JP2022518478A - 抗ｐｄ－ｌ１ダイアボディおよびその使用 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１ダイアボディおよびその使用 Download PDF

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Abstract

疾患または状態を有する個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布および発現レベルの決定のための、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ、イメージング剤、方法およびキットが提供される。抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤、および疾患または障害を処置するための方法もまた提供される。本出願は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ、標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤、イメージング剤（抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を含む）を調製する方法、ならびにイメージング剤を使用したイメージングおよび診断の方法を提供する。本出願は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを個体中に投与することによって疾患または障害を処置するための方法もまた提供する。

Description

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７９２５７２０００５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年１２月２５日、サイズ：３５ＫＢ）。
発明の分野
本発明は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、イメージング剤、ならびにＰＤ－Ｌ１をイメージングする方法および疾患または状態を処置する方法に関する。
プログラム死（ＰＤ）ネットワークには、少なくとも５つの相互作用する分子が関与する：ＰＤ－１（プログラム細胞死１）、２つのＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）、およびＰＤ－Ｌ１の２つの阻害性受容体（ＰＤ－１およびＣＤ８０）。感染に対する炎症応答において末梢組織中のＴ細胞の活性をモジュレートすることおよび自己免疫を制限することにおけるＰＤ経路の重要な機能は、腫瘍細胞によって、および慢性ウイルス感染の間にはウイルスによって、乗っ取られるようである。ＰＤ－Ｌ１は、複数の組織起源由来の多くの新たに単離されたヒト腫瘍上で過剰発現される（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２； ８：７９３－８００；Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５； ３：１５；Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５； ６５：１０８９－１０９６）。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ある特定の型のヒトがんの進行および予後不良と相関している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１５； ４１：４５０－４５６；Ｃｉｅｒｎａ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ／ ＥＳＭＯ ２０１６； ２７：３００－３０５；Ｇａｎｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１６； １００：８８－９８；Ｔｈｉｅｒａｕｆ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５； ２５：５０３－５０９；Ｔａｕｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４； ２０：５０６４－５０７４）。慢性ウイルス感染の間、ＰＤ－Ｌ１は、多くの組織上で永続的に発現されるが、ＰＤ－１は、ウイルス特異的ＣＴＬ上で上方調節される（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６； １２：２４４－２４６）。腫瘍誘導性またはウイルス誘導性ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞アネルギー、アポトーシス、消耗、ＩＬ－１０産生、ＤＣ抑制、ならびにＴｒｅｇ誘導および拡大増殖を含む、宿主免疫監視の回避を促進するための複数の機構を利用し得る（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８； ８：４６７－４７７）。
免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して決定されたＰＤ－Ｌ１発現レベルは、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）および転移性去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）を含む複数のがん型に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１指向性治療の臨床試験において予測的バイオマーカーとして評価されている。ＩＨＣによって決定されたより高いレベルのＰＤ－Ｌ１を有する患者は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１指向性治療に対する優れた応答を有するようであった。しかし、黒色腫を有するＰＤ－Ｌ１陰性患者は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療に対する耐久性のある応答をなおも得ることができるが、ＰＤ－Ｌ１陰性ＮＳＣＬＣ患者における奏効率は、稀である。
ヒト腫瘍検体におけるＩＨＣによるＰＤ－Ｌ１検出の正確さは、複数の因子によって混乱される。２８－８、２２Ｃ３、５Ｈ１、ＭＩＨ１および４０５．９Ａ１１を含む、ＩＨＣ検出のための多数のＰＤ－Ｌ１抗体が利用されている。さらに、Ｖｅｎｔａｎａ ＳＰ１４２およびＶｅｎｔａｎａ ＳＰ２６３アッセイなどの、いくつかの独占所有権のあるコンパニオン診断法が、この分野において開発されている。これらのアッセイの比較成績特徴は、周知ではない。腫瘍微小環境内の不均一なＰＤ－Ｌ１発現という既存の問題に加えて、腫瘍試料中のＩＨＣによる「陽性」ＰＤ－Ｌ１染色の明確な定義の欠如もまた存在する。陽性結果についてのカットオフポイントは、染色された腫瘍細胞のパーセントに基づいて、＞１％～＞５０％の範囲であり得る。さらに、ＰＤ－Ｌ１は、２つの小さい親水性領域しか含まないので、ＩＨＣ検出抗体に対する制限された結合部位を有し、このことは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体において古典的に使用される免疫組織化学的アプローチの有効性を低くする。ＰＤ－Ｌ１上の結合部位の欠如に起因して、ＩＨＣ抗体は、典型的には、治療的ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、構造的に独自の部位においてＰＤ－Ｌ１に結合する。
さらに、ＰＤ－Ｌ１は、動的ＩＦＮγ発現を介してまたは構成的癌遺伝子活性化を介して細胞膜上で発現される場合にのみ、生物学的に活性である。癌遺伝子で駆動されるＰＤ－Ｌ１発現は、炎症で駆動されるＰＤ－Ｌ１発現と比較して、病理組織学的および生物学的に別個の実体を示す。後者は、ＩＦＮγ媒介性の免疫学的攻撃の部位において限局的に生じるが、癌遺伝子で駆動されるＰＤ－Ｌ１発現は、構成的かつ散在性である。ＩＦＮγ誘導性のＰＤ－Ｌ１発現は、動的バイオマーカーを示し、活発な炎症の部位に存在し、生検試料は、空間および時間における腫瘍免疫微小環境のスナップショットを示す。低酸素を含む、腫瘍代謝微小環境中の他の因子は、ＰＤ－Ｌ１上方調節を生じ得、ＨＩＦ１ａを介したシグナル伝達に依存する。より小さい腫瘍生検は、適正な腫瘍－免疫界面を欠き得、または生検は、生物学的に適切なＰＤ－Ｌ１過剰発現が既に起きた後に、実施され得る。ＰＤ－Ｌ１自体は、２つの潜在的に臨床的に適切な免疫シナプス － 腫瘍／Ｔ細胞界面、ならびにＡＰＣ／Ｔ細胞界面 － において発現される。腫瘍／Ｔ細胞界面について、腫瘍／免疫界面の生検捕捉は、黒色腫におけるＩＨＣによるＰＤ－Ｌ１検出における重要な決定因子である。転移性黒色腫を有する患者におけるＰＤ－Ｌ１発現を評価する研究では、ＰＤ－Ｌ１過剰発現黒色腫の９６％は、リンパ球浸潤物（ＴＩＬ）を有したが、ＰＤ－Ｌ１過剰発現黒色腫の残りの４％は、ＴＩＬを欠如し、これは、癌遺伝子で駆動されるＰＤ－Ｌ１発現をおそらくは示す。さらに、ＰＤ－Ｌ１陰性試料の２２％は、ＴＩＬに関連し、これは、腫瘍免疫妨害の代替的機構を示している。
ＰＤ－Ｌ１発現の大多数は、ＩＦＮγを分泌する免疫細胞との腫瘍界面において生じ、このことは、ＰＤ－Ｌ１過剰発現が、ＴＩＬによる首尾よい腫瘍死滅に対する最初は保護的な応答であり得、時間と共に、免疫抑制的腫瘍環境中に吸収されるようになるという、直観に反した仮説をもたらす。さらに、ＰＤ－Ｌ１検出のための生検のための適切な部位の選択は、謎のままである。事前処置ＦＦＰＥ原発腫瘍試料は、最も容易に入手可能であり得るが、これらの試料は、特に、暫定的処置が投与された場合、所与の患者中に現在存在する全体的な免疫学的状態を反映していない可能性がある。生検された病変におけるＰＤ－Ｌ１発現の非存在は、全身の免疫学的状況を反映していない可能性があり、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達に依存する疾患の他の部位における治療の有益な効果を捕捉していない可能性がある。要約すると、正確かつ代替的なＰＤ－Ｌ１検出剤および方法の必要性が満たされていない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願および公開された特許出願の開示は、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２； ８：７９３－８００ Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５； ３：１５ Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５； ６５：１０８９－１０９６ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１５； ４１：４５０－４５６ Ｃｉｅｒｎａ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ／ ＥＳＭＯ ２０１６； ２７：３００－３０５ Ｇａｎｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１６； １００：８８－９８；Ｔｈｉｅｒａｕｆ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５； ２５：５０３－５０９ Ｔａｕｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４； ２０：５０６４－５０７４ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６； １２：２４４－２４６
本出願は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ、標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤、イメージング剤（抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を含む）を調製する方法、ならびにイメージング剤を使用したイメージングおよび診断の方法を提供する。本出願は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを個体中に投与することによって疾患または障害を処置するための方法もまた提供する。
本出願の一態様は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、ダイアボディを提供する。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬならびに第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは各々、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。
本出願の別の態様は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディを提供する。
本出願の別の態様は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディを提供する。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、共有結合を介して連結される。一部の実施形態では、共有結合は、第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の共有結合を含む、および／または共有結合は、第１のポリペプチドのＶＬと第２のポリペプチドのＶＨとの間にある。一部の実施形態では、共有結合は、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、ジスルフィド結合、または少なくとも２つのジスルフィド結合のうち１つは、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つまたはそれよりも多くの共有結合を介して連結される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの共有結合は、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１の共有結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２の共有結合を含む。一部の実施形態では、共有結合は、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１のジスルフィド結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２のジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、ジスルフィド結合、または少なくとも２つのジスルフィド結合のうち１つは、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＨは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｇ４４Ｃ変異および／またはＱ１０５Ｃ変異を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＬは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｑ１００Ｃ変異および／またはＡ４３Ｃ変異を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｑ１０５Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ａ４３Ｃ変異を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１および／または第２のポリペプチドのＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１および／または第２のポリペプチドのＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、タグをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、タグは、Ｈｉｓ－タグを含む。一部の実施形態では、タグは、第２のリンカーを介してポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、第２のリンカーは、約４～１５アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のリンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。
上記ダイアボディのいずれかに従う一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、配列番号３６～４３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本出願の別の態様は、上記ダイアボディのいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本出願の別の態様は、上記ダイアボディのいずれかをコードするポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチドまたは複数のポリペプチド）を提供する。
本出願の別の態様は、上記ポリヌクレオチドのいずれかを含み、必要に応じて、ポリヌクレオチドと作動するように接続したプロモーターをさらに含む、核酸構築物を提供する。
本出願の別の態様は、上記核酸構築物のいずれかを含むベクターを提供する。
本出願の別の態様は、上記ポリヌクレオチドのいずれか、上記核酸構築物のいずれかまたは上記ベクターのいずれかを含む、単離された宿主細胞を提供する。
本出願の別の態様は、上記ダイアボディのいずれか、上記ポリヌクレオチドのいずれか、上記核酸構築物のいずれか、上記ベクターのいずれかまたは上記宿主細胞のいずれかを含む、培養培地を提供する。
本出願の別の態様は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを産生する方法であって、ａ）上記単離された宿主細胞のいずれかを、ダイアボディを発現するのに有効な条件下で培養するステップ；およびｂ）宿主細胞から、発現されたダイアボディを得るステップ、を含む方法を提供する。
本出願の別の態様は、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、ａ）個体に、標識化剤（例えば、放射性核種）で標識された上記ダイアボディのいずれかを含むイメージング剤を投与するステップ；およびｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法を提供する。
本出願の別の態様は、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、ａ）上記個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法のいずれかを使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するステップ；およびｂ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含む方法を提供する。
本出願の別の態様は、疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、ａ）上記個体を診断する方法のいずれかを使用して、個体を診断するステップ；およびｂ）個体がＰＤ－Ｌ１について陽性と診断される場合に、個体に、有効量のＰＤ－Ｌ１を標的化する治療剤を投与するステップ、を含む方法を提供する。
本出願の別の態様は、疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、個体に、有効量の、上記ダイアボディのいずれかまたは上記医薬組成物のいずれかを投与するステップを含む方法を提供する。
本出願の別の態様は、放射性核種で標識された上記ダイアボディのいずれかを含むイメージング剤を提供する。
本出願の別の態様は、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、ａ）標識を、上記抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディのいずれかにコンジュゲートし、それによって、イメージング剤を提供するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、ａ）キレート化合物を、上記ダイアボディのいずれかにコンジュゲートして、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；ｂ）放射性核種を、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む方法が提供される。
本出願の別の態様は、ａ）上記ダイアボディのいずれか；およびｂ）キレート剤、を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、放射性核種をさらに含む。
本出願の別の態様は、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、個体に、上記ダイアボディのいずれかおよび標識化剤を含む有効量のイメージング剤を投与するステップ；ならびに個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、個体に、上記ダイアボディのいずれかおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量のダイアボディ剤を投与するステップ；個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を引き続いて投与するステップであって、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、ステップ；ならびに個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は各々、クリックケミストリー対のメンバーを含み、クリックケミストリーを介して互いにコンジュゲートされる。
図１は、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの構築物設計の概略図を示す。
図２は、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディに対応するモノマー形態の概略図を示す。
図３Ａ～３Ｂは、シリカゲル上でのインスタント薄層クロマトグラフィーを使用して測定した、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの収量（図３Ａ）および精製後のｓｃＦｖの放射化学的純度（図３Ｂ）を示す。 同上。
図４Ａ～４Ｂは、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの遮断なし（図４Ａ）または未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの遮断あり（図４Ｂ）の、ＭＣ３８またはＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの結合を示す。 同上。
図５Ａ～５Ｂは、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの遮断なし（図５Ａ）または未標識の抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの遮断あり（図５Ｂ）の、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの注射の１時間後（上パネル）または２時間後（下パネル）の、マウスにおける腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージング結果を示す。腫瘍を、それぞれマウスの左側腹および右側腹中へのＭＣ３８細胞およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞の事前投与によって誘導した。 同上。
図６Ａ～６Ｂは、シリカゲル上でのインスタント薄層クロマトグラフィーを使用して測定した、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの収量（図６Ａ）および精製後のダイアボディの放射化学的純度（図６Ｂ）を示す。 同上。
