BR112016015838B1 - Compostos heterocíclicos aromáticos, composição farmacêutica e formulação farmacêutica em pó seco compreendendo os referidos compostos, produto de combinação e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS HETEROCÍCLICOS AROMÁTICOS COMO COMPOSTOS ANTI- INFLAMATÓRIOS. Proporciona-se um composto de fórmula (I), como definido no relatório descritivo, o qual é um inibidor da cinase MAP p38, para uso como medicamento para o tratamento inter alia de doenças inflamatórias.

Description

Campo da invenção

[001] A invenção refere-se a um composto que é um inibidor da família das enzimas cinases proteicas ativadas por mitógeno p38 (referido neste documento como inibidores das cinases MAP p38), por exemplo, os seus subtipos de cinases alfa e gama, e da família de ti- rosina cinases Src, e ao seu uso em terapia, incluindo em combinações farmacêuticas, especialmente no tratamento de doenças inflamatórias, em particular, as doenças inflamatórias do pulmão, tais como a asma e a COPD, bem como aquelas do trato gastrointestinal, tais como a colite ulcerativa, a Doença do Intestino Irritável (IBD) e a doença de Crohn e do olho, tal como a uveíte.

Antecedentes da invenção

[002] Quatro isoformas da MAPK p38 (alfa, beta, gama e delta, respectivamente) foram identificadas, cada uma mostrando diferentes padrões de expressão no tecido no homem. As isoformas da MAPK p38 alfa e beta são encontradas abundantemente no corpo, estando presentes em muitos tipos diferentes de células. A isoforma alfa é bem caracterizada em termos de seu papel na inflamação. Embora os estudos usando uma abordagem genética química em camundongos indiquem que a isoforma da MAPK p38 beta não desempenhe um papel na inflamação (O'Keefe, S.J. e col., J. Biol. Chem., 2007, 282(48), 34663-71), ela pode estar envolvida nos mecanismos da dor através da regulação da expressão de COX2 (Fitzsimmons, B.L. e col., Neuro-report, 2010, 21(4), 313-7). Estas isoformas são inibidas por diversos compostos de pequeno peso molecular, anteriormente descritos. As classes iniciais de inibidores eram altamente tóxicas devido à ampla distribuição destas isoformas no tecido, o que resultou em múltiplos efeitos incorretos dos compostos. Além disso, o desenvolvimento de um número substancial de inibidores tem sido descontinuado devido aos perfis inaceitáveis de segurança nos estudos clínicos (Pettus, L.H. e Wurz, R.P., Curr. Top. Med. Chem., 2008, 8(16), 1452-67). Visto que estes efeitos adversos variam com o quimiotipo, e os compostos têm padrões distintos de seletividade pelas cinases, as toxicidades observadas podem estar relacionadas com a estrutura, e não baseadas no mecanismo de p38. Mais recentemente, foram desenvolvidos compostos com maior potência e especificidade pela MAPK p38α/β; entretanto, os níveis de eficácia obtidos no tratamento de doenças inflamatórias crônicas, incluindo a artrite reumatóide (SCIO-469, Genovese e col., J. Rheumatol., 2011, 38, 846-54; Pamapimod, Cohen e col., Arthritis Rheum., 2009, 60, 335-344; BMS-582949, Schieven e col., Arthritis Rheum., 2010, 62, Suppl. 10:1513) e a COPD (Losmapimod, Watz e col., Lancet Resp. Med., 2014, 2, 63-72), foram insatisfatórios. Ademais, é digno de nota que um inibidor da MAPK p38 foi verificado gerar benefício para pacientes com IBD após um tratamento de uma semana, o qual não foi mantido durante um curso de tratamento de quatro semanas (BIRB-796, Schreiber, S. e col., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4, 325-334).

[003] Uma conclusão importante deduzida destes estudos é que o uso de um inibidor de cinase de alvo específico pode não ser suficiente para obter e manter um benefício terapêutico em doenças inflamatórias complexas, onde a desregulação das múltiplas vias imunoin- flamatórias e a adaptação biológica podem ignorar o bloqueio de um mecanismo de alvo único, resultando na perda de resposta. Pode ser afirmado que, para uma doença inflamatória complexa, tal como a COPD, a artrite reumatóide e a IBD, inibidores que alvejem um grupo de cinases que sejam críticas para a regulação dos diferentes mecanismos imunoinflamatórios ligados à patologia terão maior potencial para obter eficácia e uma resposta terapêutica contínua.

[004] O papel da MAPK-alfa p38 na regulação das vias inflamató rias tem sido investigado extensivamente e está bem estabelecido. Menos se sabe sobre as isoformas da MAPK p38 gama e delta, que, ao contrário das isozimas alfa e beta são expressas em tecidos e células específicos. A isoforma da MAPK-delta p38 é expressa mais altamente no pâncreas, testículos, pulmão, intestino delgado e no rim. Ela é também abundante em macrófagos e detectável em neutrófilos, células T CD4+ e em células endoteliais (Shmueli, O. e col., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11), 1067-1072; Smith, S. J. Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Wang, X. S. e col., J. Biol. Chem., 1997, 272(38), 23668-23674). Muito pouco se sabe sobre a distribuição da MAPK p38 gama, embora ela seja expressa mais altamente no cérebro, músculo esquelético e coração, assim como nos linfócitos e macrófagos (Shmueli, O. e col., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11), 1067-1072; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Court, N. W. e col., J. Mol. Cell. Cardiol., 2002, 34(4), 413-26; Mertens, S. e col., FEBS Lett., 1996, 383(3), 273-6). Uma evidência que as cinases MAPK-gama p38 e MAPK-delta p38 são expressas em tipos de células imunologicamente importantes e pró-inflamatórias despertou interesse em suas funções em relação à MAPK-alfa p38. Inibidores seletivos de pequenas moléculas da MAPK p38 gama e da MAPK p38 delta não estão atualmente disponíveis para avaliar as funções destas cinases farmacologicamente, embora se saiba que um composto anteriormente divulgado, o BIRB 796, possui atividade inibitória de todas as isoformas. A inibição das isoformas da MAPK p38 gama e delta é observada em concentrações mais elevadas do composto do que aquelas requeridas para inibir a MAPK p38 alfa e p38 beta (Kuma, Y., J. Biol. Chem., 2005, 280, 19472-19479). Além disso, o BIRB 796 também diminuiu a fosforilação das MPKs p38 e das JNKs pela cinase à montante MKK6 ou MKK4. Kuma discutiu a possibilidade que a mudança conformacional causada pela ligação do inibidor à proteína MAPK poderia afetar a estrutura tanto do seu sítio de fosforilação quanto do sítio de contato para o ativador à montante, com isso diminuindo a fosfo- rilação das MPKs p38 ou das JNKs.

