PT100030B - Processo para a preparacao de composicoes detergentes para a lavagem de roupa com elevada actividade de celulase e compostos de amonio quaternarios - Google Patents

Description

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA TEL: 88851 51 /2/3TELEX: 18355INPI TELEFAX :8753 08

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

Modalidade e n.° (Π)	TD	Data do pedido (22)	Classificação Internacional (51)
01-Nr. 100.030S		1992/01/16

Resumo (continuação)

De acordo com a presente invenção, uma celulase preferida consiste num ccmponente de endoglucanase hanogéneo que é imuno-reactivo com um anticorpo monoclonal obtido a partir de uma celulase 43 KD parcialmente purificada derivada de Humicola insolens DM1800.

A cctnposição da invenção pode encontrar-se sob a forma granular,granular ccmpacta ou líquida.

DSM-5 —MOOREraí2S=^·.

611.276

Case CM39H

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DETERGENTES PARA A LAVAGEM DE ROUPA COM. ELEVADA ACTIVIDADE DE CELULASE E COMPOSTOS DE AMÕNIO QUATERNÁRIOS

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a composições detergentes que possuem melhores propriedades de limpeza e de amaciamento.

Enquadramento Geral da Invenção

Mod. 7) - 20.000 ·«.

A necessidade de composições detergentes que possuam não só boas propriedades de limpeza, mas também boas propriedades de amaciamento dos tecidos e outros benefícios no tratamento dos tecidos é bem conhecida pela técnica .

A Patente de Invenção Europeia EP

026 529 descreve composições detergentes que contém argilas do tipo da esmectíte e certos compostos catiónicOs que possuem melhores propriedades de limpeza e de amaciamento dos tecidos.

A eficiência das enzimas celulósicas _t isto é, de celulose, em termos de limpeza de tecidos e de agentes de redução de sujidade em tecidos foi recolhecida há já algum tempo; as Patentes de Invenção Britânicas GB-A-2 075 028, GB-A-2 095 275 e GB-A-2 094 826 referem-se a composições detergentes com celulase para melhorar as qualidades de limpeza; a Patente de Invenção Britânica GB-A— 1 368 599 refere-se à utilização de celulase para reduzir a sujidade de tecidos que contêm algodão; a Patente de Inven ção Norte-Americana US 4 435 307 explica a utilização de uma enzima celulolítica derivada de Humicola insolens, assim como duma sua fracção designada ACXI, como aditivo deter64.276

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gente que diminui a sujidade.

A Patente de Invenção Europeia EP-A-0 269 168 refere-se a composições detergentes optimizadas que contêm celulase, que são formuladas a um nível de pH alcalino suave e que proporcionam propriedades combinadas de limpeza de tecidos, amaciamento de tecidos e tratamento de tecidos.

A Patente de Invenção Europeia ΞΡ-Β-0 125 122 refere-se a uma composição detergente que combina as propriedades de limpeza e de amaciamento de tecidos, usando uma mistura sinérgica de uma amina terciária de cadeia comprida e de celulase.

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Na Patente de invenção da Organização Mundial da Propriedade Industrial WO 89109259, referem-se preparações à base de celulase úteis para reduzir a sujidade de tecidos que contêm algodão, compreendendo um componente de endoglucanase com elevada actividade de endoase e com afinidade em relação à celulose.

No entanto, a exploração prática das celulases tem si do abandonada, pelo facto de as preparações de celulase, como as descritas nos documentos acima mencionados da técnica anterior, se rem misturas complexas, e apenas uma certa fracção das mesmas ser eficaz no contexto do tratamento dos tecidos; foi assim difícil implementar a produção industrial, a custos de eficiência da celulase na industria de detergentes; e grandes quantidades dessas preparações de celulase precisavam de ser aplicadas a fim de se obter o efeito pretendido sobre os tecidos.

Muitas vezes, os aperfeiçoamentos na preparação da celulase ser suficientemente identificáveis em termos de aplicabilidade em detergentes. Foi possível definir um critério de selecção da celulase relevante para aplicações detergentes por meio do método C14 CMC descrito na Patente de Invenção Europeia EP-A-350 098, Verificou30

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-se que, um mínimo de 10 de remoção de carboximetilcelulose marcada radioactivamente imobilizada a um nível de 25 x 10 θ em peso de proteína de celulase na solução de ensaio de lavandaria, proporciona uma elevada actividade de celulase. Um grupo preferido de celulases que estão compreendidas dentro da definição de elevada actividade de acordo com a presente invenção foi descrito no Pedido de Patente de Invenção Dinamarquesa copendente número 1159/90, depositado em 5 de Maio de 1990. Nele, refere-se uma preparação de celulase que consiste essencialmente num componente homogéneo de endoglucanase que é imuno-reactivo com um anticorpo monoclonal criado contra uma celulose de 43 kD par cialmente purificada derivada de Humicola insolens DM1800

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A descoberta de que este componente particular de endoglucanase de celulase é vantajoso para o tra tamento de materiais texteis que contêm celulose permite agora produzir a celulase a custos de eficiência económica por exemplo, empregando técnicas de ADN recombinante, e permite aplicar apenas uma pequena quantidade da preparação de celulase e obter o efeito pretendido sobre os tecidos .

J

Surpreendentemente, a Requerente descobriu que se pode formular uma composição detergente aperfeiçoada que combine superiores propriedades de limpeza e de amaciamento usando uma mistura sinérgica de compostos de amónio quaternários solúveis- e de celulase muito activa. A mencionada celulase possui pelo menos 10 í de remoção de CMC a 25 x 10 ? em peso da proteína de celulase na solução de ensaio de lavandaria.

É um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para tratar tecidos numa máquina de lavar que compreende a utilização das composições detergentes de acordo com a presente invenção para o ciclo de lavagem principal.