図７Ａ～７Ｂは、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの遮断なし（図７Ａ）または未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの遮断あり（図７Ｂ）の、ＭＣ３８またはＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの結合を示す。 同上。
図８Ａ～８Ｂは、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの遮断なし（図８Ａ）および未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの遮断あり（図８Ｂ）の、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの注射の１時間後（上パネル）または２時間後（下パネル）の、マウスにおける腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージング結果を示す。腫瘍を、それぞれマウスの左側腹および右側腹中へのＭＣ３８細胞およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞の事前投与によって誘導した。 同上。
図９は、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖまたは６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの注射の１時間後のイメージングの比較を示す。
本出願は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤、イメージング剤、個体におけるＰＤ－Ｌ１の検出のための方法、および疾患または障害を処置するための方法を提供する。本明細書に記載されるダイアボディは、標的ＰＤ－Ｌ１に対する高い結合親和性を提供し、イメージング剤中に取り込まれると、検出のための高い感度、ならびに標的組織の有効な標的化およびその中への透過を提供する。ＰＤ－Ｌ１の分布および発現レベルは、イメージング剤が投与された個体のｉｎ ｖｉｖｏ生イメージングによって決定され得る。
本出願の一態様は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを提供する。一部の実施形態では、ダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。
本出願の別の態様は、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を提供する。
本出願の別の態様は、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；およびｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法を提供する。本出願の別の態様は、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、ａ）上記方法を使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するステップ；およびｂ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含む方法を提供する。
本明細書に記載されるイメージング剤および抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディまたはダイアボディ剤を含む組成物、キットおよび製造物品、それらを作製する方法、ならびに疾患または状態（例えば、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患）を有する個体を処置する方法もまた提供される。
Ｉ．定義
用語「抗体」は、その最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体およびそれらの抗原結合性断片が含まれるがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、緊密に非共有結合的に関連した、１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインのダイマーからなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（各々重鎖および軽鎖由来の３つのループ）が発する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも短縮される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖へと接続されたＶＨ抗体ドメインおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）を参照のこと。
本明細書に記載される「ダイアボディ（単数または複数）」は、２つのｓｃＦｖポリペプチドを含む複合体を指す。一部の実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの鎖内対合ではなく鎖間対合が達成され、二価断片、即ち、２つの抗原結合部位を有する断片を生じる。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見出される非連続の抗原組み合わせ部位を意味することが意図される。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：６６０９－６６１６ （１９７７）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７３： ９２７－９４８ （１９９７）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５ （１９９６）；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４５： ３８３２－３８３９ （２００８）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７： ５５－７７ （２００３）；およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３０９：６５７－６７０ （２００１）によって記載されており、これらの文献中で、定義は、互いに対して比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体もしくはグラフト抗体またはそれらのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され使用される用語の範囲内であることが意図される。上で引用した参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較として、以下の表１に示される。ＣＤＲ予測アルゴリズムおよびインターフェースは、例えば、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４５： ３８３２－３８３９ （２００８）；Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３８： Ｄ３０１－Ｄ３０７ （２０１０）；およびＡｄｏｌｆ－Ｂｒｙｆｏｇｌｅ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４３： Ｄ４３２－Ｄ４３８ （２０１５）を含め、当該分野で公知である。この段落で引用した参考文献の内容は、本発明における使用のためおよび本明細書の１つまたは複数の請求項における可能な包含のために、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
表１： ＣＤＲ定義
Figure 2022518478000001
 １残基番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記の命名法に従う
２残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、上記の命名法に従う
３残基番号付けは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、上記の命名法に従う
４残基番号付けは、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、上記の命名法に従う
５残基番号付けは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記の命名法に従う
表現「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位置番号付け」およびそれらの変形形態は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記中の抗体の収集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはその中への挿入に対応して、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。
本明細書で他に示されない限り、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記と同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。重鎖または軽鎖中のＦＲ配列ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、一般式：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４によって定義される。
用語「半合成」は、抗体またはダイアボディに関して、その抗体またはダイアボディが、１つまたは複数の天然に存在する配列および１つまたは複数の天然に存在しない（即ち、合成の）配列を有することを意味する。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の超可変領域からの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに精緻化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものの、少なくとも一部分もまた含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９ （１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６ （１９９２）を参照のこと。
本明細書で同定されるポリペプチドおよび抗体配列に関して、「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「相同性」は、全ての保存的置換を配列同一性の一部として考慮して配列をアラインメントした後の、比較されているポリペプチド中のアミノ酸残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムＭＵＳＣＬＥを使用して生成される（Ｅｄｇａｒ， Ｒ．Ｃ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７， ２００４；Ｅｄｇａｒ， Ｒ．Ｃ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５（１）：１１３， ２００４）。
「相同な」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較された配列の両方中の位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々中の位置がアデニンによって占められる場合、これらの分子は、その位置において相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、比較された位置の数によって除算された、２つの配列によって共有されるマッチするまたは相同な位置の数×１００の関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうち６個がマッチするまたは相同である場合、これら２つの配列は、６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣとは、５０％の相同性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるようにアラインメントされる場合に、比較が行われる。
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に別個の型のうち１つに割り当てられ得る。
用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、抗体またはダイアボディが結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２つの抗体または抗体部分は、それらが抗原に対する競合的結合を示す場合、その抗原内の同じエピトープに結合し得る。
本明細書で使用される場合、第１の抗体（例えば、ダイアボディ）は、第１の抗体が、等モル濃度の第１の抗体の存在下で、第２の抗体の標的抗原結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）阻害する場合、標的抗原への結合について、第２の抗体（例えば、ダイアボディ）と「競合」し、逆もまた同様である。それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」および「～に対して特異的である」は、例えば、生物分子を含む分子の不均一な集団の存在下での標的の存在を決定する、測定可能かつ再現性のある相互作用、例えば、標的と抗体（例えば、ダイアボディ）との間の結合を指す。例えば、ある標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する抗体は、他の標的へのその結合よりも、より高い親和性、アビディティで、より迅速に、および／またはより長い持続時間で、この標的に結合する抗体（例えば、ダイアボディ）である。一部の実施形態では、無関係の標的への抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、標的への抗体の結合の約１０％未満である。一部の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ、≦１０－１１Ｍまたは≦１０－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。一部の実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されている、タンパク質上のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを要求するわけではない。抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該分野で公知の方法によって、実験的に決定され得る。かかる方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、ＥＩＡ試験、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ試験およびペプチドスキャンを含むがこれらに限定されない。
「単離された」抗体（または構築物）は、同定された、その産生環境（例えば、天然または組換え）の成分から分離および／または回収されたものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境由来の全ての他の成分に関連していない。
本明細書に記載される構築物または抗体（例えば、ダイアボディ）をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、それが産生された環境においてそれが通常関連する少なくとも１つの夾雑物核酸分子から分離された、核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関連する全ての成分に関連していない。本明細書に記載されるポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、天然に見出される形態または状況以外の形態にある。したがって、単離された核酸分子は、細胞中に天然に存在する、本明細書に記載されるポリペプチドおよび抗体をコードする核酸から識別される。単離された核酸には、この核酸分子を通常含む細胞中に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
核酸は、別の核酸配列と機能的に関連するように配置されている場合、「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質としてそれが発現される場合、そのポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列の転写にそれが影響を与える場合、その配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するようにそれが位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しておりかつリーディング相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来実務に従って使用される。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それが連結される別の核酸を増大させることが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製性核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、それらが動作可能に連結した核酸の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、本明細書で使用される場合、外因性核酸が宿主細胞中に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換されたまたは形質導入された細胞である。細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」および「宿主細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代の形質転換された細胞、および継代数にかかわらず、それに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換された細胞」が含まれる。子孫は、核酸内容が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含み得る。元々形質転換された細胞においてそれについてスクリーニングまたは選択されるものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のうち１つまたは複数が含まれるがこれらに限定されない：疾患から生じる１つもしくは複数の症状を軽減すること、疾患の程度を弱めること、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化を予防もしくは遅延すること）、疾患の伝播（例えば、転移）を予防もしくは遅延すること、疾患の再発を予防もしくは遅延すること、疾患の進行を遅延もしくは緩徐化すること、疾患状態を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）こと、疾患の寛解（部分的もしくは完全な）を提供すること、疾患を処置するために必要な１つもしくは複数の他の薬物療法の用量を減少させること、疾患の進行を遅延すること、生活の質を増加もしくは改善すること、体重増加を増加させること、および／または生存を延長すること。がんの病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の低減もまた、「処置」によって包含される。本発明の方法は、処置のこれらの態様のうち任意の１つまたは複数を企図する。
用語「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な、薬剤の量を指す。この用語は、本明細書に記載されるイメージング方法のうちいずれか１つによる検出のためのイメージを提供する用量にも適用される。具体的な用量は、以下のうち１つまたは複数に依存して変動し得る：選択された特定の薬剤、従う投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングされる組織、およびそれを運搬する物理的送達システム。
用語「対象」、「個体」および「患者」は、本明細書で相互交換可能に使用されて、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物を指す。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
本明細書に記載される本発明の実施形態は、実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書での、「約」ある値またはパラメーターに対する言及は、その値またはパラメーター自体に対する変形形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメーター「ではない」に対する言及は、一般に、ある値またはパラメーター「以外」であることを意味し、それを記載する。例えば、方法が、型Ｘのがんを処置するために使用されない、とは、その方法が、Ｘ以外の型のがんを処置するために使用されることを意味する。
本明細書で使用される用語「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語「約Ｘ、ＹまたはＺ」は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」と同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「または」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。
「コンジュゲートされた」は、本明細書で使用される場合、共有結合的または非共有結合的であり得る、２つのコンジュゲーション部分の特定の関連を指す。
ＩＩ．抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディ
本出願の一態様は、単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよび抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を提供する。一部の実施形態では、ダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨは、配列番号１～５のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６～１０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１～１３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約３アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬは、配列番号１４～１６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７～１９のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０～２１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約３アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬならびに第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは各々、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１～５のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６～１０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１～１３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５、４、３、２もしくは１アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４～１６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７～１９のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０～２１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５、４、３、２もしくは１アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、ダイアボディが提供される。一部の実施形態では、置換は、保存的置換物（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）（例えば、表２に開示されるもの）からなる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸（例えば、約１～１５アミノ酸または約１５～３０アミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチド（例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬならびに第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは各々、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５、４、３、２もしくは１アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５、４、３、２もしくは１アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、ダイアボディが提供される。一部の実施形態では、置換は、保存的置換物（例えば、表２に開示される）からなる。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸（例えば、約１～１５アミノ酸または約１５～３０アミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチド（例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬならびに第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは各々、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディが提供される。一部の実施形態では、結合ドメインは、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬまたは第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬによって形成される。一部の実施形態では、結合ドメインは、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、または第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬによって形成される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸（例えば、約１～１５アミノ酸または約１５～３０アミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチド（例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディが提供される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸（例えば、約１～１５アミノ酸または約１５～３０アミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチド（例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬならびに第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは各々、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディの第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、共有結合を介して連結される。一部の実施形態では、共有結合は、第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の共有結合を含む、および／または共有結合は、第１のポリペプチドのＶＬと第２のポリペプチドのＶＨとの間にある。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つまたはそれよりも多くの共有結合を介して連結される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの共有結合は、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１の共有結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２の共有結合を含む。一部の実施形態では、共有結合は、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して連結される。一部の実施形態では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１のジスルフィド結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２のジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、ジスルフィド結合、または少なくとも２つのジスルフィド結合のうち１つは、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＨは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｇ４４Ｃ変異またはＱ１０５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＬは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｑ１００Ｃ変異またはＡ４３Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｑ１０５Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ａ４３Ｃ変異を含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１５アミノ酸以下（例えば、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９アミノ酸以下）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１５アミノ酸（例えば、少なくとも約１５、１８、２０、２２、２５または２７アミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１～１５、２～１２、４～１０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１および／または第２のポリペプチドのＶＨは、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
一部の実施形態では、第１および／または第２のポリペプチドのＶＬは、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、タグをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、タグは、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、タグは、Ｈｉｓ－タグを含む。一部の実施形態では、タグは、第２のリンカーを介してポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、第２のリンカーは、約１～３０アミノ酸、例えば、約４～１５アミノ酸、約４～１０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のリンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、配列番号３６～４３のうちいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３６～４３のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
一部の実施形態では、ダイアボディは、酸性ｐＨ（例えば、約６．５、６．０、５．５または５．０よりも低いｐＨ）において安定である。一部の実施形態では、ダイアボディは、約５５～７０ｏＣ（例えば、約５５～６０、６０～６５または６５～７０℃のうちいずれか１つ）の融解温度（Ｔｍ）を有する。
一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化される。
ａ）置換、挿入、欠失およびバリアント
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディバリアントが提供される。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）およびＦＲが含まれる。例示的な保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下に、表２中に示される。より実質的な変化は、「例示的な置換」の見出しの下に表２中で提供され、アミノ酸側鎖クラスに関して以下にさらに記載される。アミノ酸置換は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされる目的のダイアボディおよび産物中に導入され得る。
表２．アミノ酸置換
Figure 2022518478000002
Figure 2022518478000003
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされ得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを、別のクラスに交換することを必然的に伴う。
置換バリアントの１つの型には、親抗体の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することが関与する（例えば、ヒト化ダイアボディ）。一般に、さらなる研究のために選択される得られたバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物特性における改変（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、低減された免疫原性）を有する、および／または親抗体の実質的に保持されたある特定の生物特性を有する。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどの、ファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して簡便に生成され得る、親和性成熟された抗体である。簡潔に述べると、１つまたは複数のＨＶＲ残基は、変異され、バリアント抗体は、ファージ上にディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変更（例えば、置換）が、例えば、ダイアボディ親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセスの間に高い頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０７：１７９－１９６ （２００８）を参照のこと）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）においてなされ得、得られたバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７ （Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， （２００１））に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性は、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟化のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが創出される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意のダイアボディバリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法には、ＨＶＲ指向性アプローチが関与し、そこでは、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化される。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が、しばしば標的化される。
一部の実施形態では、置換、挿入または欠失は、かかる変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内に存在し得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいてなされ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲの外側であり得る。
変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５によって記載される。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基または標的残基の群（例えば、荷電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕ）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。この方法は、本明細書に記載されるダイアボディに適用可能である。さらなる置換が、初回の置換に対する機能的感度を実証するアミノ酸位置において導入され得る。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基および近隣残基は、置換のための候補として標的化または除外され得る。バリアントは、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
ｂ）グリコシル化バリアント
一部の実施形態では、ダイアボディは、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させるために変更される。ダイアボディへのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つまたは複数のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更させることによって、簡便に達成され得る。
哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結によって一般に結合される、分岐鎖の二分岐オリゴ糖（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２ （１９９７）を参照のこと。オリゴ糖は、二分岐オリゴ糖構造の「幹（ｓｔｅｍ）」中のＧｌｃＮＡｃに結合した、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸、ならびにフコースを含み得る。一部の実施形態では、ダイアボディ中のオリゴ糖の改変は、ある特定の改善された特性を有する抗体バリアントを創出するためになされ得る。
一部の実施形態では、ダイアボディは、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定した場合、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（例えば、複合型、ハイブリッド型および高マンノース型構造）の合計と比較した、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７は、抗体における軽微な配列バリエーションに起因して、２９７位の上流または下流約±３アミノ酸、即ち、２９４位と３００位との間に位置してもよい。かかるフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する公報の例には、以下が含まれる：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９－１２４９ （２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４ （２００４）。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞系の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５ （１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２ Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞系、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４ （２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０－６８８ （２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）が含まれる。
ｃ）ダイアボディ誘導体
一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディは、当業者で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに改変され得る。ダイアボディの誘導体化のために適切な部分には、水溶性ポリマーが含まれるがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐鎖でも非分岐鎖でもよい。ダイアボディに結合されるポリマーの数は、変動し得、１つよりも多くのポリマーが結合される場合、それらは、同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または型は、改善されるダイアボディの特定の特性または機能、ダイアボディ誘導体が規定された条件下で診断において使用されるかどうかなどが含まれるがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
一部の実施形態では、ダイアボディは、１つまたは複数の生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの断片を含むように、さらに改変され得る。「生理活性」または「生物学的に活性な」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、特定の機能を実行する身体中での生物活性を示すことを意味する。例えば、これは、特定の生体分子、例えば、タンパク質、ＤＮＡなどとの組合せを意味し得、次いで、かかる生体分子の活性の促進または阻害を意味し得る。一部の実施形態では、生理活性タンパク質またはその断片には、疾患または状態の予防または処置のための活性薬物物質として患者に投与されるタンパク質およびポリペプチド、ならびに診断試験またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用される酵素などの、診断目的で使用されるタンパク質およびポリペプチド、ならびにワクチンなどの、疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質およびポリペプチドが含まれる。
ＩＩＩ．イメージング剤および抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤
本出願の一態様は、標識化剤（例えば、放射性核種）で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を提供する。このセクションに記載されるイメージング剤のいずれか１つが、本明細書に記載される、ＰＤ－Ｌ１の分布および／もしくは発現レベルを決定する方法、または診断もしくは処置の方法において使用され得る。
一部の実施形態では、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載されるダイアボディのいずれか）を含むイメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、１，４，７－トリアザシクロノナン－ｌ，４，７－トリス酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化される。
一部の実施形態では、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載されるダイアボディのいずれか）を含むイメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤であって、ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、イメージング剤が提供される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化される。
企図されるダイアボディには、ヒト化ダイアボディ、部分的にヒト化されたダイアボディ、完全にヒト化されたダイアボディ、半合成ダイアボディ、ならびに例えば、「抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ」のセクションにおいて本明細書で議論される重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含むダイアボディが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト由来のＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する。一部の実施形態では、ダイアボディは、２つまたはそれよりも多くの種由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。モデル動物およびヒトとのダイアボディの交差反応性は、イメージング剤の臨床研究を促進する。一部の実施形態では、ダイアボディは、非ヒト動物、例えば、哺乳動物由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザル由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。
放射性核種
本明細書に記載されるイメージング剤は、標識化剤を含む。診断目的のために、標識化剤は、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤および光活性剤であり得る。かかる診断標識は周知であり、任意のかかる公知の標識が使用され得る。
一部の実施形態では、イメージング剤は、放射性核種を含む。「放射性核種」は、「放射活性同位体」または「放射性同位体」と称される場合が多い。本明細書に記載される抗体部分に結合され得る例示的な放射性核種または安定な同位体には、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４－１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のガンマ放射体、ベータ放射体もしくは陽電子放射体が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。
使用される常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ得る。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）が含まれ得る。放射線不透過性診断剤は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物から選択され得る。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅ１ｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミンが含まれるがこれらに限定されない広範な種々の蛍光標識が、当該分野で公知である。使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルが含まれ得る。
