ES2927715T3 - Inhibidores de la quinasa p38 reducen la expresión de dux4 y de los genes que le siguen para el tratamiento de la FSHD - Google Patents

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Lorin A Thompson
Owen Brendan Wallace
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Ning Shen
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Abstract

La descripción se refiere a métodos y composiciones que incluyen inhibidores de la quinasa p38 y agentes que regulan la expresión de DUX4 y genes aguas abajo, incluidos, entre otros, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDClL, RFPL2, CCNAl, SLC34A2, TPRXL, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEFl5 o ZNF280A. Se describen métodos útiles para tratar una enfermedad asociada con DUX4 anormal y expresión génica corriente abajo (p. ej., distrofia muscular fascioescapulohumeral). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de la quinasa p38 reducen la expresión de dux4 y de los genes que le siguen para el tratamiento de la FSHD
Incorporación del listado de secuencias
El contenido del archivo de texto denominado “FULC-02602WO_SeqList”, que fue creado el 5 de octubre de 2018 y tiene un tamaño de 3 KB, se incorpora por referencia en su totalidad.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un inhibidor de la quinasa p38 de Fórmula V', o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de la distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD).
Antecedentes de la invención
Las distrofias musculares (DM) son un grupo de más de 30 enfermedades genéticas diferentes que se caracterizan por la debilidad progresiva y la degeneración de los músculos esqueléticos que controlan el movimiento. Algunas formas de DM se producen en la infancia o en la niñez, mientras que otras pueden no aparecer hasta la mediana edad o más. Las diversas enfermedades de la DM difieren en cuanto a la distribución y el alcance de la debilidad muscular (algunas formas de DM también afectan al músculo cardíaco), la edad de aparición, el ritmo de progresión y el patrón de herencia.
La distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD) es la tercera forma más común de distrofia muscular y afecta aproximadamente a 1 de cada 15.000 personas en todo el mundo. La FSHD está causada por mutaciones genéticas que provocan la desrepresión epigenética del gen DUX4, lo que provoca que esta enfermedad sea única entre las distrofias musculares. Las principales manifestaciones de la FSHD son la debilidad y el desgaste de los músculos de la cara, la cintura escapular, la parte superior de los brazos y el tronco, y afecta a las extremidades inferiores en los casos más graves.
Las mutaciones genéticas asociadas a la FSHD conducen a una descomposición parcial de la estructura de la cromatina D4Z4 y a un fallo resultante en la represión de DUX4, un factor de transcripción codificado por la unidad D4Z4, en el músculo esquelético. La FSHD1, que representa alrededor del 95% de los casos de FSHD reportados, está asociada a supresiones de repeticiones del macrosatélite D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35, dejando de 1 a 10 repeticiones D4Z4 (revisado en Tawil et al., 2014). La FSHD2 está causada por mutaciones en el gen de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas que Contienen el Dominio Bisagra Flexible 1(SMCHD1) en el cromosoma 18 (revisado en van der Maarel et al., 2007). Tanto las mutaciones en FSHD1 como en FSHD2 conducen a la pérdida de la represión en el conjunto de repeticiones D4Z4 de 4q35, lo que permite la transcripción aberrante en el músculo de una forma de longitud completa del ARNm de la doble homeobox 4, DUX4(DuX4-fl), que codifica el factor de transcripción de la doble homeobox 4 (DUX4) (Tawil et al., 2014). Las isoformas de ARNDUX4-fl que se han encontrado asociadas a la FSHD varían sólo en la región no traducida de 3' y no tienen ninguna distinción funcional identificada.
El documento WO 2016/114655 desvela procedimientos para tratar enfermedades neuromusculares o neurológicas por medio de la reducción de la sobreestimulación de la actividad de los neurotransmisores inhibidores GABAérgicos y Glicinérgicos, y composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos capaces de reducir la actividad Glicinérgica y/o uno o más compuestos capaces de reducir la actividad GABAérgica.
En la actualidad no existe ningún tratamiento aprobado que pueda detener o revertir los efectos de la FSHD, aunque a menudo se recetan antiinflamatorios no esteroideos para mejorar el confort y la movilidad. Por lo tanto, es evidente que existe una necesidad en la técnica de nuevos procedimientos para reducir los niveles de expresión de DUX4, por ejemplo, ARNm de DUX4-fl y/o proteína DUX4, por ejemplo, para tratar la FSHD y otras enfermedades. La presente invención satisface dicha necesidad.
Sumario de la invención
En un aspecto, se proporciona un inhibidor de la quinasa p38 para su uso en un procedimiento para tratar la distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD). El procedimiento incluye administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa p38 de Fórmula V';
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o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.
En algunas formas de realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce los niveles de expresión de DUX4 y/o la expresión de uno o más genes de la corriente descendente en las células musculares del sujeto.
Breve descripción de las figuras
Las FIGS. 1A y 1B muestran la expresión de la proteína y el ARN de DUX4 en los miotubos de FSHD. La FIG.
1A incluye micrografías de miotubos de FSHD teñidos con un anticuerpo que se une a la proteína DUX4 y/o DAPI (para detectar los núcleos). Los miotubos maduros de la FSHD mostraron estrías de actina en el cultivo (no se muestra) y expresaron la proteína DUX4 en conjuntos discretos de núcleos contenidos en un miotubo diferenciado (FIG. 1A). La FIG. 1B es un gráfico que muestra la expresión relativa del ARNm de DUX4 en los miotubos de la FSHD y en los miotubos de un control isogénico de tipo salvaje (sano).
La FIG. 2 es un gráfico que muestra la expresión de ARNm de los genes regulados por DUX4 indicados en miotubos de tipo salvaje tratados con DMSO, o miotubos de FSHD tratados con FTX-2 o DMSO. Para cada gen indicado, las barras de izquierda a derecha se correlacionan con miotubos de tipo salvaje tratados con DMSO, miotubos FSHD tratados con DMSO y miotubos FSHD tratados con FTX-2 (ASO dirigido a DUX4).
Las FIGS. 3A a 3C muestran la reducción del ARNm de MBD3L2 en miotubos de FSHD tratados con ASO dirigidos a DUX4. MBD3L2 se normalizó con respecto al ARNm de POLR2A medido por qPCR. La FIG. 3A es un gráfico que muestra los datos de control de calidad de placas agrupadas que comparan la expresión de MBD3L2 en miotubos de FSHD tratados con control DMSO o con ASO dirigidos a DUX4 de 1 j M, y miotubos normales isogénicos de tipo salvaje (WT). La FIG. 3B es un gráfico que muestra la reducción dependiente de la dosis de la expresión del ARNm de MBD3L2 en miotubos de FSHD tratados con diferentes diluciones del ASO dirigido a DUX4 (FTX-2). La FIG. 3C muestra las estadísticas del ensayo en placa que comparan la señal de MBD3L2 en miotubos de FSHD tratados con DMSO con ASO dirigidos a DUX4 o miotubos de tipo salvaje tratados con DMSO.
Las FIGS. 4A a 4D son gráficos que muestran los niveles de expresión del ARNm de MBD3L2 y del ARNm de MYOG en miotubos de FSHD tratados con los inhibidores de p38a/p indicados en relación con el tratamiento con el control DMSO. Los inhibidores de p38a/p incluyeron el s B 239063 (FIG. 4A), VX-702 (FIG. 4B), Pamapimod (FIG. 4C), y TAK-715 (FIG. 4D). También se proporcionan las estructuras de los inhibidores.
Las FIGS. 5A y 5B muestran datos de miotubos de FSHD tratados con Pamapimod. La FIG. 5A es un gráfico que muestra la reducción dependiente de la dosis del ARNm de DUX4-fl (círculos rellenos) y del ARNm de MBD3L2 (círculos abiertos). La FIG. 5B muestra micrografías de miotubos de FSHD tratados con DMSO o Pamapimod.
Las FIGS. 6A a 6C son gráficos que muestran los niveles de ARNm de MAPK14 (FIG. 6A) y MBD3L2 (FIG. 6B y FIG. 6C) en miotubos de FSHD tratados con ARNsi dirigidos a p38a MAPK14 (siMAPKl4 85 y símAp K14 86; FIG. 6A y FIG. 6B) o tratados con RNPs Cas9/ARNsg de p38a quinasa (MAPK14 y DUX4 pLAM) (FIG. 6C), en comparación con el control no dirigido (NT CTRL). En la FIG. 6C, para cada tratamiento, los resultados mostrados de izquierda a derecha corresponden a MBD3L2 y MYOG, respectivamente.
La FIG. 7 es un gráfico que muestra los niveles de expresión de la proteína DUX4, el ARNm de MBD3L2 y la proteína p-HSP27 en miotubos de FSHD tras el tratamiento con dosis crecientes de FTX-1821 (estructura mostrada), como porcentaje de los niveles del tratamiento de control con DMSO. Las barras representan la desviación estándar.
Las FIGS. 8A y 8B muestran el efecto de FTX-1821 en la formación de miotubos. La FIG. 8A proporciona imágenes representativas de la morfología de los miotubos inmortalizados de FSHD obtenidas tras el tratamiento con el vehículo (DMSO) o las concentraciones indicadas de FTX-1821, y la tinción con anticuerpos contra MHC y DAPI (tinción nuclear). La FIG. 8B es un gráfico que muestra la cuantificación de los núcleos en los miotubos, de acuerdo con la tinción MHC, tras el tratamiento con FTX-1821 a las concentraciones probadas. Las barras representan la desviación estándar de tres réplicas.
Las FIGS. 9A y 9B muestran los resultados de los ensayos de apoptosis en miotubos de FSHD in vitro. La FIG.
9A proporciona micrografías de miotubos de FSHD teñidos para caspasa-3 activa (como marcador de apoptosis) o DAPI. La apoptosis se detectó de forma esporádica en un subconjunto de miotubos en cultivo, como se muestra en los círculos blancos del panel izquierdo y en la región ampliada de la derecha. La FIG. 9B es un gráfico que muestra la cuantificación de la señal de caspasa-3 activa en miotubos de FSHD tratados con las concentraciones indicadas de FTX 1821.
Las FIGS. 10A y 10B ilustran la identificación de los genes regulados a la baja en los miotubos de FSHD por FTX-1821. La FIG. 10A es un mapa de calor, que ilustra los genes expresados diferencialmente identificados por el perfil de ARN-seq. Se analizaron tres réplicas para cada condición por medio de ARN-seq y los genes se agruparon de acuerdo con la dirección e intensidad del cambio, como se indica. La barra de color indica los cambios normalizados observados, por ejemplo, los genes que fueron regulados a la baja por FTX-1821 están enriquecidos en las muestras tratadas sólo con DMSO. Los genes regulados a la baja se enumeran en la FIG.
10A La FIG. 10B es un gráfico que muestra las lecturas del nivel de expresión normalizado de los genes diana de DUX4 que fueron regulados a la baja tras el tratamiento con FTX-1821 en las células de tipo salvaje tratadas con el control del vehículo DMSO, las células FSHD tratadas con DMSO, o las células FSHD tratadas con FTX-1821. La FIG. 11 es un gráfico que muestra los niveles de expresión de ARNm por qRT-PCR del gen diana de DUX4, MBD3L2 (normalizado a POLR2A), en miotubos derivados de cuatro líneas diferentes de mioblastos de pacientes con FSHD, FTCE-016, -020, -197, -196 y dos líneas de control de tipo salvaje (WT), tras el tratamiento indicado con el control vehicular DMSO, FTX-1821 o FTX-839.
Las FIGS. 12A y 12B proporcionan información sobre diversos inhibidores de la quinasa p38. La FIG. 12A es una tabla de datos que resume la farmacología de los inhibidores p38a y p indicados, incluida la IC50 para reducir la expresión de MBD3L2 en las células de FSHD. Se muestran valores de IC50 de MBD3L2 comparables, lo que indica la inhibición de la expresión génica descendente de DUX4 en los miotubos de FSHD a través de un amplio panel estructural de inhibidores de p38a y p de los que se ha informado que tienen potencias enzimáticas similares. Estos datos indican que la inhibición de p38 resulta en la reducción del gen diana de DUX4, MBD3L2, con valores IC50 en el intervalo de ~6 a 68 nM. La FIG. 12B proporciona las estructuras de los compuestos de los inhibidores de la quinasa p38 enumerados en la FIG. 12A.
La FIG. 13 es una tabla de varias líneas celulares utilizadas en el “ensayo clínico en un plato”, que muestra la diversidad de genotipos, e incluye tanto líneas primarias como inmortalizadas, así como líneas de pacientes con FSHD1 y FSHD2.