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Càs;e CM394

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona uma composição detergente que compreende um composto de amónio quaternário de fórmula ^r1^R2^R3^R4^{N X} na qual o símbolo é alquilo em Cg-C^; cada um dos símbolos R₂, θ R|| é, independentemente dos outros, alquilo em C^-ou hidroxi-alquilo, benzilo ou -(C₂H^O)· -H, em que x tem um valor de 2 a 5, não sendo mais do que um dos símbolos R₂, ou benzilo; e x é um anião, e uma celulase caracterizada por proporcionar pelo menos /5 de remoção de carboxi-metil-celulose marcada radioacti vamente imobilizada determinados de acordo com o método C14 CMC a 25 x 1θ’θ $ em peso de proteína de celulose na solução de ensaio de lavandaria.

De acordo com a presente invenção, uma celulose preferida consiste num componente de endoglucanase homogéneo que é imuno-reactiva em relação a um anticorpo monoclonal formado contra uma celulase de 43 kD parcialmente purificada derivada de Humicola insolens DM1800.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Celulase

A actividade das enzimas e, particular mente, a actividade da enzima celulase, foi definida para váriasaplicações por diferentes métodos analíticos. Todos estes métodos tentam proporcionar um conhecimento realístico do comportamento esperado em uso ou, pelo menos, uma medida que esteja correlacionada com o comportamento em utili zação. Como foi pormenorizado no Pedido de Patente de In64.276

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J venção Europeia EP-A-350098, muitos destes métodos, particu larmente os frequentemente utilizados por fabricantes de celulase, não estãosuficientemente correlacionados com o comportamento em utilização da celulase nas composições detergentes de lavandaria. Isto deve-se a estes métodos de medição da actividade terem sido desenvolvidos para várias outras condições de utilização.

método descrito na Patente de Invenção Europeia EP-A-350098 foi desenvolvido para ser e permi tir uma correlação previsível para a classificação da actividade de celulase em composições detergentes de lavandaria.

Por consequência, na presente invenção utiliza-se o método descrito na Patente de Invenção Europeii EP-A-350098 para seleccionar as celulases a fim de distinguir as que são úteis de acordo com a presente invenção das que não proporcionam a obtenção dos objectivos da presente invenção. 0 método de selecção, daqui por diante referido na presente memória descritiva como método C14 CMC, foi adoptado a partir do método descrito em EP-A-350098, podendo ser descrito da seguinte maneira.

Princípio princípio do método C14CMC para se lecção de celulases consiste em medir, a uma concentração de celulase definida numa solução de lavagem, a remoção de carboxi-metiul-celulose (CMC) imobilizada a partir de um substrato de tecido. A remoção da CMC mede-se marcando radioactivamente parte da CMC usando carbono radioactivo C14. A simples contagem da quantidade de C14 radioactivo existente no substrato de tecido antes e depois do tratamento com celulase permite fazer a avaliação da actividade da celulase.

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Preparação da Amostra

Preparação de CMC

A solução de reserva da CMC radioactiva prepara-se de acordo com a Tabela I. A CMC radioactiva pode ser obtida pelos métodos referidos na EP-A-350098.

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Substratos de Tecido :

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Os substratos de tecido são constituídos por amostras de musselina de algodão com o tamanho de 5 cm x 5 cm. São inoculados com 0,35 ml de solução de reserva de CMC marcada radioactivamente no seu centro. As amostras de musselina de algodão são seguidamente secas ao ar.

)

Imobilização de CMC : Para imobilizar a CMC marcada radioactivamente nas amostras de musselina de algodão, utiliza-se o equipamento medidor de lavagem Linitest Original Haunau”, fabricado por Original Haunau, Alemanha. Enche-se um vaso metálico do Laundero-meter com 400 ml de água dura (4 milimoles/litro de iões Ca ). Por cada carga colo cada no vaso, pode utilizar-se o número máximo de 13 amostras de tecido. Incuba-se então o vaso num ciclo de aquecimento de 20 a 60^c durante 40 minutos no equipamento

Laundero-meter. Depois da incubação, as amostras de pano são enxaguadas com um ponto de água da rede de distri35 buição durante 1 minuto. São espremidas e secas ao ar du= 8 =

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 rante pelo menos 20 minutos.

De acordo com a patente de Invenção Europeia EP-A-35009Ô, as amostras de pano com CMC radioactiva imobilizada podem também ser medidas como amostras em branco sem lavagem.

Tratamento da Amostra

Solução de Ensaio de Lavandaria : A solução de ensaio de lavandaria prepara-se de aoordo com a composição indicada na Tabela II. É equilibrada a pH 7,5. A solução de ensaio de lavandaria é a base à qual se adiciona uma amostra de ensaio de células. Deve ter-se o cuidado de não diluir a solução de ensaio de lavandaria adicionando água até um equilíbrio de 100$ antes de ter sido determinada a quantidade de celulase a ser adicionada. A quantidade de celulase utilizada neste ensaio de selecção deve ser adicionada de modo a proporcionar 25 x 10' $ em peso de proteína de celulase na solução de ensaio de lavandaria (equivalente a 0,25 miligrama/litro a 14,5^0.

Procedimento de Lavagem : As amostras de pano assim inoculadas com CMC marcada radioactivamente são então tratadas num processo simulado de lavandaria. 0 processo de lavandaria é simulado num equipaento do tipo Laundero-meter, Linitest, Original Haunau, fabricado por Original Haunau, Haunau, Alemanha. Uma amostra individual de pano é colocada num frasco de vidro de 20 cm . 0 frasco é cheio com 10 ml de solução de ensaio de lavandaria e depois é vedado de maneira a ficar estanque a líquidos. Colocam-se até 5 frascos em cada vaso do Laundero-meter. 0 vaso é chio com água que serve como meio de transferência de calor para a simulação da = 9 =

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J operação de lavandaria. Esta operação é realizada sob a forma de um ciclo de aquecimento de 20 a 602C durante 40 minutos.

Depois do processamento das amostras, os frascos são mergulhados em água fria e, subsequentemente, cada amostra de pano é retirada do respectivo frasco, lavada num copo de precipitação sob água corrente desendurecida, esprimida e deixada ao ar para secar pelo menos duranbte trinta minutos.