放射免疫検出（ＲＡＩＤ）は、過去３５年の間に、臨床的に有用な分野として浮上してきた。ＲＡＩＤを使用するほぼ１０００の臨床試験が、いくらかの明確かつ重要な知見を伴って、この期間の間実施されてきた。従来のイメージングによって「潜在性」とみなされた病変を検出するためのこの技法のより高い能力は、初期の研究においてさえ認識されており、抗体、腫瘍または放射性核種の型にかかわらず、研究によって反復して確認されてきた。
多くの放射性核種、例えば、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、６４Ｃｕおよび１８Ｆは、選択される優れたイメージング剤である。これらは通常、安全なイメージングにとって理想的なガンマまたはベータエネルギーを有し、安価であり、容易に入手可能であり、ジェネレーターで産生され、担体を含まない。それらの短い半減期（６時間未満）は、容易に、それらを、初期のイメージング研究のための抗体断片とのカップリングに適したものにしている。
一部の実施形態では、イメージング剤は、放射性核種をキレートするキレート化合物を含む。一部の実施形態では、キレート化合物は、放射活性金属をキレートする。一部の実施形態では、キレート化合物は、金属１８Ｆをキレートする。一部の実施形態では、キレート化合物は、金属イオンに結合でき、迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを確実にすることを助けることができる、親水性キレート化合物である。適切なキレート化合物は、それらの特定の金属結合特性について選択され得、公知の化学的架橋技法によるまたは側鎖反応性基を有するキレーター（例えば、二機能性キレート化合物）の使用による置換は、慣用的に過ぎない実験を用いて実施され得る。
特に有用な金属－キレート化合物の組合せには、放射性イメージングのための、６０～４，０００ｋｅＶの一般的なエネルギー範囲の診断的同位体、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、９４Ｔｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒと共に使用される、２－ベンジル－ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）ならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシルアナログが含まれる。同じキレート化合物は、非放射活性金属、例えば、マンガン、鉄およびガドリニウムと錯体化されると、ＭＲＩのために有用である。大環状キレート化合物、例えば、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’－四酢酸）、ＴＥＴＡ（ブロモアセトアミド－ベンジル－テトラエチルアミン四酢酸）およびＮＥＴＡ（｛４－［２－（ビス－カルボキシメチル－アミノ）－エチル］－７－カルボキシメチル－［１，４，７］トリアゾナン－１－イル｝－酢酸）は、種々の診断的放射性金属、例えば、ガリウム、イットリウムおよび銅と共に使用される。かかる金属－キレート錯体は、環サイズを目的の金属に合わせることによって、非常に安定にされ得る。当業者は、ＮＯＴＡなどの大環状環構造に結合される基を変動させることによって、異なる金属および／または放射性核種に対する結合特徴および親和性が変化し得、したがって、例えばＮＯＴＡのかかる誘導体またはアナログが、本明細書で議論される金属または放射性核種のいずれかに結合するように設計され得ることが理解される。
ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型キレーターは、リガンドが硬い塩基キレート性官能基、例えば、カルボキシレートまたはアミン基を含む場合、硬い酸カチオン、特に、ＩＩａ族およびＩＩＩａ族金属カチオンをキレートするのに最も有効である。かかる金属－キレート錯体は、環サイズを目的の金属に合わせることによって、非常に安定にされ得る。他の環型キレーター、例えば、大環状ポリエーテルは、核種に安定に結合するために目的とされる。ポルフィリンキレーターは、多数の金属錯体と共に使用され得る。１つよりも多くの型のキレーターが、複数の金属イオンを結合するために、ペプチドにコンジュゲートされ得る。キレーター、例えば、米国特許第５，７５３，２０６号に開示されるもの、特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｙｌｇｌｙｏｘｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）（Ｔｓｃｇ－Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｎｙｌ）－アセチルシステイン（Ｔｓｃａ－Ｃｙｓ）キレーターは、軟らかい塩基リガンドに緊密に結合されるＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉならびに他の遷移金属、ランタニドおよびアクチニドの軟らかい酸カチオンを結合するために、有利に使用される。他の硬い酸キレーター、例えば、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどが、ＤＴＰＡおよび／またはＴｓｃｇＣｙｓ基を置換し得る。
一部の実施形態では、キレート化合物は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディにコンジュゲートされ得る官能基を含む。一部の実施形態では、キレート化合物は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ中の第１級アミン（－ＮＨ２）基と反応性の官能基を含む。第１級アミンは、各ポリペプチド鎖のＮ末端に、およびリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基の側鎖中に存在する。抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの第１級アミン、例えば、リシン側鎖にコンジュゲートされ得る例示的な官能基には、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物およびフルオロフェニルエステルが含まれるがこれらに限定されない。これらの官能基のほとんどは、アシル化またはアルキル化のいずれかによって、アミンにコンジュゲートする。
一部の実施形態では、キレート化合物は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ中のシステイン側鎖（即ち、スルフヒドリル基）と反応性の官能基を含む。例示的なスルフヒドリル反応性基には、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオールおよびジスルフィド還元剤が含まれるがこれらに限定されない。これらの基のほとんどは、アルキル化（通常、チオエーテル結合の形成）またはジスルフィド交換（ジスルフィド結合の形成）のいずれかによって、スルフヒドリルにコンジュゲートする。
一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ誘導体を含むＮＯＴＡである。例えば、アミノ酸側鎖、例えば、リシンおよびシステインを介した抗体部分へのコンジュゲーションに適切な官能基を有する例示的なＮＯＴＡ化合物は、図１０に示される。一部の実施形態では、イメージング剤は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディにコンジュゲートされたＮＯＴＡを含む。一部の実施形態では、ＮＯＴＡ化合物は、イソチオシアネート（－ＳＣＮ）基を含む。一部の実施形態では、ＮＯＴＡ化合物は、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡである。一部の実施形態では、キレート化合物は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ中のリシン残基にコンジュゲートされるＮＯＴＡを含み、ＮＯＴＡは、６８Ｇａをキレートする。一部の実施形態では、ＮＯＴＡ化合物は、放射活性金属、例えば、６８Ｇａまたは１８Ｆ－金属で最初に標識され、次いで、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディにコンジュゲートされる。
抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤
一部の実施形態では、セクションＩＩに記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含む抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤が提供される。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、以下に記載される第１のコンジュゲーション部分をさらに含む。
コンジュゲーション部分
本出願の一態様は、ダイアボディおよび／または標識化剤（例えば、放射性核種）中に取り込まれ得るコンジュゲーション部分を提供する。一部の実施形態では、ダイアボディ剤中に取り込まれたコンジュゲーション部分（例えば、第１のコンジュゲーション部分）は、標識化剤（例えば、放射性核種化合物）中に取り込まれたコンジュゲーション部分（例えば、第２のコンジュゲーション部分）にｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされることが可能である。
一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分のコンジュゲーションは、非共有結合的である。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分のコンジュゲーションは、共有結合的である。
一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および／または第２のコンジュゲーション部分は各々、互いに相補的な核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを介して互いにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は、２つのコンジュゲーション部分間の共有結合を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分または第２のコンジュゲーション部分は、システイン残基、リシン残基またはチロシン残基を含む。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は、システイン残基のカップリングに基づいて（例えば、ジスルフィド結合を介して）コンジュゲートされる。
一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は、抗体－薬物コンジュゲートに基づいてコンジュゲートされる。
クリックケミストリー
一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は各々、クリックケミストリー対のメンバーを含み、クリックケミストリーを介して互いにコンジュゲートされる。本明細書に記載されるクリックケミストリー対は、クリックケミストリーを介して互いに排他的に反応することが可能な２つの化学的部分である。
一部の実施形態では、クリックケミストリー対は、アジド－アルキン対、アルキン－ニトロン対、アルケンおよびテトラゾール対、ならびにイソニトリル（例えば、イソシアニド）およびテトラジン対からなる群より選択される。
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、アジド－アルキンＨｕｉｓｇｅｎ環化付加に基づく。一部の実施形態では、アジド－アルキンＨｕｉｓｇｅｎ環化付加は、銅で触媒される。一部の実施形態では、アジド－アルキンＨｕｉｓｇｅｎ環化付加は、銅を含まない。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、アルキニル基の環式誘導体を含む。一部の実施形態では、アルキニル基の環式誘導体は、シクロオクチン、二フッ素化シクロオクチンおよびジベンゾシクロオクチンから選択される。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、アジドの歪み促進型Ｈｕｉｓｇｅｎ環化付加に基づく。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、歪みアルケンの反応に基づく。
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ－Ｂｅｒｔｏｚｚｉライゲーションに基づき、このとき、クリックケミストリーには、アジドとホスフィンとの間のカップリング反応が関与する。
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環化付加に基づき、このとき、クリックケミストリーには、歪みアルケンとテトラジンとの間のカップリング反応が関与する。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）もしくはテトラジン（Ｔｚ）を含むまたはトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）もしくはテトラジン（Ｔｚ）である。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分は、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）を含むまたはトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）であり、第２のコンジュゲーション部分は、テトラジン（Ｔｚ）を含むまたはテトラジン（Ｔｚ）である。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分は、Ｔｚを含むまたはＴｚであり、第２のコンジュゲーション部分は、ＴＣＯを含むまたはＴＣＯである。一部の実施形態では、Ｔｚは、６－メチル置換されたテトラジン（６－Ｍｅテトラジン）である。一部の実施形態では、Ｔｚは、６－水素置換されたテトラジン（６－Ｈテトラジン）である。
一部の実施形態では、コンジュゲーション部分（例えば、テトラジン）は、スペーサーをさらに含む。一部の実施形態では、スペーサーは、コンジュゲーション部分と抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディとの間にある。一部の実施形態では、スペーサーは、コンジュゲーション部分と標識化剤との間にある。一部の実施形態では、スペーサーは、アルキルスペーサーである。一部の実施形態では、スペーサーは、ＰＥＧスペーサーである。一部の実施形態では、ＰＥＧスペーサーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のエチレングリコール単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧスペーサーは、約１～２０、５～１５、８～１２または約１０個のエチレングリコール単位を含む。
ＩＶ．イメージングおよび処置の方法
本出願の一態様は、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布および／または発現レベルを決定する方法を提供する。
一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載されるダイアボディのうちいずれか１つ）を含むイメージング剤を投与するステップ；および（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、組織からイメージング剤によって放射されるシグナルに基づいて、個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを放射性核種で標識することによって、イメージング剤を調製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、コンピュータ断層撮影イメージング、磁気共鳴イメージング、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングをさらに含む。一部の実施形態では、イメージング剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経口投与される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間に実施される。一部の実施形態では、この方法は、一定期間にわたって個体をイメージングするステップを含む。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、１，４，７－トリアザシクロノナン－ｌ，４，７－トリス酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。
一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；および（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップを含み、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；および（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップを含み、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；および（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップを含み、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、この方法は、組織からイメージング剤によって放射されるシグナルに基づいて、個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを放射性核種で標識することによって、イメージング剤を調製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、コンピュータ断層撮影イメージング、磁気共鳴イメージング、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングをさらに含む。一部の実施形態では、イメージング剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経口投与される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間に実施される。一部の実施形態では、この方法は、一定期間にわたって個体をイメージングするステップを含む。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、ヒト化される。
本明細書に記載される方法は、個体におけるまたは個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するために使用され得る。この方法は、個体の１つまたは複数の組織または臓器におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルについての定性的または定量的情報もまた提供し得る。さらに、本明細書に記載される方法は、例えば、個体へのイメージング剤の投与後の異なる時点において、イメージング結果の複数のセットを提供することによって、一定期間にわたって個体をイメージングすることを可能にし得る。一部の実施形態では、イメージングは、約１０分間～約２４時間（例えば、約１０分間～１時間、１時間～２時間、２時間～４時間、４時間～８時間、８時間～１２時間、１２時間～２４時間、１時間～４時間または１時間～８時間のうちいずれか１つ）の間の期間にわたって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの回数実施される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間、例えば、約１０分後～１時間後、１時間後～２時間後、２時間後～４時間後、４時間後～８時間後、８時間後～１２時間後、１２時間後～２４時間後、１時間後～４時間後または１時間後～８時間後のうちいずれか１つの間に実施される。
標識されたポリペプチドを使用してイメージングする方法は、当該分野で周知であり、任意のかかる公知の方法が、本明細書に開示されるイメージング剤と共に使用され得る。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ （ｅｄ．）， Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９８８）， Ｃｈａｓｅ， ”Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ”、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ６２４－６５２ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， １９９０）およびＢｒｏｗｎ， ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２２７－４９， Ｐｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３）を参照のこと。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、例えば、約５１１ｋｅＶのエネルギーを有する陽電子放射放射性核種（ＰＥＴ同位体）、例えば、１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕおよび１２４Ｉを使用する。かかる放射性核種は、周知のＰＥＴスキャニング技法によってイメージングされ得る。これにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９５３，５６７号；同第９，８８４，１３１号および国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６１４９１８８ Ａ１、ならびにＫｉｍ ＨＹ． ｅｔ ａｌ．， （２０１８） ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（３）： ｅ０１９２８２１もまた参照のこと。
一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、ＳＰＥＣまたはＰＥＴイメージングは、イメージング剤からのシグナルに基づいても基づかなくてもよい１つまたは複数の他の非侵襲性イメージング方法と組み合わされる。例えば、ＰＥＴは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）イメージング、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングと組み合わされ得る。
本明細書に記載されるイメージング方法は、低い、中程度のまたは高い発現レベルでＰＤ－Ｌ１を検出するために適切である。一部の実施形態では、イメージング方法は、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルおよび分布についての動的情報を提供する。一部の実施形態では、イメージング方法は、検出の他の方法、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）にとっては困難であり得る状況で、ＰＤ－Ｌ１を検出することが可能である。例えば、一部の実施形態では、目的の組織は、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイまたは別のアッセイに基づくと、ＰＤ－Ｌ１について陰性である。ＰＤ－Ｌ１の存在または非存在を検出するために使用され得る分子アッセイには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイ、次世代配列決定（ＮＧＳ）アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイおよびＥＬＩＳＡが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、目的の組織は、低い発現レベルのＰＤ－Ｌ１を有する。一部の実施形態では、目的の組織は、免疫細胞の浸潤の際にのみＰＤ－Ｌ１を発現する。