[005] Acredita-se que a cinase MAP p38 desempenhe um papel central em muitas das vias de sinalização que estejam envolvidas em iniciar e manter a inflamação persistente, crônica, em doença humana, por exemplo, na asma severa e na COPD (Chung, F., Chest, 2011, 139(6), 1470-1479). Existe agora uma literatura abundante que demonstra que a cinase MAP p38 é ativada por uma variedade de citoci- nas pró-inflamatórias e que a sua ativação resulta no recrutamento e na liberação de citocinas pró-inflamatórias adicionais. Por exemplo, Smith descreve o efeito inibitório dos inibidores da cinase MAP p28 sobre a liberação de TNFα das PBMCs humanas. Entretanto, a produção de algumas citocinas (IL-8 e GM-CSF) pelos macrófagos do tecido do pulmão isolados de fumantes e ex-fumantes foi relativamente insensível aos inibidores da MAPK p38α/β e Smith sugere que a abundância de MAPK-delta p38 expressa nestas células pode ser responsável pelos efeitos diminuídos dos compostos (Smith e col., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404). Risco e col., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, 109, 11200-11205) usaram camundongos nocautes dos genes de AMPK-gama p38 e MAPK-delta p38 para investigar os papéis destas isoformas de p38 nas vias que regulam a produção de ci- tocinas por macrófagos. Estes estudos estabeleceram que, nos camundongos, ambas as cinases são essenciais para as respostas in-flamatórias imunes naturais, incluindo a produção de citocinas pró- inflamatórias. Mais recentemente, Criado, G. e col., (Arthritis Rheum., 2014, 66(5), 1208-17) demonstraram que, em um modelo de camundongo de artrite inflamatória, a gravidade reduzida da doença em camundongos p38Y/δ-/- estava associada com uma produção de citoci- nas e uma ativação imunológica menores do que em camundongos de controle normais, indicando que a MAPK p38 gama e a MAPK p38 delta são reguladores fundamentais da patologia inflamatória da articulação. Estas descobertas sugerem que, além da MAPK p38 alfa, a MAPK p38 gama e a MAPK p38 delta são alvos terapêuticos potenciais em doenças complexas que envolvam respostas imunes naturais e adaptativas, tais como a COPD.

[006] O uso de inibidores da cinase MAP p38 no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) também tem sido investigado. Os inibidores de pequenas moléculas alvejados para a MAPK p38 α/β provaram ser efetivos na redução de diversos parâmetros de inflamação em células e em tecidos obtidos de pacientes com COPD que, em geral, são insensíveis aos corticosteroides, (Smith, S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404), bem como em diversos modelos de animais in vivo (Underwood, D.C. e col., Am. J. Physiol., 2000, 279, L895-902; Nath, P. e col., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544, 160-167). Irusen e colegas também sugeriram o possível envolvimento da MAPK p38 α/β com a insensibilidade aos corticosteroides por meio da redução da afinidade de ligação do receptor de glicocorticoide (GR) nos núcleos (Irusen, E. e col., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109, 649657). Descreveu-se a experiência clínica com uma variedade de inibidores da cinase MAP p38, incluindo AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 e SCIO323 (Lee, M.R. e Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12, 2979-2994).

[007] A COPD é uma condição na qual a inflamação básica é descrita ser substancialmente resistente aos efeitos anti-inflamatórios dos corticosteroides inalados. Consequentemente, uma estratégia superior para tratar a COPD seria desenvolver uma intervenção que tivesse tanto efeitos anti-inflamatórios inerentes quanto a capacidade de aumentar a sensibilidade dos tecidos do pulmão de pacientes com COPD aos corticosteroides inalados. Uma publicação recente de Mercado (Mercado, N., e col., Mol. Pharmacol., 2011, 80(6), 1128-1135) demonstra que o silenciamento da MAPK-y p38 tem o potencial de restabelecer a sensibilidade aos corticosteroides. A MAPK p38 alfa (Mercado, N. e col., PLoS ONE, 2012, 7(7), e41582, 1-9) e a JNK (Papi e col., J. Allergy Clin. Immunol., 2013, 132, 1075-1085) foram também descritas terem papéis na regulação da insensibilidade aos corticoste- roides e Armstrong e col. (JPET, 2011, 338, 732-740) mostraram que o inibidor da isoforma de p38 misto BIRD-796 e o corticosteróide dexa- metasona têm efeitos anti-inflamatórios sinérgicos sobre os macrófa- gos alveolares da COPD. Consequentemente, pode haver um benefício para os pacientes no uso de um inibidor da cinase MAP p38 alfa- específico para o tratamento de COPD e asma severa.

[008] Muitos pacientes diagnosticados com asma ou com COPD continuam a sofrer de sintomas descontrolados e de pioras de sua condição médica, que podem resultar em hospitalização. Isto ocorre apesar do uso dos regimes de tratamento mais avançados, atualmente disponíveis, que compreendem produtos de combinação de um corti- costeroide inalado e agonista β de longa atuação. Os dados acumulados durante a última década indicam que uma incapacidade de controlar efetivamente o componente inflamatório básico da doença no pulmão é a razão mais provável que as pioras ocorrem. Dada a eficácia estabelecida dos corticosteroides como agentes anti-inflamatórios e, em particular, dos corticosteroides inalados no tratamento de asma, estas descobertas provocaram investigação intensa. Os estudos resultantes identificaram que alguns riscos ambientais causam alterações inflamatórias insensíveis aos corticosteroides nos pulmões dos pacientes. Um exemplo é a resposta que se origina de infecções do trato respiratório superior (URTI) mediadas por vírus, que têm significado particular em aumentar a morbidade associada com a asma e a COPD.