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Medição

A fim de medir a solução de CMC marcada radioactivamente, utiliza-se um contador de cintilações, por exemplo, um contador de cintilações LKB 1210 Ultrabeta. A fim de se obter resultados o mais exactos possíveis , deve seguir-se o manual de instruções para operar em condições óptimas um particular contador de cintilações. Por exemplo, para o contador de cintilações LKB 1210 Ultrabeta, deve adoptar-se o seguinte procedimento:

A amostra de pano a medir é colocada num frasco de plástico cheio com 12 ml de líquido cintilador (por exemplo, líquido cintilador 299 da Packard). Deixa-se então estabilizar a amostra de pano pelo menos durante 30 minutos. 0 frasco é então colocado no contador de cintilações LKB 1210 Ultrabeta e obtém-se as respeetivas contagens de radioactividade do pano.

a fim de se medir a quantidade de remoção de CMC devida apenas à celulase, é necessária a medição de uma amostra que tenha sido inoculada ao mesmo tempo, mas que tenha sido tratada com a solução de ensaio de lavandaria sem celulase. A actividade da celulase é então expressa como percentagem de remoção de CMC marcada radioactivamente. Esta percentagem é calculada por meio da se10

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J guinte fórmula:

% de remoção de CMC radioactiva = XO - XC x 100

XO na qual

XO é a contagem de cintilações de radioactividade de uma amostra de pano tratada com solução de ensaio de lavagem sem celulase; e

XC é a contagem de cintilações de radioactividade de uma amostra de pano tratada com a solução de ensaio de lavagem que contém a celulase a ser avaliada.

Considerações Estatísticas, Confirmação da Maneira de Proceder

A fim de se obter resultados estatisticamente correctos, deve empregar-se análise estatística normalizada. Para o exemplo apresentado, utilizando um contador de cintilações LKB 1210 Ultrabeta, verificou-se que pode utilizar-se uma medida de amostra constituída por 3 amostras de pano por cada contagem de cintilações de radioaetividade.

A fim de confirmar a maneira de proceder por verificação cruzada interna, recomendam-se as medições e o cálculo da amostra em branco ” de acordo com EP-A-350098. Isto permite também detectar e eliminar erros .

Interpretação dos Resultados ensaio de selecção descrito proporciona um método rápido, único e digno de confiança para identificar ascelulases que satisfazem os critérios de actividade de-acordo com a presente invenção em comparação

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J com as celulases que não interessam à presente invenção.

Verificou-se que uma remoção de 10$ ou mais da CMC marcada radioactivamente imobilizada de acordo com o método C14 CMC acima mencionado, indica que a respectiva celulase satisfaz as exigências da invenção.

É óbvio para os peritos no assunto que percentagens de remoção maiores do que 10 $ indicam uma actividade maior da respectiva celulase. Por isso, é aceite que a celulase que proporcionasse mais de 25 $ ou, preferivelmente, mais de 50 % de remoção da CMC marcada radioactivamente, com a concentração de proteína na solução de lavagem de ensaio de acordo com o método C14 CMC, proporcionaria a indicação de um ainda melhor comportamento da celulase para utilização em detergentes de lavagem.

Também se admite que a utilização de maiores concentrações de celulase nométodo C14 CMC proporcionariam ainda maiores percentagens de remoção. No entanto, não existe nenhuma correlação linear provocada entre a concentração de celulase e a percentagem de remoção por ela obtida.

Também se aceita que a utilização de maiores concentrações de celulase no método C14 CMC propor cionariam realmente maiores percentagens de remoção.

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TABELA I

Solução de Reserva de CMC Marcada com C14

Radioactivo (todas as percentagens são em peso relativo da solução total)

J

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CMC* total (A CMC deve ser CMC do grau detergente com um grau de substituição compreendido entre cerca de 0,47 e cerca de 0,7

99,2 x 10“³ $

Etanol

14985,12 x 10³ %

J

Água desionizada

84915,68 x 10³ %

Total

100 % * 0 valor da concentração de CMC total convém a CMC não radioactiva e a CMC radioactiva para fornecer uma radioactividade que permita leituras suficientemente nítidas con o contador de cintilações utilizado. Por exemplo,a = 13 =

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* CMC radioactiva pode ter uma actividade igual a 0,7 milicurie/grama e ser misturada com CMC não radioactiva na proporçãode 1 : 6,7.

TABELA II

Solução de Ensaio de Lavagem (todas as percentagens são em peso relativo da solução total)

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Acido alquilo linear em C12-benzenossulfónico	0,110 %
Sal de trietanolamina (TEA) de alquilo de coco-sulfato	0,040 %
Álcool em etoxilado (7 unidades de E0)	0,100 %
Ácido gordo de coco	0,100 %
Ácido oleico	0,050 í
Acido cítrico	0,010 %
Trietanolamina	0,040 %

= 14 =

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Tabela II (Cont.)

Etanol

0,060 %

J

Hidróxido de sódio

0,015 ?

Formiato de sódio

0,010 %

Mod. 71 - 20.000 ·«. - 90/06

Protease

0,006 %

J

Agua contendo 2,5 milimoles/

2+ /litro de Ca^⁺), agente de ajustamento de pH (soluções de HC1 ou de NaOH) e celulase restante até perfazer 100%

>

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De acordo com a presente invenção, as oelulases preferidas são as descritas no Pedido de ₅ Patente de Invenção Dinamarquesa Número 1159/90. Por exemplo, uma preparação de celulase útil nas composições da presente invenção pode consistir essencialmente num componente de endoglucanase homogéneo, que seja imuno10 -reactivo com um anti-corpo desenvolvido contra uma célulase de 43 kD muito murificada, derivada de Humicola insolens DSM 1800, ou que seja homólogo à referida endo15

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gluoanase	de 43 kD.
		Deve	sublinhar-se	que	todas as
enzimas	de celulase	de acordo	com	a	presente invenção
têm de se	satisfazer	os critérios	do	ensaio	de	selecção

J acima mencionado. No entanto, no Pedido de Patente de Invenção Dinamarquesa Número 1159/90, estabelecem-se critérios adicionais que permitem identificar enzimas de celulase preferidas em combinação com o presente ensaio de selecção.