イメージング剤は、任意の適切な投薬量および投与経路を使用して、個体に投与され得る。投与経路は、適切な様式、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、関節内、腫瘍内による注射もしくは注入、または経口経路での、一定期間にわたる、例えば、単一のまたは複数のボーラスまたは注入による、公知の受容された方法に従う。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。動物実験は、ヒト診断適用のための有効用量の決定のための信頼性のあるガイダンスを提供する。有効用量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｗ． ”Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ｐｐ． ４２－４６によって記された原理に従って実施され得る。
診断および処置
本明細書に記載される方法は、異常な免疫応答に関連する種々の疾患および状態の診断のために、ならびにその処置のためのコンパニオン診断方法として、有用である。一部の実施形態では、疾患または状態は、免疫不全に関連する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。
一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するための方法のうちいずれか１つを使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するステップ；および（ｂ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。
一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ；および（ｃ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、組織からイメージング剤によって放射されるシグナルに基づいて、個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを放射性核種で標識することによって、イメージング剤を調製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、コンピュータ断層撮影イメージング、磁気共鳴イメージング、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングをさらに含む。一部の実施形態では、イメージング剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経口投与される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間に実施される。一部の実施形態では、この方法は、一定期間にわたって個体をイメージングするステップを含む。一部の実施形態では、放射性核種は、６６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。
一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ；および（ｃ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含み；抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ；および（ｃ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含み；抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ；および（ｃ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含み；抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨは各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬは各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃは、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃは、第２のジスルフィド結合を形成する。
一部の実施形態では、この方法は、組織からイメージング剤によって放射されるシグナルに基づいて、個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ダイアボディを放射性核種で標識することによって、イメージング剤を調製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、コンピュータ断層撮影イメージング、磁気共鳴イメージング、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングをさらに含む。一部の実施形態では、イメージング剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経口投与される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間に実施される。一部の実施形態では、この方法は、一定期間にわたって個体をイメージングするステップを含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、ヒト化される。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。
本出願の一態様は、ａ）抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載されるダイアボディのいずれか）および第１のコンジュゲーション部分を含む有効量の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤、ならびにｂ）標識（例えば、放射性核種）および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の標識化剤（例えば、放射性核種化合物）を使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布および／または発現レベルを決定する方法であって、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップをさらに含む。
一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、ａ）個体に、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディのいずれか）および第１のコンジュゲーション部分を含む有効量の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を投与するステップ；ｂ）個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を引き続いて投与するステップであって、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、ステップ；ならびにｃ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、個体に、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を投与するステップを含み、個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物が投与され、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、方法が提供される。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤が投与された個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を投与するステップを含み、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、ａ）個体に、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ剤を投与するステップ；ｂ）個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を引き続いて投与するステップであって、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、ステップ；ならびにｃ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬは、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨは、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬは、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分は各々、クリックケミストリー対のメンバーを含み、クリックケミストリーを介して互いにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、第１のコンジュゲーション部分は、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）であり、第２のコンジュゲーション部分は、テトラジン（Ｔｚ）である、または第１のコンジュゲーション部分は、Ｔｚであり、第２のコンジュゲーション部分は、ＴＣＯである。一部の実施形態では、放射性核種化合物は、ダイアボディ剤の投与後即座に投与される。一部の実施形態では、放射性核種化合物は、ダイアボディ剤の投与の約１時間後と約１００時間後との間に投与される。一部の実施形態では、放射性核種化合物および／またはダイアボディ剤は、放射性核種をキレートするキレート化合物を含む。一部の実施形態では、キレート化合物は、１，４，７－トリアザシクロノナン－ｌ，４，７－トリス酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、個体は、固形腫瘍、血液学的悪性疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患を有する。
処置
一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、（ａ）本明細書に記載される任意の診断方法を使用して、個体を診断するステップ；および（ｂ）個体がＰＤ－Ｌ１について陽性と診断される場合に、個体に、有効量のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的化する治療剤を投与するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、治療剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１の阻害剤である。一部の実施形態では、治療剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に特異的に結合する放射性標識された分子である。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、膀胱、卵巣または前立腺疾患である。
一部の実施形態では、疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、（ａ）個体に、放射性核種で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；（ｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ；（ｃ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ；および（ｄ）個体がＰＤ－Ｌ１について陽性と診断される場合に、個体に、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１受容体を標的化する有効量の治療剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１の阻害剤、またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１に特異的に結合する放射性標識された分子）を投与するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、組織からイメージング剤によって放射されるシグナルに基づいて、個体中の目的の組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ＰＤ－Ｌ１を放射性核種で標識することによって、イメージング剤を調製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを含む。一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法は、コンピュータ断層撮影イメージング、磁気共鳴イメージング、化学発光イメージングまたは電気化学発光イメージングをさらに含む。一部の実施形態では、イメージング剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経口投与される。一部の実施形態では、イメージングは、イメージング剤の投与の約１０分後～約２４時間後の間に実施される。一部の実施形態では、この方法は、一定期間にわたって個体をイメージングするステップを含む。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、ダイアボディは、放射性核種をキレートするキレート化合物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはサル）由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応する。一部の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患である。
一部の実施形態では、個体は、がんを有する。がんは、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫）を含み得、または固形腫瘍を含み得る。本明細書に記載される方法を使用して診断され得る例示的ながんには、癌腫、芽腫および肉腫、ならびにある特定の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫および黒色腫が含まれるがこれらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。本明細書で議論される固形または血液学的がんには、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮滑膜肉腫（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓａｃｒｏｎｏｍａｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌および黒色腫が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書に記載される方法は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）ステージ分類群に従う、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む全てのステージの固形または血液学的がんに適用可能である。一部の実施形態では、固形または血液学的がんは、早期がん、非転移性がん、原発性がん、進行がん、局所進行がん、転移性がん、または寛解状態のがんである。
一部の実施形態では、個体は、血液学的がんを有する。本明細書に記載される方法を使用して診断され得る例示的な血液学的がんには、白血病、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性非リンパ芽球性白血病（ＡＮＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫が含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、個体は、固形腫瘍を有する。本明細書に記載される方法を使用して診断され得る例示的な固形腫瘍には、結腸腫瘍、黒色腫、腎臓腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍および膵腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
がん処置は、例えば、腫瘍退縮、腫瘍重量もしくはサイズ収縮、進行までの時間、生存の持続時間、無進行生存、全奏効率、応答の持続時間、生活の質、タンパク質発現および／または活性によって評価され得る。例えば、放射線イメージングを介した応答の測定を含む、治療の有効性を決定するためのアプローチが使用され得る。
一部の実施形態では、個体は、感染性疾患を有する。感染は、ウイルス、細菌、原生生物または寄生生物によって引き起こされ得る。例示的な病原体には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、アナプラズマ属、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、アスペルギルス属、アストロウイルス科、バベシア属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、ＢＫウイルス、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ボレリア属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ、ブルセラ属、Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ、ブニヤウイルス科、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａおよび他のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、カリシウイルス科、カンピロバクター属、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、ＣＪＤプリオン、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｐ、コロナウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、クリプトスポリジウム属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコッカス属、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、エールリヒア属、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、エンテロコッカス属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１およびＯ１０４：Ｈ４、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａおよびＦａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、．フゾバクテリウム属、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｋｕｒｕプリオン、ラッサウイルス、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、リーシュマニア属、レプトスピラ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｓｐｐ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ属、プラスモディウム属、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、リケッチア属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ属、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、ＳＡＲＳコロナウイルス、住血吸虫属、赤痢菌属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、ブドウ球菌属、ブドウ球菌属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、テニア属、Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓまたはＴｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡または小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、黄熱病ウイルス、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓならびにＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、個体は、自己免疫性疾患を有する。例示的な自己免疫性疾患には、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症および進行性全身性強皮症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎および顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人発症スチル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、線維筋痛症候群、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎および自己免疫性膵炎）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、橋本甲状腺炎、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎機能不全）、Ｉ型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚疾患、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、再発性胎児喪失および炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）が含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、個体は、異常な免疫応答に関連する代謝疾患を有する。例示的な代謝疾患には、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスが含まれるがこれらに限定されない。
Ｖ．調製の方法
イメージング剤を調製する方法