Las FIGS. 14A y 14B son gráficos que muestran la expresión del ARNm de MBD3L2 normalizada con respecto a POLR2A (por qRT-PCR) (FIG. 14A) y la apoptosis medida por la caspasa-3 escindida (FIG. 14B) determinados en nueve miotubos de pacientes con FSHD1 y tres con FSHD2 (enumerados en la Tabla 2, FIG. 14B contiene sólo 2 líneas celulares de FSHD2) tras el tratamiento con FTX-1821, FTX-839 o el control vehicular DMSO. La FIG. 15 es un gráfico que muestra el curso temporal de la exposición del plasma, la exposición del músculo trapecio y la participación de la diana p38 (fosforilada - p38a : Ratio p38a total) en la rata tras la administración oral de 0,3 mg/kg de FTX-1821.
La FIG. 16 es un gráfico que muestra los niveles de ARNm de MBD3L2 en los músculos TA xenoinjertados A4 y C6.
La FIG. 17 es un gráfico que muestra la relación fósforo/total de MC2 en los músculos del trapecio de ratón tras el tratamiento con el vehículo de control o con el inhibidor de la quinasa p38, FTX-2865.
La FIG. 18. es un gráfico que muestra los niveles de ARNm de MBD3L2 en los músculos TA xenoinjertados C6 tras el tratamiento con el control del vehículo o el inhibidor de p38, FTX-2865.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la inhibición de la quinasa p38, por ejemplo, la p38-a, produce una reducción de la expresión de DUX4 y de los genes descendentes regulados por DUX4. En consecuencia, se desvela un inhibidor de p38, por ejemplo, p38-a, (solo o en combinación con otro agente) para su uso en un procedimiento de reducción de los niveles de expresión y/o actividad de DUX4 y/o de cualquiera de sus genes diana corriente abajo, por ejemplo, para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de DUX4, tales como la FSHD, un tipo de distrofia muscular.
Las distrofias musculares son un grupo diverso de enfermedades genéticas que causan una debilidad progresiva de los músculos del cuerpo. Algunos tipos de distrofia muscular presentan síntomas en la primera infancia, mientras que otros tipos aparecen en la edad adulta. Dependiendo del tipo de distrofia muscular, también se pueden ver afectados diferentes grupos musculares. Véase, por ejemplo, Isin Dalkilic y Louis M Kunkel. Se conocen casi 30 genes que dan lugar a diversas formas de distrofia muscular, que difieren en la edad de aparición, la gravedad y los grupos musculares afectados. El número de genes identificados aumenta cada año, lo que aumenta nuestra comprensión y revela la complejidad general de la patogénesis de estas enfermedades.
Por ejemplo, dos distrofias musculares comunes, la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia facioescapulohumeral (FSHD), se consideran enfermedades únicas con algunas características compartidas. Las similitudes entre la DMD y la FSHD incluyen que ambas son enfermedades genéticas y los síntomas incluyen la pérdida de masa muscular con debilidad muscular que conduce a la discapacidad (por lo tanto, tanto la DMD como la FSHD se agrupan en la gran categoría de distrofias musculares, que significa degeneración muscular). Sin embargo, la DMD y la FSHD tienen una etiología y un diagnóstico de la enfermedad muy diferentes (pérdida de distrofina en la DMD vs. expresión de DUX4-mixta en la FSHD). Por ejemplo, en la DMD, las mutaciones en el gen de la DMD (>2000 conocidas) resultan en una distrofina disfuncional o ausente. En la FSHD, la enfermedad se debe a la sobreexpresión del gen DUX4 en el tejido muscular; no se debe a mutaciones puntuales en el gen (la proteína DUX4 se expresa cuando el número de repeticiones D4Z4 en el gen DUX4 está entre 1 y 8, o cuando se pierde la represión en el D4Z4 por mutaciones en otra maquinaria de silenciamiento). Otras diferencias incluyen que sólo el músculo esquelético está involucrado en la FSHD, mientras que tanto el músculo esquelético como el cardíaco están afectados en la DMD; el diafragma está involucrado en la d Md pero no en la FSHD; generalmente existen un inicio en la infancia en la DMD pero un inicio en la edad adulta/adolescente en la FSHD; y un inicio con afectación ambulatoria en la DMD pero un inicio en la cara y en la parte proximal del brazo/hombros en la FSHD. Otra distinción importante es que existe respuesta a los esteroides en la DMD pero no en la FSHD. Además, el tratamiento aprobado para la DMD (Exondys-51 en los Estados Unidos; Ataluren en la UE) no tendrá ningún efecto en la FSHD. Por último, en la DMD sólo están afectados los varones, mientras que en la FSHD están implicados por igual ambos sexos.
La FSHD también tiene una patología inusual, y es única entre las distrofias musculares en el sentido de que su desarrollo requiere condiciones tanto genéticas como epigenéticas. La condición genética es la presencia de un gen DUX4 completo. El gen DUX4 es un retrogén que se expresa normalmente en la línea germinal y en las células embrionarias tempranas, pero es reprimido por el silenciamiento inducido por la repetición D4Z4 en los tejidos adultos (Ehrlich y Lacey, 2012). Cada elemento D4Z4 contiene un promotor y el ORF de DUX4, pero carece de una señal de poliadenilación (PAS), lo que provoca una rápida degradación del ARNm de DUX4. Por el contrario, los transcritos iniciados en la unidad distal D4Z4 en un alelo permisivo 4qA se extienden fuera del conjunto de repeticiones y alcanzan un PAS en la secuencia pLAM flanqueante (revisado en Tawil et al., 2014; Himeda et al., 2015). La cola poli-A resultante estabiliza los ARNm de DUX4 y permite su traducción en una proteína que no se expresa normalmente en el músculo sano y es tóxica para la función del músculo esquelético. Se ha descrito que dos potenciadores, DUX4 potenciador miogénico 1 (DME1) y DME2, que activan la expresión de DUX4-fl en los miocitos esqueléticos, regulan la expresión de DUX4-fl en la FSHD (Himeda et al., 2014).
El FSHD1, el FSHD2 y las etapas del desarrollo temprano, así como las etapas de formación de la línea germinal, parecen conferir una conformación transcripcionalmente permisiva a la cromatina D4Z4. Esto se evidencia por los cambios en la modificación de las histonas, la hipometilación parcial pero variable de D4Z4 en FSHD1, y una hipometilación más extensa en FSHD2 (Himeda et al., 2015). Sin embargo, la hipometilación de D4Z4 no es suficiente para la enfermedad, dado que existen una ausencia de síntomas de distrofia muscular en pacientes con ICF (inmunodeficiencia, inestabilidad de la región centromérica y anomalías faciales), una rara enfermedad asociada a la hipometilación del ADN no relacionada en la que D4Z4 está fuertemente hipometilado (Entrada OMIM - Núm.
614069).
DUX4 es una proteína de factor de transcripción homeobox, y la expresión de DUX4 en el músculo induce un programa transcripcional que conduce a la expresión de genes y productos proteicos posteriores que no se expresan normalmente en el músculo esquelético. Por ejemplo, la expresión de DUX4 provoca la inducción de diversos genes de la línea germinal en los músculos esqueléticos de la FSHD y en las células transfectadas (Yao et al., 2014; Ehrlich y Lacey, 2012). Muchos de estos nuevos transcritos se expresan en las células musculares de la FSHD pero no en las células musculares de control (Yao et al., 2014; Homma et al., 2015; Shadle et al., 2017; Bosnakovski et al., 2014). Dado que algunos de los genes diana corriente abajo de DUX4 codifican factores de transcripción, la activación patológica de DUX4 conduce a una gran cascada de desregulación de la expresión génica en el músculo, lo que provoca la enfermedad (Yao et al., 2014; Homma et al., 2015; Shadle et al., 2017; Bosnakovski et al., 2014).
La expresión endógena (en la miofibra de la FSHD) y forzada de DUX4 en las células musculares es tóxica, conduce a la apoptosis y al estrés oxidativo, e interfiere en la miogénesis y la función del sarcómero (Rickard et al., 2015; Homma et al., 2015; Bosnokovski et al., 2014; Tawil et al., 2014; Himeda et al., 2015). La heterogeneidad clínica tanto en la progresión de la enfermedad como en la edad de inicio se puede explicar, en parte, por la inestabilidad epigenética que conduce a cambios progresivos en la transcripción de DUX4. El papel de la hipometilación del ADN y de la transcripción permisiva de DUX4 se ejemplifica con la elevada gravedad clínica observada en pacientes que heredan defectos combinados de FSHD1 y 2 (revisado en Tawil et al., 2014; van der Maarel et al., 2007). La heterogeneidad clínica también se explica por las diferencias en la gravedad del acortamiento de la repetición D4Z4, con un fenotipo más grave y una edad de inicio más temprana en los pacientes con repeticiones más cortas (1 a 3) en comparación con los pacientes con repeticiones menos contraídas (4 a 7).
Actualmente se reconoce que DUX4 es la causa de la patología de la FSHD, dado que la activación de sus genes diana es la principal firma molecular en el músculo de la FSHD (revisado en Tawil et al., 2014; Himeda et al., 2015). Los principales genes diana corriente abajo son miembros de familias de genes altamente homólogos que se agrupan espacialmente en los cromosomas, que incluyen las familias PRAMEF (expresado preferentemente en el melanoma), TRIM (que contiene un motivo tripartito), MBDL (similar a la proteína de unión a metil-CpG), ZSCAN (que contiene un dedo de zinc y un dominio SCAN) y RFPL (similar a la proteína ret-finger) (Geng et al., 2012; Yao et al., 2014; Shadle et al., 2017; Ehrlich y Lacey, 2012; Tawil et al., 2014; van der Maarel et al., 2007). La discriminación entre el músculo esquelético de la FSHD y el de control se puede llevar a cabo mediante el uso de ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ZNF280A, etc. (descrito en Yao et al., 2014; Shadle et al., 2017; Ehrlich y Lacey, 2012).
Se examinaron sondas químicas anotadas para identificar dianas farmacológicas de moléculas pequeñas modificadoras de la enfermedad que reduzcan la expresión de DUX4 en los miotubos de FSHD. Estos cribados identificaron múltiples andamios químicos que inhiben la proteína quinasa activada por mitógenos p38 alfa (MAPK14 o p38-a). Como se describe en los Ejemplos adjuntos, se ha demostrado que el derribo del gen MAPK14 por medio de la tecnología de ARN de interferencia pequeño (ARNsi) o la edición del genoma mediada por CRISPR con ARN guía (ARNg) específicos que se dirigen selectivamente a la isoterma alfa de la quinasa p38 también reduce la expresión de DUX4 y de los genes relacionados con DUX4 en los miotubos de la FSHD. También se descubrió que los inhibidores selectivos de las quinasas p38a y p reducían específicamente DUX4 y sus genes descendentes en los miotubos de la FSHD, para de ese modo impactar en la fisiopatología central del proceso de la enfermedad de la FSHD (datos ejemplificados en la presente memoria). Los mismos experimentos revelaron que los inhibidores de las quinasas p38a y p no afectan a la miogenina ni a la expresión de otros factores miogénicos, ni tampoco a la proliferación de los mioblastos ni a la diferenciación de los mismos exhibida por la fusión miogénica en los miotubos de la FSHD. Estas pequeñas moléculas inhibidoras de la quinasa p38 reducen la expresión de DUX4 y de los genes relacionados con ella, lo que repercute en la fisiopatología del proceso de la enfermedad de la FSHd , incluida la reducción de la muerte celular apoptótica. Se espera que la reducción de DUX4 mediada por p38 repercuta en los procesos inflamatorios, de infiltración grasa y fibróticos posteriores en la FSHD.
Los miembros de la familia p38 MAPK, compuesta por las isoformas a, p, y y 5, están codificados por genes separados que desempeñan un papel crítico en las respuestas celulares necesarias para la adaptación al estrés y la supervivencia (revisado en Whitmarsh 2010; Martin et al., 2014; Krementsov et al., 2013). En numerosas enfermedades inflamatorias, incluidas las cardiovasculares y otras enfermedades crónicas, estas mismas señales inducidas por el estrés de la p38 MAPK pueden desencadenar respuestas inadaptadas que agravan, en lugar de aliviar, la enfermedad (revisado en Whitmarsh 2010; Martin et al., 2014). De hecho, en el músculo esquelético, se ha demostrado que una serie de tensiones celulares, que incluyen el ejercicio crónico, la exposición a la insulina y los estados endocrinos alterados, la diferenciación de los mioblastos en miocitos, las especies reactivas del oxígeno, así como la apoptosis, inducen la vía de la quinasa p38 (Keren, et al., 2006; Zarubin et al., 2006). De hecho, la vía de la quinasa p38 puede ser activada por un número de estímulos externos, que incluyen las citoquinas proinflamatorias y el estrés celular, lo que conduce a la activación de las quinasas MAPK de doble especificidad MKK3 y MKK6. La activación de MKK3 y MKK6, que a su vez fosforilan a p38 en su bucle de activación, desencadena eventos de fosforilación posteriores. Estos incluyen la fosforilación de HSP27,MAPKAPK2 (MK2) y una variedad de factores de transcripción que culminan en cambios transcripcionales en el núcleo. Se ha identificado un modesto número de transcritos regulados por p38 y un gran número de efectores corriente abajo de la quinasa p38 (descritos en Cuenda et al., 2007 y Kyriakis et al., 2001, Viemann et al., 2004).