As preparações de celulase particula mente úteis nas composições de acordo com a presente invenção são aquelas em que, além do ensaio de selecção, o compo nente de endoglucanase possui actividade de CMC-endoase pelo menos igual a cerca de 50, preferivelmente, pelo menos

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J

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J igual a cerca de 60, em particular, pelo menos igual a cerca de 90 unidades de CMC-endoase por miligrama de proteína total. Particularmente, um componente de endoglucanase preferido possui uma actividade de CMC-endoase pelo menos igua a 100 unidades de CMC-endoase por miligrama de proteína to tal.

No presente contexto, a expressão actividade de CMC-endoase ’’ refere-se à actividade de endoglucanase do componente de endoglucanase em termos da sua capacidade para degradar a celulase com obtenção em glucose celobiose e triose, como se determina pela diminuição da viscosidade de uma solução de carboximetil-celulose (CMC) depois da incubação com a preparação de celulase de acordo com a presente invenção, como se descreve pormenorizadamente mais adiante.

A actividade de CMC-endoase (endoglucanase) pode determinar-se a partir da diminuição da viscosidade de CMC, procedendo da seguinte forma: Prepara-se uma solução de substrato contendo 35 g/litro de CMC (Hercu les 7 LFD) em tampão de Tris 0,1 Ma pH 9. Dissolve-se a amostra da enzima a analisar no mesmo tampão. Misturam-se 10 ml de solução de substrato a 0,5 ml de solução de enzima e transfere-se para um viscosímetro (por exemplo, Haake VT 181, sensor NV, 181 rotações por minuto), termostatizado a 40°C. Fazem-se as leituras da viscosidade logo que possível depois de misturar e novamente trinta minutos depois.

A quantidade de enzima que diminui a viscosidade para metade sob estas condições é definida como 1 unidade de actividade de CMC-endoase ou CEVU/litro.

A eleotroforase em gel de acrilamida com SDS (SDS-PAGE) e a focagem iso-eléctrica com proteínas marcadoras , de acordo com uma maneira de proceder conhecida pelos peritos no assunto, foram utilizadas para determinar o peso molecular e o ponto iso-eléctrico (pi), respec17 =

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tivamente, do componente de endoglucanase na preparação de celulase útil no presente contexto. Desta forma, determinou-se que a massa molecular de um componente de endoglucanase específico era de 43 kD. Determinou-se que o ponto iso-eléctrico desta endoglucanase era igual a cerca de 5,1.

A actividade de celobio-hidrolase pode definir-se como a actividade em relação a celobiose-p-nitro—6 fenilo. A actividade é determinada com base em 10” mole de nitrofenilo libertado por minuto, a 37 C e pH 7. Verificou-se que o presente componente de endoglucanase não ten essencialmente actividade de celobio-hidrolase.

componente de endoglucanase da prepa ração de celulase de acordo com a presente invenção foi ini. oialmente isolado por procedimentos de purificação extensiva, isto é, envolvendo a purificação por HPLC em fase inversa de uma mistura de celulase de Humicula insolens bruta de acordo com a Patente de Invenção Norte-Americana U.S.

435 307. Surpreendentemente, este procedimento teve como resultado 0 isolamento de uma endoglucanase de 43 kD como componente único com propriedades inesperadamente favoráveis devido à surpreendentemente elevada actividade de endoglucanase .

Também, em adição ao ensaio de selec ção, as enzimas de celulase úteis nas presentes composições podem ainda ser definidas como enzimas que possuem activida de de endoglucanase (seguidamente, na presente memória descritiva, referida como uma enzima de endoglucanase), enzimas essas que têm as sequências de aminoácidos indicadas na Lista de Sequências ID 2, (ver págs. 29 e 30), ou um seu homólogo possuindo actividade de endoglucanase.

No presente contexto, pretende-se que 0 termo homólogo indique um polipéptido codificado por ADN que se hibridiza para 0 mesmo ensaio como 0 ADN que codifica a enzima de endoglucanase com esta sequência de ami

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12. «92

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J noácidos sob certas condições especificadas (tais como pré-embebimento em 5 x SSC e pré-hidridização durante uma hora a 402C numa solução de formamida a 20 %, 5 x solução de Denhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 e 50 microgramas de ADN de timo de vitelo desnaturado e tratado com ultra-sons, seguido de hidridização na mesma solução suplementada com 100 micromolar de ATP durante dezoito horas a 402C). Pretende-se que o termo inclua derivados da sequência acima mencionada, obtidos por adição de um ou mais resíduos de aminoácidos a um qualquer ou a ambos os terminais C e N da sequência natural, substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais sítios da sequência natural, supressão de um ou mais resíduos de aminoá eidos de qualquer uma ou em ambas as extremidades da sequên cia de aminoácidos natural ou em um ou mais sítios dentro da sequência natural, ou a inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais sítios da sequência natural.

A enzima endoglucanase de acordo com a presente invenção pode ser uma enzima obtida a partir da espécie Humicola, tal como Humicola insolens, por exemplo, a estirpe DSM 1800, depositada em 1 de Outubro de 1981 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 18, D-33OO Braunschweig, . Alemanha, de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Finalidades de Procedimentos de Patentes (Tratado de Budapeste).

De acordo ainda com outro aspecto, as enzimas de celulase úteis de acordo com a presente invenção podem ser definidas, adioionalmente ao ensaio de selecção, como enzimas de endoglucanase que têm as sequências de aminoácidos representadas na Lista de Sequências ID Número 4, em anexo, ou um seu homólogo (como se definiu acima) que possua actividade de endoglucanase. A mencionada enzima de endoglucanase pode ser uma enzima pro30 = 19 =

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Mod. 71 - 20.000 ·χ. - 90/06 duzida por um espécie de Fusarium, tal como F. oxisporum, por exemplo a estirpe DSM 2672, depositada em 6 de Junho de 1983 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 18, D-33OO Braunsschweig, Alemanha, de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste.

