TW202417048A - Pd-1結合分子和其使用方法 - Google Patents

Pd-1結合分子和其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202417048A
TW202417048A TW113102094A TW113102094A TW202417048A TW 202417048 A TW202417048 A TW 202417048A TW 113102094 A TW113102094 A TW 113102094A TW 113102094 A TW113102094 A TW 113102094A TW 202417048 A TW202417048 A TW 202417048A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
domain
seq
mab
cdr
binding
Prior art date
Application number
TW113102094A
Other languages
English (en)
Inventor
坎帕納 尚
道格拉斯 史密斯
羅斯 拉莫特莫斯
萊斯利 強生
保羅 摩爾
愛利歐 波維尼
史考特 寇尼格
Original Assignee
美商宏觀基因股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商宏觀基因股份有限公司 filed Critical 美商宏觀基因股份有限公司
Publication of TW202417048A publication Critical patent/TW202417048A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

本發明涉及選擇的能夠結合食蟹猴PD-1和人PD-1的抗PD-1抗體：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15，和這類抗體的人源化和嵌合形式。本發明另外涉及PD-1結合分子，其包括這類抗PD-1抗體的PD-1結合片段、免疫綴合物，和雙特異性分子，包括雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等，其包括(i)這樣的PD-1結合片段，和(ii)能夠結合參與調節免疫檢查點的免疫細胞的表面上存在的分子的表位元的結構域。本發明也涉及使用PD-1結合分子刺激免疫應答的方法，以及檢測PD-1的方法。

Description

PD-1結合分子和其使用方法
本發明涉及PD-1結合分子(結合PD-1的分子)，其包括下述選擇的能夠結合食蟹猴(cynomolgus monkey)PD-1和人PD-1的抗PD-1抗體的PD-1結合結構域(結合PD-1的結構域)：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15。本發明尤其涉及PD-1結合分子，其是這類抗體的人源化形式或嵌合形式，或其包括這類抗PD-1抗體的PD-1結合片段(結合PD-1的片段)(尤其地，免疫綴合物、雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等)。本發明尤其涉及這類PD-1結合分子，其另外能夠結合免疫細胞的表面上存在的參與調節免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類PD-1結合分子檢測PD-1或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法(組合療法)的方法，其中包括這類選擇的抗PD-1抗體的一個或多個PD-1結合結構域的PD-1結合分子聯合有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子和/或聯合特異性結合癌症抗原的一種或多種另外的分子施用。
I. 細胞介導的免疫應答
人和其他哺乳動物的免疫系統負責提供針對感染和疾病的保護。這種保護通過體液免疫應答和細胞介導的免疫應答二者被提供。體液應答導致抗體和能夠識別和中和外源靶(抗原)的其他生物分子的產生。相比之下，細胞介導的免疫應答涉及巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)和抗原特異性細胞毒性T-淋巴細胞通過T-細胞的啟動，和回應抗原的識別的各種細胞因數的釋放(Dong, C.等(2003) “ Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,Immunolog. Res. 28(1):39-48)。
T-細胞最佳地介導針對抗原的免疫應答的能力需要兩種不同的信號傳導相互作用(Viglietta,V.等(2007) “ Modulating Co-Stimulation,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等(2007) “ Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339)。第一，已經排列在抗原呈遞細胞(APC)的表面上的抗原必須被呈遞至抗原特異性幼稚(naive)CD4 +T-細胞。這樣的呈遞經T-細胞受體(TCR)遞送信號，所述信號引導T-細胞啟動對呈遞的抗原為特異性的免疫應答。第二，通過在APC和不同的T-細胞表面分子之間的相互作用介導的一系列共刺激和抑制信號首先引發T-細胞的啟動和增殖，並最終導致它們的抑制。因此，第一信號賦予免疫應答特異性，而第二信號用於確定應答的性質、量級(magnitude)和持續時間。
免疫系統通過共刺激和共抑制配體和受體被嚴格地控制。這些分子提供用於T-細胞啟動的第二信號，並且提供正信號和負信號的平衡網路以最大化針對感染的免疫應答，同時限制對自身的免疫性(Wang, L.等(2011年3月7日) “ VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies, B.等(2008) “ The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288)。尤其重要的是抗原呈遞細胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配體和CD4 +T-淋巴細胞的CD28和CTLA-4受體之間的結合(Sharpe, A.H.等(2002) “ The B7-CD28 Superfamily”, Nature Rev. Immunol. 2:116-126；Dong, C.等(2003) “ Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules”,Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等(2009) “ The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation”, Immunol. Rev. 229:307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T-細胞啟動；B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這種啟動(Dong, C.等(2003) “ Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules”, Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等(2009) “ The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation”, Immunol. Rev. 229:307-321；Greenwald, R.J.等(2005) “ The B7 Family Revisited”, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548)。CD28在T-細胞的表面上組成型表達(Gross, J., 等(1992) “ Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse”, J. Immunol. 149:380–388)，而CTLA-4表達在T細胞啟動之後被快速上調(Linsley, P.等(1996) “ Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535–543)。因為CTLA-4是更高的親和力受體(Sharpe, A.H.等(2002) “ The B7-CD28 Superfamily”,Nature Rev. Immunol. 2:116-126)，所以結合首先啟動T-細胞增殖(經CD28)，然後抑制它(經CTLA-4的初期表達)，從而在不再需要增殖時阻遏所述效果。
對CD28受體的配體的進一步研究導致對一組相關的B7分子(“B7超家族”)的鑒定和表徵(Coyle, A.J.等(2001) “ The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function”,Nature Immunol. 2(3):203-209；Sharpe, A.H.等(2002) “ The B7-CD28 Superfamily”, Nature Rev. Immunol. 2:116-126；Greenwald, R.J.等(2005) “ The B7 Family Revisited”, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548；Collins, M.等(2005) “ The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands”, Genome Biol. 6:223.1-223.7；Loke, P.等(2004) “ Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells.” Arthritis Res. Ther. 6:208-214；Korman, A.J.等(2007) “ Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, ” Adv. Immunol. 90:297-339；Flies, D.B.等(2007) “ The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260；Agarwal, A.等(2008) “ The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, ” Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372；Lenschow, D.J.等(1996) “ CD28/B7 System of T-Cell Costimulation,” Ann. Rev. Immunol. 14:233-258；Wang, S.等(2004) “ Co- Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6:759-766)。該家族當前具有若干個已知成員：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導的共刺激配體(ICOS-L)、程式性死亡-1配體(PD-L1；B7-H1)、程式性死亡-2配體(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6 (Collins, M.等(2005) “ The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, ” Genome Biol. 6:223.1-223.7；Flajnik, M.F.等(2012) “ Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, ” Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)。
II. 程式性死亡-1 (“PD-1”)
程式性死亡-1 (“PD-1”也稱為“CD279”)是廣泛地負調節免疫應答的T-細胞調節劑的擴展的CD28/CTLA-4家族的約31 kD I型膜蛋白成員(Ishida, Y.等(1992) “ Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；美國專利申請公開號2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667、美國專利號6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868、PCT公開號WO 01/14557)。
PD-1在啟動的T-細胞、B-細胞和單核細胞上表達(Agata, Y.等(1996) “ Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772；Yamazaki, T.等(2002) “ Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC,” J. Immunol. 169:5538-5545)，並且，以低水準在天然殺傷細胞(NK) T-細胞中表達(Nishimura, H.等(2000) “ Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,” J. Exp. Med. 191:891-898；Martin-Orozco, N.等(2007) “ Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。
PD-1的細胞外區域由與CTLA-4中等同結構域具有23%同一性的單免疫球蛋白(Ig)V結構域組成(Martin-Orozco, N.等(2007) “ Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。細胞外IgV結構域之後是跨膜區域和細胞內尾區。細胞內尾區包含位於基於免疫受體酪氨酸的抑制基序和基於免疫受體酪氨酸的轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號(Ishida, Y.等(1992) “ Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；Blank, C.等(2006) “ Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor EvasionCancer,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。
通過結合B7-H1和B7-DC，PD-1介導其對免疫系統的抑制(Flies, D.B.等(2007) “ The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192、7,794,710、美國專利申請公開號2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687、PCT申請號WO 01/39722、WO 02/086083)。
B7-H1和B7-DC在人和鼠科動物組織，比如心臟、胎盤、肌肉、胎肝、脾、淋巴結和胸腺以及鼠科動物肝、肺、腎、胰腺的胰島細胞和小腸的表面上廣泛表達(Martin-Orozco, N.等(2007) “ Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。在人中，在人內皮細胞(Chen, Y.等(2005) “ Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92；de Haij, S.等(2005) “ Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1” Kidney Int. 68:2091-2102；Mazanet, M.M.等(2002) “ B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis,” J. Immunol. 169:3581-3588)、心肌(Brown, J.A.等(2003) “ Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production,” J. Immunol. 170:1257-1266)、合胞滋養層(syncyciotrophoblast)(Petroff, M.G.等(2002) “ B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,” Placenta 23:S95-S101)中已經發現了B7-H1蛋白質表達。分子也由一些組織的駐留型巨噬細胞、已經被干擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因數(TNF)-α啟動的巨噬細胞表達(Latchman, Y.等(2001) “ PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation,” Nat. Immunol 2:261-268)，並且在腫瘤中被表達(Dong, H. (2003) “ B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med. 81:281-287)。
已經發現B7-H1和PD-1之間的相互作用為T和B-細胞提供了重要的負共刺激信號(Martin-Orozco, N.等(2007) “ Inhibitory Costimulation And Anti-TumorImmunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)，並且用作細胞死亡誘導者(Ishida, Y.等(1992) “ Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895；Subudhi, S.K.等(2005) “ The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med. 83:193-202)。更具體而言，已經發現低濃度的PD-1受體和B7-H1配體之間的相互作用導致強烈抑制抗原特異性CD8 +T-細胞增殖的抑制信號的傳輸；在更高的濃度下，與PD-1的相互作用不抑制T細胞增殖但是顯著減少多種細胞因數的產生(Sharpe, A.H.等(2002) “ The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。已經發現可溶性B7-H1-Fc融合蛋白抑制靜息和先前啟動的CD4和CD8 T-細胞，以及甚至來自臍帶血的幼稚T-細胞的T細胞增殖和細胞因數產生(Freeman, G.J.等(2000) “ Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med. 192:1-9；Latchman, Y.等(2001) “ PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation,” Nature Immunol. 2:261-268；Carter, L.等(2002) “ PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643；Sharpe, A.H.等(2002) “ The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。
B7-H1和PD-1在抑制T-細胞啟動和增殖中的作用已經提示這些生物分子可能用作用於治療炎症和癌症的治療性靶。因此，已經建議了抗PD-1抗體治療感染和腫瘤以及上調適應性免疫應答的用途(見，美國專利申請公開號2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401、美國專利號7,521,051、7,563,869、7,595,048、PCT公開號WO 2004/056875、WO 2008/083174)。下述文獻已經報導了能夠特異性結合PD-1的抗體：Agata, T.等(1996) “ Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772；和Berger, R.等(2008) “ Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies,” Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (也見美國專利號8,008,449和8,552,154、US專利公開號2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT專利公開號WO 2003/099196、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2009/014708、WO 2009/073533、WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668)。
然而，儘管所有這些現有技術的進步，仍需要改善的組合物，其能夠更有力地引導身體的免疫系統攻擊癌細胞或病原體感染的細胞，尤其以較低的治療性濃度。儘管適應性免疫系統可以是抵抗癌症和疾病的有力防禦機制，但是其經常在腫瘤微環境中受到免疫抑制機制的阻礙，比如PD-1的表達。此外，在腫瘤環境(milieu)中由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可明顯減弱針對癌細胞的T-細胞應答。因此，仍需要有效的PD-1結合分子 。尤其地，需要這樣的有效PD-1結合分子：其具有期望的結合動力學特徵並且通過阻斷PD-1/PD-L1相互作用來對抗PD-1/PD-L1軸(axis)，其可為遭受癌症或其他疾病和病況的患者提供改善的治療價值。本發明涉及這些和其他目標。
本發明涉及PD-1結合分子，其包括下述能夠結合食蟹猴PD-1和人PD-1二者的選擇的抗PD-1抗體的PD-1結合結構域：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15。本發明尤其涉及PD-1結合分子，其是這類抗體的人源化形式或嵌合形式，或其包括這類抗PD-1抗體的PD-1結合片段(尤其地，免疫綴合物、雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等)。本發明尤其涉及這類PD-1結合分子，其另外能夠結合免疫細胞的表面上存在的參與調節免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類PD-1結合分子檢測PD-1或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法的方法，其中包括這類選擇的抗PD-1抗體的一個或多個PD-1結合結構域的PD-1結合分子聯合有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子和/或聯合特異性結合癌症抗原的一種或多種另外的分子施用。
詳細地，本發明提供了抗人PD-1結合分子，其包括三個重鏈CDR結構域CDR H1、CDR H2和CDR H3和三個輕鏈CDR結構域CDR L1、CDR L2和CDR L3，其中： (A)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 1的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:71 、 SEQ ID NO:72和 SEQ ID NO:73；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 1的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:76 、 SEQ ID NO:77和 SEQ ID NO:78； 或 (B)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 2的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:85 、 SEQ ID NO:86和 SEQ ID NO:87；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 2的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:90 、 SEQ ID NO:91和 SEQ ID NO:92； 或 (C)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 3的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:99 、 SEQ ID NO:100和 SEQ ID NO:101；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 3的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:104 、 SEQ ID NO:105和 SEQ ID NO:106； 或 (D)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 4的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:109 、 SEQ ID NO:110和 SEQ ID NO:111；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 4的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:114 、 SEQ ID NO:115和 SEQ ID NO:116； 或 (E)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 5的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:119 、 SEQ ID NO:120和 SEQ ID NO:121；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 5的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:124 、 SEQ ID NO:125和 SEQ ID NO:126； 或 (F)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 6的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:129 、 SEQ ID NO:130和 SEQ ID NO:131；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 6的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:134 、 SEQ ID NO:135和 SEQ ID NO:136； 或 (G)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 7的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:139 、 SEQ ID NO:140和 SEQ ID NO:141；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 7的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:144 、 SEQ ID NO:145和 SEQ ID NO:146； 或 (H)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 8的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:161 、 SEQ ID NO:162和 SEQ ID NO:163；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 8的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:166 、 SEQ ID NO:167和 SEQ ID NO:168； 或 (I)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 9的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:171 、 SEQ ID NO:172和 SEQ ID NO:173；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 9的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:176 、 SEQ ID NO:177和 SEQ ID NO:178； 或 (J)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 10的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:192 、 SEQ ID NO:193和 SEQ ID NO:194；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 10的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:197 、 SEQ ID NO:198和 SEQ ID NO:199； 或 (K)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 11的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:202 、 SEQ ID NO:203和 SEQ ID NO:204；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 11的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:207 、 SEQ ID NO:208和 SEQ ID NO:209； 或 (L)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 12的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:212 、 SEQ ID NO:213和 SEQ ID NO:214；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 12的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:217 、 SEQ ID NO:218和 SEQ ID NO:219或 (M)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 13的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:222 、 SEQ ID NO:223和 SEQ ID NO:224；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 13的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:227 、 SEQ ID NO:228和 SEQ ID NO:229； 或 (N)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 14的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:232 、 SEQ ID NO:233和 SEQ ID NO:234；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 14的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:237 、 SEQ ID NO:238和 SEQ ID NO:239； 或 (O)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是PD-1 mAb 15的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:242 、 SEQ ID NO:243和 SEQ ID NO:244；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是PD-1 mAb 15的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:247 、 SEQ ID NO:248和 SEQ ID NO:249； 或 (P)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是hPD-1 mAb 7(1.2)的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:139 、 SEQ ID NO:140和 SEQ ID NO:141；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是hPD-1 mAb 7(1.2)的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:157 、 SEQ ID NO:145和 SEQ ID NO:146； 或 (Q)(1)所述CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是hPD-1 mAb 7(1.3)的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:139 、 SEQ ID NO:140和 SEQ ID NO:141；和 (2)所述CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是hPD-1 mAb 7(1.3)的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:157 、 SEQ ID NO:158和 SEQ ID NO:145； 或 (R)(1)CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域是hPD-1 mAb 9(2.2)的重鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:183 、 SEQ ID NO:172和 SEQ ID NO:173；和 (2)CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域是hPD-1 mAb 9(2.2)的輕鏈CDR，並且分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:188 、 SEQ ID NO:189和 SEQ ID NO:178。
本發明進一步涉及所有這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子是抗體，尤其地，其中分子是嵌合抗體或人源化抗體。
本發明進一步涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中重鏈可變結構域具有 SEQ ID NO:79 、 SEQ ID NO:93 、 SEQ ID NO:147 、 SEQ ID NO:149 、 SEQ ID NO:179 、 SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:250的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中輕鏈可變結構域具有 SEQ ID NO:81 、 SEQ ID NO:95 、 SEQ ID NO:151 、 SEQ ID NO:153 、 SEQ ID NO:155 、 SEQ ID NO:184 、 SEQ ID NO:186或 SEQ ID NO:251的氨基酸序列。
本發明進一步涉及其中抗人PD-1結合分子是能夠同時結合人PD-1和第二表位的雙特異性結合分子的實施方式，尤其涉及其中第二表位是參與調節免疫檢查點的免疫細胞的表面上存在的分子的表位元的實施方式(尤其地，其中第二表位是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA，最尤其地，其中第二表位是下述的表位：CD137、CTLA-4、LAG-3、OX40、TIGIT或TIM-3)。
本發明進一步涉及這樣的實施方式：其中抗人PD-1結合分子是包括LAG-3表位結合位點(結合LAG-3表位的位點)的雙特異性分子，尤其地，其中所述LAG-3表位結合位點包括： (A)(1)LAG-3 mAb1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:42 、 SEQ ID NO:43和 SEQ ID NO:44；和 (2)LAG-3 mAb 1的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:46 、 SEQ ID NO:47和 SEQ ID NO:48； 或 (B)(1)hLAG-3 mAb 1 VH1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:42 、 SEQ ID NO:43和 SEQ ID NO:44；和 (2)hLAG-3 mAb 1 VL4的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:55 、 SEQ ID NO:47和 SEQ ID NO:48； 或 (C)(1)LAG-3 mAb 6的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:57 、 SEQ ID NO:58和 SEQ ID NO:59；和 (2)LAG-3 mAb 6的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:61 、 SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63； 或 (D)(1) hLAG-3 mAb 6 VH1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:57 、 SEQ ID NO:58和 SEQ ID NO:59；和 (2)LAG-3 mAb 6的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，其分別具有下述氨基酸序列： SEQ ID NO:298 、 SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63。
本發明進一步涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子是雙抗體，和尤其地，其中雙抗體是共價結合的複合物，其包括兩條或三條或四條或五條多肽鏈。本發明進一步涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子是三價結合分子，和尤其地，其中三價結合分子是共價結合的複合物，其包括三條、四條、五條或多於五條多肽鏈。本發明另外涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子包括Fc區域。本發明另外涉及這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子包括白蛋白結合結構域，尤其地，去免疫化的白蛋白結合結構域。
本發明進一步涉及所有這類抗人PD-1結合分子的實施方式，其中分子包括Fc區域，並且其中Fc區域是變異的Fc區域，其包括降低變異的Fc區域對FcγR的親和力和/或延長血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾，和更具體地，其中修飾包括選自下述的至少一種氨基酸取代： (1)L234A；L235A； (2)L234A和L235A； (3)M252Y；M252Y和S254T； (4)M252Y和T256E； (5)M252Y、S254T和T256E；或 (6)K288D和H435K； 其中編號是如Kabat中EU索引的編號。
本發明進一步涉及其中任何上述PD-1結合分子被用於刺激T-細胞介導免疫應答的實施方式。本發明另外涉及其中任何上述PD-1結合分子被用於治療與受抑制的免疫系統相關的疾病或病況，尤其癌症或感染，的實施方式。
本發明尤其涉及在癌症的治療或診斷或預後中的這類用途，其中癌症特徵在於存在選自由下述的細胞組成的組的癌症細胞：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤(posterious uveal melanoma)、罕見血液學疾病、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
本發明尤其涉及在癌症的治療或診斷或預後中的這類用途，其中癌症是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、急性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
本發明進一步涉及其中任何上述PD-1結合分子被可檢測地標記和用於檢測PD-1的實施方式。
本發明涉及PD-1結合分子，其包括如下選擇的能夠結合食蟹猴PD-1和人PD-1的抗PD-1抗體的PD-1結合結構域：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15。本發明尤其涉及PD-1結合分子，其是這類抗體的人源化形式或嵌合形式，或，其包括這類抗PD-1抗體的PD-1結合片段(尤其地，免疫綴合物、雙抗體(包括但不限於DART-A、DART-B、DART-C、DART-D、DART-E、DART-F、DART-G、DART-H、DART-I和DART-J)、BiTE、雙特異性抗體等)。本發明尤其涉及這類PD-1結合分子，其另外能夠結合免疫細胞的表面上存在的參與調節免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類PD-1結合分子檢測PD-1或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法的方法，其中包括這類選擇的抗PD-1抗體的一個或多個PD-1結合結構域的PD-1結合分子聯合有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子和/或聯合特異性結合癌症抗原的一種或多種另外的分子施用。 I. 抗體和它們的結合結構域
本發明的抗體是免疫球蛋白分子，其能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一個抗原識別位點而特異性結合至靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所使用，術語“ 抗體”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物連接的雙特異性Fvs (sdFv)、胞內抗體和任何上述的表位結合片段。尤其地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，類別(例如，IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1和IgA 2)或亞類。除了它們在診斷中已知的用途，已經證明抗體可用作治療劑。抗體能夠免疫特異性結合多肽或蛋白質或非蛋白質分子，因為在這樣的分子上存在特定的結構域或部分或構象(“ 表位”)。包含表位的分子可具有免疫原性活性，以便其在動物中引起抗體產生反應；這類分子稱為“ 抗原”)。最近數十年已經看到對抗體的治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一種主要類型的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等(2009) “ The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。
術語“ 單克隆抗體”指同質型(homogeneous)抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的和非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，直接針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab') 2Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合抗原的必要的特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構造(configuration)。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “ Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞它們本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi，可用作免疫原(見，例如，Jennings, V.M. (1995) “ Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地有活性。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用于基因操作，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合的部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。
天然抗體(比如IgG抗體)包括與兩條重鏈複合的兩條輕鏈。每條輕鏈包含可變結構域( VL)和恒定結構域( CL)。每條重鏈包含可變結構域( VH)，三個恒定結構域( CH1 、 CH2和 CH3)，和位於CH1和CH2結構域之間的“ 鉸鏈”結構域(“ H”)。天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元因此是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常作為約150,000 Da的糖蛋白被表達。每條鏈的氨基端(“N-末端”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基端(“C-末端”)部分限定了恒定區，其中輕鏈具有單個恒定結構域而重鏈通常具有三個恒定結構域和鉸鏈結構域。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c並且IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中H是鉸鏈結構域，n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。IgG分子的可變結構域由互補決定區(CDR)和稱為框架區段(FR)的非CDR區段組成，所述互補決定區(CDR)包含與表位接觸的殘基，所述框架區段一般維持結構和決定CDR環的定位，以便允許這類接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為 CDR L1 結構域、 CDR L 2 結構域和 CDR L 3 結構域。類似地，是(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為 CDR H1 結構域、 CDR H 2 結構域和 CDR H 3 結構域。因此，術語CDR L1結構域、CDR L2結構域、CDR L3結構域、CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域指當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合特異性表位的多肽，無論這樣的蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。因此，如本文所使用，術語“ 表位結合片段”意思是能夠免疫特異性結合表位的抗體的片段，並且術語“ 表位結合位點”指包含表位結合片段的分子的、負責表位元結合的部分。表位結合位點可包含這類抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR結構域，並且儘管能夠免疫特異性結合這類表位，但可展示對與這樣的抗體的表位不同的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。但是，優選地，表位結合片段將包含這類抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單個多肽鏈(例如，scFv)，或可包括兩條或更多條多肽鏈，每條鏈均具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、F(ab') 2片段等)。
本發明尤其包括本發明的抗PD-1抗體的單鏈可變結構域片段(“ scFv”)和包括其的多特異性結合分子。通過使用短的連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備單鏈可變結構域片段。Bird等(1988) (“ Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變結構域的羧基端和另一可變結構域的氨基端之間橫橋接約3.5 nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等(1988) “ Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)。連接體可進而被修飾，用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可經重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的適當的質粒引入到適當的宿主細胞中，所述宿主細胞是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸埃希氏菌(E. coli)。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
本發明還尤其包括本發明的抗PD-1抗體的人源化的變體和包括其的多特異性結合分子。術語“ 人源化 ”抗體指一般使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。本發明的抗人PD-1抗體包括抗體PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15的人源化變體、嵌合變體或犬源化變體。這類抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生這類衍生物和改善這類抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的抗原結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個基本步驟。這些是：(1)確定開始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪種抗體框架區域(3)實際人源化或犬源化方法/技術和(4)轉染和表達人源化抗體。見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
抗原結合位點可包括與恒定結構域融合的完整的可變結構域或僅僅包括移植至適當框架區的這類可變結構域的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定區，但是仍保留對外源可變結構域的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等(1989) “ Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅僅關注提供源自人的恒定區，而且也修飾可變結構域，以便重塑它們使其盡可能地與人形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變結構域都包含三個互補決定區(CDR)，側翼是四個框架區(FR)，所述互補決定區(CDR)對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力，所述框架區(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可變結構域。已經報導了該方法應用於各種抗體：Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “ Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “ Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “ Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “ Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “ Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “ Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “ Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “ Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “ Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有的CDR序列(例如，人源化鼠抗體，其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其序列相對於初始抗體不同。
已經描述了包括源自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的許多“人源化”抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恒定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見，例如，Winter等(1991) “ Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “ Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw等(1987) “ Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown等(1987) “ Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物CDR，其然後與適當的人抗體恒定結構域融合(見，例如，Riechmann, L.等(1988) “ Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “ Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “ Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的”分子被設計，以使對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “ Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。 II. Fcγ受體(FcγR)
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用，以形成Fc區域，其是被細胞Fc受體，包括但不限於Fc γ受體(FcγR)，識別的結構域。如本文所使用，術語“Fc區域”用於限定IgG重鏈的C-末端區域。示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1)： 231     240       250         260        270       280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290        300       310        320        330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340        350        360        370       380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390        400       410         420       430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440    447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如在Kabat闡釋的EU索引編號，其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)： 231    240        250        260        270        280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290        300       310         320        330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340        350        360        370        380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390       400         410        420        430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440    447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如在Kabat闡釋的EU索引編號，其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)： 231    240        250        260        270        280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290       300         310        320       330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340       350        360        370      380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390       400        410        420       430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440     447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 如在Kabat闡釋的EU索引編號，其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)： 231     240       250        260        270       280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290        300        310       320       330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340       350        360        370      380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390       400        410        420       430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440     447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 如在Kabat闡釋的EU索引編號，其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
遍及本說明書，IgG重鏈的恒定區中殘基的編號是如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”)中的EU索引的編號，其通過參考明確併入本文。術語“如在Kabat的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。通過鏈中氨基酸的位置命名來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑒定了每個亞組的氨基酸共有序列，並且為每個氨基酸賦予殘基編號，並且，如Kabat定義的來鑒定CDR(應當理解，如Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,”. J. Mol. Biol. 196:901-917)限定的CDR H1在之前的五個殘基開始)。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列中的一條，Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。用於賦予殘基編號的該方法已經成為本領域的標準並且容易鑒定在不同抗體，包括嵌合或人源化的變體中等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸的等同位置。
在抗體恒定區中的許多不同位置(例如，CH1位置，包括但不限於192、193和214位；Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如在Kabat闡釋的EU索引編號)處已經觀察到了多態性，因此示出的序列和現有技術的序列之間可能存在輕微的差別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，已知18個Gm同種異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.”Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G. 等1979，Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達體系中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明的PD-1結合分子中的任選的氨基酸殘基。本發明具體考慮缺少CH3結構域的C-末端殘基的PD-1結合分子。本發明也具體考慮包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類構建體。
通過將Fc區連接至細胞Fcγ受體(FcγR)轉換啟動信號和抑制信號。導致正好相反的功能的這類連接的能力是由於不同FcγR之間的結構差異造成的。受體的胞質信號傳導結構域中的兩個不同的結構域——稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAMs)和基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMS)——是造成不同應答的原因。募集不同胞質酶到這些結構中控制了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，然而，含ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯的FcγRIIA聚類用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的停泊位點，Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI3K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在限定了FcγR的這種抑制性亞類。最近，確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時，FcγRIIB中的ITIM變成磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca++的流入。因此，FcγRIIB的交聯抑制對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌因此被中止。 III. 雙特異性抗體 / 多特異性雙抗體和 DART ® 雙抗體
抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用，形成天然抗體的兩個表位結合位點之一。天然抗體能夠結合僅僅一個表位種類(即，它們是單特異性的)，但是它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示雙價或多價)。
本發明的結合結構域以“免疫特異性”方式結合表位元。如本文所使用，如果抗體、雙抗體或其他表位結合分子，相對于可選的表位，與另一分子的區域(即，表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其他表位結合分子“免疫特異性”結合該表位。例如，免疫特異性結合病毒表位元的抗體是，相比其免疫特異性結合其他病毒表位元或非病毒表位元，以更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持久性結合該病毒表位元的抗體。通過閱讀該定義，應理解，例如，免疫特異性結合第一靶的抗體(或部分或表位元)可特異性或非特異性或優選或非優選結合第二靶。因此，“免疫特異性結合”不必要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言，但不是必要的，提及結合意思是“特異性”結合。如果兩個分子的結合展示受體結合它們各自配體的特異性，則認為兩個分子能夠彼此以“物理特異性”方式結合。
可通過產生可同時結合兩個分開的和獨特的抗原(或相同抗原的不同表位)的基於多特異性抗體的分子，和/或通過產生對於相同的表位和/或抗原具有更高價(即，大於兩個結合位點)的基於抗體的分子，增強抗體的功能。
為了提供比天然抗體具有更大能力的分子，已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見，例如，PCT公佈號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用連接肽，所述連接肽與其他表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)融合或在抗體核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或與多個表位結合片段(例如，兩個Fab片段或scFvs)融合。可選的形式使用連接肽，以將表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)與二聚化結構域，比如CH2-CH3結構域，或可選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這些方法涉及折中和權衡。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了使用連接體可造成治療情形中的問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被轉變，並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合大於一種抗原。因此，在這些文檔中公開的分子用結合特異性換取了結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。文檔指出，CH2結構域在介導效應子功能過程中可能僅僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區已經用另外的VL和VH結構域替換，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單個鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單多肽鏈被合成，然後經歷蛋白酶解，以產生異源二聚化結構。因此，這些文檔中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能集團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。因此，這些文檔中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
現有技術已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即，除了雙價或多價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不同于這樣的天然抗體的雙抗體的能力(見，例如，Holliger等(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448、US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388/WO 02/02781 (Mertens等)；Alt等(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
雙抗體的設計是基於被稱為單鏈可變結構域片段(scFv)的抗體衍生物。這樣的分子通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。B Bird等(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變區的羧基末端和另一可變區的氨基末端之間橋接約3.5 nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)。連接體進而可被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組體產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入適當的宿主細胞中，所述宿主細胞可以是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸埃希氏菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
非單特異性雙抗體的供應提供了相對於抗體的明顯優勢，包括但不限於共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有寬範圍的應用，包括治療和免疫診斷。在各種應用中，雙特異性在設計和工程化雙抗體方面允許大的靈活性，提供對多聚抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的導向靶向，這取決於兩個靶抗原的存在。由於其增加的價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為~50 kDa或以下)，本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald等(1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。
雙抗體的雙特異性使得它們用於共連接不同的細胞，例如，將細胞毒性T細胞與腫瘤細胞交聯(Staerz等(1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631；和Holliger等(1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Marvin等(2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。可選地，或另外，雙特異性雙抗體可用於共連接不同細胞或單個細胞表面上的受體。不同細胞和/或受體的共連接可用於調節效應子功能和/或免疫細胞信號傳導。包括表位結合位點的多特異性分子(例如，雙特異性雙抗體)可被引導至在T淋巴細胞、天然殺傷細胞(NK)細胞、抗原呈遞細胞或其他單核細胞上表達的任何免疫細胞的表面決定簇，所述免疫細胞比如B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、BTLA (CD272)、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32、CD40、CD40L、CD47、CD64、CD70 (CD27L)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、CD94 (KLRD1)、CD137 (4-1BB)、CD137L (4-1BBL)、CD226、CTLA-4 (CD152)、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS (CD278)、ICOSL (CD275)、Killer啟動受體(KIR)、LAG-3 (CD223)、LIGHT (TNFSF14、CD258)、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40 (CD134)、OX40L (CD134L)、PD1H、PD-1 (CD279)、PD-L1 (B7-H1、CD274)、PD-L2 (B7-CD、CD273)、PVR (NECL5、CD155)、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3 (HAVCR2)和/或VISTA (PD-1H)。尤其地，被引導至參與調節免疫檢查點的細胞表面受體(或其配體)的表位結合位點可用於產生雙特異性或多特異性結合分子，所述雙特異性或多特異性結合分子對抗或阻斷免疫檢查點分子的抑制性信號傳導，從而刺激、上調或增強受試者中的免疫應答。參與調節免疫檢查點的分子包括但不限於B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3和/或VISTA。
