JPH09107996A - 検出可能にラベルされた二元的形態、オリゴヌクレオチドプローブ、アッセイおよびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 広い範囲のアッセイ条件下において、標的配
列とわずかに異なる別の配列と標的配列とを区別してハ
イブリダイズできる、検出可能にラベルされた二元的形
態、オリゴヌクレオチドプローブ、アッセイおよびキッ
トを提供する。 【解決手段】 標的相補配列と、標的配列の非存在下で
閉じた形態にプローブを保持する親和性ペアと、プロー
ブが閉じた状態にあるときに相互作用するラベルペアと
を含む核酸標的配列を検出するためのユニタリーハイブ
リダイゼーションプローブ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸ハイブリダイ
ゼーションプローブを含むアッセイの分野に関する。ア
ッセイは、特定の遺伝子、遺伝子セグメント、ＲＮＡ分
子および他の核酸の検出に使用できる。このようなアッ
セイは、例えば組織、血液および尿のサンプル等のよう
に臨床的に、また食物技術の分野、農業および生物学的
研究の分野で用いられる。

【０００２】

【従来の技術】複合混合物中の特異的標的配列を検出す
るために、核酸ハイブリダイゼーションプローブが用い
られる。GillespieおよびSpiegelman(1965)に記載され
たような従来の不均一なハイブリダイゼーションアッセ
イは、典型的に以下の工程、すなわち、キャプチャープ
ローブを用いてあるいは用いずに、紙、ビーズもしくは
プラスチック表面に対する少なくとも標的核酸の固定
化；標的の配列に相補的な過剰の標識プローブの添加；
ハイブリダイゼーション；ハイブリダイズしないプロー
ブの除去；および固定された標的に結合した残存するプ
ローブの検出を含む。

【０００３】ハイブリダイズしないプローブは、ハイブ
リッドの大量の洗浄によって除去する。これは、一般的
に最も時間のかかる工程の一部分であって、しばしばサ
ンドウィッチハイブリダイゼーション等の複雑な構成を
利用する。固体表面の使用により、標的の可動性または
標的への接近を制限することによって、ハイブリダイゼ
ーションにかかる時間が延びる。固体表面により提示さ
れた広いエリアは、非限定的にハイブリダイズしないプ
ローブを維持し、バックグラウンドシグナルをもたら
す。さらに、固体表面は、プローブからのシグナルに抵
触する。プローブ−標的ハイブリッドが単離される要件
が、in vivoでの検出および合成反応中における核酸の
同時検出（リアルタイム検出）を妨げる。

【０００４】時として不均一アッセイと称される、いく
つかの溶液-相検出機構が知られている。“不均一(homo
geneous)”により、プローブ-標的ハイブリッドからハ
イブリダイズしないプローブを分けることなく行われる
アッセイを意味する。これらの機構は、多くの蛍光ラベ
ルの蛍光は当面の化学的環境によって影響され得るとい
う事実を利用している。このような機構の一つは、Hell
erら（１９８３）およびCardulloら（１９８８）によて
記述されている。これは、標的ＤＮＡ鎖の連続領域に相
補的な一対のオリゴデオキシヌクレオチドプローブを用
いる。一方のプローブは、その５’末端に蛍光ラベルを
含み、他のプローブはその３’末端に別の蛍光ラベルを
含む。プローブが標的配列にハイブリダイズする際に、
この二つのラベルが互いに非常に近接する。サンプルが
適切な周波数の光で刺激されると、一方のラベルから他
方へ蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance
energy transfer)（“ＦＲＥＴ”）が起こる。このエネ
ルギー転移は、標的の存在の間接的信号化するスペクト
ル反応における測定可能な変化をもたらす。しかしなが
ら、変化したスペクトル特性は微妙であり、この変化は
バックグラウンドシグナルに比べて小さい。モニタリン
グには精巧な装置が必要とされ、感度が制限されてい
る。さらに、場合によっては、ハイブリダイゼーション
シグナルがネガティブである、すなわち標的の存在によ
り特定の波長で測定される蛍光の量が減少する。

【０００５】この技術は、二つの会合していないプロー
ブが一本鎖の標的配列に同時に結合することを必要とす
る。この３分子間ハイブリダイゼーションの機構は、こ
の技術をリアルタイム検出に適合させるにはあまりにも
遅い。標的が一本鎖であるという要件は、この技術を二
本鎖の核酸のin vivo検出に不適切にしてしまう。

【０００６】他の溶液-相機構も一対のオリゴデオキシ
ヌクレオチドプローブを利用する。しかしながら、ここ
で二つのプローブは、互いにおよび標的ＤＮＡの相補鎖
に対して完全に相補的である（Morrison, 1987; Morris
on, 1989; Morrisonら, 1989; MorrisonとStols, 199
3）。各プローブは、その３’末端に結合した発蛍光団
およびその５’末端結合した消光分子を含む。

【０００７】この二つのオリゴヌクレオチドプローブが
互いにアニールされる際に、各プローブの発蛍光団は、
他のプローブの消光分子に近接して保持される。蛍光ラ
ベルが適切な周波数の光で刺激されれば、蛍光は消光分
子によって消光される。しかしながら、各プローブが標
的に結合すれば、相補プローブの消光効果はなくなる。
このプローブは十分に長いので、標的に結合した際に自
分で消光することはない。

【０００８】この種のアッセイでは、二つの対立するデ
ザインの考慮がある。標的に対するプローブのハイブリ
ダイゼーションを確実に急速にする高濃度のプローブを
有することが望ましい。標的に結合したプローブからの
シグナルが、標的または他のプローブのいずれかにハイ
ブリダイズしていないプローブからのバックグラウンド
シグナルによって圧倒されないような低い濃度のプロー
ブを有することも好ましい。この状況は、蛍光シグナル
を読む前にバックグラウンドの蛍光を低下させるのに比
較的長時間待つ必要がある。

【０００９】この計画に係るアッセイは、プローブと標
的配列を含むサンプルとの混合物を融解させることによ
って始まる。次いで温度を下げて、競合ハイブリダイゼ
ーションを導く。あるプローブは標的にハイブリダイズ
し、存在すれば、あるものは相補プローブにハイブリダ
イズする；そしてあるものはハイブリダイズせずバック
グラウンドシグナルを産する。平衡した対照アッセイ
（a parallel control assay）は標的無しに行われ、蛍
光のバックグラウンドレベルのみを与える。サンプルが
十分な標的を含有するものであれば、検出可能なより高
レベルの残余蛍光が得られる。

【００１０】この計画では、ほとんど全ての過剰プロー
ブがそれらの相補物にアニールさせるためにかなりの時
間の間残余蛍光の読みとりを遅延させる必要がある。ま
た、平衡した対照反応が行われなければならない。さら
に、低濃度のプローブが、蛍光バックグラウンドを減少
するために用いられる。しかして動力学が貧弱で、本質
的に遅いアッセイになってしまう。これは、リアルタイ
ムの検出を妨げる。プローブ並びに標的は、融解が必要
であり、アッセイをin vivoでの使用に不適切なものと
する。また、シグナルは残余のみならず、外部のコント
ロールとの比較とは別のシグナルである。

【００１１】鎖置換（strand ）として知られるこの現
象を利用した他の溶液相計画は、Diamondら、1988によ
って記載されている。典型的に、これらのアッセイは、
二分子核酸プローブ複合体を含む。標的配列のサブセッ
トを含む短い方の一本鎖は、プローブの完全な標的結合
領域を含む長い方のプローブの一本鎖にアニールする。
しかして、報告されたプローブ複合体は、一本鎖と二本
鎖の部位の両方を含む。この参考文献は、これらのプロ
ーブ複合体が、短い方の鎖に結合した³²Ｐラベル、また
はプローブ複合体が形成された際に互いに近接して保持
される蛍光および消光剤をさらに含んでもよいことを提
案している。

【００１２】これらのプローブ複合体を利用するアッセ
イにおいて、標的検出が二段階の工程で行われることが
述べられている。最初に、複合体の一本鎖部分が標的に
ハイブリダイズする。分岐点移動のメカニズムを介し
て、標的核酸がプローブ複合体から短いラベル保持鎖を
移動させた後に、標的認識が行われることが記載されて
いる。標的保持鎖は、溶液に放出されるとされており、
溶液から単離および検出される。捕捉工程における³²Ｐ
標識プローブとして報告された選択的調整においては、
二本の一本鎖核酸は単一分子に結合される。

【００１３】これらの鎖置換プローブ複合体は、欠点を
有している。このメカニズムは二段階であり、そこでは
プローブ複合体が最初に標的に結合しなければならず、
次いで分岐点移動を介して、標的が認識されシグナルが
産生される前に、鎖置換が起こらなければならない。二
分子プローブ複合体は、高い効率で形成するとは報告さ
れておらず、標的結合領域の大部分が標識鎖にアニール
されないようにプローブを調製する。これは、同じ標的
配列に対する、ラベル保持およびラベル無しの標的結合
領域間の競合を導く。さらに、標識鎖の非特異的減少を
伴う問題がある。さらに、置換された標識鎖は、シグナ
ルが検出される前にハイブリダイズしていないプローブ
複合体から分離される必要がある。この必要により、プ
ローブ複合体が均一なアッセイに不適切なものとされ
る。

【００１４】ラベルされたプローブを用いる従来の均一
および不均一なアッセイの欠点は、標的配列とわずかに
異なる他の配列へのハイブリダイズを避けながら、所定
の標的配列にハイブリダイゼーションをさせる困難さで
ある。許容できる条件の範囲は、狭くかつ、ある標的と
別の標的とが別になりがちである。アッセイを行う側の
立場から、また、アッセイおよびキットを開発および市
販する立場から共通のアッセイ条件が望ましいが、結果
的に、アッセイ条件は異なる標的−プローブの組み合わ
せによって変えなければならない。さらに、調節された
条件でさえ、組み立てられていない(unstructured)オリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて対立遺伝子間を区別す
ることは困難である。オリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションにおける違いのみで、一つの塩基対のみが
異なる対立遺伝子を区別することは困難である。さらな
る識別技術、例えば変異の場所で隣接するハイブリダイ
ゼーションプローブをリゲートする技術（Landegrenら,
U.S. Patent 4988617）またはポリメラーゼチェーン反
応の増幅産物の分解および電気泳動（Mullisら, U.S. P
atent 4683195）は、対立遺伝子間の識別を改良してい
る。しかしながら、これらのリゲーションまたは分解方
法は、さらなる試薬または工程、あるいはその両方を必
要とする欠点を備えている。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
したような、従来のハイブリダイゼーションプローブと
アッセイ、並びに現在の均一なハイブリダイゼーション
プローブとアッセイの制限を克服することである。本発
明の他の目的は、標的核酸配列とハイブリダイゼーショ
ンしてシグナルを生成するが、ハイブリダイズしていな
いときには、ほとんどあるいは全くシグナルを生成しな
いハイブリダイゼーションプローブであり、これらのプ
ローブを用いたアッセイである。さらに、本発明の目的
は、選択された標的配列に特異的な核酸プローブを作製
するために用いられるキットである。さらに、本発明の
目的は、このようなプローブを用いた均一なアッセイで
ある。

【００１６】さらに、本発明の目的は、ハイブリダイゼ
ーションプローブと、検出が早く遅延することなく行わ
れる急速な方法である。本願発明のさらなる目的は、ハ
イブリダイゼーションプローブと、in vivoで核酸を検
出できる方法である。本願発明のさらなる目的は、ハイ
ブリダイゼーションプローブと、in situで核酸を検出
できる方法である。本発明の更なる目的は、リアルタイ
ムで、核酸増幅および他の合成反応における核酸標的配
列を検出できるハイブリダイゼーションプローブと方法
である。本発明の更なる目的は、高価な装置を使用する
ことなく核酸標的を検出できるハイブリダイゼーション
プローブおよびアッセイである。本発明のさらなる目的
は、遺伝的対立遺伝子間、および一つのヌクレオチドの
みが異なる配列を含む、密接に関連した他の核酸配列を
区別する改良された能力を備えた、ラベルされたハイブ
リダイゼーションプローブ、およびこのようなプローブ
を用いたアッセイである。

【００１７】本発明のさらなる目的は、ラベルされたハ
イブリダイゼーションプローブであって、その構成は、
広い範囲のアッセイ条件で、または用意に標準化された
ハイブリダイゼーション条件を用いて、改良された対立
遺伝子識別のために修飾することができるものである。
診断および検索の分野におけるハイブリダイゼーション
方法の十分な可能性を実現させるために、標的にハイブ
リダイズした際に検出できるシグナルを産生するまでは
ほとんどあるいは全くシグナルを有しないプローブとの
溶液内におけるハイブリダイゼーションを観察する技術
が必要である。好ましくは、直線的または指数的動力学
で核酸を産生する反応の進行を観察することができるも
のである。また、プローブは、組織または細胞を破壊す
ることなくin vivo（およびin situ）で核酸の検出がで
きるものとすべきである。もちろん、プローブは従来の
ハイブリダイゼーションアッセイにも用いられる。さら
に、このアッセイは、直接的にあるいは増幅技術と共に
標的の非常に敏感な検出ができるべきである。また好ま
しくは、このプローブは、裸眼で検出可能なハイブリダ
イゼーションシグナルを生成するべきである。最後に、
このプローブは、一度のアッセイで別の標的の検出が可
能であるべきである。本発明の目的は、上記の要求の全
てまたはほぼ全てを満たす核酸ハイブリダイゼーション
アッセイおよびプローブである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明に係るプローブ
は、標的が存在しないアッセイ条件下で互いに相互作用
してステム二重鎖を形成する親和性ペア、または腕が隣
接した、核酸標的相補配列を有するラベルされたプロー
ブである。所定の標的配列に対するプローブのハイブリ
ダイゼーションにより、腕を放すように作用して、ステ
ム二重鎖を解除してプローブに形態的変化を起こす。本
発明に係るプローブの実施態様は、形態変化が検出され
る相互作用ラベル、または、特に限定された対立遺伝子
識別構造、あるいはこれらの両方を用いる。本発明は、
形態的に検出できるハイブリダイゼーションプローブ、
アッセイおよびキットを含む。また、共通ステム（univ
ersal stems）およびプローブを作製するために前記ス
テムを含むキットを含む。

【００１９】相互作用するラベルを備えた本発明に係る
プローブは“ユニタリー(unitary)”であり、ユニタリ
ーとは、ペアとして結合しかつ連結してアッセイで操作
される二分子プローブ、あるいは単一の一本鎖を意味す
る。これらは、少なくとも、所望の標的核酸に相補的な
一本鎖核酸配列、ここでは“標的相補配列”と称する；
相補的な核酸配列または他の親和性ペアの結合部材によ
って可逆的に相互作用する前記標的相補配列に隣接する
５’および３’領域；およびシグナルを生成する相互作
用するラベル分子を含む。本発明の好ましいプローブ
は、標的相補配列が標的に結合していないときの検出条
件下で互いにハイブリダイズすることによって可逆的に
相互作用する相補的な核酸配列または“腕”を含む。ユ
ニタリープローブが単一分子なら、上述の全ての成分が
一分子である。全ての対立遺伝子識別の実施態様が、単
一分子である。ユニタリープローブが二分子であれば、
標的相補配列の半分またはほぼ半分と、親和性ペアの一
方と、ラベルペアの一方とが各分子中に存在する。

【００２０】相互作用ラベルを備えた本発明のプローブ
のシグナル生成ラベル分子は、十分に離されたときでは
なく近接したときに、少なくとも一方のラベル分子が他
のラベル分子の少なくとも一つの物理学的に測定可能な
特性を変えることができるように適合した“ペア”であ
る。ラベル分子は、ラベル分子の互いの近接が、親和性
ペアの相互作用の状態によって制御されるようにプロー
ブに結合される。標的がなければ、ラベル分子は、親和
性ペアの結合相互作用により互いに近接に保持される。
この形態を、“閉じた”状態と称する。閉じた状態では
検出可能なシグナルが生成されない、これはほとんどの
実施態様を伴う事実であり、閉じた状態を“オフ”の状
態と称する。標的相補配列がその標的にハイブリダイズ
すると、形態変化がユニタリープローブ内に起こり、親
和性ペアを分離させ、結果として相互作用ラベルのラベ
ル分子を分離させる。この形態を“開いた”状態と称
し、ほとんどの実施態様において“オン”の状態であ
る。分離は、標的相補配列−標的配列ヘリックスの形成
の熱力学によって行われる。標的相補配列−標的配列ヘ
リックスの形成は、完全であっても切り込み(nicked)が
入っていても、アッセイ条件下での親和性ペアの誘引を
克服する。親和性ペアの分離がラベル分子の相互作用を
変えるので、シグナルが生成され、その後、プローブに
結合した少なくとも一つのラベル分子の少なくとも一つ
の特性における差異を測定することができる。本発明の
プローブの重要な特徴は、非特異的に結合した場合に
は、開いた形態に変形しないことである。

【００２１】相互作用ラベルを備えた本発明に係るプロ
ーブは、測定可能な特徴を備えており、しばしば“シグ
ナル”と称し、プローブが開いているか閉じているかに
よって異なる。測定可能な特徴は、ラベル分子の相互作
用の関数であり、これらの分子間の相互作用の度合いは
これらの分子の分離に応じて変化する。上述したよう
に、本発明のユニタリープローブは、閉じた形態と開い
た形態とを有する。ラベル分子は閉じた形態より開いた
形態においていっそう分離しており、この差異は少なく
とも一つの測定可能な特徴における検出可能な変化を生
ずるのに十分である。閉じた状態ではラベル分子の形態
は互いに“近接”しており、すなわち、相互作用するの
にこれらが十分に近いので、測定できる特徴が、検出で
きる量、質、もしくはレベルにおいて、このように相互
作用しない開いた形態と区別される。もちろん、この差
はできるだけ大きい方が好ましい。場合によっては、
“オフ”の状態で、測定可能な特徴ができるだけゼロに
近いシグナルであることが好ましい。

【００２２】測定可能な特徴は、蛍光共鳴エネルギー転
移(fluorescence resonance energytransfer)（ＦＲＥ
Ｔ）ペアの少なくとも一方を刺激するから得られる特有
の光シグナルでもよい。それは、検出可能な産物を生成
するために基質に対する酵素／抑制ペアまたは酵素／補
助因子ペアの作用から得られる色変化でもよい。これら
のどの場合においても、プローブは特有のシグナルを有
し、そのレベルは、プローブが閉じた状態にあるために
ラベル分子が近接しているか、またはプローブが開いた
状態にあるためにラベル分子が離れているかに依存する
と言える。上述したように、検出できるシグナルは、開
いたまたは閉じた形態にあるプローブによって生成され
る。ラベル分子の選択は、その状態でシグナルが生成さ
れるか、あるいは異なるシグナルが各状態で生成される
かを支配する。最も好ましい相互作用ラベル分子は、発
蛍光団／消光剤ペアであり、好ましくはプローブに共有
結合しており、最も好ましくは標的に相補的でない腕部
に共有結合したものである。しかして最も好ましいプロ
ーブは、開いた状態で標的に結合し、適切な光源で刺激
された際に特定の波長の陽性蛍光シグナルを生成する。
これらのプローブを称する際に、“オン”の状態のこの
形態も称する。

【００２３】本発明は、“共通ステム”とこれらを含む
キットも含む。本発明に係る共通ステムは、所望の標的
配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド類を共通ステムにリゲートあるいは共
有結合させることにより、一つまたは他の標的配列を検
出するための本発明に係るプローブを作製するために使
用することができる。本発明は、さらに本発明に係る少
なくとも一つの相互作用的にラベルされた、ユニタリー
プローブを利用するアッセイ方法を含む。本発明のこの
ようなアッセイは、一本鎖または二本鎖の標的に対して
用いることができる。しかしながら、標的とは無関係に
親和性ペアを分けるかもしれない一つのまたは複数の段
階を含むアッセイでは、単一分子のプローブのみが適し
ている。本発明に係るアッセイは、in vitroまたはin v
ivoで行うことができる。このようなアッセイは、組織
を破壊することなく生物または固定された組織における
in situで行うことができる。好ましいアッセイは、未
結合のプローブを除去するために分離または洗浄を必要
としないが、洗浄は性能を上げる。相互作用的にラベル
されたユニタリープローブを用いた最も好ましいアッセ
イは、均一(homogeneous)アッセイである。