Diversos compuestos de diferentes andamios químicos que inhiben la vía de señalización de la p38a MAPK han entrado en ensayos clínicos en diversas indicaciones (no neuromusculares), que incluyen la artritis reumatoide, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el dolor, las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. La inhibición de p38a y p en los ensayos clínicos ha demostrado ser segura pero no eficaz en ninguna de estas indicaciones. La farmacología in vitro e in vivo sugiere que la participación de la diana p38a en estos estudios clínicos fue sólida, como se demostró al medir la reducción de la fosforilación de HSP27 (una diana indirecta) y de pMK2 (una diana directa).
Se sabe que la p38a MAPK desempeña funciones críticas en la biología del músculo esquelético, específicamente en la abrogación de los mioblastos proliferantes a la diferenciación y posteriormente a la fusión para formar miotubos multinucleados. El tratamiento de los pacientes con distrofia muscular que sufren constitutivamente procesos de degeneración y regeneración con inhibidores de p38a no sería evidente. El knockout completo (KO) de p38a es embrionariamente letal. El rescate embrionario permite la supervivencia de las crías hasta unos días postnatales y el aislamiento de las células satélite para estudiar los precursores miogénicos que carecen de p38a. Los mioblastos que carecen por completo de p38a expresan una cantidad significativamente menor de genes de diferenciación críticos y muestran graves déficits de fusión. La histología de las crías P2 muestra un aumento significativo de las células satélite cíclicas y una distribución de las fibras desplazada hacia la izquierda. (Perdiguero et al., 2007). Es importante destacar que el KO de p38a en el músculo maduro (cre impulsado por el promotor Myl1) no muestra deficiencias en puntos de tiempo tempranos, pero los ratones deficientes en p38a a los 6 meses de edad muestran una regeneración significativamente mayor y fibras de tipo I, así como una menor distribución de fibras en comparación con los controles (Wissing et al., 2014). Estos datos sugieren que la inhibición de p38a desencadenaría la regeneración del músculo esquelético en enfermedades deficientes en regeneración además de la FSHD por un mecanismo independiente de la regulación de la expresión de DUX4.
En el músculo esquelético, se ha demostrado que p38 regula la expresión génica durante la miogénesis. Se ha demostrado que p38y es necesaria para la miogénesis mediante el uso de enfoques de knock out de genes específicos y knock out condicional (Cuenda et al., 2007; Kerin et al., 2006; Aouadi et al., 2006). En el adulto, los inhibidores selectivos de p38a y p evitan el impacto relacionado con p38y en la miogénesis.
La presente divulgación encuentra que p38 se activa durante la miogénesis, y que la inhibición de p38a y p por moléculas ejemplificadas en la presente memoria, que incluyen FTX-839, FTX-1821, etc., reduce profundamente la expresión de DUX4 y su programa de genes descendente en miotubos de FSHD (datos ejemplificados en la presente memoria). Sin querer ceñirnos a la teoría, parece que p38a regula directamente la expresión de DUX4 al impactar en la actividad de los potenciadores miogénicos críticos necesarios para la expresión patológica de DUX4 a nivel del locus D4Z4 mutado con repeticiones más cortas (FSHD1) o de las mutaciones SMCHD1 (FSHD2) o cuando la represión se pierde por otros mecanismos en el músculo de los pacientes con FSHD. Se trata de un mecanismo diferenciado de los estudios clínicos anteriores, que se dirigían a las funciones de la p38 en el citoplasma y no mostraron eficacia en numerosas enfermedades, que incluyen la artritis reumatoide, el dolor, la depresión, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y las enfermedades cardiovasculares. Los inhibidores de p38 nunca se han explorado clínicamente para la FSHD
Definiciones
Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, el término “y/o” se utiliza en esta divulgación para referirse a “y” o “o”, a menos que se indique lo contrario.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, o variaciones de la misma tal como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado o número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
Como se utiliza en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se utilizan como equivalentes. Todos los números utilizados en esta solicitud con o sin aproximadamente/aproximadamente están destinados a cubrir cualquier fluctuación normal apreciada por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, el término “aproximadamente” o “sobre” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
El término “administración” se refiere en la presente memoria a la introducción de un agente o composición en un sujeto o al contacto de un agente o composición con una célula y/o tejido.
El término “tratar” o “tratamiento” de una enfermedad incluye: (1) prevenir la enfermedad, es decir, provocar que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un mamífero que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas de la misma; (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos.
El término “una cantidad efectiva para uso terapéutico” significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un mamífero para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La cantidad efectiva para uso terapéutico variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc. del mamífero que se debe tratar.
Ciertos compuestos de la presente divulgación pueden existir en formas estereoisoméricas (por ejemplo, pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos o pueden presentar isomería cis-trans). Algunos compuestos pueden incluir más de un átomo de carbono asimétrico. El término “estereoisómero” se refiere a un compuesto que difiere en orientación (R/S) sobre uno o más átomos de carbono asimétricos, o difiere en orientación (cis:trans) sobre un doble enlace. El término estereoisómero también puede abarcar los atropisómeros, que surgen de la rotación obstaculizada en torno a un único enlace, por ejemplo, en compuestos que tienen una fracción de bifenilo sustituida. Un “enantiómero” es un compuesto que es una imagen especular de otro compuesto, es decir, todos los átomos de carbono asimétricos de un enantiómero existen en orientación opuesta (R/S) con respecto al otro compuesto. Un “diastereómero” es un compuesto que no es una imagen especular de otro compuesto, sino que incluye uno o más átomos de carbono asimétricos que existen en orientación opuesta (R/S) con respecto al otro compuesto. La presente divulgación puede incluir mezclas de estereoisómeros, o puede incluir un solo estereoisómero. Los enantiómeros o diastereómeros simples se pueden preparar a partir de reactivos quirales o por medio de técnicas sintéticas estereoselectivas o estereoespecíficas. Alternativamente, los enantiómeros o diastereómeros individuales se pueden aislar de las mezclas por medio de técnicas cromatográficas o de cristalización quirales estándar.
El término “enriquecido isotópicamente” se refiere a un compuesto en el que uno o más átomos están enriquecidos con un isótopo más allá de su abundancia natural. Por ejemplo, la abundancia natural del deuterio es del 0,015%. Los expertos en la técnica reconocen que en todos los compuestos químicos con un átomo de H, el átomo de H representa en realidad una mezcla de H y D, siendo aproximadamente el 0,015% D. Un compuesto enriquecido isópticamente puede tener uno o más sitios químicos específicos en los que la relación H/D es superior al 0,015%. Un compuesto enriquecido isotópicamente se puede denominar etiquetado isotópicamente.
El término “solvato” se refiere a un agregado de un compuesto con una o más moléculas de disolvente, un complejo de estequiometría variable formado por un soluto y el disolvente. Dichos disolventes, a efectos de la invención, no pueden interferir con la actividad biológica del soluto. Algunos ejemplos de disolventes adecuados son el agua, el metanol, el etanol y el ácido acético. Preferentemente, el disolvente utilizado es un disolvente aceptable para uso farmacéutico. Los ejemplos de disolventes aceptables para uso farmacéutico adecuados son el agua, el etanol y el ácido acético. Todos estos solvatos están incluidos en el ámbito de la presente invención. Por ejemplo, el disolvente de cualquier disolvente descrito en la presente memoria puede incluir agua.
El término “fármaco” se refiere a un compuesto que puede convertirse en condiciones fisiológicas o por solvólisis en el compuesto especificado o en una sal aceptable para uso farmacéutico de dicho compuesto.
La “sal aceptable para uso farmacéutico” es una sal que conserva la eficacia biológica de los ácidos y bases libres del compuesto especificado y que no es biológicamente o de otro modo indeseable. Un compuesto de la invención puede poseer un grupo funcional suficientemente ácido, suficientemente básico, o ambos, y en consecuencia reaccionar con cualquiera de un número de bases inorgánicas u orgánicas, y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal aceptable para uso farmacéutico. Los ejemplos de sales aceptables para uso farmacéutico incluyen aquellas sales preparadas por reacción de los compuestos de la presente invención con un ácido mineral u orgánico o una base inorgánica. Por ejemplo, las sales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a sulfatos, pirosulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos, fosfatos, monohidrogenofosfatos, dihidrogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloruros, bromuros, yoduros, acetatos, propionatos decanoatos, caprilatos, acrilatos, formatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butileno-1,4-dioatos, hexino-1,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, dinitro-menzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenosulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, Y-hidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, metanosulfonatos, propanosulfonatos, naftaleno-1-sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos y mandelatos. Por ejemplo, las sales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: Acetato, Bencenosulfonato, Benzoato, Bicarbonato, Bisulfato, Bitartrato, Borato, Bromuro, Edetato de Calcio, Camsilato, Carbonato, Cloruro, Clavulanato, Citrato, Diclorhidrato, Edetato, Edisilato, Estolato, Esilato, Fumarato, Gluceptato, Gluconato, Glutamato, Glicolilarsanilato, Hexilresorcinato, Hidrabamina, Bromhidrato, Clorhidrato, Hidroxinaftoato, loduro, Isetionato, Lactato, Lactobionato, Laurato, Malato, Maleato, Mandelato, Mesilato, Metilbromuro, Metilnitrato, Metilsulfato, Maleato Monopotásico, Mucato, Napsilato, Nitrato, N-metilglucamina, Oxalato, Parnoato (Embonato), Palmitato, Pantotenato, Fosfato/difosfato, Poligalacturonato, Potasio, Salicilato, Sodio, Estearato, Subacetato, Succinato, Tanato, Tartrato, Teoclate, Tosilato, Trietioduro, Trimetilamonio y Valerato. Por ejemplo, las sales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, difosfórico, bromhídrico y nítrico o sales de ácidos orgánicos tales como fórmico, cítrico, málico, maleico, fumárico, tartárico, succínico, acético, láctico, metanosulfónico, p-toluenosulfónico, 2-hidroxietilsulfónico, salicílico y esteárico. Del mismo modo, los cationes aceptables para uso farmacéutico incluyen, pero no se limitan a sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio. Por ejemplo, las sales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: sales de metales alcalinos: sal de sodio, sal de potasio y similares; sal de metales alcalinotérreos: sal de calcio, sal de magnesio, sal de bario y similares; sal de aluminio y similares. Como ejemplo adecuado de una sal con una base orgánica, por ejemplo, existen sales con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, 2,6-lutidina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, ciclohexilamina, diciclohexilamina, N,N'-dibencilendiamina y similares. Como ejemplo adecuado de una sal con un ácido inorgánico, por ejemplo, existen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares. Como ejemplo adecuado de una sal con un ácido orgánico, por ejemplo, existen sales con ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido Itálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y similares. Como ejemplo adecuado de una sal con un aminoácido básico, por ejemplo, existen sales con alginina, lisina, ornitina y similares. Como ejemplo adecuado de una sal con un aminoácido ácido, por ejemplo, existen sales con ácido aspártico, ácido glutámico y similares.
Uso en procedimientos de tratamiento
Se desvela un inhibidor de la quinasa p38 para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno que responde a la inhibición de la quinasa p38.
La invención reivindicada proporciona un inhibidor de la quinasa p38 para su uso en un procedimiento para tratar la distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD). El procedimiento incluye administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa p38 de Fórmula V':
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o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. El inhibidor de la quinasa p38 puede reducir los niveles de expresión de DUX4 y/o la expresión de uno o más genes descendentes en las células musculares del sujeto.
El inhibidor de la quinasa p38 es un compuesto de Fórmula V', o un estereoisómero del mismo, un compuesto enriquecido isotópicamente del mismo, un solvato del mismo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En algunas realizaciones, las células son células musculares terminalmente diferenciadas.
En algunas realizaciones, las células incluyen una o más mutaciones en un gen de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas que Contienen el Dominio Bisagra Flexible 1 (SMCHD1). En algunas realizaciones, las células pueden incluir al menos un alelo 4qA no eliminado.
