-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vor-Ort-Authentifizieren einer
Substanz ohne Durchführen
einer Elektrophorese. Die Substanz wird dazu mit einer in der Substanz
ansonsten nicht vorhandenen ersten Nukleinsäure bekannter Sequenz gleichmäßig vermischt
und dadurch markiert. Bei der späteren
Authentifizierung der Substanz wird das Vorhandensein der ersten
Nukleinsäure
nachgewiesen.
-
Die
Authentifizierung einer Substanz ist in allen Bereichen bedeutsam,
in welchen Substanzen ohne Autorisierung durch den Hersteller verändert oder
gefälschte
Substanzen als vom Hersteller produziert deklariert werden und dem
Hersteller dadurch ein wirtschaftlicher Schaden entsteht. Durch
die Möglichkeit
der Authentifizierung der vom Hersteller produzierten Substanz kann
der Distributionsweg der Substanz überwacht und die Echtheit der
Substanz überprüft werden.
Der wirtschaftliche Schaden kann dadurch vermindert werden, weil
gefälschte
und unautorisiert veränderte
Substanzen von Originalsubstanzen unterschieden werden können. Eine
Markierung der Substanz selbst anstatt der Verpackung der Substanz
bietet dabei eine höhere
Sicherheit.
-
Aus
der
DE 690 28 402
T2 ist ein Verfahren zur Markierung von Stoffen mit Nukleinsäuren bekannt.
Der Nachweis der Nukleinsäure
erfolgt durch deren Amplifikation und einem anschließenden Standard-Nukleinsäurehybridisierungstest
oder einer Nukleinsäuresequenzierung.
Nachteilig bei der Nukleinsäuresequenzierung
ist, dass diese verhältnismäßig aufwendig
ist und eine Nukleinsäuresequenzierung nicht
mit einem mobilen Gerät
vor Ort durchgeführt werden
kann. Die üblichen
Standard-Nukleinsäurehybridisierungstests
sind zeitaufwendig und erfordern Laborgeräte, welche nicht ohne Weiteres
portabel sind. Diese Tests erlauben keine schnelle Authentifizierung
vor Ort.
-
Nach
dem Stand der Technik ist es auch bekannt, eine Nukleinsäure nach
deren Amplifikation einer Gel-Elektrophorese zu unterziehen, auf
eine Membran zu übertragen
und die amplifizierte Nukleinsäure
auf der Membran durch Hybridisierung spezifisch nachzuweisen. Auch
dieses Verfahren ist zeitaufwendig, erfordert Laborgeräte und erlaubt
keine schnelle Authentifizierung vor Ort.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, welches
von wenig geschultem Personal vor Ort, d. h. zum Beispiel beim Zoll,
in Geschäften
oder bei Kontrollen auf der Straße, angewandt werden kann.
Das Verfahren soll in verhältnismäßig kurzer
Zeit eine Authentifizierung einer markierten Substanz ermöglichen.
-
Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch
1 gelöst.
Zweckmäßige Ausgestaltungen
ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 32.