但是，上述優勢需要突出的成本。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特和不同的多肽(即，這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體不同，其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致失活分子(Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588)，這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以便防止同源二聚化) (Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588)。所以，現有技術教導了這類多肽的非共價締合(見，例如，Olafsen等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(見，例如，Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
面對這樣的挑戰，本領域已經成功地開發了穩定的、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱為DART® (雙親和力重靶向試劑)雙抗體；見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Sloan, D.D.等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini, M.等(2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704；Chichili, G.R.等(2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)。這樣的雙抗體包括兩個或多個共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中，其允許形成二硫鍵，從而共價結合兩條多肽鏈。例如，將半胱氨酸殘基添加至這樣的構建體的C-末端已經被證明允許多肽鏈之間的二硫結合，穩定了產生的異源二聚體，而不干擾二價分子的結合特性。
最簡單的雙特異性DART®雙抗體的兩條多肽的每一條包括三個結構域。第一條多肽包括(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區；(ii)第二結構域，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區；和(iii)第三結構域，其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和異源二聚體促進結構域，其用於促進與雙抗體的第二多肽的異源二聚化和彼此共價結合雙抗體的第一和第二多肽。第二多肽含有(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL2)的結合區；(ii)第二結構域，其包括第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH1)的結合區；和(iii)第三結構域，其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和互補性異源二聚體促進結構域，其與第一多肽鏈的異源二聚體促進結構域複合，以促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價結合。這樣的分子是穩定的、有效的，並且具有同時結合兩個或多個抗原的能力。在一個實施方式中，第一和第二多肽的第三結構域各含半胱氨酸殘基，其用於經二硫鍵將多肽結合在一起。圖1提供了這樣的雙抗體的示意圖，其使用E螺旋/K螺旋異源二聚體-促進結構域和包含半胱氨酸的連接體用於共價結合。如圖2和圖3A-3C中所提供的，多肽中的一條或兩條可另外具有CH2-CH3結構域的序列，以便兩條雙抗體多肽之間的複合形成能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc區。如在下面更詳細提供的，這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列一致，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。
已經描述了這類分子的許多變型(見，例如，美國專利公開號2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053和2009/0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。這些包含Fc區域的DART®雙抗體可包括兩對多肽鏈。第一多肽鏈包括(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區，(ii)第二結構域，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區，(iii)第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)並且用於促進與雙抗體的第二多肽的異源二聚化並且使雙抗體的第一和第二多肽彼此共價結合，和(iv) CH2-CH3結構域。第二多肽包含(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL2)的結合區，(ii)第二結構域，其包括第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH1)的結合區，和(iii) )第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚體-促進結構域，所述異源二聚體-促進結構域促進與第一多肽鏈的異源二聚化。在本文中，兩條第一多肽彼此複合，以形成Fc區。圖3A-3C提供了利用不同的異源二聚體-促進結構域的這類雙抗體的三個變型的示意圖。
其他包含Fc區的DART®雙抗體可包括三條多肽鏈。這類DART®雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類DART®雙抗體的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域、和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。這類DART®雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，這類DART®雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類更複雜的DART®分子也具有包含半胱氨酸的結構域，其用於形成共價結合的複合物。因此，第一和第二多肽通過涉及在它們各自第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵穩定的Fc區。圖4A-4B提供了包括三條多肽鏈的這類雙抗體的示意圖。
其他包含Fc區的DART®雙抗體可包括五條多肽鏈，其可包括來自多達三種不同免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變結構域的結合區(稱為VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3)。例如，這類雙抗體的第一多肽鏈可包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈可包含：(i)包含VL1的結構域、和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第三多肽鏈可包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域、和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽可包含：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2的結構域、和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。在本文中，第一和第三多肽彼此複合，以形成Fc區。這類更複雜的DART®分子也具有包含半胱氨酸的結構域，其用於形成共價結合的複合物，以便每條多肽鏈通過涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵結合至少一種另外的多肽鏈。優選地，這類結構域在N-末端至C-末端方向上排列。圖5提供了包括五條多肽鏈的這類雙抗體的示意圖。
用於期望四價分子而不需要Fc的應用的可選的構建體在本領域中是已知的，包括但不限於四價串聯抗體，也稱為“TandAbs”(見，例如美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018，和WO 2013/013700)，其通過每個具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域的兩條相同鏈的同源二聚化而形成。
最近，已經描述了合併兩個雙抗體型結合結構域和一個非雙抗體型結構域和Fc區的三價結構(見，例如，2015年5月29日提交的PCT申請號：PCT/US15/33076，名稱是“Tri-Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof”和2015年5月29日提交的PCT/US15/33081，名稱是“Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof”)。這類三價分子可用于產生單特異性，雙特異性或三特異性分子。圖6A-6F提供了包括3或4條多肽鏈的這類三價分子的示意圖。 IV. 本發明的抗人 PD-1 結合分子
本發明優選的PD-1結合分子包括抗體、雙抗體、BiTE等，並且能夠結合人PD-1 (CD279)的連續的或不連續的(例如，構象)部分(表位元)。本發明PD-1結合分子優選地也展示結合一個或多個非人物種，尤其地，靈長類物種(尤其是靈長類物種，比如食蟹猴)，的PD-1分子的能力。代表性人PD-1多肽(NCBI序列NP_005009.2；包括20個氨基酸殘基信號序列(以底線顯示)和268個氨基酸殘基成熟蛋白質) 具有氨基酸序列( SEQ ID NO:68)： MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
在某些實施方式中，本發明的抗人PD-1結合分子特徵在於任何(一個或多個)下述標準： (1)特異性結合在刺激的人T-細胞的表面上內源表達的人PD-1； (2)特異性結合人PD-1，平衡結合常數(KD)為40 nM或更小； (3)特異性結合人PD-1，平衡結合常數(KD)為5 nM或更小； (4)特異性結合人PD-1，結合速率(on rate)(ka)為1.5 x 104 M-1min-1或更大； (5)特異性結合人PD-1，結合速率(ka)為90.0 x 104 M-1min-1或更大； (6)特異性結合人PD-1，解離速率(off rate)(kd)為7 x 10-4 min-1或更小； (7)特異性結合人PD-1，解離速率(kd)為2 x 10-4 min-1或更小； (8)特異性結合非人靈長類PD-1 (例如，食蟹猴的PD-1)； (9)抑制(即，阻斷或干擾) PD-1配體(PD-L1/PD-L2)與PD-1的結合/抑制活性； (10)刺激免疫應答；和/或 (11)與抗人LAG-3抗體協同作用，以刺激抗原特異性T-細胞應答。
如本文使用的，術語“抗原特異性T-細胞應答”指通過用對T細胞特異性的抗原刺激T細胞而導致的T細胞的應答。在抗原特異性刺激時，通過T細胞應答的非限制性例子包括增殖和細胞因數產生(例如，TNF-α、IFN-γ產生)。分子刺激抗原特異性T-細胞應答的能力可使用例如本文所述的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)腸毒素B型抗原(“SEB”)刺激的PBMC試驗來測定。
本發明優選的抗人PD-1結合分子具有下述鼠科抗人PD-1單克隆抗體的VH和/或VL結構域：“ PD-1 mAb 1 ” 、 “ PD-1 mAb 2 ” 、 “ PD-1 mAb 3 ” 、 “ PD-1 mAb 4 ” 、 “ PD-1 mAb 5 ” 、 “ PD-1 mAb 6 ” 、 “ PD-1 mAb 7 ” 、 “ PD-1 mAb 8 ” 、 “ PD-1 mAb 9 ” 、 “ PD-1 mAb 10 ” 、 “ PD-1 mAb 11 ” 、 “ PD-1 mAb 12 ” 、 “ PD-1 mAb 13 ” 、 “ PD-1 mAb 14 ”或 “ PD-1 mAb 15 ”，並且更優選地具有這類抗人PD-1單克隆抗體的VH結構域的1、2或所有3個CDR H和/或VL結構域的1、2或所有3個CDR L。這類優選的抗人PD-1結合分子包括雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合或人源化抗體、BiTE、雙抗體等，和具有變異的Fc區域的這類結合分子。
本發明尤其涉及包括PD-1結合結構域的PD-1結合分子，所述結合結構域具有： (A)(1) PD-1mAb 1的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 1的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 1的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 1的VL結構域的三個CDR L； (4) hPD-1 mAb 1 VH1的VH結構域； (5) hPD-1 mAb 1 VL1的VL結構域； (6) hPD-1 mAb 1的VH和VL結構域； (B)(1) PD-1 mAb 2的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 2的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 2的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 2的VL結構域的三個CDR L； (4) hPD-1 mAb 2 VH1的VH結構域； (5) hPD-1 mAb 2 VL1的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 2的VH和VL結構域； (C)(1) PD-1 mAb 3的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 3的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 3的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 3的VL結構域的三個CDR L； (D)(1) PD-1 mAb 4的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 4的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 4的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 4的VL結構域的三個CDR L； (E)(1) PD-1 mAb 5的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 5的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 5的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 5的VL結構域的三個CDR L； (F)(1) PD-1 mAb 6的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 6的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 6的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 6的VL結構域的三個CDR L； (G)(1) PD-1 mAb 7的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 7或hPD-1 mAb 7 VL2或hPD-1 mAb 7 VL3的VL結構域的三個CDR L； (3)PD-1 mAb 7的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 7或hPD-1 mAb 7 VL2、hPD-1 mAb 7 VL3的VL結構域的三個CDR L； (4) hPD-1 mAb 7 VH1或hPD-1 mAb 7 VH2的VH結構域； (5) hPD-1 mAb 7 VL1或hPD-1 mAb 7 VL2或hPD-1 mAb 7 VL 3的VL結構域； (6) hPD-1 mAb 7(1.1)，或hPD-1 mAb 7(1.2)，或hPD-1 mAb 7(1.3)，或hPD-1 mAb 7(2.1)，或hPD-1 mAb 7(2.2)，或hPD-1 mAb 7(2.3)的VH和VL結構域； (H)(1) PD-1 mAb 8的VH結構域的三個CDRH； (2)PD-1 mAb 8的VL結構域的三個CDR L； (3)PD-1 mAb 8的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 8的VL結構域的三個CDR L； (I)(1)PD-1 mAb 9或hPD-1 mAb 9 VH2的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 9或hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 9或hPD-1 mAb 9 VH2的VH結構域的三個CDRH，和PD-1 mAb 9或hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域的三個CDR L； (4) hPD-1 mAb 9 VH1，或hPD-1 mAb 9 VH2的VH結構域； (5) hPD-1 mAb 9 VL1，或hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域； (6) hPD-1 mAb 9(1.1)，或hPD-1 mAb 9(1.2)，或hPD-1 mAb 9(2.1)，或hPD-1 mAb 9(2.2)的VH和VL結構域； (J)(1) PD-1 mAb 10的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 10的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 10的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 10的VL結構域的三個CDR L； (K)(1) PD-1 mAb 11的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 11的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 11的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 11的VL結構域的三個CDR L； (L)(1) PD-1 mAb 12的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 12的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 12的VH結構域和PD-1 mAb 12的VL結構域的三個CDRH； (M)(1) PD-1 mAb 13的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 13的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 13的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 13的VL結構域的三個CDR L； (N)(1) PD-1 mAb 14的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 14的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 14的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 14的VL結構域的三個CDR L； (O)(1) PD-1 mAb 15的VH結構域的三個CDRH； (2) PD-1 mAb 15的VL結構域的三個CDR L； (3) PD-1 mAb 15的VH結構域的三個CDRH和PD-1 mAb 15的VL結構域的三個CDR L； (4) hPD-1 mAb 15 VH1的VH結構域； (5) hPD-1 mAb 15 VL1的VL結構域； (6)hPD-1 mAb 15的VH和VL結構域； 或 其與PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15結合相同的表位，或與其競爭結合相同的表位。 A. 抗人 PD-1 抗體 PD-1 mAb 1 1. 鼠科抗人 PD-1 抗體 PD-1 mAb 1
PD-1 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:69)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWN WIRQ FPGNKLEWMG HITYSGSTSY NPSLKS RISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCAR DY GSGYPYTLDY WGQGTSVTVS S PD-1 mAb 1的CDRH1 (SEQ ID NO:71):NDYAWNPD-1 mAb 1的CDRH2 (SEQ ID NO:72) ： HITYSGSTSYNPSLKSPD-1 mAb 1的CDRH3 (SEQ ID NO:73):DYGSGYPYTLDY
編碼PD-1 mAb 1的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:70 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaac tg gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag cactagctac aacccatctc tcaaa agtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc aaga gattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt caccgtctcc tcc
PD-1 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:74)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTC SATSIVS YVY WYQQKPG SSPQPWIY LT SNLAS GVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKLEIK PD-1 mAb 1的CDR L1( SEQ ID NO:76): SATSIVSYVYPD-1 mAb 1的CDR L2( SEQ ID NO:77): LTSNLASPD-1 mAb 1的CDR L3( SEQ ID NO:78): QQWSDNPYT
編碼PD-1 mAb 1的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:75(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc atgacctgc a gtgccacctc aattgtaagt tacgtttac t ggtaccagca gaagcctgga tcctcccccc aaccctggat ttat ctcaca tccaacctgg cttct ggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg c cagcagtgg agtgataacc cgtacacg tt cggagggggg accaagctgg  aaataaaa 2. 人源化抗人 PD-1 抗體 PD-1 mAb1 以形成 “ hPD-1 mAb 1 ”
當鑒定了抗原表位時，將上述鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 1人源化並且進一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗體從而在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生一個人源化的VH結構域，本文命名為 “ hPD-1 mAb 1 VH1 ”和一個人源化的VL結構域，本文命名為 “ hPD-1 mAb 1 VL1 ”。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域的抗體被稱為 “ hPD-1 mAb 1 ”。
hPD-1 mAb 1 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:79)顯示在下面(CDR H殘基以底線顯示)： DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWN WIRQ PPGKGLEWIG HITYSGSTSY NPSLKS RLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCAR DY GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS S
編碼hPD-1 mAb 1 VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:80 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaat tg gattaggcag cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat aatcccagtc tgaag agccg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcga gattat ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc tcc
hPD-1 mAb 1 VL1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITC SATSIVS YVY WYQQKPG QAPQPLIY LT SNLAS GIPAR  FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKVEIK
編碼hPD-1 mAb 1 VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:82 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga aaaggtcacc attacttgc t ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtac t ggtatcagca gaagcccggt caggctcccc agccattgat atat ctgacc agcaacctgg cttct ggtat cccagctcgt ttttccggta gcgggtccgg gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa gacgccgcca cctattattg t caacagtgg tcagacaatc catacact tt tggcggtggc accaaagtcg aaataaag B. 抗人 PD-1 抗體 PD-1 mAb 2 1. 鼠科抗人 PD-1 抗體 PD-1 mAb 2
PD-1 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LS DYFDY WGQGT TLTVSS PD-1 mAb 2的CDRH1( SEQ ID NO:85): SFGMHPD-1 mAb 2的CDRH2( SEQ ID NO:86)： YISSGSMSISYADTVKGPD-1 mAb 2的CDRH3( SEQ ID NO:87): LSDYFDY
編碼PD-1 mAb 2的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:84(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcac tgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgca tac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat gcagacacag tgaagggc cg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atcc ctgagt gactactttg   actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
PD-1 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:88)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 2的CDR L1( SEQ ID NO:90): RSSQSLVHSTGNTYLHPD-1 mAb 2的CDR L2( SEQ ID NO:91): RVSNRFSPD-1 mAb 2的CDR L3( SEQ ID NO:92): SQTTHVPWT
編碼PD-1 mAb 2的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:89(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgc a gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttacat tgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac agggtttc taaccgattt tc tggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tttttctgc t ctcaaactac acatgttccg tggacg ttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 2. 人源化抗人PD-1抗體PD-1 mAb2以形成“hPD-1 mAb 2”
當鑒定了抗原表位時，將上述鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 2人源化並且進一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗體從而在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生一個人源化的VH結構域，本文命名為“ hPD-1 mAb 2 VH1”和一個人源化的VL結構域本文命名為“ hPD-1 mAb 1 VL1”。因此，任何包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域的抗體被稱為“ hPD-1 mAb 2”。
hPD-1 mAb 2 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:93)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCAS LS DYFDY WGQGT TVTVSS
編碼hPD-1 mAb 2 VH1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:94(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgcaat tggttgagag tggtggtggc ctggtgcagc caggtggaag tctgcggttg tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga tgcat tgggt gcgccaggct cccggcaagg gtctcgagtg ggtagca tac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat gccgacacag tgaaaggc ag gtttactatc tcccgtgaca atgcaaaaaa cacactgtac ctgcaaatga atagcctgcg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttcc ctgtct gattacttcg actac tgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc
hPD-1 mAb 2 VL1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:95)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPQ LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC SQTTHVP WT FGQGTKLE IK
編碼hPD-1 mAb 2 VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:96 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt atttcttgt c ggagttcaca gagtctggta cattccacag gaaatacata tctccat tgg tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag ctgctgattt at agagtgtc taatcgattt tct ggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac actgaaaatc tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgt a gtcagaccac ccatgtaccc tggact tttg gccaaggtac taagctggaa atcaag C. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 3
PD-1 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:97)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY NQKFKG KAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTR EK ITTIVEGTYW YFDV WGTGTT VTVSS PD-1 mAb 3的CDRH1( SEQ ID NO:99): DYVMHPD-1 mAb 3的CDRH2( SEQ ID NO:100)： TIDPETGGTAYNQKFKGPD-1 mAb 3的CDRH3( SEQ ID NO:101): EKITTIVEGTYWYFDV
編碼PD-1 mAb 3的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:98(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： caggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa tgcac tgggt gaagcagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattgga act attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggc aa ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aaga gagaag attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tc tggggcac agggaccacg gtcaccgtct cctca
PD-1 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:102)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGDTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHLP YT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 3的CDR L1( SEQ ID NO:104): RSSQNIVHSNGDTYLEPD-1 mAb 3的CDR L2( SEQ ID NO:105): KVSNRFSPD-1 mAb 3的CDR L3( SEQ ID NO:106): FQGSHLPYT
編碼PD-1 mAb 3的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:103(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgc a gatctagtca gaacattgta catagtaatg gagacaccta tttggaa tgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct at aaagtttc caaccgattt tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgc t ttcaaggttc acatcttccg tacacg ttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa D. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 4
PD-1 mAb 4的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:107)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LT DYFDY WGQGT TLTVSS PD-1 mAb 4的CDRH1( SEQ ID NO:109): SFGMHPD-1 mAb 4的CDRH2( SEQ ID NO:110)： YISSGSMSISYADTVKGPD-1 mAb 4的CDRH3( SEQ ID NO:111): LTDYFDY
編碼PD-1 mAb 4的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:108 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcac tgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgca tat attagtagtg gcagtatgag tatttcctat gcagacacag tgaagggc cg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atcc ctgact gactactttg actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca
PD-1 mAb 4的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYFH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 4的CDR L1( SEQ ID NO:114): RSSQSLVHSTGNTYFHPD-1 mAb 4的CDR L2( SEQ ID NO:115): RVSNRFSPD-1 mAb 4的CDR L3( SEQ ID NO:116): SQTTHVPWT
編碼PD-1 mAb 4的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:113(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcctgc a gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttccat tgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac agggtttc taaccgattt tct ggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaactac acatgttccg tggacg ttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa E. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 5
PD-1 mAb 5的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMN WMKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL NQKFKD KATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGSSPFAY WG QGTLVTVSA PD-1 mAb 5的CDRH1(SEQ ID NO:119):AYWMN PD-1 mAb 5的CDRH2(SEQ ID NO:120)：VIHPSDSETWLNQKFKD PD-1 mAb 5的CDRH3(SEQ ID NO:121):EHYGSSPFAY
編碼PD-1 mAb 5的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:118 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc gcctactgga tgaac tggat gaaacagagg cctggacaag gccttgagtg gattggc gtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta aatcagaagt tcaag gacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaga gagcac tacggtagta gcccgtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca
PD-1 mAb 5的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:122)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIY AASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 5的CDRL1(SEQ ID NO:124):RANESVDNYGMSFMN PD-1 mAb 5的CDRL2(SEQ ID NO:125):AASNQGS PD-1 mAb 5的CDRL3(SEQ ID NO:126):QQSKEVPYT
編碼PD-1 mAb 5的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:123(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgc a gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaac tggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctat g ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtac acg ttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa F. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 6
PD-1 mAb 6的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSDTYY PDSVKG RFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCAR QK ATTWFAY WGQ GTLVTVST PD-1 mAb 6的CDRH1( SEQ ID NO:129): SYGMSPD-1 mAb 6的CDRH2( SEQ ID NO:130)： TISGGGSDTYYPDSVKGPD-1 mAb 6的CDRH3( SEQ ID NO:131): QKATTWFAY
編碼PD-1 mAb 6的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:128 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
PD-1 mAb 6的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASESVD NYGISFMN WF QQKPGQPPKL LIY PASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPW T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 6的CDR L1( SEQ ID NO:134): RASESVDNYGISFMNPD-1 mAb 6的CDR L2( SEQ ID NO:135): PASNQGSPD-1 mAb 6的CDR L3( SEQ ID NO:136): QQSKEVPWT
編碼PD-1 mAb 6的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:133(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgc a gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaac tggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctat c ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtgg acg ttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa G. 抗人PD-1抗體PD-1 mAb 7 1. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 7
PD-1 mAb 7的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMN WVKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD KATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS PD-1 mAb 7的CDRH1(SEQ ID NO:139):SYWMN PD-1 mAb 7的CDRH2(SEQ ID NO:140)：VIHPSDSETWLDQKFKD PD-1 mAb 7的CDRH3(SEQ ID NO:141):EHYGTSPFAY
編碼PD-1 mAb 7的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:138(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaac tgggt gaagcagagg cctggacaag gccttgagtg gattggc gtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta gatcagaagt tcaaggac aa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagg gagcac tacggtacta gcccgtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt gtcttcc
PD-1 mAb 7的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:142)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K PD-1 mAb 7的CDRL1 (SEQ ID NO:144):RANESVDNYGMSFMNPD-1 mAb 7的CDRL2 (SEQ ID NO:145):AASNQGSPD-1 mAb 7的CDRL3 (SEQ ID NO:146):QQSKEVPYT
編碼PD-1 mAb 7的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:143(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgc a gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaac tggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccat g ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtac acg ttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 2. 人源化抗人PD-1抗體PD-1 mAb7以形成“hPD-1 mAb 7”
當鑒定了抗原表位時，將上述鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 7人源化並且進一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗體從而在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生兩個人源化的VH結構域，本文命名為“ hPD-1 mAb 7 VH1”和“ hPD-1 mAb 7 VH2”，和三個人源化的VL結構域本文命名為“ hPD-1 mAb 7 VL1”、“ hPD-1 mAb 7 VL2”和“ hPD-1 mAb 7 VL3”。任何人源化的VL結構域可與任一人源化的VH結構域配對。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“ hPD-1 mAb 7”，並且人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定的VH/VL結構域命名，例如包括hPD-1 mAb 7 VH1和hPD-1 mAb 1 VL2的人源化抗體具體稱為“ hPD-1 mAb 7(1.2)”。
hPD-1 mAb 7 VH1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:147)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWIG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS
編碼hPD-1 mAb 7 VH1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:148(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaat tgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg gattggg gtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagat cg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc caga gagcac tacggcacat caccttttgc atac tggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc
hPD-1 mAb 7 VH2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:149)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWAG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS
編碼hPD-1 mAb 7 VH2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:150 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaat tgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg ggctggg gtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagat cg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc caga gagcac tacggcacat caccttttgc atac tggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc
hPD-1 mAb 7 VL1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:151)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
編碼hPD-1 mAb 7 VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:152 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgc a gagcaaatga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
hPD-1 mAb 7 VL2的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:153)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
編碼hPD-1 mAb 7 VL2的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:154(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgc a gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
hPD-1 mAb 7 VL3的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:155)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNRGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K
編碼hPD-1 mAb 7 VL3的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:156(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgc a gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
hPD-1 mAb 7 VL2和hPD-1 mAb 7 VL3二者的VL結構域的CDRL1包括天冬醯胺至絲氨酸的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列：RASESVDNYGMSFMN((SEQ ID NO:157)，取代的絲氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入到上述任何PD-1 mAb 7 CDRL1結構域中。
另外，hPD-1 mAb 7 VL3的VL結構域的CDRL2包括穀氨醯胺至精氨酸的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列：AASNRGS((SEQ ID NO:158)，取代的精氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入上述任何PD-1 mAb 7 CDRL2結構域中。 H. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 8
PD-1 mAb 8的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:159)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMN WVKQN HGKSLEWIG D INPKNGDTHY NQKFKG EATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAS DF DY WGQGTTLT VSS PD-1 mAb 8的CDRH1( SEQ ID NO:161):DYYMNPD-1 mAb 8的CDRH2( SEQ ID NO:162) ： DINPKNGDTHYNQKFKGPD-1 mAb 8的CDRH3( SEQ ID NO:163):DFDY
編碼PD-1 mAb 8的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:160 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaac tgggt gaagcagaac catggaaaga gccttgagtg gattgga gat attaatccta aaaatggtga cactcactac aaccagaagt tcaagggc ga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagc gatttt gactac tggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc
PD-1 mAb 8的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:164)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVGLGDQAS ISC RSSQTLV YSNGNTYLN W FLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP FT FGSGTKLE IK PD-1 mAb 8的CDRL1( SEQ ID NO:166):RSSQTLVYSNGNTYLNPD-1 mAb 8的CDRL2( SEQ ID NO:167):KVSNRFSPD-1 mAb 8的CDRL3( SEQ ID NO:168):SQSTHVPFT
編碼PD-1 mAb 8的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:165(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgc a gatctagtca gacccttgta tatagtaatg gaaacaccta tttaaat tgg ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac aaagtttc caaccgattt tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaagtac acatgttcca ttcacg ttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa I. 抗人PD-1抗體PD-1 mAb 9 1. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 9
PD-1 mAb 9的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:169)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS PD-1 mAb 9的CDRH1( SEQ ID NO:171):SYLVSPD-1 mAb 9的CDRH2( SEQ ID NO:172) ： TISGGGGNTYYSDSVKGPD-1 mAb 9的CDRH3( SEQ ID NO:173):YGFDGAWFAY
編碼PD-1 mAb 9的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:170(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg tgtct tgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat tcagacagtg tgaagggt cg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatca gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagg tatggt ttcgacggcg cctggtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt ctcttcc
PD-1 mAb 9的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITC RASENIY SYLA WYQQKQ EKSPQLLVY N AKTLAA GVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYC QH HYAVPWT FGG GTRLEIT PD-1 mAb 9的CDRL1( SEQ ID NO:176):RASENIYSYLAPD-1 mAb 9的CDRL2( SEQ ID NO:177):NAKTLAAPD-1 mAb 9的CDRL3( SEQ ID NO:178):QHHYAVPWT
編碼PD-1 mAb 9的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:175(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga tattgtcacc atcacatgt c gagcaagtga gaatatttac agttatttag ca tggtatca gcagaaacag gaaaaatctc ctcagctcct ggtctat aat gcaaaaacct tggcagca gg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggaattatta ctgt cagcat cattatgctg ttccgtggac g ttcggtgga ggcaccagac tggaaatcac a 2. 人源化抗人PD-1抗體PD-1 mAb9以形成“hPD-1 mAb 9”
當鑒定了抗原表位時，將上述鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 9人源化並且進一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗體從而在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生兩個人源化的VH結構域，本文命名為“hPD-1 mAb 9 VH1”和“hPD-1 mAb 9 VH2”，和兩個人源化的VL結構域本文命名為“hPD-1 mAb 9 VL1”和“hPD-1 mAb 9 VL2”。任何人源化的VL結構域可與人源化的VH結構域配對。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“hPD-1 mAb 9”，並且人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定的VH/VL結構域命名，例如包括hPD-1 mAb 9 VH1和hPD-1 mAb 9 VL2的人源化抗體具體稱為“hPD-1 mAb 9(1.2)”。
hPD-1 mAb 9 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:179)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQA PGKGLEWVA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
編碼hPD-1 mAb 9 VH1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:180(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgtct tgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaaggga ag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgc tatgga tttgacggcg catggtttgc ctac tgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
hPD-1 mAb 9 VH2的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:181)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVG WVRQA PGKGLEWTA T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
編碼hPD-1 mAb 9 VH2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:182 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgggc tgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg gacggcc act atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaaggga ag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgc tatgga tttgacggcg catggtttgc ctac tgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
hPD-1 mAb 9 VH2的VH結構域的CDRH1包括絲氨酸至甘氨酸的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列：SYLV G (( SEQ ID NO:183)，取代的甘氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入上述任何PD-1 mAb 9 CDRH1結構域中。
hPD-1 mAb 9 VL1的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:184)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY SYLA WYQQKP GKAPKLLIY N AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
編碼hPD-1 mAb 9 VL1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:185(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgc c gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg cc tggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttac aac gccaagaccc tcgcagct gg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgc cagcat cattacgcag tgccctggac c ttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa a
hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:186)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY NYLA WYQQKP GKAPKLLIY D AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
編碼hPD-1 mAb 9 VL2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:187 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgc c gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg cc tggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttac gac gccaagaccc tcgcagct gg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgc cagcat cattacgcag tgccctggac c ttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa a
hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域的CDR L1包括絲氨酸至天冬醯胺的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列：RASENIY N YLA ( SEQ ID NO:188)，取代的天冬醯胺以底線顯示)。考慮類似的取代可併入上述任何PD-1 mAb 9 CDR L1結構域中。
hPD-1 mAb 9 VL2的VL結構域的CDRL2包括天冬醯胺至天冬氨酸的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列：DAKTLAA ((SEQ ID NO:189)，取代的天冬氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入上述任何PD-1 mAb 7 CDRL2結構域中。 J. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 10
