PT633311E - Aminas hidrofobas para a estabilizacao da celulase em composicoes detergentes liquidas contendo agente tensioactivo anionico e celulase - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

AMINAS HIDRÓFOBAS PARA A ESTABILIZAÇÃO DA CELULASE EM COMPOSIÇÕES DETERGENTES LÍQUIDAS CONTENDO AGENTE TENSIOACTIVO

ANIÓNICO E CELULASE

Campo Técnico A presente invenção refere-se a composições detergentes líquidas que contêm agente tensioactivo aniónico e celulase. Nas composições de acordo com a presente invenção a celulase está estabilizada.

Antecedentes da Invenção

Composições detergentes líquidas que compreendem enzimas são conhecidas na técnica. É desejável que essas composições devam apresentar estabilidade á longo prazo em relação à enzima. No entanto, observou-se que em composições detergentes líquidas de agente tensioactivo aniónico, a estabilidade das enzimas, particularmente das celulases é muito reduzida. A incorporação de enzimas celulase nessas composições é muito desejável. Assim, a instabilidade durante a armazenagem dessas composições representa um problema para os fabricantes de detergentes.

Supõe-se que a razão da instabilidade da celulase na presença de agentes tensioactivos aniónicos se baseia nas interacções que ocorrem entre o agente tensioactivo aniónico e a estrutura tridimensional da enzima celulase. Isto tem como consequência o desenrolamento da enzima e uma redução da sua actividade. 0bservou-se também que este problema é mais agudo na presença da enzima protease. Pensa-se que a enzima celulase desdobrada é mais vulnerável ao ataque por protease. Assim, a presença de proteases desactiva mais as celulases.

Portanto é um objectivo da invenção proporcionar uma composição detergente líquida que compreende agente tensioactivo aniónico e celulase, que é estável durante a armazenagem.

Como resposta a este objectivo, a presente invenção propõe formular composições detergentes líquidas que compreendem aminas hidrófobas solúveis detergentes líquidas, 1 que podem ser primárias, secundárias, terciárias ou quaternárias, como compostos de estabilização da celulase.

Uma vantagem da presente invenção reside no facto de que é aplicável à protecção de qualquer celulase e também tem utilização na presença de protease.

Aminas foram divulgadas na técnica em composições detergentes líquidas. EP 160 762, EP 137 615 e EP 137 616 divulgam detergentes líquidos que compreendem ciclo-hexilamina. Exemplificam-se composições que compreendem agentes tensioactivos aniónicos, protease e amilase, mas não há qualquer menção à celulase. O papel da ciclo--hexilamina nestas composições é estabilizar as composições que estão sob a forma de microemulsões. EP 495 554 divulga composições detergentes que compreendem um composto de amónio quaternário e uma celulase. EP 173 397 divulga composições detergentes que compreendem um agente tensioactivo aniónico, um composto amaciador de tecidos catiónico que pode ser uma amina quaternária e uma celulase. EP 177 165 divulga composições detergentes que compreendem agentes tensioactivos aniónicos, celulase e uma variedade de aminas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias. As aminas primárias, secundárias e terciárias em EP 177 165 têm todas pelo menos uma cadeia de alquilo comprida. As composições da EP 177 165 compreendem obrigatoriamente argila. EP 177 165 não refere que aminas podem estabilizar celulases. EP 11 340 refere o amaciamento mediante composições detergentes de lavagem que compreendem aminas terciárias e argila. As composições em EP 11 340 não compreendem celulase. GB 2 094 826 e GB 2 095 275 divulgam composições que compreendem agentes tensioactivos aniónicos, celulase, protease e aminas quaternárias. Nenhum destes documentos revela que aminas podem estabilizar celulases. 2 ΕΡ 120 528 divulga composições que compreendem agentes tensioactivos aniónicos, celulase com outras enzimas, assim como aminas terciárias. As aminas terciárias em EP 120 528 têm pelo menos um alquilo de cadeia comprida. EP 120 528 nãp refere que aminas podem estabilizar celulases. EP 26 528 e EP 26 529 divulgam composições que compreendem agentes tensioactivos aniónicos e aminas quaternárias. Nem EP 26 528 nem EP 26 529 divulgam celulase. WO 91/17243 e as publicações EP números 495 258, 495 554 e 540 784 divulgam CarezymeR, incluído nos detergentes líquidos. Não mencionam aminas.

Sumário da Invenção

As composições de acordo com a presente invenção são composições detergentes líquidas que compreendem 1 - 50% de agente tensioactivo aniónico e enzima celulase, caracterizadas por compreenderem ainda uma quantidade estabilizadora de amina que é 0,5 - 10%. As composições de acordo com a presente invenção preferivelmente contêm protease. As aminas da presente invenção são aminas de acordo com as fórmulas: R!R2R3N na qual Ri e R2 são independentemente H ou uma cadeia C2-C9-alquilo e R3 é uma cadeia C2-C9-alquilo ou ciclopentilo, ciclo-hexilo ou ciclo-heptilo, ou as suas misturas.

Descrição Pormenorizada da Invenção

As composições detergentes líquidas de acordo com a presente invenção compreendem três componentes essenciais, um agente tensioactivo aniónico, enzima celulase e quantidade estabilizante de uma amina hidrófoba. A Amina

Aminas estabilizantes da composição detergente de acordo com a presente invenção constituem 0,5% a 10% em peso da composição total, preferivelmente 1% a 8%, mais preferivelmente 2% a 5% de uma amina de estabilização da celulase. Aminas hidrófobas tal como são utilizadas referem-se a aminas que podem formar uma micela mista com um 3 agente tensioactivo aniónico e em que pelo menos um dos grupos alquilo tem um comprimento da cadeia de átomos de carbono maior do que C3.

As aminas para utilização de acordo com a presente invenção são de acordo com a fórmula R^F^N na qual Ri e R2 são, independentemente, H ou um C2-C9-alquilo, preferivelmente H ou uma cadeia C2-C3-alquilo, R3 é uma cadeia C2-C9-alquilo, preferivelmente C^Cs-alquilo, ou ciclopentilo, ciclo-hexilo ou ciclo-heptilo. Aminas preferidas de acordo com a fórmula acima referida são n-alquilaminas. São particularmente preferidas ciclo-hexilamina e n-hexilaminas. Aminas apropriadas para utilização neste caso podem ser escolhidas de N-metil-N-hexilamina, Ν,Ν-dietil n--hexilamina, n-butilamina, n-octilamina, N-metil-ciclo-hexilamina, N, N-dietil-ciclo--hexilamina e diciclo-hexilamina.

Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria, supõe-se que é a hidrofobicidade da amina que é responsável pela protecção das enzimas de celulase. A amina hidrófoba actua como um contra-ião resultando no rearranjo do agente tensioactivo aniónico para produzir um efeito de “protecção” pela formação do par de iões neutros de amina hidrófoba - agente tensioactivo aniónico na fase de agente tensioactivo do detergente líquido.

Celulase

Como componente essencial, as presentes composições compreendem uma enzima celulítica ou suas misturas. Há uma grande variedade de celulases disponíveis para o formulador de detergentes, sendo todas apropriadas para utilização neste caso.

Celulases apropriadas na presente invenção podem ser qualquer celulase bacteriana ou fúngica que tem um pH óptimo de 5 a 11,5. Celulases apropriadas que têm uma actividade óptima a valores de pH alcalinos são descritos nas memórias descritivas das patentes Britânicas GB 2 075 028 A (Novo Industri A/S, GB 2 094 826 A (Kao Soap Co. Ltd.). Exemplos dessas celulases alcalinas são celulases produzidas pela estirpe Humicola insolens (Humecola grisea var. thermoidea), particularmente a estirpe de Humicola DSM 1800, e celulase produzidas por um fungo que pertence ao género Aeromonas, e a celulase extraída do hepatopâncreas de um molusco marinho (Dolabella Auricula Solander). 4

As celulases preferidas para utilização na presente invenção podem ser escolhidas de acordo com o seguinte método. A actividade de enzimas e particularmente a actividade de enzima celulase foi definida para várias aplicações por diferentes métodos analíticos. Estes métodos tentam todos proporcionar uma avaliação realista do comportamento esperado em utilização ou pelo menos uma medição que está correlacionada com o comportamento em utilização. Como foi pormenorizado no Pedido de Patente Europeia EP-A-350098, muitos métodos, particularmente os que são frequentemente utilizados pelos fabricantes de celulase, não estão suficientemente correlacionados com o comportamento de utilização da celulase nas composições detergentes de lavandaria. Isto deve-se às diferentes condições de utilização para as quais estes métodos de definição da actividade foram desenvolvidos. O método descrito em EP-A-350098 foi desenvolvido para ser e ter uma correlação previsível com a ordem de grandeza da actividade de celulase em composições detergentes de lavandaria. A presente invenção utiliza portanto o método divulgado em EP-A-350098 para fazer a triagem de celulases a fim de distinguir celulases que são úteis na presente invenção e as que não proporcionam os objectivos da presente invenção. O método de triagem, na presente memória descritiva referido como método C14CMC, que foi adoptado a partir do método divulgado em EP-A-350098, pode ser descrito na seguinte maneira:

Princípio: O princípio do Método C14CMC para fazer a triagem consiste em medir a uma concentração definida de celulase numa solução de lavagem a remoção de carboximetil-celulose (CMC) imobilizada a partir do substrato de tecido. A remoção de CMC é medida marcando com carbono radioactivo alguma CMC utilizando carbono radioactivo C14. A simples contagem da quantidade de C14 radioactivo no substrato de tecido antes e depois do tratamento com celulase permite fazer a avaliação da actividade de celulase.