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法が提供される。本明細書に記載されるイメージング剤は、以下に概して記載され、実施例でより具体的に記載されるいくつかのプロセスによって調製され得る。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、ａ）キレート化合物を、本明細書に記載されるダイアボディにコンジュゲートして、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；ｂ）放射性核種を、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、キレート化合物は、ダイアボディ部分のリシンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、この方法は、キレート化合物および／または放射性核種からイメージング剤を単離するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、（ａ）キレート化合物を、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（例えば、本明細書に記載されるダイアボディのいずれか）にコンジュゲートして、ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；および（ｂ）放射性核種を、ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、この方法は、ダイアボディを、キレート化合物と共に３７℃でインキュベートするステップを含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも約２０分間、４０分間または６０分間持続する。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、キレート化合物は、ダイアボディのリシンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、この方法は、キレート化合物および／または放射性核種からイメージング剤を単離するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、（ａ）キレート化合物を放射性核種と接触させるステップ；（ｂ）放射性核種をキレートするキレート化合物を、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディのうちいずれか１つにコンジュゲートし、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、キレート化合物は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９Ｆ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、８６Ｙ、８８Ｙおよび４５Ｔｉからなる群より選択される。一部の実施形態では、放射性核種は、６８Ｇａである。一部の実施形態では、キレート化合物は、ダイアボディのリシンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、この方法は、キレート化合物および／または放射性核種からイメージング剤を単離するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、（ａ）本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディをｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡにコンジュゲートして、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；（ｂ）６８Ｇａを、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、ダイアボディを、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡと共に３７℃でインキュベートするステップを含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも約２０分間、４０分間または６０分間持続する。一部の実施形態では、ダイアボディコンジュゲートは、ダイアボディおよびｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡの混合物をカラム（例えば、ＮＡＰ－５カラム）に通過させることによって、単離される。一部の実施形態では、イメージング剤は、６８Ｇａとダイアボディコンジュゲートとの混合物をカラム（例えば、ＮＡＰ－５カラム）に通過させることによって、単離される。
ダイアボディの発現および産生
本明細書に記載されるダイアボディは、以下および実施例に記載されるものを含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを産生する方法であって、ａ）本明細書に記載される単離された宿主細胞を、ダイアボディを発現するのに有効な条件下で培養するステップ；およびｂ）宿主細胞から、発現されたダイアボディを得るステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
ダイアボディをコードする核酸分子
本出願は、本明細書に記載されるダイアボディまたはダイアボディの一部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子をさらに提供する。一部の実施形態では、核酸分子は、第１または第２のポリペプチドの重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるダイアボディの第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の核酸分子は、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子は、同じダイアボディの第２のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列（例えば、配列番号３５のシグナル配列）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、タグ（例えば、Ｈｉｓ－タグ）をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４４、４５、４８～５１のうちいずれか１つの核酸配列、または配列番号２２～２４のうちいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
核酸分子は、当該分野で従来の組換えＤＮＡ技法を使用して構築され得る。一部の実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適切な発現ベクターである。
ベクター
本明細書に記載されるダイアボディ（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本明細書に記載されるダイアボディの一部分（例えば、ダイアボディの第１または第２のポリペプチドの重鎖可変領域または軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。かかるベクターには、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ベクターは、ダイアボディの第１または第２のポリペプチドの重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、ダイアボディの第１または第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＨＯもしくはＣＨＯ由来細胞、またはＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なかかるベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：８８０－８８９ （２００４）に記載されている。
宿主細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディは、原核生物細胞、例えば、細菌細胞において；または真核生物細胞、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞において、発現され得る。かかる発現は、例えば、当該分野で公知の手順に従って、実施され得る。ポリペプチドを発現するために使用され得る例示的な真核生物細胞には、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４．Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞およびＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；ならびにＮＳＯ細胞が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディは、酵母において発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号Ａ１を参照のこと。一部の実施形態では、特定の真核生物宿主細胞が、ダイアボディの第１および／または第２のポリペプチドに対する所望の翻訳後改変を行うその能力に基づいて選択される。例えば、一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞において産生された同じポリペプチドよりも高いレベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。
所望の宿主細胞中への１つまたは複数の核酸の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染などが含まれるがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞において一過的にまたは安定にトランスフェクトされ得る。
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞もまた提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することが可能な任意の宿主細胞が、目的のダイアボディ、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離することを目的として使用され得る。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が含まれるがこれらに限定されない。ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２もまた参照のこと。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
一部の実施形態では、ダイアボディは、無細胞系において産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４９８： ２２９－４４ （２００９）；Ｓｐｉｒｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２： ５３８－４５ （２００４）；Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｄｖ． ２１： ６９５－７１３ （２００３）に記載されている。
ダイアボディの精製
抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディは、当該分野で公知の任意の適切な方法によって精製され得る。かかる方法には、親和性マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が含まれるがこれらに限定されない。例示的な親和性精製方法には、Ｈｉｓ－タグ付きタンパク質精製が含まれるがこれに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムは、ダイアボディを精製するために適切であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィー）もまた、ダイアボディを精製するために適切であり得る。混合モードのクロマトグラフィー（例えば、逆相／アニオン交換、逆相／カチオン交換、親水性相互作用／アニオン交換、親水性相互作用／カチオン交換など）もまた、ダイアボディを精製するために適切であり得る。
ＶＩ．ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、宿主細胞および培養培地
ポリヌクレオチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディのうちいずれか１つまたはそれらの一部分をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちいずれか１つを使用して調製されたポリヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のうちいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちいずれか１つ）の配列同一性を有する核酸配列を含む。
核酸構築物
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのうちいずれか１つを含む核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製された核酸構築物が提供される。
一部の実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子に対応し、ここで、プロモーターは、その遺伝子についての野生型プロモーターである。
ベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の核酸構築物を含むベクターが提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製されたベクターが提供される。
一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、Ｓ因子、レトロエレメント、レトロウイルス、ウイルス、人工染色体（例えば、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはＭＡＣ）、ミニ染色体および染色体からなる群より選択される。
宿主細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のポリペプチド、核酸構築物および／またはベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製されたベクターが提供される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、発酵条件下で本明細書に記載される任意の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを産生することが可能である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、原核生物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
培養培地
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のダイアボディ、ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、および／または宿主細胞を含む培養培地が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製された培養培地が提供される。
一部の実施形態では、培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび／またはチミジンを含む（例えば、ＨＡＴ培地）。一部の実施形態では、培地は、血清を含まない。一部の実施形態では、培地は、血清を含む。一部の実施形態では、培地は、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地である。
ＶＩＩ．組成物、キットおよび製造物品
本明細書に記載されるダイアボディおよび／もしくは標識化剤（例えば、放射性核種化合物）のうちいずれか１つを含む組成物（例えば、製剤）、ダイアボディのうちいずれか１つをコードする核酸、ダイアボディのうちいずれか１つをコードする核酸を含むベクター、または核酸もしくはベクターを含む宿主細胞もまた、本明細書で提供される。
本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよび／または標識化剤（例えば、放射性核種化合物）の適切な製剤は、所望の程度の純度を有する抗体剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体剤）および／または標識化剤（例えば、放射性核種化合物）を、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態の、必要に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０））と混合することによって得られ得る。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。皮下投与のために適合された凍結乾燥された製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されている。かかる凍結乾燥された製剤は、適切な希釈剤によって、高いタンパク質濃度になるように再構成され得、再構成された製剤は、本明細書でイメージング、診断または処置される個体に、皮下投与され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって、容易に達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるダイアボディのいずれかおよびキレート剤を含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、標識化剤（例えば、放射性核種）をさらに含む。
本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディもしくはダイアボディ剤のうちいずれか１つおよび／または標識化剤（例えば、放射性核種化合物）を含むキットもまた提供される。キットは、本明細書に記載されるイメージング、診断および処置の方法のいずれかのために有用であり得る。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ、およびコンジュゲーション部分（例えば、ＴＣＯまたはＴｚ）、を含むキットが提供される。
一部の実施形態では、標識（例えば、放射性核種、例えば、６８Ｇａ）を含む標識化剤、およびコンジュゲーション部分（例えば、ＴＣＯまたはＴｚ）、を含むキットが提供される。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、放射性核種をキレートするキレート剤（例えば、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡまたはそれらの誘導体）をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、ダイアボディもしくはダイアボディ剤および／または標識化剤を送達することが可能なデバイスをさらに含む。非経口送達などの適用のためのデバイスの１つの型は、対象の身体中に組成物を注射するために使用されるシリンジである。吸入デバイスもまた、ある特定の適用のために使用され得る。
一部の実施形態では、キットは、疾患または状態、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫性疾患または代謝疾患を処置するための治療剤をさらに含む。一部の実施形態では、治療剤は、ＰＤ－Ｌ１またはその受容体（例えば、ＰＤ－１）の阻害剤である。一部の実施形態では、治療剤は、ＰＤ－Ｌ１またはその受容体（例えば、ＰＤ－１）に特異的に結合する放射性標識された分子である。
本出願のキットは、適切な包装材料（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）中にある。適切な包装材料には、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装材料（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれるがこれらに限定されない。キットは、必要に応じて、さらなる成分、例えば、緩衝液および説明情報を提供し得る。
したがって、本出願は、製造物品もまた提供する。製造物品は、容器、および容器上のまたは容器に関連する標識または添付文書を含み得る。適切な容器には、バイアル（例えば、密封バイアル）、ボトル、ジャー、可撓性包装材料などが含まれる。一般に、容器は、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。標識または添付文書は、組成物が、個体における特定の状態をイメージング、診断または処置するために使用されることを示す。標識または添付文書は、個体に組成物を投与するためおよび個体をイメージングするための指示をさらに含む。標識は、再構成および／または使用のための指示を示し得る。組成物を保持している容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする、複数回使用バイアルであり得る。添付文書は、そのような診断用製品の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む診断用製品の市販の包装中に通例含まれる指示を指す。さらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
キットまたは製造物品は、病院の薬局および調合薬局などの薬局での貯蔵および使用のために十分な量で包装された、複数の単位用量の組成物および使用のための指示を含み得る。
当業者は、いくつかの実施形態が、本発明の範囲および精神の範囲内で可能であることを認識するであろう。本発明は、ここに、以下の非限定的な例を参照して、より詳細に記載される。以下の例は、本発明をさらに例示するが、当然、その範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
例示的な実施形態
１．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、またはＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、またはＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、ダイアボディ。
２．ａ）ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載のダイアボディ。
３．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｂ）第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬ、ｃ）第１のポリペプチドのＶＨおよび第２のポリペプチドのＶＬ、またはｄ）第２のポリペプチドのＶＨおよび第１のポリペプチドのＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、ａ）ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディ。
４．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびにｂ）ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、ダイアボディ。
５．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、共有結合を介して連結される、実施形態１～４のいずれか１つに記載のダイアボディ。
６．共有結合が、第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の共有結合を含む、および／または共有結合が、第１のポリペプチドのＶＬと第２のポリペプチドのＶＨとの間にある、実施形態５に記載のダイアボディ。
７．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの共有結合を介して連結される、実施形態１～６のいずれか１つに記載のダイアボディ。
８．２つまたはそれよりも多くの共有結合が、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１の共有結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２の共有結合を含む、実施形態７に記載のダイアボディ。
９．共有結合が、ジスルフィド結合を含む、実施形態５～８のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１０．２つまたはそれよりも多くの共有結合が、少なくとも２つのジスルフィド結合を含む、実施形態７に記載のダイアボディ。
１１．少なくとも２つのジスルフィド結合が、ａ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第１のジスルフィド結合；およびｂ）第１のポリペプチドのＶＨと第２のポリペプチドのＶＬとの間の第２のジスルフィド結合を含む、実施形態１０に記載のダイアボディ。
１２．ジスルフィド結合、または少なくとも２つのジスルフィド結合のうち１つが、ａ）第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される、実施形態９～１１のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１３．第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＨが、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｇ４４Ｃ変異またはＱ１０５Ｃ変異を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１４．第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチド中のＶＬが、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｑ１００Ｃ変異またはＡ４３Ｃ変異を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１５．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨが各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬが各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃが、第１のジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドのＶＬ中のＱ１００Ｃおよび第２のポリペプチドのＶＨ中のＧ４４Ｃが、第２のジスルフィド結合を形成する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１６．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＨが各々、Ｑ１０５Ｃ変異を含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のＶＬが各々、Ａ４３Ｃ変異を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１７．第１のポリペプチドのＶＨおよびＶＬが、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１８．第２のポリペプチドのＶＨおよびＶＬが、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のダイアボディ。
１９．ペプチドリンカーが、約１～３０アミノ酸の長さを有する、実施形態１７または実施形態１８に記載のダイアボディ。
２０．ペプチドリンカーが、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２１．第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２２．シグナルペプチドが、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載のダイアボディ。
２３．ＶＨが、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２４．ＶＬが、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２５．第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、タグをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２６．タグが、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドのＣ末端に融合される、実施形態２５に記載のダイアボディ。
２７．タグが、Ｈｉｓ－タグを含む、実施形態２５または実施形態２６に記載のダイアボディ。
２８．タグが、第２のリンカーを介してポリペプチドに融合される、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のダイアボディ。
２９．第２のリンカーが、約４～１５アミノ酸の長さを有する、実施形態２８に記載のダイアボディ。
３０．第２のリンカーが、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む、実施形態２８または実施形態２９に記載のダイアボディ。
３１．第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、配列番号３６～４３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のダイアボディ。
３２．実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３３．実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディをコードするポリヌクレオチド。
３４．実施形態３３に記載のポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、ポリヌクレオチドと作動するように接続したプロモーターをさらに含む、核酸構築物。
３５．実施形態３４に記載の核酸構築物を含むベクター。
３６．実施形態３３に記載のポリヌクレオチド、実施形態３４に記載の核酸構築物または実施形態３５に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
３７．実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディ、実施形態３３に記載のポリヌクレオチド、実施形態３４に記載の核酸構築物、実施形態３５に記載のベクターまたは実施形態３６に記載の宿主細胞を含む、培養培地。
３８．抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを産生する方法であって、ａ）実施形態３６に記載の単離された宿主細胞を、ダイアボディを発現するのに有効な条件下で培養するステップ；およびｂ）宿主細胞から、発現されたダイアボディを得るステップ、を含む、方法。
３９．個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、ａ）個体に、放射性核種で標識された実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；およびｂ）個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む、方法。
４０．疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、ａ）実施形態３９に記載の方法を使用して、個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するステップ；およびｂ）イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、またはイメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、を含む、方法。
４１．疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、ａ）実施形態４０に記載の方法を使用して、個体を診断するステップ；およびｂ）個体がＰＤ－Ｌ１について陽性と診断される場合に、個体に、有効量のＰＤ－Ｌ１を標的化する治療剤を投与するステップ、を含む、方法。
４２．疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、個体に、有効量の、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディまたは実施形態３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
４３．放射性核種で標識された実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディを含むイメージング剤。
４４．ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、ａ）キレート化合物を、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディにコンジュゲートして、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；ｂ）放射性核種を、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、イメージング剤を提供するステップ、を含む、方法。
４５．ａ）実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディ；ｂ）キレート剤、を含む、キット。
４６．放射性核種をさらに含む、実施形態４５に記載のキット。
４７．個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、個体に、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のダイアボディおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量のダイアボディ剤を投与するステップ；個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を引き続いて投与するステップであって、第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、ステップ；ならびに個体中のイメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、を含む、方法。
４８．第１のコンジュゲーション部分および第２のコンジュゲーション部分が各々、クリックケミストリー対のメンバーを含み、クリックケミストリーを介して互いにコンジュゲートされる、実施形態４７に記載の方法。
以下の実施例は、純粋に本発明の例示を意図し、したがって、本発明を限定すると決して解釈すべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
（実施例１）
抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの生成
抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖのための構築物設計の概略図は、図１に示される。具体的には、ヒト化抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体由来のＶＨおよびＶＬ抗原結合ドメインならびにその間のペプチドリンカーを含む断片を、人工的に合成した。図１中の構築物Ａを参照のこと。さらに、単鎖ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｓｃ－ｄｓＦｖ）もまた、ＶＨ４４／ＶＬ１００またはＶＨ１０５／ＶＬ４３（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う）において単一の変異を導入することによって構築した。図１中の構築物Ｂおよび構築物Ｃを参照のこと。３つの構築物のＶＨおよびＶＬ配列については、表３を参照のこと。ＶＨおよびＶＬを含む断片は、それぞれ５’および３’末端における制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識部位、ならびに短いペプチドリンカーを介してＣ末端に融合されたＨｉｓタグ配列もまた含んだ。次いで、融合された重鎖および軽鎖を、ＰＸＣ１７．４発現ベクターの対応するＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識部位中にクローニングした。
表３．抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの配列
Figure 2022518478000004
Figure 2022518478000005
（実施例２）
抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの構築および発現
ダイアボディ構築に対応するモノマー形態の模式図を図２に示した。具体的には、ＶＨ（Ｇ４４Ｃ）およびＶＬ（Ｑ１００Ｃ）遺伝子断片を、図１中の構築物Ｂから、ＰＣＲによって生成した。ＶＨ（Ｑ１０５Ｃ）およびＶＬ（Ａ４３Ｃ）遺伝子断片を、図１中の構築物Ｃから、ＰＣＲによって生成した。ＶＨ（Ｇ４４Ｃ）およびＶＬ（Ｑ１００Ｃ）遺伝子断片を、重複ＰＣＲによって一緒に融合させ、Ｈ４４／Ｌ１００と命名した；ＶＨ（Ｑ１０５Ｃ）およびＶＬ（Ａ４３Ｃ）遺伝子断片を、重複ＰＣＲによって一緒に融合させ、Ｈ１０５／Ｌ４３と命名した。ＰＣＲおよび重複ＰＣＲの間に使用したＰＣＲプライマーについては、表４を参照のこと。
表４． ＰＣＲプライマー
Figure 2022518478000006
Ｈ４４／Ｌ１００およびＨ１０５／Ｌ４３ ＰＣＲ産物を、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化した。消化された産物を、ＰＸＣ１７．４発現ベクター中に挿入した。２つの産物の発現を、一過的トランスフェクションの５日後に、ＣＨＯ細胞において評価した。細胞培養上清を回収し、消化されたＨ４４／Ｌ１００またはＨ１０５／Ｌ４３ ＰＣＲ産物の発現から生成されたタンパク質産物を、ＣａｐｔｏＬ親和性カラムによって精製した。発現結果を表５に示した。Ｈ４４／Ｌ１００についての精製されたタンパク質を、ダイアボディ形態およびモノマー形態の比率について分析した。総タンパク質のうち約８５％は、ダイアボディ形態にある。ダイアボディ形態を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフによって、１００％の純度で精製した。
表５
Figure 2022518478000007
（実施例３）
抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディおよび抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖのＰＤ－Ｌ１結合親和性
実施例２に例示したように生成した抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（Ｈ４４／Ｌ１００）、図１中の構築物Ａから生成した抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、および抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体（同じＣＤＲを有する）を、それらのＰＤ－Ｌ１結合親和性について試験した。表６に示されるように、ダイアボディ形態は、ｓｃＦｖ形態よりも、ＰＤ－Ｌ１に対する予想外に高い結合親和性を有する。
表６
Figure 2022518478000008
（実施例４）
抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖおよびＮＯＴＡのカップリング、ならびに６８ＧａによるＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの標識化
ＮＯＴＡを、図１中の構築物Ａから生成した抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖとカップリングさせた。カップリング後、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを、同位体６８Ｇａで標識した。具体的には、４００μＬの総体積の抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖを、８．７のｐＨを有する０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３－Ｎａ２ＣＯ３緩衝液１００μＬ中に添加し、その後、１６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去して、１００μＬの最終体積を達成した。上記ステップを一回よりも多く反復し、最終溶液を、１．５ｍＬ遠心分離管に移した。次いで、２．７５μＬの体積のｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡを、遠心分離管に添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートした。
ｓｃＦｖ／ＮＯＴＡ溶液を、ＰＢＳで事前に平衡したＮＡＰ－５カラムに添加した。次いで、カラムを、０．４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた。溶出液を、０．０５ｍＬの体積を有する部分へとアリコートにし、－２０℃で貯蔵した。
６８Ｇａは、２．４ｍＣｉ／１ｍＬ ＨＣｌの最終濃度で、０．０５Ｎ ＨＣｌに溶出された。次いで、９３μＬの体積の１．２５Ｍ酢酸ナトリウムを添加して、６８Ｇａ溶液のｐＨを４．０に調整した。５０μＬの体積のＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を、３５０ｕＬ ６８Ｇａ溶液と混合し、その後、２５℃で１０分間インキュベートした。標識化率を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを展開溶媒として使用する薄層クロマトグラフィー紙上での展開によって決定した。ＮＡＰ－５カラムを、ＰＢＳで平衡化し、次いで、４００ｕＬの体積の標識された産物を添加した。濾過後、４００ｕＬ ＰＢＳを添加した。濾液は収集しなかった。次いで、４００ｕＬ ＰＢＳを添加し、濾液を収集した。産物の放射化学的純度を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを展開溶媒として使用するインスタント薄層クロマトグラフィー－シリコーンゲル（ＩＴＬＣ－ＳＧ）上での展開によって決定した。起点は、産物に対応し、展開溶媒フロントは、遊離６８Ｇａに対応した。
図３Ａ～３Ｂに示されるように、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの標識化率は、６６．９％であった。精製後、放射化学的純度は、９５．９％であった。
（実施例５）
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖの細胞結合
ＭＣ３８およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、トリプシンで消化し、次いで、培養し、計数した。各型の細胞を、１ウェル当たり２．５×１０５細胞／０．５ｍＬで、２４ウェルプレート中にプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖを、３６ｎＭの最終濃度で各型の細胞に添加し、細胞を３７℃で０．５時間維持した。引き続いて、氷冷ＰＢＳを添加して、細胞を３回洗浄した。次いで、細胞を、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解させた。細胞溶解物を収集し、計数した。データ分析およびプロッティングを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞またはＭＣ３８細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖの結合を、図４Ａに示した。
別々の実験において、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、トリプシンで消化し、次いで、培養し、計数した。細胞を、１ウェル当たり２．５×１０５細胞／０．５ｍＬで、２４ウェルプレート中にプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖを、１．８μＭの最終濃度の未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの存在下または非存在下で、３６ｎＭの最終濃度で細胞に添加した。次いで、細胞を３７℃で０．５時間維持した。引き続いて、氷冷ＰＢＳを添加して、細胞を３回洗浄した。次いで、細胞を、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解させた。細胞溶解物を収集し、計数した。データ分析およびプロッティングを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。図４Ｂに示されるように、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ＳｃＦｖの結合は、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖによって有意に遮断された。
（実施例６）
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖのｉｎ ｖｉｖｏイメージング
約６～８週齢の合計１０匹の雄性マウスに、ＭＣ３８細胞およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を同時に投与した。具体的には、４０万個のＭＣ３８細胞を、マウスの左側腹中に注射し、４０万個のＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、右側腹中に注射した。注射の７日後、腫瘍は、直径約０．５ｃｍのサイズまで成長した。次いで、マウスをｉｎ ｖｉｖｏイメージングに使用した。５匹のマウスに、尾静脈を介して４０μＣｉ ６８Ｇａ－抗抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖを投与した。他の５匹のマウスに、１：５０のモル比で、４０μＣｉ ６８Ｇａ－抗抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖおよび未標識の非放射性抗ＰＤ－Ｌ１抗体を同時発生的に投与した。マウスを、注射の１時間後および２時間後にイメージングした。
６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖのみの注射後、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１腫瘍（右側腹）は、強く染色された。ＭＣ３８腫瘍（左側腹）は、腎臓における最も高い摂取を伴って、弱く染色された。注射の１２０分後のイメージは、注射の６０分後のイメージよりも、増加した感度を有した。図５Ａを参照のこと。図５Ｂに示されるように、５０倍過剰の未標識の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖの両方を注射したマウスにおいて、Ｂ７－Ｈ１陽性腫瘍のイメージングを遮断した。図５Ｂを参照のこと。
（実施例７）
抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディおよびＮＯＴＡのカップリング、ならびにＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの６８Ｇａ標識化
ＮＯＴＡを、実施例２に例示したようにＨ４４／Ｌ１００産物から産生した抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディとカップリングした。カップリング後、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを、同位体６８Ｇａで標識した。具体的には、４００μＬ抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを、８．７のｐＨを有する０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３－Ｎａ２ＣＯ３緩衝液１００μＬ中に添加し、その後、１６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、１００μＬに濃縮した。次いで、これを、１６０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離のために、０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３－Ｎａ２ＣＯ３緩衝液４００μＬ中に添加する。上清を除去して、１００μＬの最終体積を達成した。最終溶液を、１．５ｍＬ遠心分離管に移した。次いで、２．７５μＬの体積のｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡを、遠心分離管に添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートした。
ダイアボディ／ＮＯＴＡ溶液を、ＰＢＳで事前に平衡したＮＡＰ－５カラムに添加した。次いで、カラムを、０．４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた。溶出液を、０．０５ｍＬの体積を有する部分へとアリコートにし、－２０℃で貯蔵した。