[009] As investigações epidemiológicas revelaram uma forte as sociação entre as infecções virais do trato respiratório superior e uma porcentagem substancial das pioras sofridas por pacientes já diagnosticados com doenças respiratórias crônicas. Alguns dos dados mais convincentes com relação a isso se derivam de estudos longitudinais de crianças que sofrem de asma (Papadopoulos, N.G. e col., Paediatr. Respir. Rev., 2004, 5(3), 255-260). Uma variedade de estudos adicionais suporta a conclusão que uma infecção viral pode precipitar pioras e aumentar a gravidade da doença. Por exemplo, as infecções clínicas experimentais com rinovírus foram descritas causarem hipersensibili- dade bronquial à histamina em asmático que é insensível ao tratamento com corticosteroides (Grunberg, K., e col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 164(10), 1816-1822). Uma evidência adicional deriva-se da associação observada entre as pioras da doença em pacientes com fibrose cística e infecções por HRV (Wat, D. e col., J. Cyst. Fibros., 2008, 7, 320-328). Também está consistente com este corpo de dados a descoberta que as infecções virais respiratórias, incluindo o rinoví- rus, representam um fator de risco independente que se correlaciona negativamente com a taxa de sobrevivência de 12 meses em receptores de transplante de pulmão, pediátricos (Liu, M. e col., Transpl. Infect. Dis., 2009, 11(4), 304-312).

[0010] O TLR3 é um receptor de reconhecimento de padrão de patógeno endossômico que percebe o dsRNA viral que é produzido durante a infecção viral. Nas células epiteliais bronquiais humanas (BEAS2B), a via do TLR3 é ativada em resposta à infecção por rinoví- rus (RV1B e RV39) (Wang e col., J. Immunol., 2009, 183, 6989-6997). O dsRNA inalado e a infecção por rinovírus provocam a piora neutrofí- lica em camundongos alérgicos com asma experimental estabelecida (Mahmutovic-Persson e col., Allergy, 2014, 69(3), 348-358). Em um modelo de asma alérgica, os camundongos nocautes de TLR3 infectados com rinovírus demonstraram infiltração reduzida de neutrófilos e macrófagos nos pulmões e inflamação significativamente menor das vias aéreas quando comparados com os controles positivos para TLR3 (Wang, Q. e col., PLoS Pathog., 7(5), e1002070). Consideradas juntas, estas observações sugerem que a ativação da via do TLR3 é provável de desempenhar um papel importante no desenvolvimento de inflamação das vias aéreas e pioras da doença respiratória em resposta às infecções do trato respiratório mediadas por rinovírus.

[0011] Em células humanas infectadas com rinovírus, a ativação do TLR3 mostrou envolver o recrutamento de receptores e a ativação da cinase c-Src, que media múltiplos efeitos celulares à jusante. Surgiu um número pequeno de estudos que liga a ativação das cinases Src (Src1 ou p60-Src) ou da família de Src a respostas específicas após a infecção com os vírus. Estes incluem um relatório que o ade- novírus provoca uma ativação mediada pela cinase PI3 de Akt através de um mecanismo dependente de c-Src. A atividade da cinase Syk é relatada ser controlada por c-Src como uma cinase à montante na infecção por HRV (Lau e col., J. Immunol., 2008, 180, 870-880). Sugeriu-se também que a produção de IL-8 induzida pelo Rinovíurus-39 em células epiteliais depende da ativação da cinase Src (Bentley, J.K. e col., J. Virol., 2007, 81, 1186-1194). Finalmente, foi proposto que a ativação da cinase Src está envolvida na indução da produção de mucina pelo rinovírus-14 em células epiteliais e glândulas submucosas (Inoue, D. e col., Respir. Physiol. Neurobiol., 2006, 154(3),484-499).

[0012] Divulgou-se anteriormente que os compostos que inibem a p59-HCK são efetivos contra a replicação do vírus influenza Charron, C.E. e col., WO 2011/070369). Certos inibidores da MAPK p38 também foram descritos como inibidores da replicação do vírus sincicial respiratório (Cass, L. e col., WO 2011/158039).

[0013] Pelas razões resumidas acima, os compostos projetados para tratar as doenças respiratórias crônicas que combinam inibição das cinases c-Src e p59-HCK com a inibição das MAPKs p38 são esperados serem particularmente eficazes.

[0014] Além de desempenhar papéis-chave nos eventos de sinali zação das células que controlam a atividade das vias pró- inflamatórias, as enzimas cinases são agora também reconhecidas regularem a atividade de uma variedade de funções celulares. Entre as que foram discutidas recentemente estão a manutenção da integridade do DNA (Shilo, Y. Nat. Rev. Cancer, 2003, 3, 155-168) e a coordenação dos processos complexos da divisão celular. Uma ilustração das descobertas recentes é uma publicação que descreve o impacto de um grupo de inibidores que atua sobre as assim chamadas "cina- ses de Olaharsky" sobre a frequência da formação de micronúcleos in vitro (Olaharsky, A.J. e col., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446). A formação de micronúcleos está envolvida no, ou associada com o, rompimento de processos mitóticos e é, portanto, uma manifestação indesejável de toxicidade potencial. A inibição da cinase glicogênio sintase 3α (GSK3a) foi verificada ser um fator particularmente significativo que aumenta a probabilidade de um inibidor de ci- nase de promover a formação de micronúcleos. Recentemente, a inibição da cinase GSK3β com o RNAi foi também descrita promover a formação de micronúcleos (Tighe, A. e col., BMC Cell Biology, 2007, 8:34).

[0015] Pode ser possível atenuar os efeitos adversos que resultam das interações dos fármacos com as cinases de Olaharsky, tais como a GSK3α, por otimização da dose e/ou por alteração da rota de administração. Entretanto, seria mais vantajoso identificar moléculas tera- peuticamente úteis que demonstrassem atividade baixa ou indetectá- vel contra estas enzimas incorretas e, consequentemente, provocassem pouco ou nenhum rompimento dos processos mitóticos, como medido nos ensaios de mitose.

[0016] Está evidente a partir de consideração da literatura citada acima que permanece uma necessidade de identificar e desenvolver novos inibidores das cinases MAP p38 que tenham potencial terapêutico melhorado sobre os tratamentos atualmente disponíveis. Os compostos desejáveis são aqueles que exibem um índice terapêutico superior exercendo, no mínimo, um efeito igualmente eficaz que os agentes anteriores, porém, em um ou mais aspectos, são menos tóxicos na dose terapêutica relevante. Um objetivo da presente invenção, portanto, é proporcionar tal novo composto que inibe a atividade de enzima da cinase MAP p38, por exemplo, com certas especificidades pelos subtipos (particularmente alfa e gama), assim como inibe a atividade de enzima das tirosina cinases dentro da família de Src (tais como p59-HCK e particularmente c-Src), com isso possuindo boas proprie-dades anti-inflamatórias, e adequado para uso em terapia. O composto da invenção exibe atividade inibitória fraca ou nenhuma atividade inibitória das cinases de Olaharsky, tais como a GSK3α, e exibe atividade inibitória fraca ou nenhuma atividade inibitória da cinase SYK, o que contribui para o seu perfil de segurança satisfatório esperado.

Sumário da invenção

[0017] De acordo com a invenção, proporciona-se um composto de fórmula (I):

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0018] O composto de fórmula (I) juntamente com seus sais far- maceuticamente aceitáveis é algumas vezes referido neste documento como "o composto da presente invenção" ou similar.

Breve descrição das figuras

[0019] A figura 1 mostra um espectro de IV (micro ATR) de uma amostra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0020] A figura 2 mostra um padrão de XRD de pó de uma amos tra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0021] A figura 3 mostra um padrão de XRD de pó de uma amos tra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 1.

[0022] A figura 4 mostra uma curva de DSC de uma amostra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0023] A figura 5 mostra uma curva de TGA de uma amostra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0024] A figura 6 mostra uma sobreposição de DVS de uma amos tra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0025] A figura 7 mostra um gráfico cinético de DVS de uma amos tra do composto de fórmula (I), sal de maleato, Forma 2.

[0026] A figura 8 mostra o resultado do teste da estabilidade quí mica sobre diversas composições contendo o composto da invenção (nas formas de base livre e sal de maleato).

[0027] A figura 9 mostra o efeito dos compostos de teste sobre a Liberação de IL-8 induzida por rinovírus nas células BEAS2B.

Descrição detalhada da invenção

[0028] O composto de fórmula (I) pode ser preparado ou empre gado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, incluindo os sais de adição de ácidos não tóxicos terapeuticamente ativos que o composto de fórmula (I) é capaz de formar. Estes sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis podem convenientemente ser obtidos tratando-se a forma de base livre com tais ácidos apropriados, em um solvente ou mistura de solventes adequada. Os ácidos apropriados compreendem, por exemplo, os ácidos inorgânicos, tais como os ácidos hidro-hálicos, p.ex., o ácido clorídrico ou bromídrico, os ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico e similares; ou os ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, o ácido acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, malônico, succínico, maléico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, p- toluenossulfônico, ciclâmico, salicílico, p-aminossalicílico, pamóico e similares. De preferência, o composto de fórmula (I) é empregado na forma de seu sal de maleato. Inversamente, as ditas formas de sais podem ser convertidas, por tratamento com uma base apropriada, na forma de base livre.

[0029] A invenção proporcionada neste documento se estende pa ra todos os estereoisômeros do composto de fórmula (I). O termo este- reoisômeros, conforme empregado neste documento, refere-se às moléculas isoméricas que têm a mesma fórmula molecular e sequência dos átomos ligados (constituição), porém que diferem somente nas orientações tridimensionais de seus átomos no espaço.

[0030] Conforme empregado neste documento, pretende-se que a definição do composto de fórmula (I) inclua todos os tautômeros dos ditos compostos, e os solvatos dos ditos compostos (incluindo os sol- vatos dos sais dos ditos compostos), a não ser que o contexto especi-ficamente indique de outro modo. Os exemplos de solvatos incluem os hidratos.

[0031] A invenção proporcionada neste documento estende-se pa ra os pró-medicamentos do composto de fórmula (I), isto quer dizer, os compostos que se decompõem e/ou são metabolizados in vivo para proporcionar um composto ativo de fórmula (I).

[0032] Em um aspecto adicional da invenção, proporciona-se um ou mais metabólitos do composto de fórmula (I), em particular, um me- tabólito que conserva uma ou mais das atividades terapêuticas do composto de fórmula (I). Um metabólito, como empregado neste documento, é um composto que é produzido in vivo a partir do metabolismo do composto de fórmula (I), tal como, sem limitação, os metabóli- tos oxidativos e/ou os metabólitos gerados, por exemplo, a partir da O- desalquilação.

[0033] O composto divulgado inclui um composto onde o átomo especificado é um isótopo que ocorre naturalmente ou que não ocorre naturalmente. Em uma modalidade, o isótopo é um isótopo estável. Desse modo, o composto divulgado inclui, por exemplo, os compostos contendo o deutério e similares.

[0034] A divulgação também se estende para todas as formas po- limórficas dos compostos aqui contidos, definidos.

[0035] Um primeiro processo para preparar um composto de fór mula (I) ou um derivado protegido dele compreende reagir um composto de fórmula (II)

[0036] ou um derivado protegido dele

[0037] em que LG1 representa um grupo abandonador;

[0038] com um composto de fórmula (III)

[0039] ou um derivado protegido dele;

[0040] e, opcionalmente, desproteger o produto para produzir um composto de fórmula (I).

[0041] Nos compostos de fórmula (II), os exemplos de grupos abandonadores LG incluem o halo (especialmente Cl, Br) e arilóxi-, especialmente o fenóxi-.

[0042] Os grupos de proteção adequados e os meios para a sua remoção são descritos infra.

[0043] As condições adequadas para a reação dos compostos de fórmulas (II) e (III) incluem tratar uma mistura de (II) e (III) em um solvente adequado, tal como o THF, o DCM ou o acetato de isopropila, com a trietilamina ou a base de Hunig, e aquecer a reação até uma temperatura tal como 40°C.

[0044] Um segundo processo para preparar um composto de fór mula (I) compreende reagir um composto de fórmula (IV)

[0045] ou um derivado protegido dele,

[0046] com um composto de fórmula (V)

[0047] em que LG2 representa o grupo abandonador, tal como ha lo e, especialmente, o Cl

[0048] ou um derivado protegido dele

[0049] e, opcionalmente, desproteger o produto para produzir um composto de fórmula (I).

[0050] Os grupos de proteção adequados e os meios para a sua remoção são descritos infra.

[0051] As condições adequadas para a reação dos compostos de fórmulas (IV) e (V) incluem aquelas normalmente empregadas para a reação de Buchwald, i.e., o tratamento de uma solução de (IV) e (V) em um solvente, tal como a 1,4-dioxana, com uma fonte de paládio e um ligante, tal como o Pd2(dba)3 e a BINAP, e uma base, tal como o terc-butóxido de sódio ou o carbonato de césio, em temperatura elevada.

[0052] Os ligantes alternativos incluem o difenilfosfinoferroceno e a trifenilfosfina; a fonte alternativa de paládio inclui o acetato de paládio (II) e o tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0); as bases alternativas incluem a bis(trimetilsilil)amida de lítio e o fosfato de potássio; os solventes alternativos incluem o THF e o tolueno. Quanto a uma faixa mais ampla de condições, ver Surry, D.S., Buchwald, S.L. (2008), "Biaryl Phospha- ne Ligands in Palladium-Catalyzed Amination", Angew. Chem. Int. Ed., 47, 6338-6361, e as referências nele.

[0053] Os compostos de fórmula (II) podem ser preparados pela reação de um composto de fórmula (VI)

com um composto de fórmula LG1C(=O)LG3, onde LG3 representa um grupo abandonador, tal como halo, e especialmente o Cl.

[0054] As condições adequadas para a reação de um composto de fórmula (VI) com um composto de fórmula LG1C(=O)LG3, onde LG1 é PhO e LG3 é Cl, compreendem o tratamento de uma mistura de uma solução do composto de fórmula (VI) em um solvente, tal como o acetato de isopropila, e uma solução aquosa de uma base inorgânica, tal como o carbonato de sódio com o cloroformato de fenila.

[0055] Os compostos de fórmula (VI) são conhecidos ou podem ser preparados por métodos conhecidos por pessoas versadas na técnica.

[0056] Um primeiro processo para preparar um composto de fór mula (III) compreende reduzir um composto de fórmula (VII)

[0057] As condições adequadas para a redução de um composto de fórmula (VII) incluem o tratamento com gás hidrogênio sobre o catalisador de platina em carbono. Essa reação pode ser realizada em pressão elevada, em um solvente, tal como o THF acidificado com o ácido acético. Alternativamente, ela pode ser efetuada em um solvente, tal como DCM/MeOH, sob condições de fluxo usando um hidroge- nador H-cube.

[0058] Um segundo processo para preparar um composto de fór mula (III) compreende desproteger um composto de fórmula (VIII)

em que P1 representa um grupo de proteção de amina.

[0059] Os grupos de proteção adequados e os meios para a sua remoção são descritos infra. Um grupo de proteção mais adequado é a Boc, que pode ser removida pelo tratamento com ácido, tal como o TFA ou o HCl.

[0060] Um primeiro processo para preparar um composto de fór mula (VII) compreende reagir um composto de fórmula (IX)

[0061] com um composto de fórmula (X)

[0062] em que Hal representa o halogênio, especialmente o Cl.

[0063] As condições adequadas para a reação dos compostos de fórmulas (IX) e (X) incluem aquelas mencionadas acima para a reação dos compostos de fórmulas (IV) e (V).

[0064] Um segundo processo para preparar um composto de fór mula (VII) compreende reagir um composto de fórmula (XI)

[0065] em que Hal representa halogênio, especialmente o Cl

[0066] com um composto de fórmula (XII)

[0067] As condições adequadas para a reação dos compostos de (XI) e (XII) incluem o tratamento de uma solução de (XI) e (XII) em um solvente, tal como a 1,4-dioxana, com uma fonte de paládio e um ligante, tal como o Pd2(dba)3 e a BINAP, e uma base, tal como terc-butóxido de sódio ou carbonato de césio, em temperatura elevada.

[0068] Um primeiro processo para preparar um composto de fór mula (VIII) compreende reagir um composto de fórmula (XIII)

[0069] com um composto de fórmula (X)

[0070] em que Hal representa halogênio, especialmente o Cl.

[0071] As condições adequadas para a reação dos compostos de fórmulas (XIII) e (X) são as mesmas que aquelas descritas acima para a reação dos compostos de fórmulas (IX) e (X).

[0072] Um segundo processo para preparar os compostos de fór mula (VIII) compreende reagir um composto de fórmula (XIV)

[0073] em que Hal representa halogênio, especialmente o Cl

[0074] com um composto de fórmula (XII)

[0075] As condições adequadas para a reação dos compostos de fórmulas (XIV) e (XII) são as mesmas que aquelas descritas acima para a reação dos compostos de fórmulas (XI) e (XII).