Preparação da amostra: 5

Preparação da CMC : A solução concentrada de CMC radioactiva é preparada de acordo com a Tabela I. A CMC radioactiva pode obter-se pelos processos referidos em EP-A-350098.

Substratos de Tecido : Os substratos de tecido são amostras de musselina de algodão que têm um tamanho de 5 cm x 5 cm. São inoculados com 0,35 ml de uma solução de armazenagem de CMC marcada radioactivamente no seu centro. As amostras de musselina de algodão são então secas ao ar.

Imobilização de CMC : Para imobilizar a CMC marcada radioactivamente nas amostras de musselina de algodão, utilizou-se o equipamento de medição da lavagem “Linistest Original Haunau” fabricado por Original Haunau, Alemanha. Um vaso metálico do launderómetro é cheio com 400 ml de água dura (4 mmol/litro de iões Ca++). Por vaso pode utilizar-se um número máximo de 13 amostras. O vaso é então incubado num ciclo de aquecimento de 20°C até 60°C durante 40 minutos no equipamento do launderómetro. Depois da incubação, as amostras são enxaguadas em água corrente da rede de distribuição doméstica durante um minuto. São espremidas e deixadas secar ao ar durante pelo menos 30 minutos.

De acordo com EP-A-350098 amostras dos panos com CMC radioactiva imobilizada podem também ser medidos como “amostras em branco” sem lavar.

Tratamento da amostra:

Solução de ensaio de lavagem : Prepara-se a solução de ensaio de lavagem de acordo com a composição da Tabela II. Ajusta-se a pH 7,5. A solução de ensaio de lavagem é a base a que se adiciona uma amostra de ensaio de celulase. Deve ter-se o cuidado para não diluir a solução de ensaio de lavagem adicionanda água até um valor de 100% antes de ter determinado a quantidade de celulase a ser adicionada. A quantidade de celulase que é utilizada neste ensaio de triagem deve ser adicionado para proporcionar 25 x 10"6 % em peso de proteína de celulase na solução de ensaio de lavagem (equivalente a 0,25 miligramas/litro a 14,5°C).

Procedimento de lavagem : As amostras de pano assim inoculadas com CMC marcada radioactivamente são em seguida tratadas num processo de simulação de lavagem na 6 lavandaria. O processo de lavandaria é simulado no equipamento tipo launderómetro, “Linitest, Original Haunau”, fabricado pela firma Original Haunau, Alemanha. Uma amostra de pano individual é colocada num frasco de vidro de 20 cm3. O frasco é cheio com 10 ml da solução de ensaio de lavagem e depois vedado hermeticamente. Colocam-se até 5 frascos em cada vaso do launderómetro. O vaso é cheio com água como meio de transferência de calor para a simulação da lavagem. A simulação de lavagem é realizada como um ciclo de aquecimento de 20°C até 60°C durante 40 minutos.

Depois do processamento das amostras, os frascos são submersos em água fria e em seguida cada amostra é retirada do seu frasco, lavada num copo sob água macia corrente, espremido e deixado secar ao ar durante pelo menos 30 minutos.

Medição:

Para medir a remoção de CMC radioactivamente marcada, utiliza-se um contador de cintilações, por exemplo, um LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter. Para obter resultados mais rigorosos, deve seguir-se o manual de instruções para operação óptima do contador de cintilações particular. Por exemplo, para o LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter deve seguir-se o seguinte procedimento. A amostra de pano a ser medida é colocada num frasco de plástico cheio com 12 ml de líquido cintilador (por exemplo cintilador 299 de Packard). Deixa-se então estabilizar a amostra de pano durante pelo menos 30 minutos. O frasco é então colocado no LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter e obtém-se a respectiva contagem de radioactividade para o pano.

Com o fim de medir a quantidade de remoção de CMC devida apenas à celulase, é necessária uma medição de um pano que foi inoculado ao mesmo tempo mas foi tratado na solução de ensaio de lavagem sem celulase. A actividade da celulase é então expressa com percentagem de remoção de CMC radioactivamente marcada. Esta percentagem é calculada por meio da seguinte fórmula:

XO —XC % de remoção de CMC radioactiva =- x 100

XO na qual XO é a contagem de cintilações de radioactividade de uma amostra de pano tratada com a solução de ensaio de lavagem sem celulase e 7 XC é a contagem de cintilações de radioactividade de uma amostra tratada com a solução de ensaio de lavagem contendo a celulase a ser avaliada.

Considerações estatísticas, confirmação do procedimento:

Para proporcionar resultados estatisticamente seguros deve aplicar-se análise estatística corrente. Para o exemplo dado, usando o Contador LKB 1210 Ultrabeta Scintillation, verificou-se que pode ser usado um tamanho da amostra constituído por 3 amostras de pano por cada contagem de cintilações de radioactividade.

Com fim de confirmar o procedimento por verificação cruzada interna, recomenda-se a medição e o cálculo da “amostra em branco” de acordo com EP-A-350098. Isto permitir detectar e eliminar erros,

Interpretação de resultados: O ensaio de triagem descrito proporciona um método rápido único e digno de confiança para identificar celulase que satisfazem os critérios de actividade da presente invenção em comparação com celulases que não fazem parte da presente invenção.

Verificou-se que uma remoção de 10% ou mais da CMC radioactivamente marcada imobilizada de acordo com o método C14CMC acima mencionado, indica que a respectiva celulase satisfaz os requisitos da presente invenção. É óbvio para os peritos no assunto que percentagens de remoção superiores a 10% indicam uma maior actividade da respectiva celulase. Considera-se portanto que celulase que proporciona acima de 25% ou preferivelmente acima de 50% de remoção de CMC radioactivamente marcada com a concentração de proteína presente na solução de ensaio de lavagem de acordo com o método C14CMC, proporciona a indicação de um comportamento ainda melhor da solução para utilização em detergentes de lavandaria.

Também se considera que a utilização de concentrações maiores de celulase para o método C14CMC proporciona maiores percentagens de remoção. No entanto, não existe uma correlação linear comprovada entre a concentração de celulase e a percentagem de remoção obtida por ela. 8

Também se considera que a utilização de concentrações maiores de celulase para o método C14CMC proporciona maiores percentagens de remoção. TABELA I: Solução de armazenagem de CMC radioactivamente marcada com CM (todas as percentagens em peso em relação à solução total) CMC* total (A CMC deve ser CMC da qualidade para detergentes com um grau de substituição compreendido entre cerca de 0,47 e cerca de 0,7) 99,2 x 10 J% Etanol 14985,12 x 10-5% Água desionizada 84915,68x10"’% Total: 100% * A CMC não radioactiva e radioactiva para proporcionar uma radioactividade que permite leituras suficientemente claras no contador de cintilações utilizado. Por exemplo, a CMC radioactiva deve ter uma actividade de 0,7 milicurie/g e ser misturada com CMC não radioactiva numa proporção de 1:6,7. TABELA II: Solução de ensaio de lavagem (todas as percentagens em peso em relação à solução total) Ácido C12 alquilo linear - benzenos sulfónico 0,110% Alquilo de coco - sulfato (sal de TEA) 0,040% Álcool C12-15 etoxilado (DE7) 0,100% Acido gordo de coco 0,100% Acido oleico 0,050% Ácido cítrico 0,010% Trietanolamina 0,040% Etanol 0,060% Propanodiol 0,015% Hidróxido de sódio 0,030% Formiato de sódio 0,010% Protease 0,006% Agua (2,5 mmol/litro de Ca**), agente ajustamento pH (soluções de HCI ou NaOH) e celulase até perfazer 100% 9

Deve salientar-se que a todas as enzimas de celulase de acordo com a presente invenção têm de satisfazer os critérios do ensaio de triagem acima mencionados. No entanto, em WO 91/17243 estabelecem-se critérios adicionais que permitem identificar enzimas de celulase preferidas em combinação com o presente ensaio de triagem.

