis Therapeutics Inc Nuevos profarmacos que contienen fosforo.
AU7361400A (en) * 1999-09-08 2001-04-10 Metabasis Therapeutics, Inc. Prodrugs for liver specific drug delivery
AU3653301A (en) * 2000-01-28 2001-08-07 Merck & Co., Inc. Treatment or prevention of prostate cancer with a cox-2 selective inhibiting drug
JP2003522790A (ja) * 2000-02-17 2003-07-29 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｃｏｘ−２選択的阻害薬を用いた前立腺癌の治療または予防
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
EA005890B1 (ru) * 2000-05-26 2005-06-30 Айденикс (Кайман) Лимитед СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ β-L-2'-ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДОВ
EP1736478B1 (en) 2000-05-26 2015-07-22 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses
US6875751B2 (en) * 2000-06-15 2005-04-05 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3′-prodrugs of 2′-deoxy-β-L-nucleosides
WO2002040021A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Idenix (Cayman) Limited Methods for inhibiting the transmission of hiv using topically applied substituted 6-benzyl-4-oxopyrimidines
SK286630B6 (sk) * 2001-01-22 2009-02-05 Merck & Co., Inc. Nukleozidové deriváty, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
US6710068B2 (en) * 2001-04-11 2004-03-23 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Phenylindoles for the treatment of HIV
US20030232760A1 (en) * 2001-09-21 2003-12-18 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20040006002A1 (en) * 2001-09-28 2004-01-08 Jean-Pierre Sommadossi Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses using 4'-modified nucleoside
EP1435974A4 (en) * 2001-09-28 2006-09-06 Idenix Cayman Ltd METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C VIRUS USING 4 'MODIFIED NUCLEOSIDES
EP2223927B1 (en) * 2002-05-13 2014-10-15 Metabasis Therapeutics, Inc. Salts of a phosphonic acid based prodrug of PMEA
WO2003095665A2 (en) * 2002-05-13 2003-11-20 Metabasis Therapeutics, Inc. Pmea and pmpa cyclic producing synthesis
TW200500375A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenix Cayman Ltd Modified 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae
PL374792A1 (pl) 2002-06-28 2005-10-31 Idenix (Cayman) Limited Proleki 2' i 3'-nukleozydowe do leczenia infekcjiFlaviviridae
CN1678326A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒感染的2'－c－甲基－3'－o－l－缬氨酸酯核糖呋喃基胞苷
BR0315795A (pt) * 2002-10-31 2005-09-13 Metabasis Therapeutics Inc Pró-medicamentos de monofosfato de citarabina

Also Published As

Publication number Publication date
JP5046219B2 (ja) 2012-10-10
JP2006504791A (ja) 2006-02-09
WO2004041834A2 (en) 2004-05-21
BR0315795A (pt) 2005-09-13
IL167990A (en) 2010-12-30
WO2004041834A3 (en) 2004-07-01
US7151092B2 (en) 2006-12-19
PL376327A1 (pl) 2005-12-27
KR20050083879A (ko) 2005-08-26
AU2003287389A1 (en) 2004-06-07
IL167984A (en) 2011-09-27
CA2503729C (en) 2012-09-18
US20070021388A1 (en) 2007-01-25
KR101026294B1 (ko) 2011-03-31
ATE442375T1 (de) 2009-09-15
JP4689274B2 (ja) 2011-05-25
US20070037774A1 (en) 2007-02-15
KR20050072776A (ko) 2005-07-12
CA2503730C (en) 2011-10-18
BR0315806A (pt) 2005-09-13
US20040192651A1 (en) 2004-09-30
US20040092476A1 (en) 2004-05-13
AU2003287389B2 (en) 2010-08-12
EP1556393A2 (en) 2005-07-27
US7148349B2 (en) 2006-12-12
EP1556393B1 (en) 2013-12-25
MXPA05004504A (es) 2005-08-16
PL376474A1 (pl) 2005-12-27
CA2503729A1 (en) 2004-05-21
EP1556398B1 (en) 2009-09-09
EP1556398A1 (en) 2005-07-27
WO2004041837A1 (en) 2004-05-21
US7553826B2 (en) 2009-06-30
KR101115210B1 (ko) 2012-04-12
AU2003286816A1 (en) 2004-06-07
CA2503730A1 (en) 2004-05-21
JP2006507308A (ja) 2006-03-02
US7498320B2 (en) 2009-03-03
AU2003286816B2 (en) 2010-08-19
MXPA05004503A (es) 2005-08-16
DE60329211D1 (de) 2009-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL212929B1 (pl) Pochodna cytarabiny, jej zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ta pochodna
EP3665179B1 (en) Selective inhibitors of protein arginine methyltransferase 5 (prmt5)
JP4741725B2 (ja) リン含有化合物のための新規なプロドラッグ
DK3031812T3 (en) CHEMICAL COMPOUNDS
JP2024160265A (ja) ＨＣＶ治療に対するβ－Ｄ－２’－デオキシ－２’－α－フルオロ－２’－β－Ｃ－置換－２－修飾－Ｎ６－置換プリンヌクレオチド
CN109553651B (zh) 4’-硫代核苷的新型化合物及其制备方法、药物组合物和应用
WO2018013937A1 (en) Beta-d-2&#39;-deoxy-2&#39;-alpha-fluoro-2&#39;-beta-c-substituted-4&#39;-fluoro-n6-substituted-6-amino-2-substituted purine nucleotides for the treatment of hepatitis c virus infection
EP3820879B1 (en) Phosphorus-containing prodrugs of gemcitabine
ZA200503252B (en) Novel cytarabine monophosphate prodrugs
KR102776475B1 (ko) 아민, 아미드 및 페놀 전달에 유용한 프로드러그 플랫폼
WO2023041786A1 (en) 5-fluorouracil derivatives as prodrugs for cancer treatment
HK40069170A (en) Phosphoramidate derivatives of 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
CN119569783A (zh) 一种磷酰胺类前药及制备方法和用途