CN114773475A - Pd-1结合分子和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明名称为PD‑1结合分子和其使用方法。本发明涉及选择的能够结合食蟹猴PD‑1和人PD‑1的抗PD‑1抗体：PD‑1mAb 1、PD‑1mAb 2、PD‑1mAb 3、PD‑1mAb 4、PD‑1mAb 5、PD‑1mAb 6、PD‑1mAb 7、PD‑1mAb 8、PD‑1mAb 9、PD‑1mAb 10、PD‑1mAb 11、PD‑1mAb 12、PD‑1mAb 13、PD‑1mAb 14或PD‑1mAb 15，和这类抗体的人源化和嵌合形式。本发明另外涉及PD‑1结合分子，其包括这类抗PD‑1抗体的PD‑1结合片段、免疫缀合物，和双特异性分子，包括双抗体、BiTE、双特异性抗体等，其包括(i)这样的PD‑1结合片段，和(ii)能够结合参与调节免疫检查点的免疫细胞的表面上存在的分子的表位的结构域。本发明也涉及使用PD‑1结合分子刺激免疫应答的方法，以及检测PD‑1的方法。

Description

PD-1结合分子和其使用方法
本申请为申请日是2016年07月28日、申请号是201680044392.9(PCT/US2016/044430)、发明名称为“PD-1结合分子和其使用方法”的中国申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求美国专利申请系列号62/198,867(2015年7月30日提交；待决)、62/239,559(2015年10月9日提交；待决)、62/255,140(2015年11月13日提交；待决)和62/322,974(2016年4月15日提交；待决)的优先权，每一篇申请通过引用以它们的整体并入本文。
参考序列表
根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，其以计算机可读的介质公开(文件名：1301_0122PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，2016年7月1日创建，并且大小为282,789字节)，该文档通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及PD-1结合分子(结合PD-1的分子)，其包括下述选择的能够结合食蟹猴(cynomolgus monkey)PD-1和人PD-1的抗PD-1抗体的PD-1结合结构域(结合PD-1的结构域)：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15。本发明尤其涉及PD-1结合分子，其是这类抗体的人源化形式或嵌合形式，或其包括这类抗PD-1抗体的PD-1结合片段(结合PD-1的片段)(尤其地，免疫缀合物、双抗体、BiTE、双特异性抗体等)。本发明尤其涉及这类PD-1结合分子，其另外能够结合免疫细胞的表面上存在的参与调节免疫检查点的分子的表位。本发明也涉及使用这类PD-1结合分子检测PD-1或刺激免疫应答的方法。本发明也涉及联合疗法(组合疗法)的方法，其中包括这类选择的抗PD-1抗体的一个或多个PD-1结合结构域的PD-1结合分子联合有效刺激免疫应答的一种或多种另外的分子和/或联合特异性结合癌症抗原的一种或多种另外的分子施用。
发明背景
I.细胞介导的免疫应答
人和其他哺乳动物的免疫系统负责提供针对感染和疾病的保护。这种保护通过体液免疫应答和细胞介导的免疫应答二者被提供。体液应答导致抗体和能够识别和中和外源靶(抗原)的其他生物分子的产生。相比之下，细胞介导的免疫应答涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和抗原特异性细胞毒性T-淋巴细胞通过T-细胞的激活，和响应抗原的识别的各种细胞因子的释放(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules,Immunolog.Res.28(1):39-48)。
T-细胞最佳地介导针对抗原的免疫应答的能力需要两种不同的信号传导相互作用(Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,Adv.Immunol.90:297-339)。第一，已经排列在抗原呈递细胞(APC)的表面上的抗原必须被呈递至抗原特异性幼稚(naive)CD4+T-细胞。这样的呈递经T-细胞受体(TCR)递送信号，所述信号引导T-细胞启动对呈递的抗原为特异性的免疫应答。第二，通过在APC和不同的T-细胞表面分子之间的相互作用介导的一系列共刺激和抑制信号首先引发T-细胞的激活和增殖，并最终导致它们的抑制。因此，第一信号赋予免疫应答特异性，而第二信号用于确定应答的性质、量级(magnitude)和持续时间。
免疫系统通过共刺激和共抑制配体和受体被严格地控制。这些分子提供用于T-细胞激活的第二信号，并且提供正信号和负信号的平衡网络以最大化针对感染的免疫应答，同时限制对自身的免疫性(Wang,L.等(2011年3月7日)“VISTA,A Novel Mouse IgSuperfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses,”J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies,B.等(2008)“The Role Of NegativeCostimulators During Parasitic Infections,”Endocrine,Metabolic&ImmuneDisorders-Drug Targets 8:279-288)。尤其重要的是抗原呈递细胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配体和CD4+T-淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily”,Nature Rev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulation by Novel Costimulatory Molecules”,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-MediatedCostimulation”,Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2与CD28的结合刺激T-细胞激活；B7.1或B7.2与CTLA-4的结合抑制这种激活(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation byNovel Costimulatory Molecules”,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation”,Immunol.Rev.229:307-321；Greenwald,R.J.等(2005)“The B7 Family Revisited”,Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T-细胞的表面上组成型表达(Gross,J.,等(1992)“Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In TheMouse”,J.Immunol.149:380–388)，而CTLA-4表达在T细胞激活之后被快速上调(Linsley,P.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization TowardsSites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535–543)。因为CTLA-4是更高的亲和力受体(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily”,Nature Rev.Immunol.2:116-126)，所以结合首先启动T-细胞增殖(经CD28)，然后抑制它(经CTLA-4的初期表达)，从而在不再需要增殖时阻遏所述效果。
对CD28受体的配体的进一步研究导致对一组相关的B7分子(“B7超家族”)的鉴定和表征(Coyle,A.J.等(2001)“The Expanding B7Superfamily:Increasing ComplexityIn Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function”,Nature Immunol.2(3):203-209；Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily”,Nature Rev.Immunol.2:116-126；Greenwald,R.J.等(2005)“The B7 Family Revisited”,Ann.Rev.Immunol.23:515-548；Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands”,GenomeBiol.6:223.1-223.7；Loke,P.等(2004)“Emerging Mechanisms Of Immune Regulation:The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells.”Arthritis Res.Ther.6:208-214；Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339；Flies,D.B.等(2007)“The New B7s:Playing a Pivotal Rolein Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3):251-260；Agarwal,A.等(2008)“The Role OfPositive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,”Curr.Opin.Organ Transplant.13:366-372；Lenschow,D.J.等(1996)“CD28/B7 System ofT-Cell Costimulation,”Ann.Rev.Immunol.14:233-258；Wang,S.等(2004)“Co-SignalingMolecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of TLymphocyte Responses,”Microbes Infect.6:759-766)。该家族当前具有若干个已知成员：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、程序性死亡-1配体(PD-L1；B7-H1)、程序性死亡-2配体(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6(Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7；Flajnik,M.F.等(2012)“Evolution Of The B7 Family:Co-Evolution Of B7H6 AndNkp30,Identification Of A New B7 Family Member,B7H7,And Of B7's HistoricalRelationship With The MHC,”Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)。
II.程序性死亡-1(“PD-1”)
程序性死亡-1(“PD-1”也称为“CD279”)是广泛地负调节免疫应答的T-细胞调节剂的扩展的CD28/CTLA-4家族的约31kD I型膜蛋白成员(Ishida,Y.等(1992)“InducedExpression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,UponProgrammed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；美国专利申请公开号2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667、美国专利号6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868、PCT公开号WO 01/14557)。
PD-1在激活的T-细胞、B-细胞和单核细胞上表达(Agata,Y.等(1996)“ExpressionOf The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等(2002)“Expression Of Programmed Death1Ligands By Murine T-Cells And APC,”J.Immunol.169:5538-5545)，并且，以低水平在天然杀伤细胞(NK)T-细胞中表达(Nishimura,H.等(2000)“Facilitation Of BetaSelection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,”J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等(2007)“InhibitoryCostimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。
PD-1的细胞外区域由与CTLA-4中等同结构域具有23％同一性的单免疫球蛋白(Ig)V结构域组成(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。细胞外IgV结构域之后是跨膜区域和细胞内尾区。细胞内尾区包含位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号(Ishida,Y.等(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin GeneSuperfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；Blank,C.等(2006)“Contribution Of The PD-L1/PD-1Pathway To T-Cell Exhaustion:An Update OnImplications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,”Immunol.Immunother.56(5):739-745)。
通过结合B7-H1和B7-DC，PD-1介导其对免疫系统的抑制(Flies,D.B.等(2007)“The New B7s:Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3):251-260；美国专利号6,803,192、7,794,710、美国专利申请公开号2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687、PCT申请号WO 01/39722、WO 02/086083)。
B7-H1和B7-DC在人和鼠科动物组织，比如心脏、胎盘、肌肉、胎肝、脾、淋巴结和胸腺以及鼠科动物肝、肺、肾、胰腺的胰岛细胞和小肠的表面上广泛表达(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。在人中，在人内皮细胞(Chen,Y.等(2005)“Expression of B7-H1in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,”Nephron.Exp.Nephrol.102:e81-e92；de Haij,S.等(2005)“Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-CellResponses Via ICOS-L And B7-H1”Kidney Int.68:2091-2102；Mazanet,M.M.等(2002)“B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell CytokineSynthesis,”J.Immunol.169:3581-3588)、心肌(Brown,J.A.等(2003)“Blockade OfProgrammed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation AndCytokine Production,”J.Immunol.170:1257-1266)、合胞滋养层(syncyciotrophoblast)(Petroff,M.G.等(2002)“B7 Family Molecules:Novel Immunomodulators At TheMaternal-Fetal Interface,”Placenta23:S95-S101)中已经发现了B7-H1蛋白质表达。分子也由一些组织的驻留型巨噬细胞、已经被干扰素(IFN)-γ或肿瘤坏死因子(TNF)-α激活的巨噬细胞表达(Latchman,Y.等(2001)“PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1AndInhibits T-Cell Activation,”Nat.Immunol 2:261-268)，并且在肿瘤中被表达(Dong,H.(2003)“B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,”J.Mol.Med.81:281-287)。
已经发现B7-H1和PD-1之间的相互作用为T和B-细胞提供了重要的负共刺激信号(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)，并且用作细胞死亡诱导者(Ishida,Y.等(1992)“Induced Expression Of PD-1,ANovel Member Of The Immunoglobulin GeneSuperfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；Subudhi,S.K.等(2005)“The Balance Of Immune Responses:Costimulation Verse Coinhibition,”J.Molec.Med.83:193-202)。更具体而言，已经发现低浓度的PD-1受体和B7-H1配体之间的相互作用导致强烈抑制抗原特异性CD8+T-细胞增殖的抑制信号的传输；在更高的浓度下，与PD-1的相互作用不抑制T细胞增殖但是显著减少多种细胞因子的产生(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。已经发现可溶性B7-H1-Fc融合蛋白抑制静息和先前激活的CD4和CD8 T-细胞，以及甚至来自脐带血的幼稚T-细胞的T细胞增殖和细胞因子产生(Freeman,G.J.等(2000)“Engagement Of The PD-1Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To NegativeRegulation Of Lymphocyte Activation,”J.Exp.Med.192:1-9；Latchman,Y.等(2001)“PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1And Inhibits T-Cell Activation,”NatureImmunol.2:261-268；Carter,L.等(2002)“PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects BothCD4(+)and CD8(+)T-cells And Is Overcome By IL-2,”Eur.J.Immunol.32(3):634-643；Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。
B7-H1和PD-1在抑制T-细胞激活和增殖中的作用已经提示这些生物分子可能用作用于治疗炎症和癌症的治疗性靶。因此，已经建议了抗PD-1抗体治疗感染和肿瘤以及上调适应性免疫应答的用途(见，美国专利申请公开号2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401、美国专利号7,521,051、7,563,869、7,595,048、PCT公开号WO 2004/056875、WO 2008/083174)。下述文献已经报道了能够特异性结合PD-1的抗体：Agata,T.等(1996)“Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface OfStimulated Mouse T And B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；和Berger,R.等(2008)“Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011,A HumanizedAntibody Interacting With PD-1,In Patients With Advanced HematologicMalignancies,”Clin.Cancer Res.14(10):3044-3051(也见美国专利号8,008,449和8,552,154、US专利公开号2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT专利公开号WO 2003/099196、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2009/014708、WO 2009/073533、WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668)。
然而，尽管所有这些现有技术的进步，仍需要改善的组合物，其能够更有力地引导身体的免疫系统攻击癌细胞或病原体感染的细胞，尤其以较低的治疗性浓度。尽管适应性免疫系统可以是抵抗癌症和疾病的有力防御机制，但是其经常在肿瘤微环境中受到免疫抑制机制的阻碍，比如PD-1的表达。此外，在肿瘤环境(milieu)中由肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞表达的共抑制分子可明显减弱针对癌细胞的T-细胞应答。因此，仍需要有效的PD-1结合分子。尤其地，需要这样的有效PD-1结合分子：其具有期望的结合动力学特征并且通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来对抗PD-1/PD-L1轴(axis)，其可为遭受癌症或其他疾病和病况的患者提供改善的治疗价值。本发明涉及这些和其他目标。
发明内容
本发明涉及PD-1结合分子，其包括下述能够结合食蟹猴PD-1和人PD-1二者的选择的抗PD-1抗体的PD-1结合结构域：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15。本发明尤其涉及PD-1结合分子，其是这类抗体的人源化形式或嵌合形式，或其包括这类抗PD-1抗体的PD-1结合片段(尤其地，免疫缀合物、双抗体、BiTE、双特异性抗体等)。本发明尤其涉及这类PD-1结合分子，其另外能够结合免疫细胞的表面上存在的参与调节免疫检查点的分子的表位。本发明也涉及使用这类PD-1结合分子检测PD-1或刺激免疫应答的方法。本发明也涉及联合疗法的方法，其中包括这类选择的抗PD-1抗体的一个或多个PD-1结合结构域的PD-1结合分子联合有效刺激免疫应答的一种或多种另外的分子和/或联合特异性结合癌症抗原的一种或多种另外的分子施用。
详细地，本发明提供了抗人PD-1结合分子，其包括三个重链CDR结构域CDRH1、CDRH2和CDRH3和三个轻链CDR结构域CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：
(A)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 1的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 1的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；
或
(B)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 2的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 2的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92；
或
(C)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 3的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 3的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106；
或
(D)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 4的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 4的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116；
或
(E)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 5的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 5的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126；
或
(F)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 6的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 6的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136；
或
(G)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 7的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 7的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；
或
(H)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 8的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:163；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 8的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168；
或
(I)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 9的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:173；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 9的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:178；
或
(J)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 10的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 10的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199；
或
(K)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 11的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 11的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209；
或
(L)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 12的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 12的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219
或
(M)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 13的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:224；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 13的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229；
或
(N)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 14的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233和SEQ ID NO:234；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 14的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238和SEQ ID NO:239；
或
(O)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是PD-1mAb 15的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是PD-1mAb 15的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248和SEQ ID NO:249；
或
(P)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是hPD-1mAb 7(1.2)的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是hPD-1mAb 7(1.2)的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；
或
(Q)(1)所述CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是hPD-1mAb 7(1.3)的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；和
(2)所述CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是hPD-1mAb 7(1.3)的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:146；
或
(R)(1)CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域是hPD-1mAb 9(2.2)的重链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:173；和
(2)CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域是hPD-1mAb 9(2.2)的轻链CDR，并且分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:178。
本发明进一步涉及所有这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子是抗体，尤其地，其中分子是嵌合抗体或人源化抗体。
本发明进一步涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中重链可变结构域具有SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:179、SEQ IDNO:181或SEQ ID NO:250的氨基酸序列。
本发明进一步涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中轻链可变结构域具有SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:184、SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:251的氨基酸序列。
本发明进一步涉及其中抗人PD-1结合分子是能够同时结合人PD-1和第二表位的双特异性结合分子的实施方式，尤其涉及其中第二表位是参与调节免疫检查点的免疫细胞的表面上存在的分子的表位的实施方式(尤其地，其中第二表位是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I类或II类MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA，最尤其地，其中第二表位是下述的表位：CD137、CTLA-4、LAG-3、OX40、TIGIT或TIM-3)。
本发明进一步涉及这样的实施方式：其中抗人PD-1结合分子是包括LAG-3表位结合位点(结合LAG-3表位的位点)的双特异性分子，尤其地，其中所述LAG-3表位结合位点包括：
(A)(1)LAG-3mAb1的可变重链的CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；和
(2)LAG-3mAb 1的可变轻链的CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；
或
(B)(1)hLAG-3mAb 1 VH1的可变重链的CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；和
(2)hLAG-3mAb 1 VL4的可变轻链的CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；
或
(C)(1)LAG-3mAb 6的可变重链的CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59；和
(2)LAG-3mAb 6的可变轻链的CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63；
或
(D)(1)hLAG-3mAb 6 VH1的可变重链的CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59；和
(2)LAG-3mAb 6的可变轻链的CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域，其分别具有下述氨基酸序列：SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。
本发明进一步涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子是双抗体，和尤其地，其中双抗体是共价结合的复合物，其包括两条或三条或四条或五条多肽链。本发明进一步涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子是三价结合分子，和尤其地，其中三价结合分子是共价结合的复合物，其包括三条、四条、五条或多于五条多肽链。本发明另外涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子包括Fc区域。本发明另外涉及这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子包括白蛋白结合结构域，尤其地，去免疫化的白蛋白结合结构域。
本发明进一步涉及所有这类抗人PD-1结合分子的实施方式，其中分子包括Fc区域，并且其中Fc区域是变异的Fc区域，其包括降低变异的Fc区域对FcγR的亲和力和/或延长血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰，和更具体地，其中修饰包括选自下述的至少一种氨基酸取代：
(1)L234A；L235A；
(2)L234A和L235A；
(3)M252Y；M252Y和S254T；
(4)M252Y和T256E；
(5)M252Y、S254T和T256E；或
(6)K288D和H435K；
其中编号是如Kabat中EU索引的编号。
本发明进一步涉及其中任何上述PD-1结合分子被用于刺激T-细胞介导免疫应答的实施方式。本发明另外涉及其中任何上述PD-1结合分子被用于治疗与受抑制的免疫系统相关的疾病或病况，尤其癌症或感染，的实施方式。
本发明尤其涉及在癌症的治疗或诊断或预后中的这类用途，其中癌症特征在于存在选自由下述的细胞组成的组的癌症细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤(posterious uveal melanoma)、罕见血液学疾病、肾转移性癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症和子宫癌。
本发明尤其涉及在癌症的治疗或诊断或预后中的这类用途，其中癌症是结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、急性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)，和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大细胞增多症或伯基特淋巴瘤。
本发明进一步涉及其中任何上述PD-1结合分子被可检测地标记和用于检测PD-1的实施方式。
附图简述
图1提供了包括两条多肽链的、具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体的示意图，每条链各具有E-螺旋或K-螺旋异源二聚体促进结构域(促进异源二聚体的结构域)。半胱氨酸残基可存在于连接体和/或异源二聚体促进结构域中，如图3B中所显示。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图2提供了包括两条多肽链的、具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图，每条链各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成所有或部分Fc区域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图3A-3C提供了显示包括两对多肽链(即，总共四条多肽链)的、具有四个表位结合位点的代表性四价双抗体的示意图。每对的一条多肽各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成所有或部分Fc区域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。两对多肽链可以相同。在其中VL和VH结构域识别不同的表位的这样的实施方式中(如图3A-3C中显示)，所得分子具有四个表位结合位点，并且就每个结合的表位而言是双特异性的和二价的。在其中VL和VH结构域识别相同的表位的这样的实施方式中(例如，相同的VL结构域CDR和相同的VH结构域CDR用在两条链上)，所得分子具有四个表位结合位点，并且就单个表位而言是单特异性的和四价的。可选地，两对多肽可以不同。在其中每对多肽识的VL和VH结构域别不同的表位的这类实施方式中(如图3A-3C中显示)，所得分子具有四个表位结合位点，并且就每个结合的表位而言是四特异性的和单价的。图3A显示了Fc双抗体，其包含包括半胱氨酸残基的肽异源二聚体促进结构域。图3B显示了包含Fc区域的双抗体，其包含包括半胱氨酸残基和连接体(具有任选的半胱氨酸残基)的E-螺旋和K-螺旋异源二聚体促进结构域。图3C显示了包含Fc区域的双抗体，其包含抗体CH1和CL结构域。
图4A和4B提供了包括三条多肽链的、具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。多肽链中的两条各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成所有或部分Fc区域。包括VL和VH结构域的多肽链进一步包括异源二聚体促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图5提供了包括五条多肽链的、具有四个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。多肽链中的两条各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成包括所有或部分Fc区域的Fc区域。包括连接的VL和VH结构域的多肽链进一步包括异源二聚体促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图6A-6F提供了包含Fc区域的代表性三价结合分子的示意图，所述三价结合分子具有三个表位结合位点。图6A和6B分别示意性阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括具有不同结构域取向的两个双抗体型结合结构域和Fab型结合结构域，其中双抗体型结合结构域在Fc区域的N-末端或C-末端。图6A和6B中的分子包括四条链。图6C和6D分别示意性阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括在Fc区域的N-末端的两个双抗体型结合结构域，和其中轻链和重链经多肽间隔体连接的Fab型结合结构域，或scFv型结合结构域。图6E和6F中的三价结合分子分别示意性阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括在Fc区域的C-末端的两个双抗体型结合结构域，和连接的Fab型结合结构域，或scFv型结合结构域，其中双抗体型结合结构域是。图6C-6F中的三价结合分子包括三条链。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图7A-7D显示，抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15结合人PD-1。与shPD-1-His结合的结合曲线显示在图7A(PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 4和PD-1mAb 9)，图7B(PD-1mAb 5、PD-1mAb6和PD-1mAb 7)，和图7C(PD-1mAb 3、PD-1mAb 8、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14和PD-1mAb 15)中。与shPD-1-人Fc结合的结合曲线显示在图7D(PD-1mAb 3、PD-1mAb 8、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14，和PD-1mAb 15)中。
图8A-8C显示，抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15结合食蟹猴PD-1。与scynoPD-1-hFc结合的结合曲线显示在图8A(PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7)，图8B(PD-1mAb 9)，和图8C(PD-1mAb 3、PD-1mAb 8、PD-1mAb10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14和PD-1mAb 15)中。
图9A-9D显示了抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15阻断人PD-L1与人PD-1结合的能力。抑制曲线显示在图9A(PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 15和PD-1mAb A)，图9B(PD-1mAb 4)，图9C(PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7和PD-1mAb A)，和图9D(PD-1mAb 3、PD-1mAb 8、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14、PD-1mAb 15和PD-1mAb A)中。
图10A-10B显示抗人PD-1抗体PD-1mAb 7的组织特异性。图10A显示了正常结肠(图i和vii)、肝(图ii和viii)、肺(图iii和ix)、胰腺(图iv和x)、肾(图v和xi)和心脏(图vi和xii)组织的组织学染色。图10A，图i-vi显示了用标记的PD-1mAb 7(0.313μg/mL)孵育的组织的结果。图10A，图vii-xii显示了用标记的同种型对照mAb(0.314μg/mL)孵育的组织的结果。图10B显示了皮肤(图i和iv)、扁桃体(图ii和v)和表达PD-1的NSO细胞(图iii和vi)的组织学染色。图10B，图i-iii显示了用标记的PD-1mAb 7(0.313μg/mL)孵育的组织的结果。
图11显示了具有用于结合细胞表面PD-1的IgG1(AA)或IgG4(P)的人源化抗人PD-1抗体hPD-1mAb 2、hPD-1mAb 7(1.1)、hPD-1mAb 7(1.2)、hPD-1mAb 9(1.1)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B的结合特征。
图12A-12B显示了具有IgG1(AA)或IgG4(P)的人源化抗PD抗体hPD-1mAb 2、hPD-1mAb 7(1.1)、hPD-1mAb 7(1.2)、hPD-1mAb 9(1.1)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAbB阻断可溶性人PD-L1(图12A)和可溶性人PD-L2(图12B)结合细胞表面人PD-1的能力。
图13显示了具有IgG1(AA)或IgG4(P)的人源化抗PD抗体hPD-1mAb 2、hPD-1mAb 7(1.1)、hPD-1mAb 7(1.2)、hPD-1mAb 9(1.1)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B在Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1荧光素酶报告试验中，通过阻断PD-1/PD-L1相互作用和防止下调T-细胞应答而对抗PD-1/PD-L1轴的能力。
图14显示，PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15能够刺激细胞因子产生，达到与参考抗PD-1抗体(PD-1mAb A和PD-1mAb B)相当或比其更高的水平，并且用PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15联合LAG-3mAb 1的治疗提供了细胞因子释放的最大增强。IFNγ分泌特征来自用抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理和联合处理的葡萄球菌属(Staphylococcal)肠毒素B(SEB)-刺激的PBMC。
图15A-15B显示，具有IgG1(AA)或IgG4(P)的人源化抗PD抗体hPD-1mAb 2、hPD-1mAb 7(1.2)、hPD-1mAb 9(1.1)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B刺激细胞因子产生的能力。IFNγ(图15A)和TNFα(图15B)，来自用抗PD-1抗体处理的SEB-刺激的PBMC的分泌特征。
图16A-16B显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART A、DART D、DART E、DART F、DART G和DART H，能够刺激细胞因子产生，达到与施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A)的组合时观察到的水平相当的或比其更高的水平，和PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART A、DART D、DART E、DART F和DART G提供了细胞因子释放的最大增强。将用通过PD-1x LAG-3双特异性双抗体，或通过抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理和联合处理的低浓度的SEB(0.2ng/mL)刺激的PBMC的IFNγ分泌特征绘图。使用来自两个代表性供体的PBMC的结果显示在图16A和图16B中。
图17A-17B显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART A、DART B和DART C能够刺激细胞因子产生，达到比施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A)的组合时观察到的水平更高的水平。将用通过PD-1x LAG-3双特异性双抗体，或通过抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理和联合处理的高浓度的SEB(85ng/mL)刺激的、来自两个代表性供体的PBMC的IFNγ分泌特征绘图。使用来自两个代表性供体的PBMC的结果显示在图17A和图17B中。
图18A-18B显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART A、DART B和DART C能够刺激细胞因子产生，达到比施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A)的组合时观察到的水平更高的水平。将用通过PD-1x LAG-3双特异性双抗体，或通过抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理和联合处理的中浓度的SEB(0.5ng/mL)刺激的、来自两个代表性供体的PBMC的IFNγ分泌特征绘图。使用来自两个代表性供体的PBMC的结果显示在图18A和图18B中。
图19显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART D和DART H能够刺激细胞因子产生，达到与施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A)的组合时所观察到的水平相当的或比其更高的水平，并且DART D提供细胞因子释放的最大增强。将用通过PD-1xLAG-3双特异性双抗体，或通过抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理或联合处理的高浓度的SEB(85ng/mL)刺激的、来自代表性供体的PBMC的IL-2分泌特征绘图。
图20显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体DART B和DART I能够刺激细胞因子产生，达到比施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A、hPD-1mAb 7(1.2)+hLAG-3mAb1(1.4)、hPD-1mAb 7(1.2)+hLAG-3mAb 6(1.1))的组合时观察到的水平更高的水平。将用通过PD-1x LAG-3双特异性双抗体，或通过抗PD-1和抗LAG-3抗体单独处理或联合处理的中等浓度的SEB(0.5ng/mL)刺激的、来自代表性供体的PBMC的IFNγ分泌特征绘图。
图21A-21D显示，PD-1x LAG-3双特异性双抗体DART I能够刺激细胞因子产生，达到比施用抗PD-1mAb+抗LAG-3mAb(PD-1mAb A+LAG-3mAb A)的组合时所观察到的水平更高的水平。将用通过PD-1x LAG-3双特异性双抗体DART-I、抗PD-1和抗LAG-3抗体联合处理，或通过同种型对照处理的破伤风毒素(5μg/mL)刺激的、来自两个代表性供体的CD4记忆细胞的IFNγ(图21A和21C)和IL-2(图21B和21D)分泌特征绘图。在第7天，使用来自两个代表性供体的CD4记忆T细胞的结果显示在图21A-B和图21C-D中。
图22显示食蟹猴中PD-1x LAG-3双特异性分子DART I的药物动力学与抗PD-1抗体PD-1mAb AIgG4(P)的药物动力学相当。线指示DART I(实线)和PD-1mAb A(虚线)的平均血清浓度。将雄性(实心)和雌性(空心)猴子针对DART I(三角形)和PD-1mAb A(圆形)的单个值绘图。
图23A-23C显示，在用不同的抗PD-1抗体处理之后，随着时间的推移，动物中的血清抗体浓度和CD4+或CD8+T细胞的表面上结合的PD-1的百分数。将抗PD 1mAb治疗之后CD4+或CD8+T细胞的表面上结合的PD 1的百分数绘制在右侧y轴上；符号表示每个动物个体的T细胞上结合的PD 1的％并且虚线表示平均值。血清mAb浓度绘制在左侧y轴上；符号表示每个动物个体的血清水平并且实线表示数据的非线性拟合。每个图表示在第1天通过IV输注而施用10mg/kg hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)(图23A)、PD-1mAb A IgG4(P)(图23B)或PD-1mAbB IgG4(P)(图23B)的动物(n＝1/性别/组)的数据。
发明详述
本发明涉及PD-1结合分子，其包括如下选择的能够结合食蟹猴PD-1和人PD-1的抗PD-1抗体的PD-1结合结构域：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15。本发明尤其涉及PD-1结合分子，其是这类抗体的人源化形式或嵌合形式，或，其包括这类抗PD-1抗体的PD-1结合片段(尤其地，免疫缀合物、双抗体(包括但不限于DART-A、DART-B、DART-C、DART-D、DART-E、DART-F、DART-G、DART-H、DART-I和DART-J)、BiTE、双特异性抗体等)。本发明尤其涉及这类PD-1结合分子，其另外能够结合免疫细胞的表面上存在的参与调节免疫检查点的分子的表位。本发明也涉及使用这类PD-1结合分子检测PD-1或刺激免疫应答的方法。本发明也涉及联合疗法的方法，其中包括这类选择的抗PD-1抗体的一个或多个PD-1结合结构域的PD-1结合分子联合有效刺激免疫应答的一种或多种另外的分子和/或联合特异性结合癌症抗原的一种或多种另外的分子施用。
I.抗体和它们的结合结构域
本发明的抗体是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变结构域中的至少一个抗原识别位点而特异性结合至靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用，术语“抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼源化(camelized)抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fvs(sdFv)、胞内抗体和任何上述的表位结合片段。尤其地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。除了它们在诊断中已知的用途，已经证明抗体可用作治疗剂。抗体能够免疫特异性结合多肽或蛋白质或非蛋白质分子，因为在这样的分子上存在特定的结构域或部分或构象(“表位”)。包含表位的分子可具有免疫原性活性，以便其在动物中引起抗体产生反应；这类分子称为“抗原”)。最近数十年已经看到对抗体的治疗潜能的兴趣的复兴，并且抗体已经成为一种主要类型的生物技术衍生的药物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。超过200种基于抗体的药物已经被批准使用或正在开发。
术语“单克隆抗体”指同质型(homogeneous)抗体群体，其中单克隆抗体包括参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然产生的和非天然产生的)。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个表位(或抗原位点)。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包括具有结合抗原的必要的特异性和能力的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构造(configuration)。就抗体的来源或制备其的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)而言，不旨在是限制性的。术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据“抗体”的定义描述的片段等。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody OfPredefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用免疫原性量的细胞、细胞提取物或包含期望的表位的蛋白质制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是但不限于原代细胞、培养细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可被培养一段时间(例如，至少24小时)，然后将它们用作免疫原。细胞它们本身或联合非变性佐剂，比如Ribi，可用作免疫原(见，例如，Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,”ILARJ.37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原时，细胞应保持完整并且优选地有活性。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被免疫的动物更好地检测。变性或烈性佐剂，例如，弗氏佐剂的使用，可使细胞破裂，因此，其应用受阻。免疫原可以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以以维持在动物(例如，在组织重组体中)中的生存力这样的方式被施用。可选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有单克隆抗体和任意其他等价抗体可被测序，并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方式中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞中保持在载体中，并且，可然后扩展和冷冻宿主细胞，用于将来的使用。这样的抗体的多核苷酸序列可用于基因操作，以产生本发明的单特异性或多特异性(例如，双特异性、三特异性和四特异性)分子以及亲和力优化的嵌合抗体、人源化抗体和/或犬源化(caninized)抗体，以改善抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原理涉及保留抗体的抗原结合的部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。
天然抗体(比如IgG抗体)包括与两条重链复合的两条轻链。每条轻链包含可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。每条重链包含可变结构域(VH)，三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，和位于CH1和CH2结构域之间的“铰链”结构域(“H”)。天然产生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元因此是具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常作为约150,000Da的糖蛋白被表达。每条链的氨基端(“N-末端”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变结构域。每条链的羧基端(“C-末端”)部分限定了恒定区，其中轻链具有单个恒定结构域而重链通常具有三个恒定结构域和铰链结构域。因此，IgG分子的轻链的结构是n-VL-CL-c并且IgG重链的结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是铰链结构域，n和c分别表示多肽的N-末端和C-末端)。IgG分子的可变结构域由互补决定区(CDR)和称为框架区段(FR)的非CDR区段组成，所述互补决定区(CDR)包含与表位接触的残基，所述框架区段一般维持结构和决定CDR环的定位，以便允许这类接触(尽管某些框架残基也可接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗体轻链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域。类似地，是(或可用作)抗体重链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域。因此，术语CDRL1结构域、CDRL2结构域、CDRL3结构域、CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域指当并入到蛋白质中时使得该蛋白质能够结合特异性表位的多肽，无论这样的蛋白质是否是具有轻链和重链的抗体或双抗体或单链结合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一类型的蛋白质。因此，如本文所使用，术语“表位结合片段”意思是能够免疫特异性结合表位的抗体的片段，并且术语“表位结合位点”指包含表位结合片段的分子的、负责表位结合的部分。表位结合位点可包含这类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR结构域，并且尽管能够免疫特异性结合这类表位，但可展示对与这样的抗体的表位不同的这样的表位的特异性、亲和力或选择性。但是，优选地，表位结合片段将包含这类抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单个多肽链(例如，scFv)，或可包括两条或更多条多肽链，每条链均具有氨基末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、F(ab')2片段等)。
本发明尤其包括本发明的抗PD-1抗体的单链可变结构域片段(“scFv”)和包括其的多特异性结合分子。通过使用短的连接肽连接轻链和/或重链可变结构域而制备单链可变结构域片段。Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变结构域的羧基端和另一可变结构域的氨基端之间横桥接约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。连接体可进而被修饰，用于另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体。可经重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组产生scFv，可将包含编码scFv的多核苷酸的适当的质粒引入到适当的宿主细胞中，所述宿主细胞是真核细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，或原核细胞，比如大肠埃希氏菌(E.coli)。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
本发明还尤其包括本发明的抗PD-1抗体的人源化的变体和包括其的多特异性结合分子。术语“人源化”抗体指一般使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。本发明的抗人PD-1抗体包括抗体PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15的人源化变体、嵌合变体或犬源化变体。这类抗体的可变结构域的多核苷酸序列可用于遗传操作，以产生这类衍生物和改善这类抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原则涉及保留抗体的抗原结合部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。人源化单克隆抗体有四个基本步骤。这些是：(1)确定开始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列(2)设计人源化抗体或犬源化抗体，即，决定在人源化或犬源化过程中使用哪种抗体框架区域(3)实际人源化或犬源化方法/技术和(4)转染和表达人源化抗体。见，例如，美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
