KR20050083879A - 신규 시타라빈 모노포스페이트 전구약물 - Google Patents

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KR20050083879A
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메타베이시스 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고; 상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고; V는 4-피리딜인 화학식 I의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염, 이들의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

신규 시타라빈 모노포스페이트 전구약물 {NOVEL CYTARABINE MONOPHOSPHATE PRODRUGS}
본 발명은 1,3 프로판-1-아릴 디올의 특정 신규 시타라빈 모노포스페이트 (araCMP) 시클릭 디에스테르, 이들의 제조 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 시스 입체화학성을 갖는 1,3 프로판-1-(4-피리딜) 디올의 시타라빈 모노포스페이트 (araCMP) 시클릭 디에스테르 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경 기술에 대한 하기의 설명은 본 발명을 이해하는데 도움을 주기 위한 것으로, 본 발명에 대한 선행 기술을 수용하거나 기술하기 위한 것이 아니다. 모든 공보는 이의 전문을 참고로 인용한다.
araC는 뉴클레오시드 전달체를 통해 세포 내로 전달되고, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 키나제에 의해 활성 대사물 araC 트리포스페이트 (araCTP)로 인산화되는 데옥시시티딘의 유사체이다. 이는 급성 비림프구성 백혈병을 치료하는데 사용되는 가장 성공적인 약물 중 하나이지만, 필수적인 뉴클레오시드 키나제가 간에서는 낮은 수준으로 발현되기 때문에 간세포 암종 ("HCC")에 대한 치료에는 비효과적이다 (Arner et al. Pharmacol. Ther. 67 (2): 155-86, (1995); Ruiz van Haperen et al. Semin. Oncol. 22 Suppl 11 (4): 35-41, (1995)). 그러나, 상기 키나제는 관련된 투여량-제한 독성을 일으키는 독성의 표적 기관 (예를 들어, 골수)에서는 높은 발현을 유지한다. araC의 시클릭 전구약물은 높은 농도의 araCTP를 CYP3A4-발현 간 및 HCC 세포에 특이적으로 전달함으로써 간에서 araC의 유효성을 개선시키는 잠재성을 제공한다. araC의 모노포스페이트인 araCMP로서의 이의 전달은 우회하여 옥시시티딘 키나제, 데옥시시티딘 데아미나제 및 정상 세포 및 저항성 종양 세포에서 전달 활성을 제한하는 것으로 예상된다. 따라서, 1,3-프로판 디올의 araCMP 시클릭 디에스테르는 araC와 비교하여 인간에서 나타난 투여량-제한 골수억제를 일으키는 간 이외의 조혈기관 계통에 대한 독성은 감소시키면서 간에서는 증가된 항-종양 활성을 갖는다고 예측된다 (US 6,312,662 참고).
간염 및 간암은 투여량-제한 간외 부작용 또는 표적 조직으로 화학요법 제제의 부적절한 전달에 의해 현재 치료법으로 불량하게 치료되도록 남아있다. 본 접근에서의 제한은 약물 로딩량, 접합체의 제조 및 특성화의 복잡성 및 수용체 하향 조절을 포함한다. 따라서, 약물을 전달하는 방법, 예컨대 간으로의 araC를 전달하는 방법에 대한 요구가 여전히 있다.
도 1a는 화합물 A 및 화합물 B를 수컷 NIH 스위스 마우스에 100 mg/kg CE의 투여량으로 시간 0에 단일 복강내 일시 주사 투여하였을 때 간에서의 araCTP의 수준을 도식한다.
도 1b는 화합물 A 및 화합물 B를 수컷 NIH 스위스 마우스에 100 mg/kg CE의 투여량으로 시간 0에 단일 복강내 일시 주사 투여하였을 때 혈장에서의 전구약물의 수준을 도식한다.
도 1c는 화합물 A 및 화합물 B를 수컷 NIH 스위스 마우스에 100 mg/kg CE의 투여량으로 시간 0에 단일 복강내 일시 주사 투여하였을 때 혈장에서의 araC의 수준을 도식한다.
도 2a는 화합물 A, 화합물 B 또는 화합물 C를 연속 정맥내 주입에 의해 투여한 후 간에서의 araCTP의 수준을 도식한다.
도 2b는 화합물 A 또는 화합물 B으로 치료한 후 간 araCTP의 투여량 반응을 도식한다.
도 3a는 30-1000 mg/kg CE의 투여량의 araC를 5일 동안 매일 복강내 주사하여 치료한 마우스에서 시간의 함수로서 초기 중량의 백분율로서 표현된 체중을 도식한다.
도 3b는 30-1000 mg/kg CE의 투여량의 화합물 C를 5일 동안 매일 복강내 주사하여 치료한 마우스에서 시간의 함수로서 초기 중량의 백분율로서 표현된 체중을 도식한다.
도 4a는 염수 비히클에 대한 araC 또는 화합물 C로의 5일간 치료 후 혈액학 종점을 도식한다. 유핵 골수 세포.
도 4b는 염수 비히클에 대한 araC 또는 화합물 C로의 5일간 치료 후 혈액학 종점을 도식한다. 말초 혈액 다핵 세포 (PMN's).
도4c는 염수 비히클에 대한 araC 또는 화합물 C로의 5일간 치료 후 혈액학 종점을 도식한다. 말초 혈액 단핵 세포.
도 4d는 염수 비히클에 대한 araC 또는 화합물 C로의 5일간 치료 후 혈액학 종점을 도식한다. 혈소판.
발명의 요약
본 발명은 1,3 프로판-1-아릴 디올의 특정 신규 시타라빈 모노포스페이트 (araCMP) 시클릭 디에스테르, 이들의 제조 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 시스 입체화학성을 갖는 1,3 프로판-1-(4-피리딜) 디올의 시타라빈 모노포스페이트 (araCMP) 시클릭 디에스테르 분야에 관한 것이다.
본 발명의 일면은 하기 화학식 I의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염에 관한 것이다:
상기 식 중,
M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고;
상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고;
V는 4-피리딜이다.
또다른 면에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 염 및 전구약물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 하기 화학식 IV의 인산화 시약 및 임의로 보호되는 시타라빈을 커플링시키는 것을 포함하는, 화학식 III의 화합물의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
<화학식 III>
상기 식 중,
시타라빈의 5' 산소는 인에 부착된다.
상기 식 중,
L은 클로로 및 4-니트로페녹시로 이루어진 군으로부터 선택된다.
정의
본 발명에 따라서, 그리고, 본원에서 사용되는 바와 같이, 하기의 용어들은 달리 명백하게 진술하지 않는 한 하기와 같은 의미로 정의된다.
용어 "시스" 입체화학성은 6원 고리 상의 V 기 및 M 기의 관계를 말한다. 하기 화학식은 시스 입체화학성을 보여준다.
또다른 시스 입체화학성은 평면 위의 V 및 M 위치를 갖는다. 하기 화학식은 이러한 시스 입체화학을 보여준다.
용어 "S-배열", "S-이성질체" 및 "S-전구약물"은 탄소 C'의 절대 배열 S를 말한다. 하기 화학식은 S-입체화학성을 보여준다.
용어 "R-배열", "R-이성질체" 및 "R-전구약물"은 탄소 C'의 절대 배열 R을 말한다. 하기 화학식은 R-입체화학성을 보여준다.
용어 "거울상이성질체 과잉률 (％ e.e.)"은 광학 순도를 의미한다. 이는 하기 화학식을 사용하여 수득한다:
[R] - [S] × 100 = ％ R - ％ S
[R] + [S]
여기서, [R]은 R 이성질체의 양이고, [S]는 S 이성질체의 양이다. 이 화학식은 R이 우세한 이성질체일 때의 ％ e.e.를 제공한다.
용어 "입체이성질체생성 중심"은 의미한다.
용어 "d. e."는 부분입체이성질체 초과를 의미한다. 이는 하기 화학식을 사용하여 수득한다:
[시스] - [트랜스] × 100 = ％ [시스] - ％ [트랜스]
[시스] + [트랜스]
용어 "부분입체이성질체"는 동일한 치환기를 갖고, 동일한 유형의 화학 반응을 거치는 2개 이상의 비대칭 중심을 갖는 화합물을 말하며, 여기서 부분입체이성질체는 상이한 물리적인 특정을 갖고, 공간에서 상이한 상대적 위치를 차지하는 치환기를 가지며, 상이한 생물학적 특성을 갖는다.
용어 "라세미"는 광학적으로 활성이 아닌 동일한 양의 거울상이성질체 분자형의 분자으로 구성된 화합물 또는 혼합물을 말한다.
용어 "거울상이성질체"는 분자 구조가 서로 거울상- 관계를 갖는 분자의 쌍 모두를 말한다.
용어 "할로겐"은 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드 또는 플루오라이드를 말한다.
용어 "알킬"은 직쇄, 분지쇄 및 시클릭기를 비롯한 포화된 지방족 기를 말한다. 적합한 알킬기는 메틸, 에틸, 이소프로필 및 시클로프로필을 포함한다.
용어 "아릴"은 방향족 5 내지 6 고리 원자를 말한다. 적합한 아릴 기는 페닐, 푸라닐, 피리딜 및 티에닐을 포함한다. 아릴 기는 치환될 수 있다.
용어 "아릴옥시-"는 아릴-O-기를 말한다.
유기 라디칼 또는 화합물과 각각 관련하여 본원에서 언급된 용어 "저급"은 각각 10 개 이하, 6 개 이하, 유리하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 정의한다. 상기 기는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭일 수 있다.
용어 "임의로 치환되는" 또는 "치환된"은 독립적으로 저급 알킬, 저급 아릴 및 할로겐으로부터 선택되는 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 아릴 기를 포함한다. 바람직하게는 이들 치환기는 할로겐들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "제약상 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물 및 유기 또는 무기 산 또는 염기의 조합으로부터 유도된 화학식 I의 화합물의 염 및 이의 전구약물을 포함한다. 적합한 산은 아세트산, 아디프산, 벤젠술폰산, (+)-7,7-디메틸-2-옥소비시클로[2.2.1]헵탄-1-메탄술폰산, 시트르산, 1,2-에탄디술폰산, 도데실 술폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루코론산, 히푸르산, 히드로클로라이드, 헤미에탄올산, HBr, HCl, HI, 2-히드록시에탄술폰산, 락트산, 락토비온산, 말레산, 메탄술폰산, 브롬화메틸산, 메틸황산, 2-나프탈렌술폰산, 질산, 올레산, 4,4'-메틸렌비스[3-히드록시-2-나프탈렌카르복실산], 인산, 폴리갈락투론산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 술포살리시클릭산, 탄닌산, 타르타르산, 테레프탈산 및 p-톨루엔술폰산을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "전구약물"은 생물계에 투여될 때, 자발적인 화학 반응(들), 효소 촉매 화학 반응(들) 및(또는) 대사성 화학 반응(들) 또는 각각의 조합의 결과로 생물학적으로 활성인 화합물을 생성하는 임의의 M 화합물을 말한다. 표준 전구약물은 생체내에서 분해되는, 약물과 연관된 관능기, 예를 들어, HO-, HS-, HOOC-, R2N-에 부착된 기를 사용하여 형성된다. 표준 전구약물은 알킬, 아릴, 아르알킬, 아실옥시알킬, 알콕시카르보닐옥시알킬 뿐 아니라 히드록실, 티올 및 아민의 에스테르인 카르복실레이트 에스테르 (여기서, 부착된 기가 아실기, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 포스페이트 또는 술페이트임)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 기들은 총망라되지 않은 예시용이며, 당업자들은 기타의 공지된 다양한 전구약물을 제조할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 상기 전구약물은 본 발명의 범주 내에 속한다. 전구약물은 임의 형태의 화학적 변형 형태를 거쳐 생물학적으로 활성인 화합물 또는 생물학적으로 활성인 화합물의 전구체를 생성해야 한다. 특정 경우에 있어서, 전구약물은 약물 그 자체 보다 통상적으로 생물학적으로 활성이 적고, 향상된 경구 생체이용률, 약물동력학적 반감기 등을 통하여 약물 효능 또는 안전성을 개선시킨다. 생물학적으로 활성인 화합물은 예를 들어, 항암제 및 항바이러스제를 포함한다. 시타라빈의 특정 전구약물, 예를 들어, 아실화기가 팔미토실 또는 베하노일인 N4-아실화 시타라빈 (문헌 [Wechter et al., J. Med. Chem. 19 (8), 1013 (1976)] 참고)은 지질 용해성 및 막 수송이 증가할 뿐만 아니라 시티딘 데아미나제에 의한 탈아미노화를 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 알킬리덴 (즉, 이미노 기)과 같은 N4-에서의 다른기가 또한 가능하다. 이들 기는 생체내에서 제거되어 시타라빈의 4-아미노 기를 생성한다. 유사한 전구약물이 본 발명의 전구약물로 고려된다.
용어 "시클릭 1',3'-프로판 에스테르", "시클릭 1,3-프로판 에스테르", "시클릭 1',3'-프로파닐 에스테르" 및 "시클릭 1,3-프로파닐 에스테르"는 하기를 말한다:
용어 "4-피리딜", "피리드-4-일" 및 "4-피리디닐"은 하기를 말한다:
용어 "5' 산소"는 하기에서의 산소를 말한다:
용어 "N-함유 헤테로아릴 용매"는 고리 원자로서 1 내지 3개의 질소를 갖고, 4 < pka < 6인 헤테로아릴 기 및 비-N-함유 헤테로아릴 용매와의 임의의 혼합물이다.
용어 "N-히드록시-질소-함유 헤테로아릴"은 히드록시기가 질소 원자에 부착된 N-함유 헤테로아릴을 말한다. 예는 N-히드록시-벤조트리아졸이다.
용어 "N-함유 헤테로아릴"은 고리 원자로서 1 내지 3개의 질소를 가지고, 탄소 원자를 통해 부착된 헤테로아릴 기를 말한다.
용어 "전자-흡인 기"는 당업계에 인지되며, 이웃 원자로부터 원자가 전자를 끌어당기는 치환기의 경향을 의미한다 (즉, 치환기는 이웃 원자에 대해 전기음성임). 전자-끄는 능력의 수준은 하메트 (Hammett) 시그마 (δ) 상수에 의해 정량된다. 익히 공지된 이 상수는 다수의 참고문헌, 예를 들어, 문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 edition) pp. 251-259]에 기재되어 있다. 하메트 상수값은 일반적으로 전자 공여기에 대해서는 음수 (NH2에 대해 δp = -0.66)이고, 전자 끄는 기에 대해서는 양수 (니트로 기에 대해 δp = 0.78)이며, δp는 파라 치환을 나타낸다. 예시적인 전자-끄는 기는 니트로, 케톤, 알데히드, 술포닐, 트리플루오로메틸, -CN, 클로라이드 등을 포함한다.
용어 "이탈기"는 반응 중에 분해되었을 때 반응 동안 결합을 제공하는 인을 함유하지 않는 기질 분자의 일부를 말한다.
용어 "P450"은 시토크롬 P-450을 말한다. P450 효소는 간 및 기타 이들 효소를 함유하는 조직에 대량으로 발견된다. 특정한 P450 동종효소는 본 발명의 시클릭 포스포네이트를 산화시켜 궁극적으로는 자유 포스포네이트 또는 포스페이트를 생성시키는 원인이 된다. P450 효소는 모든 포유동물의 조직 및 세포에서 발견된다.
용어 "P450-발현 조직"은 본 발명의 시클릭 전구약물을 산화시키는 것으로 밝혀진 CYP3A4 동종효소 또는 임의의 다른 P450 동종효소를 함유하는 간 및 간 유사 조직 및 세포를 말한다. 문헌 [DeWaziers et al., J. Phare. Exp. Ther., 253, 387-394 (1990)]에 따라, CYP3A4는 인간에서 다음의 조직에 위치한다 (면역블롯팅 및(또는) 효소 측정으로 측정):
조직 간 활성의 ％
간 100
십이지장 50
공장 30
회장 10
결장 < 5 (단지 P450 동종효소만 발견됨)
위 < 5
식도 < 5
신장 발견되지 않음
용어 "P450-발현 조직의 질환"은 P450-발현 조직의 기능이 손상되어 조직이 더 이상 이들의 대사 기능을 수행할 수 없는 경우의 질환을 말한다. 이는 생화학적 최종 생성물을 과다생산하거나 감소시킬 수 있다. 이들 질환은 간 질환, 예컨대 원발성 또는 전이성 간암 (예를 들어, HCC), 간섬유증 또는 간경화; 간을 포함할 수 있고, 또한 원발성 또는 전이성 결장직장 암, 고지질혈증, 당뇨병, 및 바이러스 및 기생충 감염을 포함할 수 있는 그밖의 P450-발현 조직을 포함할 수 있는 질환을 포함한다.
용어 "임의로 보호되는 시타라빈"은 표준 보호기에 의한 시타라빈의 2' 및 3' 히드록실 기, 및 4-질소 기의 보호를 말한다.
용어 "증강"은 특정한 특성의 증가 또는 개선을 말한다.
용어 "강화"는 반응에 의해 생성된 특정한 이성질체의 양을 증가시키는 것을 말한다.
용어 "동시 투여"는 하나의 약을 투여와 동일한 시간 또는 가까운 시간에 또다른 약을 투여하는 것을 말한다. 바람직하게는 또다른 투여의 30 분 이내에 투여한다.
용어 "치료 지수" ("TI")는 목적하지 않은 반응, 예컨대 사망, 독성을 나타내는 마커의 상승 및(또는) 약리학적 부작용을 발생시키는 투여량에 대한 치료적으로 유리한 반응을 발생시키는 약물 또는 전구약물의 투여량의 비율을 말한다.
용어 "완화"는 질환의 증후의 중증도에서의 경감 또는 감소를 말한다.
용어 "암이 없는 상태"는 임의의 조직 또는 기관에서 악성 신생물 (암) 또는 전이의 존재를 나타내는 증거의 부족함을 말한다.
하기의 익히 공지된 화학물질을 명세서 및 청구범위에서 언급하였다. 약어 및 일반명을 또한 제공하였다.
CH2Cl2; 디클로로메탄 또는 염화메틸렌
DCM; 디클로로메탄 또는 염화메틸렌
(-)-DIP-Cl; (-)-β-클로로디이소피노캄페닐보란
DMAP; 4-디메틸아미노피리딘
DMF; 디메틸포름아미드
DMPU; 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논
DMSO; 디메틸 술폭시드
HCl; 염산
KI; 요오드화칼륨
MgSO4; 황산마그네슘
MTBE; t-부틸 메틸 에테르
NaCl; 염화나트륨
NaOH; 수산화나트륨
P450; 시토크롬 P-450
PyBOP; 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
TBDMSCl; TBSCl; t-부틸디메틸 클로로실란
TBS; TBDMS; t-부틸디메틸실릴
TEA; 트리에틸아민
THF; 테트라히드로푸란
TMSCl; 클로로트리메틸실란
5'-O-시스-[4-(4-피리딜)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드; 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-시스-[2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실]
하기 익히 공지된 약물을 명세서 및 청구범위에서 언급하였다. 약어 및 일반명을 또한 제공하였다.
시타라빈; 1-(β-D-아라비노푸라노실)시토신; araC
본 발명은 5'-O-시스-[4-(4-피리딜)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 화합물의 발견 및 간 질환을 치료하는데 이들의 용도에 관한 것이다. 일면에서, 간 질환은 바이러스성 감염 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 간암은 간세포 암종이다. 부차적인 측면에서, 간암은 결장직장 암종이다. 일면에서, 5'-O-시스-[4-(4-피리딜)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 화합물의 이성질체는 탄소 C'가 S 배열인 이성질체이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 또한 5'-O-시스-[4-(4-피리딜)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 화합물의 합성을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 araCMP의 시클릭 포스페이트 디에스테르의 두가지 시스-입체이성질체의 합성에 관한 것이다. 일면에서, 시타라빈 포스페이트 디에스테르의 시스-이성질체는 C' 탄소에서 S-배열을 갖는 시타라빈 포스페이트 디에스테르의 시스-이성질체이다.
매우 적은 절차가 간암을 치료하는데 효과적인 것으로 보여져 왔다. 환자의 적은 비율에서, 종양이 윤곽이 매우 명확되고, 매우 적은 경우, 외과적 제거, 냉동제거 및 에탄올 주사가 환자를 치료하는 제한된 효능을 나타내어 왔다. 그러나, 이러한 절차를 받은 환자의 대부분은 결국 암이 재발되었다. 또다른 측면에서, 본 발명은 또한 약물 또는 외과적 치료를 받은 환자에서 P450-발현 종양에서의 암의 재발을 예방하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 바람직한 전구약물은 전이성 암을 치료하는데 사용한다. 일면에서, 전이성 암은 결장직장 암으로부터 유래된 속발성 암으로부터 선택된다.
재발성 암을 치료하기 위한 방법
간세포 암종 환자는 초음파촬영술, 컴퓨터 단층촬영술 (CT), 자기 공명 이미징, 혈관조영술 및 생검을 비롯한 다양한 기술을 사용하여 확인하고 모니터링한다. 알파 태아단백질 (AFP) 수준을 진단에 사용하고, 특히 초기 AFP 수준이 높은 환자에서 항종양 활성의 우수한 지표가 될 수 있다. 이러한 기술은 종종 치료 선택사항 및 환자 적격사항을 결정하는데 유용하다. 치료 선택사항은 동소 간 이식 (OLT), 외과적 절제술, 다양한 제제 (알콜을 포함함)의 경피경유 주사, 냉동요법, 동맥내 화학요법, 경도관 동맥 화학색전술 (TACE), 전신 화학용법, 방사선요법, 면역용법 및 호르몬 요법을 포함한다. 일반적으로 1 cm 미만의 종양은 진단될 수 없다. 외과적 절차 (OLT 또는 외과적 절제술)를 받은 환자에서는 절차 후 종양의 확연한 증거가 나타나지 않을 수 있다. 유사하게 비-외과적 치료, 예컨대 제거 요법 (에탄올, 저주파, 고주파) 및 TACE를 받은 환자는 종양 크기에서 유의한 감소가 나타나고, 종양이 없는 것과 같이 보일 수 있을 것이다. 환자는 미세구 (이트륨 (Yttrium)-90을 갖는 방사성표지된 미세 유리 비드), 약물 전달 비히클, 예컨대 외부 자석을 이용하여 종양으로 위치시킬 수 있는 철로 이루어진 미세입자, 화학요법제, 예를 들어, 겔 중 시스플라틴, HCC 종양 표적 약물, 예컨대 디옥소루비신 및 에탄올 제거 중 화학 제제 (디옥소루비신과 같은)의 사용으로 치료받을 수 있다. 또한, 다른 화학요법제가 항-혈관형성제, 티미딜레이트 합성효소 억제제 (예를 들어, 티미택), 튜불린 중합체화 억제제 (예를 들어, T67), 다양한 국소이성질화효소 I 억제제, 예를 들어, 테칸 부류로부터의 약물, 예컨대 엑사테칸, 시스플라틴, 인터페론, 아드리아마이시난 및 5-FU의 배합물을 비롯한, 다양한 약물 배합물을 비롯한 잠재적 초기 전신 요법 치료로서 간주된다.
HCC의 모든 치료가 암 재발의 높은 발병률과 관련된다. 재발하는 암은 하나 이상의 이유로 발생할 수 있다. 예를 들어, 외과술의 시점에 존재하는 속발성 간내 전이는 이들의 크기 (< 1 cm) 때문에 종종 발견되지 않는다. 간문맥 또는 간정맥 침범을 앓는 환자는 종양이 다른 간엽의 원인이 될 수 있기 때문에 불량한 예후를 갖는다. 이러한 미세 전이의 크기가 커지고, 증식하며, 본 발명의 전구약물에 특히 감수성이다. 재발하는 질환을 유도할 수 있는 두번째 요인이 원발성 종양(들)의 불완전한 종양 절제 또는 제거로부터 발생한다. 세번째 요인은 존재하나 치료의 시점에서 발견되지 않을 수 있는 "새로운" 원발물 일부에 대해 간이 높은 위험성이 되도록 만들 수 있는 간의 환경 (경변, 바이러스 감염)에 관한 것이다.