Preparações de celulase particularmente úteis nas composições de acordo com a invenção são aquelas em que, além do ensaio de triagem, o componente de endoglucanase possui uma actividade de CMC-endoase de pelo menos 50, preferivelmente pelo menos aproximadamente 60, particularmente pelo menos aproximadamente 90 unidades de CMC-endoase por mg da proteína total. De maneira particular, um componente de endoglucanase preferido possui uma actividade de CMC-endoase pelo menos igual a 100 unidades de CMC-endoase por mg de proteína total.

No presente contexto, a expressão “actividade de CMC-endoase” (cevu) refere-se à actividade de endoglucanase do componente de endoglucanase em termos da sua capacidade para degradar celulose com obtenção de glucose, celobiose e triose, como determinado por uma diminuição da viscosidade de uma solução de carboximetilcelulose (CMC) depois da incubação com a preparação de celulase da invenção, como se descreve pormenorizadamente mais adiante. A actividade de CMC-endoase (endoglucanase) pode ser determinada a partir da diminuição da viscosidade de CMC, como se descreve seguidamente:

Prepara-se uma solução de substrato que contém 35 g/l de CMC Blanose 7LFD (Aqualun) em tampão de tris 0,1 M a pH 9,0. Dissolve-se a amostra de enzima a ser analisada no mesmo tampão. Misturam-se 10 ml de solução de substrato e 0,5 ml de solução de enzima e transferem-se para um viscosímetro (por exemplo, Haake VT 181, sensor NV, 181 r.p.m.), termostatizado a 40°C. Fazem-se leituras da viscosidade o mais depressa possível depois de misturar e novamente passados 30 minutos. A quantidade de enzima que reduz a viscosidade para metade sob estas condições é definida como uma unidade de actividade de CMC-endoase.

Electroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) e a focagem do ponto isoeléctrico com proteínas marcadoras de uma maneira conhecida pelos peritos no assunto foram usadas para determinar o peso molecular e o ponto isoeléctrico (pl), 10 respectivamente do componente de endoglucanase na preparação de celulase útil no presente contexto. Desta maneira, o peso molecular de um componente específico de endoglucanase verificou-se ser 43 kD. O ponto isoeléctrico desta endoglucanase foi determinado como sendo cerca de 5,1. A actividade de celobio-hidrolase pode ser definida como a actividade em relação a celobiose p-nitrofenilo. A actividade é determinada como as μηιοΐββ de nitrofenilo libertadas por minuto a 37°C e pH 7,0. O presente componente de endoglucanase verificou-se não ter essencialmente a actividade de celobio-hidrolase'. 0 componente de endoglucanase na preparação de celulase foi inicialmente isolado por procedimentos de purificação extensiva, envolvendo a purificação por HPLC em fase inversa de uma mistura de celulase bruta de H. insolens de acordo com U.S. 4 435 307. Este procedimento surpreendentemente resultou no isolamento de uma endoglucanase de 43 kD como componente único com propriedades inesperadamente favoráveis devido a uma surpreendentemente elevada actividade de endoglucanase.

Também, além do teste de triagem, as enzimas de celulase úteis nas presentes composições podem ainda ser definidas como enzimas que possuem actividade de endoglucanase (daqui para diante designadas por uma “enzima de endoglucanase”), enzimas que têm a sequência de aminoácidos apresentada na Lista de Sequências ID Número 2 anexas, ou no seu homólogo que possui actividade de endoglucanase.

No presente contexto, o termo "homólogo” pretende-se que indique um polipéptido codificado por DNA que hibridiza para a mesma amostra que o DNA que codifica a enzima de endoglucanase com esta sequência de aminoácidos sob certas condições especificadas (como por exemplo pré-embebimento em 5xSSC e pré-hibridização durante 1 h a 40°C numa solução de formamida a 20%, õxsolução de Denhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 e 50 μg de DNA de timo de vitelo tratado por ultra-sons desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com ATP 100 μΜ durante 18 horas a 40°C). O termo pretende-se que inclua derivados da sequência acima mencionada obtida por adição de um ou mais tecidos de aminoácidos quer a um quer a ambos os terminais C e N da sequência natural, substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos um ou mais sítios na sequência natural, eliminação de um ou mais resíduos de aminoácidos em qualquer ou ambas as extremidades da sequência de aminoácidos 11 natural ou num ou mais sítios dentro da sequência natural, ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos num ou mais sítios da sequência natural. A enzima de endoglucanase pode ser uma enzima que pode ser produzida pela espécie de Humicola tal como Humicola insolens, por exemplo, a estirpe DSM 1800, depositada em 1 de Outubro de 1981 na Deutsch Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, República Federal da Alemanha, de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para as Finalidades de Procedimento de Concessão de Patentes (o Tratado de Budapeste).

De acordo ainda com outro aspecto, as enzimas de celulase úteis na presente invenção podem ser definidas, em adição ao ensaio de triagem, como enzimas de endoglucanase que têm a sequência de aminoácidos representada na Lista de Sequências em Anexo ID Número 4 ou uma sua homóloga (como definido acima) que possui a actividade de endoglucanase. A mencionada enzima de endoglucanase pode ser uma enzima que se obtém por uma espécie de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum, por exemplo estirpe DSM 2672, depositada em 6 de Junho de 1983 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, FRG, de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste.

Além disso, prevê-se que endoglucanases homólogas possam ser derivadas de outros microrganismos que produzem enzimas celulíticas, por exemplo espécies de Trichoderma, Myceliophthora, Phanerochaete, Schozophyllum, Penicillium, Aspergillus e Geotricum.

De acordo ainda com outro aspecto, as enzimas de celulase úteis na presente invenção podem ser definidas como endoglucanase, preferivelmente originária de Humicola Insolens, muito embora outros fungos e bactérias possam ser utilizados afim de produzir a mencionada endoglucanase. A citada endoglucanase tem um peso molecular igual a cerca de 50 KDa, um ponto isoeléctrico igual a 5,5 e contêm 415 aminoácidos. A sequência de aminoácidos codificantes é como se representa na Lista de Sequência em Anexo Número 5. Sem isso ser especificamente incorporado nas reivindicações, é evidente que um ou mais aminoácidos de sequência podem ser substituídos por outros aminoácidos ou homólogos de aminoácidos ou derivados. Também eliminações e/ou 12 substituições ou inserções de um ou mais aminoácidos na sequência são incorporados nesta.

Para a produção industrial da preparação de celulase de acordo com a presente invenção, no entanto, prefere-se empregar técnicas de DNA recombinante ou outras técnicas que envolvam ajustamentos de fermentações ou mutação dos microrganismos envolvidos para assegurar sobreprodução das actividades enzimáticas pretendidas. Esses métodos e técnicas são conhecidas na prática e podem ser facilmente realizados por peritos na técnica. O componente de endoglucanase pode assim ser uma endoglucanase que se pode produzir por um processo que compreende cultivar uma célula hospedeira transformada com o vector de DNA recombinante que possui uma sequência de DNA que codifica o referido componente de endoglucanase ou um precursor do mencionado componente de endoglucanase assim como sequências de DNA que codificam funções que permitem a expressão de DNA que codifica o componente de endoglucanase ou o seu precursor, no meio de cultura sob condições que permitem a expressão do componente de endoglucanase ou do seu precursor e recuperando o componente de endoglucanase da cultura.

Construtos de DNA que compreendem uma sequência de DNA que codifica uma enzima de endoglucanase como se descreveu acima ou uma forma precursora da enzima que incluem os construtos de DNA que têm uma sequência de DNA como se representa nas Listas de Sequências em anexo ID Número 1 ou ID Número 3 ou uma sua modificação. Exemplos de modificações apropriadas da sequência de DNA são substituições de nucleóticos que não originam outra sequência de aminoácidos da endoglucanase mas que correspondem à utilizaçãode codões em que o construto do DNA é introduzido ou substituições de nucleótidos que originam uma sequência de aminoácidos diferente e portanto, possivelmente, uma estrutura de proteína diferente que pode originar um mutante com diferentes propriedades em relação à enzima natural. Outros exemplos de modificações possíveis são a inserção de um ou mais nucleótidos em qualquer das extremidades da sequência ou a eliminação de um ou mais nucleótidos ou numa extremidade ou dentro da sequência. 13

Construtos de DNA que codificam enzimas de endoglucanase úteis de acordo com a presente invenção podem preparar-se sinteticamente por métodos usuais bem estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidite descrito por S.L. Beaucage e Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, p. 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, p . 801-805. De acordo com o método da fosfoamidite, sintetizam-se oligonucleótidos, por exemplo num sintetizador automático de DNA, purificam-se, recosem-se, ligam-se e clonam-se em vectores apropriados.