[0076] Os compostos de fórmula (IX) podem ser preparados como mostrado no esquema abaixo:

[0077] Os reagentes desse processo são compostos conhecidos. As condições de Mitsunobu incluem o tratamento de uma mistura de um fenol e um álcool com a trifenilfosfina e o di- isopropilazodicarboxilato, em um solvente, tal como o THF. Quanto a uma faixa mais ampla de condições, ver Swamy, K. C.; Kumar, N. N.; Balaraman, E.; Kumar, K. V. (2009). "Mitsunobu and Related Reactions: Advances and Applications" Chemical Reviews 109 (6): 2551- 2651, e as referências nele.

[0078] Os compostos de fórmula (XI) podem ser preparados con-

[0079] Os reagentes desse processo são compostos conhecidos. As condições de Mitsunobu incluem aquelas dadas acima.

[0080] Os compostos de fórmula (XIII) podem ser preparados con forme mostrado no esquema abaixo:

em que LG4 é um grupo abandonador, tal como halo, especialmente o Cl.

[0081] Os reagentes desse processo são compostos conhecidos. As condições de alquilação incluem o tratamento de uma mistura de um fenol e um halogeneto de alquila com uma base, tal como o carbonato de césio ou potássio, em um solvente, tal como a acetonitrila ou a DMF, opcionalmente em temperatura elevada.

[0082] Os compostos de fórmula (XIV) podem ser preparados con- forme mostrado no esquema abaixo:

em que LG5 é um grupo abandonador, tal como aqueles mencionados acima para o LG4.

[0083] Os reagentes desse processo são compostos conhecidos. As condições de alquilação incluem aquelas dadas acima.

[0084] Os compostos de fórmulas (IV), (V), (VI), (X) e (XII) são co nhecidos ou podem ser preparados por métodos conhecidos para a pessoa versada. Com relação ao composto de fórmula (IV), ver, por exemplo, o WO2010/067131, e especificamente a estrutura de composto referida como "Intermediário A". Com relação ao composto de fórmula (VI), ver, por exemplo, o WO00/043384, e especificamente o composto de fórmula LXVII.

[0085] Uma forma não solvatada, cristalina, aparentemente está vel, da forma de base livre do composto da invenção pode ser obtida por recristalização da solução (preferivelmente quente, p.ex., temperatura de refluxo) em acetonitrila. Se outra forma for produzida, esta forma pode ser obtida por conversão em uma pasta, em acetonitrila.

[0086] Conforme observado acima, o sal de maleato é uma forma do composto da invenção de interesse particular. O sal de maleato pode ser preparado tratando-se a forma de base livre do composto da invenção com o ácido maléico, em um solvente adequado.

[0087] Em um processo preferido, o sal de maleato é preparado tratando-se uma solução do composto da invenção, em 2-butanona, com uma solução de ácido maléico em 2-butanona. A cristalização é deixada ocorrer, que pode ser auxiliada com semeadura. O sal de ma- leato como seu polimorfo cristalino Forma 2 é preparado deste modo. O polimorfo cristalino Forma 2 pode também ser obtido esfriando-se uma solução quente do sal de maleato do composto da invenção em 2-butanona, p.ex., de 50 °C até a temperatura ambiente. A cristalização é deixada ocorrer, que pode ser auxiliada com semeadura.

[0088] O polimorfo cristalino Forma 2 do sal de maleato do com posto da invenção é caracterizado por ter as posições de picos em um padrão de XRD de pó em 4,2, 8,4, 8,7, 11,0, 11,5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 17,4, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 e 26,3 (± 0,2) graus 2-teta (ver a figura 2). Os picos (o dublete) em 8,4 e 8,7 (± 0,2) graus 2-teta são especialmente característicos para o polimorfo cristalino Forma 2, visto que os picos nestas posições estão ausentes no padrão de XRD do polimorfo cristalino Forma 1.

[0089] O polimorfo cristalino Forma 2 tem um alto ponto de fusão (aprox.. 199 °C), com uma morfologia do tipo placa.

[0090] Outra forma cristalina do sal de maleato do composto da invenção foi identificada após a recristalização a partir de THF, que tem propriedades menos favoráveis do que aquelas da Forma 2. Ela tem morfologia do tipo agulha e um menor ponto de fusão, aprox.. 148 °C. Esta forma cristalina é referida como Forma 1.

[0091] O polimorfo cristalino Forma 1 do sal de maleato do com posto da invenção é caracterizado por ter posições de picos em um padrão de XRD de pó em 3,8, 6,3, 7,8, 9,3, 9,9, 10,7, 11,2, 12,7, 15,4, 16,5, 17,9, 19,2 e 19,6 (± 0,2) graus (ver a figura 3. Os picos em 6,3, 7,8 e 9,9 (± 0,2) graus 2-teta são especialmente característicos para o polimorfo cristalino Forma 1, visto que os picos nestas posições estão ausentes no padrão de XRD do polimorfo cristalino Forma 2.

[0092] Desse modo, o polimorfo Forma 2 é caracterizado por ter um padrão de difração XRD contendo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou mais preferivelmente 19 posições de picos selecionadas a partir de 4,2, 8,4, 8,7, 11,0, 11,5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 17,4, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 e 26,3 (± 0,2) graus 2-teta, preferivelmente incluindo picos em 8,4 e 8,7 (± 0,2) graus 2-teta e não contendo picos em 6,3, 7,8 e 9,9 (± 0,2) graus 2-teta.

[0093] Em relação às figuras 2 e 3, será entendido que podem ocorrer variações da intensidade nos padrões de XRD, devidas aos processos que influenciam as intensidades, tais como a história de processamento da amostra.

[0094] Os sais do composto da invenção que são cristalinos, po rém de menor interesse do que o sal de maleato, incluem os sais de bromidrato, fosfato, tartarato, fumarato e mesilato.

[0095] Podem ser requeridos grupos protetores para proteger gru pos quimicamente sensíveis durante uma ou mais das reações descritas acima, para garantir que o processo seja eficiente. Desse modo, se desejado ou necessário, os compostos intermediários (incluindo os compostos de fórmulas (II) até (V) conforme destacados acima, assim como os compostos de fórmulas (VI) até (XIV)) podem ser protegidos pelo uso de grupos protetores convencionais. Os grupos protetores e os meios para a sua remoção são descritos em "Protective Groups in Organic Synthesis", por Theodora W. Greene e Peter G.M. Wuts, pu-blicado por John Wiley & Sons Inc; 4a Ed. Rev., 2006, ISBN-10: 0471697540. Desse modo, os grupos protetores de amina ilustrativos incluem a Boc, que pode ser removido pelo TFA, e os grupos protetores de álcool ilustrativos são o THP, que pode ser removido pelo HCl.

[0096] Os compostos de fórmula (III) (juntamente com os seus de rivados, nos quais o grupo amino está protegido, tais como o composto de fórmula (VIII)) e o composto de fórmula (VII) são novos. Estes compostos novos, juntamente com os seus sais (incluindo os sais far- maceuticamente aceitáveis) são reivindicados como aspectos da in-venção.

[0097] O composto de fórmula (I) é um inibidor da cinase MAP p38 (especialmente um inibidor do subtipo alfa) e, em um aspecto, o com-posto da presente invenção é proporcionado para uso como um medi-camento, p.ex., no tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo, a COPD e/ou a asma.

[0098] Espera-se que o composto de fórmula (I) seja potente in vivo.

[0099] Tipicamente, os compostos da técnica anterior, desenvolvi- dos até o momento, eram pretendidos para a administração oral. Esta estratégia envolve otimizar o perfil farmacocinético das substâncias de fármacos para obter uma duração de ação adequada. Neste modo, uma concentração de fármaco suficientemente alta é estabelecida e mantida entre as doses, para proporcionar o benefício clínico contínuo. A consequência inevitável desta abordagem é que todos os tecidos corpóreos, e especialmente o fígado e o intestino, são prováveis de serem expostos a concentrações supraterapeuticamente ativas do fármaco, quer eles sejam adversamente afetados ou não pela doença que está sendo tratada.

[00100] Uma estratégia alternativa é projetar paradigmas de tratamento, nos quais o fármaco é dosado diretamente no órgão inflamado, ou seja, usar a administração tópica. Embora esta abordagem não seja adequada para tratar todas as doenças inflamatórias crônicas, ela tem sido usada nos distúrbios dos pulmões, tais como a asma e a COPD; nas doenças da pele, por exemplo, contra a dermatite atópica e a psoríase; para as condições nasais, representadas por rinite alérgica; e em doenças gastrointestinais, tais como a colite ulcerativa, a IBD e a doença de Crohn, e as doenças inflamatórias do olho, tais como a uveíte.

[00101] Na terapia tópica, um modo no qual a eficácia pode ser obtida é pelo uso de um fármaco que tenha uma duração de ação prolongada e seja mantido no órgão relevante, com isso minimizando o risco de toxicidade sistêmica. Alternativamente, em alguns casos, uma formulação pode ser desenvolvida que gere um "reservatório" do fár- maco ativo que está disponível para manter os seus efeitos desejados. A primeira abordagem é exemplificada pelo fármaco anticolinérgico tiotrópio (Spiriva). Este composto é administrado topicamente ao pulmão como um tratamento para a COPD, e tem uma afinidade excepcionalmente alta por seu receptor-alvo, resultando em uma taxa de dis- sociação muito lenta e, consequentemente, mostra uma duração de ação prolongada.

[00102] Em um aspecto da divulgação do composto de fórmula (I), ele é particularmente adequado para a liberação tópica, tal como a liberação tópica nos pulmões, em particular, para o tratamento de doença respiratória, por exemplo, as doenças respiratórias crônicas, tais como a COPD e/ou a asma.

[00103] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é adequado para sensibilizar pacientes ao tratamento com um corticosteroide, que tenham se tornado refratários a tais regimes de tratamento.

[00104] O composto de fórmula (I) pode ter propriedades antivirais, por exemplo, a capacidade de prevenir a infecção das células (tais como as células epiteliais respiratórias) com um picornavírus, em particular, um rinovírus, vírus influenza ou sincicial respiratório.

[00105] Desse modo, acredita-se que os compostos sejam agentes antivirais, em particular, adequados para a prevenção, o tratamento ou a melhora de infecções com picornavírus, tais como a infecção com rinovírus, vírus influenza ou sincicial respiratório.

[00106] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é capaz de reduzir a inflamação induzida por infecção viral, tal como a infecção com rinovírus e, em particular, as infecções virais que resultam na liberação de citocinas, tais como a IL-8, especialmente in vivo. Esta atividade pode, por exemplo, ser testada in vitro empregando um ensaio de IL-8 induzia por rinovírus, conforme descrito nos Exemplos aqui contidos.

[00107] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é capaz de reduzir a expressão de ICAM1 induzida por rinovírus, especialmente in vivo. A ICAM1 é o mecanismo receptor usado pelos assim chamados serótipos de rinovírus de sulco principais para infectar as células. Esta atividade pode ser medida, por exemplo, através de um método des- crito nos Exemplos aqui contidos.

[00108] Espera-se que as propriedades acima mencionadas tornem o composto de fórmula (I) particularmente adequado para uso no tra-tamento (incluindo a profilaxia) de pioras de doenças inflamatórias, em particular as pioras virais, ou no tratamento de infecções virais, em pa-cientes com uma ou mais condições crônicas, tais como a insuficiência cardíaca congestiva, a COPD, a asma, o diabetes, o câncer, e/ou em pacientes imunossuprimidos, por exemplo, pós-transplante de órgãos. Tal uso pode ser em combinação com agentes antivirais, tais como zanamivir, oseltamivir (por exemplo, fosfato de oseltamivir) peramivir ou laninamivir.

[00109] Em geral, o composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de uma ou mais condições tendo um componente inflamatório que, adequadamente, pode ser tratado por terapia tópica ou local.