재발성 암을 예방하거나 지연시키기 위해, 본 발명의 전구약물은 상기 치료 중 하나 전에 또는 그 중에 또는 그 이후에 사용되는 것으로 파악된다. 치료는 HCC 환자에게 1 내지 2년의 과정에 걸쳐 1 내지 10 주기, 바람직하게는 3 내지 6 주기 동안의 본 발명의 전구약물의 투여를 수반한다. 주기는 종양의 성장을 늦추거나 방지하는데 효과적임을 보이는 치료의 과정을 의미한다. 본 발명의 일면에서, 치료는 전구약물을 7 내지 14 일 동안 연속 주입한 후 14일 이상의 약물을 주입하지 않는 기간 (1 주기)을 수반한다. 환자를 시간에 걸쳐 모니터링한다. 전구약물은 암이 없는 상태의 시간을 증가시키고(거나), 생존 시간을 증가시키고(거나) 삶의 질을 개선시킨다.
백혈병을 치료하기 위한 방법
시타라빈은 다양한 백혈병을 치료하는데 사용된다. 전형적으로 시카라빈은 7일 이하 동안 연속 주입에 의해 100 내지 200mg/m2/일의 투여량으로 투여한 후 시타라빈-유도된 골수억제의 결과로서 몇 주간의 약물을 주입하지 않는 기간을 갖는다. 전형적으로 백혈병 환자를 치료하는데 3 주기 이상 사용한다. 또한, 높은 투여량 섭생이 다양한 이유로 사용되어 왔다 (예를 들어, 3 gm/m2). 원리적으로 araC의 불활성 대사물인 araU로의 탈아미노화를 수반하는 시타라빈의 빠른 대사작용으로 인해 전체적으로 보다 높은 약물 수준이 필요하다. 연장된 전달이 세포 주기-의존형 종양붕괴제, 예컨대 시타라빈으로 암을 치료하는데 최적인 것으로 고려된다. 시타라빈은 DNA 중합효소를 억제하고(거나) 성장하는 DNA 가닥을 쇄 종결시킨 후 DNA 중합효소 촉매된 도입을 일으키는 이의 능력으로 인한 DNA 합성을 억제시키는 이의 능력으로 적어도 부분적으로 효과적이다. DNA 합성의 억제제로서, araC는 아마도 DNA 상으로 이의 도입 및 S-기 동안 동화 작용 효소의 보다 큰 활성에 대한 필요로 인해 세포 주기의 S-기 동안 가장 큰 세포독성 효과를 갖는다. 결론적으로, araC에 세포가 노출되는 기간은 보다 긴 노출 기간이 이들이 S-기를 지나는 동안 보다 큰 비율의 세포의 DNA 중으로 araC를 도입하도록 하기 때문에 직접적으로 세포사와 상호관련된다.
보다 높은 투여량의 araC로 치료받거나 연장된 기간 동안 치료받는 환자들은 다양한 araC-관련 독성에 대해 위험한 상태에 있다. 추가로, 특정 환자, 예를 들어, 간 손상 노인 환자는 시타라빈 독성에 특히 위험한 상태에 있을 수 있다. 독성은 골수억제, 위장 상피 궤양화, 간내 콜레스테롤화 및 췌장염, 소뇌 및 대뇌 기능손상 및 결막염을 포함한다.
본 발명의 전구약물은 이들 투여량-제한 독성의 일부를 감소시키는 것으로 파악된다. 특히, 전구약물 활성화 후에 간에서 생성되고 방출되는 araC는 더 적은 독성을 갖는 항백혈병 활성을 달성하기 위한 방법을 제공할 것이다. 예컨대 소뇌 및 대뇌 기능장애 및 결막염과 같은 독성을 일으킬 수 있는 높은 최고점 수준을 달성하지 않는 정상 상태 수준을 본 발명의 전구약물으로 달성할 수 있다. 전구약물은 또한 주사 부위-관련 부작용을 감소시키는 시타라빈을 투여하는 방법을 제공한다. 전구약물로부터 시타라빈의 지속되는 방출은 연속 주입에서 정맥내 일시 또는 단기 주입, 피하, 근육내, 경구, 등의 주입으로 투여 섭생을 변경할 수 있다. 골수억제는 여전히 요법들과 관련될 수 있다. 약물의 휴일, 골수 이식 또는 골수 조혈 세포 활성화를 증가시키는 제제 (예를 들어, IL-3, GM-CSF, G-CSF, 에포에틴)를 비롯한 다양한 기작은 전구약물의 골수억제 활성의 효과를 감소시키는데 사용할 수 있다.
치료 지수의 증가
또한, 여러 독성은 대개 모든 항암제와 관련된다. 원발성 또는 속발성 간암의 치료 동안의 이들 독성을 감소시키 위한 노력에서, 약물을 때때로 간 약물 노출을 증가시키기 위해 간문 동맥으로 직접 투여한다. 종양붕괴 약물은 전형적으로 유의한 부작용과 관련되어 있기 때문에, 국부 투여는 간의 흡수를 증가시키고, 이에 따라 간외 독성을 감소시킬 수 있다. 간 흡수를 보다 증가시키기 위해, 때때로 간동맥 약물 주입과 함께 화학색전술을 병용한다. 본 발명에서 전구약물의 높은 간 특이성은 전신 부작용이 신규 전구약물 접근에 의해 유사하게 최소화될 것임을 제안한다.
또한 원발성 및 속발성 간암은 화학요법 및 방사선요법 모두에 특히 저항성이다. 저항성에 대한 기작이 완전히 이해되지는 않았으나, 이는 대사를 빠르게 하고(거나) 화학요법제를 방출시키는 간 유전자 생성물이 증가됨으로써 일어날 수 있다. 추가로, 일반적으로 생체이물 대사 및 세포독성 중간체의 발생과 관련된 간은 다중 보호 기작이 자연적으로 갖추어져 있어 이들 중간체로부터의 손상이 최소화된다. 예를 들어, 다른 조직에 비해 간에서는 글루타티온의 세포내 농도가 매우 높아 추정컨대 단백질 및 DNA를 알킬화할 수 있는 중간체를 빠른 세포내 반응을 통해 해독시킨다. 결론적으로, 간은 이들의 기작 때문에 화학요법제제에 저항성일 수 있고, 따라서 성공을 달성하기 위해 종양붕괴제의 정상 농도보다 더 높은 농도를 필요로 한다. 보다 높은 간 농도는 일반적으로 간외 독성을 일으키는 약물의 보다 높은 투여량을 필요로 한다.
본 발명의 전구약물은 시타라빈의 치료 지수 ("TI")를 유의하게 증가시킬 수 있다. 다수의 경우에서, 증가된 TI는 높은 간 특이성의 결과이다. 예를 들어, 시타라빈은 키나제의 낮은 수준으로 의해 간에서 불량하게 인산화된다. 그러나, 키나제는 독성의 표적 기관 (예를 들어, 골수)에서 높게 발현되어 관련된 투여량-제한 독성을 일으킨다. 따라서, araC의 시클릭 전구약물은 CYP3A4-발현 간 및 HCC 세포에 훨씬 더 높은 농도의 araCTP를 특이적으로 전달함으로써 간에서 araC의 효능을 개선시키는 가능성을 제공한다.
전구약물 분해의 높은 간 특이성은 전구약물 분해의 부산물이 또한 간에서 우선적으로 생성된다는 것을 내포한다. 따라서, 부산물과 관련된 독성은 부산물이 빈번히 부산물 독성을 제거하거나 최소화시키는 신속한 해독 반응을 거치기 때문에 최소화된다. 예를 들어, 부산물과 화합물 및(또는) 단백질 사이 (예를 들어, 글루타티온과 전구약물의 분쇄에 의해 생성되는 α,β-불포화된 올레핀)의 반응이 간세포에 존재한다. 게다가, 간에 존재하는 효소는 또한 부산물을 비-독성 화합물로 추가로 전환시킬 수 있다 (예를 들어, 히드록시피리딘의 산화 및(또는) 황산화, 또는 α,β-불포화된 케톤의 환원 등). 또한, 반응기 및 전구약물의 분쇄에 의해 생성된 α,β-불포화된 카르보닐-함유 화합물 사이의 고리화 반응을 포함하는 세포내 반응이 부산물 독성을 최소화시킬 수 있다.
전구약물의 세포독성은 P450 활성 (예를 들어, CYP3A4 활성)이 없는 세포주를 사용하여 용이하게 평가한다.
증가된 TI는 또한 모 약물의 등가량 투여량에 비해 생물학적으로 활성인 제제의 보다 많은 양을 간으로 전달하여 달성할 수 있다. 생물학적으로 활성인 제제의 증가된 간 수준은 P450 활성, 예를 들어, CYP3A4 활성을 유도하는 제제 (예를 들어, 리팜피신, 글루코코르티코이드, 페노바르비탈, 에리트로마이신)와 함께 전구약물을 투여하여 달성할 수 있다.
전구약물 안정성을 개선하는 방법
생물 계에서의 화합물 안정성은 시타라빈과 같은 세포독성 약물의 전구약물의 개발에 중요하다. 예를 들어, 혈장에 존재하는 효소에의 안정성 부족은 표적된 CYP3A4-발현 조직 대신 혈장에서 활성 화합물을 파쇄시키고, 결과적으로 전구약물 방법에 의해 달성되어야 할 기대하는 TI를 감소시킬 수 있다. 유사하게, 수성 매질에서의 고유 안정성의 부족은 혈장에서 뿐 아니라 전구약물이 분산될 수 있는 임의의 기관에서 전물약물을 파쇄시키고, 역시 TI를 감소시킬 것이다. 또한, 안정성의 부족은 특히 전구약물이 비경구로 사용되는 경우 활성 화합물의 최종 제제화를 보다 어렵게 만들므로 약물 개발을 손상시킬 수 있다. 일면에서, 본 발명은 araCMP의 전구약물의 전체적인 안정성을 개선하기 위한 araCMP의 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올 전구약물의 용도에 관한 것이다. 일면에서, araCMP의 전구약물은 araCMP의 시스-(4-피리딜) 전구약물이다. 또다른 측면에서, araCMP의 전구약물은 탄소 C'가 S 배열일 때의 araCMP의 시스-(4-피리딜) 전구약물이다.
전구약물의 안정성은 생물학적 체액, 예컨대 혈장 및 여러 pH에서 상이한 완충제로 완충시킨 용액에서 전구약물의 파쇄를 모니터링함으로써 용이하게 측정한다.
약물동력학적 반감기의 개선
지속된 기간에 걸쳐 역물을 생산하는 이의 능력 및 일부 경우에서는 전구약물의 더욱 길어진 약동학 반감기의 결과로서 시타라빈의 약물동력학적 반감기는 신규 전구약물 방법론에 의해 연장될 수 있다. 두가지 특성은 개별적으로 치료 약물 수준을 연장된 기간에 걸쳐 유지시켜 약물동력학적 반감기에서 개선을 가져왔다. 약물동력학적 반감기는 대사 또는 제거 경로를 저해한 후, 모 약물을 저해하여 연장될 수 있다. 일부 약물에 대해, 본 발명의 전구약물은 대사 또는 제거 경로를 저해한 후 모 약물을 저해할 수 있고, 이로써 동물에서 연장된 기간 동안 존재할 수 있다. 예를 들어, 시타라빈은 시티딘을 우리딘으로 전환시켜 시타라빈을 아리비노푸라노실-우라실로 전환시키는 대사 효소 시티딘 데아미나제에 대한 기질이다. 그러나, araCMP의 전구약물은 이 효소의 기질이 아니므로, 결과적으로 시타라빈의 직접 투여와 비교하여 시타라빈의 약물동력학적 반감기를 보다 길게 만든다.
포스페이트 약물 제거의 일반적인 경로는 신장 및 음이온 화합물을 인지하는 전달체를 통한 것이다. 순환으로부터 포스페이트 함유 약물의 완전한 제거는 종종 약물 투여 후 단지 몇 분 내에 일어난다. 본 발명의 전구약물은 간 및 유사 조직에서 산화 및 가수분해 후까지 음전하를 제거함으로써 약물의 제거를 늦춘다.
제제화
본 발명의 화합물은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 전체 하루 투여량으로 투여된다. 가장 바람직한 투여량 범위는 약 10 mg/kg/일이다. 투여량은 편의에 따라 다수의 나누어진 투여량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물은 다른 항바이러스제 또는 종양붕괴제와 함께 사용되는 경우, 하루 투여량으로 또는 하루 투여량의 적절한 분획 (예를 들어, 하루에 두차례)으로 투여할 수 있다. 전구약물은 다른 항바이러스제 또는 종양붕괴제를 투여하는 동시에 또는 가까이 또는 상이한 시간에 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 배합물 또는 '칵테일' 요법으로 공지된 다중약물 섭생으로 사용될 수 있으며, 여기서 다중 제제는 함께 투여될 수 있거나, 동시에 또는 상이한 간격에 개별적으로 투여할 수 있거나 후속적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또다른 제제에 의한 치료의 과정 후에, 또는 또다른 제제로의 요법의 과정 중에 또는 치료 섭생의 부분으로서, 또는 치료 프로그램에서 또다른 제제에 의한 요법 전에 투여할 수 있다.
본 발명의 전구약물은 효율성을 보다 향상시키고(거나) 시타라빈-관련 독성을 감소시키는 다양한 제제와 합할 수 있다. 다양한 배합물이 요법의 효능을 증가시키는 것으로 파악될 수 있다. 암에 대해 효과적인 것으로 공지된 약물과의 배합물은 간을 벗어나고 전구약물 요법에는 반응하지 않는 전이를 치료하는데 도움이 될 수 있다. 이러한 제제는 DNA 합성의 억제제 (DNA 중합효소 억제제, 신생 합성 피리미딘 경로의 억제제 (예를 들어, 티미딜산 합성효소 억제제), 디히드로오로테이트 탈수소효소 억제제, 아스파르테이트 카르바모일전이효소 억제제), 폴레이트 항대사물 (예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소 억제제, 폴리폴리글루타메이트 합성효소 억제제), 퓨린 생합성의 억제제 (이노신 5'-모노포스페이트 탈수소효소 억제제, 글리신아미드 리보뉴클레오티드 포르밀전이효소 억제제, 리보뉴클레오시드 디포스페이트 환원효소 억제제), 폴리아민 생합성의 억제제 (예를 들어, S-아데노실-1-메티오닌 데카르복실라제, 오르니틴 데카르복실라제, 스퍼미딘/스퍼민 N-아세틸전이효소의 억제제), 항종양 항생제, 식물 알칼로이드, 파르네실 전이효소 억제제, 국소이성질화효소 억제제, 백금계 약물, 항혈관형성 약물, 튜불린 중합효소 억제제 등을 비롯한 익히 공지된 화학요법 제제의 군으로부터 선택된 약물을 포함한다.
에피포도필로톡신, 캄프토테신, 안트라실린, 안트라피라졸, 콤브레타스타틴 유사체, 에네디인 항생제, 탁산을 비롯한 다양한 익히 공지된 약물 부류는 본 발명의 전구약물과의 배합물에 적합한 것으로 파악한다.
본 발명의 일면에서, 에토포시드, 테니포시드, NK-611, G1-331 및 아자톡신을 비롯한 에피포도필로톡신이 바람직하다. 일면에서 에피포도필로톡신은 에토포시드 및 테니포시드이다. 일면에서, 캄프토테신은 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸 (CPT-11), 루르토테칸 (GI 147211), 9-아미노캄프토테신, GG-211, DX-8951F, SKF 107874 및 SKF 108025를 포함하는 것이 바람직하다. 또다른 측면에서, 캄프토테신은 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 루르토테칸 및 9-아미노캄프토테신을 포함한다. 또다른 측면에서, 캄프토테신은 토포테칸 및 이리노테칸을 포함한다. 일면에서, 탁산은 파클리탁셀, 도데탁셀 및 FCE-28161을 포함한다. 또다른 측면에서, 탁산은 파클리탁셀을 포함한다. 일면에서, 콤브레타스타틴은 콤브레타스타인 A-4 및 문헌 [Bioorg. Med. Chem. Lett. 88: 1997-2000 (1998)]에 보고된 (S,S) 디옥솔란 유사체를 포함한다. 일면에서, 안트라피라졸은 미톡산트론, 피록산트론 및 로속산트론을 포함한다. 일면에서, 안트라실린은 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 피라루비신, 플리카마이신, 발루비신, 닥티노마이신 및 에피루비신을 포함한다. 또다른 측면에서, 안트라실린은 독소루비신, 피라루비신, 에피루비신 및 이다루비신을 포함한다. 또다른 측면에서, 안트라실린은 피라루비신 및 독소루비신을 포함한다. 일면에서, 에넨디인 항생제는 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신 및 에스페라미신을 포함한다. 또다른 측면에서, 에넨디인 항생제는 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신 및 다이네미신을 포함한다. 일면에서, DNA 손상 약물, 예컨대 알킬화제 (질소 머스터드, 아지리딘), 니트로조우레아 및 금속 착물을 사용한다. 일면에서, 미토마이신이 바람직하다. 일면에서, 백금 착물은 시스플라틴, 네다플라틴, 미리플라틴 및 카르보플라틴을 포함한다. 일면에서 알킬화제는 시클로포스파미드 및 이포스파미드를 포함한다. 일면에서, 니트로조우레아는 카르무스틴 (BCNU), 테모졸로미드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 일면에서, 세포 주기-의존성 억제제는 5-FU, 독시플루리딘, 겜시타빈, 클라드리빈, 플루다라빈을 포함하는 것이 바람직하다. 폴레이트 항대사물은 메토트렉세이트를 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명의 전구약물과 함께 사용되는 종양 약물은 부술판, 티오테파, 멜팔란 및 루로테카를 포함한다.
일면에서, 시트라빈과 상승적인 작용을 하는 제제를 사용한다. 이들 제제는 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴 (BCNU), 시스플라틴, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 메토트렉세이트, 6-티오구아닌 및 3-데아자우리딘을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명의 전구약물은 세포 주기를 S-기로 진행하도록 자극하여 이들을 본 발명의 전구약물에 보다 감수성이 되도록 만드는 공지된 약물과 합한다.
또다른 측면에서, 본 발명의 전구약물은 아포토시스를 자극하는 것으로 공지된 약물과 조합한다. 이러한 약물은 카스파제-3 억제제를 포함한다.
조합 요법은 개별적으로 또는 동시에 제제를 숙주에게 투여하는 것을 수반한다. 일면에서, 전구약물을 종양 약물과 동시에 투여한다. 약물은 동일한 비히클 중에 또는 개별적으로 투여할 수 있다. 두 약물은 모두 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 진피내를 포함함) 투여하거나, 경구, 직장, 비강, 국부, 질내 및 경피를 비롯한 그밖의 경로로 투여할 수 있다. 일면에서, 두 제제는 모두 동일한 캡슐에 또는 개별적인 알약으로 동시에 투여한다. 또다른 측면에서, 두 제제는 모두 식사 시간 동안 (급식 직전 또는 급식 직후) 투여한다. 또다른 측면에서, 약물 배합물은 개별적인 시간에 투여한다. 일면에서, 약물은 주기 요법의 기간 동안 때에 맞추어 개별적으로 투여한다. 또다른 측면에서, 하나의 약물을 다른 약물에 대한 약물 휴일 동안 투여한다.
종양붕괴제 또는 항바이러스제 및 본 발명의 화합물을 개별적으로 투여하거나 동시에 투여할 수 있다. 적합한 종양붕괴제는 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미리플라틴, 테모졸로미드, 티오테파, 멜팔란, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 클로람부실, 디옥소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 발루비신, 닥티노마이신, 겜시타빈, 플록스우리딘, 플루오로우라실, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 메토트렉세이트, 미토마이신, 에토포시드, 파클리탁셀, 도데탁셀, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 네다플라틴, 카르무스틴, 독시플루리딘, 클라드리빈, 플루다라빈, 아자톡신, 캄프토테신, 루르토테칸, 9-아미노캄프토테신, 피라루빈, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 루로테카를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 본 화합물을 제약상 허용가능한 담체, 아쥬반트 및 비히클을 함유하는 제형으로 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국부 또는 직장을 비롯한 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 여기서 사용되는 용어 비경구는 다양한 주입 기술로의 피하, 정맥내, 근육내 및 동맥내 주사를 포함한다. 본원에 사용된 동맥내 및 정맥내 주사는 카테터를 통한 투여를 포함한다. 정맥내 투여가 일반적으로 바람직하다.
제약상 허용가능한 염은 아세테이트, 아디페이트, 베실레이트, 브로마이드, 캄실레이트, 클로라이드, 시트레이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루코라네이트, 히푸레이트, 히클레이트, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 말레에이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸술페이트, 납실레이트, 니트레이트, 올레에이트, 팔모에이트, 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 술포살리이실레이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테르프탈레이트, 토실레이트 및 트리에티오디드를 포함한다.
활성 성분을 함유하는 제약 조성물은 투여하고자 하는 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 경구 사용을 위해 사용될 경우, 예를 들어, 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 및 유성 현탁제, 분산가능한 산제 또는 과립제, 에멀젼제, 경질 또는 연질 캡슐제, 시럽 또는 엘릭서를 제조할 수 있다. 경구 사용을 위한 조성물을 제약 조성물의 제조에 대한 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 상기 조성물은 맛이 좋은 제제를 제공하기 위한 감미제, 풍미제, 착색제 및 방부제를 비롯한 1종 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제의 제조에 적합한 비-독성인 제약상 허용가능한 부형제와의 혼합물 중의 활성 성분을 함유하는 정제가 허용가능하다. 이들 부형제는 예를 들어, 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시켜 이에 따라 장기간에 걸쳐 작용을 지속시키는 미세피막화를 비롯한 공지된 기술로 코팅할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
또한, 경구 사용을 위한 제형은 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 인산칼슘 또는 카올린과 함께 혼합된 경질 젤라틴 캘슐 또는 활성 성분이 물 또는 유성 매질, 예컨대 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브 오일와 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.
본 발명의 수성 현탁제는 수성 현탁제의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물로 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트래거캔스 및 검 아카시아, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 천연 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물으로부터의 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 또한, 수성 현탁제는 1종 이상의 방부제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 풍미제 및 1종 이상의 감미제, 예컨대 수크로즈 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 현탁제는 활성 성분을 식물성 오일, 예컨대 아라키드 오일, 올리브 오일, 참깨유 또는 코코넛 오일 또는 무기 오일, 예컨대 액체 파라핀 중에 현탁시켜 제제화할 수 있다. 경구 현탁제는 증점제, 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 상기 기술한 바와 같은 감미제 및 풍미제를 첨가하여 맛이 좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 항산화제, 예컨대 아스코르브산의 첨가로 보존될 수 있다.
물의 첨가에 의한 수성 현탁제의 제조에 적합한 본 발명의 분산가능한 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 1종 이상의 방부제와의 혼합물로 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제는 상기 개시한 것으로 예시된다. 추가적인 부형제, 예를 들어, 감미제, 풍미제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 유중수 에멀젼의 형태일 수 있다. 유성상은 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 아라키드 오일, 무기 오일, 예컨대 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 검, 예컨대 검 아카시아, 검 트래거캔스, 천연 포스파티드, 예컨대 대두 레시틴, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물으로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레이트, 및 에틸렌 옥시드와의 이들 부분 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 또한, 에멀젼은 감미제 및 풍미제를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭서는 감미제, 예컨대 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로즈와 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 점활제, 방부제, 풍미제 및 착색제를 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 멸균 주사가능한 제제, 예컨대 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁제의 형태일 수 있다. 상기 현탁제는 상기 언급한 적합한 분산액 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화할 수 있다. 또한, 멸균 주사가능한 제제는 비-독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 1,3-부탄-디올 중의 용액 중의 멸균 주사가능한 액제 또는 현탁제이거나 냉동건조된 산제로서 제조될 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 추가로, 통상적으로 멸균 고정된 오일을 용매 또는 현탁화된 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 순한 고정된 오일을 사용할 수 있다. 추가로, 지방산, 예컨대 올레산을 이와 같이 주사가능한 제제 중에 사용할 수 있다.