Um construto de DNA que codifica a enzima de endoglucanase ou um seu precursor pode por exemplo ser isolado estabelecendo uma biblioteca de cDNA ou genómica de um microrganismo que produz celulase, tal como Humicola insolens, DSM 1800, e fazendo a triagem dos clones positivos por procedimentos convencionais tais como por hidridização usando amostras de oligonucleótidos sintetizados na base da sequência completa ou parcial de aminoácidos da endoglucanase de acordo com técnicas habituais (cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor, 1989), ou escolhendo clones que expressam a actividade de enzima apropriada (isto é, actividade de CMC-endoase como se definiu acima) ou escolhendo clones que produzem uma proteína que reage com um anticorpo contra uma celulase natural (endoglucanase).

Finalmente o construto de DNA pode ser de origem mista sintética genómica, de origem mista sintética e de cDNA ou de origem mista genómica e de cDNA preparado por ligação de fragmentos de origem sintética genómica ou de cDNA (como for apropriado), correspondendo os fragmentos às várias partes do construto completo de DNA, de acordo com técnicas usuais. O construto de DNA pode também preparar-se por reacção em cadeia de polimerase usando primários específicos, por exemplo como se descreve em US 4 682 202 ou R. K. Saiki et al., Science 239, 1988, p. 487-491.

Vectores de expressão recombinantes em que são inseridos os construtos de DNA acima mencionados incluem qualquer vector que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e a escolha do vector depende muitas vezes da célula hospedeira em que deve ser introduzido. Assim, o vector pode ser um vector que se replica autonomamente, isto é, um vector que existe como uma entidade extracromosónica cuja replicação é independente da replicação cromosómica, por exemplo plasmidio. Como variante, o vector pode ser um vector que, quando introduzido 14 numa célula hospedeira, é integrado numa célula hospedeira e replicado conjuntamente com o cromossoma ou com os cromossomas em que foi integrado.

No vector, a sequência de DNA que codifica a endoglucanase deve ser operavelmente ligada a um promotor apropriado e na sequência terminadora. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que possua actividade de transcrição na célula hospedeira escolhida e pode derivar de genes que codificam proteínas ou homólogos ou heterólogos das células do hospedeiro. Os procedimentos usados para ligar as sequências DNA que codificam a endoglucanase, o promotor e o terminador, respectivamente, e para os inserir em vectores apropriados são conhecidas pelos peritos no assunto (cf. por exemplo, Sambrook et al., op. cit.). Células hospedeiras que são transformadas com os construtos de DNA acima referidos ou vectores de expressão acima mencionados podem por exemplo pertencer a uma espécie de Aspergillus, mais preferivelmente Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Células de fungos podem ser transformadas por um processo que envolve a formação do protoplasta e a transformação dos protoplastas seguida para regeneração da parede das células de uma maneira assim conhecida. A utilização de Aspergillus como um microorganismo hospedeiro é descrita em EP 238 023 (de Novo Industri A/S), cujo conteúdo é incorporado na presente memória descritiva como referência. A célula hospedeira pode também ser uma célula de levedura, por exemplo, uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.

Como alternativa, o organismo hospedeiro pode ser uma bactéria, em particular estirpes de Streptomyces e Bacillus, e E. coli. A transformação de células de bactérias pode realizar-se de acordo com métodos convencionais, por exemplo como se descreve em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989. A triagem das sequências de DNA apropriadas e a construção de vectores pode também realizar-se por procedimentos correntes, cf. Sambrook et al., op. cit. O meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio convencional apropriado para o crescimento das células hospedeiras em questão. A endoglucanase expressada pode convenientemente ser segregada para o meio de cultura e pode ser recuperada a partir dele por processos em si conhecidos incluindo a separação 15 das células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteináceos por intermédio de um sal tal como sulfato de amónio, seguido por processo de cromatografia tais como cromatografia de permuta de iões, cromatografia de afinidade ou semelhantes.

Empregando técnicas de DNA recombinante como se indicou acima, as técnicas de purificação das proteínas, as técnicas de fermentação e mutação ou outras técnicas que são conhecidas na prática, é possível proporcionar endoglucanases com uma elevada pureza. O nível de celulase na presente composição descrita acima deve ser tal que a quantidade proteína de enzima a ser fornecida na solução de lavagem está compreendida entre 0,005 e 40 mg(litro de solução de lavagem, preferivelmente 0,01 a 10 mg/litro da solução de lavagem. A celulase adicionada à composição de acordo com a presente invenção pode estar em qualquer forma, por exemplo, grânulos que não libertam pó, por exemplo “marumas" ou “prills”, ou sob a forma de um líquido em que a celulase é fornecida como um concentrado de celulase suspenso em, por exemplo, um agente tensioactivo não inónico ou dissolvido num meio aquoso, tendo actividade de celulase de pelo menos 250 unidades de actividade de celulase Cx regular/grama, medida nas condições padrão como descrito em GB 2 075 028 A. A quantidade de celulase adicionada à composição de acordo com a presente invenção é em geral compreendida entre 0,01 e 10% em peso sob qualquer forma. Em termos da actividade de celulase, a utilização de celulase numa quantidade que corresponde a 0,25 até 150 ou mais unidades regulares Cx/grama da composição detergente está dentro do âmbito preferido da invenção. Uma gama mais preferida da actividade de celulase, no entanto, está compreendida entre 0,5 e 25 unidades Cx/grama da composição detergente.

Outra quantidade preferida de celulase é 0,01% a 5% (a 5000 CEV μ/g). O Agente Tensioactivo Aniónico 16

Sais tensioactivos aniónicos apropriados são escolhidos do grupo dos sulfonatos e sulfatos. Agentes tensioactivos aniónicos semelhantes são conhecidos na técnica dos detergentes e encontraram uma larga aplicação em detergentes comerciais. Os sais de sulfonato ou de sulfato solúveis em água aniónicos preferidos têm na sua estrutura molecular um radical alquilo que contém 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos desses sais tensioactivos aniónicos preferidos são os produtos da reacção obtidos sulfatando álcoois gordos em C8-Ci8 derivados de, por exemplo, óleo de sebo, óleo de palma, óleo de palmiste e óleo de coco; alquilbenzenossulfonatos em que o grupo alquilo contém 9 a 15 átomos de carbono; alquilgliceriléter-sulfonatos de sódio; éter-sulfatos de álcoois gordos derivados de óleos de sebo e de coco; monoglicérido sulfatos e sulfonatos de ácidos gordos de coco; sais solúveis em água de parafina-sulfonatos tendo 8 a 22 átomos de carbono na cadeia alquilo. Podem também ser utilizados agentes tensioactivos de olefinas sulfonadas como são mais concretamente descritos em, por exemplo, a Memória Descritiva da Patente U.S. 3 332 880. O catião de neutralização para os sulfonatos e/ou sulfatos sintéticos aniónicos é representado por catiões convencionais que são largamente utilizados na tecnologia dos detergentes tais como sódio, potássio ou alcanolamónio.

Um componente tensioactivo sintético aniónico apropriado é representado pelos sais solúveis em água de um ácido alquilbenzenossulfónio, preferivelmente alquilbenzenossulfonatos de sódio preferivelmente alquilbenzenossulfonatos de sódio que têm entre cerca de 10 e 13 átomos de carbono no grupo alquilo. Outro componente tensioactivo aniónico preferido da presente invenção é um alquilsulfato de sódio que tem entre cerca de 10 e 15 átomos de carbono no grupo alquilo.

Outra agente tensioactivo aniónico apropriado para utilização de acordo com a presente invenção pode ser um agente tensioactivo de alquilsulfato alcoxilado. Agentes tensioactivos de alquilsulfato alcoxilado são sais solúveis em água ou ácidos da fórmula R0(A)mS03M na qual R é um radical alquilo em Ci0-C24 não substituído ou um grupo hidroxialquilo tendo um radical alquilo em C10-C24, preferivelmente um grupo alquilo ou hidroxialquilo em Ci2-C18, A é uma unidade etoxi ou propoxi, m é maior do que zero, tipicamente entre cerca de 0,5 e cerca de 6, mais preferivelmente entre 0,5 e 3, e M é H ou um catião que por exemplo pode ser um catião metálico (por exemplo, sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, etc.), ou um catião amónio ou amónio substituído. Alquil-sulfatos etoxilados assim como alquilsulfatos propoxilados são também considerados de 17 acordo com a presente invenção. Exemplos específicos de catiões amónio substituídos incluem os catiões metilamónio, dimetilamónio, trimetilamónio e amónio quaternário tal como tetrametilamónio e os catiões dimetilpiperidinio e os que derivam de alquilaminas tais como etilamina, dietilamina, trietilamina e suas misturas, e semelhantes. Agentes tensioactivos que são apontados como exemplos são C12-C18-alquil-polietoxilato (1,0) sulfato (C12-C18E(1,0)M), C12-C18-alquil-polietoxilato (2,25) sulfato (C12-Ci8E(2,25)M), C12-C18-alquil-polietoxilato (4,0) sulfato (Ci2-C18E(4,0)M), em que M é convenientemente escolhido de sódio e potássio.