-
Erfindungsgemäß ist ein
Verfahren zum Vor-Ort-Authentifizieren einer Substanz ohne Durchführung einer
Elektrophorese vorgesehen, wobei die Substanz mit einer in der Substanz
ansonsten nicht vorhandenen ersten Nukleinsäure bekannter Sequenz gleichmäßig vermischt
wird, wobei die erste Nukleinsäure
bei der Authentifizierung der Substanz nach einer Herausgabe der
Substanz aus der unmittelbaren Kontrolle eines Herstellers oder
Händlers der
Substanz mit folgenden Schritten nachgewiesen wird:
- a) Entnahme einer Probe aus der Substanz,
- b) Mischen der Probe mit einer ersten Flüssigkeit, welche eine zweite
Nukleinsäure
und zur Durchführung
einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion
(NSV) erforderliche Stoffe enthält,
wobei die zweite Nukleinsäure
so ausgebildet ist, dass sie an die erste Nukleinsäure binden
kann, und wobei die Stoffe durch das Binden der zweiten Nukleinsäure an die
erste Nukleinsäure
in der NSV eine Vervielfältigung
einer Nukleotidsequenz der ersten oder zweiten Nukleinsäure oder
einer zu der Nukleotidsequenz komplementären weiteren Nukleotidsequenz
bewirken können,
- c) Durchführen
der NSV in der ersten Flüssigkeit,
- d) In-Kontakt-Bringen der durch die NSV vervielfältigten
Nukleotidsequenz oder weiteren Nukleotidsequenz mit einer dazu zumindest
teilweise komplementären
dritten Nukleinsäure,
so dass die dritte Nukleinsäure
mit der Nukleotidsequenz oder weiteren Nukleotidsequenz spezifisch
hybridisiert, wobei die dritte Nukleinsäure mindestens eine optisch
erfassbare Markierungssubstanz enthält, welche ein optisches Erfassen
der erfolgten Hybridisierung erlaubt und
- e) Authentifizierung der Substanz durch optisches Erfassen der
erfolgten Hybridisierung,
wobei die erste Flüssigkeit
zwischen den Schritten c) und d) auf eine Oberfläche eines Feststoffs aufgebracht
wird und die Schritte d) und e) auf dieser Oberfläche durchgeführt werden
oder, wobei die erste Flüssigkeit
zwischen den Schritten d) und e) auf eine Oberfläche eines Feststoffs aufgebracht
wird und Schritt e) auf dieser Oberfläche durchgeführt wird, wobei
zumindest die Oberfläche
des Feststoffs saugfähig
ist, wobei die dritte Nukleinsäure
nicht an der Oberfläche
immobilisiert ist und zwischen dem Aufbringen der ersten Flüssigkeit
auf die Oberfläche
und der Authentifizierung kein Waschschritt erfolgt.
-
Bei
den genannten Nukleinsäuren
kann es sich um DNA oder RNA handeln. Die Nukleinsäuren können auch
künstliche,
in der Natur nicht vorkommende Nukleotide enthalten. Bei der Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion
kann es sich beispielsweise um eine PCR handeln. Bei den erforderlichen
Stoffen kann es sich dann um die Bestandteile eines Puffersystems,
Magnesiumionen, Desoxynukleotide, eine Polymerase und ggf. einen
oder zwei Primer handeln. Bei der ersten oder zweiten Nukleinsäure kann es
sich ebenfalls um einen Primer handeln. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann die erste Nukleinsäure
als Primer zur Vervielfältigung
der Nukleotidsequenz der zweiten Nukleinsäure oder der zu der Nukleotidsequenz
komplementären
weiteren Nukleotidsequenz oder die zweite Nukleinsäure als
Primer zur Vervielfältigung
der Nukleotidsequenz der ersten Nukleinsäure oder der zu der Nukleotidsequenz
komplementären
weiteren Nukleotidsequenz dienen. Bei der NSV kann es sich auch
um eine isothermal, d.h. bei gleichbleibender Temperatur, durchzuführende NSV
handeln. Eine solche NSV ist z. B. die so genannte "Rolling Circle-Amplifikation". Die Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion
kann beispielsweise durch, insbesondere zyklisches, Erwärmen in
einem tragbaren Gerät
erfolgen. Das Gerät
kann netzunabhängig
mit Strom versorgt werden.
-
Im
Sinne der Erfindung gilt die dritte Nukleinsäure dann als nicht immobilisiert,
wenn sie mit Wasser, insbesondere bei Raumtemperatur, von der Oberfläche mit
einem einzigen Waschschritt abgewaschen werden kann. Insbesondere
ist die dritte Nukleinsäure
nicht kovalent an die Oberfläche
gebunden. Eine solche Nukleinsäure
kann besser und schneller mit der Nukleotidsequenz oder weiteren
Nukleotidsequenz hybridisieren als eine immobilisierte dritte Nukleinsäure. Nicht
hybridisierte dritte Nukleinsäure wird
vor Schritt e) nicht entfernt. Durch das Entfallen eines Waschschritts,
dessen Durchführung
ein Herauswaschen der dritte Nukleinsäure und der Nukleotidsequenz
oder weiteren Nukleotidsequenz aus der Oberfläche be wirken würde, ist
das erfindungsgemäße Verfahren
sehr schnell durchführbar.