En numerosas realizaciones, las células pueden incluir un nivel de expresión aumentado de un polipéptido DUX4, o un polipéptido codificado por uno o más genes diana corriente abajo, en comparación con el nivel de expresión de un polipéptido DUX4, o un polipéptido codificado por uno o más genes diana corriente abajo en una célula de control.
En numerosas realizaciones, el DUX4 es un DUX4 de longitud completa (DUX4-fl).
En algunas realizaciones, las células pueden estar asociadas con FSHD.
En algunas realizaciones, el trastorno está asociado a la expresión del gen DUX4.
En algunas realizaciones, el trastorno está asociado con la expresión del gen DUX4 y la expresión del gen DUX4 puede ser el resultado de que el sujeto tenga menos de 10 repeticiones D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35. En algunas realizaciones, las células pueden incluir una supresión de una o más repeticiones del macrosatélite D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35. En otras realizaciones, las células pueden incluir menos de 7 repeticiones del macrosatélite D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35.
En algunas realizaciones, las células musculares pueden incluir una matriz D4Z4 desregulada en el cromosoma 4q35 antes de la administración del inhibidor de la quinasa p38. En una realización, las células musculares pueden incluir una matriz D4Z4 desregulada que incluye menos de 11 unidades de repetición. En algunas realizaciones, la matriz D4Z4 disregulada puede incluir menos de 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 unidades de repetición.
El trastorno de acuerdo con la invención reivindicada es la FSHD. La FSHD puede incluir una o más de FSHD1 y FSHD2. En una realización, el trastorno es FSHD1. En otra realización, el trastorno es FSHD2. En una realización, el trastorno es FSHD1 o FSHD2.
En una realización, se identifica que el sujeto tiene FSHD en base a la presencia de un DUX4 transcripcionalmente activo. En otra realización, se identifica que el sujeto tiene FSHD en base a la presencia de uno o más genes descendentes ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A en el músculo. En otra realización, se identifica que el sujeto tiene FSHD en base a la presencia de niveles de expresión aumentados de uno o más genes descendentes ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A en relación con un control sano. En otra realización, se identifica que el sujeto tiene FSHD en base a la presencia de un DUX4 transcripcionalmente activo y la presencia de los genes descendentes ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, o ZNF280A.
En otra realización, el procedimiento puede incluir la medición del nivel de expresión de uno o más de: DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A en el sujeto antes de la administración del inhibidor de la quinasa p38. El procedimiento además puede incluir determinar que el sujeto necesita tratamiento si el nivel de expresión de uno o más de: DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A están elevados en relación con un control sano.
En otra realización, el procedimiento puede incluir la medición del nivel de expresión de uno o más de: DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A en las células del sujeto antes y después de la administración del inhibidor de la quinasa p38. El procedimiento puede incluir la comparación del nivel de expresión de uno o más de: DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A en el sujeto antes y después de la administración del inhibidor de la quinasa p38. El procedimiento puede incluir la determinación de la eficacia del tratamiento por medio de la comparación del nivel de expresión de uno o más de: DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, y ZNF280A antes y después de la administración del inhibidor de la quinasa p38, en la que una disminución del nivel o niveles de expresión es indicativa de un tratamiento eficaz.
En algunas realizaciones, el inhibidor de la quinasa p38 reduce uno o más genes corriente abajo seleccionados entre ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 y ZNF280A.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce MBD3L2.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce ZSCAN4.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce LEUTX.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce PRAMEF2.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce TRIM43.
En una realización, el inhibidor de la quinasa p38 reduce KHDC1L.
En una realización, un modulador transcripcional de DUX4 y los genes descendentes ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, y ZNF280A son inhibidos por la quinasa p38.
En algunas realizaciones, la administración se puede combinar con un tratamiento clínico que incluya fisioterapia, ejercicio aeróbico, terapia de la función respiratoria, intervenciones ortopédicas.
En algunas realizaciones, la administración incluye la administración del inhibidor de la quinasa p38 con otro agente farmacéutico.
En algunas realizaciones, la administración incluye la administración del inhibidor de la quinasa p38 con otro agente farmacéutico para el tratamiento de la FSHD
En algunas realizaciones, la administración provoca una disminución de la degeneración muscular.
En algunas realizaciones, la administración provoca una reducción de la apoptosis de las células musculares en el sujeto. En una realización, las células musculares están diferenciadas terminalmente.
En la presente memoria se describe un inhibidor de la quinasa p38 del Género V, que se define de forma más precisa en las reivindicaciones.
Descripción del género V
Los compuestos del género V se pueden preparar de acuerdo con la divulgación del documento US 7.125.898. El género V se caracteriza por los compuestos de fórmula V:
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o estereoisómeros de los mismos, compuestos enriquecidos isotópicamente de los mismos, profármacos de los mismos, solvatos de los mismos y sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos; en los que:
R1 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido por hasta tres grupos seleccionados entre alcoxi C1-6, halógeno e hidroxi, alquenilo C2-6, cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6, fenilo opcionalmente sustituido por hasta tres grupos seleccionados entre R5 y R6, y heteroarilo opcionalmente sustituido por hasta tres grupos seleccionados entre R5 y R6,
R2 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6 y -(CH2)q-cicloalquilo C3-7opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6, o -(CH2)mR1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 4 a 6 miembros opcionalmente sustituido por hasta tres grupos alquilo C1-6;
R3 es cloro o metilo;
R4 es -NH-CO-R7 o -CO-NH-(CH2)q-R8;
R5 se selecciona entre alquilo C1-6, alcoxi C1-6, -(CH2)q-cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1.6, -CONR9R10, -NHCOR10, -SO2NHR9 , (CH2)sNHSO2R10, halógeno, -CN, -OH, -(CH2)sNR11R12 y trifluorometilo;
R6 se selecciona entre alquilo C1-6, alcoxi C1-6, halógeno, trifluorometilo y -(CH2)sNR11R12;
R7 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6, -(CH2)q-cicioaiquiio C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6, trifluorometilo, -(CH2)r-heteroarilo opcionalmente sustituido por R13 y/o R14, y -(CH2)r-fenilo opcionalmente sustituido por R13 y/o R14;
R8 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6, -CONHR9 , fenilo opcionalmente sustituido por R13 y/o R14, y heteroarilo opcionalmente sustituido por R13 y/o R14;
R9 y R10 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno y alquilo C1-6, o R9 y R10 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre oxígeno, azufre y N-R15, en el que el anillo puede estar sustituido por hasta dos grupos alquilo C1-6;
R11 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6 y -(CH2)q-cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6,
R12 se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1-6, o R11 y R12 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre oxígeno, azufre y N-R15;
R13 se selecciona entre alquilo C1-6, alcoxi C1-6, -(CH2)q.cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido por uno o más grupos alquilo C1-6, -CONR9R10, -NHCOR10, halógeno, -CN, -(CH2)sNR11R12, trifluorometilo, fenilo opcionalmente sustituido por uno o más grupos R14 y heteroarilo opcionalmente sustituido por uno o más grupos R14;
R14 se selecciona entre alquilo C1-6, alcoxi C1.6, halógeno, trifluorometilo y -NR11R12;
R15 se selecciona entre hidrógeno y metilo;
X e Y se seleccionan de forma independiente entre hidrógeno, metilo y halógeno;
Z es halógeno;
m se selecciona entre 0, 1, 2, 3 y 4, en el que cada átomo de carbono de la cadena de carbono resultante puede estar opcionalmente sustituido con hasta dos grupos seleccionados independientemente entre alquilo C1-6 y halógeno;
n se selecciona entre 0, 1 y 2;
q se selecciona entre 0, 1 y 2;
r se selecciona entre 0 y 1; y
s se selecciona entre 0, 1, 2 y 3.
El inhibidor de la quinasa p38 reivindicado es 6-(5-(ciclopropilcarbamoil)-3-fluoro-2-metilfenil)-N-neopentilnicotinamida (“Losmapimod”), Fórmula V'.
Definiciones del género V
Como se utiliza en la presente memoria, el término “alquilo” se refiere a las cadenas de hidrocarburos rectas o ramificadas que contienen el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C1-6 significa un alquilo recto o ramificado que contiene al menos 1 y como máximo 6 átomos de carbono. Los ejemplos de “alquilo”, como se utilizan en la presente memoria, incluyen, entre otros, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, isobutilo, isopropilo y t-butilo. Se prefiere un grupo alquilo C1-4, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo o t-butilo. Dichos grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de flúor, por ejemplo, trifluorometilo.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “alquenilo” se refiere a cadenas de hidrocarburos rectas o ramificadas que contienen el número especificado de átomos de carbono y que contienen al menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo C2-6 significa un alquenilo recto o ramificado que contiene al menos 2, y como máximo 6, átomos de carbono y que contiene al menos un doble enlace. Los ejemplos de “alquenilo”, como se utilizan en la presente memoria, incluyen, entre otros, el etenilo, el propenilo, el 3-metilbut-2-enilo y el 1,1-dimetilbut-2-enilo. Como se utiliza en la presente memoria, el término “alcoxi” se refiere a un grupo alcoxi de cadena recta o ramificada, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, prop-2-oxi, butoxi, but-2-oxi, 2-metilprop-1-oxi, 2-metilprop-2-oxi, pentoxi o hexiloxi. Se prefiere un grupo alcoxi C1-4, por ejemplo, metoxi o etoxi.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “cicloalquilo” se refiere a un anillo de hidrocarburo no aromático que contiene el número especificado de átomos de carbono y que puede contener opcionalmente hasta un doble enlace. Por ejemplo, cicloalquilo C3-7 significa un anillo no aromático que contiene al menos tres y como máximo siete átomos de carbono en el anillo. Los ejemplos del “cicloalquilo” como se usan en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. Se prefiere un grupo cicloalquilo C3-6, por ejemplo, ciclopropilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Dichos grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más grupos alquilo C1-6, por ejemplo, uno o dos grupos metilo. En una realización, los grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por hasta cuatro grupos alquilo C1-6, por ejemplo, uno o dos grupos alquilo C1-6, en particular uno o dos grupos alquilo C1-4 tales como el metilo o el etilo.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos “anillo heteroarilo” y “heteroarilo” se refieren a un anillo monocíclico de hidrocarburo insaturado de cinco a siete miembros que contiene al menos un heteroátomo seleccionado de forma independiente entre oxígeno, nitrógeno y azufre. Preferentemente, el anillo heteroarilo tiene cinco o seis átomos de anillo. Los ejemplos de anillos heteroarilo incluyen, entre otros, furilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo y triazinilo. Dicho anillo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de forma independiente entre alquilo C1-6 y óxido.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “anillo heterocíclico” o “heterociclilo” se refieren a un anillo monocíclico de hidrocarburo saturado de tres a siete miembros que contiene al menos un heteroátomo seleccionado independientemente entre el oxígeno, el nitrógeno y el azufre. Preferentemente, el anillo heterocíclico tiene cinco o seis átomos de anillo. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, piperidilo, piperazinilo, morfolino, tetrahidropiranilo, tetrahidrofurano y tiomorfolino. Dicho anillo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de forma independiente entre alquilo C1-6 y óxido.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos “halógeno” o “halo” se refieren a los elementos flúor, cloro, bromo y yodo. Los halógenos preferentes son el flúor, el cloro y el bromo. Un halógeno particularmente preferente es el flúor o el cloro.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “opcionalmente” significa que el o los eventos descritos posteriormente pueden tener lugar o no, e incluye tanto eventos que se producen como eventos que no se producen.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “sustituido” se refiere a la sustitución con el sustituyente o sustituyentes nombrados, permitiéndose múltiples grados de sustitución a menos que se indique lo contrario.
Compuestos modificados
También se contempla un compuesto modificado de cualquiera de dichos compuestos que incluya una modificación que tenga una solubilidad farmacéutica mejorada, por ejemplo, mayor, estabilidad, biodisponibilidad y/o índice terapéutico en comparación con el compuesto no modificado. Los ejemplos de modificaciones incluyen, entre otros, los derivados de profármacos y los compuestos marcados isotópicamente, por ejemplo, los compuestos enriquecidos con deuterio.
(No reivindicados) Derivados de fármacos: los profármacos, tras su administración a un sujeto, se convertirán in vivo en compuestos activos de la presente invención (Nature Reviews of Drug Discovery, 2008, 7:255). Los profármacos de los compuestos de la presente invención se pueden preparar por medio de una reacción orgánica estándar, por ejemplo, por medio de la reacción con un agente carbamilante (por ejemplo, 1,1-aciloxicarbonocloridato, carbonato de para-nitrofenilo, o similares) o un agente acilante. Otros ejemplos de procedimientos y estrategias de fabricación de profármacos se describen en Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1994, 4:1985.