As composições de acordo com a presente invenção compreendem 1% a 50% em peso da composição total do referido agente tensioactivo aniónico ou das suas misturas, preferivelmente entre 1% e 30%, mais preferivelmente entre 5% e 15%. O resto da composição líquida detergente de acordo com a presente invenção é formado por ingredientes convencionais de detergentes, isto é, água, agentes tensioactivos, agentes encorpastes e outros.

As composições detergentes líquidas podem adicionalmente compreender como um ingrediente opcional entre 0,5% e 50% em peso da composição detergente líquida total, preferivelmente entre 5 e 25% em peso de um agente tensioactivo orgânico escolhido de agentes tensioactivos não iónicos, catiónicos e híbridos e suas misturas.

Os agentes tensioactivos não iónicos apropriados para utilização de acordo com a presente invenção incluem os que são produzidos por condensação de óxido de etileno com um hidrocarboneto que tem um átomo de hidrogénio reactivo, por exemplo, um grupo hidróxido, carboxilo ou amido, na presença de um catalisador acídico ou básico, e incluem compostos que têm a fórmula geral RA(CH2CH20)nH na qual R representa o agrupamento hidrófobo, A representa o grupo que possui o átomo de hidrogénio reactivo e n representa o número médio de unidades de óxido de etileno. R tipicamente contém 8 a 22 átomos de carbono. Eles podem também ser formados pela condensação de óxido de propileno com um composto de peso molecular inferior, n usualmente varia entre 2 e 24.

Uma classe preferida de etoxilatos não iónicos é representada pelo produto de condensação de um álcool gordo que têm entre 12 e 15 átomos de carbono e entre 4 e 10 moles de unidades de óxido de etileno por mole de ácido gordo. Espécies apropriadas 18 desta classe de etoxilatos incluem: o produto de condensação de C12-C15-oxoálcoois e 3 a 9 moles de óxido de etileno por mole de álcool; o produto de condensação de uma fracção apertada Ci4-C15-oxoálcoois e 3 a 9 moles de óxido de etileno por mole de (oxo)álcool gordo; o produto de condensação de uma fracção apertada de C12-C13-(oxo)álcool gordo e 6,5 moles de óxido de etileno por mole de álcool gordo; e os produtos de condensação de um álcool gordo de coco C10-C4 com grau de etoxilação (moles de OE/mole de álcool gordo) no intervalo de 4 a 8. Os oxo-álcoois gordos embora principalmente lineares podem ter, dependendo das condições de processamento e do material de olefinas usado como matéria prima, um certo grau de ramificação, particularmente com cadeias curtas tais como ramificação metilo. Um grau de ramificação compreendido no intervalo de 15% a 50% (% em peso) encontra-se frequentemente em oxo-álcoois comerciais. As composições de acordo com a presente invenção contêm entre 0,5% e 50% da composição total, preferivelmente entre 2% e 25% de agentes tensioactivos não iónicos.

Um agente tensioactivo opcional para utilização na presente invenção é constituído por agentes tensioactivos catiónicos. Os agentes tensioactivos catiónicos apropriados incluem compostos de amónio quaternários da fórmula R!R2R3R4N+ na qual Ri, R2 e R3 são grupos metilo e R4 é um grupo alquilo em C12-Ci5 ou em que Rt é um grupo etilo ou hidroxietilo, R2 e R3 são grupos metilo e R* é um grupo alquilo em Ci2-Ci5. As composições de acordo com a presente invenção contêm entre 0,5% e 10% em peso da composição total, preferivelmente 1% a 5% de agentes tensioactivos catiónicos.

Outros ingredientes opcionais são agentes tensioactivo híbridos. Os agentes tensioactivos híbridos incluem derivados de compostos de amónio, fosfónio e sulfónio quaternários alifáticos em que um agrupamento alifático pode ser de cadeia linear ou ramificada e em que um dos substituintes alifáticos contém 8 a 24 átomos de carbono e o outro substituinte contem pelo menos um grupo aniónico que proporciona solubilização em água. Materiais híbridos particularmente preferidos são os sulfonatos e sulfatos de amónio etoxilados descritos em U.S. 3 925 262, Laughlin et al., e 3 929 678, Laughlin et al. Composições de acordo com a presente invenção contêm 0,5% a 25% em peso da composição total, preferivelmente 2% a 10% de agentes tensioactivos híbridos.

Agentes tensioactivos não iónicos semipolares incluem óxidos de amina solúveis em água que contêm um agrupamento alquilo ou hidroxialquilo com 8 a 28 átomos de carbono e dois agrupamentos escolhidos do grupo que consiste em grupos alquilo e grupos 19 hidroxialquilo contendo 1 a cerca de 3 átomos de carbono que podem ser opcionalmente unidos para formar estruturas de anel. São também apropriados agentes tensioactivos de amida de poli-hidroxi ácidos gordos da fórmula R2 -C-N-Z, na qual R1 é H, hidrocarbilo, 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo ou

II I O R1 uma sua mistura, R2 é C5.3i-hidrocarbilo e Z é um radical poli-hidroxi-hidrocarbilo tendo uma cadeia linear hidrocarbilo com pelo menos 3 grupos hidroxilo directamente ligados à cadeia, ou um seu derivado alcoxilado. Preferivelmente, Ri é metilo, R2 é uma cadeia alquilo ou alcenilo linear em Cn-i5 ou as suas misturas e Z deriva de um açúcar redutor tal como glucose, frutose, maltose, lactose, por meio de uma reacção de aminação com redução. As composições compreendem 1% a 25%, preferivelmente 5% a 15% de agentes tensioactivos de amidas de poli-hidroxiácidos gordos.

As composições de acordo com a invenção podem ainda compreender um sistema encorpante. É apropriado qualquer sistema encorpante convencional para utilização na presente invenção incluindo policarboxilatos e ácidos gordos, materiais tais como etileno-diamino-tetraacetato, sequestrantes de iões metálicos tais como aminopolifosfonatos, particularmente ácido etilenodiamino-tetrametileno-fosfónico e ácido de etileno triamino-pentametileno-fosfónico. Embora menos preferidos por razões ambientais óbvias, podem--se usar também encorpantes de fosfato.

Encorpantes de policarboxilatos apropriados para utilização na presente invenção incluem ácido cítrico, preferivelmente sob a forma de um sal solúvel em água, derivados de ácido succínico da fórmula R=(CH(COOH)CH2(COOH) na qual R é alquilo ou alcenilo em C10-2o, preferivelmente C12-ie ou em que R pode ser substituído por substituintes hidroxilo, sulfo sulfoxilo ou sulfona. Exemplos específicos incluem lauril-succinato, miristil-succinato, palmitil-succinato, 2-tetradecenil-succinato. Encorpantes de succinato são preferivelmente utilizados na forma do seus sais solúveis em água incluindo sais de sódio, potássio, amónio e alcanolamónio.

Outros policarboxilatos apropriados são oxodissuccinatos e misturas de ácido tartarato-monossuccínico e tartaratodisuccínico como descritos em US 4 663 071. 20

Encorpantes de ácido gordo apropriados para utilização na presente invenção são ácidos gordos saturados ou insaturados em Cio-Ci8, assim como os correspondentes sabões. As espécies saturadas preferidas têm 12 a 16 átomos de carbono da cadeia alquilo. O ácido gordo insaturado preferido é ácido oleico.

Um sistema de encorpante preferido para utilização na presente invenção consiste numa mistura de ácido cítrico, ácidos gordos e derivados de ácido succínico descritos acima na presente memória descritiva. O sistema encorpante de acordo com a presente invenção preferivelmente representa 5% a 35% em peso da composição total, preferivelmente 5% a 25%, mais preferivelmente 8% a 20%.

As composições de acordo com a presente invenção podem compreender 0,01% a 10% em peso da composição total, preferivelmente 0,1% a 5%, mais preferivelmente 0,5% a 2% de enzimas adicionais, isto é diferentes de celulases.

Enzimas apropriadas para utilização na presente invenção são protease, lipases e amilases e suas misturas. Enzimas adicionais preferidas para utilização de acordo com a presente invenção são proteases. Proteases apropriadas incluem proteases de origem animal, vegetal ou de microrganismos. As mais preferidas são proteases de origem bacteriana, mais preferivelmente serina protease obtida a partir de Bactillus subtilis e/ou Bactillus lichenformis.