PD-1 mAb 10的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:190)顯示在下面(CDRH殘 基以底線顯示)。 EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMS WVRQT PEKRLEWVA S ISGGGSNIYY PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCAR QE LAFDY WGQGT   TLTVSS PD-1 mAb 10的CDRH1( SEQ ID NO:192): NYLMSPD-1 mAb 10的CDRH2( SEQ ID NO:193)： SISGGGSNIYYPDSVKGPD-1 mAb 10的CDRH3( SEQ ID NO:194): QELAFDY
編碼PD-1 mAb 10的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:191 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca tgtct tgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgca agt attagtggtg gtggtagtaa tatctactat ccagacagtg tgaagggt cg attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaga caagaa ctggcttttg actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
PD-1 mAb 10的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:195)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RTSQDIS NFLN WYQQKP DGTIKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GSTLPWT FGG GTKLEII PD-1 mAb 10的CDRL1 (SEQ ID NO:197):RTSQDISNFLNPD-1 mAb 10的CDRL2 (SEQ ID NO:198):YTSRLHSPD-1 mAb 10的CDRL3 (SEQ ID NO:199):QQGSTLPWT
編碼PD-1 mAb 10的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:196(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgc a ggacaagtca ggacattagc aattttttaa ac tggtatca gcagaaacca gatggaacta ttaaactcct gatctac tac acatcaagat tacactca gg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgc caacag ggtagtacgc ttccgtggac g ttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcat a K. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 11
PD-1 mAb 11的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:200)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMH WVKQR PGQGLKWMG A IYPGNSDTHY NQKFKG KAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTT GT YSYFDV WGTG TTVTVSS PD-1 mAb 11的CDRH1(SEQ ID NO:202):GYWMH PD-1 mAb 11的CDRH2(SEQ ID NO:203)：AIYPGNSDTHYNQKFKG PD-1 mAb 11的CDRH3(SEQ ID NO:204):GTYSYFDV
編碼PD-1 mAb 11的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:201(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga tgcac tgggt aaaacagagg cctggacagg gtctgaaatg gatgggg gct atttatcctg gaaatagtga tactcactac aaccagaagt tcaagggc aa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tact gggacc tactcgtact tcgatgtc tg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc a
PD-1 mAb 11的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:205)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TSIH WYQHRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ SNSWLT FGAG TKLELK PD-1 mAb 11的CDRL1(SEQ ID NO:207):RASQSIGTSIH PD-1 mAb 11的CDRL2(SEQ ID NO:208):YASESIS PD-1 mAb 11的CDRL3(SEQ ID NO:209):QQSNSWLT
編碼PD-1 mAb 11的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:206(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt ttctcctgc a gggccagtca gagcattggc acaagcatac ac tggtatca gcacagaaca aatggttctc caaggcttct cataaag tat gcttctgagt ctatctct gg gatcccttcc aggtttagtg gcagtggatc agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct gaagatattg cagattatta ctgt caacaa agtaatagct ggctcacg tt cggtgctggg accaagctgg agctgaaa L. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 12
PD-1 mAb 12的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:210)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY NQKFKG KAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSR ER ITTVVEGAYW YFDV WGTGTT VTVSS PD-1 mAb 12的CDRH1 (SEQ ID NO:212):DYEMHPD-1 mAb 12的CDRH2 (SEQ ID NO:213) ： TIDPETGGTAYNQKFKGPD-1 mAb 12的CDRH3 (SEQ ID NO:214):ERITTVVEGAYWYFDV
編碼PD-1 mAb 12的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:211(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga tgcac tgggt gaaacagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattggg act attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggc aa ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aaga gagagg attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tc tggggcac agggaccacg gtcaccgtct cctca
PD-1 mAb 4的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:215)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIC KVSTRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP YT FGGGTKLE IK PD-1 mAb 12的CDRL1 (SEQ ID NO:217):RSSQNIVHSNGNTYLEPD-1 mAb 12的CDRL2 (SEQ ID NO:218):KVSTRFSPD-1 mAb 12的CDRL3 (SEQ ID NO:219):FQGSHVPYT
編碼PD-1 mAb 12的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:216(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgc a gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaa tgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct gc aaagtttc cacccgattt tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgc t ttcaaggttc acatgttccg tacacg ttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa M. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 13
PD-1 mAb 13的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:220)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSNIYY PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCAR QA YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS S PD-1 mAb 13的CDRH1 (SEQ ID NO:222):SHTMSPD-1 mAb 13的CDRH2 (SEQ ID NO:223) ： TISGGGSNIYYPDSVKGPD-1 mAb 13的CDRH3 (SEQ ID NO:224):QAYYGNYWYFDV
編碼PD-1 mAb 13的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:221(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca tgtct tgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgca acc attagtggtg gtggttctaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg a ttcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaga caagct tactacggta attactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc tcc
PD-1 mAb 13的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:225)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYC QQ LDSIPWT FGG GTKLEIK PD-1 mAb 13的CDRL1 (SEQ ID NO:227):LASQTIGTWLAPD-1 mAb 13的CDRL2 (SEQ ID NO:228):AATSLADPD-1 mAb 13的CDRL3 (SEQ ID NO:229):QQLDSIPWT
編碼PD-1 mAb 13的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:226(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc atcacgtgc c tggcaagtca gaccattggt acatggttag ca tggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttat gct gcaaccagct tggcagat gg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taagttatta ctgt caacaa cttgacagta ttccgtggac g ttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa a N. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 14
PD-1 mAb 14的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:230)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWIT WVKQR PGQGLQWIG N IYPGTDGTTY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCAT GL HWYFDV WGTG TTVTVSS PD-1 mAb 14的CDRH1 (SEQ ID NO:232):SYWITPD-1 mAb 14的CDRH2 (SEQ ID NO:233) ： NIYPGTDGTTYNEKFKSPD-1 mAb 14的CDRH3 (SEQ ID NO:234):GLHWYFDV
編碼PD-1 mAb 14的VH結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:231(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga taacc tgggt gaaacagagg cctggacaag gccttcagtg gattgga aat atttatcctg gtactgatgg tactacctac aatgagaagt tcaagagc aa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac atgcacctca gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aact gggcta cactggtact tcgatgtc tg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc c
PD-1 mAb 14的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:235)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQSVG TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASSRFS GVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFC QQ YNSYPYT FGG GTKLEIK PD-1 mAb 14的CDRL1 (SEQ ID NO:237):KASQSVGTNVAPD-1 mAb 14的CDRL2 (SEQ ID NO:238):SASSRFSPD-1 mAb 14的CDRL3 (SEQ ID NO:239):QQYNSYPYT
編碼PD-1 mAb 14的VL結構域的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:236(編碼CDR L殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt gtcacctgc a aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag cc tggtatca acagaagccc ggtcaatctc ctaaagcact gatttac tcg gcatcctccc gattcagt gg cgtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgt cagcaa tataacagct atccgtacac g ttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa a O. 抗人PD-1抗體PD-1 mAb 15 1. 鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 15
PD-1 mAb 15的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:240)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLIS WVRQT PEKRLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTR RG TYAMDY WGQG TSVTVSS PD-1 mAb 15的CDRH1 (SEQ ID NO:242):SYLISPD-1 mAb 15的CDRH2 (SEQ ID NO:243) ： AISGGGADTYYADSVKGPD-1 mAb 15的CDRH3 (SEQ ID NO:244):RGTYAMDY
編碼PD-1 mAb 15的VH結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:241 (編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctct tgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgct gcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat gccgacagtg tgaagggt cg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aaga cgaggg acctatgcta tggactac tg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c
PD-1 mAb 15的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:245)顯示在下面(CDRL殘基以底線顯示)： DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYC QQ LYSIPWT FGG GTKLEIK PD-1 mAb 15的CDR L1( SEQ ID NO:247): LASQTIGTWLAPD-1 mAb 15的CDR L2( SEQ ID NO:248): AATSLADPD-1 mAb 15的CDR L3( SEQ ID NO:249): QQLYSIPWT
編碼PD-1 mAb 15的VL結構域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:246(編碼CDRL殘基的核苷酸以底線顯示)： gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc atcacatgc c tggcaagtca gaccattggt acatggttag ca tggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttat gct gcaaccagct tggcagat gg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taaattatta ctgt caacaa ctttacagta ttccgtggac g ttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa a 2. 人源化抗人PD-1抗體PD-1 mAb 15以形成“hPD-1 mAb 15”
當鑒定了抗原表位時，將上述鼠科抗人PD-1抗體PD-1 mAb 15人源化並且進一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗體從而在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生一個人源化的VH結構域，本文命名為“ hPD-1 mAb 2 VH1”，和一個人源化的VL結構域本文命名為“ hPD-1 mAb 1 VL1”。包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域的抗體被稱為“ hPD-1 mAb 15”。
hPD-1 mAb 15 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:250)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLIS WVRQA PGKGLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR RG TYAMDY WGQG TLVTVSS
編碼hPD-1 mAb 15 VH1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:251(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctct tgggt gcgccaagcc ccaggtaagg gccttgaatg ggtc gccgcc attagtgggg gtggtgccga tacatattat gccgacagcg tcaaggga cg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccgg cgcggg acttacgcta tggactat tg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c
hPD-1 mAb 15 VL1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:252)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKAPKLLIY A ATSLAD GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYC QQ LYSIPWT FGQ GTKLEIK
編碼hPD-1 mAb 15 VL1的示例性多核苷酸是 SEQ ID NO:253(編碼CDRH殘基的核苷酸以底線顯示)： gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc atcacctgt c tggccagtca gaccattgga acctggctcg cc tggtatca gcagaaacct ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagat gg agtgccctcc cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc gaggatttcg ctacatacta ctgt caacag ctctactcca ttccatggac c tttggtcag ggtactaaac tggagatcaa a IV. 抗人PD-1抗體PD-1 mAb 1-15以及它們具有工程化的Fc區域的衍生物
在傳統的免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用產生各種各樣的應答，範圍從效應子功能，比如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬，到免疫調節信號，比如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合物的Fc區與造血細胞上專用細胞表面受體的結合來啟動。由抗體和免疫複合物引發的細胞應答的多樣性由三種Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性造成。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動(即，免疫系統增強)性受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制(即，免疫系統抑制)性受體。另外，與新生Fc受體(FcRn)的相互作用介導IgG分子從內體至細胞表面的再迴圈並且釋放進入血液中。上面呈現了示例性野生型IgG1 ( SEQ ID NO:1)、IgG2 ( SEQ ID NO:2)、IgG3 ( SEQ ID NO:3)和IgG4 ( SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
Fc區域的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。就效應子功能而言，可期望修飾本發明的抗體或其他結合分子，例如，以便增強這樣的分子在治療癌中的有效性。在某些情況下，期望降低或消除效應子功能，例如在抗體的作用機制涉及阻斷或對抗但不是殺傷攜帶靶抗原的細胞的情況下。當被引導至不期望的細胞諸如其中FcγR以低水準表達的腫瘤和外源細胞時，例如具有低水準FcγRIIB的腫瘤-特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，提高的效應子功能通常是期望的。在所述實施方式中，具有賦予的或改變的效應子功能活性的本發明的分子可用于治療和/或預防疾病、病症或感染，其中增強的效應子功能活性的功效是期望的。
在某些實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括Fc區域，其具有對野生型Fc區域(例如， SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的一個或多個修飾(例如，取代、缺失或插入)，所述修飾降低Fc區域的親和力和親合力，從而降低了本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中，本發明的分子包括這樣的Fc區域，其具有對野生型Fc區域的氨基酸的一個或多個修飾，所述修飾提高了Fc區域的親和力和親合力，因此提高了本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中，分子包括變異的Fc區域，其中相對於不包括Fc區域或包括野生型Fc區域的分子，所述變體賦予或介導提高的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性和/或與FcγRIIA增加的結合。在可選的實施方式中，分子包括變異的Fc區域，其中相對於不包括Fc區域或包括野生型Fc區域的分子，所述變體賦予或介導降低的ADCC活性(或其他效應子功能)和/或與FcγRIIB增加的結合。在一些實施方式中，本發明包括這樣的PD-1結合分子，其包括變異的Fc區域，該變異的Fc區域相對於包括野生型Fc區域的相當的分子，不顯示可檢測的與任何FcγR的結合。在其他實施方式中，本發明包括這樣的PD-1結合分子，其包括變異的Fc區域，該變異的Fc區域僅僅結合單FcγR，優選地結合FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA之一。任意這樣的增加的親和力和/或親合力均優選通過體外測量對細胞中的FcγR可檢測的結合程度或FcγR相關活性而評估，所述細胞在親本分子(沒有修飾的Fc區)的結合活性不能在細胞中被檢測到時表達低水準FcγR，或者所述細胞以以下密度表達非FcγR受體靶抗原：密度為30,000至20,000分子/細胞、密度為20,000至10,000分子/細胞、密度為10,000至5,000分子/細胞、密度為5,000至1,000分子/細胞、密度為1,000至200分子/細胞或密度為200分子/細胞或更小(但是至少為10、50、100或150分子/細胞)。
本發明的PD-1結合分子可包括變異的Fc區域，所述變異的Fc區域對於啟動性和/或抑制性Fcγ受體具有改變的親和力。在一個實施方式中，PD-1結合分子包括變異的Fc區域，所述變異的Fc區域相對於具有野生型Fc區域的相當的分子，對於FcγRIIB具有增加的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另一實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，所述變異的Fc區域相對於具有野生型Fc區域的相當的分子，對於FcγRIIB具有降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有增加親和力。在仍另一實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，所述變異的Fc區域相對於具有野生型Fc區域的相當的分子，對於FcγRIIB具有降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在仍另一實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其相對於具有野生型Fc區域的相當的分子，對於FcγRIIB具有不變的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或增加的)親和力。
在某些實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有改變的親和力，使得免疫球蛋白具有增強的效應子功能。效應細胞功能的非限制性例子包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性、抗體依賴性吞噬、吞噬、調理作用、調理吞噬、細胞結合、玫瑰花結(rosetting)、C1q結合和補體依賴性細胞介導的細胞毒性。
在優選的實施方式中，相對於包括野生型Fc區域的相當的分子，親和力或效應子功能的改變是至少2倍、優選地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本發明的其他實施方式中，相對於包括野生型Fc區域的分子，變異的Fc區域以至少65%，優選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%更大的親和力免疫特異性結合一個或多個FcR。這類測量可以是體內或體外試驗，在優選的實施方式中是體外試驗，比如ELISA或表面等離子共振試驗。
在不同的實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其中所述變體激動(agonize)FcγR受體的至少一種活性或對抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中，分子包括這樣的變體：其對抗FcγRIIB的一種或多種活性，例如，B細胞受體-介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入、細胞週期進程、FcγRIIB-介導的對FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合或一個或多個下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)在FcγRIIB信號轉導途徑中的活性。在另一實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變體，其激動FcεRI的一種或多種活性，例如，肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因數產生或5-羥色胺釋放。
在某些實施方式中，分子包括Fc區，其包括來自兩個或更多個IgG同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的區域。如本文所使用，相對於其他IgG同種型，如果Fc區的氨基酸序列與特定的IgG同種型最同源，則認為Fc區具有該IgG同種型。由於它們的鉸鏈和/或Fc區的氨基酸序列的差異，各種IgG同種型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、補體結合、FcγR結合親和力和效應子功能活性(例如，ADCC、CDC等)，例如在Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156；Chappel等(1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131；Chappel等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040;或Brüggemann等(1987) J. Exp. Med 166:1351-1361中描述。該類型的變異的Fc區可單獨使用或組合氨基酸修飾使用，以影響Fc-介導的效應子功能和/或結合活性。在組合中，相對於包括野生型Fc區的本發明分子，氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區可展示類似的功能(例如，對FcγRIIA提高的親和力)並可另外或更優選協同作用，以修飾本發明分子中的效應子功能。在其他實施方式中，相對於不包括Fc區或包括相同同種型的野生型Fc區的本發明分子，氨基酸修飾和IgG Fc區可展示相反的功能(例如，分別對FcγRIIA提高的和降低的親和力)並可發揮作用，以選擇減輕和或降低本發明分子的特定功能。
在優選的具體實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其中所述變異的Fc區相對於野生型Fc區包括至少一個氨基酸的修飾，以便所述分子對FcR具有改變的親和力，條件是基於諸如由Sondermann等 (2000) Nature 406:267-73公開的Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析，所述變異Fc區在直接接觸FcγR的位置不具有取代。Fc區中直接接觸FcγR的位置的實例是氨基酸殘基234-239、氨基酸殘基265-269 (B/C 環)、氨基酸殘基297-299 (C’/E環)和氨基酸殘基327-332 (F/G環)。在一些實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc區，其包括至少一個殘基的修飾，所述殘基基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR，例如不在Fc-FcγR結合位點內。
變異的Fc區域是本領域熟知的，並且可在本發明中使用任何已知的變異的Fc區，以賦予或修飾包括Fc區(或其部分)的本發明的分子展示的效應子功能，如在例如NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中功能測定的。例如，PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707和WO 2008/140603中公開了鑒定為改變效應子功能的Fc區變體，並且，其中公開的任何合適的變體均可用于本發明的分子中。
在某些實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其在一個或多個區域中具有一個或多個氨基酸修飾，該修飾(相對於野生型Fc區域)改變了變異的Fc區域對於啟動性FcγR (比如FcγRIIA或FcγRIIIA)相對於抑制性FcγR (比如FcγRIIB)的 親和力的比例：
尤其優選的是本發明的PD-1結合分子，其具有變異的Fc區域(相對於野生型Fc區域)，其中變異的Fc區域的親和力的比例大於1。這樣的分子在提供其中期望由FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的增強的功效的疾病、病症或感染，例如癌或感染性疾病，的療法或預防療法或其症狀的改善方面具有特別的用途。相比之下，親和力比例小於1的變異的Fc區介導降低的效應細胞功能的效力。根據其親和力比是否大於或小於1，表1列出了示例性單、雙、三、四和五突變。
表1 按照親和力的比例列舉的示例性單突變和多突變
單 雙 三 四 五
親和力的比例＞ 1
F243L F243L & R292P F243L、P247L & N421K L234F、F243L、R292P & Y300L L235V、F243L、R292P、Y300L & P396L
D270E F243L & Y300L F243L、R292P & Y300L L235I、F243L、R292P & Y300L L235P、F243L、R292P、Y300L & P396L
R292G F243L & P396L F243L、R292P & V305I L235Q、F243L、R292P & Y300L F243L、R292P、V305I、Y300L & P396L
R292P D270E & P396L F243L、R292P & P396L F243L、P247L、D270E & N421K
R292P & Y300L F243L、Y300L & P396L F243L、R255L、D270E & P396L
R292P & V305I P247L、D270E & N421K F243L、D270E、G316D & R416G
R292P & P396L R255L、D270E & P396L F243L、D270E、K392T & P396L
Y300L & P396L D270E、G316D & R416G F243L、D270E、P396L & Q419H
P396L & Q419H D270E、K392T & P396L F243L、R292P、Y300L、& P396L
D270E、P396L & Q419H F243L、R292P、V305I & P396L
V284M、R292L & K370N P247L、D270E、Y300L & N421K
R292P、Y300L & P396L R255L、D270E、R292G & P396L
R255L、D270E、Y300L & P396L
D270E、G316D、P396L & R416G
親合力的比例＜ 1
Y300L F243L & P396L F243L、R292P & V305I
P396L P247L & N421K
R255L & P396L
R292P & V305I
K392T & P396L
P396L & Q419H
在具體的實施方式中，在變異的Fc區域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330，優選地下述殘基的一個或多個：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具體實施方式中，在變異的Fc區域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在任何下述位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，優選地下述殘基的一個或多個：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在優選的實施方式中，在以改變的親和力結合FcγR的變異的Fc區域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地，變異的Fc區域具有任何下述殘基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的實施方式中，在以降低親和力的結合FcγR (經其Fc區域)的變異的Fc區域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的實施方式中，在以增強的親和力結合FcγR (經其Fc區域)的變異的Fc區域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。在不同的實施方式中，在以增強的親和力結合FcγRIIA的變異的Fc區域，任何下述殘基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
優選的變體包括在下述任何位置的一個或多個修飾：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其優選的變體包括選自A-AI組的一個或多個修飾：
A 228E、228K、228Y或228G；
B 230A、230E、230Y或230G；
C 231E、231K、231Y、231P或231G；
D 232E、232K、232Y、232G；
E 233D；
F 234I或234F；
G 235D、235Q、235P、235I或235V；
H 239D、239E、239N或239Q；
I 240A、240I、240M或240T；
J 243R、243、243Y、243L、243Q、243W、243H或243I；
K 244H；
L 245A；
M 247G、247V或247L；
N 262A、262E、262I、262T、262E或262F；
O 263A、263I、263M或263T；
P 264F、264E、264R、264I、264A、264T或264W；
Q 265F、265Y、265H、265I、265L、265T、265V、265N或265Q；
R 266A、266I、266M或266T；
S 271D、271E、271N、271Q、271K、271R、271S、271T、271H、271A、271V、271L、271I、271F、271M、271Y、271W或271G；
T 273I；
U 275L或275W；
V 281D、281K、281Y或281P；
W 284E、284N、284T、284L、284Y or284M；
X 291D、291E、291Q、291T、291H、291I或291G；
Y 299A、299D、299E、299F、299G、299H、299I、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S、299V、299W或299Y；
Z 302I；
AA 304D、304N、304T、304H或304L
AB 305I；
AC 313F；
AD 323I；
AE 325A、325D、325E、325G、325H、325I、325L、325K、325R、325S、325F、325M、325T、325V、325Y、325W或325P；
AF 328D、328Q、328K、328R、328S、328T、328V、328I、328Y、328W、328P、328G、328A、328E、328F、328H、328M或328N；
AG 330L、330Y、330I或330V；
AH 332A、332D、332E、332H、332N、332Q、332T、332K、332R、332S、332V、332L、332F、332M、332W、332P、332G或332Y；和
AI 336E、336K或336Y
仍更尤其優選的變體包括選自1-105組的一個或多個修飾：
組 變體 組 變體
1 A330L/I332E 54 S239D/D265L/N297D/I332E
2 D265F/N297E/I332E 55 S239D/D265T/N297D/I332E
3 D265Y/N297D/I332E 56 S239D/D265V/N297D/I332E
4 D265Y/N297D/T299L/I332E 57 S239D/D265Y/N297D/I332E
5 F241E/F243Q/V262T/V264F 58 S239D/I332D
6 F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E 59 S239D/I332E
7 F241E/F243R/V262E/V264R 60 S239D/I332E/A330I
8 F241E/F243R/V262E/V264R/I332E 61 S239D/I332N
9 F241E/F243Y/V262T/V264R 62 S239D/I332Q
10 F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E 63 S239D/N297D/I332E
11 F241L/F243L/V262I/V264I 64 S239D/N297D/I332E/A330Y
12 F241L/V262I 65 S239D/N297D/I332E/A330Y/F241S/F243H/V262T/V264T
13 F241R/F243Q/V262T/V264R 66 S239D/N297D/I332E/K326E
14 F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E 67 S239D/N297D/I332E/L235D
15 F241W/F243W/V262A/V264A 68 S239D/S298A/I332E
16 F241Y/F243Y/V262T/V264T 69 S239D/V264I/A330L/I332E
17 F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E 70 S239D/V264I/I332E
18 F243L/V262I/V264W 71 S239D/V264I/S298A/I332E
19 P243L/V264I 72 S239E/D265N
20 L328D/I332E 73 S239E/D265Q
21 L328E/I332E 74 S239E/I332D
22 L328H/I332E 75 S239E/I332E
23 L328I/I332E 76 S239E/I332N
24 L328M/I332E 77 S239E/I332Q
25 L328N/I332E 78 S239E/N297D/I332E
26 L328Q/I332E 79 S239E/V264I/A330Y/I332 E
27 L328T/I332E 80 S239E/V264I/I332 E
28 L328V/I332E 81 S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E
29 N297D/A330Y/I332E 82 S239N/A330L/I332E
30 N297D/I332E 83 S239N/A330Y/I332E
31 N297D/I332E/S239D/A330L 84 S239N/I332D
32 N297D/S298A/A330Y/I 332E 85 S239N/I332E
33 N297D/T299L/I332E 86 S239N/I332N
34 N297D/T299F/I332E/N297D/T299H/I332E 87 S239N/I332Q
35 N297D/T299I/I332E 88 S239N1S298A/I332E
36 N297D/T299L/I332E 89 S239Q/I332D
37 N297D/T299V/I332E 90 S239Q/I332E
38 N297E/I332E 91 S239Q/I332N
39 N297S/I332E 92 S239Q/I332Q
40 P230A/E233D/I332E 93 S239Q/V264I/I332E
41 P244H/P245A/P247V 94 S298A/I332E
42 S239D/A330L/I332E 95 V264E/N297D/I332E
43 S239D/A330Y/I332E 96 V264I/A330L/I332E
44 S239D/A330Y/I332E/K326E 97 V264I/A330Y/I332E
45 S239D/A330Y/I332E/K326T 98 V264I/I332E
46 S239D/A330Y/I332E/L234I 99 V264I/S298A/I332E
47 S239D/A330Y/I332E/L235D 100 Y296D/N297D/I332E
48 S239D/A330Y/I332E/V240I 101 Y296E/N297D/I332 E
49 S239D/A330Y/I332E/V264T 102 Y296H/N297D/I332E
50 S239D/A330Y/I332E/V266I 103 Y296N/N297D/I332E
51 S239D/D265F/N297D/I332E 104 Y296Q/N297I/I332E
52 S239D/D265H/N297D/I332E 105 Y296T/N297D/I332E
53 S239D/D265I/N297D/I332E
在一個實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其在Fc區域中具有至少一個修飾。在某些實施方式中，變異的Fc區域包括選自L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一個取代。
在具體的實施方式中，變異的Fc區域包括： (A)選自F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一個取代； (B)選自下述的至少兩個取代： (1) F243L和P396L； (2) F243L和R292P；和 (3) R292P和V305I； (C)選自下述的至少三個取代： (1) F243L、R292P和Y300L； (2) F243L、R292P和V305I； (3) F243L、R292P和P396L；和 (4) R292P、V305I和P396L； (D)選自下述的至少四個取代： (1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和 (2) F243L、R292P、V305I和P396L；或 (E)選自下述的至少五個取代： (1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和 (2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具體的實施方式中，變異的Fc區域包括下述取代： (A)F243L、R292P和Y300L； (B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或 (C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在一個實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其(相對於野生型IgG1 Fc區域( SEQ ID NO:1)展示的結合)展示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合。在一個實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其展示對FcγR (例如，FcγRIIIA)降低的(或基本上沒有)結合和降低的(或基本上沒有) ADCC效應子功能。在某些實施方式中，變異的Fc區域包括選自下述的至少一個取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。在具體的實施方式中，變異的Fc區域包括下述取代：L234A；L235A；L234A和L235A；D265A；N297Q或N297G。
用於本發明的PD-1結合分子的CH2和CH3結構域的優選的IgG1序列具有L234A/L235A取代( SEQ ID NO:5)： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
在不同的實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括Fc區域，其(相對於野生型IgG1 Fc區域( SEQ ID NO:1)展示的結合)固有地展示對FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能。在具體的實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括IgG2 Fc區域( SEQ ID NO:2)或IgG4 Fc區域( SEQ ID:NO:4)。當使用IgG4 Fc區域時，本發明也包括引入穩定化突變，比如IgG4鉸鏈區S228P取代(見，例如， SEQ ID NO:13 ：ESKYGPPCP P CP，(Lu等, (2008) “ The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By AnalyticalUltracentrifugation,” J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以降低鏈交換的發生率。本領域已知的其他穩定化突變可被引入到IgG4 Fc區域中(Peters, P等, (2012) “ Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533；PCT專利公開號：WO 2008/145142)。
在其他實施方式中，本發明包括使用本領域已知的任何Fc變體，比如下述文獻中公開的那些：Jefferis, B.J.等(2002) “ Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models,” Immunol. Lett. 82:57-65；Presta, L.G.等(2002) “ Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,” Biochem. Soc. Trans. 30:487-90；Idusogie, E.E.等(2001) “ Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement,” J. Immunol. 166:2571-75；Shields, R.L.等(2001) “ High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R,” J. Biol. Chem. 276:6591-6604；Idusogie, E.E.等(2000) “ Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc,” J. Immunol. 164:4178-84；Reddy, M.P.等(2000) “ Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,” J. Immunol. 164:1925-1933；Xu, D.等(2000) “ In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26；Armour, K.L.等(1999) “ Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,” Eur. J. Immunol. 29:2613-24；Jefferis, R.等(1996) “ Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,” Immunol. Lett. 54:101-04；Lund, J.等(1996) “ Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,” J. Immunol. 157:4963-4969；Hutchins等(1995) “ Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84；Jefferis, R.等(1995) “ Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation,” Immunol. Lett. 44:111-17；Lund, J.等(1995) “ Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,” FASEB J. 9:115-19；Alegre, M.L.等(1994) “ A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,” Transplantation 57:1537-1543；Lund等(1992) “ Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11,” Mol. Immunol. 29:53-59；Lund等(1991) “ Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,” J. Immunol. 147:2657-2662；Duncan, A.R.等(1988) “ Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,” Nature 332:563-564；美國專利號5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586和7,317,091；以及PCT公開WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
在一些實施方式中，本發明的分子進一步包括一個或多個糖基化位點，從而一個或多個碳水化合物部分被共價連接至分子。優選地，與未修飾的抗體相比，在Fc區中具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個修飾的本發明的分子賦予或具有增強的抗體介導的效應子功能，例如，增強的ADCC活性。在一些實施方式中，本發明進一步包括這樣的分子：所述分子包括已知直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸的一個或多個修飾，所述氨基酸包括但不限於在位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的氨基酸。直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本領域已知的，見，例如，Jefferis等, 1995 Immunology Letters,44: 111-7，其通過引用以其整體併入本文。
在另一實施方式中，本發明包括這樣的分子：所述分子已經通過在分子的一個或多個位點中引入一個或多個糖基化位點被修飾，優選不改變分子的功能，例如，與靶抗原或FcγR的結合活性。糖基化位點可被引入到本發明分子的可變結構域和/或恒定結構域中。如本文所使用，“糖基化位點”包括與寡糖(即，碳水化合物，其含有兩個或多個連接在一起的單糖)特異性和共價結合的抗體中的任何特定氨基酸序列。寡糖側鏈通常經N-或O-鍵而連接至抗體的骨架。N-連接的糖基化指寡糖部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指寡糖部分連接至羥基氨基酸，例如，絲氨酸、蘇氨酸。本發明的分子可包括一個或多個糖基化位點，包括N-連接的和O-連接的糖基化位點。本領域已知的用於N-連接的或O-連接的糖基化的任何糖基化位元點可根據本發明使用。根據本發明的方法可用的示例性N-連接的糖基化位點是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸和Thr/Ser指示蘇氨酸或絲氨酸。這類位點可使用本發明所屬領域熟知的方法引入到本發明的分子中(見例如， In vitroMutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson,等W.H. Freeman and Company, New York, 1983, 第8章, pp. 106-116，其通過引用以其整體併入本文。用於將糖基化位點引入本發明分子中的示例性方法可包括：修飾或突變分子的氨基酸序列，從而獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。
在一些實施方式中，本發明包括通過添加或刪除糖基化位點修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。修飾抗體(和包括抗體結構域，例如，Fc區的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域熟知的並且包括在本發明中，見，例如，美國專利號6,218,149、EP 0 359 096 B1、美國公開號US 2002/0028486、WO 03/035835、美國公開號2003/0115614、美國專利號6,218,149、美國專利號6,472,511，其所有通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中，本發明包括通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分，修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。在具體的實施方式中，本發明包括通過修飾與297相鄰的位置而轉變抗體Fc區的糖基化位點。在具體的實施方式中，本發明包括修飾296位，從而296位而不是297位被糖基化。
也可通過技術，比如通過在Fc區中引入一個或多個半胱氨酸殘基，修飾效應子功能，從而允許在該區域內發生鏈間二硫鍵形成，導致產生可具有改善的內化能力和/或提高的補體-介導的細胞殺傷和ADCC的同源二聚化抗體(Caron, P.C.等(1992) “ Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies,” J. Exp. Med. 176:1191-1195；Shopes, B. (1992) “ A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity,” J. Immunol. 148(9):2918-2922。也可使用異源雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同源二聚化抗體，如Wolff, E.A.等(1993) “ Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,” Cancer Research 53:2560-2565中描述。可選地，抗體可被工程化，其具有雙Fc區域並且可從而具有增強的補體裂解和ADCC能力(Stevenson, G.T.等(1989) “ A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge,” Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)。
可通過增加Fc區域對於FcRn的結合親和力而延長包括Fc區域的本發明分子的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學性質，是對在其施用之後分子的平均生存時間的衡量。半衰期可表示為從受試者的身體(例如，人患者或其他哺乳動物)或其特定區室消除百分之五十(50%)的已知量的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即，迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其中所述變異的Fc區域相對於野生型Fc區域包括至少一個氨基酸修飾，使得所述分子(相對于野生型Fc區域)具有增加的半衰期。
在一些實施方式中，本發明的PD-1結合分子包括變異的Fc區域，其中所述變異的Fc區域在選自下述的一個或多個位置處包括延長半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436。能夠延長包含Fc區域的分子的半衰期的許多具體的突變是本領域已知的，並且包括，例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如，見下述文獻描述的突變：美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376、美國公開號2002/0147311、2007/0148164和國際公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279，其通過引用以它們的整體併入本文。具有延長半衰期的包含Fc區域的分子也包括在下述兩個或更多個Fc區域殘基處具有取代的那些分子：250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436。尤其地，兩個或更多個取代選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I。
在具體的實施方式中，變異的Fc區域包括下述取代： (A)M252Y、S254T和T256E； (B)M252Y和S254T； (C)M252Y和T256E； (D)T250Q和M428L； (E)T307Q和N434A； (F)A378V和N434A； (G)N434A和Y436I； (H)V308P和N434A；或 (I)K288D和H435K。
本發明進一步包括變異的Fc區域，其包括： (A)改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變；和 (B)延長血清半衰期的一個或多個突變。 V. 雙特異性抗人PD-1結合分子
本發明的一個實施方式涉及雙特異性結合分子，其能夠結合“ 第一表位”和“ 第二表位”，其中第一表位是人PD-1的表位和第二表位是PD-1的相同的或不同的表位，或是免疫細胞(比如T淋巴細胞)的表面上存在的並參與調節免疫檢查點的另一分子的表位。在一個實施方式中，第二表位元是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32、CD40、CD40L、CD47、CD64、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA。在一個實施方式中，第二表位元不是PD-1的表位。在具體的實施方式中，第二表位元是CD137、CTLA-4、LAG-3、OX40、TIGIT或TIM-3。在某些實施方式中，雙特異性分子包括多於兩個表位結合位點。這類雙特異性分子可結合LAG-3的兩個或更多個不同表位和不是LAG-3的分子的至少一個表位。
本發明包括能夠同時結合PD-1和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)的雙特異性抗體。在一些實施方式中，使用下述文獻描述的任何方法產生能夠同時結合PD-1和第二表位的雙特異性抗體：PCT公開號WO 1998/002463、WO 2005/070966、WO 2006/107786 WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 2006/107617、WO 2007/046893、WO 2007/146968、WO 2008/003103、WO 2008/003116、WO 2008/027236、WO 2008/024188、WO 2009/132876、WO 2009/018386、WO 2010/028797、WO2010028796、WO 2010/028795、WO 2010/108127、WO 2010/136172、WO 2011/086091、WO 2011/133886、WO 2012/009544、WO 2013/003652、WO 2013/070565、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2013/174873和WO 2014/022540，其每一篇通過引用以其整體併入本文。 A. 缺少Fc區域的雙特異性雙抗體
本發明的一個實施方式涉及雙特異性雙抗體，其包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，最優選地由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成，所述多肽鏈的序列允許多肽鏈彼此共價結合，以形成共價締合的雙抗體，其能夠同時結合第一表位和第二表位，這類表位彼此不同。這類雙特異性雙抗體因此包括能夠結合第一表位的“ VL1”/“ VH1”結構域和能夠結合第二表位的“ VL2”/“ VH2”結構域。符號“ VL1”和“ VH1”分別表示結合這類雙特異性雙抗體的“第一”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似地，符號“ VL2”和“ VH2”分別表示結合這類雙特異性雙抗體的“第二”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。具體的表位是否被命名為第一或第二表位不重要；這類符號僅僅與本發明的結合分子的多肽鏈的結構域的存在和取向相關。在一個實施方式中，這類表位之一是PD-1的表位和這類表位的另一個不是PD-1的表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等的表位)。
第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成對於第一抗原特異性的第一功能性抗原-結合位點(即，PD-1或包含第二表位的抗原)。類似地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，以便形成對第二抗原(即，包含第二表位的抗原或PD-1)特異性的第二功能性抗原-結合位點。因此，協調第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇，以便雙抗體的兩條多肽鏈總體地包括能夠結合PD-1的表位和第二表位二者的VL和VH結構域(即，它們包括VL PD-1/VH PD-1和VL2/VH2，其中PD-1是“第一”表位，或VL1/VH1和VL PD-1/VH PD-1，其中PD-1是“第二”表位)。
這類雙特異性雙抗體的實施方式的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VL1結構域(即，VL PD-1或VL 表位 2)、第一間插間隔肽(連接體1)、能夠結合第二表位(如果這類第一多肽鏈包含VL PD-1)或第一表位(如果這類第一多肽鏈包含VL 表位 2)的單克隆抗體的VH2結構域、任選地包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端( 圖 1)。
雙特異性雙抗體的該實施方式的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合PD-1或第二表位的單克隆抗體的VL2結構域(即，VL PD-1或VL 表位 2，並且不是為包括在雙抗體的第一多肽鏈中選擇的VL結構域)、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合第二表位(如果這類第二多肽鏈包含VL PD-1)或PD-1 (如果這類第二多肽鏈包含VL 表位 2)的單克隆抗體的VH1結構域、任選地包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔肽(連接體2)、異源二聚體促進結構域和C-末端( 圖 1)。
最優選地，選擇將這類VL和VH結構域分開的間插連接體肽(例如，連接體1)的長度，以基本上或完全防止多肽鏈的VL和VH結構域彼此結合。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣地，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔肽(連接體1)具有序列( SEQ ID NO:14)：GGGSGGGG。
基於異源二聚體促進結構域的選擇而選擇第二間插連接體肽(連接體2)的長度和組成。典型地，第二間插連接體肽(連接體2)包括3-20個氨基酸殘基。尤其地，在異源二聚體促進結構域不包括半胱氨酸殘基時，使用包含半胱氨酸的第二間插連接體肽(連接體2)。包含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)包含1、2、3或更多個半胱氨酸。優選的包含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)具有序列SEQ ID NO:15：GGCGGG。可選地，連接體2不包括半胱氨酸(例如，GGG、GGGS (SEQ ID NO:29)、LGGGSG (SEQ ID NO:261)、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:262)、ASTKG (SEQ ID NO:30)、LEPKSS (SEQ ID NO:33)、APSSS (SEQ ID NO:34)等)，並且使用如下面所描述的包含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域。任選地，使用包含半胱氨酸的連接體2和包含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域二者。
異源二聚體促進結構域可以是一條多肽鏈上的GVEPKSC ( SEQ ID NO:16)或VEPKSC ( SEQ ID NO:17)或AEPKSC ( SEQ ID NO:18)和另一條多肽鏈上的GFNRGEC ( SEQ ID NO:19)或FNRGEC ( SEQ ID NO:20) (US2007/0004909)。