抗原结合位点可包括与恒定结构域融合的完整的可变结构域或仅仅包括移植至适当框架区的这类可变结构域的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代被修饰。这消除了人个体中作为免疫原的恒定区，但是仍保留对外源可变结构域的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一种方法不仅仅关注提供源自人的恒定区，而且也修饰可变结构域，以便重塑它们使其尽可能地与人形式接近。已知重链和轻链的可变结构域都包含三个互补决定区(CDR)，侧翼是四个框架区(FR)，所述互补决定区(CDR)对所讨论的抗原响应不同并且决定结合能力，所述框架区(FR)在给定物种中相对保守并且推定其为CDR提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可变结构域。已经报道了该方法应用于各种抗体：Sato,K.等(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodiesfor Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping HumanAntibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody ByCDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped HumanAntibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping AHuman Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial VirusInfection in vivo,”Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.等(1991)“HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human CancerTherapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“ChimericAnd Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化抗体保留所有的CDR序列(例如，人源化鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其他实施方式中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其序列相对于初始抗体不同。
已经描述了包括源自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的许多“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物或修饰的啮齿动物可变结构域和它们与人恒定结构域融合的相关的互补决定区(CDR)的嵌合抗体(见，例如，Winter等(1991)“Man-made Antibodies,”Nature349:293-299；Lobuglio等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224(1989),Shaw等(1987)“Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,”J.Immunol.138:4534-4538,and Brown等(1987)“Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human ChimericMonoclonal Antibody,”Cancer Res.47:3577-3583)。其他参考文献描述了移植至人支撑框架区(FR)的啮齿动物CDR，其然后与适当的人抗体恒定结构域融合(见，例如，Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An AntilysozymeActivity,”Science 239:1534-1536；和Jones等(1986)“Replacing TheComplementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From AMouse,”Nature 321:522-525)。另外的参考文献描述了由重组修饰的啮齿动物框架区支撑的啮齿动物CDR。见，例如，欧洲专利公开号519,596。这些“人源化的”分子被设计，以使对啮齿动物抗人抗体分子的不利免疫应答最小化，所述不利免疫应答限制了这些部分在人接受者中治疗应用的持续时间和效力。也可使用的人源化抗体的其他方法，其公开在以下文献中：Daugherty等(1991)“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody DirectedAgainst The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,”Nucl.Acids Res.19:2471-2476和美国专利号6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
II.Fcγ受体(FcγR)
两条重链的CH2和CH3结构域相互作用，以形成Fc区域，其是被细胞Fc受体，包括但不限于Fcγ受体(FcγR)，识别的结构域。如本文所使用，术语“Fc区域”用于限定IgG重链的C-末端区域。示例性人IgG1的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003673007740000291
如在Kabat阐释的EU索引编号，其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0003673007740000301
如在Kabat阐释的EU索引编号，其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)：
Figure BDA0003673007740000302
如在Kabat阐释的EU索引编号，其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)：
Figure BDA0003673007740000303
Figure BDA0003673007740000311
如在Kabat阐释的EU索引编号，其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
遍及本说明书，IgG重链的恒定区中残基的编号是如在Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,NH1,MD(1991)(“Kabat”)中的EU索引的编号，其通过参考明确并入本文。术语“如在Kabat的EU索引”指人IgG1 EU抗体的编号。通过链中氨基酸的位置命名来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变结构域的氨基酸。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，鉴定了每个亚组的氨基酸共有序列，并且为每个氨基酸赋予残基编号，并且，如Kabat定义的来鉴定CDR(应当理解，如Chothia,C.&Lesk,A.M.((1987)“Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins,”.J.Mol.Biol.196:901-917)限定的CDRH1在之前的五个残基开始)。通过参考保守的氨基酸比对所讨论的抗体与Kabat中的共有序列中的一条，Kabat的编号方案可扩展至未包括在其纲要中的抗体。用于赋予残基编号的该方法已经成为本领域的标准并且容易鉴定在不同抗体，包括嵌合或人源化的变体中等同位置处的氨基酸。例如，在人抗体轻链50位的氨基酸占据与在小鼠抗体轻链的50位氨基酸的等同位置。
在抗体恒定区中的许多不同位置(例如，CH1位置，包括但不限于192、193和214位；Fc位置，包括但不限于270、272、312、315、356和358位，如在Kabat阐释的EU索引编号)处已经观察到了多态性，因此示出的序列和现有技术的序列之间可能存在轻微的差别。已经充分表征了人免疫球蛋白的多态性形式。目前，已知18个Gm同种异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(Lefranc,等,“The Human IgG Subclasses:Molecular Analysis Of Structure,Function And Regulation.”Pergamon,Oxford,43-78页(1990)；Lefranc,G.等1979，Hum.Genet.:50,199-211)。具体考虑本发明的抗体可并入任何免疫球蛋白基因的任何同种异型(allotype)、异同种异型(isoallotype)或单倍型(haplotype)，并且不限于本文提供的序列的同种异型、异同种异型或单倍型。此外，在一些表达体系中，CH3结构域的C-末端氨基酸残基(上面粗体显示的)可在翻译后去除。因此，CH3结构域的C-末端残基是本发明的PD-1结合分子中的任选的氨基酸残基。本发明具体考虑缺少CH3结构域的C-末端残基的PD-1结合分子。本发明也具体考虑包括CH3结构域的C-末端赖氨酸残基的这类构建体。
通过将Fc区连接至细胞Fcγ受体(FcγR)转换激活信号和抑制信号。导致正好相反的功能的这类连接的能力是由于不同FcγR之间的结构差异造成的。受体的胞质信号传导结构域中的两个不同的结构域——称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAMs)和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIMS)——是造成不同应答的原因。募集不同胞质酶到这些结构中控制了FcγR-介导的细胞应答的结果。含有ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，然而，含ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。人嗜中性粒细胞表达FcγRIIA基因。通过免疫复合物或特异性抗体交联的FcγRIIA聚类用于使ITAM与促进ITAM磷酸化的受体相关的激酶聚集。ITAM磷酸化充当Syk激酶的停泊位点，Syk激酶的激活导致下游底物(例如，PI3K)的激活。细胞激活导致促炎性介质的释放。FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达；其细胞外结构域与FcγRIIA是96％一致的，并且以不能区分的方式结合IgG复合物。ITIM在FcγRIIB的胞质结构域中的存在限定了FcγR的这种抑制性亚类。最近，确定了这种抑制的分子基础。当与激活FcγR共连接时，FcγRIIB中的ITIM变成磷酸化的，并且吸引肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)水解由于含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶激活而释放的磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++的流入。因此，FcγRIIB的交联抑制对FcγR连接的激活应答并抑制细胞应答。B-细胞激活、B-细胞增殖和抗体分泌因此被中止。
III.双特异性抗体/多特异性双抗体和
Figure BDA0003673007740000331
双抗体
抗体结合抗原的表位的能力取决于抗体的VL和VH结构域的存在和氨基酸序列。抗体轻链和抗体重链的相互作用，尤其地，其VL和VH结构域的相互作用，形成天然抗体的两个表位结合位点之一。天然抗体能够结合仅仅一个表位种类(即，它们是单特异性的)，但是它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示双价或多价)。
本发明的结合结构域以“免疫特异性”方式结合表位。如本文所使用，如果抗体、双抗体或其他表位结合分子，相对于可选的表位，与另一分子的区域(即，表位)更经常、更快速、以更长的持久性和/或以更大的亲和力反应或缔合，则认为抗体、双抗体或其他表位结合分子“免疫特异性”结合该表位。例如，免疫特异性结合病毒表位的抗体是，相比其免疫特异性结合其他病毒表位或非病毒表位，以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持久性结合该病毒表位的抗体。通过阅读该定义，应理解，例如，免疫特异性结合第一靶的抗体(或部分或表位)可特异性或非特异性或优选或非优选结合第二靶。因此，“免疫特异性结合”不必要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言，但不是必要的，提及结合意思是“特异性”结合。如果两个分子的结合展示受体结合它们各自配体的特异性，则认为两个分子能够彼此以“物理特异性”方式结合。
可通过产生可同时结合两个分开的和独特的抗原(或相同抗原的不同表位)的基于多特异性抗体的分子，和/或通过产生对于相同的表位和/或抗原具有更高价(即，大于两个结合位点)的基于抗体的分子，增强抗体的功能。
为了提供比天然抗体具有更大能力的分子，已经开发了各种重组双特异性抗体形式(见，例如，PCT公布号WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用连接肽，所述连接肽与其他表位结合片段(例如，scFv、VL、VH等)融合或在抗体核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或与多个表位结合片段(例如，两个Fab片段或scFvs)融合。可选的形式使用连接肽，以将表位结合片段(例如，scFv、VL、VH等)与二聚化结构域，比如CH2-CH3结构域，或可选的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，这些方法涉及折中和权衡。例如，PCT公开号WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO2010/136172公开了使用连接体可造成治疗情形中的问题，并且教导了三特异性抗体，其中CL和CH1结构域由其各自的天然位置被转变，并且VL和VH结构域已经被多样化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允许它们结合大于一种抗原。因此，在这些文档中公开的分子用结合特异性换取了结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO 2013/163427和WO 2013/119903公开了修饰CH2结构域，以包含包括结合结构域的融合蛋白加合物。文档指出，CH2结构域在介导效应子功能过程中可能仅仅起到最小的作用。PCT公开号WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公开了重组抗体，其Fc区已经用另外的VL和VH结构域替换，以便形成三价结合分子。PCT公开号WO 2003/025018和WO2003012069公开了重组双抗体，其单个链包含scFv结构域。PCT公开号WO 2013/006544公开了多价Fab分子，其作为单多肽链被合成，然后经历蛋白酶解，以产生异源二聚化结构。因此，这些文档中公开的分子用所有或一些介导效应子功能的能力换取结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公开了添加另外的结合结构域或功能集团至抗体或抗体部分(例如，添加双抗体至抗体的轻链或添加另外的VL和VH结构域至抗体的轻链和重链或添加异源融合蛋白或彼此链接多个Fab结构域)。因此，这些文档中公开的分子用天然抗体结构换取结合另外的抗原种类的能力。
现有技术已经另外注意到产生在能够结合两个或多个不同表位种类(即，除了双价或多价之外显示双特异性或多特异性)方面不同于这样的天然抗体的双抗体的能力(见，例如，Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific AntibodyFragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448、US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388/WO 02/02781(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody ToBoth The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth FactorReceptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEADiabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Protein Eng.Des.Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein IsMediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For CancerTherapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
双抗体的设计是基于被称为单链可变结构域片段(scFv)的抗体衍生物。这样的分子通过利用短连接肽连接轻链和/或重链可变结构域而制备。B Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。连接体进而可被修饰用于另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体。可重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组体产生scFv，可将包含编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入适当的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，或原核细胞，比如大肠埃希氏菌。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
非单特异性双抗体的供应提供了相对于抗体的明显优势，包括但不限于共连接和共定位表达不同表位的细胞的能力。因此，双特异性双抗体具有宽范围的应用，包括治疗和免疫诊断。在各种应用中，双特异性在设计和工程化双抗体方面允许大的灵活性，提供对多聚抗原的增强的亲合力、不同抗原的交联和对特定细胞类型的导向靶向，这取决于两个靶抗原的存在。由于其增加的价、低离解速率和从循环中快速清除(对于小尺寸的双抗体，为～50kDa或以下)，本领域中已知的双抗体分子在肿瘤成像领域还显示特别的用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide StabilizedDiabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。
双抗体的双特异性使得它们用于共连接不同的细胞，例如，将细胞毒性T细胞与肿瘤细胞交联(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells,”Nature 314:628-631；和Holliger等(1996)“Specific Killing Of LymphomaCells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like BispecificAntibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。可选地，或另外，双特异性双抗体可用于共连接不同细胞或单个细胞表面上的受体。不同细胞和/或受体的共连接可用于调节效应子功能和/或免疫细胞信号传导。包括表位结合位点的多特异性分子(例如，双特异性双抗体)可被引导至在T淋巴细胞、天然杀伤细胞(NK)细胞、抗原呈递细胞或其他单核细胞上表达的任何免疫细胞的表面决定簇，所述免疫细胞比如B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32、CD40、CD40L、CD47、CD64、CD70(CD27L)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD94(KLRD1)、CD137(4-1BB)、CD137L(4-1BBL)、CD226、CTLA-4(CD152)、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS(CD278)、ICOSL(CD275)、Killer激活受体(KIR)、LAG-3(CD223)、LIGHT(TNFSF14、CD258)、I类或II类MHC、NKG2a、NKG2d、OX40(CD134)、OX40L(CD134L)、PD1H、PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1、CD274)、PD-L2(B7-CD、CD273)、PVR(NECL5、CD155)、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3(HAVCR2)和/或VISTA(PD-1H)。尤其地，被引导至参与调节免疫检查点的细胞表面受体(或其配体)的表位结合位点可用于产生双特异性或多特异性结合分子，所述双特异性或多特异性结合分子对抗或阻断免疫检查点分子的抑制性信号传导，从而刺激、上调或增强受试者中的免疫应答。参与调节免疫检查点的分子包括但不限于B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I类或II类MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3和/或VISTA。
但是，上述优势需要突出的成本。这类非单特异性双抗体的形成需要成功组装两个或更多个独特和不同的多肽(即，这样的形成需要通过不同多肽链种类的异源二聚化而形成双抗体)。该事实与单特异性双抗体不同，其通过一致的多肽链的同源二聚化而形成。由于至少两个不同的多肽(即，两个多肽种类)必须被提供以形成非单特异性双抗体并且由于这样的多肽的同源二聚化导致失活分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，这样的多肽的产生必须以防止相同种类的多肽之间的共价结合的方式完成(即，以便防止同源二聚化)(Takemura,S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。所以，现有技术教导了这类多肽的非共价缔合(见，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer ImmunotherapyAnd Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(SmallRecombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific AntibodyTo Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like GrowthFactor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
但是，现有技术已经认识到由非共价缔合的多肽组成的双特异性双抗体不稳定并且容易解离成非功能单体(见，例如，Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
面对这样的挑战，本领域已经成功地开发了稳定的、共价结合的异源二聚非单特异性双抗体，称为
Figure BDA0003673007740000381
(双亲和力重靶向试剂)双抗体；见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Sloan,D.D.等(2015)“Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cellsby Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)that Bind HIV Envelope andRecruit Cytotoxic T Cells,”PLoS Pathog.11(11):e1005233.doi:10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini,M.等(2015)“Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting
Figure BDA0003673007740000382
Platform,”Blood pii:blood-2014-05-575704；Chichili,G.R.等(2015)“A CD3xCD123 Bispecific DART ForRedirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia:Preclinical Activity AndSafety In Nonhuman Primates,”Sci.Transl.Med.7(289):289ra82；Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve OptimalRedirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment OfFcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel BispecificAntibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-TargetingProtein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449)。这样的双抗体包括两个或多个共价复合的多肽并涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化到每个应用的多肽种类中，其允许形成二硫键，从而共价结合两条多肽链。例如，将半胱氨酸残基添加至这样的构建体的C-末端已经被证明允许多肽链之间的二硫结合，稳定了产生的异源二聚体，而不干扰二价分子的结合特性。
最简单的双特异性
Figure BDA0003673007740000391
双抗体的两条多肽的每一条包括三个结构域。第一条多肽包括(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一结构域，其包括第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区；(ii)第二结构域，其包括第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区；和(iii)第三结构域，其含有半胱氨酸残基(或含半胱氨酸的结构域)和异源二聚体促进结构域，其用于促进与双抗体的第二多肽的异源二聚化和彼此共价结合双抗体的第一和第二多肽。第二多肽含有(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一结构域，其包括第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区；(ii)第二结构域，其包括第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区；和(iii)第三结构域，其含有半胱氨酸残基(或含半胱氨酸的结构域)和互补性异源二聚体促进结构域，其与第一多肽链的异源二聚体促进结构域复合，以促进与第一多肽链的异源二聚化。第二多肽链的第三结构域的半胱氨酸残基(或含半胱氨酸的结构域)用于促进双抗体的第二多肽链与第一多肽链的共价结合。这样的分子是稳定的、有效的，并且具有同时结合两个或多个抗原的能力。在一个实施方式中，第一和第二多肽的第三结构域各含半胱氨酸残基，其用于经二硫键将多肽结合在一起。图1提供了这样的双抗体的示意图，其使用E螺旋/K螺旋异源二聚体-促进结构域和包含半胱氨酸的连接体用于共价结合。如图2和图3A-3C中所提供的，多肽中的一条或两条可另外具有CH2-CH3结构域的序列，以便两条双抗体多肽之间的复合形成能够结合细胞(比如B淋巴细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的Fc受体的Fc区。如在下面更详细提供的，这类多肽链的CH2和/或CH3结构域不需要序列一致，并且有利地被修饰以促进两条多肽链之间的复合。
已经描述了这类分子的许多变型(见，例如，美国专利公开号2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053和2009/0060910；欧洲专利公开号EP2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。这些包含Fc区域的
Figure BDA0003673007740000401
双抗体可包括两对多肽链。第一多肽链包括(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一结构域，其包括第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区，(ii)第二结构域，其包括第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区，(iii)第三结构域，其包含半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)并且用于促进与双抗体的第二多肽的异源二聚化并且使双抗体的第一和第二多肽彼此共价结合，和(iv)CH2-CH3结构域。第二多肽包含(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一结构域，其包括第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区，(ii)第二结构域，其包括第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区，和(iii))第三结构域，其包含半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)和异源二聚体-促进结构域，所述异源二聚体-促进结构域促进与第一多肽链的异源二聚化。在本文中，两条第一多肽彼此复合，以形成Fc区。图3A-3C提供了利用不同的异源二聚体-促进结构域的这类双抗体的三个变型的示意图。
其他包含Fc区的
Figure BDA0003673007740000402
双抗体可包括三条多肽链。这类
Figure BDA0003673007740000403
双抗体的第一多肽包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域、和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。这类
Figure BDA0003673007740000404
双抗体的第二多肽包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域、和(iii)促进与双抗体的第一多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。这类
Figure BDA0003673007740000405
双抗体的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，这类
Figure BDA0003673007740000406
双抗体的第一和第二多肽链缔合在一起，以形成能够结合表位的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。这类更复杂的
Figure BDA0003673007740000407
分子也具有包含半胱氨酸的结构域，其用于形成共价结合的复合物。因此，第一和第二多肽通过涉及在它们各自第三结构域中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。值得注意的是，第一和第三多肽链彼此复合，以形成经二硫键稳定的Fc区。图4A-4B提供了包括三条多肽链的这类双抗体的示意图。
其他包含Fc区的
Figure BDA0003673007740000411
双抗体可包括五条多肽链，其可包括来自多达三种不同免疫球蛋白的轻链和重链可变结构域的结合区(称为VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3)。例如，这类双抗体的第一多肽链可包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域、和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。这类双抗体的第二和第五条多肽链可包含：(i)包含VL1的结构域、和(ii)包含CL的结构域。这类双抗体的第三多肽链可包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域、(iii)包含CH2-CH3序列的结构域、(iv)包含VL2的结构域、(v)包含VH3的结构域、和(vi)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第三链与第四链的二聚化。这类双抗体的第四多肽可包含：(i)包含VL3的结构域、(ii)包含VH2的结构域、和(iii)促进与双抗体的第三多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。在本文中，第一和第三多肽彼此复合，以形成Fc区。这类更复杂的
Figure BDA0003673007740000412
分子也具有包含半胱氨酸的结构域，其用于形成共价结合的复合物，以便每条多肽链通过涉及半胱氨酸残基的二硫键结合至少一种另外的多肽链。优选地，这类结构域在N-末端至C-末端方向上排列。图5提供了包括五条多肽链的这类双抗体的示意图。
用于期望四价分子而不需要Fc的应用的可选的构建体在本领域中是已知的，包括但不限于四价串联抗体，也称为“TandAbs”(见，例如美国专利公开号2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；欧洲专利公开号EP 1078004、EP2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公开号WO 1999/057150、WO 2003/025018，和WO2013/013700)，其通过每个具有VH1、VL2、VH2和VL2结构域的两条相同链的同源二聚化而形成。
最近，已经描述了合并两个双抗体型结合结构域和一个非双抗体型结构域和Fc区的三价结构(见，例如，2015年5月29日提交的PCT申请号：PCT/US15/33076，名称是“Tri-Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof”和2015年5月29日提交的PCT/US15/33081，名称是“Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bindto Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof”)。这类三价分子可用于产生单特异性，双特异性或三特异性分子。图6A-6F提供了包括3或4条多肽链的这类三价分子的示意图。
IV.本发明的抗人PD-1结合分子
本发明优选的PD-1结合分子包括抗体、双抗体、BiTE等，并且能够结合人PD-1(CD279)的连续的或不连续的(例如，构象)部分(表位)。本发明PD-1结合分子优选地也展示结合一个或多个非人物种，尤其地，灵长类物种(尤其是灵长类物种，比如食蟹猴)，的PD-1分子的能力。代表性人PD-1多肽(NCBI序列NP_005009.2；包括20个氨基酸残基信号序列(以下划线显示)和268个氨基酸残基成熟蛋白质)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:68)：
Figure BDA0003673007740000421
在某些实施方式中，本发明的抗人PD-1结合分子特征在于任何(一个或多个)下述标准：
(1)特异性结合在刺激的人T-细胞的表面上内源表达的人PD-1；
(2)特异性结合人PD-1，平衡结合常数(KD)为40nM或更小；
(3)特异性结合人PD-1，平衡结合常数(KD)为5nM或更小；
(4)特异性结合人PD-1，结合速率(on rate)(ka)为1.5x104M-1min-1或更大；
(5)特异性结合人PD-1，结合速率(ka)为90.0x104M-1min-1或更大；
(6)特异性结合人PD-1，解离速率(off rate)(kd)为7x10-4min-1或更小；
(7)特异性结合人PD-1，解离速率(kd)为2x10-4min-1或更小；
(8)特异性结合非人灵长类PD-1(例如，食蟹猴的PD-1)；
(9)抑制(即，阻断或干扰)PD-1配体(PD-L1/PD-L2)与PD-1的结合/抑制活性；
(10)刺激免疫应答；和/或
(11)与抗人LAG-3抗体协同作用，以刺激抗原特异性T-细胞应答。
如本文使用的，术语“抗原特异性T-细胞应答”指通过用对T细胞特异性的抗原刺激T细胞而导致的T细胞的应答。在抗原特异性刺激时，通过T细胞应答的非限制性例子包括增殖和细胞因子产生(例如，TNF-α、IFN-γ产生)。分子刺激抗原特异性T-细胞应答的能力可使用例如本文所述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肠毒素B型抗原(“SEB”)刺激的PBMC试验来测定。
本发明优选的抗人PD-1结合分子具有下述鼠科抗人PD-1单克隆抗体的VH和/或VL结构域：“PD-1mAb 1”、“PD-1mAb 2”、“PD-1mAb 3”、“PD-1mAb 4”、“PD-1mAb 5”、“PD-1mAb6”、“PD-1mAb 7”、“PD-1mAb 8”、“PD-1mAb 9”、“PD-1mAb 10”、“PD-1mAb 11”、“PD-1mAb12”、“PD-1mAb 13”、“PD-1mAb 14”或“PD-1mAb 15”，并且更优选地具有这类抗人PD-1单克隆抗体的VH结构域的1、2或所有3个CDRH和/或VL结构域的1、2或所有3个CDRL。这类优选的抗人PD-1结合分子包括双特异性(或多特异性)抗体、嵌合或人源化抗体、BiTE、双抗体等，和具有变异的Fc区域的这类结合分子。
本发明尤其涉及包括PD-1结合结构域的PD-1结合分子，所述结合结构域具有：
(A)(1)PD-1mAb 1的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 1的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 1的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 1的VL结构域的三个CDRL；
(4)hPD-1mAb 1VH1的VH结构域；
(5)hPD-1mAb 1VL1的VL结构域；
(6)hPD-1mAb 1的VH和VL结构域；
(B)(1)PD-1mAb 2的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 2的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 2的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 2的VL结构域的三个CDRL；
(4)hPD-1mAb 2VH1的VH结构域；
(5)hPD-1mAb 2VL1的VL结构域；
(6)hPD-1mAb 2的VH和VL结构域；
(C)(1)PD-1mAb 3的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 3的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 3的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 3的VL结构域的三个CDRL；
(D)(1)PD-1mAb 4的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 4的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 4的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 4的VL结构域的三个CDRL；
(E)(1)PD-1mAb 5的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 5的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 5的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 5的VL结构域的三个CDRL；
(F)(1)PD-1mAb 6的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 6的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 6的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 6的VL结构域的三个CDRL；
(G)(1)PD-1mAb 7的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 7或hPD-1mAb 7VL2或hPD-1mAb 7VL3的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 7的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 7或hPD-1mAb 7VL2、hPD-1mAb7VL3的VL结构域的三个CDRL；
(4)hPD-1mAb 7VH1或hPD-1mAb 7VH2的VH结构域；
(5)hPD-1mAb 7VL1或hPD-1mAb 7VL2或hPD-1mAb 7VL 3的VL结构域；
(6)hPD-1mAb 7(1.1)，或hPD-1mAb 7(1.2)，或hPD-1mAb 7(1.3)，或hPD-1mAb 7(2.1)，或hPD-1mAb 7(2.2)，或hPD-1mAb 7(2.3)的VH和VL结构域；
(H)(1)PD-1mAb 8的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 8的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 8的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 8的VL结构域的三个CDRL；
(I)(1)PD-1mAb 9或hPD-1mAb 9VH2的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 9或hPD-1mAb 9VL2的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 9或hPD-1mAb 9VH2的VH结构域的三个CDRH，和PD-1mAb 9或hPD-1mAb9VL2的VL结构域的三个CDRL；
(4)hPD-1mAb 9VH1，或hPD-1mAb 9VH2的VH结构域；
(5)hPD-1mAb 9VL1，或hPD-1mAb 9VL2的VL结构域；
(6)hPD-1mAb 9(1.1)，或hPD-1mAb 9(1.2)，或hPD-1mAb 9(2.1)，或hPD-1mAb 9(2.2)的VH和VL结构域；
(J)(1)PD-1mAb 10的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 10的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 10的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 10的VL结构域的三个CDRL；
(K)(1)PD-1mAb 11的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 11的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 11的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 11的VL结构域的三个CDRL；
(L)(1)PD-1mAb 12的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 12的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 12的VH结构域和PD-1mAb 12的VL结构域的三个CDRH；
(M)(1)PD-1mAb 13的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 13的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 13的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 13的VL结构域的三个CDRL；
(N)(1)PD-1mAb 14的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 14的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 14的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 14的VL结构域的三个CDRL；
(O)(1)PD-1mAb 15的VH结构域的三个CDRH；
(2)PD-1mAb 15的VL结构域的三个CDRL；
(3)PD-1mAb 15的VH结构域的三个CDRH和PD-1mAb 15的VL结构域的三个CDRL；
(4)hPD-1mAb 15VH1的VH结构域；
(5)hPD-1mAb 15VL1的VL结构域；
(6)hPD-1mAb 15的VH和VL结构域；
或
其与PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15结合相同的表位，或与其竞争结合相同的表位。
A.抗人PD-1抗体PD-1mAb 1
1.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 1
PD-1mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:69)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000471
PD-1mAb 1的CDRH1(SEQ ID NO:71):NDYAWN
PD-1mAb 1的CDRH2(SEQ ID NO:72)：HITYSGSTSYNPSLKSPD-1mAb 1的CDRH3(SEQ IDNO:73):DYGSGYPYTLDY
编码PD-1mAb 1的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:70(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000472
PD-1mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:74)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000473
PD-1mAb 1的CDRL1(SEQ ID NO:76):SATSIVSYVY
PD-1mAb 1的CDRL2(SEQ ID NO:77):LTSNLAS
PD-1mAb 1的CDRL3(SEQ ID NO:78):QQWSDNPYT
编码PD-1mAb 1的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:75(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000481
2.人源化抗人PD-1抗体PD-1mAb1以形成“hPD-1mAb 1”
当鉴定了抗原表位时，将上述鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 1人源化并且进一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗体从而在施用至人接受者时降低其抗原性的能力。人源化产生一个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 1VH1”和一个人源化的VL结构域，本文命名为“hPD-1mAb 1VL1”。因此，包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域的抗体被称为“hPD-1mAb 1”。
hPD-1mAb 1VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000482
编码hPD-1mAb 1VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:80(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000483
hPD-1mAb 1VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000484
Figure BDA0003673007740000491
编码hPD-1mAb 1VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:82(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000492
B.抗人PD-1抗体PD-1mAb 2
1.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 2
PD-1mAb 2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000493
PD-1mAb 2的CDRH1(SEQ ID NO:85):SFGMH
PD-1mAb 2的CDRH2(SEQ ID NO:86)：YISSGSMSISYADTVKGPD-1mAb 2的CDRH3(SEQID NO:87):LSDYFDY
编码PD-1mAb 2的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:84(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000494
PD-1mAb 2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000501
PD-1mAb 2的CDRL1(SEQ ID NO:90):RSSQSLVHSTGNTYLHPD-1mAb 2的CDRL2(SEQ IDNO:91):RVSNRFS
PD-1mAb 2的CDRL3(SEQ ID NO:92):SQTTHVPWT
编码PD-1mAb 2的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:89(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000502
2.人源化抗人PD-1抗体PD-1mAb2以形成“hPD-1mAb 2”
当鉴定了抗原表位时，将上述鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 2人源化并且进一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗体从而在施用至人接受者时降低其抗原性的能力。人源化产生一个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 2VH1”和一个人源化的VL结构域本文命名为“hPD-1mAb 1VL1”。因此，任何包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域的抗体被称为“hPD-1mAb 2”。
hPD-1mAb 2VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:93)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000503
编码hPD-1mAb 2VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:94(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000504
Figure BDA0003673007740000511
hPD-1mAb 2VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:95)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000512
编码hPD-1mAb 2VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:96(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000513
C.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 3
PD-1mAb 3的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:97)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000514
PD-1mAb 3的CDRH1(SEQ ID NO:99):DYVMH
PD-1mAb 3的CDRH2(SEQ ID NO:100)：TIDPETGGTAYNQKFKG
PD-1mAb 3的CDRH3(SEQ ID NO:101):EKITTIVEGTYWYFDV
编码PD-1mAb 3的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:98(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000515
Figure BDA0003673007740000521
PD-1mAb 3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:102)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000522
PD-1mAb 3的CDRL1(SEQ ID NO:104):RSSQNIVHSNGDTYLEPD-1mAb 3的CDRL2(SEQID NO:105):KVSNRFS
PD-1mAb 3的CDRL3(SEQ ID NO:106):FQGSHLPYT
编码PD-1mAb 3的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:103(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000523
D.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 4
PD-1mAb 4的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:107)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000524
PD-1mAb 4的CDRH1(SEQ ID NO:109):SFGMH
PD-1mAb 4的CDRH2(SEQ ID NO:110)：YISSGSMSISYADTVKG
PD-1mAb 4的CDRH3(SEQ ID NO:111):LTDYFDY
编码PD-1mAb 4的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:108(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000531
PD-1mAb 4的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000532
PD-1mAb 4的CDRL1(SEQ ID NO:114):RSSQSLVHSTGNTYFHPD-1mAb 4的CDRL2(SEQID NO:115):RVSNRFS
PD-1mAb 4的CDRL3(SEQ ID NO:116):SQTTHVPWT
编码PD-1mAb 4的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:113(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000533
E.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 5
PD-1mAb 5的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000534
Figure BDA0003673007740000541
PD-1mAb 5的CDRH1(SEQ ID NO:119):AYWMN
PD-1mAb 5的CDRH2(SEQ ID NO:120)：VIHPSDSETWLNQKFKD
PD-1mAb 5的CDRH3(SEQ ID NO:121):EHYGSSPFAY
编码PD-1mAb 5的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:118(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000542
PD-1mAb 5的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:122)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000543
PD-1mAb 5的CDRL1(SEQ ID NO:124):RANESVDNYGMSFMNPD-1mAb 5的CDRL2(SEQ IDNO:125):AASNQGS
PD-1mAb 5的CDRL3(SEQ ID NO:126):QQSKEVPYT
编码PD-1mAb 5的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:123(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000544
F.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 6
PD-1mAb 6的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000551
PD-1mAb 6的CDRH1(SEQ ID NO:129):SYGMS
PD-1mAb 6的CDRH2(SEQ ID NO:130)：TISGGGSDTYYPDSVKG
PD-1mAb 6的CDRH3(SEQ ID NO:131):QKATTWFAY
编码PD-1mAb 6的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:128(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000552
PD-1mAb 6的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000553
PD-1mAb 6的CDRL1(SEQ ID NO:134):RASESVDNYGISFMN
PD-1mAb 6的CDRL2(SEQ ID NO:135):PASNQGS
PD-1mAb 6的CDRL3(SEQ ID NO:136):QQSKEVPWT
编码PD-1mAb 6的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:133(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000554
Figure BDA0003673007740000561
G.抗人PD-1抗体PD-1mAb 7
1.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 7
PD-1mAb 7的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000562
PD-1mAb 7的CDRH1(SEQ ID NO:139):SYWMN
PD-1mAb 7的CDRH2(SEQ ID NO:140)：VIHPSDSETWLDQKFKD
PD-1mAb 7的CDRH3(SEQ ID NO:141):EHYGTSPFAY
编码PD-1mAb 7的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:138(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000563
PD-1mAb 7的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:142)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000564
PD-1mAb 7的CDRL1(SEQ ID NO:144):RANESVDNYGMSFMNPD-1mAb 7的CDRL2(SEQ IDNO:145):AASNQGS
PD-1mAb 7的CDRL3(SEQ ID NO:146):QQSKEVPYT
编码PD-1mAb 7的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:143(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000571
2.人源化抗人PD-1抗体PD-1mAb7以形成“hPD-1mAb 7”
当鉴定了抗原表位时，将上述鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 7人源化并且进一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗体从而在施用至人接受者时降低其抗原性的能力。人源化产生两个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 7VH1”和“hPD-1mAb 7VH2”，和三个人源化的VL结构域本文命名为“hPD-1mAb 7VL1”、“hPD-1mAb 7VL2”和“hPD-1mAb 7VL3”。任何人源化的VL结构域可与任一人源化的VH结构域配对。因此，包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域之一的任何抗体一般称为“hPD-1mAb 7”，并且人源化的VH/VL结构域的具体组合通过参考特定的VH/VL结构域命名，例如包括hPD-1mAb 7VH1和hPD-1mAb1VL2的人源化抗体具体称为“hPD-1mAb 7(1.2)”。
hPD-1mAb 7VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:147)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000572