Ciertos compuestos marcados isotópicamente (no reivindicados) de las diversas fórmulas (por ejemplo, los marcados con 3H y 14C) son útiles en ensayos de distribución tisular de compuestos y/o sustratos. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y el carbono-14, es decir 14C, resultan particularmente preferentes por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución por isótopos más pesados tales como el deuterio, es decir 2H, puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas resultantes de la mayor estabilidad metabólica (por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o necesidades de dosis menores) y por lo tanto puede resultar preferente bajo algunas circunstancias. Los compuestos etiquetados isotópicamente de las diversas Fórmulas se pueden preparar generalmente siguiendo procedimientos análogos a los desvelados en los Esquemas y/o en los Ejemplos que figuran a continuación, por medio de la sustitución de un reactivo apropiado etiquetado isotópicamente por un reactivo no etiquetado isotópicamente.
(No reivindicado) Compuestos enriquecidos con deuterio: el deuterio (D o 2H) es un isótopo estable y no radiactivo del hidrógeno y tiene un peso atómico de 2,0144. El hidrógeno se presenta de forma natural como una mezcla de los isótopos xH (hidrógeno o protio), D (2H o deuterio) y T (3H o tritio). La abundancia natural del deuterio es del 0,015%. Los expertos en la técnica reconocen que en todos los compuestos químicos con un átomo de H, el átomo de H representa en realidad una mezcla de H y D, con aproximadamente un 0,015% de D. Por lo tanto, los compuestos con un nivel de deuterio que ha sido enriquecido para ser mayor que su abundancia natural del 0,015%, se deben considerar no naturales y, como resultado, novedosos respecto a sus homólogos no enriquecidos.
En un aspecto no reivindicado, se entiende que la presente divulgación incluye todos los isótopos de átomos que aparecen en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que presentan el mismo número atómico, aunque diferentes números másicos. En particular, uno, algunos o todos los hidrógenos pueden ser deuterio. Los isótopos radiactivos se pueden utilizar, por ejemplo, para el análisis estructural o para facilitar el seguimiento del destino de los compuestos o de sus productos metabólicos tras su administración. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
Se debe reconocer que los compuestos de la presente invención pueden estar presentes y administrarse opcionalmente en forma de sales y solvatos. Por ejemplo, está dentro del alcance de la presente invención convertir los compuestos de la presente invención en y utilizarlos en forma de sus sales aceptables para uso farmacéutico derivadas de varios ácidos y bases orgánicas e inorgánicas de acuerdo con procedimientos muy conocidos en la técnica.
Cuando los compuestos de la presente divulgación poseen una forma de base libre, los compuestos se pueden preparar como una sal de adición ácida aceptable para uso farmacéutico por medio de la reacción de la forma de base libre del compuesto con un ácido inorgánico u orgánico aceptable para uso farmacéutico, por ejemplo, hidrohalogenuros tales como el clorhidrato, el bromhidrato, el yodhidrato; otros ácidos minerales tales como el sulfato, el nitrato, el fosfato, etc.; y alquil y monoarilsulfonatos tales como el etanosulfonato, el toluenosulfonato y el bencenosulfonato; y otros ácidos orgánicos y sus correspondientes sales tales como el acetato, el tartrato, el maleato, el succinato, el citrato, el benzoato, el salicilato y el ascorbato. Otras sales de adición de ácido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a adipato, alginato, arginato, aspartato, bisulfato, bisulfito, bromuro, butirato, canforato, canforsulfonato, caprilato, cloruro, clorobenzoato, ciclopentanopropionato, digluconato dihidrogenofosfato, dinitrobenzoato, dodecilsulfato, fumarato, galacterato (de ácido múcico), galacturonato, glucoheptaoato, gluconato, glutamato, glicerofosfato, hemisuccinato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hipurato, 2-hidroxietanosulfonato, yoduro, isetionato, isobutirato, lactato, lactobionato, malonato, mandelato, metafosfato, metanosulfonato, metilbenzoato, monohidrogenofosfato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, oleato, pamoato, pectinato, persulfato, fenilacetato, 3-fenilpropionato, fosfonato y ftalato. Se debe reconocer que las formas de base libre diferirán típicamente de sus respectivas formas de sal un poco en las propiedades físicas tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus respectivas formas de base libre para los propósitos de la presente invención.
Cuando los compuestos de la presente divulgación poseen una forma de ácido libre, se puede preparar una sal de adición de ácido aceptable para uso farmacéutico por medio de la reacción de la forma de ácido libre del compuesto con una base inorgánica u orgánica aceptable para uso farmacéutico. Los ejemplos de tales bases son los hidróxidos de metales alcalinos, incluidos los hidróxidos de potasio, sodio y litio; los hidróxidos de metales alcalinotérreos, tales como los hidróxidos de bario y calcio; los alcóxidos de metales alcalinos, por ejemplo, el etanolato de potasio y el propanolato de sodio; y diversas bases orgánicas, tales como el hidróxido de amonio, la piperidina, la dietanolamina y la N-metilglutamina. También se incluyen las sales de aluminio de los compuestos de la presente invención. Otras sales de base de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: sales de cobre, férricas, ferrosas, de litio, de magnesio, mangánicas, de potasio, de sodio y de zinc. Las sales de bases orgánicas incluyen, entre otras, las sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, las aminas sustituidas, incluidas las aminas sustituidas naturales, las aminas cíclicas y las resinas básicas de intercambio iónico, por ejemplo, arginina, betaína, cafeína, cloroprocaína, colina, N,N'-dibencilendiamina (bencina), diciclohexilamina, dietanolamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lidocaína, lisina, meglumina, N-metil-D-glucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietanolamina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina y tris-(hidroximetil)-metilamina (trometamina). Se debe reconocer que las formas de ácido libre diferirán típicamente de sus respectivas formas de sal un poco en las propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus respectivas formas de ácido libre para los fines de la presente invención.
En un aspecto, una sal aceptable para uso farmacéutico es una sal de clorhidrato, una sal de bromhidrato, un metanosulfonato, un toluenesulfonato, un acetato, un fumarato, un sulfato, un bisulfato, un succinato, un citrato, un fosfato, un maleato, un nitrato, un tartrato, un benzoato, un bicarbonato, un carbonato, una sal de hidróxido de sodio, una sal de hidróxido de calcio, una sal de hidróxido de potasio, una sal de trometamina o mezclas de las mismas.
Los compuestos de la presente divulgación que comprenden grupos terciarios que contienen nitrógeno se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo (C1-4), por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, isopropilo y terc-butilo; sulfatos de dialquilo (C1-4) , por ejemplo, dimetil, dietil y diamil sulfatos; haluros de alquilo, por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, dodecilo, laurilo, miristilo y estearilo; y haluros de arilo (C1-4), por ejemplo, cloruro de bencilo y bromuro de fenetilo. Dichas sales permiten la preparación de compuestos de la invención tanto solubles en agua como en aceite.
Los óxidos de amina, también conocidos como amina-N-óxido y N-óxido, de agentes anticancerígenos con átomos de nitrógeno terciarios han sido desarrollados como profármacos (Mal. Cáncer Therapy, 2004 Mar; 3(3):233 a 244). Los compuestos de la presente invención que comprenden átomos de nitrógeno terciario pueden ser oxidados por agentes tales como peróxido de hidrógeno (H2O2), ácido de Caro o perácidos como el ácido metacloroperoxibenzoico (mCPBA) a partir de óxido de amina.
Composiciones farmacéuticas
Se desvelan composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de la presente invención y excipientes farmacéuticos, así como otros agentes farmacéuticos convencionales inactivos. En las composiciones de la presente invención se puede utilizar cualquier excipiente inerte que se emplee habitualmente como portador o diluyente, tales como azúcares, polialcoholes, polímeros solubles, sales y lípidos. Los azúcares y polialcoholes que se pueden emplear incluyen, sin limitación, la lactosa, la sacarosa, el manitol y el sorbitol. Entre los polímeros solubles que se pueden emplear se encuentran el polioxietileno, los poloxámeros, la polivinilpirrolidona y el dextrano. Las sales útiles incluyen, sin limitación, cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio. Los lípidos que se pueden emplear incluyen, sin limitación, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de glicerol, glicolípidos y fosfolípidos.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además aglutinantes (por ejemplo, acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, povidona), agentes desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa sódica, crospovidona, goma guar, glicolato sódico de almidón, Primogel), tampones (por ejemplo, tris-HCL, acetato, fosfato) de diversos pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar la absorción en las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de la proteasa, tensioactivos (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeabilidad, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilenglicerol, ciclodextrinas), un deslizante (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, butilhidroxianisol), estabilizadores (por ejemplo hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo, sacarosa, aspartamo, ácido cítrico), agentes aromatizantes (por ejemplo, menta, salicilato de metilo o aroma de naranja), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, laurilsulfato de sodio), auxiliares de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo, ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato de sodio, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica), revestimientos poliméricos (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes de revestimiento y formación de película (por ejemplo, etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
En una realización, las composiciones farmacéuticas se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de entrega microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el acetato de vinilo y etileno, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliésteres y el ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores aceptables para uso farmacéutico. Se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.522.811.
Además, se desvelan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquier forma física sólida o líquida del compuesto de la invención. Por ejemplo, los compuestos pueden estar en forma cristalina, en forma amorfa y tener cualquier tamaño de partícula. Las partículas pueden ser micronizadas, o pueden ser aglomerados, gránulos de partículas, polvos, aceites, suspensiones aceitosas o cualquier otra forma física sólida o líquida.
Cuando los compuestos de acuerdo con la presente invención presentan una solubilidad insuficiente, se pueden utilizar procedimientos para solubilizar los compuestos. Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el ajuste del pH y la formación de sales, mediante el uso de co-disolventes, tales como etanol, propilenglicol, polietilenglicol (PEG) 300, PEG 400, DMA (10 a 30%), DMSO (10 a 20%), NMP (10 a 20%), mediante el uso de tensioactivos, tales como polisorbato 80 polisorbato 20 (1 a 10%), cremophor EL, Cremophor RH40, Cremophor RH60 (5 a 10%), Pluronic F68/Poloxamer 188 (20 a 50%), Solutol Hs 15 (20 a 50%), TPGS de vitamina E, y succinato de d-a-tocoferilo PEG 1000 (20 a 50%), y mediante el uso de enfoques avanzados tales como la micela, la adición de un polímero, las suspensiones de nanopartículas y la formación de liposomas.
Se puede utilizar una amplia variedad de procedimientos de administración junto con los compuestos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar o coadministrar por vía tópica, oral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, rectal, transbucal, intranasal, liposomal, por inhalación, vaginal, intraocular, por vía local (por ejemplo, por catéter o stent), subcutánea, intraadiposal por vía intraarticular, intratecal, transmucosa, pulmonar o parenteral, por ejemplo, por inyección, incluida la subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea e intraesternal; por medio de la implantación de un depósito o reservorio, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Por ejemplo, la administración se puede combinar con inhibidores de la miostatina, agentes antiinflamatorios y terapia génica para reducir la producción patógena de la proteína DUX4 en la FSHD por medio del control de la mutilación de D4Z4, la supresión del ARNm de DUX4 y la inhibición de las vías de DUX4. Por ejemplo, la administración se puede combinar con ARN de interferencia pequeño (ARNsi), ARN de horquilla pequeña (ARNhc), microARN (miARN), edición de genes CRISPR y oligonucleótidos antisentido dirigidos a DUX4 y a los transcritos posteriores.
Los compuestos de acuerdo con la invención también se pueden administrar o coadministrar en formas de dosificación de liberación lenta. Los compuestos pueden estar en forma gaseosa, líquida, semilíquida o sólida, formulados de forma adecuada a la vía de administración que se vaya a utilizar. Para la administración oral, las formulaciones orales sólidas adecuadas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, gránulos, gránulos, sobres y efervescentes, polvos y similares. Las formulaciones orales líquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, jarabes, emulsiones, aceites y similares. Para la administración parenteral, se suele utilizar la reconstitución de un polvo liofilizado.