Além disso, prevê-se que possam derivar-se endogluoanases homólogas a partir de outros microorganismos produtores de enzimas celulolíticas, por exemplo, espécies de Trichoderma, Myceliophthora, Phanerochaeta, Schizophyllum, Penicillium, Aspergillus, e Geotricum.

No entanto, para a produção industrial da preparação de celulase de acordo com a presente invenção prefere-se o emprego de técnicas de ADN recombinante ou doutras técnicas que compreendem ajustamentos de fermentações ou mutação dos microorganismos envolvidos para garantir a super-produção das actividades enzimáticas pretendidas. Estes métodos e técnicas são conhecidos na técnica e podem facilmente ser realizados por pessoas peritas no assunto.

componente de endoglucanase pode assim ser um componente que se pode produzir por um método que compreende a cultura de uma célula hospedeira transforma da com um vector de ADN recombinante que possui uma sequência de ADN que codifica 0 citado componente de endoglucanase ou um precursor do referido componente de endoglu canase assim como sequências de ADN que codificam funções que permitem a expressão da sequência de ADN que codifica o componente de endoglucanase ou o seu precursor, num meio de cultura sob condições que permitem a expressão do componente de endoglucanase ou do seu precursor e a recuperaçãoó do componente de endoglucanase a partir desta cultura.

As construções de ADN compreendendo uma sequência de ADN que codifica uma enzima de endoglucanase como se descreve acima, ou uma forma precursora da

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Case C&394 )

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J enzima, incluem as construções de ADN que têm uma sequência de ADN como se representa nas Listas de Sequências ID # 1 (págs. 27 e 28) ou ID # 3, (págs. 31, 32 e 33), ou uma sua modificação. Exemplos de modificações apropriadas da sequência de ADN são substituições de nucleótidos que não originam outra sequência de aminoácidos de endoglucanase, mas que correspondem à utilização do codão do organismo hospedeiro em que a construção de ADN é introduzida, ou substituições de nucleótidos que originam uma sequência de aminoácidos diferentes e, portanto, possivelmente, uma estru tura de proteína diferente que pode originar um mutante de endoglucanase com propriedades diferentes das da enzima natural. Outros exemplos de modificações possíveis são a inserção de um ou mais nucleótidos em qualquer extremidade da sequência ou a supressão de um ou mais nucleótidos em · qualquer extremidade ou no interior da sequência.

As construções de ADN que codificam enzimas de endoglucanase úteis de acordo com a presente invenção podem preparar-se sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, pelo método de fosfo-amidite descrito por S. L. Beaucage e Μ. H. Caruthers em Tetrahedron Lett. 22, 1981, páginas 1859 - 1869, ou pelo método descrito por Matther e col., em EMBO Journal 3, 1984, páginas 801 - 805. De acordo com o método da fosfo-amidite, sintetizam-se os oligonucleótidos, por exemplo, num sintetizador de ADN automático, purificam-se, recozem-se, ligam-se e clonam-s os vectores apropriados.

Uma construção de ADN que codifica a enzima de endoglucanase ou um seu precursor pode ser isolada, por exemplo, estabelecendo uma biblioteca de cADN oi genómica de um microrganismo que produza celulase, tal comc Humicola inslolens DSM 1800 e seleccionando os clones positivos por procedimentos convencionais, tais como, hibridização usando amostras de oligonucleótidos sintetiza21

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J

Mod. 71 - 20.000 «x. · 90/08

J dos à base da sequência completa ou parcial da endoglucana se de acordo com técnicas padrão (veja-se Sambrook e col. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2^ã Edição, Cold Spring Harbor, 1989) , ou seleccionando os clones que expres sam a actividade enzimática apropriada (isto é, a actividade de CMC-endoase, como se definiu acima), ou seleccionando os clones que produzem uma proteína que é reactiva com um anticorpo contra uma celulase natural (endoglucanase).

Finalmente, a construção de ADN pode ser de origem mista sintética e genómica, mista sintética e de cADN ou mista genómica e de cADN, preparada ligandc fragmentos de origem sintética, genómica ou de cADN (con forme for mais apropriado), correspondendo os fragmentos a. várias partes da construção de ADN completa de acordo com as técnicas padrão. A construção de ADN pode também pre parar-se por uma reacção em cadeia de polimerase utilizando primários específicos, por exemplo, como se descreve na patente de Invenção Norte-Americana US 4 683 202 ou por R. K. Saiki e col., em Science 239, 1988, páginas 487 -491 .

Os vectores de expressão recombinantes em que se inserem as construções de ADN acima referidas incluem qualquer vector que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de ADN recombinante e a escolha do vector depende muitas vezes da célula hospedeira em que se pretende que seja introduzido. Assim, 0 vector pode ser um vector de replicação autónoma, isto é, um vector que exista como uma entidade extracromossómica, cuja replicação seja independente da replicação cromossómica, por exemplo, um plasmídio, Como variante, o vector pode ser tal que, quando introduzido numa célula hospedeira , seja integrado na genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o cromossoma ou os cromossomas em que foi integrado.

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J

Mod. 71 - 20.000 ·χ.

No vector, a sequncia de ADN que codifica a endoglucanase deve estar operacionalmente ligada a um promotor apropriado e a uma sequência terminal. 0 pro motor pode ser qualquer sequência de ADN que apresenta actividade de transcrição na célula hospedeira escolhida e pode derivar de genes que codificam proteínas, quer homó Iogas, quer heterólogas, em relação à célula hospedeira. Os procedimentos utilizados para ligar as sequências de ADN que codificam endoglucanase, o promotor e o terminal, respectivamente, e para as inserir nos vectores apropriados são conhecidos pelos peritos na técnica (veja-se, por exemplo, Sambrook e col., op. cit.).

As células hospedeiras que são transformadas com as construções de ADN acima referidas ou os vectores de expressão acima citados podem pertencer, por exemplo, à espécie Aspergillus, mais preferivelmente, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. As células de fungos podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasta e a transformação de protoplastas, seguida de regeneração da parede celular de maneira em si conhecida. A utilização de Arpergillus com microrganismo hospedeiro é descrita na patnete de Invenção Europeia EP 238 023 (de Novo Industri A/S), cujo conteúdo se incorpora na present ememória descritiva como referência A célula hospedeira pode também ser uma célula de levedura, por exemplo, uma estirpe de Sacoharomyces cerevisiae.