６８Ｇａは、２．４ｍＣｉ／１ｍＬ ＨＣｌの最終濃度で、０．０５Ｎ ＨＣｌに溶出された。次いで、９３μＬの体積の１．２５Ｍ酢酸ナトリウムを添加して、６８Ｇａ溶液のｐＨを４．０に調整した。５０μＬの体積のＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディ（１．０ｍｇ／ｍｌ）を、３５０ｕＬ ６８Ｇａ溶液と混合し、その後、２５℃で１０分間インキュベートした。標識化率を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを展開溶媒として使用する薄層クロマトグラフィー紙上での展開によって決定した。ＮＡＰ－５カラムを、ＰＢＳで平衡化し、次いで、４００ｕＬの体積の標識された産物を添加した。濾過後、４００μＬ ＰＢＳを添加した。濾液は収集しなかった。次いで、４００μＬ ＰＢＳを添加し、濾液を収集した。産物の放射化学的純度を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを展開溶媒として使用するインスタント薄層クロマトグラフィー－シリコーンゲル（ＩＴＬＣ－ＳＧ）上での展開によって決定した。起点は、産物に対応し、展開溶媒フロントは、遊離６８Ｇａに対応した。
図６Ａ～６Ｂに示されるように、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの標識化率は、６２．０％であった。精製後、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの放射化学的純度は、９８．１％であった。
（実施例８）
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディについての細胞結合実験
ＭＣ３８およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、トリプシンで消化し、次いで、培養し、計数した。各型の細胞を、１ウェル当たり２．５×１０５細胞／０．５ｍＬで、２４ウェルプレート中にプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディを、３６ｎＭの最終濃度で各型の細胞に添加し、細胞を３７℃で０．５時間維持した。引き続いて、氷冷ＰＢＳを添加して、細胞を３回洗浄した。次いで、細胞を、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解させた。細胞溶解物を収集し、計数した。データ分析およびプロッティングを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。図７Ａに示されるように、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの結合は、ＭＣ３８細胞へのその結合よりも高かった。
別々の実験において、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、トリプシンで消化し、次いで、培養し、計数した。細胞を、１ウェル当たり２．５×１０５細胞／０．５ｍＬで、２４ウェルプレート中にプレートした。３７℃での一晩のインキュベーション後、６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディを、１．８μＭの最終濃度の未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの存在下または非存在下で、３６ｎＭの最終濃度で細胞に添加した。次いで、細胞を３７℃で０．５時間維持した。引き続いて、氷冷ＰＢＳを添加して、細胞を３回洗浄した。次いで、細胞を、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解させた。細胞溶解物を収集し、計数した。データ分析およびプロッティングを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞への６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの結合は、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディによって有意に遮断された。図７Ｂを参照のこと。
（実施例９）
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディのｉｎ ｖｉｖｏイメージング
約６～８週齢の合計１０匹の雄性マウスに、ＭＣ３８細胞およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を同時に投与した。具体的には、４０万個のＭＣ３８細胞を、マウスの左側腹中に注射し、４０万個のＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１細胞を、右側腹中に注射した。注射の７日後、腫瘍は、直径約０．５ｃｍのサイズまで成長した。次いで、マウスをｉｎ ｖｉｖｏイメージングに使用した。５匹のマウスに、尾静脈を介して４０ｕＣｉ ６８Ｇａ－抗抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディを投与した。他の５匹のマウスに、１：５０のモル比で、４０ｕＣｉ ６８Ｇａ－抗抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディおよび未標識の非放射性抗ＰＤ－Ｌ１抗体を同時発生的に投与した。マウスを、注射の１時間後および２時間後にイメージングした。
６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディのみの注射後、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ１腫瘍（右側腹）は、強く染色された。ＭＣ３８腫瘍（左側腹）は、腎臓における最も高い摂取を伴って、弱く染色された。注射の１２０分後のイメージは、注射の６０分後のイメージよりも、増加した感度を有した。図８Ａを参照のこと。５０倍過剰の未標識の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、未標識の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディの両方を注射したマウスにおいて、Ｂ７Ｈ１陽性腫瘍のイメージングを遮断した。図８Ｂを参照のこと。
（実施例１０）
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖおよび６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディによるイメージングの比較
６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖおよび６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディの注射の１時間後の代表的イメージングの比較は、６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ダイアボディが、より明確なイメージングを伴って、６８Ｇａ－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖよりも良好であったことを示した。図９を参照のこと。これは、より高い肝臓摂取もまた有した。
上の実施例は、６８Ｇａ標識されたダイアボディがＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍をイメージングするために使用され得ることを少なくとも実証した。
配列表
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Figure 2022518478000010
Figure 2022518478000011
Figure 2022518478000012
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Figure 2022518478000014
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Claims (48)

  1. 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
    ａ）前記ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３、または前記ＨＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む；ならびに
    ｂ）前記ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３、または前記ＬＣ－ＣＤＲ中に最大で合計約５アミノ酸の置換を含むそれらのバリアントを含む、
    ダイアボディ。
  2. ａ）前記ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびに
    ｂ）前記ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、
    請求項１に記載のダイアボディ。
  3. 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ａ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記ＶＬ、ｂ）前記第２のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記ＶＬ、ｃ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記第２のポリペプチドの前記ＶＬ、またはｄ）前記第２のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記第１のポリペプチドの前記ＶＬが、第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合ドメインを形成し、
    ａ）前記ＶＨ－２が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ２および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびに
    ｂ）前記ＶＬ－２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＣＤＲ３を含む、
    ダイアボディ。
  4. 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディであって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
    ａ）前記ＶＨが、配列番号２２～２４のいずれかに示される配列を有する第２の重鎖可変領域（ＶＨ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む；ならびに
    ｂ）前記ＶＬが、配列番号２５～２７のいずれかに示される配列を有する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ－２）内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む、
    ダイアボディ。
  5. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、共有結合を介して連結される、請求項１から４のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  6. 前記共有結合が、前記第１のポリペプチドの前記ＶＨと前記第２のポリペプチドの前記ＶＬとの間の共有結合を含む、および／または共有結合が、前記第１のポリペプチドの前記ＶＬと前記第２のポリペプチドの前記ＶＨとの間にある、請求項５に記載のダイアボディ。
  7. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの共有結合を介して連結される、請求項１から６のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  8. 前記２つまたはそれよりも多くの共有結合が、ａ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨと前記第２のポリペプチドの前記ＶＬとの間の第１の共有結合；およびｂ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨと前記第２のポリペプチドの前記ＶＬとの間の第２の共有結合を含む、請求項７に記載のダイアボディ。
  9. 前記共有結合が、ジスルフィド結合を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  10. 前記２つまたはそれよりも多くの共有結合が、少なくとも２つのジスルフィド結合を含む、請求項７に記載のダイアボディ。
  11. 前記少なくとも２つのジスルフィド結合が、ａ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨと前記第２のポリペプチドの前記ＶＬとの間の第１のジスルフィド結合；およびｂ）前記第１のポリペプチドの前記ＶＨと前記第２のポリペプチドの前記ＶＬとの間の第２のジスルフィド結合を含む、請求項１０に記載のダイアボディ。
  12. 前記ジスルフィド結合、または前記少なくとも２つのジスルフィド結合のうち１つが、ａ）前記第１のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基および前記第２のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基、ならびに／またはｂ）前記第１のポリペプチドのＬＣ－ＦＲ４中のシステイン残基および前記第２のポリペプチドのＨＣ－ＦＲ２中のシステイン残基によって形成される、請求項９から１１のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  13. 前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチド中の前記ＶＨが、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｇ４４Ｃ変異またはＱ１０５Ｃ変異を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  14. 前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチド中の前記ＶＬが、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、Ｑ１００Ｃ変異またはＡ４３Ｃ変異を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  15. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中の前記ＶＨが各々、Ｇ４４Ｃ変異を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中の前記ＶＬが各々、Ｑ１００Ｃ変異を含み、前記第１のポリペプチドの前記ＶＨ中の前記Ｇ４４Ｃおよび前記第２のポリペプチドの前記ＶＬ中の前記Ｑ１００Ｃが、第１のジスルフィド結合を形成し、前記第１のポリペプチドの前記ＶＬ中の前記Ｑ１００Ｃおよび前記第２のポリペプチドの前記ＶＨ中の前記Ｇ４４Ｃが、第２のジスルフィド結合を形成する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  16. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中の前記ＶＨが各々、Ｑ１０５Ｃ変異を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中の前記ＶＬが各々、Ａ４３Ｃ変異を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  17. 前記第１のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記ＶＬが、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  18. 前記第２のポリペプチドの前記ＶＨおよび前記ＶＬが、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  19. 前記ペプチドリンカーが、約１～３０アミノ酸の長さを有する、請求項１７または請求項１８に記載のダイアボディ。
  20. 前記ペプチドリンカーが、配列番号２８～３４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  21. 前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  22. 前記シグナルペプチドが、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のダイアボディ。
  23. 前記ＶＨが、配列番号２２～２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  24. 前記ＶＬが、配列番号２５～２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  25. 前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドが、タグをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  26. 前記タグが、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドのＣ末端に融合される、請求項２５に記載のダイアボディ。
  27. 前記タグが、Ｈｉｓ－タグを含む、請求項２５または請求項２６に記載のダイアボディ。
  28. 前記タグが、第２のリンカーを介して前記ポリペプチドに融合される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  29. 前記第２のリンカーが、約４～１５アミノ酸の長さを有する、請求項２８に記載のダイアボディ。
  30. 前記第２のリンカーが、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む、請求項２８または請求項２９に記載のダイアボディ。
  31. 前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドが、配列番号３６～４３のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載のダイアボディ。
  32. 請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  33. 請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディをコードするポリヌクレオチド。
  34. 請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、前記ポリヌクレオチドと作動するように接続したプロモーターをさらに含む、核酸構築物。
  35. 請求項３４に記載の核酸構築物を含むベクター。
  36. 請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の核酸構築物または請求項３５に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
  37. 請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディ、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の核酸構築物、請求項３５に記載のベクターまたは請求項３６に記載の宿主細胞を含む、培養培地。
  38. 抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディを産生する方法であって、
    ａ）請求項３６に記載の単離された宿主細胞を、前記ダイアボディを発現するのに有効な条件下で培養するステップ；および
    ｂ）前記宿主細胞から、発現された前記ダイアボディを得るステップ、
    を含む、方法。
  39. 個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、
    ａ）前記個体に、放射性核種で標識された請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディを含むイメージング剤を投与するステップ；および
    ｂ）前記個体中の前記イメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を用いてイメージングするステップ、
    を含む、方法。
  40. 疾患または状態を有する個体を診断する方法であって、
    ａ）請求項３９に記載の方法を使用して、前記個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定するステップ；および
    ｂ）前記イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出される場合に、前記個体を、ＰＤ－Ｌ１について陽性と診断する、または前記イメージング剤のシグナルが目的の組織において検出されない場合に、前記個体を、ＰＤ－Ｌ１について陰性と診断するステップ、
    を含む、方法。
  41. 疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、
    ａ）請求項４０に記載の方法を使用して、前記個体を診断するステップ；および
    ｂ）前記個体がＰＤ－Ｌ１について陽性と診断される場合に、前記個体に、有効量のＰＤ－Ｌ１を標的化する治療剤を投与するステップ、
    を含む、方法。
  42. 疾患または状態を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、有効量の、請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディまたは請求項３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  43. 放射性核種で標識された請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディを含むイメージング剤。
  44. ＰＤ－Ｌ１を標的化するイメージング剤を調製する方法であって、
    ａ）キレート化合物を、請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディにコンジュゲートして、抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートを提供するステップ；
    ｂ）放射性核種を、前記抗ＰＤ－Ｌ１ダイアボディコンジュゲートと接触させ、それによって、前記イメージング剤を提供するステップ、
    を含む、方法。
  45. ａ）請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディ；
    ｂ）キレート剤
    を含む、キット。
  46. 放射性核種をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
  47. 個体におけるＰＤ－Ｌ１の分布を決定する方法であって、
    （ａ）前記個体に、請求項１から３１のいずれか一項に記載のダイアボディおよび第１のコンジュゲーション部分を含む有効量のダイアボディ剤を投与するステップ；
    （ｂ）前記個体に、放射性核種および第２のコンジュゲーション部分を含む有効量の放射性核種化合物を引き続いて投与するステップであって、前記第１のコンジュゲーション部分および前記第２のコンジュゲーション部分が、互いにｉｎ ｖｉｖｏでコンジュゲートされて、イメージング剤を提供する、ステップ；ならびに
    （ｃ）前記個体中の前記イメージング剤を、非侵襲性イメージング技法を使用してイメージングするステップ、
    を含む、方法。
  48. 前記第１のコンジュゲーション部分および前記第２のコンジュゲーション部分が各々、クリックケミストリー対のメンバーを含み、クリックケミストリーを介して互いにコンジュゲートされる、請求項４７に記載の方法。
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