Las dosis adecuadas de los compuestos para su uso en el tratamiento de las enfermedades o trastornos descritos en la presente memoria pueden ser determinadas por los expertos en la técnica. Las dosis terapéuticas se identifican generalmente a través de un estudio de intervalo de dosis en seres humanos en base a la evidencia preliminar derivada de los estudios en animales. Las dosis deben ser suficientes para obtener el beneficio terapéutico deseado sin causar efectos secundarios no deseados. El modo de administración, las formas de dosificación y los excipientes farmacéuticos adecuados también pueden ser bien utilizados y ajustados por los expertos en la técnica. Todos los cambios y modificaciones se contemplan dentro del ámbito de la presente solicitud de patente.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se puede administrar a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 60 mg/kg, o más. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto a una dosis de 5, 10, 15, 20, 25, 40, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 mg/kg, o dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, entre aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, y similares. En otra realización, un compuesto descrito en la presente memoria se puede administrar a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto a una dosis de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mg/kg, o dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores procedentes, por ejemplo, entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, entre aproximadamente 6 mg/kg y aproximadamente 12 mg/kg, y similares. En otra realización, un compuesto descrito en la presente memoria se administra a una dosis de <15 mg/kg. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar a razón de 15 mg/kg al día durante 7 días para un total de 105 mg/kg por semana. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar a razón de 10 mg/kg dos veces al día durante 7 días para un total de 140 mg/kg por semana.
En numerosas realizaciones, las dosis descritas en la presente memoria se pueden referir a una dosis única, una dosis diaria o una dosis semanal.
En una realización, un compuesto se puede administrar hasta 120 mg/kg por día.
En una realización, un compuesto se puede administrar hasta 840 mg/kg por semana
En una realización, un compuesto se puede administrar una vez al día. En otra realización, un compuesto se puede administrar dos veces al día. En algunas realizaciones, un compuesto se puede administrar tres veces al día. En algunas realizaciones, un compuesto puede ser cuatro veces al día.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se puede administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 veces por semana. En otras realizaciones, el compuesto se administra una vez cada dos semanas.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se puede administrar por vía oral.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se puede administrar por vía oral a una dosis de <15 mg/kg una vez al día.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (V') se puede administrar por vía oral a una dosis de <15 mg/kg una vez al día.
En algunas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria se administra por vía oral a <15 mg/kg dos veces al día.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (V') se puede administrar por vía oral a una dosis de <15 mg/kg dos veces al día.
La dosis real empleada puede variar en función de las necesidades del paciente y de la gravedad de la condición que se está tratando. La determinación del régimen de dosificación apropiado para una situación particular está dentro de la habilidad de la técnica. Para mayor comodidad, la dosis diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el día de acuerdo con lo necesario.
El régimen de dosificación que utiliza el compuesto desvelado se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la condición médica del paciente; la gravedad de la condición que se va a tratar; la vía de administración; la función renal o hepática del paciente; y el compuesto particular desvelado empleado. Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios en la técnica puede determinar y recetar fácilmente la cantidad efectiva del fármaco necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la enfermedad.
La cantidad y la frecuencia de administración de los compuestos de la invención y/o las sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos se regularán de acuerdo con el juicio del clínico que los atienda, teniendo en cuenta factores tales como la edad, la condición y el tamaño del paciente, así como la gravedad de los síntomas a tratar. ASO oligonucleótidos antisentido
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol (diclorhidrato)
DMSO Dimetilsulfóxido
DUX4 doble homeobox 4
DUX4-fl doble homeobox 4 de longitud completa
FSHD distrofia muscular facioescapulohumeral
ARNg ARN guía
MBD3L2 proteína de dominio de unión a metil CpG 3 como 2
MHC cadena pesada de miosina
MPAK14 proteína quinasa activada por mitógenos 14
ARNm ARN mensajero
MYOG miogenina (factor miogénico 4)
p HSP27 proteína de choque térmico 27 fosforilada
PCR reacción en cadena de la polimerasa
pLAM secuencia de señal de poliadenilación
POLR2A Subunidad A de la ARN Polimerasa II
qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
ARN ácido ribonucleico
ARNsg ARN guía único
ARNsi ARN pequeño de interferencia
EJEMPLOS
La divulgación se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no se deberían interpretar en modo alguno como limitativos. Se debe entender que los ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas realizaciones y que no se pretende limitar el alcance de la divulgación. La invención reivindicada en la presente memoria se define por medio de las reivindicaciones adjuntas. Cualquier información técnica de los ejemplos que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona a modo de referencia, para situar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
Materiales y procedimientos
Materiales:
Mioblastos de músculo esquelético humano:
Para todos los estudios se utilizaron FTCE-00016-01 (línea de mioblastos inmortalizados de FSDH, 6,3 repeticiones) y líneas isogénicas A4 de control de mioblastos sanos normales y C12 de FSHD (como se describe en Mamchaoui et al., 2011; Thorley et al., 2016). Cuatro líneas diferentes de mioblastos de pacientes, FTCE-016, - 020, -197, -196 fueron proporcionadas por R. Tawil. Se demostró que los mioblastos de la FSHD expresan DUX4 aberrante a través de la desmetilación del D4Z4 en el cromosoma 4q35.
Componentes de los medios y materiales de cultivo de tejidos incluidos:
Medio de crecimiento muscular esquelético (PromoCell, C-23160) complementado con 15% de FBS (Hyclone, SH30071) y Pen/Strep (Gibco, 15140148). Medio de diferenciación de células musculares esqueléticas (PromoCell, C-23061) complementado con un 20% de suero de sustitución KnockOut (Gibco, 10828010) y Pen/Strep (medio de diferenciación). Solución de gelatina al 0,1% EmbryoMax (EMDmillipore ES-006-B). PBS (Gibco, 10010023),Microplaca de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos (Corning, CLS3595), Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC (Falcon, 353046).
Reactivos y kits de PCR en tiempo real:
Tampón de lisis-Roche Realtime Ready Tampón de lisis 19,5 j L (para 20 j L) (Roche, 07248431001), ADNse I (Ambion, AM2222) 0,25 j L, Inhibidor de ARNse Protector (Roche, 3335402001) 0,25 j L, RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004), Taqman Preamp Master Mix (ThermoFisher Scientific, 4391128), Taqman Multiplex Master Mix (ThermoFisher Scientific, 4484262), ZSCAN4 Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs00537549_ml, FAM-MGB), MYOG Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs01072232_ml, JUN-QSY), RPLP0 Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs99999902_ml), LEUTX Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs00418470_m1). Oligonucleótidos antisentido (ASO)
Los ASO se compraron a Exiqon: FTSE-000001 (DUX4 ASO de Exiqon, CAGCGTCGGAAGGTGG (SEC. ID Núm.: 1), 300610)), ASO no dirigido (Exiqon, AACACGTCTATACGC (SEC. ID Núm.: 2), 300610).
Revestimiento de gelatina de las placas de cultivo de tejidos:
Tres días antes del tratamiento, se preparó una solución de gelatina al 0,1% por medio de la combinación de 1 g de gelatina (por ejemplo, Sigma G9391) y 1 L de agua de cultivo de tejidos; se autoclavó durante 30 minutos para disolverla y esterilizarla. Suficiente gelatina al 0,1% para revestir los platos mediante el uso de una pipeta estéril, aspirar la solución hasta que todos los platos hayan sido recubiertos. Secado al aire y guardado en la funda original a temperatura ambiente.
Línea celular: Tres días antes del tratamiento, se sembraron 10000 células por pozo en placas de 96 pozos gelatinizadas, o 100000 células en placas de 6 pozos gelatinizadas.
Tratamiento con oligonucleótidos antisentido y compuestos:
Para los tratamientos con ASO o compuestos, las células se colocaron en placas en 100 pl de medio de crecimiento Promocell que contenía ASO o compuestos a las concentraciones descritas.
Diferenciación de los miotubos del músculo esquelético:
En el día 0, cambiar al medio de diferenciación. Retirar las placas de la incubadora y aspirar el medio de crecimiento, lavar una vez con PBS, 100 pL para los pocillos de 96 y 1 mL para una placa de 6 pocillos, Añadir 100 pL o 2 mL de medio de diferenciación por pocillo, de 96 o 6 pocillos respectivamente. Añadir los oligonucleótidos antisentido o el fármaco a la concentración deseada y volver a poner en la incubadora. La fusión debe comenzar en el día 1 a 2. Incubar durante 3 a 4 días.
Preparación de ARN:
Se sacaron las células de la incubadora y se aspiró el medio. Se lisó rápidamente siguiendo uno de los siguientes protocolos: Para la lisis en placas de 96 pocillos se describe a continuación el protocolo de lisis directa y RT-Preamp qPCR de una etapa. Para cada pocillo de 96, preparar una mezcla que contenga 19,5 pl de tampón de lisis Roche Realtime Ready, 0,25 pl de inhibidor de ARN, 0,25 pl de ADNsel (de Thermo, no el incluido en el kit). Se añadieron 20 pl de la mezcla a cada pocillo, se mezcló 5 veces y se incubó 5 minutos a RT o, alternativamente, se agitó enérgicamente durante 15 minutos. La lisis se observó al microscopio. Las muestras se congelaron a -80 °C durante al menos 15 minutos.
qPCR de una Etapa:
Para la qPCR, diluir 1:10 y utilizar 2 pl para una reacción de RT-qPCR de una etapa de 10 pl. Para la detección de GAPDH, RPLP0, TBP, MYOG, FRG1, MYH3, ACTN2, etc.). Por reacción de 10 pL: ARN (lisado de dilución 1:10) 2 pL, Mezcla Maestra Taqman Rápida Avanzada (2X) 5 pL, mezcla enzimática Rt (40X) 0,25 pL, juego de sondas Taqman (20X) 0,5 pL, H2O 2,25 pL. El siguiente protocolo de reacción se ejecutó en el QuantStudio 7: 48 °C durante 15 minutos, 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 30 segundos, 40x, 95 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 30 segundos, y posteriormente se leyeron las placas de acuerdo con lo especificado por el fabricante (Thermo). Para la preamplificación en una etapa de la RT utilizada para la detección de los genes descendentes de DUX4, es decir, MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, TRIM43, KHDC1L. El POL2RA-VIC CAR se utilizó como control Endógeno. Por reacción de 10 pL: ARN (lisado de dilución 1:10) 2,25 pL, Mezcla Maestra Taqman Pre-Amp (2X) 5 pL, mezcla de enzimas RT (40X) 0,25 pL, juego de sondas Taqman (0,2X)* 2,5 pL, * Agrupación de los ensayos TaqMan: se combinaron volúmenes iguales de cada ensayo de expresión génica TaqMan® 20X, hasta 100 ensayos. Por ejemplo, para agrupar 50 ensayos TaqMan, se combinaron 10 pl de cada ensayo en un tubo de microcentrífuga.. Los ensayos TaqMan agrupados se diluyeron mediante el uso de un tampón TE 1X para que cada ensayo tuviera una concentración final de 0,2X. Para el ejemplo anterior, añada 500 pl de tampón Te 1X a los ensayos TaqMan agrupados para obtener un volumen final total de 1 mL. Se utilizó el protocolo QuantStudio748 °C 15 min, 95 °C 10 min, 10 ciclos: 95 °C 15 seg, 60 °C 4 min, 4 °C infinito. A continuación, las muestras se diluyeron a 50 pl y se continuó con la etapa de qPCR. Por reacción de 10 pL: Dilución previa 2 pL, Mezcla Maestra Taqman Rápida Avanzada (2X) 5 pL, juego de sondas Taqman (20X) 0,5 pL, H2O 2,5 pL. Al multiplexar el volumen se ajustó a 10 pl en total). El siguiente programa se ejecutó en el QuantStudio7: 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 30 segundos, 40x, 95 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 30 segundos, las placas se leyeron de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Thermo).
Procedimientos para la extracción de ARN total de miotubos mediante el uso del kit RNeasy Micro Plus:
En una placa de 6 pozos, se añadieron 450 |jl de Tampón RLT Plus. El lisado se homogeneizó por medio de la transferencia a una columna de centrifugación ADNg Eliminator colocada en un tubo de recolección de 2 mL (suministrado), se centrifugó durante 30 s a >8000 x g (>10.000 rpm) y se desechó la columna guardando el flujo. A continuación, se añadieron 250 j l de etanol (35% final) al flujo, y se mezclaron bien por medio de pipeteo, sin centrifugar. A continuación, se transfirieron las muestras, incluido cualquier precipitado que pudiera haberse formado, a una columna de centrifugado RNeasy MinElute colocada en un tubo de recolección de 2 mL (suministrado). A continuación, se centrifuga durante 15 s a >8000 x g. El flujo se desecha o se recolecta para la precipitación de proteínas. Se añadieron 700 jL de Tampón RW1 a la columna de centrifugado RNeasy MinElute y se centrifugó durante 15 s a >8000 x g y se desechó el flujo. El tratamiento con ADNse se llevaron a cabo por medio de la mezcla suave de 10 j l de ADNse con 70 j l de Tampón RDD y se añadió directamente a la columna, incubándose a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 700 j l de tampón RW1 (de acuerdo con las especificaciones del fabricante) a la columna de centrifugación RNeasy MinElute, se centrifugó durante 15 s a >8000 x g y se descartó el flujo. Se añadieron 500 j l de tampón RPE a la columna de centrifugado RNeasy MinElute, se centrifugó durante 15 s a >8000 x g y se desechó el flujo. Se añadieron 500 j l de etanol al 80% a la columna de centrifugación RNeasy MinElute, se centrifugó durante 2 minutos a >8000 x g para lavar la membrana de la columna de centrifugación y se desechó el tubo de recolección con el flujo. La columna de centrifugación RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recolección de 2 mL (suministrado) que se centrifugó a máxima velocidad durante 5 minutos para secar la membrana y se desechó el tubo de recolección con el flujo. La columna de centrifugado RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recolección de 1,5 mL (suministrado). Se añadieron 14 j l de agua libre de ARNse directamente al centro de la membrana de la columna de centrifugación y se centrifugó durante 1 minuto a máxima velocidad para eluir el ARN. Debería obtener aproximadamente 12 j l de ARN eluido.