-
Schritt
d) kann nach Schritt c) durchgeführt werden.
Die dritte Nukleinsäure
kann aber auch während
der Durchführung
der NSV in der ersten Flüssigkeit
enthalten sein. Die Schritte c) und d) erfolgen dann zeitgleich
nach dem ersten Entstehen der Nukleotidsequenz oder der weiteren
Nukleotidsequenz. Das erfindungsgemäß vorgesehene Aufbringen der ersten
Flüssigkeit
zwischen den Schritten c) und d) oder d) und e) auf eine Oberfläche ermöglicht ein
einfaches und schnelles optisches Erfassen des Hybridisierens der
dritten Nukleinsäure
mit der Nukleotidsequenz oder der weiteren Nukleotidsequenz. Unter der
Durchführung
des Schritts e) auf der Oberfläche ist
zu verstehen, dass eine auf der Oberfläche durch die Hybridisierung
stattfindende Veränderung
optisch erfasst wird. Die dritte Nukleinsäure kann zur Durchführung des
Schritts d) gelöst
in einer weiteren Flüssigkeit
vorliegen. Bei der dritten Nukleinsäure kann es sich beispielsweise
um einen mit einem Fluorophor markierten Molecular Beacon handeln.
Die Floureszenz des Fluorophors wird im nicht mit der Nukleotidsequenz
oder weiteren Nukleotidsequenz hybridisierten Molecular Beacon durch
einen darin enthaltenen Quencher gelöscht. Durch die Hybridisierung
verändert
sich der räumliche
Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Quencher, so dass die Floureszenz
des Fluorophors gemessen werden kann. Das optische Erfassen der
Hybridisierung kann auch indirekt erfolgen, z.B. indem der hybridisierte Molecular
Beacon mittels eines Restriktionsenzyms gespalten wird. Dadurch
kann die Empfindlichkeit des Verfahrens gesteigert werden, weil
keine Rückfaltung
des gespaltenen Molecular Beacons und dadurch keine erneute Löschung der
Fluoreszenz stattfinden kann. Der hybridisierte Molecular Beacon kann
durch Anregung mit Licht einer für
den Fluorophor spezifischen Wellenlänge aus einem Handlesegerät angeregt
und mit dem Handlesegerät
sogar bei Tageslicht detektiert werden. Ein dazu geeignetes Handlesegerät ist das
von der Anmelderin vertriebene Gerät "Mobi Scanner B". Als optisch erfassbare Markierungssubstanz
können
beispielsweise auch Goldpartikel verwendet werden, welche in der
nicht hybridisierten dritten Nukleinsäure einen anderen Abstand zueinander
aufweisen als in der hybridisierten Nukleinsäure. Eine solche Nukleinsäure ist
aus
US 6,361,944 bekannt.
Die Hybridisierung führt
dann zu einer Farbänderung,
die mit dem bloßen
Auge erfasst werden kann. Auch wenn die dritte Nukleinsäure jeweils
nur mit einem Goldpartikel als Markierungssubstanz versehen ist,
kann deren Anreicherung an einem Ort der Oberfläche aufgrund einer spezifischen
Hybridisierung mit der Nukleotidsequenz oder weiteren Nukleotidsequenz
mit dem bloßen
Auge optisch erfasst werden.
-
Durch
die Saugfähigkeit
des Feststoffs oder zumindest der Oberfläche des Feststoffs bleibt die Oberfläche des
Feststoffs nach einem Aufbringen der dritten Nukleinsäure länger feucht.
Die Feuchtigkeit kann dabei von der ersten Flüssigkeit oder von einer Lösung der
dritten Nukleinsäure
stammen. Liegt die dritte Nukleinsäure als Molecular Beacon vor,
ist das vorteilhaft, weil sich die Haarnadelstruktur eines Molecular
Beacons beim Eintrocknen leicht öffnen
kann. Durch das längere
Feuchtbleiben verlängert
sich auch die dann zur Verfügung
stehende Zeit für
das optische Erfassen der erfolgten Hybridisierung. Das optische
Erfassen kann innerhalb von 15 Minuten, bevorzugt innerhalb von
5 Minuten, nach Schritt d) erfolgen. Der Feststoff kann z.B. ein
Filz oder ein Filterpapier sein.
-
Die
Durchführung
einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
erlaubt es, die erste Nukleinsäure
der Substanz in geringer Konzentration beizumischen. Die Markierung
ist dadurch preiswert. Bei der Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion ist es lediglich
erforderlich, eine für
einen Nachweis durch Hybridisierung ausreichende Menge der Nukleotidsequenz
oder der weiteren Nukleotidsequenz bereitzustellen. Dazu kann beispielsweise
bei einer PCR das Durchlaufen von nur 25, insbesondere nur 20, Temperaturzyklen ausreichend
sein. Das Verfahren ist dadurch schnell und mit einem geringen Energieaufwand
durchzuführen.
Es kann vor Ort, beispielsweise bei einer Lebensmittelkontrolle,
durchgeführt
werden. Insbesondere bei Lebensmitteln kann es sich bei der ersten Nukleinsäure um eine
mit einer natürlicherweise
in anderen Lebensmitteln vorkommenden Nukleinsäure identische Nukleinsäure oder
ein Fragment einer solchen Nukleinsäure handeln, so dass deren
Vermischen mit einem zu markierenden Lebensmittel auf keine gesundheitlichen
Bedenken stoßen
sollte. Bei den anderen Lebensmitteln handelt es sich im allgemeinen
um Lebensmittel auf Basis von Pflanzen, Pilzen oder Tieren.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
erfordert darüber
hinaus im Gegensatz zu den bekannten Laborverfahren nur gering geschultes
Personal, so dass es von jedermann vor Ort durchgeführt werden kann.
Die erste Flüssigkeit
und die dritte Nukleinsäure
kann dazu in einem Kit bereitgestellt werden. Weiterhin kann dazu
ein einfach zu bedienendes Gerät zur
Durchführung
der NSV und gegebenenfalls ein weiteres oder darin integriertes
Gerät zum
optischen Erfassen des Hybridisierens bereitgestellt werden.
-
Vorzugsweise
handelt es sich bei der optisch erfassbaren Markierungssubstanz
um ein Fluorophor und die dritte Nukleinsäure ist so ausgebildet, dass sich
eine Fluoreszenz des Fluorophors durch das Hybridisieren der dritten
Nukleinsäure
mit der Nukleotidsequenz oder der weiteren Nukleotidsequenz verändert. Das
optische Erfassen der erfolgten Hybridisierung gemäß Schritt
e) des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann durch Messen einer für
die hybridisierte dritte Nukleinsäure spezifischen Fluoreszenz
des Fluorophors erfolgen. Bei der dritten Nukleinsäure handelt
es sich vorzugsweise um einen Molecular Beacon.
-
Bei
einer Ausgestaltung des Verfahrens ist die dritte Nukleinsäure vor
dem Aufbringen der ersten Flüssigkeit
auf die Oberfläche
im Feststoff oder auf der Oberfläche
vorgelegt.
-
Die
Durchführung
des Verfahrens wird dadurch erheblich vereinfacht. Beispielsweise
kann der Feststoff mit darin in getrockneter Form vorliegender dritter
Nukleinsäure
bereitgestellt und in dieser Form vertrieben werden. Nach Schritt
c) ist es dann nur erforderlich die erste Flüssigkeit auf die Oberfläche aufzubringen
und die erfolgte Hybridisierung optisch zu erfassen.
-
Bei
der Substanz kann es sich um eine zweite Flüssigkeit, Creme, Salbe oder
Paste oder einen pulverförmigen
weitern Feststoff handeln. Die Substanz kann ein Lebensmittel, ein
Medikament, ein Kosmetikum oder ein Parfüm sein. Insbesondere kann die
Substanz ein alkoholisches Getränk,
insbesondere ein alkoholisches Getränk mit einem Alkoholgehalt
von über
30 %vol., bevorzugt ein alkoholisches Getränk mit einem Alkoholgehalt
von mindestens 38 %vol., sein. Bei einem solchen alkoholischen Getränk kann
das erfindungsgemäße Verfahren,
z.B. beim Zoll, auch zur Authentifizierung eines regulär versteuerten
gegenüber
einem nicht versteuerten Alkohol verwendet werden.
-
Bevorzugt
wird eine solche Menge der ersten Nukleinsäure eingesetzt, dass die Konzentration
der ersten Nukleinsäure
in der Substanz weniger als 1 nmol/kg der Substanz beträgt. Die
Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Substanz beträgt vorzugsweise
mindesten 1 fmol/kg der Substanz. Besonders vorteilhaft ist es,
wenn die Substanz mit einer vorgegebenen Menge der ersten Nukleinsäure vermischt wird,
so dass die erste Nukleinsäure
in einer definierten Konzentration in der Substanz vorliegt. Die Kenntnis
der genauen Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Substanz erhöht die Fälschungssicherheit
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
weil aus der Konzentration bei der Durchführung einer PCR eine genaue
Anzahl von Zyklen ermittelt werden kann, welche zur Bereitstellung
einer Nukleinsäuremenge
ausreicht, die für
das optische Erfassen der erfolgten Hybridisierung ausreichend ist.
Dadurch kann eine Substanz, welcher lediglich die authentische Sub stanz
beigemischt worden ist, von der authentischen Substanz unterschieden
werden, weil in einer solchen Substanz die erste Nukleinsäure in einer
so niedrigen Konzentration enthalten ist, dass die Anzahl der ermittelten
Zyklen bei der PCR nicht dazu ausreicht, eine Nukleinsäuremenge
bereitzustellen, welche ein optisches Erfassen der erfolgten Hybridisierung
ermöglicht.
-
Die
Schritte c) und/oder e) können
mittels mindestens eines Geräts
durchgeführt
werden, welches ausschließlich über mindestens
eine Batterie oder mindestens einen Akkumulator mit Strom versorgt
wird. Dadurch ist eine vom Stromnetz unabhängige Vor-Ort-Authentifizierung
möglich.
Dazu kann die Konzentration in der Substanz so gewählt werden,
dass nur wenige Amplifikationsschritte bei Durchführung des
Schritts c) erforderlich sind, so dass zur dazu gegebenenfalls erforderlichen
Erwärmung
nur eine geringe Energiemenge aufgewandt werden muss.
-
Die
Vor-Ort-Authentifizierung kann weiterhin dadurch erleichtert werden,
dass ein Gerät
zur Durchführung
der Schritte c) und/oder e) so ausgestaltet ist, dass es mit einer
Hand tragbar ist. Dazu kann das Gerät ein Gewicht von höchstens
15 kg, vorzugsweise höchstens
10 kg, insbesondere höchstens
5 kg, aufweisen. Schritt e) kann mittels eines mobilen Handlesegeräts durchgeführt werden.
Das Handlesegerät
kann zur Anregung der Fluoreszenz des Fluorophors eine Laserdiode
und zum erfassen des vom Fluorophor emittierten Lichts einen Detektor aufweisen.
Das Verfahren ist vorzugsweise so ausgestaltet, dass es eine Authentifizierung
in weniger als drei Stunden, vorzugsweise weniger als zwei Stunden,
insbesondere weniger als einer Stunde erlaubt. Das kann beispielsweise
dadurch erreicht werden, dass die Konzentration der ersten Nukleinsäure in der
Substanz so gewählt
wird, dass nur eine geringe Zahl von Vervielfältigungsschritten bei Schritt
c) erforderlich ist und die Sequenz der dritten Nukleinsäure und
die optisch erfassbare Markierungssubstanz so gewählt werden,
dass be reits eine geringe Anzahl hybridisierter dritter Nukleinsäuren nachgewiesen
werden kann.
-
Die
erste und die zweite Nukleinsäure
können,
zumindest teilweise, zueinander komplementär sein. Dadurch kann eine spezifische
Bindung der zweiten Nukleinsäure
an die erste Nukleinsäure
gewährleistet
und dadurch die Fälschungssicherheit des
erfindungsgemäßen Verfahrens
erhöht
werden. Vorzugsweise bindet die zweite Nukleinsäure bei Schritt c) spezifisch
an die erste Nukleinsäure.
-
Die
NSV ist vorzugsweise eine, insbesondere asymmetrische, PCR. Dazu
kann die erste Flüssigkeit
eine vierte Nukleinsäure
enthalten, die zusammen mit der ersten oder zweiten Nukleinsäure ein
Primerpaar für
die Durchführung
der PCR bildet. Bei der asymmetrischen PCR wird einer der beiden Primer
in erheblichem Überschuss
eingesetzt, so dass ein Strang häufiger
als der andere amplifiziert wird. Dadurch kann die mit der dritten
Nukleinsäure hybridisierende
Nukleotidsequenz oder weitere Nukleotidsequenz in hoher Konzentration
bereitgestellt und die Hybridisierung dadurch begünstigt werden.
-
Vorzugsweise
werden bei der PCR höchstens
25, bevorzugt höchstens
20, Temperaturzyklen durchlaufen.
-
Bevorzugt
wird die Probe vor Durchführung des
Schritts b) verdünnt.
Das ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Substanz ein hochprozentiges alkoholisches
Getränk
ist, weil dadurch die Alkoholkonzentration so reduziert werden kann,
dass der Alkohol die NSV nicht stört. Beim Verdünnen können der
Probe auch Chemikalien zugesetzt werden, die beispielsweise den
pH stabilisieren oder, z.B. durch Fällen oder Komplexieren, Faktoren
unschädlich
machen, welche die NSV ansonsten stören würden.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird die erste Nukleinsäure vor Durchführung des
Schritts b) aus der Probe ex trahiert und bei Schritt b) statt der Probe
die extrahierte erste Nukleinsäure
mit der ersten Flüssigkeit
gemischt. Eine Extraktion ist insbesondere dann sinnvoll, wenn es
sich bei der Substanz um eine Creme oder ein Öl handelt.
-
Besonders
bevorzugt ist es, wenn die erste Flüssigkeit nach dem Aufbringen
auf die Oberfläche eingetrocknet
wird. Nach dem Eintrocknen kann die erste Flüssigkeit mindestens ein weiteres
Mal auf die Oberfläche
aufgetragen und dort eingetrocknet werden. Dadurch kann eine Konzentrierung
der Nukleotidsequenz oder der weiteren Nukleotidsequenz erreicht
und die nachfolgende Hybridisierung mit der dritten Nukleinsäure erleichtert
werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens ist die Oberfläche und/oder
der Feststoff vor dem Aufbringen der ersten Flüssigkeit trocken. Dadurch kann eine
größere Menge
der ersten Flüssigkeit
von der Oberfläche
bzw. dem Feststoff aufgenommen werden.
-
Vorzugsweise
ist die Oberfläche
eben ausgebildet. Dadurch kann das optische Erfassen der erfolgten
Hybridisierung erleichtert werden.
-
Beim
Aufbringen der ersten Flüssigkeit
zwischen den Schritten c) und d) auf die Oberfläche und anschließendem Eintrocknen
kann zur Durchführung von
Schritt d) die dritte Nukleinsäure
nach dem Eintrocknen auf die Oberfläche aufgebracht werden.
-
Die
dritte Nukleinsäure
kann mittels einer Pipette oder eines Fläschchens mit einer Tropfvorrichtung
auf die Oberfläche
aufgebracht werden. Besonders bevorzugt ist es aber, wenn die dritte
Nukleinsäure
mittels eines Stifts in der Art eines Schreibgeräts, insbesondere mittels eines
Faserstifts, auf die Oberfläche
aufgebracht wird. Ein solcher Faserstift kann beispielsweise Bestandteil
eines Authentifizierungskits sein. Er vereinfacht erheblich die
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Eine
schnelle Vor-Ort-Authentifizierung kann dadurch begünstigt werden,
dass zwischen den Schritten d) und e) kein Waschschritt durchgeführt wird.