编码hPD-1mAb 7VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:148(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000573
Figure BDA0003673007740000581
hPD-1mAb 7VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:149)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000582
编码hPD-1mAb 7VH2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:150(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000583
hPD-1mAb 7VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:151)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000584
编码hPD-1mAb 7VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:152(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000585
Figure BDA0003673007740000591
hPD-1mAb 7VL2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000592
编码hPD-1mAb 7VL2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:154(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000593
hPD-1mAb 7VL3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:155)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000594
编码hPD-1mAb 7VL3的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:156(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000595
hPD-1mAb 7VL2和hPD-1mAb 7VL3二者的VL结构域的CDRL1包括天冬酰胺至丝氨酸的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：RASESVDNYGMSFMN((SEQ ID NO:157)，取代的丝氨酸以下划线显示)。考虑类似的取代可并入到上述任何PD-1mAb 7CDRL1结构域中。
另外，hPD-1mAb 7VL3的VL结构域的CDRL2包括谷氨酰胺至精氨酸的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：AASNRGS((SEQ ID NO:158)，取代的精氨酸以下划线显示)。考虑类似的取代可并入上述任何PD-1mAb 7CDRL2结构域中。
H.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 8
PD-1mAb 8的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:159)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000601
PD-1mAb 8的CDRH1(SEQ ID NO:161):DYYMN
PD-1mAb 8的CDRH2(SEQ ID NO:162)：DINPKNGDTHYNQKFKG
PD-1mAb 8的CDRH3(SEQ ID NO:163):DFDY
编码PD-1mAb 8的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:160(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000602
PD-1mAb 8的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:164)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000603
PD-1mAb 8的CDRL1(SEQ ID NO:166):RSSQTLVYSNGNTYLN
PD-1mAb 8的CDRL2(SEQ ID NO:167):KVSNRFS
PD-1mAb 8的CDRL3(SEQ ID NO:168):SQSTHVPFT
编码PD-1mAb 8的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:165(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000611
I.抗人PD-1抗体PD-1mAb 9
1.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 9
PD-1mAb 9的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:169)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000612
PD-1mAb 9的CDRH1(SEQ ID NO:171):SYLVS
PD-1mAb 9的CDRH2(SEQ ID NO:172)：TISGGGGNTYYSDSVKG
PD-1mAb 9的CDRH3(SEQ ID NO:173):YGFDGAWFAY
编码PD-1mAb 9的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:170(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000613
PD-1mAb 9的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000621
PD-1mAb 9的CDRL1(SEQ ID NO:176):RASENIYSYLA
PD-1mAb 9的CDRL2(SEQ ID NO:177):NAKTLAA
PD-1mAb 9的CDRL3(SEQ ID NO:178):QHHYAVPWT
编码PD-1mAb 9的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:175(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000622
2.人源化抗人PD-1抗体PD-1mAb9以形成“hPD-1mAb 9”
当鉴定了抗原表位时，将上述鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 9人源化并且进一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗体从而在施用至人接受者时降低其抗原性的能力。人源化产生两个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 9VH1”和“hPD-1mAb 9VH2”，和两个人源化的VL结构域本文命名为“hPD-1mAb 9VL1”和“hPD-1mAb 9VL2”。任何人源化的VL结构域可与人源化的VH结构域配对。因此，包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域之一的任何抗体一般称为“hPD-1mAb 9”，并且人源化的VH/VL结构域的具体组合通过参考特定的VH/VL结构域命名，例如包括hPD-1mAb 9VH1和hPD-1mAb 9VL2的人源化抗体具体称为“hPD-1mAb 9(1.2)”。
hPD-1mAb 9VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:179)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000623
Figure BDA0003673007740000631
编码hPD-1mAb 9VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:180(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000632
hPD-1mAb 9VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:181)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000633
编码hPD-1mAb 9VH2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:182(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000634
hPD-1mAb 9VH2的VH结构域的CDRH1包括丝氨酸至甘氨酸的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：SYLVG((SEQ ID NO:183)，取代的甘氨酸以下划线显示)。考虑类似的取代可并入上述任何PD-1mAb 9CDRH1结构域中。
hPD-1mAb 9VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:184)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000635
Figure BDA0003673007740000641
编码hPD-1mAb 9VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:185(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000642
hPD-1mAb 9VL2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:186)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000643
编码hPD-1mAb 9VL2的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:187(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000644
hPD-1mAb 9VL2的VL结构域的CDRL1包括丝氨酸至天冬酰胺的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：RASENIYNYLA(SEQ ID NO:188)，取代的天冬酰胺以下划线显示)。考虑类似的取代可并入上述任何PD-1mAb 9CDRL1结构域中。
hPD-1mAb 9VL2的VL结构域的CDRL2包括天冬酰胺至天冬氨酸的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：DAKTLAA((SEQ ID NO:189)，取代的天冬氨酸以下划线显示)。考虑类似的取代可并入上述任何PD-1mAb 7CDRL2结构域中。
J.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 10
PD-1mAb 10的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:190)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000651
PD-1mAb 10的CDRH1(SEQ ID NO:192):NYLMS
PD-1mAb 10的CDRH2(SEQ ID NO:193)：SISGGGSNIYYPDSVKG
PD-1mAb 10的CDRH3(SEQ ID NO:194):QELAFDY
编码PD-1mAb 10的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:191(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000652
PD-1mAb 10的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:195)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000653
PD-1mAb 10的CDRL1(SEQ ID NO:197):RTSQDISNFLN
PD-1mAb 10的CDRL2(SEQ ID NO:198):YTSRLHS
PD-1mAb 10的CDRL3(SEQ ID NO:199):QQGSTLPWT
编码PD-1mAb 10的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:196(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000654
Figure BDA0003673007740000661
K.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 11
PD-1mAb 11的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:200)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000662
PD-1mAb 11的CDRH1(SEQ ID NO:202):GYWMH
PD-1mAb 11的CDRH2(SEQ ID NO:203)：AIYPGNSDTHYNQKFKG
PD-1mAb 11的CDRH3(SEQ ID NO:204):GTYSYFDV
编码PD-1mAb 11的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:201(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000663
PD-1mAb 11的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:205)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000664
PD-1mAb 11的CDRL1(SEQ ID NO:207):RASQSIGTSIH
PD-1mAb 11的CDRL2(SEQ ID NO:208):YASESIS
PD-1mAb 11的CDRL3(SEQ ID NO:209):QQSNSWLT
编码PD-1mAb 11的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:206(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000671
L.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 12
PD-1mAb 12的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:210)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000672
PD-1mAb 12的CDRH1(SEQ ID NO:212):DYEMH
PD-1mAb 12的CDRH2(SEQ ID NO:213)：TIDPETGGTAYNQKFKG
PD-1mAb 12的CDRH3(SEQ ID NO:214):ERITTVVEGAYWYFDV
编码PD-1mAb 12的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:211(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000673
PD-1mAb 4的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000674
Figure BDA0003673007740000681
PD-1mAb 12的CDRL1(SEQ ID NO:217):RSSQNIVHSNGNTYLE
PD-1mAb 12的CDRL2(SEQ ID NO:218):KVSTRFS
PD-1mAb 12的CDRL3(SEQ ID NO:219):FQGSHVPYT
编码PD-1mAb 12的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:216(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000682
M.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 13
PD-1mAb 13的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:220)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000683
PD-1mAb 13的CDRH1(SEQ ID NO:222):SHTMS
PD-1mAb 13的CDRH2(SEQ ID NO:223)：TISGGGSNIYYPDSVKG
PD-1mAb 13的CDRH3(SEQ ID NO:224):QAYYGNYWYFDV
编码PD-1mAb 13的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:221(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000684
Figure BDA0003673007740000691
PD-1mAb 13的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:225)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000692
PD-1mAb 13的CDRL1(SEQ ID NO:227):LASQTIGTWLA
PD-1mAb 13的CDRL2(SEQ ID NO:228):AATSLAD
PD-1mAb 13的CDRL3(SEQ ID NO:229):QQLDSIPWT
编码PD-1mAb 13的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:226(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000693
N.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 14
PD-1mAb 14的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:230)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000694
PD-1mAb 14的CDRH1(SEQ ID NO:232):SYWIT
PD-1mAb 14的CDRH2(SEQ ID NO:233)：NIYPGTDGTTYNEKFKS
PD-1mAb 14的CDRH3(SEQ ID NO:234):GLHWYFDV
编码PD-1mAb 14的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:231(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000701
PD-1mAb 14的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:235)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000702
PD-1mAb 14的CDRL1(SEQ ID NO:237):KASQSVGTNVA
PD-1mAb 14的CDRL2(SEQ ID NO:238):SASSRFS
PD-1mAb 14的CDRL3(SEQ ID NO:239):QQYNSYPYT
编码PD-1mAb 14的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:236(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000703
O.抗人PD-1抗体PD-1mAb 15
1.鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 15
PD-1mAb 15的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:240)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740000704
Figure BDA0003673007740000711
PD-1mAb 15的CDRH1(SEQ ID NO:242):SYLIS
PD-1mAb 15的CDRH2(SEQ ID NO:243)：AISGGGADTYYADSVKG
PD-1mAb 15的CDRH3(SEQ ID NO:244):RGTYAMDY
编码PD-1mAb 15的VH结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:241(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000712
PD-1mAb 15的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:245)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000713
PD-1mAb 15的CDRL1(SEQ ID NO:247):LASQTIGTWLA
PD-1mAb 15的CDRL2(SEQ ID NO:248):AATSLAD
PD-1mAb 15的CDRL3(SEQ ID NO:249):QQLYSIPWT
编码PD-1mAb 15的VL结构域的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:246(编码CDRL残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000714
2.人源化抗人PD-1抗体PD-1mAb 15以形成“hPD-1mAb 15”
当鉴定了抗原表位时，将上述鼠科抗人PD-1抗体PD-1mAb 15人源化并且进一步去免疫化，以便表明人源化抗人PD-1抗体从而在施用至人接受者时降低其抗原性的能力。人源化产生一个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 2VH1”，和一个人源化的VL结构域本文命名为“hPD-1mAb 1VL1”。包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域的抗体被称为“hPD-1mAb 15”。
hPD-1mAb 15VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:250)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000721
编码hPD-1mAb 15VH1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:251(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000722
hPD-1mAb 15VL1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:252)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000723
编码hPD-1mAb 15VL1的示例性多核苷酸是SEQ ID NO:253(编码CDRH残基的核苷酸以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740000724
Figure BDA0003673007740000731
IV.抗人PD-1抗体PD-1mAb 1-15以及它们具有工程化的Fc区域的衍生物
在传统的免疫功能中，抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用产生各种各样的应答，范围从效应子功能，比如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬，到免疫调节信号，比如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用通过抗体或免疫复合物的Fc区与造血细胞上专用细胞表面受体的结合来启动。由抗体和免疫复合物引发的细胞应答的多样性由三种Fc受体：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的结构异质性造成。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是激活(即，免疫系统增强)性受体；FcγRIIB(CD32B)是抑制(即，免疫系统抑制)性受体。另外，与新生Fc受体(FcRn)的相互作用介导IgG分子从内体至细胞表面的再循环并且释放进入血液中。上面呈现了示例性野生型IgG1(SEQ ID NO:1)、IgG2(SEQ ID NO:2)、IgG3(SEQ ID NO:3)和IgG4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
Fc区域的修饰通常导致改变的表型，例如改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性或改变的效应子功能。就效应子功能而言，可期望修饰本发明的抗体或其他结合分子，例如，以便增强这样的分子在治疗癌中的有效性。在某些情况下，期望降低或消除效应子功能，例如在抗体的作用机制涉及阻断或对抗但不是杀伤携带靶抗原的细胞的情况下。当被引导至不期望的细胞诸如其中FcγR以低水平表达的肿瘤和外源细胞时，例如具有低水平FcγRIIB的肿瘤-特异性B细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，提高的效应子功能通常是期望的。在所述实施方式中，具有赋予的或改变的效应子功能活性的本发明的分子可用于治疗和/或预防疾病、病症或感染，其中增强的效应子功能活性的功效是期望的。
在某些实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括Fc区域，其具有对野生型Fc区域(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的一个或多个修饰(例如，取代、缺失或插入)，所述修饰降低Fc区域的亲和力和亲合力，从而降低了本发明的分子对一个或多个FcγR受体的亲和力和亲合力。在其他实施方式中，本发明的分子包括这样的Fc区域，其具有对野生型Fc区域的氨基酸的一个或多个修饰，所述修饰提高了Fc区域的亲和力和亲合力，因此提高了本发明的分子对一个或多个FcγR受体的亲和力和亲合力。在其他实施方式中，分子包括变异的Fc区域，其中相对于不包括Fc区域或包括野生型Fc区域的分子，所述变体赋予或介导提高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或与FcγRIIA增加的结合。在可选的实施方式中，分子包括变异的Fc区域，其中相对于不包括Fc区域或包括野生型Fc区域的分子，所述变体赋予或介导降低的ADCC活性(或其他效应子功能)和/或与FcγRIIB增加的结合。在一些实施方式中，本发明包括这样的PD-1结合分子，其包括变异的Fc区域，该变异的Fc区域相对于包括野生型Fc区域的相当的分子，不显示可检测的与任何FcγR的结合。在其他实施方式中，本发明包括这样的PD-1结合分子，其包括变异的Fc区域，该变异的Fc区域仅仅结合单FcγR，优选地结合FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA之一。任意这样的增加的亲和力和/或亲合力均优选通过体外测量对细胞中的FcγR可检测的结合程度或FcγR相关活性而评估，所述细胞在亲本分子(没有修饰的Fc区)的结合活性不能在细胞中被检测到时表达低水平FcγR，或者所述细胞以以下密度表达非FcγR受体靶抗原：密度为30,000至20,000分子/细胞、密度为20,000至10,000分子/细胞、密度为10,000至5,000分子/细胞、密度为5,000至1,000分子/细胞、密度为1,000至200分子/细胞或密度为200分子/细胞或更小(但是至少为10、50、100或150分子/细胞)。
本发明的PD-1结合分子可包括变异的Fc区域，所述变异的Fc区域对于激活性和/或抑制性Fcγ受体具有改变的亲和力。在一个实施方式中，PD-1结合分子包括变异的Fc区域，所述变异的Fc区域相对于具有野生型Fc区域的相当的分子，对于FcγRIIB具有增加的亲和力和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的亲和力。在另一实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，所述变异的Fc区域相对于具有野生型Fc区域的相当的分子，对于FcγRIIB具有降低的亲和力和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有增加亲和力。在仍另一实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，所述变异的Fc区域相对于具有野生型Fc区域的相当的分子，对于FcγRIIB具有降低的亲和力和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的亲和力。在仍另一实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其相对于具有野生型Fc区域的相当的分子，对于FcγRIIB具有不变的亲和力和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或增加的)亲和力。
在某些实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有改变的亲和力，使得免疫球蛋白具有增强的效应子功能。效应细胞功能的非限制性例子包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性吞噬、吞噬、调理作用、调理吞噬、细胞结合、玫瑰花结(rosetting)、C1q结合和补体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在优选的实施方式中，相对于包括野生型Fc区域的相当的分子，亲和力或效应子功能的改变是至少2倍、优选地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本发明的其他实施方式中，相对于包括野生型Fc区域的分子，变异的Fc区域以至少65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％更大的亲和力免疫特异性结合一个或多个FcR。这类测量可以是体内或体外试验，在优选的实施方式中是体外试验，比如ELISA或表面等离子共振试验。
在不同的实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其中所述变体激动(agonize)FcγR受体的至少一种活性或对抗FcγR受体的至少一种活性。在优选的实施方式中，分子包括这样的变体：其对抗FcγRIIB的一种或多种活性，例如，B细胞受体-介导的信号传导、B细胞的激活、B细胞增殖、抗体产生、B细胞的细胞内钙流入、细胞周期进程、FcγRIIB-介导的对FcεRI信号传导的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和与Shc的缔合或一个或多个下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)在FcγRIIB信号转导途径中的活性。在另一实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变体，其激动FcεRI的一种或多种活性，例如，肥大细胞激活、钙动员、脱粒、细胞因子产生或5-羟色胺释放。
在某些实施方式中，分子包括Fc区，其包括来自两个或更多个IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的区域。如本文所使用，相对于其他IgG同种型，如果Fc区的氨基酸序列与特定的IgG同种型最同源，则认为Fc区具有该IgG同种型。由于它们的铰链和/或Fc区的氨基酸序列的差异，各种IgG同种型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、补体结合、FcγR结合亲和力和效应子功能活性(例如，ADCC、CDC等)，例如在Flesch andNeppert(1999)J.Clin.Lab.Anal.14:141-156；Chappel等(1993)J.Biol.Chem.33:25124-25131；Chappel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:9036-9040；或Brüggemann等(1987)J.Exp.Med 166:1351-1361中描述。该类型的变异的Fc区可单独使用或组合氨基酸修饰使用，以影响Fc-介导的效应子功能和/或结合活性。在组合中，相对于包括野生型Fc区的本发明分子，氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区可展示类似的功能(例如，对FcγRIIA提高的亲和力)并可另外或更优选协同作用，以修饰本发明分子中的效应子功能。在其他实施方式中，相对于不包括Fc区或包括相同同种型的野生型Fc区的本发明分子，氨基酸修饰和IgGFc区可展示相反的功能(例如，分别对FcγRIIA提高的和降低的亲和力)并可发挥作用，以选择减轻和或降低本发明分子的特定功能。
在优选的具体实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其中所述变异的Fc区相对于野生型Fc区包括至少一个氨基酸的修饰，以便所述分子对FcR具有改变的亲和力，条件是基于诸如由Sondermann等(2000)Nature 406:267-73公开的Fc-FcR相互作用的晶体学和结构分析，所述变异Fc区在直接接触FcγR的位置不具有取代。Fc区中直接接触FcγR的位置的实例是氨基酸残基234-239、氨基酸残基265-269(B/C环)、氨基酸残基297-299(C’/E环)和氨基酸残基327-332(F/G环)。在一些实施方式中，本发明的分子包括变异的Fc区，其包括至少一个残基的修饰，所述残基基于结构和晶体学分析不直接接触FcγR，例如不在Fc-FcγR结合位点内。
变异的Fc区域是本领域熟知的，并且可在本发明中使用任何已知的变异的Fc区，以赋予或修饰包括Fc区(或其部分)的本发明的分子展示的效应子功能，如在例如NK依赖性或巨噬细胞依赖性试验中功能测定的。例如，PCT公开号WO 04/063351、WO 06/088494、WO07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707和WO 2008/140603中公开了鉴定为改变效应子功能的Fc区变体，并且，其中公开的任何合适的变体均可用于本发明的分子中。
在某些实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰，该修饰(相对于野生型Fc区域)改变了变异的Fc区域对于激活性FcγR(比如FcγRIIA或FcγRIIIA)相对于抑制性FcγR(比如FcγRIIB)的亲和力的比例：
Figure BDA0003673007740000771
尤其优选的是本发明的PD-1结合分子，其具有变异的Fc区域(相对于野生型Fc区域)，其中变异的Fc区域的亲和力的比例大于1。这样的分子在提供其中期望由FcγR介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的增强的功效的疾病、病症或感染，例如癌或感染性疾病，的疗法或预防疗法或其症状的改善方面具有特别的用途。相比之下，亲和力比例小于1的变异的Fc区介导降低的效应细胞功能的效力。根据其亲和力比是否大于或小于1，表1列出了示例性单、双、三、四和五突变。
Figure BDA0003673007740000772
Figure BDA0003673007740000781
在具体的实施方式中，在变异的Fc区域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330，优选地下述残基的一个或多个：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具体实施方式中，在变异的Fc区域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在任何下述位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，优选地下述残基的一个或多个：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在优选的实施方式中，在以改变的亲和力结合FcγR的变异的Fc区域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。优选地，变异的Fc区域具有任何下述残基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的实施方式中，在以降低亲和力的结合FcγR(经其Fc区域)的变异的Fc区域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的实施方式中，在以增强的亲和力结合FcγR(经其Fc区域)的变异的Fc区域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。在不同的实施方式中，在以增强的亲和力结合FcγRIIA的变异的Fc区域，任何下述残基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
优选的变体包括在下述任何位置的一个或多个修饰：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其优选的变体包括选自A-AI组的一个或多个修饰：
Figure BDA0003673007740000801
Figure BDA0003673007740000811
仍更尤其优选的变体包括选自1-105组的一个或多个修饰：
Figure BDA0003673007740000812
Figure BDA0003673007740000821
Figure BDA0003673007740000831
在一个实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其在Fc区域中具有至少一个修饰。在某些实施方式中，变异的Fc区域包括选自L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一个取代。
在具体的实施方式中，变异的Fc区域包括：
(A)选自F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一个取代；
(B)选自下述的至少两个取代：
(1)F243L和P396L；
(2)F243L和R292P；和
(3)R292P和V305I；
(C)选自下述的至少三个取代：
(1)F243L、R292P和Y300L；
(2)F243L、R292P和V305I；
(3)F243L、R292P和P396L；和
(4)R292P、V305I和P396L；
(D)选自下述的至少四个取代：
(1)F243L、R292P、Y300L和P396L；和
(2)F243L、R292P、V305I和P396L；或
(E)选自下述的至少五个取代：
(1)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和
(2)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具体的实施方式中，变异的Fc区域包括下述取代：
(A)F243L、R292P和Y300L；
(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或
(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在一个实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其(相对于野生型IgG1 Fc区域(SEQ ID NO:1)展示的结合)展示对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合。在一个实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其展示对FcγR(例如，FcγRIIIA)降低的(或基本上没有)结合和降低的(或基本上没有)ADCC效应子功能。在某些实施方式中，变异的Fc区域包括选自下述的至少一个取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。在具体的实施方式中，变异的Fc区域包括下述取代：L234A；L235A；L234A和L235A；D265A；N297Q或N297G。
用于本发明的PD-1结合分子的CH2和CH3结构域的优选的IgG1序列具有L234A/L235A取代(SEQ ID NO:5)：
Figure BDA0003673007740000841
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
在不同的实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括Fc区域，其(相对于野生型IgG1Fc区域(SEQ ID NO:1)展示的结合)固有地展示对FcγRIIIA(CD16a)降低的(或基本上没有)结合和/或降低的效应子功能。在具体的实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括IgG2Fc区域(SEQ ID NO:2)或IgG4 Fc区域(SEQ ID:NO:4)。当使用IgG4 Fc区域时，本发明也包括引入稳定化突变，比如IgG4铰链区S228P取代(见，例如，SEQ ID NO:13：ESKYGPPCPPCP，(Lu等,(2008)“The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 AsMonitored By Analytical Ultracentrifugation,”J.Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以降低链交换的发生率。本领域已知的其他稳定化突变可被引入到IgG4 Fc区域中(Peters,P等,(2012)“Engineering an Improved IgG4 Molecule with ReducedDisulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,”J.Biol.Chem.,287:24525-24533；PCT专利公开号：WO 2008/145142)。
在其他实施方式中，本发明包括使用本领域已知的任何Fc变体，比如下述文献中公开的那些：Jefferis,B.J.等(2002)“Interaction Sites On Human IgG-Fc ForFcgammaR:Current Models,”Immunol.Lett.82:57-65；Presta,L.G.等(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,”Biochem.Soc.Trans.30:487-90；Idusogie,E.E.等(2001)“Engineered Antibodies WithIncreased Activity To Recruit Complement,”J.Immunol.166:2571-75；Shields,R.L.等(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For FcGamma RI,Fc Gamma RII,Fc Gamma RIII,And FcRn And Design Of IgG1 Variants WithImproved Binding To The Fc gamma R,”J.Biol.Chem.276:6591-6604；Idusogie,E.E.等(2000)“Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan,A Chimeric Antibody With AHuman IgG Fc,”J.Immunol.164:4178-84；Reddy,M.P.等(2000)“Elimination Of FcReceptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal AntibodyTo Human CD4,”J.Immunol.164:1925-1933；Xu,D.等(2000)“In Vitro Characterizationof Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,”Cell.Immunol.200:16-26；Armour,K.L.等(1999)“Recombinant human IgG MoleculesLacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,”Eur.J.Immunol.29:2613-24；Jefferis,R.等(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R AndHuman Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,”Immunol.Lett.54:101-04；Lund,J.等(1996)“Multiple Interactions Of IgG With ItsCore Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human FcGamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,”J.Immunol.157:4963-4969；Hutchins等(1995)“Improved Biodistribution,TumorTargeting,And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant OfCampath-1H,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92:11980-84；Jefferis,R.等(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors:The Role OfGlycosylation,”Immunol.Lett.44:111-17；Lund,J.等(1995)“Oligosaccharide-ProteinInteractions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,”FASEBJ.9:115-19；Alegre,M.L.等(1994)“A Non-Activating"Humanized"Anti-CD3 MonoclonalAntibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,”Transplantation 57:1537-1543；Lund等(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG ForMouse Fc Gamma R11,”Mol.Immunol.29:53-59；Lund等(1991)“Human Fc Gamma RI AndFc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,”J.Immunol.147:2657-2662；Duncan,A.R.等(1988)“Localization Of The Binding SiteFor The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,”Nature 332:563-564；美国专利号5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586和7,317,091；以及PCT公开WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
在一些实施方式中，本发明的分子进一步包括一个或多个糖基化位点，从而一个或多个碳水化合物部分被共价连接至分子。优选地，与未修饰的抗体相比，在Fc区中具有一个或多个糖基化位点和/或一个或多个修饰的本发明的分子赋予或具有增强的抗体介导的效应子功能，例如，增强的ADCC活性。在一些实施方式中，本发明进一步包括这样的分子：所述分子包括已知直接或间接与Fc区的碳水化合物部分相互作用的氨基酸的一个或多个修饰，所述氨基酸包括但不限于在位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的氨基酸。直接或间接与Fc区的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本领域已知的，见，例如，Jefferis等,1995Immunology Letters,44:111-7，其通过引用以其整体并入本文。
在另一实施方式中，本发明包括这样的分子：所述分子已经通过在分子的一个或多个位点中引入一个或多个糖基化位点被修饰，优选不改变分子的功能，例如，与靶抗原或FcγR的结合活性。糖基化位点可被引入到本发明分子的可变结构域和/或恒定结构域中。如本文所使用，“糖基化位点”包括与寡糖(即，碳水化合物，其含有两个或多个连接在一起的单糖)特异性和共价结合的抗体中的任何特定氨基酸序列。寡糖侧链通常经N-或O-键而连接至抗体的骨架。N-连接的糖基化指寡糖部分连接至天冬酰胺残基的侧链。O-连接的糖基化指寡糖部分连接至羟基氨基酸，例如，丝氨酸、苏氨酸。本发明的分子可包括一个或多个糖基化位点，包括N-连接的和O-连接的糖基化位点。本领域已知的用于N-连接的或O-连接的糖基化的任何糖基化位点可根据本发明使用。根据本发明的方法可用的示例性N-连接的糖基化位点是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸和Thr/Ser指示苏氨酸或丝氨酸。这类位点可使用本发明所属领域熟知的方法引入到本发明的分子中(见例如，In vitro Mutagenesis,Recombinant DNA:A Short Course,J.D.Watson,等W.H.Freemanand Company,New York,1983,第8章,106-116页，其通过引用以其整体并入本文。用于将糖基化位点引入本发明分子中的示例性方法可包括：修饰或突变分子的氨基酸序列，从而获得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。
在一些实施方式中，本发明包括通过添加或删除糖基化位点修饰本发明分子的碳水化合物含量的方法。修饰抗体(和包括抗体结构域，例如，Fc区的分子)的碳水化合物含量的方法是本领域熟知的并且包括在本发明中，见，例如，美国专利号6,218,149、EP 0 359096 B1、美国公开号US 2002/0028486、WO 03/035835、美国公开号2003/0115614、美国专利号6,218,149、美国专利号6,472,511，其所有通过引用以其整体并入本文。在其他实施方式中，本发明包括通过删除分子的一个或多个内源碳水化合物部分，修饰本发明分子的碳水化合物含量的方法。在具体的实施方式中，本发明包括通过修饰与297相邻的位置而转变抗体Fc区的糖基化位点。在具体的实施方式中，本发明包括修饰296位，从而296位而不是297位被糖基化。
也可通过技术，比如通过在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，修饰效应子功能，从而允许在该区域内发生链间二硫键形成，导致产生可具有改善的内化能力和/或提高的补体-介导的细胞杀伤和ADCC的同源二聚化抗体(Caron,P.C.等(1992)“EngineeredHumanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies,”J.Exp.Med.176:1191-1195；Shopes,B.(1992)“A Genetically Engineered Human IgG Mutant WithEnhanced Cytolytic Activity,”J.Immunol.148(9):2918-2922。也可使用异源双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚化抗体，如Wolff,E.A.等(1993)“MonoclonalAntibody Homodimers:Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,”Cancer Research53:2560-2565中描述。可选地，抗体可被工程化，其具有双Fc区域并且可从而具有增强的补体裂解和ADCC能力(Stevenson,G.T.等(1989)“A Chimeric Antibody With Dual FcRegions(bisFabFc)Prepared By Manipulations At The IgG Hinge,”Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230)。
可通过增加Fc区域对于FcRn的结合亲和力而延长包括Fc区域的本发明分子的血清半衰期。如本文使用的术语“半衰期”意思是分子的药物代谢动力学性质，是对在其施用之后分子的平均生存时间的衡量。半衰期可表示为从受试者的身体(例如，人患者或其他哺乳动物)或其特定区室消除百分之五十(50％)的已知量的分子需要的时间，例如，如在血清中测量的，即，循环半衰期，或在其他组织中测量的。一般而言，半衰期的增加导致施用的分子在循环中的平均停留时间(MRT)的增加。
在一些实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其中所述变异的Fc区域相对于野生型Fc区域包括至少一个氨基酸修饰，使得所述分子(相对于野生型Fc区域)具有增加的半衰期。
在一些实施方式中，本发明的PD-1结合分子包括变异的Fc区域，其中所述变异的Fc区域在选自下述的一个或多个位置处包括延长半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436。能够延长包含Fc区域的分子的半衰期的许多具体的突变是本领域已知的，并且包括，例如M252Y、S254T、T256E和其组合。例如，见下述文献描述的突变：美国专利号6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376、美国公开号2002/0147311、2007/0148164和国际公开号WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279，其通过引用以它们的整体并入本文。具有延长半衰期的包含Fc区域的分子也包括在下述两个或更多个Fc区域残基处具有取代的那些分子：250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436。尤其地，两个或更多个取代选自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I。
在具体的实施方式中，变异的Fc区域包括下述取代：
(A)M252Y、S254T和T256E；
(B)M252Y和S254T；
(C)M252Y和T256E；
(D)T250Q和M428L；
(E)T307Q和N434A；
(F)A378V和N434A；
(G)N434A和Y436I；
(H)V308P和N434A；或
(I)K288D和H435K。
本发明进一步包括变异的Fc区域，其包括：
(A)改变效应子功能和/或FcγR的一个或多个突变；和
(B)延长血清半衰期的一个或多个突变。
V.双特异性抗人PD-1结合分子
本发明的一个实施方式涉及双特异性结合分子，其能够结合“第一表位”和“第二表位”，其中第一表位是人PD-1的表位和第二表位是PD-1的相同的或不同的表位，或是免疫细胞(比如T淋巴细胞)的表面上存在的并参与调节免疫检查点的另一分子的表位。在一个实施方式中，第二表位是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32、CD40、CD40L、CD47、CD64、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I类或II类MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA。在一个实施方式中，第二表位不是PD-1的表位。在具体的实施方式中，第二表位是CD137、CTLA-4、LAG-3、OX40、TIGIT或TIM-3。在某些实施方式中，双特异性分子包括多于两个表位结合位点。这类双特异性分子可结合LAG-3的两个或更多个不同表位和不是LAG-3的分子的至少一个表位。
本发明包括能够同时结合PD-1和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)的双特异性抗体。在一些实施方式中，使用下述文献描述的任何方法产生能够同时结合PD-1和第二表位的双特异性抗体：PCT公开号WO 1998/002463、WO 2005/070966、WO 2006/107786 WO2007/024715、WO 2007/075270、WO 2006/107617、WO 2007/046893、WO 2007/146968、WO2008/003103、WO 2008/003116、WO 2008/027236、WO 2008/024188、WO 2009/132876、WO2009/018386、WO 2010/028797、WO2010028796、WO 2010/028795、WO 2010/108127、WO2010/136172、WO 2011/086091、WO 2011/133886、WO 2012/009544、WO 2013/003652、WO2013/070565、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2013/174873和WO 2014/022540，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
A.缺少Fc区域的双特异性双抗体
本发明的一个实施方式涉及双特异性双抗体，其包括第一多肽链和第二多肽链，最优选地由第一多肽链和第二多肽链组成，所述多肽链的序列允许多肽链彼此共价结合，以形成共价缔合的双抗体，其能够同时结合第一表位和第二表位，这类表位彼此不同。这类双特异性双抗体因此包括能够结合第一表位的“VL1”/“VH1”结构域和能够结合第二表位的“VL2”/“VH2”结构域。符号“VL1”和“VH1”分别表示结合这类双特异性双抗体的“第一”表位的可变轻链结构域和可变重链结构域。类似地，符号“VL2”和“VH2”分别表示结合这类双特异性双抗体的“第二”表位的可变轻链结构域和可变重链结构域。具体的表位是否被命名为第一或第二表位不重要；这类符号仅仅与本发明的结合分子的多肽链的结构域的存在和取向相关。在一个实施方式中，这类表位之一是PD-1的表位和这类表位的另一个不是PD-1的表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等的表位)。
第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用，以形成对于第一抗原特异性的第一功能性抗原-结合位点(即，PD-1或包含第二表位的抗原)。类似地，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域相互作用，以便形成对第二抗原(即，包含第二表位的抗原或PD-1)特异性的第二功能性抗原-结合位点。因此，协调第一和第二多肽链的VL和VH结构域的选择，以便双抗体的两条多肽链总体地包括能够结合PD-1的表位和第二表位二者的VL和VH结构域(即，它们包括VLPD-1/VHPD-1和VL2/VH2，其中PD-1是“第一”表位，或VL1/VH1和VLPD-1/VHPD-1，其中PD-1是“第二”表位)。
这类双特异性双抗体的实施方式的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合第一或第二表位的单克隆抗体的VL1结构域(即，VLPD-1或VL表位2)、第一间插间隔肽(连接体1)、能够结合第二表位(如果这类第一多肽链包含VLPD-1)或第一表位(如果这类第一多肽链包含VL表位2)的单克隆抗体的VH2结构域、任选地包含半胱氨酸残基的第二间插间隔肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端(图1)。
双特异性双抗体的该实施方式的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合PD-1或第二表位的单克隆抗体的VL2结构域(即，VLPD-1或VL表位2，并且不是为包括在双抗体的第一多肽链中选择的VL结构域)、间插连接体肽(连接体1)、能够结合第二表位(如果这类第二多肽链包含VLPD-1)或PD-1(如果这类第二多肽链包含VL表位2)的单克隆抗体的VH1结构域、任选地包含半胱氨酸残基的第二间插间隔肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端(图1)。
最优选地，选择将这类VL和VH结构域分开的间插连接体肽(例如，连接体1)的长度，以基本上或完全防止多肽链的VL和VH结构域彼此结合。因此，第一多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。同样地，第二多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。优选的间插间隔肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:14)：GGGSGGGG。
基于异源二聚体促进结构域的选择而选择第二间插连接体肽(连接体2)的长度和组成。典型地，第二间插连接体肽(连接体2)包括3-20个氨基酸残基。尤其地，在异源二聚体促进结构域不包括半胱氨酸残基时，使用包含半胱氨酸的第二间插连接体肽(连接体2)。包含半胱氨酸的第二间插间隔肽(连接体2)包含1、2、3或更多个半胱氨酸。优选的包含半胱氨酸的间隔肽(连接体2)具有序列SEQ ID NO:15：GGCGGG。可选地，连接体2不包括半胱氨酸(例如，GGG、GGGS(SEQ ID NO:29)、LGGGSG(SEQ ID NO:261)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:262)、ASTKG(SEQ ID NO:30)、LEPKSS(SEQ ID NO:33)、APSSS(SEQ ID NO:34)等)，并且使用如下面所描述的包含半胱氨酸的异源二聚体促进结构域。任选地，使用包含半胱氨酸的连接体2和包含半胱氨酸的异源二聚体促进结构域二者。
异源二聚体促进结构域可以是一条多肽链上的GVEPKSC(SEQ ID NO:16)或VEPKSC(SEQ ID NO:17)或AEPKSC(SEQ ID NO:18)和另一条多肽链上的GFNRGEC(SEQ ID NO:19)或FNRGEC(SEQ ID NO:20)(US2007/0004909)。
但是，更优选地，这类双抗体的异源二聚体-促进结构域由具有相反电荷的一个、两个、三个或四个串联重复的螺旋结构域形成，所述螺旋结构域包括至少六个、至少七个或至少八个氨基酸残基的序列，以便异源二聚体-促进结构域具有净电荷(Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments:Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for aHeterodimeric Coiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312:221-228；Arndt,K.M.等(2002)“Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric CoiledCoils,”Structure 10:1235-1248；Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By WesternBlot Via Coiled–Coil Interactions,”Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development:Measurement OfPolyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide CaptureAnd Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,”J.Mol.Recognit.17:540-557；De Crescenzo,G.D.等(2003)“Real-Time Monitoring ofthe Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils:Effect ofChain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,”Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez,J.等(2012)“InducedHeterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A SyntheticCoiled-Coil Tag,”Protein Science 21:511-519；Ghosh,T.S.等(2009)“End-To-End AndEnd-To-Middle Interhelical Interactions:New Classes Of Interacting HelixPairs In Protein Structures,”Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan,G.等(2008)“Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,”Curr.Opin.Struc.Biol.18:477-483；Litowski,J.R.等(2002)“Designing HeterodimericTwo-Strandedα-Helical Coiled-Coils:The Effects Of Hydrophobicity Andα-HelicalPropensity On Protein Folding,Stability,And Specificity,”J.Biol.Chem.277:37272-37279；Steinkruger,J.D.等(2012)“The d′--d--d′Vertical Triad is LessDiscriminating Than the a′--a--a′Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,”J.Amer.Chem.Soc.134(5):2626–2633；Straussman,R.等(2007)“Kinking the Coiled Coil–Negatively Charged Residues at the Coiled-coilInterface,”J.Molec.Biol.366:1232-1242；Tripet,B.等(2002)“Kinetic Analysis ofthe Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I RegulatoryRegion and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used forSurface Plasmon Resonance,”J.Molec.Biol.323:345–362；Woolfson,D.N.(2005)“TheDesign Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,”Adv.Prot.Chem.70:79-112；Zeng,Y.等(2008)“A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo DesignedPeptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,”J.Gene Med.10:355-367)。
这样的重复的螺旋结构域可以是准确的重复或可具有取代。例如，第一多肽链的异源二聚体-促进结构域的螺旋结构域可包括选择为这类异源二聚体-促进结构域提供负电荷的八个氨基酸残基的序列，并且第二多肽链的异源二聚体-促进结构域的螺旋结构域可包括选择为这类异源二聚体-促进结构域提供正电荷的八个氨基酸残基的序列。哪个螺旋被提供给第一或第二多肽链是不重要的，前提是另一多肽链使用具有相反电荷的螺旋。带正电的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸等和/或带负电的氨基酸可以是谷氨酸，天冬氨酸等。带正电的氨基酸优选地是赖氨酸和/或带负电的氨基酸优选地是谷氨酸。仅仅使用单个异源二聚体-促进结构域是可能的(因为这类结构域将抑制同源二聚化，从而促进异源二聚化)，但是，优选本发明双抗体的第一和第二多肽链都包含异源二聚体-促进结构域。
在优选的实施方式中，异源二聚体-促进结构域之一包括四个串联的“E螺旋”螺旋结构域(SEQ ID NO:21：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK)，其谷氨酸残基在pH 7形成负电荷，而另一个异源二聚体促进结构域将包括四个串联“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:22：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE)，其赖氨酸残基将在pH 7形成正电荷。这类带电结构域的存在促进了第一和第二多肽之间的缔合，因此有助于异源二聚体形成。尤其优选是这样的异源二聚体促进结构域：其中SEQ ID NO:21的四个串联“E-螺旋”螺旋结构域之一已经被修饰以包含半胱氨酸残基：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23)。同样地，尤其优选的是这样的异源二聚体促进结构域：其中SEQ ID NO:22的四个串联“K-螺旋”螺旋结构域之一已经被修饰，以包含半胱氨酸残基：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:24)。
如在WO 2012/018687中公开，为了提高双抗体的体内药物代谢动力学特性，双抗体可被修饰，以在双抗体的一个或多个末端处包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，血清结合蛋白的这类多肽部分设置在双抗体的C-末端。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质并且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子结合位点，这允许其非共价结合其他蛋白，从而延长它们的血清半衰期。链球菌属(Streptococcus)菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定的三螺旋束的46个氨基酸残基组成并且具有广泛的白蛋白结合特异性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction ForBacterial Albumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120。因此，对于改善双抗体的体内药物代谢动力学特性，尤其优选的血清结合蛋白的多肽部分是来自链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域(ABD)，更优选地，停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)(SEQ ID NO:25)：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068(通过引用并入本文)中公开，SEQ ID NO:25的“去免疫化”的变体具有削弱或消除II类MHC结合的能力。基于组合突变结果，对于形成这样的去免疫化的ABD，如下取代的组合被认为是优选的取代：66D/70S+71A、66S/70S+71A、66S/70S+79A、64A/65A/71A、64A/65A/71A+66S、64A/65A/71A+66D、64A/65A/71A+66E、64A/65A/79A+66S、64A/65A/79A+66D、64A/65A/79A+66E。变异的ABD具有修饰L64A、I65A和D79A或修饰N66S、T70S和D79A。具有下述氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP(SEQ ID NO:26)，
或氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79EILAALP(SEQ ID NO:27)，
或氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79EILAALP(SEQ ID NO:28)，的变异的去免疫化的ABD是尤其优选的，因为这类去免疫化的ABD展示基本上野生型结合，同时提供削弱的II类MHC结合。因此，具有ABD的这类双抗体的第一多肽链包含肽连接体，其优选地位于这类多肽链的E螺旋(或K螺旋)结构域的C-末端，以便插在E螺旋(或K螺旋)结构域和ABD(其优选地是去免疫化的ABD)之间。用于这类肽连接体的优选的序列是SEQ ID NO:29：GGGS。
B.包含Fc区域的双特异性双抗体
本发明的一个实施方式涉及包括Fc区域的双特异性双抗体，其能够同时结合PD-1和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。将IgG CH2-CH3结构域添加至双抗体多肽链中的一条或两条中，以便双抗体链的复合导致Fc区域的形成，延长了生物半衰期和/或改变了双抗体的价。将IgG CH2-CH3结构域并入到两条双抗体多肽上允许形成双链双特异性包含Fc-区域的双抗体(图2)。
可选地，仅仅在一条双抗体多肽上并入IgG CH2-CH3结构域允许形成更复杂的、包含Fc区的四链双特异性双抗体(图3A-3C)。图3C显示具有恒定轻链(CL)结构域和恒定重链CH1结构域的代表性四链双抗体，然而，可以可选地采用这类结构域的片段以及其他多肽(见，例如，图3A和3B，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1结构域，可采用源自人IgG的铰链结构域的、具有氨基酸序列GVEPKSC(SEQ ID NO:16)VEPKSC(SEQ ID NO:17)或AEPKSC(SEQ ID NO:18)的肽，和代替CL结构域，可采用人κ轻链的C-末端6个氨基酸GFNRGEC(SEQ ID NO:19)或FNRGEC(SEQ ID NO:20)。包含四链双抗体的代表性肽显示在图3A中。可选地，或另外，可采用包括具有相反电荷的串联螺旋结构域的肽，比如“E-螺旋”螺旋结构域(SEQ ID NO:21：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK或SEQ ID NO:23：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK)；和“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:22：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE或SEQ ID NO:24：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE)。包含螺旋结构域的代表性四链双抗体显示在图3B中。
本发明的包含Fc区域的双抗体分子一般包括另外的间插连接体肽(连接体)。典型地，另外的连接体包括3-20个氨基酸残基。在本发明的包含Fc区域的双抗体分子中可采用的另外或可选的连接体包括：GGGS(SEQ ID NO:29)、LGGGSG(SEQ ID NO:261)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:262)、ASTKG(SEQ ID NO:30)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:31)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:32)、LEPKSS(SEQ ID NO:33)、APSSS(SEQ ID NO:34)和APSSSPME(SEQ ID NO:35)、LEPKSADKTHTCPPC SEQ ID NO:36)、GGC和GGG。可使用SEQ ID NO:33代替GGG或GGC，以易于克隆。另外，SEQ ID NO:31可紧随氨基酸GGG或SEQ ID NO:33之后，以形成可选的连接体：GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:263)和LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:37)。除了或代替连接体，本发明的包含Fc区域的双抗体分子可并入IgG铰链区。示例性铰链区包括：来自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:32)、来自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:11)、来自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:12)和ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:13)，包括稳定化取代以减少链交换的IgG4铰链变体。
如在图3A-3C中提供，本发明的双抗体可包括四条不同的链。这类双抗体的第一和第三多肽链包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域、和(iv)包含CH2-CH3序列的结构域。第二和第四多肽链包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第一/第三多肽链与第二/第四多肽链的二聚化。第三和第四多肽链的VL和/或VH结构域，以及第一和第二多肽链的VL和/或VH结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或四特异性的四价结合。符号“VL3”和“VH3”分别表示结合这类双抗体的“第三”表位的可变轻链结构域和可变重链结构域。类似地，符号“VL4”和“VH4”分别表示结合这类双抗体的“第四”表位的可变轻链结构域和可变重链结构域。本发明的包含Fc区的、代表性四链双抗体的多肽链的一般结构提供在表2中：
Figure BDA0003673007740000981
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性、四价(即，具有四个表位结合位点)、包含Fc的双抗体(图3A-3C)，其由总共四条多肽链组成。本发明双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的两个表位结合位点(其可以能够结合PD-1的相同表位或PD-1的不同表位)，和对于第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特异性的两个表位结合位点。
在进一步的实施方式中，包含Fc区的双特异性双抗体可包括三条多肽链。这类双抗体的第一多肽包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。这类双抗体的第二多肽包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)促进与双抗体的第一多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。这类双抗体的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，这类双抗体的第一和第二多肽链缔合在一起，以形成能够结合第一表位的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。第一和第二多肽通过涉及在它们各自的第三结构域中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。值得注意的是，第一和第三多肽链彼此复合，以形成经二硫键稳定的Fc区。这类双抗体具有增强的效价。图4A和4B阐释了这类双抗体的结构。这类包含Fc区的双特异性的双抗体可具有两个取向之一
(表3)：
Figure BDA0003673007740000991
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性、二价(即，具有两个表位结合位点)、包含Fc的双抗体(图4A-4B)，其由总共三条多肽链组成。本发明双特异性、二价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的一个表位结合位点，和对于第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特异性的一个表位结合位点。
在进一步的实施方式中，包含Fc区的双特异性双抗体可包括总共五条多肽链。在具体的实施方式中，所述五条多肽链的两条具有相同的氨基酸序列。这类双抗体的第一多肽链包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。第一多肽链可以是抗体的重链，其包含VH1和重链恒定结构域。这类双抗体的第二和第五条多肽链包含：(i)包含VL1的结构域和(ii)包含CL的结构域。这类双抗体的第二和/或第五多肽链可以是抗体的轻链，其包含与第一/第三多肽链的VH1互补的VL1。第一、第二和/或第五多肽链可分离自天然产生的抗体。可选地，它们可以是重组构建的。这类双抗体的第三多肽链包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域、(iii)包含CH2-CH3序列的结构域、(iv)包含VL2的结构域、(v)包含VH3的结构域和(vi)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第三链与第四链的二聚化。这类双抗体的第四多肽包含：(i)包含VL3的结构域、(ii)包含VH2的结构域和(iii)促进与双抗体的第三多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。
因此，这类双抗体的第一和第二，以及第三和第五多肽链缔合在一起，以形成能够结合第一表位的两个VL1/VH1结合位点。这类双抗体的第三和第四多肽链缔合在一起，以形成能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点，以及能够结合第三表位的VL3/VH3结合位点。第一和第三多肽通过涉及在它们各自恒定区中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。值得注意的是，第一和第三多肽链彼此复合，以形成Fc区。这类双抗体具有增强的效价。图5图解了这类双抗体的结构。应当理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或三特异性的结合。但是，如本文所提供，优选地选择这些结构域，以便结合PD-1和第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
选择多肽链的VL和VH结构域，以便形成对于期望的表位特异性的VL/VH结合位点。通过多肽链的缔合形成的VL/VH结合位点可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性、三特异性或四特异性的四价结合。尤其地，可选择VL和VH结构域，以便双特异性双抗体可包括针对第一表位的两个结合位点和针对第二表位的两个结合位点，或针对第一表位的三个结合位点和针对第二表位的一个结合位点，或针对第一表位的两个结合位点，针对第二表位的一个结合位点和针对第三表位的一个结合位点(如图5中所描绘)。本发明的代表性包含Fc区的五链双抗体的多肽链的一般结构提供在表4中：
Figure BDA0003673007740001011
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性、四价(即，具有四表位结合位点)、包含Fc的双抗体，其由总共五条多肽链组成，具有针对第一表位的两个结合位点和针对第二表位的两个结合位点。在一个实施方式中，本发明双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的两个表位结合位点(其可以能够结合PD-1相同的表位或PD-1不同的表位)，和对于第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特异性的两个表位结合位点。在另一实施方式中，本发明的双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的三个表位结合位点，其可以能够结合PD-1相同的表位或PD-1不同的表位)，和对于第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特异性的一个表位结合位点。在另一实施方式中，本发明的双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的一个表位结合位点，和对于第二表位(例如，B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特异性的三个表位结合位点。
C.包含Fc区域的双特异性三价结合分子
本发明的进一步实施方式涉及包括Fc区并且能够同时结合第一表位、第二表位和第三表位的双特异性、三价结合分子，其中这类表位中的至少一个与这类表位中的另一个不同。这类双特异性双抗体因此包括能够结合第一表位的“VL1”/“VH1”结构域，能够结合第二表位的“VL2”/“VH2”结构域和能够结合第三表位的“VL3”/“VH3”结构域。在一个实施方式中，这类表位中的一个或两个是PD-1的表位并且这类表位中的另一个(或其他)不是PD-1的表位(例如，下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。这类双特异性三价结合分子包括三个表位结合位点，其中两个是双抗体型结合结构域，其提供了结合位点A和结合位点B，和其中一个是非双抗体型结合结构域，其提供了结合位点C(见，例如，图6A-6F，和PCT申请号：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076)。
典型地，本发明的三价结合分子包括四条不同的多肽链(见图6A-6B)，但是，例如，通过彼此融合这类多肽链(例如，经肽键)或通过分开这类多肽链，以形成另外的多肽链，或通过经二硫键缔合更少的或另外的多肽链，分子可包括更少或更多数量的多肽链。图6B-6F通过示意性描绘具有三条多肽链的这类分子阐释了本发明的这个方面。如图6A-6F中提供的，本发明的三价结合分子可具有可选的取向，其中双抗体型结合结构域在Fc区的N-末端(图6A、6C和6D)或C-末端(图6B、6E和6F)。
在某些实施方式中，本发明的这类三价结合分子的第一多肽链包含：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域和(iv)包含CH2-CH3序列的结构域。VL1和VL2结构域位于包含CH2-CH3的结构域的N-末端或C-末端，如表5(图6A和6B)中所显示。这类实施方式的第二多肽链包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域。这类实施方式的第三多肽链包含：(i)包含VH3的结构域、(ii)包含CH1的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。第三多肽链可以是抗体的重链，其包含VH3和重链恒定区。这类实施方式的第四多肽包含：(i)包含VL3的结构域和(ii)包含CL的结构域。第四多肽链可以是抗体的轻链，其包含与第三多肽链的VH3互补的VL3。第三或第四多肽链可分离自天然产生的抗体。可选地，它们可经重组、合成通过其方式而构建。
第一和第二多肽链的可变轻链结构域通过长度过短的间插间隔连接体与这类多肽链的可变重链结构域分开，以允许它们的VL1/VH2(或它们的VL2/VH1)结构域缔合在一起，以形成能够结合第一或第二表位的表位结合位点。用于该目的的优选间插间隔肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:14)：GGGSGGGG。三价结合分子的其他结构域可通过任选地包括半胱氨酸残基的一个或多个间插间隔肽分开。本文提供了用于产生三价结合分子的示例性连接体，其也提供在PCT申请号：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，这类三价结合分子的第一和第二多肽链缔合在一起，以形成能够结合第一表位的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。这类三价结合分子的第三和第四多肽链缔合在一起，以形成能够结合第三表位的VL3/VH3结合位点。应当理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或三特异性的结合。
如上述，本发明的三价结合分子可包括三条多肽。可通过将第四多肽N-末端的结构域连接至第三多肽的包含VH3的结构域获得包括三条多肽链的三价结合分子。可选地，使用包含下述三个结构域的本发明的三价结合分子的第三多肽链：(i)包含VL3的结构域、(ii)包含VH3的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域，其中VL3和VH3通过足够长(至少9个或更多个氨基酸残基)的间插间隔肽彼此分开，以便允许这些结构域缔合，以形成表位结合位点。
应当理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或三特异性的结合。但是，如本文提供，优选地选择这些结构域，以便结合PD-1和第二表位(或第二和第三表位)(优选地，这类表位是下述的表位：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3I类或II类MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
尤其地，可选择VL和VH结构域，以便三价结合分子包括针对第一表位的两个结合位点和针对第二表位的一个结合位点，或针对第一表位的一个结合位点和针对第二表位的两个结合位点，或针对第一表位的一个结合位点、针对第二表位的一个结合位点和针对第三表位的一个结合位点。本发明的代表性三价结合分子的多肽链的一般结构提供在图6A-6F和表5中：
Figure BDA0003673007740001041
HPD＝异源二聚体促进结构域
本发明的一个实施方式涉及双特异性三价结合分子，其包括针对PD-1的两个表位结合位点和针对不是PD-1的分子(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40，PD-L1、TCR、TIM-3等)上存在的第二表位的一个表位结合位点。针对PD-1的两个表位结合位点可结合相同的表位或不同的表位。本发明的另一实施方式涉及双特异性三价结合分子，其包括针对PD-1的一个表位结合位点和结合不是PD-1的分子(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3、I类或II类MHC、OX40，PD-L1、TCR、TIM-3等)上存在的第二抗原的两个表位结合位点。针对第二抗原的两个表位结合位点可结合抗原的相同的表位或不同的表位(例如，LAG-3的相同的或不同的表位)。如上面提供的，这类双特异性三价结合分子可包括三条或四条多肽链。
VI.恒定结构域和Fc区域
本文提供了可用于产生本发明的PD-1结合分子(例如，抗体、双抗体、三价结合分子等)的抗体恒定结构域。
优选的CL结构域是人IgG CLκ结构域。示例性人CLκ结构域的氨基酸序列是(SEQID NO:8)：
Figure BDA0003673007740001051
可选地，示例性CL结构域是人IgG CLλ结构域。示例性人CLκ结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9)：
Figure BDA0003673007740001052
如本文提供，本发明的PD-1结合分子可包括Fc区域。本发明的这类分子的Fc区域可以具有任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本发明的PD-1结合分子可进一步包括CH1结构域和/或铰链区。当存在时，CH1结构域和/或铰链区可以具有任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，并且优选地与期望的Fc区域具有相同的同种型。
示例性CH1结构域是人IgG1 CH1结构域。示例性人IgG1 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10)：
Figure BDA0003673007740001053
Figure BDA0003673007740001061
示例性CH1结构域是人IgG2 CH1结构域。示例性人IgG2 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:257)：
Figure BDA0003673007740001062
示例性CH1结构域是人IgG4 CH1结构域。示例性人IgG4 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:254)：
Figure BDA0003673007740001063
一个示例性铰链区是人IgG1铰链区。示例性人IgG1铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:32)：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性铰链区是人IgG2铰链区。示例性人IgG2铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:11)：ERKCCVECPPCP。
另一示例性铰链区是人IgG4铰链区。示例性人IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:12)：ESKYGPPCPSCP。如本文所描述，IgG4铰链区可包括稳定化突变比如S228P取代。示例性稳定化的IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13)：ESKYGPPCPPCP。
本发明的包含Fc区域的分子(例如，抗体、双抗体和三价分子)的Fc区域可以是完整的Fc区(例如，完整的IgG Fc区)或仅仅Fc区的片段。任选地，本发明包含Fc区的分子的Fc区缺少C-末端赖氨酸氨基酸残基。尤其地，本发明包含Fc区的分子的Fc区可以是工程化的变异的Fc区。尽管本发明双特异性包含Fc区的分子的Fc区可以具有结合一个或多个Fc受体(例如，FcγR)的能力，但是更优选地这类变异的Fc区具有对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)改变的结合(相对于野生型Fc区展示的结合)，或具有对抑制性受体基本上降低结合能力或没有结合抑制性受体的能力。因此，本发明包含Fc区的分子的Fc区可包括完整的Fc区的一些或所有CH2结构域和/或一些或所有CH3结构域，或可包括变异的CH2和/或变异的CH3序列(其相对于完整的Fc区的CH2或CH3结构域，可包括，例如，一个或多个插入和/或一个或多个缺失)。这类Fc区可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc区的部分，或可包括非天然产生的取向的CH2和/或CH3结构域(比如，例如，两个CH2结构域或两个CH3结构域，或者在N-末端至C-末端方向上，连接至CH2结构域的CH3结构域等)。
鉴定为改变效应子功能的Fc区域修饰是本领域已知的，包括增加与激活性受体(例如，FcγRIIA(CD16A)的结合的修饰和减少与抑制性受体(例如，FcγRIIB(CD32B)结合的修饰(见，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization Of TherapeuticAntibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And ControlsTumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,”CancerRes.57(18):8882-8890)。具有与CD32B降低的结合和/或与CD16A增加的结合的人IgG1 Fc区的示例性变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以以任何组合或亚组合存在于人IgG1 Fc区中。在一个实施方式中，人IgG1 Fc区变体包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一实施方式中，人IgG1 Fc区变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。
尤其地，本发明包含Fc区的分子的多肽链的Fc区域优选地展示对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合(相对于野生型IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)。上面叙述了能够介导这类改变的结合的变异的Fc区和突变体形式。在具体的实施方式中，本发明的包含Fc区的分子包括展示降低的ADCC效应子功能的IgG Fc区。在优选的实施方式中，这类包含Fc区的分子的第一和/或第三多肽链的CH2-CH3结构域包括下述的任何1、2或3个取代：L234A、L235A、N297Q和N297G。在另一实施方式中，人IgG Fc区变体包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因为这些突变消除了FcR结合。可选地，使用固有地展示对FcγRIIIA(CD16a)降低的(或基本上没有)结合和/或降低的效应子功能(相对于野生型IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)的Fc区的CH2-CH3结构域。在具体的实施方式中，本发明包含Fc区的分子包括IgG2 Fc区(SEQ IDNO:2)或IgG4 Fc区(SEQ ID：NO:4)。当使用IgG4 Fc区时，本发明也包括引入稳定化突变，比如上述的铰链区S228P取代(见，例如，SEQID NO:13)。因为N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效应子功能，在期望效应子功能的情况下，优选地将不采用这些取代。
尤其地，本发明的包含Fc区域的分子的多肽链的Fc区域优选地展示延长的血清半衰期(相对于相应的野生型Fc展示的半衰期)。上面叙述了展示延长的血清半衰期的变异的Fc区域和变体形式。在优选的实施方式中，这类包含Fc区域的分子的第一和/或第三多肽链的CH2-CH3结构域包括下述任何1、2或3个取代：M252Y、S254T和T256E。本发明进一步包括本发明的包含Fc区域的分子，其包括变异的Fc区域，所述变异的Fc区域包括：
(A)改变效应子功能和/或FcγR的一个或多个突变；和
(B)延长血清半衰期的一个或多个突变。
对于本发明的包含Fc区域的分子的CH2和CH3结构域优选的IgG1序列将包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E(SEQ ID NO:258)：
Figure BDA0003673007740001081
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明的包含Fc区域的分子的CH2和CH3结构域优选的IgG4序列将包括M252Y/S254T/T256E取代(SEQ ID NO:259)：
Figure BDA0003673007740001082
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
对于第一和第三多肽链不同的双抗体和三价结合分子，期望减少或防止两个第一多肽链的CH2-CH3结构域之间或两个第三多肽链的CH2-CH3结构域之间发生同源二聚化。这类多肽链的CH2和/或CH3结构域不需要序列相同，并且有利地被修饰以促进两条多肽链之间的复合。例如，氨基酸取代(优选以包括形成“杵(knob)”的大侧基的氨基酸例如色氨酸进行取代)可被引入CH2或CH3结构域中，以便空间干扰将防止与类似的突变结构域的相互作用并将迫使突变的结构域与其中互补或适应性突变已经被工程化的结构域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配对。这样的突变组可被工程化到任意对、的包括形成Fc区的CH2-CH3结构域的多肽中。蛋白质工程化以相对于同源二聚化利于异源二聚化的方法在本领域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白样分子而言，这些都包括在本文中(见例如，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains ForHeavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr.9:617-621；Atwell等(1997)“StableHeterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using APhage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“A New Format OfBispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And TumorCell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通过引用以其整体并入本文)。优选地“杵”被工程化至包括三条多肽链的双抗体的第一多肽链的CH2-CH3结构域中和“臼”被工程化至第三多肽链的CH2-CH3结构域中。因此，“杵”有助于防止第一多肽链经其CH2和/或CH3结构域而同源二聚化。因为第三多肽链优选地包含“臼”取代，其将与第一多肽链异源二聚化以及和本身同源二聚化。该策略可用于上面详述的包括三条、四条或五条链的双抗体和三价结合分子，其中“杵”被工程化至第一多肽链的CH2-CH3结构域中和“臼”被工程化至第三多肽链的CH2-CH3结构域中。
通过修饰IgG Fc区以包含修饰T366W而产生优选的杵。通过修饰IgG Fc区以包含修饰T366S、L368A和Y407V而产生优选的臼。为了有助于从最终的双特异性的、异源二聚化的、包含Fc区的分子中纯化含臼的第三多肽链同源二聚体，优选地通过在435位的氨基酸取代(H435R)突变第三多肽链的含臼的CH2和CH3结构域的蛋白质A结合位点。因此，含臼的第三多肽链同源二聚体不结合蛋白质A，而双特异性的异源二聚体经在第一多肽链上的蛋白质A结合位点而保持其结合蛋白质A的能力。在可选的实施方式中，含臼的第三多肽链可并入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
对于本发明包含Fc区域的分子的第一多肽链的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含杵的”序列(SEQ ID NO:6)：
Figure BDA0003673007740001101
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
对于具有两条多肽链的本发明的包含Fc区域的分子的第二多肽链(或具有三、四或五条多肽链的包含Fc区域的分子的第三多肽链)的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含臼的”序列(SEQ ID NO:7)：
Figure BDA0003673007740001102
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
如将认识到，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的CH2-CH3结构域包括在234位用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代，因此形成展示对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合的Fc区(相对于野生型Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)。本发明也包括这类CH2-CH3结构域，其包括可选的和/或另外的取代，其修饰Fc区域的效应子功能和/或FγR结合活性。本发明也包括这类CH2-CH3结构域，其进一步包括一个或多个延长半衰期的氨基酸取代。尤其地，本发明包括这类包含臼的和这类包含杵的CH2-CH3结构域，其进一步包括M252Y/S254T/T256E。
优选地第一多肽链具有“包含杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO:6的序列。但是，如将认识到，“包含臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:7)可用在第一多肽链中，在该情况下，“包含杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:6)将用在具有两条多肽链的本发明的包含Fc区域的分子的第二多肽链中(或在具有三、四或五条多肽链的包含Fc区域的分子的第三多肽链中)。
如上面详细描述，本发明包括包含Fc区域的分子(例如，包含Fc区域的抗体和双抗体)，其具有野生型CH2和CH3结构域，或具有包括上述取代的组合的CH2和CH3结构域。包括这些变异的IgG1 CH2-CH3结构域的示例性氨基酸序列是(SEQ ID NO:260)：
Figure BDA0003673007740001111
其中：
(a)X1和X2都是L(野生型)，或都是A(降低的FcγR结合)；
(b)X3、X4和X5分别是M、S和T(野生型)，或Y、T和E(延长的半衰期)，
(c)X6、X7和X8分别是：T、L和Y(野生型)，或W、L和Y(杵)，或S、A和V(臼)；
(d)X9和X10分别是N和H(野生型)，或N和R(没有蛋白质A结合)，或A和K(没有蛋白质A结合)；和
(e)X11是K或不存在。
在其他实施方式中，本发明包括PD-1结合分子，其包括使用本领域已知的突变已经被工程化成相对于同源二聚化利于异源二聚化的CH2和/或CH3结构域，比如PCT公开号WO2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中公开的那些，其所有通过引用以其整体并入本文。
VIII.PD-1x LAG-3双特异性结合分子
本发明尤其涉及PD-1x LAG-3双特异性结合分子(例如，双特异性抗体、双特异性双抗体等)，其包括抗PD-1抗体，优选本文提供的新抗人PD-1抗体之一，的表位结合片段，和抗人LAG-3抗体，优选本文提供的新的抗人LAG-3抗体之一，的表位结合片段。本发明优选的PD-1x LAG-3双特异性结合分子具有抗体的表位结合片段，所述抗体的表位结合片段能够确保它们能够协同结合两个不同表位：PD-1的表位和LAG-3的表位，以便减弱这类分子的抑制活性。如本文所使用，这类减弱指可检测的PD-1和/或LAG-3抑制活性减少至少20％、减少至少50％、减少至少80％或减少至少90％，或完全消除可检测的PD-1和/或LAG-3抑制活性。协调抗人PD-1抗体和抗LAG-3抗体的表位结合片段(例如，VL和VH结构域)的选择，以便构成这类PD-1x LAG-3双特异性结合分子的多肽链组装形成对于第一抗原(即，PD-1或LAG-3)特异性的至少一个功能性抗原结合位点和对于第二抗原(即，PD-1或LAG-3，取决于第一抗原的身份)特异性的至少一个功能性抗原结合位点。
在具体的实施方式中，本发明的PD-1x LAG-3双特异性结合分子是双特异性双抗体，其优选地包括如本文所描述的二、三、四或五条多肽链。在另一具体的实施方式中，本发明的PD-1x LAG-3双特异性结合分子是双特异性抗体，其优选地包括如本文所描述的二、三、或四条多肽链(也见，例如，WO 2007/024715、WO2007/110205、WO 2009/080251、WO2009/080254、WO 2009/089004、WO 2011/069104、WO 2011/117329、WO 2011/131746、WO2011/133886、WO 2011/143545、WO2012/023053、WO 2013/060867，其所有描述通过引用以其整体并入本文)。
A.抗人LAG-3抗体
下面提供了对于人LAG-3免疫特异性的示例性抗体。可通过分离使用LAG-3或其肽片段引起的分泌抗体的杂交瘤，或通过筛选用于结合LAG-3或其肽片段的重组抗体文库，制备另外期望的抗体。人LAG-3(包括28个氨基酸残基信号序列(以下划线显示)和497个氨基酸残基成熟的蛋白质)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:38)：
Figure BDA0003673007740001131
1.LAG-3mAb A
已经描述了抗人LAG-3抗体BMS-986016(25F7；Medarex/BMS)，本文命名为“LAG-3mAb A”和其变体(见，例如，WO 2014/008218)。LAG-3mAb A的重链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:39)(CDR加下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001132
LAG-3mAb A的轻链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:40)(CDR加下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001133
最近已经鉴定了具有独特的结合特征的另外的鼠科抗人LAG-3抗体(见，美国专利申请号62/172,277)。本发明优选的PD-1x LAG-3双特异性结合分子包括抗人LAG-3抗体LAG-3mAb 1或LAG-3mAb 6抗体的表位结合片段，其结合新的表位并且不与BMS-986016竞争LAG-3结合。尤其优选的是本发明的PD-1x LAG-3双特异性结合分子，其具有LAG-3mAb 1或LAG-3mAb 6的人源化的VH和/或VL结构域。
2.LAG-1mAb 1
LAG-3mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)。
Figure BDA0003673007740001141
LAG-3mAb 1的CDRH1(SEQ ID NO:42):RNYGMN
LAG-3mAb 1的CDRH2(SEQ ID NO43)：WINTYTGESTYADDFEG
LAG-3mAb 1的CDRH3(SEQ ID NO:44):ESLYDYYSMDY
LAG-3mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001142
LAG-3mAb 1的CDRL1(SEQ ID NO:46):KSSQSLLHSDGKTYLN
LAG-3mAb 1的CDRL2(SEQ ID NO:47):LVSELDS
LAG-3mAb 1的CDRL3(SEQ ID NO:48):WQGTHFPYT
下面提供了本文命名为“hLAG-3mAb 1VH1”和“hLAG-3mAb 1VH2”的LAG-3mAb 1的两个示例性人源化的VH结构域，和LAG-3mAb 1的四个示例性人源化的VL结构域“hLAG-3mAb1VL1”、“hLAG-3mAb 1VL2”、“hLAG-3mAb 1VL3”和“hLAG-3mAb 1VL4”。任何人源化的VL结构域可与任何人源化的VH结构域配对，以产生LAG-3结合结构域。因此，包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域之一的任何抗体一般称为“hLAG-3mAb 1”，并且并且人源化的VH/VL结构域的具体组合通过参考特定的VH/VL结构域命名，例如包括hLAG-3mAb 1VH1和hLAG-3mAb 1VL2的人源化抗体具体称为“hLAG-3mAb 1(1.2)”。
hLAG-3mAb 1VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001151
hLAG-3mAb 1VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001152
hLAG-3mAb 1VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:51)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001153
hLAG-3mAb 1VL2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001154
hLAG-3mAb 1VL3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001155
hLAG-3mAb 1VL4的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001156
hLAG-3mAb 1VL4的VL结构域的CDRL1包括甘氨酸至丙氨酸的氨基酸取代，并且具有氨基酸序列：KSSQSLLHSDAKTYLN(SEQ ID NO:55)，取代的丙氨酸加下划线显示)。考虑类似的取代可并入任何上述LAG-3mAb 1CDRL1结构域中。
3.LAG-3mAb 6
LAG-3mAb 6的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:56)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001161
LAG-3mAb 6的CDRH1(SEQ ID NO:57):DYNMD
LAG-3mAb 6的CDRH2(SEQ ID NO:58):DINPDNGVTIYNQKFEG
LAG-3mAb 6的CDRH3(SEQ ID NO:59):EADYFYFDY
LAG-3mAb 6的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:60)显示在下面(CDR残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001162
LAG-3mAb 6的CDRL1(SEQ ID NO:61):KASQDVSSVVA
LAG-3mAb 6的CDRL2(SEQ ID NO:62):SASYRYT
LAG-3mAb 6的CDRL3(SEQ ID NO:63):HYSTPWT
下面提供了本文命名为“hLAG-3mAb 6VH1”和“hLAG-3mAb 6VH2”的LAG-3mAb 6的两个示例性人源化的VH结构域，和LAG-3mAb 6的两个示例性人源化的VL结构域“hLAG-3mAb1VL1”和“hLAG-3mAb 1VL2”。任何人源化的VL结构域可与任何人源化的VH结构域配对，以产生LAG-3结合结构域。因此，包括与人源化的VH结构域配对的人源化的VL结构域之一的任何抗体一般称为“hLAG-3mAb 6”，并且，人源化的VH/VL结构域的具体组合通过参考特定VH/VL结构域命名，例如包括hLAG-3mAb 6VH1和hLAG-3mAb 6VL2的人源化抗体具体称为“hLAG-3mAb 6(1.2).”
hLAG-3mAb 6VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:294)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001171
hLAG-3mAb 6VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:295)显示在下面(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001172
hLAG-3mAb 6VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:296)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001173
hLAG-3mAb 6VL2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:297)显示在下面(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001174
hLAG-3mAb 6VL1和VL2的VL结构域的CDRL1包括赖氨酸至精氨酸的氨基酸取代并且具有氨基酸序列：RASQDVSSVVA(SEQ ID NO:298)，取代的精氨酸加下划线显示)。考虑类似的取代可并入上述任何LAG-3mAb 6CDRL1结构域中。
C.具有E/K-螺旋的、包含Fc区域的示例性四链双抗体
产生了包含Fc区域的四个示例性PD-1X LAG-3双特异性、四链双抗体，其包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域(命名为“DART A”、“DART B”、“DART C”和“DART I”)。下面详细描述了这些包含Fc区域的双抗体的结构。这些示例性PD-1x LAG-3双抗体旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
1.DART A
DART A是双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4 Fc区域、和包含半胱氨酸的E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART A的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23))；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E和缺少C-末端残基的变异的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART A的第一和第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:267的变体：
Figure BDA0003673007740001181
其中独立地选择X1、X2、X3和X4，并且其中X1是A或G；X2是Y或M；X3是T或S；和X4是E或T。
DART A的第一和第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:267，其中X1是A；X2是Y；X3是T；和X4是E。
DART A的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:24)；和C-末端。
DART A的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:268)：
Figure BDA0003673007740001191
2.DART B
DART B与DART A相同，除了DART B的第一和第三多肽链包括HLAG-3mAb 1VL3的VL结构域(SEQ ID NO:53)，其包括CDRL1中的氨基酸取代。因此，DART B的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG- 3hLAG-3mAb 1VL3)(SEQ ID NO:53)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23))；稳定化的IgG4铰链区(SEQ IDNO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E并且没有C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART B的第一和第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:267，其中X1是G；X2是Y；X3是T；和X4是E。
DART B的第二和第四多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:268。
3.DART C
DART C与DART B相同，除了DART B的第一和第三多肽链包括缺少C-末端残基的野生型IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)。因此，DART C的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb1VL3)(SEQ ID NO:53)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23))；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:13)；缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)；和C-末端。
DART C的第一和第三多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:267，其中X1是G；X2是M；X3是S；和X4是T。
DART C的第二和第四多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:268。
4.DART I
DART I是双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4 Fc区域、和包含半胱氨酸的E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART I的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 6VL1)(SEQ ID NO:296)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:23))；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:13)；包括取代M252Y/S254T/T256E和缺少C-末端残基的变异的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART I的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:290)：
Figure BDA0003673007740001211
DART I的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 6VH1)(SEQ ID NO:294)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ IDNO:15))；包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:24)；和C-末端。
DART I的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:291)：
Figure BDA0003673007740001212
C.具有CL/CH1结构域的、包含Fc区域的示例性四链双抗体
产生了命名为“DART D”、“DART E”、“DART J”和“DART 1”的包括CL/CH1结构域的四个示例性PD-1X LAG-3双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体。下面详述了这些包含Fc区域的双抗体的结构。这些示例性PD-1x LAG-3双抗体旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
1.DART D
DART D是双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域和被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4 Fc区域。DART D的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)；间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))；IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:254)；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：13)；包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART D的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:269)：
Figure BDA0003673007740001221
DART D的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))；κCL结构域(SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART D的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:270)：
Figure BDA0003673007740001231
2.DART E
DART E是另一双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域和被工程化用于延长的半衰期的变异的IgG4 Fc区域。DART E的PD-1和LAG-3结合位点的位置与DART D相比是颠倒的。
DART E的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))；IgG4CH1结构域(SEQ ID NO:254)；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：13)；包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART E的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:271)：
Figure BDA0003673007740001232
Figure BDA0003673007740001241
DART E的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)；间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))；κCL结构域(SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART E的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:272)：
Figure BDA0003673007740001242
3.DART J
DART J是双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域和被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4 Fc区域。DART J的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 6VL1)(SEQ ID NO:296)；间插连接体肽(连接体1：GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))；IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:254)；稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：13)；包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:259)；和C-末端。
DART J的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:292)：
Figure BDA0003673007740001251
DART J的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 6VH1)(SEQ ID NO:294)；间插连接体肽(连接体2：LGGGSG(SEQ ID NO:261))；κCL结构域(SEQ ID NO:8)；和C-末端。
DART J的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:293)：
Figure BDA0003673007740001252
Figure BDA0003673007740001261
4.DART 1
DART 1是双特异性、四链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域和针对降低的FcγR结合被工程化的变异的IgG1 Fc区域。DART 1的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1mAb A VL)(SEQ ID NO:65)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3LAG-3mAb A VH1)(SEQ ID NO:39)、间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:261))、IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:10)、IgG1铰链区(SEQ ID NO：32)、包括取代L234A/L235A并且缺少C-末端残基的IgG1 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:5)和C-末端。
DART 1的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:284)：
Figure BDA0003673007740001262
Figure BDA0003673007740001271
DART 1的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3LAG-3mAb A VL)(SEQ ID NO:40)、间插连接体肽(连接体1：GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1mAbA VH)(SEQ ID NO:64)、间插连接体肽(连接体2：LGGGSG(SEQ ID NO:261))、κCL结构域(SEQID NO:8)和C-末端。
DART 1的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:285)：
Figure BDA0003673007740001272
D.包含Fc区域的示例性五链双抗体
产生包括CL/CH1结构域和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的两个示例性PD-1XLAG-3双特异性、包含Fc区域的五链双抗体，命名为“DART F”和“DART G”。下面详述了这些包含Fc区域的双抗体的结构。这些示例性PD-1x LAG-3双抗体旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
1.DART F
DART F是双特异性、五链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的三个结合位点、对于LAG-3特异性的一个结合位点、CL/CH1结构域、针对降低的FcγR结合和延长的半衰期而被工程化的包含变异的杵/臼的IgG1 Fc区域和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART F的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:10)；IgG1铰链区(SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K并且缺少C-末端残基的、包含臼的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:260，其中X1是A，X2是A；X3是Y，X4是T，X5是E，X6是S，X7是A，X8是V，X9是A，X10是K，和X11不存在)；和C-末端。
DART F的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:273)：
Figure BDA0003673007740001281
DART F的第二和第五多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)、κCL结构域(SEQ IDNO:8)和C-末端。
DART F的第二和第五多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:274)：
Figure BDA0003673007740001282
DART F的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1结构域(SEQ IDNO:10)；IgG1铰链区(SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的、包含杵的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:260，其中X1是A，X2是A；X3是Y，X4是T，X5是E，X6是W，X7是L，X8是Y，X9是N，X10是H，和X11不存在)；间插连接体肽(GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:262))；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQID NO:54)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:21))；和C-末端。
DART F的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:275)：
Figure BDA0003673007740001291
DART F的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb1VH1)(SEQ ID NO:49)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))、异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:22))和C-末端。
DART F的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:276)：
Figure BDA0003673007740001301
2.DART G
DART G是双特异性、五链、包含Fc区域的双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域、针对降低的FcγR结合和延长的半衰期而被工程化的包含变异的杵/臼的IgG1 Fc区域，和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART G的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)；IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:10)；IgG1铰链区(SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K并且缺少C-末端残基的、包含臼的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:260，其中X1是A，X2是A；X3是Y，X4是T，X5是E，X6是S，X7是A，X8是V，X9是A，X10是K，和X11不存在)；和C-末端。
DART G的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:277)：
Figure BDA0003673007740001302
Figure BDA0003673007740001311
DART G的第二和第五多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)、κCL结构域(SEQID NO:8)和C-末端。
DART G的第二和第五多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:278)：
Figure BDA0003673007740001312
DART G的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)；IgG1 CH1结构域(SEQ IDNO:10)、IgG1铰链区(SEQ ID NO:32)；包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的、包含杵的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:260，其中X1是A，X2是A；X3是Y，X4是T，X5是E，X6是W，X7是L，X8是Y，X9是N，X10是H，和X11不存在)；间插连接体肽(GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:262))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQID NO:153)；间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))；异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:21))；和C-末端。
DART G的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:279)：
Figure BDA0003673007740001313
Figure BDA0003673007740001321
DART G的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb7VH1)(SEQ ID NO:147)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))、异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:22)和C-末端。
DART G的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:280)：
Figure BDA0003673007740001322
E.具有E/K-螺旋的包含Fc区域的示例性三链双抗体
本发明另外提供了PD-1X LAG-3双特异性、三链、包含Fc区域的双抗体，其包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。产生了包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的示例性PD-1X LAG-3双特异性、三链、包含Fc区域的双抗体，命名为“DART H”。下面详述了该包含Fc区域的双抗体的结构。该示例性PD-1x LAG-3双抗体旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
DART H是双特异性、包含Fc区域的三链双抗体，其具有对于PD-1特异性的一个结合位点、对于LAG-3特异性的一个结合位点、针对降低的FcγR结合而被工程化的包含变异的杵/臼的IgG1 Fc区域和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。
DART H的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb1VH1)(SEQ ID NO:49)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))、异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:21))、间插连接体(间隔体-连接体3:GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:263))、包括取代L234A/L235A和具有C-末端赖氨酸残基的包含杵的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:6)和C-末端。
DART H的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:281)：
Figure BDA0003673007740001331
Figure BDA0003673007740001341
DART H的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:14))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb7VH1)(SEQ ID NO:147)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:15))、异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:22))和C-末端。
DART H的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:282)：
Figure BDA0003673007740001342
DART H的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、铰链区(DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:31)、包括取代L234A/L235A并且具有C-末端赖氨酸残基的包含臼的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:7)和C-末端。
DART H的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:283)：
Figure BDA0003673007740001343
F.示例性双特异性抗体
产生示例性PD-1X LAG-3四链双特异性抗体，命名为“BSAB A”。下面详述了该双特异性抗体的结构。该示例性PD-1x LAG-3双特异性抗体旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
BSAB A是双特异性抗体，其具有对于PD-1特异性的一个结合位点、对于LAG-3特异性的一个结合位点、被工程化以降低FcγR结合和促进两个不同重链多肽之间复合的变异的IgG1 Fc区域(见，例如，WO 2011/143545)。
BSAB A的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端；能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1hPD-1mAb 7VH1)(SEQ ID NO:147)；IgG1 CH1结构域(SEQ IDNO:10)；包括取代D221E/P228E(根据如在Kabat中的EU索引编号并且在下面SEQ ID NO:286中以下划线显示)的变异的IgG1铰链区；包括取代L234A/L235A/L368E(在下面的SEQ IDNO:286中加下划线)并且缺少C-末端残基的变异的IgG1 CH2-CH3结构域；和C-末端。
BSAB A的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:286)：
Figure BDA0003673007740001351
BSAB的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1hPD-1mAb 7VL2)(SEQ ID NO:153)、κCL结构域(SEQ ID NO:8)和C-末端。
BSAB的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:287)：
Figure BDA0003673007740001352
Figure BDA0003673007740001361
BSAB A的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VH结构域(VHLAG-3hLAG-3mAb 1VH1)(SEQ ID NO:49)、IgG1 CH1结构域(SEQ IDNO:10)、包括取代D221R/P228R(在下面SEQ ID NO:288中加下划线)的变异的IgG1铰链区、包括取代L234A/L235A/L409R(在下面SEQ ID NO:288中加下划线)并且缺少C-末端残基的变异的IgG1 CH2-CH3结构域和C-末端。
BSAB A的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:288)：
Figure BDA0003673007740001362
BSAB A的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合LAG-3的单克隆抗体的VL结构域(VLLAG-3hLAG-3mAb 1VL4)(SEQ ID NO:54)、κCL结构域(SEQ ID NO:8)和C-末端。
BSAB A的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:289)：
Figure BDA0003673007740001363
IX.参考抗体
A.参考抗人PD-1抗体
为了评估和表征本发明新的抗人PD-1结合分子，采用下述参考抗体：尼鲁单抗(nivolumab)(也称为5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106，并且由Bristol-Myers Squibb以
Figure BDA0003673007740001371
出售)、本文命名为“PD-1mAb A”的人IgG4抗体；和派姆单抗(pembrolizumab)(之前称为兰罗利珠单抗(lambrolizumab)，也称为MK-3475，SCH-900475，并且由Merck以
Figure BDA0003673007740001372
出售)，一种人源化的IgG4抗体，本文命名为“PD-1mAb B”。
1.尼鲁单抗(“PD-1mAb A”)
PD-1mAb A的重链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:64)(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001373
PD-1mAb A的轻链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:65)(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001374
2.派姆单抗(“PD-1mAb B”)
PD-1mAb B的重链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:66)(CDRH残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001375
PD-1mAb B的轻链可变区的氨基酸序列具有氨基酸序列(SEQ ID NO:67)(CDRL残基以下划线显示)：
Figure BDA0003673007740001376
X.生产方法
可由抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15的多核苷酸和/或序列通过本领域已知的方法，例如，合成或重组产生抗人PD-1多肽和其他PD-1激动剂、拮抗剂和调节剂。产生这类肽激动剂、拮抗剂和调节剂的一种方法涉及多肽的化学合成，随后在适于获得天然构象，即，正确的二硫键连接的氧化条件下处理。这可使用本领域技术人员熟知的方法完成(见，例如，Kelley,R.F.等(1990)，在以下中：Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.编辑,Plenum Press,N.Y.,vol.12，pp 1-19；Stewart,J.M等(1984)SolidPhase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL；也见美国专利号4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925)。
可使用固相肽合成常规制备本发明的多肽(Merrifield,B.(1986)“Solid PhaseSynthesis,”Science 232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)“General Method ForThe Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:Specificity OfAntigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-PhaseSynthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
在仍另一可选方案中，可通过使用商业上可得的已经被工程化而表达特异性人免疫球蛋白蛋白质的小鼠，获得用于结合人PD-1的、具有下述的一个或多个CDR的完全人抗体或其可溶性形式：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15，或与PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15。被设计来产生更期望的(例如，完全人抗体)或更强力免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人抗体。这类技术的例子是XenomouseTM(Abgenix,Inc.,Fremont,CA)和
Figure BDA0003673007740001391
和TC MOUSETM(都来自Medarex,Inc.,Princeton,NJ)。
可选地，可重组制备抗体和使用本领域已知的任何方法表达。可如下经重组制备抗体：首先从宿主动物分离制备的抗体，获得基因序列，和使用基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体。可采用的另一方法是在植物(例如，烟草)或转基因奶中表达抗体序列。用于在植物或奶中重组表达抗体的适当的方法已经被公开了(见，例如，Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,”Vaccine 19:2756；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method ForThe Production Of Recombinant Antibodies,”J.Immunol Methods 231:147-157)。制备抗体衍生物，例如，人源化抗体、单链抗体等的适当的方法是本领域已知的。在另一可选方案中，可通过噬菌体展示技术重组制备抗体(见，例如，美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter,G.等(1994)“Making Antibodies By Phage DisplayTechnology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
可通过Edman降解对感兴趣的抗体或蛋白质进行测序，其是本领域技术人员熟知的。从质谱或Edman降解产生的肽信息可用于设计用于克隆感兴趣的蛋白质的探针或引物。
克隆感兴趣的蛋白质的可选的方法是通过使用纯化PD-1或其部分“淘洗”表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞，所述感兴趣的抗体或蛋白质具有下述的一个或多个CDR：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15，或与PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15，用于结合人PD-1。可如下进行“淘洗”程序：从表达PD-1的组织或细胞获得cDNA文库，在第二细胞类型中过表达cDNA，和在存在或没有PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15的情况下针对特异性结合PD-1筛选转染的第二细胞类型的细胞。用于通过“淘选”克隆编码细胞表面蛋白的哺乳动物基因的方法的详细描述可见于现有技术(见，例如，Aruffo,A.等(1987)“Molecular Cloning Of ACD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:8573-8577和Stephan,J.等(1999)“Selective CloningOf Cell Surface Proteins Involved In Organ Development:EpithelialGlycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,”Endocrinol.140:5841-5854)。
包含感兴趣的多核苷酸的载体可通过一些适当手段中的任意手段被引入到宿主细胞中，所述适当手段包括电穿孔；采用氯化钙、铷氯化物、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击(microprojectile bombardment)；脂转染；和感染(例如，在载体是感染剂诸如痘苗病毒的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择常常取决于宿主细胞的特征。
能够过表达异源DNA的任何宿主细胞均可被使用，用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。合适的哺乳动物宿主细胞的非的限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选地，相比于宿主细胞中相应的感兴趣的内源抗体或蛋白质(如果存在)，宿主细胞以约5-倍，更优选10-倍，甚至更优选20-倍的水平表达cDNA。通过免疫试验或FACS实现筛选特异性结合PD-1的宿主细胞。可鉴定过表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。
本发明包括的多肽包括本发明抗体的氨基酸序列。可通过本领域已知的程序制备本发明的多肽。可通过抗体的蛋白水解或其他降解、如上述的重组方法(即，单个或融合多肽)或化学合成来产生多肽。抗体的多肽，尤其地，上至约50个氨基酸的较短的多肽，通过化学合成被常规制备。化学合成方法在本领域中是已知的，并且是商业上可得到的。例如，抗人PD-1多肽可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。
本发明包括下述的变体：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15抗体，和它们结合PD-1的多肽片段，包括功能上等同的抗体和不明显影响这类分子性质的融合多肽以及具有增强的或降低的活性的变体。多肽的修饰在本领域中是常规操作，因而不需要在本文详细描述。修饰的多肽的实例包括这样的多肽：其具有氨基酸残基的保守取代、未明显有害改变功能活性的氨基酸的一个或多个缺失或添加，或使用化学类似物。可彼此保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；丝氨酸/苏氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻译后修饰的多肽，所述其它翻译后修饰，诸如例如，用不同糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代应该是保守的，即，取代的氨基酸会具有与原始氨基酸类似的化学性质。这样的保守取代在本领域中是已知的，并且已经在上文提供实例。氨基酸修饰范围可从改变或修饰一个或多个氨基酸到区域诸如可变结构域的完全重新设计(redesign)。可变结构域中的变化可改变结合亲和力和/或特异性。修饰的其它方法包括利用本领域中已知的偶合技术，包括但不限于酶促手段、氧化取代和螯合。修饰可用于例如，连接标签用于免疫分析，诸如连接放射性部分用于放射免疫分析。修饰的多肽利用本领域中确定的方法制备，并且可利用本领域中已知的标准测定来筛选。
本发明包括融合蛋白，其包括本发明的一个或多个多肽或PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15抗体。在一个实施方式中，提供的融合多肽包括轻链、重链或轻链和重链二者。在另一实施方式中，融合多肽包含异源免疫球蛋白恒定区。在另一实施方式中，融合多肽包含由公共保藏的杂交瘤产生的抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域。为了本发明的目的，抗体融合蛋白包含特异性结合PD-1的一个或多个多肽结构域和其在天然分子中未连接的另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列例如，异源序列或来自另一区域的同源序列。
XI.本发明的PD-1结合分子的用途
本发明包括组合物，包括药物组合物，其包括本发明的PD-1结合分子(例如，抗PD-1抗体、抗PD-1双特异性双抗体等)、源自这类分子的多肽、包括编码这类分子或多肽的序列的多核苷酸和如本文所描述的其他试剂。
A.治疗性用途
如上所讨论，PD-1在负调节T-细胞增殖、功能和稳态中起重要的作用。本发明的某些PD-1结合分子具有抑制PD-1功能的能力，从而逆转PD-1-介导的免疫系统抑制。因此，PD-1mAb 1、PD-1mAb 3、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14和PD-1mAb 15、它们人源化的衍生物和包括它们的PD-1结合片段的分子(例如，双特异性抗体、双特异性双抗体(包括但不限于DART-A、DART-B、DART-C、DART-D、DART-E、DART-F、DART-G、DART-H、DART-I和DART-J)等)或与这类抗体竞争结合的分子，可用于阻断PD-1-介导的免疫系统抑制，从而促进免疫系统的激活。
结合PD-1和细胞表面上存在的参与调节免疫检查点的另一分子(例如，LAG-3)的本发明的这类双特异性PD-1结合分子，通过阻断PD-1和这类免疫检查点分子介导的免疫系统抑制而加强了免疫系统。因此，本发明的这类PD-1结合分子可用于加强受试者的免疫应答(例如，T-细胞介导的免疫应答)。尤其地，本发明的这类PD-1结合分子可用于治疗与与非期望的被抑制的免疫系统相关的任何疾病或病况，包括与病原体(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物感染)的存在相关的癌症和疾病。
可由本发明的这类PD-1结合分子治疗的癌症包括特征在于存在选自由以下的细胞组成的组的癌症细胞的癌症：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤、罕见血液学疾病、肾转移性癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症和子宫癌。
尤其地，本发明的这类PD-1结合分子可用于治疗结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌。
可由本发明的这类PD-1结合分子治疗的病原体相关的疾病包括慢性病毒、细菌、真菌和寄生虫感染。可由本发明的PD-1结合分子治疗的慢性感染包括爱泼斯坦-巴尔病毒、甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)、淋球菌(Gonococci)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分歧杆菌(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Pneumonococci、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、破伤风(Tetanus)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔假丝酵母(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毛霉目(Mucorales)的属(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球霉菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、细螺旋体病(Leptospirosis)、包柔氏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、蠕虫寄生虫(钩虫、绦虫、吸虫、扁形虫(例如血吸虫(Schistosomia))、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、旋毛虫(trichinella)、脆双核阿米巴(DientamoebaFragilis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)。
本发明的这类PD-1结合分子可联合其他抗癌剂，尤其地，特异性结合癌症抗原的分子(例如，抗体、双抗体)。可与本发明的PD-1结合分子联合的抗癌疗法包括特异性结合一种或多种癌症抗原的分子，所述癌症抗原包括：结肠癌中发现的19.9、胃癌黏蛋白；4.2；A33(结直肠癌抗原；Almqvist,Y.2006,Nucl Med Biol.Nov；33(8):991-998)；ADAM-9(美国专利公开号2006/0172350、PCT公开号WO 06/084075)；胃癌中发现的AH6；ALCAM(PCT公开号WO03/093443)；APO-1(恶性人淋巴细胞抗原)(Trauth等(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,”Science 245:301-304)；B1(Egloff,A.M.等2006,Cancer Res.66(1):6-9)；B7-H3(Collins,M.等(2005)“The B7Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7)。Chapoval,A.等(2001)“B7-H3:A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γProduction,”Nature Immunol.2:269–274；Sun,M.等(2002)“Characterization of Mouseand Human B7-H3 Genes,”J.Immunol.168:6294-6297)；BAGE(Bodey,B.2002 Expert OpinBiol Ther.2(6):577-84)；β-联蛋白(Prange W.等2003 J Pathol.201(2):250-9)；如结肠腺癌中发现的血型ALeb/Ley；伯基特淋巴瘤抗原-38.13，如结肠腺癌中发现的C14；CA125(卵巢癌抗原)(Bast,R.C.Jr.等2005Int J Gynecol Cancer 15Suppl 3:274-81；Yu等(1991)“Coexpression Of Different Antigenic Markers On 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在某些实施方式中，本发明的这类抗PD-1结合分子与特异性结合5T4、B7H3、CD19、CD20、CD51、CD123、DR5、EGFR、EpCam、GD2、gpA33、HER2、ROR-1、TAG-72、VEGF-A抗体和/或VEGFR2的一个或多个分子联合使用。
本发明的这类PD-1结合分子可与免疫原性试剂比如肿瘤疫苗联合。这类疫苗可包括纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)，自体或异源的肿瘤细胞。已经描述了许多肿瘤疫苗策略(见例如，Palena,C.,等,(2006)“Cancer vaccines:preclinicalstudies and novel strategies,”Adv.Cancer Res.95,115-145；Mellman,I.,等(2011)“Cancer immunotherapy comes of age,”Nature 480,480–489；Zhang,X.M.等(2008)“Theanti-tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derivedpeptides,”Oncol.Rep.20,245–252；Disis,M.L.等(2002)“Generation of T-cellimmunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neupeptide-based vaccines,”J.Clin.Oncol.20,2624–2632；Vermeij,R.等(2012)“Potentiation of a p53-SLP vaccine by cyclophosphamide in ovarian cancer:asingle-arm phase II study.”Int.J.Cancer 131,E670–E680)。本发明的这类PD-1结合分子可联合化疗方案。在这些情况下，可能降低施用的化疗剂的剂量(Mokyr等(1998)CancerResearch 58:5301-5304)。
本发明的这类PD-1结合分子可联合其他免疫刺激分子，比如激活宿主免疫反应性的抗体，以提供增加水平的T-细胞激活。尤其地，已经表明抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体激活免疫系统(见，例如，del Rio,M-L.等(2005)“Antibody-MediatedSignaling Through PD-1Costimulates T Cells And Enhances CD28-DependentProliferation,”Eur.J.Immunol 35:3545-3560；Barber,D.L.等(2006)“Restoringfunction in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection,”Nature 439,682–687；Iwai,Y.等(2002)“Involvement Of PD-L1 On Tumor Cells In The EscapeFrom Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade,”Proc.NatlAcad.Sci.USA 99,12293–12297；Leach,D.R.,等,(1996)“Enhancement Of AntitumorImmunity By CTLA-4Blockade,”Science 271,1734-1736)。可与本发明的PD-1结合分子联合的另外的免疫刺激分子包括激活树突细胞(DC)功能和抗原呈递的针对树突细胞表面上的分子的抗体、能够代替T细胞助细胞活性的抗CD40抗体、和针对T细胞共刺激分子，比如PD-L1、CTLA-4、OX-40 4-1BB和ICOS的激活抗体(见，例如，Ito等(2000)“EffectivePriming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous AdministrationOf Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4Antibodies,”Immunobiology 201:527-40；美国专利号5,811,097；Weinberg等(2000)“Engagement of the OX-40Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity,”Immunol164:2160-2169；Melero等(1997)“Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-CellActivation Molecule Eradicate Established Tumors,”Nature Medicine 3:682-685；Hutloff等(1999)“ICOS Is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally AndFunctionally Related To CD28,”Nature 397:263-266；和Moran,A.E.等(2013)“TheTNFRs OX40,4-1BB,and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy,”Curr OpinImmunol.2013 Apr；25(2):10.1016/j.coi.2013.01.004)，和/或刺激性嵌合抗原受体(CAR)，其包括针对与来自各种共刺激蛋白质受体(例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40等)的一个或多个细胞内信号传导结构域融合的疾病抗原的抗原结合结构域，其用于在抗原结合时刺激T细胞(见，例如，Tettamanti,S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia ByCytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific ChimericAntigen Receptor,”Br.J.Haematol.161:389-401；Gill,S.等(2014)“Efficacy AgainstHuman Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In AMouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,”Blood 123(15):2343-2354；Mardiros,A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific ChimericAntigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And AntitumorEffects Against Human Acute Myeloid Leukemia,”Blood 122:3138-3148；Pizzitola,I.等(2014)“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens EfficientlyTarget Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,”Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。
本发明的这类PD-1结合分子可联合抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，以转移(divertoff)靶向免疫疗法应答。iCAR，一种针对与来自各种抑制性蛋白质受体(例如，CTLA-4、PD-1等)的一个或多个细胞内信号传导结构域融合的疾病抗原的抗原结合结构域，其用于在抗原结合时约束T-细胞应答(见，例如，Fedorov V.D.(2013)“PD-1–and CTLA-4–BasedInhibitory Chimeric Antigen Receptors(iCARs)Divert Off-Target ImmunotherapyResponses,”Sci.Tranl.Med.5:215ra172 doi:10.1126/scitranslmed.3006597。
尤其地，本发明的这类抗PD-1结合分子与抗CD137抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX40抗体、抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体和/或癌症疫苗组合使用。
B.诊断和治疗诊断用途
本发明的某些PD-1结合分子几乎不展示或不展示阻断PD-1和PD-1L配体之间结合的能力。因此，抗体PD-1mAb 2和PD-1mAb 4、它们的人源化衍生物和包括它们的PD-1结合片段的分子(例如，双特异性双抗体等)或与这类抗体竞争结合的分子可被可检测地标记(例如，标记以放射性、酶、荧光、化学发光、顺磁性、抗磁性或其他标记部分)，并且用于检测样品中的PD-1或用于细胞上PD-1的成像。因为这类分子不影响PD-1的生物活性，所以它们尤其可用于确定受试者(例如，针对与表达或靶向PD-1相关的癌症被治疗的受试者)中PD-1表达的程度、位置和改变的方法中。
XII.药物组合物
本发明的组合物包括原料药组合物(bulk drug composition)，其可用于制备药学组合物(例如，不纯或非无菌组合物)和可用于制备单位剂型的药学组合物(即，适于施用给受试者或患者的组合物)。这样的组合物包括预防有效量的或治疗有效量的本发明的PD-1结合分子或这类剂和药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的PD-1结合分子和药学上可接受的载体。本发明尤其包括这类药物组合物，其中PD-1结合分子是：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15；人源化PD-1mAb 1；PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15；任何这类抗体的PD-1结合片段；或其中PD-1结合分子是双特异性PD-1双抗体(例如，PD-1x LAG-3双特异性双抗体)。尤其包括的是这类分子：其包括下述的3个CDRL和3个CDRH：PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15抗体；人源化的PD-1mAb 1；PD-1mAb 2、PD-1mAb3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15。
本发明还包括这样的药学组合物，其另外包括对特定癌抗原是特异性的第二治疗抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)和药学上可接受的载体。
在具体的实施方式中，术语“药学上可接受的”表示获得联邦政府或州政府管理机构的许可或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常获得认可的药典中，供用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。这类药学载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药学组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，组合物也可以含有小量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。
一般而言，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型混合在一起，例如作为标明活性剂的量的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌的药学级水或盐水的输注瓶分配。如果通过注射施用所述组合物，则可以提供一安瓿注射用无菌水或盐水，以便可以在施用前混合所述成分。
可以将本发明的组合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的盐以及用阳离子形成的盐，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，并且所述阳离子例如来自氢氧化纳、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子。
本发明也提供药学包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充本发明的PD-1结合分子(更优选地，PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15；人源化的PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15抗体；任何这类抗体的PD-1结合片段；或其中PD-1结合分子是双特异性PD-1双抗体(例如，PD-1x LAG-3双特异性双抗体))。尤其包括这类分子，其包括PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14或PD-1mAb 15的3个CDRL和3个CDRH，单独地或与这类药学上可接受的载体一起。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂也可包括在药物包装或试剂盒中。本发明也提供了这样的药物包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地与这类容器(一个或多个)关联的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的布告(notice)，所述布告反映了管理机构许可用于人类施用的制造、使用或销售。
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。试剂盒可包括本发明的任何PD-1结合分子。试剂盒可在一个或多个容器中进一步包括可用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂和/或治疗剂；和/或试剂盒可进一步包括结合与癌症相关的一种或多种癌症抗原的一种或多种细胞毒性抗体。在某些实施方式中，其他预防剂或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，预防剂或治疗剂是生物或激素治疗剂。
XIII.施用方法
通过向受试者施用有效量的本发明的融合蛋白或缀合分子或包括本发明的融合蛋白或缀合分子的药学组合物，可以提供本发明的组合物用来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面，这类组合物基本上是纯的(即，基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物，如非灵长类(例如牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。
各种送递系统是已知的，并且可以用于施用本发明的组合物，例如封装于脂质体中、微粒、微胶囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(见，例如，Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)、构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分等。
施用本发明的分子的方法包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌肉、腹腔内、静脉内以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻内和口腔途径)。在具体实施方式中，本发明的PD-1结合分子经肌肉、静脉内或皮下施用。组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或弹丸注射、通过上皮或黏膜皮肤被覆(lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身的或局部的。另外，也可以应用肺给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，并且与雾化剂一起配制。见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT申请号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
本发明也使得本发明的PD-1结合分子包装在密封容器中，比如指示分子的数量的安瓿或小袋中。在一个实施方式中，这样的分子作为冻干无菌粉或无水浓缩物提供于密封容器中，并且可以用例如水或盐水重构至适当浓度，用于施用于受试者。优选地，本发明的PD-1结合分子作为冻干无菌粉提供于密封容器中。
本发明的冻干的PD-1结合分子应在它们的初始容器中储存在2℃和8℃之间，并且分子应该在重构之后12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在可选的实施方式中，这样的分子以液体形式提供在指示分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，这类PD-1结合分子在以液体形式提供时，被供应在密封容器中。
可通过标准临床技术确定本发明的组合物有效治疗、预防或改善与病症相关的一个或多个症状的量。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用的路径和病况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断。
如本文所使用，在一个实施方式中，“有效量”的药物组合物是足够实现有益或期望的结果的量，所述结果包括但不限于临床结果，比如减少源自疾病的症状、减少感染的症状(例如，病毒量、发烧、疼痛、败血症等)或癌症的症状(例如，癌细胞的增殖、肿瘤存在、肿瘤转移等)，从而提高遭受疾的患者的生命质量，降低治疗疾病需要的其他药物治疗的剂量、比如经靶向和/或内化增强另一药物的作用、延迟疾病的进展，和/或延长个体的生存。
可在一次或多次施用中施加有效量。为了本发明的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是足够减少病毒存在的增殖(或影响)和直接或间接减少和/或延迟病毒疾病的发展的量。在一些实施方式中，药物、化合物或药物组合物的有效量可联合或不联合另一药物、化合物或药物组合物实现。因此，“有效量”可在施用一种或多种化疗剂的背景下考虑，并且如联合一种或多种其他剂，可实现或实现期望的结果，则单剂可视为以有效量施用。尽管个体的需要不同，但是测定每种组分的有效量的最佳范围是本领域技术人员已知的。
对于本发明包括的PD-1结合分子，向患者施用的剂量优选地基于接受受试者的体重(kg)确定。对于本发明包括的PD-1结合分子，向患者施用的剂量通常是至少约0.01μg/kg、至少约0.05μg/kg、至少约0.1μg/kg、至少约0.2μg/kg、至少约0.5μg/kg、至少约1μg/kg、至少约2μg/kg、至少约5μg/kg、至少约10μg/kg、至少约20μg/kg、至少约50μg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约1mg/kg、至少约3mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约30mg/kg、至少约50mg/kg、至少约75mg/kg、至少约100mg/kg、至少约125mg/kg、至少约150mg/kg受试者的体重或更多。
可通过修饰比如，例如脂质化而增强分子的吸收和组织渗透，来减少或改变施用的本发明的PD-1结合分子的剂量和频率。
对于用作单剂疗法，可计算向患者施用的本发明的PD-1结合分子的剂量。可选地，分子可与其他治疗组合物联合使用，并且向患者施用的剂量小于当所述分子用作单剂疗法时的剂量。
本发明的药物组合物可被局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不限于下述方式实现：局部注入、通过注射、或通过植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用不吸收该分子的材料。
本发明的组合物可在泡状体(vesicle)，尤其是脂质体中递送(见Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等,在Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,New York,353-365页(1989)中；Lopez-Berestein,同上,3 17-327页)。
本发明的组合物可以在控释或缓释系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术均可用于产生包括本发明的一个或多个PD-1结合分子的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等(1995)“Antibody MediatedLung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric CarriersFor A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of RecombinantHumanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通过引用以其整体并入本文。在一个实施方式中，泵可用于控释系统(见Langer,上文；Sefton,(1987)“Implantable Pumps,”CRCCrit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term,ContinuousIntravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump InAmbulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable MedicationSystem For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一实施方式中，聚合材料可用于实现分子的控释(见例如，Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification OfBioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,”Science228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A PolymericBrain Implant:In Vivo Characterization,”Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112)；美国专利号5,679,377、美国专利号5,916,597、美国专利号5,912,015、美国专利号5,989,463、美国专利号5,128,326、PCT公开号WO 99/15154和PCT公开号WO 99/20253)。缓释制剂中所用的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控释系统可接近治疗靶(例如，肺)布置，因此仅仅需要全身剂量的一部分(见，例如，Goodson,在以下中：Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2，115-138页(1984))。根据Dunn等(见U.S.5,945,155)，使用可用作控释移植物的聚合物组合物。该特定方法基于聚合物系统中生物活性材料原位控释的治疗效果。移植可通常发生于患者身体内需要治疗的任何地方。可使用非聚合物持续递送系统，由此受试者身体内的非聚合物移植物被用作药物递送系统。一旦移植到身体中，移植物的有机溶剂会从组合物中消散、分散或渗漏到周围组织流中，并且非聚合物材料会逐渐凝结或沉淀，形成固体微孔基质(见美国5,888,533)。
Langer的综述中讨论了控释系统(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来生产包含本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见，例如美国专利号4,526,938；国际公开号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human ColonCancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-CirculatingEmulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody ForCardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
在本发明的组合物是编码本发明的PD-1结合分子的核酸的情况下，核酸可被体内施用，以通过如下方式促进其编码的PD-1结合分子的表达：将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用其从而其成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道技术(Biolistic),Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过与已知进入核的同源框样肽联合施用(见例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox PeptideRegulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等。可选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。
用治疗或预防有效量的本发明的PD-1结合分子治疗受试者可包括单治疗，或优选地，可包括一系列治疗。在优选的实施例中，用这类双抗体治疗受试者每周一次，持续约1至10周，优选地2至8周，更优选地约3至7周，和甚至更优选地持续约4、5或6周。本发明的药物组合物可每天施用一次、每天施用两次或每天施用三次。可选地，药物组合物可每周施用一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每年两次或每年一次。也将认识到，用于治疗的分子的有效剂量可随着具体治疗的疗程而增加或降低。
实施例
下述实施例阐释了组合物在本发明的诊断或治疗方法中的的各种方法。实施例旨在是说明性的，但是决不限制本发明的范围。
实施例1
抗人PD-1单克隆抗体的表征
分离能够特异性结合人和食蟹猴PD-1二者的十五种鼠科单克隆抗体，并且给与命名“PD-1mAb 1”、“PD-1mAb 2”、“PD-1mAb 3”、“PD-1mAb 4”、“PD-1mAb 5”、“PD-1mAb 6”、“PD-1mAb 7”、“PD-1mAb 8”、“PD-1mAb 9”、“PD-1mAb 10”、“PD-1mAb 11”、“PD-1mAb 12”、“PD-1mAb 13”、“PD-1mAb 14”和“PD-1mAb 15”。发现这些抗体的CDR不同，并且在上面提供。如下评估与人和食蟹猴PD-1的细胞外结构域的结合：用可溶性人或食蟹猴PD-1(与组氨酸标签(shPD-1His)或人Fc区域(shPD-1hFc)融合的人PD-1的细胞外结构域，或与人Fc区域融合的食蟹猴PD-1的细胞外结构域(scyno-PD1 Fc))涂覆平底maxisorb 96孔板，每个孔0.5或1μg/mL，洗涤平板，并且用分离的抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15之一进行孵育。对于这些研究，以3、1.0、0.3333、0.1111、0.0370、0.0123或0.0041μg/mL(三倍连续稀释)使用抗PD-1抗体。使用山羊抗小鼠IgG-HRP二抗，评估结合至固定的PD-1(人或食蟹猴)的抗体的量。在平板阅读器(Victor 2Wallac,Perkin Elmers)上分析所有的样品。可溶性人和可溶性食蟹猴PD-1的代表性结合曲线分别显示在图7A-7D和图8A-8C中。
这些结合试验的结果(图7A-7D和图8A-8C)显示，所有的抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15均结合可溶性人和可溶性食蟹猴PD-1二者。
为了进一步表征鼠科抗PD-1抗体，在两个不同的试验中评估它们阻断可溶性人PD-L1与可溶性人PD-1的结合的能力。在一个试验中，检测抗体阻断人PD-1与固定在表面上的PD-L1的结合的能力。对于该试验，将抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15中的每种，或参考抗PD-1抗体(PD-1mAb A)与shPD-1His融合蛋白(以2.5μg/mL)混合，并且分别与以1μg/mL固定在链霉抗生物素包被的板上的生物素标记的可溶性人PD-L1(与人Fc融合的PD-L1的细胞外结构域(sPD-L1))一起孵育。对于这些研究，以10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125或0.1563μg/mL(两倍连续稀释)使用抗PD-1抗体。使用抗His-Tag-HRP二抗，经His-Tag，评估与固定的sPD-L1结合的shPD-1His的量。在平板阅读器(Victor 2Wallac,Perkin Elmers)上分析所有的样品。该实验的结果显示在图9A-9D中。
这些抑制试验的结果(图9A-9D)显示，抗PD-抗体PD-1mAb 1、PD-1mAb 3、PD-1mAb5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 8、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14和PD-1mAb 15能够不能程度地阻断可溶性人PD-L1与可溶性人PD-1的结合，而PD-1mAb 2和PD-1mAb 4在该试验形式中展示很小的阻断活性至没有阻断活性。
在第二个试验中，检测鼠科抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15阻断PD-1配体(即，人PD-L1或人PD-L2)与在NSO细胞的表面上表达的PD-1结合的能力。对于该试验，将抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15中的每种，或参考抗PD-1抗体(PD-1mAb A或PD-1mAb B)分别与生物素化的-可溶性人PD-L1(shPD-L1融合蛋白)或生物素化的-可溶性人PD-L2-muIgFc融合蛋白(shPD-L2；Ancell Cat#573-030)混合，各为0.1μg/测试，并且在阻断缓冲液(FACS+10％人血清白蛋白)中与表达人PD-1的NSO细胞一起孵育(～250,000细胞/孔)。对于这些研究，以4.0、1.0、2.5x10-1、6.25x10-2、1.56x10-2、3.90x10-3、9.76x10-4、2.4x10-4、0.6x10-4μg/测试(四倍连续稀释)使用抗PD-1抗体。使用PE缀合的链霉抗生物素二抗通过FACS分析测定结合至NSO细胞的表面的shPD-L1(或shPD-L2)的量。测定抑制PD-1/PD-L1结合的IC50值，并且在表6中提供至少两个实验的样品平均值()(除非在指出的情况下)。
Figure BDA0003673007740001641
Figure BDA0003673007740001642
来自单个实验的结果
shPD-L1抑制试验的结果(表6)显示，抗PD-1抗体PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 11、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14和PD-1mAb 15能够阻断人PD-L1与在NSO细胞的表面上表达的人PD-1的结合。尤其地，相比参考PD-1抗体(PD-1mAb A、PD-1mAb B)，PD-1mAb 1、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 10和PD-1mAb 15一样好地阻断或更好地阻断shPD-L1结合，而PD-1mAb 8在该试验形式中基本上是非阻断的。PD-1mAb 2和PD-1mAb 4都能够在该试验形式中阻断PD-1/PD-L1结合。
类似地，抗PD-1抗体PD-1mAb 1、PD-1mAb 2和PD-1mAb 3、PD-1mAb 4、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9、PD-1mAb 10、PD-1mAb 12、PD-1mAb 13、PD-1mAb 14能够阻断人PD-L2与在NSO细胞的表面上表达的人PD-1的结合，而PD-1mAb 8在该试验形式中基本上是非阻断的。尤其地，与参考PD-1抗体(PD-1mAb A、PD-1mAb B)相比，PD-1mAb 1、PD-1mAb 5、PD-1mAb 6、PD-1mAb 7和PD-1mAb 10一样好地阻断或更好地阻断shPD-L2结合。在该试验中，没有检测PD-1抗体PD-1mAb 11和PD-1mAb 15。下面提供了若干人源化抗PD-1抗体，包括hPD-1mAb 15的结果。
实施例2
人源化和进一步表征
将抗PD-1抗体PD-1mAb 1、PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15的可变结构域人源化，在鉴定了抗原表位的情况下，使抗体进一步去免疫化，以产生最终的人源化可变结构域。PD-1mAb 1、PD-1mAb 2和PD-1mAb 15的人源化为每种抗体产生一个人源化的VH结构域和一个人源化的VL结构域，本文命名为“hPD-1mAb 1VH1”和“hPD-1mAb 1VL1”、“hPD-1mAb 2VH1”和“hPD-1mAb 2VL1”和“hPD-1mAb 15VH1”和“hPD-1mAb 15VL1”。PD-1mAb7的人源化产生两个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 7VH1”和“hPD-1mAb 7VH2”，和三个人源化的VL结构域，本文命名为“hPD-1mAb 1VL1”、“hPD-1mAb 7VL2”和“hPD-1mAb7VL3”。PD-1mAb 9的人源化产生两个人源化的VH结构域，本文命名为“hPD-1mAb 9VH1”和“hPD-1mAb 9VH2”，和两个人源化的VL结构域，本文命名为“hPD-1mAb 9VL1”和“hPD-1mAb1VL2”。在产生多个人源化的可变结构域的情况下，具体抗PD-1抗体(例如，PD-1mAb7)的人源化的重链和轻链可变结构域可以以任何组合使用，并且参考特定的VH/VL结构域命名人源化的链的具体组合，例如包括hPD-1mAb7VH1和hPD-1mAb 7VL2的人源化抗体具体称为“hPD-1mAb 7(1.2)”。产生全长人源化抗体，其具有包括L234A/L235A取代(IgG1(AA))的人IgG1恒定区或包括S228P取代(IgG4(P))的人IgG4恒定区。
如下构建全长IgG1人源化抗体重链：将人源化的VH结构域的C-末端与具有变异的CH2-CH3结构域(包括L234A/L235A(AA)取代)并且缺少C-末端赖氨酸残基的人IgG1恒定区的N-末端融合(SEQ ID NO:255)：
Figure BDA0003673007740001651
Figure BDA0003673007740001661
在SEQ ID NO:255中，氨基酸残基1-98对应IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO：10)，氨基酸残基99-113对应IgG1铰链区(SEQ ID NO：32)和氨基酸残基114-329对应包括L234A/L235A取代(加下划线的)但是缺少C-末端赖氨酸残基的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:5)。
具有包括L234A/L235A突变并且缺少C-末端赖氨酸残基的IgG1重链恒定区的示例性人源化抗体((hPD-1mAb 7(1.2))的重链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:265)：
Figure BDA0003673007740001662
在SEQ ID NO：265中，氨基酸残基1-119对应hPD-1mAb 7VH1的VH结构域(SEQ IDNO：147)，氨基酸残基120-217对应IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO：10)，残基218-232对应IgG1铰链区(SEQ ID NO：32)和残基233-448对应包括L234A/L235A取代(加下划线的)但是缺少C-末端赖氨酸残基的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:5)。
如下构建全长IgG4人源化抗体重链：将人源化的VH结构域的C-末端与具有稳定化的铰链区(包括S228P取代)并且缺少C-末端赖氨酸残基的人IgG4恒定区的N-末端融合(SEQID NO:256)：
Figure BDA0003673007740001671
在SEQ ID NO:256中，氨基酸残基1-98对应IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:254)，氨基酸残基99-110对应包括S228P取代(加下划线的)的稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：13)和氨基酸残基111-326对应IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)，但是缺少C-末端赖氨酸残基。
具有IgG4重链恒定区的示例性人源化抗体((hPD-1mAb 7(1.2))的重链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:266)，所述IgG4重链恒定区包括具有S228P突变的稳定化的铰链区并且缺少C-末端赖氨酸残基：
Figure BDA0003673007740001672
在SEQ ID NO:266中，氨基酸残基1-119对应hPD-1mAb 7VH1的VH结构域(SEQ IDNO:147)，氨基酸残基120-217对应IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:254)，氨基酸残基218-229对应包括S228P取代(加下划线的)的稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:13)和氨基酸残基230-445对应IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)，但是缺少C-末端赖氨酸残基。
如下构建全长人源化抗体轻链：将人源化的VL结构域的C-末端与人轻链κ区域(SEQ ID NO:8)的N-末端融合。相同轻链与IgG1(AA)和IgG4(P)重链配对。
具有κ恒定区的示例性人源化的PD-1抗体(hPD-1mAb 7(1.2))的轻链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:264)：
Figure BDA0003673007740001681
在SEQ ID NO:264中，氨基酸残基1-111对应hPD-1mAb 7VL2的VL结构域(SEQ IDNO:153)，和氨基酸残基112-218对应轻链κ恒定区(SEQ ID NO：8)。
通过并入不同的恒定区和/或通过引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，容易产生具有可选的恒定区，例如工程化的Fc区域，的抗PD-1抗体。例如，在期望双特异性抗体的情况下，包含杵的和包含臼的CH2-CH3结构域用于利于异源二聚化。如上述产生包括鼠科可变区和人恒定区的嵌合抗PD-1抗体。
如上所述测试人源化抗体(IgG1(AA)和/或IgG4(P))的结合和阻断活性。比较人源化抗体和相应的鼠科抗体与人PD-1(shPD-1His，和shPD-1hFc)和食蟹猴PD-1(shPD-L1hFc)的结合。另外，在ELISA试验中，人源化抗体保持阻断人PD-L1与人PD-1结合的能力。
使用Biacore分析研究鼠科抗体PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9、PD-1mAb 15、人源化抗体hPD-1mAb 2、hPD-1mAb 7(1.2)、hPD-1mAb 9(1.1)、hPD-1mAb 15、和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B的结合动力学。将抗PD-1抗体捕获在固定的蛋白质A上，并且用His标记的可溶性人PD-1(shPD-1-His)或被切割以去除Fc部分的可溶性人食蟹猴PD-1Fc融合物(scyno PD-1hFc)孵育，并且经Biacore分析测定结合的动力学。在另外的研究中，将抗PD-1抗体hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG4(P)、PD-1mAb A IgG1(AA)、PD-1mAb A IgG4(P)、PD-1mAb BIgG1(AA)和PD-1mAb B IgG4(P)捕获在固定的F(ab)2山羊抗人Fc上，并且如上述通过Biacore分析测定结合动力学。来自这些研究的计算的ka、kd和KD提供在表7中。
Figure BDA0003673007740001691
a组氨酸标记的可溶性人PD-1(shPD-1 His)
b可溶性食蟹猴PD-1(scyno PD-1 hFc)，切割的
结果表明，PD-1mAb 7和人源化的hPD-1mAb 7(1.2)相对于参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B展示更好的结合动力学。PD-1mAb 2和hPD-1mAb 2展示的结合动力学在参考抗PD-1抗体的约两倍之内，而PD-1mAb 9、hPD-1mAb 9(1.1)、PD-1mAb 15和hPD-1mAb15展示的结合动力学在参考抗PD-1抗体的约2-6倍之内。
研究抗人PD-1抗体PD-1mAb 7的组织特异性。使正常的组织与PD-1mAb 7或与同种型对照(0.313μg/mL)接触，并且使染色的程度可视化。Bloxall用于内源酶阻断，以减少结肠组织中的非特异性粘蛋白染色。如图10A，图i-xii中显示，PD-1mAb 7和同种型对照二者都不能标记正常结肠、肝、肺、胰腺、肾和心脏组织的细胞。另外，PD-1mAb 7和同种型对照不能使正常皮肤染色(图10B，图i-ii)。相反，发现PD-1mAb 7强烈标记正常扁桃体组织中存在的淋巴细胞和表达PD-1的PDCD1转染的NSO细胞(图10B，图iii和v)，而同种型对照不能标记任何一个(图10B，图iv和vi)。结果呈现在图10A-10B中，因此指示PD-1mAb 7能够特异性结合淋巴细胞和表达PD-1的细胞。
检查hPD-1mAb 2IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG4(P)、hPD-1mAb 15IgG1(AA)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B的结合饱和度特征(saturation profile)。简言之，将抗PD-1抗体，PD-1mAb 1-15，或参考抗PD-1抗体(PD-1mAb A和PD-1mAb B)中的每一种与表达人PD-1的NSO细胞(～250,000细胞/孔)在封闭缓冲液(FACS+10％人血清白蛋白)中混合。对于这些研究，以50、12.5、3.13、2.0x10-1、4.9x10-2、1.2x10-2、3.0x10-3、1.9x10-4、7.6x10-4、4.75x10-5或1.19x10-5μg/测试(四倍连续稀释)使用抗PD-1抗体。通过FACS分析使用山羊抗人-APC二抗测定结合至NSO细胞的表面的抗体的量。代表性饱和度曲线显示在图11中。测定EC50和EC90值，并且在表8中提供来自四个独立实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001701
Figure BDA0003673007740001711
结合饱和度研究表明，PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15的人源化形式对于与细胞表面PD-1结合具有有利的特征。尤其地，在所有检测的抗体中，人源化的PD-1mAb 7(具有IgG1(AA)或IgG4(P)Fc区域的hPD-1mAb 7(1.1)和hPD-1mAb 7(1.2))具有最低EC90值。
为了进一步表征人源化的抗PD-1抗体hPD-1mAb 2IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG4(P)和hPD-1mAb 15IgG1(AA)，检查它们阻断人PD-L1(shPD-L1)和人PD-L2(shPD-L2)与在NSO细胞的表面上表达的PD-1结合的能力。基本上如上述进行这些试验。抑制sPD-L1和sPD-L2与在NSO细胞上表达的PD-1结合的代表性曲线分别显示在图12A和12B。测定IC50和IC90值，并且在表9中提供来自三个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001712
Figure BDA0003673007740001721
配体结合抑制研究表明，PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15的人源化的形式能够抑制sPD-L1和sPD-L2与细胞表面上的PD-1结合。尤其地，在所有检测的抗体中，人源化的PD-1mAb 7(hPD-1mAb 7(1.1)和hPD-1mAb 7(1.2))具有最低IC90值。
实施例3
通过人源化抗人PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1检查点
在Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1荧光素酶报告试验中，检测hPD-1mAb 2IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG1，(AA)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG1(AA)、hPD-1mAb 9(1.1)IgG4(P)、hPD-1mAb 15IgG1(AA)和参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B对抗PD-1/PD-L1轴(axis)的能力(即，阻断PD-1/PD-L1相互作用和防止T-细胞应答的下调)。简言之，将表达PD-L1的CHO细胞(CHO/PD-L1)以40,000/孔涂铺在100μL培养基(RPMI+10％FBS+100μg/mL潮霉素B+100μg/mL G418)中并且孵育过夜。第二天，去除培养基，并且，以50,000细胞/孔将在40μL试验缓冲液(RPMI+2％FBS)中的MNFAT-luc2/PD-1Jurkat细胞(Promega)以及抗PD-1抗体PD-1mAb 1-15或参考抗PD-1抗体(PD-1mAb A和PD-1mAb B)(0-25μg/mL；在试验缓冲液中八次2.5倍连续稀释)添加至每个孔中，并且在37℃孵育6小时，随后在环境温度孵育5-10分钟。接着，将80μL的BioGlo底物(Promega)添加至每个孔中，并且将平板在环境温度孵育另外的5-10分钟，在Victor平板阅读器中测量发光。代表性饱和度曲线显示在图13中。测定EC50和EC90值，并且，在表10中提供来自四个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001731
报告信号传导研究表明，PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15的人源化形式可阻断PD-1/PD-L1轴并且防止T-细胞应答的下调。尤其地，人源化的PD-1mAb 7(具有IgG1(AA)或IgG4(P)Fc区域的hPD-1mAb 7(1.1)和hPD-1mAb 7(1.2))具有最低的EC50/EC90值。
实施例4
抗人PD-1抗体的功能活性
金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)是能够激活SEB-应答供体中大部分T-细胞(5-30％)的微生物超级抗原。SEB结合肽结合槽(peptide binding grove)外面的MHC II，因此是MHC II依赖性的，但是是不受限制的和TCR介导的。T细胞的SEB-刺激使得寡克隆T细胞增殖和细胞因子产生(尽管可观察到供体变化性，并且一些供体无应答)。在SEB-刺激48小时内，PMBC上调PD-1和LAG-3，在96-孔板中伴随SEB-刺激的二次培养后第5天，看到进一步增强。SEB-刺激PBMC之后，免疫检查点蛋白质PD-1和LAG-3的上调限制了再次刺激时的细胞因子释放。检测抗PD-1抗体单独和联合抗LAG-3抗体通过检查点抑制增强细胞因子释放的能力。
简言之，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度离心方法，根据制造商的指导，从在健康供体知情同意的情况下获得自健康供体的全血(BiologicalSpecialty Corporation)纯化PBMC，然后使用
Figure BDA0003673007740001741
Untouched Human T CellsKit(
Figure BDA0003673007740001742
Untouched人T细胞试剂盒)(Life Technologies)，根据制造商的指导，纯化T细胞。在T-25大烧瓶中的RPMI-培养基+10％热失活的FBS+1％青霉素/链霉素中单独培养纯化的PBMC，2-3天，或与SEB(Sigma-Aldrich)，0.1ng/mL(初次刺激)，一起培养2-3天。在第一轮的SEB-刺激结束时，用PBS洗涤PBMC两次，并且在96孔组织培养板中立即以1-5x105细胞/孔的浓度铺平板，其在单独的培养中、在具有对照或抗PD-1抗体的培养基中、在具有0.1ng/mL的SEB(二次刺激)和无抗体的培养基中，或在具有SEB和对照IgG或抗PD-1抗体+/-抗LAG-3mAb的培养基中，并且培养另外的2-3天。在二次刺激结束时，收获上清液，以使用针对IFNγ、TNFα、IL-10和IL-4的人DuoSet ELIS Kits(R&D Systems)，根据制造商的指导，测量细胞因子分泌。
检测PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15单独或联合独特的抗LAG-3抗体LAG-3mAb1通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能力。这些研究也包括一个或多个下述参考抗PD-1抗体：PD-1mAb A、PD-1mAb B和LAG-3mAb A，单独的或组合的。图14显示了来自通过：无抗体；同种型对照抗体；PD-1mAb 7和/或LAG-3mAb 7；PD-1mAb 9和/或LAG-3mAb 1；PD-1mAb 15和/或LAG-3mAb 1；PD-1mAb 2和/或LAG-3mAb 1；或参考抗PD-1抗体PD-1mAb B和/或LAG-3mAb A(以10μg/mL使用抗体)处理的代表性应答供体(D:38941)的SEB-刺激的(0.1ng/mL)PBMC的IFNγ分泌特征。
在另外的研究中，检测了人源化形式的PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15(包括人IgG1(AA)或人IgG4(P)Fc区域)以及参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAbB通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能力。对于这些研究，以0.625、2.5和10μg/mL使用抗体。图15A-15B显示了来自不用抗体处理或通过以下抗体之一处理的代表性应答供体(D:57709)的SEB-刺激的(0.2ng/mL)PBMC的IFNγ(图15A)和TNFα(图15B)分泌特征：同种型对照；hPD-1mAb 2IgG1(AA)；hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)；hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)；hPD-1mAb9(1.1)IgG1(AA)；hPD-1mAb 9(1.1)IgG4(P)；hPD-1mAb 15IgG1(AA)；或参考抗PD-1抗体PD-1mAb A IgG1(AA)、PD-1mAb A IgG4(P)、PD-1mAb B IgG1(AA)、PD-1mAb B IgG4(P)。对于通过抗PD-1抗体以0.625、2.5和10μg/mL处理的样品，测定用SEB+Ab处理的样品中总的pg/mg的IFNγ，并且将来自3个不同应答供体(除非在指出的情况下)的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)提供在表11中。用人源化形式的PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15(包括人IgG1(AA)或人IgG4(P)Fc区域)与参考抗PD-1抗体PD-1mAb A和PD-1mAb B(即，人源化抗PD-1/PD-1mAb A，和人源化抗PD-1/PD-1mAb B)处理的样品中IFNγ分泌的比例分别提供在表12和
表13中。
Figure BDA0003673007740001751
Figure BDA0003673007740001752
来自两个应答供体的结果
Figure BDA0003673007740001753
Figure BDA0003673007740001761
Figure BDA0003673007740001762
来自两个应答供体的结果
Figure BDA0003673007740001763
Figure BDA0003673007740001764
来自两个应答供体的结果
这些研究的结果表明，当再次刺激时，PD-1抗体PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9和PD-1mAb 15显著增强来自SEB-刺激的PBMC的IFNγ(图14和15A，和表11-13)和TNFα(图15B)产生。另外，当再次刺激时，抗PD-1抗体与抗LAG-3抗体的联合导致来自SEB-刺激的PBMC的细胞因子释放的进一步增强(图14)。尤其地，PD-1mAb 2、PD-1mAb 7、PD-1mAb 9或PD-1mAb 15与独特的抗LAG-3抗体LAG-3mAb 1的组合提供了最大的增强。
实施例5
PD-1x LAG-3双特异性分子结合研究
产生许多PD-1x LAG-3双特异性分子，包括具有三、四和五条链的、包含Fc区域的双抗体以及双特异性抗体。产生具有四条链并且包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的四种双抗体，并且命名为“DART A”、“DART B”、“DART C”和“DART I”。产生具有四条链并且包括CH1/CL结构域的四种双抗体，并且命名为“DART D”、“DART E”、“DART J”和“DART 1”。产生具有五条链并且包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域和CH1/CL结构域的两种双抗体，并且命名为“DART F”和“DART G”。产生具有三条链并且包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的一种双抗体，并且命名为“DART H”。产生具有四条链的一种双特异性抗体，并且命名为“BSAB A”。上面提供了这些PD-1x LAG-3双特异性分子的结构和氨基酸序列并且总结在下面表14中。
Figure BDA0003673007740001771
Figure BDA0003673007740001781
Figure BDA0003673007740001782
并入IgG4Fc区域的分子，也并入稳定化的IgG4铰链区。
通过并入不同VH和VL结构域，可容易产生包括可选的PD-1和/或LAG-3表位结合位点的另外的PD-1x LAG-3双特异性分子。类似地，可通过并入具有期望的特异性的VH和VL产生结合不是LAG-3的抗原的分子。
基本上如上所述检测PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体：DART A、DART B、DARTD、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I和DART 1；抗PD-1抗体：hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)、PD-1mAb A IgG1(AA)和PD-1mAb AIgG4(P)；和抗LAG-3抗体：hLAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)、LAG-3mAb AIgG4(P)、hLAG-3mAb 1(1.4)IgG1(AA)和LAG-3mAb AIgG1(AA)的结合饱和度特征。测试PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体的PD-1和LAG-3结合，同时，仅仅测试抗PD-1和抗LAG-3抗体与它们各自抗原的结合。对于这些研究，使用表达PD-1或LAG-3的NSO细胞。使用双抗体和抗体(170.0-0.013μM或85.0-0.0021μM(四倍连续稀释)。测定EC50和EC90值并且提供在表15-16中。提供了进行2个或更多个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001783
Figure BDA0003673007740001791
§来自单个实验的结果
Figure BDA0003673007740001792
§来自单个实验的结果
结合饱和度研究表明，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体保持与PD-1的结合，并且，其结合特征与亲本抗PD-1抗体的结合特征类似。类似地，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体保持与LAG-3的结合，并且，除了DART 1以外，其结合特征与亲本抗LAG-3抗体的结合特征类似。
实施例6
PD-1x LAG-3双特异性分子抑制研究
基本上如上所述检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART B、DART D、DARTE、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗PD-1抗体：hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)、PD-1mAb A IgG1(AA)和PD-1mAb A IgG4(P)阻断人PD-L1(shPD-L1)和人PD-L2(shPD-L2)结合在NSO细胞的表面上表达的PD-1的能力。以33.75-0.002μM或107.5-0.0001μM(四倍连续稀释)使用双抗体和抗体。
测定IC50和IC90值并且呈现在表17中。提供了进行2个或更多个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001801
配体结合抑制研究表明，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体保留抑制sPD-L1和sPD-L2结合细胞表面上PD-1的能力。
另外，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗LAG-3抗体：hLAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)，LAG-3mAb AIgG4(P)，hLAG-3mAb 1(1.4)IgG1(AA)和LAG-3mAb AIgG1(AA)阻断人LAG-3结合Daudi细胞的表面上的天然II型MHC的能力。简言之，混合每种PD-1x LAG-3双特异性分子和对照抗LAG-3抗体与生物素化的-可溶性人LAG-3-Fc融合蛋白(shLAG-3)(以0.5μg/ml)，并且分别与MHC II阳性Daudi细胞(2.5x106细胞)孵育。使用缀合PE的链霉抗生物素二抗通过FACS分析测定与Daudi细胞的表面结合LAG-3的量。以27.5-0.026μM(两倍连续稀释)或107.5-0.0001μM(四倍连续稀释)，或35-0.002μM(四倍连续稀释)使用双抗体和抗体。
测定IC50和IC90值并且提供在表18中。提供进行了2个或更多个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001811
配体结合抑制研究表明，PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体保留抑制shLAG-3-Fc融合蛋白结合细胞表面上II型MHC的能力。除了DART 1之外，PD-1x LAG-3双特异性分子具有与亲本抗LAG-3抗体类似的抑制特征。
实施例7
通过PD-1x LAG-3双特异性分子阻断PD-1/PD-L1检查点
基本上如上所述，在Jurkat-luc2-NFAT/CHO-PD-L1荧光素酶报告试验(使用CHO/PD-L1细胞和MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat细胞)中检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART B、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H、DART I、DART 1和BSAB A；和抗PD-1抗体：hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)，hPD-1mAb 7(1.2)IgG1(AA)，PD-1mAb A IgG1(AA)和PD-1mAb AIgG4(P)对抗PD-1/PD-L1轴(即，阻断PD-1/PD-L1相互作用和防止T-细胞应答的下调)的能力。以100-0.0065μM(四倍连续稀释)或100-0.0013μM(五倍连续稀释)使用双抗体和抗体。
测定IC50和IC90值并且提供在表19中。提供进行了2个或更多个单独实验的样品平均值(SM)和标准差(SDσ)。
Figure BDA0003673007740001821
报告信号传导研究表明，大部分PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体保留抑制sPD-L1结合细胞表面上PD-1的能力。在该试验中，四价PD-1x LAG-3双特异性双抗体构建体，DART A、DART B、DART D、DART-E、DART F、DART G和DART I是最强的抑制剂。在PD-L2报告试验中检测的这些双特异性构建体中的若干构建体获得了类似的结果。
实施例8
PD-1x LAG-3双特异性分子的功能活性
除非在说明的情况下，否则基本上如上所述，在再刺激时，在SEB-刺激的PBMC中检测PD-1x LAG-3双特异性分子通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能。
在初始研究中，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART D、DART E、DART F、DART G、DART H；和抗PD-1和抗LAG抗体：PD-1mAb A IgG4(P)和LAG-3mAb A IgG4(P)，单独地或组合地，通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能力。在这些试验中，以3.125、12.5或50nM的总浓度使用PD-1x LAG-3双特异性分子和抗体，并且用0.2ng/mL的SEB刺激PBMC(之前的研究使用0.1ng/mL)。对于这些研究，在使用抗体的组合的情况下，每种抗体以总浓度的一半(即，1.563、6.25或25nM)被提供。图16A和16B分别显示来自两个代表性应答供体D：35644和D：59697的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特征。
如所述的，并不是所有的供体对0.1或0.2ng/mL的SEB应答。为了增强来自更多数量供体的PBMC的SEB刺激，在另外的研究中，以85ng/mL的高浓度，或0.5ng/mL的中等浓度使用SEB。在这些浓度，SEB刺激在更多的供体中更强，尽管仍可看到供体-供体之间的差异。
在一个这样的研究中，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART B；抗PD-1抗体：hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)；抗LAG-3抗体：LAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)；以及PD-1mAb AIgG4(P)和LAG-3mAb A IgG4(P)的组合通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能力。在这些试验中，以0.019、0.078、0.3125、1.25、5或20nM的浓度使用PD-1x LAG-3双特异性分子和抗体，并且用85ng/mL的SEB刺激PBMC。对于使用抗体组合的该试验，以指示的浓度提供每种抗体，因此总的抗体浓度是每种抗体使用的浓度的两倍(即，0.038、0.156、0.625、2.5、10或40nM)。图17A和17B分别显示了来自两个代表性供体D:55515和D:54024的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特征。
在另一研究中，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART A、DART B、DART C；抗PD-1抗体：hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)；抗LAG-3抗体：LAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)；和PD-1mAb AIgG4(P)和LAG-3mAb A IgG4(P)的组合通过检查点抑制而增强细胞因子释放的能力。在这些试验中，使用的PD-1x LAG-3双特异性分子和抗体的总浓度是0.048、0.195、0.78、3.125、12.5或50nM，并且用0.5ng/mL的SEB刺激PBMC。对于其中使用抗体组合的这些研究，以总浓度的一半提供每种抗体(即，0.024、0.098、0.39、1.563、6.25或25nM)。图18A和18B分别显示了来自两个代表性供体D:20990和D:54947的SEB-刺激PBMC的IFNγ分泌特征)。
在进一步的研究中，检测细胞因子IL-2的释放。具体而言，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART D、DART H；抗PD-1抗体：PD-1mAb A IgG4(P)，hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)；抗LAG-3抗体：LAG-3mAb A IgG4(P)和LAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)；和PD-1mAb A IgG4(P)和LAG-3mAb A IgG4(P)，以及hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)和LAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)的组合，通过检查点抑制而增强IL-2释放。在这些试验中，使用的PD-1x LAG-3双特异性分子和抗体的总浓度是3.125、12.5或50nM，并且用85ng/mL的高浓度的SEB刺激PBMC。对于其中使用抗体组合的这些研究，以总浓度的一半提供每种抗体(即，1.563、6.25或25nM)。图19显示了来自代表性供体(D:54024)的SEB-刺激的PBMC的IL-2分泌特征。
在另外的研究中，检测PD-1x LAG-3双特异性分子：DART B和DART I；抗PD-1抗体：PD-1mAb A IgG4(P)和hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)；抗LAG-3抗体：LAG-3mAb A IgG4(P)、hLAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)和hLAG-3mAb 6(1.1)IgG4(P)；以及PD-1mAb A IgG4(P)和LAG-3mAb A IgG4(P)、hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)和hLAG-3mAb 1(1.4)IgG4(P)、和hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)和hLAG-3mAb 6(1.1)IgG4(P)的组合，通过检查点抑制而增强细胞因子释放。在这些试验中，使用的PD-1x LAG-3双特异性分子和抗体的浓度是0.0061、0.024、0.09、0.39、1.56、6.25或25nM，并且用0.5ng/mL的SEB刺激PBMC。对于其中使用抗体组合的这些研究，以指示的浓度提供每种抗体，因此总抗体浓度是每种抗体使用的浓度的两倍(即，0.0122、0.048、0.18、0.78、3.12、12.5或50nM)。图20显示了来自代表性供体D:56041)的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特征。
使用破伤风毒素回忆试验(Tetanus--toxoid recall assay)检测PD-1x LAG-3双特异性分子DART I；抗PD-1抗体PD-1mAb A IgG4和抗LAG-3抗体LAG-3mAb A IgG4(P)的组合；和阴性对照抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力。尤其地，在共培养试验系统中，使用破伤风毒素作为回忆抗原测量细胞因子的抗原特异性增强分泌的应答。简言之，使用阴性选择分离试剂盒(Miltenyi Biotec,San Diego,CA和Invitrogen,Carlsbad,CA)从人外周血液分离CD4记忆T细胞(0.5-1.0X105细胞/孔)，并且用来自相同供体的照射的单核细胞(0.01-0.05X105细胞/孔，3500拉德(rads))在存在或没有5μg/mL回忆抗原破伤风毒素(TTd)和DART I、PD-1mAb AIgG4+LAG-3mAb AIgG4(P)或同种型对照的稀释(始于25nM)的情况下培养5-7天。在平行板中，在第5-7天，通过并入氚标记的胸苷测量增殖，并且使用ELISA(R&D systms,Minneapolis,MN)测量IL-2和IFNγ。图21A-D显示了来自两个代表性供体(D50702和D54267)在第7天的IFNγ(图21A，21C)和IL-2(图21B，21D)分泌特征。
这些研究的结果表明，当再刺激时，PD-1x LAG-3双特异性分子显著增强来自SEB-刺激的PBMC的IFNγ(图16A-16B、17A-17B、18A-18B、20)和IL-2(图19)产生。另外，PD-1xLAG-3双特异性分子显著增强了来自用破伤风毒素刺激的CD4记忆T细胞的IFNγ产生(图21A和21C)。尤其地，四价PD-1x LAG-3双特异性分子提供了比抗PD-1抗体与抗LAG-3抗体组合更大的增强。
实施例9
PD-1x LAG-3双特异性分子的药物动力学
在食蟹猴中检测代表性PD-1x LAG-3双特异性分子DART I和代表性抗PD-1抗体PD-1mAb A的药物动力学。简言之，两个食蟹猴(一个雄性和一个雌性)被输注单剂量的DARTI(5mg/kg)或PD-1mAb A(10mg/kg)，并且使用夹心ELISA试验监测分子随着时间推移的血清浓度。简言之，使maxisorb 96孔试验板包被可溶性人PD-1(shPD-1)，用牛血清白蛋白阻断、洗涤并且用校准标准品、质量控制标准品和稀释的血清样品孵育。通过顺序添加山羊抗人IgG Fc-生物素二抗和链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)，评估捕获的DART I和PD-1mAb A的量。使用TMB底物检测HRP活性。通过酶标仪(SpectraMax M2e,Molecular Device,Sunnyvale,CA)分析所有的样品，并且使用SoftMax Pro软件(5.4版本,Molecular Device)将通过标准校准器产生的OD信号用于四-参数逻辑模型中。通过描述标准曲线的方程式，从样品的OD信号数据的内推(interpolation)确定PD-1mAb A或DART I的浓度。以9.775ng/mL评估对于该试验的定量(LLOQ)的下限以。
图22显示随着时间推移的血清浓度，线表示被输注DART I(实线，三角形)或PD-1mAb A(虚线，圆圈)的雄性(填充符号)和雌性(开放符号)猴子的平均数。这些数据表明，PD-1x LAG-3双特异性分子在食蟹猴中的药物动力学与抗PD-1抗体的药物动力学相当。
实施例10
PD-1抗体和PD-1x LAG-3双特异性分子的毒理学研究
在食蟹猴中，在非GLP(实验室管理规范(good laboratory practice))给药研究中，评估代表性抗PD1抗体hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)和代表性PD1x LAG3双特异性分子DARTI的安全性特征。
在该研究中，评估当通过多次静脉内输注而施用时，抗PD-1抗体(hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P))的潜在毒性和毒性动力学。另外，也评估当通过单次静脉内输注时，PD-1xLAG-3DART分子(DART I)的潜在的毒性和药物动力学。研究方案提供在表20中。
Figure BDA0003673007740001861
Figure BDA0003673007740001871
在该研究中评估下述参数和端点：临床表现、体重、食物消耗、体温、临床病理学参数(血液学、凝聚和临床化学)、生物分析和毒代动力学参数、抗药物抗体分析、流式细胞术、细胞因子、肉眼尸检发现、器官重量和组织病理学检查。
所有的动物均存活，直到在第18或22天安排的安乐死，或在第29天从研究释放。对于hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)，在临床表现、食物消耗、体重、体温、血液学、凝聚或临床化学参数或肉眼尸检发现方面没有测试物相关(test-article related)的变化。在第18和22天，脾重量的增加和红髓从轻度至中度的剂量依赖性淋巴组织细胞渗透物(lymphohistiocytic infiltrate)在接收1或100mg/kg的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的动物中是明显的。与周围淋巴细胞相比，淋巴组织细胞具有灰白色细胞质和不规则细胞核。稀有的有丝分裂图是明显的。对于增加的脾重量，渗透物是显微相关物。
被给予hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的动物的血清浓度-时间特征显示在该物种中针对抗体的预期的特征(profile)，有很少的例外。对于1mg/kg剂量组的两个动物和100mg/kg剂量组的两个动物，第三剂量之后曲线的斜率比第一剂量之后更急剧地下降，表明在稍后的循环中可能出现抗药物抗体(ADA)。分析显示，在1mg/kg组中2/4的动物发展了ADA和在100mg/kg组中1/4的动物发展了ADA。
总之，以1和100mg/kg的水平，通过静脉内输注，每周一次，持续3周(第1、8和15天)，hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的施用在食蟹猴中是良好耐受的。在1和100mg/kg hPD-1mAb7(1.2)IgG4(P)中存在脾红髓的轻度至中度剂量依赖性淋巴组织细胞渗透物。
对于DART I，在临床表现、食物消耗、体重、体温、血液学或凝聚参数方面没有测试物相关的变化。在临床化学参数方面的DART I相关的变化包括在第2天，天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的非损害、瞬时升高。平均AST变化是媒介处理的对照动物的3.2x和预研究(prestudy)水平的7.8x，其中水平高于对照参考范围2。平均LDH变化是媒介处理的对照动物的2.5x和预研究水平的6.9x。在第8天，两个参数都回到基线水平附近。总之，在5mg/kg的水平，通过静脉内输注，DART-I的单施用在食蟹猴中良好耐受。
实施例11
用抗PD-1抗体的单剂量PK研究
用选择的毒理学端点在食蟹猴中进行单剂量PK研究。在该研究中，比较hPD-1mAb7(1.2)IgG4(P)与两个其他抗PD1 IgG4(P),κmAbs：PD-1mAb A IgG4(P)和PD-1mAb B IgG4(P)。将每种抗体以10mg/kg通过1-小时静脉内输注施用至2只猴子(1M，1F)中，并且监测动物65天。
没有与施用hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)或PD-1mAb A IgG4(P)相关的体重、食物消耗、细胞因子或免疫表型方面的测试物相关的临床表现变化。数据与PD-1mAb B IgG4(P)的类似，除了在PD-1mAb B IgG4(P)施用之后观察到IL-5的升高之外。
对于从用hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)、PD-1mAb A IgG4(P)或PD-1mAb B IgG4(P)处理的食蟹猴收集的全时间段(full time course)的血液样品在没有(PBS对照)或存在过量竞争剂(未标记的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P))的情况下，通过流式细胞术使用竞争方法测定抗PD-1抗体与T细胞表面上的PD-1的结合，其中结合T细胞的荧光标记的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的平均荧光强度(MFI)。如图23A-23C中显示，与PD-1mAb A IgG4(P)(PD-1结合保持在≥80％，达21天或更少)(图23B)相比，hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)和PD-1mAb B IgG4(P)表现出与CD4+和CD8+T细胞表面上的PD-1的延长的结合(PD-1结合保持在≥80％，达28天或更多)(分别为图23A和23C)。对于每种抗PD-1抗体，将T-细胞PD-1结合数据与它们的血清浓度相关联。
实施例12
重复剂量毒理学研究
为了评估本发明治疗分子的安全性、毒代动力学和药效特征，将示例性分子(hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P))施用至食蟹猴并且进行GLP(实验室管理规范)给药研究。在该研究中，通过以3剂量水平输注，用hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)或对照物处理四组动物(每组10只，5只雄性，和5只雌性)，每周一次。在4-周药物给药期间，随后在另外的10-周无药物期间进行监测，评估动物的任何潜在毒性。该研究的实验方案提供在表21中。在研究的第1、8、15和22天，使用校准输注泵经一小时静脉内输注向动物给药，每周一次。在第25天，处死来自每个组的一只雄性和一只雌性，在研究的第95天处死剩余的动物。评估hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)施用对循环中白细胞亚群的作用，包括T-淋巴细胞上PD-1受体的占据。另外，测定抗药物抗体(ADA)特征。
Figure BDA0003673007740001891
a经静脉内输注每周施用一次对照和hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)
b每组六只猴子(3M/3F)在第25天被尸体剖检，而剩余的恢复组猴子(2M/2F)在第95天被尸体剖检
以0、10、40和150mg/kg每周一次向食蟹猴静脉内(IV)输注hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)是良好耐受的，并且所有的动物均存活，直到它们被安排在第25或95天的安乐死。在临床表现、食物消耗、体重、身体检查、眼科和神经科学检查，心电学、体温、呼吸速度、血压和心率、凝聚、临床化学和尿分析参数、器官重量或肉眼尸检发现方面，没有hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)相关的变化。
血液学参数的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)相关的变化包括淋巴细胞滴度(lymphocyte titer)的瞬时下降。在≥10mg/kg的雄性和雌性中，在第2天(输注后23小时)，与预研究(给药前(predose)1天)相比，淋巴细胞滴度适度降低，对于10和40mg/kg的雄性和40和150mg/kg的雌性与对照相比是统计学上显著的。在给药前第8天，淋巴细胞滴度返回到接近预研究水平，但是在第9天(输注后23小时)，对于在所有剂量水平(0.47x至0.68x预研究)的一些个体雄性和雌性，其轻微降低。在第15和22天给药之前，淋巴细胞滴度增加，但是在第16和23天(输注后23小时)，对于一些个体雄性和雌性(0.36x至0.54x预研究)，其降低。
与对照组相比，在hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)处理的动物中，在输注结束后23小时，观察到循环免疫细胞群体，包括总的白细胞、T细胞、B细胞和NK细胞，的非剂量依赖性、瞬时下降。在第1天第一剂量施用之后观察到改变的最大量级；在第8、15或22天的随后剂量之后瞬间观察到较小量级的改变。在EOI后72小时和整个恢复阶段，免疫细胞群体一般恢复至基线值或接近基线值。与对照组相比，在hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)处理的动物中，没有观察到循环单核细胞的变化。
在所有测试剂量(10、40或150mg/kg)的研究的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)处理期间，观察到与PD-1+/CD4+和PD-1+/CD8+细胞的最大hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)结合。在恢复过程中，未发展抗药物抗体(ADA)应答的动物中，血清hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)浓度保持高于29μg/mL，并且在整个10-周恢复期间，保持与PD-1+/CD4+和PD-1+/CD8+T细胞的最大hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)结合。在这些动物中，没有PD-1对T细胞进行调节的证据。在发展了ADA应答的恢复动物中，MGD012结合的PD-1+T细胞的频率下降至基线水平。当表观(apparent)血清hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)浓度下降低于约25μg/mL时，通常出现ADA阳性动物的PD-1+/CD4+和PD-1+/CD8+细胞上的最大hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)结合的下降。但是，不清楚该表观阈值关系是否适用于ADA阴性动物，因为在ADA阳性动物中ADA的存在可有助于阻断PD-1抗体与PD-1的结合。
在hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的药物代谢动力学应答中存在最小的性别相关的差异，其在评估的剂量范围内是线性的(10至150mg/kg)。对于10、40和150mg/kg的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)，性别组合的平均Cmax分别是240μg/mL(0.240mg/mL)、1078μg/mL(1.08mg/mL)和3938μg/mL(3.94mg/mL)，并且AUC是47310h·μg/mL(47.3h·mg/mL)、205723h·μg/mL(206h·mg/mL)和745681h·μg/mL(746h·mg/mL)。在出现ADA之前，通过第一循环的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的非房室模型分析(NCA)的平均清除(mean clearance)是0.21mL/h/kg，大大低于如针对大分子量蛋白质可预期的食蟹猴的肾小球滤过率。通过第一循环的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的NCA的分布的平均稳态体积是68mL/kg，接近血清体积的1.5倍，但是小于细胞外水空间。这提示，hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)从血管腔隙溢出进入组织细胞外空间，但是，并不是所有的细胞外空间对于该分子都是可到达的。通过第一循环的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的NCA的平均停留时间(MRT)的平均值是335小时或约14天。在第2至4循环中，ADA的出现降低了hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的浓度。在10、40和150mg/kg剂量组中，在重复剂量的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)之后，分别在7/10、4/10和3/10动物中观察到降低的hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)血清浓度的证据。在10、40和150mg/kg剂量组中，分别在这些动物的4个、2个和1个中确认了抗hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)的ADA的存在；其中ADA未被确认的的所有动物处于最终的尸体剖检组中，在此期间，hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)血清浓度可能干扰检测ADA的能力。因此，在随后的TK分析中，当波谷浓度小于之前的波谷浓度时，核实自该时间以来的数据。根据3个剂量组的所有循环的数据的二室模型，排除受ADA影响的点，二室模型的主要TK参数的平均值对于清除是0.22mL/h/kg，对于分布的初始体积(V1)是38.5mL/kg，和对于V2是33.8mL/kg，其产生的分布的平均稳态体积(Vss)是72.3mL/kg，和MRT是329小时。这些值与从第一剂量的NCA获得的参数一致。在没有ADA的情况下，模拟预测，在每周给药的情况下，第5次给药之后将在食蟹猴中实现稳态，并且积累指数将是2.4。
在第25天，在≥40mg/kg的雄性和≥10mg/kg的雌性中，在IV注射位点的浅层真皮中出现hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)相关的最小多灶血管周围单核细胞渗透物，其是对重复注射外源蛋白(单克隆抗体)的预期的反应。在第95天，没有注意到hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)相关的显微镜变化，指示在第25天出现的测试物相关的变化的恢复。
总之，该研究的结果指示，在食蟹猴中以10、40或150mg/kg的水平每周一次(第1、8、15和22天)经静脉内输注施用hPD-1mAb 7(1.2)IgG4(P)在临床上是良好耐受的。观察到的作用限于循环淋巴细胞的瞬时下降和与注射外源蛋白相关的最小的注射位点变化。基于这些结果，认为没有观察到的不利作用水平(NOAEL)是150mg/kg(性别组合的平均Cmax是3.94mg/mL和AUC是746h·mg/mL)。
本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，达到如同具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的相同程度。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步修改，并且本申请旨在覆盖大体上根据本发明原理并且包括与本公开的偏离的本发明的任何变型、用途或改变，只要在本发明所属领域的已知或习惯实践内并且如可应用至本文之前所阐释的本质特征。
序列表
<110> 宏观基因有限公司
Shah, Kalpana
Smith, Douglas
La Motte-Mohs, Ross
Johnson, Leslie
Moore, Paul
Bonvini, Ezio
Koenig, Scott
<120> PD-1结合分子和其使用方法
<130> 1301.0122PCT
<150> US 62/198,867
<151> 2015-07-30
<150> US 62/239,559
<151> 2015-10-09
<150> US 62/255,140
<151> 2015-11-13
<150> US 62/322,974
<151> 2016-04-15
<160> 298
<170> PatentIn 3.5版本
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<221> MISC_特征
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<220>
<221> MISC_特征
<222> (216)..(216)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
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20 25 30
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<213> 智人
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<220>
<221> MISC_特征
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<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
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<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
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<221> MISC_特征
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<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
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Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
<400> 6
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1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> "含有臼的" 人IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
<400> 7
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
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<220>
<221> MISC_特征
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
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Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
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Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
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Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 10
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG1 CH1结构域
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> 人IgG2铰链区
<400> 11
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> 人IgG4铰链区
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 稳定化的IgG4铰链区
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体1
<400> 14
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的连接体 2
<400> 15
Gly Gly Cys Gly Gly Gly
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 16
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 17
Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 18
Ala Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 19
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
<400> 20
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 21
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进(E-螺旋)结构域
<400> 21
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 22
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进"K-螺旋"结构域
<400> 22
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的异源二聚体促进"E-螺旋"结构域
<400> 23
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的异源二聚体促进"K-螺旋"结构域
<400> 24
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 25
<211> 46
<212> PRT
<213> 停乳链球菌
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(46)
<223> 链球菌菌株的蛋白质G的白蛋白结合结构域3
G148
<400> 25
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 26
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变异的去免疫化的白蛋白结合结构域
<400> 26
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 27
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变异的去免疫化的白蛋白结合结构域
<400> 27
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 28
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变异的去免疫化的白蛋白结合结构域
<400> 28
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的连接体2
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的连接体2
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 31
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 32
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的连接体2
<400> 33
Leu Glu Pro Lys Ser Ser
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的连接体2
<400> 34
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 35
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 36
Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 37
Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 38
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(525)
<223> 人LAG-3 (信号序列和成熟的蛋白质)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(28)
<223> 信号序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (29)..(525)
<223> 成熟的蛋白质
<400> 38
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(120)
<223> LAG-3 mAb A的重链可变结构域
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> LAG-3 mAb A的轻链可变结构域
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> LAG-3 mAb 1的重链可变结构域
<400> 41
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ile Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(6)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRH1
<400> 42
Arg Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRH2
<400> 43
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRH3
<400> 44
Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> LAG-3 mAb 1的VL结构域
<400> 45
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRL1
<400> 46
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRL2
<400> 47
Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> LAG-3 mAb 1的CDRL3
<400> 48
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VH1的VH结构域
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VH2的VH结构域
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VL1的VH结构域
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VL2的VL结构域
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VL3的VL结构域
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VL4的VL结构域
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 1 VL4的VL结构域的CDRL1
<400> 55
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 56
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(118)
<223> LAG-3 mAb 6的VH结构域
<400> 56
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRH1
<400> 57
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRH2
<400> 58
Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRH3
<400> 59
Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> LAG-3 mAb 6的VL结构域
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRL1
<400> 61
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val Val Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRL2
<400> 62
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 6的CDRL3
<400> 63
His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 64
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(113)
<223> PD-1 mAb A的重链可变结构域
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb A的轻链可变结构域
<400> 65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(120)
<223> PD-1 mAb B的重链可变结构域
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb B的轻链可变结构域
<400> 67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(288)
<223> 人PD-1多肽(NCI序列NP 005009.2)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(20)
<223> 人PD-1信号序列
<400> 68
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 69
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(121)
<223> PD-1 mAb 1的VH结构域
<400> 69
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Arg Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 373
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(373)
<223> 编码PD-1 mAb 1的VH结构域的多核苷酸
<400> 70
cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc 60
tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaactg 120
gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag 180
cactagctac aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa 240
ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc 300
aagagattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt 360
caccgtctcc tcc 373
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(6)
<400> 71
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 1的CDRH2
<400> 72
His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> PD-1 mAb 1的CDRH3
<400> 73
Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(106)
<223> PD-1 mAb 1的VL结构域
<400> 74
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Gln Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(318)
<223> 编码PD-1 mAb 1的VL结构域的多核苷酸
<400> 75
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacgtttact ggtaccagca gaagcctgga 120
tcctcccccc aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtgataacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(10)
<223> PD-1 mAb 1的CDRL1
<400> 76
Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 1的CDRL2
<400> 77
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 1的CDRL3
<400> 78
Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 79
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 1 VH1的VH结构域
<400> 79
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 1 VH1的多核苷酸
<400> 80
gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg 60
acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaattg gattaggcag 120
cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat 180
aatcccagtc tgaagagccg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt 240
ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcgagattat 300
ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc 360
tcc 363
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 1 VL1的VL结构域
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 1 VL1的多核苷酸
<400> 82
gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga aaaggtcacc 60
attacttgct ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtact ggtatcagca gaagcccggt 120
caggctcccc agccattgat atatctgacc agcaacctgg cttctggtat cccagctcgt 180
ttttccggta gcgggtccgg gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa 240
gacgccgcca cctattattg tcaacagtgg tcagacaatc catacacttt tggcggtggc 300
accaaagtcg aaataaag 318
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(116)
<223> PD-1 mAb 2的VH结构域
<400> 83
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 348
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(348)
<223> 编码PD-1 mAb 2的VH结构域的多核苷酸
<400> 84
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat 180
gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgagt 300
gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc 348
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 2的CDRH1
<400> 85
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 2的CDRH2
<400> 86
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 2的CDRH3
<400> 87
Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> PD-1 mAb 2的VL结构域
<400> 88
Asp Val Val Met Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(336)
<223> 编码PD-1 mAb 2的VL结构域的多核苷酸
<400> 89
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt 180
tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tttttctgct ctcaaactac acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 2的CDRL1
<400> 90
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 2的CDRL2
<400> 91
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 2的CDRL3
<400> 92
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 93
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 2 VH1的VH结构域
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 2 VH1的多核苷酸
<400> 94
gaagtgcaat tggttgagag tggtggtggc ctggtgcagc caggtggaag tctgcggttg 60
tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga tgcattgggt gcgccaggct 120
cccggcaagg gtctcgagtg ggtagcatac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat 180
gccgacacag tgaaaggcag gtttactatc tcccgtgaca atgcaaaaaa cacactgtac 240
ctgcaaatga atagcctgcg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttccctgtct 300
gattacttcg actactgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc 348
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 2 VL1的VL结构域
<400> 95
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 96
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 2 VL1的多核苷酸
<400> 96
gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt 60
atttcttgtc ggagttcaca gagtctggta cattccacag gaaatacata tctccattgg 120
tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag ctgctgattt atagagtgtc taatcgattt 180
tctggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac actgaaaatc 240
tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgta gtcagaccac ccatgtaccc 300
tggacttttg gccaaggtac taagctggaa atcaag 336
<210> 97
<211> 125
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(125)
<223> PD-1 mAb 3的VH结构域
<400> 97
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe
85 90 95
Thr Arg Glu Lys Ile Thr Thr Ile Val Glu Gly Thr Tyr Trp Tyr Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 98
<211> 375
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(375)
<223> 编码 PD-1 mAb 3的VH结构域的多核苷酸
<400> 98
caggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60
tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgtgcatg gcctggaatg gattggaact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aagagagaag 300
attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tctggggcac agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 3的CDRH1
<400> 99
Asp Tyr Val Met His
1 5
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 3的CDRH2
<400> 100
Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 3的CDRH3
<400> 101
Glu Lys Ile Thr Thr Ile Val Glu Gly Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 102
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> PD-1 mAb 3的VL结构域
<400> 102
Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 103
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(336)
<223> 编码PD-1 mAb 3的VL结构域的多核苷酸
<400> 103
gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg gagacaccta tttggaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatcttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 3的CDRL1
<400> 104
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 3的CDRL2
<400> 105
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 3的CDRL3
<400> 106
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 107
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(116)
<223> PD-1 mAb 4的VH结构域
<400> 107
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 348
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(348)
<223> 编码 PD-1 mAb 4的VH结构域的多核苷酸
<400> 108
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat attagtagtg gcagtatgag tatttcctat 180
gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgact 300
gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 4的CDRH1
<400> 109
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 4的CDRH2
<400> 110
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 4的CDRH3
<400> 111
Leu Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> PD-1 mAb 4的VL结构域
<400> 112
Asp Val Val Met Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(336)
<223> 编码PD-1 mAb的VL结构域的多核苷酸
<400> 113
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttccattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt 180
tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactac acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 114
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 4的CDRL1
<400> 114
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Phe His
1 5 10 15
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 4的CDRL2
<400> 115
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 4的CDRL3
<400> 116
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 117
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(119)
<223> PD-1 mAb 5的VH结构域
<400> 117
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Val Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 118
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(357)
<223> 编码 PD-1 mAb 5的VH结构域的多核苷酸
<400> 118
caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc gcctactgga tgaactggat gaaacagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagagcac 300
tacggtagta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 5的CDRH1
<400> 119
Ala Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 5的CDRH2
<400> 120
Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(10)
<223> PD-1 mAb 5的CDRH3
<400> 121
Glu His Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb 5的VL结构域
<400> 122
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 123
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(333)
<223> 编码PD-1 mAb 5的VL结构域的多核苷酸
<400> 123
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(15)
<223> PD-1 mAb 5的CDRL1
<400> 124
Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Met Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 5的CDRL2
<400> 125
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 5的CDRL3
<400> 126
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 127
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(118)
<223> PD-1 mAb 6的VH结构域
<400> 127
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Ala Thr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Thr
115
<210> 128
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(333)
<223> 编码 PD-1 mAb 6的VH结构域的多核苷酸
<400> 128
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact 60
ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt 120
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct 180
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc 240
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 300
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa 333
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 6的CDRH1
<400> 129
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 6的CDRH2
<400> 130
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 6的CDRH3
<400> 131
Gln Lys Ala Thr Thr Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 132
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb 6的VL结构域
<400> 132
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 133
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(333)
<223> 编码PD-1 mAb 6的VL结构域的多核苷酸
<400> 133
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 134
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(15)
<223> PD-1 mAb 6的CDRL1
<400> 134
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 6的CDRL2
<400> 135
Pro Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 6的CDRL3
<400> 136
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 137
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(119)
<223> PD-1 mAb 7的VH结构域
<400> 137
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 138
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(357)
<223> 编码 PD-1 mAb 7的VH结构域的多核苷酸
<400> 138
gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta 180
gatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac 240
atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggagcac 300
tacggtacta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt gtcttcc 357
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 7的CDRH1
<400> 139
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 7的CDRH2
<400> 140
Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(10)
<223> PD-1 mAb 7的CDRH3
<400> 141
Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 142
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb 7的VL结构域
<400> 142
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 143
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(333)
<223> 编码PD-1 mAb 7的VL结构域的多核苷酸
<400> 143
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(15)
<223> PD-1 mAb 7的CDRL1
<400> 144
Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Met Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 7的CDRL2
<400> 145
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 7的CDRL3
<400> 146
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 147
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VH1的VH结构域
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 148
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 7 VH1的多核苷酸
<400> 148
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg 60
tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca 120
ccagggcagg gtctggaatg gattggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg 180
gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac 240
atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac 300
tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc 357
<210> 149
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VhPD-1 mAb 7 VH2的H结构域
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ala
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 7 VH2的多核苷酸
<400> 150
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg 60
tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca 120
ccagggcagg gtctggaatg ggctggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg 180
gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac 240
atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac 300
tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc 357
<210> 151
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VL1的VL结构域
<400> 151
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 152
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 7 VL1的多核苷酸
<400> 152
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact 60
ctcagctgca gagcaaatga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt 120
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct 180
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc 240
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 300
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa 333
<210> 153
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VL2的VL结构域
<400> 153
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 154
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 7 VL2的多核苷酸
<400> 154
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact 60
ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt 120
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct 180
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc 240
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 300
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa 333
<210> 155
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VL3的VL结构域
<400> 155
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 7 VL3的多核苷酸
<400> 156
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact 60
ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt 120
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct 180
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc 240
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat 300
acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa 333
<210> 157
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VL2和hPD-1 mAb 7 VL3的VL结构域的CDRL1
<400> 157
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Met Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 7 VL3的VL结构域的CDRL2
<400> 158
Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser
1 5
<210> 159
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(113)
<223> PD-1 mAb 8的VH结构域
<400> 159
Glu Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 160
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(339)
<223> 编码 PD-1 mAb 8的VH结构域的多核苷酸
<400> 160
gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagaac 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta aaaatggtga cactcactac 180
aaccagaagt tcaagggcga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagcgatttt 300
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc 339
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 8的CDRH1
<400> 161
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 8的CDRH2
<400> 162
Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 4
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(4)
<223> PD-1 mAb 8的CDRH3
<400> 163
Asp Phe Asp Tyr
1
<210> 164
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> PD-1 mAb 8的VL结构域
<400> 164
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Gly Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 165
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(336)
<223> 编码PD-1 mAb 8的VL结构域的多核苷酸
<400> 165
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gacccttgta tatagtaatg gaaacaccta tttaaattgg 120
ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 166
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 8的CDRL1
<400> 166
Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 8的CDRL2
<400> 167
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 8的CDRL3
<400> 168
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 169
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(119)
<223> PD-1 mAb 9的VH结构域
<400> 169
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 170
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(357)
<223> 编码 PD-1 mAb 9的VH结构域的多核苷酸
<400> 170
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat 180
tcagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatca gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaggtatggt 300
ttcgacggcg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctcttcc 357
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 9的CDRH1
<400> 171
Ser Tyr Leu Val Ser
1 5
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 9的CDRH2
<400> 172
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(10)
<223> PD-1 mAb 9的CDRH3
<400> 173
Tyr Gly Phe Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 9的VL结构域
<400> 174
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Glu Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 175
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 编码PD-1 mAb 9的VL结构域的多核苷酸
<400> 175
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga tattgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120
gaaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tggcagcagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggaattatta ctgtcagcat cattatgctg ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccagac tggaaatcac a 321
<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 9的CDRL1
<400> 176
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 9的CDRL2
<400> 177
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Ala
1 5
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 9的CDRL3
<400> 178
Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 179
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VH1的VH结构域
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 180
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 9 VH1的多核苷酸
<400> 180
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag tctgaaactg 60
tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgtcttgggt aagacaagca 120
cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat 180
agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac 240
ctccagatga actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga 300
tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc 357
<210> 181
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VH2的VH结构域
<400> 181
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Thr
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Ala Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 182
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 9 VH2的多核苷酸
<400> 182
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag tctgaaactg 60
tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgggctgggt aagacaagca 120
cccggaaaag gcttggaatg gacggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat 180
agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac 240
ctccagatga actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga 300
tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc 357
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有丝氨酸至甘氨酸氨基酸取代的hPD-1 mAb 9 VH2 的VH结构域的CDRH1
<400> 183
Ser Tyr Leu Val Gly
1 5
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VL1的VL结构域
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 185
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 9 VL1的多核苷酸
<400> 185
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc 60
atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg cctggtatca acagaaacct 120
ggtaaagccc caaaattgct catttacaac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt 180
aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc 240
gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa 300
ggcactaagc tcgagatcaa a 321
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VL2的VL结构域
<400> 186
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 187
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 9 VL2的多核苷酸
<400> 187
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc 60
atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg cctggtatca acagaaacct 120
ggtaaagccc caaaattgct catttacgac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt 180
aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc 240
gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa 300
ggcactaagc tcgagatcaa a 321
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VL2的VL结构域的CDRL1
<400> 188
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 9 VL2的VL结构域的CDRL2
<400> 189
Asp Ala Lys Thr Leu Ala Ala
1 5
<210> 190
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(116)
<223> PD-1 mAb 10的VH结构域
<400> 190
Glu Val Ile Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 191
<211> 348
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(348)
<223> 编码PD-1 mAb 10的VH结构域的多核苷酸
<400> 191
gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaagt attagtggtg gtggtagtaa tatctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagaa 300
ctggcttttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc 348
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 10的CDRH1
<400> 192
Asn Tyr Leu Met Ser
1 5
<210> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 10的CDRH2
<400> 193
Ser Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 194
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 10的CDRH3
<400> 194
Gln Glu Leu Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 10的VL结构域
<400> 195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile
100 105
<210> 196
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 编码PD-1 mAb 10的VL结构域的多核苷酸
<400> 196
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca ggacaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcat a 321
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 10的CDRL1
<400> 197
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 10的CDRL2
<400> 198
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (19)..()
<223> PD-1 mAb 10的CDRL3
<400> 199
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 200
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(117)
<223> PD-1 mAb 11的VH结构域
<400> 200