【００２４】相互作用的にラベルされたプローブを用い
た本発明に係るアッセイは、本発明に係る少なくとも一
つのユニタリープローブを、標的配列を含む核酸鎖を含
むと思われるサンプルに、プローブに適したアッセイ条
件下で添加することを少なくとも含む。そして、標的配
列がない同一条件下における特徴と比較して、プローブ
の測定可能な特徴における変化があるか否かを評価す
る。アッセイは、定性的または定量的とすることができ
る。ある実施態様では、標的を含まないコントロールを
行い、コントロールでの反応とサンプルでの反応とを比
較することが望ましい。シグナルのレベルは、定量的な
定量として測定される。変化は単に定量的アッセイに検
出される。コントロールが用いられれば、サンプルとコ
ントロールとの間のシグナルの変化の差異が算出され
る。相互作用的にラベルされたプローブを用いた本発明
に係るアッセイは、本発明の少なくとも一つの単一分子
プローブを、増幅または他の核酸合成反応と関連させて
もよく、例えば：ポリメラーゼチェーン反応,ＰＣＲ，
(Erlichら, 1991)；Ｑ-βレプリカーゼ仲介増幅反応，
(Lomeliら,1989)；鎖置換増幅反応，ＳＤＡ，(Walker
ら,1992)；自己維持配列反応(self-sustained sequence
reactions)，３ＳＲ，(Guatelliら,1990)；および転写
並びに複製反応である。上述したように二分子プローブ
は、あらゆる反応において使用するには不適切であり、
例えば親和性ペアが標的に依存して分けられるＰＣＲ等
では不適切であるが、別の反応、例えば転写で用いるこ
とができる。しかしながら、上記のどの方法においても
単一分子プローブが好ましい。これらは、合成された標
的をリアルタイムに検出することができる。もちろん、
本発明の単一分子または二分子プローブのいずれでも、
完了した反応のアッセイで用いることができる。

【００２５】本発明に係る核酸プローブのある実施態様
を“対立遺伝子識別”プローブと称する。これらは、互
いに相補的な核酸の腕が隣接した比較的短い標的相補配
列を備えたラベルされた、単一分子プローブである。対
立遺伝子識別の実施態様は、完全に相補的な標的配列と
優先的にハイブリダイズする。これらのプローブにとっ
て標的ではない、内部に位置する一つのヌクレオチドに
よって変わった配列に対して識別する。対立遺伝子識別
の実施態様は相互作用するラベルを含んでもよく、この
場合には、プローブは、アッセイにおける作成、操作お
よび使用が上述されている相互作用ラベルプローブのサ
ブセットである。しかしながら、本発明の対立遺伝子識
別プローブは、放射活性ラベル等の相互作用しないラベ
ルを備えていてもよく、このような場合には、シグナル
レベルはプローブが開いているか閉じているかに依存し
て変わらない。非相互作用ラベルが用いられたときに
は、結合した（標的配列にハイブリダイズした）および
非結合のプローブは分けられなければならない。結合お
よび非結合（ハイブリダイズせず）のプローブを分離す
るための多くの技術が、核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイの当業者によく知られている。本発明に係る対立
遺伝子識別プローブ、相互作用ラベルを備えたプローブ
と非相互作用ラベルを備えたプローブの両方は、構築さ
れていないラベルされた核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブと比べて、一つのヌクレオチドの違いの非標的配
列と標的配列とを区別できる優れた能力を備えている。
これらは、適切に機能するためのアッセイ条件のより広
い許容範囲を備えている。さらに、特定の条件下におけ
るそれらの性能は、一般にオリゴヌクレオチドプローブ
が有していない設計の変更である、ステム二重鎖の構造
を変えることによって調節することができる。本発明に
係る改良された特徴の対立遺伝子識別プローブは、共通
の条件下における複数のアッセイ、および同一のアッセ
イに複数のプローブと標的を含む多重なアッセイを可能
にする。

【００２６】対立遺伝子識別プローブを用いた本発明に
係るアッセイは、植物またはヒトあるいは他の動物の対
立遺伝子の状態を調べるのに特に有益である。また、近
接したウイルス、細菌および他の生物、例えば、種、亜
種および変種等を区別するのにも使用できる。相互作用
的にラベルされた対立遺伝子識別プローブを利用するア
ッセイの実施態様は、上述したように、相互作用的ラベ
ルされたプローブを用いたアッセイのサブセットであ
る。非相互作用的ラベルされたプローブを用いたアッセ
イの実施態様は、一方で、慣例的な分離技術を含む。こ
れらの実施態様は、例えば、本発明に係る非相互作用ラ
ベルを有する少なくとも一つの単一分子プローブを、標
的配列を含む核酸鎖を有すると推定されるサンプルに、
そのプローブに適したアッセイ条件下で添加すること、
ハイブリダイズしないプローブを除去すること、および
非相互作用シグナルが存在するか否かを確かめることを
含むことができる。陽性または陰性のコントロールを用
いることができる。非相互作用シグナルのレベルは定量
的決定として測定することができ、シグナルレベルの変
化は定性的決定として決定することができる。コントロ
ールを用いれば、コントロールと非相互作用シグナルと
の違いを算定することができる。

【００２７】この発明は、増幅された標的の位置決め
（ロケーティング）および単離の手段も提供する。例え
ば、発蛍光団／消光剤ラベルペアを含む好ましいプロー
ブを利用して、ＰＣＲ産物が同定、定量そして任意にゲ
ル電気泳動後にゲル中のハイブリダイズしたプローブを
刺激することによって単離され、得られたシグナルの全
てが、標的の存在、量および位置を示している。同様
に、本発明は、核酸の混合物からあらゆる所望の核酸を
同定もしくは単離する手段を提供するものであり、クロ
マトグラフィーまたは電気泳動等の物理的手段で分離さ
れる。本発明は、本発明に係るアッセイを行うための試
薬および高分子のキットも含む。この記載において、
“プローブ”、“標的”、“オリゴヌクレオチド”、
“核酸”、“鎖”および他の用語をときとして単数で称
している。分子を記載するのに用いられる多くの用語が
単数形で用いられ、単一の分子あるいは複数を意味する
ことが当業者に理解されている。例えば、標的配列はア
ッセイでプローブによって検出されるが（実際に個々の
プローブ個々の標的配列と相互作用する）、アッセイは
プローブの多くのコピーと標的の多くのコピーを必要と
する。この場合には、用語は文脈で理解されるべきであ
る。このような用語は、単一の分子または複数の分子の
いずれかの意味に限定されない。

【００２８】本発明は、検出温度を含む所定のアッセイ
条件下で、所定の核酸標的配列を含む少なくとも一つの
核酸鎖を検出するためのラベルされたユニタリープロー
ブであって、１０から約１４０ヌクレオチドを有し、
５’末端と３’末端とを備えかつ標的配列に相補的であ
る一本鎖標的相補配列と、前記５’末端に隣接かつ共有
結合した５’腕配列と、前記３’末端に隣接かつ共有結
合した３’腕配列とからなり、長さが３から２５ヌクレ
オチドであって、所定のアッセイ条件下の前記検出温度
以上の融解温度を備えたステム二重鎖と、前記５’腕配
列の近くでプローブに結合した第一ラベル分子と、該第
一ラベル分子に近接しかつ前記３’腕配列の近くでプロ
ーブに結合した第二ラベル分子を含む少なくとも一つの
ラベルペアとを含み、前記プローブは、前記標的配列の
存在しない前記所定のアッセイ条件下で、そのレベルが
前記第一ラベル分子及び第二ラベル分子の相互作用の度
合いに応じた特徴的なシグナルを有し、前記シグナルは
前記融解温度より１０℃低いところで第一レベル、前記
融解温度より１０℃高いところで第二レベル、かつ前記
検出温度において第三レベルを備え、検出温度における
所定のアッセイ条件下かつ過剰の前記標的配列の存在下
において、標的配列に対する標的相補配列のハイブリダ
イゼーションが、前記特徴的なシグナルのレベルを、前
記第三レベルから第二レベル方向に、第一レベルと第二
レベルとの間の差異の少なくとも１０パーセント変える
プローブとすることができる。また、前記ユニタリープ
ローブが単一分子プローブであってもよい。さらに、前
記ユニタリープローブが、前記５’末端を含む前記標的
相補配列の約半分、５’腕配列及び第一ラベル分子を含
む第一分子と、前記３’末端を含む前記標的相補配列の
約半分、３’腕配列及び第二ラベル分子を含む第二分子
とからなる二分子プローブであってもよい。前記少なく
とも一つのラベルペアがＦＲＥＴペアであってもよい。
前記溶解温度が前記検出温度より少なくとも５℃高いも
とのすることができる。また、このプローブが単一分子
プローブであってもよい。前記５’及び３’腕配列が前
記標的相補配列に直接的に隣接していてもよい。さら
に、前記第一及び第二ラベル分子が前記単一プローブに
共有結合していてもよい。また、前記融解温度が前記検
出温度より少なくとも１０℃高いものとすることができ
る。前記ＦＲＥＴペアは、蛍光剤と消光剤とすることが
できる。また、前記ＦＲＥＴペアがＥＤＡＮＳとＤＡＢ
ＣＹＬであってもよい。前記５’及び３’腕配列が、前
記標的相補配列に直接的に共有結合していてもよい。少
なくとも一つの前記５’及び３’腕配列が、標的配列を
含む核酸鎖に少なくとも部分的に相補的であってもよ
い。５’及び３’腕配列のいずれも、少なくとも３ヌク
レオチドの隣接した相補配列を有するプローブであって
もよい。プローブ配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡと
ＲＮＡとの混合物からなる群から選択されてもよい。前
記第一ラベル分子及び第二ラベル分子が、前記ユニタリ
ープローブに共有結合していてもよく、前記第一ラベル
分子及び第二ラベル分子が、アルキルスペーサーを介し
て共有結合していてもよい。また、前記プローブが、固
体表面に繋がれていてもよい。前記融解温度が前記検出
温度より少なくとも５℃高く、前記５’及び３’腕配列
が前記標的相補配列に直接的に共有結合しており、前記
第一ラベル分子及び第二ラベル分子が前記５’及び３’
腕配列に共有結合しており、前記少なくとも一つのラベ
ルペアが蛍光剤及び消光剤であってもよく、このプロー
ブが固体支持体に繋がれていてもよい。前記標的相補配
列が、２０ないし６０ヌクレオチドを有するものであっ
てもよい。

【００２９】所定の核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イ条件下で、所定の標的配列を含む少なくとも一つの核
酸標的を検出するためのユニタリーハイブリダイゼーシ
ョンプローブであって、該プローブは閉じた形態及び開
いた形態を呈することができ、 ａ）５’末端と３’末端とを備える、前記所定の核酸標
的配列に相補的な１０ないし約１４０ヌクレオチドの標
的相補配列、 ｂ）前記５’末端に共有結合した第一親和性分子と前記
３’末端に共有結合した第二親和性分子とを有し、前記
核酸標的が存在しない前記所定のアッセイ条件下で前記
プローブを閉じた形態に保持するのに十分に相互作用す
る親和性ペア、および ｃ）前記プローブに前記第一親和性分子の近くで結合し
た第一ラベル分子と、前記プローブに前記第二親和性分
子の近くで結合した第二ラベル分子とを備え、前記プロ
ーブが閉じた形態にあるときにこれらのラベル分子の少
なくとも一つの測定可能な特徴に影響するように相互作
用するラベルペアを含み、所定のアッセイにおける前記
標的配列に対する前記標的相補配列のハイブリダイゼー
ションにより、前記プローブが、前記ラベル分子が上記
のように相互作用しない開いた形態を呈するプローブと
することもできる。前記ユニタリープローブが単一分子
プローブであってもよい。前記ユニタリープローブが、
前記５’末端を含む前記標的相補配列の約半分、５’第
一親和性分子及び第一ラベル分子を含む第一分子と、前
記３’末端を含む前記標的相補配列の約半分、第二親和
性分子及び第二ラベル分子を含む第二分子とからなる二
分子プローブであってもよい。前記第一ラベル分子が前
記第一親和性分子に結合し、前記第二ラベル分子が前記
第二親和性分子に結合していてもよい。前記親和性ペア
が、長さが３ないし２５ヌクレオチドの相補的オリゴヌ
クレオチドの腕配列を有していてもよい。前記第一ラベ
ル分子が前記第一親和性分子に共有結合しており、前記
第二ラベル分子が前記第二親和性分子に共有結合してい
てもよい。また、前記ラベルペアがＦＲＥＴペアを含ん
でもよい。前記親和性ペアが、抗体及び抗原を含んでも
よい。前記プローブが、固体表面に繋がれていてもよ
い。

【００３０】さらに、共通ステムが、３’末端に第一の
共有結合性反応基を備え、かつ、その３’末端以外の位
置に第一ラベルペアの少なくとも一つの第一ラベル分子
が結合した、５ないし２０ヌクレオチドの第一オリゴヌ
クレオチド、および前記第一オリゴヌクレオチドに相補
的で、５’末端に第二の共有結合性反応基を備え、か
つ、その５’末端以外の位置に前記第一ラベルペアの少
なくとも一つの第二ラベル分子が結合し、前記オリゴヌ
クレオチドが互いにハイブリダイズすると前記ラベル分
子が近接する、５ないし２０ヌクレオチドの第二オリゴ
ヌクレオチドを含み、前記第一及び第二ラベル分子が、
互いに近接していない場合との違いを検出できる程度ま
で近接した際に、前記第一ラベルペアの少なくとも一つ
のラベル分子が、他方の物理学的に測定可能な特徴に影
響してもよい。前記第一及び第二オリゴヌクレオチド
が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡとＲＮＡとの混合物から
なる群から選択されてもよい。前記第一の共有結合性反
応基及び第二の共有結合性反応基が、ヒドロキシル基、
リン酸基、スルフヒドリル基、アミノ基、アルキルリン
酸基、アルキルアミノ基およびヒドロキシアルキル基か
らなる群からそれぞれ選択されてもよい。前記第一及び
第二オリゴヌクレオチドが、少なくとも３ヌクレオチド
の隣接する相補配列を含んでもよい。前記第一ラベルペ
アがＦＲＥＴペアであってもよい。前記第一および第二
オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズして、５’
末端および３’末端の一方が少なくとも２ヌクレオチド
だけ他方より長く伸びたリゲートし得る突出部を与えて
もよい。前記第一および第二オリゴヌクレオチドが、一
組の容器に別々に収容されてもよい。前記第一および第
二オリゴヌクレオチドの一方が、固体表面に繋がれても
よい。

【００３１】前記共通ステム、およびこのステムに標的
相補配列を共有結合させるのに十分な情報を含む、共通
ステムを用いて本願発明の少なくとも一つのプローブを
作成するためのキット。前記共通ステムの第一ラベルペ
アがＦＲＥＴペアであってもよい。前記共通ステムの第
一および第二オリゴヌクレオチドが、別々に収容されて
いてもよい。前記情報が、第一オリゴヌクレオチドに、
３’末端を含む本願発明の標的相補配列の約半分を含む
第一核酸鎖を共有結合させ、かつ、第二オリゴヌクレオ
チドに、５’末端を含む前記標的相補配列の約半分を含
む第二核酸鎖を共有結合させるのに十分なものであって
もよい。前記第一および第二オリゴヌクレオチドの一方
が固体表面に繋がれていてもよい。また、前記ステムの
第一および第二オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダ
イズして、５’末端および３’末端の一方が少なくとも
２ヌクレオチドだけ他方より長く伸びたリゲートし得る
突出部を与え、かつ、前記情報が、前記突出部に相補的
であって本発明の標的相補配列を含む自発的にハイブリ
ダイズし得る一本鎖を前記ステムにリゲートするのに十
分な共通ステムおよびキットでもよい。所定のアッセイ
条件下で異なる融解温度を備えた、少なくとも２つのス
テムを含むものでもよい。前記ステムが共通する第一ま
たは第二オリゴヌクレオチドを有するものでもよい。前
記ステムの前記第一および第二オリゴヌクレオチドが、
少なくとも３ヌクレオチドの隣接する相補配列を含むも
のであってもよい。

【００３２】検出温度を含む所定のアッセイ条件下で、
所定の標的配列を含む少なくとも一つの核酸鎖を検出す
るためのアッセイであって、前記所定のアッセイ条件下
で本発明のユニタリープローブをサンプルに添加し、か
つ、前記検出温度における前記特徴的シグナルのレベル
の変化を調べることを含むアッセイであってもよい。前
記調べる段階が測定を含んでもよく、リアルタイムアッ
セイであってもよい。調べる段階が、時間の関数の測定
を含むものであってもよい。前記所定のアッセイ条件下
で本願発明のプローブを標的のないコントロールに添加
する工程と、前記コントロールのレベル変化を測定する
工程とをさらに含み、前記調べる段階が前記コントロー
ルのレベル変化と前記サンプルのレベル変化との間の差
異を算定することを含むものであってもよい。標的を含
まないコントロールに本発明のプローブを添加する工程
をさらに含んでもよい。前記プローブが本発明の二分子
プローブであり、アッセイが前記プローブの融解温度以
下で完全に行われてもよい。前記プローブの融解温度が
前記検出温度より少なくとも５℃高く、前記５’および
３’腕配列が前記標的相補配列に直接的に共有結合して
おり、前記第一および第二ラベル分子が前記５’および
３’腕配列に共有結合しており、前記少なくとも一つの
ラベルペアが蛍光剤および消光剤であってもよい。前記
プローブが本発明の二分子プローブであり、アッセイが
前記プローブの融解温度以下で完全に行われるものであ
ってもよい。調べる段階が定量的であってもよい。前記
プローブが単一分子プローブであってもよい。前記核酸
標的配列が増幅反応の産物であり、サンプルへの前記プ
ローブの添加段階を前記増幅反応の完了前に行ってもよ
い。陰性コントロールに前記プローブを添加する工程を
さらに含み、この工程を前記陰性コントロールにおける
前記増幅反応の完了前に行ってもよい。前記調べる工程
が、前記コントロールのレベル変化と前記サンプルのレ
ベル変化との間の差異を算定することを含むものであっ
てもよい。前記調べる工程が、前記増幅反応の間中反復
して測定することを含んでもよい。前記増幅反応がＲＮ
ＡポリメラーゼによるＲＮＡレポーターの増幅であって
もよい。前記増幅反応がＰＣＲ反応またはＳＤＡ反応で
あってもよい。前記ラベルペアがＦＲＥＴペアであって
もよい。本発明のプローブが固体表面に繋がれていても
よい。また、異なる標的相補配列を有し、同一の支持体
表面に所定の位置で結合された本発明にかかる少なくと
も一つの付加の繋がれたプローブを含むことができる。

【００３３】また、所定のアッセイ条件下で本発明のユ
ニタリープローブをサンプルに添加する工程、および前
記測定し得る特徴のレベル変化を調べる工程を含む、所
定の標的配列を含有する少なくとも一つの核酸標的を検
出するためのアッセイであってもよい。前記調べる工程
が測定することを含んでもよい。前記測定が、基準と視
覚的に比較することを含んでもよい。前記核酸標的が増
幅反応の産物であり、前記プローブが単一分子であって
もよい。前記プローブの添加工程を前記増幅反応が完了
する前に行ってもよい。

【００３４】さらに、本発明に係るプローブおよびアッ
セイを行うための説明を含むアッセイを行うためのキッ
トであってもよい。キットが、塩類、バッファー類、ヌ
クレアーゼ阻害剤類、制限酵素類および変性剤からなる
群から選択された一つ以上の試薬をさらに含んでもよ
い。プライマー類、ヌクレオチド類、ポリメラーゼ類お
よびポリメラーゼの鋳型類からなる群から選択された一
つ以上の成分を含んでもよい。プローブが単一分子であ
ってもよい。浸透剤類、リポソーム前駆体類およびカウ
ンター染料類からなる群から選択された一つ以上の成分
を含む生体染色アッセイキットであってもよい。固定化
剤類、脱水素剤類、プロテアーゼ類、カウンター染料類
および界面活性剤類からなる群から選択された一つ以上
の成分を含むin situアッセイキットであってもよい。
前記プローブが繋がれたプローブであるフィールドキッ
トであってもよい。異なる標的相補配列を有し、同一の
支持体表面に所定の位置で結合された本発明にかかる少
なくとも一つの付加の繋がれたプローブを含んでもよ
い。本発明に係る陽性コントロールプローブを含んでも
よい。上記プローブが単一分子であってもよい。