Das bedeutet, dass nicht hybridisierte dritte Nukleinsäure vor
Durchführung
des Schritts e) nicht entfernt wird und das optische Erfassen der
erfolgten Hybridisierung in Gegenwart nicht hybridisierter dritter
Nukleinsäure
stattfindet.
-
Die
erste Flüssigkeit
und/oder die Substanz können
weitere Nukleinsäuren
enthalten. Dadurch wird ein unautorisiertes Identifizieren und Sequenzieren
der ersten und/oder zweiten Nukleinsäure und damit ein Fälschen der
Markierung durch Bereitstellen der ersten Nukleinsäure erschwert.
Das erfindungsgemäße Verfahren
wird dadurch noch sicherer. Die weiteren Nukleinsäuren können zumindest
teilweise weitere Markierungssubstanzen, wie Fluorophore, aufweisen,
damit die dritte Nukleinsäure
nicht auf Grund ihrer Markierungssubstanz identifiziert werden kann.
Sofern die dritte Nukleinsäure
als Molecular Beacon ausgestaltet ist, kann es sich bei den weiteren
Nukleinsäuren
zumindest teilweise auch um Molecular Beacons handeln. Dadurch ist
eine Identifizierung der dritten Nukleinsäure erheblich erschwert. Weiterhin
kann die Identifizierung der ersten, zweiten, dritten und vierten
Nukleinsäure
dadurch erschwert werden, dass die weiteren Nukleinsäuren dieselbe
oder eine maximal um fünf
Nukleotide abweichende Anzahl an Nukleotiden gegenüber der
Anzahl der Nukleotide der ersten, zweiten, dritten oder vierten
Nukleinsäure
aufweisen.
-
Zur
Kontrolle des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorteilhaft, wenn das Verfahren parallel mit einer Probe
der Substanz durchgeführt
wird, welche die erste Nukleinsäure
nicht enthält.
Es handelt sich dabei also um eine Probe der Substanz, wobei die
Substanz nicht mit der ersten Nukleinsäure vermischt worden ist.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert.
-
Soweit
nicht anders angegeben, stammen alle Chemikalien von der Fa. Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Eschenstrasse 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland.
-
1. Markierung von Kornbranntwein mit einer
ersten Nukleinsäure
(Markierungsnukleinsäure)
-
Als
erste Nukleinsäure
wurde eine synthetisch hergestellte, der Sequenz Nr. 1 gemäß dem anliegenden
Sequenzprotokoll entsprechende, 62 Nukleotide lange, einzelsträngige DNA
(Markierungsnukleinsäure
(M-NS)) eingesetzt. Die M-NS wurde in einer Konzentration von 10 μmol/l in
entionisiertem Wasser gelöst.
Je 100 μl,
10 μl und
1 μl dieser
Lösung
wurden zu einem Liter Kornbranntwein mit einem Alkoholgehalt von
38% vol. (Supermarkt) zugefügt
und gemischt. Die Endkonzentration der M-NS im Kornbranntwein betrug
1 nmol/l, 100 pmol/l und 10 pmol/l.
-
2. Amplifikation der Markierungsnukleinsäure
-
Es
wurde je eine Probe von 10 μl
aus jedem der markierten Kornbranntweine entnommen und jeweils mit
90 μl entionisiertem
Wasser verdünnt.
Je 2,5 μl
der so entstandenen wässrigen
Lösungen
der M-NS wurden zur Durchführung
einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit jeweils 22,5 μl einer ersten Flüssigkeit
gemischt. Die erste Flüssigkeit
bestand aus der PCR-MasterMix-Flüssigkeit
(PCR-Master-Mix S) aus dem Kit "peqGOLD" der Firma Peqlab (Carl-Thiersch-Str.