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Gly Thr Tyr Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 201
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(351)
<223> 编码PD-1 mAb 11的VH结构域的多核苷酸
<400> 201
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctgaaatg gatgggggct atttatcctg gaaatagtga tactcactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240
atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tactgggacc 300
tactcgtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 11的CDRH1
<400> 202
Gly Tyr Trp Met His
1 5
<210> 203
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 11的CDRH2
<400> 203
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 204
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(8)
<223> PD-1 mAb 11的CDRH3
<400> 204
Gly Thr Tyr Ser Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 205
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(106)
<223> PD-1 mAb 11的VL结构域
<400> 205
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln His Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 206
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(318)
<223> 编码PD-1 mAb 11的VL结构域的多核苷酸
<400> 206
gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcacagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 11的CDRL1
<400> 207
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 208
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 11的CDRL2
<400> 208
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 209
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(8)
<223> PD-1 mAb 11的CDRL3
<400> 209
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Leu Thr
1 5
<210> 210
<211> 125
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(125)
<223> PD-1 mAb 12的VH结构域
<400> 210
Gln Gly His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Arg Ile Thr Thr Val Val Glu Gly Ala Tyr Trp Tyr Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 211
<211> 375
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(375)
<223> 编码 PD-1 mAb 12的VH结构域的多核苷酸
<400> 211
cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60
tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga tgcactgggt gaaacagaca 120
cctgtgcatg gcctggaatg gattgggact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aagagagagg 300
attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tctggggcac agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 212
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 12的CDRH1
<400> 212
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 213
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 12的CDRH2
<400> 213
Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 214
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 12的CDRH3
<400> 214
Glu Arg Ile Thr Thr Val Val Glu Gly Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 215
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(112)
<223> PD-1 mAb 4的VL结构域
<400> 215
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 216
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(336)
<223> 编码PD-1 mAb 12的VL结构域的多核苷酸
<400> 216
gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct gcaaagtttc cacccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 217
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(16)
<223> PD-1 mAb 12的CDRL1
<400> 217
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 218
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 12的CDRL2
<400> 218
Lys Val Ser Thr Arg Phe Ser
1 5
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 12的CDRL3
<400> 219
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 220
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(121)
<223> PD-1 mAb 13的VH结构域
<400> 220
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 221
<211> 363
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(363)
<223> 编码PD-1 mAb 13的VH结构域的多核苷酸
<400> 221
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggttctaa tatctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagct 300
tactacggta attactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcc 363
<210> 222
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 13的CDRH1
<400> 222
Ser His Thr Met Ser
1 5
<210> 223
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 13的CDRH2
<400> 223
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 224
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(12)
<223> PD-1 mAb 13的CDRH3
<400> 224
Gln Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 225
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 13的VL结构域
<400> 225
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 226
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 编码PD-1 mAb 13的VL结构域的多核苷酸
<400> 226
gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60
atcacgtgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240
gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa cttgacagta ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 13的CDRL1
<400> 227
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 13的CDRL2
<400> 228
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 13的CDRL3
<400> 229
Gln Gln Leu Asp Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 230
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(117)
<223> PD-1 mAb 14的VH结构域
<400> 230
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Leu His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 231
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(351)
<223> 编码 PD-1 mAb 14的VH结构域的多核苷酸
<400> 231
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga taacctgggt gaaacagagg 120
cctggacaag gccttcagtg gattggaaat atttatcctg gtactgatgg tactacctac 180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcacctca gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aactgggcta 300
cactggtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc c 351
<210> 232
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 14的CDRH1
<400> 232
Ser Tyr Trp Ile Thr
1 5
<210> 233
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 14的CDRH2
<400> 233
Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 234
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(8)
<223> PD-1 mAb 14的CDRH3
<400> 234
Gly Leu His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 235
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 14的VL结构域
<400> 235
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 236
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 编码PD-1 mAb 14的VL结构域的多核苷酸
<400> 236
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt 60
gtcacctgca aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaagccc 120
ggtcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctccc gattcagtgg cgtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 237
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 14的CDRL1
<400> 237
Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 14的CDRL2
<400> 238
Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser
1 5
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 14的CDRL3
<400> 239
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 240
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(117)
<223> PD-1 mAb 15的VH结构域
<400> 240
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ile Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 241
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(351)
<223> 编码PD-1 mAb 15的VH结构域的多核苷酸
<400> 241
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgctgcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat 180
gccgacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aagacgaggg 300
acctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c 351
<210> 242
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(5)
<223> PD-1 mAb 15的CDRH1
<400> 242
Ser Tyr Leu Ile Ser
1 5
<210> 243
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(17)
<223> PD-1 mAb 15的CDRH2
<400> 243
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(8)
<223> PD-1 mAb 15的CDRH3
<400> 244
Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 245
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 15的VL结构域
<400> 245
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 246
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(321)
<223> 编码PD-1 mAb 15的VL结构域的多核苷酸
<400> 246
gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60
atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240
gaagattttg taaattatta ctgtcaacaa ctttacagta ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(11)
<223> PD-1 mAb 15的CDRL1
<400> 247
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 248
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(7)
<223> PD-1 mAb 15的CDRL2
<400> 248
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(9)
<223> PD-1 mAb 15的CDRL3
<400> 249
Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 250
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 15 VH1的VH结构域
<400> 250
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 251
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 15 VH1的多核苷酸
<400> 251
gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg 60
tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctcttgggt gcgccaagcc 120
ccaggtaagg gccttgaatg ggtcgccgcc attagtgggg gtggtgccga tacatattat 180
gccgacagcg tcaagggacg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac 240
ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccggcgcggg 300
acttacgcta tggactattg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c 351
<210> 252
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPD-1 mAb 15 VL1的VH结构域
<400> 252
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 253
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码hPD-1 mAb 15 VL1的多核苷酸
<400> 253
gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc 60
atcacctgtc tggccagtca gaccattgga acctggctcg cctggtatca gcagaaacct 120
ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagatgg agtgccctcc 180
cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc 240
gaggatttcg ctacatacta ctgtcaacag ctctactcca ttccatggac ctttggtcag 300
ggtactaaac tggagatcaa a 321
<210> 254
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG4 CH1结构域
<400> 254
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 255
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1人源化抗体重链
<400> 255
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 256
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有稳定化的铰链区的IgG4人源化抗体重链
<400> 256
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 257
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG2 CH1结构域
<400> 257
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 258
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2和CH3结构域的IgG1序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
<400> 258
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 259
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于 CH2和CH3结构域的IgG4序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa 是赖氨酸(K)或不存在
<400> 259
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 260
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型和变异的人IgG1 CH2和CH3结构域
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(5)
<223> Xaa4和Xaa5都是L (野生型), 或都是A (降低的FcγR结合)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (22)..(26)
<223> Xaa22, Xaa24和Xaa26各自是M, S和T (野生型),或是Y、T和E (延长的半衰期)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (136)..(177)
<223> Xaa136, Xaa138,和Xaa177各自是: T, L和Y (野生型),或是W、L和Y (杵)或S、A和V (臼)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (204)..(205)
<223> Xaa204和Xaa205各自是N和H (野生型),或是N和R (没有蛋白质A结合), 或A和K (没有蛋白质A结合)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是 K或不存在
<400> 260
Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Xaa Xaa Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 261
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的连接体2
<400> 261
Leu Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体3
<400> 262
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 263
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体3
<400> 263
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 264
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化PD-1抗体(hPD-1 mAb 7(1.2))的轻链
<400> 264
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 265
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体((hPD-1 mAb 7(1.2))的重链
<400> 265
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 266
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体((hPD-1 mAb 7(1.2))的重链
<400> 266
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 267
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART A的第一和第三多肽链
<220>
<221> MISC_特征
<222> (34)..(34)
<223> Xaa34是A或G
<220>
<221> MISC_特征
<222> (307)..(307)
<223> Xaa307是Y或M
<220>
<221> MISC_特征
<222> (309)..(309)
<223> Xaa309是T或S
<220>
<221> MISC_特征
<222> (311)..(311)
<223> Xaa311是E或T
<400> 267
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Xaa Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser
165 170 175
Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser
210 215 220
Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
370 375 380
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Gly
500
<210> 268
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART A的第二和第四多肽链
<400> 268
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
165 170 175
Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp
180 185 190
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr
210 215 220
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260 265 270
Glu
<210> 269
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART D的第一和第三多肽链
<400> 269
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
165 170 175
Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp
180 185 190
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr
210 215 220
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
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435 440 445
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565 570
<210> 270
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART D的第二和第四多肽链
<400> 270
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
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Gly Gly Gly Ser Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
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340 345 350
<210> 271
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART E的第一和第三多肽链
<400> 271
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
340 345 350
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val
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565 570
<210> 272
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART E的第二和第四多肽链
<400> 272
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
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Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
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Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
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Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu
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Gly Gly Gly Ser Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
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Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
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<210> 273
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART F的第一多肽链
<400> 273
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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435 440 445
<210> 274
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART F的第二和第五多肽链
<400> 274
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
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Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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210 215
<210> 275
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART F的第三多肽链
<400> 275
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr
245 250 255
Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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485 490 495
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545 550 555 560
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Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
580 585 590
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
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675 680 685
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly
690 695 700
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
705 710 715 720
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
725 730
<210> 276
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART F的第四多肽链
<400> 276
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
165 170 175
Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp
180 185 190
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr
210 215 220
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260 265 270
Glu
<210> 277
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART G的第一多肽链
<400> 277
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
245 250 255
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Ala Lys Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 278
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART G的第二和第五多肽链
<400> 278
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 279
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART G的第三多肽链
<400> 279
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
245 250 255
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu
450 455 460
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
465 470 475 480
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Met Ser Phe
485 490 495
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
500 505 510
His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
530 535 540
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr
545 550 555 560
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
580 585 590
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
595 600 605
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
610 615 620
Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp
625 630 635 640
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
645 650 655
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
660 665 670
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp
675 680 685
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly
690 695 700
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
705 710 715 720
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
725 730
<210> 280
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART G的第四多肽链
<400> 280
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu
165 170 175
Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro
210 215 220
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 281
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART H的第一多肽链
<400> 281
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
165 170 175
Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp
180 185 190
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr
210 215 220
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 282
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART H的第二多肽链
<400> 282
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser
165 170 175
Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser
210 215 220
Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260 265 270
Glu
<210> 283
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART H的第三多肽链
<400> 283
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 284
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART 1的第一和第三多肽链
<400> 284
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
115 120 125
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
210 215 220
Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
245 250 255
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
260 265 270
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
275 280 285
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
290 295 300
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
305 310 315 320
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
325 330 335
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
340 345 350
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
355 360 365
Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
370 375 380
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
385 390 395 400
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
405 410 415
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
420 425 430
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
435 440 445
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
450 455 460
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
465 470 475 480
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
485 490 495
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
500 505 510
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
515 520 525
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
530 535 540
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
545 550 555 560
Ser Pro Gly
<210> 285
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART 1的第二和第四多肽链
<400> 285
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
115 120 125
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
130 135 140
Ser Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro
165 170 175
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln
180 185 190
Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
195 200 205
Tyr Cys Ala Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
245 250 255
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
260 265 270
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
275 280 285
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
290 295 300
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
305 310 315 320
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
325 330 335
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 286
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BSAB A的第一多肽链
<400> 286
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 287
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BSAB A的第二多肽链
<400> 287
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 288
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BSAB A的第三多肽链
<400> 288
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Arg
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 289
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BSAB A的第四多肽链
<400> 289
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 290
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART I的第一和第三多肽链
<400> 290
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
245 250 255
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr
290 295 300
Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
<210> 291
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART I的第二和第四多肽链
<400> 291
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val
165 170 175
Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp
180 185 190
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 292
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART J的第一和第三多肽链
<400> 292
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
245 250 255
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
260 265 270
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
275 280 285
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
290 295 300
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
305 310 315 320
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
325 330 335
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
340 345 350
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
355 360 365
Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
370 375 380
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
385 390 395 400
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
405 410 415
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
420 425 430
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
435 440 445
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
450 455 460
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
485 490 495
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
500 505 510
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
515 520 525
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
530 535 540
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
545 550 555 560
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565
<210> 293
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART J的第二和第四多肽链
<400> 293
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val
165 170 175
Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp
180 185 190
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
245 250 255
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
260 265 270
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
275 280 285
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
290 295 300
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
305 310 315 320
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
<210> 294
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VH1的VH结构域
<400> 294
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 295
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VH2的VH结构域
<400> 295
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 296
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL1的VL结构域
<400> 296
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 297
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL2的VL结构域
<400> 297
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 298
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL1和VL2的VL结构域的CDRL1
<400> 298
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val Val Ala
1 5 10

Claims (28)

1.一种抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，用于联合有效刺激免疫应答的一种或多种另外的分子，其中所述联合用于刺激需要其的受试者的T-细胞介导免疫应答，
所述抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体包括可变重链结构域和可变轻链结构域，其中：
所述可变重链结构域包括SEQ ID NO:147的氨基酸序列，和所述可变轻链结构域包括SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
2.一种抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，用于联合特异性结合癌症抗原的一种或多种另外的分子和/或化疗剂，其中所述联合用于治疗癌症，所述抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体包括可变重链结构域和可变轻链结构域，其中：
所述可变重链结构域包括SEQ ID NO:147的氨基酸序列，和所述可变轻链结构域包括SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
4.权利要求1-3任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述抗体包括Fc区域。
5.权利要求4所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述Fc区域具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
6.权利要求5所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述抗体进一步包括铰链结构域。
7.权利要求6所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述Fc区域和所述铰链结构域具有IgG4同种型，并且其中所述铰链结构域包括稳定化突变。
8.权利要求4-7任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述抗体包括SEQ ID NO:264和265。
9.权利要求4-7任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述抗体包括SEQ ID NO:264和266。
10.权利要求4-7任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述Fc区域是变异的Fc区域，其包括：
(a)降低所述变异的Fc区域对FcγR的亲和力的一个或多个氨基酸修饰；和/或
(b)延长所述变异的Fc区域的血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰。
11.权利要求10所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中降低所述变异的Fc区域对FcγR的亲和力的所述修饰包括下述取代：L234A；L235A；或L234A和L235A，其中编号是如Kabat中EU索引的编号。
12.权利要求10或11所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中延长所述变异的Fc区域的血清半衰期的所述修饰包括下述取代：M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K，其中编号是如Kabat中EU索引的编号。
13.权利要求1或3-12任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述有效刺激免疫应答的一种或多种另外的分子是抗CD137抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX40抗体、抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体和/或癌症疫苗。
14.权利要求2-12任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症抗原是5T4、B7H3、CD19、CD20、CD51、CD123、DR5、EGFR、EpCam、GD2、gpA33、HER2、ROR-1、TAG-72、VEGF-A和/或VEGFR2。
15.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症特征在于存在选自由下述的细胞组成的组的癌症细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤、罕见血液学疾病、肾转移性癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症和子宫癌。
16.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是结直肠癌；肝细胞癌；神经胶质瘤；肾癌；乳腺癌；多发性骨髓瘤；膀胱癌；成神经细胞瘤；肉瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；直肠癌；急性髓细胞样白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞白血病(HCL)；急性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；霍奇金淋巴瘤；系统性肥大细胞增多症或伯基特淋巴瘤。
17.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是子宫癌。
18.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是鳞状细胞癌。
19.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是神经胶质瘤。
20.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是宫颈癌。
21.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是肾癌。
22.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是肺癌。
23.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
24.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是头颈癌。
25.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是肾转移性癌症。
26.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是肉瘤。
27.权利要求所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体26，其中所述肉瘤是嫌色细胞肾细胞癌。
28.权利要求2-12或14任一项所述的抗人PD-1结合单特异性单克隆抗体，其中所述癌症是皮肤癌。
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