Detección de DUX4-fl por medio del procedimiento descrito por Himeda etal. 2015:
Preparación del ADNc. Por reacción de 10 jL: ARN (1 jg ) 1 jL , Oligo dT 0,5 jL, 10 mM dNTPs 0,5 jL, H2O 4,5 jL, Las muestras se incubaron a 65 °C durante 2 min y se trasladaron rápidamente a hielo y se mantuvieron al menos 1 min antes de añadir la mezcla de enzimas, 5x Tampón de primera cadena 2 jL, 0,1M DTT 0,5 jL, inhibidor de ARNse 0,5 jL, SSIV RT 0,5 jL, las muestras se incubaron a 55 °C durante 20 min y 80 °C durante 10 min, con enfriamiento a 4 °C. Se llevaron a cabo la preamplificación de DUX4: Por reacción de 10 jL, reacción RT 1 jL, tampón GC 5X 2 jL, DMSO 0,8 jL, 10 mM de dNTPs 0,2 jL, 10 jM de TJ38F 0,2 jL, 10 jM de TJ40R 0,2 jL, Phusion II DNA pol 0,1 jL, H2O 5,5 jL. El siguiente protocolo se ejecutó en el QuantStudio 7: 98 °C 2 min, 10 ciclos de 98 °C, 15 segundos, 64 °C, 20 segundos, 72 °C, 15 segundos, 4 °C infinitos. DUX4 qPCR con cebadores anidados: por reacción de 10 jL, ADN de preamplificación de DUX4 1 jL, 2X IQ SYBR Mix 5 jL, 10 jM TJ38F 0,4 jL, 10 jM TJ41R 0,4 jL, H2O 3,2 jL. El siguiente protocolo se ejecutó en el QuantStudio795 °C 3 min, 40 ciclos de, 95 °C 10 segundos, 64 °C 15 segundos, 72 °C 20 segundos, 86 °C 10 segundos y posteriormente leer la placa en el QuantStudio7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo). Los valores Ct se extrajeron del software QuantStudio Realtime PCR y se utilizó Genedata para calcular los niveles relativos de expresión mediante el uso de POLR2A como gen de mantenimiento.
Inmunocitoquímica de los miotubos de la FSHD
Brevemente, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron con PBST (solución 1 x PBS con 0,1% de Triton X-100) antes de bloquearlas con suero normal de burro al 10% o con 3% de BSA (NDS) en PBST. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos primarios debidamente diluidos en PBST con NDS al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente o 12 horas a 4 °C, se lavaron con PBST durante 3 veces a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron con los anticuerpos secundarios deseados en TBST con NDS al 5% y DAPI para contratinción de los núcleos. DUX4 se detectó por medio de inmunocitoquímica mediante el uso del anticuerpo E5-5 en miotubos diferenciados de FSHD. La Caspasa-3 activada se detectó con el anticuerpo de señalización celular que estamos mediante el uso de para la ICC, Asp175 (https://www.cellsignal.com/products/primaryantibodies/cleaved-caspase-3-asp175-antibody/9661).
Procedimientos de ARNsec
Las lecturas de extremo único de 40 pb de Illumina tenían buena calidad al comprobarlo con FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Las lecturas se asignaron a hg19 mediante el uso de TopHat v2.1.1. El modelo de genes para TopHat se creó por medio de la fusión de genes conocidos en formato gtf con la tabla kgXref. Tanto los genes conocidos como los kgXref fueron descargados del navegador de tablas de la UCSC en el conjunto hg19. Los recuentos de lecturas se obtuvieron mediante el uso de la función de recuentos de características del paquete Subread con la opción de estrangulamiento como -r 2. Las lecturas se normalizaron con DESeq2. Las réplicas biológicas en las muestras de neuronas, procesadas en diferentes periodos de tiempo, tienen efecto de partida como sugiere el análisis de componentes principales. En consecuencia, se utilizó el Combat para reducir este efecto de partida. Valores estándar de expresión RPKM calculados. La firma génica total es muy pequeña y está definida en los límites estadísticos estándar: 86/19.799 genes de ARNm. La firma génica regulada por DUX4 es la mayoría de la firma total: 77/86 genes de ARNm = 90%. Los genes no regulados por DUX4 son una minoría de la firma total con cambios de pliegues moderados: 9/86 genes de ARNm = 10%; 2-2,7X logFC.
Procedimientos para la transducción de ARNsi y ARNsg de Cas9 en miotubos de FSHD:
Los ARNcr sintéticos se compraron a Thermo Fisher Scientific y el recocido a los ARNcr se llevó a cabo de acuerdo con las especificaciones. En resumen, los ARNcr y el ARNtra se resuspendieron en tampón TE a 100 pM, se mezclaron y se diluyeron 5 veces en tampón de recocido. El recocido se llevó a cabo en un sistema PCR ProFlex siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se incubaron 100 ng de ARNcr:ARNtra ensamblado con 500 ng de TrueCut Cas9 (ThermoFisher, Núm. A36497) en el tampón de resuspensión suministrado con el kit del sistema de transfección Neon (ThermoFisher, Núm. MPK10096). Tras 15 minutos de incubación, la reacción se utilizó para transfectar 50.000 mioblastos de acuerdo con los procedimientos descritos. Las secuencias utilizadas para la orientación de MAPK14 (3 ARNsg) y la región pLAM (secuencia de poliadenilación de DUX4, 4 ARNg) fueron: NT-CTRL, GTATTACTGATGGTGGG (SEC. ID Núm.: 3), MAPK14, GCTGAACAAGACAATCTGGG (SEC. ID Núm.: 4), CTGCTTTTGACACAAAAACG (SEC. ID Núm.: 5), CTTATCTACCAAATTCTCCG (SEC. ID Núm.: 6); pLAM, AGAATTTCACGGAAGAACAA (SEC. ID Núm.: 7), CAGGTTTGCCTAGACAGCGT (SEC. ID Núm.: 12), ATTAAAATGCCCCCTCCCTG (SEC. ID Núm.: 8), AATCTTCTATAGGATCCACA (SEC. ID Núm.: 9). ARNsi MAPK14, Antisentido: UAGAUUACUAGGUUUUAGGTC (SEC. ID Núm.: 10), CCUAAAACCUAGUAAUCUATT (SEC. ID Núm.: 11).
Experimental
Ejemplo 1
LA REPRESIÓN DE DUX4 por medio de UN OLIGONUCLEÓTIDO ANTISENTIDO DIRIGIDO A LA SECUENCIA REDUCE LOS GENES DIANA corriente abajo
Los miotubos de tipo salvaje se trataron con un vehículo de control DMSO, y los miotubos de FSHD derivados de pacientes maduros que expresan la proteína DUX4 se trataron con un vehículo de control DMSO o con 1 pM de un oligonucleótido antisentido dirigido a la secuencia de DUX4 (ASO; FTX-2) adquirido en Exiqon. Tras el tratamiento, los miotubos se lisaron en 19,5 pl de tampón de lisis de Roche Real Time Ready, 0,25 pl de ADNse1 (Ambion, AM2222), 0,25 pl de inhibidor de RNasa Protector (Roche, 3335402001), y el ARN se recolectóó en una Mezcla Maestra RNeasy Micro Kit. Los niveles de expresión de los genes descendentes regulados por DUX4 (ZSCAN4, TRIM43, MBD3L2, LEUTX y KHDC1L) se determinaron por medio de PCR en tiempo real (ThermoFisher Scientific, 4484262), ensayo Taqman de z ScAN4 (ThermoFisher Scientific, Hs00537549_m1, FAM-MGB), ensayo Taqman MYOG (ThermoFisher Scientific, Hs01072232_m1, JUN-QSY), ensayo Taqman RPLP0 (ThermoFisher Scientific, Hs99999902_m1), y/o ensayo Taqman LEUTX (ThermoFisher Scientific, Hs00418470_m1). Los valores Ct se extrajeron del software QuantStudio Realtime PCR, y se utilizó Genedata para calcular los niveles relativos de expresión mediante el uso de POLR2A como gen de mantenimiento.
Los resultados mostraron que los miotubos de FSHD tratados con ASO dirigido a la secuencia de DUX4 expresan cantidades reducidas de DUX4 y de los genes diana del factor de transcripción descendente de DUX4, ZSCAN4, TRIM43, MBD3L2, LEUTX y KHDC1L, en comparación con los miotubos de FSHD tratados con el control vehicular DMSO (FIG. 2).
Los datos de la FIG. 3A son datos de control de calidad de placas agrupadas que comparan la expresión del ARNm de MBD3L2 en miotubos de FSHD tratados con control Dm SO o 1 pM de d Ux 4 As O, y miotubos normales sanos de control isogénico. La FIG. 3B muestra los datos de control de calidad farmacológica y la reducción dependiente de la dosis de DUX4 y del gen descendente, MBD3L2, mediante el uso de diferentes diluciones del ASO DUX4. La FIG. 3C muestra las estadísticas del ensayo en placa por medio de la comparación de los miotubos FSHD tratados con DMSO con los WT: Z' es 0,512 y la relación señal/ruido (S/N) es 5,1, y los miotubos de FSHD tratados con DMSO o DUX4 ASO:Z' es 0,319 y la relación señal/ruido (S/N) es 4,6.
Ejemplo 2
LOS INHIBIDORES DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS P38 REDUCEN LA EXPRESIÓN DE ARNm MBD3L2
Los miotubos de tipo salvaje y los miotubos de FSHD derivados de pacientes maduros que expresan la proteína DUX4 se trataron con el control vehicular DMSO o con múltiples concentraciones de varios inhibidores de p38a/p con diferentes intervalos de selectividad de isoformas y cinomas, incluido el SB239063 (FIG. 4A; IC50 = 15 nM), VX-702 (FIG. 4B), Pamapimod (FIG. 4C), e TAK-715 (FIG. 4D). Tras el tratamiento, las células de control y las tratadas se procesaron para la cuantificación por PCR en tiempo real de la expresión del ARNm de MBD3L2 (gen descendente de DUX4) y de la miogenina (MYOG) (control). Estos inhibidores de p38a/p mostraron ser potentes (IC50 aproximadamente <10 nM, FIGS. 4A a D) reducción de la expresión del ARNm de MBD3L2 sin impacto en la expresión del ARNm de MYOG en los miotubos de FSHD.
En los miotubos de FSHD, los inhibidores de la quinasa p38 (por ejemplo, Pamapimod) redujeron de forma dependiente de la dosis el ARNm de DUX4 y la expresión del ARNm del gen descendente de DUX4, MBD3L2, sin afectar a la formación de miotubos. En comparación con el tratamiento con DMSO, 10, 100 y 1000 nM de FTX000839 (Pamapimod) redujeron de forma dependiente de la dosis los niveles de ARNm de los genes descendentes DUX4-fl y MBD3L2 normalizados con respecto al ARNm de POLR2A, medidos por qPCR y Taqman en miotubos de FSHD (FIG. 5A) sin afectar a la diferenciación en miotubos (FIG. 5B). Los datos muestran que los inhibidores de la quinasa p38 reducen de forma dependiente de la dosis la expresión del ARNm de MBD3L2 sin afectar a la expresión del ARNm de la miogenina.
Ejemplo 3
REDUCCIÓN DE LA ARNm P38 MAPK14 Y MBD3L2 A TRAVÉS DEL KNOCKDOWN DE ARNsi
Se transfectaron ARNsi de p38a MAPK14 85 y p38a MAPK14 86 en miotubos de pacientes con FSHD como se describe en Materiales y Procedimientos. Cada uno de los ARNsi de p38a MAPK14 85 y de p38a MAPK14 86 (en menor medida) redujo la expresión de p38 MAPK14, como se muestra en la FIG. 6A, y la expresión del ARNm de MBD3L2 (gen diana de DUX4), como se muestra en la FIG. 6B, en comparación con los ARNsis de control no objetivo (Nt CTRL 1 y NT CTRL 2). Los datos muestran que la reducción genómica de p38a MAPK14 >50% redujo específicamente DUX4 y los genes diana corriente abajo, como ejemplifica MBD3L2.
Ejemplo 4
REDUCCIÓN DEL ARNm MBD3L2 A TRAVÉS DE LA quinasa P38a CAS9/ARNsg RNPS
El ARNg CRISPR dirigido a MAPK14 o pLAM (secuencia de señal de poliadenilación para DUX4) se llevó a cabo como se describe en Materiales y Procedimientos. El ARNg CRISPR dirigido a MAPK14 o a pLAM (secuencia de señal de poliadenilación para DUX4) dio lugar a una reducción de la expresión de MBD3L2 pero no de MYOG. Los datos indican que la reducción genómica de p38a MAPK14 redujo específicamente DUX4 y los genes diana corriente abajo, como ejemplifica MBD3L2.
Ejemplo 5
FTX-1821 REGULA A LA BAJA LA PROTEÍNA DUX4 Y LA ARNm MBD3L2
Los miotubos de FSHD derivados de pacientes (con 6 repeticiones de matrices D4Z4) se trataron con el control vehicular DMSO y con diferentes concentraciones de FTX-1821, y se determinaron los niveles de proteína DUX4 y de ARNm MBD3L2 como se describe en Procedimientos y Materiales. Para DUX4 y MBD3L2, se analizaron cuatro réplicas biológicas. Además, se determinaron los niveles de pHSP27. Para la cuantificación de pHSP27, se obtuvieron tres réplicas en dos experimentos independientes.
El tratamiento de los miotubos derivados de pacientes con FSHD con FTX 1821 dio lugar a una reducción dependiente de la concentración de la proteína DuX4 (IC50 = 25nM) y del ARNm de MBD3L2 (IC50 = 25nM) que se correlacionó con los cambios observados en los niveles de fosfo HSP27 (IC50 = 10nM) como evidencia de la participación de la diana (FIG. 7). Los resultados fueron indicativos de una reducción dependiente de la concentración de la proteína DUX4 (IC50 = 25 nM) y del ARNm MBD3L2 (IC50 = 10 nM). Las reducciones de la proteína DUX4 y del ARNm de MBD3L2 se correlacionaron con los cambios observados en los niveles de p-HSP27 (IC50 = 10 nM) como evidencia de la participación de la diana. Estos resultados indican que la inhibición de la vía p38a por parte de FTX-1821 produce una potente regulación a la baja de la proteína DUX4 y del ARNm de MBD3L2.
Ejemplo 6
FTX-1821 NO AFECTA A LA FORMACIÓN DE MIOTUBOS
Se diferenciaron miotubos FHSD inmortalizados y se trataron con el control vehicular DMSO o con FTX-1821 a concentraciones de 1 j M, 0,33 j M, 0,11 j M o 0,037 j M. Después de 4 días, las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra el MHC o DAPI. Véase la FIG. 8A. Los núcleos de los miotubos se cuantificaron de acuerdo con la tinción MHC (FIG. 8B). Los resultados no mostraron cambios en la formación o fusión de miotubos tras el tratamiento con FTX-1821 en las concentraciones probadas.
Ejemplo 7
FTX-1821 REDUCE LA APOPTOSIS EN MIOTUBOS FSHD
La apoptosis se midió por medio de los niveles de Caspasa-3 activa en miotubos de FSHD in vitro, como se describe en Materiales y Procedimientos. La apoptosis se detectó de forma esporádica en un subconjunto de miotubos en cultivo, como muestran los círculos blancos y la región ampliada de la FIG. 9A. Se cuantificó la señal de Caspasa-3 activa en miotubos de FSHD que habían sido tratados con FTX-1821 a diferentes concentraciones (FIG. 9B). Los resultados mostraron una reducción dependiente de la dosis de la señal apoptótica, como indica la reducción de la detección de la Caspasa 3 activa (IC50 = 45 nM), y este efecto fue específico para los miotubos de la FSHD en comparación con los miotubos de control. No se observó ningún cambio en la señal de la Caspasa-3 activa tras el tratamiento con DMSO.
Ejemplo 8
FTX-1821 REDUCE LA EXPRESIÓN DEL PROGRAMA TRANSCRIPCIONAL DUX4 PATOLÓGICO
Se llevaron a cabo estudios como se describe en Procedimientos y Materiales para identificar los genes de la vía DUX4 cuya expresión se regula a la baja en los miotubos de FSHD tratados con FTX-1821 en comparación con los miotubos de FSHD tratados con el control vehicular DMSO. Además, también se determinó la expresión génica en miotubos de tipo salvaje tratados con DMSO. Se analizaron tres réplicas para cada condición por medio de ARN-sec y los genes se agruparon por la dirección e intensidad del cambio.
Como se muestra en el mapa de calor de la FIG. 10A, se identificó un número de genes expresados diferencialmente por medio del perfil de ARN-sec. La barra indica los cambios normalizados observados, por ejemplo, los genes que fueron regulados a la baja por FTX-1821 están enriquecidos en las muestras tratadas sólo con DMSO. La expresión de estos genes se normalizó tras el tratamiento con FTX-1821 (1 j M) y se asemejó más a las observaciones en las células de tipo salvaje. Calculada por medio de los valores de expresión RPKM estándar, la firma génica total era muy pequeña y estaba definida de acuerdo con los límites estadísticos estándar: 86/19.799 genes de ARNm. La firma génica regulada por DUX4 fue la mayoría de la firma total, y estos genes se enumeran en la FIG. 10A. Los genes no regulados por DUX4 eran minoritarios en la firma total con cambios de pliegues moderados: 9/86 genes de ARNm = 10%; 2-2,7X logFC. La FIG. 10B muestra las lecturas normalizadas, como se describe en Materiales y Procedimientos, de los genes diana de DUX4 que fueron regulados a la baja tras el tratamiento con FTX-1821. Se analizaron tres réplicas independientes por grupo.
Ejemplo 9
REDUCCIÓN DE LA ARNm MBD3L2 EN VARIOS GENOTIPOS Y FENOTIPOS DE FSHD1
La capacidad de los inhibidores de la quinasa p38 para reducir la expresión de los genes diana de DUX4 en las células obtenidas de pacientes con diferentes genotipos de FSHD1 se llevó a cabo como se describe en Procedimientos y Materiales. Cuatro líneas diferentes de mioblastos de pacientes con FSHD, es decir, FTCE-016, -020, -197 y -196 (amablemente proporcionadas por Rabi Tawil) fueron tratadas con FTX-1821 (1 jM) o FTX-839 (1 j M), y se determinaron los niveles de ARNm del gen diana de DUX4, MBD3L2, tras el tratamiento.
Los niveles de expresión de MBD3L2 se redujeron en todas las líneas de FSHD, resultando en niveles similares a los medidos en los controles sanos, FTCE-396 y FTCE-014 (FIG. 11). Esto es una prueba de la reducción del gen diana DUX4 por los inhibidores de la quinasa p38 en los miotubos derivados de diversos genotipos y fenotipos de FSHD1 (se observaron resultados similares para FSHD2, datos no mostrados).
Ejemplo 10
REDUCCIÓN DE LA ARNm MBD3L2 DE LOS GENOTIPOS Y FENOTIPOS FSHD1 Y FSHD2
Para evaluar el efecto del tratamiento de la inhibición selectiva de p38 mediante el uso de FTX-1821 en las células FSHD1 y FSHD2, las líneas primarias de mioblastos fueron amablemente proporcionadas por Rabi Tawil en la Universidad de Rochester. La FIG. 13 resume los genotipos y fenotipos de 13 mioblastos de pacientes con FSHD1 y 3 con FSHD2 utilizados en el estudio. Los diversos mioblastos FSHD1 y FSHD2 fueron tratados con DMSO, FTX-1821 o FTX-839 (1 jM), y tras el tratamiento se determinaron los niveles de expresión de ARNm del gen diana de DUX4, MBD3L2. Además, se determinó la apoptosis por medio de la medición de la caspasa-3 activa en las líneas FSHD1 y FSHD2.
Cada uno de los diversos mioblastos FSHD1 y FSHD2 mostró una reducción de MBD3L2 (FIG. 14A, 11 líneas superiores). La reducción dio lugar a niveles de expresión similares a los de las líneas de control sanas (CTRL-FTCE-014) (FIG. 14A, 2 líneas inferiores). Además, el tratamiento con FTX-839 mostró una reducción de la apoptosis en ambas líneas FSHD1 y FSHD2, a un nivel que fue similar a la cantidad determinada en una línea de control sana (CTRL- FTCE-014) (FIG. 14B). Estos resultados indican que los mioblastos de las biopsias clínicas de FSHD, cuando se diferencian en miotubos, muestran una reducción tanto de la expresión génica descendente patológica de DUX4 como de la muerte celular resultante en los genotipos y fenotipos de FSHD1 y FSHD2.
Ejemplo 11
PARTICIPACIÓN DE DIANAS EN EL MÚSCULO DE RATAS DE TIPO SALVAJE TRAS EL TRATAMIENTO CON UN POTENTE Y SELECTIVO INHIBIDOR DE LA QUINASA P38
Las propiedades farmacocinéticas de FTX-1821 se estudiaron en un modelo animal. El FTX-1821 se administró por vía oral a ratas macho Sprague-Dawley en ayunas o no (N=6 animales por punto de tiempo y grupo de tratamiento), y se determinaron los niveles de fosfo p38a : p38a total. El análisis farmacodinámico de la activación del sistema p38 en el tejido muscular se llevó a cabo por medio de la medición del cambio en la relación entre la proteína quinasa 2 activada por el fósforo (MK2) y la MK2 total antes y después del tratamiento con el fármaco. Todos los

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de la quinasa p38 para su uso en un procedimiento de tratamiento de la distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD), el procedimiento comprende la administración de una cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa p38 a un sujeto que lo necesita, en el que el inhibidor de la quinasa p38 se caracteriza por la Fórmula (V'):
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o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.
2. El inhibidor de la quinasa p38 para uso de la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra al sujeto en combinación con otro agente farmacéutico para el tratamiento de la FSHD.
3. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el inhibidor de la quinasa p38 reduce los niveles de expresión de DUX4 y/o la expresión de uno o más genes descendentes en las células musculares del sujeto.
4. El inhibidor de la quinasa p38 para uso de la reivindicación 3, en el que el gen descendente DUX4 se selecciona del grupo que consiste en: ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, y ZNF280A.
5. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células musculares.
(a) son células musculares terminalmente diferenciadas,
(b) comprenden una matriz D4Z4 desregulada en el cromosoma 4q35, opcionalmente en la que la matriz D4Z4 comprende menos de 11 unidades de repetición, o
(c) comprenden al menos un alelo 4qA no suprimido;
a condición de que, cuando las células musculares comprendan al menos un alelo 4qA no eliminado, las células musculares comprendan una o más mutaciones en un gen de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas que Contienen el Dominio Bisagra Flexible 1 (SMCHD1).
6. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la distrofia muscular facioescapulohumeral es
(a) FSHD tipo 1 (FSHD1), opcionalmente en el que las células musculares comprenden una supresión de una o más repeticiones del macrosatélite D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35, además opcionalmente < 7 repeticiones del macrosatélite D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35, o (b) FSHD tipo 2 (FSHD2), opcionalmente en el que las células musculares comprenden una o más mutaciones en un gen de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas que Contienen el Dominio Bisagra Flexible 1 (SMCHD1).
7. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la administración provoca una disminución de la degeneración muscular en el sujeto.
8. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración provoca una reducción de la apoptosis de las células musculares en el sujeto.
9. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra al sujeto por vía parenteral.
10. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra al sujeto por vía oral.
11. El inhibidor de la quinasa p38 para uso de la reivindicación 10, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra a una dosis de 7,5 mg o 15 mg dos veces al día.
12. El inhibidor de la quinasa p38 para uso de la reivindicación 11, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra a una dosis de 7,5 mg dos veces al día.
13. El inhibidor de la quinasa p38 para uso de la reivindicación 11, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra a una dosis de 15 mg dos veces al día.
14. El inhibidor de la quinasa p38 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el inhibidor de la quinasa p38 o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo se administra al sujeto por vía inhalatoria.
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