Como variante, 0 organismo hospedeiro pode ser uma bactéria, em particular estirpes de Streptomyces e de Bacillus e E. coli. A transformação de células de bactérias pode realizar-se de acordo com métodos convencionais, por exemplo, como se descreve em Sambrook e col., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold = 23

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Spring Horbor, 198990/04 · ·»· οοο'οε · 1Ζ pow

J

A escolha das sequências de ADN apropriados e a construção dos vectores pode também realizar-se através de procedimentos padrão (veja-se Sambrook e col., op. cit.).

meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional apropriado para desenvolver as células hospedeiras em questão. A endoglucanase expressa pode ser segregada convenientemente para o meio de cultura e pode ser reeu perada desse meio porprocedimentos bem conhecidos, incluindo a separação das células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteicos do meio por meio de um sal tal como o sulfato de amónio, seguida de pro cedimentos cromatográficos como cromatografia com permuta de iões, cromatografia de afinidade ou semelhantes.

Empregando técnicas de ADN recombinan te como se indica acima, técnicas de purificação da proteína, técnicas de fermentação e de mutação ou outras técnicas que são conhecidas pelos peritos no assunto, é possível proporcionar endoglucanases com elevada pureza.

nível da celulase acima descrita nas presentes composições deve ser tal que a quantidade de enzi ma de proteína a ser fornecida para a solução de lavagem esteja compreendida entre 0,005 e 40 mg/litro de solução de lavagem, preferivelmente, entre 0,01 e 10 mg/litro de solução de lavagem.

Composto de Amónio Quaternário Solúvel em Água

Os compostos de amónio quaternário solúveis em água úteis na presente invenção têm a seguinte fórmula r₁r₂r₃r_í|n⁺x“ = 24

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J

Mod.7l · 20.000 ·». - »0/0β

J na qual R-j é alquilo em Cg-C g, cada um dos símbolos R^, R^ ^e % ®’ independentemente dos outros, alquilo em C^-Cjp hidroxi-alquilo em C^-C^, benzilo e -(θ£Η^Ο)_χΗ, em que x tem um valor de 2 a 5 e X é um anião. Não mais do que um dos símbolos R^, ou deve ser benzilo.

comprimento da cadeia de alquilo preferido para R^ é particularmente quando o grupo alquilo é uma mistura de comprimentos: de cadeia diferentes , derivado de gordura de coco ou de semente de palma ou é obtido sinteticamente por formação de olefinas ou resulta da síntese de álcoois. Os grupos preferidos para R^, R^ e R|| são os grupos metilo e hidroxi-etilo e o anião X pode ser escolhido de iões haleto, meto-sulfato, acetato e fosfato.

São exemplos de compostos de amónio quaternário apropriados para usar na presente invenção os seguintes:

brometo ou cloreto de coco-trimetilamónio, brometo ou cloreto de cóco-metil-di-hidroxi-etilamónio, brometo ou cloreto de decil-trietilamónio, brometo ou cloreto de decil-dimetil-hidroxi-etilamónio, brometo ou cloreto de dimetil-hidroxi-etilamónio em ^ci2“^Ci4’ metil-sulfato de miristil-trietilamónio, brometo ou cloreto de lauril-dimetil-benzilamónio. e brometo ou cloreto de lauril-metil-(etenoxi)-4-amónio.

água das composi.ções de capaz de existir sob a componente catiónioo solúvel em acordo com a presente invenção é forma catiónica numa solução aquosa a 0,1 % a pH 10.

composto oatiónico solúvel em água está normalmente presente numa quantidade compreendida entre 0,2 e 10 % em peso da composição detergente.

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J

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J

ADITIVOS DETERGENTES

Nas composições detergentes, pode utilizar-se uma larga gama de agentes tensio-activos. Uma lis ta típica de classes de detergentes aniónicos, não-iónicos anfolíticos e híbridos e de espécies destes agentes tensio-activos é apresentada na patente de Invenção Norte-Americana Número 3 664 961, concedida a Morris em 23 de Maio de 1972.

São particularmente apropriadas neste caso misturas de agentes tensio-activos aniónicos, em especial , misturas de agentes tensio-activos de sulfonato e de sulfato, numa proporção em peso compreendida entre 5:1 e 1:2, preferivelmente, entre 3:1 e 2:3, mais preferivelmente em 3 : 1 e 1 : 1. Os sulfonatos preferidos incluem alquilo-benzeno-sulfonatos com entre nove e quinze átomos de carbono, especialmente entre 11 e 13 átomos de carbono nc radical alquilo, e ésteres de metil-ácidos gordos alfa-sulfonados, em que o ácido gordo deriva de uma fonte de ácidoí gordos em ^C-|2~^C-|8’ Preferivelmente, de uma fonte de ácidos gordos em C-jg-CqQ. ^ca-da caso, o catião é um catião de metal alcalino, preferivelmente sódio. Os agentes tensio-activos de sulfato preferidos são alquil-sulfatos .f que têm entre doze e dezoito átomos de carbono no radical alquilo, opcionalmente em mistura com etoxi-sulfatos que têm dez a vinte, preferivelmente dez a dezasseis átomos de carbono no radical alquilo e um grau médio de etoxilação compreendido entre 1 e 6. Os exemplos de alquil-sulfatos preferidos neste caso são alquil-sulfato de sebo, alquíl-sulfato de coeo e alquil-sulfatos em C^-C^. 0 catião, em cada caso, é novamente um catião de metal alcalino, preferivelmente sódio.