【００３５】

【発明の実施の形態】本発明のハイブリダイゼーション
プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれら二つの組み合
わせからなる。プローブは修飾ヌクレオチドを含むこと
もできる。修飾されたヌクレオチド間(internucleotid
e)結合は、例えば、ハイブリダイゼーション強度および
非特異的分解およびヌクレアーゼに対する抵抗を変える
ために、デオキシリボヌクレオチド類およびリボヌクレ
オチド類を含むプローブにおいて用いられる。プローブ
におけるヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結
合以外の結合、例えばペプチド結合を含んでもよい。修
飾されたヌクレオチド間結合は当該技術においてよく知
られており、メチルホスホナート類、ホスホロチオアー
ト類(phosphorotioates)、ホスホロジチオナート類(pho
sphorodithionates)、ホスホロアミダイト類(phosphoro
amidites)およびリン酸エステル結合を含む。ヌクレオ
チド間の架橋として、脱リン酸結合(Dephospho-linkag
e)も知られており、シロキサン、カーボナート、カルボ
キシメチルエステル、アセトアミダート、カルバマー
ト、およびチオエーテル架橋を含む。例えばＮ-ビニ
ル、メタクリロキシエチル、メタクリルアミドまたはエ
チレネイミン(ethyleneimine)ヌクレオチド間結合を有
する“プラスティックＤＮＡ”も、プローブに使用する
ことができる（Uhlmann and Peyman (1990) pp.545-569
参照）。ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗のため、
および天然の核酸とより強力なハイブリッドを形成する
ために、“ペプチド核酸”（ＰＮＡ）は、特に使用する
ことができる（Orumら, (1993); Egholmら, (1993)参考
としてここに取り込む）。

【００３６】図１は、相互作用ラベルを備えたユニタリ
ープローブ１の二分子バージョンを図式的に示す。プロ
ーブ１は、５’末端と３’末端とを有する一本鎖標的相
補配列２を含み、二分子プローブ１に配列２ａと配列２
ｂとを含み、これらは共に核酸標的鎖内に含まれる予め
選択された標的配列に相補的である。プローブ１は、一
本鎖、すなわち単一分子バージョンと見なされ、単一標
的相補配列２はそのほぼ中部に配されている。以下の記
載は、プローブ１がこのように考えられたものとして、
すなわち簡便のために単一分子バージョン考えられたも
のとして記載する。しかして、本記載は、二分子および
単一分子バージョンの両方に適用される。親和性ペア
は、配列２から伸び、これに結合しており、ここではオ
リゴヌクレオチドの腕３、４として示されている。親和
性ペアは、互いに親和性を備えた一対の分子である。図
１に示すような相補核酸配列の方が好ましいが、他の親
和性ペアを用いることができる。例えば、タンパク−リ
ガンド、抗体−抗原、タンパクサブユニット類、および
核酸結合タンパク−結合部位が含まれる。さらなる例は
当業者にとって明らかであろう。ある場合には、一つ以
上の親和性ペアの使用が、相互作用に適切な強度を与え
る。親和性ペアは、標的配列の存在しない検出条件下で
近接した状態にプローブを維持するのに十分に強く、し
かし、その標的相補配列とその標的配列のハイブリダイ
ゼーションが熱力学的に親和性ペアの相互作用以上に支
持されるのに十分に弱く可逆的に相互作用する。このバ
ランスは、プローブを閉じた状態から開いた状態へと形
態的に変化させる。さらに、親和性ペアが分離するの
は、プローブが標的に結合した場合のみであって、プロ
ーブが非特異的に結合した場合ではない。

【００３７】プローブが閉じた形態から開いた形態に変
形するメカニズムは、親和性ペアが相補的なオリゴヌク
レオチドの腕である実施態様について記載するが、他の
親和性ペアに対する一般論は示されていない。図１で
は、腕３、４は、検出温度を含む予め選択されたアッセ
イ条件下で互いにハイブリダイズし、腕ステムと称する
場合があるステム二重鎖５を形成するように選択され
る。標的がなければ、腕３、４の連結は熱力学的に支持
され、図１に示された閉じた形態にプローブ１を保持し
て、ステム二重鎖５を維持する。図２では、標的相補配
列２（配列２ａと２ｂを含む）は、標的核酸９の標的配
列８にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーショ
ンは、適切な長さの比較的厳密なダブルヘリックスを形
成する。図２の相互作用ラベルを備えたプローブの二分
子バージョンでは、切り込みの入ったヘリックスであ
る。本発明のプローブでは、標的相補配列と標的配列と
の相互作用によるヘリックスの形成は、検出温度におけ
るアッセイ条件下で熱力学的に支持され、腕３、４を分
離させ、結果的にステム二重鎖５を溶解させ、図２に示
された開いた形態を維持する。腕領域３、４は、標的相
補配列２が標的配列８にハイブリダイズした際には、ス
テム二重鎖を形成するように互いに相互作用することが
ない。標的相補配列２と標的配列８の相補作用が腕３と
４の分離を誘導するので、このメカニズムを“スプリン
グ(spring)”と称する場合がある。対立遺伝子識別プロ
ーブではない相互作用ラベルされたプローブのある実施
態様では、標的相互配列が標的配列にハイブリダイズし
たときに起こる閉じた形態からの開いた形態への変化
は、切り込みの存在または一つ以上の核酸のミスマッチ
の存在にもかかわらず成される。重要なのは、プローブ
の非特異的結合によっては、このような腕の結合が克服
されないことである。この特徴は、不適切に“開けられ
た”プローブから非常に低いバックグラウンドシグナル
に導く。

【００３８】図１および２の好ましい実施態様に図示さ
れた親和性ペアは、一対の相補性核酸配列である。腕
３、４は、ステム二重鎖５（図１）が標的相補配列２と
標的配列８のハイブリッドより小さいハイブリッドであ
る（図２）。二分子バージョンでは、ステム二重鎖５
は、２ａおよび２ｂを含む切り込みの入ったヘリックス
の各部位より小さくあるべきである。この限定が満たさ
れれば、２ａおよび２ｂはそれぞれ標的相補配列２の
“約半分”を含むと言える。他の親和性ペアは、上述し
たように、ある場合には非相補的な腕を介して、または
非核酸の腕に、標的相補配列に結合される。適切な親和
性ペアは、当該技術分野で知られた方法で標的相補配列
に結合することができる。親和性ペアは、標的相補配列
に直接的に共有結合していることが好ましい。本発明に
係る相互作用ラベルを有するユニタリープローブは、ラ
ベルペアによる特徴的なシグナルまたは単にシグナルと
称する場合がある測定可能な特徴を備えている。プロー
ブ１は、ステム二重鎖５の５’および３’末端のそれぞ
れにおいて、プローブ１に結合しかつプローブ１の一部
を形成するラベル分子６、７を含む。ラベル分子６、７
は、それらの近接、従ってそれらの互いの相互作用が、
腕３、４の相互作用によって変えられるように配され
る。ラベル分子６、７は、腕３、４の他の場所に、ある
いはステム５との結合に近い配列２、すなわち腕３、４
の近くに結合させることができる。あるラベル分子は、
腕に沿って内部的に結合した際に検知可能に高度に相互
作用するであろう。これは、末端が解けないことによっ
て影響されないからである。

【００３９】一つ以上のペアのラベル分子を用いること
ができる。さらに、ラベルペアの要素間に一対一の分子
の対応は必要ではなく、特に、一つの要素が、別の要素
の一分子以上に影響し、影響されることができる。本発
明のプローブの使用に適したラベル分子は、少なくとも
一つの分子が、他のラベル分子の少なくとも一つの物理
学的に測定可能な特徴を近接依存的に変えることができ
るように相互作用する。ラベルペアの特徴シグナルは、
プローブが開いた形態か閉じた形態かに依存して検出可
能に異なる。例えば、図１および２を参照すると、好ま
しい標的分子はＦＲＥＴペアであり、最も好ましくは発
蛍光団７と消光剤６である。この実施態様では、特徴シ
グナルは、特定の波長の蛍光である。プローブ１が閉じ
た状態のとき（図１）、ラベル分子６は分子７から蛍光
を消光する。分子７が適切な周波数の光で刺激される
と、蛍光シグナルは最初のレベルでプローブから生成さ
れるが、それはゼロであろう。プローブ１は、“オフ”
である。プローブ１が開いた状態にある場合（図２）、
ラベル分子６はラベル分子７から十分に離れおり、それ
らの間の蛍光共鳴エネルギー転移は、完全ではないにし
ても実質的に妨げられる。それゆえ、ラベル分子６は、
ラベル分子７の蛍光を効果的に消光することができな
い。分子７が刺激されれば、第一レベルよりも高い第二
レベルの蛍光シグナルが発生する。プローブ１は“オ
ン”である。蛍光の二つのレベル間の違いは検出可能か
つ測定可能である。このように蛍光および消光分子を用
いて、プローブは“開いた”形態で“オン”になり、プ
ローブが標的に結合したことが容易に検出可能なシグナ
ルを発することにより示される。プローブの形態的状態
は、ラベル分子間の相互作用を制御することにより、プ
ローブから生じるシグナルを変える。

【００４０】親和性ペアが相補的オリゴヌクレオチドの
腕である実施態様では、標的相補配列および腕配列の長
さは、計画されたハイブリダイゼーションアッセイの条
件下でプローブの適切な熱力学的機能のために選択され
る。ハイブリダイゼーションアッセイの技術者であれ
ば、適切な条件が、プローブ、標的および溶質濃度、検
出温度、変性剤および体積排除剤(volume excluders)、
並びに他のハイブリダイゼーション影響因子を含むこと
がわかるであろう。標的相補配列の長さは、７ないし約
１４０ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチドから
約１４０ヌクレオチドの範囲とすることができる。プロ
ーブが対立遺伝子識別プローブであれば、後述するよう
に長さはさらに限定される。二分子の実施態様では、標
的相補配列の各部位は、少なくとも１０ヌクレオチドの
長さを有するべきである。低い方の限定は、プローブが
閉じている場合にラベル分子間の相互作用によって影響
される測定可能な特徴（または特徴的なシグナル）と、
プローブが開いている場合の測定可能な特徴との間に検
出可能な違いがない、最小の距離で決められている。し
かして、適切なプローブにとっての標的相補配列２の最
小の長さは、ラベルペアの個性とプローブへのその結合
に依存する。ラベル分子は、蛍光分子５−［（２−アミ
ノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤ
ＡＮＳ）と消光分子４−（４−ジメチルアミノフェニラ
ゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）が最も好ましい。ＥＤＡ
ＮＳとＤＡＢＣＹＬでは、消光は、長さが二重らせん核
酸の約２０ヌクレオチドペアに等しい、６０オングスト
ロームの分離によって必須に除去される。しかして、図
１および２の好ましい実施態様では、２ａと２ｂを含む
標的相補配列２は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さ
とすべきである。短い配列２は、ハイブリダイズしたプ
ローブからのシグナルを漸進的に弱め、開いたプローブ
と閉じたプローブとの間のシグナルレベルにおける違い
を減少する。

【００４１】対立遺伝子識別プローブでないプローブの
実施態様の最長は制限が少なく、二重らせん核酸分子の
既知の柔軟性によって決定されている（Shoreら, 198
1）。プローブ−標的二重らせんの長さが約１４０ヌク
レオチド対を超えると、プローブ−標的ハイブリッドの
柔軟性により、二重らせん核酸分子の末端が互いに接触
することが可能である。当業者にとって明らかなよう
に、この距離は、二重らせん状の核酸（ＤＮＡ：ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ）および形成
された二重らせんの種類（Ａ型、Ｂ型、Ｚ型等）に依存
して変えてもよい。例えば、標的相補配列２（図１）が
１４０ヌクレオチドより長くＡ型のＤＮＡ：ＲＮＡ二重
らせんを形成するように標的に結合すれば、開いた形態
で望ましくない消光が起こるであろう。時々の消光は、
検出可能なシグナルを生成するプローブの能力を完全に
破壊しないかもしれないが、プローブの性能を破壊して
しまう。望ましくない消光は、腕または他の親和性ペア
の末端以外の位置にラベルペアを結合することによって
減少することができる。対立遺伝子識別の実施態様では
ないプローブでは、標的相補配列の最大の長さは、プロ
ーブが標的に結合した際の熱力学的に支持された開いた
形態を帯びる機能的要求により拘束される。過剰に長い
標的相補配列は、プローブ−標的ヘリックスと腕ステム
ヘリックスの両方が同じ複合体で存在できるのに十分な
柔軟性を備えたプローブ−標的二重らせんを形成してし
まう。プローブは、閉じた状態のままである。それゆ
え、標的相補配列の最大の長さは、標的に結合した際に
プローブが開いた形態を帯びるのに十分に短く、かつ得
られたプローブ−標的ヘリックスが十分に堅固なもので
なければならない。以上の理由から、標的相補配列の最
大の長さは、どんなことがあっても約１４０ヌクレオチ
ドを超えないべきであり、これによって上述した因子に
依存する数の１０パーセント以内を意味する。

【００４２】本発明の相互作用ラベルを備えたプローブ
を設計する際に、対立遺伝子識別の実施態様であるか否
かを問わず、二本鎖ＤＮＡのらせんの性質に考慮が払わ
れるべきである。単一分子プローブが開いた形態にある
場合、分子がプローブ−標的二重らせんの反対側に位置
していれば、ラベル分子の最大の分離がなされる。例え
ば、ラベル分子が、標的相補配列結合の末端のステム二
重鎖の５’および３’末端に結合していれば、Ｂ型標的
相補配列−標的配列二重らせんは、６−、１６−、２６
−、３７−、４７−、５８−、６８−または７９−ヌク
レオチド長の標的相補配列の選択は、ラベル分子６、７
が図２に示されているように、二重らせんの逆側にトラ
ンス形態に標的分子を配向させることにより、最大の分
離をなすと予想される。このサイズの範囲では、これら
の長さの１〜３ヌクレオチド以内にある標的相補配列が
好ましい。７〜６０ヌクレオチド、好ましくは１０−４
０の範囲の長さを有する標的相補配列が好ましい。これ
までに作製された最も好ましい実施態様の標的相補配列
は、１５および３５ヌクレオチドである。

【００４３】親和性ペア等の核酸配列を有する好ましい
実施態様では、腕の配列は、アッセイの条件下および検
出温度において、プローブが標的に結合していない場合
に、腕が結合し、ラベル分子が互いに近接に保持される
のに十分な長さであるべきである。用いられるアッセイ
条件に依存して、３−２５ヌクレオチドの腕の長さこの
機能を行うことができる。中間の範囲である４−１５ヌ
クレオチド、さらに好ましくは５−１１ヌクレオチド
は、しばしば適切である。実際の長さは、標的のない状
態ではプローブが閉じた形態をとり、標的に結合したと
きには開いた形態を帯びるように標的相補配列に関連し
て選択される。標的相補配列が長さで１００ヌクレオチ
ドまで含むのであれば、腕の長さは１０−２５ヌクレオ
チドまで増やすことができる。標的相補配列が１００ヌ
クレオチド以上では、腕の長さをさらに増やすことはで
きない。プローブが対立遺伝子識別プローブであれば、
後述するように、腕の長さはさらに限定される。オリゴ
ヌクレオチド配列が親和性ペアとして用いられるなら、
腕の長さの上限は本発明に係るプローブの熱力学に関連
した二つの基準によって支配される。まず、腕ステムの
融解温度は、アッセイ条件下で、アッセイの検出温度よ
り高いことが好ましい。アッセイ温度より少なくとも５
℃、好ましくは少なくとも１０℃高い融解温度を備えた
ステムが好ましい。

【００４４】第二に、プローブの標的仲介開裂が熱力学
的に支持されるように、ステムの形成によって放出され
るエネルギーが、標的相補配列−標的配列ハイブリッド
の形成によって放出されるエネルギーより小さくあるべ
きである。しかして、標的相補配列−標的配列ハイブリ
ッドの融解温度はステムの融解温度より高い。それゆ
え、腕の配列は標的相補配列より短くあるべきである。
二分子の実施態様では、既に述べたように、腕の配列は
各標的相補配列より短くあるべきである。従って、標的
相補配列が標的にハイブリダイズする前にプローブが開
かないように、腕ステムの融解温度はアッセイ温度より
高くなければならず、しかもなお、適切なプローブ機能
およびそれによる検出可能なシグナルの生成を確実にす
るために、標的相補配列と標的配列の完全または切り込
みの入ったハイブリッドの融解温度より十分低くなけれ
ばならない。腕ステムの融解温度は、アッセイ温度より
少なくとも５℃、さらに好ましくは少なくとも１０℃高
く、標的相補配列と標的配列とのハイブリッドの融解温
度より少なくとも約２０度低いことが好ましい。

【００４５】本発明に係るプローブの実施態様は、対立
遺伝子識別プローブも含み、相補的なオリゴヌクレオチ
ドの腕を有するラベルされた単一分子プローブである。
対立遺伝子識別プローブは、標的様配列と標的相補配列
との間に一つ以上の内在するヌクレオチドのミスマッチ
がある場合には閉じた形態から開いた形態に変形しな
い。“内在する”によって、標的相補配列の末端または
末端から二番目のヌクレオチドを意味しない。対立遺伝
子識別プローブは、内在する挿入または欠失を検出する
ためにも使用することができる。標的相補配列が、ミス
マッチ、欠失または付加ができるだけ中間に近いように
設計されることが望ましい。対立遺伝子識別プローブ
は、本発明に係る単一分子プローブについて上述したも
のと同じ熱力学的機構で開いたり閉じたりする。

【００４６】しかしながら、本発明に係る対立遺伝子識
別プローブのデザインに使用できると考えられるいくつ
かの付加的な考察を見いだした。対立遺伝子識別プロー
ブは、用いられるアッセイ条件下で、ハイブリダイゼー
ションおよび開いた形態への変形が、標的相補配列が完
全に相補的な標的配列を見いだしたときにのみ起こるよ
うに設計されなければならない。ステム二重鎖の分子間
の性質が、ステム二重鎖の形成をなすと思われる。これ
は、設計のかなりの自由度を与え、識別力を驚くほど改
良する。標的相補配列−完全に相補的な標的配列ハイブ
リッドを形成することによって放出されたエネルギー
と、標的相補配列−不完全に相補的な配列ハイブリッド
の形成により放出されるエネルギーの差異は、ステム二
重鎖を形成する際に放出されるエネルギーを参照して考
慮されなければならない。標的相補配列と標的配列との
間の完全なハイブリッドを形成する際のアッセイ条件下
で放出されるエネルギーは、ステム二重鎖を形成する際
に放出されるエネルギーより大きくなければならない。
しかしながら、標的相補配列と一つの内在性ミスマッチ
を有する非標的配列との間の不完全ハイブリッドを形成
する同一のアッセイ条件下で放出されるエネルギーは、
ステム二重鎖の形成で放出されるエネルギーより小さく
なければならない。

【００４７】これらのパラメーターの範囲で設計された
プローブは、標的配列が標的相補配列に完全に相補的で
ある場合に限ってハイブリダイズし、かつ開いた状態に
変形する。３ないし８ヌクレオチドの腕配列と結合した
７ないし２５ヌクレオチドの標的相補配列を有するプロ
ーブは、これらのパラメーターの範囲内で設計できるこ
とがわかった。ステム二重鎖およびプローブ−標的ハイ
ブリッドのグアノシン−シチジン含有量、塩、およびア
ッセイ温度が全て考慮されるべきである。マグネシウム
塩が、強力な安定化効果を備えており、短い、対立遺伝
子識別プローブを設計する際に特にに考慮することが重
要であることに気づいた。Tinocoら.,(1973)とFreier
ら.,(1986)の方法を含む、既知の方法によるあらゆる特
定のハイブリッド形成で放出される自由エネルギーを計
算してもよい。しかしながら、エネルギーを概算して、
プローブを合成し、用いられるアッセイ条件下で識別さ
れるべき不完全非標的と標的に対してプローブを試験す
ることが最も簡単である。対立遺伝子識別プローブが、
２５ヌクレオチドの長さの上限に近い標的相補配列を有
するなら、区別されるべき一つのヌクレオチドのミスマ
ッチが標的相補配列の中間またはその近くで起こるよう
に配列が設計されるべきである。例えば、２１ヌクレオ
チドのプローブは、ミスマッチが、好ましくは標的相補
配列のもっとも中央に位置する１４ヌクレオチドの一つ
に対して起こるべきであり、もっとも好ましくはもっと
も中央に位置する７ヌクレオチドの一つに対して起こる
ように設計されるべきである。識別されるべきミスマッ
チが、標的相補配列−不完全標的配列の中間またはその
近くで起こるようにプローブを設計することにより、対
立遺伝子識別プローブの性能が改良されると信じられ
る。

【００４８】当業者であれば、これらのパラメーターが
ハイブリダイゼーションアッセイの条件で変わるであろ
うこと、並びにこれらの条件が本発明のプローブの核酸
配列を設計する際に考慮されなければならないことを理
解するであろう。別の方法では、プローブは、本発明に
係るプローブであるために用いられるアッセイ条件下で
上述のように機能するように設計されなければならな
い。特定の作製物は、あるセットのアッセイ条件下では
本発明に係るプローブであっても、別のセットのアッセ
イ条件では違うことがある。腕の長さおよびそれらのグ
アノシン−シチジン含有率はステム二重鎖の融解温度に
影響する。所望の融解温度では、特定のアッセイ条件下
で、腕の長さおよびグアノシン−シチジン含有率は、当
業者に容易に算定される。プローブの二重ステムの融解
温度は、以下の実施例Vに記載された方法を用いて所定
のアッセイ条件用に経験的に決定することができる。こ
れらのパラメーターを、ガイドラインとして使用できる
設計の考慮と見なす。複合溶液中のプローブの挙動が常
に確実に予想できとは限らないので、特定のアッセイ条
件下で最適に行うために、すなわちオフシグナルとオン
シグナルの違いを最大にし、所望であればオフのシグナ
ルレベルを最小にするために、本発明に係る作製プロー
ブでは、経験的な試験が非常に有効である。プローブ機
能についての以下の記載から当業者に明らかであるよう
に、核酸ステムを有するプローブの熱力学は、ステムお
よび標的相補配列の長さおよびヌクレオチドの組成、並
びにアッセイ条件で変わる。“直鎖状”オリゴヌクレオ
チドプローブ、すなわち閉じた形態をとらないプローブ
を越えた本発明のプローブの利点は、典型的になされ
る、直鎖状オリゴヌクレオチドプローブにあったアッセ
イ条件を変えることよりも、アッセイ条件に係るプロー
ブを設計するのにずっと優れた自由度を有していること
である。直鎖状オリゴヌクレオチドプローブを用いて、
完全に相補的な標的と一つのミスマッチを有する非標的
とを識別しようと試みる際に、直鎖状オリゴヌクレオチ
ドが完全な相補的標的配列のみにハイブリダイズするよ
うな狭い範囲のアッセイ条件を探さなければならない。
これに対して、本発明に係る対立遺伝子識別プローブの
ステム二重鎖の形成は、標的相補配列とミスマッチのあ
るハイブリッドの形成の自由エネルギーの放出に対抗す
る自由エネルギーを放出させる。それゆえ、ステム二重
鎖の存在は、直鎖状オリゴヌクレオチドがミスマッチの
あるハイブリッドを形成するアッセイ条件下でミスマッ
チのあるハイブリッドの形成を妨げる。

【００４９】本発明に係る対立遺伝子識別プローブは、
上述したように相互作用ラベルを備えていてもよい。し
かしながら、非相互作用シグナルを放出する非相互作用
ラベルを備えてもよい。本発明に係るこのようなプロー
ブでは、非相互作用シグナルは、プローブが開いた状態
か閉じた状態かに関わらず生成される。非相互作用ラベ
ルは当該技術分野で一般に知られており、放射性同位元
素、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ等の酵素、蛍光剤および放射的発
光、生物学的発光、化学的発光または電気化学的発光反
応により光を生成するラベル分子等のラベルが含まれ
る。非相互作用ラベル分子は、プローブのどこであって
もよく、プローブ機能、特に標的へのハイブリダイゼー
ションを実質的に妨げない限りプローブのあらゆる場所
に結合してもよい。ある好ましい実施態様では、それぞ
れの腕の配列が、プローブが開いた際に、ヘアピンステ
ム等の第二の内部構造を形成する。このデザインの、相
互作用ラベルを備えたユニタリープローブ９０が、図９
に例証されている。プローブ９０は単一分子であるが、
このデザインの特徴は、同様に二分子プローブに適用さ
れる。標的相補配列９１が標的９３の標的配列９２に結
合し、プローブ−標的ヘリックスを形成したら、腕９
４、９５が分離し、シグナルがラベル分子９６、９７の
分離によって精製される。開いた腕９４、９５が自分で
ホールドバックしてヘアピン９８、９９を形成するか
ら、図９に示された開いた形態は安定である。ヘアピン
は、長さにして少なくとも３つのヌクレオチドペアのス
テムを形成する隣接する相補配列を有する。これは、そ
れぞれ分かれた腕９４、９５が内部ヘアピン構造を形成
する際にさらなるエネルギーが放出されるので、開いた
形態を安定させる。さらに、これらのヘアピン構造を含
む腕は効果的に短くなり、互いに相互作用しそうもな
い。この特徴を備えることにより、１０−２５ヌクレオ
チドの範囲内の腕を用いることができ、これは、閉じた
形態でラベル分子をよりしっかりとホールドするこの特
徴を具備しない腕に適切な長さより比較的長い。結果的
に、閉じた形態のバックグラウンドレベルがより低いた
めに、この特徴を備えたプローブはよりシャープなシグ
ナルを示すことができる。

【００５０】開いた形態を安定化する別の方法は、一方
または他方の腕の配列が、標的配列に隣接する配列に少
なくとも部分的に相補的であることである。相補配列
は、腕の内部の、腕と標的相補配列との接合部の近くま
たは遠位に配置することができる。さらに、一方の腕の
配列は、特定の標的に適合されたプローブのデザインに
過度の限定をすることなく、標的に隣接する配列に完全
に相補的であってもよい。この特徴は、開いた形態の熱
力学的安定性を増す。腕の部分が標的に相補的であって
もよいが、標的配列と標的相補配列との相互作用は、開
いた形態にプローブを変形させるのに十分でなければな
らないことに注意すべきである。このデザインの特徴
は、単一分子の実施態様と二分子の実施態様の両方に適
用される。図１−５は、蛍光分子（７、３７、４６、５
５）および消光分子（６、３８、４５、５６）の好まし
いラベルペアを示す。近接しているときには、ペアの一
方がもう一方の少なくとも一つの物理学的に測定可能な
特徴を検出可能に変更でき、分離したときには異なる程
度になる、あらゆるラベルペアをシグナル生成のために
使用できる。さらに、ラベル分子がプローブに結合して
いなければならない。

【００５１】適切な消光分子と組み合わされる蛍光ラベ
ル分子は、以下の既知の範囲、すなわち蛍光ラベル、放
射性蛍光ラベル(a radioluminescent label)、化学蛍光
ラベル(a chemiluminescent label)、生物蛍光ラベル(a
bioluminescent label)および電気化学蛍光ラベル(an
electrochemiluminescent label)のいずれかから選択す
ることができる。単一の蛍光分子と多数の消光分子を使
用すれば、消光が増すであろう。この場合には、一つの
ラベルペアは、いくつかの消光分子と“ペアになった”
一つの蛍光分子を有する。他の使用できるラベルペア
は、レポーター酵素と適切な阻害剤を含む。好ましくは
ないが、閉じた形態でシグナルを生成し、開いた形態で
不活性化されるラベルペアを使用することができる。こ
のようなペアの例としては、酵素が活性化されるように
互いに近づけられなければならない、酵素とその補助因
子および酵素のフラグメントまたはサブユニットであ
る。この種の実施態様においては、近づけられた形態は
“オン”の状態である。

【００５２】好ましいラベルは、蛍光共鳴エネルギー転
移が二つのラベル間の相互作用のモデルであるように選
択される。このような場合には、ラベルの測定可能な物
理的特徴は、一方のラベルの励起状態の寿命の減少、一
方のラベルの蛍光の完全または部分的な消光、一方のラ
ベルの蛍光の増強、あるいは一方のラベルの蛍光の減極
とすることができる。ラベルは、狭い波長帯の放射線ま
たは広い波長帯の放射線で励起されうる。同様に放射さ
れた放射線は、装置を用いて、あるいは直接的な視覚に
よる観察により狭いまたは広い範囲の波長で観察するこ
とができる。このようなペアの例は、フルオレセイン／
スルホローダミン１０１、フルオレセイン／ピレンブタ
ノアート、フルオレセイン／フルオレセイン、アクリジ
ン／フルオレセイン、アクリジン／スルホローダミン１
０１、フルオレセイン／エテノアデノシン、フルオレセ
イン／エオシン、フルオレセイン／エリスロシンおよび
アントラニルアミド−３−ニトロチロシン／フルオレセ
インである。この種の他のラベルペアは、当業者にとっ
て明らかであろう。実施例に特別に記載されている最も
好ましいプローブ、単一分子および二分子の両方は、裸
眼でハイブリダイゼーションの検出ができるものであ
り、励起装置として単なる紫外線ランプのみを必要とす
るものである。これらのプローブは以下の基準を満た
す；すなわち一方のラベル分子のみが蛍光であって、そ
の蛍光は裸眼で観察され；他方のラベル分子がこの蛍光
を極度に効率的に消光し；核酸の二重らせんの約二回転
以上離れるとあまり消光しないものである。もちろん、
一方または他方のラベル分子の複数のコピーを用いるこ
とができる。

【００５３】最も好ましい蛍光ラベルはＥＤＡＮＳであ
り、最も好ましい消光分子はＤＡＢＣＹＬである。ＤＡ
ＢＣＹＬの吸収スペクトルは、ＥＤＡＮＳ発光スペクト
ルと良好にオーバーラップするので、非常に効率的なエ
ネルギー転移が行われる。オクタペプチドスペーサーを
介してＤＡＢＣＹＬに結合させることによりＥＤＡＮＳ
の蛍光を４０倍減少できたこと、およびＤＡＢＣＹＬに
直接的にＥＤＡＮＳを結合することにより蛍光を２００
倍以上減少し得たことが示されている。また、６０オン
グストローム以上離すとＤＡＢＣＹＬによってＥＤＡＮ
Ｓの蛍光が消光されない。最後に、ＤＡＢＣＹＬは、そ
れ自身では全く蛍光を有していない（Matayoshiら, 199
0; Wangら, 1991）。ＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ
は、オリゴヌクレオチドの腕または他の親和性ペアの領
域でプローブに結合される。これまで最も好ましいプロ
ーブとしては、ＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬが、腕と
標的相補配列の結合の遠位であって腕の５’および３’
末端に共有結合した、単一分子および二分子の両方であ
る。それぞれ５’および３’末端に位置するＥＤＡＮＳ
とＤＡＢＣＹＬの位置は、当然ながら逆にすることがで
きる。ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬの分子は、プローブが
閉じた形態では互いに近接し、開いた形態では互いに十
分に離れていさえすれば、プローブの末端部位にそった
あらゆる場所に結合させることができる。このようにラ
ベルされたプローブを、相対して末端がラベルされたプ
ローブと称することがある。

【００５４】図１を参照すると、腕のフリーの５’およ
び３’末端よりむしろ、ステム二重鎖５にそってラベル
分子が位置されているので、プローブが閉じた形態にあ
る場合に、ラベル分子間の相互作用を増幅する。二重ら
せんの末端ヌクレオチドが解かれ、温度に依存した速度
で不規則的に再度ハイブリダイズすることが良く知られ
ている。それゆえ、ステムに沿って内部に分子を配する
ことにより、末端が解けることによる分子の分離を低減
することができるであろう。ステム二重鎖に沿って分子
を配した際に、考慮すべきことは、ステム二重鎖のらせ
ん構造に与えられる。この分子は、腕がアニールした際
に分子がステム二重らせんの同じ側に来るように、各腕
に沿って互い違いに配されたヌクレオチドに結合させて
もよい。この位置づけは、閉じた形態におけるラベル分
子の相互作用をさらに増強するであろう。前にも述べた
ように、複数のラベル、例えば、多数のＥＤＡＮＳおよ
びＤＡＢＣＹＬ分子を用いることができる。多数のラベ
ルは、時として、より高い厳密性でアッセイをすること
を可能にする。例えば、親和性ペアがオリゴヌクレオチ
ドの腕である場合に、腕ステムヘリックスが形成された
際に、各ＥＤＡＮＳ分子がＤＡＢＣＹＬ分子に近接でき
るように、一方の腕にある数のＥＤＡＮＳ分子を配し、
他方の腕に対応する数のＤＡＢＣＹＬ分子を配すること
により、ラベルの多重性が達成される。また、多重性
は、ブドウの房に似た方法で、腕に多数のラベルを共有
結合させることによってもなされる。ラベルの多重性
は、自発的に消光するラベル分子と共に用いられるべき
ではない。好ましい適用では、ステムヘリックスが形成
された際に、少なくとも一つのＤＡＢＣＹＬ分子がいつ
でもＥＤＡＮＳ分子に隣接するように、一方の腕に一つ
のＥＤＡＮＳ分子を配し、もう一方の腕に多数のＤＡＢ
ＣＹＬ分子を配することにより、閉じた形態における消
光を増幅することができる。

【００５５】プローブのあらゆる位置に対するラベル分
子の結合は、アッセイ条件下で安定でなければならな
い。結合は共有結合でもよく、これが好ましい。非共有
結合の例は、限定されることなく、イオン結合、挿入、
タンパク−リガンド結合並びに疎水性および親水性相互
作用を含む。プローブに対するラベル分子の結合の適切
に安定な手段は、当業者には明らかであろう。ここで
“結合”という用語の使用は、使用条件下で安定なプロ
ーブに対するラベル分子の結合の全ての意味を包括す
る。安定に結合したラベル分子とは、それらが結合する
プローブ分子の内部に含まれるものと考えられる。場合
によって、スペーサー、好ましくは直鎖アルキルスペー
サーを介した共有結合でプローブにラベル分子を結合す
る。スペーサーの性質は、臨界的ではない。例えば、Ｅ
ＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬは、当該技術分野において良く
知られかつ一般的に用いられている６炭素長のアルキル
スペーサーを介して結合することができる。アルキルス
ペーサーは、効率的な蛍光共鳴エネルギー転移、結果的
には効率的な消光のために、互いに相互作用するのに十
分柔軟なラベル分子を与える。適切なスペーサーの化学
的成分は、当業者によって理解されるだろう。炭素鎖ス
ペーサーの長さは、少なくとも１〜１５炭素の間で変え
ることができる。しかしながら、“ブドウの房”状に腕
に結合した多重性のラベルでは、多数の分岐したスペー
サーが望ましい。

【００５６】非相互作用ラベルを備えた対立遺伝子識別
プローブでは、ラベルは上述したようにプローブに結合
させることができる。しかしながら、放射活性ラベル
は、当該技術分野で知られているように、放射活性ヌク
レオチドを用いた合成、またはキナーゼ反応によってプ
ローブに取り込むことができる。本発明のハイブリダイ
ゼーションプローブおよび共通ステムは、一般的に知ら
れた固相合成法、合成配列または制限フラグメントのリ
ゲーション、もしくはこれらの技術の組み合わせによっ
て組み立てるられる核酸分子を含む。最も簡単なプロー
ブは、標的相補配列に隣接する腕配列を有する単一のオ
リゴヌクレオチドの合成によって組み立てることができ
る。次いで、オリゴヌクレオチドの末端にラベル分子が
結合される。あるいは、ラベルされたヌクレオチドはオ
リゴヌクレオチド合成に用いることができる。二分子プ
ローブは、二つが別々に合成され、オリゴヌクレオチド
がラベルされて調製される。二分子プローブを、標的相
補配列部位に結合させ、副木上でリゲーションすること
によって、対応する単一分子プローブに変形することが
できる。許容される収率で行われるならば、直接的な合
成が特に適切である。合成およびリゲーションの組み合
わせの一つの使用は、単一分子ＤＮＡプローブを二つの
直接的に合成されたオリゴデオキシヌクレオチドから組
み立てることによって例証される。一方のオリゴヌクレ
オチドは、標的相補配列、ラベル分子の一方と共有結合
した完全な第一の腕配列、および第二の腕配列の一部を
含む。腕とこのオリゴヌクレオチドの腕の一部とは互い
にハイブリダイズする。第二のオリゴヌクレオチドは、
もう一方のラベル分子に共有結合した第二の腕配列の残
部を含む。第二のオリゴヌクレオチドは、第一の腕配列
のハイブリダイズしていない、すなわち突き出た領域に
相補的である。二つのオリゴヌクレオチドは互いにアニ
ールする。最後に、プローブはアニールした複合体のリ
ゲーションによって組み立てられる。

【００５７】あるいは、それぞれが、標的相補配列の本
質的な部位すなわち“約半分”と称される部位、一方の
オリゴヌクレオチドの５’および他方の３’に位置した
腕配列、並びに適切なラベル分子を含有する二つのオリ
ゴヌクレオチドを合成する。単一分子プローブが所望で
あれば、これらの二つのオリゴヌクレオチドを副木オリ
ゴヌクレオチドでアニールさせてリゲートする。次い
で、このプローブをゲル濾過または当該技術分野で知ら
れた他の手段によって副木から精製する。二分子プロー
ブが所望であれば、プローブは二つのオリゴヌクレオチ
ドをアニールすることによって組み立てられる。本発明
は、共通ステム、並びに種々の予め選択された標的配列
を検出するための本発明に係るプローブを調製するため
にこの共通ステムを使用するための説明を含むキットを
含んでいる。共通ステムは腕領域の部位を含み、それぞ
れラベルペアの要素に結合している。本発明に係る単一
分子プローブを作製するのに使用するために、反応基を
含む二重鎖の結合端が形成されるように、腕が互いにハ
イブリダイズした状態で、ステムはユニットとして提供
および使用されてもよい。任意に、結合端はリゲートし
得る平滑端または突き出た端部を含んでもよい。あるい
は、他の生物学的結合剤、または化学的成分が、共通ス
テムの５’および３’結合端に存在してもよい。化学的
リゲーションは、ヒドロキシル基、リン酸基、スルフヒ
ドリル基、アミノ基、アルキルリン酸基、アルキルアミ
ノ基またはヒドロキシアルキル基等の反応基を含むこと
ができる。共有反応基が好ましい。

【００５８】プローブの両端に同じ腕領域が結合するこ
とが自動的に避けられるため、プローブが調製される際
に共通ステムがハイブリダイズされていると有利であ
る。しかしながら、それぞれの腕部に相互に排他的な付
着反応がなされるのであれば、共通ステムはプローブ調
製中にハイブリダイズしている必要はない。この場合に
は、腕部は連続的な反応の間には分かれたままでよい
が、腕部を共通ステムと称する。二分子プローブの調製
における使用では、また二分子プローブのリゲーション
による単一分子プローブの調製における使用では、二つ
のステム部が別々に提供および使用されると好ましい。
共通ステムが、長さにして５〜２０ヌクレオチドのオリ
ゴヌクレオチド腕部を含むことが好ましい。本発明に係
る共通ステムの腕部のヌクレオチドは標的配列認識に無
関係であり、このことが特別な場合でも適用されること
は理解されるであろう。ステムは、ユニタリープローブ
の形状を制御することに関係することのみを必要とす
る。好ましい共通ステムは、ラベル分子としてＦＲＥＴ
ペア、最も好ましくはＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬを
含み、それぞれ以下に記載するように、結合端の遠位で
ステム二重鎖の一端に結合されている。二つの共通ステ
ムオリゴヌクレオチドを固相合成法によって調製した。
しかしながら、適切な長さおよび融解温度の天然配列も
ステムとしての使用に適用することができる。

【００５９】当業者であれば理解できるように、自身に
相補的な突出した配列を含有するオリゴヌクレオチドを
有するステムは、二つのステムの望ましくない結合を導
く。しかして、必要ではないが、このような二量体を形
成するオリゴヌクレオチドの使用を避けることが好まし
い。本発明に係る共通ステムを使用することは、最終的
なプローブの腕配列の残余部に隣接した標的相補配列を
含むオリゴヌクレオチドの合成を含んでもよい。このオ
リゴヌクレオチドは、残余腕部を介して自己的にハイブ
リダイズして、結合しうる末端を作製する。共通ステム
が突出部を含むのであれば、オリゴヌクレオチドは、共
通ステムの突出部に相補的な突出部を備えているべきで
ある。次いで、このオリゴヌクレオチドを、好ましくは
上述したように酵素的または化学的リゲーションによっ
て共通ステムに結合される。このようにして、共通ステ
ムは、本発明に係る単一分子プローブの最終的なプロー
ブステムに取り込まれる。本発明に係る共通ステムは、
種々の単一分子または二分子のプローブを設計すること
を望む研究者にとって特に利益がある。共通ステムは、
一つ以上のステムと、適切な標的相補配列オリゴヌクレ
オチド、または適切な制限フラグメントを調製してステ
ムに結合させるための説明を含むキットの一部とするこ
とができる。この説明は、もし記載するとすれば、上述
したように標的相補配列に隣接し適切な結合端を形成す
ることが必要とされる、腕配列の一部について記載する
べきである。キットは、形成すべき最終的なプローブス
テムの融解温度および／または長さによって変わる多重
性共通ステムを含んでもよい。キットは、一つの共通な
ステムオリゴヌクレオチドおよび長さが違う多数の種類
の他のステムオリゴヌクレオチドを具備することができ
る。しかして、種々のまたは異なる所定のアッセイ条件
下で使用するために、種々の長さの標的配列または同じ
標的配列を備えた、本発明のプローブの調製に適したス
テムを含むことができる。このようなキットの説明は、
使用者を、ここで教示したことに関連する特定の標的相
補配列とともに使用するための適切な共通ステムに向け
る。また、キットの使用者が、本発明のプローブを設計
および調製するのに共通ステムを容易に使用することが
できるように、キットが任意に酵素および試薬を含んで
もよい。

【００６０】定量的または定性的とされる本発明に係る
アッセイは、相互作用ラベルが用いられれば、非結合プ
ローブを洗浄および除去する必要がない。しかして、本
発明に係るアッセイは、本発明に係るユニタリープロー
ブを標的配列を含む鎖を含有すると思われるサンプルに
添加し、検出温度におけるアッセイ条件下において検出
可能なシグナルが発生するか否かを確かめることをを含
む。均質なアッセイが好ましいが、本発明に係る相互作
用ラベルを備えたプローブを不均一なハイブリダイゼー
ションアッセイに用いてもよい。非相互作用ラベルを用
いた対立遺伝子識別プローブを用いた本発明に係るアッ
セイは、分離または洗浄工程を含む不均一なハイブリダ
イゼーションアッセイである。標的配列を含まないコン
トロールを同時に行っても良く、二つを測定して差異を
算定することによって定量的または定性的にサンプルお
よびコントロールのシグナル生成を比較することができ
る。本発明のアッセイは、核酸合成反応の特異的一本鎖
または二本鎖産物のリアルタイムおよび終点検出を含
み、例えば、転写、複製、ポリメラーゼチェーン反応
（ＰＣＲ）、自己維持配列反応（３ＳＲ）、鎖置換増幅
反応（ＳＤＡ）、およびＱ-βレプリカーゼ仲介増幅反
応等が挙げられる。ユニタリープローブが融解または他
の変性にさらされるようなアッセイでは、プローブは単
一分子でなければならない。対立遺伝子識別プローブを
用いたアッセイは、例えば、標的配列またはその標的配
列の対立遺伝子のいずれかを含む配列または遺伝子領域
を増幅すること、および増幅産物中に対立遺伝子の変種
が存在することを検出するプローブを添加することを含
む。プローブが相互作用ラベルであれば、アッセイは均
一である。プローブが非相互作用ラベルを有するもので
あれば、非結合プローブから結合物を分けることがアッ
セイに含まれる。

【００６１】定量的アッセイは、当該技術分野で知られ
た定量的方法を用いることができる。サンプルの終点
は、例えば、一連の標的の希釈物の終点と比較すること
ができる。また、読みとりを時間中ずっと行い、陽性ま
たは陰性のコントロール、または両方の読みとりと比較
しても、一つ以上の一連の標的希釈物の曲線と比較して
もよい。相互作用ラベルを備えたプローブを用いた本発
明に係るアッセイは、組織を破壊することなく、例えば
固定された組織における核酸の定量的または定性的なin
situ検出を含む。洗浄する必要なしにかつ大きなバック
グラウンドシグナルを生成することなく大過剰のプロー
ブを用いることができるため、本発明のin situアッセ
イは特に有益である。本発明に係るin situハイブリダ
イゼーションは、クロモソームマッピングを目的とし
て、およびクロモソームの異常を検出するために“クロ
モソームペインティング”を含む(Lichterら, 1990)。
相互作用ラベルを備えたプローブを用いた本発明のアッ
セイはin vivoアッセイを含む。大過剰のプローブを、
洗浄する必要無しに用いることができる。アッセイは、
二重鎖標的のため、並びに一本鎖標的のためとすること
ができる。本発明に係るプローブは、in vivoでの標的
の検出用アッセイにおいて“生体染色剤”（殺すことな
く細胞の特異的成分を染色する試薬）として有用であ
る。これらは、種々の生きた細胞内の特異的な核酸また
は生きた細胞内のオルガネラを位置を定めるアッセイに
おいて使用できる。これらは、組織内または生きた生物
内の特定の細胞の種類を同定するためのアッセイに用い
ることができる。本発明に係るアッセイにおいて、既知
の技術、例えば、リポソームによりまたは核酸分子に対
して浸透性の細胞膜を作製することによって、プローブ
を細胞の内部に輸送することができる。遺伝子発現の研
究では、直接的な注射が好ましい。

【００６２】例えば、異なる波長の蛍光または蛍光およ
び着色したサンプル形成等の、異なる抵触しない検出可
能なシグナルを生成する相互作用ラベルを用いた多重性
プローブを用いることにより、本発明のアッセイは一回
のアッセイで多数の標的を検出することができる。ま
た、同じ標的核酸の異なる領域にそれぞれ特異的な多数
のプローブは、シグナルを増強するために用いられる。
多数のプローブが同じ標的に用いられれば、隣接するプ
ローブが互いに消光しないように標的に結合するべきで
ある。同様に、ハイブリダイズしないプローブから、ハ
イブリダイズしたプローブを分けることを含むアッセイ
において、異なる、区別可能な、非相互作用ラベルを備
えた対立遺伝子識別プローブを用いることができる。さ
らに、本発明に係る特別なプローブを、多数の標的配列
を検出するように設計することができる。多重する標的
相補配列が一つのプローブに取り込まれれば、プローブ
のデザインは、標的に対するいずれか一つの配列のハイ
ブリダイゼーションによって、プローブを閉じた状態か
ら開いた状態に変形させるようなデザインでなければな
らない。本発明に係るアッセイのある好ましい実施態様
は、本発明に係る相互作用ラベルを備えたプローブのサ
ンプルへの添加と、複合混合物中の特定の標的核酸配列
の検出を裸眼で視認することを含む。陽性のスタンダー
ドと比較することにより、または陽性のスタンダードで
得られた結果により、視認することにより大まかに定量
できる。核酸のサイズの情報が所望されるある状況で
は、サンプルの核酸を先ず非変性ゲル電気泳動で分画
し、次いでそのゲル自体を直接にアッセイすることがで
きる。あるいは、ハイブリダイゼーションを、実施例VI
のように、分画することなくまたは分画する前に、制限
フラグメントで行うことができる。

【００６３】しかして、本発明を用いて、サザンブロッ
ティングやノーザンブロッティング（Sambrook, 1989）
等のしばしば用いられる工程に要求されるものを削除す
ることができる。しかしながら、本発明のプローブは、
不均一のアッセイ等でも非常に有益である。これらのア
ッセイの主な欠点、すなわち、標的にハイブリダイズし
ていないプローブからバックグラウンドシグナルを減少
させるために過度の洗浄を必要とすることは、相互作用
ラベルを備えた本発明のプローブの使用により改善され
る。相互作用ラベルを備えた単一分子および二分子の両
方において、標的に結合した場合、すなわち開いた形態
の場合にのみ高レベルの陽性シグナルを発し、閉じた形
態ではほとんどシグナルを発しないプローブが好まし
い。さらに、標的に結合しなければ開いた形態を呈する
ことがなく、非特異的に結合した場合には閉じたままで
あるようなプローブが好ましい。上述したように、この
ことによって、バックがラウンドシグナルが存在しな
か、あるいは非常に低くなる。従って、これらのプロー
ブを使用することによって、洗浄が全く不要であるか、
あるいは、ハイブリダイゼーション後に存在するバック
グラウンドシグナルをさらに減少させるために、やさし
く、厳密性の低い洗浄が用いられればよいことから、従
来の不均一なアッセイが非常に簡単になる。さらに、従
来のハイブリダイゼーションを、一般的に低い厳密条件
下で行うことができる。

【００６４】本発明に係る不均一なアッセイは、捕捉プ
ローブの使用を含んでもよい。捕捉プローブアッセイで
は、捕捉プローブが標的鎖を捕捉する前後のいずれかに
表面に取り付けられる。表面取り付け手段と工程は、当
該技術分野で良く知られており、アビジン被覆された表
面に対するビオチンラベルされた捕捉プローブの反応、
例えばマグネティックビーズ等を含む。捕捉プローブ
は、標的鎖における配列に相補的な配列を含み、標的鎖
にハイブリダイズして捕捉する。捕捉プローブがハイブ
リダイズする位置以外の位置で標的にハイブリダイズす
る標的相補配列を備えた本発明に係るプローブは、捕捉
プローブと同時または前後並びに捕捉プローブ−標的鎖
ハイブリッドを洗浄する前後に添加してもよい。相互作
用ラベル分子を備えたプローブを用いた場合には、洗浄
は必要ないが、やさしく洗浄することによりバックグラ
ウンドを低くすることができアッセイの結果を増幅する
ことができる。非相互作用ラベルを備えたプローブを添
加した場合には、捕捉プローブ−標的鎖−プローブハイ
ブリッドを有する表面を典型的な不均一アッセイで洗浄
するべきである。本発明に係るプローブは、標的配列と
の相互作用で非常に早く開く。ハイブリダイゼーション
アッセイの技術者であれば知っているように、相互作用
の能力は濃度依存性である。アッセイ条件を、相互作用
ラベルを備えたプローブが標的核酸の存在に反応してシ
グナルを非常に早く生成するように選択することができ
る。このため、本発明に係るアッセイは特定の核酸の生
成のリアルタイムの観察を含む。転写、複製または増幅
等の合成方法は、反応混合物中にプローブを含みかつ連
続的または断続的に蛍光を測定することにより観察する
ことができる。標的が相補鎖の結合によって隠される前
に、相対的に豊かなプローブが、初期の核酸鎖中の標的
を見つけだすことができるように、プローブは実質的に
過剰に用いられる。

【００６５】核酸増幅反応の産物の同定のためのアッセ
イにおける相互作用ラベルを備えた本発明のプローブの
使用により、所望の産物を同定し、不要な副反応やバッ
クグラウンドの産物から所望の産物を区別する増幅後分
析の必要性が一般的に排除される。もちろん、本発明に
係るプローブは、産物の終点検出のために、合成工程の
最後に添加することができる。増幅反応の進行を監視す
るアッセイでは、プローブは合成中に存在することがで
きる。プローブの存在により、標的核酸濃度の概算の正
確さ、および動力学的レンジが改良される。閉ざされた
チューブでの反応は、これまでのようにチューブを開け
ることなしに観察することができる。従って、相互作用
ラベルを備えたこれらのプローブを用いるアッセイで
は、混入を制限することができるため、誤った陽性の数
を制限することができる。本発明に係る相互作用ラベル
を備えた単一分子プローブは、本発明に係るプローブが
温度サイクルの速さよりも速い速度で開閉できるため、
追跡ポリメラーゼチェーン反応のアッセイに特に使用で
きる。プローブ、好ましくは閉じた状態“オフ”であっ
て、所望の増幅産物に相補的な標的相補配列を含むプロ
ーブを、ポリメラーゼチェーン反応混合物中に含める。
この実施態様では、プローブは、ポリメラーゼチェーン
反応のアニーリング温度における反応条件下で閉じたま
まであるような融解点を備えている。必要ではないが、
アニーリング温度より高ければ、延長温度においてプロ
ーブが閉じたままであってもよい。アニーリング温度で
は、標的相補配列がその標的にハイブリダイズし、プロ
ーブがシグナルを生成する。変性温度からアニーリング
温度に下がる間並びにアニーリング温度において、標的
を見つけだしていない融解された（すなわち開いた）プ
ローブは、急速に分子内反応を介して閉じる。しかし
て、蛍光等のシグナルは、アニーリング温度において読
むことができる。また、蛍光が読みとられる別個の温度
を反応サイクル中に組み込んでもよい。ＰＣＲ反応で用
いるためのプローブを設計する際に、ＰＣＲプライマー
の一つに相補的でない標的相補配列を自然に選択するで
あろう。

【００６６】あるプローブは、ＰＣＲプライマーのよう
な産物の相補鎖のアニーリングによって標的配列から除
去されうる。これは、プローブの濃度を増すことによっ
て、もしくはポリメラーゼチェーン反応における産物鎖
の合成に非対称性を設計することによって克服すること
ができる。非対称性増幅では、相補鎖の合成に比べて、
標的を含むより多くの鎖が合成される。同様に、相互作
用ラベルを備えた本発明のプローブの実施態様を用い
て、他の核酸増幅機構（Landegren, 1993を参照）が、
観察あるいはアッセイされる。増幅機構をなにも変更せ
ずに、例えばＱ-βレプリカーゼ仲介増幅反応、自己維
持配列複製反応、転写増幅反応、および鎖置換増幅反応
等において、適切なプローブを用いることができる。例
えば転写等の、ＤＮＡに向けられたＲＮＡポリメラーゼ
を利用する増幅を観察するために、プローブはポリメラ
ーゼの鋳型であってはいけない。例えば、プローブはＲ
ＮＡとすることができる。本発明に係るアッセイのある
実施態様では、固体表面に結合した相互作用ラベルを備
えた複数のハイブリダイゼーションプローブを利用す
る。本発明のプローブが用いられているため、洗浄は不
要である。プローブが固体表面に結合された場合、それ
らを“繋がれたプローブ”と称する。本発明に係る繋が
れたプローブは、相互作用ラベルを備えていなければな
らない。これらは、必須的ではないが、対立遺伝子識別
プローブであってもよい。この種のプローブは、図１０
に示されており、標的相補配列１０４、相補的な腕１０
５および１０６、並びに腕１０５、１０６に結合したラ
ベルペア１０７、１０８を備えたプローブ１０１を示し
ている。プローブ１０１は、結合分子１０２によって固
体表面１０３に繋がれている。結合分子１０２は、共有
結合であっても、非共有結合であってもよい。共有結合
が好ましい。ビーズ、膜、ミクロタイターウェル、およ
び計量棒を含むあらゆる種類の表面１０３を用いること
ができる。プローブの成分に関して中性な表面、すなわ
ち、核酸と相互作用せず、ラベル分子と相互作用せず、
かつプローブシグナルと抵触しない表面が好ましい。こ
のような表面の例としては、シリコーン処理剤で被覆さ
れた表面である。

【００６７】使用できる表面は、本質的に以下のものと
抵触しない：ａ）閉じた形態を維持するためのプローブ
の親和性ペア、好ましくは腕の配列の能力；ｂ）標的に
対する標的相補配列のハイブリダイゼーション；ｃ）開
いた形態の場合に、親和性ペアが離れたままである能
力、好ましくはプローブの腕配列が互いにハイブリダイ
ズしていないままである能力；ｄ）閉じた形態における
近接したラベル分子の相互作用、好ましくは消光分子に
よる蛍光分子の消光；およびｅ）開いた形態におけるラ
ベル分子の作用、好ましくは適切な周波数の光で刺激さ
れた際に蛍光分子が蛍光を発する作用。このような表面
は、当該技術分野で知られている。本発明のプローブ
は、当業者に知られている巨大分子結合分子１０２によ
って繋ぐことができる。例えば、適切な結合分子１０２
は、アルキル鎖またはオリゴヌクレオチド鎖（オリゴウ
リジン等）を含む。容易にプローブに取り込まれること
から、オリゴヌクレオチド結合分子が好ましい。当業者
が理解しているように、このようなオリゴヌクレオチド
結合分子のヌクレオチド配列は、プローブ中の別のどの
配列とも実質的に相補的であるべきではない。

【００６８】本発明に係る繋がれたプローブは、予め決
定されたセットの標的配列の同時調査のためのアッセイ
に有利に使用できる。例えば、一連の蛍光プローブを調
製することができ、それぞれが異なる標的相補配列を含
有する。各プローブを、計量棒等の同じ支持表面に所定
の位置に結合することができる。ハイブリダイゼーショ
ン条件下で支持体とサンプルとを接触させた後、支持体
を適切な周波数の光で刺激することができる。繋がれた
プローブがサンプルの標的分子とハイブリッドを形成し
た位置で、蛍光が発生する。繋がれたプローブが対立遺
伝子識別プローブであれば、例えば特定の遺伝子の変異
または対立遺伝子が存在する単一アッセイを調べること
ができる。このようなアッセイは、例えば患者が明らか
に感染しており、医師が早急に効果的な処置を処方する
ために感染性の作因の同一性を知る必要がある場合に、
診療の状況において特に有益である。本発明に係るアッ
セイキットは、本発明の少なくとも一つのプローブとア
ッセイを行うための説明を含む。またキットは、塩類、
バッファー類、ヌクレアーゼ阻害剤、制限酵素および変
性剤等のアッセイ試薬を含んでもよい。キットは陽性対
照試験用の標的またはモデル標的、および陰性対照試験
用の標的を含まない“サンプル”を含んでもよい。

【００６９】増幅アッセイキットは、上記のいくつかま
たは全てに加えて、アッセイ用および対照アッセイ用
の、プライマー類、ヌクレオチド類、ポリメラーゼ類お
よびポリメラーゼ鋳型を含んでもよい。生体染色キット
は、プローブおよび説明に加えて、透過剤、リポソーム
前駆体、バッファー類、塩類、カウンター染料類(count
erstains)および光学的フィルター類を含んでもよい。i
n situキットは、プローブと説明に加えて、固定液類、
脱水素剤類、プロテアーゼ類、カウンター染料類、界面
活性剤類、光学的フィルター類および被覆された顕微鏡
スライド類を含んでもよい。キットは、対立遺伝子識別
プローブであるプローブを含むことができる。このよう
なキットは、生物の対立遺伝子の状態を確かめることに
使用でき、近親な生物間を識別するために使用すること
ができる。非相互作用ラベルプローブを備えた対立遺伝
子識別プローブキットは、結合プローブを非結合プロー
ブから分離する際に使用する捕捉プローブとマグネティ
ックビーズを含むことができる。選択されたラベルに合
わせて、キットは検出試薬を含んでもよい。

【００７０】フィールド（携帯用）キットは、説明に加
えて、本発明に係る相補ラベルを備えた繋がれたプロー
ブを含む。少なくとも一つのプローブが、ビーズ、ウェ
ルまたは計量棒に繋がれてもよい。未感作のサンプルの
成分にハイブリダイズする陽性対照プローブを含む複数
のプローブが含まれてもよい。フィールドキットは、説
明に加えて、本発明に係る繋がれていないプローブを含
んでもよい。このようなキットは、感染性の作因または
遺伝子用であってもよい。遺伝子用のキットは、陰性
の、また時には陽性の標的を含んでもよい。プローブの
構成が、特定のアッセイ条件下で本発明のユニタリープ
ローブであるか否かを決定するために試験が行われても
よい。プローブの構成に用いられた親和性ペアおよびラ
ベル分子に適した試験を、設計することができる。例え
ば、プローブが相互作用ラベルを備える場合、試験は、
用いられるべき検出剤を用いて、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイの条件下で行われるべきであり、一般的に以
下の工程を含む：第一に、標的のない条件下で生成され
るシグナルレベルを測定し、次いで検出を必要とする最
小レベルの標的存在下でプローブが過剰に存在する場合
に生成されるシグナルレベルを測定する。第一の測定の
シグナルレベルが、近接したラベル分子から予測される
レベルと一致し、第二の測定のシグナルレベルがプロー
ブの開裂によって予測されるレベルと一致し、かつ、検
出剤が二つの測定のシグナルレベル間を確実に区別でき
るならば、その構成はそのアッセイにおいて本発明に係
るプローブである。

【００７１】プローブの構成が親和性ペアとしてオリゴ
ヌクレオチドの腕を有する場合には、プローブの構成
は、本発明に係るプローブであるためには、実施例Vに
記載された試験をパスしなければならない。非相互作用
ラベルを備えたプローブが、本発明に係る対立遺伝子識
別プローブであるかどうかを調べるために、使用される
アッセイ条件下において、プローブが標的配列の非存在
下でステム二重鎖を形成し、その標的配列とハイブリダ
イズして開いた形態に変形するか否かを調べなければな
らない。相互作用ラベルペアＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ
が非相互作用ラベルに代わって置換されたプローブの変
異体を作製し、所定のアッセイ条件下でこの変異体に実
施例５に記載された試験を行うことによってなされる。
以下に記載するように放射活性ラベルされたプローブＦ
では、同じヌクレオチド配列であるが相互作用ラベルを
備えたプローブＤを調べることによって行った。多くの
場合、非相互作用ラベルの代わりに置換するよりも、問
題の非相互ラベルされたプローブにＤＡＢＣＹＬとＥＤ
ＡＮＳを添加することができる。

【００７２】相互作用ラベルを備えた本発明に係るプロ
ーブが対立遺伝子識別プローブであるか否かを調べるた
めに、内在するミスマッチを備えた非標的物に対してさ
らにプローブを試験する。完全に相補的な標的を用いた
試験アッセイで検出されるシグナルレベルが、内在する
一つのミスマッチを備えた非標的物を用いたアッセイ試
験におけるバックグラウンドを超えたシグナルより、バ
ックグラウンドを超えて少なくとも５倍高ければ、その
プローブは、そのアッセイ条件下において本発明に係る
対立遺伝子識別プローブである。このましくは、この割
合がさらに高く、好ましくは少なくとも１０倍高いかあ
るいはさらに好ましくは少なくとも２０倍高い。上記の
最初の試験をパスした非相互作用ラベルを備えたプロー
ブが本発明に係る対立遺伝子識別プローブであるか否か
を調べるために、完全な標的配列と内在するミスマッチ
を備えた非標的物に対して、共通の不均一アッセイでプ
ローブをさらに試験する。完全に相補的な標的を用いた
アッセイ試験で検出される非相互作用シグナルレベル
が、単一のミスマッチを備えた非標的物を用いた同一の
アッセイ試験においてバックグラウンドを超えた非相互
作用シグナルより、バックグラウンドを超えて少なくと
も３倍高ければ、そのプローブは、そのアッセイ条件下
で本発明に係る対立遺伝子識別プローブである。このま
しくは、この割合は高い方が良く、好ましくは少なくと
も５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、そして最
も好ましくは少なくとも２０倍高いものである。以下の
実施例は本発明のいくつかの実施態様を例証する。これ
らは、本発明を制限するものではなく、これらの特異的
な実施態様に限定されるものではない。

【００７３】

【実施例】

実施例Ｉ：プローブＡの合成 プローブＡが図３に示されている。図３は、標的相補配
列３１および相補的な腕を備えた単一分子プローブ３０
のヌクレオチド配列を示す。図３に示された特定のプロ
ーブは、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１（Muesingら,
1985）のインテグラーゼ遺伝子を検出するためのもの
である。標的相補配列３１は、ヌクレオチド３２からヌ
クレオチド３３まで５’から３’に伸び、３５ヌクレオ
チドの標的配列５’−ＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣ
ＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧＧＣ−３’に相
補的である。同じ長さの、他方の標的に相補的な標的相
補配列が代用されることは、理解されるであろう。プロ
ーブ３０は、上述した最初の二つのオリゴヌクレオチド
をリゲーションする方法を用いて組み立てられた。二つ
のオリゴヌクレオチド３４、３５はいずれも、固相合成
法によって調製された。図３で四角に囲まれたオリゴデ
オキシヌクレオチド３４の合成中に、被修飾ヌクレオチ
ドを５’末端に導入した。このヌクレオチドは、ヘキサ
アルキルスペーサーを介して５’リン酸塩に共有結合し
たスルフヒドリル基を有する。次いで、オリゴヌクレオ
チド３４は、ＥＤＡＮＳラベル分子３７に結合される。
参照としてここに取り込むConnolyとRider(1985)の方法
を、チオエーテル結合を介してオリゴヌクレオチドにＥ
ＤＡＮＳ（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、モレキュラープロ
ーブ(Molecular Probes)、Eugene、オレゴン）のスルフ
ヒドリル反応性形態を結合するために用いた。次いで、
オリゴヌクレオチド３４を、高圧液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）で精製した。オリゴヌクレオチド３５の
合成中に、参照としてここに取り込むNelsonら(1989)の
方法を用いて、３’末端ヌクレオチドの３’酸素にヘプ
タアルキルスペーサーを介して共有結合された一次アミ
ノ基を導入した。約２．５ｍｇのオリゴヌクレオチド３
５は、その５’末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて³²Ｐでリン酸基転移された。この³²Ｐは、
合成および精製中にオリゴヌクレオチドを追跡するため
に用いられた。次いで、リン酸基転移されたオリゴヌク
レオチド３５を３００ｌの０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム
中に溶解し、３００ｌの６０ｍｇ／ｍｌのラベル分子３
８、ＤＡＢＣＹＬスクシンイミジルエステル（モレキュ
ラープローブ、Eugene、オレゴン）のアミノ反応性の形
態と反応させた。アミノ反応性ＤＡＢＣＹＬを、７２時
間以上、それぞれ２０ｌの１５の画分の連続的に撹拌さ
れた反応混合物に添加した。反応混合物を酢酸アンモニ
ウムに次いでエチルアルコールを添加することによって
エチルアルコールで沈殿させた。次いで、オリゴヌクレ
オチド３５をＨＰＬＣで精製した。オリゴヌクレオチド
３４および３５を、互いにアニールし、１６℃でＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼとのインキュベーションによってリゲート
した。リゲートされた産物を、７Ｍの尿素の存在下でポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。プローブＡ
を含むバンドは、尿素の存在下で青白い蛍光を示し（Ｅ
ＤＡＮＳによる）、オレンジ色を呈し（ＤＡＢＣＹＬに
よる）、放射活性を有していた（³²Ｐによる）。精製さ
れたプローブＡをゲルから溶出し、１ｍＭのＥＤＴＡを
含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（ＴＥバッ
ファー）に保存した。

【００７４】実施例II：共通ステムとその使用方法 図４は、本発明にかかる共通ステムを用いて設計され
た、ここではプローブＢと称するプローブを示す。図４
を参照すると、明確にするために線４２で描かれた共通
ステム４１は、以下に記載するあらゆる標的相補配列を
含有する鎖をリゲートし得る腕領域４３、４４を含む。
共通ステム４１を作成するために、二つのオリゴヌクレ
オチド４３、４４を固相合成法によって作成した。オリ
ゴヌクレオチド４３は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸基転移された。オリゴヌクレオチド４
３、４４は相補的である。一方、すなわちこの場合には
オリゴヌクレオチド４３は、他方、すなわちオリゴヌク
レオチド４４より５ヌクレオチド長い。図４を参照する
と、これらの５ヌクレオチドは５’−ＡＴＣＣＧであ
る。オリゴヌクレオチド４３は、その３’末端におい
て、ラベル分子４５、すなわちＤＡＢＣＹＬ分子に結合
している。オリゴヌクレオチド４４は、その５’末端に
おいて、ラベル分子４６、すなわちＥＤＡＮＳ分子に結
合している。これらの結合を行い、結合したオリゴヌク
レオチドを実施例Ｉで記載したように精製した。次いで
オリゴヌクレオチド４３、４４をアニールし、それによ
ってラベル分子４５、４６を互いに近接させた。固相合
成法によって調製されたオリゴヌクレオチド４７は、図
４で線で表示された、腕配列の残りの部分４８、４９を
含む領域に隣接した、標的相補配列を含む。腕配列４
８、４９を互いにアニールし、共通配列の突出部に相補
的な突出部を形成した。この突出部、５’−ＡＴＣＣＧ
は、腕部４８の最初の５ヌクレオチドを含む。次いで、
実施例Ｉの条件下で、オリゴヌクレオチド４７を共通ス
テム４１にアニールし、リゲートした。プローブＢを、
ゲル電気泳動でリゲーション混合物から単離した。ステ
ム配列４３、４４及び腕部４８、４９は混合前には別々
にアニールされたが、混合後にはアニールされうる。プ
ローブ４０の最終的な腕ステムは、領域４４及び４８と
領域４３及び４９の組み合わせをそれぞれ備えている。

【００７５】実施例III：プローブＣの合成 プローブＣ、図５に示された単一分子プローブを、上述
した第二の二つのオリゴヌクレオチド方法で作成した。
プローブ５０の５’末端からヌクレオチド５２にのびる
オリゴヌクレオチド５１、及びヌクレオチド５４からプ
ローブ５０の３’末端にのびるオリゴヌクレオチド５３
を固相合成法によって調製した。オリゴヌクレオチド５
１は、その５’末端でＥＤＡＮＳ５５に結合され、オリ
ゴヌクレオチド５３はその３’末端においてＤＡＢＣＹ
Ｌ５６に結合された。結合されたオリゴヌクレオチドの
結合及び精製は、実施例Ｉに記載されたようにして行わ
れた。ここで、二つの分子、オリゴヌクレオチド５１と
５３は、本発明の二分子プローブを形成するようにアニ
ールすることができる。単一分子プローブは、これらの
オリゴヌクレオチドから、配列５’−ＡＡＴＧＧＣＡＧ
ＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧ
ＧＣ−３’のオリゴヌクレオチドの副木にこれらをアニ
ールすることによって形成され、ヌクレオチド５２と５
４の接合部においてリゲートされる。次いで、単一分子
プローブを実施例Ｉに記載されたように電気的に精製し
た。プローブＣは、異なる条件下で使用するように設計
されているものの、プローブＡと同じ標的相補配列を備
えている。この標的相補配列は、ヌクレオチド５７から
ヌクレオチド５８に、５’から３’に伸びている。プロ
ーブＣのステム二重鎖は、８塩基対の長さである。

【００７６】実施例IV：プローブＥおよびプローブＥの
合成 保護されたスルフヒドリル基をその５’端に含み、一次
アミノ基をその３’末端に含むオリゴデオキシヌクレオ
チドを、Midland Certified Reagent Companyから購入
した。これらのオリゴデオキシヌクレオチドでは、スル
フヒドリル基が-（ＣＨ₂）₆-スペーサーを介して５’リ
ン酸基に結合し、一次アミノ基が-（ＣＨ₂）₇-スペーサ
ーを介して３’ヒドロキシル基に結合している。最初の
カップリング反応は、各３’アミノ基にＤＡＢＣＹＬ分
子を結合する。各オリゴヌクレオチドに対し、０．６ｍ
Ｍオリゴデオキシヌクレオチドと０．１Ｍの炭酸水素ナ
トリウムを含む５００μｌ溶液を、Ｎ，Ｎ-ジメチルホ
ルムアミドに溶かした６０ｍｇ／ｍｌのＤＡＢＣＹＬの
スクシンイミジルエステル（Molecular Probes,Eugene,
OR.）の５００μｌ溶液と反応させた。次いで、ＤＡＢ
ＣＹＬのスクシンイミジルエステルを、室温で７２時間
以上の間連続して攪拌された反応混合物に少量で添加し
た。次いで、過剰な染料を除去するために、この反応混
合物中のオリゴヌクレオチドを、３００μｌの３Ｍ酢酸
ナトリウム、１．７ｍｌの水および７．５ｍｌのエタノ
ールを添加することにより沈殿させた。

【００７７】第二のカップリング反応により、５’スル
フヒドリル基にＥＤＡＮＳを結合した。オリゴヌクレオ
チドとＥＤＡＮＳをカップリングする直前に、Ｓ-トリ
チル保護基をオリゴデオキシヌクレオチドの５’端から
除去した。沈殿されたオリゴヌクレオチドを、１ｍｌの
０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ６．５）に溶かした。
この溶液を、室温で３０分間１０μｌの０．１５Ｍ硝酸
銀（５倍モーラー過剰の硝酸銀）で処理した。次いで、
１４μｌの０．１５Ｍジチオトレイトール（７倍過剰の
ジチオトレイトール）をこの混合物に加えた。室温で５
分間インキュベートした後、遠心して除去される沈殿が
形成された。上清中の修飾されたオリゴヌクレオチド
を、室温で１時間、５００μｌの０．２Ｍ炭酸水素ナト
リウムに溶かした３Ｍ１，５ＩＡＥＤＡＮＳ（Molecula
r Probes, Eugene, OR）（ＥＤＡＮＳの５倍モーラー過
剰のスルフヒドリル反応形態）で処理した（Connolly a
nd Rider 1985,参照としてここに取り込む）。次いで、
修飾されたオリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウムと
エタノールを添加して沈殿させた。ＥＤＡＮＳとＤＡＢ
ＣＹＬの両方を含むオリゴデオキシヌクレオチドを高圧
液体クロマトグラフィー（Beckman）で以下のようにし
て行った：沈殿したオリゴヌクレオチドを１ｍｌのトリ
エチルアンモニウムアセタート（ｐＨ６．５）に溶解し
た。この混合物を、Ｃ−１８逆相カラム（Nucleogen DE
AE 60-7）上で、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムア
セタート（ｐＨ６．５）を含む０−７５％のアセトニト
リルの直線勾配を用いて、４０分間、１ｍｌ／分の流速
で分画した。２６０と３３６ｎｍにおいて吸収があり、
４９０ｎｍで蛍光を発する画分を単離する。これらの画
分は、ＥＤＡＮＳの特徴のある蛍光を備え、以下に記載
する融解温度変性プロファイルを示す。

【００７８】プローブＤの配列は、ＥＤＡＮＳ-５’-Ｇ
ＣＧＡＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＣＣＴＡＴＧＣＴＣＧＣ-
３’-ＤＡＢＣＹＬであり、プローブＥの配列は、ＥＤ
ＡＮＳ-５’ＧＣＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＡＡＣＴＧＴ
ＡＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧ
ＣＡＣＴＣＧＣ-３’-ＤＡＢＣＹＬであり、それぞれの
場合において、下線を施したセグメントは腕であり、ス
テムの形成に適しており、内部の配列は標的相補配列を
構成する。プローブＥは、プローブＣと同じヌクレオチ
ド配列を有する（図５）。

【００７９】実施例Ｖ：プローブ作成物の試験 この実施例は、核酸腕配列を用いて構成されたプローブ
が、特定のアッセイ条件下で本発明のプローブであるか
否かを調べる試験について記載する。このようなプロー
ブ作成物、プローブＡのデータについて、提供および評
価する。プローブＡは、塩を含まない２０℃のアッセイ
において本発明のプローブであることがわかった。本発
明のプローブは、二つのハイブリダイズした核酸鎖が温
度エネルギーのために分離する、特徴的な融解温度Ｔｍ
を示す。プローブＡの融解温度は、所定のアッセイ条件
下、すなわち塩が添加されていないＴＥバッファーで、
１０℃から８０℃まで温度を上げながらその蛍光シグナ
ルのレベルを観察することによって測定された。プロー
ブの濃度は、２ｍｌのＴＥバッファー当たり１５０ｐモ
ルであった。温度による変性または転移曲線は、パーキ
ンエルマーＬＳ−５Ｂ蛍光測定器で記録された。プロー
ブＡのＥＤＡＮＳ分子は３３６ｎｍで励起され、４８０
ｎｍにおける蛍光が観察された。結果は図６に示されて
いる。装置追跡６０は、これらのアッセイ条件下におけ
るプローブＡの温度変性曲線を示す。プローブのＴｍ
は、その温度変性曲線の屈曲点で示される。プローブＡ
の融解点Ｔｍは２７℃であった。

【００８０】以下のレベルのシグナル、すなわちここで
は蛍光が、温度変性曲線からわかる：Ｔｍ−１０℃の第
一レベル、Ｔｍ＋１０℃の第二レベル、並びに所定のア
ッセイの検出温度における第三レベルである。もし検出
温度において、過剰のモデル標的の添加により、Ｔｍ−
１０℃とＴｍ＋１０℃におけるシグナルレベル間の差異
の少なくとも１０％に相当する量でＴｍ＋１０℃のレベ
ルの方向へのシグナルレベルの変化がもたらされるので
あれば、そのプローブ作成物は、所定のアッセイ条件下
における本発明のプローブである。“モデル標的”は、
プローブ作成物の標的相補配列に相補的な配列を含有す
る核酸鎖であり、その５’または３’に直接的に隣接す
る付加的なヌクレオチドを一つも含まない。しばしば、
実際の標的はこの定義に合う。モデル標的の存在下でシ
グナルレベルを測定するために用いられるプローブ作成
物の濃度は、標的のない条件下でシグナルレベルを測定
するために用いられた濃度、すなわち温度変性曲線を得
るために用いられた濃度と同じである。プローブＡで
は、シグナルレベルは、図６に示された装置追跡６０か
ら以下のように決定された。すなわち、Ｔｍ−１０℃で
２ユニットのレベル；Ｔｍ＋１０℃で１６ユニットのレ
ベル；並びに検出温度、すなわち２０℃で２．５ユニッ
トのレベルであった。以下に記載するような大過剰のモ
デル標的を用いて、検出温度における過剰の標的の添加
により、３時間で２．５ユニットから１４．５ユニット
へと変化した。しかして、プローブＡは、このような所
定のアッセイ条件下で本発明のプローブである。

【００８１】モデル標的は、固相合成法によって調製さ
れ、ＨＰＬＣで精製された５’−ＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧ
ＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴ
ＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴ−３’の配列を有するＤＮＡ
鎖であった。下線を施した配列は、プローブＡの３５ヌ
クレオチドの標的配列を同定する。モデル標的２５ｎモ
ルを、１５０ｐモルのプローブＡを含有する２ｍｌのＴ
Ｅバッファーに添加した。蛍光を、検出温度で維持した
石英キュベットを備えたパーキンエルマーＬＳ−５Ｂで
連続して観察した。図８の装置による追跡８２は、この
結果を示している。図８は、蛍光の急速な変化が、早期
に起こり、徐々に減少して、安定に至ることを示してい
る。この場合では、“試験通過”レベルが早期になされ
るならば、そのように長く待つ必要はないが、試験の点
は安定のレベルである。理解されるように、安定レベル
までの時間はモデル標的の濃度に依存する。例えば、モ
デル標的の濃度を５倍減少すれば、すなわち図８の装置
の追跡８１では、１０時間後でさえ安定には到達しな
い。もう一方の作成物、プローブＣは、別の所定のアッ
セイ条件、３７℃でＴＥバッファー中の１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂で試験した。その温度変性曲線、すなわち図６の
装置の追跡６１は、６１℃のそのＴｍを与えた。装置の
追跡６１のデータ、および３７℃での過剰なモデル標的
の存在下におけるシグナルの測定から、プローブＣが所
定のアッセイ条件下で本発明のプローブであることがわ
かった。ユニタリープローブＣの二分子の実施態様を、
ユニタリープローブＣの単一分子の実施態様を試験する
ために用いられたアッセイ条件と同じ条件下で試験し
た。二分子プローブが、本発明のプローブであることも
わかった。二分子プローブは、実際にその単一分子の片
割れと同じハイブリダイゼーションの動力学を示す。

【００８２】プローブＤ及びＥを用いた変性プロファイ
ル及び他の全ての蛍光測定は、ＱＳセル（Hellma Cells
New York）を用いたＬＳ−５Ｂスペクトロメータ（Per
kin-Elmer）で実施した。その温度は循環バスで制御し
た。プローブは、３３６ｎｍで励起し、蛍光放射を４９
０ｎｍで測定した。１５０マイクロリットル溶液（１７
０ｎＭのプローブＤ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、
１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０）の蛍光を、温度
を２℃／分の速度で２５℃から７５℃まで変化させてモ
ニターした。温度変性プロファイルを図１１に示した
（曲線１１１）。プローブを含む溶液の温度が上昇する
と、その蛍光は、核酸二重螺旋の融解の特徴を持つよう
に変化した。明確な温度遷移の出現は、低温においては
腕がステムｄｕｐｌｅｘを形成し、高温においてはステ
ムの螺旋秩序が融解し、プローブはランダム-コイルの
コンフィギュレーションと仮定されることを示してい
る。本発明のプローブの融解温度は、腕配列の長さ及び
グアノシン−シトシン含有量、及び媒質中のＭｇ及び他
の塩の濃度に依存している。例えば、３５ヌクレオチド
長の標的相補配列の有するが異なる腕及び異なる試験ア
ッセイ条件を持つプローブＡ及びＣの融解挙動（図６）
と比較してみるとよい。２価カチオンは、融解温度に対
して特に強い影響を与える。例えば、プローブＡ（図
３）の融解温度は、マグネシウムイオンが存在しないと
きは２７℃であるが、たかだか１ｍＭのＭｇＣｌ₂が存
在すると５６℃となる。さらに短い腕（８または５ヌク
レオチド長）の本発明のプローブは、マグネシウムイオ
ンが存在しないときはランダムコイルとして存在するこ
とがわかった。これらは、たかだか１ｍＭのＭｇＣｌ₂
が存在するときは、安定なステムｄｕｐｌｅｘｅｓを形
成する。

【００８３】図１１（曲線１１１）の２５℃及び７５℃
における蛍光レベルから、プローブＤのＥＤＡＮＳの蛍
光は、プローブがステムｄｕｐｌｅｘを有する場合は９
６パーセント消光され、ランダムコイルの状態にあると
きは１９パーセント消光されると見積もられる。図１１
の縦軸は、０から１００の範囲の蛍光の線形目盛りであ
る。目盛りの下限は緩衝溶液（１００ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０）の蛍光レベ
ルに合わせ、上限は標的配列に結合したプローブＤの１
７０ｎＭ溶液の蛍光に設定した。我々は既に、腕がステ
ムｄｕｐｌｅｘを形成する場合は、消光の程度がプロー
ブ長に依存しないことを示した。しかし、ランダムコイ
ル状態では、本発明のプローブが小さいほど長いプロー
ブより消光の程度が大きい。例えば、５１ヌクレオチド
長であるプローブＥは、融解時において、その評定に結
合したときと同様の蛍光を示した。プローブＤは、その
温度変性プロファイル（図１１、曲線１１１）と、その
ハイブリダイゼーション曲線（図１２）とを比較するこ
とにより、記載したアッセイ条件において本発明のプロ
ーブであるであると決定された。プローブＤのハイブリ
ダイゼーション曲線１２１を得るために、まず上述した
プローブＤの溶液を２５℃に維持して蛍光をモニターし
た。最初の２分間以上に渡って蛍光レベルが一定である
ことを確認した後、標的モデルであるオリゴデオキシヌ
クレオチド（５’−ＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴ−
３’）２．２５μＭを含む溶液５μｌを添加した。プロ
ーブ濃度に対して５倍モルの過剰な標的モデルが存在す
る。蛍光レベルを毎秒記録した。この実験を、単一の内
部ヌクレオチドミスマッチを含むオリゴデオキシヌクレ
オチド（５’−ＣＡＴＡＧＧＴＧＴＴＡＡＣＴＴ−
３’）に対して（図１２、曲線１２２）、及び単一の内
部ヌクレオチド欠失を含むオリゴデオキシヌクレオチド
（５’−ＣＡＴＡＧＧＴ−ＴＴＡＡＣＴＴ−３’）に対
して（図１２、曲線１２３）繰り返した。ミスマッチ及
び欠失の同定は、各々下線及び「−」で示した。

【００８４】曲線１２１（図１２）に見られるように、
全部の相補的一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド標的モ
デルを、プローブＤを含む溶液に、その融解領域より低
温で添加したとき、溶液の蛍光は短時間に劇的に増加す
る。この時間による蛍光の増加は、ハイブリダイゼーシ
ョン反応の２次速度論の特徴、即ち、プローブ、標的、
塩の濃度または温度の上昇に伴って２次速度定数が増加
することを示している。我々は、シグナル−対−バック
グラウンドの比を極めて大きくすることができるので、
フルオロフォア(fluorophore)及びククエンチャー(quen
cher)からなる相互作用ラベルを用いることを好む。図
１２は、これらの条件下でのプローブＤの比が２５：１
であり、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬとがラベル対である
ことを示している。同様な蛍光の増加が、ＲＮＡ標的を
用いたときにも観察された。そのようなＲＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッドは、リボヌクレアーゼＨで処理され、ＲＡ
Ｎ−ＤＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡの消化によって
蛍光は最小レベルに戻される。プローブＤとその標的と
のハイブリダイゼーションによる蛍光の増加は、そのス
テムの温度変性による蛍光の増加よりも大きい。このこ
とは図１１と図１２とを比較することによってわかる
が、それらの図の縦軸の目盛りは同じである。我々は、
ここで観察された相違を以下のように理論付けする。即
ち、ランダムコイルコンフォメーションと仮定される融
解したプローブＤ（わずか２５ヌクレオチド長）では消
光が起こるが、プローブＤがその標的とハイブリダイズ
すると、プローブ−標的ハイブリッドは、消光が低減さ
れるまたは起こらないコンフォメーションと仮定される
からである。

【００８５】さらなる実験において、プローブＤのハイ
ブリダイゼーションは、何ら手段を講じることなく可視
化することができる。１６．４マイクロモルのプローブ
Ｄ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂
を１０μｌ入れた試験管を２本用意した。一方の試験管
に、完全相補的標的モデルの２５０マイクロモル溶液
１．５μｌを添加した。この試験管の蛍光は、両試験管
を広域波長の紫外線源（Transilluminator, Model No.3
-3100, Fotodyne, New Berlin, Wisconsin）で照射した
とき、室温において裸眼に可視であった。他方の試験管
は、実質的に蛍光を発しなかった。蛍光シグナルは、実
質的に即座に現れた。この試験管は、Kodak Ektachrome
ASA 200 フィルムを用い、０．２５秒の露光時間で写
真撮影された。

【００８６】実施例VI：プローブ機能の論証 プローブＡを用いたさらなる試験を、プローブ機能を論
証するために行った。プローブＡを、過剰のＤＮＡ標的
及び過剰のＲＮＡ標的を用いて試験した。ＤＮＡ標的
は、実施例Ｖに上述したモデル標的である。ＲＮＡ標的
は、ＨＩＶ−１のインテグラーゼ遺伝子に対応する８８
０ヌクレオチドＲＮＡであった（Muesingら、1985）。
ＤＮＡモデル標的の配列は、ＲＮＡ標的の配列の内部に
含まれている。この標的核酸及びプローブＡを、ＴＥバ
ッファーに懸濁した。５つの０．５ｍｌのプラスティッ
クスナップキャップチューブを、以下を含むように調製
した：１）１０００ｐモルのＤＮＡ標的；２）８０ｐモ
ルのＲＮＡ標的；３）８０ｐモルのＲＮＡ標的及び１５
ｐモルのプローブＡ；４）１０００ｐモルのＤＮＡ標的
及び１５ｐモルのプローブＡ；及び５）１５ｐモルのプ
ローブＡ。各試験の最終体積を、ＴＥバッファーで６μ
ｌに調整した。

【００８７】トランシルミネーター（Model No. 3-310
0, Fotodyne, New Berlin, Wisconsin）からの紫外線で
チューブを照射しながら、チューブをギルソン(Gilson)
マイクロピペッターで二度優しくピペッティングして混
合した。プローブＡによる標的の検出を意味する、強く
青い蛍光が目で観察され、撮影された。チューブ１−５
に対応する、結果７１−７５は、それぞれ図７に示され
ている。蛍光シグナルの外観は、ＤＮＡ標的を含むチュ
ーブで実際に瞬間的であり、ＲＮＡ標的を有するチュー
ブでは数分で起こった。ＲＮＡ標的における遅れは、Ｒ
ＮＡ中の周辺配列によって標的配列が隠されたためかも
しれないが、使用された標的が低量であったためと考え
られる。対照試験では、無関係の核酸がプローブＡと混
合された。これらの対照では蛍光が全く観察されなかっ
た（データは示さず）。これらの実験の結果から、ａ）
標的のない条件では、本発明のよく設計されたプローブ
は大変低いレベルのバックグラウンドシグナルを有す
る；ｂ）プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、ヒ
トの目によって検出可能なシグナル変化を生ずることが
できる；ｃ）本発明のプローブはＲＮＡまたはＤＮＡ標
的のいずれかと作用する；およびｄ）標的の存在下で
は、本発明のプローブは、数分以内に非常に急速に“オ
ン”になることができる、ことが推論される。さらに、
標的配列のない条件下でプローブＡを急速に熱しかつ冷
却することにより、プローブが非常に速く、実際には瞬
間的に“オフ”になることが示された。

【００８８】図８で報告された試験に用いられたサンプ
ル、追跡８２は、９５℃に熱せられ、アイスバスで急速
に冷却され、検出温度である２０℃で再度インキュベー
トされた。シグナル生成の動力学は、上述のようであっ
た。２０℃でのインキュベーション中の追跡は、実際に
追跡８２と区別できなかった。これは、親和性ペアとし
てオリゴヌクレオチドの腕を有する本発明のよく設計さ
れた単一分子プローブを用いて、プローブ−標的ハイブ
リッドが可逆的に温度的に変性し得ることを証明してい
る。しかして、このような実施態様は、増幅産物のリア
ルタイム検出のためのＰＣＲ等のサイクル反応への取り
込みに適している。

【００８９】図１２は、プローブＤが上記で報告したア
ッセイ条件下において、本発明の「対立遺伝子識別プロ
ーブ」であることを示している。曲線１２１は、プロー
ブＤと完全相補的標的モデルとのハイブリダイゼーショ
ンによる蛍光の大きな増加を示している。中心に単一の
ヌクレオチドミスマッチを含むオリゴデオキシヌクレオ
チドをプローブＤの溶液に添加したとき、実質的に蛍光
の増加は観察されなかった（曲線１２２）。同様に、単
一のヌクレオチド欠失を含むオリゴデオキシヌクレオチ
ドを添加しても、実質的な蛍光の増加はもたらされなか
った（曲線１２３）。また、無関係な核酸の添加も、報
告したアッセイ条件下では蛍光の増加をもたらさなかっ
た。曲線１２１は、プローブＤがその完全相補的標的モ
デルを、標的相補的配列の予め選択した核酸標的配列へ
のハイブリダイゼーションによって認識し結合したこと
を示している。曲線１２２及び１２３は、プローブＤ
が、最小に不完全にマッチしたオリゴデオキシヌクレオ
チドとハイブリダイズしないことを証明している。曲線
１２２及び１２３、並びに曲線１２１によれば、プロー
ブＤは、完全相補的標的モデルと、単一のヌクレオチド
が変更または欠失されているオリゴヌクレオチドとを有
効に識別することが示されている。プローブＤは、わず
かにミスマッチしたオリゴヌクレオチドを識別するの
で、我々は、これらのオリゴヌクレオチドを「標的モデ
ル」と呼ぶことをやめる。完全に相補的な配列、及び内
部に配置された１つのミスマッチを有する配列より少な
いハイブリダイゼーションエネルギーで変化できる配列
のみが、適当なアッセイ条件下での本発明の対立遺伝子
識別プローブの標的である。即ち、我々は、対立遺伝子
識別プローブが、実質的に完全にマッチした標的配列と
のみハイブリッドを形成するように設計できることを示
した。非相互作用ラベルを持ったプローブを用いた場
合、意図された対立遺伝子にハイブリダイズした「対立
遺伝子識別プローブ」を、そのようにハイブリダイズし
ていないプローブから分離するために洗浄を用いること
ができる。

【００９０】実施例VII：アッセイ 本発明のプローブを利用するアッセイは、ハイブリダイ
ゼーションのための条件下で、調べるべき物質にプロー
ブを添加することによって簡単に開始する。サンプルの
処理方法及び蛍光シグナルの観察方法は、サンプルの性
質によって変えてもよい。組織は、機械的に、またはカ
オトロピック塩類とのインキュベーションによって分裂
されてもよい。ほとんどの分裂組織は、アッセイに直接
的に用いることができる。しかしながら、ある組織は、
シグナルの検出と抵触し得る天然の蛍光物質を含む。こ
のような場合には、核酸をハイブリダイゼーションの前
後で蛍光物質から単離してもよい。開裂したプローブの
蛍光は、蛍光測定器によって観察することができる。本
発明の好ましいユニタリープローブは、感染性疾患のた
めのフィールド（携帯）試験で有益である。例えば、マ
ラリアの試験は、細胞を溶かすために血液サンプルにグ
アニジンチオシアナートを添加することによって開始
し、細胞を解毒し、成分を変性してもよい。次いで、マ
ラリア虫のリボソームＲＮＡに相補的な大過剰の相互作
用ラベルされたプローブ（期待される最大の標的濃度と
比べて）を加えて、ハイブリダイゼーションさせる。開
いたプローブ蛍光は、視覚的にまたは蛍光測定器の補助
を伴って観察することができる。陽性蛍光シグナルの検
出は、マラリア虫による感染を示す。

【００９１】本発明にかかる相互作用ラベルを備えたプ
ローブは、例えば特定の核酸のサイズの情報が所望とさ
れるような場合に、ゲルまたは他の媒体における特定の
核酸フラグメントを位置づけるために用いることができ
る。サンプル中の核酸を最初にゲル電気泳動で分画し、
次いでゲル自体をプローブを含有する溶液中に浸しても
よい。標的核酸が移動したゲルにおける位置は、ハイブ
リダイゼーションの結果として特徴的なシグナルによっ
て検出されるだろう。好ましくは単一分子、好ましくは
ラベル分子として蛍光剤と消光剤を有する、相互作用ラ
ベルを備えた本発明のプローブは、標的核酸を有する細
胞の検出のための生体染色として用いることができる。
このようなプローブのために修飾されたヌクレオチドが
特に有益である。プローブを細胞中に輸送するために、
トルエン等の透過剤を、プローブを添加する前に組織に
加える。あるいは、プローブをリポソームに内包させ、
これらのリポソームを細胞と融合させることができる。
プローブの輸送後に、ハイブリダイゼーションが細胞の
内部で行われる。組織を蛍光顕微鏡で観察すると、標的
核酸を含有する細胞が蛍光を発して見えるであろう。標
的核酸の細胞下の位置も、これらの実験で見つけること
ができる。

【００９２】合成反応における核酸の生成は、適切に設
計された相互作用ラベルを備えたプローブを反応混合物
中に含み、蛍光等のシグナルレベルをリアルタイムで観
察することによって観察することができる。このプロー
ブは、生成される核酸のセグメントに相補的であるよう
に設計されるべきである。このような反応の例は、ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼ及びＱ−βレプリカーゼによ
るＲＮＡ合成である。単一分子プローブは、この反応で
用いられるインキュベーション工程の期間よりずっと短
い時間で開閉するために、ポリメラーゼチェーン反応を
追跡するのに特に有益である。プローブのステムの溶解
温度より５−１２℃低い、各サイクルにおけるさらなる
温度を、検出温度として含むことができる。各サイクル
において、蛍光のレベルは標的ＤＮＡ鎖の存在量を示
す。過剰なＰＣＲプライマーとして、反応混合物におけ
る過剰なプローブを用いるべきである。ＰＣＲは非対称
でもよい。終点検出に対し、正しい産物のリアルタイム
観察は、ポリメラーゼチェーン反応による標的核酸の濃
度の概算の正確さ及び動的範囲を改良し、増幅後の分析
の必要性をなくす。

【００９３】プローブＥは、ポリメラーゼ連鎖反応に典
型的な条件下における相互作用的にラベルされた本発明
のプローブである。我々は、これを反応の進行をモニタ
ーするために使用した。プローブＥの標的相補的配列
は、１３０−ヌクレオチド長の標的ＤＮＡフラグメント
の中間領域に相補的である。この標的は、ポリメラーゼ
連鎖反応において、プライマー５’−ＣＴＣＴＴＡＡＡ
ＡＴＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧ−３’及び５’−ＴＧＴＡＧ
ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’、及びＨＩＶ−
１ゲノムのインテグラーゼ部位を含むテンプレートプラ
スミドを用いたときに生成される。このテンプレートプ
ラスミドは、以下のように構成された。ＨＩＶ−１株Ｎ
Ｌ４−３（Adachi, et al., (1986), genbank にＨＩＶ
ＮＬ４３として挙げられている）のポリメラーゼ遺伝子
の部位をコードするｃＤＮＡは、プラスミドｐＧＥＭ−
４Ｚ（Promega）のポリリンカー中のＨｉｎｄ ＩＩＩ
及びＸｍａ Ｉ制限部位の間にサブクローンされた。得
られたプラスミドであるｐＧＥＭ−Ｉｎｔを、以下にテ
ンプレートとして用いた。

【００９４】４つのポリメラーゼ連鎖反応（”ＰＣ
Ｒ”）の系列を調製した。反応の第１の系列は、１０億
のｐＧＥＭ−Ｉｎｔテンプレート分子で開始した。反応
の第２の系列は、１千万のテンプレート分子で開始し
た。対照として、第３の系列はテンプレート分子を持た
ず、第４の系列はテンプレートと、無関係な増殖生成物
を産生するように選択されたプライマーとを有する。各
ＰＣＲ反応（１３０マイクロリットル）は、１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭの
ＫＣｌ、３．６ｕＭの各プライマー、０．０５単位／μ
ｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ［Boehringer Manhei
m: この調剤は、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性
を欠くと報告されている； Product Insert 1093. T 1
3.51.1180 075 MBGPM, citing Tindall, et al. 1988
参照］、及び０．２７μＭのプローブＥを含んでいる。
９２℃で２分、５５℃で３分、及び７２℃で３分という
温度プロファイルを３５回繰り返した。各系列の反応混
合物を入れた試験管を、種々の回数のサイクルを完了し
た後に温度サイクル装置（Coy Laboratories）から取り
出した。全てのサイクルプログラムの終了後、全ての反
応混合物を９２℃に加熱し、３７℃に冷却し、それらの
蛍光を測定した。曲線１３１−１３４（図１３）は、各
々第１の系列から第４の系列までの測定結果を示してい
る。

【００９５】図１３は、ＰＣＲ増殖の進行がモニターで
きることを示し、増殖生成物の同定が確認された。３７
℃における蛍光は、ＰＣＲ増殖が進行するに伴って増加
し（曲線１３１及び１３２）、予測されたＤＮＡの蓄積
が報告されている。蛍光の増加のプロファイルは、増殖
されたＤＮＡの量が少なすぎて見ることのできない指数
相と、それに続き、シグナルが見えるようになる線形相
とによって特徴づけられる。第１の系列（曲線１３１）
では、指数相が完了するのに約１０サイクルを要する。
第２の系列（曲線１３２）では、１００分の１の少ない
テンプレートで開始され、指数相が完了するのに約１７
サイクルを要する。これら２つの反応において蛍光が線
形的に増加するとき、それらは互いに平行である。テン
プレートとしてのＤＮＡを添加しない第３の系列（曲線
１３３）、及び、無関係なＤＮＡが合成される第４の系
列（曲線１３４）では、蛍光の僅かな増加しか見られな
かった。正の蛍光シグナルは、これらのバックグラウン
ドから容易に見分けられる。増殖過程に渡って観察され
るバックグラウンド蛍光の増加（図１３）は、ポリメラ
ーゼの量を減らすことによって低減させることができ
る。各サイクルでの蛍光発光過程をシミュレーションす
るために、第１の系列の反応混合物をさらに分析した。
種々のサイクルで停止させた反応物を９２℃に加熱して
３７℃に冷却した。各反応混合物の蛍光を測定し、温度
の関数としてプロットした。図１４は、この実験の結果
を示す。

【００９６】温度変化サイクルの零サイクル及び２サイ
クル後に停止させた反応混合物において、温度が低下す
るに伴って蛍光は低レベルに減少した（曲線１４１及び
１４２）。これらの曲線は、実質的に区別できなかっ
た。これらの反応の曲線は、標的分子が存在しないとき
のプローブＥの融解プロファイルと等価である。８サイ
クル後の反応混合物では、蛍光は高レベルで安定した
（曲線１４３）。蛍光が安定化するレベルは、サイクル
数の増加に伴って徐々に向上した（曲線１４１−１４
９）。冷却時の温度トランジションの変化の大きさは、
ＰＣＲ生成物の蓄積が多くなるに従って減少し（曲線１
４１−１４８）、３５回目のサイクルでは温度トランジ
ションは見られなかった（曲線１４９）。３５回目のサ
イクルまでに、添加されたプローブ分子の数より多くの
ＰＣＲ生成物が作製される。また、図１４の曲線群は、
約５０℃より低い任意の温度で測定した蛍光は、プロー
ブＥのハイブリダイゼーションのみによるものであり、
（これは６１℃のＴｍを持ちプローブＣと同様であ
る）。約５０℃より高く、かつＴｍより低い温度での検
出は、標的の量に比例するが、腕の温度的分離(Thermal
separation)による蛍光及びハイブリダイゼーションに
よる蛍光を含んでいると思われる。

【００９７】ＰＣＲ反応生成物は、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色を用いても消光さ
れる。プローブＥを含む試料の蛍光と、臭化エチジウム
を含む試料の蛍光との間に強い相関が見られる。これら
の結果は、この２つの消光方法が、その感度において類
似していることも示している。ＰＣＲ反応の内容物のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動は、３５サイクルの重合
の後でも、検出できるほどのプローブの減成が無いこと
を示している。本発明の相互作用ラベルを持つプローブ
は、鎖置換(strand displacement)増殖反応、自己支持
配列(self-sustained sequence)複製反応といった他の
核酸増殖反応のモニタリングにも用いることができる。
有効なプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応生成物用のプ
ローブと類似の方法で設計され使用される。等温増殖に
対して、反応中の任意の時間における蛍光は、合成され
た核酸の量の直接的な測定となる。

【００９８】実施例VIII 非相互作用的にラベルされた本発明の対立遺伝子識別プ
ローブの優れた識別力が実験的に示された。放射活性に
ラベルされたプローブを、標的配列及び僅かにミスマッ
チさせたオリゴヌクレオチドとに対して比較し、これら
のプローブの相対的識別力を比較した。第１のプローブ
であるプローブＦは、本発明の対立遺伝子識別プローブ
である。プローブＦは、１５ヌクレオチドの標的相補的
配列と、各５ヌクレオチドの相補的腕を有する。プロー
ブＦのヌクレオチド配列は、プローブＤのヌクレオチド
配列と同じである。相互作用的ラベルを持った変形例と
して既に試験したように、プローブＦは、実施例Ｖに記
載したプローブＤに対する条件下において、本発明のプ
ローブであることが示されている。第２のプローブであ
るプローブＧは、プローブＤと同じ標的相補的配列を有
するが、その腕の一方のヌクレオチドが異なった順序で
合成され、２本の腕が相補的でないようにされている。
第３のプローブであるプローブＨは、プローブＤと同じ
標的相補的配列を有するが、腕配列を持たない。プロー
ブＦ、Ｇ及びＨは、プローブＤのような相互作用的ラベ
ルではなく、それらの５’末端に非相互作用的ラベルで
ある放射活性リン酸塩原子を有している。２つの可能な
オリゴヌクレオチド標的は、１９−ヌクレオチド長であ
り、ストレプトアビジン被覆した常磁性粒子（Promeg
a）に、それらの５’末端のビオチンを介して結合して
いる。プローブＦ、Ｇ及びＨの標的相補的配列に完全に
相補的な標的配列は、第１の可能な標的の３’末端に位
置している。第２の可能な標的は、３’末端から８番目
のヌクレオチドがＧであること以外は第１のものと同じ
であり、プローブＦ、Ｇ及びＨの標的相補的配列に対し
て唯一のミスマッチを内部に含んでいる。

【００９９】各プローブを、プローブＤについて上述し
た条件下で各標的にハイブリダイズした。ハイブリッド
は、ストレプトアビジン被覆した常磁性粒子表面上に細
くした。この粒子を洗浄してハイブリダイズしていない
プローブを取り除いた。洗浄後、ビーズに結合した放射
活性をシンチレーションカウンターで測定した。この反
応を標的無しで繰り返し、ビーズに吸着したプローブか
らのバックグラウンドが、毎分約６０００カウントであ
ると見積もった。第１のプローブは、第１の標的に対し
てバックグラウンドを越える読み（毎分５９，０００カ
ウント）を与え、この値は、第２の標的に対する値（毎
分１１，０００）の５倍以上であった。第２及び第３の
プローブも、第１の標的に対してバックグラウンドを越
える読みを与えたが、これらの値は、ともに第２の標的
に対する値の約２．５倍に過ぎなかった（第２のプロー
ブ：毎分４５，０００（第１の標的）、２１，０００
（第２の標的）カウント、第３のプローブ：毎分１３
５，０００（第１の標的）、５４，０００（第２の標
的）カウント）。本発明の対立遺伝子識別プローブの向
上した識別力は、驚くべき発見である。この向上した識
別能力は、核酸親和性ペア(nucleic acid affinity pai
r)の存在によるものであり、それによってプローブが、
ミスマッチした配列へのハイブリダイゼーションのとき
にはエネルギー的に好ましいが、完全の相補的な標的配
列へのハイブリダイゼーションのときには好ましくない
コンフォメーションをとるものと考えられる。これらの
結果は、「対立遺伝子識別プローブ」が、完全相補的標
的に好ましくハイブリダイズされることを示している。
対立遺伝子識別プローブが非相互作用的ラベルを持つと
きは、標的にハイブリダイズしたプローブを、ハイブリ
ダイズしていないプローブから単離するために、洗浄、
補足または他の手段といった分離工程を用いることがで
きる。即ち、単離したハイブリッドからの蛍光を測定す
ることにより、完全にマッチした標的配列の存在を定量
的または定性的に決定することができる。さらに、対立
遺伝子識別プローブが相互作用的ラベルを有する場合
は、完全にマッチした標的にハイブリダイズしたプロー
ブからのシグナルの大きさを測定するために、ハイブリ
ッドを単離する必要がない。

【０１００】実施例IX：繋がれたプローブ 相互作用ラベルを備えた本発明のプローブは、上述しか
つ図１０に示したような固体の支持体に繋がれたアッセ
イで用いることができる。好ましい実施態様としては、
多重プローブを調製する。各プローブは、独特の標的相
補配列を含む。全てが、同じラベルペア、すなわち発蛍
光団及び消光剤を含んでもよい。また、各プローブは、
一方の腕の端部から伸びるオリゴヌクレオチド鎖も含
む。各プローブは、それに割り当てられた計量棒上の特
定の位置にオリゴヌクレオチド鎖を介して繋がれる。こ
の設計は、均一なハイブリダイゼーションができるよう
に標的相補配列を自由にさせる。この実施態様を利用す
るアッセイでは、計量棒を、一つまたはいくつかの異な
る標的配列を含むサンプルと接触させる。次いで、繋が
れたプローブが、対応する標的配列と相互作用する。こ
のように相互作用したプローブは、開いた状態に変形す
るであろう。計量棒を、適切な周波数の光で照らす。計
量棒の特定の位置からの蛍光は、対応する標的配列の存
在を示す。繋がれたプローブアッセイのさらなる構成
は、当業者には明らかであろう。繋がれたプローブは、
相互作用ラベルを備えた対立遺伝子識別プローブであっ
てもよい。

【０１０１】参考文献 Adachi, A., Gendelman, H.E., Koenig, S., Folks,
T., Willey, R., Rabson, A., Martin, M.A., (1986) P
roduction of Acquired Immunodeficiency Syndrome-As
sociated Retrovirus in Human and Nonhuman Cells Tr
ansfected with an Infectious Molecular Clone, Jour
nal of Virology, 59, 284-291.Cardullo, R.A., Agarw
al, S., Flores, C., Zamecnik, P.C.and Wolf, D.E.,
(1988), Detection of hybridization by nonradiative
fluorescence energy transfer, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 85, 8790-8794.Connoly, B.A. and Rider,
P., (1985), Chemical synthesis of oligonucleotide
containing a free sulphydryl group and a subsequen
t attachment of thiol specific probes, Nucleic Aci
ds Res. 13, 4485-4502.Diamond, S.E., Brewen, J.G.,
Williams, J.I., Ellwood, M.S., Collins, M. and Fr
itsh, E.F., (1988), Displacement Polynucleotide as
say method andpolynucleotide complex reagent there
fore, U.S. Patent No.4766062.Egholm, M., Buchardt,
O., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S.M.,Dr
iver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K. Norden, B., Niel
sen, P.E., PNA hybridizes to complementary oligonu
cleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bondin
g rules(1993) Nature, 365, 566-568.Erlich, H.A., G
elfand, D. and Sninsky, J.J.,(1991), Recent adcanc
es inthe polymerase chain reaction, Science 252, 1
643-1651.Freire, S.M., Kierzek, R., Jaeger, J.A.,
Sugimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson, T., Turne
r, D.H., (1986) Improved free-energy parameters fo
rpredictions of RNA duplex stability, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 83,9373-9377.Gillespie, D. and
Spiegelman, S., (1956), A quantitative assay for D
NA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane,
J. Mol. Biol. 12, 829-852.Guatelli, J.C., Whitfie
ld, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richman,D.
D. and Gingeres, T.R.,(1990), Isothermal in vitro
amplification of nucleic acids by a multienzyme re
action modeled after retroviral replication, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87. 1874-1878.Heller, M.
J., Morrison, L.E., Prevatt, W.D. and Akin, C., (1
983), Homogenous nucleic acid hybridization diagno
stics by nonradiative energy transfer, European Pa
tent Application 070685.Landegren, U.,(1993), Mole
cular mechanics of nucleic acid sequence amplifica
tion, Trends Genet. 9, 199-204.Lichter, P., Tang,
C.J.C., Call, K., Hermanson, G., Evans, G.A., Hous
man, D. and Ward, D.C.,(1990), High resolution map
ping of human chromosome 11 by in situ hybridizati
on with cosmid clones, Science 247, 64-69.Lomeli,
H., Tyagi, S., Pritchard, C.G., Lizardi, P.M. and
Kramer, F.R.,(1989), Quantitative assays based on
the use of replicatable hybridization proves, Cli
n. Chem. 39, 1826-1831.Matayoshi, E.D., Wang, G.
T., Krafft, G.A. and Erickson, J.E.,(1990), Novel
fluorogenic substrates for assaying retroviral pro
teases by resonance energy transfer, Science 247,
954-958.Morrison, L.E.,(1987), Compotitive homogen
eous assays, European PatentApplication 87300195.2 Morrison, L.E.,(1989), Lifetime-resolved assay pro
cedures, U.S.PatentNo.4822733.Morrison, L.E., Hald
er, T.C. and Stols, L.M.,(1989),Solution phase det
ection of polynucleotides using interacting fluore
scent labels and competitive hybridization, Analy
t. Biochem. 183, 231-244.Morrison, L.E. and Stols.
L.M.,(1993), Sensitive fluorescence-based thermod
ynamic and kinetic measurements of DNA hybridizati
on in solution, Biochemistry, 32, 3095-3104.Muesin
g, M.A., Smith, D.H., Cabrailla, C.D., Benton, C.
V., Lasky, L.A.and Eopon, D.J.,(1985), Nucleic aci
d structure and expression of the human AIDS/adeno
pathy retrovirus, Nature 313, 450-458.Nelson, P.
S., Fry, R.A. and Liu, E., (1989), Bifunctional ol
igonucleotide probes synthesized using a novel CPG
support are able to detect single base pair mutat
ions, Nucleic Acids Res. 17, 7187-7194.Orum, H., N
ielsen, P.E., Eghlom, M., Berg, R.H., Buchardt, O.
Stanley,C., (1993) Single base pair mutation anal
ysis by PNA directed PCR clamping, Nucleic Acids R
es. 21, 5332-5336.Sambrook, J., Fritsch, E.F. and
Maniatis, T., (1989), Molecular cloning -- a labor
atory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Shore, D., Langowski, J. and Baldwin, R.L.,(1981),
DNA flexibility studied by cobalent colosure of s
hort fragments into circles, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 78, 4833-4827.Tindall, K.R., Kunkel T.
A., (1988) Fidelity of DNA Synthesis by the Therm
us aquaticus DNA Polymerase, Biochem., 27, 6008-60
13.Tinoco, Jun., I., Borer, P., Dengler, B., Levin
e, M.D., Uhlenbeck, O.C., Crothers, D.M., Gralla,
J., (1973), Improved Estimation of SecondaryStruct
ure in Ribonucleic Acids, Nature, 246, 40-41.Uhlma
nn, E. and Peyman, A., (1988) Antisense Oligonucle
otides: A New Theraputic Principal, Chemical Revie
ws 90, 543-584.Walker, G.T., Fraiser, M.S., Schra
m, J.L., Little, M.C., Nadeau, J.G.and Malinowski,
D.P., (1992), Strand displacement amplification -
- an isothermal, in vitro DNA amplification techni
que, Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696.Wang, G.T.,
Matayoshi, E.D., Huffaker, H.J. and Krafft, G.A.,
(1991) Design and synthesis of new fluorogenic HIV
protease substrates based onresonance energy tran
sfer, Tetrahedron Lett. 31, 6493-6496.

【図面の簡単な説明】

【図１】“閉じた”形態にある本発明にかかる相互作用
ラベルを有する好ましい二分子プローブを示す図であ
る。

【図２】“開いた”形態にある図１のプローブを示す図
である。

【図３】は、相互作用ラベルを有する最も好ましい単一
分子プローブの一つである実施例ＩのプローブＡを示す
図である。

【図４】実施例IIの相互作用ラベルを有する共通ステム
の使用を示す図である。

【図５】実施例IIIの単一分子プローブＣを示す図であ
る。

【図６】実施例ＶのプローブＡおよびプローブＣの温度
変性曲線を示す。

【図７】実施例VIの結果を示す写真である。

【図８】実施例ＶのプローブＡのハイブリダイゼーショ
ンの動力学のグラフである。

【図９】標的配列に結合した、腕にヘアピン配列と相互
作用ラベルを備えた単一分子プローブを示す図である。

【図１０】本発明に係る相互作用ラベルを有する繋がれ
た単一分子プローブを示す図である。

【図１１】実施例Ｖに係るプローブＤの温度変性曲線を
示す図である。

【図１２】本発明に係る相互作用ラベルされた対立遺伝
子識別プローブである、プローブＤのハイブリダイゼー
ションの動力学のグラフである。

【図１３】プローブＥを用いたポリメラーゼチェーン反
応アッセイの進行を示す図である。

【図１４】プローブＥを用いた、温度に応じたポリメラ
ーゼチェーン反応における蛍光レベルを示す図である。

【符号の説明】 １ プローブ ２ 標的相補配列 ３ 腕 ４ 腕 ５ ステム二重鎖 ６ ラベル分子 ７ ラベル分子 ９ 標的配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フレッド・アール・クレイマー アメリカ合衆国・ニューヨーク・10463・ リヴァデイル・ウェスト・231スト・スト リート・561 (72)発明者 ポール・エム・リザーディ メキシコ国・62120・クエアナヴァーカ・ コロニア・ランチョー・コーティズ・プラ イヴァーダ・セアリートス・＃99（番地な し)

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検出温度を含む決められた条件を備えた
   アッセイで、サンプル中に所定の核酸標的配列が存在す
   るか否かを検出するためのラベルされた一本鎖プローブ
   であって、該プローブは ａ）ｉ）７ないし２５ヌクレオチドを有し、５’末端と
   ３’末端とを備えかつ標的配列に完全に相補的である標
   的相補配列、およびii）前記５’末端に共有結合した第
   一の腕配列および前記３’末端に共有結合した第二の腕
   配列であって、前記第一の腕配列は前記５’末端に直接
   的に隣接する３ないし８ヌクレオチドを有し、前記３’
   末端に直接的に隣接した前記第二の腕配列のヌクレオチ
   ドに相補的であり、前記アッセイ条件下における前記検
   出温度より少なくとも５℃高い融解温度を備えたステム
   二重鎖を形成する腕配列を具備するオリゴヌクレオチド
   配列であって、前記オリゴヌクレオチド配列は、相対す
   る末端が蛍光剤／消光剤のペアでラベルされている場合
   に、前記条件下で過剰のモデル標的を添加することによ
   り、前記融解温度より１０℃低いところから１０℃高い
   ところまで熱して引き起こされる蛍光増加の少なくとも
   １０％蛍光を増加させるオリゴヌクレオチド配列、およ
   び ｂ）少なくとも一つの検出可能なラベルを備え、 前記プローブは、前記標的配列を含むサンプルの前記ア
   ッセイにおいて、一つの内在性ヌクレオチドが前記標的
   配列と異なる配列を含むサンプルの前記アッセイより、
   バックグラウンドを越えて少なくとも３倍高いバックグ
   ラウンドを越えた検出可能なシグナルを生成することを
   特徴とするプローブ。
2. 【請求項２】 前記ラベルが、放射性同位元素、酵素、
   発蛍光団および発光分子からなる群から選択された非相
   互作用ラベルであることを特徴とする請求項１記載のプ
   ローブ。
3. 【請求項３】 前記ラベルが相互作用ラベルペアであっ
   て、該ラベルペアの一方の成分が第一の腕配列に結合
   し、該ラベルペアのもう一方の成分が第二の腕配列に結
   合しており、該成分は腕がステム二重鎖を形成する際に
   相互作用することを特徴とする請求項１記載のプロー
   ブ。
4. 【請求項４】 前記相互作用ラベルペアが、蛍光剤およ
   び消光剤であることを特徴とする請求項３記載のプロー
   ブ。
5. 【請求項５】 前記ラベルペアが、ＤＡＢＣＹＬとＥＤ
   ＡＮＳであることを特徴とする請求項４記載のプロー
   ブ。
6. 【請求項６】 サンプル中に所定の核酸標的配列が存在
   するか否かを検出するためのアッセイであって、検出温
   度を含む決められた条件を備え、 ａ）前記アッセイ条件下で請求項３記載のプローブを含
   む前記サンプルをインキュベートする工程、および ｂ）前記検出温度において、前記サンプルを添加するこ
   とによって前記シグナルが増加するか否かを調べる工程
   を含むことを特徴とするアッセイ。
7. 【請求項７】 前記相互作用ラベルペアが、発蛍光団お
   よび消光剤である請求項６記載のアッセイ。
8. 【請求項８】 前記ラベルペアが、ＤＡＢＣＹＬとＥＤ
   ＡＮＳであることを特徴とする請求項７記載のアッセ
   イ。
9. 【請求項９】 サンプル中に所定の核酸標的配列を含む
   核酸鎖が存在するか否かを検出するためのアッセイであ
   って、検出温度を含む決められた条件を備え、 ａ）前記サンプルを、前記鎖に相補的であるが、前記所
   定の標的配列には相補的でない少なくとも一つの捕捉プ
   ローブとインキュベートする工程、 ｂ）前記少なくとも一つの捕捉プローブを固体表面に結
   合させる工程、 ｃ）前記サンプルを、前記アッセイ条件下で請求項２記
   載のプローブとインキュベートする工程、 ｄ）工程ａ、ｂおよびｃが完了した後に、前記固体表面
   を洗浄する工程、および ｅ）前記検出温度において、前記シグナルを検出する工
   程を含むことを特徴とするアッセイ。
10. 【請求項１０】 ａ）アッセイを行うための説明、およ
    び ｂ）前記アッセイ条件下で請求項１記載のプローブであ
    るプローブを備えたキット。