담체 재료와 합하여 단일 투여형을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 숙주 및 투여의 특정한 형식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하기 위한 시간-방출 제형은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95％로 다양할 수 있는 담체 재료의 적절하고 편리한 양과 배합된 활성 물질 20 내지 2000 μmol (대략 10 내지 1000 mg)을 함유할 수 있다. 제조된 제약 조성물은 투여를 위해 용이하게 측정가능한 양을 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위한 수용액은 약 30 mL/시간의 속도에서 적합한 부피의 주입이 일어날 수 있기 위해 용액의 밀리리터 당 활성 성분 약 0.05 내지 약 50 μmol (약 0.025 내지 25 mg)을 함유해야 한다.
상기와 같이, 경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 예정된 양의 활성 성분을 함유하는 개별 단위체, 예컨대 캡슐제, 카세제 또는 정제; 산제 또는 과립제; 수성 또는 비-수성 액체 중의 액제 또는 현탁제; 또는 유중수 액체 에멀젼 또는 수중유 액체 에멀젼으로서 존재할 수 있다. 또한, 활성 성분은 볼루스, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
정제는 임의로 1종 이상의 부가적 성분과 함께 압축 또는 성형시켜 제조될 수 있다. 압축된 정제는 자유 유동형, 예컨대 분말 또는 과립인 활성 성분을 임의로 결합제 (예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제 (예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교된 포비돈, 가교된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈), 계면 활성제 또는 분산제와 혼합하여 적합한 기계로 압축시켜 제조할 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계로 성형시켜 제조할 수 있다. 정제는 임의로 코팅시키거나, 새김을 줄 수 있고, 예를 들어, 히드록시프로필 메틸셀룰로즈를 다양한 비율로 사용하여 활성 성분을 방출을 늦추거나 조절하여 목적하는 방출 프로파일을 제공하도록 제제화할 수 있다. 정제는 임의로 장 코팅을 제공하여 위보다는 장의 일부에서 방출을 제공할 수 있다. 이는 화학식 I의 화합물이 산 가수분해에 감수성인 경우 상기 화합물에 특히 유리하다.
구강에서의 국소 투여에 적합한 제형은 풍미 기재, 일반적으로 수크로즈 및 아카시아 또는 트래거캔스 중에 활성 성분을 포함하는 로젠지제; 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로즈 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 향제; 및 적합한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 구강세정제를 포함하다.
직장 투여를 위한 제형은, 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실산염을 포함하는 적합한 기재를 포함하는 좌제로서 존재할 수 있다.
질내 투여에 적합한 제형은 활성 성분 외에 당업계에 적절한 것으로 공지된 담체를 함유하는 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼물 또는 스프레이 제형으로 존재할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 특정 항산화제, 완충제, 정균제 및 수여자의 혈액과 등장액이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장 멸균 주사 액제; 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제를 포함한다. 제형은 단위-투여량 또는 다중-투여량 밀봉된 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알 중에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사를 위한 물을 첨가하는 것만을 필요로 하는 냉동-건조 (동결건조) 조건 중에 저장할 수 있다. 주사 용제 및 현탁제는 멸균 분말, 과립 및 상기 기재한 종류의 정제로부터 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 유치 펌프를 통해 또는 병원용 백을 통해 연속 주입 방식으로 투여할 수 있다. 연속 주입은 외부 펌프에 의한 주입을 포함한다. 주입은 히크만 (Hickman) 또는 PICC, 또는 비경구 또는 정맥내로 제형을 투여하는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다.
바람직한 단위 투여 제형은 약물의 하루 투여량 또는 단위체, 하루 하위-투여량 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 것들이다.
그러나, 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 투여량 수준은 당업자에 의해 잘 이해되는, 사용하는 특정 화합물의 활성; 치료할 개체의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식사; 투여할 시간 및 경로; 배출 속도; 이전에 투여된 다른 약물; 및 치료법을 받고 있는 특정 질환의 중증도를 비롯한 다양한 요인에 따라 다를 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 의해 제조된 화합물
본 발명에 의해 제조된 화합물 및 중간체는 하기 화학식 I의 araCMP의 6-원 시클릭 포스페이트 디에스테르 전구약물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염이다.
<화학식 I>
상기 식 중,
M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고;
상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고;
V는 4-피리딜이다.
본 발명의 또다른 면은 하기 화학식 II의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염의 제조이다.
상기 식 중,
MH는 5'히드록실 위치에서 산소 원자를 통해 화학식 II에서의 인과 부착되는 시타라빈이고;
V는 4-피리딜이다.
본 발명의 또다른 면은 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염의 제조이다.
<화학식 III>
1.0 인산화 시약의 합성:
1,3-디올을 제조하는 다양한 합성 방법이 공지되어 있다. 이들 적합한 방법은 하기와 같이 2가지 유형으로 분류된다:
1) 라세미 1-(아릴)-프로판-1,3-디올의 합성;
2) 거울상이성질체 강화된 1-(아릴)-프로판-1,3-디올의 합성.
1.1 라세미 1-(아릴)-프로판-1,3-디올의 합성:
1,3-디히드록시 화합물을 참고문헌으로부터의 여러가지 익히 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 치환된 방향족 알데히드를 사용하여 알킬 아세테이트의 리튬 에놀레이트를 첨가한 다음, 에스테르 환원을 통해 라세미 1-(아릴)프로판-1,3-디올을 합성한다 (Turner, J. Org. Chenz. 55: 4744 (1990)). 별법으로, 1-히드록시 프로판-3-알에 아릴 그리냐르 (Grignard) 첨가로 또한 1-(아릴치환된)프로판-1,3-디올을 수득한다 (경로 B). 이 방법은 다양한 치환된 아릴 할라이드를 1-(아릴치환된)-1,3-프로판 디올로 전환할 수 있을 것이다 (Coppi, et al., J. Org Chem. 53: 911 (1988)). 또한, 아릴 할라이드를 사용하여 1,3-디옥스-4-엔을 헥크 (Heck) 커플링시킨 다음, 환원시키고 가수분해하여 1-치환된 프로판 디올을 합성할 수 있다 (Sakamoto, et al., Tetrahedron Lett. 33: 6845 (1992)). 피리딜, 퀴놀린, 이소퀴놀린 프로판-3-올 유도체를 N-옥시드를 형성한 다음, 아세트산 무수물 조건에 재배열하여 1-치환된-1,3-디올로 산소화할 수 있다 (경로 C) (Yamamoto, et al, Tetrahedron 37: 1871 (1981)). 또한, 다양한 방향족 알데히드를 비닐 그리냐르 첨가 후, 수소화붕소화 반응으로 1-치환된-1,3-디올로 전환할 수 있다 (경로 D).
1.2 거울상이성질체 강화된 1-(아릴)-프로판-1,3-디올의 합성:
화학 제제 또는 효소 제제를 통한 2급 알콜의 분리를 위한 다양한 공지된 방법을 디올 거울상이성질체의 제조를 위해 사용할 수 있다 (Harada, et al., Tetrahedron Lett. 28: 4843 (1987)). 치환된 3-아릴-3-옥소 프로피온산 또는 에스테르의 전이 금속 촉매 수소화는 높은 거울상이성질체 순도로 베타 히드록시산 또는 에스테르의 R 또는 S-이성질체를 제조하는 효과적인 방법이다 (Comprehensive Asymmetric Catalysis, Jacobsen, E. N., Pfaltz, A., Yamamoto, H. (Eds), Springer, (1999); Asymmetric Catalysis in Organic Synthesis, Noyori, R., John Wiley, (1994)). 이들 베타 히드록시 산 또는 에스테르 생성물을 추가로 환원시켜 목적하는 1-(아릴)-프로판-1,3-디올을 높은 e.e.로 수득할 수 있다 (경로 A). 고압 수소화 또는 수소 전달 반응에 대한 β-케토 산 또는 에스테르 기질을 다양한 방법, 예컨대 염기 존재하의 디메틸카르보네이트와의 아세토페논의 축합 (Chu, et al., J. Het Chem. 22: 1033 (1985)), 에스테르 축합 (Turner, et al., J. Org. Chem. 54: 4229 (1989))에 의해, 또는 아릴 할라이드로부터 (Kobayashi, et al., Tetrahedron Lett. 27: 4745 (1986)) 제조할 수 있다. 별법으로, 높은 거울상이성질체 순도의 1,3-디올을 β-히드록시에틸 아릴 케톤 유도체 또는 β-케토 산 유도체를 겨울상이성질체성 보란 환원으로 수득할 수 있다 (경로 B) (Ramachandran, et al., Tetrahedron Lett. 38: 761 (1997)). 또다른 방법에서, 시판되는 신나밀 알콜을 촉매 비대칭 에폭시화 조건 하에 에폭시 알콜로 전환시킬 수 있다. 이들 에폭시 알콜을 레드-알 (Red-Al)로 환원시켜, 높은 e.e.를 갖는 1,3-디올을 생성한다 (경로 C) (Gao, et al., J. Org Chem. 53: 4081 (1980)). 거울상이성질체 알돌 축합은 방향족 알데히드로부터 출발하는 높은 e.e.를 갖는 1,3-산소화된 관능기의 합성을 위한 익히 공지된 방법의 또다른 하나이다 (경로 D) (Mukaiyama, Org. React. 28: 203 (1982)).
본 발명의 목적을 위해, 중간체 케토에스테르를 하기 화학식 A의 4-아세틸피리딘으로부터 제조한다. C'은 본 발명에 의해 제조되는 최종 화합물에서 메틴 탄소 입체이성질체생성성 중심인 탄소를 나타낸다.
화학식 A의 화합물은 디메틸카르보네이트와 반응시켜 옥소-프로판산 메틸 에스테르를 수득한다. 입체이성질체생성성 중심은 노요리 (Noyori)의 수소 전달 방법을 사용하여 위치시킨다 (Fujii et al., J. Am. Chem. Soc. 118 (10): 2521-2 (1996)). 옥시-프로판산 에스테르를 거울상이성질체 강화된 루테늄 촉매 (10)의 존재하에 히드록시 에스테르 중간체로 환원시키고, 이를 수소화붕소나트륨을 사용하여 하기 화학식 B에 나타낸 거울상이성질체 강화된 1,3-프로판 디올로 추가 환원시킨다:
탄소에서의 입체이성질체생성성 중심, C'는 이 공정 단계에서 생성되었으며, 거울상이성질체 초과는 공정의 나머지를 통해 유지되었다.
1.3. 인산화 시약의 합성
본 발명의 또다른 면은 하기 화학식 C의 인산화제의 제조이다:
상기 식 중,
L은 할로겐, 1 내지 3개의 전자-흡인 기에 의해 치환된 아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택된 이탈기이다.
L 기 및 4-피리딜은 서로 트랜스이다.
화학식 C의 화합물은 라세미이거나 탄소 C'에서 S 배열을 갖거나 탄소 C'에서 R 배열을 갖는다.
화학식 C의 인산화 시약의 일반적인 합성은 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올을 화학식 Cl2P(O)-L의 포스포로디클로리데이트와 반응시켜 수행한다. 일면에서, 이탈기 L은 할로겐, 1 내지 3개의 전자-끄는 기에 의해 치환된 아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 이탈기는 할로겐, 예컨대 클로로 또는 브로모 및 치환된-아릴옥시 기, 예컨대 클로로페녹시, 디클로로페녹시 또는 니트로페녹시이다. 또다른 측면에서, 이탈기는 클로로, 4-클로로페녹시, 3,5-디클로로페녹시, 2,4-디클로로페녹시 및 4-니트로페녹시이다. L이 아릴옥시인 경우, 포스포로디클로리데이트는 치환된-페놀을 포스포러스옥시클로라이드와 반응시켜 합성한다 (Rathore et al., Indian J. Chem B 32 (10), 1066 (1993)).
거울상이성질체 강화된 활성 인산화제는 염기의 존재하에 거울상이성질체 강화된 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올을 화학식 L-P(O)Cl2의 포스포로디클로리데이트로 인산화하여 합성한다 (Ferroni et al., J. Org. Chem. 64 (13), 4943 (1999)). 일면에서, 첨가의 순서는 선택한 용매 중에 디올의 용액 및 염기의 포스포로디클로리데이트의 용액으로의 첨가를 포함한다. 또다른 측면에서, 동일한 용매 또는 상이한 용매 중에 디올의 용액 및 염기, 및 포스포로디클로리데이트를 함유하는 또다른 용액을 선택한 용매에 동시에 첨가한다. 또다른 측면에서, 디올의 용액을 포스포러스 시약의 용액에 첨가한 후, 염기를 첨가한다. 디올의 인산화를 위한 전형적인 용매는 포스포로디클로리데이트와의 낮은 반응성을 갖고, 디올 또는 포스포로디클로리데이트를 안정화시키는 극성 비양성자성 용매이다. 일면에서, 인산화 반응에 사용되는 용매는 디클로로메탄, THF, 아세토니트릴, 피리딘, 테트라알킬우레아, 트리알킬 포스페이트 또는 헥사알킬포스포르아미드이다. 또다른 측면에서, 용매는 디클로로메탄, THF, 아세토니트릴, 피리딘, DMPU, DMEU, 테트라메틸 우레아, 트리메틸 포스페이트 또는 헥사메틸포스포르아미드이다. 특히 발열 반응의 초기 동안 반응 온도를 낮게 유지하여 시약의 일체성을 보존한다. 일면에서, 온도를 -20 ℃ 내지 10 ℃ 내의 실온 미만으로 유지시킨다. 일면에서, 발열을 조절하고, 반응 온도를 포스페이트 시약의 형성이 완료되도록 실온으로 서서히 상승시킨다. 또다른 측면에서, 온도를 반응이 완료할 때까지 동일하게 유지시켜 시약의 일체성을 보존한다. 인 원자의 입체이성질체생성성 특성으로 인해 상기 기재한 반응 조건하에 포스포로디클로리데이트를 디올과 반응시켜 다소 시스-이성질체가 우세한 시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물을 생성한다. 전형적인 시스/트랜스 비율은 50/50 내지 60/40의 범위이다. 시스 및 트랜스 이성질체는 컬럼 크로마토그래피 및(또는) 결정화의 조합으로 분리한다. 본 발명의 일면에서, 본 발명자들은 4-니트로페녹시 인산화 시약의 단리된 시스-이성질체가 4-니트로페놀의 염과 함께 가열되는 경우, 단리된 인산화 시약의 85％ 초과가 트랜스-이성질체라는 것을 알았다. 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명자들은 인산화 단계를 위해 사용된 동일한 용매 또는 또다른 용매 중에 4-니트로페녹시 인산화 시약의 시스 및 트랜스 이성질체의 단리된 혼합물이 4-니트로페놀의 염과 함께 가열되는 경우, 단리된 인산화 시약의 85％ 초과가 트랜스-이성질체라는 것을 알았다. 추가로, 어떠한 혼합물의 사전 단리도 강화를 달성하기 위해 필요하지 않다는 것을 알았다. 이처럼, 디올의 아릴옥시 인산화 시약이 생성되는 페놀-이탈기의 염의 조질의 반응 혼합물로의 첨가로, 인산화 시약의 단리된 혼합물에 대한 강화를 수행하는 경우 수득되는 비율과 동일한 비율로 화학식 C의 트랜스-이성질체에 강화를 달성한다. 유사하게, 화학식 C의 화합물 (L = Cl)의 시스 및 트랜스 포스포로클로리데이트의 등몰 혼합물을 가열하는 경우, 트랜스 이성질체만이 단리될 수 있다. 페녹시드 염은 상응하는 페놀을 염기, 바람직하게는 트리알킬아민, 질소-함유 헤테로사이클 또는 나트륨과 반응시켜 생성한다. 일면에서, 염기는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, DABCO, DBU, 수소화나트륨 또는 알칼리 금속이다. 또다른 측면에서, 염기는 트리에틸아민, DBU 또는 페녹시드의 나트륨 염이다. 강화 단계는 실온에서 수행할 수 있으나 일반적으로는 반응 시간을 단축하기 위해 바람직하게는 40 ℃ 내지 70 ℃의 범위에서 가열한다. 아릴옥시 인산화 시약의 전환이 상응하는 페녹시드의 염의 첨가를 필요로 하는 반면, 키랄 디올의 포스포로클로리데이트의 전환은 바람직한 염기로의 포스포로클로리데이트 자체의 형성이 염소 이온의 2 등가량을 생성시키므로 용해성 클로라이드 염의 추가 사용이 필요하지 않다. 일면에서, 디올의 인산화 반응이 완료되자마자, 이어서 반응 혼합물을 40 ℃ 내지 70 ℃의 범위로 가열하여 시스 이성질체를 트랜스 이성질체로 완전히 전환시킨다. 또다른 측면에서, 온도를 시약을 첨가하는 동안 사용된 온도와 동일하게 유지시킨다.
거울상이성질체 강화된 디올로부터 거울상이성질체 강화된 인산화제를 제조하기 위해, 탄소 C'에서의 키랄성의 보존이 중요하다. 상기 기재한 조건을 사용하여 단리된 트랜스-인산화 시약 중에서 디올에 대한 98％의 초기 e.e.를 85％ 미만으로 감소시키는 경우, 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올으로 부분 라세미화가 관찰된다. 본 발명의 일면에서, N-함유 헤테로아릴 용매를 사용하여 트랜스-인산화제의 광학 순도를 95％ e.e. 초과로 유지시킨다는 것을 밝혔다. 일면에서, N-함유 헤테로아릴 용매는 임의로 치환되는 피리딘, 퀴놀린 및 피라진이다. 또다른 측면에서, N 함유 헤테로아릴 용매는 임의로 치환되는 피리딘이다. 또다른 측면에서, N-함유 헤테로아릴 용매는 피리딘이다. 본 발명의 또다른 측면에서, 포스포로디클로리데이트 또는 포스포러스옥시클로라이드를 첨가하기 전에 거울상이성질체 강화된 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올의 염을 형성하고 후속적으로 염기를 첨가하는 것이 N-함유 헤테로아릴 용매의 사용을 필요로 하지 않으면서 C' 탄소의 에피머화를 방지하는데 도움을 준다는 것을 발견하였다. 일면에서, 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올의 염은 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올을 pka가 2 미만인 유기 또는 무기산과 반응시켜 제조된 염이다. 또다른 측면에서, 염은 pka가 1 미만인 무기산이다. 또다른 측면에서, 염은 염산염 및 부롬화수소산염이다. 시스 및 트랜스 이성질체는 컬럼 크로마토그래피 및(또는) 결정화의 조합으로 분리한다. 그러나 강화 단계를 수행한 후 95％ 초과의 트랜스-이성질체의 높은 순도 및 95％ 초과 e.e.의 인산화 시약을 생성하는 트랜스-이성질체의 단리가 매우 단순화된다는 것을 알았다. 일면에서, 트랜스-인산화 시약을 단리한다. 또다른 측면에서, 인산화 시약은 용액 중에 보관하고, 정제 없이 뉴클레오시드의 인산화를 위해 사용한다. 인 원자의 상대적인 배열은 31P NMR 스펙트럼의 비교로 측정한다. 적도형 포스포릴옥시 잔기 (트랜스-이성질체)의 화학 이동이 축형 이성질체 (시스-이성질체)보다 높은 장이다 (Verkade, et al., J. Org. Chem. 42, 1549 (1977)).
2.0 araCMP의 시스-전구약물의 합성
화학식 I의 시스-전구약물의 합성을 위해, 전구약물 잔기를 합성의 상이한 단계에 도입할 수 있다. 이들 기의 다양한 반응 조건에의 일반적인 감수성 때문에 후기 단계에서 가장 자주 시클릭 포스페이트를 도입한다. 합성은 보호되는 또는 보호되지 않는 시타라빈을 사용하여 진행될 수 있다. 시스-전구약물의 단일 입체이성질체는 컬럼 크로마토그래피 및(또는) 결정화의 조합에 의한 부분입체이성질체의 분리 또는 거울상이성질체 강화된 인산화제를 사용한 거울상이성질체특이적 합성으로 제조될 수 있다.
2.1. 시타라빈의 보호
araC (Merck Index 11th Edition, No. 2790)의 다양한 제제 및 이의 유사체가 참고문헌 (예를 들어, 미국 특허 제3,116,282호; [Shen et al., J. Org. Chem. 30: 835-838 (1965)]; [Hessler, J. Org. Chez. 41 (10): 1828-1831 (1976)])에 기재되어 있으며, 당업자에게 공지되어 있다.
시타라빈은 또한 샹하이 프리만 인터네셔날 트레이딩 캄파니 (Shanghai Freeman International Trading Co.), 브랜트포드 (Brantford), 시그마 (Sigma), 플루카 (Fluka) 및 선레이 파마슈티칼즈 (Sunray Pharmaceuticals)를 포함하나 이로써 제한되지 않는 판매원으로부터 구입할 수 있다.
보호된 시타라빈의 인산화를 위한 일반적인 절차는 적합하게 보호된 시타라빈 중간체를 염기와 반응시키고, 생성된 알콕시드를 인산화 시약과 반응시켜 수행한다. 보호된 시타라빈은 당업자에 의해 뉴클레오시드의 보호에 대해 기재된 다수의 절차 중 하나를 사용하여 제조될 수 있다 (Greene T. W., Protective Group in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)). 뉴클레오시드 상의 모든 나머지 히드록실 기 및 다른 관능기를 보호하는 것이 인산화 단계를 방해하거나 위치이상질체를 생성할 수 있는 반면, 뉴클레오시드를 포스페이트기를 첨가할 5'-히드록실기를 노출시키는 방식으로 보호한다. 일면에서, 선택된 보호기는 강염기, 예를 들어, 에테르 및 실릴 에테르이다. 또다른 측면에서, 상기 보호기는 임의로 치환되는 MOM 에테르, MEM 에테르 및 트리알킬실릴 에테르이다. 또다른 측면에서, 보호기는 t-부틸디메틸실릴 에테르이다. 추가 보호는 임의의 산성 프로톤을 제거하는 시타라빈의 4-질소의 차폐를 수반한다. 일면에서, 선택된 N-보호기는 디알킬 포름아미드, 모노 및 디알킬 이민, 모노 및 디아릴 이민의 군으로부터 선택된다. 일면에서, N-보호기는 디알킬 포름아미드 및 모노-알킬 이민 및 모노 아릴 이민의 군으로부터 선택된다. 일면에서, 모노-알킬 이민은 벤질이민이고, 모노-아릴 이민은 페닐이민이다. 또다른 측면에서, N-보호기는 디메틸포름아미드 및 디에틸포름아미드의 군으로부터 선택된 대칭성 디알킬 포름아미드이다.
일면에서, 시타라빈의 보호는 하기의 4-단계 절차에 의해 달성된다. 시타라빈을 DMPU 중에 벤조일 클로라이드로 처리하여 벤조에이트 에스테르를 수득한다. 에스테르를 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드와 함께 가열하여 디실릴 및 모노실릴 화합물의 혼합물을 수득한다. 조질의 혼합물을 에탄올성 히드라진으로 처리하여 에스테르를 분해한다. 수성 후처리 및 염산염으로서의 정제로 목적하는 2',3'-디실릴시타라빈을 단일 본체로서 수득한다. 이를 디메틸포름아미드 디메틸아세탈과 혼합하여 하기 화학식 D에 나타낸 바와 같은 보호된 시타라빈 포름아미드 화합물을 수득한다.
2.2. 보호된 시타라빈의 인산화
적합하게 보호된 시타라빈 상에 노출된 히드록실 기의 알콕시드의 생성을 염기 감수성이 아닌 비양성자성 용매, 예컨대 THF, 디알킬 및 시클릭포름아미드, 에테르, 톨루엔 및 이들 용매의 혼합물 중에 염기로 달성한다. 일면에서, 용매는 DMF, DMA, DEF, N-메틸피롤리딘, THF 및 이들 용매의 혼합물이다.
다수의 상이한 염기가 시클릭 및 비시클릭 인산화제로의 뉴클레오시드의 인산화에 사용되어 왔다. 예를 들어, 트리알킬아민, 예컨대 트리에틸아민 (Roodsari et al., J. Org Chem. 64 (21), 7727 (1999)) 또는 디이소프로필에틸아민 (Meek et al.,J. Am. Chem. Soc. 110 (7), 2317 (1988)); 질소 함유 헤테로시클릭 아민, 예컨대 피리딘 (Hoefler et al., Tetrahedron 56 (11), 1485 (2000)), N-메틸이미다졸 (Vankayalapati et al., J. Chem.. Soc. Perk T 114, 2187 (2000)), 1,2,4-트리아졸 (Takaku et al., Chem. Lett. (5) 699 (1986)) 또는 이미다졸 (Dyatkina et al., Tetrahedron Lett. 35 (13), 1961 (1994)); 유기금속 염기, 예컨대 칼륨 t-부톡시드 (Postel et al., J. Carbohyd. Chem. Lett 19 (2), 171 (2000)), 부틸리튬 (Torneiro et al., J. Org. Chem. 62 (18), 6344 (1997), t-부틸마그네슘 클로라이드 (Hayakawa et al., Tetrahedron Lett. 28 (20), 2259 (1987)) 또는 LDA (Aleksiuk et al., J. Chem.. Soc. Chem. Comm. (1) 11 (1993)); 무기 염기, 예컨대 세슘 플루오라이드 (Takaku et al., Nippon Kagaku Kaishi (10), 1968 (1985)), 수소화나트륨 (Hanaoka et al, Heterocycles 23 (11), 2927 (1985)), 요오드화나트륨 (Stromberg et al., J. Nucleos. Nucleot. 6 (5), 815 (1987)), 요오드 (Stromberg et al., J. Nucleos. Nucleot. 6 (5), 815 (1987)) 또는 수산화나트륨 (Attanasi et al., Phosphorus Sulfur 35 (1-2), 63 (1988)) 금속, 예컨대 구리 (Bhatia et al., Tetrahedron Lett. 28 (3), 271 (1987))이다. 그러나, 화학식 C의 인산화 시약의 커플링이 상기 기재된 절차를 사용하여 시도되었을 때 인 키랄 중심에서의 어떠한 반응 또는 라세미화도 관찰되지 않았다. 특히 상응하는 시클릭 포스페이트를 높은 수율로 생성하는 치환된 시클릭 인산화 시약과의 이전에 사용된 염기, 예컨대 수소화나트륨 (Thuong et al., Bull. Soc. Chim. Fr. 667 (1974)), 피리딘 (Ayral-Kaloustian et al., Carbohydr. Res. 187 (1991)), 부틸-리튬 (Hulst et al., Tetrahedron Lett. 1339 (1993)), DBU (Merckling et al, Tetrahedron Lett. 2217 (1996)), 트리에틸아민 (Hadvary et al., Helv. Chim. Acta 69 (8), 1862 (1986)), N-메틸이미다졸 (Li et al., Tetrahedron Lett. 6615 (2001)) 또는 나트륨 메톡시드 (Gorenstein et al., J. Am. Chem. Soc. 5077 (1980))과의 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 본 발명의 일면에서, 그리냐르 시약의 사용이 인 중심의 에피머화를 최소화하는 인산화를 촉진시킨다는 것을 알았다. 일면에서, 그리냐르 시약은 알킬 및 아릴 그리냐르이다. 또다른 측면에서, 그리냐르 시약은 t-부틸 마그네슘 할라이드 및 페닐 마그네슘 할라이드이다. 또다른 측면에서, 그리냐르 시약은 t-부틸마그네슘 클로라이드 및 페닐마그네슘 클로라이드이다.
본 발명의 또다른 측면에서, 마그네슘 알콕시드는 시타라빈의 마그네슘 5'-알콕시드를 생성하는데 사용한다. 일면에서, 마그네슘 알콕시드는 Mg(O-t-Bu)2 및 Mg(O-iPr)2의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 측면에서, 루이스산을 상기 기재한 염기의 하나로 제조된 5'-알콕시드의 용액에 첨가하여 알콕시드의 카르보양이온과 교환하고(거나) 인산화제로 형성된 알콕시드의 반응성을 조정할 수 있다. 루이스산의 예는 알칼리 염, 희토류염 또는 전이 금속 염을 포함한다. 일면에서, 루이스산은 마그네슘 염, 칼슘 염, 세슘 염, 알루미늄 염 또는 세륨 염을 포함한다. 또다른 측면에서, 루이스산은 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 브로마이드 및 마그네슘 요오다이드이다.
일면에서, 화학식 I의 화합물의 합성을 위한 반응 조건은 첫째는 그리냐르 시약 또는 다른 염기 중 하나로 알콕시드를 생성한 후, 마그네슘 염을 첨가하는 것이고, 두번째는 용액 중에, 일반적으로 동일한 용매 중에 (필수적인 것은 아님) 또는 고체로서 직접적으로 화학식 C의 인산화 시약을 뉴클레오시드의 용액에 첨가하는 것이다. 또다른 측면에서, 알콕시드의 용액을 인산화 시약의 용액에 첨가한다. 일면에서, 염기로 알콕시드를 생성하기 위한 온도는 -78 ℃ 내지 40 ℃의 범위로부터 선택된다. 일면에서, 온도는 -20 ℃ 내지 25 ℃의 범위로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 인산화 단계를 위한 온도는 -10 ℃ 내지 70 ℃의 범위로부터 선택된다. 또다른 측면에서, 온도는 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위로부터 선택된다.
그 다음, 상기 기재된 바와 같이 생성된 보호된 전구약물은 당업자에게 공지되고 (Greene T. W., Protective Group in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)), 포스페이트 전구약물의 안정성과 상화되는 다수의 방법 중 하나를 사용하여 모든 보호기를 제거하기 위한 탈보호 단계를 수행한다. 일면에서, 탈보호 시약은 존재하는 경우, 실릴 보호기를 제거하는 플루오라이드 염, 산 불안정 보호기, 예컨대 실릴 및(또는) 케탈 및 N-보호기를 제거하는 무기 또는 유기산을 포함한다. 또다른 측면에서, 탈보호 시약은 TBAF, 염산 용액 및 수성 TFA 용액이다. 또다른 측면에서, 탈보호 시약은 염산 용액이다. 최종 전구약물 뿐 아니라 모든 중간체의 단리 및 정제를 컬럼 크로마토그래피 및(또는) 결정화의 조합으로 달성하여 화학식 I의 화합물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 단일 이성질체를 합성하는 방법을 제공한다. 시클릭 포스페이트 시약 상의 C'에서 입체이성질체생성 중심의 존재함으로 인해, 이 탄소 원자는 2개의 개별적인 배향성, 즉 R 또는 S를 가질 수 있다. 이처럼 화학식 C의 트랜스-포스페이트 시약은 S-트랜스 또는 R-트랜스 배열로서 존재할 수 있으며, 이들 2가지 시약은 거울상이성질체이다. 따라서, 라세미 디올로부터의 인산화제의 합성은 R-트랜스 및 S-트랜스 이성질체의 라세미 혼합물을 생성시킨다. 또한, 시타라빈이 키랄이므로, 이 뉴클레오시드의 라세미 트랜스-포스페이트 시약으로의 인산화는 화학식 I의 2가지 부분입체이성질체 시스-전구약물의 혼합물을 생성시킬 것이다. 이들 화합물은 컬럼 크로마토그래피 및(또는) 결정화의 조합으로 분리시킬 수 있다. 별법으로, 시타라빈의 알콕시드를 거울상이성질체 강화된 트랜스-포스페이트 시약으로 인산화하여 단일 시스-전구약물을 생성시킨다. 이처럼 화학식 B의 디올로부터 제조된 C'-S-트랜스-포스페이트 시약의 반응은 화학식 III의 C'-S-시스-전구약물을 생성시키는 반면, C'-R-트랜스-포스페이트 시약으로의 반응은 C'-R-시스-전구약물을 생성시킨다.
또다른 측면에서, 트랜스-포스페이트 시약으로의 시타라빈의 반응 속도와 비교하여 시스-포스페이트 시약의 트랜스-포스페이트 시약으로의 에피머화의 속도에 따라, 시스-인산화 시약이 여전히 시타라빈의 시스-전구약물을 생성한다다는 것을 발견하였다. 이러한 측면에서, 시스-인산화 시약은 소량의 전구약물의 형성에 의해 생성된 미량의 이탈기로 트랜스-포스페이트 시약으로 에피머화시킨다. 그 다음, 시타라빈은 시스-전구약물을 제공하는 동일계에서 생성된 트랜스-포스페이트 시약과 반응한다. 또다른 측면에서, 시타라빈은 시스-전구약물을 생성시키는 인산화 시약의 조질의 혼합물과 반응한다. 일면에서, 인산화 시약의 조질의 혼합물은 트랜스-이성질체 중에 강화된다. 또다른 측면에서, 인산화 시약은 강화 단계 없이 사용한다.
2.3. 비보호된 시타라빈의 인산화
별법으로, 시타라빈의 전구약물은 1차 히드록실 기를 선택적으로 인산화하는 반응 조건을 사용하여 사전 보호 없이 합성할 수 있다. 뉴클레오시드, 예컨대 araC의 아실 클로라이드로의 선택적 5'-아크릴화가 잘 확립되어 있다 (Gish et al., J. Med. Chem. 14, 1159 (1971)). 그러나, 인산화제가 보다 반응성인 것으로 고려되기 때문에, 추정컨대 이들은 위치선택성이 적어지고, 수율을 낮출 뿐 아니라 반응에 사용된 용매 (DMF)와 반응을 일으킨다. 본 발명의 일면에서, 본 발명자들은 화학식 C의 인산화제와 비보호된 시타라빈을 반응시켜 높은 수율, 위치선택성 및 입체선택성으로 화학식 I의 5'-시스-포스페이트 전구약물을 생성한다는 것을 알았다. 일면에서, 단리된 인산화제를 시타라빈의 용액에 첨가한다. 또다른 측면에서, 시타라빈을 인산화 시약의 용액에 첨가한다. 유사하게, 화학식 B의 S-디올로부터 제조한 S-트랜스-인산화 시약의 반응이 화학식 III의 S-시스-전구약물을 생성하는 반면, R-트랜스-인산화 시약이 R-시스-전구약물을 생성한다. 일반적인 용매에서의 비보호된 뉴클레오시드의 불량한 안정성 및 용매와 인산화 시약의 잠재적 반응성으로 인해 인산화 시약과 낮은 반응성을 갖는 높은 유전 상수를 갖는 용매가 필요하다. 이러한 용매의 예는 테트라알킬우레아이다. 일면에서, 용매는 DMPU, 테트라메틸 우레아, DMEU, 트리메틸 포스페이트 또는 헥사메틸포스포르아미드이다.
실시예 1. 메틸-3-옥소-3-(피리드-4-일)-프로파노트 (1)의 합성
50 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 가열 맨틀 및 질소 주입구를 장착하였다. 플라스크에 THF (8 L) 및 칼륨 t-부톡시드 (5 kg, 44.6 mol)를 충전시킨 후, 추가 THF (18 L)를 충전시켰다. 온도의 상승을 동반하는 4-아세틸피리딘 (2.5 kg, 20.6 mol)의 첨가 후, 디메틸카르보네이트 (3.75 L, 44.5 mol)를 첨가하였다. 두 첨가 후, 혼합물 온도가 40 ℃를 초과하였다. 반응 혼합물을 2.5 시간 동안 가열없이 교반하였으며, 이 기간 동안 평균 온도가 55 ℃가 되도록 승온되었다. 이어서, 혼합물을 3 시간 동안 57 내지 60 ℃로 가열하였다. 과정을 박막 크로마토그래피 (TLC)로 모니터링하였다. 가열원을 끄고, 혼합물을 밤새 서서히 냉각하였다 (15 시간). 그 다음, 혼합물을 45 cm 부흐너 (Buchner) 깔때기를 통해 여과하였다. 고체인 케토 에스테르의 칼륨 에놀레이트를 50 L 플라스크로 되돌리고, 수성 아세트산 (물 15 L 중 아세트산 3 L)로 희석하였다. 이 산성 혼합물을 t-부틸 메틸 에테르 (MTBE) (1 × 16 L, 1 × 12 L)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 수성 탄산나트륨 (Na2CO3) (물 12.5 L 중 1750 g), 포화된 수성 중탄산나트륨(NaHCO3)(8 L) 및 염수 (8 L)로 세척하였다. 황산마그네슘 (MgSO4) (500 g)을 사용하여 합한 유기 층을 밤새 (15 시간) 건조하였다. 건조된 유기 용액을 여과하고, 용매를 회전 증발기로 제거하여 6.4 kg 매스를 얻었다. 대략 용매의 반이 제거되 후 물질이 침전되기 시작하였다. 생성된 현탁액을 2 시간 동안 교반하면서 얼음조에서 냉각시켰다. 고체를 여과로 수집하고, MTBE (500 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 15 시간 동안 20 ℃로 건조하여 흐린 황색 고체로서 케토 에스테르 1 2425 g (60％ 수율)을 수득하였다.
MTBE 모액을 대략 1 L로 농축하였다. 생성된 현탁액을 얼음조에서 1 시간 동안 냉각시키고, 고체를 여과로 수집하고, MTBE (2 × 150 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 건조하여 두번째 수확물 240 g (6％)을 수득하였다.
TLC 조건: 반응 혼합물을 머크 (Merck) 실리카겔 60 플레이트를 사용하여 모니터링하였다 (2.5 × 7.5 cm, 250 마이크론; UV 램프: 1:2 THF/헥산 용매). 출발 물질의 Rf = 0.25; 생성물의 Rf = 0.3.
실시예 2. (S)(-)메틸-3-히드록시-3-(피리딘-4-일)-프로파노트 (2)의 합성
22 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 써머웰/온도계, 첨가 깔때기 (1 L) 및 냉각 용기 (비어 있음)를 장착하였다. 플라스크를 질소로 플러싱하고, 포름산 (877 g)으로 충전시키고, 얼음조로 냉각시켰다. 트리에틸아민 (TEA) (755 g)을 첨가 깔때기에 충전시키고, 교반된 포름산에 50 분의 시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 첨가의 말기로 갈수록 소산되는 온건한 발연이 있는 발열 반응이 있었다. 첨가를 완료한 후, 냉각조를 제거하고, 반응 용액을 디메틸포름아미드 (DMF) (5.0 L)로 희석하였다. 케토에스테르 1 (2648 g)을 한번에 첨가한 후, 흡열 반응 중에 DMF 추가 0.5 L를 첨가하였다. 케토에스테르 1이 용해되지 않는 시점에서 온도가 약 5 ℃로 내려갔다. 플라스크에 가열 맨틀을 장착하고, 교반된 혼합물을 16 ℃로 점차적으로 가열하여 모든 고체를 용해시켰다. 키랄 루테늄 촉매 (18.8 g) (10)을 한번에 첨가하고, 교반된 혼합물을 1 시간에 걸쳐 55 ℃로 가열하였다. 생성된 어두운 용액을 55 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC를 사용하여 반응이 완료된 때를 측정하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 (고진공 하의 부히 (Buchi) R152 회전 증발기, 조 온도 = 60 ℃) 갈색 오일 3574 g을 수득하였다. 오일을 디클로로메탄 (10 L) 중에 용해시키고, 5 gal. 부동 분별 깔때기로 옮겼다. 암색 용액을 포화된 중탄산나트륨 용액 (3.0 L)으로 세척하고, 그 다음 수성상을 디클로로메탄 (3.0 L)으로 추출하였다. 합한 디클로로메탄 추출물을 MgSO4 (300 g)로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 갈색 오일 3362 g을 수득하였다 (이론상 125％, 1HNMR에 의해 DMF 함유하였음). 이 실시예 및 하기 실시예를 위한 1H-NMR 분석은 베리안 게미니-200 MHz 스펙트로미터 (VARIAN GEMINI Spectrometer)로 수행하였다. 샘플은 지시한 용매에 용해시켰고, 화학 이동은 잔류한 용매에 관한 것이다.
TLC 조건: 반응 혼합물을 머크 실리카겔 60 플레이트를 사용하여 모니터링하였다 (2.5 × 7.5 cm, 250 마이크론; UV 램프: CH2Cl2 중 5％ MeOH: 출발 물질의 Rf = 0.44; 생성물의 Rf = 0.15).
1H NMR (CDCl3): δ 2.73 (d, 2H, J=1.5Hz), 3.73 (s, 3H), 4.35 (s, 1H), 5.11-5.19 (m, 1H), 7.31 (d, 2H, J=6.6Hz), 8.53 (d, 2H, J=6.0Hz)
e.e. = 87％ S 이성질체 (HPLC로 측정).
HPLC 조건:
컬럼: 키랄팩 (Chiralpak) AD, 0.46 × 25 cm; 이동상 = 10:90, 에탄올:헥산, 등용매; 유속 = 1.5 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 254 nm에서 UV 검출; r.t.: R-히드록시 에스테르 = 19.9 분; S-히드록시 에스테르 = 21.7 분.
실시예 3: S-(-)-1-(4-피리딜)-1,3-프로판디올 (3)의 합성
22 L, 4-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 써머웰/온도계, 첨가 깔때기 (2 L), 응축기 및 냉각 용기 (비어 있음)를 장착하였다. 플라스크를 질소로 플러싱하고 후속적으로 수소화붕소나트륨 (419 g) 및 1-부탄올 (9.0 L)로 충전시켰다. 조질의 히드록시에스테르 (2)를 1-부탄올 (1.0 L, 용액의 총 부피 = 3.2 L) 중에 용해시켰다. 히드록시에스테르 용액의 사분의 일 (800 mL)을 90 분에 걸쳐 서서히 교반된 수소화붕소나트륨 슬러리에 첨가하였다. 온도를 19 ℃ 에서 32 ℃로 상승시키자, 온건한 기체-제거가 일어났다. 혼합물을 45 분 동안 교반시키자, 온도가 36 ℃에서 최고에 이르렀다. 히드록시에스테르 용액의 두번째 사분의 일을 45분에 걸쳐 온도를 36℃ 에서 52 ℃로 상승시키면서 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 20 분 동안 교반시키자, 온도가 57 ℃에서 최고에 이르렀다. 이 혼합물을 얼음조를 사용하여 40 ℃로 냉각시키고, 히드록시에스테르 용액의 세번째 사분의 일을 45분에 걸쳐 첨가하였다. 다시, 온도는 38℃ 에서 51 ℃로 증가됨을 나타냈다. 혼합물을 20 분 동안 교반시키자, 온도는 57 ℃에서 최고에 이르렀다. 혼합물을 38 ℃로 냉각시키고, 히드록시에스테르 용액의 마지막 사분의 일을 25 분에 걸쳐 첨가하자, 이 시점에는 분명한 발열 반응이 나타나지 않았다. 45 ℃의 온도에서 혼합물을 40 분 동안 교반한 다음, 플라스크에 가열 맨틀을 장착하고, 교반된 혼합물을 2.5 시간에 걸쳐 80 ℃로 가열시켰다. 혼합물을 3 시간 동안 80 내지 85 ℃에서 교반시켰다. 혼합물을 12 시간 동안 점차적으로 주위 온도로 냉각시켰다. TLC를 사용하여 다시 반응의 완료를 모니터링 하였다. 반응 혼합물을 탄산칼륨 수용액 (20 wt％, 5.2 L)으로 켄칭하고, 혼합물을 10 분 동안 교반시켰다. 층을 분리하고, 부탄올상 층을 탄산칼륨 수용액 (20 wt％, 2.6 L) 및 염화나트륨 용액 (15 wt％, 1.3 L)으로 세척하였다. 용매를 감압하에 제거하여 (Buchi R152 회전 증발기, 고진공, 조 온도 = 60 ℃) 황색 반-고체를 수득하였다. 아세토니트릴 (3 L)을 증발기 플라스크로 공급하고, 용매를 감압하에 증발시켰다. 아세토니트릴 (9 L)을 다시 증발기 플라스크로 공급하고, 슬러리를 15 분 동안 60 ℃ (조 온도 = 65 ℃, 대기압)에서 교반시켰다 (회전 증발기 상에서 회전시킴). 뜨거운 슬러리를 SiO2의 여과제 (셀라이트 (Celite) 521) (아세토니트릴 1 L 중의 슬러리로서 250 g을 24 cm 부흐너 깔때기 상에서 미리 포장하였음)를 통해 여과하였다. 여액을 감압하에 부분적으로 농축하고 (증류액 4 L를 수집하였음), 생성된 슬러리를 대기압하에 회전 증상기 상에서 가열하여 모든 고체를 용해시켰다 (조 온도 = 65 ℃). 가열원을 끄고, 생성된 용액을 주위 온도로 점차 냉각시키면서 회전 증발기 상에서 16 시간 동안 교반시켰다. 생성된 혼합물을 여과하고, 수집된 고체를 아세토니트릴 (2 × 200 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하여 (-30 in. Hg, 55 ℃, 4 시간) 연황색 고체로서 수득하였다 (3, 436 g, 39％).
융점 = 98 내지 100 ℃
e.e. = 98％ S 이성질체 (HPLC로 측정).
HPLC 조건: 컬럼: 키랄팩 AD, 0.46 × 25 cm; 이동상 = 10:90, 에탄올:헥산, 등용매; 유속 = 1.5 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 254 nm에서 UV 검출; r.t.: R-디올 = 12.7 분; S-디올 = 14 분.
실시예 4. (4S)-(-)-트랜스-4-(4-피리딜)-2-(4-니트로페녹시)-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난 (4)의 합성
자기 교반기 및 질소 주입구가 장착된 1 L 둥근 바닥 플라스크를 디올 3 (100 g, 0.65 mol) 및 피리딘 (500 mL)으로 충전하였다. 디올 3이 완전히 용해될 때까지 혼합물을 실온에서 격렬하게 교반하였다. 3의 용해성이 TEA에 의해 작아졌다. 개별적인 3 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 열전대, 1 L 첨가 깔때기 및 질소 주입구를 장착하였다. 이 용기를 4-니트로페닐 포스포로디클로리데이트 (166.4 g, 0.65 mol)로 충전시키고, 얼음조에 위치시킨 다음, 피리딘 (500 mL)을 첨가 깔때기를 통해 도입하였다. 생성된 혼합물을 얼음조 온도에서 15 분 동안 교반하였다.
3을 완전히 용해시킨 후 (대략 0.5 시간), TEA (190 mL, 1.36 mol)를 첨가하자 약간 흐려졌으며, 황갈색 용액을 3 L 플라스크 상의 첨가 깔때기로 옮기고, 2 시간 40 분에 걸쳐 냉각시킨 디클로리데이트 용액에 첨가하였다. 반응은 발열반응이고, 첨가율을 유지시켜, 반응 온도가 6 ℃를 넘지 않았다. 첨가를 완료한 후, 얼음조를 실온 수조로 대체시키고, 3 시간 동안 계속 교반시켰다.
이 시간 동안, 개별적인 3 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 열전대, 250 mL 첨가 깔때기 및 질소 주입구를 장착하였다. 이어서, 이 플라스크를 수소화나트륨 (15 g, 0.38 mol) 및 THF (100 mL)로 충전시키고, 첨가 깔때기를 THF (100 mL) 중 4-니트로페놀 (67.5 g, 0.49 mol)의 용액으로 충전시켰다. 이어서, 플라스크를 얼음조에 위치시키고, 니트로페놀 용액을 수소화나트륨의 냉각된 현탁액에 서서히 첨가하였다. 니트로페놀을 첨가하는 동안 40 ℃ 미만의 온도를 유지하였다. 기체 발생의 중단이 첨가가 완료되었음을 나타내었다. 생성된 밝은 오렌지색 현탁액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다.
디올 (3) 후, HPLC로 디클로리데이트 반응이 완료되었음을 판단하고, 암색 현탁액을 진공 여과하였다. 유리기구 및 여과 케이크 (TEA-HCl)를 THF (100 mL)로 세정하고, 합한 여액 및 세정액을 오렌지색인 나트륨 4-니트로페녹시드 현탁액에 부었다. 그 다음, 생성된 혼합물을 4 시간 동안 40 ℃에서 가열하고, 시스/트랜스 평형화를 HPLC로 모니터링하였다. 가열 맨틀을 끄고, 반응물을 실온에서 교반하였다. 조질의 반응 혼합물을 여과제, SiO2 (셀라이트 521, 0.5 인치)를 통해 여과하고, 유리기구 및 셀라이트를 디클로로메탄 200 mL로 세정하였다. 합한 여액 및 세정액을 회전 증발기 상에서 감압하에 (오일 펌프) 30 내지 35 ℃로 농축시켰다. 생성된 점성 흑색 발포성 타르를 1.0 M aq HCl (1.5 L) 및 에틸 아세테이트 (800 mL) 중에 용해시키고, 4 L 분별 깔때기로 옮기고, 상을 분리하였다. 에틸 아세테이트 층을 1.0 M aq HCl의 추가 300 mL 일부로 세척하였다. 디클로로메탄 (750 mL)을 합한 수성층에 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 교반하면서, 이를 고체 중탄산나트륨을 사용하여 pH 7 내지 8로 조심스럽게 중화시켰다. 용액을 다시 4 L 분별 깔때기로 옮기고 층을 분리하였다. 수성층을 디클로로메탄 (750 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 건조하였다. 생성된 건조 잔류물을 이소프로판올 (200 mL) 중의 슬러리로서 교반하고, 여과하여 포스페이트 4 190 g을 수득하였다.
조질의 4를 디클로로메탄 (600 mL) 중에 용해시키고, 활성 탄소 (다르코(Darco)) 10 g의 존재하에 10 분 동안 교반하고, SiO2 (셀라이트 521, 0.5 인치)를 통해 여과하였다. 플라스크 및 셀라이트를 디클로로메탄 (150 mL)으로 세정하고, 합한 여액 및 세정액을 다시 농축하여 건조하였다. 생성된 고체를 분말화하고, 50 ℃에서 이소프로판올 (250 mL) 중의 슬러리로서 교반하였다. 1 시간 후, 슬러리를 실온으로 냉각하고, 후속적으로 여과를 위해 얼음조 온도로 냉각하였다. 고체를 진공 오븐에서 55 ℃로 16 시간 동안 건조시켜 베이지색 고체로서 포스페이트 4 154.6 g (70％)을 수득하였다.
융점 = 140 내지 142 ℃
특정 회전 = -80.350 ° (c = 1.0, MeOH)
HPLC 조건: 컬럼: 키랄팩 AD, 0.46 × 25 cm; 이동상 = 50:50, 2-프로판올:헥산, 등용매; 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 254 nm에서 UV 검출; r.t. = 6.6 분., 99+％ 트랜스
e.e. = 99+％
실시예 5. S'-O-벤조일시타라빈 (5)의 합성
12 L, 4-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 열전대 및 질소 주입구를 장착하였다. 용기를 시타라빈 (500 g, 2.06 mol) 및 DMPU (1 L)로 충전시켜 점성이하나 교반가능한 용액을 수득하였다. 디옥산 (617 mL, 2.47 mol) 중의 HCl 용액을 온도를 52 ℃로 상승시키면서 한번에 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 교반하고, 27 ℃로 냉각하였다. 벤조일 클로라이드 (578 g, 4.11 mol)를 첨가하고, 혼합물을 온도를 처음 30 분 동안 34 ℃로 상승시키고 22 시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 2.5 시간 후, 온도를 25 ℃로 낮추었다. 물 (2.5 L)을 첨가하고, 혼합물을 온도를 37 ℃로 상승시키면서 30 분 동안 교반시켰다. 생성된 층을 분리하고, 수성층을 디클로로메탄 (2 × 1 L)으로 추출하였다. 합한 유기층을 10％ (vol/vol) 수성 HCl (2 × 500 mL)로 추출하였다. 합한 수성층을 12 L 플라스크에 충전시키고, 물 (1.5 L)로 희석시키고, 얼음조에서 냉각시켰다. 30％ (wt/wt) 수성 NaOH (850 mL)를 첨가하여 pH를 10으로 조정하였다. 중화하는 동안 14 ℃ 에서 21 ℃로의 온도 증가가 30분의 첨가 기간 동안 있었다. 침전 형성이 pH 3에서 일어나기 시작하였다. 얼음조에서 방치하면서, 생성된 점성 현탁액을 8 시간 동안 교반하였다. 고체를 24 cm 부흐너에 수집하였다. 케이크를 물 (2 L)로 세척하고, 밤새 깔때기에서 부분적으로 건조하였다. 생성된 고체 물질을 진공 오븐에서 16 시간 동안 70 ℃로 건조하여 5'-O-벤조일시타라빈 (5) 659 g (92％ 수율)을 수득하였다. 칼 피셔 (Karl Fischer)로 측정한 물 함량이 너무 높았고, 이 물질을 재결정화하였다. 12 L 플라스크를 (5), 메탄올 (5 L) 및 에탄올 (3 L)로 충전시키고, 이 혼합물은 교반 후에 증점되었다. 혼합물을 환류에서 가열하여 투명한 황색 용액을 수득하였다. 혼합물을 증류액 2 L가 수집될 때까지 대기압에서 증류시켰다. 에탄올 (2 L)를 첨가하고, 1 L가 더 수집될 때까지 계속 증류시켰다. 증류를 종료하였을 때, 온도는 79 ℃였다. 가열원을 끄고, 혼합물을 21 ℃로 냉각시키고, 19 시간 동안 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 에탄올 (1 L)로 세척하고, 진공 오븐에서 36 시간 동안 70 ℃로 건조시켜 백색 결정질 고체로서 화합물 5 508 g (71％)을 수득하였다.
HPLC 조건: 컬럼: 조르박스 이클립스 (Zorbax Eclipse) XDB-C8; 용매 A = 20 mM 인산나트륨 완충액 중 5％ 아세토니트릴; 용매 B = 물 중 80％ 아세토니트릴; 구배; 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 270 nm에서 UV 검출; r.t. = 4.3 분.
실시예 6. 5'-O-벤조일-2,3'-디-O-TBS-시타라빈 (6)의 합성:
12 L, 4-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 열전대, 응축기 및 질소 주입구를 장착하였다. 플라스크를 피리딘 (703 mL, 8.64 mol), DMF (1 L) 및 (5)로 충전하였다. 혼합물을 5 분 동안 교반하였다. 화합물 (5)를 용매에 첨가하여 용해를 촉진하였다. tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (TBSCl)를 첨가한 후, DMF (500 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 HPLC로 때때로 모니터링하면서 44 시간 동안 93 ℃ ± 1 ℃에서 가열하였다. 혼합물을 51 ℃로 냉각시키고, 메탄올 (250 mL)을 첨가하여 반응하지 않은 TBSCl을 켄칭하였다. 혼합물을 4.5 시간 동안 교반한 이후, 물 (2 L)를 첨가하였다. 추가 40 분 동안 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 L)로 추출하였다. 상부의 유기층을 10％ 수성 HCl (2 × 2 L), 7％ 수성 NaHCO3 (2 × 2 L) 및 10％ 수성 NaCl (2 L)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조하고, 여과하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하여 1.3 kg 중량의 점성 흑색 오일로서 조물질 (6)을 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 이후 반응에 사용하였다.
HPLC 조건: 컬럼: 조르박스 이클립스 XDB-C8; 용매 A = 20 mM 인산나트륨 완충액 중 5％ 아세토니트릴; 용매 B = 물 중 80％ 아세토니트릴; 구배; 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10 ㎕ 270 nm에서 UV 검출; r.t. 디-실릴 = 10.1 분; r.t. 모노실릴 = 6.9 분
실시예 7. 2',3'-디-O-TBS-시타라빈 히드로클로라이드 (7)의 합성
12 L, 4-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 상부에 질소 버블링기를 장착한 응축기, 열전대 및 가열 맨틀을 장착하였다. 플라스크를 에탄올 (2.3 L) 중 조질의 (6)의 용액 및 히드라진 (185 g, 5.76 mol)으로 충전하였다. 혼합물을 HPLC로 모니터링하면서 15 시간 동안 80 ℃에서 가열하였다. 가열 맨틀을 제거하고, 혼합물을 2 시간에 걸쳐 35 ℃로 냉각시켰다. 암색의 용액을 15％ 수성 NH4Cl (4 L)로 붓고, 에틸 아세테이트 (4 L)로 추출하였다. 유기상을 15％ 수성 NH4Cl (2 L)로 세척한 다음, 회전 증발기 상에서 점성 오일로 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 (3 L) 중에 용해시키고, 큰 분별 깔때기로 옮겼다. 물 (3 L) 중 HCl의 10％ 용액을 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 교반하였다. 생성된 흐린 용액을 헥산 (2 × 3 L)으로 추출하였다. 헥산 추출 후에 두 상은 투명하였다. 증류액 3 L가 수집될 때까지 (7)을 함유하는 저급 수성/아세토니트릴 층을 회전 증발기 상에서 농축시켰다. 물 (3 L)을 첨가하고, 추가 용매 대략 500 mL가 제거될 때까지 증류를 계속하였다. 증류를 정지한 후 잔류한 점성 슬러리로 2 L를 제거한 후 침전물이 형성되었다. 24 cm 부흐너 깔때기 중에 고체를 여과로 수집하고, 케이크를 물 (2 × 1 L) 중 5％ vol/vol 아세토니트릴로 세척하였다. 습윤 고체 (2.6 kg)를 12 L 플라스크에 옮기고, 45 분 동안 5％ 아세토니트릴/물 (6 L)로 세척하였다. 고체 여과로 수집하고 (서서히), 물 (1 L)로 세척하고, 진공 오븐에서 46 시간 동안 65 ℃로 건조하여 644 g (88％)을 수득하였다. 정제를 HPLC 및 1H NMR (DMSO-d6)로 측정하고, 조물질을 12 L 플라스크에 충전시켰다. 에틸 아세테이트 (4 L)를 첨가하고, 혼합물을 환류에서 1 시간에 걸쳐 가열한 다음, 1 시간 동안 환류에서 모니터링하였다. 혼합물을 3 시간에 걸쳐 25 ℃로 냉각시켰다. 생성된 고체 (7)를 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 진공 오븐에서 24 시간 동안 65 ℃로 건조하여 회백색 고체 (335 g, 46％)를 수득하였다.
모액을 포화된 수성 NaHCO3으로 중화시키고, 상을 분리하였다. 유기상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 회전 증발기 상에서 증발시켜 점성 갈색 오일 283 g을 수득하였다. 이 물질을 2％ MeOH/디클로로메탄 다음 15％ MeOH/디클로로메탄으로 용출시키는 실리카겔 (1.1 kg) 상 크로마토그래피하였다. 투명한 생성물을 함유한 분획을 합하고, 용매를 증발시켰다. 생성된 잔류물, 2',3'-디-O-TBS시타라빈 유리 염기를 진공하에 밤새 건조하여 호박색 무정형 고체 (171 g)를 수득하였다.
HPLC 조건: 컬럼: 조르박스 이클립스 XDB-C8; 용매 A = 20 mM 인산나트륨 완충액 중 5％ 아세토니트릴; 용매 B = 물 중 80％ 아세토니트릴; 구배; 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 270 nm에서 UV 검출; r.t. = 7.4 분
실시예 8. 2',3'-디-O-TBS-시타라빈-N,N-디메틸포름아미딘 (8)의 합성:
오버헤드 교반기를 장착한 12 L, 4-구 플라스크를 (7) (333 g, 0.66 mol) 및 톨루엔 (2 L)으로 충전하였다. 물 (2 L) 중 NaHCO3 (110 g, 1.31 mol)의 용액을 첨가하고 이 혼합물을 15 분 동안 격렬하게 교반하였다. 다량의 고체가 여전히 존재하여 에틸 아세테이트 (2 L)를 첨가하였다. 15 분 내에, 모든 물질이 pH 8에서 용해되었다. 상을 분리하고, 유기상을 10％ 수성 NaCl 용액 (1.5 L)으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하여 중량이 398 g (이론치의 130％)인 백색 발포물로서 유리 염기를 수득하였다.
회전 증발기 플라스크 내에 2',3'-디-O-TBS-시타라빈 유리 염기 (실시예 7에서의 크로마토그래피로부터)를 상기 제조로부터의 유리 염기에 첨가하였다. 톨루엔 (2 L)을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 50 ℃로 가열하여 투명한 갈색 오일을 수득하였다. 용액을 12 L, 4-구 플라스크에 옮겼다. 톨루엔 (400 mL)을 사용하여 로토뱁 (rotovap) 플라스크를 세정하였다. DMF 디메틸 아세탈 (158 g, 1.32 mol)을 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 21 시간 동안 교반하고, 반응을 TLC로 모니터링하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하여 점성 오일을 수득하였다. 헥산 (1 L)을 첨가한 다음, 진공하에 제거하였다. 이 물질을 회전 증발기 상에서 60 ℃로 2 시간 동안 건조시켰으나 점성 오일이 여전히 남아있었다. 헥산 (2 L) 및 디클로로메탄 (2 L)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 50 ℃로 교반하여 투명한 갈색 오일을 수득하였다. 증류액 2 L가 수집될 때까지 혼합물을 대기압에서 증류하였다. 혼합물을 약간 냉각시키고, 잔류한 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 회전 증발기 상에서 15 시간 동안 건조하여 결질의 발포물을 수득하였다. 이 물질을 플라스크 옆면에서 긁어내고, 생성된 자유 유동성 고체를 25 ℃에서 24 시간 동안 진공하에 건조하여 황갈색 고체로서 화합물 8을 527.6 g (98％) 수득하였다.
TLC 조건: 반응 혼합물을 머크 실리카겔 60 플레이트를 사용하여 모니터링하였다. 2.5 × 7.5 cm, 250 마이크론; UV 램프: CH2Cl2 중 10％ MeOH; 출발 물질의 Rf = 0.4; 생성물의 Rf = 0.7.
실시예 9. 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9)의 합성
12 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 써머웰/온도계, 첨가 깔때기(1 L) 및 냉각조를 장착하였다. 플라스크를 질소로 플러싱하고 보호된 뉴클레오시드 8 (250 g, 0.47 mol) 및 THF (2.5 L)로 충전하였다. 교반된 용액을 4 ℃로 냉각하고 (얼음조), 온도를 8 ℃ 미만으로 유지하면서 t-부틸마그네슘 클로라이드 용액 (617 mL, 0.62)을 1 시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 용액을 얼음조 온도에서 1.25 시간 동안 교반하였다. 포스페이트 시약 (4) (262 g, 0.78 mol)를 한번에 첨가하고, 냉각조를 제거하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응물을 염화암모늄 용액 (20 wt％, 2.5 L)으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (2.5 L)로 희석하였다. 혼합물을 5 분 동안 교반하여 모든 잔류물을 용해시키고, 층을 분리하였다. 수성상을 에틸 아세테이트 (1.1 L)로 역추출하고, 합한 유기 상을 염화나트륨 용액 (15 wt％, 1.6 L)으로 세척하고, MgSO4 (260 g)로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 어두운 오렌지색 슬러지 526 g을 수득하고, 이를 HPLC (하기 HPLC 조건 참고) 분석하였다.
12 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 써머웰/온도계, 베이스 트랩/버블링기를 장착한 응축기 및 가열 맨틀을 장착하였다. 플라스크를 메탄올 (2.5 L) 중의 용액으로서 조질의 슬러지 및 HCl-디옥산 용액 (790 mL, 3.16 mol)으로 충전하였다. 교반된 오렌지색 용액을 50 ℃로 가열하고, HPLC (하기 HPLC 조건 참고)로 모니터링하면서 50 내지 55 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 점성 오렌지색 타르를 수득하였다. 증발 플라스크 (10 L)에 오버헤드 교반기/베어링 부품을 장착하고, 타르를 물 (800 mL) 및 에틸 아세테이트 (800 mL) 사이에서 분배하였다. 고체 중탄산나트륨을 2 내지 5 g씩 첨가하고, 기체 발생이 적어지고, 수성상의 pH가 7이 될 때까지 (광범위 pH 종이) 교반하였다. 층을 분리하고, 수성상을 에틸 아세테이트 (800 mL)로 다시 추출하였다. 수성상을 여과하고, 물을 감압하에 에탄올로 등비 증류를 통하여 증발시켜 (4 × 400 mL 에탄올, 에탄올을 후속적으로 첨가하여 수행하였음), 물을 점차 에탄올로 점차 대체됨에 따라 갈색 오일/고체 혼합물 445 g을 수득하였다. 에탄올 (700 mL)을 첨가하고, 슬러리를 주위 온도에서 2 시간 동안 교반하였다 (오버헤드 교반기).
9.1 생성된 혼합물을 여과하고, 수집된 고체를 에탄올 (2 × 50 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하여 (-30 in. Hg, 55 ℃, 2 시간) 베이지색 고체 199 g을 수득하였고, 이는 측정되지 않는 양의 NaCl를 함유하였다. 이 고체 물질을 자기 교반기를 장착한 1 L 둥근 바닥 플라스크에 옮겼다. 물 (200 mL)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 수집된 고체 (9)를 물 (2 × 25 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하였다 (-30 in. Hg, 55 ℃, 16 시간). 회수 = 대략 10％ NaCl을 함유하는 베이지색 분말 (9) 109 g.
9.2. 상기로부터의 에탄올 여액을 감압하에 농축시켜 점성 갈색 타르를 수득하였다. 타르를 가온하면서 메탄올 (200 mL) 중에 용해시키고, 생성된 점성 용액을 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 침전물이 형성되었다. 혼합물을 여과하고, 수집된 고체 (9)를 메탄올 (2 × 25 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하였다 (-30 in. Hg, 55 ℃, 16 시간). 회수 = 회백색 고체 6.22 g.
이 실시예로부터의 생성물 (9)는 2개의 개별 후처리 스트림으로부터 단리하였다 (9.1 및 9.2).
9.3. 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9)의 정제
2 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기를 장착하고, 개별 후처리 스트림으로부터의 합한 조물질 (9) 및 물 (650 mL)로 충전하였다. 슬러리를 교반하고, 고체가 용해될 때까지 진한 염산을 부분씩 첨가하였다 (34 mL가 필요하였음, 광범위 pH 종이에 의해 pH = 3). HCl의 처음 20 mL를 신속하게 첨가하였고, 나머지는 5 × 2 mL 및 4 × 1 mL 부분으로 첨가하였다. 오렌지색 용액을 여과하고, 플라스크에 다시 충전시켰다. 혼합물의 pH가 6 내지 7이 될 때까지 (광범위 pH 종이) 고체 중탄산나트륨 (36 g)을 2 내지 3 g으로 부분씩 첨가하였다. 혼합물을 기체 제거가 적어질 때까지 교반하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 다음 여과하였다. 수집된 고체를 물 (2 × 25 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하여 (-30 in. Hg, 55 ℃, 16 시간) 황-베이지색 과립 고체 (39.7％)로서 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] 133.0 g을 수득하였다.
C17H21N408P에 대한 원소 분석 계산치: C, 46.09; H, 4.85; N, 12.65. 실측치: C, 45.88; H, 4.72; N, 12.58.
HPLC 조건: 컬럼: 일련의 연결로 2개의 하기 컬럼: 아길렌트 (Agilent), 조르박스 이클립스 XDB-C8, 4.6 × 250 mm, 5㎛; 용매 A = 11％ 아세토니트릴/물 중 20 mM 인산나트륨 완충액; 용매 B = 탈이온수 중 50％ 아세토니트릴; 역상; 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 210 nm에서 UV 검출, 컬럼 온도 = 30 ℃; r.t. = 13.4 분 (S 이성질체); r.t. = 14.1 분 (R 이성질체)
HPLC 조건 A:
컬럼: 키랄팩 AD, 0.46 × 25 cm; 이동상 = 10:90, 에탄올:헥산, 등용매; 유속 = 1.5 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 254 nm에서 UV 검출. r.t. = 18.9 분.
HPLC 조건 B:
컬럼: 본드클론 (Bondclone) 10, C18, 300 × 3.9 mm; 용매 A: 20 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 6.2) 중의 10％ 아세토니트릴, 용매 B: 아세토니트릴; 구배; 유속 = 1.4 mL/분; 주사 부피 = 10 ㎕ 260 nm에서 UV 검출. r.t.= 5.8 분.
실시예 10. 키랄 루테늄 촉매 (10)의 합성
3 L, 3-구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기 및 써머웰/온도계를 장착하였다. 플라스크를 질소로 플러싱하고, 루테늄 착물 (32.0 g), (1S,2S)-(+)-N-p-토실-1,2-디페닐에틸렌디아민 (38.24 g) 및 이소프로판올 (1.0 L)로 충전시켰다. 트리에틸아민 (30.0 mL)을 교반된 슬러리에 첨가하고, 함유물을 1 시간에 걸쳐 80 ℃로 가열하였다. 오렌지색 혼합물을 1 시간 동안 80 ℃에서 교반한 다음, 가열 맨틀을 제거하고, 교반된 혼합물을 주위 온도로 45 분에 걸쳐 냉각하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 어두운 오렌지색 고체를 수득하였다. 메탄올 (320 mL)을 첨가하고, 교반된 슬러리를 50 ℃로 가열하였다. 혼합물을 50 ℃에서 15 분 동안 교반한 다음, 30 분에 걸쳐 주위 온도로 점차 냉각하였다. 혼합물을 얼음조 온도에서 추가 30 분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 수집된 고체를 메탄올 (2 × 15 mL)로 세척한 다음, 일정한 중량으로 건조하여 (-30 in. Hg, 50 ℃, 1 시간) 오렌지색 고체 (80％ 수율)로서 촉매 53.1 g을 수득하였다.
실시예 11. 디올의 염산염을 사용한 (4S)-(-)-(S)-(-)-(4-피리딜)-2-(4-니트로페녹시)-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난 (4)의 합성
1 리터 3-구 둥근 바닥 플라스크에 기계적 교반기, 첨가 깔때기, 온도계 및 N2 주입구를 장착하였다. 플라스크를 S(-)-1-(피리드-4-일)-프로판-1,3-디올 (25 g, 163.4 mmol) 및 에틸 아세테이트 (250 mL)로 충전시키고, 생성된 현탁액을 디옥산 (43 mL, 176 mmol) 중 4 N HCl 용액으로 15 분의 기간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 실온에서 30 분 동안 교반한 후, 4-니트로페닐포스포로디클로리데이트 (41.81 g, 163.4 mmol)를 고체로서 N2의 양성 흐름하에 가능한 한 빨리 첨가하였다. 반응 혼합물의 내부 온도를 드라이아이스-아세톤 냉각조를 사용하여 -10 ℃로 조정하였다. 반응 온도를 -5 ℃ 미만으로 유지하면서 에틸 아세테이트 (100 mL) 중 트리에틸아민 (57.76 g, 79 mL, 572 mmol)의 용액을 첨가하였다. 트리에틸아민 용액의 첨가를 완료한지 30 분 후, 냉각조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 트리에틸아민-염산염을 제거하고, 이를 여액이 희미한 흡수를 보일 때까지 에틸 아세테이트 (3 × 30 mL)로 세척하였다. 여액을 감압하에 증발시켜 부피를 150 내지 175 mL로 감소시켰다. 4-니트로페놀 (7.5 g, 54.3 mmol) 및 트리에틸아민 (9 mL)을 농축된 용액에 첨가하고, 생성된 오렌지색 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 중에 형성된 고체를 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트 (2 × 25 mL) 및 메틸 t-부틸 에테르 (25 mL)로 세척하고, 진공하에 55 ℃에서 건조하여 목적하는 생성물 31.96 g (58.4％)을 수득하였다. 실시예 4와 분석 데이타는 동일하다.
실시예 12: (4S)-(-)-트랜스-(4-피리딜)-2-클로로-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난 (11)의 합성
자기 교반 막대를 장착한 오븐 건조된 250 mL 둥근 바닥 플라스크를 S-(-) 1-(4-피리딜)-1,3-프로판디올 3.49 g으로 충전시킨 후, 아세토니트릴 60 mL로 충전시켰다. 비균질 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반한 다음, 디옥산 용액 중 4 M HCl 5.7 mL로 5 분에 걸쳐 서서히 처리하였다. 1 시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 POCl3 2.16 mL로 주사기를 통해 한번에 처리하였다. 개별적인 25 mL 플라스크에서 DABCO 2.68 g을 아세토니트릴 15 mL 중에 질소하에 용해시키고, 주사기 또는 첨가 깔때기를 통해 반응 혼합물로 5 분에 걸쳐 옮겼다. 약간의 발열반응이 DABCO 용액의 첨가의 끝에서 관찰되었다 (+ 10 ℃). 반응 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였으며, 이 동안 반응 혼합물은 비균질하게 남아있었다. 반응 혼합물의 적은 샘플을 취해 건조 N2의 제트로 빠르게 증발시키고, 잔류물을 DMSO-d6 중에 용해시켜 1H-NMR 스펙트럼을 수행하였다.