Uma classe de agentes tensio-activos não iónicos úteis na presente invenção são os conden= 26

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sados de óxido de etileno com um agrupamento hidrofóbico para proporcionar um agente tensio-activo tendo um valor de índice do equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) médio compreendido entre 8 e 17, preferivelmente, entre 9,5 e 13,5 e, mais preferivelmente, entre 10 e 12,5. 0 agrupamento hidrofóbico (lipofílico) pode ser de natureza alifática ou aromática e o comprimento do grupo de polioxi-etileno que é condensado com qualquer grupo hidrofóbico particular pode facilmente ajustar-se para se obter um composto solúvel em água possuindo o grau de equilíbrio pretendido entre os elements hidrofílicos e hidrofóbicos.

Mod. 74-20.000 ·χ. 90/06

Os agentes tensio-activos não iónicos especialmente preferidos deste tipo são os etoxilatos de álcoois primários em C^-C^ contendo 3 a 8 moles de dos de etileno por mole de álcool, particularmente os álcoois primários em Q^{ue con}tem 6 a 8 moles de óxido de etileno por mole de álcool e os álcoois primários em ^12“^14 q^{ue cont}®^m 3 a 5 moles de óxido de etileno por mole de álcool.

óxiJ

Uma outra classe de agnetes tensio-activos não iónicos compreende os compostos de alquil-poliglioósidos de fórmula geral

RO (^c _n ^H2n°^t^Zx na qual Z é um agrupamento derivado de glicose; R é um grupo alquilo hidrofóbico saturado contendo doze a dezoito átomos de carbono; t é um número compreendido entre e 10 e n é 2 ou 3; x é· um número compreendido entre 1,3 e 4; compreendendo os compostos menos de 10 $ de álcool gordo que não reagiu e menos de 50 $ de alquilo de cadeia eurta-poliglicosidos. Os compostos deste tipo e a sua utilização no fabrico de detergentes são descritos nas

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Case CM394

Patentes de Invenção Europeias EP-B 0 070 077.

075 996 e 0 094 118.

São também agentes tensio-activos não iónieos apropriados os agentes tensio-aetivos de amida de ácido poli-hidroxi-gordo de fórmula

J

j na qual R é H, ou R é hidrocarbilo em C -C>., 2-hi- ⁴ 2 droxi-etilo, 2-hidroxi-propilo ou uma sua mistura; R é hidrocarbilo em

Z é um poli-hidroxi-hidrocar

Mod. 71 - 20.000 «x. 90/08 bilo que tem uma cadeia de hidrocarbilo linear com pelo menos três grupos hidroxilo directamente ligados à cadeia ou um seu derivado alcoxilado. Preferivelmente, R é meti2 lo, R é uma cadeia linear ou alquilo ou de alcenilo em

C.tal como uma cadeia de um radical alquilo deriva1 i 1 b do de coco ou as suas misturas e Z deriva de um açúcar redutor, tal como glucose, frutose, maltose, lactose, numa reacção de aminação redutora.

J

As composições de acordo com a presente invenção podem ainda compreender um sistema encorpante. Para utilização nos detergentes de acordo com a presente invenção, é apropriado qualquer sistema encorpante convencional incluindo materiais de alumino-silicato, silicatos, policarboxilatos e ácidos gordos, materiais tais como etilenodiamina-tetracetato, sequestrantes de iões metálicos , tais como aminopolifosfonatos, partioularmente ácido etilenodiamino-tetrametileno-fosfónico e ácidos dietileno-triamino-pentametileno-fosfónico. Muito embora sejam menos preferidos por razões óbvias de poluição do meio ambiente, também podem utilizar-se agentes encorpantes de = 28 =

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Mod. 71 - 20.000 «x. TO/Οβ fosfato.

Os agentes encorpantes apropriados podem ser um material inorgânico permutador de iões, vulgarmente um material de alumino-silicato hidratado inorgânico, mais partieularmente, um zeólito sintético hidratado tal como o zeólitos hidratados A, X, B ou HS.

Outro produto enoorpante inorgânico apropriado é o silicato em camadas, por exemplo, SKS-6 (Hoechst). 0 SKS-6 é um silicato cristalino em camadas que consiste em silicato de sódio (Na₂Si₂0çj).

Os encorpantes de policarboxilatos apropriados para utilização de acordo com a presente invenção incluem ácido cítrico, preferivelmente sob a forma de um sal solúvel em água, derivados de ácido succínico de fórmula geral

J

R-CH(C00H)CH₂(C00H) na qual o símbolo R é alquilo ou alcenilo em ^c-|q“^C20’ ^pre“ ferivelmente em ^c-|2”^Ci6’ ^{ou na} Q^{ual R} pode ser substituí do por hidroxilo, sulfo-sulfoxilo ou sulfona. Os exemplos específicos incluem succinato de laurilo, succinato de miristilo, succinato-2-dodecil-succinato de palmitilo, succinato de 2-tetradecenilo. Os encorpantes de succinato são preferivelmente utilizados sob a forma dos seus sais solúveis em água, incluindo os sais de sódio, potássio, amónio e alcanolamónio.

Outros policarboxilatos apropriados são oxodisuccinatos e misturas de ácido tartarato-mono-succínico e ácido tartarato-dissuccínico, como se descreve na patente de Invenção Norte-Americana 4 663 071.

Especialmente para as formas de realização líquidas, os encorpantes de ácidos gordos apropria= 29 =

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J

Mod. 71 · 20.000 ·χ. · 90/08

J dos para utilização de acordo com a presente invenção são ácidos gordos em C θ-C θ saturados ou não saturados, assim como os correspondentes sabões. As espécies saturadas prefe_ ridas têm entre 12 e 16 átomos de carbono na cadeia de alquilo. 0 ácido gordo não saturado preferido é o ácido oleico. Os sistemas encorpantes preferidos para utilização em composições granulares incluem uma mistura de um agente encorpante de alumino-silicato insolúvel em água, tal como zeolito A, e um agente quelante de carboxilato solúvel em água, tal como ácido cítrico.

Outros materiais encorpantes que podem fazer parte do sistema encorpante para utilização nas composições granulares de acordo com as finalidades da presente invenção incluem materiais inorgânicos, tais como carbonatos, bicarbonatos e silicatos de metais alcalinos; e materiais orgânicos, tais como fosfonatos orgânicos, amino-polialquileno-fosfonatos e amino-policarboxilatos.