但是，更優選地，這類雙抗體的異源二聚體-促進結構域由具有相反電荷的一個、兩個、三個或四個串聯重複的螺旋結構域形成，所述螺旋結構域包括至少六個、至少七個或至少八個氨基酸殘基的序列，以便異源二聚體-促進結構域具有淨電荷(Apostolovic, B.等(2008) “ pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt, K.M.等(2001) “ Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221-228；Arndt, K.M.等(2002) “ Comparison of In Vivo Selection andRational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235-1248；Boucher, C.等(2010) “ Protein Detection By Western Blot Via Coiled–Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia, P.J.等(2004) “ Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540-557；De Crescenzo, G.D.等(2003) “ Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez, J.等(2012) “ Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,” Protein Science 21:511-519；Ghosh, T.S.等(2009) “ End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan, G.等(2008) “ Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483；Litowski, J.R.等(2002) “ Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279；Steinkruger, J.D.等(2012) “ The d ′ --d--d ′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a ′ --a--a ′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626–2633；Straussman, R.等(2007) “ Kinking the Coiled Coil – Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242；Tripet, B.等(2002) “ Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345–362；Woolfson, D.N. (2005) “ The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112；Zeng, Y.等(2008) “ A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355-367)。
這樣的重複的螺旋結構域可以是準確的重複或可具有取代。例如，第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域的螺旋結構域可包括選擇為這類異源二聚體-促進結構域提供負電荷的八個氨基酸殘基的序列，並且第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域的螺旋結構域可包括選擇為這類異源二聚體-促進結構域提供正電荷的八個氨基酸殘基的序列。哪個螺旋被提供給第一或第二多肽鏈是不重要的，前提是另一多肽鏈使用具有相反電荷的螺旋。帶正電的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電的氨基酸可以是谷氨酸，天冬氨酸等。帶正電的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電的氨基酸優選地是谷氨酸。僅僅使用單個異源二聚體-促進結構域是可能的(因為這類結構域將抑制同源二聚化，從而促進異源二聚化)，但是，優選本發明雙抗體的第一和第二多肽鏈都包含異源二聚體-促進結構域。
在優選的實施方式中，異源二聚體-促進結構域之一包括四個串聯的“E螺旋”螺旋結構域( SEQ ID NO:21： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，而另一個異源二聚體促進結構域將包括四個串聯“K-螺旋”結構域( SEQ ID NO:22： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基將在pH 7形成正電荷。這類帶電結構域的存在促進了第一和第二多肽之間的締合，因此有助於異源二聚體形成。尤其優選是這樣的異源二聚體促進結構域：其中 SEQ ID NO:21的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾以包含半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K ( SEQ ID NO:23)。同樣地，尤其優選的是這樣的異源二聚體促進結構域：其中 SEQ ID NO:22的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾，以包含半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E ( SEQ ID NO:24)。
如在WO 2012/018687中公開，為了提高雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，雙抗體可被修飾，以在雙抗體的一個或多個末端處包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，血清結合蛋白的這類多肽部分設置在雙抗體的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子結合位點，這允許其非共價結合其他蛋白，從而延長它們的血清半衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3)由形成穩定的三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U.等(2002) “ Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120。因此，對於改善雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)，更優選地，停乳鏈球菌( Streptococcus dysgalactiae)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3) ( SEQ ID NO:25)：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068 (通過引用併入本文)中公開， SEQ ID NO:25的“ 去免疫化 ”的變體具有削弱或消除II類MHC結合的能力。基於組合突變結果，對於形成這樣的去免疫化的ABD，如下取代的組合被認為是優選的取代：66D/70S +71A、66S/70S +71A、66S/70S +79A、64A/65A/71A、64A/65A/71A+66S、64A/65A/71A+66D、64A/65A/71A+66E、64A/65A/79A+66S、64A/65A/79A+66D、64A/65A/79A+66E。變異的ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有下述氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66NAK S 70 A 71EGVKALIDE ILAALP ( SEQ ID NO:26)， 或氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP ( SEQ ID NO:27)， 或氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70VEGVKALI A 79E ILAALP ( SEQ ID NO:28)， 的變異的去免疫化的ABD是尤其優選的，因為這類去免疫化的ABD展示基本上野生型結合，同時提供削弱的II類MHC結合。因此，具有ABD的這類雙抗體的第一多肽鏈包含肽連接體，其優選地位於這類多肽鏈的E螺旋(或K螺旋)結構域的C-末端，以便插在E螺旋(或K螺旋)結構域和ABD (其優選地是去免疫化的ABD)之間。用於這類肽連接體的優選的序列是 SEQ ID NO:29：GGGS。 B. 包含Fc區域的雙特異性雙抗體
本發明的一個實施方式涉及包括Fc區域的雙特異性雙抗體，其能夠同時結合PD-1和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。將IgG CH2-CH3結構域添加至雙抗體多肽鏈中的一條或兩條中，以便雙抗體鏈的複合導致Fc區域的形成，延長了生物半衰期和/或改變了雙抗體的價。將IgG CH2-CH3結構域併入到兩條雙抗體多肽上允許形成雙鏈雙特異性包含Fc-區域的雙抗體( 圖 2)。
可選地，僅僅在一條雙抗體多肽上併入IgG CH2-CH3結構域允許形成更複雜的、包含Fc區的四鏈雙特異性雙抗體( 圖 3A-3C)。 圖 3C顯示具有恒定輕鏈(CL)結構域和恒定重鏈CH1結構域的代表性四鏈雙抗體，然而，可以可選地採用這類結構域的片段以及其他多肽(見，例如， 圖 3A和 3B，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1結構域，可採用源自人IgG的鉸鏈結構域的、具有氨基酸序列GVEPKSC ( SEQ ID NO:16) VEPKSC ( SEQ ID NO:17)或AEPKSC ( SEQ ID NO:18)的肽，和代替CL結構域，可採用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸GFNRGEC ( SEQ ID NO:19)或FNRGEC ( SEQ ID NO:20)。包含四鏈雙抗體的代表性肽顯示在 圖 3A中。可選地，或另外，可採用包括具有相反電荷的串聯螺旋結構域的肽，比如“E-螺旋”螺旋結構域( SEQ ID NO:21： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K或 SEQ ID NO:23 ： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)；和“K-螺旋”結構域( SEQ ID NO:22： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E或 SEQ ID NO:24 ： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)。包含螺旋結構域的代表性四鏈雙抗體顯示在 圖 3B中。
本發明的包含Fc區域的雙抗體分子一般包括另外的間插連接體肽(連接體)。典型地，另外的連接體包括3-20個氨基酸殘基。在本發明的包含Fc區域的雙抗體分子中可採用的另外或可選的連接體包括：GGGS ( SEQ ID NO:29)、LGGGSG ( SEQ ID NO:261)、GGGSGGGSGGG ( SEQ ID NO:262)、ASTKG ( SEQ ID NO:30)、DKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:31)、EPKSCDKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:32)、LEPKSS ( SEQ ID NO:33)、APSSS ( SEQ ID NO:34)和APSSSPME ( SEQ ID NO:35)、LEPKSADKTHTCPPC SEQ ID NO:36)、GGC和GGG。可使用 SEQ ID NO:33代替GGG或GGC，以易於克隆。另外， SEQ ID NO:31可緊隨氨基酸GGG或SEQ ID NO:33之後，以形成可選的連接體：GGGDKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:263)和LEPKSSDKTHTCPPCP( SEQ ID NO:37)。除了或代替連接體，本發明的包含Fc區域的雙抗體分子可併入IgG鉸鏈區。示例性鉸鏈區包括：來自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:32)、來自IgG2的ERKCCVECPPCP ( SEQ ID NO:11)、來自IgG4的ESKYGPPCPSCP ( SEQ ID NO:12)和ESKYGPPCPPCP ( SEQ ID NO:13)，包括穩定化取代以減少鏈交換的IgG4鉸鏈變體。
如在 圖 3A-3C中提供，本發明的雙抗體可包括四條不同的鏈。這類雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域、和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或四特異性的四價結合。符號“ VL3”和“ VH3”分別表示結合這類雙抗體的“第三”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似地，符號“ VL4”和“ VH4”分別表示結合這類雙抗體的“第四”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。本發明的包含Fc區的、代表性四鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在 表 2中：
表2
雙特異性 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
四特異性 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH
第四鏈 NH 2-VL4-VH3-HPD-COOH
HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性、四價(即，具有四個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體( 圖 3A-3C)，其由總共四條多肽鏈組成。本發明雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於PD-1免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合PD-1的相同表位或PD-1的不同表位)，和對於第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的兩個表位結合位點。
在進一步的實施方式中，包含Fc區的雙特異性雙抗體可包括三條多肽鏈。這類雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。這類雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，這類雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過涉及在它們各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵穩定的Fc區。這類雙抗體具有增強的效價。 圖 4A 和 4B闡釋了這類雙抗體的結構。這類包含Fc區的雙特異性的雙抗體可具有兩個取向之一( 表 3)：
表3
第一 取向 第三鏈 NH 2-CH2-CH3-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第二 取向 第三鏈 NH 2-CH2-CH3-COOH
第一鏈 NH 2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性、二價(即，具有兩個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體( 圖 4A-4B)，其由總共三條多肽鏈組成。本發明雙特異性、二價、包含Fc的雙抗體包括對於PD-1免疫特異性的一個表位結合位點，和對於第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的一個表位結合位點。
在進一步的實施方式中，包含Fc區的雙特異性雙抗體可包括總共五條多肽鏈。在具體的實施方式中，所述五條多肽鏈的兩條具有相同的氨基酸序列。這類雙抗體的第一多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是抗體的重鏈，其包含VH1和重鏈恒定結構域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是抗體的輕鏈，其包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1。第一、第二和/或第五多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可以是重組構建的。這類雙抗體的第三多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。
因此，這類雙抗體的第一和第二，以及第三和第五多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1結合位點。這類雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點，以及能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過涉及在它們各自恒定區中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成Fc區。這類雙抗體具有增強的效價。 圖 5圖解了這類雙抗體的結構。應當理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。但是，如本文所提供，優選地選擇這些結構域，以便結合PD-1和第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
選擇多肽鏈的VL和VH結構域，以便形成對於期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。尤其地，可選擇VL和VH結構域，以便雙特異性雙抗體可包括針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或針對第一表位的三個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的兩個結合位點，針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點(如 圖 5中所描繪)。本發明的代表性包含Fc區的五鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在 表 4中：
表4
雙特異性(2x2) 第二鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第一鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH
第五鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第四鏈 NH 2-VL2-VH2-HPD-COOH
雙特異性(3x1) 第二鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第一鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
第五鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第四鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
三特異性(2x1x1) 第二鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第一鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH
第五鏈 NH 2-VL1-CL-COOH
第四鏈 NH 2-VL3-VH2-HPD-COOH
HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性、四價(即，具有四表位結合位點)、包含Fc的雙抗體，其由總共五條多肽鏈組成，具有針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點。在一個實施方式中，本發明雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於PD-1免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合PD-1相同的表位或PD-1不同的表位)，和對於第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的兩個表位結合位點。在另一實施方式中，本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於PD-1免疫特異性的三個表位結合位點，其可以能夠結合PD-1相同的表位或PD-1不同的表位)，和對於第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的一個表位結合位點。在另一實施方式中，本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於PD-1免疫特異性的一個表位結合位點，和對於第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的三個表位結合位點。 C. 包含Fc區域的雙特異性三價結合分子
本發明的進一步實施方式涉及包括Fc區並且能夠同時結合第一表位、第二表位和第三表位的雙特異性、三價結合分子，其中這類表位中的至少一個與這類表位中的另一個不同。這類雙特異性雙抗體因此包括能夠結合第一表位的“ VL1”/“ VH1”結構域，能夠結合第二表位的“ VL2”/“ VH2”結構域和能夠結合第三表位的“ VL3”/“ VH3”結構域。在一個實施方式中，這類表位中的一個或兩個是PD-1的表位並且這類表位中的另一個(或其他)不是PD-1的表位(例如，下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。這類雙特異性三價結合分子包括三個表位結合位點，其中兩個是雙抗體型結合結構域，其提供了結合位點A和結合位點B，和其中一個是非雙抗體型結合結構域，其提供了結合位點C (見，例如， 圖 6A-6F，和PCT申請號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076)。
典型地，本發明的三價結合分子包括四條不同的多肽鏈(見 圖 6A-6B)，但是，例如，通過彼此融合這類多肽鏈(例如，經肽鍵)或通過分開這類多肽鏈，以形成另外的多肽鏈，或通過經二硫鍵締合更少的或另外的多肽鏈，分子可包括更少或更多數量的多肽鏈。 圖 6B-6F通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這類分子闡釋了本發明的這個方面。如 圖 6A-6F中提供的，本發明的三價結合分子可具有可選的取向，其中雙抗體型結合結構域在Fc區的N-末端( 圖 6A、 6C和 6D)或C-末端( 圖 6B、 6E和 6F)。
在某些實施方式中，本發明的這類三價結合分子的第一多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。VL1和VL2結構域位於包含CH2-CH3的結構域的N-末端或C-末端，如 表 5( 圖 6A和 6B)中所顯示。這類實施方式的第二多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這類實施方式的第三多肽鏈包含：(i)包含VH3的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以是抗體的重鏈，其包含VH3和重鏈恒定區。這類實施方式的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域和(ii)包含CL的結構域。第四多肽鏈可以是抗體的輕鏈，其包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3。第三或第四多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可經重組、合成通過其方式而構建。
第一和第二多肽鏈的可變輕鏈結構域通過長度過短的間插間隔連接體與這類多肽鏈的可變重鏈結構域分開，以允許它們的VL1/VH2 (或它們的VL2/VH1)結構域締合在一起，以形成能夠結合第一或第二表位的表位結合位點。用於該目的的優選間插間隔肽(連接體1)具有序列( SEQ ID NO: 14)：GGGSGGGG。三價結合分子的其他結構域可通過任選地包括半胱氨酸殘基的一個或多個間插間隔肽分開。本文提供了用於產生三價結合分子的示例性連接體，其也提供在PCT申請號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，這類三價結合分子的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。應當理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。
如上述，本發明的三價結合分子可包括三條多肽。可通過將第四多肽N-末端的結構域連接至第三多肽的包含VH3的結構域獲得包括三條多肽鏈的三價結合分子。可選地，使用包含下述三個結構域的本發明的三價結合分子的第三多肽鏈：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH3的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域，其中VL3和VH3通過足夠長(至少9個或更多個氨基酸殘基)的間插間隔肽彼此分開，以便允許這些結構域締合，以形成表位結合位點。
應當理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。但是，如本文提供，優選地選擇這些結構域，以便結合PD-1和第二表位(或第二和第三表位) (優選地，這類表位是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I類或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
尤其地，可選擇VL和VH結構域，以便三價結合分子包括針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的一個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或針對第一表位的一個結合位點、針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點。本發明的代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構提供在 圖 6A-6F和 表 5中：
表5
四鏈 第一取向 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
第四鏈 NH 2-VL3-CL-COOH
四鏈 第二取向 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-CH2-CH3--VL1-VH2-HPD COOH
第三鏈 NH 2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
第四鏈 NH 2-VL3-CL-COOH
三鏈 第一取向 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
第三鏈 NH 2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
三鏈 第二取向 第二鏈 NH 2-VL2-VH1-HPD-COOH
第一鏈 NH 2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD COOH
第三鏈 NH 2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
HPD =異源二聚體促進結構域
本發明的一個實施方式涉及雙特異性三價結合分子，其包括針對PD-1的兩個表位結合位點和針對不是PD-1的分子(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40，PD-L1、TCR、TIM-3等)上存在的第二表位的一個表位結合位點。針對PD-1的兩個表位結合位點可結合相同的表位或不同的表位。本發明的另一實施方式涉及雙特異性三價結合分子，其包括針對PD-1的一個表位結合位點和結合不是PD-1的分子(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I類或II類MHC、OX40，PD-L1、TCR、TIM-3等)上存在的第二抗原的兩個表位結合位點。針對第二抗原的兩個表位結合位點可結合抗原的相同的表位或不同的表位(例如，LAG-3的相同的或不同的表位)。如上面提供的，這類雙特異性三價結合分子可包括三條或四條多肽鏈。 VI. 恒定結構域和Fc區域
本文提供了可用于產生本發明的PD-1結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)的抗體恒定結構域。
優選的CL結構域是人IgG CL κ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是( SEQ ID NO :8)： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可選地，示例性CL結構域是人IgG CL λ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是( SEQ ID NO:9)： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
如本文提供，本發明的PD-1結合分子可包括Fc區域。本發明的這類分子的Fc區域可以具有任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本發明的PD-1結合分子可進一步包括CH1結構域和/或鉸鏈區。當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈區可以具有任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，並且優選地與期望的Fc區域具有相同的同種型。
示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是( SEQID NO:10)： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS  GLYSLSSVVT  VPSSSLGTQT YICNVNHKPS  NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是( SEQ ID NO:257)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是( SEQ ID NO:254)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
一個示例性鉸鏈區是人IgG1鉸鏈區。示例性人IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是( SEQ ID NO:32)：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性鉸鏈區是人IgG2鉸鏈區。示例性人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是( SEQ ID NO:11)：ERKCCVECPPCP。
另一示例性鉸鏈區是人IgG4鉸鏈區。示例性人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是( SEQ ID NO:12)：ESKYGPPCPSCP。如本文所描述，IgG4鉸鏈區可包括穩定化突變比如S228P取代。示例性穩定化的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是( SEQ ID NO:13)：ESKYGPPCP P CP。
本發明的包含Fc區域的分子(例如，抗體、雙抗體和三價分子)的Fc區域可以是完整的Fc區(例如，完整的IgG Fc區)或僅僅Fc區的片段。任選地，本發明包含Fc區的分子的Fc區缺少C-末端賴氨酸氨基酸殘基。尤其地，本發明包含Fc區的分子的Fc區可以是工程化的變異的Fc區。儘管本發明雙特異性包含Fc區的分子的Fc區可以具有結合一個或多個Fc受體(例如，FcγR)的能力，但是更優選地這類變異的Fc區具有對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)改變的結合(相對於野生型Fc區展示的結合)，或具有對抑制性受體基本上降低結合能力或沒有結合抑制性受體的能力。因此，本發明包含Fc區的分子的Fc區可包括完整的Fc區的一些或所有CH2結構域和/或一些或所有CH3結構域，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其相對於完整的Fc區的CH2或CH3結構域，可包括，例如，一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這類Fc區可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc區的部分，或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或者在N-末端至C-末端方向上，連接至CH2結構域的CH3結構域等)。
鑒定為改變效應子功能的Fc區域修飾是本領域已知的，包括增加與啟動性受體(例如，FcγRIIA (CD16A)的結合的修飾和減少與抑制性受體(例如，FcγRIIB (CD32B)結合的修飾(見，例如，Stavenhagen, J.B.等(2007) “ Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。具有與CD32B降低的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc區的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以以任何組合或亞組合存在於人IgG1 Fc區中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc區變體包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方式中，人IgG1 Fc區變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。
尤其地，本發明包含Fc區的分子的多肽鏈的Fc區域優選地展示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於野生型IgG1 Fc區( SEQ ID NO: 1)展示的結合)。上面敘述了能夠介導這類改變的結合的變異的Fc區和突變體形式。在具體的實施方式中，本發明的包含Fc區的分子包括展示降低的ADCC效應子功能的IgG Fc區。在優選的實施方式中，這類包含Fc區的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括下述的任何1、2或3個取代：L234A、L235A、N297Q和N297G。在另一實施方式中，人IgG Fc區變體包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除了FcR結合。可選地，使用固有地展示對FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc區( SEQ ID NO: 1)展示的結合)的Fc區的CH2-CH3結構域。在具體的實施方式中，本發明包含Fc區的分子包括IgG2 Fc區( SEQ IDNO: 2)或IgG4 Fc區( SEQ ID ： NO: 4)。當使用IgG4 Fc區時，本發明也包括引入穩定化突變，比如上述的鉸鏈區S228P取代(見，例如， SEQ ID NO: 13)。因為N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效應子功能，在期望效應子功能的情況下，優選地將不採用這些取代。
尤其地，本發明的包含Fc區域的分子的多肽鏈的Fc區域優選地展示延長的血清半衰期(相對於相應的野生型Fc展示的半衰期)。上面敘述了展示延長的血清半衰期的變異的Fc區域和變體形式。在優選的實施方式中，這類包含Fc區域的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括下述任何1、2或3個取代：M252Y、S254T和T256E。本發明進一步包括本發明的包含Fc區域的分子，其包括變異的Fc區域，所述變異的Fc區域包括： (A)改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變；和 (B)延長血清半衰期的一個或多個突變。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域優選的IgG1序列將包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E ( SEQ ID NO:258)： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域優選的IgG4序列將包括M252Y/S254T/T256E取代( SEQ ID NO:259)： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
對於第一和第三多肽鏈不同的雙抗體和三價結合分子，期望減少或防止兩個第一多肽鏈的CH2-CH3結構域之間或兩個第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間發生同源二聚化。這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包括形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域中，以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配對。這樣的突變組可被工程化到任意對、的包括形成Fc區的CH2-CH3結構域的多肽中。蛋白質工程化以相對于同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(見例如 ，Ridgway等(1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr. 9:617-621；Atwell等(1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,”J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等(2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,”J. Immunol. Methods 296:95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文)。優選地“杵”被工程化至包括三條多肽鏈的雙抗體的第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化至第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，“杵”有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。因為第三多肽鏈優選地包含“臼”取代，其將與第一多肽鏈異源二聚化以及和本身同源二聚化。該策略可用於上面詳述的包括三條、四條或五條鏈的雙抗體和三價結合分子，其中“杵”被工程化至第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化至第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。
通過修飾IgG Fc區以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾IgG Fc區以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從最終的雙特異性的、異源二聚化的、包含Fc區的分子中純化含臼的第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)突變第三多肽鏈的含臼的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此，含臼的第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A，而雙特異性的異源二聚體經在第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點而保持其結合蛋白質A的能力。在可選的實施方式中，含臼的第三多肽鏈可併入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
對於本發明包含Fc區域的分子的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域，優選的IgG1氨基酸序列具有“ 包含杵的”序列( SEQ ID NO:6)： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
對於具有兩條多肽鏈的本發明的包含Fc區域的分子的第二多肽鏈(或具有三、四或五條多肽鏈的包含Fc區域的分子的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域，優選的IgG1氨基酸序列具有“ 包含臼的”序列( SEQ ID NO:7)： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中， X是賴氨酸(K)或不存在。
如將認識到， SEQ ID NO:6和 SEQ ID NO:7的CH2-CH3結構域包括在234位元用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代，因此形成展示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合的Fc區(相對於野生型Fc區( SEQ ID NO: 1)展示的結合)。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其包括可選的和/或另外的取代，其修飾Fc區域的效應子功能和/或FγR結合活性。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其進一步包括一個或多個延長半衰期的氨基酸取代。尤其地，本發明包括這類包含臼的和這類包含杵的CH2-CH3結構域，其進一步包括M252Y/S254T/T256E。
優選地第一多肽鏈具有“包含杵的”CH2-CH3序列，比如 SEQ ID NO:6的序列。但是，如將認識到，“包含臼的”CH2-CH3結構域(例如， SEQ ID NO:7)可用在第一多肽鏈中，在該情況下，“包含杵的”CH2-CH3結構域(例如， SEQ ID NO:6)將用在具有兩條多肽鏈的本發明的包含Fc區域的分子的第二多肽鏈中(或在具有三、四或五條多肽鏈的包含Fc區域的分子的第三多肽鏈中)。
如上面詳細描述，本發明包括包含Fc區域的分子(例如，包含Fc區域的抗體和雙抗體)，其具有野生型CH2和CH3結構域，或具有包括上述取代的組合的CH2和CH3結構域。包括這些變異的IgG1 CH2-CH3結構域的示例性氨基酸序列是( SEQ ID NO:260)： APEX 1X 2GGPSV FLFPPKPKDT LX 3IX 4RX 5PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLX 6CX 7VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLX 8SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHX 9X 10YTQKS LSLSPGX 11其中： (a)X 1和X 2都是L (野生型)，或都是A (降低的FcγR結合)； (b)X 3、X 4和X 5分別是M、S和T (野生型)，或Y、T和E (延長的半衰期)， (c)X 6、X 7和X 8分別是：T、L和Y (野生型)，或W、L和Y (杵)，或S、A和V (臼)； (d)X 9和X 10分別是N和H (野生型)，或N和R (沒有蛋白質A結合)，或A和K (沒有蛋白質A結合)；和 (e)X 11是K或不存在。
在其他實施方式中，本發明包括PD-1結合分子，其包括使用本領域已知的突變已經被工程化成相對于同源二聚化利於異源二聚化的CH2和/或CH3結構域，比如PCT公開號WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中公開的那些，其所有通過引用以其整體併入本文。 VIII. PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子
本發明尤其涉及PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子(例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體等)，其包括抗PD-1抗體，優選本文提供的新抗人PD-1抗體之一，的表位結合片段，和抗人LAG-3抗體，優選本文提供的新的抗人LAG-3抗體之一，的表位結合片段。本發明優選的PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子具有抗體的表位結合片段，所述抗體的表位結合片段能夠確保它們能夠協同結合兩個不同表位：PD-1的表位和LAG-3的表位，以便減弱這類分子的抑制活性。如本文所使用，這類減弱指可檢測的PD-1和/或LAG-3抑制活性減少至少20%、減少至少50%、減少至少80%或減少至少90%，或完全消除可檢測的PD-1和/或LAG-3抑制活性。協調抗人PD-1抗體和抗LAG-3抗體的表位結合片段(例如，VL和VH結構域)的選擇，以便構成這類PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子的多肽鏈組裝形成對於第一抗原(即，PD-1或LAG-3)特異性的至少一個功能性抗原結合位點和對於第二抗原(即，PD-1或LAG-3，取決於第一抗原的身份)特異性的至少一個功能性抗原結合位點。
在具體的實施方式中，本發明的PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子是雙特異性雙抗體，其優選地包括如本文所描述的二、三、四或五條多肽鏈。在另一具體的實施方式中，本發明的PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子是雙特異性抗體，其優選地包括如本文所描述的二、三、或四條多肽鏈(也見，例如，WO 2007/024715、WO2007/110205、WO 2009/080251、WO 2009/080254、WO 2009/089004、WO 2011/069104、WO 2011/117329、WO 2011/131746、WO 2011/133886、WO 2011/143545、WO2012/023053、WO 2013/060867，其所有描述通過引用以其整體併入本文)。 A. 抗人LAG-3抗體
下面提供了對於人LAG-3免疫特異性的示例性抗體。可通過分離使用LAG-3或其肽片段引起的分泌抗體的雜交瘤，或通過篩選用於結合LAG-3或其肽片段的重組抗體文庫，製備另外期望的抗體。人LAG-3 (包括28個氨基酸殘基信號序列(以底線顯示)和497個氨基酸殘基成熟的蛋白質)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:38)： MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAE VP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL 1.  LAG-3 mAb A
已經描述了抗人LAG-3抗體BMS-986016 (25F7；Medarex/BMS)，本文命名為“ LAG-3 mAb A”和其變體(見，例如，WO 2014/008218)。 LAG-3 mAb A的重鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQ ID NO:39) (CDR加底線顯示)： QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWN WIRQP PGKGLEWIG E INHNGNTNSN PSLKS RVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAF GYS DYEYNWFDP W GQGTLVTVSS
LAG-3 mAb A的輕鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQ ID NO:40) (CDR加底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSIS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPLT FGQ GTNLEIK
最近已經鑒定了具有獨特的結合特徵的另外的鼠科抗人LAG-3抗體(見，美國專利申請號62/172,277)。本發明優選的PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子包括抗人LAG-3抗體 LAG-3 mAb 1或 LAG-3 mAb 6抗體的表位結合片段，其結合新的表位並且不與BMS-986016競爭LAG-3結合。尤其優選的是本發明的PD-1 x LAG-3雙特異性結合分子，其具有LAG-3 mAb 1或LAG-3 mAb 6的人源化的VH和/或VL結構域。 2.  LAG-1 mAb 1
LAG-3 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:41)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)。 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMN WVKQA PGKVLKWMG W INTYTGESTY ADDFEG RFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCAR ES LYDYYSMDY W GQGTSVTVSS LAG-3 mAb 1的CDRH1 (SEQ ID NO:42): RNYGMNLAG-3 mAb 1的CDRH2 ( SEQ ID NO43)： WINTYTGESTYADDFEGLAG-3 mAb 1的CDRH3 ( SEQ ID NO:44): ESLYDYYSMDY
LAG-3 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:45)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DVVVTQTPLT LSVTIGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQRPGQSPE RLIY LVSELD S GVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC WQGTHFP YT FGGGTKLE IK LAG-3 mAb 1的CDR L1 ( SEQ ID NO:46): KSSQSLLHSDGKTYLNLAG-3 mAb 1的CDR L2 ( SEQ ID NO:47): LVSELDSLAG-3 mAb 1的CDR L3 ( SEQ ID NO:48): WQGTHFPYT
下面提供了本文命名為“ hLAG-3 mAb 1 VH1”和“ hLAG-3 mAb 1 VH2”的LAG-3 mAb 1的兩個示例性人源化的VH結構域，和LAG-3 mAb 1的四個示例性人源化的VL結構域“ hLAG-3 mAb 1 VL1”、“ hLAG-3 mAb 1 VL2”、“ hLAG-3 mAb 1 VL3”和“ hLAG-3 mAb 1 VL4”。任何人源化的VL結構域可與任何人源化的VH結構域配對，以產生LAG-3結合結構域。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“ hLAG-3 mAb 1”，並且並且人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定的VH/VL結構域命名，例如包括hLAG-3 mAb 1 VH1和hLAG-3 mAb 1 VL2的人源化抗體具體稱為“ hLAG-3 mAb 1(1.2)”。
hLAG-3 mAb 1 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:49)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTYTGESTY ADDFEG RFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCAR ES LYDYYSMDY W GQGTTVTVSS
hLAG-3 mAb 1 VH2的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:50)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTYTGESTY ADDFEG RFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCAR ES LYDYYSMDY W GQGTTVTVSS
hLAG-3 mAb 1 VL1的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:51)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQKPGQSPE RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCW QGTHFP YT FGGGTKVE IK
hLAG-3 mAb 1 VL2的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:52)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQRPGQSPE RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP YT FGGGTKVE IK
hLAG-3 mAb 1 VL3的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:53)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQKPGQPPE RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP YT FGGGTKVE IK
hLAG-3 mAb 1 VL4的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:54)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDAKTYLN W LLQKPGQPPE RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP YT FGGGTKVE IK
hLAG-3 mAb 1 VL4的VL結構域的CDR L1包括甘氨酸至丙氨酸的氨基酸取代，並且具有氨基酸序列： KSSQSLLHSD AKTYLN ( SEQ ID NO:55)，取代的丙氨酸加底線顯示)。考慮類似的取代可併入任何上述LAG-3 mAb 1 CDR L1結構域中。 3. LAG-3 mAb 6
LAG-3 mAb 6的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:56)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMD WVKQS HGESLEWIG D INPDNGVTIY NQKFEG KATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS LAG-3 mAb 6的CDRH1 ( SEQ ID NO:57): DYNMDLAG-3 mAb 6的CDRH2 ( SEQ ID NO:58): DINPDNGVTIYNQKFEGLAG-3 mAb 6的CDRH3 ( SEQ ID NO:59): EADYFYFDY
LAG-3 mAb 6的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:60)顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)： DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITC KASQDVS SVVA WYQQKP GQSPKLLIF S ASYRYT GVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWT FGG GTKLEIK LAG-3 mAb 6的CDR L1 ( SEQ ID NO:61): KASQDVSSVVALAG-3 mAb 6的CDR L2 ( SEQ ID NO:62): SASYRYTLAG-3 mAb 6的CDR L3 ( SEQ ID NO:63): HYSTPWT
下面提供了本文命名為“ hLAG-3 mAb 6 VH1”和“ hLAG-3 mAb 6 VH2”的LAG-3 mAb 6的兩個示例性人源化的VH結構域，和LAG-3 mAb 6的兩個示例性人源化的VL結構域“ hLAG-3 mAb 1 VL1”和“ hLAG-3 mAb 1 VL2”。任何人源化的VL結構域可與任何人源化的VH結構域配對，以產生LAG-3結合結構域。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“ hLAG-3 mAb 6”，並且，人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定VH/VL結構域命名，例如包括hLAG-3 mAb 6 VH1和hLAG-3 mAb 6 VL2的人源化抗體具體稱為“ hLAG-3 mAb 6(1.2).”
hLAG -3mAb 6 VH1的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:294)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMD WVRQA PGQGLEWMG D INPDNGVTIY NQKFEG RVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS
hLAG-3mAb 6 VH2的VH結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:295)顯示在下面(CDRH殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMD WVRQA PGKGLEWVS D INPDNGVTIY NQKFEG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS
hLAG-3mAb 6 VL1的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:296)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWT FGG GTKLEIK
hLAG-3mAb 6 VL2的VL結構域的氨基酸序列( SEQ ID NO:297)顯示在下面(CDR L殘基以底線顯示)： DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWT FGG GTKLEIK
hLAG-3 mAb 6 VL1和VL2的VL結構域的CDR L1包括賴氨酸至精氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列： R ASQDVSSVVA( SEQ ID NO:298)，取代的精氨酸加底線顯示)。考慮類似的取代可併入上述任何LAG-3 mAb 6 CDR L1結構域中。 C. 具有E/K-螺旋的、包含Fc區域的示例性四鏈雙抗體
產生了包含Fc區域的四個示例性PD-1 X LAG-3雙特異性、四鏈雙抗體，其包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域(命名為“ DART A”、“ DART B”、“ DART C”和“ DART I”)。下面詳細描述了這些包含Fc區域的雙抗體的結構。這些示例性PD-1 x LAG-3雙抗體旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。 1.  DART A
DART A是雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位元點、被工程化用於延長半衰期的變異的IgG4 Fc區域、和包含半胱氨酸的E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。DART A的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:23))；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E和缺少C-末端殘基的變異的IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART A的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:267的變體： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDX 1KTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLX 2IX 3R X 4PEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G 其中獨立地選擇X 1、X 2、X 3和X 4，並且其中X 1是A或G；X 2是Y或M；X 3是T或S；和X 4是E或T。
DART A的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:267 ，其中X 1是A；X 2是Y；X 3是T；和X 4是E。
DART A的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ( SEQ ID NO:24)；和C-末端。
DART A的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:268)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE 2.  DART B
DART B與DART A相同，除了DART B的第一和第三多肽鏈包括HLAG-3 mAb 1 VL3的VL結構域( SEQ ID NO:53)，其包括CDR L1中的氨基酸取代。因此，DART B的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL3) ( SEQ ID NO:53)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:23))；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E並且沒有C-末端殘基的IgG4 CH2-CH3結構域的變體( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART B的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:267，其中X 1是G；X 2是Y；X 3是T；和X 4是E。
DART B的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:268。 3.  DART C
DART C與DART B相同，除了DART B的第一和第三多肽鏈包括缺少C-末端殘基的野生型IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:4)。因此，DART C的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL3) ( SEQ ID NO:53)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:23))；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO:13)；缺少C-末端殘基的IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:4)；和C-末端。
DART C的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:267，其中X 1是G；X 2是M；X 3是S；和X 4是T。
DART C的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO:268。 4.  DART I
DART I是雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位元點、被工程化用於延長半衰期的變異的IgG4 Fc區域、和包含半胱氨酸的E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。DART I的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 6 VL1) ( SEQ ID NO:296)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:23))；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E和缺少C-末端殘基的變異的IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART I的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:290)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
DART I的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 6 VH1) ( SEQ ID NO:294)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ( SEQ ID NO:24)；和C-末端。
DART I的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:291)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E C. 具有CL/CH1結構域的、包含Fc區域的示例性四鏈雙抗體
產生了命名為“ DART D”、“ DART E”、“ DART J”和“ DART 1”的包括CL/CH1結構域的四個示例性PD-1 X LAG-3雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體。下面詳述了這些包含Fc區域的雙抗體的結構。這些示例性PD-1 x LAG-3雙抗體旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。 1. DART D
DART D是雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位點、CL/CH1結構域和被工程化用於延長半衰期的變異的IgG4 Fc區域。DART D的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)；間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；IgG4 CH1結構域( SEQ ID NO:254)；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO ： 13)；包括取代M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的IgG4 CH2-CH3結構域的變體( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART D的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:269)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
DART D的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；κ CL結構域( SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART D的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:270)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 2. DART E
DART E是另一雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位點、CL/CH1結構域和被工程化用於延長的半衰期的變異的IgG4 Fc區域。DART E的PD-1和LAG-3結合位點的位置與DART D相比是顛倒的。
DART E的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；IgG4 CH1結構域( SEQ ID NO:254)；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO ： 13)；包括取代M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的IgG4 CH2-CH3結構域的變體( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART E的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:271)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
DART E的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)；間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；κ CL結構域( SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART E的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:272)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 3. DART J
DART J是雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位點、CL/CH1結構域和被工程化用於延長半衰期的變異的IgG4 Fc區域。DART J的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 6 VL1) ( SEQ ID NO:296)；間插連接體肽( 連接體 1：GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；IgG4 CH1結構域( SEQ ID NO:254)；穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO ： 13)；包括取代M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的IgG4 CH2-CH3結構域的變體( SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART J的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:292)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSLGGGSG ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
DART J的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG( SEQ ID NO:14))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 6 VH1) ( SEQ ID NO:294)；間插連接體肽( 連接體 2：LGGGSG ( SEQ ID NO:261))；κ CL結構域( SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART J的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:293)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSLGG GSGRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 4. DART 1
DART 1是雙特異性、四鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位點、CL/CH1結構域和針對降低的FcγR結合被工程化的變異的IgG1 Fc區域。DART 1的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1PD-1 mAb A VL) ( SEQ ID NO:65)、間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3LAG-3 mAb A VH1) ( SEQ ID NO:39)、間插連接體肽( 連接體 2:LGGGSG ( SEQ ID NO:261))、IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)、IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO ： 32)、包括取代L234A/L235A並且缺少C-末端殘基的IgG1 CH2-CH3結構域的變體( SEQ ID NO:5)和C-末端。
DART 1的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:284)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSLG GGSGASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLYI TREPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG
DART 1的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3LAG-3 mAb A VL) ( SEQ ID NO:40)、間插連接體肽( 連接體 1：GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1PD-1 mAb A VH) ( SEQ ID NO:64)、間插連接體肽( 連接體 2：LGGGSG ( SEQ ID NO:261))、κ CL結構域( SEQ ID NO:8)和C-末端。
DART 1的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:285)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSLGGGS GRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS  STLTLSKADY  EKHKVYACEV  THQGLSSPVT  KSFNRGEC D.包含Fc區域的示例性五鏈雙抗體
產生包括CL/CH1結構域和E/K-螺旋異源二聚體促進結構域的兩個示例性PD-1 X LAG-3雙特異性、包含Fc區域的五鏈雙抗體，命名為“ DART F”和“ DART G”。下面詳述了這些包含Fc區域的雙抗體的結構。這些示例性PD-1 x LAG-3雙抗體旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。 1.  DART F
DART F是雙特異性、五鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的三個結合位點、對於LAG-3特異性的一個結合位元點、CL/CH1結構域、針對降低的FcγR結合和延長的半衰期而被工程化的包含變異的杵/臼的IgG1 Fc區域和E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。DART F的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)；IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K並且缺少C-末端殘基的、包含臼的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:260 ，其中X 1是A，X 2是A；X 3是Y，X 4是T，X 5是E，X 6是S，X 7是A，X 8是V，X 9是A，X 10是K，和X 11不存在)；和C-末端。
DART F的第一多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:273)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS  KLTVDKSRWQ  QGNVFSCSVM  HEALHAKYTQ  KSLSLSPG
DART F的第二和第五多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)、κ CL結構域( SEQ ID NO:8)和C-末端。
DART F的第二和第五多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:274)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
DART F的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)；IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的、包含杵的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:260 ，其中X 1是A，X 2是A；X 3是Y，X 4是T，X 5是E，X 6是W，X 7是L，X 8是Y，X 9是N，X 10是H，和X 11不存在)；間插連接體肽(GGGSGGGSGGG ( SEQ ID NO:262))；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:21))；和C-末端。
DART F的第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:275)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IVMTQTPLSL SVTPGQPASI SCKSSQSLLH SDAKTYLNWL LQKPGQPPER LIYLVSELDS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS RVEAEDVGVY YCWQGTHFPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
DART F的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)、間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)、包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ( SEQ ID NO:22))和C-末端。
DART F的第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:276)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE 2. DART G
DART G是雙特異性、五鏈、包含Fc區域的雙抗體，其具有對於PD-1特異性的兩個結合位點、對於LAG-3特異性的兩個結合位元點、CL/CH1結構域、針對降低的FcγR結合和延長的半衰期而被工程化的包含變異的杵/臼的IgG1 Fc區域，和E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。DART G的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)；IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)；IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K並且缺少C-末端殘基的、包含臼的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:260 ，其中X 1是A，X 2是A；X 3是Y，X 4是T，X 5是E，X 6是S，X 7是A，X 8是V，X 9是A，X 10是K，和X 11不存在)；和C-末端。
DART G的第一多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:277)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHAKYT QKSLSLSPG
DART G的第二和第五多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)、κ CL結構域( SEQ ID NO:8)和C-末端。
DART G的第二和第五多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:278)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
DART G的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)；IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)、IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E並且缺少C-末端殘基的、包含杵的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:260 ，其中X 1是A，X 2是A；X 3是Y，X 4是T，X 5是E，X 6是W，X 7是L，X 8是Y，X 9是N，X 10是H，和X 11不存在)；間插連接體肽(GGGSGGGSGGG ( SEQ ID NO:262))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)；間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))；異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:21))；和C-末端。
DART G的第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:279)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGG GGSGGGSGGG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
DART G的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)、間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)、包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ( SEQ ID NO:22)和C-末端。
DART G的第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:280)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE E. 具有E/K-螺旋的包含Fc區域的示例性三鏈雙抗體
本發明另外提供了PD-1 X LAG-3雙特異性、三鏈、包含Fc區域的雙抗體，其包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。產生了包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域的示例性PD-1 X LAG-3雙特異性、三鏈、包含Fc區域的雙抗體，命名為“ DART H”。下面詳述了該包含Fc區域的雙抗體的結構。該示例性PD-1 x LAG-3雙抗體旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。
DART H是雙特異性、包含Fc區域的三鏈雙抗體，其具有對於PD-1特異性的一個結合位點、對於LAG-3特異性的一個結合位點、針對降低的FcγR結合而被工程化的包含變異的杵/臼的IgG1 Fc區域和E/K-螺旋異源二聚體促進結構域。
DART H的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)、間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)、包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ( SEQ ID NO:21))、間插連接體( 間隔體 - 連接體 3:GGGDKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:263))、包括取代L234A/L235A和具有C-末端賴氨酸殘基的包含杵的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:6)和C-末端。
DART H的第一多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:281)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
DART H的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)、間插連接體肽( 連接體 1:GGGSGGGG ( SEQ ID NO:14))、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)、包含半胱氨酸的間插連接體肽( 連接體 2:GGCGGG ( SEQ ID NO:15))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( KVAAL KE- KVAAL KE- KVAAL KE- KVAAL KE ( SEQ ID NO:22))和C-末端。
DART H的第二多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:282)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
DART H的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、鉸鏈區(DKTHTCPPCP ( SEQ ID NO:31)、包括取代L234A/L235A並且具有C-末端賴氨酸殘基的包含臼的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:7)和C-末端。
DART H的第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:283)： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK F. 示例性雙特異性抗體
產生示例性PD-1 X LAG-3四鏈雙特異性抗體，命名為“ BSAB A”。下面詳述了該雙特異性抗體的結構。該示例性PD-1 x LAG-3雙特異性抗體旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。
BSAB A是雙特異性抗體，其具有對於PD-1特異性的一個結合位點、對於LAG-3特異性的一個結合位元點、被工程化以降低FcγR結合和促進兩個不同重鏈多肽之間複合的變異的IgG1 Fc區域(見，例如，WO 2011/143545)。
BSAB A的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能夠結合PD-1的單克隆抗體的VH結構域(VH PD-1hPD-1 mAb 7 VH1) ( SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)；包括取代D221E/P228E(根據如在Kabat中的EU索引編號並且在下面 SEQ ID NO:286中以底線顯示)的變異的IgG1鉸鏈區；包括取代L234A/L235A/L368E(在下面的 SEQ ID NO:286中加底線)並且缺少C-末端殘基的變異的IgG1 CH2-CH3結構域；和C-末端。
BSAB A的第一多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:286)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SC E KTHTCP E CPAPE AA GGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTC E VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
BSAB的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合PD-1的單克隆抗體的VL結構域(VL PD-1hPD-1 mAb 7 VL2) ( SEQ ID NO:153)、κ CL結構域( SEQ ID NO:8)和C-末端。
BSAB的第二多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:287)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
BSAB A的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(VH LAG-3hLAG-3 mAb 1 VH1) ( SEQ ID NO:49)、IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO:10)、包括取代D221R/P228R (在下面 SEQ ID NO:288中加底線)的變異的IgG1鉸鏈區、包括取代L234A/L235A/L409R (在下面 SEQ ID NO:288中加底線)並且缺少C-末端殘基的變異的IgG1 CH2-CH3結構域和C-末端。
BSAB A的第三多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:288)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSC R KTHTCP R CPAPE AA GG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY S R LTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
BSAB A的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域(VL LAG-3hLAG-3 mAb 1 VL4) ( SEQ ID NO:54)、κ CL結構域( SEQ ID NO:8)和C-末端。
BSAB A的第四多肽鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:289)： DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC IX. 參考抗體 A. 參考抗人PD-1抗體
為了評估和表徵本發明新的抗人PD-1結合分子，採用下述參考抗體：尼魯單抗(nivolumab)(也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106，並且由Bristol-Myers Squibb以OPDIVO®出售)、本文命名為“ PD-1 mAb A”的人IgG4抗體；和派姆單抗(pembrolizumab)(之前稱為蘭羅利珠單抗(lambrolizumab)，也稱為MK-3475，SCH-900475，並且由Merck以KEYTRUDA®出售)，一種人源化的IgG4抗體，本文命名為“ PD-1 mAb B”。 1.  尼魯單抗(“PD-1 mAb A”)
PD-1 mAb A的重鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQ ID NO:64) (CDR H殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMH WVRQA PGKGLEWVA V IWYDGSKRYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCAT ND DY WGQGTLVT VSS
PD-1 mAb A的輕鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQID NO:65) (CDR L殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SSNWPRT FGQ GTKVEIK 2. 派姆單抗 (“PD-1 mAb B”)
PD-1 mAb B的重鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQID NO:66) (CDR H殘基以底線顯示)： QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMY WVRQA PGQGLEWMG G INPSNGGTNF NEKFKN RVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCAR RD YRFDMGFDY W GQGTTVTVSS
PD-1 mAb B 的輕鏈可變區的氨基酸序列具有氨基酸序列( SEQ ID NO:67) (CDR L殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASKGVS TSGYSYLH WY QQKPGQAPRL LIY LASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHSRDLPL T FGGGTKVEIK X.生產方法
可由抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15的多核苷酸和/或序列通過本領域已知的方法，例如，合成或重組產生抗人PD-1多肽和其他PD-1激動劑、拮抗劑和調節劑。產生這類肽激動劑、拮抗劑和調節劑的一種方法涉及多肽的化學合成，隨後在適於獲得天然構象，即，正確的二硫鍵連接的氧化條件下處理。這可使用本領域技術人員熟知的方法完成(見，例如，Kelley, R. F.等(1990)，在以下中：Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K.編輯, Plenum Press, N.Y., vol. 12，pp 1-19；Stewart, J.M等(1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL；也見美國專利號4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925)。
可使用固相肽合成常規製備本發明的多肽(Merrifield, B. (1986) “S olid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) “ General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “ Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
在仍另一可選方案中，可通過使用商業上可得的已經被工程化而表達特異性人免疫球蛋白蛋白質的小鼠，獲得用於結合人PD-1的、具有下述的一個或多個CDR的完全人抗體或其可溶性形式：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15，或與PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15。被設計來產生更期望的(例如，完全人抗體)或更強力免疫應答的轉基因動物也可用於產生人源化抗體或人抗體。這類技術的例子是Xenomouse™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA)和HuMAb-MOUSE®和TC MOUSE™ (都來自Medarex, Inc., Princeton, NJ)。
可選地，可重組製備抗體和使用本領域已知的任何方法表達。可如下經重組製備抗體：首先從宿主動物分離製備的抗體，獲得基因序列，和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法已經被公開了(見，例如，Peeters等(2001) “ Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等(1995) “ Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “ Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol Methods 231:147-157)。製備抗體衍生物，例如，人源化抗體、單鏈抗體等的適當的方法是本領域已知的。在另一可選方案中，可通過噬菌體展示技術重組製備抗體(見，例如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter, G.等(1994) “ Making Antibodies By Phage Display Technology,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
可通過Edman降解對感興趣的抗體或蛋白質進行測序，其是本領域技術人員熟知的。從質譜或Edman降解產生的肽資訊可用於設計用於克隆感興趣的蛋白質的探針或引物。
克隆感興趣的蛋白質的可選的方法是通過使用純化PD-1或其部分“淘洗”表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞，所述感興趣的抗體或蛋白質具有下述的一個或多個CDR：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15，或與PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15，用於結合人PD-1。可如下進行“淘洗”程式：從表達PD-1的組織或細胞獲得cDNA文庫，在第二細胞類型中過表達cDNA，和在存在或沒有PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15的情況下針對特異性結合PD-1篩選轉染的第二細胞類型的細胞。用於通過“淘選”克隆編碼細胞表面蛋白的哺乳動物基因的方法的詳細描述可見于現有技術(見，例如，Aruffo, A.等(1987) “ Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577和Stephan, J.等(1999) “ Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,” Endocrinol. 140:5841-5854)。
包含感興趣的多核苷酸的載體可通過一些適當手段中的任意手段被引入到宿主細胞中，所述適當手段包括電穿孔；採用氯化鈣、銣氯化物、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇常常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被使用，用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非的限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質（如果存在），宿主細胞以約5-倍，更優選10-倍，甚至更優選20-倍的水準表達cDNA。通過免疫試驗或FACS實現篩選特異性結合PD-1的宿主細胞。可鑒定過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。
本發明包括的多肽包括本發明抗體的氨基酸序列。可通過本領域已知的程式製備本發明的多肽。可通過抗體的蛋白水解或其他降解、如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或化學合成來產生多肽。抗體的多肽，尤其地，上至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成被常規製備。化學合成方法在本領域中是已知的，並且是商業上可得到的。例如，抗人PD-1多肽可通過採用固相方法的自動多肽合成儀產生。
本發明包括下述的變體：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15抗體，和它們結合PD-1的多肽片段，包括功能上等同的抗體和不明顯影響這類分子性質的融合多肽以及具有增強的或降低的活性的變體。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽：其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，所述其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計(redesign)。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如，連接標籤用於免疫分析，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。
本發明包括融合蛋白，其包括本發明的一個或多個多肽或PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15抗體。在一個實施方式中，提供的融合多肽包括輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈二者。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恒定區。在另一實施方式中，融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含特異性結合PD-1的一個或多個多肽結構域和其在天然分子中未連接的另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列例如，異源序列或來自另一區域的同源序列。 XI. 本發明的PD-1結合分子的用途
本發明包括組合物，包括藥物組合物，其包括本發明的PD-1結合分子(例如，抗PD-1抗體、抗PD-1雙特異性雙抗體等)、源自這類分子的多肽、包括編碼這類分子或多肽的序列的多核苷酸和如本文所描述的其他試劑。 A.  治療性用途
如上所討論，PD-1在負調節T-細胞增殖、功能和穩態中起重要的作用。本發明的某些PD-1結合分子具有抑制PD-1功能的能力，從而逆轉PD-1-介導的免疫系統抑制。因此，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14和PD-1 mAb 15、它們人源化的衍生物和包括它們的PD-1結合片段的分子(例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體(包括但不限於DART-A、DART-B、DART-C、DART-D、DART-E、DART-F、DART-G、DART-H、DART-I和DART-J)等)或與這類抗體競爭結合的分子，可用于阻斷PD-1-介導的免疫系統抑制，從而促進免疫系統的啟動。
結合PD-1和細胞表面上存在的參與調節免疫檢查點的另一分子(例如，LAG-3)的本發明的這類雙特異性PD-1結合分子，通過阻斷PD-1和這類免疫檢查點分子介導的免疫系統抑制而加強了免疫系統。因此，本發明的這類PD-1結合分子可用于加強受試者的免疫應答(例如，T-細胞介導的免疫應答)。尤其地，本發明的這類PD-1結合分子可用于治療與與非期望的被抑制的免疫系統相關的任何疾病或病況，包括與病原體(例如，細菌、真菌、病毒或原生動物感染)的存在相關的癌症和疾病。
可由本發明的這類PD-1結合分子治療的癌症包括特徵在於存在選自由以下的細胞組成的組的癌症細胞的癌症：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。
尤其地，本發明的這類PD-1結合分子可用于治療結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌。
可由本發明的這類PD-1結合分子治療的病原體相關的疾病包括慢性病毒、細菌、真菌和寄生蟲感染。可由本發明的PD-1結合分子治療的慢性感染包括愛潑斯坦-巴爾病毒、甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；皰疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢桿菌綱( Bacilli)、檸檬酸桿菌屬( Citrobacter)、霍亂( Cholera)、白喉( Diphtheria)、腸桿菌屬( Enterobacter)、淋球菌( Gonococci)、幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌屬( Klebsiella)、軍團菌屬( Legionella)、腦膜炎球菌( Meningococci)、分歧桿菌(mycobacteria)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、 Pneumonococci、立克次氏體細菌(rickettsia bacteria)、沙門氏菌屬( Salmonella)、沙雷菌屬( Serratia)、葡萄球菌屬( Staphylococci)、鏈球菌屬( Streptococci)、破傷風( Tetanus)、曲黴菌屬( Aspergillus)(煙麯黴( fumigatus)、黑麯黴( niger)等)、皮炎芽生菌( Blastomyces dermatitidis)、念珠菌屬( Candida)(白色念珠菌( albicans)、克柔假絲酵母( krusei)、光滑念珠菌( glabrata)、熱帶念珠菌( tropicalis)等)、新生隱球菌( Cryptococcus neoformans)、毛黴目( Mucorales)的屬(毛黴屬( mucor)、犁頭黴屬( absidia)、根黴屬( rhizopus))、申克氏胞絲菌( Sporothrix schenkii)、巴西芽生菌( Paracoccidioides brasiliensis)、粗球黴菌( Coccidioides immitis)、莢膜組織胞漿菌( Histoplasma capsulatum)、細螺旋體病( Leptospirosis)、包柔氏螺旋體( Borrelia burgdorferi)、蠕蟲寄生蟲(鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁形蟲(例如血吸蟲( Schistosomia))、藍氏賈第蟲( Giardia lambia)、旋毛蟲( t richinella)、脆雙核阿米巴( Dientamoeba Fragilis)、布氏錐蟲( Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲( Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼蟲( Leishmania donovani)。
本發明的這類PD-1結合分子可聯合其他抗癌劑，尤其地，特異性結合癌症抗原的分子(例如，抗體、雙抗體)。可與本發明的PD-1結合分子聯合的抗癌療法包括特異性結合一種或多種癌症抗原的分子，所述癌症抗原包括：結腸癌中發現的 19.9、胃癌黏蛋白； 4.2； A33(結直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998)； ADAM-9(美國專利公開號2006/0172350、PCT公開號WO 06/084075)；胃癌中發現的 AH6； ALCAM(PCT公開號WO 03/093443)； APO-1 ( 惡性人淋巴細胞抗原 )(Trauth等(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,”Science 245:301-304)； B1(Egloff, A.M.等2006, Cancer Res. 66(1):6-9)； B7-H3(Collins, M.等(2005) “ The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。Chapoval, A.等(2001) “ B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269–274；Sun, M.等(2002) “ Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297)； BAGE(Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84)； β - 聯蛋白(Prange W.等2003 J Pathol.201(2):250-9)；如結腸腺癌中發現的 血型 ALe b/Le y ； 伯基特淋巴瘤抗原 -38.13，如結腸腺癌中發現的 C14； CA125 ( 卵巢癌抗原 )(Bast, R.C. Jr.等2005 Int J Gynecol Cancer15 Suppl 3:274-81；Yu等(1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,”Cancer Res. 51(2):468‑475)； 羧肽酶 M(美國專利公開號2006/0166291)； CD5(Calin, G.A.等2006 Semin Oncol. 33(2):167-73； CD19(Ghetie等(1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,”Blood 83:1329-1336；Troussard, X.等1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)； CD20(Reff等(1994) “Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,”Blood 83:435-445；Thomas, D.A.等2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36)； CD22(Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51)； CD23(Rosati, S.等2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107)； CD25(Troussard, X.等1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)； CD27(Bataille, R. 2006 Haematologica91(9):1234-40)； CD28(Bataille, R. 2006 Haematologica91(9):1234-40)； CD33(Sgouros等(1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,”J. Nucl. Med .34:422-430)； CD36(Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7)；CD40/CD154 (Messmer, D.等2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60)； CD45(Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46)；CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica91(9):1234-40)； CD46(美國專利號7,148,038；PCT公開號WO 03/032814)； CD52(Eketorp, S.S.等(2014) “ Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients,” Ann Hematol. 93(10):1725-1733；Suresh, T.等(2014) “ New Antibody Approaches To Lymphoma Therapy,” J. Hematol. Oncol. 7:58；Hoelzer, D. (2013) “ Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706)； CD56(Bataille, R. 2006 Haematologica91(9):1234-40)； CD79a/CD79b(Troussard, X.等1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48；Chu, P.G.等2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106)； CD103(Troussard, X.等1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)； CD317(Kawai, S.等(2008) “ Interferon-Α Enhances CD317 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell Carcinoma Xenograft Models,” Cancer Science 99(12):2461-2466；Wang, W.等(2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody,” Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976；Wang, W.等(2009) “ Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer,” 63(1):23-31；Sayeed, A.等(2013) “ Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells,” PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10)； CDK4(Lee, Y.M.等2006 Cell Cycle5(18):2110-4)； CEA(癌胚抗原；Foon等(1995) “Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine,”J. Clin. Invest. 96(1):334-42)；Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46；Tellez-Avila, F.I.等2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9)； CEACAM9/CEACAM6(Zheng, C.等(2011) “ A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11)； CO17-1A(Ragnhammar等(1993) “Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced,”Int. J. Cancer 53:751-758)； CO-43(血型Le b)；如在腺癌中發現的 CO-514(血型Le a)； CTA-1； CTLA-4(Peggs, K.S.等2006 Curr Opin Immunol.18(2):206-13)； 細胞角蛋白 8(PCT公開號WO 03/024191)； D1.1； D 156-22 ； DR5(Abdulghani, J.等(2010) “ TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；Andera, L. (2009) “ Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180；Carlo-Stella, C.等(2007) “ Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy,” Clin, Cancer 13(8):2313-2317；Chaudhari, B.R.等(2006) “ Following the TRAIL to Apoptosis,” Immunologic Res. 35(3):249-262)；如胰腺癌中發現的 E 1 系列(血型B)； EGFR(表皮生長因數受體；Adenis, A.等2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32)； 肝配蛋白受體(尤其是 EphA2(美國專利號7,569,672、PCT公開號WO 06/084226)； Erb(ErbB1；ErbB3；ErbB4；Zhou, H.等2002 Oncogene21(57):8732-8740；Rimon, E.等2004 Int J Oncol. 24(5):1325-1338)； GAGE(GAGE-1；GAGE-2；Akcakanat, A.等2006 Int J Cancer. 118(1):123-128)； GD2/GD3/GM2(Livingston, P.O.等2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-1025)； 神經節苷脂 GD2(G D2；Saleh等(1993) “Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen,”J.Immunol., 151, 3390-3398)； 神經節苷脂 GD3((G D3；Shitara等(1993) “A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities,”Cancer Immunol. Immunother .36:373-380)； 神經節苷脂 GM2(G M2；Livingston等(1994) “Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside,”J. Clin. Oncol. 12:1036-1044)； 神經節苷脂 GM3(G M3；Hoon等(1993) “Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers,”Cancer Res. 53:5244-5250)； GICA 19-9(Herlyn等(1982) “Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma,”J. Clin. Immunol. 2:135-140)； gp100(Lotem, M.等2006 J Immunother.29(6):616-27)； Gp37(人白血病T細胞抗原；Bhattacharya-Chatterjee等(1988) “Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3),”J. Immunol .141:1398-1403)； gp75(黑素瘤抗原；Vijayasardahl等(1990) “The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product,”J. Exp. Med. 171(4):1375-1380)； gpA33(Heath, J.K.等(1997) “ The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The ImmunoglobulinSuperfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474；Ritter, G.等(1997) “ Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686；Wong, N.A.等(2006) “ EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263)； HER2 抗原(HER2/neu, p185 HER2；Kumar, Pal S等2006 Semin Oncol. 33(4):386-91)； HMFG(人乳脂肪球抗原；WO1995015171)； 人乳頭瘤病毒 -E6/ 人乳頭瘤病毒 -E7(DiMaio, D.等2006 Adv Virus Res. 66:125-59； HMW-MAA(高分子量黑素瘤抗原；Natali等(1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance,”Cancer 59:55-63；Mittelman等(1990) “Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,”J. Clin. Invest. 86:2136-2144)； I 抗原(分化抗原；Feizi (1985) “Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens,”Nature 314:53-57)； IL13R α 2(PCT公開號WO 2008/146911；Brown, C.E.等(2013) “ Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769；Barderas, R.等(2012) “ High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790；Kasaian, M.T.等(2011) “ IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569；Bozinov, O.等(2010) “ Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621；Fujisawa, T.等(2009) “ A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)； 整聯蛋白 β 6(PCT公開號WO 03/087340)； JAM-3(PCT公開號WO 06/084078)； KID3(PCT公開號WO 05/028498)； KID31(PCT公開號WO 06/076584)； KS 1/4 泛 (pan) - 癌抗原(Perez等(1989) “Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,”J. Immunol.142:3662‑3667；Möller等(1991) “Bi-specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,”Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216；Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80)； L6和 L20(人肺癌抗原；Hellström等(1986) “Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma,”Cancer Res. 46:3917-3923)； LEA； LUCA-2(美國專利公開號2006/0172349；PCT公開號WO 06/083852)； M1:22:25:8； M18； M39； MAGE(MAGE-1；MAGE-3；Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84)； MART(Kounalakis, N.等2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82； 間皮蛋白(Chang K, 和Pastan I. 1996 ” Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers,” Proc Natl Acad Sci USA 93:136–40)、 MUC-1(Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46)； MUM-1(Castelli, C.等2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31)； Myl； N- 乙醯葡糖氨基轉移酶(Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34)； 擬糖蛋白；如腺癌中發現的 NS-10； OFA-1； OFA-2； 致癌蛋白 M(致癌蛋白受體β；美國專利號7,572,896；PCT公開號WO 06/084092)； p15(Gil, J.等2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77)； p97(黑素瘤相關的抗原；Estin等(1989) “Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97,”J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454)； PEM(多態上皮粘蛋白；Hilkens等(1992) “Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property,”Trends in Biochem. Sci. 17:359-363)； PEMA ( 多態上皮粘蛋白抗原 )； PIPA(美國專利號7,405,061；PCT公開號WO 04/043239)； PSA(前列腺特異性抗原；Henttu等(1989) “cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes,”Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910；Israeli等(1993) “Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen,”Cancer Res. 53:227-230；Cracco, C.M.等2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11)； PSMA(前列腺特異性膜抗原；Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180)； 前列腺酸性磷酸酯(Tailor等(1990) “Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone,”Nucl. Acids Res. 18(16):4928)；如黑素瘤中發現的 R 24 ； ROR1(美國專利號5,843,749)； 鞘脂； SSEA-1； SSEA-3； SSEA-4； sTn(Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91)；來自皮膚T細胞淋巴瘤的 T 細胞受體 衍生的 肽(見Edelson (1998) “Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy,”Cancer J Sci Am. 4:62-71)；髓樣細胞中發現的 T 5A 7 ； TAG-72(Yokota等(1992) “Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms,”Cancer Res. 52:3402-3408)； TL5(血型A)； TNF- 受體(TNF-α受體，TNF-ß受體； TNF- γ 受體(van Horssen, R.等2006 Oncologist. 11(4):397-408；Gardnerova, M.等2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64)； TRA-1-85(血型H)； 運鐵蛋白受體(美國專利號7,572,895；PCT公開號WO 05/121179)； 5T 4(TPBG，滋養層糖蛋白；Boghaert, E.R.等(2008) “ The Oncofetal Protein,5T4 , Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234；Eisen, T.等(2014) “ Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6 ) ； TSTA ( 腫瘤 特異性 移植抗原 )比如病毒誘導的腫瘤抗原，包括T-抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原甲胎蛋白，比如結腸的CEA、膀胱腫瘤癌胚抗原(Hellström等(1985) “Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas,”Cancer. Res. 45:2210-2188)； VEGF(Pietrantonio, F.等(2015) “ Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians,” Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272-281；Grabowski, J.P. (2015) “ Current Management Of Ovarian Cancer,” Minerva Med. 106(3):151-156；Field, K.M. (2015) “ Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies,” Cancer 121(7):997-1007；Suh, D.H.等(2015) “ Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014,” J. Gynecol. Oncol. 26(2):156-167；Liu, K.J.等(2015) “ Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Tumour Biol. 36(3):1323-1327；Di Bartolomeo, M.等(2015) “Bevacizumab treatment in the elderly patient with metastatic colorectal cancer,” Clin. Interv. Aging 10:127-133)； VEGF 受體(O’Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998)； VEP8； VEP9； VIM-D5；和 Y 半抗原，胚胎性癌細胞中發現的 Le y 。
在某些實施方式中，本發明的這類抗PD-1結合分子與特異性結合5T4、B7H3、CD19、CD20、CD51、CD123、DR5、EGFR、EpCam、GD2、gpA33、HER2、ROR-1、TAG-72、VEGF-A抗體和/或VEGFR2的一個或多個分子聯合使用。
本發明的這類PD-1結合分子可與免疫原性試劑比如腫瘤疫苗聯合。這類疫苗可包括純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子)，自體或異源的腫瘤細胞。已經描述了許多腫瘤疫苗策略(見例如，Palena, C.,等, (2006) “ Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies,” Adv. Cancer Res. 95, 115-145；Mellman, I.,等(2011) “ Cancer immunotherapy comes of age,” Nature 480, 480–489；Zhang, X. M.等(2008) “ The anti-tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derived peptides,” Oncol. Rep. 20, 245–252；Disis, M. L.等(2002) “Generation of T-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines,”J. Clin. Oncol. 20, 2624–2632 ； Vermeij, R. 等 (2012) “Potentiation of a p53-SLP vaccine by cyclophosphamide in ovarian cancer: a single-arm phase II study.”Int. J. Cancer 131, E670–E680)。本發明的這類PD-1結合分子可聯合化療方案。在這些情況下，可能降低施用的化療劑的劑量(Mokyr等(1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。
本發明的這類PD-1結合分子可聯合其他免疫刺激分子，比如啟動宿主免疫反應性的抗體，以提供增加水準的T-細胞啟動。尤其地，已經表明抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體和/或抗CTLA-4抗體啟動免疫系統(見，例如，del Rio, M-L.等(2005) “ Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation,” Eur. J. Immunol 35:3545-3560；Barber, D. L.等(2006) “ Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection,” Nature 439, 682–687；Iwai, Y.等(2002) “ Involvement Of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade,” Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293–12297；Leach, D. R.,等, (1996) “ Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade,” Science 271, 1734-1736)。可與本發明的PD-1結合分子聯合的另外的免疫刺激分子包括啟動樹突細胞(DC)功能和抗原呈遞的針對樹突細胞表面上的分子的抗體、能夠代替T細胞助細胞活性的抗CD40抗體、和針對T細胞共刺激分子，比如PD-L1、CTLA-4、OX-40 4-1BB和ICOS的啟動抗體(見，例如，Ito等(2000) “ Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies,”Immunobiology 201:527-40；美國專利號5,811,097；Weinberg等(2000) “ Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity,” Immunol 164:2160-2169；Melero等(1997) “ Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,” Nature Medicine 3: 682-685；Hutloff等(1999)  “ ICOS Is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related To CD28,” Nature 397: 263-266；和Moran, A.E.等(2013) “ The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy,” Curr Opin Immunol. 2013 Apr；25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004)，和/或刺激性嵌合抗原受體( CAR)，其包括針對與來自各種共刺激蛋白質受體(例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40等)的一個或多個細胞內信號傳導結構域融合的疾病抗原的抗原結合結構域，其用於在抗原結合時刺激T細胞(見，例如，Tettamanti, S.等(2013) “ Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific ChimericAntigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等(2014) “ Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等(2013) “ T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood  122:3138-3148；Pizzitola, I.等(2014) “ Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。
本發明的這類PD-1結合分子可聯合抑制性嵌合抗原受體( iCAR)，以轉移(divert off)靶向免疫療法應答。iCAR，一種針對與來自各種抑制性蛋白質受體(例如，CTLA-4、PD-1等)的一個或多個細胞內信號傳導結構域融合的疾病抗原的抗原結合結構域，其用於在抗原結合時約束T-細胞應答(見，例如，Fedorov V.D. (2013) “ PD-1– and CTLA-4–Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses,” Sci. Tranl. Med. 5:215ra172 doi:10.1126/scitranslmed.3006597。
尤其地，本發明的這類抗PD-1結合分子與抗CD137抗體、抗CTLA-4抗體、抗OX40抗體、抗LAG-3抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和/或癌症疫苗組合使用。 B. 診斷和治療診斷用途
本發明的某些PD-1結合分子幾乎不展示或不展示阻斷PD-1和PD-1L配體之間結合的能力。因此，抗體PD-1 mAb 2和PD-1 mAb 4、它們的人源化衍生物和包括它們的PD-1結合片段的分子(例如，雙特異性雙抗體等)或與這類抗體競爭結合的分子可被可檢測地標記(例如，標記以放射性、酶、螢光、化學發光、順磁性、抗磁性或其他標記部分)，並且用於檢測樣品中的PD-1或用於細胞上PD-1的成像。因為這類分子不影響PD-1的生物活性，所以它們尤其可用於確定受試者(例如，針對與表達或靶向PD-1相關的癌症被治療的受試者)中PD-1表達的程度、位置和改變的方法中。 XII. 藥物組合物
本發明的組合物包括原料藥組合物(bulk drug composition)，其可用於製備藥學組合物(例如，不純或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用給受試者或患者的組合物)。這樣的組合物包括預防有效量的或治療有效量的本發明的PD-1結合分子或這類劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的PD-1結合分子和藥學上可接受的載體。本發明尤其包括這類藥物組合物，其中PD-1結合分子是：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15；人源化PD-1 mAb 1；PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15；任何這類抗體的PD-1結合片段；或其中PD-1結合分子是雙特異性PD-1雙抗體(例如，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體)。尤其包括的是這類分子：其包括下述的3個CDR L和3個CDRH：PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15抗體；人源化的PD-1 mAb 1；PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15。
本發明還包括這樣的藥學組合物，其另外包括對特定癌抗原是特異性的第二治療抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學上可接受的載體。
在具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。
一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。
可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。
本發明也提供藥學包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明的PD-1結合分子(更優選地，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15；人源化的PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15抗體；任何這類抗體的PD-1結合片段；或其中PD-1結合分子是雙特異性PD-1雙抗體(例如，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體))。尤其包括這類分子，其包括PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14或PD-1 mAb 15的3個CDR L和3個CDRH，單獨地或與這類藥學上可接受的載體一起。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
本發明提供了可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可包括本發明的任何PD-1結合分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一種或多種癌症抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。 XIII. 施用方法
通過向受試者施用有效量的本發明的融合蛋白或綴合分子或包括本發明的融合蛋白或綴合分子的藥學組合物，可以提供本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用本發明的組合物，例如封裝於脂質體中、微粒、微膠囊、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見，例如，Wu等(1987) “ Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用本發明的分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，本發明的PD-1結合分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT申請號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
本發明也使得本發明的PD-1結合分子包裝在密封容器中，比如指示分子的數量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中，這樣的分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。優選地，本發明的PD-1結合分子作為凍幹無菌粉提供於密封容器中。
本發明的凍幹的PD-1結合分子應在它們的初始容器中儲存在2°C和8°C之間，並且分子應該在重構之後12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中，這樣的分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，這類PD-1結合分子在以液體形式提供時，被供應在密封容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
如本文所使用，在一個實施方式中，“ 有效量”的藥物組合物是足夠實現有益或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，比如減少源自疾病的症狀、減少感染的症狀(例如，病毒量、發燒、疼痛、敗血症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾的患者的生命品質，降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、比如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展，和/或延長個體的生存。
可在一次或多次施用中施加有效量。為了本發明的目的，有效量的藥物、化合物或藥物組合物是足夠減少病毒存在的增殖(或影響)和直接或間接減少和/或延遲病毒疾病的發展的量。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如聯合一種或多種其他劑，可實現或實現期望的結果，則單劑可視為以有效量施用。儘管個體的需要不同，但是測定每種組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員已知的。
對於本發明包括的PD-1結合分子，向患者施用的劑量優選地基於接受受試者的體重(kg)確定。對於本發明包括的PD-1結合分子，向患者施用的劑量通常是至少約0.01 μg/kg、至少約0.05 μg/kg、至少約0.1 μg/kg、至少約0.2 μg/kg、至少約0.5 μg/kg、至少約1 μg/kg、至少約2 μg/kg、至少約5 μg/kg、至少約10 μg/kg、至少約20 μg/kg、至少約50 μg/kg、至少約0.1 mg/kg、至少約1 mg/kg、至少約3 mg/kg、至少約5 mg/kg、至少約10 mg/kg、至少約30 mg/kg、至少約50 mg/kg、至少約75 mg/kg、至少約100 mg/kg、至少約125 mg/kg、至少約150 mg/kg受試者的體重或更多。
可通過修飾比如，例如脂質化而增強分子的吸收和組織滲透，來減少或改變施用的本發明的PD-1結合分子的劑量和頻率。
對於用作單劑療法，可計算向患者施用的本發明的PD-1結合分子的劑量。可選地，分子可與其他治療組合物聯合使用，並且向患者施用的劑量小於當所述分子用作單劑療法時的劑量。
本發明的藥物組合物可被局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射、或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。
本發明的組合物可在泡狀體(vesicle)，尤其是脂質體中遞送(見Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等, 在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (編輯), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989)中；Lopez-Berestein, 同上, pp. 3 17-327)。
本發明的組合物可以在控釋或緩釋系統中遞送。本領域技術人員已知的任何技術均可用於產生包括本發明的一個或多個PD-1結合分子的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ning等(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained ‑ Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long ‑ Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等(1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，其每一篇通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統(見Langer, 上文；Sefton, (1987) “Implantable Pumps,”CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等(1980) “Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989) “A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N. Engl. J. Med .321:574-579)。在另一實施方式中，聚合材料可用于實現分子的控釋(見例如，Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Levy等(1985) “Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,”Science 228:190-192；During等(1989) “Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,”Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等(1989) “Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J. Neurosurg. 7(1):105-112)；美國專利號5,679,377、美國專利號5,916,597、美國專利號5,912,015、美國專利號5,989,463、美國專利號5,128,326、PCT公開號WO 99/15154和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑中所用的聚合物的實例包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控釋系統可接近治療靶(例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson, 在以下中：Medical Applications of Controlled Release, 上文 ,vol. 2，pp. 115-138 (1984))。根據Dunn等 (見U.S. 5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。該特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植可通常發生于患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織流中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(見美國5,888,533)。
Langer的綜述中討論了控釋系統(1990, “New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見，例如美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained ‑ Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long ‑ Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等(1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
在本發明的組合物是編碼本發明的PD-1結合分子的核酸的情況下，核酸可被體內施用，以通過如下方式促進其編碼的PD-1結合分子的表達：將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic), Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑包被，或通過與已知進入核的同源框樣肽聯合施用(見例如，Joliot等(1991) “Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc. Natl. Acad.Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。
用治療或預防有效量的本發明的PD-1結合分子治療受試者可包括單治療，或優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用這類雙抗體治療受試者每週一次，持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地持續約4、5或6周。本發明的藥物組合物可每天施用一次、每天施用兩次或每天施用三次。可選地，藥物組合物可每週施用一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次。也將認識到，用於治療的分子的有效劑量可隨著具體治療的療程而增加或降低。 實施例
下述實施例闡釋了組合物在本發明的診斷或治療方法中的的各種方法。實施例旨在是說明性的，但是決不限制本發明的範圍。 實施例1 抗人 PD-1 單克隆抗體的表徵
分離能夠特異性結合人和食蟹猴PD-1二者的十五種鼠科單克隆抗體，並且給與命名“ PD-1 mAb 1”、“ PD-1 mAb 2”、“ PD-1 mAb 3”、“ PD-1 mAb 4”、“ PD-1 mAb 5”、“ PD-1 mAb 6”、“ PD-1 mAb 7”、“ PD-1 mAb 8”、“ PD-1 mAb 9”、“ PD-1 mAb 10”、“ PD-1 mAb 11”、“ PD-1 mAb 12”、“ PD-1 mAb 13”、“ PD-1 mAb 14”和“ PD-1 mAb 15”。發現這些抗體的CDR不同，並且在上面提供。如下評估與人和食蟹猴PD-1的細胞外結構域的結合：用可溶性人或食蟹猴PD-1(與組氨酸標籤(shPD-1 His)或人Fc區域(shPD-1 hFc)融合的人PD-1的細胞外結構域，或與人Fc區域融合的食蟹猴PD-1的細胞外結構域(scyno-PD1 Fc))塗覆平底maxisorb 96孔板，每個孔0.5或1 μg/mL，洗滌平板，並且用分離的抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15之一進行孵育。對於這些研究，以3、1.0、0.3333、0.1111、0.0370、0.0123或0.0041 µg/mL(三倍連續稀釋)使用抗PD-1抗體。使用山羊抗小鼠IgG-HRP二抗，評估結合至固定的PD-1 (人或食蟹猴)的抗體的量。在平板閱讀器(Victor 2 Wallac, Perkin Elmers)上分析所有的樣品。可溶性人和可溶性食蟹猴PD-1的代表性結合曲線分別顯示在 圖 7A-7D和 圖 8A-8C中。
這些結合試驗的結果( 圖 7A-7D和 圖 8A-8C)顯示，所有的抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15均結合可溶性人和可溶性食蟹猴PD-1二者。
為了進一步表徵鼠科抗PD-1抗體，在兩個不同的試驗中評估它們阻斷可溶性人PD-L1與可溶性人PD-1的結合的能力。在一個試驗中，檢測抗體阻斷人PD-1與固定在表面上的PD-L1的結合的能力。對於該試驗，將抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15中的每種，或參考抗PD-1抗體(PD-1 mAb A)與shPD-1 His融合蛋白(以2.5 μg/mL)混合，並且分別與以1 μg/mL固定在鏈黴抗生物素包被的板上的生物素標記的可溶性人PD-L1 (與人Fc融合的PD-L1的細胞外結構域(sPD-L1))一起孵育。對於這些研究，以10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125或0.1563 µg/mL (兩倍連續稀釋)使用抗PD-1抗體。使用抗His-Tag-HRP二抗，經His-Tag，評估與固定的sPD-L1結合的shPD-1 His的量。在平板閱讀器(Victor 2 Wallac, Perkin Elmers)上分析所有的樣品。該實驗的結果顯示在 圖 9A-9D中。
這些抑制試驗的結果( 圖 9A-9D)顯示，抗PD-抗體PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14和PD-1 mAb 15能夠不能程度地阻斷可溶性人PD-L1與可溶性人PD-1的結合，而PD-1 mAb 2和PD-1 mAb 4在該試驗形式中展示很小的阻斷活性至沒有阻斷活性。
在第二個試驗中，檢測鼠科抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15阻斷PD-1配體(即，人PD-L1或人PD-L2)與在NSO細胞的表面上表達的PD-1結合的能力。對於該試驗，將抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15中的每種，或參考抗PD-1抗體(PD-1 mAb A或PD-1 mAb B)分別與生物素化的-可溶性人PD-L1 (shPD-L1融合蛋白)或生物素化的-可溶性人PD-L2-muIgFc融合蛋白(shPD-L2；Ancell Cat# 573-030)混合，各為0.1 μg/測試，並且在阻斷緩衝液(FACS + 10%人血清白蛋白)中與表達人PD-1的NSO細胞一起孵育(~250,000細胞/孔)。對於這些研究，以4.0、1.0、2.5 x10 -1、6.25 x 10 -2、1.56 x 10 -2、3.90 x 10 -3、9.76 x 10 -4、2.4 x 10 -4、0.6 x 10 -4μg/測試(四倍連續稀釋)使用抗PD-1抗體。使用PE綴合的鏈黴抗生物素二抗通過FACS分析測定結合至NSO細胞的表面的shPD-L1 (或shPD-L2)的量。測定抑制PD-1/PD-L1結合的IC50值，並且在 表 6中提供至少兩個實驗的樣品平均值( 　) (除非在指出的情況下)。
表 6
抗 PD-1 抗體 IC50 (µg/ 測試 ) 抗 PD-1 抗體 IC50 (µg/ 測試 )
PD-1 mAb A 0.0044 PD-1 mAb 8 0.6611 ‡
PD-1 mAb B 0.0064 PD-1 mAb 9 0.0154
PD-1 mAb 1 0.0048 PD-1 mAb 10 0.0057
PD-1 mAb 2 0.0110 PD-1 mAb 11 0.0259 ‡
PD-1 mAb 3 0.0361 ‡ PD-1 mAb 12 0.0238 ‡
PD-1 mAb 4 0.0156 ‡ PD-1 mAb 13 0.0117
PD-1 mAb 5 0.0039 PD-1 mAb 14 0.0149 ‡
PD-1 mAb 6 0.0051 PD-1 mAb 15 0.0060
PD-1 mAb 7 0.0024
‡來自單個實驗的結果
shPD-L1抑制試驗的結果( 表 6)顯示，抗PD-1抗體PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14和PD-1 mAb 15能夠阻斷人PD-L1與在NSO細胞的表面上表達的人PD-1的結合。尤其地，相比參考PD-1抗體(PD-1 mAb A、PD-1 mAb B)，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 10和PD-1 mAb 15一樣好地阻斷或更好地阻斷shPD-L1結合，而PD-1 mAb 8在該試驗形式中基本上是非阻斷的。PD-1 mAb 2和PD-1 mAb 4都能夠在該試驗形式中阻斷PD-1/PD-L1結合。
類似地，抗PD-1抗體PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2和PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14能夠阻斷人PD-L2與在NSO細胞的表面上表達的人PD-1的結合，而PD-1 mAb 8在該試驗形式中基本上是非阻斷的。尤其地，與參考PD-1抗體(PD-1 mAb A、PD-1 mAb B)相比，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7和PD-1 mAb 10一樣好地阻斷或更好地阻斷shPD-L2結合。在該試驗中，沒有檢測PD-1抗體PD-1 mAb 11和PD-1 mAb 15。下面提供了若干人源化抗PD-1抗體，包括hPD-1 mAb 15的結果。 實施例2 人源化和進一步表徵
將抗PD-1抗體PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15的可變結構域人源化，在鑒定了抗原表位元的情況下，使抗體進一步去免疫化，以產生最終的人源化可變結構域。PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2和PD-1 mAb 15的人源化為每種抗體產生一個人源化的VH結構域和一個人源化的VL結構域，本文命名為 “hPD-1 mAb 1 VH1”和 “hPD-1 mAb 1 VL1”、“ hPD-1 mAb 2 VH1”和 “hPD-1 mAb 2 VL1”和 “hPD-1 mAb 15 VH1”和 “hPD-1 mAb 15 VL1” 。PD-1 mAb 7的人源化產生兩個人源化的VH結構域，本文命名為 “hPD-1 mAb 7 VH1”和 “hPD-1 mAb 7 VH2”，和三個人源化的VL結構域，本文命名為 “hPD-1 mAb 1 VL1”、“ hPD-1 mAb 7 VL2”和 “hPD-1 mAb 7 VL3”。PD-1 mAb 9的人源化產生兩個人源化的VH結構域，本文命名為 “hPD-1 mAb 9 VH1”和 “hPD-1 mAb 9 VH2”，和兩個人源化的VL結構域，本文命名為 “hPD-1 mAb 9 VL1”和 “hPD-1 mAb 1 VL2”。在產生多個人源化的可變結構域的情況下，具體抗PD-1抗體(例如，PD-1 mAb 7)的人源化的重鏈和輕鏈可變結構域可以以任何組合使用，並且參考特定的VH/VL結構域命名人源化的鏈的具體組合，例如包括hPD-1 mAb 7 VH1和hPD-1 mAb 7 VL2的人源化抗體具體稱為 “hPD-1 mAb 7(1.2)”。產生全長人源化抗體，其具有包括L234A/L235A取代(IgG1 (AA))的人IgG1恒定區或包括S228P取代(IgG4 (P))的人IgG4恒定區。
如下構建全長IgG1人源化抗體重鏈：將人源化的VH結構域的C-末端與具有變異的CH2-CH3結構域(包括L234A/L235A (AA)取代)並且缺少C-末端賴氨酸殘基的人IgG1恒定區的N-末端融合( SEQ ID NO:255)： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPE AA GG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
在 SEQ ID NO:255中，氨基酸殘基1-98對應IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO ： 10)，氨基酸殘基99-113對應IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO ： 32)和氨基酸殘基114-329對應包括L234A/L235A取代(加底線的)但是缺少C-末端賴氨酸殘基的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:5)。
具有包括L234A/L235A突變並且缺少C-末端賴氨酸殘基的IgG1重鏈恒定區的示例性人源化抗體((hPD-1 mAb 7(1.2))的重鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:265)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA stkgpsvfpl apsskstsgg taalgclvkd yfpepvtvsw nsgaltsgvh tfpavlqssg lyslssvvtv pssslgtqty icnvnhkpsn tkvdkrvepk scdkthtcpp cpape aa ggp svflfppkpk dtlmisrtpe vtcvvvdvsh edpevkfnwy vdgvevhnak tkpreeqyns tyrvvsvltv lhqdwlngke ykckvsnkal papiektisk akgqprepqv ytlppsreem tknqvsltcl vkgfypsdia vewesngqpe nnykttppvl dsdgsfflys kltvdksrwq qgnvfscsvm healhnhytq kslslspg
在 SEQ ID NO ： 265中，氨基酸殘基1-119對應hPD-1 mAb 7 VH1的VH結構域( SEQ ID NO ： 147)，氨基酸殘基120-217對應IgG1 CH1結構域( SEQ ID NO ： 10)，殘基218-232對應IgG1鉸鏈區( SEQ ID NO ： 32)和殘基233-448對應包括L234A/L235A取代(加底線的)但是缺少C-末端賴氨酸殘基的IgG1 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:5)。
如下構建全長IgG4人源化抗體重鏈：將人源化的VH結構域的C-末端與具有穩定化的鉸鏈區(包括S228P取代)並且缺少C-末端賴氨酸殘基的人IgG4恒定區的N-末端融合( SEQ ID NO:256)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
在 SEQ ID NO:256中，氨基酸殘基1-98對應IgG4 CH1結構域( SEQ ID NO:254)，氨基酸殘基99-110對應包括S228P取代(加底線的)的穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO ： 13)和氨基酸殘基111-326對應IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:4)，但是缺少C-末端賴氨酸殘基。
具有IgG4重鏈恒定區的示例性人源化抗體((hPD-1 mAb 7(1.2))的重鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:266)，所述IgG4重鏈恒定區包括具有S228P突變的穩定化的鉸鏈區並且缺少C-末端賴氨酸殘基： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCP P CPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
在 SEQ ID NO:266中，氨基酸殘基1-119對應hPD-1 mAb 7 VH1的VH結構域( SEQ ID NO:147)，氨基酸殘基120-217對應IgG4 CH1結構域( SEQ ID NO:254)，氨基酸殘基218-229對應包括S228P取代(加底線的)的穩定化的IgG4鉸鏈區( SEQ ID NO:13)和氨基酸殘基230-445對應IgG4 CH2-CH3結構域( SEQ ID NO:4)，但是缺少C-末端賴氨酸殘基。
如下構建全長人源化抗體輕鏈：將人源化的VL結構域的C-末端與人輕鏈κ區域( SEQ ID NO:8)的N-末端融合。相同輕鏈與IgG1 (AA)和IgG4 (P)重鏈配對。
具有κ恒定區的示例性人源化的PD-1抗體(hPD-1 mAb 7(1.2))的輕鏈的氨基酸序列是( SEQ ID NO:264)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
在 SEQ ID NO:264中，氨基酸殘基1-111對應hPD-1 mAb 7 VL2的VL結構域( SEQ ID NO:153)，和氨基酸殘基112-218對應輕鏈κ恒定區( SEQ ID NO ： 8)。
通過併入不同的恒定區和/或通過引入一個或多個氨基酸取代、添加或缺失，容易產生具有可選的恒定區，例如工程化的Fc區域，的抗PD-1抗體。例如，在期望雙特異性抗體的情況下，包含杵的和包含臼的CH2-CH3結構域用於利於異源二聚化。如上述產生包括鼠科可變區和人恒定區的嵌合抗PD-1抗體。
如上所述測試人源化抗體(IgG1 (AA)和/或IgG4 (P))的結合和阻斷活性。比較人源化抗體和相應的鼠科抗體與人PD-1 (shPD-1 His，和shPD-1 hFc)和食蟹猴PD-1 (shPD-L1 hFc)的結合。另外，在ELISA試驗中，人源化抗體保持阻斷人PD-L1與人PD-1結合的能力。
使用Biacore分析研究鼠科抗體PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9、PD-1 mAb 15、人源化抗體hPD-1 mAb 2、hPD-1 mAb 7(1.2)、hPD-1 mAb 9(1.1)、hPD-1 mAb 15、和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B的結合動力學。將抗PD-1抗體捕獲在固定的蛋白質A上，並且用His標記的可溶性人PD-1 (shPD-1-His)或被切割以去除Fc部分的可溶性人食蟹猴PD-1 Fc融合物(scyno PD-1 hFc)孵育，並且經Biacore分析測定結合的動力學。在另外的研究中，將抗PD-1抗體hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P)、PD-1 mAb A IgG1 (AA)、PD-1 mAb A IgG4 (P)、PD-1 mAb B IgG1 (AA)和PD-1 mAb B IgG4 (P)捕獲在固定的F(ab) 2山羊抗人Fc上，並且如上述通過Biacore分析測定結合動力學。來自這些研究的計算的ka、kd和KD提供在 表 7中。
表7
蛋白質A 捕獲
抗PD-1 抗體 人 a 食蟹猴 b
k a (x10 4) k d (x10 -4) KD(nM) k a (x10 4) k d (x10 -4) KD(nM)
PD-1 mAb A 60 18 3 14 9.6 6.9
PD-1 mAb B 140 35 2.5 37 12 3.2
PD-1 mAb 7 21 2.8 1.3 17 6 3.5
hPD-1 mAb 7(1.2) 110 4.3 0.39 37 6.4 1.7
PD-1 mAb 9 4.3 4.2 9.8 2.2 16 72.7
hPD-1 mAb 9(1.1) 1.8 6.5 36.1 1.5 11 73.3
PD-1 mAb 15 4.5 1.3 2.9 2.7 11 40.7
hPD-1 mAb 15 2.4 3.2 13.3 2.3 18 78.3
PD-1 mAb 2 5.5 5.6 10.2 4.2 6.0 14.3
hPD-1 mAb 2 3.2 1.6 5.0 2.3 3.9 17
F(ab) 2 山羊抗人Fc 捕獲
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 13 8.4 6.5 8.1 4.5 5.6
PD-1 mAb A IgG4 (P) 13 7.9 6.1 8.4 5.0 6.0
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 25 28 11.2 20 6.4 3.2
PD-1 mAb B IgG4 (P) 26 25 9.6 20 7.9 4.0
hPD-1 mAb 7(1.2)IgG1 (AA) 25 3.8 1.5 16 7.8 4.9
hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4 (P) 27 4.1 1.5 17 7.8 4.6
hPD-1 mAb 9(1.1)IgG1 (AA) 5.6 6.1 10.9 5.6 5.2 9.3
hPD-1 mAb 9(1.1)IgG4 (P) 6.1 5.8 9.5 4.9 7.4 15.1
a 組氨酸標記的可溶性人PD-1 (shPD-1 His) b 可溶性食蟹猴PD-1 (scyno PD-1 hFc)，切割的
結果表明，PD-1 mAb 7和人源化的hPD-1 mAb 7(1.2)相對於參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B展示更好的結合動力學。PD-1 mAb 2和hPD-1 mAb 2展示的結合動力學在參考抗PD-1抗體的約兩倍之內，而PD-1 mAb 9、hPD-1 mAb 9(1.1)、PD-1 mAb 15和hPD-1 mAb 15展示的結合動力學在參考抗PD-1抗體的約2-6倍之內。
研究抗人PD-1抗體PD-1 mAb 7的組織特異性。使正常的組織與PD-1 mAb 7或與同種型對照(0.313 μg/mL)接觸，並且使染色的程度視覺化。Bloxall用於內源酶阻斷，以減少結腸組織中的非特異性粘蛋白染色。如 圖 10A ，圖 i-xii中顯示，PD-1 mAb 7和同種型對照二者都不能標記正常結腸、肝、肺、胰腺、腎和心臟組織的細胞。另外，PD-1 mAb 7和同種型對照不能使正常皮膚染色( 圖 10B ，圖 i-ii)。相反，發現PD-1 mAb 7強烈標記正常扁桃體組織中存在的淋巴細胞和表達PD-1的PDCD1轉染的NSO細胞( 圖 10B ，圖 iii和 v)，而同種型對照不能標記任何一個( 圖 10B ，圖 iv和 vi)。結果呈現在 圖 10A-10B中，因此指示PD-1 mAb 7能夠特異性結合淋巴細胞和表達PD-1的細胞。
檢查hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG4 (P)、hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B的結合飽和度特徵(saturation profile)。簡言之，將抗PD-1抗體，PD-1 mAb 1-15，或參考抗PD-1抗體(PD-1 mAb A和PD-1 mAb B)中的每一種與表達人PD-1的NSO細胞(~250,000細胞/孔)在封閉緩衝液(FACS + 10%人血清白蛋白)中混合。對於這些研究，以50、12.5、3.13、2.0 x10 -1、4.9 x 10 -2、1.2 x 10 -2、3.0 x 10 -3、1.9 x 10 -4、7.6 x 10 -4、4.75 x 10 -5或1.19 x 10 -5μg/測試(四倍連續稀釋)使用抗PD-1抗體。通過FACS分析使用山羊抗人-APC二抗測定結合至NSO細胞的表面的抗體的量。代表性飽和度曲線顯示在 圖 11中。測定EC50和EC90值，並且在 表 8中提供來自四個獨立實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表8
飽 和度結合
EC50 (µg/ 測試) EC90 (µg/ 測試)
抗PD-1 抗體 SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.1991 0.1309 1.4528 0.8040
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.1581 0.1161 1.5464 1.7690
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.1347 0.0681 1.3917 0.9573
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.1398 0.0951 1.1619 1.2681
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.4431 0.1997 2.4374 1.2637
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.1069 0.0500 0.9102 0.5476
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.1872 0.1553 0.6810 0.3226
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.1376 0.0926 0.6609 0.3437
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 0.3123 0.2291 1.6486 0.9117
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.5128 0.2228 3.0563 0.9437
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.2927 0.1333 2.0640 0.6096
結合飽和度研究表明，PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15的人源化形式對於與細胞表面PD-1結合具有有利的特徵。尤其地，在所有檢測的抗體中，人源化的PD-1 mAb 7 (具有IgG1 (AA)或IgG4 (P) Fc區域的hPD-1 mAb 7(1.1)和hPD-1 mAb 7(1.2))具有最低EC90值。
為了進一步表徵人源化的抗PD-1抗體hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG4 (P)和hPD-1 mAb 15IgG1 (AA)，檢查它們阻斷人PD-L1 (shPD-L1)和人PD-L2 (shPD-L2)與在NSO細胞的表面上表達的PD-1結合的能力。基本上如上述進行這些試驗。抑制sPD-L1和sPD-L2與在NSO細胞上表達的PD-1結合的代表性曲線分別顯示在 圖 12A和 12B。測定IC50和IC90值，並且在 表 9中提供來自三個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表9
sPD-L1 sPD-L2
IC50 (µg/ 測試) IC90 (µg/ 測試) IC50 (µg/ 測試) IC90 (µg/ 測試)
抗PD-1 抗體 SM SD σ SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.0203 0.0089 0.2985 0.3279 0.0414 0.0124 0.1601 0.066
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.0156 0.0096 0.0776 0.0208 0.0280 0.0070 0.1594 0.1153
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.0148 0.0008 0.1034 0.0100 0.0280 0.0059 0.1190 0.060
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.0143 0.0013 0.0798 0.0239 0.0280 0.0055 0.0924 0.0065
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.0578 0.0124 0.2480 0.050 0.1294 0.0143 0.3813 0.0656
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.0166 0.0032 0.0674 0.0041 0.0283 0.0147 0.0886 0.0166
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.0118 0.0027 0.0678 0.0031 0.0212 0.0031 0.0672 0.0043
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.0103 0.0023 0.0520 0.0033 0.0213 0.0019 0.0616 0.0063
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 0.0593 0.0036 0.3238 0.0508 0.4002 0.5000 0.4573 0.1805
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.0460 0.0118 0.2461 0.0513 0.1105 0.0146 0.2914 0.0526
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.0440 0.0092 0.2068 0.035 0.0945 0.0022 0.3093 0.0588
配體結合抑制研究表明，PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15的人源化的形式能夠抑制sPD-L1和sPD-L2與細胞表面上的PD-1結合。尤其地，在所有檢測的抗體中，人源化的PD-1 mAb 7 (hPD-1 mAb 7(1.1)和hPD-1 mAb 7(1.2))具有最低IC90值。 實施例3 通過人源化抗人 PD-1 抗體阻斷 PD-1/PD-L1 檢查點
在Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1螢光素酶報告試驗中，檢測hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1，(AA)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG1 (AA)、hPD-1 mAb 9(1.1)IgG4 (P)、hPD-1 mAb 15IgG1 (AA)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B對抗PD-1/PD-L1軸(axis)的能力(即，阻斷PD-1/PD-L1相互作用和防止T-細胞應答的下調)。簡言之，將表達PD-L1的CHO細胞(CHO/PD-L1)以40,000/孔塗鋪在100 μL培養基(RPMI + 10% FBS + 100 μg/mL潮黴素B + 100 μg/mL G418)中並且孵育過夜。第二天，去除培養基，並且，以50,000細胞/孔將在40 μL試驗緩衝液(RPMI + 2% FBS)中的MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat細胞(Promega)以及抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15或參考抗PD-1抗體(PD-1 mAb A和PD-1 mAb B) (0-25 μg/mL；在試驗緩衝液中八次2.5倍連續稀釋)添加至每個孔中，並且在37℃孵育6小時，隨後在環境溫度孵育5-10分鐘。接著，將80 μL的BioGlo底物(Promega)添加至每個孔中，並且將平板在環境溫度孵育另外的5-10分鐘，在Victor平板閱讀器中測量發光。代表性飽和度曲線顯示在 圖 13中。測定EC50和EC90值，並且，在 表 10中提供來自四個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表10
抗PD-1 抗體 報告信號傳導
EC50 (µg/ 測試) EC90 (µg/ 測試)
SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.2549 0.0480 2.4474 1.2228
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.2049 0.0719 2.5535 1.2139
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.2119 0.1781 2.2036 2.0118
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.1142 0.0323 0.9418 0.2863
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.3539 0.0983 3.8975 2.0054
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.1080 0.0386 1.1992 0.5103
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.0944 0.0153 0.6452 0.2615
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.0965 0.0169 0.6885 .01858
hPD-1 mAb 9 IgG1 (AA) 0.2835 0.0530 2.9968 0.8866
hPD-1 mAb 9 IgG4 (P) 0.3154 0.0872 5.0940 4.0496
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.2585 0.0592 3.3138 1.0532
報告信號傳導研究表明，PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15的人源化形式可阻斷PD-1/PD-L1軸並且防止T-細胞應答的下調。尤其地，人源化的PD-1 mAb 7 (具有IgG1 (AA)或IgG4 (P) Fc區域的hPD-1 mAb 7(1.1)和hPD-1 mAb 7(1.2))具有最低的EC50/EC90值。 實施例4 抗人 PD-1 抗體的功能活性
金黃色葡萄球菌腸毒素B型(SEB)是能夠啟動SEB-應答供體中大部分T-細胞(5-30%)的微生物超級抗原。SEB結合肽結合槽(peptide binding grove)外面的MHC II，因此是MHC II依賴性的，但是是不受限制的和TCR介導的。T細胞的SEB-刺激使得寡克隆T細胞增殖和細胞因數產生(儘管可觀察到供體變化性，並且一些供體無應答)。在SEB-刺激48小時內，PMBC上調PD-1和LAG-3，在96-孔板中伴隨SEB-刺激的二次培養後第5天，看到進一步增強。SEB-刺激PBMC之後，免疫檢查點蛋白質PD-1和LAG-3的上調限制了再次刺激時的細胞因數釋放。檢測抗PD-1抗體單獨和聯合抗LAG-3抗體通過檢查點抑制增強細胞因數釋放的能力。
簡言之，使用Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)密度梯度離心方法，根據製造商的指導，從在健康供體知情同意的情況下獲得自健康供體的全血(Biological Specialty Corporation)純化PBMC，然後使用Dynabeads® Untouched Human T Cells Kit (Dynabeads® Untouched人T細胞試劑盒)(Life Technologies)，根據製造商的指導，純化T細胞。在T-25大燒瓶中的RPMI-培養基+ 10%熱失活的FBS + 1%青黴素/鏈黴素中單獨培養純化的PBMC，2-3天，或與SEB (Sigma-Aldrich)，0.1ng/mL (初次刺激)，一起培養2-3天。在第一輪的SEB-刺激結束時，用PBS洗滌PBMC兩次，並且在96孔組織培養板中立即以1-5 x 10 5細胞/孔的濃度鋪平板，其在單獨的培養中、在具有對照或抗PD-1抗體的培養基中、在具有0.1ng/mL的SEB (二次刺激)和無抗體的培養基中，或在具有SEB和對照IgG或抗PD-1抗體+/-抗LAG-3 mAb的培養基中，並且培養另外的2-3天。在二次刺激結束時，收穫上清液，以使用針對IFNγ、TNFα、IL-10和IL-4的人DuoSet ELIS Kits (R&D Systems)，根據製造商的指導，測量細胞因數分泌。
檢測PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15單獨或聯合獨特的抗LAG-3抗體LAG-3 mAb1通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能力。這些研究也包括一個或多個下述參考抗PD-1抗體：PD-1 mAb A、PD-1 mAb B和LAG-3 mAb A，單獨的或組合的。 圖 14顯示了來自通過：無抗體；同種型對照抗體；PD-1 mAb 7和/或LAG-3 mAb 7；PD-1 mAb 9和/或LAG-3 mAb 1；PD-1 mAb 15和/或LAG-3 mAb 1；PD-1 mAb 2和/或LAG-3 mAb 1；或參考抗PD-1抗體PD-1 mAb B和/或LAG-3 mAb A (以10 μg/mL使用抗體)處理的代表性應答供體(D:38941)的SEB-刺激的(0.1 ng/mL) PBMC的IFNγ分泌特徵。
在另外的研究中，檢測了人源化形式的PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15(包括人IgG1 (AA)或人IgG4 (P) Fc區域)以及參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能力。對於這些研究，以0.625、2.5和10 µg/mL使用抗體。 圖 15A-15B顯示了來自不用抗體處理或通過以下抗體之一處理的代表性應答供體(D:57709)的SEB-刺激的(0.2 ng/mL) PBMC的IFNγ ( 圖 15A)和TNFα ( 圖 15B)分泌特徵：同種型對照；hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA)；hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)；hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)；hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA)；hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P)；hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA)；或參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A IgG1 (AA)、PD-1 mAb A IgG4 (P)、PD-1 mAb B IgG1 (AA)、PD-1 mAb B IgG4 (P)。對於通過抗PD-1抗體以0.625、2.5和10 µg/mL處理的樣品，測定用SEB+Ab處理的樣品中總的pg/mg的IFNγ，並且將來自3個不同應答供體(除非在指出的情況下)的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)提供在 表 11中。用人源化形式的PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15 (包括人IgG1 (AA)或人IgG4 (P) Fc區域)與參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B (即，人源化抗PD-1/PD-1 mAb A，和人源化抗PD-1/PD-1 mAb B)處理的樣品中IFNγ分泌的比例分別提供在 表 12和 表 13中。
表11
IFNγ 分泌(pg/mL)
μg/mL 抗PD1 抗體 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
抗PD-1 抗體 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 221.18 110.89 341.13 247.93 347.46 144.72
PD-1 mAb A IgG4 (P) 281.36 132.65 495.15 190.57 399.41 117.56
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 366.69 196.64 387.682 215.51 387.32 282.81
PD-1 mAb B IgG4 (P) 348.40 185.96 433.382 163.23 551.68 125.08
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 302.05 185.71 610.70 209.77 414.63 272.65
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 384.57‡ 323.79‡ 411.40 398.59 370.06 108.12
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 340.81 207.76 442.598 303.70 655.29 567.91
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 309.82 130.30 468.62 350.15 424.35 288.95
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 360.00 274.28 373.32 160.25 541.83 444.22
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 275.88 135.23 372.73 53.53 496.70 235.37
對照IgG 137.14 76.61 100.65 48.67 138.10 120.81
無抗體 120.05 73.90 120.05 73.90 109.46 85.18
‡來自兩個應答供體的結果
表12
IFNγ 分泌比例( 新抗PD-1/PD-1 mAb A)
μg/mL 抗PD1 抗體 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
抗PD-1 抗體 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00
PD-1 mAb A IgG4 (P) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 1.77 0.92 1.28 0.36 1.07 0.42
PD-1 mAb B IgG4 (P) 1.23 0.16 0.92 0.27 1.40 0.12
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 1.36 0.37 2.46 1.85 1.17 0.41
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 1.20‡ 0.35‡ 0.79 0.54 0.95 0.22
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 1.48 0.19 1.46 0.71 1.70 0.84
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 1.13 0.13 0.91 0.42 1.02 0.46
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 1.50 0.39 1.51 1.23 1.48 0.71
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 1.32 0.53 1.48 0.86 1.42 0.12
對照IgG 0.63 0.2 0.33 0.08 0.39 0.24
無抗體 0.54 0.12 0.39 0.14 0.31 0.17
‡來自兩個應答供體的結果
表13
IFNγ 分泌比例( 新抗PD-1/PD-1 mAb B)
μg/mL 抗PD1 抗體 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
抗PD-1 抗體 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.37 0.37 0.82 0.20 1.06 0.48
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.82 0.12 1.16 0.38 0.72 0.07
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 1.0 0.00 1.0 0.00 1.0 0.00
PD-1 mAb B IgG4 (P) 1.0 0.00 1.0 0.00 1.0 0.00
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.84 0.22 1.77 0.81 1.11 0.07
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.91‡ 0.26‡ 0.83 0.50 0.68 0.17
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 1.04 0.59 1.12 0.29 1.60 0.42
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.92 0.09 0.99 0.36 0.75 0.39
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 1.01 0.48 1.07 0.57 1.34 0.15
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.78 0.12 1.10 0.38 1.46 0.53
對照IgG 0.39 0.08 0.27 0.08 0.34 0.13
無抗體 0.34 0.11 0.31 0.03 0.28 0.08
‡來自兩個應答供體的結果
這些研究的結果表明，當再次刺激時，PD-1抗體PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15顯著增強來自SEB-刺激的PBMC的IFNγ ( 圖 14和 15A，和 表 11-13)和TNFα ( 圖 15B)產生。另外，當再次刺激時，抗PD-1抗體與抗LAG-3抗體的聯合導致來自SEB-刺激的PBMC的細胞因數釋放的進一步增強( 圖 14)。尤其地，PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9或PD-1 mAb 15與獨特的抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的組合提供了最大的增強。 實施例5 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子結合研究
產生許多PD-1 x LAG-3雙特異性分子，包括具有三、四和五條鏈的、包含Fc區域的雙抗體以及雙特異性抗體。產生具有四條鏈並且包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域的四種雙抗體，並且命名為“ DART A”、“ DART B”、“ DART C”和“ DART I”。產生具有四條鏈並且包括CH1/CL結構域的四種雙抗體，並且命名為“ DART D”、“ DART E”、“ DART J”和“ DART 1”。產生具有五條鏈並且包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域和CH1/CL結構域的兩種雙抗體，並且命名為“ DART F”和“ DART G”。產生具有三條鏈並且包括E/K-螺旋異源二聚體促進結構域的一種雙抗體，並且命名為“ DART H”。產生具有四條鏈的一種雙特異性抗體，並且命名為“ BSAB A”。上面提供了這些PD-1 x LAG-3雙特異性分子的結構和氨基酸序列並且總結在下面 表 14中。
表14
名稱 親本mAbs Fc ‡ 鏈 SEQ ID NO: 其他組分
DART A hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (YTE) 4 267 (X 1=A；X 2=Y；X 3=T；X 4=E)和268 E/K-螺旋；見圖3B
DART B hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.3) IgG4 (YTE) 4 267 (X 1=G；X 2=Y；X 3=T；X 4=E)和268 E/K-螺旋；見圖3B
DART C hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.3) IgG4 4 267 (X 1=G；X 2=M；X 3=S；X 4=T)和268 E/K-螺旋；見圖3B
DART D hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (YTE) 4 269和270 CL/CH1；見圖3C
DART E hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (YTE) 4 271和272 CL/CH1；見圖3C
DART F hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA/YTE) 5 273、274、275和276 CL/CH1和E/K-螺旋；見圖5
DART G hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA/YTE) 5 277、278、279和280 CL/CH1和E/K-螺旋；見圖5
DART H hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 3 281、282和283 E/K Coils；見圖4A
DART I hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (YTE) 4 290和291 E/K-螺旋；見圖3B
DART J hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (YTE) 4 292和293 CL/CH1；見圖3C
DART 1 PD-1 mAb A LAG-3 mAb A IgG1 (AA) 4 284和285 CL/CH1；見圖3C
BSAB A hPD-1 mAb 7(1.2) hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 4 286、287、288和289 具有工程化的Fc區域的mAb
‡併入IgG4 Fc區域的分子，也併入穩定化的IgG4鉸鏈區。
通過併入不同VH和VL結構域，可容易產生包括可選的PD-1和/或LAG-3表位結合位點的另外的PD-1 x LAG-3雙特異性分子。類似地，可通過併入具有期望的特異性的VH和VL產生結合不是LAG-3的抗原的分子。
基本上如上所述檢測PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I和DART 1；抗PD-1抗體：hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)、PD-1 mAb A IgG1 (AA)和PD-1 mAb A IgG4 (P)；和抗LAG-3抗體：hLAG-3 mAb 1(1.4)IgG4 (P)、LAG-3 mAb AIgG4 (P)、hLAG-3 mAb 1(1.4)IgG1 (AA)和LAG-3 mAb AIgG1 (AA)的結合飽和度特徵。測試PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體的PD-1和LAG-3結合，同時，僅僅測試抗PD-1和抗LAG-3抗體與它們各自抗原的結合。對於這些研究，使用表達PD-1或LAG-3的NSO細胞。使用雙抗體和抗體(170.0-0.013 μM或85.0-0.0021 μM(四倍連續稀釋)。測定EC50和EC90值並且提供在 表 15-16中。提供了進行2個或更多個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表15
分子 飽 和度結合PD-1
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 1.9297 0.4324 9.6027 0.4801
DART B 1.7640 § 12.2700 §
DART D 2.2267 0.4140 10.9313 2.6351
DART E 3.2180 0.5742 23.840 3.2385
DART F 1.4320 § 14.5800 §
DART G 1.1488 0.6227 3.4220 2.4600
DART H 4.5310 § 22.6600 §
DART I 1.3232 0.4890 7.8135 4.0821
DART 1 2.1329 1.4850 13.8113 9.0256
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 1.2083 0.8112 3.9340 1.8746
PD-1 mAb A IgG4 (P) 2.3470 1.2362 22.7770 15.0690
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 1.0879 0.3958 7.4153 3.0794
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.6733 0.5464 9.9543 6.6569
§來自單個實驗的結果
表16
分子 飽 和度結合LAG-3
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 0.8402 0.2231 4.4448 2.4770
DART B 1.0750 § 9.8580 §
DART D 0.8985 0.5326 5.7967 4.7329
DART E 0.9250 0.8075 5.6450 5.6809
DART F 5.0090 0.5770 19.3350 4.7447
DART G 0.9396 0.3045 8.5507 4.7448
DART H 2.3840 § 9.7810 4.2412
DART I 0.5321 0.0547 4.198 3.2188
DART 1 20.0233 2.1454 115.97 15.2425
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P) 1.0057 0.1969 5.1360 4.7904
LAG-3 mAb A IgG4 (P) 0.5968 0.1376 2.0833 0.3244
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 0.6069 0.3430 3.6373 2.4762
LAG-3 mAb A IgG1 (AA) 0.4523 0.1660 2.0187 0.7035
§來自單個實驗的結果
結合飽和度研究表明，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體保持與PD-1的結合，並且，其結合特徵與親本抗PD-1抗體的結合特徵類似。類似地，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體保持與LAG-3的結合，並且，除了DART 1以外，其結合特徵與親本抗LAG-3抗體的結合特徵類似。 實施例6 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子抑制研究
基本上如上所述檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗PD-1抗體：hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)、PD-1 mAb A IgG1 (AA)和PD-1 mAb A IgG4 (P)阻斷人PD-L1 (shPD-L1)和人PD-L2 (shPD-L2)結合在NSO細胞的表面上表達的PD-1的能力。以33.75-0.002 μM或107.5-0.0001μM(四倍連續稀釋)使用雙抗體和抗體。
測定IC50和IC90值並且呈現在 表 17中。提供了進行2個或更多個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表17
分子 阻斷PD-L1/PD-1 結合 阻斷PD-L2/PD-1 結合
IC50 (μM) IC90 (μM) IC50 (μM) IC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ SM SD σ SM SD σ
DART A 0.9645 0.1485 5.6312 1.5247 1.6273 0.4285 6.9335 3.9849
DART B 1.1515 0.0007 4.8615 0.2199 2.1150 0.3154 7.9550 0.0933
DART D 1.5548 0.1692 7.8950 2.5135 3.1255 0.5869 9.2973 5.5426
DART E 1.6533 0.3307 7.8470 1.1642 2.9460 0.7736 6.6135 0.0177
DART F 0.5697 0.1729 2.0360 0.1174 0.8389 0.0846 1.7995 0.2171
DART G 1.6013 0.3581 8.1953 1.5708 2.5540 0.7891 7.4810 0.2333
DART H 3.3950 0.1018 18.640 9.5742 6.2065 3.6847 29.395 3.8679
DART I 0.8363 0.1302 5.3115 0.3125 1.286 0.3125 6.2485 1.3951
DART 1 1.7467 0.3097 5.4533 1.0214 2.8355 1.8250 7.2735 3.9831
BSAB A 2.1590 0.3097 11.075 0.8132 4.8775 0.5438 15.580 1.3294
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.5186 0.1668 3.8050 1.2227 1.0425 0.2563 3.4880 0.5459
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.9209 0.3256 4.3023 0.7069 1.3859 0.3882 5.1675 0.2943
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1(AA) 0.7320 0.2337 3.2048 1.1479 0.9769 0.2893 2.8437 1.4801
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.0765 0.2393 5.2775 0.9933 1.9510 0.8814 5.0880 1.3831
配體結合抑制研究表明，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體保留抑制sPD-L1和sPD-L2結合細胞表面上PD-1的能力。
另外，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗LAG-3抗體：hLAG-3 mAb 1(1.4)IgG4 (P)，LAG-3 mAb AIgG4 (P)，hLAG-3 mAb 1(1.4)IgG1 (AA)和LAG-3 mAb AIgG1 (AA)阻斷人LAG-3結合Daudi細胞的表面上的天然II型MHC的能力。簡言之，混合每種PD-1 x LAG-3雙特異性分子和對照抗LAG-3抗體與生物素化的-可溶性人LAG-3-Fc融合蛋白(shLAG-3)(以0.5 µg/ml)，並且分別與MHC II陽性Daudi細胞(2.5x10 6細胞)孵育。使用綴合PE的鏈黴抗生物素二抗通過FACS分析測定與Daudi細胞的表面結合LAG-3的量。以27.5-0.026μM (兩倍連續稀釋)或107.5-0.0001μM (四倍連續稀釋)，或35-0.002 μM (四倍連續稀釋)使用雙抗體和抗體。
測定IC50和IC90值並且提供在 表 18中。提供進行了2個或更多個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表18
分子 阻斷shLAG-3/II 型MHC 結合
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 1.3835 1.6465 8.396102 8.3962
DART B 0.4081 0.1104 3.0645 0.3924
DART D 1.1843 1.1398 8.0041 7.3317
DART E 3.2706 2.9177 28.9683 24.1694
DART F 1.5347 1.2674 10.3920 11.2555
DART G 2.0618 3.3552 11.4422 12.4964
DART H 2.8967 4.9817 17.2533 21.1420
DART I 0.4864 0.1549 2.339 1.1780
DART 1 15.9610 14.0883 87.1486 109.533
BSAB A 0.7101 0.0571 7.2470 1.0706
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P) 0.4815 0.2176 3.4837 1.7564
LAG-3 mAb A IgG4 (P) 0.7011 0.1900 2.4232 0.3481
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 0.3637 0.1409 9.4422 7.9319
LAG-3 mAb A IgG1 (AA) 0.5923 0.3407 2.1451 1.1139
配體結合抑制研究表明，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體保留抑制shLAG-3-Fc融合蛋白結合細胞表面上II型 MHC的能力。除了DART 1之外，PD-1 x LAG-3雙特異性分子具有與親本抗LAG-3抗體類似的抑制特徵。 實施例7 通過 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子阻斷 PD-1/PD-L1 檢查點
基本上如上所述，在Jurkat-luc2-NFAT/CHO-PD-L1螢光素酶報告試驗(使用CHO/PD-L1細胞和MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat細胞)中檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗PD-1抗體：hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)，hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA)，PD-1 mAb A IgG1 (AA)和PD-1 mAb A IgG4 (P)對抗PD-1/PD-L1軸(即，阻斷PD-1/PD-L1相互作用和防止T-細胞應答的下調)的能力。以100-0.0065 μM (四倍連續稀釋)或100-0.0013 μM (五倍連續稀釋)使用雙抗體和抗體。
測定IC50和IC90值並且提供在 表 19 中。提供進行了2個或更多個單獨實驗的樣品平均值(SM)和標準差(SD σ)。
表19
分子 報告信號傳導
IC50 (μM) IC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 0.8804 0.1949 7.9115 1.3232
DART B 1.079 0.1535 7.5413 3.1483
DART D 1.4044 0.2584 12.0786 3.6616
DART E 1.4060 0.1222 13.7867 1.4981
DART F 0.3404 0.0103 1.8710 0.481
DART G 0.6914 0.0206 4.2090 0.7331
DART H 36.6167 20.8078 968.300 811.8471
DART I 1.3335 0.3641 12.146 6.8787
DART 1 11.8807 3.4905 1048.2000 1508.9992
BSAB A 9.7825 1.0288 113.3350 22.2951
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.6460 0.3035 6.0736 2.5513
PD-1 mAb A IgG4 (P) 1.328 0.7439 16.5138 9.7149
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1(AA) 0.5214 0.1541 4.7592 2.1044
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.4514 1.0049 35.7382 40.9858
報告信號傳導研究表明，大部分PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體保留抑制sPD-L1結合細胞表面上PD-1的能力。在該試驗中，四價PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體，DART A、DART B、DART D、DART-E、DART F、DART G和DART I是最強的抑制劑。在PD-L2報告試驗中檢測的這些雙特異性構建體中的若干構建體獲得了類似的結果。 實施例8 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子的功能活性
除非在說明的情況下，否則基本上如上所述，在再刺激時，在SEB-刺激的PBMC中檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能。
在初始研究中，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H；和抗PD-1和抗LAG抗體：PD-1 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb A IgG4 (P)，單獨地或組合地，通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能力。在這些試驗中，以3.125、12.5或50 nM的總濃度使用PD-1 x LAG-3雙特異性分子和抗體，並且用0.2 ng/mL的SEB刺激PBMC (之前的研究使用0.1 ng/mL)。對於這些研究，在使用抗體的組合的情況下，每種抗體以總濃度的一半(即，1.563、6.25或25 nM)被提供。 圖 16A和 16B分別顯示來自兩個代表性應答供體D：35644和D：59697的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特徵。
如所述的，並不是所有的供體對0.1或0.2 ng/mL的SEB應答。為了增強來自更多數量供體的PBMC的SEB刺激，在另外的研究中，以85 ng/mL的高濃度，或0.5 ng/mL的中等濃度使用SEB。在這些濃度，SEB刺激在更多的供體中更強，儘管仍可看到供體-供體之間的差異。
在一個這樣的研究中，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART B；抗PD-1抗體：hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)；抗LAG-3抗體：LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)；以及PD-1 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb A IgG4 (P)的組合通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能力。在這些試驗中，以0.019、0.078、0.3125、1.25、5或20 nM的濃度使用PD-1 x LAG-3雙特異性分子和抗體，並且用85 ng/mL的SEB刺激PBMC。對於使用抗體組合的該試驗，以指示的濃度提供每種抗體，因此總的抗體濃度是每種抗體使用的濃度的兩倍(即，0.038、0.156、0.625、2.5、10或40 nM)。 圖 17A和 17B分別顯示了來自兩個代表性供體D:55515和D:54024的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特徵。
在另一研究中，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART A、DART B、DART C；抗PD-1抗體：hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)；抗LAG-3抗體：LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)；和PD-1 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb A IgG4 (P)的組合通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放的能力。在這些試驗中，使用的PD-1 x LAG-3雙特異性分子和抗體的總濃度是0.048、0.195、0.78、3.125、12.5或50 nM，並且用0.5 ng/mL的SEB刺激PBMC。對於其中使用抗體組合的這些研究，以總濃度的一半提供每種抗體(即，0.024、0.098、0.39、1.563、6.25或25 nM)。 圖 18A和 18B分別顯示了來自兩個代表性供體D:20990和D:54947的SEB-刺激PBMC的IFNγ分泌特徵)。
在進一步的研究中，檢測細胞因數IL-2的釋放。具體而言，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART D、DART H；抗PD-1抗體：PD-1 mAb A IgG4 (P)，hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)；抗LAG-3抗體：LAG-3 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)；和PD-1 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb A IgG4 (P)，以及hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)和LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)的組合，通過檢查點抑制而增強IL-2釋放。在這些試驗中，使用的PD-1 x LAG-3雙特異性分子和抗體的總濃度是3.125、12.5或50 nM，並且用85 ng/mL的高濃度的SEB刺激PBMC。對於其中使用抗體組合的這些研究，以總濃度的一半提供每種抗體(即，1.563、6.25或25 nM)。 圖 19顯示了來自代表性供體(D:54024)的SEB-刺激的PBMC的IL-2分泌特徵。
在另外的研究中，檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子：DART B和DART I；抗PD-1抗體：PD-1 mAb A IgG4 (P)和hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)；抗LAG-3抗體：LAG-3 mAb A IgG4 (P)、hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)和hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (P)；以及PD-1 mAb A IgG4 (P)和LAG-3 mAb A IgG4 (P)、hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)和hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)、和hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)和hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (P)的組合，通過檢查點抑制而增強細胞因數釋放。在這些試驗中，使用的PD-1 x LAG-3雙特異性分子和抗體的濃度是0.0061、0.024、0.09、0.39、1.56、6.25或25 nM，並且用0.5 ng/mL的SEB刺激PBMC。對於其中使用抗體組合的這些研究，以指示的濃度提供每種抗體，因此總抗體濃度是每種抗體使用的濃度的兩倍(即，0.0122、0.048、0.18、0.78、3.12、12.5或50 nM)。 圖 20顯示了來自代表性供體D:56041)的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特徵。
使用破傷風毒素回憶試驗(Tetanus--toxoid recall assay)檢測PD-1 x LAG-3雙特異性分子DART I；抗PD-1抗體PD-1 mAb A IgG4和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb A IgG4 (P)的組合；和陰性對照抗體增強抗原特異性T細胞應答的能力。尤其地，在共培養試驗系統中，使用破傷風毒素作為回憶抗原測量細胞因數的抗原特異性增強分泌的應答。簡言之，使用陰性選擇分離試劑盒(Miltenyi Biotec, San Diego, CA和Invitrogen, Carlsbad, CA)從人外周血液分離CD4記憶T細胞(0.5-1.0 X10 5細胞/孔)，並且用來自相同供體的照射的單核細胞(0.01-0.05X10 5細胞/孔，3500 拉德(rads))在存在或沒有5 µg/mL回憶抗原破傷風毒素(TTd)和DART I、PD-1 mAb AIgG4 + LAG-3 mAb AIgG4(P)或同種型對照的稀釋(始於25nM)的情況下培養5-7天。在平行板中，在第5-7天，通過併入氚標記的胸苷測量增殖，並且使用ELISA (R&D systms, Minneapolis, MN)測量IL-2和IFNγ。 圖 21A-D顯示了來自兩個代表性供體(D50702和D54267)在第7天的IFNγ ( 圖 21A ， 21C)和IL-2 ( 圖 21B ， 21D)分泌特徵。
這些研究的結果表明，當再刺激時，PD-1 x LAG-3雙特異性分子顯著增強來自SEB-刺激的PBMC的IFNγ ( 圖 16A-16B 、 17A-17B 、 18A-18B、 20)和IL-2 ( 圖 19)產生。另外，PD-1 x LAG-3雙特異性分子顯著增強了來自用破傷風毒素刺激的CD4記憶T細胞的IFNγ產生( 圖 21A和 21C)。尤其地，四價PD-1 x LAG-3雙特異性分子提供了比抗PD-1抗體與抗LAG-3抗體組合更大的增強 。 實施例9 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子的藥物動力學
在食蟹猴中檢測代表性PD-1 x LAG-3雙特異性分子DART I和代表性抗PD-1抗體PD-1 mAb A的藥物動力學。簡言之，兩個食蟹猴(一個雄性和一個雌性)被輸注單劑量的DART I (5 mg/kg)或PD-1 mAb A (10 mg/kg)，並且使用夾心ELISA試驗監測分子隨著時間推移的血清濃度。簡言之，使maxisorb 96孔試驗板包被可溶性人PD-1 (shPD-1)，用牛血清白蛋白阻斷、洗滌並且用校準標準品、品質控制標準品和稀釋的血清樣品孵育。通過順序添加山羊抗人IgG Fc-生物素二抗和鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶(SA-HRP)，評估捕獲的DART I和PD-1 mAb A的量。使用TMB底物檢測HRP活性。通過酶標儀(SpectraMax M2e, Molecular Device, Sunnyvale, CA)分析所有的樣品，並且使用SoftMax Pro軟體(5.4版本, Molecular Device)將通過標準校準器產生的OD信號用於四-參數邏輯模型中。通過描述標準曲線的方程式，從樣品的OD信號資料的內推(interpolation)確定PD-1 mAb A或DART I的濃度。以 9.775 ng/mL評估對於該試驗的定量(LLOQ)的下限以。
圖 22顯示隨著時間推移的血清濃度，線表示被輸注DART I (實線，三角形)或PD-1 mAb A (虛線，圓圈)的雄性(填充符號)和雌性(開放符號)猴子的平均數。這些資料表明，PD-1 x LAG-3雙特異性分子在食蟹猴中的藥物動力學與抗PD-1抗體的藥物動力學相當。 實施例10 PD-1 抗體和 PD-1 x LAG-3 雙特異性分子的毒理學研究
在食蟹猴中，在非GLP (實驗室管理規範(good laboratory practice))給藥研究中，評估代表性抗PD1抗體hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)和代表性PD1 x LAG3雙特異性分子DART I的安全性特徵。
在該研究中，評估當通過多次靜脈內輸注而施用時，抗PD-1抗體(hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))的潛在毒性和毒性動力學。另外，也評估當通過單次靜脈內輸注時，PD-1 x LAG-3 DART分子(DART I)的潛在的毒性和藥物動力學。研究方案提供在 表 20中。
表20
組號 測試材料 劑量水準(mg/kg) 給藥天 劑量體積 劑量 (mg/mL) 動物的編號
雄性 雌性
1 對照 0 1、8、15 5 0 1 a 1 a
2A hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 1 1、8、15 5 0.2 1 a 1 a
2B hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 1 1、8、15 5 0.2 1 b 1 b
3A hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 100 1、8、15 5 20 1 a 1 a
3B hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 100 1、8、15 5 20 1 b 1 b
4 DART I 5 1 5 1 1 c 1 c
a組1、2A和3A 在第1天開始給藥並且在它們在第18天最後(第三次)給藥後72小時被屍體剖檢。 b組2B和3B在第1天開始給藥並且在它們在第22天最後(第三次)給藥後7天被屍體剖檢。 c組4 在第1天開始給藥，並且單劑量施用之後持續28天(至天29)；然後，式動物返回群體(colony)。
在該研究中評估下述參數和端點：臨床表現、體重、食物消耗、體溫、臨床病理學參數(血液學、凝聚和臨床化學)、生物分析和毒代動力學參數、抗藥物抗體分析、流式細胞術、細胞因數、肉眼屍檢發現、器官重量和組織病理學檢查。
所有的動物均存活，直到在第18或22天安排的安樂死，或在第29天從研究釋放。對於hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)，在臨床表現、食物消耗、體重、體溫、血液學、凝聚或臨床化學參數或肉眼屍檢發現方面沒有測試物相關(test-article related)的變化。在第18和22天，脾重量的增加和紅髓從輕度至中度的劑量依賴性淋巴組織細胞滲透物(lymphohistiocytic infiltrate)在接收1或100 mg/kg的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的動物中是明顯的。與周圍淋巴細胞相比，淋巴組織細胞具有灰白色細胞質和不規則細胞核。稀有的有絲分裂圖是明顯的。對於增加的脾重量，滲透物是顯微相關物。
被給予hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的動物的血清濃度-時間特徵顯示在該物種中針對抗體的預期的特徵(profile)，有很少的例外。對於1 mg/kg劑量組的兩個動物和100 mg/kg劑量組的兩個動物，第三劑量之後曲線的斜率比第一劑量之後更急劇地下降，表明在稍後的迴圈中可能出現抗藥物抗體(ADA)。分析顯示，在1 mg/kg組中2/4的動物發展了ADA和在100 mg/kg組中1/4的動物發展了ADA。
總之，以1和100 mg/kg的水準，通過靜脈內輸注，每週一次，持續3周(第1、8和15天)，hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的施用在食蟹猴中是良好耐受的。在1和100 mg/kg hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)中存在脾紅髓的輕度至中度劑量依賴性淋巴組織細胞滲透物。
對於DART I，在臨床表現、食物消耗、體重、體溫、血液學或凝聚參數方面沒有測試物相關的變化。在臨床化學參數方面的DART I相關的變化包括在第2天，天冬氨酸轉氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)的非損害、暫態升高。平均AST變化是媒介處理的對照動物的3.2x和預研究(prestudy)水準的7.8x，其中水準高於對照參考範圍2。平均LDH變化是媒介處理的對照動物的2.5x和預研究水準的6.9x。在第8天，兩個參數都回到基線水準附近。總之，在5 mg/kg的水準，通過靜脈內輸注，DART-I的單施用在食蟹猴中良好耐受。 實施例11 用抗 PD-1 抗體的單劑量 PK 研究
用選擇的毒理學端點在食蟹猴中進行單劑量PK研究。在該研究中，比較hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)與兩個其他抗PD1 IgG4 (P), κ mAbs：PD-1 mAb A IgG4 (P)和PD-1 mAb B IgG4 (P)。將每種抗體以10 mg/kg通過1-小時靜脈內輸注施用至2只猴子(1M，1F)中，並且監測動物65天。
沒有與施用hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)或PD-1 mAb A IgG4 (P)相關的體重、食物消耗、細胞因數或免疫表型方面的測試物相關的臨床表現變化。資料與PD-1 mAb B IgG4 (P)的類似，除了在PD-1 mAb B IgG4 (P)施用之後觀察到IL-5的升高之外。
對於從用hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)、PD-1 mAb A IgG4 (P)或PD-1 mAb B IgG4 (P)處理的食蟹猴收集的全時間段(full time course)的血液樣品在沒有(PBS對照)或存在過量競爭劑(未標記的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))的情況下，通過流式細胞術使用競爭方法測定抗PD-1抗體與T細胞表面上的PD-1的結合，其中結合T細胞的螢光標記的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的平均螢光強度(MFI)。如 圖 23A-23C中顯示，與PD-1 mAb A IgG4 (P) (PD-1結合保持在≥ 80%，達21天或更少) ( 圖 23B)相比，hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)和PD-1 mAb B IgG4 (P)表現出與CD4+和CD8+ T細胞表面上的PD-1的延長的結合(PD-1結合保持在≥ 80%，達28天或更多) (分別為 圖 23A和 23C)。對於每種抗PD-1抗體，將T-細胞PD-1結合資料與它們的血清濃度相關聯。 實施例12 重複劑量毒理學研究
為了評估本發明治療分子的安全性、毒代動力學和藥效特徵，將示例性分子(hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))施用至食蟹猴並且進行GLP (實驗室管理規範)給藥研究。在該研究中，通過以3劑量水準輸注，用hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)或對照物處理四組動物(每組10只，5只雄性，和5只雌性)，每週一次。在4-周藥物給藥期間，隨後在另外的10-周無藥物期間進行監測，評估動物的任何潛在毒性。該研究的實驗方案提供在 表 21中。在研究的第1、8、15和22天，使用校準輸注泵經一小時靜脈內輸注向動物給藥，每週一次。在第25天，處死來自每個組的一隻雄性和一隻雌性，在研究的第95天處死剩餘的動物。評估hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)施用對迴圈中白細胞亞群的作用，包括T-淋巴細胞上PD-1受體的佔據。另外，測定抗藥物抗體(ADA)特徵。
表 21
組號 測試材料 a 劑量水準 (mg/kg) 劑量體積 (mL/kg) 劑量 (mg/mL) 動物的編號 b
主要研究 恢復研究
M F M F
1 對照 0 5.88 0 3 3 2 2
2 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 10 5.88 1.7 3 3 2 2
3 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 40 5.88 6.8 3 3 2 2
4 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 150 5.88 25.5 3 3 2 2
a經靜脈內輸注每週施用一次對照和hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) b每組六隻猴子(3M/3F)在第25天被屍體剖檢，而剩餘的恢復組猴子(2M/2F)在第95天被屍體剖檢
以0、10、40和150 mg/kg每週一次向食蟹猴靜脈內(IV)輸注hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)是良好耐受的，並且所有的動物均存活，直到它們被安排在第25或95天的安樂死。在臨床表現、食物消耗、體重、身體檢查、眼科和神經科學檢查，心電學、體溫、呼吸速度、血壓和心率、凝聚、臨床化學和尿分析參數、器官重量或肉眼屍檢發現方面，沒有hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)相關的變化。
血液學參數的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)相關的變化包括淋巴細胞滴度(lymphocyte titer)的暫態下降。在≥ 10 mg/kg的雄性和雌性中，在第2天(輸注後23小時)，與預研究(給藥前(predose)1天)相比，淋巴細胞滴度適度降低，對於10和40 mg/kg的雄性和40和150 mg/kg的雌性與對照相比是統計學上顯著的。在給藥前第8天，淋巴細胞滴度返回到接近預研究水準，但是在第9天(輸注後23小時)，對於在所有劑量水準(0.47x至0.68x預研究)的一些個體雄性和雌性，其輕微降低。在第15和22天給藥之前，淋巴細胞滴度增加，但是在第16和23天(輸注後23小時)，對於一些個體雄性和雌性(0.36x至0.54x預研究)，其降低。
與對照組相比，在hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)處理的動物中，在輸注結束後23小時，觀察到迴圈免疫細胞群體，包括總的白細胞、T細胞、B細胞和NK細胞，的非劑量依賴性、暫態下降。在第1天第一劑量施用之後觀察到改變的最大量級；在第8、15或22天的隨後劑量之後瞬間觀察到較小量級的改變。在EOI後72小時和整個恢復階段，免疫細胞群體一般恢復至基線值或接近基線值。與對照組相比，在hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)處理的動物中，沒有觀察到迴圈單核細胞的變化。
在所有測試劑量(10、40或150 mg/kg)的研究的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)處理期間，觀察到與PD-1+/CD4+和PD‑1+/CD8+細胞的最大hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)結合。在恢復過程中，未發展抗藥物抗體(ADA)應答的動物中，血清hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)濃度保持高於29 μg/mL，並且在整個10-周恢復期間，保持與PD-1+/CD4+和PD-1+/CD8+ T細胞的最大hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)結合。在這些動物中，沒有PD-1對T細胞進行調節的證據。在發展了ADA應答的恢復動物中，MGD012結合的PD-1+ T細胞的頻率下降至基線水準。當表觀(apparent)血清hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)濃度下降低於約25 μg/mL時，通常出現ADA陽性動物的PD‑1+/CD4+和PD-1+/CD8+細胞上的最大hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)結合的下降。但是，不清楚該表觀閾值關係是否適用於ADA陰性動物，因為在ADA陽性動物中ADA的存在可有助於阻斷PD-1抗體與PD-1的結合。
在hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的藥物代謝動力學應答中存在最小的性別相關的差異，其在評估的劑量範圍內是線性的(10至150 mg/kg)。對於10、40和150 mg/kg的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)，性別組合的平均C max分別是240 μg/mL (0.240 mg/mL)、1078 μg/mL (1.08 mg/mL)和3938 μg/mL (3.94 mg/mL)，並且AUC是47310 h•μg/mL (47.3 h•mg/mL)、205723 h•μg/mL (206 h•mg/mL)和745681 h•μg/mL (746 h•mg/mL)。在出現ADA之前，通過第一迴圈的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的非房室模型分析(NCA)的平均清除(mean clearance)是0.21 mL/h/kg，大大低於如針對大分子量蛋白質可預期的食蟹猴的腎小球濾過率。通過第一迴圈的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的NCA的分佈的平均穩態體積是68 mL/kg，接近血清體積的1.5倍，但是小於細胞外水空間。這提示，hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)從血管腔隙溢出進入組織細胞外空間，但是，並不是所有的細胞外空間對於該分子都是可到達的。通過第一迴圈的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的NCA的平均停留時間(MRT)的平均值是335小時或約14天。在第2至4迴圈中，ADA的出現降低了hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的濃度。在10、40和150 mg/kg劑量組中，在重複劑量的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)之後，分別在7/10、4/10和3/10動物中觀察到降低的hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)血清濃度的證據。在10、40和150 mg/kg劑量組中，分別在這些動物的4個、2個和1個中確認了抗hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)的ADA的存在；其中ADA未被確認的的所有動物處於最終的屍體剖檢組中，在此期間，hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)血清濃度可能干擾檢測ADA的能力。因此，在隨後的TK分析中，當波谷濃度小於之前的波谷濃度時，核實自該時間以來的資料。根據3個劑量組的所有迴圈的資料的二室模型，排除受ADA影響的點，二室模型的主要TK參數的平均值對於清除是0.22 mL/h/kg，對於分佈的初始體積(V 1)是38.5 mL/kg，和對於V 2是33.8 mL/kg，其產生的分佈的平均穩態體積(V ss)是72.3 mL/kg，和MRT是329小時。這些值與從第一劑量的NCA獲得的參數一致。在沒有ADA的情況下，類比預測，在每週給藥的情況下，第5次給藥之後將在食蟹猴中實現穩態，並且積累指數將是2.4。
在第25天，在≥ 40 mg/kg的雄性和≥ 10 mg/kg的雌性中，在IV注射位點的淺層真皮中出現hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)相關的最小多灶血管周圍單核細胞滲透物，其是對重複注射外源蛋白(單克隆抗體)的預期的反應。在第95天，沒有注意到hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)相關的顯微鏡變化，指示在第25天出現的測試物相關的變化的恢復。
總之，該研究的結果指示，在食蟹猴中以10、40或150 mg/kg的水準每週一次(第1、8、15和22天)經靜脈內輸注施用hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)在臨床上是良好耐受的。觀察到的作用限於迴圈淋巴細胞的暫態下降和與注射外源蛋白相關的最小的注射位點變化。基於這些結果，認為沒有觀察到的不利作用水準(NOAEL)是150 mg/kg (性別組合的平均C max是3.94 mg/mL和AUC是746 h•mg/mL)。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
無
[ 圖 1]提供了包括兩條多肽鏈的、具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體的示意圖，每條鏈各具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體促進結構域(促進異源二聚體的結構域)。半胱氨酸殘基可存在於連接體和/或異源二聚體促進結構域中，如 圖 3B中所顯示。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
[ 圖 2]提供了包括兩條多肽鏈的、具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，每條鏈各具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成所有或部分Fc區域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
[ 圖 3A-3C]提供了顯示包括兩對多肽鏈(即，總共四條多肽鏈)的、具有四個表位結合位點的代表性四價雙抗體的示意圖。每對的一條多肽各具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成所有或部分Fc區域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。兩對多肽鏈可以相同。在其中VL和VH結構域識別不同的表位元的這樣的實施方式中(如 圖 3A-3C中顯示)，所得分子具有四個表位結合位點，並且就每個結合的表位而言是雙特異性的和二價的。在其中VL和VH結構域識別相同的表位元的這樣的實施方式中(例如，相同的VL結構域CDR和相同的VH結構域CDR用在兩條鏈上)，所得分子具有四個表位結合位點，並且就單個表位而言是單特異性的和四價的。可選地，兩對多肽可以不同。在其中每對多肽識的VL和VH結構域別不同的表位元的這類實施方式中(如 圖 3A-3C中顯示)，所得分子具有四個表位結合位點，並且就每個結合的表位而言是四特異性的和單價的。 圖 3A顯示了Fc雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基的肽異源二聚體促進結構域。 圖 3B顯示了包含Fc區域的雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基和連接體(具有任選的半胱氨酸殘基)的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體促進結構域。 圖 3C顯示了包含Fc區域的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。
[圖4A]和[圖4B]提供了包括三條多肽鏈的、具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖。多肽鏈中的兩條各具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成所有或部分Fc區域。包括VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
[圖5]提供了包括五條多肽鏈的、具有四個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖。多肽鏈中的兩條各具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成包括所有或部分Fc區域的Fc區域。包括連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
[圖6A-6F]提供了包含Fc區域的代表性三價結合分子的示意圖，所述三價結合分子具有三個表位結合位點。圖6A和6B分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包括具有不同結構域取向的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域，其中雙抗體型結合結構域在Fc區域的N-末端或C-末端。圖6A和6B中的分子包括四條鏈。圖6C和6D分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包括在Fc區域的N-末端的兩個雙抗體型結合結構域，和其中輕鏈和重鏈經多肽間隔體連接的Fab型結合結構域，或scFv型結合結構域。圖6E和6F中的三價結合分子分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包括在Fc區域的C-末端的兩個雙抗體型結合結構域，和連接的Fab型結合結構域，或scFv型結合結構域，其中雙抗體型結合結構域是。圖6C-6F中的三價結合分子包括三條鏈。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
[圖7A-7D]顯示，抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15結合人PD-1。與shPD-1-His結合的結合曲線顯示在圖7A(PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 4和PD-1 mAb 9)，圖7B(PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6和PD-1 mAb 7)，和圖7C(PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14和PD-1 mAb 15)中。與shPD-1-人Fc結合的結合曲線顯示在圖7D(PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14，和PD-1 mAb 15)中。
[圖8A-8C]顯示，抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15結合食蟹猴PD-1。與scynoPD-1-hFc結合的結合曲線顯示在圖8A(PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7)，圖8B(PD-1 mAb 9)，和圖8C(PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14和PD-1 mAb 15)中。
[圖9A-9D]顯示了抗PD-1抗體PD-1 mAb 1-15阻斷人PD-L1與人PD-1結合的能力。抑制曲線顯示在圖9A(PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 15和PD-1 mAb A)，圖9B(PD-1 mAb 4)，圖9C(PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7和PD-1 mAb A)，和圖9D(PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 8、PD-1 mAb 10、PD-1 mAb 11、PD-1 mAb 12、PD-1 mAb 13、PD-1 mAb 14、PD-1 mAb 15和PD-1 mAb A)中。
[圖10A-10B]顯示抗人PD-1抗體PD-1 mAb 7的組織特異性。圖10A顯示了正常結腸(圖i和vii)、肝(圖ii和viii)、肺(圖iii和ix)、胰腺(圖iv和x)、腎(圖v和xi)和心臟(圖vi和xii)組織的組織學染色。圖10A，圖i-vi顯示了用標記的PD-1 mAb 7 (0.313 μg/mL)孵育的組織的結果。圖10A，圖vii-xii顯示了用標記的同種型對照mAb (0.314 μg/mL)孵育的組織的結果。圖10B顯示了皮膚(圖i和iv)、扁桃體(圖ii和v)和表達PD-1的NSO細胞(圖iii和vi)的組織學染色。圖10B，圖i-iii顯示了用標記的PD-1 mAb 7 (0.313 μg/mL)孵育的組織的結果。
[圖11]顯示了具有用於結合細胞表面PD-1的IgG1 (AA)或IgG4 (P)的人源化抗人PD-1抗體hPD-1 mAb 2、hPD-1 mAb 7(1.1)、hPD-1 mAb 7(1.2)、hPD-1 mAb 9(1.1)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B的結合特徵。
[圖12A-12B]顯示了具有IgG1 (AA)或IgG4 (P)的人源化抗PD抗體hPD-1 mAb 2、hPD-1 mAb 7(1.1)、hPD-1 mAb 7(1.2)、hPD-1 mAb 9(1.1)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B阻斷可溶性人PD-L1 (圖12A)和可溶性人PD-L2 (圖12B)結合細胞表面人PD-1的能力。
[圖13]顯示了具有IgG1 (AA)或IgG4 (P)的人源化抗PD抗體hPD-1 mAb 2、hPD-1 mAb 7(1.1)、hPD-1 mAb 7(1.2)、hPD-1 mAb 9(1.1)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B在Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1螢光素酶報告試驗中，通過阻斷PD-1/PD-L1相互作用和防止下調T-細胞應答而對抗PD-1/PD-L1軸的能力。
[圖14]顯示，PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15能夠刺激細胞因數產生，達到與參考抗PD-1抗體(PD-1 mAb A和PD-1 mAb B)相當或比其更高的水準，並且用PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 9和PD-1 mAb 15聯合LAG-3 mAb 1的治療提供了細胞因數釋放的最大增強。IFNγ分泌特徵來自用抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理和聯合處理的葡萄球菌屬(Staphylococcal)腸毒素B (SEB)-刺激的PBMC。
[圖15A-15B]顯示，具有IgG1 (AA)或IgG4 (P)的人源化抗PD抗體hPD-1 mAb 2、hPD-1 mAb 7(1.2)、hPD-1 mAb 9(1.1)和參考抗PD-1抗體PD-1 mAb A和PD-1 mAb B刺激細胞因數產生的能力。IFNγ (圖15A)和TNFα (圖15B)，來自用抗PD-1抗體處理的SEB-刺激的PBMC的分泌特徵。
[圖16A-16B]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART A、DART D、DART E、DART F、DART G和DART H，能夠刺激細胞因數產生，達到與施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)的組合時觀察到的水準相當的或比其更高的水準，和PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART A、DART D、DART E、DART F和DART G提供了細胞因數釋放的最大增強。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體，或通過抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理和聯合處理的低濃度的SEB (0.2 ng/mL)刺激的PBMC的IFNγ分泌特徵繪圖。使用來自兩個代表性供體的PBMC的結果顯示在圖16A和圖16B中。
[圖17A-17B]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART A、DART B和DART C能夠刺激細胞因數產生，達到比施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)的組合時觀察到的水準更高的水準。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體，或通過抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理和聯合處理的高濃度的SEB (85 ng/mL)刺激的、來自兩個代表性供體的PBMC的IFNγ分泌特徵繪圖。使用來自兩個代表性供體的PBMC的結果顯示在圖17A和圖17B中。
[圖18A-18B]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART A、DART B和DART C能夠刺激細胞因數產生，達到比施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)的組合時觀察到的水準更高的水準。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體，或通過抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理和聯合處理的中濃度的SEB (0.5 ng/mL)刺激的、來自兩個代表性供體的PBMC的IFNγ分泌特徵繪圖。使用來自兩個代表性供體的PBMC的結果顯示在圖18A和圖18B中。
[圖19]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART D和DART H能夠刺激細胞因數產生，達到與施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)的組合時所觀察到的水準相當的或比其更高的水準，並且DART D提供細胞因數釋放的最大增強。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體，或通過抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理或聯合處理的高濃度的SEB (85 ng/mL)刺激的、來自代表性供體的PBMC的IL-2分泌特徵繪圖。
[圖20]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體構建體DART B和DART I能夠刺激細胞因數產生，達到比施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A、hPD-1 mAb 7(1.2) + hLAG-3 mAb 1(1.4)、hPD-1 mAb 7(1.2) + hLAG-3 mAb 6(1.1))的組合時觀察到的水準更高的水準。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體，或通過抗PD-1和抗LAG-3抗體單獨處理或聯合處理的中等濃度的SEB (0.5 ng/mL)刺激的、來自代表性供體的PBMC的IFNγ分泌特徵繪圖。
[圖21A-21D]顯示，PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體DART I能夠刺激細胞因數產生，達到比施用抗PD-1 mAb +抗LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)的組合時所觀察到的水準更高的水準。將用通過PD-1 x LAG-3雙特異性雙抗體DART-I、抗PD-1和抗LAG-3抗體聯合處理，或通過同種型對照處理的破傷風毒素(5 μg/mL)刺激的、來自兩個代表性供體的CD4記憶細胞的IFNγ (圖21A和21C)和IL-2 (圖21B和21D)分泌特徵繪圖。在第7天，使用來自兩個代表性供體的CD4記憶T細胞的結果顯示在圖21A-B和圖21C-D中。
[圖22]顯示食蟹猴中PD-1 x LAG-3雙特異性分子DART I的藥物動力學與抗PD-1抗體PD-1 mAb A IgG4 (P)的藥物動力學相當。線指示DART I (實線)和PD-1 mAb A (虛線)的平均血清濃度。將雄性(實心)和雌性(空心)猴子針對DART I (三角形)和PD-1 mAb A (圓形)的單個值繪圖。
[圖23A-23C]顯示，在用不同的抗PD‑1抗體處理之後，隨著時間的推移，動物中的血清抗體濃度和CD4+或CD8+ T細胞的表面上結合的PD-1的百分數。將抗PD 1 mAb治療之後CD4+或CD8+ T細胞的表面上結合的PD 1的百分數繪製在右側y軸上；符號表示每個動物個體的T細胞上結合的PD 1的%並且虛線表示平均值。血清mAb濃度繪製在左側y軸上；符號表示每個動物個體的血清水準並且實線表示資料的非線性擬合。每個圖表示在第1天通過IV輸注而施用10 mg/kg hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) (圖23A)、PD-1 mAb A IgG4 (P) (圖23B)或PD-1 mAb B IgG4 (P) (圖23B)的動物(n = 1/性別/組)的數據。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133
Figure 12_A0101_SEQ_0134
Figure 12_A0101_SEQ_0135
Figure 12_A0101_SEQ_0136
Figure 12_A0101_SEQ_0137
Figure 12_A0101_SEQ_0138
Figure 12_A0101_SEQ_0139
Figure 12_A0101_SEQ_0140
Figure 12_A0101_SEQ_0141
Figure 12_A0101_SEQ_0142
Figure 12_A0101_SEQ_0143
Figure 12_A0101_SEQ_0144
Figure 12_A0101_SEQ_0145
Figure 12_A0101_SEQ_0146
Figure 12_A0101_SEQ_0147
Figure 12_A0101_SEQ_0148
Figure 12_A0101_SEQ_0149
Figure 12_A0101_SEQ_0150
Figure 12_A0101_SEQ_0151
Figure 12_A0101_SEQ_0152
Figure 12_A0101_SEQ_0153
Figure 12_A0101_SEQ_0154
Figure 12_A0101_SEQ_0155
Figure 12_A0101_SEQ_0156
Figure 12_A0101_SEQ_0157
Figure 12_A0101_SEQ_0158
Figure 12_A0101_SEQ_0159
Figure 12_A0101_SEQ_0160
Figure 12_A0101_SEQ_0161
Figure 12_A0101_SEQ_0162
Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164
Figure 12_A0101_SEQ_0165
Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167
Figure 12_A0101_SEQ_0168
Figure 12_A0101_SEQ_0169
Figure 12_A0101_SEQ_0170
Figure 12_A0101_SEQ_0171
Figure 12_A0101_SEQ_0172
Figure 12_A0101_SEQ_0173
Figure 12_A0101_SEQ_0174
Figure 12_A0101_SEQ_0175
Figure 12_A0101_SEQ_0176
Figure 12_A0101_SEQ_0177
Figure 12_A0101_SEQ_0178
Figure 12_A0101_SEQ_0179
Figure 12_A0101_SEQ_0180
Figure 12_A0101_SEQ_0181
Figure 12_A0101_SEQ_0182
Figure 12_A0101_SEQ_0183
Figure 12_A0101_SEQ_0184
Figure 12_A0101_SEQ_0185
Figure 12_A0101_SEQ_0186
Figure 12_A0101_SEQ_0187
Figure 12_A0101_SEQ_0188
Figure 12_A0101_SEQ_0189
Figure 12_A0101_SEQ_0190
Figure 12_A0101_SEQ_0191
Figure 12_A0101_SEQ_0192
Figure 12_A0101_SEQ_0193
Figure 12_A0101_SEQ_0194
Figure 12_A0101_SEQ_0195
Figure 12_A0101_SEQ_0196
Figure 12_A0101_SEQ_0197
Figure 12_A0101_SEQ_0198
Figure 12_A0101_SEQ_0199
Figure 12_A0101_SEQ_0200
Figure 12_A0101_SEQ_0201
Figure 12_A0101_SEQ_0202
Figure 12_A0101_SEQ_0203
Figure 12_A0101_SEQ_0204
Figure 12_A0101_SEQ_0205
Figure 12_A0101_SEQ_0206
Figure 12_A0101_SEQ_0207
Figure 12_A0101_SEQ_0208
Figure 12_A0101_SEQ_0209
Figure 12_A0101_SEQ_0210
Figure 12_A0101_SEQ_0211
Figure 12_A0101_SEQ_0212
Figure 12_A0101_SEQ_0213
Figure 12_A0101_SEQ_0214
Figure 12_A0101_SEQ_0215
Figure 12_A0101_SEQ_0216
Figure 12_A0101_SEQ_0217
Figure 12_A0101_SEQ_0218
Figure 12_A0101_SEQ_0219
Figure 12_A0101_SEQ_0220
Figure 12_A0101_SEQ_0221
Figure 12_A0101_SEQ_0222
Figure 12_A0101_SEQ_0223
Figure 12_A0101_SEQ_0224
Figure 12_A0101_SEQ_0225
Figure 12_A0101_SEQ_0226
Figure 12_A0101_SEQ_0227
Figure 12_A0101_SEQ_0228
Figure 12_A0101_SEQ_0229
Figure 12_A0101_SEQ_0230
Figure 12_A0101_SEQ_0231
Figure 12_A0101_SEQ_0232
Figure 12_A0101_SEQ_0233
Figure 12_A0101_SEQ_0234
Figure 12_A0101_SEQ_0235
Figure 12_A0101_SEQ_0236
Figure 12_A0101_SEQ_0237
Figure 12_A0101_SEQ_0238
Figure 12_A0101_SEQ_0239
Figure 12_A0101_SEQ_0240
Figure 12_A0101_SEQ_0241
Figure 12_A0101_SEQ_0242
Figure 12_A0101_SEQ_0243
Figure 12_A0101_SEQ_0244
Figure 12_A0101_SEQ_0245
Figure 12_A0101_SEQ_0246
Figure 12_A0101_SEQ_0247
Figure 12_A0101_SEQ_0248
Figure 12_A0101_SEQ_0249

Claims (27)

  1. 一種組合，其包括： (i) 多特異性抗人PD-1結合分子，其包括PD-1結合結構域和能夠結合第二表位元的結合結構域，和 (ii) 有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子， 其中抗人PD-1結合結構域包括可變重鏈結構域和可變輕鏈結構域，其中： 所述可變重鏈結構域包括氨基酸序列SEQ ID NO:147，和所述可變輕鏈結構域包括氨基酸序列SEQ ID NO:153，其中所述組合用於刺激需要其的受試者的T-細胞介導的免疫應答。
  2. 一種組合，其包括： (i) 多特異性抗人PD-1結合分子，其包括PD-1結合結構域和能夠結合第二表位元的結合結構域，和 (ii) 特異性結合癌症抗原的一種或多種另外的分子和/或化療劑，其中抗人PD-1結合單特異性單克隆抗體包括可變重鏈結構域和可變輕鏈結構域，其中： 所述可變重鏈結構域包括氨基酸序列SEQ ID NO:147，和所述可變輕鏈結構域包括氨基酸序列SEQ ID NO:153，其中所述組合用於治療癌症。
  3. 如請求項1或2所述的組合，其中分子是雙特異性結合分子，能夠同時結合人PD-1和第二表位元。
  4. 如請求項3所述的組合，其中第二表位元是參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位元。
  5. 如請求項3所述的組合，其中第二表位元是下述的表位元：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA。
  6. 如請求項3所述的組合，其中第二表位元是下述的表位元：CD137、CTLA-4、LAG-3、OX40、TIGIT或TIM-3。
  7. 如請求項3所述的組合，其中第二表位元是LAG-3的表位元。
  8. 如請求項7所述的組合，其中能夠結合LAG-3的結合結構域包括： (A)     (1)  LAG-3 mAb1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:42 、 SEQ ID NO:43和 SEQ ID NO:44；和 (2)  LAG-3 mAb 1的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:46 、 SEQ ID NO:47和 SEQ ID NO:48；或 (B)     (1)  hLAG-3 mAb 1 VH1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:42 、 SEQ ID NO:43和 SEQ ID NO:44；和 (2)  hLAG-3 mAb 1 VL4的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:55 、 SEQ ID NO:47和 SEQ ID NO:48；或 (C)     (1)  LAG-3 mAb 6的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:57 、 SEQ ID NO:58和 SEQ ID NO:59；和 (2)  LAG-3 mAb 6的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:61 、 SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63；或 (D)     (1)  hLAG-3 mAb 6 VH1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:57 、 SEQ ID NO:58和 SEQ ID NO:59；和 (2)  LAG-3 mAb 6的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:298 、 SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63。
  9. 如請求項7所述的組合，其中能夠結合LAG-3的結合結構域包括： (1)  hLAG-3 mAb 6 VH1的可變重鏈的CDR H1結構域、CDR H2結構域和CDR H3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:57 、 SEQ ID NO:58和 SEQ ID NO:59；和 (2)  LAG-3 mAb 6 VL1/VL2的可變輕鏈的CDR L1結構域、CDR L2結構域和CDR L3結構域，並且分別包括下述氨基酸序列： SEQ ID NO:298 、 SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63。
  10. 如請求項7所述的組合，其中能夠結合LAG-3的結合結構域包括： (1)     根據 SEQ ID NO:294的hLAG-3 mAb 6 VH1的可變重鏈和 (2)     根據 SEQ ID NO:296的hLAG-3 mAb 6 VL1的可變輕鏈。
  11. 如請求項1所述的組合，其中分子是： (A) 雙抗體，所述雙抗體是共價結合的複合物，其包括兩條、三條、四條或五條多肽鏈； 或 (B) 三價結合分子，所述三價結合分子是共價結合的複合物，其包括三條、四條或五條多肽鏈。
  12. 如請求項11所述的組合，其中分子是雙抗體。
  13. 如請求項1所述的組合，其中分子包括Fc區域。
  14. 如請求項13所述的組合，其中Fc區域具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。
  15. 如請求項13所述的組合，其中分子進一步包括鉸鏈結構域。
  16. 如請求項15所述的組合，其中： (a) Fc區域和鉸鏈結構域具有IgG4同種型，並且 (b) 鉸鏈結構域包括穩定化突變。
  17. 如請求項13所述的組合，其中Fc區域是變異的Fc區域，其包含： (a)  降低變異的Fc區域對FcγR的親和力的一種或多種氨基酸修飾；和/或 (b)  延長變異的Fc區域的血清半衰期的一種或多種氨基酸修飾。
  18. 如請求項17所述的組合，其中降低變異的Fc區域對FcγR的親和力的修飾包括下述取代：L234A；L235A；或L234A和L235A，其中編號是如Kabat中EU索引的編號。
  19. 如請求項17所述的組合，其中延長變異的Fc區域的血清半衰期的修飾包括下述取代：M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K，其中編號是如Kabat中EU索引的編號。
  20. 如請求項12所述的組合，其中分子是雙抗體，其包括： (a) SEQ ID NO:267，其中X 1是Ala；X 2是Tyr；X 3是Thr；X 4是Glu，和 SEQ ID NO:268；或 (b) SEQ ID NO:267，其中X 1是Gly；X 2是Tyr；X 3是Thr；X 4是Glu，和 SEQ ID NO:268；或 (c) SEQ ID NO:267，其中X 1是Gly；X 2是Met；X 3是Ser；X 4是Thr，和 SEQ ID NO:268；或 (d) SEQ ID NO:269 和 270；或 (e) SEQ ID NO:271 和 272；或 (f) SEQ ID NO:273 、 274 、 275 和 276；或 (g) SEQ ID NO:277 、 278 、 279 和 280；或 (h) SEQ ID NO:281 、 282 和 283；或 (i) SEQ ID NO:290 和 291；或 (j) SEQ ID NO:292 和 293。
  21. 如請求項20所述的組合，其中分子是包括 SEQ ID NO:290 和 291的雙抗體。
  22. 一種組合物，其包括： (A)    如請求項1-21中任一項所述的組合；和 (B)     藥學上可接受的載體。
  23. 如請求項22所述的組合物，其中分子、抗體或組合物用於刺激需要其的受試者的T-細胞介導的免疫應答。
  24. 如請求項22所述的組合物，其中分子、抗體或組合物用於治療與受抑制的免疫系統相關的疾病或病況。
  25. 如請求項24所述的組合物，其中疾病或病況是癌症或感染。
  26. 如請求項25所述的組合物，其中癌症選自由下述組成的組：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症或子宮癌。
  27. 如請求項25所述的組合物，其中癌症是結直腸癌；肝細胞癌；神經膠質瘤；腎癌；乳腺癌；多發性骨髓瘤；膀胱癌；成神經細胞瘤；肉瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小細胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；直腸癌；急性髓細胞樣白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；毛細胞白血病(HCL)；急性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)；霍奇金淋巴瘤；系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
TW113102094A 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法 TW202417048A (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562198867P 2015-07-30 2015-07-30
US62/198,867 2015-07-30
US201562239559P 2015-10-09 2015-10-09
US62/239,559 2015-10-09
US201562255140P 2015-11-13 2015-11-13
US62/255,140 2015-11-13
US201662322974P 2016-04-15 2016-04-15
US62/322,974 2016-04-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202417048A true TW202417048A (zh) 2024-05-01

Family

ID=57884977

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111110951A TWI833183B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法
TW113102094A TW202417048A (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法
TW105123965A TWI691509B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Ｐｄ-１結合分子和其使用方法
TW109107547A TWI762879B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111110951A TWI833183B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105123965A TWI691509B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Ｐｄ-１結合分子和其使用方法
TW109107547A TWI762879B (zh) 2015-07-30 2016-07-28 Pd-1結合分子和其使用方法

Country Status (39)

Country Link
US (3) US10577422B2 (zh)
EP (4) EP3456346B1 (zh)
JP (4) JP6959907B2 (zh)
KR (2) KR20180034588A (zh)
CN (4) CN107847574B (zh)
AU (4) AU2016298227B9 (zh)
CA (1) CA2993948A1 (zh)
CL (1) CL2018000254A1 (zh)
CO (1) CO2018000867A2 (zh)
CR (3) CR20220194A (zh)
CY (2) CY1124634T1 (zh)
DK (3) DK3456346T3 (zh)
EA (1) EA201890296A1 (zh)
EC (1) ECSP18006831A (zh)
ES (2) ES2898958T3 (zh)
FI (2) FI3981792T3 (zh)
FR (1) FR24C1033I1 (zh)
GE (3) GEP20237538B (zh)
HK (1) HK1248106A1 (zh)
HR (2) HRP20211645T1 (zh)
HU (3) HUE055207T2 (zh)
IL (4) IL287916B2 (zh)
JO (2) JO3736B1 (zh)
LT (2) LT3328419T (zh)
MA (1) MA42542B1 (zh)
MD (2) MD3456346T2 (zh)
MX (3) MX2018001227A (zh)
NL (1) NL301287I2 (zh)
PE (3) PE20181151A1 (zh)
PH (1) PH12018500232A1 (zh)
PL (2) PL3328419T3 (zh)
PT (2) PT3328419T (zh)
RS (2) RS62568B1 (zh)
SG (2) SG10202010506TA (zh)
SI (2) SI3456346T1 (zh)
TW (4) TWI833183B (zh)
UA (1) UA127372C2 (zh)
WO (1) WO2017019846A1 (zh)
ZA (2) ZA201800500B (zh)

Families Citing this family (284)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
ME02461B (me) 2005-05-10 2017-02-20 Incyte Holdings Corp Modulatori indoleamina 2,3-dioksigenaze i metode za upotrebu istih
MY171866A (en) 2008-07-08 2019-11-05 Incyte Holdings Corp 1,2,5-oxadiazoles as inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase
CN107652289B (zh) 2012-06-13 2020-07-21 因塞特控股公司 作为fgfr抑制剂的取代的三环化合物
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP6449244B2 (ja) 2013-04-19 2019-01-09 インサイト・ホールディングス・コーポレイションＩｎｃｙｔｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｆｇｆｒ抑制剤としての二環式複素環
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
TWI742423B (zh) * 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
TWI693232B (zh) * 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
CN110894240B (zh) 2014-11-26 2022-04-15 森科股份有限公司 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
WO2016134320A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
TW201709929A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 宏觀基因股份有限公司 治療癌症的聯合療法
SG10201913303XA (en) 2015-07-13 2020-03-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
PL3328419T3 (pl) * 2015-07-30 2021-12-27 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania
CN114605548A (zh) 2015-09-01 2022-06-10 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
KR20180054824A (ko) 2015-09-29 2018-05-24 셀진 코포레이션 Pd-1 결합 단백질 및 이의 사용 방법
EA201891106A1 (ru) 2015-11-02 2018-12-28 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Полипептиды внеклеточного домена cd80 и их применение в лечении рака
SG11201803520PA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR102424513B1 (ko) 2015-12-14 2022-07-25 마크로제닉스, 인크. Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
NZ746934A (en) 2016-04-15 2023-11-24 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
EP3471753A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10766958B2 (en) 2016-09-19 2020-09-08 Celgene Corporation Methods of treating vitiligo using PD-1 binding antibodies
BR112019004733A2 (pt) 2016-09-19 2019-05-28 Celgene Corp métodos de tratamento de distúrbios imunes usando proteínas de ligação a pd-1
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
MA50948A (fr) 2016-12-07 2020-10-14 Agenus Inc Anticorps et procédés d'utilisation de ceux-ci
HRP20220230T1 (hr) 2017-01-05 2022-04-29 Kahr Medical Ltd. Sirp1 alfa-41bbl fuzijski protein i metoda njegove upotrebe
WO2018127916A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A pd1-cd70 fusion protein and methods of use thereof
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
HRP20230937T1 (hr) 2017-01-05 2023-11-24 Kahr Medical Ltd. Pd1-41bbl fuzijski protein i metode korištenja istog
EP3565840A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
WO2018129714A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 杭州翰思生物医药有限公司 抗pd-1的单克隆抗体及其应用
WO2018133837A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Anti-pd-1 antibodies and uses thereof
CN108341871A (zh) * 2017-01-24 2018-07-31 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
JP6929951B2 (ja) * 2017-02-22 2021-09-01 アイ−エムエービー バイオファーマ （ハンジョウ） カンパニー リミテッド 抗ｌａｇ−３抗体およびその使用
CN110325209A (zh) 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途
CR20190444A (es) 2017-02-28 2019-12-17 Sanofi Sa Arn terapéutico
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
SG11201907769XA (en) 2017-03-16 2019-09-27 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
IL269026B1 (en) 2017-03-31 2024-08-01 Bristol Myers Squibb Co Anti-PD-1 antibodies for the treatment of tumors in patients with a high tumor mutational burden (TMB)
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
BR112019021520A2 (pt) 2017-04-14 2020-08-04 Tollnine, Inc. oligonucleotídeo, composto, polinucleotídeo imunomodulador, composição, conjugado, método para modular um receptor, método de tratamento de um tumor, método de tratamento de câncer, método para tratar um tumor, método de prevenção de câncer, método para induzir uma resposta imune
JOP20190248A1 (ar) * 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
US11789010B2 (en) 2017-04-28 2023-10-17 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treatment with CD80 extracellular domain polypeptides
US20200079850A1 (en) * 2017-05-24 2020-03-12 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
CA3060989A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-lag-3 antibody, a pd-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
MX2019012032A (es) 2017-05-30 2019-10-30 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de tumores positivos a gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3).
MX2019012076A (es) 2017-05-30 2019-12-09 Bristol Myers Squibb Co Composiciones que comprenden un anticuerpo anti gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) o un anticuerpo anti-lag-3 y un anticuerpo anti muerte celular programada 1 (pd-1) o anti ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1).
EP3630840A1 (en) 2017-06-01 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor using an anti-pd-1 antibody
MA52459A (fr) 2017-06-05 2021-03-10 Janssen Biotech Inc Anticorps se liant spécifiquement à pd-1 et leurs méthodes d'utilisation
CN110799537B (zh) * 2017-06-25 2023-07-28 西雅图免疫公司 抗pd-1抗体及其制备和使用方法
IL271833B2 (en) * 2017-07-06 2024-09-01 Merus Nv Antibodies that regulate biological activity expressed by a cell
CN118126157A (zh) 2017-08-03 2024-06-04 美国安进公司 白介素-21突变蛋白和治疗方法
UA128472C2 (uk) 2017-08-25 2024-07-24 Файв Прайм Терапеутікс Інк. B7-h4 антитіла і методи їх використання
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2019075468A1 (en) 2017-10-15 2019-04-18 Bristol-Myers Squibb Company TUMOR TREATMENT METHODS
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
EP3706778A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
EP3710478A1 (en) 2017-11-13 2020-09-23 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
CN109897111B (zh) * 2017-12-08 2021-02-23 杭州翰思生物医药有限公司 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
CN109971714B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN109971712B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
US11518808B2 (en) 2018-01-12 2022-12-06 Amgen Inc. Anti-PD-1 antibodies and methods of treatment
CA3096287A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Pascal Biosciences Inc. Cannabinoids and derivatives for promoting immunogenicity of tumor and infected cells
WO2019148412A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
GB201802573D0 (en) * 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
JP7110369B2 (ja) * 2018-02-23 2022-08-01 ユーキュア・（ベイジン）・バイオファーマ・カンパニー・リミテッド 抗ｐｄ－１抗体及びその用途
IL303087B1 (en) 2018-02-27 2024-08-01 Incyte Corp Midazopyrimidines and triazolopyrimidines as A2A /A2B inhibitors
KR20200144094A (ko) 2018-03-02 2020-12-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 및 이의 사용 방법
EP3768727A4 (en) * 2018-03-20 2021-12-22 Wuxi Biologics Ireland Limited. NEW BIS SPECIFIC PD-1 / LAG-3 ANTIBODY MOLECULES
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
CN108546297B (zh) * 2018-03-29 2019-08-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 针对pd-1的单克隆抗体及其应用
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US20210363255A1 (en) * 2018-04-04 2021-11-25 Truebinding, Inc. Methods and compositions for blocking interaction between non-glycosylated pd-1 polypeptides
CN112074533A (zh) * 2018-04-15 2020-12-11 信立泰(成都)生物技术有限公司 结合pd-1的抗体及其用途
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
JP7368453B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-24 シャンハイ エピムアブ バイオセラピューティクス カンパニー リミテッド Ｐｄ－１およびｌａｇ－３に対する高親和性抗体ならびにそれらから作製された二重特異性結合タンパク質
DK3788047T3 (da) 2018-05-04 2024-09-16 Incyte Corp Faste former af en FGFR-inhibitor og fremgangsmåder til fremstilling deraf
SG11202010882XA (en) 2018-05-04 2020-11-27 Incyte Corp Salts of an fgfr inhibitor
JP7519907B2 (ja) 2018-05-07 2024-07-22 ジェンマブ エー／エス 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法
US11168089B2 (en) 2018-05-18 2021-11-09 Incyte Corporation Fused pyrimidine derivatives as A2A / A2B inhibitors
CN117442717A (zh) 2018-06-01 2024-01-26 大有华夏生物医药集团有限公司 治疗疾病或病况的组合物及其用途
AU2019288276A1 (en) 2018-06-20 2021-01-14 Incyte Corporation Anti-PD-1 antibodies and uses thereof
AU2019293618A1 (en) 2018-06-29 2021-02-18 Incyte Corporation Formulations of an AXL/MER inhibitor
CN113166153A (zh) 2018-07-05 2021-07-23 因赛特公司 作为a2a/a2b抑制剂的稠合吡嗪衍生物
CN110684113A (zh) * 2018-07-06 2020-01-14 复旦大学 一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体及其构建方法
MX2021000398A (es) * 2018-07-12 2021-05-27 F Star Therapeutics Ltd Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y cd137.
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
EP3823991A4 (en) * 2018-07-19 2022-08-03 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. ANTI-PD-1 ANTIBODIES, DOSAGES AND USES THEREOF
EP3826660A1 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 combination therapy for the treatment of cancer
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
TW202028237A (zh) 2018-09-27 2020-08-01 美商西建公司 SIRPα結合蛋白及其使用方法
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US11066404B2 (en) 2018-10-11 2021-07-20 Incyte Corporation Dihydropyrido[2,3-d]pyrimidinone compounds as CDK2 inhibitors
US20210338813A1 (en) 2018-10-19 2021-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination Therapy for Melanoma
WO2020086724A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
JP2022513432A (ja) 2018-11-13 2022-02-08 ジェイエヌ バイオサイエンシーズ エルエルシー 免疫細胞活性化のための二重特異性抗体
WO2020102501A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Bristol-Myers Squibb Company Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
US20220099637A1 (en) 2018-12-04 2022-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Methods of analysis using in-sample calibration curve by multiple isotopologue reaction monitoring
EP3666905A1 (en) 2018-12-11 2020-06-17 Sanofi E. coli positive for pks island as marker of positive response to anti-pd1 therapy in colorectal cancer
JP2022514698A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 二機能性抗ｐｄ－１／ｓｉｒｐａ分子
CN111349162A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 神州细胞工程有限公司 人源化抗pd-1抗体及其用途
CN113614109A (zh) 2018-12-21 2021-11-05 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd-1/il-7分子
CN111423510B (zh) * 2019-01-10 2024-02-06 迈威(上海)生物科技股份有限公司 重组抗人pd-1抗体及其应用
JP2022518236A (ja) 2019-01-21 2022-03-14 サノフイ 進行期固形腫瘍がんに対する治療用ｒｎａおよび抗ｐｄ１抗体
CN113795511B (zh) * 2019-01-23 2024-07-23 大有华夏生物医药集团有限公司 抗pd-l1双抗体及其用途
TWI829857B (zh) 2019-01-29 2024-01-21 美商英塞特公司 作為a2a / a2b抑制劑之吡唑并吡啶及三唑并吡啶
WO2020156509A1 (zh) * 2019-02-03 2020-08-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2020168197A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Incyte Corporation Pyrrolo[2,3-d]pyrimidinone compounds as cdk2 inhibitors
EP3923949A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Incyte Corporation Cyclin-dependent kinase 2 biomarkers and uses thereof
JP2022523946A (ja) 2019-03-01 2022-04-27 ゼンコア インコーポレイテッド Ｅｎｐｐ３およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体
US11472791B2 (en) 2019-03-05 2022-10-18 Incyte Corporation Pyrazolyl pyrimidinylamine compounds as CDK2 inhibitors
US11628162B2 (en) 2019-03-08 2023-04-18 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an FGFR inhibitor
EP3946625A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
KR20210146349A (ko) 2019-03-28 2021-12-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
WO2020205560A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Incyte Corporation Sulfonylamide compounds as cdk2 inhibitors
US11447494B2 (en) 2019-05-01 2022-09-20 Incyte Corporation Tricyclic amine compounds as CDK2 inhibitors
WO2020223469A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Incyte Corporation N-(1-(methylsulfonyl)piperidin-4-yl)-4,5-di hydro-1h-imidazo[4,5-h]quinazolin-8-amine derivatives and related compounds as cyclin-dependent kinase 2 (cdk2) inhibitors for treating cancer
JP2022534889A (ja) 2019-05-24 2022-08-04 ファイザー・インコーポレイテッド Ｃｄｋ阻害剤を使用した組合せ療法
WO2020243563A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
WO2020243570A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
EP3976832A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject suitable for an immuno-oncology (i-o) therapy
CN112225809B (zh) * 2019-06-30 2023-09-05 福州创方医药科技有限公司 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
CN117447596A (zh) * 2019-06-30 2024-01-26 福州创方医药科技有限公司 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
KR20220030956A (ko) 2019-07-05 2022-03-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 Pd-1/cd3 이중 특이성 단백질에 의한 혈액암 치료
WO2021007269A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
CN112239506B (zh) * 2019-07-16 2023-09-26 复旦大学 一种抗PD-1及c-Met抗原的小分子双特异性抗体Diabody
JP2022543062A (ja) 2019-08-01 2022-10-07 インサイト・コーポレイション Ｉｄｏ阻害剤の投与レジメン
EP4008351A4 (en) * 2019-08-02 2023-08-09 CTTQ-Akeso (ShangHai) Biomed. Tech. Co., Ltd. ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND ASSOCIATED MEDICAL USE
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
TW202120550A (zh) 2019-08-08 2021-06-01 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性蛋白質
WO2021030537A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Incyte Corporation Imidazolyl pyrimidinylamine compounds as cdk2 inhibitors
WO2021055994A1 (en) 2019-09-22 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Quantitative spatial profiling for lag-3 antagonist therapy
CA3152263A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Julia SANTUCCI PEREIRA DEL BUONO Composite biomarker for cancer therapy
JP2022550243A (ja) * 2019-09-30 2022-12-01 シチュアン ケルン－バイオテック バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド 抗ｐｄ－１抗体及びその使用
PE20221905A1 (es) 2019-10-11 2022-12-23 Incyte Corp Aminas biciclicas como inhibidoras de la cdk2
MX2022004513A (es) 2019-10-14 2022-07-19 Incyte Corp Heterociclos biciclicos como inhibidores de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (fgfr).
WO2021076728A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
EP4055392A1 (en) 2019-11-05 2022-09-14 Bristol-Myers Squibb Company M-protein assays and uses thereof
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
AU2020380384A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 Bristol-Myers Squibb Company LAG-3 antagonist therapy for melanoma
WO2021097256A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
WO2021097800A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 Abl Bio Inc. Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
JP2023505258A (ja) 2019-12-04 2023-02-08 インサイト・コーポレイション Ｆｇｆｒ阻害剤としての三環式複素環
BR112022010664A2 (pt) 2019-12-04 2022-08-16 Incyte Corp Derivados de um inibidor de fgfr
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
WO2021127554A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Bristol-Myers Squibb Company Combinations of dgk inhibitors and checkpoint antagonists
US20230044381A1 (en) * 2019-12-20 2023-02-09 Guangdong Feipeng Pharmaceutical Co., Ltd Anti-human programmed death-1 monoclonal antibody
US20230056230A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-23 Macrogenics, Inc. Therapy for the Treatment of Cancer
CN115279766A (zh) 2020-01-03 2022-11-01 因赛特公司 包含a2a/a2b和pd-1/pd-l1抑制剂的组合疗法
IL294557A (en) 2020-01-07 2022-09-01 Univ Texas Enhanced human methylthioadenosine/adenosine-depleting enzyme variants for cancer therapy
US12012409B2 (en) 2020-01-15 2024-06-18 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
AU2021213317A1 (en) 2020-01-28 2022-06-30 Centre National De La Recherche Scientifique Antisense oligonucleotide targeting LINC00518 for treating melanoma
US20230086099A1 (en) 2020-01-30 2023-03-23 Ona Therapeutics, S.L. Combination therapy for treatment of cancer and cancer metastasis
JP2023514152A (ja) 2020-02-06 2023-04-05 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－１０およびその使用
US11920136B2 (en) 2020-02-28 2024-03-05 Tallac Therapeutics, Inc. Transglutaminase-mediated conjugation
CN115768465A (zh) 2020-03-06 2023-03-07 Ona疗法有限公司 抗cd36抗体及其治疗癌症的用途
MX2022010912A (es) 2020-03-06 2022-11-09 Celgene Quanticel Res Inc Combinacion de un inhibidor de desmetilasa-1 especifica de lisina (lsd-1) y nivolumab para usarse en el tratamiento de cancer de pulmon de celulas peque?as (sclc) o cancer de pulmon de celulas no peque?as escamosas (sqnsclc).
EP4114401A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Incyte Corporation Combination therapy comprising axl/mer and pd-1/pd-l1 inhibitors
EP4135844A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Incyte Corporation Fused tricyclic kras inhibitors
WO2021219048A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用
EP4147053A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Institut Curie Antxr1 as a biomarker of immunosuppressive fibroblast populations and its use for predicting response to immunotherapy
WO2021231526A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Incyte Corporation Fused pyrimidine compounds as kras inhibitors
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
MX2023000197A (es) 2020-07-07 2023-02-22 BioNTech SE Arn terapeutico para el cancer positivo para vph.
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
TW202227490A (zh) * 2020-08-19 2022-07-16 美商潘迪恩營運公司 多重特異性抗ｐｄ－１抗體及其用途
AU2021331476A1 (en) 2020-08-28 2023-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
US11999752B2 (en) 2020-08-28 2024-06-04 Incyte Corporation Vinyl imidazole compounds as inhibitors of KRAS
JP2023538955A (ja) 2020-08-31 2023-09-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在シグネチャーおよび免疫療法
WO2022072783A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Incyte Corporation Bicyclic dione compounds as inhibitors of kras
KR20230080460A (ko) 2020-10-05 2023-06-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질을 농축시키는 방법
WO2022076596A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
WO2022074107A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 Worldwide Innovative Network Novel prediction method and gene signatures for the treatment of cancer
MX2023004493A (es) 2020-10-23 2023-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia de agonista del gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) para cancer de pulmon.
EP4236960A1 (en) 2020-10-28 2023-09-06 Ikena Oncology, Inc. Combination of an ahr inhibitor with a pdx inhibitor or doxorubicine
US20240024320A1 (en) 2020-11-17 2024-01-25 Seagen Inc. Methods of treating cancer with a combination of tucatinib and an anti-pd-1/anti-pd-l1 antibody
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
US20220168293A1 (en) 2020-12-02 2022-06-02 Pfizer Inc. Time to resolution of axitinib-related adverse events
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
EP4261225A1 (en) * 2020-12-10 2023-10-18 Eutilex Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody and uses thereof
WO2022129512A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd1/il-7 molecules
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2022146948A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
JP2024502005A (ja) 2020-12-29 2024-01-17 インサイト・コーポレイション Ａ２ａ／ａ２ｂ阻害剤、ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤、及び抗ｃｄ７３抗体を含む併用療法
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
KR102618718B1 (ko) * 2021-01-11 2023-12-29 주식회사 유틸렉스 항-4-1bb 항체 및 pd-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
CN113336848B (zh) * 2021-02-03 2022-08-19 上海莱馥医疗科技有限公司 一种抗pd-1抗体及其用途
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
TW202304506A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
US20240181052A1 (en) 2021-03-29 2024-06-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
AU2022253351A1 (en) 2021-04-09 2023-10-12 Ose Immunotherapeutics New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
EP4323405A1 (en) 2021-04-12 2024-02-21 Incyte Corporation Combination therapy comprising an fgfr inhibitor and a nectin-4 targeting agent
WO2022240741A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lag3 and gal3 inhibitory agents, xbp1, cs1, and cd138 peptides, and methods of use thereof
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
CA3220274A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2022261159A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US11981671B2 (en) 2021-06-21 2024-05-14 Incyte Corporation Bicyclic pyrazolyl amines as CDK2 inhibitors
TW202317565A (zh) 2021-07-07 2023-05-01 美商英塞特公司 作為kras抑制劑的三環化合物
CR20240065A (es) * 2021-07-09 2024-04-08 Macrogenics Inc Composiciones farmacéuticas de un anticuerpo contra pd-1 y uso de las mismas
KR20240046323A (ko) 2021-07-13 2024-04-08 비온테크 에스이 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
JP2024529347A (ja) 2021-07-14 2024-08-06 インサイト・コーポレイション Ｋｒａｓの阻害剤としての三環式化合物
WO2023007472A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 ONA Therapeutics S.L. Anti-cd36 antibodies and their use to treat cancer
EP4396187A1 (en) 2021-08-31 2024-07-10 Incyte Corporation Naphthyridine compounds as inhibitors of kras
US12030883B2 (en) 2021-09-21 2024-07-09 Incyte Corporation Hetero-tricyclic compounds as inhibitors of KRAS
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
JP2024537824A (ja) 2021-10-01 2024-10-16 インサイト・コーポレイション ピラゾロキノリンｋｒａｓ阻害剤
WO2023057882A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Pfizer Inc. Combinations of azalactam compounds with a pd-1 axis binding antagonist for the treatment of cancer
IL311771A (en) 2021-10-06 2024-05-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against PD-L1 and CD137 in combination
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
IL312114A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Incyte Corp Quinoline compounds as Kras inhibitors
US20230272072A1 (en) * 2021-10-21 2023-08-31 Seismic Therapeutic, Inc. Dual targeted immune regulating compositions
MX2024005053A (es) 2021-10-29 2024-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia con antagonista del gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) para cancer hematologico.
WO2023079428A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Pfizer Inc. Combination therapies using tlr7/8 agonist
WO2023083439A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment
TW202320792A (zh) 2021-11-22 2023-06-01 美商英塞特公司 包含ｆｇｆｒ抑制劑及ｋｒａｓ抑制劑之組合療法
US11976073B2 (en) 2021-12-10 2024-05-07 Incyte Corporation Bicyclic amines as CDK2 inhibitors
AR128043A1 (es) 2021-12-22 2024-03-20 Incyte Corp Sales y formas sólidas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
MX2024008831A (es) 2022-01-26 2024-07-25 Bristol Myers Squibb Company Terapia combinada para carcinoma hepatocelular.
AU2023226078A1 (en) 2022-02-25 2024-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma.
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
WO2023170606A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
US20230326022A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Machine Learning Identification, Classification, and Quantification of Tertiary Lymphoid Structures
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
US20230399342A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Incyte Corporation Tricyclic triazolo compounds as dgk inhibitors
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
US20240101557A1 (en) 2022-07-11 2024-03-28 Incyte Corporation Fused tricyclic compounds as inhibitors of kras g12v mutants
EP4310197A1 (en) 2022-07-21 2024-01-24 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda Method for identifying lung cancer patients for a combination treatment of immuno- and chemotherapy
WO2024023740A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Astrazeneca Ab Combinations of recombinant virus expressing interleukin-12 with pd-1/pd-l1 inhibitors
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
US20240101718A1 (en) * 2022-09-28 2024-03-28 Incyte Corporation Anti-pd-1/lag-3 bispecific antibodies and uses thereof
WO2024069009A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alentis Therapeutics Ag Treatment of drug-resistant hepatocellular carcinoma
US12030945B2 (en) 2022-10-25 2024-07-09 Seismic Therapeutic, Inc. Variant IgG Fc polypeptides and uses thereof
WO2024091919A2 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Klrb1 binding agents and methods of use thereof
US20240190982A1 (en) 2022-11-03 2024-06-13 Incyte Corporation Combination therapies comprising an anti-gitr antibody for treating cancers
WO2024107731A2 (en) * 2022-11-14 2024-05-23 Ablexis, Llc Anti-pd-l1 antibodies
WO2024105180A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Predictive efficacy biomarkers for anti-sirpa antibodies
TW202428272A (zh) 2022-11-18 2024-07-16 美商英塞特公司 作為ｄｇｋ抑制劑之雜芳基氟烯烴
WO2024116140A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
WO2024115725A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors
WO2024137776A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for lung cancer
CN117482246B (zh) * 2022-12-30 2024-10-15 英百瑞(杭州)生物医药有限公司 抗cd33/cll1双特异性抗体-自然杀伤细胞偶联物及其用途
WO2024150177A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Advesya Treatment methods for solid tumors
WO2024151093A1 (ko) * 2023-01-11 2024-07-18 주식회사 녹십자 혈전성 질환의 예방 또는 치료를 위한 신규한 액상 제형물
TW202428575A (zh) 2023-01-12 2024-07-16 美商英塞特公司 作為ｄｇｋ抑制劑之雜芳基氟代烯烴
US20240294651A1 (en) 2023-01-30 2024-09-05 Kymab Limited Antibodies
WO2024175699A1 (en) 2023-02-23 2024-08-29 Imcheck Therapeutics Combination of btn3a activating antibody and immune checkpoint inhibitors
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy
WO2024200826A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell inhibiting molecule and use thereof
WO2024200823A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
WO2024209072A1 (en) 2023-04-06 2024-10-10 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 for treating cancer

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (zh) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
EP0359096B1 (en) 1988-09-15 1997-11-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibodies having modified carbohydrate content and methods of preparation and use
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
AU642932B2 (en) 1989-11-06 1993-11-04 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
FR2656800B1 (fr) 1990-01-08 1992-05-15 Roussy Inst Gustave Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
FR2664500B1 (fr) 1990-07-13 1994-10-28 Lille Ii Universite Droit Sant Procede de preparation d'une lipoproteine modifiee par incorporation d'une substance active lipophile, lipoproteine modifiee ainsi obtenue et composition pharmaceutique ou cosmetique la contenant.
US5972337A (en) 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
ES2181673T3 (es) 1991-05-01 2003-03-01 Jackson H M Found Military Med Procedimiento de tratamiento de las enfermedades respiratorias infecciosas.
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
IL108501A (en) 1994-01-31 1998-10-30 Mor Research Applic Ltd Antibodies and pharmaceutical compositions containing them
JP3700859B2 (ja) 1994-05-06 2005-09-28 アンスティテュ ギュスタブ ルシ Ｌａｇ−３タンパク質の可溶性ポリペプチドフラクション；製造方法、治療用製剤、抗イディオタイプ抗体
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
PT885002E (pt) 1996-03-04 2011-07-14 Massachusetts Inst Technology Materiais e métodos para aumento da internalização celular
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
AU728911B2 (en) 1996-11-28 2001-01-18 Institut Gustave Roussy Mutants of the LAG-3 proteins, products for the expression of these mutants and use
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
DE69840723D1 (de) 1997-02-11 2009-05-20 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikörper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0900841A1 (en) 1997-06-18 1999-03-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) LAG-3 splice variants
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US20030187196A1 (en) 1998-12-30 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
HUP0202882A2 (en) 1999-08-23 2002-12-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Novel b7-4 molecules and uses therefor
IL147972A0 (en) 1999-08-23 2002-09-12 Dana Farber Cancer Inst Inc Ge Pd-1, a receptor for b7-4 and uses therefor
DK1234031T3 (en) 1999-11-30 2017-07-03 Mayo Foundation B7-H1, AN UNKNOWN IMMUNE REGULATORY MOLECULE
US6803192B1 (en) 1999-11-30 2004-10-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
WO2002002781A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
WO2003011911A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
ATE346866T1 (de) 2001-09-14 2006-12-15 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, tandem-fv- antikörper
WO2003024191A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
US7148038B2 (en) 2001-10-16 2006-12-12 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen CD46 and methods of use thereof
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1456652A4 (en) 2001-11-13 2005-11-02 Dana Farber Cancer Inst Inc IMMUNOCELL ACTIVATION MODULATING SUBSTANCES AND USE METHOD THEREFOR
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2006506323A (ja) 2002-04-12 2006-02-23 レイヴェン バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド インテグリンα−ｖ−β−６に結合する抗体およびその使用方法
AU2003230874A1 (en) 2002-04-16 2003-11-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003225294A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
DE10161767T1 (de) 2002-07-03 2018-06-07 Honjo Tasuku Immunopotenzierende Zusammensetzungen, die einen Anti-PD-L1 Antikörper enthalten
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP4757493B2 (ja) 2002-11-13 2011-08-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 抗原ｐｉｐａおよびそれに結合する抗体
ATE514713T1 (de) 2002-12-23 2011-07-15 Wyeth Llc Antikörper gegen pd-1 und ihre verwendung
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
FI1897548T4 (fi) 2003-02-28 2024-09-03 The Johns Hopkins University T-solujen säätely
ES2301099T3 (es) 2003-07-07 2008-06-16 The Scripps Research Institute Composiciones de parejas ortogonales lisil-arnt y aminoacil-arnt sintetasa y usos de las mismas.
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7790855B2 (en) 2003-09-18 2010-09-07 Macrogenics, Inc. KID3 and KID3 antibodies that bind thereto
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
DK1709081T3 (da) 2004-01-16 2011-06-06 Regeneron Pharma Fusionspolypeptider, der kan aktivere receptorer
WO2007046893A2 (en) 2005-10-19 2007-04-26 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating bioactive assemblies and uses thereof
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
CA2569692C (en) 2004-06-07 2015-07-21 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
US20070166281A1 (en) 2004-08-21 2007-07-19 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods for their synthesis
WO2006021955A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Mor Research Applications Ltd. Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
AU2005295579B2 (en) 2004-10-15 2011-08-04 NortonLifeLock Inc. One time password
WO2007024249A2 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP1846767B1 (en) 2005-01-12 2012-06-06 MacroGenics West, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
US7847070B2 (en) 2005-01-31 2010-12-07 Raven Biotechnologies, Inc. LUCA2 and antibodies that bind thereto
WO2006084078A2 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Jam-3 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
MX2007009403A (es) 2005-02-04 2007-10-02 Raven Biotechnologies Inc Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.
JP5011277B2 (ja) 2005-04-06 2012-08-29 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ホモダイマー、ホモテトラマーまたはダイマーのダイマーのからなる安定に連結された複合体を発生させるための方法および使用
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
PT2397156T (pt) 2005-06-08 2016-12-23 The President And Fellows Of Harvard College Métodos e composições para tratamento de infeções persistentes e cancro através da inibição da via de morte celular programada 1 (pd-1)
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
DK1907424T3 (en) 2005-07-01 2015-11-09 Squibb & Sons Llc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED death ligand 1 (PD-L1)
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2633486C (en) 2005-12-16 2015-02-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
CA2644903A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
CN101663323A (zh) 2006-12-27 2010-03-03 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的组合物和方法
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
WO2008145142A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
EP2170959B1 (en) 2007-06-18 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US8062852B2 (en) 2007-10-01 2011-11-22 The Children's Hospital And Regional Medical Center Detection and treatment of autoimmune disorders
JP2011505372A (ja) 2007-11-30 2011-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
CN101970499B (zh) 2008-02-11 2014-12-31 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
US7565048B1 (en) 2008-05-30 2009-07-21 Ofs Fitel Llc Undersea optical fiber transmission systems
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
JP5945096B2 (ja) 2008-07-04 2016-07-05 小野薬品工業株式会社 抗ヒトｐｄ−１抗体の癌に対する治療効果を最適化するための判定マーカーの使用
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
SI2350129T1 (sl) 2008-08-25 2015-11-30 Amplimmune, Inc. Sestavki PD-1 antagonistov in postopek njihove uporabe
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
CA2998281C (en) 2008-09-26 2022-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1 antobodies and uses therefor
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
RU2504553C2 (ru) 2009-03-20 2014-01-20 Дженентек, Инк. Антитела к her
CA2761233A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
US20130017199A1 (en) 2009-11-24 2013-01-17 AMPLIMMUNE ,Inc. a corporation Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
RU2580038C2 (ru) 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
PT2361936T (pt) 2010-02-25 2016-07-15 Affimed Gmbh Molécula que se liga a antigénio e utilizações desta
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
GEP201706660B (en) * 2010-03-04 2017-04-25 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
EP2545078A1 (en) 2010-03-11 2013-01-16 UCB Pharma, S.A. Pd-1 antibody
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
PT2560993T (pt) 2010-04-20 2024-09-16 Genmab As Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas
US8876892B2 (en) 2010-04-21 2014-11-04 Medtronic, Inc. Prosthetic heart valve delivery system with spacing
CA2796633C (en) 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
CA2802344C (en) 2010-06-18 2023-06-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20130115215A1 (en) 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
AU2011286024B2 (en) 2010-08-02 2014-08-07 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
MX338953B (es) 2010-08-16 2016-05-06 Novimmune Sa Metodos para la generacion de anticuerpos multiespecificos y multivalentes.
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
MX341076B (es) 2011-03-31 2016-08-04 Merck Sharp & Dohme Formulaciones estables de anticuerpos para el receptor humano pd-1 de meurte programada y tratamientos relacionados.
CN103608040B (zh) 2011-04-20 2017-03-01 米迪缪尼有限公司 结合b7‑h1和pd‑1的抗体和其他分子
WO2012156430A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Trion Research Gmbh Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
CN104080804B (zh) 2011-05-21 2017-06-09 宏观基因有限公司 去免疫化的血清结合结构域及其延长血清半衰期的用途
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
WO2013003652A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
KR20140058532A (ko) 2011-06-30 2014-05-14 겐자임 코포레이션 Ｔ-세포 활성화 억제제
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
WO2013006867A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 Massachussetts Institute Of Technology Methods and apparatus for ultrathin catalyst layer for photoelectrode
JP5938473B2 (ja) 2011-07-22 2016-06-22 アフィメート テラポイティクス アーゲー 多価抗原結合Ｆｖ分子
CA2840018C (en) 2011-07-24 2019-07-16 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
EP3674320A3 (en) 2011-10-27 2020-08-12 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
JP2014533249A (ja) 2011-11-07 2014-12-11 メディミューン，エルエルシー 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
SG11201407190TA (en) 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
WO2013174873A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JP6403166B2 (ja) 2012-08-03 2018-10-10 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド 単一抗原抗ｐｄ−ｌ１およびｐｄ−ｌ２二重結合抗体およびその使用方法
AU2013315019B2 (en) 2012-09-17 2017-06-01 Galectin Therapeutics, Inc. Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
KR102130865B1 (ko) 2012-10-02 2020-08-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암을 치료하기 위한 항-kir 항체와 항-pd-1 항체의 조합물
US20150273056A1 (en) 2012-10-12 2015-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Enhancement of the immune response
WO2014066532A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
US10034939B2 (en) 2012-10-26 2018-07-31 The University Of Chicago Synergistic combination of immunologic inhibitors for the treatment of cancer
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
KR101763352B1 (ko) 2013-03-15 2017-07-31 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 항­ｌａｇ­3 결합 단백질
SG11201508528TA (en) * 2013-05-02 2015-11-27 Anaptysbio Inc Antibodies directed against programmed death-1 (pd-1)
CA3175360C (en) * 2013-05-31 2024-05-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
DK177790B1 (en) 2013-08-08 2014-07-07 Liqtech Internat A S A METHOD OF PRODUCING A CERAMIC FILTER MEMBRANE, A METHOD OF IMPROVING A CERAMIC FILTER MEMBRANE AND THE CERAMIC FILTER MEMBRANE OBTAINED BY THE METHOD
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
US10077305B2 (en) 2013-09-10 2018-09-18 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses thereof
CN112457403B (zh) * 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
RS58705B1 (sr) 2013-09-20 2019-06-28 Bristol Myers Squibb Co Kombinacija anti-lag-3 antitela i anti-pd-1 antitela za lečenje tumora
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
HUE046249T2 (hu) 2013-12-12 2020-02-28 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd PD-1 antitest, antigén-kötõ fragmense, és gyógyászati alkalmazása
RU2016129959A (ru) 2013-12-30 2018-02-02 Эпимаб Биотерепьютикс Инк. Иммуноглобулин с тандемным расположением fab-фрагментов и его применение
CA2936244A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Medimmune, Llc Compositions and methods for modulating and redirecting immune responses
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
BR112016017174A2 (pt) 2014-01-28 2017-10-03 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos anti-lag-3 para tratar malignidades hematológicas
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
US20150307620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
KR20230144099A (ko) 2014-05-15 2023-10-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-pd-1 항체 및 또 다른 항암제의 조합물을 사용한 폐암의 치료
TWI742423B (zh) 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
WO2015200828A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 H. Lee Moffit Cancer Center And Research Institute, Inc. Conjugates for immunotherapy
RU2711141C2 (ru) 2014-07-22 2020-01-15 СиБи ТЕРЕПЬЮТИКС, ИНК. Антитела против pd-1
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
SG10201901057UA (en) 2014-08-05 2019-03-28 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
KR102357893B1 (ko) 2014-08-05 2022-02-04 맵퀘스트 에스아 Pd-1 에 결합하는 면역학적 시약
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
GB201419084D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-PD-1 antibodies
US10822414B2 (en) 2014-11-11 2020-11-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-PD-1 antibodies, compositions comprising anti-PD-1 antibodies and methods of using anti-PD-1 antibodies
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
DK3237446T3 (en) 2014-12-22 2021-07-26 Pd 1 Acquisition Group Llc Anti-PD-1-antistoffer
JP2018506280A (ja) 2015-02-06 2018-03-08 カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニー 免疫調節薬
AU2016249395B2 (en) 2015-04-17 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-PD-1 antibody and another antibody
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TW201709929A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 宏觀基因股份有限公司 治療癌症的聯合療法
PL3328419T3 (pl) * 2015-07-30 2021-12-27 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania
RU2731202C2 (ru) * 2015-10-08 2020-08-31 Макродженикс, Инк. Комбинированная терапия для лечения рака
SG11201803520PA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
LT3328419T (lt) 2021-11-10
PL3456346T3 (pl) 2021-12-20
ES2898958T3 (es) 2022-03-09
TWI762879B (zh) 2022-05-01
MD3456346T2 (ro) 2021-11-30
AU2018214151B2 (en) 2019-10-31
JO3736B1 (ar) 2021-01-31
KR20180093127A (ko) 2018-08-20
HRP20211645T1 (hr) 2022-02-04
JP7557567B2 (ja) 2024-09-27
EP3456346A1 (en) 2019-03-20
IL257216B (en) 2022-03-01
MX2022014645A (es) 2022-12-15
ES2898511T3 (es) 2022-03-07
IL290571B2 (en) 2023-03-01
HUS2400028I1 (hu) 2024-08-28
CY1124723T1 (el) 2022-07-22
TW202229357A (zh) 2022-08-01
CN116333138A (zh) 2023-06-27
CR20220194A (es) 2022-06-16
HUE055207T2 (hu) 2021-11-29
CN114773475A (zh) 2022-07-22
US20190127467A1 (en) 2019-05-02
MA42542B1 (fr) 2021-09-30
PE20240111A1 (es) 2024-01-22
JP6959897B2 (ja) 2021-11-05
PH12018500232A1 (en) 2018-08-29
EP3981792A1 (en) 2022-04-13
CN114773475B (zh) 2024-01-12
DK3981792T3 (da) 2024-09-02
HUE056201T2 (hu) 2022-02-28
IL287916B1 (en) 2023-05-01
CN107847574A (zh) 2018-03-27
IL297090B1 (en) 2024-09-01
PE20181151A1 (es) 2018-07-17
MX2018001227A (es) 2018-03-26
PL3328419T3 (pl) 2021-12-27
TWI833183B (zh) 2024-02-21
US20230357404A1 (en) 2023-11-09
SI3456346T1 (sl) 2021-11-30
CN107847574B (zh) 2023-05-23
MX2019001161A (es) 2019-07-04
WO2017019846A8 (en) 2018-01-25
JP2019055948A (ja) 2019-04-11
AU2020200054A1 (en) 2020-01-30
SG10202010506TA (en) 2020-11-27
GEP20227419B (en) 2022-10-10
IL290571B (en) 2022-11-01
JOP20200213A1 (ar) 2022-10-30
AU2020200054B2 (en) 2022-03-03
EP3328419A4 (en) 2018-12-26
AU2018214151A1 (en) 2018-08-30
CY1124634T1 (el) 2022-07-22
EP4450088A2 (en) 2024-10-23
IL297090A (en) 2022-12-01
EP3456346B1 (en) 2021-07-07
HK1248106A1 (zh) 2018-10-12
EP3328419B1 (en) 2021-08-25
EA201890296A1 (ru) 2018-08-31
CN108976300B (zh) 2023-04-14
LT3456346T (lt) 2021-09-27
TW202028234A (zh) 2020-08-01
EP3328419A1 (en) 2018-06-06
CO2018000867A2 (es) 2018-04-19
JP7245304B2 (ja) 2023-03-23
AU2022200168A1 (en) 2022-02-10
CR20180062A (es) 2018-05-25
US11623959B2 (en) 2023-04-11
US10577422B2 (en) 2020-03-03
US20200231675A1 (en) 2020-07-23
GEP20237538B (en) 2023-09-11
FR24C1033I1 (fr) 2024-08-30
UA127372C2 (uk) 2023-08-02
AU2016298227B2 (en) 2019-10-03
KR20180034588A (ko) 2018-04-04
AU2016298227A8 (en) 2018-03-08
SG10201906059VA (en) 2019-08-27
MD3328419T2 (ro) 2022-01-31
PT3328419T (pt) 2021-11-26
WO2017019846A1 (en) 2017-02-02
HRP20211333T1 (hr) 2021-11-26
IL287916A (en) 2022-01-01
RS62374B1 (sr) 2021-10-29
DK3328419T3 (da) 2021-10-11
JP2018524394A (ja) 2018-08-30
FIC20240028I1 (fi) 2024-08-05
GEP20227438B (en) 2022-11-10
IL290571A (en) 2022-04-01
IL257216A (en) 2018-03-29
CR20200423A (es) 2021-01-20
ZA201807856B (en) 2020-09-30
EP3981792B1 (en) 2024-08-21
ECSP18006831A (es) 2018-04-30
DK3456346T3 (da) 2021-08-30
CN108976300A (zh) 2018-12-11
TW201710292A (zh) 2017-03-16
FI3981792T3 (fi) 2024-09-23
MA42542A (fr) 2021-05-26
PT3456346T (pt) 2021-09-28
AU2016298227B9 (en) 2019-10-31
PE20231958A1 (es) 2023-12-06
JP2022002540A (ja) 2022-01-11
RS62568B1 (sr) 2021-12-31
SI3328419T1 (sl) 2021-11-30
IL287916B2 (en) 2023-09-01
CA2993948A1 (en) 2017-02-02
CL2018000254A1 (es) 2018-07-20
JP2023075241A (ja) 2023-05-30
AU2016298227A1 (en) 2018-02-22
AU2016298227A2 (en) 2018-09-13
NL301287I2 (nl) 2024-08-21
ZA201800500B (en) 2020-10-28
JP6959907B2 (ja) 2021-11-05
TWI691509B (zh) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11623959B2 (en) PD-1-binding molecules and methods of use thereof
US11858991B2 (en) LAG-3-binding molecules and methods of use thereof
EA047726B1 (ru) Мультиспецифичные молекулы, связывающие pd-1, и способы их применения
EA042076B1 (ru) Pd-1-связывающие молекулы и способы их применения
EA041483B1 (ru) Связывающие lag-3 молекулы и способы их применения