1H NMR (DMSO d6, 배리안 게미니 200 MHz): C'-프로톤: 트랜스-이성질체 5.85-5.75 (d, 1H).
실시예 13. 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9)의 합성
방법 A:
자기 교반 막대를 장착한 오븐 건조된 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 시타라빈-HCl 3.35 g 및 DMPU 6.0 mL로 충전시켰다. 이 플라스크로 실시예 12로부터의 반응 혼합물을 직접 여과하고, DABCO-HCl 염을 아세토니트릴 (1 × 15 mL)로 빠르게 세척하였다. 휘발물을 회전 증발기 상에서 흡입기 진공하에 제거하였다 (조 온도 < 35 ℃). 잔류성 오일을 고진공 하에 간단히 방치하고, 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 MeOH 100 mL로 처리하고, 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 메탄올 중 25 wt％ NaOMe 용액을 사용하여 7.0으로 조정하였다 (대략 13 mL가 필요하였음). 이 단계에서 반응 혼합물은 탁해졌다. HPLC를 수행하여 반응 프로파일의 일체성을 보증하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조하고, 잔류물을 30 분 동안 실온에서 디클로로메탄 50 mL와 교반하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 메틸렌 클로라이드 (1 × 20 mL)로 세척하고, 플라스크에 다시 옮기고, 15 분 동안 디클로로메탄 50 mL로 다시 교반하고, 여과하였다. 고체를 에탄올 200 mL로 1 내지 2 시간 동안 교반하고, 여과하고, 에탄올 (2 × 10 mL)로 세척하였다. 여액을 증발시켜 건조하여 백색 고체 4.90 g을 수득하였다. 이 고체를 H2O 10 mL 중에 용해시키고, 실온에서 밤새 교반하여 고체를 수득하였고, 이를 여과로 수집하고, 물 (2 × 3 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 건조하여 화합물 9 1.38 g, (26％)을 수득하였다.
방법 B:
단계 A: 시타라빈 히드로클로라이드의 합성
오버헤드 교반기 및 열전대를 장착한 5 L, 3-구 플라스크에 시타라빈 (500 g, 2.06 mol) 및 메탄올 (2.0 L)을 충전시켰다. 현탁액을 2 ℃로 냉각시켰다. HCl 기체를 버블링하여 매우 점성 혼합물을 수득하고, 25 ℃로 발열되었다. 현탁액을 메탄올 (0.5 L)로 희석하여 교반을 용이하게 하였다. HCl 기체 108 g (2.96 mol) 전체를 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 20 ℃에서 교반한 다음, 여과로 고체를 수집하였다. 고체를 MTBE (3 × 250 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 70 ℃로 건조하여 솜털형 백색 고체로서 시타라빈 히드로클로라이드 555 g (96％ 수율)을 수득하였다.
단계 B: 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드의 합성
1 L 재킷 실린더형 반응기에 오버헤드 교반기, 열전대 및 2개의 첨가 깔때기 (60 mL 및 125 mL)를 장착하였다. 반응기를 질소로 플러싱하고, DMPU (188 mL, 195.8 g)로 충전하였다. 교반된 용액을 -16 ℃로 냉각하였다 (줄라보 (Julabo) F32 칠러/순환기).
디올 용액: 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 자기 교반 막대 및 온도계를 장착하였다. 플라스크를 S-(-)-1-(피리드-4-일)-1,3-프로판디올 (50.0 g), DMPU (62.5 mL, 64.5 g) 및 피리딘 (25.8 g)으로 충전한 다음, 질소 분위기하에 두었다. 교반된 함유물을 40 ℃로 가열하고 (수조), 모든 고체가 용해될 때까지 (10 분) 40 내지 42 ℃에서 교반하였다. 생성된 흐린 오렌지색 용액을 22 ℃로 냉각한 다음, 125 mL 첨가 깔때기에 충전시켰다 (부피 = 127 mL).
POCl3 용액: 125 mL 엘렌마이어 플라스크를 아세토니트릴 (22.9 g) 및 포스포러스옥시클로라이드 (50.0 g)로 충전하였다. 잘 혼합한 후, 무색 용액을 60 mL 첨가 깔때기로 옮겼다 (부피 = 60 mL).
온도를 -11 ℃ 미만으로 유지하면서, 두 용액을 1 L 반응기에 2.6 시간에 걸쳐 동시에 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 온도를 -11 ℃ 내지 -17 ℃로 유지하면서, 점성있는 흐린 오렌지색 용액을 교반하였다. 반응 용액의 샘플을 취해 HPLC로 반응 완료를 체크하였다 (분취액을 시클릭 인산으로 가수분해한 다음, HPLC로 분석하였음). 시타라빈 히드로클로라이드 (60.9 g)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1 시간에 걸쳐 5 ℃로 가온하고, 87 시간 동안 4 내지 6 ℃에서 교반하였다. 생성된 점성있는 반응 용액을 HPLC 분석을 위해 매일 샘플링하였다. 교반된 반응 용액을 온도를 20 ℃ 이하로 유지시키는 속도로 용액의 pH가 5.0이 될 때까지 NaOH 용액 (13％ wt/vol)으로 서서히 켄칭하였다 (NaOH 용액 290 mL가 필요하였음). 디클로로메탄 (450 mL)을 첨가하고, 두상의 혼합물을 30 분 동안 15 내지 20 ℃에서 교반하였다. 교반을 정지하고, 혼합물을 30 분 동안 가라앉혔다. 하부 유기층을 분리하였다. 상부 수성층을 디클로로메탄으로 2회 이상 추출하였다 (450 mL, 30-분 교반, 30-분 가라앉힘) (주의 5). 반응기에 pH 탐침자를 장착하고, NaOH 용액 (13％ wt/vol)을 10 분에 걸쳐 pH가 7.0이 되도록 첨가하였다 (NaOH 용액 68 mL가 필요하였음). 재킷에 냉각 (5 ℃)을 작동시켜 온도를 20 ℃ 미만으로 유지시켰다. 생성된 용액을 주위 온도에서 20 시간 동안 교반한 다음, 5 시간 동안 5 ℃로 냉각하였다 (주의 6). 생성된 혼합물을 여과하고, 수집된 고체를 물 (2 × 100 mL)로 세척하고, 일정한 중량으로 건조하였다 (-30 in. Hg, 60 ℃, 18 시간). 회수 = 흐린 황색의 미세한 과립 고체 46.6 g (48％ 수율).
포스포로클로리데이트 합성에 대한 HPLC:
컬럼: 조르박스 이클립스 XDB-C8, 4.6 × 250 mm, 입자 크기 5㎛; 용매 A = 11 ％ 아세토니트릴/물 중 20 mM 인산나트륨 완충액; 용매 B = 탈이온수 중 50％ 아세토니트릴 (15 분 내에 100％ A 내지 100％ B의 구배); 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 250 nm에서 UV 검출, 컬럼 온도 = 30 ℃. r.t. = 4.3 분
5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드에 대한 HPLC:
컬럼: 인너트실 (Inertsil) ODS-3, 4.6 × 150 mm, 3㎛ 입자 크기; 용매 A = 5％아세토니트릴/물 중 20 mM 암모늄 포스페이트 완충액; 용매 B = 아세토니트릴 (구배 (시간 (분)/A％ 중 B％) : 0/0, 30/10, 40/40, 40.1/0, 50/0); 유속 = 1.0 mL/분; 주사 부피 = 50㎕ 210 nm에서 UV 검출, 컬럼 온도 = 30 ℃ ± 5 ℃. r.t. = 15.7 분
단계 C: 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드의 정제
절차 1: 오버헤드 교반기, 온도계, 첨가 깔때기 및 pH 탐침자를 장착한 1 L, 3-구 플라스크를 조질의 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 (80 g, 0.18 mol) 및 탈이온수 (256 mL)로 충전하였다. 혼합물의 pH는 5.16이었다. 3.0 M 황산 (60.6 mL, 0.18 mol)을 10 분에 걸쳐 적가하였다. 10 ℃ 냉각조를 사용하여 온도를 19 내지 22 ℃로 유지하였다. 약간 탁해진 황색 용액이 생성되었다. 용액을 0.45 pm 나일론 막 여과기 (직경 47 mm)를 통해 여과하였다. 플라스크 및 여과기를 물 (40 mL)로 세정하였다. 여액 및 세척액을 1 L 플라스크에 다시 붓고, pH를 3 M NaOH (155 mL) 및 3 M 황산을 첨가하여 6.5로 조정하였다. pH 5.1에서 침전 형성이 관찰되기 시작하였다. 혼합물을 2.5 시간 동안 교반한 다음, 여과로 고체를 수집하였다. 플라스크 및 여과기 케이크를 물 (2 × 80 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 밤새 건조하여 (-30 in. Hg, 60 ℃, 18 시간) 거칠은 흐린 황색 고체로서, 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 73.4 g (92％ 수율)을 수득하였다.
절차 2: 오버헤드 교반기, 열전대, 첨가 깔때기 및 pH 탐침자를 장착한 250 mL, 3-구 플라스크에 조질의 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 (16 g, 36.3 mmol) 및 탈이온수 (50 mL)로 충전하였다. pH 2.5가 되도록 3.0 M 수성 황산 (12 mL, 36.3 mmol)을 적가하고 온도를 22 ℃ 미만으로 유지하였다. 메탄올 (160 mL)을 20 분에 걸쳐 첨가하여 백색 침전물을 수득하였다. 현탁액을 20 ℃에서 1.5 시간 동안 교반한 다음, 여과로 고체를 수집하였다. 고체를 메탄올 (2 × 25 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 건조하여 (-30 in. Hg, 60 ℃, 1.5 시간) 황산염 18.89 g을 수득하였다.
오버헤드 교반기 및 pH 탐침자를 장착한 250 mL, 3-구 플라스크에 고체를 충전시켰다. 물 (180 mL)을 첨가하고, 혼합물을 10 분 동안 교반하여 모든 고체를 용해시켰다 (pH = 2.7). 인산나트륨 일염기성 일수화물 (0.25 g, 1.81 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 교반하였다. 용액을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 플라스크에 다시 붓고, 13％ (wt/vol) 수성 NaOH를 첨가하여 pH를 7.1이 되도록 하였다. 현탁액을 20 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물 (2 × 15 mL)로 세척하고, 진공 오븐에서 일정한 중량으로 건조하여 (-30 in. Hg, 60 ℃, 16 시간) 회백색, 과립 고체로서 5'-O-시스-[4-(S)-(피리드-4-일)-1,3,2-디옥사포스포린-2-옥소-2-일]-시토신-β-D-아라비노푸라노시드 13.55 g (85％ 수율)을 수득하였다.
실시예 14: R-(+)-1-(4-피리딜)-1,3-프로판디올의 합성
R-(+)-1-(4-피리딜)-1,3-프로판디올은 실시예 10의 촉매 10의 거울상이성질체를 사용한 실시예 3에 나타낸 바와 같다.
융점 = 98 내지 100 ℃
e.e. = 98％ R 이성질체 (HPLC로 측정).
HPLC 조건: 컬럼: 키랄팩 AD, 0.46 × 25 cm; 이동상 = 10:90, 에탄올:헥산, 등용매; 유속 = 1.5 mL/분; 주사 부피 = 10㎕ 254 nm에서 UV 검출; r.t.: R 디올 = 12.7 분; S 디올 = 14 분
실시예 15. (4R)-(+)-(4-피리딜)-2-(4-니트로페녹시)-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난 (12)의 합성
0 ℃에서 THF (100 mL) 중의 4-니트로페닐 포스포로디클로리데이트 (9.2 g, 36 mmol)의 교반된 용액에 30 분에 걸쳐 피리딘 (7.9 mL, 98 mmol)을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 5 분 동안 0 ℃에서 교반하고, 0 ℃에서 1.5 시간에 걸쳐 THF (300 mL) 중의 R-(+)-1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올 (95.8％ e.e., 5 g, 32.7 mmol) 및 트리에틸아민 (15.6 mL, 114 mmol)의 용액에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 2.5 시간 동안 교반하였다. 나트륨 4-니트로페녹시드 (18.17 g, 131 mmol)를 첨가하고, 비균질 오렌지색 반응 혼합물을 40 ℃에서 4.5 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 염화암모늄의 포화 수용액 (250 mL)으로 세척하고, 합한 수성 세척액을 디클로로메탄 (100 mL)으로 역추출하였다. 합한 유기 추출물을 수산화나트륨의 0.3 N 수성 용액 (200 mL × 4)으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과된 용액을 감압하에 농축시켜 방치시 결정화되는 오일을 수득하였다. 황색 고체를 2-프로판올 100 mL로부터 재결정하여 백색 고체로서 목적하는 트랜스-포스페이트 (12) (95％ e.e., [α]D 20 + 74.2 (c 1.0, MeOH))를 수득하였다.
TLC 조건 : 유니플레이트 (Uniplate) 실리카겔, 250 마이크론; 이동상 = 3/2 아세톤/헥산; 디올: rf = 0.2, 트랜스-포스페이트: rf = 0.6, 시스-포스페이트: rf = 0.5.
시스/트랜스-이성질체화에 대한 HPLC 조건: 컬럼 = 조르박스 Rx-C18 (4.6 × 250 mm); 이동상 = 35％ 아세토니트릴/65％ 20 mM 포스페이트 완충액 pH 7.95; 유속 = 0.5 mL/분; 검출 = UV @ 250 nm; 체류 시간: 시스-이성질체 = 9.39 분, 트랜스-이성질체 = 10.11 분.
e.e. 측정을 위한 HPLC조건: 컬럼 = 키랄팩 AD; 이동상 = 1:1 2-프로판올-헥산; 유속 = 1.0 mL/분; 검출 = UV @ 254 nm; 체류 시간 (분): 트랜스-포스페이트 = 7.02.
실시예 16. 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2S,4R)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (13)의 합성
16.1. 인산화 단계
실온에서 THF (40 mL) 중 화합물 8 (2.4 g, 4.55 mmol)의 교반된 용액에 t-BuMgCl (THF 중 1 M, 6 mL, 6 mmol)을 첨가하였다. 30 분 후, R-트랜스-포스페이트 12 (1.84 g, 5.5 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 염화암모늄의 포화 수용액으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (50 mL × 2)로 추출하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 조 생성물을 아세톤으로 용출시키는 실리카겔 상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 목적하는 보호된 전구약물을 수득하였다 (2.19 g, 66％, 융점: 142.0 내지 145.0 ℃).
TLC 조건: 유니플레이트 실리카겔 250 마이크론; 이동상 = 아세톤; 트랜스-포스페이트: rf = 0.6, 보호된 ara-C: rf = 0.2.
16.2 탈보호 단계
70％ TFA (20 ml) 중 상기로부터의 보호된 전구약물의 교반된 용액을 16 시간에 60 ℃에서 가열하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물에 메탄올 (30 mL)를 첨가하고, 혼합물을 탄산나트륨으로 약염기성으로 만들었다. 흐린 용액을 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 조생성물을 메탄올-아세톤 (1:1)으로 용출시키는 실리카겔 상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 목적하는 전구약물 (13)을 수득하였다 (1.06 g. 80％ 98％ de. 융점: 178.0 내지 180.0 ℃).
TLC 조건: 유니플레이트 실리카겔 250 마이크론; 이동상 = 아세톤-메탄올 (1:1), 보호된 ara-C: rf = 0.7, 생성물: rf = 0.3.
HPLC 조건: 컬럼 = 조르박스 이클립스 × DB-C8 4.6 × 250 mm; 이동상 = 5％ 아세토니트릴-물 중 20 mM 포스페이트 완충액; 유속 = 1.0 mL/분; 검출 = UV @ 210 nm; 체류 시간 (분): 생성물 = 10.60.
실시예 17: 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (+) 캄포르술페포네이트 염의 합성
(+)-캄포르술페폰산 (232 mg, 1 mmol)을 메탄올 (8 mL) 중 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9, 400 mg, 0.91 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 생성된 투명한 무색 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음 감압하에 농축하였다. 잔류한 백색 발포물을 에틸 아세테이트로 연질처리하고 감압하에 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고, 환류에서 가열하였다. 1 시간 동안 냉각시킨 후, 고체를 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트로 세정하고, 50 ℃에서 진공하에 밤새 건조하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (562 mg). 융점 193 ℃. 원소 분석 (로버트슨 마이크로릿 (Robertson Microlit)) C17H21N4O8PㆍC10H16OSㆍH2O에 대한 계산치: C, 46.95; H, 5.69; N, 8.11. 실측치: C, 47.22; H, 5.51; N, 7.81.
실시예 18: 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] 말레에이트 염의 합성
말레산 (1.1 당량)을 사용한 실시예 17과 동일한 절차. 융점 140 ℃. 원소 분석 (로버트슨 마이크로릿) C17H21N408PㆍC4H404ㆍH2Oㆍ0.5 C4H802에 대한 계산치: C, 44.67; H, 5.05; N, 9.06. 실측치: C, 44.58; H, 4.61; N, 8.48.
실시예 19: 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] 황산염의 합성
메탄올 (8 mL) 중 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9, 400 mg, 091 mmol)의 현탁액에 황산 (89 mg, 091 mmol)을 첨가하였다. 자유 유동성 고체가 증점되고, 플라스크의 옆면에 붙었다. 혼합물을 15 분 동안 환류시키고, 실온으로 냉각하고, 고체를 플라스크의 옆면에서 긁어내었다. 3 시간 동안 실온에서 교반한 후, 백색의 자유 유동성 고체를 여과로 수집하고, 메탄올로 세정하고, 20 ℃에서 진공하에 건조하여 표제 화합물 (428 mg)을 수득하였다.
융점 158 ℃. 원소 분석 (로버트슨 마이크로릿) C17H21N4O8PㆍH2SO4ㆍ2H2O에 대한 계산치: C, 35.54; H, 4.74; N, 9.75. 실측치: C, 35.50; H, 4.73; N, 9.51.
실시예 20: 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] 염산염의 합성
플라스크에서 염산 (228 ㎕, 0.23 mmol)의 1 N 용액을 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (9, 100.6 mg, 0.228 mmol)에 첨가하였다. 물 (5 mL) 및 메탄올 (5 mL)을 부분적으로 용해된 고체에 첨가하고, 혼합물을 초음파처리하였다. 투명한 무색 용액을 메탄올로 세정한 0.45 ㎛ 주사기 여과기를 통해 여과하였다. 합한 여액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 아세토니트릴 (2 × 10 mL)로 등비하였다. 잔류물을 아세토니트릴 및 메탄올 (1/1,10 mL)의 혼합물 중에 용해시키고, 농축하여 건조하였다. 백색 분말을 진공하에 20 ℃에서 건조하여 표제 화합물 (78 mg)을 수득하였다.
융점 > 200 ℃. 원소 분석 (로버트슨 마이크로릿) C17H21N408PㆍHClㆍH2O의 계산치: C, 42.03; H, 4.77; N, 11.53; Cl, 7.30. 실측치: C, 41.70; H, 4.84; N, 11.68; Cl, 7.45.
실시예 21 : 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] L-타프트레이트 염의 합성
물 중 L-타르타르산 0.1 N 용액을 사용한 실시예 20과 동일한 절차.
융점 > 200 ℃. 원소 분석 (로버트슨 마이크로릿) C17H21N408PㆍC4H606ㆍH2Oㆍ0.1 C2H3N: C = 41.57; H = 4.82; N = 9.38; 실측치: C = 41.32; H = 5.03; N = 9.69.
실시예 22. 라세미 트랜스-4-(4-피리딜)-2-(4-니트로페녹시)-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난의 합성
THF 중 라세미 1-(4-피리딜)-1,3-프로판 디올 (4 g, 26.1 mmol) 및 트리에틸아민 (12 mL, 86 mmol)의 용액을 THF 중 4-니트로페닐-포스포로디클로리데이트 (7.35 g, 28.7 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 나트륨 4-니트로페녹시드 (10 g, 71.8 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 50 ℃에서 4 시간 동안 가열하였다. 냉각한 반응 혼합물을 염화암모늄의 포화 용액으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 ×). 합한 유기 추출물을 포화된 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 여과된 용액을 감압하에 농축시키고, 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, 디클로로메탄/에탄올 95/5)로 정제하였다.
1H NMR (CDCl3, 베리안 게미니 200 MHz): C'-프로톤: 시스-이성질체 5.6-5.8 (m, 1H); 트랜스-이성질체 5.5-5.69 (m, 1H).
TLC 조건: 유니플레이트 실리카겔, 250 마이크론; 이동상 = 3/2 아세톤/헥산; 디올: rf = 0.2, 트랜스-포스페이트: rf = 0.6, 시스-포스페이트: rf = 0.5.
시스/트랜스-이성질체화에 대한 HPLC 조건: 컬럼 = 조르박스 Rx-C18 (4.6 × 250 mm); 이동상 = 35％ 아세토니트릴/65％ 20 mM 포스페이트 완충액 pH 7.95; 유속 = 0.5 mL/분; 검출 = UV @ 250 nm; 체류 시간: 시스-이성질체 = 9.39 분, 트랜스-이성질체 = 10.11 분.
실시예 23. 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-시스-[2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실]의 합성
23.1. 인산화 단계
라세미 트랜스-4-(4-피리딜)-2-(4-니트로페녹시)-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포리난을 사용하여 실시예 16.1과 동일하게 수행하였다.
TLC 조건: 유니플레이트 실리카겔 250 마이크론; 이동상 = 아세톤, 트랜스-포스페이트: rf = 0.6, 보호된 ara-C: rf = 0.2.
23.2. 탈보호 단계
실시예 16.2.와 동일
TLC 조건: 유니플레이트 실리카겔, 250 마이크론; 이동상 = 아세톤-메탄올 (1:1), 보호된 ara-C: rf = 0.7, 생성물: rf = 0.3.
본 발명의 방법의 사용의 실시예는 다음을 포함하다. 이들 실시예는 예시적이며, 본 발명의 방법이 이들 실시예 만으로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
명확성 및 간결성을 위해, 하기 실시예에서 2(1H)-피리미디논,4-아미노-1-[5-O-[(2R,4S)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥스포스포리난-2-일] (9)를 화학식 A로 칭하고, 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-[(2R,4R)-2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실] (13)을 화학식 B로 칭하며, 실시예 23으로부터의 2(1H)-피리미디논, 4-아미노-1-[5-O-시스-[2-옥시도-4-(4-피리디닐)-1,3,2-디옥사포스포리난-2-일]-β-D-아라비노푸라노실]을 화합물 C로 칭한다.
생물학적 실시예
실시예 A: 인간 간 미세소체에서의 효소 동력학
인간 간 미세소체에 의한 화합물 A 및 화합물 B의 araCMP로의 활성화를 인간 간 조직 중에서 활성화와 비교하여 측정하였다. CYP3A4 특이성을 약리학적 억제제를 사용하여 평가하였다.
방법:
화합물 A 및 화합물 B를 인간 간 미세소체 (In Vitro Technologies (IVT), catalog # X00821, lot # RQX, 50 공여체의 혼합된 성별 풀) 2 mg/mL, 100 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (Sigma, catalog # P3786, lot # 62H0619), pH 7.4 및 1 mM NADPH (Calbiochem, catalog # 481973, lot# B38806)를 함유하는 혼합물과 5 분 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 에펜도르프 열 혼합기 (Eppendorf Thermal Mixer) 5436에서 700 rpm으로 NADPH 부재하에 2 분 동안 37 ℃에서 예비인큐베이션한 다음, 최종 농도가 1 mM인 NADPH를 첨가하여 개시하였다. 반응물을 5 분 후에 메탄올 112.5 ㎕로 켄칭하고, 샘플을 에펜도르프 마이크로퓨즈에서 14,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하고, 상청액 150 ㎕를 매질 가열로 증발시켜 건조하였다. 샘플을 이온쌍 완충액 (10 mM 인산칼륨, (Fisher, catalog # P286-1, lot # 9152328A), 50 mM 테트라부틸 암모늄 히드록시드, (Aldrich, catalog # 17,878-0, lot # 07030KO), 물 중 85％ 인산 (Chempure, catalog # 831-621, lot # M224KBRR) 약 3.3 mL/L를 사용하여 pH 4.5로 조절됨) 60 ㎕ 중에 재현탁하고, 볼텍싱하고, 약 30 초 종안 초음파처리하고, 약 10 초 동안 14,000 rpm으로 스핀하였다.
araCMP의 활성화를 정량하기 위해 샘플을 역상 HPLC (Hewlett Packard 1100)로 분석하였다. 각각의 샘플 50 ㎕를 알테크 (Alltech) C-18 EPS 가드 컬럼 (catalog # 32607, 7.5 mm × 4.6 mm)과 함께 아길렌트 C18 조르박스 SB-AQ 역상 컬럼 (catalog # 883975-914, 5 ㎛, 4.6 mm × 150 mm) 상에 주사하였다. 샘플을 유속 1 mL/분, 컬럼 온도 40 ℃, 샘플 온도 4 ℃로 이온쌍 완충액 (상기 참조)과 함께 로딩하였다. araCMP를 등용매적으로 약 7분에 용출하고, 70％ 메탄올로 2 분 동안 세척하였다. 유출을 272 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다.
억제 연구를 0.1 μM 내지 100 μM 트롤레안도마이신 (TAO; Sigma T-6514, lot # 81K1655) 또는 0.01 μM 내지 10 μM 케토코나졸 (KTZ; Research Biochemicals International, catalog # K105, lot # SJG-597A)과 함께 예비인큐베이션함으로써 수행하였다. TAO 및 KTZ는 둘다 메탄올에 용해되며, 따라서 대조군을 비롯한 모든 샘플은 1％ (v/v) 메탄올의 최종 농도를 함유하였다. TAO를 이용한 억제 연구를 위해, 미세소체를 기질의 부재하에 30 분 동안 37 ℃에서 TAO로 예비인큐베이션하였다. 반응 (100 ㎕ 부피)을 기질 (화합물 A 1000 μM 또는 화합물 B 1000 μM 및 1 mM NADPH의 신선한 분취액)을 첨가하여 개시하였다. 케토코나졸은 이 예비인큐베이션 절차에 필요하지 않았으며, 따라서 반응은 기질 첨가 시간에 반응 혼합물에 케토코나졸을 첨가함하여 상기 기재한 바와 같이 수행하였다.
동력학 파라미터를 평균 표준 편차 (n = 2 또는 3회 독립적인 실험)로서 기록하였다. 미키엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 방정식, 속도 = Vmax[S]/[S] + Km을 사용하여 시그마 플롯 (Sigma Plot (SPSS, Inc.))으로부터의 엔자임 키네틱스 모듈 (Enzyme Kinetics Module) v.1.1을 사용하여 Vmax 및 Km을 계산하였다. 내인성 제거율을 Vmax를 Km으로 나누어 얻었다. 억제 연구를 위한 IC50 값을 평균 표준 편차 (n = 2 또는 3회 독립적인 실험)로서 표현되는 IC50 값으로 최대-절반 내삽하여 측정하였다. Ki는 쳉-프루조프 방정식, Ki = IC50/1 + [기질]/Km으로 측정하였다.
결과:
인간 간 미세소체 (lot # RQX)를 사용하여 화합물 A가 화합물 B보다 2.6 배 내인성 제거율이 높았다.
인간 간 미세소체에서의 화합물 A 및 화합물 B의 동력학 파라미터
화합물 A 화합물 B
시험한 농도, mM 0.25, 0.5, 0.75, 1 0.5, 1, 3, 6
Vmax, mmol/분/mg 0.11±0.02 0.13±0.02
Km, mM 1.08±0.27 3.13±0.51
클린트, ㎕/분/mg 0.11±0.02 0.042±0.003
화합물 A 및 화합물 B의 활성화는 TAO에 의해 화합물 A 및 화합물 B 각각에 대해 0.9±0.1 μM 및 0.7±0.4 μM의 IC50 값으로 억제하였다 (표 2). 화합물 A 활성화의 완전한 억제가 100 μM TAO에서 관찰되었다. 화합물 B로 시험한 가장 높은 TAO 농도는 10 μM였으며, 이는 73±2％ 억제를 가져왔다. TAO의 Ki 값은 화합물 A 및 화합물 B에 대해 각각 0.5±0.1 μM 및 0.5±0.3 μM으로 유사하였다.
TAO에서와 같이, KTZ는 화합물 A 및 화합물 B 활성화를 억제하였다. IC50 값은 TAO에 대한 것보다 낮았다: 화합물 A 및 화합물 B 모두에 대해 0.2±0.1 μM이었다 (표 2). 다시, 10 μM KTZ에서 화합물 A 및 화합물 B 활성화에 대한 96±3％ 및 89±1％의 최대 억제가 관찰되었다. Ki 값은 화합물 A에 대해 0.1±0.03 μM 및 화합물 B에 대해 0.1±0.05 μM이었다.
인간 간 미세소체에서의 활성화의 TAO 및 KTZ 억제
화합물 시험한 농도 (μM) 억제제 IC50 (μM) Ki (μM) 시험한 억제제의 최대농도에서의 억제율 ％
화합물 A 1000 TAO 0.9±0.1 0.5±0.1 100μM에서 99％(10μM에서 94％)
화합물 B 1000 TAO 0.7±0.4 0.5±0.3 10μM에서 73±2％
화합물 A 1000 KTZ 0.2±0.1 0.1±0.03 10μM에서 96±3％
화합물 B 1000 KTZ 0.2±0.1 0.1±0.05 10μM에서 89±1％
결론:
화합물 A 및 화합물 B는 인간 간 미세소체에 의해 araCMP로 활성화된다. 화합물 A는 화합물 B보다 2.6배 더 빠른 속도로 활성화된다. KTZ 및 TAO는 전구약물 활성화를 억제하며, 이는 CYP3A4에 의해 매개되고 있음을 제안한다.
실시예 B: 단일 투여량 간 수준
생체내에서 전구약물의 활성화를 마우스에게 일시 복강내 투여한 후에 특정하였다.
방법:
정상적인 단식시키지 않은 수컷 스위스 웹스터 마우스 (중량 25 내지 35 g, 하를란 스프라그 돌리, Indianapolis, IN)에 화합물 A 또는 화합물 B를 ara-C 100 mg/kg의 몰등량에 상응하는 189 및 192 mg/kg로 각각 복강내 주사하였다. 주사후 특정 시간에, 마우스를 마취시키고, 심장 천자를 통해 방혈하였다. 전체 간을 제거하고, 액체 질소 중에 순간-동결시키고, 폴리트론 (Polytron) 균질기 PT 10/35 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY)를 사용하여 10％ (v/v) 과염소산 (PCA)의 3 부피 중에 균질화하였다. 2,500 × g에서 5 분 원심분리한 후, 상청액 1 mL를 3 M KOH/3 M KHCO3 0.3 mL를 사용하여 중화시키고, 전체적으로 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 5 분 원심분리하고, 생성된 상청액을 다르게는 araCTP 검출을 방해할 수 있는 내인성 리보뉴클레오티드를 제거하기 위해 페리오데이트를 처리하였다. 이를 위하여, 100 ㎕ 조직 추출물을 4 ㎕ 0.5 M 나트륨 페리오데이트 (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, lot # 08009 BU) 및 10 ㎕ 1.8 M 메틸아민 (Aldrich lot # 04526 DQ, pH 5.5)과 함께 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 1 M 1-람노즈 (1-Rhamnose) (Aldrich lot # 06801 JS) 2 ㎕를 첨가하여 중지하였다. 생성된 샘플을 하기 기재하는 바와 같이 HPLC로 분석하였다.
골수 araCTP를 측정하기 위해, 대퇴골의 골수 소강으로부터의 골수 샘플을 미리-칭량된 에펜도르프 튜브로 1.2 ml 염수와 플러싱하였다. 20 내지 30 초 동안 원심분리한 후 (에펜도르프 마이크로퓨즈, 14,000 rpm), 상청액을 제거하여 3％ PCA (v/v) 12 부피를 골수 세포 펠렛에 첨가하였다. 그 다음, 샘플을 펠렛이 잘 용해될 때까지 볼텍싱하고, 10 분 넘게 원심분리하였다. 추출된 상청액의 90 ㎕를 1 M KOH/1 M KHCO3 30 ㎕를 사용하여 pH 7 내지 8로 중화시키고, 다시 원심분리하였다. 생성된 상청액을 상기와 같이 페리오데이트 처리하였다.
간 및 골수 araCTP 수준을 와트만 파르티실 (Whatman Partisil) 5 SAX (5m, 4.6 × 250 mm) 컬럼을 사용하는 이온 교환 상 HPLC로 측정하였다. 샘플 (50 ㎕)을 pH 3.5에서 6％ 에탄올을 함유하는 70％ 10 mM 암모늄 포스페이트 완충액 및 30％ 1 M 암모늄 포스페이트 완충액 중의 컬럼 상에 주입하였다. 뉴클레오시드 트리포스페이트를 컬럼으로부터 선형 구배 (80％ 1 M 암모늄 포스페이트 pH 3.5/ 6％ 에탄올 완충액)를 사용하여 1.25 mL/분의 유속으로 용출하였다. araCTP를 UV 흡수성 (280 nm)으로 검출하고, 일반적으로 12 내지 13 분 용출하였다. 공지된 araCTP의 양을 HPLC 샘플을 중화하고, 제조하기 전 대조군 간 또는 골수로부터의 PCA 추출물로 첨가하여 이에 따라 표준 곡선을 제조하였다.
혈장을 얻기 위해, 혈액을 헤파린첨가된 마이크로-콜렉션 튜브에 옮기고, 에펜도르프 마이크로퓨즈에서 2 분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 생성된 혈장을 수집하고, 드라이아이스 상에 두고, 후속적으로 -20 ℃에서 보관하였다. 분석하는 날에, 혈장 100 ㎕에 아세토니트릴 1 mL를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 10 분 원심분리 후 (에펜도르프 마이크로퓨즈, 14,000 rpm), 상청액을 제거하고, 샌번트 스피드 백 플러스 (Savant Speed Vac Plus) SCl10A에서 건조하였다. 샘플을 이동상 완충액 (20 mM KH2PO4, pH 4.5) 110 ㎕로 재구성하고, 5 분 동안 초음파처리하고, 30 초 동안 원심분리하였다. 상청액을 알테크 C18 컬럼 (5 ㎛, 4.6 mm × 250 mm)을 장착한 역상 HPLC (Hewlett Packard 1090)로 분석하였다. 이동상 완충액 중 샘플 50 ㎕를 주사한 후, 아세토니트릴 농도를 10 분에 걸쳐 10％로 증가시킨 다음, 15 분에 걸쳐 50％로 증가시켰다. araC 및 전구약물의 용출 시간은 각각 약 3 및 19 분이었다. araC 및 전구약물을 280 nm에서의 흡수성으로 검출하고, 상기와 같이 가공된 스파이크된 혈장 샘플로 얻어진 표준 곡선을 사용하여 정량하였다.
결과를 평균의 평균 표준 오차로서 표현하였다. 데이타를 반복 측정 ANOVA로 분석한 후, 적절한 경우, 개별적인 시간 지점에서 비교를 위해 터키 (Tukey) HSD 사후 시험을 하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다. 도면에서 점 직선은 지적된 HPLC 방법을 사용한 LOQ (정량화 제한)를 나타낸다.
결과:
화합물 A 및 화합물 B는 간에서 높은 수준의 araCTP를 생성하였으며 (도 1a), 이는 화합물 A 및 화합물 B 각각에 대해 69.89±6.37 및 27.00±4.04 nmol/g로 주사 후 60 분에서 최고치가 되었다. 화합물 A는 4 시간 시점을 제외한 모든 시점에서 화합물 B보다 유의하게 (p < 0.05) 더 높은 간 araCTP 수준을 발생시켰다. 혈장 전구약물 수준은 화합물 A 및 화합물 B와 유사하였다 (p < 0.01; 도 1b). 혈장 전구약물 수준보다 간 araCTP과 보다 상호관련된 혈장 araC 수준은 화합물 A를 투여한 마우스에서 보다 컸다 (0.5, 1 및 2 시간에 대해 p < 0.01; 도 1c). 이는 혈장 araC는 혈장에서 전구약물의 분해보다는 간 araCTP로부터 유래될 수 있음을 제안한다. 골수 araCTP는 모든 샘플에서의 양의 수준 (3 nmol/g) 이하였다.
결론:
화합물 A 및 화합물 B는 모두 일시 복강내 주사로 투여하였을 때, 간에서 araCTP의 유의한 수준을 가져왔다. 화합물 A는 화합물 B보다 간 araCTP 수준을 약 2 배 크도록 만들었다. araCTP는 두 화합물 중 어느 것으로 치료한 동물의 골수에서도 검출되지 않았다. 혈장 전구약물 수준은 두 전구약물 모두와 유사하였으나, 혈장 araC 수준은 화합물 A가 2 배 더 크도록 만들었다. 혈장 araC 수준과 간 araCTP 수준의 상대적인 상호관련성을 바탕으로, 혈장 araC는 araCTP의 araC로의 탈인산화 및 간 세포로부터의 araC의 혈장으로의 방출에 의해 가능하게는 간 araCTP로부터 생성될 수 있다는 것이 예측된다.
실시예 C: 연속 정맥내 주입에 의해 전달되는 경우의 간 araCTP
전구약물의 araCTP로의 활성화 및 간 araCTP 수준의 유지를 래트에서 측정하고, 연속 정맥내 주입에 의한 약물 전달을 위한 기계를 장치하였다.
방법:
수컷 시몬센 알비노 (Simonsen Albino) 래트 (스프라그 돌리-유래, 구입원 Simonsen laboratories, Inc., Gilroy, CA)를 1.93 ml 당 케타민 (Ketamine) ("Vetamine", 100 mg/ml, Phoenix Scientific, Inc. St. Joseph, MD) 150 mg, 크실라진 10 mg (100 mg/ml, Butler Company, Columbus, OH), 모르핀 5 mg (15 mg/ml, Marsam Pharmaceuticals, Inc., Cherry Hill, NJ)을 함유하는 마취제 혼합물의 복강내 주사 0.25 ml로 마취시켰다. 염수로 충전된 블런트 PE-50 튜브 카테터 (Intramedic, Becton Dickinson, Sparks, MD)를 견갑골 사이로 꺼낸 경정맥에 삽입하고, 이를 스위블-테터링 일정 주입 시스템 (Lomir Biomedical, Inc. , Malone, NY 및 Harvard Apparatus, Inc., South Natick, MA)에 연결하였다. 튜브는 헤파린첨가된 염수로 충전하였고, 밀봉하였으며, 동물을 1 내지 7일 동안 회복시켰다. 기계가 장착된 동물을 하기 주입 프로토콜에 도입하였다:
화합물 A: 화합물 A를 2, 4, 8, 16, 24 또는 48 시간 동안 araC 등가량 (CE) 200 mg/kg/24 시간으로 주입하였다 (n = 4 내지 5/군, 48 시간 군에서는 예외로 1임)
화합물 B: 화합물 B를 2, 4, 8, 16, 24 또는 48 시간 동안 CE 200 mg/kg/24 시간으로 주입하였다 (n = 3 내지 5/군). 추가로, 화합물 A를 4 시간 동안 동일한 투여량으로 주입하였다 (n = 3).
화합물 C: 화합물 C를 2, 4, 8, 16, 24 또는 48 시간 동안 CE 200 mg/kg/24 시간으로 주입하였다 (n = 3 내지 5/군).
투여량 반응: 화합물 A를 4 시간 동안 CE 144 및 200 mg/kg/24 시간으로 주입하였다 (n = 4 내지 5/군). 화합물 B를 24 시간 동안 CE 50, 100 및 200 mg/kg/24 시간으로 주입하였다 (n = 3 내지 5/군).
다양한 기간 동안 주입한 후, 동물을 상기 기재한 마취제 혼합물의 카테터내 주사로 마취하였다. 혈액 샘플을 헤파린 코팅된 3 cc 주사기에 부착된 23-게이지 니들을 사용하여 심장 천자를 통해 얻었다. 간 샘플을 절제하고, 냉동-클램프를 사용하여 액체 질소에서 순간-냉동시키고, 실시예 B에서 기재한 바와 같이 가공하였다. 샘플을 실시예 B에서 기재한 바와 같이 간 araCTP에 대해 분석하였다. 혈장 및 골수 샘플을 수집하고, 실시예 B에서 기재한 바와 같이 혈장 전구약물, 혈장 araC 및 골수 araCTP 수준에 대해 분석하였다.
결과:
화합물 A를 200mg/kg/24 시간으로 연속 주입하여 4 시간에 걸쳐 정상 상태의 간 araCTP 수준 (12.84±1.50 nmoles/g)을 가져하고, 잔류한 44 시간 동안 13±1 nmol/g의 평균을 유지하였다 (도 2a). 혈장 전구약물 수준은 세가지 화합물 모두에 대해 48 시간 치료에 걸쳐 30-60 μM의 범위로 비슷하였다. 화합물 B 및 화합물 C는 화합물 A보다 간에서 araCTP를 덜 생성시켰다. 이들 연구는 독립적으로 수행하였다; 따라서, 잠재적 실험 변수를 조절하기 위해, 화합물 B 연구에서 화합물 A를 동물의 한 군에 투여하였다. 주입 4 시간 후 측정된 이들 동물의 간 araCTP 수준은 화합물 A에 대한 48 시간 연구에서 동일한 시점에서 얻은 것과 유사하고, 혈장 전구약물 수준은 2종의 화합물과 동일하였으며, 이는 이들 동물의 간 araCTP 수준에서의 차이가 약동학에서의 미차로 인한 것이 아니라는 것을 제시한다. 골수 araCTP는 모든 샘플에서의 정량화 수준 (3 nmol/g) 이하였다.
araCTP 수준의 투여량 반응성은 24 시간에 걸쳐 화합물 B를 100 또는 50 g/kg/24 시간으로 주입하거나 4 시간에 걸쳐 화합물 A를 144 mg/kg/24 시간으로 주입함으로써 시험하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 간 araCTP 수준은 2종의 전구약물에 대해 투여량-반응성이었다.
결론:
화합물 A, B 또는 C의 연속 주입은 간에서의 상당한 정도로 유지된 araCTP 수준을 생성하였다. 화합물 A의 투여는 유사한 혈장 전구약물 수준과 함께 화합물 B 또는 화합물 C보다 높은 간 araCTP를 생성하는데, 이는 이들 차이가 약동학에서 보다는 활성화 속도에서의 차이로 인한 것임을 제시한다.
실시예 D: 간 표적화
이들 CYP3A-활성 전구약물에 의한 araCTP 전달의 간 특이성은 간 araCTP 수준을 다른 기관에서의 활성 대사물질과 비교함으로써 생체내에서 측정하였다. 특히, 골수는 시타라빈에 대한 독성의 표적 기관이므로 골수에 대한 간 표적화를 평가하였다.
방법:
조직 분포 연구를 실시예 B 및 C에 기재된 바와 같이 마우스 및 래트에서 수행하였다. 이들 연구에서, 간, 혈장 및 골수 샘플을 부검시 수득하여 간 표적화를 평가하였다. 모 화합물, 시타라빈을 사용하여 유사한 연구를 수행하여 간 표적화된 제제로서의 유용성을 제시하였다.
결과는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 나타내었다. 경우에 따라, AUC를 연구의 제로 시점부터 최종 시점까지 계산하였다. 간 araCTP AUC를 각각의 화합물에 대한 혈장 araC AUC (혈장 LTI) 또는 골수 araCTP AUC (골수 LTI)로 나누어 간 표적화 지수 (LTI)를 계산하였다. 연속 주입 연구를 위해서, 정상 상태 araCTP 수준을 정상 상태 혈장 araC 수준으로 나누었다.
결과:
실시예 B에 기재된 바와 같이, araCTP의 높은 수준은 화합물 A, 화합물 B, 또는 화합물 C를 마우스 또는 래트에 투여한 경우에 간에서 검출되었다. 표 3은 일시 복강내 주사 연구에 대한 피크 수준 및 AUC를 요약한다. 골수 araCTP를 모든 연구에서 정량화 수준 (3 nmol/g) 이하였으며, 이는 우수한 간 표적화를 제시한다. 대조적으로, araCTP의 높은 수준 (19 nmol/g)은 시타라빈 100 mg/kg을 유사한 방식으로 투여할 경우에 골수에서 검출되었다. 골수가 직접적으로 상기 화합물을 araCMP에 대해 활성화시킨다는 증거는 없으며; 임의의 잠재적인 araCTP가 아마도 혈장으로부터 취해지고 골수에서 araCTP로 인산화된 araC의 활성화로부터 유래할 것이다. 이들 동물의 혈장 및 모든 연구에서 검출된 araC는 간 araCTP 수준과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 표 3에 제시된 바와 같이, 혈장 araC AUC 값은 마우스 및 래트에서 화합물 A 또는 화합물 B의 복강내 투여 후에 3 내지 22 μM*시간의 범위이다. 실험 기간에 걸쳐 간 araCTP 대 혈장 araC 노출의 비를 취하여 간 표적화 지수 (LTI)를 평가한 결과 말초 노출에 비해 간에 대한 araCTP의 표적화가 19.2 내지 27 배인 것으로 나타났다. 이들 값은 시타라빈에 대한 LTI보다 100 배 더 높다. 정상 상태 값은 화합물 A, 화합물 B, 또는 화합물 C를 연속 정맥내 주입에 의해 전달할 경우에 유사하게 비교될 수 있다 (표 4). LTI는 이들 연구에서 5 내지 > 12의 범위이고, 10배 높은 투여량으로 투여된 시타라빈에 대한 LTI보다 1000 배 더 높다.
시타라빈의 4-피리딜 (화합물 A, 화합물 B) 헤프다이렉트 (HepDirect) 전구약물의 생체내 마우스 간 표적화. 화합물을 단일 복강내 주사에 의해 100 mg (시타라빈 등가물)/kg으로 투여하였음
화합물 약 1 시간째 간 araCTP 피크(nmol/g) 간 araCTP AUC0-4 시간 (nmol/g) 간 araCTP AUC0.5-4 시간 (nmol/g) 혈장 AUC0-4 시간 (μM*시간) LTI (간/혈장) (nmol/g/μM)
화합물 A 마우스 96 225 138 8.3 27
화합물 A 마우스 70 149 156 7.6 19.5
화합물 B 마우스 27 68 102 3.5 19.6
화합물 A 래트 267 422 147.1 21.9 19.2
araC 마우스 7.6 < 19.2 N/A 121.2 < 0.2
래트에서의 시타라빈의 4-피리딜 (화합물 A, 화합물 B 또는 화합물 C) 헤프다이렉트 전구약물의 연속 주입. 전구약물을 연속 정맥내 주입에 의해 200 mg (시타라빈 등가물)/kg/일의 투여량으로 투여하였음. *araC는 2000 mg/kg/일로 제공하였음
화합물 (연구) 약 4 시간째 간 araCTP 피크(nmol/g) 간 araCTP 시간 (nmol/g) 혈장 전구약물 정상 상태 (μM) 혈장 araC 정상 상태 (μM) 24 시간째 LTI (간/혈장) (nmol/g/μM)
화합물 A 12.8 12.0 40-50 ~1.6 7.5
화합물 B 6.4 5.9 25-35 < 0.5 > 12
화합물 C 9.9 7.8 35-60 ~1.5 5
araC* 2 시간째 2.3 < 2.26 N/A ~300 < 0.01
결론:
화합물 A, 화합물 B 및 화합물 C는 araCTP를 간에 효과적으로 표적화시켜 말초 노출을 복강내 투여 경우에 약 20 배 정도 또는 연속 정맥내 주입에 의한 투여 경우에 약 10 배 정도 감소시킨다. 표적화는 raraC에 비해 100 내지 1000 배의 향상을 나타낸다.