2b, 91052 Erlangen, Deutschland), der synthetisch hergestellten
zweiten Nukleinsäure
der Sequenz Nr. 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll
und der synthetisch hergestellten vierten Nukleinsäure der
Sequenz Nr. 3 gemäß dem anliegenden
Sequenzprotokoll. Die zweite und vierte Nukleinsäure bildeten dabei ein Primerpaar
zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz der ersten Nukleinsäure und
der dazu komplementären
weiteren Nukleotidsequenz. Die zweite Nukleinsäure lag dabei in einer Konzentration
von 500 nmol/l und die vierte Nukleinsäure in einer Konzentration
von 2 μmol/l
vor. Es wurden 30 Zyklen jeweils mit einer Annealing-Temperatur
von 55°C
für 10
Sekunden, einer Elongationstemperatur von 72°C für 15 Sekunden und einer Denaturierungstemperatur
von 90°C
für 5 Sekunden durchgeführt. Nach
20, 25 und 30 Zyklen wurden jeweils 5 μl aus den PCR-Ansätzen entnommen.
Als Negativ-Kontrollen wurden PCRs durchgeführt in denen statt einer Probe
des markierten Kornbranntweins je eine Probe eines unmarkierten
Kornbranntweins (Negativkontrolle 1) und eine Probe eines entionisierten
Wassers (Negativkontrolle 2) mit der ersten Flüssigkeit gemischt worden ist.
-
3. Authentifizierung des Kornbranntweins
durch Nachweis der Markierungsnukleinsäure
-
Je
2 μl der
aus den PCR-Ansätzen
entnommenen Proben wurden bei Raumtemperatur auf ein saugfähiges Filterpapier
(Filterpapier 597, Schleicher und Schüll, 37582 Dassel, Deutschland)
der Abmessungen 0,2 mm × 3
mm × 3
mm aufgetragen und für ca.
1 Minute bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
-
Zur
Bereitstellung eines Molecular Beacons wurde die Sequenz gemäß Sequenz
Nr. 4 des Sequenzprotokolls an ihrem 5'-Ende mit einer Cy5-Markierung und an
ihrem 3'-Ende mit
einer Markierung bestehend aus BHQ II (Black Hole Quencher II, Biosearch
Technologies, Inc., Novato, CA.) synthetisiert. Das Molecular Beacon
wurde in Dig EasysHyb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)
in einer Konzentration von 1 μmol/l
gelöst.
Je 2 μl
dieser Lösung
wurden mit einer Pipette auf je eines der Filterpapiere aufgetragen.
Die Fluoreszenz der Filterpapiere wurde mit einem Batterie-betriebenen
Fluoreszenz-Handscanner
(identif GmbH, Erlangen, Deutschland) bestimmt. Zur Bestimmung der
Fluoreszenz wurde der Fluoreszenz-Handscanner über das jeweilige Filterpapier
bewegt. Die Intensität
der Fluoreszenzsignale von Filterpapieren, auf die Proben aus den
PCR-Ansätzen
des markierten Kornbranntweins aufgetragen worden sind, war um ca. 20%
bis 90% erhöht
gegen über
der Intensität
des Fluoreszenzsignals eines Filterpapiers, auf welches eine Probe
aus der Negativkontrolle 1 aufgetragen worden ist. Die Intensität des Fluoreszenzsignals
eines Filterpapiers, auf welches eine Probe aus der Negativkontrolle
2 aufgetragen worden ist war nahezu identisch mit der Intensität des Fluoreszenzsignals
des Filterpapiers, auf welches die Probe aus der Negativkontrolle
1 aufgetragen worden ist.
-
Die
Authentifizierung des markierten Kornbranntweins erfolgte anhand
des Verhältnisses
der Intensität
der Fluoreszenzsignale von Filterpapieren, auf die Proben aus den
PCR-Ansätzen
des markierten Kornbranntweins aufgetragen worden sind, zu der Intensität des Fluoreszenzsignals
eines Filterpapiers, auf welches eine Proben aus der Negativkontrolle
1 aufgetragen worden ist. Markierter und unmarkierter Kornbranntwein
konnten eindeutig identifiziert und damit authentifiziert werden.
-
Eine
Authentifizierung des markierten Kornbrantweins wäre auch
allein auf Grund des überschreitens
eines Erwartungswertes der Intensität eines Fluoreszenzsignals
eines Filterpapiers, auf welches eine Probe aus einem PCR-Ansatz
des markierten Kornbranntweins aufgetragen worden ist, möglich gewesen.
Der Erwartungswert kann bei zuvor durchgeführten Kontrollexperimenten
ermittelt werden.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.