Proteases comercialmente disponíveis apropriadas incluem AlcalaseR, EsperaseR, SavinasR da Novo Industri A/S (Copenhaga, Dinamarca), enzimas de MaxataseR, MaxacalR e Maxapem 15R (MaxacalR proteína preparada) Gist-brocades (Delft, Holanda) e substilisina BPN e BPN’. São também proteases preferidas as serina proteases bacterianas modificadas tais como as fabricadas por Genencor International Inc. (San Francisco, Califórnia) que são descritas no Pedido de Patente Europeia EP 251 446, depositado em 28 de Abril de 1987 (particularmente páginas 17, 24 e 98), e que são chamadas na memória descritiva “Protease B” e 199 404, Venegas, publicada em 29 de Outubro de 1986, que refere uma protease bacteriana modificada serina (Grenencor International) que é chamada na memória descritiva “Protease A” (o mesmo que BNP’). Proteases preferidas são assim escolhidas do grupo que consiste em AlcanaseR (Novo 21

Industri A/S), BNP', Protease A e Protease B (Grenencor) e suas misturas. A protease mais preferida para utilização é Protease B.

As composições de acordo com a presente invenção podem conter uma série de outros ingredientes opcionais. Exemplos desses aditivos incluem dissolventes, alcanolaminas, agentes de ajustamento do pH, agentes de regulação de espuma, agentes a pacificantes, agentes para melhorar a compatibilidade das máquinas em relação com as superfícies revestidas com esmalte, perfumes, corantes, bactericidas, agentes abrilhantadores, agentes de libertação da sujidade, agentes amaciantes e semelhantes.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser formuladas como composições detergentes líquidas convencionais ou, como uma alternativa, como as assim chamadas composições detergentes líquidas “concentradas”, isto é composições detergentes líquidas que compreendem menos de 30% de água.

De acordo com a presente invenção, a estabilidade de armazenagem da celulase nas composições pode ser avaliada por meio de um certo número de métodos que se baseiam no comportamento de permanência real da celulase depois da armazenagem e a utilização de substratos de celulose sólida.

Um desses métodos pode ser um método de ensaio do comportamento em pequena escala. De acordo com este método, mede-se a libertação do pelo de algodão de flanela pré-envelhecida devido à actividade da celulase.

Outro método pode ser um método analítico de previsão usando linters de algodão sólidos como substrato. De acordo com este método mede-se a libertação de açúcar redutor.

Outros métodos compreendem a medição da actividade da celulase pela observação da diminuição de viscosidade numa solução de CMC ou a medição de açúcares redutores libertados para a solução devido à degradação dos substratos de celulose solúveis. Como é a absorção de celulase no substrato de sólido que determina o comportamento, métodos baseados em substratos de celulose solúveis não são apropriados para determinar a estabilidade da celulase de acordo com a presente invenção. 22

Exemplos

Os seguintes exemplos são feitos combinando os seguintes ingredientes nas proporções que se encontram indicadas na lista.

Exemplos de composições de detergentes líquidos com aminas hidrófobas

Composição em % Água e componentes secundários Alquilo em C12 linear benzenossulfonato Ci2-Ci5-alquilsulfato Ci2-Ci5-alquilsulfato +3 moles de óxido de etileno Ci2-Ci4-alquil- -glucósido Álcool em C12-Ci5 +7 moles de óxido de etileno Ácidos gordos em C12-C18 Ácido cítrico anidro Succinato de C^.u--alcenilo DTPMP ou DTPA Hidróxido de sódio (a pH 7,5-8,0) Monoetanolamina (a pH 7,5-8,0) Etanol Propan odiol Ácido bórico Protease 0,3 Celulase-Carezima (Marca Registada) Amina hidrófoba: n-butilamina n-bexilamina n-octilamina ciclo-hexilaminaEstabilidade da celulase: % de celulase presente depois de 1 semana de armazenagem à temperatura constante de 35°C

Ref A B resto até perfazer 100 7 7 7 0 0 0 9 9 9 0 0 0 9 9 9 2 2 2 3 3 3 10 10 10 0,7 0,7 0,7 7 5 5 0 0 0 4 4 4 2 2 2 1 1 1 0,3 0,3 0,3 1 1 1 0 1,5 0 0 0 2,1 0 0 0 0 0 0 C D Ref resto até perfazer 100 7 7 0 0 0 16 9 9 3 0 0 7 9 9 5 2 2 10 3 3 3 10 10 0 0,7 0,7 1,5 5 5 0 0 0 10 4 4 0 2 2 18 1 1 3 0,3 0,3 0,5 1 1 1 0 0 0 0 0 0 2,6 0 0 0 2 0 37 82 82 80 84 30 0 0 0 16 16 0 3 3 23 7 7 9 5 5 6 10 10 9 3 3 6 0 0 0 1,5 1,5 1,0 0 0 0 8 7 14 0 0 2 18 18 12 3 3 2 0,5 0,5 0,5 1 1 1 0 0 0 2,1 5 0 0 0 0 0 0 0 50 60 40 E F Ref resto até perfazer 100 G H I 0 0 0 0 0 0 23 23 23 9 9 9 6 6 6 9 9 9 6 6 6 0 0 0 1,0 1,0 1,0 0 0 0 13 12 13 2 2 2 12 12 12 2 2 2 0,5 0,5 0,5 1 1 1 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 0 2,1 58 79 60 23 INFORMAÇÃO PARA SEQUÊNCIA ID N° 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento : 1060 pares de base (B) Tipo : ácido nucleico (C) Número de hélices : única (d) Topologia : linear

(ii) TIPO DA MOLÉCULA : cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) FONTE DE OBTENÇÃO ORIGINAL (A) Organismo : Humicola insolens (B) Estirpe: DSM 1800

(ix) CARACTERÍSTICA (A) Nome/chave : pépido mate (B) Localização : 73.927

(ix) CARACTERÍSTICA (A) Nome/chave : pépido sig (B) Localização : 10.72

(ix) CARACTERÍSTICA

(A) Nome/chave: CDS (B) Localização : 10.927 INFORMAÇÃO PARA SEQUÊNCIA ID N° 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento : 305 aminoácidos (B) Tipo : aminoácido (D) Tipologia : linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA : proteína 24 INFORMAÇÃO PARA SEQUÊNCIA ID N° 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento : 1473 pares de base (B) Tipo : ácido nucleico (C) Número de hélices : única (D) Topologia : linear

(ii) TIPO DA MOLÉCULA : cDNA

(iii) HIPOTÉTICA : NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL (A) Organismo : fusarium oxysporum (B) Estirpe : DSM 2672

(ix) CARACTERÍSTICA

(A) Nome/chave: CDS (B) Localização : 97.1224 INFORMAÇÃO PARA SEQUÊNCIA ID N° 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento : 376 aminoácidos (B) Tipo : aminoácido (D) Topologia : linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA : proteína 25 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQUENCIA ID N° 1 : GGATCCAAG ATG Met -21 CGT Arg -20 TCC Ser TCC Ser CCC Pro CTC Leu GCC Ala CTG Leu CCG Pro GTG Vai -5 TTG Leu GCC Ala CTT Leu GCC Ala TGG GAC TGC TGC AAG CCT TCG TGC Trp Asp 10 Cys Cys Lys Pro Ser 15 Cys AAC CAG CCT GCT TTT TCC TGC AAC Asn 25 Gin Pro Vai Phe Ser 30 Cys Asn CTC Leu -15 CCG Pro TCC Ser GCC Ala GTT Vai GTG Vai -10 GCC Ala 46 GCT GAT GGC AGG TCC ACC CGC TAC Ala 1 Asp Gly Arg Ser 5 Thr Arg Tyr 96 GGC TGG GCC AAG AAG GCT CCC GTG 144 Gly Trp Ala Lys 20 Lys Ala Pro Vai GCC AAC TTC CAG CGT ATC ACG CAG 192 Ala Asn Phe 35 Gin Arg lie Thr Asp 40 TTC GAC GCC AAG TCC GGC TGC GAG Phe Asp Ala Lys Ser 45 Gly Cys Glu GCC Ala GAC Asp CAG Gin ACC Thr 60 CCA Pro TCG Trp GCT Ala GTG Vai GCT Ala GCC Ala ACC Thr 75 TCT Ser ATT lie GCC Ala GGC Gly AGC Ser 80 CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC 240 Pro Gly 50 Gly Vai Ala Tyr Ser 55 Cys AAC GAC GAC TTC GCG CTC GGT TTT 288 Asn 65 Asp Asp Phe Ala Leu 70 Gly Phe AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC 386 Asn Glu Ala Gly Trp 85 Cys Cys Ala TGC Cys TAC Tyr 90 GAG Glu CTC Leu ACC Thr TTC Phe ACA Thr 95 TCC Ser GTC Vai 105 GTC Vai CAG Gin TCC Ser ACC Thr AGC Ser 110 ACT Thr GGC Gly GAT Asp CTC Leu AAC Asn ATC lie CCC Pro GGC Gly GGC Gly GGC Gly 125 GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG 384 Gly Pro Vai Ala 100 Gly Lys Lys Met GGT Gly GAT Asp CTT Leu 115 GGC Gly AGC Ser AAC Asn CAC Hls TTC Phe 120 432 GTC Vai GGC Gly ATC lie TTC Phe GAC Asp GGA Gly TGC Cys ACT Thr 480 130 135 26 GCC CAG TTC GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC 528 Pro Gin Phe Gly 140 Gly Leu Pro Gly Gin 145 Arg Tyr Gly Gly lie 150 Ser Ser CGC AAC GAG TGC GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GGC TGC TAC 576 Arg Asn Glu 155 Cys Asp Arg Phe Pro 160 Asp Ala Leu Lys Pro 165 Gly Cys Tyr TGG CGC TTC GAC TGG TTC AAG AAC GCC GAC AAT CCG AGC TTC AGC TTC 624 trp Arg 170 Phe Asp Trp Phe Lys 175 Asn Ala Asp Asn Pro 180 Ser Phe Ser Phe CGT CAG GTC CAG TGC CCA GCC GAG CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC 672 Arg 185 Gin Vai Gin Cys Pro 190 Ala Glu Leu Vai Ala 195 Arg Thr Gly Cys Arg 200 CGC AAC GAC GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC 720 Arg Asn Asp Asp Gly 205 Asn Phe Pro Ala Vai 210 Gin lie Pro Ser Ser 215 Ser ACC AGC TCT CCG GTC AAC CAG CCT ACC AGC ACC AGC ACC ACG TCC ACC 768 Thr Ser Ser Pro 220 Vai Asn Gin Pro Thr 225 Ser Thr Ser Thr Thr 230 Ser Thr TCC Ser ACC Thr ACC Thr 235 TCG Ser AGC Ser CCG Pro CCA Pro GTC Vai 240 CAG Gin CCT Pro ACG Thr ACT Thr CCC Pro 245 AGC Ser GGC Gly TGC Cys 816 ACT Thr GCT Ala 250 GAG Glu AGG Arg TGG Trp GCT aAa CAG Gin 255 TGC Cys GGC Gly GGC Gly AAT Asn GGC Gly 260 TGG Trp AGC Ser GGC Gly TGC Cys 864 ACC ACC TGC GTC GCT GGC AGC ACT TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC 912 Thr 265 Thr Cys Vai Ala Gly 270 Ser Thr Cys Thr Lys 275 lie Asn Asp Trp Tyr 280 CAT CAG TGC CTG TAGACGCAGG GCAGCTTGAG GGCCTTACTG GTGGCCGCAA 964 His Gin Cys Leu 285 CGAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024

GATTGTCACA TAAATGCAAT GAGGAACAAT GAGTAC 1060 27 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 2:

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala Ala Leu Pro -21 -20 -15 -10 Vai Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys -5 1 5 10 Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Vai Asn Gin Pro 15 20 25 Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg lie Thr Asp Phe Asp Ala 30 35 40 Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Vai Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gin 45 50 55 Thr Pro Trp Ala Vai Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr 60 65 70 75 Ser lie Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu 80 85 90 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Vai Ala Gly Lys Lys Met Vai Vai Gin 95 100 105 Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn 110 115 120 lie Pro Gly Gly Gly Vai Gly lie Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe 125 130 135 Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Asn Glu 140 145 150 155 Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe 160 165 170 Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gin Vai 175 180 185 Gin Cys Pro Ala Glu Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 190 195 200 Asp Gly Asn Phe Pro Ala Vai Gin lie Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser 205 210 215 28

Pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr 220 225 Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr 240 Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn 255 Vai Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys 270 275

Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 230 235 Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu 245 250 Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys 260 265 lie Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys 280

Leu 29 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 3:

GAATTCGCGG CCGCTCATTC ACTTCATTCA TTCTTTAGAA TTACATACAC TCTCTTTCAA AACAGTCACT CTTTAAACAA AACAACTTTT GCAACA ATG Met 1 CGA Arg TCT Ser TAC Tyr ACT Thr 5 CTT Leu 11 CTG Leu GCC Ala CTG Leu GCC Ala 10 GGC Gly CCT Pro CTC Leu GCC Ala GTG Vai 15 AGT Ser GCT Ala GCT Ala TCT Ser GGA Gly 20 AGC Ser GGT Gly 162 CAC His TCT Ser ACT Thr 25 CGA Arg TAC Tyr TGG Trp GAT Asp TGC Cys 30 TGC Cys AAG Lys CCT Pro TCT Ser TGC Cys 35 TCT Ser TGG Trp AGC Ser 210 GGA Gly AAG Lys 40 GCT Ala GCT Ala GTC Vai AAC Asn GCC Ala 45 CCT Pro GCT Ala TTA Leu ACT Thr TGT Cys 50 GAT Asp AAG Lys AAC Asn GAC Asp 258 ACC Asn 55 CCC Pro ATT lie TCC Ser AAC Asn ACC Thr 60 AAT Asn GCT Ala GTC Vai AAC Asn GGT Gly 65 TGT Cys GAG Glu GGT Gly GGT Gly GGT Gly 10 306 TCT Ser GCT Ala TAT Tyr GCT Ala TGC Cys 75 ACC Thr AAC Asn TAC Tyr TCT Ser CCC Pro 80 TGG Trp GCT Ala GTC Vai AAC Asn GAT Asp 85 GAG Glu 354 CTT Leu GCC Ala TAC Tyr GGT Gly 90 TTC Phe GCT Ala GCT Ala ACC Thr AAG Lys 95 ATC lie TCC Ser GGT Gly GGC Gly TCC Ser 100 GAG Glu GCC Ala 402 30 AGC TGG TGC TGT GCT TGC Ser Trp Cys 105 Cys Ala Cys AAG GGC AAG AAG ATG ATC Lys Gly 120 Lys Lys Met lie GGC GAC AAC CAC CCT CAT Gly 135 Asp Asn His Phe Asp 140 TTC GAC GGC TGC ACC TCT Phe Asp Gly Cys Thr 155 Ser TAC GGC GGT ATC TCC TCC Tyr Gly Gly lie 170 Ser Ser CTC AAG GAC GGT TGC CAC Leu Lys Asp 185 Gly Cys His ACC CCT GAC TTC ACC TTT Asn Pro 200 Asp Phe Thr Phe GAC ATC AGT GGA TGC AAG Asp 215 lie Ser Gly Cys Lys 220 AAG GTT GAT ACC TCG GCC Lys Vai Asp Thr Ser 235 Ala AAG ACC ACC TCC GCT GCT Lys Thr Thr Ser 250 Ala Ala TCC GCT CCT GTT GTC CAG Ser Ala Pro 265 Vai Vai Gin GAG Glu CCT Pro 280 ACT Thr AAG Lys CCC Pro GCC Ala ACC Thr 295 AAG Lys CCT Pro GCT Ala GCT Ala ACC Thr 300 ACA ACC CAG AAG GTC CGT Thr Thr Gin Lys Vai 315 Arg TAT GCT TTG ACC TTC ACC Tyr Ala Leu Thr Phe Thr 110 115 GTC Vai 125 CAG Gin TCC Ser ACC Thr AAC Asn ACT Thr 130 CTC Leu ATG Met ATG Met CCC Pro GGC Gly 145 GGT Gly GAG Glu TTC Phe GGC Gly AAG Lys 160 GCT Ala CTC Leu CGA Arg AGC Ser GAA Glu 175 TGT Cys GAT Asp AGC Ser TGG Trp CGA Arg 190 TTC Phe GAC Asp TGG Trp TTC Phe GAG Glu 205 CAG Gin GTT Vai CAG Gin TGC Cys CCC Pro 210 CGT Arg GAT Asp GAC Asp GAC Asp TCC Ser 225 AGC Ser AGC AAG CCC CAG CCC TCC Ser Lys Pro Gin 240 Pro Ser GCT Ala GCC Ala GCT Ala 255 CAG Gin CCC Pro CAG Gin AAG Lys TCC Ser 270 TCC Ser ACC Thr AAG Lys CCT Pro GAC Asp 285 AAG Lys CCC Pro CAG Gin ACC Thr GAC Asp 290 AAG Lys CCC Pro GTC Vai CAA Gin CCT Pro 305 GCT Vai GGA Gly ACC Thr AAA Lys ACC Thr CGA Arg GGA Gly 320 ACT GGC CCC GTC 450 Gly Pro Vai GGA GGT GAT CTC 498 Gly Gly Asp Leu GGT GTC GGT ATC 54 Gly Vai Gly lie 150 GGC GGT GCC CAG 594 Gly Gly Ala Gin 165 TAC CCC GAG CTT 642 Tyr Pro Glu Leu 180 GAG ACC GCC GAC 690 Glu Asn Ala Asp 195 AAG GCT CTC CTC 738 Lys Ala Leu Leu TTC CCT GCC TTC 786 Phe Pro Ala Phe 230 AGC TCC GCT AAG 834 Ser Ser Ala Lys 245 AAG ACC AAG GAT 882 Lys Thr Lys Asp 360 GCC GCT CAG CCC 930 Ala Ala Gin Pro 275 AAG CCT GTC GCC 978 Lys Pro Vai Ala AAC AAG CCC AAG 1026 Asn Lys Pro Lys 310 AGC TGC CCG GCC 1074 Ser Cys Pro Ala 325 31 AAG Lys ACT Thr GAC Asp GCT Ala 330 ACC Thr GCC Ala AAG Lys GCC Ala TCC Ser 335 GTT Vai GTC Vai CCT Pro GCT Ala TAT Tyr 340 TAC Tyr CAG Gin 1122 TGT Cys GGT Gly GGT Gly 345 TCC Ser AAG Lys TCC Ser GCT Ala TAT Tyr 350 CCC Pro AAC Asn GGC Gly AAC Asn CTG Leu 355 GCT Ala TGC Cys GCT Ala 1170 ACT GGA AGC AAG TGT GTC AAG CAG AAC GAG TAC TAC TCC CAG TGT GTC 1218 Thr Gly Ser Lys Cys Vai Lys Gin Asn Glu Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai 360 365 370 CCC AAC TAAATGGTAG ATCCATCGGT TGTGGAAGAG ACTATGCGTC TCAGAAGGGA 127

Pro Asn 375 TCCTCTCATG AGCAGGCTTG TCATTGTATA GCATGGCATC CTGGACCAAG TGTTCGACCC 1334 TTGTTGTACA TAGTATATCT TCATTGTATA TATTTAGACA CATAGATAGC CTCTTGTCAG 1394 CGACAACTGG CTACAAAAGA CTTGGCAGGC TTGTTCAATA TTGACACAGT TTCCTCCATA 1454 AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1473 32 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4:

Met Arg Ser Tyr Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Vai 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys 20 25 30 Pro Ser Cys Ser Trp Ser Gly Lys Ala Ala Vai Asn Ala Pro Ala 35 40 45 Thr Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro lie Ser Asn Thr Asn Ala Vai 50 55 60 Gly Cys Glu Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser 65 70 75 Trp Ala Vai Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu 100 105 110 Phe Thr Thr Gly Pro Vai Lys Gly Lys Lys Met lie Vai Gin Ser 115 120 125 Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Met Met 130 135 140 Gly Gly Gly Vai Gly lie Phe Asp Gly Cys Thr Ser Glu Phe Gly 145 150 155 Ala Leu Gly Gly Ala Gin Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Ser Glu 165 170 175 Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gly Cys His Trp Arg Phe 180 185 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gin Vai 195 200 205 Cys Pro Lys Ala Leu Leu Asp lie Ser Gly Cys Lys Arg Asp Asp 210 215 220 Ser Ser Phe Pro Ala Phe Lys Vai Asp Thr Ser Ala Ser Lys Pro 225 230 235

Ser Lys Leu Asn Pro 80 lie Thr Thr Pro Lys 160 Cys Asp Gin Asp Gin 240 33

Pro Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gin 245 250 255 Pro Gin Lys Thr Lys Asp Ser Ala Pro Vai Vai Gin Lys Ser Ser Thr 260 265 270 Lys Pro Ala Ala Gin Pro Glu Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gin 275 280 285 Thr Asp Lys Pro Vai Ala Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Vai Gin 290 295 300 Pro Vai Asn Lys Pro Lys Thr Thr Gin Lys Vai Arg Gly Thr Lys Thr 305 310 315 320 Arg Gly Ser Cys Pro Ala Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Vai 325 330 335 Vai Pro Ala Tyr Tyr Gin Cys Gly Gly Ser Lys Ser Ala Tyr Pro Asn 340 345 350 Gly Asn Leu Ala Cys Ala Thr Gly Ser Lys Cys Vai Lys Gin Asn Glu 355 360 365 Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai Pro Asn 370 375

Lisboa, '25 JUL. 2000

Por THE PROCTER & GAMBLE COMPANY

Agente Oficial da Propriedade Industria! Areo da Conceição, 3,1?- 1100 LISBOA 34 FIGURA 1. DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N°. 5 OKPCBTKBVH POl/TTFRCTK RQOCKPATBF ZVLOSLSBn BRABaLOPOQ C8WHWWI PVCPPVKBC* 70 xncimciPD ΥΒΟτσνττβα tslrlohilp οβκνρβηντ UDRnnn hlhumpift rimusTLPC 140

OlOISALTIirS MHPTGAX8XY RSOGAYYDTO TCDAOCFVTP ΓΤΜΠ/ΤΜΟ KOeCOOBDI «BVMHASHV 210 VPBTCHKKGL· TLCBOKBCAr aOVCSOTQCG WmVMUlP Y1QIBBPKV VTLKPrTWT OPL&aUUaci. 280 KKIHKFYVQD GKVIKJBPTTB MOWTTWg MBrCEATOS Rmmawo (MCHUklffltGM VLMfBnmDQ 350 OGmOBnUDBO RACPCAKGJBQ APBKZVQVBP rPBVTÍTlUJt «OBIOBTIOB VQKPKPKPOB OFKJBS 415 35

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição detergente líquida compreendendo 1-50% em peso de um agente tensioactivo aniónico, uma enzima de celulase e 0,5-10% em peso de uma amina que pode formar uma micela mista com um agente tensioactivo aniónico e em que pelo menos um dos grupos alquilo tem um comprimento da cadeia de átomos de carbono maior do que C3, de acordo com a fórmula R^RsN, na qual Ri e R2 são independentemente um do outro H ou uma cadeia alquilo em C2 - C9 e R3 é uma cadeia alquilo em C2 - C9 ou ciclo-hexilo ou ciclopentilo ou ciclo-heptilo.
2. 2. Composição detergente líquida de acordo com a reivindicação 1, na qual a amina é uma ciclo-hexilamina e/ou uma n-hexilamina.
3. 3. Composição detergente líquida de acordo com as reivindicações 1 a 3, compreendendo ainda uma enzima de protease.
4. 4. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo 0,5% a 5% em peso da composição total da referida amina.
5. 5. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo entre 0,01% e 5% (a 5000 CEVU/g) da mencionada celulase.
6. 6. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, na qual a celulase consiste essencial mente num componente de endoglucanase homogénea que é imuno reactiva com anticorpo contra uma celulase com cerca 43 kD muito purificada derivada de Humicla insolens, DSM 1800, ou que é homóloga da mencionada endoglucanase de 43 KD.
7. 7. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o componente de endoglucanase da citada celulase tem um ponto isoeléctrico igual a cerca de 5,1.
8. 8. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações 1 anteriores, em que a celulase tem uma sequência de aminoácidos representada na lista de sequência anexa ID N° 2 ou é um seu homólogo que possui actividade de endoglucanase.
9. 9. Composição detergente líquida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o composto de celulase ser uma enzima de endoglucanase que tem a sequência de aminoácidos representada na lista de sequência em anexo ID N° 4, ou é um seu homólogo que possui actividade de endoglucanase.
10. 10. Composição detergente líquida de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de a celulase ser uma enzima de endoglucanase que tem uma sequência de aminoácidos representada na lista da sequência ID N° 4 em anexo ou é um seu homólogo que possui a actividade de endoglucanase.
11. 11. Utilização de entre 0,5-10% em peso de uma amina que pode formar uma micela mista com um agente tensioactivo aniónico e em que pelo menos um dos grupos alquilo tem um comprimento da cadeia de átomos de carbono maior do que C3, de acordo com a fórmula : R^RsN em que Ri e R2 são independentemente H ou uma cadeia de alquilo em C2 - C9 e R3 é uma cadeia de alquilo em C2 - C9 ou çiclo-hexilo ou ciclopentilo ou ciclo-heptilo, como um estabilizador de celulase das composições detergentes líquidas compreendendo 1-50% em peso de um agente tensioactivo aniónico e enzima de celulase. Lisboa, 25 JUL. WW Por THE PROCTER & GAMBLE COMPANY

    Agente Oficial da Propriedade Industrial Arco da Conceição, 3,1t - 1100 USBQA 2 RESUMO “AMINAS HIDRÓFOBAS PARA A ESTABILIZAÇÃO DA CELULASE EM COMPOSIÇÕES DETERGENTES LÍQUIDAS CONTENDO AGENTE TENSIOACTIVO ANIÓNICO E CELULASE” Uma composição detergente líquida que contém agente tensioactivo aniónico e celulase compreende ainda aminas hidrófobas como agentes estabilizadores da celulase.