실시예 E: 수성 안정성
화합물의 수성 안정성을 pH 및 완충액 농도의 함수로 측정하였다.
방법:
화합물 A 및 화합물 B를 원액으로서 500 μM (0.23 mg/mL)로 물에 용해시켰다. 희석된 용액 (50 μM)이 매 24 시간마다 수집되어 -80 ℃에 저장된 샘플과 함께 피셔 사이언티픽 드라이 배스 인큐베이터 (Fisher Scientific dry bath incubator) (catalog # 11-718-2)로 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 혈장 샘플 (100 μL)을 아세토니트릴 1 mL로 켄칭하였다. 모든 혈장 샘플이 수집되면, 샘플을 해동시키고, 에펜도르프 마이크로퓨즈에서 14,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하고, 상청액 1 mL를 취하여 중열 (~37 ℃)로 2 또는 3 시간 동안 증발시켜 고체화시켰다. 샘플을 HPLC 주입 전에 이동상 완충액 120 μL에 재현탁시켰다.
C-18 알테크 이코노스피어 (Alltech Econosphere) 컬럼, 150 mm × 4.6 mm (catalog # 70065)와 C-18 알테크 이코노스피어 가드 컬럼, 7.5 mm × 4.6 mm (catalog # 96121)을 사용하는 HP1090 또는 HP1100 (Hewlett Packard) HPLC 상에서 샘플을 분석하였다. 샘플을 5 분 동안 0％, 이어서 10 분째에 10％, 20 분째에 30％ 및 25 분째에 60％로 증가시키는 메탄올 구배로 용출시켰다. 다음 주입 전에 10 분 동안 0％ 메탄올 중에서 평형화시켰다. 유속은 40 ℃의 컬럼 온도에서 1 mL/분이었다. 약 19.5 분에 용출된 전구약물을 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다. 수성 조건에서의 전구약물의 경우, 메탄올 구배가 5 분 동안 0％, 10 분째에 10％, 및 20 분째에 30％로 증가시키는 것으로 전구약물이 약 20 분에 용출되는 것을 제외하고는 동일한 방법을 이용하였다.
결과:
화합물 A 및 화합물 B 둘다는 10 mM 인산칼륨 (Pi), pH 7.4 및 10 mM 시트레이트, pH 5.0 중에서 t90이 6일 초과로 수용액 중에서 매우 안정하였다. 화합물 A 안정성은 100 mM Pi, pH 7.4에서 6일 초과였으나, 화합물 B의 안정성은 이들 완충액 중에서 t90이 4일로 경미하게 덜하다. 두 화합물의 안정성은 100 mM 시트레이트, pH 5.0에서 감소하였으며, 화합물 A 및 화합물 B에 대해 각각 t90이 2일 및 1.7일이었다.
결론:
4-피리딜 전구약물의 안정성은 매우 우수하나, 이들 화합물은 높은 완충 강도를 갖는 낮은 pH에서는 경미하게 보다 덜 안정하였다.
실시예 F: 용해도
화합물 A 및 화합물 B의 용해도를 생체내 투여에 가능한 제제를 확인하기 위한 다양한 조건 하에서 측정하였다.
방법:
화합물 A 및 화합물 B의 용해도를 0.5 M Pi pH 8.0, 0.5 M 시트레이트 pH 7.0 및 0.5 M 시트레이트 pH 4.0 완충액 중에서 평가하였다. 3 종의 완충액 시스템을 각각 사용하여, 화합물 A 및 화합물 B의 포화 용액을 다음과 같이 제조하였다. 화합물 A 30 mg 및 화합물 B 150 mg의 표적을 개별 4 cc 투명 유리 바이알에 전달하고, 완충액 1.0 mL를 각각의 바이알에 첨가하였다. 생성된 바이알을 밀봉하고, 최소 24 시간 동안 25 ℃에서 텀블링에 의해 평형화시켰다. 인큐베이션 기간의 말기에, 용액 중에 존재하지 않는 전구약물을 0.45 ㎛ 세공 크기 나일론 주사기 필터를 통해 여과하여 샘플로부터 제거하였다. 이들 희석된 샘플을 실시예 E의 HPLC 방법에 의해 분석하였다.
결과:
화합물 A 용해도는 pH 8 완충액 중에서 2.9 mg/mL이고, pH 7.0에서 2.6 mg/mL이고, pH 4.0에서 45.8 mg/mL이다. 화합물 B 용해도는 pH 8 완충액 중에서 10.2 mg/mL이고, pH 7.0에서 9.0 mg/mL이고, pH 4.0에서 94.6 mg/mL였다.
결론:
화합물 A 및 화합물 B 둘다는 중성 pH 용액 중에서 비교적 가용성이며, 화합물 B의 용해도가 화합물 A의 용해도를 초과한다. 화합물 둘다의 용해도는 4 이하의 pH에서 제조된 경우에 상당히 증가하였다.
실시예 G: 혈장 안정성
혈장 중의 화합물 A, 화합물 B 및 화합물의 안정성은 이들 화합물이 생체내에서 안정할 것인지의 여부를 시험하기 위해 6 일간에 걸쳐 측정하였다.
방법:
항응고제로서 헤파린을 함유하는 남성 및 여성-풀링된 인간 혈장 (Bioreclamation Inc., Hickville, NY, catalog # HMPLNAHP, lot # BRH02236)의 모든 혈장 분취액의 pH는 8.3이었다. 화합물 A 및 화합물 B를 원액으로서 500 μM (0.23 mg/mL)로 물 중에 용해시키고, 혈장 샘플 중에 50 μM로 희석시키고, 매 24 시간마다 수집되어 -80 ℃에 저장된 샘플과 함께 피셔 사이언티픽 드라이 배스 인큐베이터 (catalog # 11-718-2)로 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 혈장 샘플 (100 μL)을 아세토니트릴 1 mL로 켄칭하였다. 모든 혈장 샘플이 수집되면, 샘플을 해동시키고, 에펜도르프 마이크로퓨즈에서 14,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하고, 상청액 1 mL를 취하여 중열 (~37 ℃)로 2 또는 3 시간 동안 증발시켜 고체화시켰다. 샘플을 HPLC 주입 전에 이동상 완충액 120 μL에 재현탁시켰다. 혈장 샘플의 경우에, 40 μL 또는 50 μL 샘플을 이동상 완충액, 20 mM 인산칼륨 완충액, pH 6.2 (Fisher Scientific, catalog # P261-1, 다양한 로트)를 사용하여 실시예 E에 기재된 컬럼 상에 주입하였다. 모든 다른 HPLC 분석은 실시예 E에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과:
37 ℃에서 인간 혈장 중의 t½은 모든 화합물에 대해 6±½ 일이었다.
결론:
인간 혈장 중에서의 반감기가 1 일을 초과하는 경우, 화합물 A, 화합물 B 및 화합물 C는 생체내에서 거의 분해를 겪지 않을 것으로 예상된다.
실시예 H: 래트 급성 독성
2000 mg/kg/24 시간의 투여량에서의 화합물 A의 내약성 및 안정성은 연속 정맥내 주입 24 시간 후에 평가하였다.
방법:
실시예 C에 기재된 바와 같은 연속 주입을 위해 수컷 및 암컷 시몬센 래트에 기계를 장착하였다. 처리일에, 래트에 일정 주입 테터를 걸고, 음식물 및 물에 접근을 자유롭게 하였다. 2.08 ml/kg/시간의 유속을 사용하여 투여량 2000 mg/kg/24 시간으로 화합물 A로 3마리의 수컷 및 3마리의 암컷 래트를 처리하였다. 화합물 A를 물 중에 42.5 mg/ml로 용해시키고, 1M HCl을 사용하여 pH를 4로 조정하였다. 삼투압을 5M NaCl을 사용하여 ~300 mOsm으로 조정하였다. 대조군으로서, 2마리의 수컷 래트에 동일한 기간 동안 pH 4 염수를 주입하였다. 래트의 외관 및 경향을 규칙적으로 모니터링하고, 이들의 거동에 대한 메모를 작업일 동안 매 1 내지 3 시간마다 기록하였다.
동물을 100％ 산소 중의 5％ 이소플루란 (Abbot laboratories, NDC 0074-3292-02)이 분당 1.5 내지 2 리터의 유속으로 플루오텍 (Fluotec) 3 기화기에 의해 공급되는 챔버 내에서 마취시켰다. 혈액 샘플을 헤파린 코팅된 3 cc 주사기에 부착된 23-게이지 니들을 사용하여 심장 천자를 통해 정맥내 주입 동안 얻었다. 각각의 동물로부터 혈액은 K2-EDTA-함유 미크로테이너 튜브 (Becton Dickinson, 36/5974) 및 혈청용 겔 분리제가 함유된 미크로테이너 (Becton Dickinson, 36/5956) 및 혈장 수집용 리튬 헤파린 (Becton Dickinson, 36/5958) 사이에 분류하였다. 가능한 경우, 3 cc 주사기에 부착된 23-게이지 니들을 사용하여 뇨를 방광으로부터 제거하였다. 조직 샘플을 하기 순서로 수집하였다: 간, 신장, 소장, 방광 및 골수. 소장은 십이지장, 공장 및 회장으로부터 샘플을 제공하기 위해 3개의 동등한 부분으로 분할하였고; 배설물은 블런트 겸자를 사용하여 천천히 미끄러지도록 밀어 수동으로 제거하였다. 각각의 조직으로부터의 일부분을 조직 구조를 위해 10％ 완충 포르말린 중에 두었다. 유핵 골수 세포를 측정하기 위해, 골수 샘플을 대퇴골의 골수강으로부터 1 ml PBS (w/o Ca++ 또는 Mg++)로 플러싱하고, 엄격하게 적정하고, 세포를 분리하기 위해 볼텍싱하였다.
세포 카운팅을 위해, EDTA-처리된 혈액 또는 PBS-현탁된 골수 플러쉬 50 μL를 각각 1 M 아세트산 중의 0.19 mg/mL 결정 바이올렛 (Sigma# C-1658, lot 112H3660) 함유 핵 염색 용액 450 μL 또는 950 μL와 혼합하고, 실온에서 5 분 이상 인큐베이션하였다. 단 시간 볼텍싱 후에, 혼합물의 10 μL 분취액을 혈구계에 위치시키고, 세포를 니콘 옵티포트-2 (Nikon Optiphot-2) 현미경으로 카운팅하였다. 혈액 샘플을 40x 대물렌즈로 카운팅하여 단핵 세포 (림프구 및 단핵구) 및 다형핵 세포 (PMN, 호중구, 호산구 및 호염구 유형의 과립구 포함)의 수를 평가하였다. 유핵 골수 세포를 1Ox 대물렌즈로 카운팅하였다.
EDTA-처리된 혈액 샘플을 적혈구 및 혈소판 수, 헤모글로빈 및 헤마토크리트를 비롯한 혈액학 분석을 위해 랩코프 (labCorp; San Diego, CA)에 제출하였다. 혈청 화학 분석이 또한 랩코프에 의해 수행되었다. 처리된 마우스로부터의 조직 시험편을 헤마톡실린/에오신-염색된 조직 절편의 제조 및 조직 병리학 평가를 위해 코딩하고 포르말린 하에 컴패러티브 바이오사이언시스 (Comparative Biosciences; Mountain View, CA)로 수송하였다.
결과:
화합물 A는 고용량에서 내약성으로 약물-처리되거나, 비히클-처리되거나 또는 비처리된 대조군 동물 사이에서 주지된 거동 차이가 거의 없었다. 부검시, 모든 관류된 동물의 위는 비워졌고, 어떠한 다른 차이도 관찰되지 않았음을 주의하였다. 체중 및 음식 소비량은 주입 프로토콜 전 또는 동안에 측정하지 않았다.
혈액, 골수 및 조직 절편을 다수의 파라미터에 대해 평가하였다. 한가지 염려는 높은 수준의 화합물 A에의 노출 후에 간독성에 대한 가능성 또는 제제와 관련된 명백한 독성이었다. 상기한 바와 같이, 24 시간 처리 동안 명백한 독성은 관찰되지 않았다. 모든 혈청 화학 및 혈액학 파라미터는 일반적으로 정상 범위 내에 있었다. 몇개의 샘플은 공개된 문헌과 비교하여 범위 밖의 것을 발생시키나, 이들은 비처리된 대조군보다 차이가 없거나 독성학적 관련성이 고려되지 않았다. 평가된 모든 혈청 파라미터 중, 단지 혈청 트리글리세리드 수준만이 정상 범위 밖에 있었다.
혈액 단핵 세포, PMN 및 골수 카운트를 혈액학에 대한 잠재적인 급성 효과를 시험하기 위해 측정하였다. 본 발명자들은 이러한 단 시간에서의 상당하거나 현저한 차이를 예상하지 않았다. 실제로, 비처리되거나, 비히클-처리되거나 또는 약물-처리된 동물 중에서 혈액 단핵 세포 또는 PMN 세포에서의 차이는 검출되지 않았다. 유핵 골수 세포는 또한 비히클-처리된 동물 및 약물-처리된 동물 사이에 차이가 없었다.
간, 신장, 소장 (십이지장, 공장 및 회장) 및 방광으로부터의 조직 샘플을 모두 병리학자에 의해 평가하였다. 어떠한 샘플에서도 현저한 조직병리학적 결과는 나타나지 않았다.
결론:
화합물 A는 처음 24 시간 이상 고용량으로 연속 정맥내 주입에 의해 투여되는 경우에 래트에 의해 우수한 내약성이었다.
실시예 I: 마우스 5 일간 안전성 약리학
모 화합물 araC에 대한 화합물 C의 안전성을 정상 수컷 마우스에서 5 일간 반복된 투여량 연구로 평가하였다.
방법:
araC를 시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, catalog # Cl768, lot # 39H5962)로부터 구입하였다. 화합물 C 및 araC를 멸균 생리 식염수에 용해시켰다. 원액을 미리 계량된 약물로부터 매일 제조하였다. 가장 높은 농도를 제외한 전부를 추가의 멸균 염수를 사용하여 원액을 희석함으로써 제조하였다. 즉시 사용하지 않는 약물은 냉장시키고 24 시간 이내에 사용하였다. 모든 전구약물을 시타라빈 몰등가량 (CE)으로 투여하였다.
수컷 NIH 스위스 웹스터 (Swiss Webster) 마우스 (체중 25 내지 33 g, 하를란 스프라그 돌리, Indianapolis, IN)에 화합물 C, araC 또는 비히클을 0 내지 제4일에 매일 사육장 광 주기 개시 이후 대략 3 내지 4 시간째 복강내 주사하였다. 화합물 C에 대한 투여량은 1000, 300, 100 및 30-mg/kg 뉴클레오시드 등량/일 (1848, 554, 185 및 55.4 mg/kg/일에 상당함)인 반면, araC는 100, 30, 10 및 3 mg/kg/일로 투여하였다. 비히클은 염수였다. 체중을 화합물 투여 직전 0 내지 제4일에 및 희생하기 5 일 전에 기록하였다. 모든 마우스를 할로탄 마취 하에서의 방혈, 및 후속적인 경부 탈구에 의해 제5일 (최종 복강내 투여 23 내지 25 시간 후)에 희생시켰다. 각각의 동물로부터의 혈액을 실시예 H에 기재된 바와 같은 혈액 화학 및 혈액학 파라미터에 대해 분석하였다. 간을 절제하고 중성-완충 10％ 포르말린 중에 고정시키고, 골수를 칼슘 또는 마그네슘의 부재하에서 1 ml PBS를 사용하여 우측 대퇴골로부터 플러싱하고, 유핵 세포 카운트를 실시예 H에서와 같이 측정하였다.
EDTA-처리된 혈액 샘플을 적혈구 및 혈소판 수, 헤모글로빈 및 헤마토크리트를 비롯한 혈액학 분석을 위해 랩코프 (San Diego, CA)에 제출하였다. 혈청 화학 분석이 또한 랩코프에 의해 수행되었다. 비히클 또는 100 mg/kg araC 또는 1000 mg/kg CE 화합물 C로 처리된 마우스로부터의 조직 시험편을 헤마톡실린/에오신-염색된 조직 절편의 제조 및 조직 병리학 평가를 위해 코딩하고 포르말린 하에 컴패러티브 바이오사이언시스 (Mountain View, CA)로 수송하였다. 조직병리학 연구에 대한 시험편 코드는 다음과 같다: #1-7, 화합물 C 1000 mg/kg/일; #33-40, araC 100 mg/kg/일; #65-72, 염수 비히클.
결과는 투여군 당 5 내지 8마리 동물에 대해 평균 ± 표준 오차로서 나타내었다. 선택된 혈액학 파라미터에 대해, 각각의 동물에 대한 데이터를 또한 비히클 군의 평균 ％로서 나타내었다. 통계학적 분석을 대조군 및 다중 투여군 사이의 차이에 대해 원-웨이 ANOVA, 이어서 던넷 사후 시험에 의해 수행하였다. 0.05 미만의 p-값을 통계학적으로 유의한 것으로 고려하였다.
결과:
마우스에 화합물 C 또는 araC를 5 일 동안 다양한 투여량으로 복강내 주사하고, 최종 투여 24 시간 후에 희생시켰다. 거동 및 전반적인 외관으로부터 판단되는 바와 같이, 어떠한 마우스도 명백하게 병에 걸리지 않았다. araC는 가장 높은 투여량에서 진행적으로 통계학적으로 유의한 체중 감소를 유도하는 반면 (도 3a, 100 mg/kg/일), 화합물 C는 가장 높은 투여량 (1000 mg/kg/일 뉴클레오시드 등량)에서도 유의한 효과를 갖지 않는다 (도 3b).
30 및 100 mg/kg/일에서, araC는 유핵 골수 세포, 순환 PMN, 단핵 세포 및 혈소판의 수를 유의하게 감소시켰다 (도 4). araC의 가장 높은 투여량에서, 골수 세포도를 비히클-처리된 동물의 것보다 11％ 감소시켰다. 화합물 C의 30배 더 높은 투여량 (1000 mg/kg/일 뉴클레오시드 등량)이 유핵 골수 세포의 수를 감소시키는데 필요하였다 (도 4a). araC와 대조적으로, 화합물 C는 어떠한 투여량에서도 PMN, 단핵 세포, 또는 혈소판 수에 영향을 주지 않았다 (도 4b-d).
araC 및 화합물 C는 단지 10배 상이한 투여량에서만 적혈구 세포 파라미터에 영향을 주었다. araC는 적혈구 수, 헤마토크리트 및 헤모글로빈을 2가지 가장 높은 투여량, 30 및 100 mg/kg/일에서 유의하게 감소시켰다. 헤마토크리트에서의 경미한 감소는 또한 araC의 10 mg/kg/일에서 관찰되었다. 화합물 C는 단지 10배 높은 투여량에서만 이들 파라미터에 유사하게 영향을 주었다.
혈청 화학 분석은 대부분의 분석물이 어떠한 화합물에 의해서도 영향을 받지 않는 것으로 제시하였다. 구체적으로, 간 기능 시험 파라미터 (빌리루빈, AST 및 ALT)는 비히클, araC, 또는 화합물 C로 처리된 동물에서 유사하다. 알칼리성 포스파타제는 단지 araC의 가장 높은 투여량에서만 유의하게 감소하였다. 알부민 및 BUN은 모든 치료에 대해 변화되지 않은 상태로 유지되었다. 크레아티닌 및 글루코즈는 가장 높은 투여량 (100mg/kg/일)에서 araC에 의해 감소되었다. 글루코즈는 또한 30 mg/kg/일에서 araC에 의해 및 1000 mg/kg/일에서 화합물 C에 의해 감소되었다. 글루코즈에 대한 화합물 C의 경미하나 유의한 효과는 모든 혈청 화학 파라미터에 대해 관찰된 화합물 C의 유일한 효과였다.
컴패러티브 바이오사이언시스에서 조직병리학자들이 비히클 또는 100 mg/kg araC 또는 1000 mg/kg CE 화합물 C로 처리된 마우스로부터의 포르말린-고정된 간, 신장 및 소장 시험편을 평가하였고, 어떠한 샘플에서도 독성학적으로 관련된 조직병리학적 변화를 발견하지 못했다.
결론:
화합물 C는 유핵 골수 세포, 말초 PMN 및 단핵 세포를 비롯한 혈액학적 종점과 관련하여 5 일간 반복된 투여 치료 프로토콜에서 araC보다 30 배 이상 안전하였다. 어떠한 간독성도 화합물 C 또는 이의 모 화합물, araC에 대해 관찰되지 않았다.
본 출원은 2002년 10월 31일 출원된 미국 가출원 제60/423,259호, 2002년 10월 31일 출원된 미국 가출원 제60/423,211호를 우선권으로 주장하며, 이들의 전문을 본원에서 참고로 인용하였다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염.
    <화학식 I>
    상기 식 중,
    M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고;
    상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고;
    V는 4-피리딜이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 III의 화합물인 화합물.
    <화학식 III>
  3. 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염을 투여하여 동물에서 P450 발현 조직의 질환을 치료하는 방법.
    <화학식 III>
  4. 제3항에 있어서, P450 발현 조직의 질환이 간암, 결장암 및 간의 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, P450 발현 조직의 질환이 간세포 암종인 방법.
  6. 제4항에 있어서, P450 발현 조직의 질환이 결장직장 암종인 방법.
  7. 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염을 투여하여 동물에서 암에 대한 약물 또는 외과적 치료 후 P450 발현 조직에서의 상기 암의 재발을 예방하는 방법.
    <화학식 III>
  8. 제7항에 있어서, 상기 동물이 암이 없는 상태인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 동물이 암으로부터 완화 상태에 있고, 상기 화학식 III의 화합물의 투여가 상기 암의 이후 발병을 예방하는 것인 방법.
  10. 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염을 투여하여 시타라빈의 치료 지수를 증가시키는 방법.
    <화학식 III>
  11. 제약 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
    <화학식 I>
    상기 식 중,
    M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고;
    상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고;
    V는 4-피리딜이다.
  12. 제11항에 있어서, 제약 유효량의 하기 화학식 III의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
    <화학식 III>
  13. 제약 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 염, 및 제약 유효량의 종양붕괴제 또는 이의 염, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
    <화학식 I>
    상기 식 중,
    M 및 V는 다른 하나에 대해 시스이고, MH는 시타라빈이고;
    상기 시타라빈의 5' 산소는 인에 부착되고;
    V는 4-피리딜이다.
  14. 제13항에 있어서, 제약 유효량의 하기 화학식 III의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
    <화학식 III>
  15. 제13항에 있어서, 종양붕괴제가 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미리플라틴, 테모졸로미드, 티오테파, 멜팔란, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 클로람부실, 디옥소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 발루비신, 닥티노마이신, 겜시타빈, 플록스우리딘, 플루오로우라실, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 메토트렉세이트, 미토마이신, 에토포시드, 파클리탁셀, 도데탁셀, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 네다플라틴, 카르무스틴, 독시플루리딘, 클라드리빈, 플루다라빈, 카르무스틴, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 아자톡신, 캄프토테신, 루르토테칸, 캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 피라루빈, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 루로테카로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  16. 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 전구약물 및 염을 투여하고, 제약 유효량의 종양붕괴제를 투여함으로써 P450 발현 조직에서 암을 치료하는 방법.
    <화학식 III>
  17. 제16항에 있어서, 종양붕괴제 및 화학식 III의 화합물을 개별적으로 투여하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 종양붕괴제 및 화학식 III의 화합물을 동시에 투여하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 종양붕괴제가 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미리플라틴, 테모졸로미드, 티오테파, 멜팔란, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 클로람부실, 디옥소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 발루비신, 닥티노마이신, 겜시타빈, 플록스우리딘, 플루오로우라실, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 메토트렉세이트, 미토마이신, 에토포시드, 파클리탁셀, 도데탁셀, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 네다플라틴,카르무스틴, 독시플루리딘, 클라드리빈, 플루다라빈, 카르무스틴, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 아자톡신, 캄프토테신, 루르토테칸, 캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 피라루빈, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 루로테카로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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