Outros sais orgânicos solúveis em água apropriados são os ácidos homopoliméricos ou copoliméricos ou os seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxilo separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono.

.Descrevem-se polímeros deste tipo na patente de Invenção Britânica GB-A-1 596 756. São exemplos destes sais os poliacrilatos de peso molecular compreendido entre 2.000 e 5.000 e os seus copolímeros com anidrido maleico, tendo esses copolímeros um peso molecular compreendido entre 20.000 e 70.000, especialmente igual a cerca de 40.000.

Os sais encorpantes detergentes são normalmente incluídos em quantidades compreendidas entre 10% e 80 % em peso da composição, preferivelmente, entre 20 % e 70 % e, mais correntemente, entre 30 % e 60 % em peso.

= 30 =

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)

Mod. 71 - 20.000 ·χ. · W/Οβ

J

Podem encontrar-se presentes agentes de branqueamento, agentes de controlo de espuma, agentes de suspensão da sujidade, enzimas proteolíticas, amilolíticas ou lipolítioas, especialmente proteolíticas, e avivadores ópticos.

Incorporam-se também normalmente agen tes corantes, não substantivos e perfumes, na medida do necessário, para melhorar a aceitabilidade estética do produto .

As composições detergentes de acordo com a presente invenção podem ter uma forma líquida, pastosa ou granular. As composições granulares de acordo com a presente invenção podem também estar na forma compacta”, isto é, podem ter uma densidade relativamente maior do que as composições detergentes granulares convencionais e de acordo com a presente invenção contêm uma menor quantidade de ”sal de enchimento inorgânico em comparação com os detergentes granulares convencionais; os sais de enchimento típicos são sais sulfatos e cloretos de metais alcalino-terrosos, tipicamente sulfato de sódio; os detergentes compactos compreendem tipicamente não mais do que 10 56 de sal de enchimento.

Preparação das Composições

As composições detergentes podem preparar-se de qualquer maneira que seja apropriada à sua forma física, como por exemplo por mistura dos componentes, coa glomerando-os ou dispersando-os num veículo líquido. Na forma granular, pode incorporar-se um agente encorpante de sal detergente e o produto granular prepara-se secandopor pulverização uma suspensão aquosa dos componentes não sensíveis ao calor, e o sal encorpante para formar grânulos

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secos por pulverização nos quais se podem misturar os com ponentes sensíveis ao calor, tais como per-sais, enzimas e perfumes. 0 composto quaternário solúvel em água pode ser incluído na suspensão antes da secagem por pulverização ou pode ser incorporado dissolvendo ou dispersando o compo nente catiónico em água ou noutro.líquido volátil apropria do e, em seguida, pulverizando esta solução da dispersão em cima dos grânulos secos por pulverização previamente ou depois de outros sólidos sensíveis ao calor terem sido misturados em seco com eles. Como variante, o composto quaternário solúvel em água pode ser misturado em seco conjun tamente com os outros sólidos sensíveis ao calor. Â suspea são para submeter a secagem por pulverização podem adicionar-se componentes de argila ou podem misturar-se em seco, como se prefira, por razões não relacionadas com o seu efei to de amaciamento, como, por exemplo, obtenção da cor óptima para o produto.

A invenção é exemplificada por meio dos exemplos seguintes, não limitativos.

Os exemplos seguintes destinam-se a exemplificar composições de acordo com a presente invenção, mas não se pretende que limitemou definam de qualquer outra maneira o âmbito da presente invenção, sendo este âmbito determinado apenas por intermédio das reivindicações efectuadas.

Claims (4)

1. = REIVINDICAÇÕES = )

   1â - Processo para a preparação de uma composição detergente sob a forma granular, granular compacta ou líquida, que compreende um composto de amónio quaternário de fórmula r₁r₂r₃r₄n⁺ X na qual R^ θ alquilo em Cg-C θ, cada um dos símbolos

   R₂, R₃ e é, independentemente dos outros, alquilo em C^-C₄ ou hidroxi-alquilo, benzilo ou -(0₂Η₄0)_χΗ, em

   Mod. 71 - 20.000 ·χ. - »0/0β que o símbolo x tem um valor não sendo mais do que um dos zilo e X~ é um anião, e uma a celulase proporcionar pelo compreendido entre 2 e 5, símbolos R₂, ^ou ^4 bencelulase, caracterizado por menos 10 í de remoção de car20 boximetilcelulose marcada radioactivamente, imobilizada,de acordo com 0 método C14CMG a 25 x 10 em peso da proteína de celulase na solução de ensaio de lavandaria.
2. 2— - Processo para a preparação de uma composição detergente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a celulase consistir essencialmente num componente de endoglucanase halogéneo que é imuno-reactivo em relação a um anticorpo contra uma celulase muito purificada com cerca de 43 kD derivada de Humicola insolens DSM 18OO, ou que é homólogo da mencionada endoglucanase com 43 kD.
3. 3a _ Processo para a preparação de uma composição detergente de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o componente de endoglucanase da referida celulase ter um ponto iso-eléctrico aproximadamente igual a

   68 =

   64.276

   Case CM394 )

   Mod. 71 - 20.000 ·χ. - 90/00

   5,1.
4. 4§ -Processo para a preparação de uma composição detergente de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado por o referido componente de endoglucanase se poder preparar por umprocesso que compreende cultivar-se uma célula hospediera transformada por um vector de ADN reeombinante que possui uma sequência de ADN que codifica o mencionado componente de endoglucanase ou um pre cursor do citado componente de endoglucanase, assim como se quências de ADN que codificam funções que permitem a expres são da sequncia de ADN que codifica o componente de endoglucanase ou um seu precursor, num meio de cultura sob con dições que permitem a expressão do componente de endoglucanase ou do seu precursor e recuperação do componente de endoglucanase a partir da cultura.

   - Processo para a preparação de uma composição detergente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a celulase ter a sequência de amino-ácidos representada na listagem de sequências ID # 2: