EA034927B1 - Ароматические гетероциклические соединения как противовоспалительные соединения - Google Patents

Ароматические гетероциклические соединения как противовоспалительные соединения Download PDF

Info

Publication number
EA034927B1
EA034927B1 EA201691625A EA201691625A EA034927B1 EA 034927 B1 EA034927 B1 EA 034927B1 EA 201691625 A EA201691625 A EA 201691625A EA 201691625 A EA201691625 A EA 201691625A EA 034927 B1 EA034927 B1 EA 034927B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
formula
treatment
compounds
cells
Prior art date
Application number
EA201691625A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691625A1 (ru
Inventor
Алистер Йен Лонгшо
Юэн Александер Фрэйзер Фордайс
Стюарт Томас Онионз
Джон Кинг-Андервуд
Дженнифер Дайан Венэйбл
Original Assignee
Респайверт Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Респайверт Лимитед filed Critical Респайверт Лимитед
Publication of EA201691625A1 publication Critical patent/EA201691625A1/ru
Publication of EA034927B1 publication Critical patent/EA034927B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/541—Non-condensed thiazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0075—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a dry powder inhaler [DPI], e.g. comprising micronized drug mixed with lactose carrier particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I), определенному в описании, которое является ингибитором MAP-киназы p38, для применения в качестве лекарственного средства для лечения, среди прочего, воспалительных заболеваний.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к соединению, которое является ингибитором семейства ферментов митогенактивированных протеинкиназ p38 (называемому в настоящем описании ингибиторами MAP-киназ p38), например, их подтипов α и γ, и семейства Src тирозинкиназ, и к его применению в терапии, в том числе в фармацевтических комбинациях, особенно при лечении воспалительных заболеваний, в частности воспалительных заболеваний легких, таких как астма и COPD, а также заболеваний желудочнокишечного тракта, таких как неспецифический язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника (IBD) и болезнь Крона, и глаз, таких как увеит.
Предпосылки создания изобретения
Идентифицированы четыре изоформы MAPK p38 (α, β, γ и δ соответственно), причем каждая отображает различные картины экспрессии тканей у человека. Изоформы MAPK p38 α и β обнаружены в организме повсеместно, причем присутствуют во многих различных типах клеток. Изоформа α хорошо охарактеризована в смысле ее роли в воспалении. Хотя исследования на мышах с использованием химикогенетического подхода показывают, что изоформа MAPK p38 β не играет роли в воспалении (O'Keefe S.J. et al., J. Biol. Chem., 2007, 282(48), 34663-71), она может быть вовлечена в механизмы болей через регуляцию экспрессии COX2 (Fitzsimmons B.L. et al., Neuroreport, 2010, 21(4), 313-7). Такие изоформы ингибируются рядом описанных ранее низкомолекулярных соединений.
Разработанные ранее классы ингибиторов были весьма токсичными из-за широкого распределения таких изоформ в тканях, что приводило к многочисленным действиям соединений мимо цели. Кроме того, разработка значительного числа ингибиторов прерывалась из-за неприемлемых профилей безопасности при клинических исследованиях (Pettus L.H. and Wurz R.P., Curr. Top. Med. Chem., 2008, 8(16), 1452-67). Так как такие вредные действия меняются с хемотипом, и соединения имеют картины различной селективности в отношении киназ, наблюдаемая токсичность может соотноситься со структурой, а не с механизмом на основе p38. Позднее разработаны соединения с большей эффективностью и селективностью в отношении MAPK p./8-α/β; однако уровни эффективности, достигнутые при лечении хронических воспалительных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита (SCIO-469, Genovese et al., J. Rheumatol., 2011, 38, 846-54; Pamapimod, Cohen et al., Arthritis Rheum., 2009, 60, 335-344; BMS-582949, Schieven et al., Arthritis Rheum., 2010, 62, Suppl. 10:1513) и COPD (Losmapimod, Watz et al., Lancet Resp. Med., 2014, 2, 63-72), разочаровывают. Более того, заслуживает внимания то, что обнаружено, что ингибитор MAPK p38 обеспечивает благоприятное действие для пациентов с IBD после лечения одну неделю, которое не продолжается в течение четырехнедельного курса лечения (BIRB-796, Schreiber S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4, 325-334).
Важным выводом из этих исследований является то, что применение мишеньспецифических ингибиторов киназ может являться недостаточным для достижения и поддержания терапевтического благоприятного действия при сложных воспалительных заболеваниях, где дисрегуляция нескольких иммуновоспалительных путей и биологической адаптации может обойти блокаду единственного механизмамишени, что приводит к утрате реакции. Можно утверждать, что в случае сложных воспалительных заболеваний, таких как COPD, ревматоидный артрит и IBD, ингибиторы, мишенью которых является набор киназ, которые являются критичными для регуляции различных иммуновоспалительных механизмов, связанных с патологией, будут иметь больший потенциал для достижения эффективной и пролонгированной терапевтической реакции.
Роль MAPK-α p38 в регуляции воспалительных путей широко исследована и хорошо установлена. Меньше известно об изоформах MAPK-γ и -δ p38, которые в отличие от изозимов α и β экспрессируются в специфических тканях и клетках. Изоформа MAPK-δ p38 экспрессируется в большей степени в поджелудочной железе, яичках, легких, тонкой кишке и почках. Она также распространена в макрофагах и детектируется в нейтрофилах, CD4+ T-клетках и в эндотелиальных клетках (Shmueli О. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11), 1067-1072; Smith S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404; Hale K.K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Wang X.S. et al., J. Biol. Chem., 1997, 272(38), 23668-23674). Совсем немного известно о распределении MAPK-γ p38, хотя она экспрессируется в большей степени в головном мозге, скелетных мышцах и сердце, а также в лимфоцитах и макрофагах (Shmueli О. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11), 1067-1072; Hale K.K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Court N.W. et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 2002, 34(4), 413-26; Mertens S. et al., FEBS Lett., 1996, 383(3), 273-6). Данные, что киназы MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38 экспрессируются в иммунологически важных и провоспалительных типах клеток, вызвали интерес к их функциям относительно MAPK-α p38. Селективные низкомолекулярные ингибиторы MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38 на сегодняшний день недоступны для того, чтобы оценить роль этих киназ фармакологически, хотя известно, что одно раскрытое ранее соединение BIRB 796 обладает активностью ингибирования пан-изоформы. Ингибирование изоформ MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38 наблюдают при более высоких концентрациях соединения, чем концентрации, требуемые для ингибирования MAPK-α p38 и MAPK-β p38 (Kuma Y., J. Biol. Chem., 2005, 280, 19472-19479). Кроме того, BIRB 796 также ухудшает фосфорилирование MAPK p38 или JNK-киназами уровня выше MKK6 или MKK4. Kuma обсуждает возможность того, что конформационные изменения, вызванные связыванием
- 1 034927 ингибитора с белком МАРК, могут влиять на структуру как его сайта фосфорилирования, так и сайта причаливания для активатора уровня выше, посредством чего ухудшается фосфорилирование MAPK p38 или JNK.
Полагают, что MAP-киназа p38 играет основную роль во многих сигнальных путях, которые вовлечены в инициацию и поддержание хронического постоянного воспаления при заболевании человека, например, при тяжелой астме и при COPD (Chung F., Chest, 2011, 139(6), 1470-1479). Теперь имеется достаточно литературных источников, в которых показано, что MAP-киназа p38 активируется рядом провоспалительных цитокинов, и что ее активация приводит к рекрутменту и высвобождению дополнительных провоспалительных цитокинов. Например, Smith описывает ингибирующее действие ингибиторов MAPкиназы p38 на высвобождение TNFa из человеческих РВМС. Однако продуцирование некоторых цитокинов (IL-8 и GM-CSF) макрофагами ткани легких, выделенными у курящих и бывших курящих, является относительно интенсивным для ингибиторов MAPK p38a/3, и Smith предполагает, что распространенность MAPK-δ p38, экспрессированной в таких клетках, может отвечать за ослабленное действие соединений (Smith et al., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404). Risco et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, 109, 11200-11205) использовали мышей, нокаутированных по гену MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38, для исследования роли этих изоформ p38 в метаболических путях, регулирующих продуцирование цитокинов макрофагами. В этих исследованиях установлено, что для мышей обе киназы являются существенными для естественных иммуновоспалительных реакций, включая продуцирование провоспалительных цитокинов. Позднее Criado G. et al. (Arthritis Rheum., 2014, 66(5), 1208-17) показали, что на мышиной модели воспалительного артрита сниженная тяжесть заболевания у мышей p38','/<5-/- ассоциируется с более низкими продуцированием цитокинов и иммунологической активацией, чем у нормальных контрольных мышей, что показывает, что MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38 являются ключевыми регуляторами патологии воспаления суставов. Такие результаты предполагают, что кроме MAPK-α p38, MAPK-γ p38 и MAPK-δ p38 являются потенциальными терапевтическими мишенями при сложных заболеваниях, которые включают врожденные и адаптивные иммунные реакции, таких как COPD.
Применение ингибиторов MAP-киназы p38 при лечении хронической обструктивной болезни легких (COPD) также исследовано. Показано, что низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на MAPKα/β p38 являются эффективными при уменьшении различных параметров воспаления в клетках и в тканях, полученных от пациентов с COPD, которые вообще нечувствительны к кортикостероидам (Smith S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404), а также у различных животных моделей in vivo (Underwood
D.C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279, L895-902; Nath P. et al., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544, 160-167). Irusen с сотрудниками также предположили возможное вовлечение MAPK-α/β p38 в нечувствительность к кортикостероидам через уменьшение аффинности связывания глюкокортикоидного рецептора (GR) в ядрах (Irusen E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109, 649-657). Описан клинический опыт с рядом ингибиторов MAP-киназы p38, включая AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 и SCIO323 (Lee M.R. and Dominguez С., Current Med. Chem., 2005, 12, 2979-2994).
COPD представляет собой состояние, при котором, как сообщается, лежащее в основе воспаление, по существу, резистентно к противовоспалительному действию вдыхаемых кортикостероидов. Следовательно, всеобщей стратегией лечения COPD могла бы быть разработка вмешательства, которое имеет как собственное противовоспалительное действие, так и способность повышать чувствительность тканей легких пациентов с COPD к вдыхаемым кортикостероидам. Последняя публикация Mercado (Mercado N. et al., Mol. Pharmacol., 2011, 80(6), 1128-1135) показывает, что сайленсинг MAPK-γ p38 имеет потенциал для восстановления чувствительности к кортикостероидам. Также сообщается, что MAPK-α p38 (Mercado N. et al., PLoS ONE, 2012, 7(7), e41582, 1-9) и JNK (Papi et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2013, 132, 10751085) имеют роли в регуляции нечувствительности к кортикостероидам, и Armstrong et al. (JPET, 2011, 338, 732-740) показали, что ингибитор смешанных изоформ p38 BIRB-796 и кортикостероид дексаметазон имеют синергичное противовоспалительное действие на альвеолярные макрофаги при COPD. Следовательно, для пациентов это может быть благоприятным при применении меньшего количества αспецифического ингибитора MAP-киназы p38 для лечения COPD и тяжелой астмы.
Многие пациенты с диагнозом астмы или COPD продолжают страдать от нерегулируемых симптомов и от обострений их состояния, что может привести к госпитализации. Это происходит несмотря на применение наиболее передовых доступных в настоящее время схем лечения, включающих комбинирование продуктов с вдыхаемым кортикостероидом и длительно действующего β-агониста. Данные, накопленные за последнее десятилетие, показывают, что неудача в попытке справляться с лежащим в основе воспалительным компонентом заболевания в легких является наиболее вероятной причиной того, что происходит обострение. Принимая во внимание установленную эффективность кортикостероидов как противовоспалительных средств и, в частности, вдыхаемых кортикостероидов, при лечении астмы, такие результаты побуждают к интенсивному исследованию. Проведенные исследования показали, что некоторые вредные факторы окружающей среды вызывают в легких пациентов изменения, нечувствительные к кортиокстероидам. Примером является реакция на вирусопосредованные инфекции верхних дыхательных путей (URTI), которая имеет особое значение в возрастании заболеваемости, связанной с астмой и COPD.
- 2 034927
Эпидемиологические исследования показали прочную связь с инфекциями верхних дыхательных путей и значимым процентом обострений, от которых страдают пациенты, уже имеющие диагноз хронических респираторных заболеваний. Некоторые из наиболее впечатляющих данных в этом отношении происходят из длительных исследований детей, страдающих от астмы (Papadopoulos N.G. et al., Paediatr. Respir. Rev., 2004, 5(3), 255-260). Ряд дополнительных исследований подтверждает вывод, что вирусная инфекция может ускорять обострения и повышать тяжесть заболевания. Например, сообщается, что экспериментальные клинические заражения риновирусом вызывали бронхиальную гиперреактивность на гистамин у астматиков, которая нечувствительна к лечению кортикостероидами (Grunberg K. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 164(10), 1816-1822). Другие подтверждения получают из связи, наблюдаемой между обострениями заболевания у пациентов с муковисцидозом и заражениями HRV (Wat D. et al., J. Cyst. Fibros., 2008, 7, 320-328). С этим массивом данных также согласуется открытие, что респираторные вирусные инфекции, включая ретровирусные, представляют собой объективный фактор риска, который отрицательно коллерирует с 12-месячным коэффициентом выживания реципиентов при педиатрической пересадке легких (Liu M. et al., Transpl. Infect. Dis., 2009, 11(4), 304-312).
TLR3 является эндосомным рецептором распознавания патогенных образцов, который воспринимает вирусную дцРНК, которая продуцируется во время заражения вирусом. В клетках бронхиального эпителия человека (BEAS2B) путь TLR3 активируется в ответ на риновирусную инфекцию (RV1B и RV39) (Wang et al., J. Immunol., 2009, 183, 6989-6997). Вдыхаемая дцРНК и вирусная инфекция вызывают нейтрофильное обострение у мышей с аллергией с установленной экспериментальной астмой (MahmutovicPersson et al., Allergy, 2014, 69(3), 348-358). На модели аллергической астмы зараженные риновирусом TLR3-нокаутированные мыши показывают уменьшенную инфильтрацию нейтрофилов и макрофагов в легкие и существенно меньшее воспаление дыхательных путей при сравнении с TLR3-положительными контрольными животными (Wang Q. et al., PLoS Pathog., 7(5), e1002070). Все вместе такие наблюдения предполагают, что активация пути TLR3 вероятно играет важную роль в развитии воспаления дыхательных путей и обострениях респираторного заболевания в ответ на опосредованные риновирусом инфекции дыхательных путей.
Показано, что в зараженных риновирусом клетках человека активация TLR3 включает рекрутмент рецепторов и активацию с^ст-киназы, которая опосредует несколько следующих клеточных эффектов. Появилось небольшое число исследований, в которых связываются активация клеточных киназ семейства Src (Src1 или p60-Src) со специфическими реакциями после заражения вирусами. Они включают сообщение, что аденовирус выявляет опосредуемую киназой Р13 активацию Akt через c-Scr-зависимый механизм. Сообщается, что активность Syk-киназы регулируется c-Scr как киназой уровня выше при заражении HRV (Lau et al., J. Immunol., 2008, 180, 870-880). Также предполагается, что вызываемое риновирусом-39 продуцирование IL-8 в эпителиальных клетках зависит от активации Scr-киназы (Bentley J.K. et al., J. Virol., 2007, 81, 1186-1194). Наконец, предполагается, что активация Scr-киназы вовлекается в индукцию продуцирования муцина риновирусом-14 в эпителиальных клетках и подслизистых железах (Inoue D. et al., Respir. Physiol. Neurobiol., 2006, 154 (3), 484-499).
Ранее раскрыто, что соединения, которые ингибируют p59-HCK, эффективны против репликации вирусов гриппа (Charron C.E. et al., WO 2011/070369). Некоторые ингибиторы MAPK p38 также описываются как ингибиторы репликации респираторно-синцитиального вируса (Cass L. et al., WO 2011/158039).
По причинам, перечисленным выше, ожидается, что соединения, созданные для лечения хронических респираторных заболеваний, которые объединяют ингибирование киназ c-Scr и p59-HCK с ингибированием MAPK p38, будут особенно эффективными.
Кроме исполнения ключевых ролей в событиях передачи сигналов клеткой, которые регулируют активность провоспалительных путей, ферменты киназы теперь также узнаются как регулирующие активность ряда клеточных функций. Среди функций, которые обсуждались в последнее время, находятся функции сохранения целостности ДНК (Shilo Y., Nat. Rev. Cancer, 2003, 3, 155-168) и координации комплексных процессов деления клеток. Иллюстрацией последних открытий является публикация, в которой описывается влияние набора ингибиторов, действующих на так называемые киназы Olaharsky, на частоту образования микроядер in vitro (Olaharsky A.J. et al., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446). Образование микроядер вовлечено в или ассоциируется с нарушением митотических процессов и, следовательно, является нежелательным проявлением потенциальной токсичности. Обнаружено, что ингибирование киназы 3а-гликогенсинтазы (GSK3a) является существенным фактором, который повышает вероятность образования микроядер, промотируемого ингибитором киназы (Tighe A. et al., ВМС Cell Biology, 2007, 8:34).
Может быть возможным смягчение вредного действия, возникающего при взаимодействиях лекарственного средства с киназами Olaharsky, такими как GSK3a, путем оптимизации дозы и/или изменения пути введения. Однако более выгодной могла бы быть идентификация терапевтически полезных молекул, которые показывают низкую или недетектируемую активность против таких ферментов немишеней и, следовательно, добиваются незначительного или отсутствия нарушения митотоксических процессов
- 3 034927 при измерениях в анализах митоза.
Из обзора литературы, цитированной в настоящем описании выше, очевидно, что остается потребность в идентификации и разработке новых ингибиторов MAP-киназы p38, которые имеют улучшенный терапевтический потенциал по сравнению с доступными в настоящее время лечениями. Нужными являются такие соединения, которые показывают превосходный терапевтический индекс за счет проявления действия, по меньшей мере, равно эффективного действию предыдущих средств, но в одном или нескольких отношениях являются менее токсичными в релевантной терапевтической дозе. Поэтому целью настоящего изобретения является такое новое соединение, которое ингибирует ферментативную активность MAP-киназы p38, например, со специфичностью в отношении некоторых подтипов (особенно α и γ), а также ингибирующее ферментативную активность тирозинкиназ семейства Src (таких как p59-HCK и особенно c-Src), обладающее за счет этого хорошими противовоспалительными свойствами, и подходящее для применения в терапии. Соединение по изобретению показывает слабую активность или отсутствие активности ингибирования киназ Olaharsky, таких как GSK3a, и проявляет слабую активность или отсутствие активности ингибирования SYK-киназы, которая вносит вклад в ожидаемый благоприятный профиль безопасности.
Сущность изобретения
Согласно изобретению представляется соединение формулы (I)
Ме (|) или его фармацевтически приемлемая соль.
Соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемыми солями иногда в настоящем описании называется соединением по настоящему изобретению или похоже.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан ИК-спектр (microATR) образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2;
на фиг. 2 - дифрактограмма образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2; на фиг. 3 - дифрактограмма образца соли малеата соединения формулы (I), форма 1; на фиг. 4 - кривая ДСК образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2; на фиг. 5 - кривая ТГА образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2;
на фиг. 6 - перекрывание DVS образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2; на фиг. 7 - график кинетики DVS образца соли малеата соединения формулы (I), форма 2;
на фиг. 8 - результат проверки химической устойчивости различных композиций, содержащих соединение по изобретению (формы свободного основания и соли малеата);
на фиг. 9 - действие испытываемых соединений на риновирусиндуцированное высвобождение IL-8 в клетках BEAS2B.
Подробное описание изобретения
Соединение формулы (I) можно получить или использовать в форме фармацевтически приемлемой соли, включая терапевтически активные нетоксичные соли присоединения кислот, которые соединение формулы (I) способно образовывать. Такие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот обычно можно получить путем обработки формы свободного основания соответствующими кислотами в подходящем растворителе или смеси растворителей. Соответствующие кислоты включают, например, неорганические кислоты, такие как галогеноводородные кислоты, например хлороводородная или бромоводородная кислота, серная, азотная, фосфорная кислоты и т.п.; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, пропановая, гидроксиуксусная, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памовая кислота и т.п. Предпочтительно соединение формулы (I) используют в форме соли малеата. Наоборот, указанные солевые формы можно превратить в форму свободного основания путем обработки подходящим основанием.
Настоящее изобретение распространяется на все стереоизомеры соединения формулы (I). Термин стереоизомеры, используемый в настоящем описании, относится к изомерным молекулам, которые имеют одинаковые молекулярные формулы и последовательность соединенных атомов (строение), но которые различаются только по трехмерным ориентациям своих атомов в пространстве.
Предполагается, что используемое в настоящем описании определение соединения формулы (I) включает все таутомеры указанных соединений и сольваты указанных соединений (включая сольваты солей указанных соединений), если контекст не указывает конкретно иное. Примеры сольватов включают гидраты.
- 4 034927
Настоящее изобретение распространяется на пролекарства соединения формулы (I), иначе говоря, на соединения, которые разрушаются и/или метаболизируют in vivo с образованием активного соединения формулы (I).
В другом аспекте изобретение относится к одному или нескольким метаболитам соединения формулы (I), в частности метаболиту, который сохраняет одну или больше терапевтических активностей соединения формулы (I). Метаболит, как используется в настоящем описании, представляет собой соединение, которое образуется in vivo при метаболизме соединения формулы (I), такое как, без ограничения, окислительные метаболиты и/или метаболиты, образовавшиеся, например, при O-деалкилировании.
Раскрытое соединение включает соединение, в котором конкретный атом является встречающимся в природе или невстречающимся в природе изотопом. Так, раскрытое соединение включает, например, дейтерийсодержащие соединения и подобные соединения.
Раскрытие также распространяется на все полиморфные формы соединений, определенных в на стоящем описании.
Первый способ получения соединения формулы (I) или его защищенного производного включает взаимодействие соединения формулы (II)
Ме или его содержащего защитную группу производного, где в указанной формуле LG1 представляет собой удаляемую группу, с соединением формулы (III)
или его содержащим защитную группу производным;
и, необязательно, удаление защитной группы из продукта с образованием соединения формулы (I).
В соединениях формулы (II) примеры удаляемой группы LG включают галоген (в особенности Cl, Br) и арилокси, в особенности фенокси.
Подходящие защитные группы и способы их удаления описаны ниже.
Подходящие условия взаимодействия соединений формулы (II) и соединений формулы (III) включают обработку смеси (II) и (III) в подходящем растворителе, таком как ТГФ, DCM или изопропилацетат, триэтиламином или основанием Хунига и нагревание реакционной смеси до такой температуры, как 40°C.
Второй способ получения соединения формулы (I) включает взаимодействие соединения формулы (IV)
Me или его содержащего защитную группу производного, с соединением формулы (V)
где LG2 представляет собой удаляемую группу, такую как галоген, в особенности Cl, или его содержащим защитную группу производным, и, необязательно, удаление защитной группы из продукта с образованием соединения формулы (I).
- 5 034927
Подходящие защитные группы и способы их удаления описаны ниже.
Подходящие условия взаимодействия соединений формулы (IV) и соединений формулы (V) включают условия, которые обычно используют для реакции Бухвальда, т.е. обработку раствора (IV) и (V) в растворителе, таком как 1,4-диоксан, источником палладия и лигандом, такими как Pd2(dba)3 и BINAP, и основанием, таким как трет-бутоксид натрия или карбонат цезия, при повышенной температуре.
Другие лиганды включают дифенилфосфинферроцен и трифенилфосфин; другие источники палладия включают ацетат палладия(П) и тетракис(трифенилфосфин)палладий(0); другие основания включают бис(триметилсилил)амид лития и фосфат калия; другие растворители включают ТГФ и толуол. В отношении более широкого ряда условий см. Surry D.S., Buchwald S.L. (2008), Biaryl Phosphane Ligands in Palladium-Catalyzed Amination, Angew. Chem. Int. Ed., 47, 6338-6361 и ссылки в указанной работе.
Соединения формулы (II) можно получить взаимодействием соединения формулы (VI)
NH2 (VI)
Me с соединением формулы LG1C(=O)LG3, где галоген, в особенности Cl.
LG3 представляет собой удаляемую группу, такую как
Подходящие условия для взаимодействия соединения формулы (VI) с соединением формулы LG1C(=O)LG3, где LG1 представляет собой PhO, и LG3 представляет собой Cl, включают обработку смеси раствора соединения формулы (VI) в таком растворителе, как изопропилацетат, и водного раствора неорганического основания, такого как карбонат натрия, фенилхлорформиатом.
Соединения формулы (VI) известны или могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники.
Первый способ получения соединения формулы (III) включает восстановление соединения формулы (VII)
Подходящие условия для восстановления соединения формулы (VII) включают обработку газом во дородом над катализатором платина-на-углероде. Такую реакцию можно осуществить при повышенном давлении в растворителе, таком как ТГФ, подкисленном уксусной кислотой. С другой стороны, ее можно выполнить в растворителе, таком как смесь DCM/MeOH, в условиях потока с использованием газогенератора H-cube.
Второй способ получения соединения формулы (III) включает удаление защитной группы из соединения формулы (VIII)
в которой P1 представляет собой аминозащитную группу.
Подходящие защитные группы и способы их удаления описаны ниже.
Наиболее подходящей защитной группой является Boc, которую можно удалить обработкой кислотой, такой как ТФК или HCl.
Первый способ получения соединения формулы (VII) включает взаимодействие соединения формулы (IX)
- 6 034927 с соединением формулы (X)
в которой Hal представляет собой галоген, в особенности Cl.
Подходящие условия для взаимодействия соединений формул (IX) и (X) включают условия, указанные выше для взаимодействия соединений формул (IV) и (V).
Второй способ получения соединения формулы (VII) включает взаимодействие соединения формулы (XI)
(XI) в которой Hal представляет собой галоген, в особенности Cl, с соединением формулы (XII)
Подходящие условия для взаимодействия соединений формул (XI) и (XII) включают обработку раствора (XI) и (XII) в растворителе, таком как 1,4-диоксан, источником палладия и лигандом, такими как Pd2(dba)3 и BINAP, и основанием, таким как трет-бутоксид натрия или карбонат цезия, при повышенной температуре.
Первый способ получения соединения формулы (VIII) включает взаимодействие соединения формулы (XIII)
(XIII) с соединением формулы (X)
Hal
в которой Hal представляет собой галоген, в особенности Cl.
Подходящие условия для взаимодействия соединений формул (XIII) и (X) являются такими же, как условия, описанные выше для взаимодействия соединений формул (IX) и (X).
Второй способ получения соединения формулы (VIII) включает взаимодействие соединения формулы (XIV)
- 7 034927
в которой Hal представляет собой галоген, в особенности Cl, с соединением формулы (XII)
Подходящие условия для взаимодействия соединений формул (XIV) и (XII) являются такими же, как условия, описанные выше для взаимодействия соединений формул (XI) и (XII).
Соединения формулы (IX) можно получить так, как показано на схеме ниже.
(IX)
Реагенты для такого способа являются известными соединениями. Условия по Мицунобу включают обработку смеси фенола и спирта трифенилфосфином и диизопропилазодикарбоксилатом в растворителе, таком как ТГФ. О более широком ряде условий см. Swamy K.Q Kumar N.N.; Balaraman E.; Kumar K.V. (2009). Mitsunobu and Related Reactions: Advances and Applications, Chemical Reviews, 109(6): 25512651 и ссылки в указанной работе.
Соединения формулы (XI) можно получить так, как показано на схеме ниже.
(XI)
Реагенты для такого способа являются известными соединениями. Условия по Мицунобу включают условия, указанные выше.
Соединения формулы (XIII) можно получить так, как показано на схеме ниже.
(XIII) где LG4 представляет собой удаляемую группу, такую как галоген, в особенности Cl.
Реагенты для такого способа являются известными соединениями. Условия алкилирования включают обработку смеси фенола и алкилгалогенида основанием, таким как карбонат цезия или калия, в растворителе, таком как ацетонитрил или ДМФА, необязательно, при повышенной температуре.
Соединения формулы (XIV) можно получить так, как показано на схеме ниже.
(XIV) где LG5 представляет собой удаляемую группу, такую как указанные выше для LG4.
Реагенты для такого способа являются известными соединениями. Условия алкилирования вклю
- 8 034927 чают условия, указанные выше.
Соединения формул (IV), (V), (VI), (X) и (XII) или являются известными или могут быть получены способами, известными специалисту. В отношении соединения формулы (IV), см., например, WO 2010/067131 и конкретно соединение, структура которого упоминается как промежуточное соединение A. В отношении соединения формулы (VI), см., например, WO 00/043384 и конкретно соединение формулы LXVII.
Явно устойчивую кристаллическую несольватированную форму формы свободного основания соединения по изобретению можно получить перекристаллизацией из раствора (предпочтительно горячего, например температуры образования флегмы) в ацетонитриле. В случае получения другой формы такую форму можно получить суспендированием в ацетонитриле.
Как отмечалось выше, соль малеат является формой соединения по изобретению, представляющей особый интерес. Соль малеат можно получить путем обработки формы свободного основания соединения по изобретению малеиновой кислотой в подходящем растворителе.
В предпочтительном способе соль малеат получают обработкой раствора соединения по изобретению в 2-бутаноне раствором малеиновой кислоты в 2-бутаноне. Допускают протекание кристаллизации, которой можно способствовать, добавляя затравочный кристалл. Таким путем получают соль малеат в виде ее кристаллического полиморфа формы 2. Кристаллический полиморф формы 2 также можно получить путем охлаждения горячего раствора соли малеата соединения по изобретению в 2-бутаноне, например, от 50°C до комнатной температуры. Допускают протекание кристаллизации, которой можно способствовать, добавляя затравочный кристалл.
Кристаллический полиморф формы 2 соли малеата соединения по изобретению характеризуется наличием положений пиков на порошковой дифрактограмме при 4,2, 8,4, 8,7, 11,0, 11,5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 17,4, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 и 26,3 (±0,2)° 2Θ (см. фиг. 2). Пики (дублет) при 8,4 и 8,7 (±0,2)° 2Θ являются особенно характерными для кристаллического полиморфа формы 2, так как пики в указанных положениях отсутствуют на дифрактограммах кристаллического полиморфа формы 1.
Кристаллический полиморф формы 2 имеет высокую температуру плавления (приблиз. 199°C) с пластинчатоподобной морфологией.
После перекристаллизации из ТГФ идентифицирована другая кристаллическая форма соли малеата соединения по изобретению, которая имеет менее благоприятные свойства, чем свойства формы 2. Она имеет иглоподобную морфологию и более низкую температуру плавления - приблиз. 148°C. Эта кристаллическая форма названа формой 1.
Кристаллический полиморф формы 1 соли малеата соединения по изобретению характеризуется наличием положений пиков на порошковой дифрактограмме при 3,8, 6,3, 7,8, 9,3, 9,9, 10,7, 11,2, 12,7,
15.4, 16,5, 17,9, 19,2 и 19,6 (±0,2)° 2Θ (см. фиг. 3). Пики при 6,3, 7,8 и 9,9 (±0,2)° 2Θ являются особенно характерными для кристаллического полиморфа формы 1, так как пики в указанных положениях отсутствуют на дифрактограммах кристаллического полиморфа формы 2.
Таким образом, полиморф формы 2 характеризуется наличием дифрактограммы, содержащей 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или предпочтительнее 19 положений пиков, выбранных из 4,2, 8,4, 8,7, 11,0,
11.5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 17,4, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 и 26,3 (±0,2)° 2Θ, предпочтительно включающей пики при 8,4 и 8,7 (±0,2)° 2Θ и не включающей пики при 6,3, 7,8 и 9,9 (±0,2)° 2Θ.
В отношении фиг. 2 и 3 следует иметь в виду, что вариации интенсивности на дифрактограммах могут происходить из-за процессов, которые влияют на интенсивность, таких как история обработки образца.
Соли соединения по изобретению, которые являются кристаллическими, но представляют меньший интерес, чем соль малеат, включают соли гидробромид, фосфат, тартрат, фумарат и мезилат.
Могут потребоваться защитные группы для защиты химически чувствительных групп во время одной или нескольких реакций, описанных выше, для того, чтобы гарантировать, что процесс является эффективным. Так, если желательно или необходимо, промежуточные соединения (включая соединения формул (II)-(V), описанные выше, а также соединения формул (VI)-(XIV)) могут быть защищены путем применения обычных защитных групп. Защитные группы и способы их удаления описаны в Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540. Так, примеры аминозащитных групп включают группу Boc, которую можно удалить ТФК, и примером защитных групп для спиртовых групп является ТНР, которую можно удалить HCl.
Соединения формулы (III) (вместе с их производными, в которых аминогруппа защищена, такими как соединение формулы (VIII)) и соединение формулы (VII) являются новыми. Эти новые соединения вместе с их солями (включая фармацевтически приемлемые соли) заявляются как аспекты изобретения.
Соединение формулы (I) является ингибитором MAP-киназы p38 (в частности, подтипа α), и в одном аспекте соединение по настоящему изобретению предлагается для применения в качестве лекарственного средства, например, при лечении воспалительных заболеваний, например COPD и/или астмы.
Ожидается, что соединение формулы (I) будет эффективным in vivo.
Типично соединения известного уровня техники, разработанные до настоящего времени, предна
- 9 034927 значились для перорального введения. Такая стратегия включает оптимизацию фармакокинетического профиля лекарственных веществ для того, чтобы достичь адекватной длительности действия. В таком случае устанавливают достаточно высокую концентрацию лекарственного средства и поддерживают между дозами для обеспечения пролонгированного клинического благоприятного действия. Неизбежным следствием такого подхода является то, что все ткани организма, в особенности печень и кишечник, вероятно подвергаются воздействию терапевтически сверхактивных концентраций лекарственного средства, наносят ли они или нет вред заболеванию, от которого лечат.
Альтернативной стратегией является создание примеров лечения, в которых лекарственное средство подается непосредственно в воспаленный орган, т.е. использование топического введения. Хотя такой подход не подходит для всех хронических воспалительных заболеваний, его используют при легочных расстройствах, таких как астма и COPD; при кожных болезнях, например, против атопического дерматита и псориаза; для назальных состояний, типичным примером которых является аллергический ринит; и при желудочно-кишечных заболеваниях, таких как неспецифический язвенный колит, IBD и болезнь Крона, и воспалительных заболеваниях глаз, таких как увеит.
При топической терапии одним из способов достижения эффективности является использование лекарственного средства, которое имеет пролонгированное действие и сохраняется в релевантном органе, посредством чего минимизируется опасность системной токсичности. С другой стороны, в некоторых случаях можно разработать препарат, который генерирует резервуар активного лекарственного средства, которое доступно для пролонгирования его нужного действия. Примером первого подхода является антихолинергическое лекарственное средство тиотропий (Spiriva). Такое соединение вводят местно в легкие как лечение в случае COPD, и оно имеет исключительно высокую аффинность к его рецепторумишени, что приводит к очень низкой скорости высвобождения и впоследствии отображает пролонгированное действие.
В одном аспекте раскрытия соединение формулы (I) является особенно подходящим для топической доставки, такой как топическая доставка в легкие, в частности, для лечения респираторного заболевания, например респираторных заболеваний, таких как COPD и/или астма.
В одном воплощении соединение формулы (I) подходит для сенсибилизации пациентов для лечения кортикостероидом, которые стали резистентными к таким схемам лечения.
Соединение формулы (I) может иметь противовирусные свойства, например способность предотвращать заражение клеток (таких как клетки респираторного эпителия) пикорнавирусом, в частности риновирусом, вирусом гриппа или респираторным синцитиальным вирусом.
Таким образом, полагают, что соединения являются противовирусными средствами, в частности, подходящими для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности пикорнавирусных инфекций, таких как риновирусная инфекция, грипп или заражение респираторным синцитиальным вирусом.
В одном воплощении соединение формулы (I) способно уменьшить воспаление, вызванное вирусной инфекцией, такой как риновирусная инфекция и, в частности, вирусные инфекции, которые приводят к высвобождению цитокинов, таких как IL-8, в особенности in vivo. Такую активность можно, например, проверить in vitro с использованием анализа риновирусиндуцированного IL-8, как описано в настоящем описании в примерах.
В одном воплощении соединение формулы (I) способно уменьшить риновирусиндуцированную экспрессию ICAM1, в особенности in vivo. ICAM1 представляет собой рецепторный механизм, используемый так называемыми major groove серотипами вирусов для заражения клеток. Такую активность можно измерить, например, способом, описанным в настоящем описании в примерах.
Предполагается, что описанные выше свойства сделают соединение формулы (I) особенно подходящим для применения при лечении (включая профилактику) обострений воспалительных заболеваний, в частности вирусных обострений, или при лечении вирусных инфекций у пациентов с одним или несколькими хроническими состояниями, такими как застойная сердечная недостаточность, COPD, астма, диабет, рак, и/или у пациентов с угнетенным иммунитетом, например, после трансплантации органа. Такое применение может состояться в комбинации с противовирусными средствами, такими как занамивир, озельтамивир (например, озельтамивира фосфат), перамивир или ланинамивир.
Вообще соединение формулы (I) можно применять при лечении одного или нескольких состояний с воспалительной компонентой, которые соответственно можно лечить топической или локальной терапией.
В частности, соединение формулы (I) можно применять при лечении одного или нескольких респираторных расстройств, включая COPD (включая хронический бронхит и эмфизему), астму, детскую астму, муковисцидоз, саркоидоз, идиопатический фиброз легких, аллергический ринит и синусит, в особенности астму или COPD (включая хронический бронхит и эмфизему).
Таким образом, соединение формулы (I) можно применять при лечении воспаления легких (и его симптомов) у субъектов, страдающих от муковисцидоза.
Соединение формулы (I) можно применять при лечении болезней или расстройств глаз, включая сухой кератоконъюнктивит (сухой глаз), аллергический конъюнктивит, конъюнктивит, диабетическую ретинопатию, макулярный отек (включая влажный макулярный отек и сухой макулярный отек), послеоперационное воспаление катаракты или, в частности, увеит (включая задний, передний увеит и панувеит).
- 10 034927
Соединение формулы (I) можно применять при лечении кожных болезней или расстройств, включая аллергический дерматит, контактный дерматит, атопический дерматит или псориаз.
Соединение формулы (I) можно применять при лечении желудочно-кишечных заболеваний или расстройств, включая неспецифический язвенный колит, IBD или болезнь Крона.
Соединение формулы (I) можно применять при лечении заболеваний или расстройств суставов, включая ревматоидный артрит или остеоартрит, и особенно воспалений суставов, вторичных к таким состояниям.
Соединение формулы (I) можно применять при лечении онкозаболеваний желудка и при ингибировании роста и метастазирования опухолей, включая онкозаболевания легких, такие как не-мелкоклеточный рак легких, рак желудка, колоректальные онкозаболевания и злокачественную меланому.
Также предполагается, что соединение формулы (I) можно применять при лечении некоторых других состояний, включая периодонтит, гингивит и фарингит.
Соединение формулы (I) также может вернуть сенсибилизированное состояние пациента для лечения кортикостероидом, когда состояние пациента становится резистентным к такому лечению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение согласно раскрытию необязательно в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми разбавителями или носителями.
Разбавители или носители могут включать разбавители или носители, подходящие для парентерального, перорального, топического, мукозального и ректального введения.
Настоящее изобретение также относится к способу получения такой фармацевтической композиции (например, фармацевтической композиции для парентерального, перорального, топического, мукозального или ректального введения), причем указанный способ включает смешивание ингредиентов.
Как упоминалось выше, такие композиции можно получить, например, для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, интраартикулярного или периартикулярного введения, в частности, в форме жидких растворов или суспензий; для перорального введения, в частности, в форме таблеток или капсул или в форме жидких растворов или суспензий; для топического, например, легочного или интраназального введения, в частности, в форме порошков, водных растворов или суспензий, капель в нос или водных или неводных аэрозолей, и для трансдермального введения, например, в форме пэтчей, кремов, мазей; для мукозального введения, например, в буккальную, сублингвальную или вагинальную слизистую оболочку и для ректального введения, например, в форме суппозитория, крема или пенки.
Композиции обычно можно вводить в стандартных или многодозовых лекарственных формах и можно получить любым из способов, хорошо известных в области фармации, например, как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Препараты для парентерального введения могут содержать эксципиенты, стерильную воду или физиологический раствор, алкиленгликоли, такие как пропиленгликоль, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрированные нафталины и т.п. Препараты для назального введения могут быть твердыми и могут содержать эксципиенты, например лактозу или декстран, или могут представлять собой водные или масляные растворы или суспензии для применения в форме капель в нос или дозированных спреев. Для трансбуккального введения типичные эксципиенты включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, предварительно желатинизированный крахмал и т.п.
Композиции, подходящие для перорального введения, могут включать один или несколько физиологически совместимых носителей и/или эксципиентов и могут находиться в твердой или жидкой форме. Таблетки и капсулы могут быть получены со связующими веществами, например сиропом, аравийской камедью, желатином, сорбитом, трагакантом или поливинилпирролидоном; наполнителями, такими как лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; лубрикантами, такими как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или диоксид кремния; и поверхностно-активными веществами, такими как лаурилсульфат натрия. Жидкие композиции могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие вещества, например сорбитовый сироп, метилцеллюлозу, сахарный сироп, желатин, карбоксиметилцеллюлозу или съедобные жиры; эмульгаторы, такие как лецитин или аравийская камедь; растительные масла, такие как миндальное масло, кокосовое масло, жир печени трески или арахисовое масло; консерванты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Жидкие композиции могут быть инкапсулированы, например, в желатине для обеспечения стандартной лекарственной формы.
Твердые пероральные лекарственные формы включают таблетки, капсулы с твердой оболочкой из двух частей и мягкие эластичные желатиновые (SEG) капсулы.
Сухая оболочка типично включает желатин в концентрации приблизительно 40-60%, мас./мас., пластификатор (такой как глицерин, сорбит или пропиленгликоль) в концентрации приблизительно 20-30% и воду в концентрации приблизительно 30-40%. Также могут присутствовать другие материалы, такие как консерванты, красители, замутнители и корригенты. Жидкий наполняющий материал включает твердое лекарственное вещество, которое растворено, солюбилизировано или диспергировано (с помощью таких суспендирующих веществ, как пчелиный воск, гидрированное касторовое масло или полиэтиленг
- 11 034927 ликоль 4000), или жидкое лекарственное средство в средах или комбинациях сред, таких как минеральное мало, растительные масла, триглицериды, гликоли, полиолы и поверхностно-активные вещества.
Соответственно соединение формулы (I) вводят топически в легкие, глаза или кишечник. Следовательно, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по настоящему изобретению необязательно в комбинации с одним или несколькими топически приемлемыми разбавителями или носителями.
Топического введения в легкие можно достичь с использованием аэрозольного препарата. Аэрозольные препараты типично включают активный ингредиент, суспендированный или растворенный в подходящем для аэрозоля пропелленте, таком как хлорфторуглерод (CFC) или гидрофторуглерод (HFC). Подходящие CFC пропелленты включают трихлормонофторметан (пропеллент 11), дихлортетрафторметан (пропеллент 114) и дихлордифторметан (пропеллент 12). Подходящие HFC пропелленты включают тетрафторэтан (HFC-123a) и гептафторпропан (HFC-227).
Пропеллент типично составляет 40-99,5 мас.%, например 40-90 мас.%, всей композиции для ингаляции. Препарат может включать эксципиенты, включая сорастворители (например, этанол) и поверхностно-активные вещества (например, лецитин, триолеат сорбитана и т.п.). Другие возможные эксципиенты включают полиэтиленгликоль, поливинипирролидон, глицерин и т.п. Аэрозольные препараты упаковывают в контейнеры и подходящую дозу доставляют с помощью мерного клапана (например, поставляемого Bespak, Valiis или 3M, или, с другой стороны, Aptar, Coster или Vari).
Топического ввеления в легкие можно также достичь с использованием препаратов без давления, таких как водный раствор или суспензия. Их можно вводить с помощью небулайзера, например небулайзера, который может быть ручным и портативным или для использования дома или в больнице (т.е. непортативным). Препарат может включать эксципиенты, такие как вода, буферы, средства, регулирующие тоничность, средства, регулирующие pH, поверхностно-активные вещества и сорастворители. Суспензионные жидкие и аэрозольные препараты (под давлением или без давления) типично будут содержать соединение по изобретению в тонкоизмельченной форме, например, с D50 5-10 мкм, например, порядка 1-5 мкм. Распределение частиц по размерам можно представить с использованием величин D10, D50 и D90. Медианное значение D50 в распределении частиц по размерам определяется как размер частиц в микронах, который делит распределение пополам. Измерение, полученное из лазерной дифракции, более точно описывается как распределение по объему, и, следовательно, значение D50, полученное с использованием такой процедуры, правильнее называть значением Dv50 (медиана распределения по объему). Используемые в настоящем описании значения Dv50 относятся к распределениям частиц по размерам, измеренным с использованием лазерной дифракции. Подобным образом, значения D10 и D90, используемые в контексте лазерной дифракции, берутся для обозначения значений Dv10 и Dv90 и относятся к размеру частиц, в соответствии с чем 10% распределения лежит ниже значения D10 и 90% распределения лежит ниже значения D90 соответственно.
Топического введения в легкие можно также достичь с использованием сухого порошкового препарата. Сухой порошковый препарат будет содержать соединение по раскрытию в тонкоизмельченной форме, типично с массовым медианным диаметром (MMAD) 1-10 мкм или D50 0,5-10 мкм, например приблизительно 1-5 мкм. Порошки соединения по изобретению в тонкоизмельченной форме можно получить способом микронизации или подобным способом уменьшения размеров. Микронизацию можно выполнить с использованием струйной мельницы, такой как изготовляемые Hosokawa Alpine. Полученное распределение частиц по размерам можно определить с использованием лазерной дифракции (например, с помощью прибора Malvern Mastersizer 2000S). Препарат типично будет содержать топически приемлемый разбавитель, такой как лактоза, глюкоза или маннит (предпочтительно глюкоза), обычно с частицами сравнительно крупного размера, например с массовым медианным диаметром (MMAD) 50 мкм или больше, например 100 мкм или больше, или D50 40-150 мкм. Используемый в настоящем описании термин лактоза относится к лактозосодержащему компоненту, включая моногидрат α-лактозы, моногидрат β-лактозы, безводную α-лактозу, безводную β-лактозу и аморфную лактозу. Лактозные компоненты могут быть переработаны микронизацией, просеиванием, помолом, прессованием, агломерацией или сушкой распылением. Также охватываются коммерчески доступные формы лактозы в различных формах, например продукты Lactohale® (лактоза сорта для ингаляции; DFE Pharma), InhaLac® 70 (просеяная лактоза для ингаляции сухого порошка; Meggle), фарматоза® (DFE Pharma) и респитоза® (просеяная лактоза сорта для ингаляции (DFE Pharma). В одном воплощении лактозный компонент выбирают из группы, состоящей из моногидрата α-лактозы, безводной α-лактозы и аморфной лактозы.
Предпочтительно лактоза представляет собой моногидрат α-лактозы.
Сухие порошковые препараты также могут содержать другие эксципиенты. Так, в одном волощении сухой порошковый препарат по настоящему раскрытию включает стеарат магния или кальция. Такие препараты могут иметь превосходную химическую и/или физическую устойчивость, особенно когда такие препараты также содержат лактозу.
Сухой порошковый препарат типично доставляют с использованием ингалятора для сухого порошка (DPI). Примеры систем доставки сухих порошков включают SPINHALER®, DISKHALER®, TUR
- 12 034927
BOHALER®, DISKUS®, SKYEHALER®, ACCUHALER® и CLICKHALER®. Другие системы доставки сухих порошков включают ECLIPSE, NEXT, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, MONODOSE, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIPTA, ингалятор для сухого порошка ORIEL, MICRODOSE, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR и PROHALER.
В одном воплощении соединение по настоящему изобретению предоставляется в виде микронизованного сухого порошкового препарата, например, включающего лактозу подходящего сорта.
Таким образом аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая соединение по изобретению в форме частиц в комбинации с частицами лактозы, причем указанная композиция необязательно включает стеарат магния.
В одном воплощении соединение по настоящему изобретению предоставляется в виде микронизованного сухого порошкового препарата, включающего лактозу подходящего сорта и стеарат магния, загруженный в устройство, такое как DISKUS. Соответственно, такое устройство является многодозовым устройством, например, препаратом наполняют блистеры для применения в многодозовом устройстве, таком как DISKUS.
В другом воплощении соединение по настоящему изобретению предоставляется в виде микронизованного сухого порошкового препарата, например, включающего лактозу подходящего сорта, загруженного в твердые капсулы, для примнения в однодозовом устройстве, таком как AEROLISER.
В другом воплощении соединение по настоящему изобретению предоставляется в виде микронизованного сухого порошкового препарата, включающего лактозу подходящего сорта и стеарат магния, загруженный в твердые капсулы, для применения в однодозовом устройстве, таком как AEROLISER.
В другом воплощении соединение по настоящему изобретению предоставляется в виде тонкого порошка для применения в лекарственной форме для ингаляции, где порошок представляет собой мелкие частицы с D50 0,5-10 мкм, например приблизительно 1-5 мкм, который получают способом уменьшения в размере иным, чем микронизация в струйной мельнице, например сушкой распылением, сушкой вымораживанием, микрофлюидизацией, гомогенизацией высокого давления, кристаллизацией из сверхкритических флюидов, ультразвуковой кристаллизацией или комбинацией таких способов или другими подходящими способами образования частиц, известными в технике, которые используются для получения тонких частиц с аэродинамическим размером частиц 0,5-10 мкм. Полученное распределение частиц по размерам можно определить с использованием лазерной дифракции (например, с помощью прибора Malvern Mastersizer 2000S). Частицы могут включать соединение или одно, или в комбинации с подходящими другими эксципиентами, которые могут способствовать переработке. Полученные мелкие частицы могут образовывать конечный препарат для доставки людям или в них, необязательно, могут быть включены дополнительные другие подходящие эксципиенты для облегчения доставки в приемлемой лекарственной форме.
Соединение по изобретению также можно вводить ректально, например, в форме суппозиториев или клизм, которые включают водные или масляные растворы, а также суспензий и эмульсий и пенок. Такие композиции получают, следуя стандартным процедурам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Например, суппозитории можно получить, смешивая активный ингредиент с обычной основой для суппозиториев, такой как масло какао или другие глицериды. В таком случае лекарственное средство смешивают с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такими материалами являются масло какао и полиэтиленгликоли.
Как правило, для композиций, предназначенных для топического введения в глаза в форме глазных капель или глазных мазей, общее количество соединения по настоящему изобретению будет составлять приблизительно от 0,0001 до менее 4,0% (мас./мас.).
Предпочтительно в случае топического введения в глаз композиции, вводимые согласно настоящему изобретению, будут составлены в виде растворов, суспензий, эмульсий и других лекарственных форм. Как правило, предпочтительны водные растворы на основании сущности композиции, а также возможности пациента легко вводить такие композиции, закапывая одну или две капли растворов в пораженные глаза. Однако композиции также могут представлять собой суспензии, вязкие или полувязкие гели или другие типы твердых или полутвердых композиций. Суспензии могут быть предпочтительны в случае соединений, которые плохо растворяются в воде.
Альтернативой введения в глаза является интравитреальная инъекция раствора или суспензии соединения по настоящему изобретению. Кроме того, соединение по настоящему изобретению также можно вводить с помощью глазных имплантов или вставок.
Композиции, вводимые согласно настоящему изобретению, также могут включать различные другие ингредиенты, включая, но не ограничиваясь указанным, тонические средства, буферы, поверхностноактивные вещества, стабилизирующий полимер, консерванты, сорастворители и вещества, придающие вязкость. Подходящие фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают соедине
- 13 034927 ние по изобретению в композиции с тоническим средством и буфером. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно необязательно включать поверхностно-активное вещество и/или паллиативное средство и/или стабилизирующий полимер.
Различные тонические средства можно использовать для регулирования тоничности композиции предпочтительно до тоничности натуральных слез в случае офтальмических композиций. Например, к композиции могут быть добавлены хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, хлорид кальция, простые сахара, такие как декстроза, фруктоза, галактоза, и/или простые полиолы, такие как сахарные спирты маннит, сорбит, ксилит, лактит, изомальтит, мальтит, и гидрогенизированные гидролизаты крахмала для приближения к физиологической тоничности. Так, количество тонического средства будет изменяться в зависимости от определенного средства, которое добавляют. Однако вообще композиции будут включать тоническое средство в количестве, достаточном для того, чтобы конечная композиция имела офтальмически приемлемую осмоляльность (как правило, приблизительно 150-450 мОсм, предпочтительно 250-350 мОсм и наиболее предпочтительно приблизительно 290 мОсм). Вообще тонические средства для изобретения будут присутствовать в интервале 2-4% мас./мас. Предпочтительные тонические средства для изобретения включают простые сахара или сахарные спирты, такие как D-маннит.
В композицию может быть добавлена подходящая буферная система (например, фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, борат натрия или борная кислота) для предотвращения изменения pH в условиях хранения. Конкретная концентрация будет изменяться в зависимости от используемого средства. Однако предпочтительно буфер будет выбираться для поддержания целевого pH в интервале pH 5-8 и предпочтительнее для целевого pH в интервале pH 5-7.
Поверхностно-активные вещества можно необязательно использовать для доставки более высоких концентраций соединения по настоящему изобретению. Поверхностно-активные вещества функционируют как солюбилизаторы соединения и стабилизаторы коллоидной дисперсии, такой как мицеллярный раствор, микроэмульсия, эмульсия и суспензия. Примеры поверхностно-активных веществ, которые можно необязательно использовать, включают полисорбат, полоксамер, полиозил 40 стеарат, полиоксиэтилированное касторовое масло, тилоксапол, тритон и монолаурат сорбитана. Предпочтительные поверхностно-активные вещества, используемые в изобретении, такие как тритон Х114 и тилоксапол, имеют гидрофильно/липофильный баланс ГЛБ в интервале 12,4-13,2 и приемлемы для офтальмического применения.
Дополнительными средствами, которые могут быть добавлены в офтальмические композиции соединений по настоящему изобретению, являются демульсенты, которые функционируют как стабилизирующий полимер. Стабилизирующий полимер должен представлять собой пример ионного/заряженного полимера с предпочтением для топического глазного применения, конкретнее, полимер, который несет отрицательный заряд на своей поверхности, который может проявлять зета-потенциал (-)10-50 мВ для физической устойчивости и способствует образованию дисперсии в воде (т.е. является водорастворимым). Предпочтительным стабилизирующим полимером для изобретения может быть полиэлектролит или полиэлектролиты, если их больше одного, из семейства сшитых полиакрилатов, таких как карбомеры и пемулен®, конкретно, карбомер 974р (полиакриловая кислота), при 0,1-0,5%, мас./мас.
Другие соединения также могут быть добавлены в офтальмические композиции соединения по настоящему изобретению для повышения вязкости носителя. Примеры средств, повышающих вязкость, включают, но не ограничиваются перечисленным, полисахариды, такие как гиалуроновая кислота и ее соли, хондроитина сульфат и его соли, декстраны, различные полимеры семейства целлюлоз, виниловые полимеры и полимеры акриловой кислоты.
Топические офтальмические продукты обычно упаковывают в многодозовой форме. Таким образом, требуются консерванты для предотвращения микробного загрязнения во время применения. Подходящие консерванты включают хлорид бензалкония, хлорбутанол, бромид бензододециния, метилпарабен, пропилпарабен, фенилэтиловый спирт, эденат динатрия, сорбиновую кислоту, поликватерний-1 или другие средства, известные специалистам в данной области техники. Такие консерванты обычно используют на уровне от 0,001 до 1,0% мас./об. Однодозовые композиции по настоящему изобретению будут стерильны, но обычно без консервантов. Следовательно, такие композиции обычно не будут содержать консерванты.
Практикующий врач или другой специалист сможет определить подходящую дозировку соединения по настоящему изобретению и, следовательно, количество соединения по изобретению, которое должно быть включено в любой фармацевтический препарат (в стандартной лекарственной форме или другой).
Соединение формулы (I) обладает терапевтической активностью. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к соединению, описанному в настоящем описании, для применения при лечении одного или нескольких вышеуказанных состояний.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения, описанного в настоящем описании, для изготовления лекарственного средства для лечения одного или нескольких вышеуказанных состояний.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения одного или нескольких вы
- 14 034927 шеуказанных состояний, который включает введение субъекту эффективного количества соединения по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, включающей соединение.
Предполагается, что термин лечение включает профилактику, а также лекарственное лечение. Лечение состояний или расстройств также включает лечение их обострений.
Соединение по настоящему изобретению также можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими активными ингредиентами, например активными ингредиентами, подходящими для лечения вышеуказанных состояний.
Например, возможные комбинации для лечения респираторных расстройств включают комбинации со стероидами (например, будезонидом, беклометазона дипропионатом, флутиказона пропионатом, мометазона фуроатом, флутиказона фуоратом, циклезонидом), β-агонистами (например, тербуталином, сальбутамолом, сальметеролом, формотеролом, вилантеролом, олодатеролом, индакатеролом, репротеролом, фенотеролом), ксантинами (например, теофилином), антихолинергическими средствами или мускариновыми антагонистами (например, ипратропием, тиотропием, аклидинием, умеклидинием или гликопирронием, например, в виде соли бромида), ингибиторами киназы P13 и противовирусными средствами (например, занамивиром, озельтамивиром, например, в виде фосфата, перамивиром и ланинамивиром).
Одно воплощение относится к соединению по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, вводимого в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными ингредиентами, например, выбранными из кортикостероидов, β-агонистов, ксантинов, мускариновых антагонистов и ингибиторов киназы P13. Соответственно, β-агонист представляет собой β-2-агонист.
В одном воплощении соединение по раскрытию вводят ингаляцией и кортикостероид вводят перорально или ингаляцией или в комбинации, или отдельно.
В одном воплощении соединение по раскрытию вводят ингаляцией и β-агонист вводят перорально или ингаляцией или в комбинации, или отдельно.
В одном воплощении соединение по раскрытию вводят ингаляцией и мускариновый антагонист вводят перорально или ингаляцией или в комбинации, или отдельно.
В одном воплощении соединение по раскрытию вводят ингаляцией или в комбинации, или отдельно с одним или несколькими средствами из кортикостероида, β-агониста и мускаринового антагониста, и все вводят или перорально, или ингаляцией.
Кроме того, для лечения желудочно-кишечных расстройств (таких как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит) возможные комбинации включают комбинации, например, с одним или несколькими средствами, выбранными из списка, включающего
5-аминосалициловую кислоту или ее пролекарство (такое как сульфасалазин, олсалазин или бисалазид);
кортикостероиды (например, преднизолон, метилпреднизолон или будесонид);
иммунодепрессанты (например, циклоспорин, такролимус, метотрексат, азатиоприн или 6меркаптопурин);
антитела против TNF-α (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаба пэгол или голимумаб);
антитела против IL12/IL23 (например, устекинумаб) или низкомолекулярные ингибиторы IL12/IL23 (например, апилимод);
антитела против α4β7 (например, ведолизумаб);
блокаторы MAdCAM-1 (например, PF-00547659);
антитела против молекулы клеточной адгезии а4-интегрина (например, натализумаб);
антитела против субъединицы α рецептора IL2 (например, даклизумаб или базиликсимаб); ингибиторы JAK3 (например, тофацитиниб или R348);
ингибиторы Syk и их пролекарства (например, фостаматиниб или R-406);
ингибиторы фосфодиэстеразы-4 (например, тетомиласт);
HMPL-004; пробиотки; дерсалазин;
семапимод/CPSI-2364 и ингибиторы протеинкиназы C (например, AEB-071).
Для лечения глазных расстройств (таких как сухой кератоконъюнктивит или увеит) возможные комбинации включают комбинации, например, с одним или несколькими средствами, выбранными из списка, включающего кортикостероиды (например, дексаметазон, преднизолон, триамцинолона ацетонид, дифлупреднат или флуоцинолона ацетонид);
иммунодепрессанты (например, циклоспорин, воклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолата мофетил или такролимус);
антитела против TNF-α (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаба пэгол, ESBA-105 или
- 15 034927 голимумаб);
антитела против IL-17A (например, секукинумаб);
ингибиторы mTOR (например, сиролимус);
VGX-1027;
ингибиторы JAK3 (например, тофацитиниб или R348) и ингибиторы протеинкиназы C (например, AEB-071).
Следовательно, другой аспект изобретения относится к соединению формулы (I) в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными ингредиентами, например одним или несколькими дополнительными активными ингредиентами, описанными выше.
Подобным образом, другой аспект изобретения относится к комбинированному продукту, включающему (A) соединение по настоящему изобретению и (B) одно или несколько других терапевтических средств, причем каждый из компонентов (A) и (B) входит в композицию в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
В таком аспекте изобретения комбинированный продукт может представлять собой или единый (комбинированный) фармацевтический препарат, или набор из частей.
Таким образом, этот аспект изобретения охватывает фармацевтический препарат, включающий соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем (такой препарат в настоящем описании далее называется комбинированным препаратом).
Он также охватывает набор из частей, включающих компоненты (i) фармацевтический препарат, включающий соединение по настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем; и (ii) фармацевтический препарат, включающий одно или несколько других терапевтических средств в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, и такие компоненты (i) и (ii) предоставляются, каждый, в форме, которая подходит для введения в сочетании с другим.
Компонент (i) набора из частей представляет собой описанный выше компонент (A) в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем. Подобным образом, компонент (ii) представляет собой описанный выше компонент (B) в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
Одно или несколько других терапевтических средств (т.е. описанный выше компонент (B)) могут представлять собой, например, любое из средств, указанных выше в связи с лечением респираторных, желудочно-кишечных и глазных расстройств.
Если компонент (B) представляет собой более одного дополнительного терапевтического средства, такие дополнительные терапевтические средства могут быть в композиции друг с другом, или в композиции с компонентом (A), или могут быть включены в отдельные композиции.
В одном воплощении компонент (B) представляет собой одно дополнительное терапевтическое средство. В другом воплощении компонент (B) представляет собой два дополнительных терапевтических средства.
Комбинированный продукт (или комбинированный препарат или набор из частей) по данному аспекту изобретения можно использовать при лечении или предупреждении воспалительного заболевания, например воспалительных заболеваний, указанных выше, таких как респираторные расстройства, включая COPD (вызывающую хронический бронхит и эмфизему), астму, детскую астму, муковисцидоз, саркоидоз, идиопатический фиброз легких, аллергический ринит, ринит и синусит, в особенности астму или COPD (включая хронический бронхит и эмфизему);
глазные болезни или расстройства, включая аллергический конъюнктивит, конъюнктивит, сухой кератоконъюнктивит (сухой глаз), глаукому, диабетическую ретинопатию, макулярный отек (включая диабетический макулярный отек), центральную окклюзию вены сетчатки (CRVO), сухую и/или влажную возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD), воспаление после операции катаракты или, в частности, увеит (включая задний, передний увеит и панувеит), пересадку роговицы и отторжение трансплантата лимбальных клеток;
кожные болезни или расстройства, включая аллергический дерматит, контактный дерматит, атопический дерматит или псориаз; и желудочно-кишечные заболевания или расстройства, включая глютенчувствительную энтеропатию (целиакальную болезнь), эозинофильный эзофагит, болезнь кишечный трансплантат против хозяина или, в особенности, неспецифический язвенный колит или болезнь Крона.
Аспекты изобретения, описанные в настоящем описании (например, вышеуказанное соединение, комбинации, способы и применения), могут иметь такое преимущество, что при лечении состояний, описанных в настоящем описании, они могут быть более подходящими для врача и/или пациента, более эффективными, менее токсичными, более длительного действия, лучшей селективности, с более широким интервалом активности, более сильными, давать меньше побочных действий, иметь более хороший фар
- 16 034927 макокинетический профиль, более хорошую устойчивость или могут иметь другие полезные фармакологические свойства по сравнению со схожими соединениями, комбинациями, способами (лечением) или применениями, известными на уровне техники для применения при лечении указанных или других состояний.
Для сравнения с соединениями известного уровня техники предполагается, что, по меньшей мере, в некоторых воплощениях соединение формулы (I) имеет одну или несколько следующих отличительных черт:
оно проявляет свойства, которые особенно подходят для топического/местного введения (например, после топического/местного введения генерация высокой концентрации в ткани-мишени, но низкая концентрация в плазме или системные концентрации соединения формулы (I), и/или быстрый клиренс соединения формулы (I) из плазмы или большого круга кровообращения);
оно имеет пониженную опасность экстраваскулярного воздействия после внутривенного введения (например, из-за небольшого объема распространения для соединения формулы (I));
оно проявляет превосходную эффективность в отношении выбранных киназ и/или панели киназ, таких как MAPKa p38, MAPKy p38, Src и p59-HCK;
оно проявляет низкую ингибирующую активность или ее отсутствие против киназ Olaharsky, в частности GSK3a;
оно проявляет низкую ингибирующую активность или ее отсутствие против киназы Syk;
оно проявляет уменьшенную индукцию β-катенина и/или ингибирование митоза в клетках;
оно показывает отсутствие или незначительное зависимое от времени ингибирование членов суперсемейства цитохрома P450; и/или оно продуцирует менее проблемные (например, менее токсичные) метаболиты, например, после введения пациенту.
Экспериментальный раздел
Ниже приводятся аббревиатуры, используемые в настоящем описании (табл. 1). Предполагается, что любые аббревиатуры, которые не определены, имеют свои обычные приданные им значения.
Таблица 1 Аббревиатуры
АсОН ледяная уксусная кислота
АсгО уксусный ангидрид
Aq водный уш уширенный
ВЕН этилен-мостиковый гибрид
BINAP 1' 1'-бинафтил-2,2'-диамин
Вос трет-бутоксикарбонил
CSH charged surface hybrid д Дублет
А химический сдвиг
DCM Дихлорметан
DIAD диизопропилазодикарбоксилат
ДМФА N,N-диметилформамид
ДМСО диметилсульфоксид (ES+) ионизация электронным распылением по положительному типу (ES~) ионизация электронным распылением по отрицательному типу
Et этил
EtOAc этилацетат
EtOH этанол час час(ы)
HATU гексафторфосфат 1[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3- 17 034927
триазоло[4,5-d]пиримидиний-3-оксида
Основание N,N-диизопропилэтиламин
Хунига
IPA изопропиловый спирт
iPrOAc изопропилацетат
м мультиплет
(М+Н) + протонированный молекулярный ион
(М+Н) - депротонированный молекулярный ион
Me метил
MeCN ацетонитрил
МеОН метанол
МГц мегагерц
мин минута(ы)
ш/ z отношение массы к заряду
ЯМР ядерный магнитный резонанс (спектроскопия)
Pd2 (dba) з трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0)
Ph фенил квартет
RT комнатная температура
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
с синглет
насыщ. насыщенный
SCX катионный обмен на твердом носителе (смола)
т триплет
ъВи трет-бутил
ТГФ тетрагидрофуран
ТФК трифторуксусная кислота
УФ ультрафиолет
АКТ гомолог 1 онкогена вируса мышиной тимомы akt
АТФ аденозин-5'-трифосфат
BALF бронхоальвеолярная лаважная жидкость
BSA бычий сывороточный альбумин
CPOD хроническая обструктивная болезнь легких
CXCL1 лиганд 1 хемокина (мотив С-Х-С)
- 18 034927
СОХ2 субъединица II цитохром-с-оксидазы
ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия
DSS декстран сульфата натрия
DTT дитиотреитол
Клетки d-U937 дифференцированные клетки u937 РМА
DVS динамическая сорбция паров
дцРНК двухцепочечная РНК
ELISA твердофазный иммуноферментный анализ
FACS флуоресцентно-активированный клеточный сортинг
FBS сыворотка плода коровы
FRET резонансный перенос энергии флуоресценции
GM-CSF CSF2: гранулоцитрано-макрофагальный колониестимулирующий фактор
GSK3a киназа гликогенсинтазы За
GSK3p киназа гликогенсинтазы 3β
HBSS сбалансированный солевой раствор Хенкса
HCK киназа гемопоэтических клеток
HRV риновирус человека
IBD воспалительное заболевание кишечника
IC50 концентрация ингибирования на 50%
ICAM-1 молекула межклеточной адгезии 1
IFN интерферон
IL-2 интерлейкин 2
IL-8 интерлейкин 8
JNK c-jun N-концевая киназа
KG хемоаттрактант для кератиноцитов
LPMC мононуклеарная клетка в lamina propria
ЛПС липополисахарид
МАРК митогенактивируемая протеинкиназа
MAPKAP-K2 активируемая митогенактивируемой протеинкиназой протеинкиназа 2
MKK4 активируемая митогенактивируемой протеинкиназой киназа 4
MKK6 активируемая митогенактивируемой
- 19 034927 протеинкиназой киназа 6
MOI мультиплетность инфекции
МТТ бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия
OD оптическая плотность
РВМС мононуклеарная клетка периферической крови
PBS забуференный фосфатом Дульбекко физиологический раствор
РИА Фитогемагглютинин
Р13 фосфоинозитид-3-киназа
РМА форбол 12-миристат-13-ацетат
REC50 относительная 50% эффективная концентрация
РНК рибонуклеиновая кислота
РНКи РНК-интерференция
RSV респираторно-синцитиальный вирус
SDS додецилсульфат натрия
SMS системы измерений поверхности
SRC гомолог (avian) онкогенного вируса саркомы (Шмидта-Руппина А2) v-src
Syk тирозинкиназа селезенки
TCID50 доза заражения 50% культуры ткани
ТГА термогравиметрический анализ
TLR3 толл-подобный рецептор 3
TNBS 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота
TNFoc фактор некроза опухоли альфа
URTI респираторная инфекция верхних дыхательных путей
XPD порошковая дифракция рентгеновских лучей
XRD дифракция рентгеновских лучей
Химические примеры Общие процедуры
Все исходные материалы и растворители получают или из коммерческих источников, или получают согласно описанию в литературе. Если не указано иное, все реакционные смеси перемешивают. Органические растворы обычным образом сушат над безводным сульфатом магния. Гидрирование выполняют в проточном реакторе Thales H-cube в установленных условиях.
Колоночную хроматографию выполняют на картриджах, предварительно заполненных насадкой диоксидом кремния (230-400 меш, 40-63 мкм), с использованием указанного количества. SCX закупают у Supelco и обрабатывают перед использованием 1М хлороводородной кислотой. Если не указано иное, реакционную смесь, которую очищают, сначала разбавляют МеОН и подкисляют несколькими каплями АсОН. Этот раствор непосредственно загружают на SCX и промывают МеОН. Затем элюируют нужный материал, промывая 0,7М NH3 в МеОН.
Препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.
Выполняют УФ-детекцию при 215 и 254 нм с помощью или Waters X-Select Prep-C18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, с элюированием с градиентом H2O-MeCN, содержащим 0,1% об./об. муравьиной кислоты, в течение 10 мин, или Waters X-Bridge Prep-C18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, с элюированием с градиентом H2O-MeCN, содержащим 0,1% бикарбоната аммония, в течение 10 мин.
Аналитические методы
Высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.
Метод 1. Waters XSelect CSH C18, 2,5 мкм (4,6x30 мм) при 40°C, скорость потока 2,5-4,5 мл-мин-1, элюирование с градиентом H2O-MeCN, содержащий 0,1% об./об. муравьиной кислоты, в течение 4 мин, с использованием УФ-детекции при 254 нм. Информация о градиенте: 0-3,00 мин, от 95% H2O-5% MeCN до 5% H2O-95% MeCN; 3,00-3,01 мин, удерживание 5% H2O-95% MeCN, скорость потока повышают до 4,5 мл-мин-1; 3,01-3,50 мин, удерживание 5% H2O-95% MeCN; 3,50-3,60 мин, возвращение к 95% H2O-5% MeCN, скорость потока снижают до 3,50 мл-мин-1; 3,60-3,90 мин, удерживание 95% H2O-5% MeCN; 3,904,00 мин, удерживание 95% H2O-5% MeCN, скорость потока снижают до 2,5 мл-мин-1.
Метод 2. Waters XBridge BEH C18, 2,5 мкм (4,6x30 мм), 40°C; скорость потока 2,5-4,5 мл-мин-1, элюирование с градиентом H2O-MeCN, содержащий 10 мМ бикарбоната аммония, в течение 4 мин, с ис
- 20 034927 пользованием УФ-детекции при 254 нм. Информация о градиенте: 0-3,00 мин, от 95% H2O-5% MeCN до 5% H2O-95% MeCN; 3,00-3,01 мин, удерживание 5% H2O-95% MeCN, скорость потока повышают до 4,5 мл-мин-1; 3,01-3,50 мин, удерживание 5% H2O-95% MeCN; 3,50-3,60 мин, возвращение к 95% H2O-5% MeCN, скорость потока снижают до 3,50 мл-мин-1; 3,60-3,90 мин, удерживание 95% H2O-5% MeCN; 3,904,00 мин, удерживание 95% H2O-5% MeCN, скорость потока снижают до 2,5 мл-мин-1.
1H ЯМР-спектроскопия.
Спектры 1H ЯМР получают на спектрометре Bruker Avance III при 400 МГц с использованием остаточного недейтерированного растворителя в качестве стандарта и проводят, если не указано иное, в ДМСО-а6.
Примеры
Пример 1A. 1-(3-(трет-Бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино) пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1 -ил)мочевина.
Промежуточное соединение A. 3-трет-Бутил-1-п-толил-1H-пиразол-5-амин ‘Ви
К раствору гидрохлорида п-толилгидразина (100 г, 630 ммоль) в EtOH (1251 мл) при перемешивании добавляют 4,4-диметил-3-оксопентаннитрил (88 г, 699 ммоль) и HCl (62,5 мл, 750 ммоль). Полученную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме до с.а. 1/3 исходного объема. Затем реакционную смесь охлаждают на ледяной бане и доводят pH до с.а. 8-9 с помощью 6М водного раствора NaOH. Реакционную смесь экстрагируют диэтиловым эфиром (500 мл) и органическую фазу промывают водой (2x300 мл), затем сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме, получают оранжевое твердое вещество. Твердое вещество суспендируют в изогексане и перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 2,5 ч, затем охлаждают и фильтруют в горячем состоянии и получают названный в подзаголовке продукт 3-трет-бутил-1-п-толил-1H-пиразол-5-амин в виде бледнокоричневого твердого вещества (76,5 г, 52%); Rt 1,31 мин (метод 1); m/z 230 (M+H)+ (ES+);
1H ЯМР δ: 1,20 (9H, с), 2,32 (3H, с), 5,10 (2H, ушс), 5,35 (1H, с), 7,24 (2H, д), 7,42 (2H, м).
Промежуточное соединение B. Фенил-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)карбамат
Me Me
К раствору карбоната натрия (11,3 г, 106 ммоль) в воде (80 мл) при перемешивании добавляют раствор 3-(трет-бутил)-1-п-толил-1H-пиразол-5-амина (промежуточное соединение A) (20 г, 87,0 ммоль). Через 10 мин добавляют фенилхлорформиат (12,1 мл, 96 ммоль) и полученную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют водой (160 мл), слои разделяют и органический слой промывают водой (2x80 мл), рассолом (80 мл), сушат (MgSO4) и концентрируют в вакууме. Полученное желтое твердое вещество суспендируют в смеси 10% эфира/изогексан (320 мл) и перемешивают до получения однородной суспензии. Твердое вещество собирают фильтрацией и промывают изогексаном, получают названное в подзаголовке соединение фенил-(3-(трет-бутил)-1(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)карбамат в виде белого порошка (27,3 г, 88%); Rt 2,65 мин (метод 1); m/z 350 (M+H)+ (ES+);
1H ЯМР δ: 1,29 (9H, с), 2,37 (3H, с), 6,35 (1H, с), 7,10-7,23 (3H, перекрывающийся м), 7,33-7,46 (6H, перекрывающийся м), 9,99 (1H, с).
Промежуточное соединение C. трет-Бутил-(4-((2-хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1ил)карбамат
К смеси 2-хлор-4-(хлорметил)пиридина (30 г, 185 ммоль) и трет-бутил-(4-гидроксинафталин-1
- 21 034927 ил)карбамата (40,0 г, 154 ммоль) в ацетонитриле (200 мл) добавляют карбонат цезия (75 г, 231 ммоль) и полученную смесь греют при 55°C. Через 16 ч реакционную смесь разбавляют смесью 30% МеОН в DCM (600 мл) и водой (400 мл). Слои разделяют и водный слой экстрагируют дополнительным количеством смеси 30% МеОН в DCM (2x600 мл), органические слои концентрируют в вакууме и получают сырой продукт реакции. Сырой продукт растирают с МеОН (200 мл), обрабатывают ультразвуком в течение с.а. 5 мин и перемешивают в течение 1 суток. Полученное твердое вещество собирают фильтрацией и промывают МеОН (2x10 мл), получают названное в подзаголовке соединение трет-бутил-(4-((2хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамат в виде желтого твердого вещества (43 г, 70%); Rt 2,60 мин (метод 1); m/z 383 (M-H)- (ES-);
1H ЯМР δ: 1,47 (9H, с), 5,41 (2H, с), 6,98 (1H, д), 7,36 (1H, д), 7,55-7,61 (3H, перекрывающийся м), 7,65 (1H, м), 7,94 (1H, м), 8,29 (1H, м), 8,45 (1H, м), 9,00 (1H, ушс).
Промежуточное соединение D (с защитной группой). трет-Бутил-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1 -ил)карбамат
Смесь трет-бутил-(4-((2-хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамата (промежуточное соединение C) (1050 мг, 2,73 ммоль), 6-этилпиразин-2-амина (437 мг, 3,55 ммоль) и карбоната цезия (1333 мг, 4,09 ммоль) в 1,4-диоксане (15 мл) обезгаживают азотом в течение 5 мин. Добавляют раствор Pd2(dba)3 (125 мг, 0,136 ммоль) и BINAP (170 мг, 0,273 ммоль) в 1,4-диоксане (5 мл) и реакционную смесь перемешивают при 90°C в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждают и перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч, затем разбавляют смесью 10% MeOH/DCM (25 мл) и фильтруют через слой целлита, промывая дополнительно смесью 10% MeOH/DCM (15 мл). Растворитель удаляют в вакууме, сырой продукт реакции соединяют с МеОН (15 мл) и перемешивают в течение 3 ч. Полученное оранжевое твердое вещество извлекают фильтрацией, затем соединяют с раствором MeOH/EtOH (5 мл) и перемешивают в течение 72 ч. Снова полученное оранжевое твердое вещество извлекают фильтрацией, затем добавляют ацетон (20 мл) и смесь перемешивают в течение 2 ч. Оставшееся твердое вещество отфильтровывают и фильтрат упаривают и получают названное в подзаголовке соединение трет-бутил-(4((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамат (360 мг, 27%); Rt 2,6 мин (метод 2); m/z 472 (M+H)+ (ES+);
1H ЯМР δ: 1,18 (3H, т), 1,47 (9H, с), 2,63 (2H, к), 5,36 (2H, с), 6,99 (1H, д), 7,06 (1H, д), 7,36 (1H, д), 7,53-7,63 (2H, м), 7,90-8,06 (3H, перекрывающийся м), 8,29 (1H, д), 8,36 (1H, м), 8,91 (1H, с), 8,96 (1H, с), 10,06 (1H, с).
Промежуточное соединение D. №(4-(((4-Аминонафталин-1-ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6этилпиразин-2-амин
К раствору трет-бутил-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1 ил)карбамата (промежуточное соединение D (с защитной группой)) (360 мг, 0,763 ммоль) в DCM (15 мл) добавляют ТФК (1,485 мл, 19,09 ммоль), и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток соединяют с насыщ. раствором гидрокарбоната натрия и перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Твердое вещество отфильтро вывают, промывают ацетонитрилом и сушат в вакууме, получают названное в подзаголовке соединение №(4-(((4-аминонафталин-1-ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6-этилпиразин-2-амин в виде бежевого твердого вещества (200 мг, 69%); Rt 2,14 мин (метод 2); m/z 372 (M+H)+ (ES+);
1H ЯМР δ: 1,20 (3H, т), 2,64 (2H, к), 5,18-5,24 (4H, перекрывающийся м), 6,59 (1H, д), 6,82 (1H, д), 7,03 (1H, д), 7,41-7,51 (2H, перекрывающийся м), 7,98-8,01 (2H, м), 8,04 (1H, м), 8,22-8,29 (2H, перекрывающийся м), 8,91 (1H, с), 10,04 (1H, с).
-(3 -(трет-Бутил)-1 -(п-толил)-1 ^пиразол^-ил^ -(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевина
- 22 034927
Me
К раствору фенил-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1Н-пиразол-5-ил)карбамата (промежуточное соединение B) (0,042 г, 0,121 ммоль) и Х-(4-(((4-аминонафталин-1-ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6этилпиразин-2-амина (промежуточное соединение D) (0,093 г, 0,250 ммоль) в ТГФ (1,5 мл) при 40°C добавляют триэтиламин (0,013 мл, 0,093 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 40°C в течение 40 мин, затем охлаждают до RT и перемешивают в течение 3 суток, затем концентрируют в вакууме. Сырой продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле (колонка 12 г, 0-5% МеОН в DCM) и получают не совсем белое твердое вещество. Продукт повторно очищают препаративной ВЭЖХ (Gilson, Acidic (0,1% муравьиной кислоты), Acidic, Waters X-Select Prep-C18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, 45-75% MeCN в воде), получают названное в заголовке соединение 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину в виде не совсем белого твердого вещества (0,029 г, 49%); Rt 2,26 мин (метод 1); m/z 627 (M+H)+ (ES+), 625 (M-H)- (ES-);
1H ЯМР δ: 1,18 (3H, т), 1,28 (9H, с), 2,40 (3H, с), 2,63 (2H, к), 5,36 (2H, с), 6,36 (1H, с), 7,02 (1H, д), 7,07 (1H, дд), 7,37 (2H, м), 7,45 (2H, м), 7,56-7,67 (3H, перекрывающийся м), 7,94 (1H, м), 7,99 (1H, с), 8,02 (1H, с), 8,30 (1H, д), 8,39 (1H, м), 8,60 (1H, с), 8,81 (1H, с), 8,92 (1H, с), 10,08 (1H, с).
Пример 1B. 1-(3-(трет-Бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино) пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевина (другая партия).
1-(3-(трет-Бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил) метокси)нафталин-1-ил)мочевину (10,0 г) перемешивают в ацетонитриле (770 мл) при 22°C. Гетерогенную смесь нагревают до температуры образования флегмы со скоростью 3 C/мин и поддерживают кипячение в течение 2,5 ч. В смесь вносят затравку кристаллической 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (100 мг).
Смесь равномерно охлаждают до 20°C в течение 18 ч, затем снова нагревают до температуры образования флегмы, кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч и затем равномерно охлаждают до 22°C в течение 18 ч. Твердый продукт реакции отфильтровывают, промывают ацетонитрилом (77 мл) и сушат в течение 18 ч при 45°C в вакууме, получают 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину (8,73 г).
Пример 2A. Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2).
Промежуточное соединение C. трет-Бутил-(4-((2-хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1ил)карбамат
К 2-хлор-4-(хлорметил)пиридину (1,05 экв., 59,5 г) добавляют ацетонитрил (420 мл) и смесь перемешивают при 20°C. К смеси добавляют трет-бутил-(4-гидроксинафталин-1-ил)карбамат (90,8 г), затем добавляют карбонат калия (72,6 г). Гетерогенную смесь нагревают до 55°C со скоростью 1,0 К/мин.
Смесь перемешивают в течение 16 ч при 55°C и затем реакционную смесь охлаждают до 22°C. Добавляют воду (1260 мл) в течение 30 мин, смесь перемешивают в течение 30 мин при 22°C. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и промывают 200 мл воды. Продукт реакции сушат в вакууме при 50°C в течение 20 ч и получают трет-бутил-(4-((2-хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамат (100,0 г, 90,6%).
Промежуточное соединение D (с защитной группой). трет-Бутил-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1 -ил)карбамат
диоксан
- 23 034927
К трет-бутил-(4-((2-хлорпиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамату (промежуточное соединение C) (9,6 г) добавляют диоксан (125 мл) и смесь перемешивают при 20°C. К смеси при перемешивании при 20°C добавляют карбонат цезия (2 экв., 16,3 г) и 2-амино-6-этилпиразин (1,5 экв., 4,8 г). Через реакционную смесь пропускают аргон. К реакционной смеси добавляют трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,05 экв., 1,14 г) и рацемический BINAP (0,10 экв., 1,56 г). Смесь перемешивают еще в течение 15 мин при 20°C. Смесь нагревают до 90°C со скоростью 1,5 К/мин и затем перемешивают в течение 12 ч при 90°C. Смесь охлаждают до 20°C и продолжают перемешивание еще в течение 6 ч. Гетерогенную смесь фильтруют через целит и фильтр промывают диоксаном (дважды по 5 мл). Фильтрат концентрируют в вакууме при 2 кПа (20 мбар) и 50°C. Остаток растворяют в этаноле (150 мл). Происходит спонтанная кристаллизация. Гетерогенную смесь перемешивают в течение 3 ч при 22°C. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и промывают этанолом (10 мл). Продукт сушат в вакууме при 50°C в течение 20 ч и получают трет-бутил-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамат (9,05 г, 76,8%).
Промежуточное соединение D. №(4-(((4-Аминонафталин-1-ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6этилпиразин-2-амин
aq 1\1Н4ОН
К трет-бутил-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)карбамату (промежуточное соединение D (с защитной группой)) (10,5 г) добавляют ацетонитрил (200 мл), и гетерогенную смесь перемешивают при 20°C. Добавляют серную кислоту (4,5 экв., 5,5 мл) в течение 2 ч при 20°C.
Гетерогенную смесь перемешивают еще 2 ч при 20°C. К реакционной смеси в течение 15 мин добавляют водный раствор аммиака (10 экв., 17 мл) и температуру поддерживают на уровне 20°C путем охлаждения. К гетерогенной смеси добавляют воду (33,4 мл) в течение 5 мин при 20°C. После перемешивания в течение 30 мин при 20°C смесь охлаждают до 5°C и перемешивают в течение еще 2 ч при 5°C. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и промывают водой (33,4 мл) и 2-пропанолом (18 мл). Продукт сушат при 50°C в вакууме в течение 24 ч и получают №(4-(((4-аминонафталин-1ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6-этилпиразин-2-амин (6,2 г, 75%).
-(3 -(трет-Бутил)-1 -(п-толил)-1 И-пиразол-5-ил)-3 -(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1 -ил)мочевина
Ме-ТГФ
К №(4-(((4-аминонафталин-1-ил)окси)метил)пиридин-2-ил)-6-этилпиразин-2-амину (промежуточное соединение D) (41,3 г) добавляют 2-метилтетрагидрофуран (1809 мл) и смесь перемешивают при 20°C. К смеси добавляют фенил-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1И-пиразол-5-ил)карбамат (1,2 экв., 51,3 г). Добавляют триэтиламин (0,25 экв., 3,9 мл) и смесь перемешивают еще 10 мин при 20°C. Гетерогенную реакционную смесь нагревают до 48°C в течение 30 мин и выдерживают при 48°C в течение 3,5 ч. Через 10 мин при 48°C смесь становится гомогенной, и в нее вносят затравку кристаллическую 1-(3-(третбутил)-1-(п-толил)-1И-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину (60 мг). Реакционную смесь охлаждают до 20°C и перемешивают еще в течение 16 ч. Образовавшееся выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и промывают 2-метилтетрагидрофураном (дважды по 139 мл). Продукт сушат в течение 18 ч при 45°C в вакууме и получают 1(3 -(трет-бутил)-1 -(п-толил)-1 И-пиразол-5-ил)-3 -(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину (54,1 г, 77,5%).
Малеат 1 -(3 -(трет-бутил)-1 -(п-толил)-1 И-пиразол-5-ил)-3 -(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2)
- 24 034927 о
К 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1Н-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевине (111,04 г) добавляют 2-бутанон (4442 мл) и перемешивают при 20°C. Гетерогенную смесь нагревают до 65°C и она становится гомогенным раствором. Добавляют тиол SilicaMetS (акцептор металлов) (5,55 г) и смесь перемешивают еще в течение 30 мин при 65°C. Добавляют Norit A Supra (активированный уголь) (5,55 г) и смесь перемешивают еще 20 мин при 65°C. Смесь горячей фильтруют через целит. Фильтр промывают горячим 2-бутаноном (1555 мл) (60°C). К фильтрату добавляют 2-бутанон (2887 мл) и при перемешивании доводят до 60°C.
Малеиновую кислоту (1,0 экв., 20,56 г) растворяют в 2-бутаноне (555 мл). Раствор малеиновой кислоты добавляют к раствору 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины в течение 80 мин при 65°C. После добавления 10% раствора малеиновой кислоты в смесь вносят затравку кристаллический малеат 1-(3-(трет-бутил)-1(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1ил)мочевины (форма 2). Смесь выдерживают при перемешивании в течение 1 ч при 60°C, затем охлаждают неравномерно по экспоненте 2,3 в течение 6 ч до 5°C. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывают и дважды промывают 2-бутаноном (278 мл). Продукт сушат при 45°C в вакууме в течение 20 ч и получают малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино) пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2) (113,8 г, 86,5%).
Пример 2B. Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2) (другая партия).
К 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевине (7,50 г) добавляют 2-бутанон (750 мл) и смесь перемешивают. Смесь нагревают до 60°C в течение 20 мин. К смеси в течение 5 мин добавляют раствор малеиновой кислоты (1,39 г) в 2-бутаноне (12 мл). Происходит спонтанная кристаллизация после того, как добавят приблизительно половину раствора малеиновой кислоты. Смесь перемешивают в течение 30 мин при 60°C, затем охлаждают экспоненциально (экспонента=2,3) в течение 6 ч до 5°C, затем перемешивают в течение 30 мин при 5°C, затем нагревают до 65°C в течение 30 мин, затем перемешивают в течение 30 мин при 65°C, затем охлаждают экспоненциально (экспонента=2,3) в течение 6 ч до 5°C, затем перемешивают в течение 30 мин при 5°C, затем нагревают до 65°C в течение 30 мин, затем перемешивают в течение 30 мин при 65°C, затем охлаждают экспоненциально (экспонента=2,3) в течение 6 ч до 5°C. Продукт отфильтровывают и дважды промывают 2-бутаноном (50 мл), затем сушат при 45°C в вакууме и получают малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2) (7,0 г).
Пример 2C. Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 1).
Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1Н-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (15 мг) растворяют в ТГФ (100 об.) при 50°C и температуру изменяют циклически между 50°C и комнатной температурой в течение 24 ч (4 чпри каждой температуре). Затем раствор выдерживают в холодильнике в течение 24 ч, после чего извлекают твердый материал (форма 1).
Пример 2D. Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 1) (другая партия).
1-(3-(трет-Бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину растворяют в ТГФ (40 об.) при 50°C и добавляют 1 экв. малеиновой кислоты. Образец оставляют созревать между RT и 50°C (4 ч при каждой температуре) в течение 2 суток. Извлекают твердый материал (форма 1).
Пример 3. Микронизованные партии.
Пример 3A. 1-(3-(трет-Бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино) пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевина в микронизованной форме.
Микронизованную 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину получают путем микронизации материала из примера 1B в устройстве для микронизации струйной мельнице 50 AS Hosokawa Alpine Spiral (5 см) (давление 100 кПА (1,0 бар)) (ручная загрузка). Параметры объемного распределения частиц по размерам, определенные методом лазерной дифракции с использованием Malvem Mastersizer 2000S (дисперсия в смеси вода/Твин 80, 0,1% мас./об.), приводятся в таблице ниже.
- 25 034927
DvlO (микрон) Dv50 (микрон) Dv90 (микрон)
0,15 1,54 10,76
Пример 3B. Малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины, форма 2, в микронизованной форме.
Микронизованный малеат 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-1H-пиразол-5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевины (форма 2) получают путем микронизации материала из примера 2B в устройстве для микронизации струйной мельнице 50 AS Hosokawa Alpine Spiral (5 см) (давление 100 кПА (1,0 бар)) (ручная загрузка). Параметры объемного распределения частиц по размерам, определенные методом лазерной дифракции с использованием Malvem Mastersizer 2000S (дисперсия в смеси вода/Твин 80, 0,1% мас./об.), для материала загрузки и продукта приводятся в таблице ниже.
DvlO (микрон) Dv50 (микрон) Dv90 (микрон)
Загрузка (пример 2В) 3 9 128
Продукт (пример ЗВ) 1,21 2,18 4,00
Пример 4. Лактозосодержащие композиции, содержащие 1-(3-(трет-бутил)-1-(п-толил)-Ш-пиразол5-ил)-3-(4-((2-((6-этилпиразин-2-ил)амино)пиридин-4-ил)метокси)нафталин-1-ил)мочевину в виде свободного основания и малеата (форма 2), подходящие для ингаляции.
Композиции получают смешиванием указанных далее ингредиентов.
Пример Активный ингредиент (пример ЗВ) Моногидрат лактозы* Стеарат магния* *
(малеат (форма микронизован) 2) ,
4а 7 5 мг 7 5 мг -
4Ь 7 5 мг - 7 5 мг
4с 7 5 мг 35 мг 35 мг
Пример Активный ингредиент (пример ЗА) (форма свободного основания, микрониЗована)** Моногидрат лактозы* Стеарат магния* *
4d 10 мкг 2 5 мг -
4е 10 мкг 2 5 мг 1%
4f 100 мкг 2 5 мг -
Пример Активный ингредиент (пример ЗВ) (малеат (форма 2) , микронизован) Моногидрат лактозы* Стеарат магния* *
4д 10 мкг 2 5 мг -
4h 10 мкг 2 5 мг 1%
4i 100 мкг 2 5 мг -
*Lactohale LH200 **Источник Peter Greven (сорт Ligamed MF-2V; растительного происхождения)
Пример 5. Характеризация и испытание на устойчивость.
Физическая характеризация активного ингредиента.
Инфракрасная спектрометрия (ИК) - микроослабленная полная отражательная способность (microATR).
Образцы анализируют с использованием подходящего вспомогательного обрудования для microATR.
Число сканирований 32.
Разрешение 1 см-1.
Интервал длин волн 4000-400 см-1.
Прибор спектрометр Thermo Nexus 670 FTIR.
- 26 034927
Детектор DTGS с окнами KBr.
Расщепитель луча Ge на KBr.
Вспомогательное обрудование для Harrik Split Pea с кристаллом Si microATR.
ИК-спектр образца материала примера 2A, показанный на фиг. 1, отражает виды колебаний молекулярной структуры соединения примера 1 в виде его соли малеата.
Порошковая XRD.
Анализ методом порошковой дифракции рентгеновских лучей (XPD) материала формы 2 выполняют на дифрактометре X'PertPRO MPD PANanalitical (Philips). Прибор снабжен рентгеновской трубкой Cu LFF.
Соединение наносят на держатель образца с нулевым фоном.
Параметры прибора.
Напряжение на зажимах генератора 45 кВ.
Сила тока на зажимах генератора 40 мА.
Геометрия Брэгга-Брентано.
Платформа: вращающаяся платформа.
Условия измерения.
Тип сканирования: непрерывное.
Интервал сканирования: 3-50° 2θ.
Размер шага 0,02°/шаг.
Время подсчета 30 с/шаг.
Время оборота спиннера 1 с.
Тип излучения CuKa.
Траектория падающего луча: траектория отклоненного луча.
Запрограмм. щель для 15 мм: большой + расхождения антирассеивающий экран.
Щель Соллера 0,04 рад: щель Соллера 0,04 рад.
Маска для луча 15 мм Ni фильтр +.
Антирассеивающая щель 1°.
Детектор X'Celerator.
Лучевой нож +.
Анализ методом порошковой дифракции рентгеновских лучей (XPD) материала формы 1 выполняют на дифрактометре Bruker AXS C2 GADDS. Соединение слегка спрессовывают на предметном стекле.
Параметры прибора.
Напряжение на зажимах генератора 40 кВ.
Сила тока на зажимах генератора 40 мА.
Геометрия отражение (=Брэгга-Брентано).
Платформа: автоматическая платформа XYZ.
Условия измерения.
Тип сканирования: непрерывное.
Интервал сканирования: 3-30° 2θ.
Размер шага 0,05°/шаг.
Время подсчета 120 с.
Тип излучения CuKa.
Детектор HiStar двумерный.
Одностороннее многослойное зеркало Гебеля в сочетании с коллиматором с точечной апертурой 0,3 мм.
Порошковая дифрактограмма образца материала примера 2A, приведенная на фиг. 2, показывает дифракционные пики в отсутствие гало, указывая, что соединение присутствует в виде кристаллического продукта. Эта дифрактограмма характеризует кристаллический полиморф форму 2.
Порошковая дифрактограмма образца материала примера 2D, приведенная на фиг 3, показывает дифракционные пики в отсутствие гало, указывая, что соединение присутствует в виде кристаллического продукта. Эта дифрактограмма характеризует кристаллический полиморф форму 1.
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).
Приблизительно 3 мг испытываемого соединения переносят в стандартную алюминиевую кювету для образца TA-Instrument. Кювету для образца закрывают соответствующей крышкой и регистрируют кривую ДСК на TA-Instruments Q1000 MTDSC, снабженном охлаждающей ячейкой RCS. Используют параметры, указанные ниже.
Начальная температура 25°C.
Скорость нагревания ЮЩ/мин.
Конечная температура 300°C.
Поток азота 50 мл/мин.
Кривая ДСК образца материала примера 2A, приведенная на фиг. 4, показывает плавление с разло
- 27 034927 жением продукта при приблизительно 198,6°C (форма 2).
Термогравиметрический анализ (ТГА).
Испытываемое соединение переносят в алюминиевую кювету для образца. Термогравиметрическую кривую регистрируют на термогравиметре TA-Instruments Q500. Используют параметры, указанные ниже.
Начальная температура: комнатная температура.
Скорость нагревания 20^Λ^κ
Фактор разрешения 4.
Конечное состояние 300°C или <80 [(мас./мас.)%].
График ТГА образца материала примера 2A показан на фиг. 5. Потерю массы не регистрируют в области температур от комнатной температуры до 175°C. Потеря массы при температуре выше 175°C происходит из-за разложения продукта. Динамическая сорбция паров (DSV).
Приблизительно 20 мг соединения переносят в анализатор динамической сорбции паров SMS, и регистрируют изменение массы относительно атмосферной влажности при 25°C. Используют параметры, указанные ниже.
Сушка 60 мин в атмосфере азота.
Равновесие 60 мин/шаг.
Точки измерения RH (%).
Первый набор: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5.
Второй набор: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0.
Испытания на DSV выполняют на образце материала примера 2A (см. фиг. 6 и 7). Во время начальной стадии сушки регистрируют потерю массы 0,3%. Оказывается, что продукт не является гигроскопичным.
Продукт после DSV исследуют методом XRD и ИК, и он остается в одной и той же форме твердого состояния до испытания и после испытания (данные не приводятся). Не наблюдают никаких признаков разложения соли.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM).
В экспериментах с SEM результаты собирают на сканирующем электронном микроскопе Phenom Pro. Небольшое количество образца закрепляют на алюминиевом выступе с использованием проводящей двусторонней клейкой ленты. Наносят тонкий слой золота с использованием напылительной машины (20 мА, 120 с).
Образцы материала формы 1 и формы 2 соли малеата соединения по изобретению проверяют с помощью SEM. Продукт формы 1 имеет иглоподобную морфологию. Продукт формы 2 имеет пластинчатоподобную морфологию. Пластинчатоподобная морфология формы 2 является более подходящей для получения продукта для ингаляции, чем иглоподобная морфология формы 1.
Итог по результатам физической характеризации активного ингредиента.
Испытанный материал является кристаллическим согласно XRD и плавится с разложением при приблизительно 198,6°C. Потери массы при ТГА не наблюдают между комнатной температурой и 175°C. Материал, как оказывается, не является гигроскопичным. Не имеется доказательств конверсии твердого состояния или разложения соли. Такие свойства подтверждают пригодность соли малеата соединения формулы (I) как кандидата в лекарственное средство.
Физическая характеризация активного ингредиента в микронизованной форме.
Образец материала примера 3B исследуют методами ИК, порошковой рентгенографии, ДСК, ТГА и DVS схоже с исследованиями, описанными выше для материала примера 2A. Результаты ИК и порошковой рентгенографии, по существу, такие же (данные не приводятся). Испытываемый материал является кристаллическим на основании XRD и плавится с разложением при приблизительно 194,6°C согласно ДСК. Как оказывается, материал не является гигроскопичным (данные не приводятся). Не имеется доказательств конверсии твердого состояния или разложения соли (данные не приводятся). Такие свойства подтверждают пригодность соли малеата соединения формулы (I) в микронизованной форме как кандидата в лекарственное средство.
Испытание на физическую устойчивость - устойчивость смесей с лактозой.
Композиции примеров 4a, 4b и 4c хранят в течение 3, 6 и 13 недель в условиях 40°C/75% RH, 50°C/80% RH и 50°C/RH окружающей среды. Рентгенограммы и ИК-спектры получают во время ноль и в три момента времени (параметры испытаний такие же, как описанные выше для характеризации активного ингредиента). Не наблюдают существенных различий в рентгенограммах или ИК-спектрах между временем ноль и любой из трех точек (данные не приводятся). Не наблюдают изменений формы твердого состояния или разложения соли.
Испытание на химическую устойчивость - устойчивость активного ингредиента и смесей.
Метод UPLC для определения разложения.
Образцы экстрагируют смесью растворителей (ДМСО/вода, 80:20) (7 мл) в 10-мл сосуде. Хроматографию UPLC выполняют с использованием параметров, следующих далее.
Колонка Supelco Ascentis Express C18, длина 150 мм х вн.д. 3,0 мм, размер частиц 2,7 мкм.
Температура колонки 30°C.
- 28 034927
Температура автосемплера 5°C.
Скорость потока 0,40 мл/мин.
Подвижная фаза: растворитель A: 10 мМ ацтета аммония (0,771 г/л)+0,1% об./об. трифторуксусной кислоты в воде; растворитель B: смесь ацетонитрил/изопропиловый спирт 70:30 (об./об.).
Г радиент ______________________________________________________
Растворитель Время в минутах
0 20 25 30 31 36
%А 90 35 0 0 90 90
%В 10 65 100 100 10 10
Время выполнения анализа 36 мин.
Время сбора данных 30 мин.
Объем впрыска 5 мкл.
Длина волны сканирования от 200 до 400 нм.
Длина волны для вычисления однородности содержания 334,0 нм.
Композиции примеров 4d, 4e, 4f, 4g, 4h и 4i хранят в течение 14 и 30 дней в условиях 50°C/75% RH, 60°C/30% RH, 60°C/50% RH, 70°C/10% RH, 70°C/75% RH и 80°C/50% RH.
Разложение определяют методом UPLC в момент времени ноль и моменты 7, 14 и 30 дней, и результаты показаны на фиг. 8, графики A-F.
Процент общего разложения для композиций, содержащих соль малеат, форма 2, активного ингредиента, всегда ниже, чем для эквивалентных композиций, содержащих свободное основание активного ингредиента, что показывает, что соль малеат, форма 2, более устойчива в таких композициях. Процент общего разложения для композиций, содержащих соль малеат, форма 2, активного ингредиента в более высокой концентрации, ниже, чем для композиций, содержащих соль малеат, форма 2, активного ингредиента в таких композициях в более низкой концентрации.
В подобных исследованиях материала примера 1B и примера 2B (т.е. немикронизованного материала и материала вне смеси), в которых образцы хранят до 30 дней в условиях 50°C/75% RH, 60°C/50% RH, 70°C/10% RH, 70°C/75% RH и 80°C/50% RH, получают качественно схожие результаты, т.е. процент общего разложения для соли малеата всегда ниже, чем для свободного основания (данные не приводятся).
Из таких результатов оказывается, что соль малеат соединения по изобретению является химически более устойчивой (одна и в комбинации с лактозой), чем форма свободного основания.
Пример 6. Биологическое исследование.
Экспериментальные методы биологического исследования.
Анализы ингибирования ферментов.
Активность ингибирования ферментов соединения, раскрытого в настоящем описании, определяют FRET с использованием синтетических пептидов, меченных как донорными, так и акцепторными флуорофорами (Z-LYTE, Life Technologies, Paisley, UK).
Ингибирование фермента MAPKa p38.
Ингибирующую активность соединения по изобретению против изоформы MAPKa p38 (MAPK14: Life Technologies) оценивают косвенно путем определения уровня активации/фосфорилирования пептида-мишени молекулы MAPKAP-K2 ниже MAPKa p38. Фермент (40 нг/мл, 2,5 мкл) инкубируют с испытываемым соединением (2,5 мкл раствора 40 мкг/мл, 12 мкг/мл, 4 мкг/мл, 1,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,12 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,012 мкг/мл, 0,004 мкг/мл или 0,0012 мкг/мл) в течение 2 ч при RT. Затем к смеси фермент/соединение добавляют FRET пептиды (8 мкМ, 2,5 мкл) и неактивную p38α-мишень MAPKAPK2 (Life Technologies, 2000 нг/мл) и соответствующий раствор АТФ (2,5 мкл, 40 мкМ) и инкубируют в течение 1 ч при RT. Добавляют проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) за 1 ч до детекции во флуоресцентном микроспектрофотометре (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA, США).
Ингибирование фермента MAPKy p38.
Ингибирующую активность соединения по изобретению против MAPKy p38 (MAPK12: Life Technologies) оценивают путем определения уровня активации/фосфорилирования пептида-мишени. Фермент (800 нг/мл, 2,5 мкл) инкубируют с испытываемым соединением (2,5 мкл раствора 40 мкг/мл, 12 мкг/мл, 4 мкг/мл, 1,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,12 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,012 мкг/мл, 0,004 мкг/мл или 0,0012 мкг/мл) в течение 2 ч при RT. Затем к смесям ферменты/соединение добавляют FRET пептиды (8 мкМ, 2,5 мкл) и соответствующий раствор АТФ (2,5 мкл, 400 мкМ) и инкубируют в течение 1 ч при RT. Добавляют проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) за 1 ч до детекции во флуоресцентном микроспектрофотометре (Envision, Perkin Elmer).
Ингибирование ферментов Hck, c-Scr и Syk.
Ингибирующую активность соединения по изобретению против ферментов Hck, c-Scr и Syk (Life Technologies) оценивают способом, схожим с описанным в настоящем описании выше. Соответствующий фермент (соответственно, 1000 нг/мл, 1400 нг/мл или 2000 нг/мл, 2,5 мкл) инкубируют с испытываемым соединением (40 мкг/мл, 12 мкг/мл, 4 мкг/мл, 1,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,12 мкг/мл, 0,04 мкг/мл,
- 29 034927
0,012 мкг/мл, 0,004 мкг/мл или 0,0012 мкг/мл, 2,5 мкл каждого раствора) в течение 2 ч при RT. Затем к смесям фермент/соединение добавляют FRET пептиды (8 мкМ, 2,5 мкл) и соответствующие растворы АТФ (2,5 мкл, 800 мкМ для c-Scr и 60 мкМ АТФ для НСК и Syk) и инкубируют в течение 1 ч при RT. Добавляют проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) за 1 ч до детекции во флуоресцентном микроспектрофотометре (Envision, Perkin Elmer).
Ингибирование фермента GSK 3α.
Ингибирующую активность соединения по изобретению против изоформы фермента GSK 3 α (Life Technologies) оценивают способом, схожим с описанным в настоящем описании выше. Белок GSK3a (500 нг/мл, 2,5 мкл) инкубируют с испытываемым соединением (2,5 мкл 40 мкг/мл, 12 мкг/мл, 4 мкг/мл, 1,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,12 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,012 мкг/мл, 0,004 мкг/мл или 0,0012 мкг/мл) в течение 2 ч при RT. Затем к смеси фермент/соединение добавляют FRET пептид (8 мкМ, 2,5 мкл), который является мишенью фосфорилирования для GSK3a, и раствор АТФ (40 мкМ, 2,5 мкл), и полученную смесь инкубируют в течение 1 ч при RT. Добавляют проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) за 1 ч до детекции во флуоресцентном микроспектрофотометре (Envision, Perkin Elmer).
Во всех случаях сайт-специфическая протеаза расщепляет только нефософорилированный пептид и устраняет сигнал FRET. Уровни фосфорилирования в каждой реакции вычисляют с использованием отношения испускания кумарина (донор) к испусканию флуоресцеина (акцептор), причем низкие отношения указывают на высокие уровни фосфорилирования и высокие отношения указывают на низкие уровни фосфорилирования. Процент ингибирования в каждой реакции вычисляют относительно неингибированного контроля, и затем вычисляют концентрацию для 50% ингибирования (величина IC50) из кривой зависимости от концентрации.
Клеточные анализы (используемые в примерах).
Для оценки соединения по настоящему изобретению используют следующие клеточные анализы, и результаты приводятся ниже.
ЛПС-индуцированное высвобождение TNFa/IL-8 в клетках d-U937.
Клетки U937 клеточной линии моноцитов человека дифференцируют в клетки типа макрофагов путем инкубации с РМА (100-200 нг/мл) в течение 48-72 ч. Клетки предварительно инкубируют с конечными концентрациями испытываемого соединения в течение 2 ч и затем стимулируют ЛПС (0,1 мкг/мл; из E.Coli: 0111:B4, Sigma) в течение 4 ч. Супернатант собирают для определения концентраций TNFa и IL-8 сэндвич-ELISA (Duo-set, R&D Systems). Ингибирование продуцирования TNFa и IL-8 вычисляют в виде процента от ингибирования, которого достигают с помощью 10 мкг/мл BIRB796 при каждой концентрации испытываемого соединения путем сравнения с контролем средой. Относительную 50% эффективную концентрацию (REC50) определяют из полученной кривой зависимости от концентрации. Ингибирование продуцирования IL-8 вычисляют при каждой концентрации испытываемого соединения путем сравнения с контролем средой. Из полученной кривой зависимости от концентрации вычисляют концентрацию для 50% ингибирования (IC50).
Вызываемая поли-FC экспрессия ICAM-1 в клетках BEAS2B.
Поли-FC используют в таких исследованиях, как простой миметик РНК вируса. Смесь поли-Т:Солигофектамин (2% олигофектамина±1 мкг/мл поли-ЕС, 25 мкл; Life Technologies и Invivogen Ltd., San Diego, CA соответственно) трансфицируют в клетки BEAS2B (клетки бронхиального эпителия человека, ATCC). Клетки предварительно инкубируют с конечными концентрациями испытываемых соединений в течение 2 ч и определяют уровень экспрессии ICAM-1 на поверхности клеток ELISA на клеточной основе. В момент времени 18 ч после трансфекции поли-FC клетки фиксируют в 4% растворе формальдегида в PBS (100 мкл) и затем эндогенную пероксидазу блокируют, добавляя буфер для промывки (100 мкл, 0,05% Твин в PBS: PBS-Твин), содержащий 0,1% азида натрия и 1% пероксида водорода. Клетки промывают буфером для промывки (3x200 мкл). После блокады лунок 5% молоком в PBS-твин (100 мкл) в течение 1 ч клетки инкубируют с антителами против человеческого ICAM-1 (50 мкл; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) в 1% BSA в PBS в течение ночи при 4°C.
Клетки промывают PBS-твином (3x200 мкл) и инкубируют с вторичными антителами (100 мкл; антикроличий IgG, конъюгированный с HPR, Dako Ltd., Glostrup, Дания). Затем клетки инкубируют с субстратом (50 мкл) в течение 2-20 мин с последующим добавлением стоп-раствора (50 мкл, 1N H2SO4). Сигнал ICAM-1 детектируют, считывая поглощение при 450 нм против эталонной длины волны 655 нм с использованием спектрофотометра. Затем клетки промывают PBS-твином (3x200 мкл), и определяют число клеток в каждой лунке, считывая поглощение при 595 нм после окрашивания кристаллическим фиолетовым (50 мкл 2% раствора в PBS) и элюирования 1% раствором SDS (100 мкл) в PBS. Измеренные показания OD 450-655 корректируют по числу клеток путем деления на показание OD595 в каждой лунке. Ингибирование экспрессии ICAM-1 вычисляют при каждой концентрации испытываемого соединения путем сравнения с контролем средой. Из полученной кривой зависимости от концентрации вычисляют концентрацию для 50% ингибирования (IC50).
Анализ митоза клеток.
Мононуклеоциты из периферической крови (PBMC) от здоровых субъектов выделяют из цельной
- 30 034927 крови (Quintiles, London, UK) с использованием градиента плотности (Histopaque®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, UK). Затем РВМС (3 млн клеток на образец) обрабатывают 2% PHA (Sigma-Aldrich, Poole, UK) в течение 48 ч с последующим воздействием в течение 20 ч испытываемых соединений в различных концентрациях. За 2 ч до сбора РВМС обрабатывают демеколцином (0,1 мкг/мл; Life Technologies, Paisley, UK) для того, чтобы клетки остались в метафазе. Для того чтобы наблюдать митозные клетки, РВМС пропитывают и фиксируют, добавляя Intraprep (50 мкл; Beckman Couter, Франция), и окрашивают антифосфогистоном 3 (0,26 нг/л; #9701; Cell Signaling) и иодидом пропидия (1 мг/мл; Sigma-Aldrich), как описано ранее (Muehlbauer P.A. et al., Mutation Res., 2003, 537, 117-130). Флуоресценцию наблюдают с использованием проточного цитометра ATTUNE (Life Technologies), препятствуя лимфоцитам. Процент ингибирования митоза вычисляют для каждой обработки относительно обработки средой (0,5% ДМСО).
Влияние испытываемых соединений на жизнеспособность клеток: анализ с МТТ.
Дифференцированные клетки U937 предварительно инкубируют с каждым испытываемым соединением (конечная концентрация 10 мкг/мл в 200 мкл сред, указанных ниже) по двум схемам: первая в течение 4 ч в средах RPMI1640 с 5% FCS, и вторая в средах RPMI1640 с 10% FCS в течение 24 ч. Супернатант заменяют новыми средами (200 мкл) и в каждую лунку добавляют исходный раствор МТТ (10 мкл, 5 мг/мл). После инкубации в течение 1 ч среды удаляют в каждую лунку добавляют ДМСО (200 мкл), планшеты слегка встряхивают в течение 1 ч и затем считывают поглощение при 550 нм. Процент утраты клетками жизнеспособности вычисляют для каждого соединения относительно обработки средой (0,5% ДМСО). Затем явное возрастание жизнеспособности клеток в случае обработки лекарственным средством относительно среды вносят в таблицу в виде отрицательного процента.
Продуцирование цитокинов в обработанных ЛПС макрофагах мокроты пациентов с COPD.
Пациенты с COPD вдыхают 3% (мас./об.) гипертонический солевой раствор для небулайзера с использованием ультразвукового небулайзера (Devibiss, Carthage, MO) с вдохами и выдохами в течение 5 мин. Такую процедуру повторяют максимум три раза, пока не получат достаточно мокроты. Образцы мокроты гомогенизируют и энергично перемешивают с использованием вихревого смесителя в 0,02% об./об. растворе детиотреитола (DTT). Образцы повторно суспендируют в PBS (40 мл) с последующим центрифугированием при 1500 об/мин при 4°C в течение 10 мин и получают осадки клеток мокроты. Осадки промывают PBS (40 мл). Затем клетки мокроты ресуспендируют в 4 мл свободной от макрофагов среде (macrophage-SFM, Life Technologies, содержащая 20 E/мл пенициллина, 0,02 мг/мл стрептомицина и 5 мкг/мл амфотерицина B) и высевают в high bound 96-луночный планшет с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37°C и с 5% CO2, чтобы дать возможность макрофагам присоединиться ко дну лунок планшета. Клетки на планшете промывают свежей macrophage-SFM (200 мкл/лунка) для удаления нейтрофилов и других загрязняющих клеток. Прилипшие клетки (главным образом, макрофаги мокроты) на планшете используют для дальнейшего анализа. Индукции мокроты проводят в Quintiles Drug Research Unit при Guys Hospital, и Quintiles получают одобрение по этике и письменное информированное согласие.
Соответственно, 1 мкл раствора, содержащего или испытываемое соединение или эталон в установленных концентрациях (0,1 мкг/мл, 0,01 мкг/мл или 0,001 мкг/мл), или, с другой стороны, 1 мкл среды ДМСО как контроля, добавляют в каждую лунку (200 мкл) и клетки инкубируют в течение 2 ч. Клетки стимулируют раствором ЛПС (50 мкл, конечная концентрация 1 мкг/мл) и инкубируют в течение 18 ч при 37°C и с 5% CO2. Затем собирают супернатант и хранят при -80°C. Используют подходящие наборы Luminex для оценки выбранных аналитов. После оттаивания супернатанта мультиплексируют магнитные гранулы с антителами и инкубируют в 96-луночном планшете со стандартным фоновым раствором или соответствующим объемом образца в течение ночи при встряхивании при 4°C. После двукратной промывки буфером для промывки из набора по 200 мкл на лунку с использованием промывающего устройства для планшета с магнитными частицами гранулы инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при RT с раствором антител, конъюгированных с биотином, предоставленным набором. Добавляют раствор стрептавидина в течение 30 мин при RT при встряхивании. После промывки 200 мкл буфера для промывки на лунку гранулы ресуспендируют в Sheath Fluid (150 мкл) и сразу же анализируют. Уровень каждого аналита в супернатанте вычисляют с использованием программы Xcel Fit с уравнением с 4 или 5 параметрами с использованием каждой стандартной кривой. Ингибирование продуцирования каждого цитокина вычисляют при каждой концентрации путем сравнения с контролем средой.
Риновирусиндуцированное высвобождение IL-8.
Риновирус RV16 человека получают из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Вирусные штаммы генерируют путем инфицирования клеток MRC5 HRV до тех пор, пока 80% клеток не подвергнутся цитопатическому действию.
Клетки BEAS2B инфицируют HRV при MOI 1,2 и инкубируют в течение 1 ч при 33°C при осторожном встряхивании для промотирования абсорбции. Затем клетки промывают PBS, добавляют свежие среды и клетки инкубируют дополнительно в течение 72 ч. Собирают супернатант для анализа на концентрации IL-8 с использованием набора Duoset ELISA development (R&D Systems, Mineapolis, MN). Соединения добавляют за 2 ч до заражения HRV и через 1 ч после заражения, когда вымывают незараженный HRV.
- 31 034927
Клеточные анализы (не использованные в примерах).
Можно было бы использовать для оценки соединения по настоящему изобретению следующие далее клеточные анализы.
Риновирусиндуцированное высвобождение IL-8 (вариант вышеописанного способа) и экспрессия ICAM-1.
Риновирус RV16 человека получают из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Вирусные штаммы генерируют путем инфицирования клеток Hela HRV до тех пор, пока 80% клеток не подвергнутся цитопатическому действию.
Клетки BEAS2B инфицируют HRV при MOI 5 и инкубируют в течение 1 ч при 33 °C при осторожном встряхивании для промотирования абсорбции. Затем клетки промывают PBS, добавляют свежие среды и клетки инкубируют дополнительно в течение 72 ч. Собирают супернатант для анализа на концентрации IL-8 с использованием набора Duoset ELISA development (R&D Systems, Minneapolis, MN).
Уровень экспрессии ICAM-1 на поверхности клеток определяют ELISA на клеточной основе. Через 72 ч после инфицирования клетки фиксируют 4% раствором формальдегида в PBS. После блокады эндогенной пероксидазы путем добавления 0,1% раствора азида натрия и 1% раствора пероксида водорода клетки промывают буфером для промывки (0,05% Твина в PBS: PBS-Твин). После блокады лунки 5% молоком в PBS-Твин в течение 1 ч клетки инкубируют с антителами против человеческого ICAM-1 в 5% BSA в PBS-Твин (1:500) в течение ночи и инкубируют с вторичными антителами (антикроличий IgG, конъюгированный с HPR, Dako Ltd.). Сигнал ICAM-1 детектируют, добавляя субстрат и считывая поглощение при 450 нм с эталонной длиной волны 655 нм с использованием спектрофотометра. Затем лунки промывают PBS-Твин (3x200 мкл), и определяют число клеток в каждой лунке, считывая поглощение при 595 нм после окрашивания кристаллическим фиолетовым и элюирования 1% раствором SDS. Измеренные показания OD450-655 корректируют по числу клеток путем деления на показание OD595 в каждой лунке. Соединения добавляют за 2 ч до заражения HRV и через 1-2 ч после заражения, когда вымывают незараженный HRV.
ЛПС-индуцированное высвобождение TNFa/IL-8 в клетках РВМС.
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от здоровых субъектов выделяют из цельной крови с использованием градиента плотности (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare).
Клетки РВМС высевают в 96-луночные планшеты и обрабатывают соединениями в нужной концентрации в течение 2 ч перед добавлением 1 нг/мл раствор ЛПС (Escherichia Coli: O111:B4 от Sigma Aldrich) в течение 24 ч в обычных условиях культивирования тканей (37°C, 5% CO2). Супернатант собирают для определения концентраций TNFa сэндвич-ELISA (Duo-set, R&D Systems) и считывают на флуоресцентном микроспектрофотометре (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). Из кривой дозовой зависимости вычисляют концентрацию для 50% ингибирования (IC50) продуцирования IL-8 и TNFa.
Высвобождение IL-2 и IFN-γ в клетках РВМС, стимулированных CD3/CD28.
РВМС от здоровых субъектов выделяют из цельной крови с использованием градиента плотности (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Клетки вносят в 96-луночные планшеты, предварительно сенсибилизированные моноклональными антителами CD3/CD28 (0,3 мкг/мл, eBioscience, и 3 мкг/мл BD, Pharmingen, соответственно). Затем в лунки добавляют соединение в нужной концентрации и планшет оставляют на 3 суток в нормальных условиях культивирования тканей. Супернатанты собирают и определяют высвобождение IL-2 и IFN-γ сэндвич-ELISA (Duo-set, R&D Systems). Определяют IC50 из кривой дозовой зависимости.
IL-1 β-индуцированное высвобождение IL-8 в клетках НТ29.
Клетки НТ29 клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека высевают в 96-луночный планшет (24 ч) и предварительно в течение 2 ч обрабатывают соединениями в нужной концентрации, а затем добавляют 5 нг/мл ΓΕ-1β (Abcam) в течение 24 ч. Супернатанты собирают для количественного определения IL-8 сэндвич-ELISA (Duo-set, R&D Systems). Определяют IC50 из кривой дозовой зависимости.
Пролиферация T-клеток.
РВМС от здоровых субъектов выделяют из цельной крови с использованием градиента плотности (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Фракцию лимфоцитов сначала обогащают CD4+ T-клетками отрицательным магнитным клеточным сортингом по инструкциям изготовителя (Milttenyi Biotec 130-091155). Затем отделяют нативные CD4+ T-клетки с использованием положительного магнитного отбора CD45RA+ клеток с использованием микрошариков по инструкциям изготовителя (130-045-901). Клетки высевают по 2x105 клеток на лунку в 100 мкл RPMI/10% PBS в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками (Corning Costar). Разбавляют 25 мкл испытываемого соединения в соответствующей концентрации (8x конечная конц.) в нормальной среде и добавляют в лунки на планшете по две для достижения интервала зависимости от дозы 0,03 нг/мл - 250 нг/мл. Добавляют ДМСО как отрицательный контроль. Планшеты предварительно инкубируют в течение 2 ч и затем стимулируют 1 мкг/мл анти-CD3 (OKT3; eBioscience). Через 72 ч среду в каждой лунке заменяют 150 мкл свежей среды, содержащей 10 мкМ BrdU (Roche). Через 18 ч супернатант удаляют, планшет сушат и клетки фиксируют, добавляя 100 мкл
- 32 034927 фиксирующего/денатурирующего раствора в каждую лунку, в течение 20 мин по инструкциям изготовителя (Roche). Планшеты один раз промывают PBS перед добавлением анти-BrdU антител для детекции и инкубируют в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем планшеты осторожно промывают 3х предоставленным буфером для промывки и проявляют, добавляя 100 мкл раствора субстрата. Реакцию останавливают, добавляя 50 мкл 1М H2SO4, и считывают поглощение при 450 нм на спектрофотометре (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). Из кривой дозовой зависимости определяют IC50.
Анализ биопсии человека.
Получают биопсии слизистой оболочки кишечника из воспаленных участков толстой кишки больных IBD. Биопсийный материал нарезают на небольшие кусочки (2-3 мм) и помещают на стальные объектодержатели в камере для органной культуры при 37°C в атмосфере 5% CO2/95% O2 в бессывороточные среды. К ткани добавляют контроль ДМСО или испытываемые соединения в нужной концентрации и инкубируют в течение 24 ч в камере для органной культуры. Собирают супернатант для определения уровней IL-6, IL-8, !Ρ-1β и TNFa R&D ELISA. Процент ингибирования высвобождения цитокинов испытываемыми соединениями вычисляют относительно высвобождения цитокинов для контроля ДМСО (100%).
Высвобождение IL-2 и IFNy в стимулированных CD3/CD28 клетках LPMC от больных IBD.
Мононуклеарные клетки lamina propria (LPMC) выделяют из операционных образцов воспаленной при IBD слизистой оболочки или операционных образцов здоровой слизистой оболочки и очищают следующим образом. Слизистую оболочку снимают с более глубоких слоев операционных образцов скальпелем и нарезают на фрагменты размером 3-4 мм. Эпителий удаляют, промывая фрагменты ткани три раза 1 мМ ЭДТК (Sigma-Aldrich, Poole, UK) с перемешиванием с использованием магнитной мешалки, удаляя супернатант после каждой промывки. Затем образец обрабатывают коллагеназой типа 1A (1 мг/мл, Sigma-Aldrich) в течение 1 ч при перемешивании при 37°C. Затем полученную клеточную суспензию фильтруют с использованием фильтра с ячейками 100 мкм, дважды промывают, ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% сыворотки плода коровы, 100 E/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и используют для культивирования клеток.
Свежевыделенные LPMC (2х105 клетки/лунка) стимулируют 1 мкг/мл a-CD3/a-CD28 в течение 48 ч в присутствии или контроля ДМСО или соединения в соответствующих концентрациях. Через 48 ч супернатант извлекают и анализируют на присутствие TNFa и IFNy R&D ELISA. Процент ингибирования высвобождения цитокинов испытываемыми соединениями вычисляют относительно высвобождения цитокинов, определенного для контроля ДМСО (100%).
Ингибирование высвобождения цитокинов из миофибробластов, взятых у болвных IBD.
Миофибробласты из воспаленной при IBD слизистой оболочки выделяют следующим образом.
Слизистую оболочку иссекают и отделяют, образцы слизистой оболочки размером 1 мм культивируют при 37°C во влажной камере с CO2 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Sigma-Aldrich) с добавлением 20% FBS, 1% ненезаменимых аминокислот (Invitrogen, Paisley, UK), 100 E/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина и 1 мкг/мл амфотерицина (Sigma-Aldrich). Созданные колонии миофибробластов высевают в 25-см3 колбы для культивирования и культивируют в DMEM с добавлением 20% FBS и антибиотиков по меньшей мере до 4 пассажа для получения достаточного количества для использования в экспериментах по стимуляции.
Затем субконфлюэнтный монослой миофибробластов высевают в 12-луночные планшеты по 3х105 клеток на лунку и подвергают голоданию в бессывороточной среде в течение 24 ч при 37°C, 5% CO2, перед культивированием в течение 24 ч в присутствии или контроля ДМСО или соединения в соответствующих концентрациях. Через 24 ч супернатант извлекают и анализируют на присутствие IL-8 и IL-6 R&D ELISA. Процент ингибирования высвобождения цитокинов испытываемыми соединениями вычисляют относительно высвобождения цитокинов, определенного для контроля ДМСО (100%).
Дегрануляция нейтрофилов человека.
Нейтрофилы выделяют из периферической крови человека следующим образом.
Кровь собирают венопункцией и для противодействия свертыванию добавляют смесь 1: 1 ЭДТК и стерильного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, без Ca+/Mg+). Добавляют декстран (3%, мас./об.) (1 ч. раствора декстрана на 4 ч. крови), и кровь выстаивают в течение приблизительно 20 мин пр RT. Супернатант аккуратно расслаивают в градиенте плотности (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare) и центрифугируют (15 мин, 2000 об/мин, без торможения). Супернатант аспирируют, и клеточный осадок ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе (0,2%) не долее 60 секунд (для лизиса загрязняющих красных клеток крови). Затем добавляют 10-кратный объем PBS, и клетки центрифугируют (5 мин, 1200 об/мин). Клетки ресуспендируют в HBSS + (сбалансированный солевой раствор Хэнкса (без фенолового красного), содержащий цитохалазин B (5 мкг/мл) и 1 мМ CaCl2) для достижения 5х105 клетки/мл.
В каждую лунку 96-луночного планшета с клетками с V-образным дном добавляют 5х104 клеток и инкубируют (30 мин, 37°C) с испытываемым соединением в соответствующей концентрации (0,3-1000 нг/мл) или средой (ДМСО, конечная конц. 0,5%). Дегрануляцию стимулируют, добавляя fMLP (конечная
- 33 034927 конц. 1 мкМ), и после дополнительной инкубации (30 мин, 37°C) клетки удаляют центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин), и супернатант переносят в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками. Добавляют равный объем тетраметилбензидина (TMB), через 10 мин реакцию обрывают, добавляя равный объем серной кислоты (0,5М), и считывают поглощение при 450 нм (вычитают фон при 655 нм). Концентрацию для 50% ингибирования определяют из полученной кривой зависимости от концентрации.
Анализ на цитотоксичность.
В соответствующее число лунок 96-луночного планшета добавляют 5х104 клеток TK6 (клеточная линия лимфобластов-T) в 195 мкл сред (RPMI с добавлением 10% сыворотки плода коровы). В лунки добавляют 5 мкл контроля ДМСО (конечная концентрация 0,5%, об./об.) или раствора испытываемого соединения (конечная концентрация 5 или 1 мкг/мл) и инкубируют при 37°C, 5% CO2. Через 24 ч планшет центрифугируют при 1300 об/мин в течение 3 мин и супернатант отбрасывают. Затем клетки ресуспендируют в 7,5 мкг/мл растворе иодида пропидия (PI) в PBS. Через 15 мин клетки анализируют проточной цитометрией (BD Accuri). Жизнеспособность, %, вычисляют в виде % клеток, которые являются PIотрицательными в экспериментальных лунках, нормализованных к контролю ДМСО.
Скрининг in vivo: фармакокинетика и противовоспалительная активность (используемый в примерах).
Используют следующие скрининги in vivo для оценки соединения по настоящему изобретению, и результаты приводятся ниже.
Накопление ЛПС-индуцированных нейтрофилов у мышей.
Неголодным мышам Balb/C интратрахеальным путем дают дозу или среды или испытываемого вещества в указанное время (в интервале 2-8 ч) и затем стимулируют воспалительную реакцию, применяя стимул ЛПС. В Т=0 мышей помещают в камеру для воздействия и воздействуют ЛПС (7,0 мл 0,5 мг/мл раствора в PBS в течение 30 мин). Еще через 8 ч животным дают наркоз, их трахеи канюлируют, и экстрагируют BALF путем инфузии и затем из их легких берут 1,0 мл PBS через трахеальный катетер. Общее и дифференциальное число белых клеток в образцах BALF измеряют с использованием гемоцитометра Neubaur. Мазки BALF образцов с помощью центрифуги получают центрифугированием при 200 об/мин в течение 5 мин при RT и окрашивают с использованием системы красителей DiffQuik (Dade Behring). Клетки считают с использованием иммерсионной микроскопии. Данные о числе нейтрофилов в BAL приводятся как среднее±S.E.М. (среднеквадратическая ошибка). Процент ингибирования накопления нейтрофилов вычисляют для каждой обработки относительно обработки средой.
Модель с сигаретным дымом.
Крыс A/J (самцы в возрасте 5 недель) подвергают воздействию сигаретного дыма (4% сигаретный дым, разбавленный воздухом) в течение 30 мин/день в течение 11 дней с использованием экспериментальный системы для ингаляции табачного дыма для мелких животных (модель SIS-CS; Sibata Science Technology, Tokyo, Япония). Испытываемые вещества вводят интраназально (35 мкл раствора в смеси 10% ДМСО/PBS) один раз ежедневно в течение 3 дней после последнего воздействия сигаретного дыма. Через 12 ч после последнего дозирования каждому из животных дают наркоз, трахеи канюлируют и собирают бронхоальвеолярную саважную жидкость (BALF). Определяют число альвеолярных макрофагов и нейтрофилов анализом FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, США) с использованием антимышиных антител MOMA2 (макрофаги) или антимышиных антител 7/4 (нейтрофилы). BALF центрифугируют и собирают супернатант. Уровень кератиноцитного хемоаттрактанта (KC; CXCL1) в BALF определяют количественно с использованием набора Quantikine® mouse KC ELISA kit (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, США).
Скрининг in vivo: фармакокинетика и противовоспалительная активность (не используется в примерах).
Следующие скрининги in vivo можно использовать для оценки соединения по настоящему изобретению.
DSS-индуцированный колит у мышей.
Неголодным 10-12-недельным самцам мышей BDF1 перорально через зонд дают дважды в день дозу среды или эталонного соединения (5-ASA) или испытываемого соединения за день до (день -1) стимуляции воспалительной реакции путем обработки DSS. В день 0 исследования DSS (5%, мас./об.) вводят в питьевой воде с последующим BID дозированием среды (5 мл/кг), эталона (100 мг/кг) или испытываемого соединения (5 мг/кг) в течение 7 дней. Питьевую воду с DSS восполняют каждые 3 дня. Во время исследования животных взвешивают каждый день, наблюдают за стулом и регистрируют как оценку, основанную на консистенции стула. Во время умерщвления в день +6 толстую кишку извлекают и регистрируют длину и массу. Участки толстой кишки берут для анализа на MPO для определения инфильтрации нейтрофилов или для гистопатологиической оценки для определения тяжести заболевания.
TNBS-индуцированный колит у мышей.
Неголодным 10-12-недельным самцам мышей BDF1 перорально через зонд дают дважды в день дозу среды (5 мл/кг), или эталонного соединения (будезонид, 2,5 мг/кг), или испытываемого соединения (1,5 или 50 мг/кг) за день до (день -1) стимуляции воспалительной реакции путем обработки 2,4,6
- 34 034927 тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS) (15 мг/мл в смеси 50% этанола/50% физиологического раствора). В день 0 исследования TNBS (200 мкл) вводят внутрь толстой кишки через пластиковый катетер с последующим BID дозированием среды, эталона или испытываемого соединения в течение 2 или 4 дней. Во время исследования животных взвешивают каждый день, наблюдают за стулом и регистрируют как оценку, основанную на консистенции стула. Во время умерщвления в день 2 (или день 4) толстую кишку извлекают и регистрируют длину и массу. Участки толстой кишки берут для анализа на MPO для определения инфильтрации нейтрофилов или для гистопатологии, включая оценку для определения тяжести заболевания.
Адаптивный перенос у мышей.
В день исследования 0 самок мышей Balb/C terminated и получают селезенки для извлечения клеток CD45RBhlgh (с использованием протокола SCID IBD cell Separation). Затем приблизительно 4х105 клетки/мл клеток CD45RBhigh инъецируют IP (100 мкл/мышь) самкам SCID животных. В день 14 исследования мышей взвешивают и произвольно распределяют на группы обработки на основании массы тела. В день 21 вводят соединения BID через оральный зонд в среде арахисовом масле при уровнях доз, указанных ниже, и объеме дозы 5 мл/кг. Обработку продолжают до дня 42 исследования, в этот день животных вскрывают через 4 ч после a.m. введения. Регистрируют длину и массу толстой кишки и используют в качестве вторичной конечной точки в исследовании как меру отека толстой кишки. Затем толстую кишку делят на шесть секций, четыре из которых используют для гистопатологической оценки (первичная конечная точка) и две гомогенизируют для анализа на цитокины. Данные приводят в % ингибирования индукции окна между наивными животными и животными со средой, где более высокое ингибирование предполагает большую близость к наивному фенотипу без заболевания.
Результаты скрининга in vitro и in vivo.
Результаты скрининга in vitro для соединения по изобретению (форма свободного основания) приводятся ниже в табл. 2, 3, 4 и 5 и на фиг. 9. Сравнение осуществляют со структурно родственным соединением N-(4-(4-(3 -(3-трет-бутил-1 -п-толил-Ш-пиразол-5 -ил)уреидо)нафталин-1 -илокси)пиридин-2-ил)-2метоксиацетамидом (пример 1 в WO2010/112936), которое ранее описано как сильное противовоспалительное средство с противовирусным действием, а также с пропионатом флутиказона, который является хорошо известным противовоспалительным средством.
Таблица 2
Профиль испытываемых соединений к ферментам p38 MAPKa и γ, HCK, c-Src, Syk и GSK3a
Величины IC50 для ингибирования фермента (нМ)
Испытываемое соединение р38 МАРКа р38 ΜΆΡΚγ ИСК c-Src Syk GSK3a
Эталонное соединение 10 87 7 11 42 18
Соединение по изобретению 26 152 55 199 >15955 >15105
Таблица 3 Ингибирование ЛПС-индуцированного высвобождения TNFa и IL-8 и индуцированной поли-IC экспрессии ICAM-1 испытываемыми соединениями
ЛПС-Индуцированное Поли-IC/ ICAM1 (нМ)
высвобождение (нМ)
IL-8 TNFa
Испытываемое соединение IC50 (dU937) REC50 (dU937) IC50 (BEAS2B)
Эталонное соединение 1,2 0,7 3,8
Соединение по изобретению 11, 4 5,5 61,1
- 35 034927
Таблица 4
Влияние испытываемых соединений на жизнеспособность клеток
Анализ с МТТ1 Анализ митоза2
Жизнеспособность клеток в указанный момент времени в клетках d-U937 Ингибирование (%) митоза
Испытываемое соединение 4 часа 24 часа При 5 мкг/мл
Эталонное соединение - + 93 + 5
Соединение по изобретению - - 18 + 7
1. Скрининг жизнеспособности клеток: -ve и +ve показывает величину ниже и выше, соответственно, несущественный пороговый эффект определяется как 30% ингибирование при 10 мкг/мл в указанный момент времени.
2. Среднее±SEM.
Таблица 5
Влияние испытываемых соединений на продуцирование цитокинов в макрофагах обработанной ЛПС мокроте больных COPD
Процент ингибирования при 0,1 мкг/мл
Испытываемое соединение IL-6
Пропионат флутиказона 29 ± 21
Соединение по изобретению 48 ± 9
Вывод из результатов скрининга in vitro и in vivo.
Соединение по изобретению показывает профиль в анализах in vitro и in vivo, соответствующий противовоспалительной активности. Оно имеет очень слабую активность для киназ Syk и GSK3a (табл. 2 и 3).
Соединение по изобретению показывает заметно меньшую активность в системе анализов, которые определяют его влияние на жизнеспособность клеток, что указывает, что оно вероятно обладает превосходным терапевтическим индексом по сравнению с эталонным соединением (табл. 4).
Соединение по изобретению показывает превосходную противовоспалительную активность по сравнению с пропионатом флутиказона в используемой системе анализов (табл. 5).
Соединение по изобретению показывает зависимое от дозы ингибирование HRV-индуцированного IL-8 (фиг. 9).
В итоге такие результаты предполагают, что соединение по изобретению имеет противовоспалительные свойства, схожие с эталонным соединением, раскрытым выше, и, что является перимуществом, ассоциируется с превосходным терапевтическим индексом.

Claims (19)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы (I)
    Ме (|) или его фармацевтически приемлемая соль.
  2. 2. Соединение по п.1 в форме его соли малеата.
  3. 3. Полиморфная форма 2 соли малеата соединения формулы (I)
    - 36 034927
    Me (I) которая характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, содержащей 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 положений пиков, выбранных из 4,2, 8,4, 8,7, 11,0, 11,5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 17,4, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 и 26,3 (±0,2)° 2θ.
  4. 4. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать ферментативную активность MAP-киназы p38 и тирозинкиназ семейства Src, включающая эффективное количество соединения формулы (I) по любому из пп.1-3 в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми разбавителями или носителями.
  5. 5. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать ферментативную активность MAP-киназы p38 и тирозинкиназ семейства Src, включающая эффективное количество соединения формулы (I) по любому из пп.1-3 в форме частиц в комбинации с частицами лактозы.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по п.5, дополнительно включающая частицы стеарата магния.
  7. 7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения хронической обструктивной болезни легких, астмы и детской астмы.
  8. 8. Применение по п.7, где хроническая обструктивная болезнь легких представляет собой хронический бронхит или эмфизему.
  9. 9. Применение соединения по любому из пп.1-3 для изготовления лекарственного средства для лечения хронической обструктивной болезни легких, астмы и детской астмы.
  10. 10. Применение по п.9, где хроническая обструктивная болезнь легких представляет собой хронический бронхит или эмфизему.
  11. 11. Способ лечения состояния, выбранного из хронической обструктивной болезни легких, астмы и детской астмы, который включает введение пациенту эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
  12. 12. Способ по п.11, где хроническая обструктивная болезнь легких представляет собой хронический бронхит или эмфизему.
  13. 13. Применение соединения по любому из пп.1-3 для лечения вирусных обострений воспалительных заболеваний или для лечения вирусных инфекций у пациентов с одним или несколькими хроническими состояниями, выбранными из застойной сердечной недостаточности, хронической обструктивной болезни легких, астмы, диабета, рака, и/или у пациентов с угнетенным иммунитетом.
  14. 14. Применение по п.13, где указанное лечение проводят в комбинации с лечением противовирусными средствами, выбранными из занамивира, озельтамивира, перамивира и ланинамивира.
  15. 15. Соединение формулы (VIII)
    в которой P1 представляет собой аминозащитную группу, которая представляет собой третбутоксикарбонильную группу;
    или его соль.
  16. 16. Сухой порошковый фармацевтический препарат для лечения заболеваний, опосредованных ферментативной активностью MAP-киназы p38 и тирозинкиназ семейства Src, содержащий соединение формулы (I) по любому из пп.1-3.
  17. 17. Сухой порошковый фармацевтический препарат по п.16, в котором соединение находится в тонкоизмельченной форме с массовым медианным диаметром (MMAD) 1-10 мкм.
  18. 18. Сухой порошковый фармацевтический препарат по п.16, в котором соединение микронизировано.
  19. 19. Сухой порошковый фармацевтический препарат по п.16, предназначенный для топического введения в легкие.
EA201691625A 2014-02-14 2015-02-13 Ароматические гетероциклические соединения как противовоспалительные соединения EA034927B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461940282P 2014-02-14 2014-02-14
US201461941064P 2014-02-18 2014-02-18
PCT/EP2015/053151 WO2015121444A1 (en) 2014-02-14 2015-02-13 Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691625A1 EA201691625A1 (ru) 2017-01-30
EA034927B1 true EA034927B1 (ru) 2020-04-07

Family

ID=52573661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691625A EA034927B1 (ru) 2014-02-14 2015-02-13 Ароматические гетероциклические соединения как противовоспалительные соединения

Country Status (21)

Country Link
US (8) US9884845B2 (ru)
EP (4) EP3418279B1 (ru)
JP (4) JP6586098B2 (ru)
KR (1) KR102413704B1 (ru)
CN (4) CN113264921B (ru)
AU (3) AU2015216957B2 (ru)
BR (1) BR112016015838B1 (ru)
CA (2) CA2939355A1 (ru)
DK (2) DK3357919T3 (ru)
EA (1) EA034927B1 (ru)
ES (2) ES2677595T3 (ru)
HK (1) HK1259444A1 (ru)
JO (1) JO3392B1 (ru)
MX (2) MX371312B (ru)
PL (2) PL3357919T3 (ru)
PT (2) PT3357919T (ru)
SG (1) SG11201607058PA (ru)
TR (1) TR201809072T4 (ru)
TW (2) TWI751099B (ru)
UY (1) UY35998A (ru)
WO (2) WO2015121660A1 (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2229391B1 (en) 2007-12-19 2014-08-06 Cancer Research Technology Limited Pyrido[2,3-b]pyrazine-8-substituted compounds and their use
PL2531502T3 (pl) 2010-02-01 2014-08-29 Cancer Research Tech Ltd 1-(5-tert-Butylo-2-fenylo-2H-pirazol-3-ilo)-3-[2-fluoro-4-(1-metylo-2-okso-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b]pirydyn-7-yloksy)-fenylo]-mocznik i związki pokrewne oraz ich zastosowanie w terapii
MY167798A (en) 2011-10-03 2018-09-26 Respivert Ltd 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
WO2014033447A2 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014033449A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2890460B1 (en) 2012-08-29 2017-02-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014076484A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2970190A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014162121A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
CN105408315B (zh) 2013-04-02 2018-09-14 瑞斯比维特有限公司 激酶抑制剂
GB201320732D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Methods of chemical synthesis
GB201320729D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
US9890185B2 (en) 2013-12-20 2018-02-13 Respivert Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
CN113264921B (zh) 2014-02-14 2024-09-13 瑞斯比维特有限公司 作为激酶抑制剂的吡唑基-脲
MA40774A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38
CN105801486A (zh) * 2016-03-31 2016-07-27 常州大学 一种1-（2,4二溴苯基）-3-吡唑醇的合成方法
CA3015978A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors
US20190151324A1 (en) * 2016-06-23 2019-05-23 University Of Maryland, Baltimore NON-CATALYTIC SUBSTRATE-SELECTIVE P38alpha-SPECIFIC MAPK INHIBITORS WITH ENDOTHELIAL-STABILIZING AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY, AND METHODS OF USE THEREOF
US10342786B2 (en) 2017-10-05 2019-07-09 Fulcrum Therapeutics, Inc. P38 kinase inhibitors reduce DUX4 and downstream gene expression for the treatment of FSHD
WO2019071144A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Fulcrum Therapeutics, Inc. USE OF P38 INHIBITORS TO REDUCE DUX4 EXPRESSION
JP2022511555A (ja) 2018-12-07 2022-01-31 ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア 非ＡＴＰ／触媒部位ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤
WO2020154350A1 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Imidazo[1,5-a]pyridine, 1,2,4-triazolo[4,3-a]pyridine and imidazo[1,5-a]pyrazine as jak inhibitors
CN116406355A (zh) * 2020-05-18 2023-07-07 Gen1E生命科学公司 P38α促分裂原活化蛋白激酶抑制剂
CN111889025B (zh) * 2020-09-01 2022-01-11 山东大学 一种耐酸碱耐盐超两亲分子乳化剂及其制备方法和乳液
EP4237415A1 (en) 2020-10-29 2023-09-06 GEN1E Lifesciences Inc. Crystalline 5-(dimethylamino)-n-(4-(morpholinomethyl)phenyl) naphthalene-1-sulfonamide di-hydrochloride di-hydrate
EP4313959A1 (en) 2021-03-23 2024-02-07 GEN1E Lifesciences Inc. Substituted naphthyl p38alpha mitogen-activated protein kinase inhibitors

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043384A1 (en) * 1999-01-19 2000-07-27 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
WO2010112936A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Respivert Limited P38map kinase inhibitor
WO2011124923A2 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 Respivert Limited Novel compounds
WO2013050757A1 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Respivert Limited 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1056725B1 (en) 1997-12-22 2006-06-07 Bayer Pharmaceuticals Corp. Inhibition of raf kinase using aryl and heteroaryl substituted heterocyclic ureas
US20080300281A1 (en) 1997-12-22 2008-12-04 Jacques Dumas Inhibition of p38 Kinase Activity Using Aryl and Heteroaryl Substituted Heterocyclic Ureas
DE1043995T1 (de) 1997-12-22 2001-06-07 Bayer Corp., Pittsburgh INHIBIERUNG DER p38 KINASE-AKTIVITÄT DURCH DIE VERWENDUNG VON ARYL- UND HETEROARYLSUBSTITUIERTEN HARNSTOFFEN
US7329670B1 (en) 1997-12-22 2008-02-12 Bayer Pharmaceuticals Corporation Inhibition of RAF kinase using aryl and heteroaryl substituted heterocyclic ureas
ES2253233T3 (es) 1999-07-09 2006-06-01 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Procedimiento para sintesis de compuestos de urea heteroaril sustituidos.
MXPA02004879A (es) 1999-11-16 2002-08-30 Boehringer Ingelheim Pharma Derivados de urea como agentes antiinflamatorios.
US6525046B1 (en) 2000-01-18 2003-02-25 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
US6492529B1 (en) 2000-01-18 2002-12-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Bis pyrazole-1H-pyrazole intermediates and their synthesis
WO2001064643A2 (en) 2000-02-29 2001-09-07 Cor Therapeutics, Inc. BENZAMIDES AND RELATED INHIBITORS OF FACTOR Xa
MXPA03010487A (es) 2001-05-16 2004-03-09 Boehringer Ingelheim Pharma Derivados de diarilurea utiles como agentes antiinflamatorios.
EP1408950B1 (en) 2001-07-11 2007-04-25 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Methods of treating cytokine mediated diseases
WO2003068229A1 (en) 2002-02-11 2003-08-21 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyridine, quinoline, and isoquinoline n-oxides as kinase inhibitors
EP1478358B1 (en) 2002-02-11 2013-07-03 Bayer HealthCare LLC Sorafenib tosylate for the treatment of diseases characterized by abnormal angiogenesis
JP4629978B2 (ja) * 2002-02-25 2011-02-09 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド サイトカイン媒介疾患の治療に有用な１，４−二置換ベンゾ縮合シクロアルキル尿素化合物
MXPA05000130A (es) 2002-06-27 2005-02-17 Novo Nordisk As Derivados de aril-carbonilo como agentes terapeuticos.
WO2004007472A1 (ja) 2002-07-10 2004-01-22 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Ｃｃｒ４アンタゴニストおよびその医薬用途
UY28213A1 (es) 2003-02-28 2004-09-30 Bayer Pharmaceuticals Corp Nuevos derivados de cianopiridina útiles en el tratamiento de cáncer y otros trastornos.
ES2357288T3 (es) 2003-02-28 2011-04-25 Bayer Healthcare Llc Derivados de 2-oxo-1,3,5-perhidrotriazapina útiles en el tratamiento de angiogénesis hiperproliferativa y trastornos inflamatorios.
MXPA06012394A (es) 2004-04-30 2007-01-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Derivados de pirazolilurea sustituidos utiles en el tratamiento de cancer.
GB0500435D0 (en) 2005-01-10 2005-02-16 Novartis Ag Organic compounds
EP1899299B1 (en) 2005-06-27 2010-10-20 Bristol-Myers Squibb Company C-linked cyclic antagonists of p2y1 receptor useful in the treatment of thrombotic conditions
US8455471B2 (en) 2006-10-20 2013-06-04 Icos Corporation Compositions of CHK1 inhibitors and cyclodextrin
SI2268623T1 (sl) 2008-03-17 2016-01-29 Ambit Biosciences Corporation Derivati kinazolina kot modulatorji raf-kinaze in postopki uporabe le-teh
GB0818033D0 (en) 2008-10-02 2008-11-05 Respivert Ltd Novel compound
MX2011003553A (es) 2008-10-02 2011-05-25 Respivert Ltd Inhibidores de las enzimas de proteina cinasa activadas por mitogeno p38.
EP2370428B1 (en) 2008-12-11 2016-08-10 Respivert Limited P38 map kinase inhibitors
GB0921731D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Theraputic uses
GB0921730D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Method of treatment
EP2738162B1 (en) 2010-03-15 2018-01-03 Ube Industries, Ltd. Method for producing amide compound
GB201005589D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Respivert Ltd Novel compounds
JP5787977B2 (ja) 2010-04-08 2015-09-30 レスピバート・リミテツド Ｐ３８ｍａｐキナーゼ阻害剤
US8933228B2 (en) 2010-06-17 2015-01-13 Respivert, Ltd. Respiratory formulations and compounds for use therein
GB201010193D0 (en) 2010-06-17 2010-07-21 Respivert Ltd Medicinal use
GB201010196D0 (en) 2010-06-17 2010-07-21 Respivert Ltd Methods
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
ME02624B (me) 2011-12-09 2017-06-20 Chiesi Farm Spa Inhibitori kinaze
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
WO2014033449A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2890460B1 (en) 2012-08-29 2017-02-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014033447A2 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
GB201215357D0 (en) 2012-08-29 2012-10-10 Respivert Ltd Compounds
WO2014076484A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2970190A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014162121A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
CN105408315B (zh) 2013-04-02 2018-09-14 瑞斯比维特有限公司 激酶抑制剂
US9890185B2 (en) 2013-12-20 2018-02-13 Respivert Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
CN113264921B (zh) 2014-02-14 2024-09-13 瑞斯比维特有限公司 作为激酶抑制剂的吡唑基-脲
EP3201189A1 (en) 2014-10-01 2017-08-09 Respivert Limited N-phenyl-3-quinazolin-6-yl-benzamide derivatives as p38 kinase inhibitors
MA40774A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043384A1 (en) * 1999-01-19 2000-07-27 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
WO2010112936A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Respivert Limited P38map kinase inhibitor
WO2011124923A2 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 Respivert Limited Novel compounds
WO2013050757A1 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Respivert Limited 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016015838A8 (pt) 2021-07-06
US10045980B2 (en) 2018-08-14
KR20160115949A (ko) 2016-10-06
CA2938924C (en) 2023-01-31
CN110522731A (zh) 2019-12-03
US9884845B2 (en) 2018-02-06
CN113264921B (zh) 2024-09-13
JO3392B1 (ar) 2019-10-20
US20210179584A1 (en) 2021-06-17
PT3357919T (pt) 2020-02-20
MX2016010572A (es) 2016-11-29
AU2019204525A1 (en) 2019-07-18
US20160368896A1 (en) 2016-12-22
US9624196B2 (en) 2017-04-18
TWI664967B (zh) 2019-07-11
EP3105223A1 (en) 2016-12-21
US9447076B2 (en) 2016-09-20
JP2020015743A (ja) 2020-01-30
US10294216B2 (en) 2019-05-21
JP6952085B2 (ja) 2021-10-20
DK3357919T3 (da) 2020-02-17
TR201809072T4 (tr) 2018-07-23
AU2015216705B2 (en) 2019-03-28
ES2677595T3 (es) 2018-08-03
CN106164067B (zh) 2019-09-10
WO2015121444A1 (en) 2015-08-20
AU2019204525B2 (en) 2021-01-21
MX2016010571A (es) 2017-01-05
US20200002311A1 (en) 2020-01-02
TW201620518A (zh) 2016-06-16
US11142515B2 (en) 2021-10-12
PT3105222T (pt) 2018-07-18
EP3357919B1 (en) 2019-11-20
US11634406B2 (en) 2023-04-25
JP2020055847A (ja) 2020-04-09
MX371353B (es) 2020-01-27
CN106164067A (zh) 2016-11-23
US20190092752A1 (en) 2019-03-28
JP2017505794A (ja) 2017-02-23
EA201691625A1 (ru) 2017-01-30
EP3105222A1 (en) 2016-12-21
US20150232450A1 (en) 2015-08-20
JP6586098B2 (ja) 2019-10-02
CN110522731B (zh) 2022-08-02
KR102413704B1 (ko) 2022-06-24
AU2015216957A1 (en) 2016-07-14
BR112016015838A2 (pt) 2017-08-08
JP2017505784A (ja) 2017-02-23
BR112016015838B1 (pt) 2023-05-09
TW201620895A (zh) 2016-06-16
US20170182039A1 (en) 2017-06-29
SG11201607058PA (en) 2016-10-28
JP6630280B2 (ja) 2020-01-15
EP3357919A1 (en) 2018-08-08
PL3357919T3 (pl) 2020-06-01
CN113264921A (zh) 2021-08-17
WO2015121660A1 (en) 2015-08-20
MX371312B (es) 2020-01-24
CA2939355A1 (en) 2015-08-20
AU2015216957B2 (en) 2019-04-04
US10815217B2 (en) 2020-10-27
US20180118719A1 (en) 2018-05-03
EP3418279B1 (en) 2021-01-20
TWI751099B (zh) 2022-01-01
ES2774249T3 (es) 2020-07-20
CN106573914A (zh) 2017-04-19
CA2938924A1 (en) 2015-08-20
EP3105223B1 (en) 2018-09-12
JP6841891B2 (ja) 2021-03-10
US20170057945A1 (en) 2017-03-02
HK1259444A1 (zh) 2019-11-29
EP3418279A1 (en) 2018-12-26
CN106573914B (zh) 2021-05-28
PL3105222T3 (pl) 2018-09-28
EP3105222B1 (en) 2018-04-11
UY35998A (es) 2015-08-31
DK3105222T3 (en) 2018-07-23
AU2015216705A1 (en) 2016-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6841891B2 (ja) 抗炎症化合物としての芳香族複素環化合物
JP6662863B2 (ja) Ｐ３８キナーゼ阻害剤としての４−（４−（４−フェニルウレイドナフタレン−１−イル）オキシピリジン−２−イル）アミノ安息香酸誘導体
KR102340654B1 (ko) 키나제 저해제