[00110] Em particular, o composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de um ou mais distúrbios respiratórios, incluindo a COPD (incluindo a bronquite crônica e o enfisema), a asma, a asma pediátrica, a fibrose cística, a sarcoidose, a fibrose pulmonar idiopática, a rini- te alérgica, a rinite e a sinusite, especialmente a asma, ou a COPD (incluindo a bronquite crônica e o enfisema).

[00111] Desse modo, o composto de fórmula (I) pode ser útil no tra-tamento de inflamação do pulmão (e seus sintomas) em pacientes que sofram de fibrose cística.

[00112] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios dos olhos, incluindo a ceratoconjuntivite seca (olho seco), a conjuntivite alérgica, a retinopatia diabética, o edema macular (incluindo o edema macular úmido e o edema macular seco), a inflamação da catarata pós-operatória ou, particularmente, a uveíte (incluindo a uveíte posterior, anterior e total).

[00113] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios da pele, incluindo a dermatite alérgica, a dermatite de contato, a dermatite atópica ou a psoríase.

[00114] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios gastrointestinais, incluindo a colite ulcerativa, a IBD ou a doença de Crohn.

[00115] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios das articulações, incluindo a artrite reumatóide ou a osteoartrite e, particularmente, as articulações inflamadas secundárias a tais condições.

[00116] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de cânceres, incluindo o câncer do estômago, e na inibição do crescimento e da metástase de tumores, incluindo os cânceres do pulmão, tais como o carcinoma de pulmão de células não pequenas, o carcinoma gástrico, os carcinomas colorretais e o melanoma maligno.

[00117] Também se espera que o composto de fórmula (I) possa ser útil no tratamento de certas outras condições, incluindo a periodon- tite, a gengivite e a faringite.

[00118] O composto de fórmula (I) pode também sensibilizar novamente a condição do paciente ao tratamento com um corticosteroide, quando a condição do paciente tiver se tornado refratária ao mesmo.

[00119] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a divulgação, opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00120] Os diluentes e os veículos podem incluir aqueles adequados para a administração parenteral, oral, tópica, mucosa e retal.

[00121] A presente invenção também proporciona um processo para preparar tal composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica para a administração parenteral, oral, tópica, mucosa ou retal), o dito processo compreendendo misturar os ingredientes.

[00122] Conforme mencionado acima, tais composições podem ser preparadas, p.ex., para a administração parenteral, subcutânea, intra-muscular, intravenosa, intra-articular ou periarticular, particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas; para a administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas ou na forma de soluções ou suspensões líquidas; para a administração tópica, p.ex., pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, soluções ou suspensões aquosas, gotas nasais ou aerossóis aquosos ou não aquosos, e para a administração transdérmica, p.ex., emplastros, cremes, unguentos; para a administração mucosa, p.ex., à mucosa bucal, sublingual ou vaginal, e para a administração retal, p.ex., na forma de um supositório, creme, unguento ou espuma.

[00123] As composições podem convenientemente ser administradas em formas de dosagens de unidades ou de múltiplas doses e podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bastante conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). As formulações para a administração parenteral podem conter, como excipientes, a água ou a solução salina estéril, os alquileno glicóis, tais como o propileno glicol, os polialquileno glicóis, tais como o polietileno glicol, os óleos de origem vegetal, os naftalenos hidrogenados e similares. As formulações para a administração nasal podem ser sólidas e podem conter excipientes, por exemplo, a lactose ou a dextrana, ou podem ser soluções ou suspensões aquosas ou oleosas para uso na forma de gotas nasais ou sprays dosados. Para a administração bucal, os excipientes típicos incluem os açúcares, o es- tearato de cálcio, o estearato de magnésio, o amido pré-gelatinizado, e similares.

[00124] As composições adequadas para a administração oral podem compreender um ou mais veículos e/ou excipientes fisiologica- mente compatíveis e podem estar na forma sólida ou líquida. Os com-primidos e as cápsulas podem ser preparados com agentes aglutinantes, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou poli- vinilpirolidona; cargas, tais como lactose, sacarose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol, ou glicina; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco, polietileno glicol, ou sílica; e tensoativos, tais como lauril sulfato de sódio. As composições líquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, por exemplo, xarope de sorbitol, metil celulose, xarope de açúcar, gelatina, carboximetil- celulose, ou gorduras comestíveis; agentes emulsificantes, tais como lecitina, ou acácia; óleos vegetais, tais como óleo de amêndoa, óleo de coco, óleo de fígado de bacalhau, ou óleo de amendoim; conservantes, tais como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). As composições líquidas podem ser encapsuladas em, por exemplo, gelatina para proporcionar uma forma de dosagem de unidade.

[00125] As formas de dosagens orais sólidas incluem os comprimidos, as cápsulas de cobertura dura de duas unidades e as cápsulas gelatinosas elásticas moles (SEG).

[00126] Uma formulação de cobertura seca tipicamente compreende de cerca de 40% a 60% p/p de concentração de gelatina, aproximadamente uma concentração de 20% a 30% de plastificante (tal como glicerina, sorbitol, ou propileno glicol) e aproximadamente uma concentração de 30% a 40% de água. Outros materiais, tais como os conservantes, os corantes, os agentes de opacificação e as essências, também podem estar presentes. O material de enchimento líquido compreende um fármaco sólido que tenha sido dissolvido, solubilizado ou disperso (com agentes de suspensão, tais como a cera de abelha, o óleo de mamona hidrogenado ou o polietileno glicol 4000) ou um fármaco líquido em veículos ou combinações de veículos, tais como o óleo mineral, os óleos vegetais, os triglicerídeos, os glicóis, os polióis e os agentes tensoativos.

[00127] De modo adequado, um composto de fórmula (I) é administrado topicamente ao pulmão, olho ou intestino. Consequentemente, nós proporcionamos, de acordo com a invenção, uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção op-cionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos topicamente aceitáveis.

[00128] A administração tópica ao pulmão pode ser obtida por uso de uma formulação de aerossol. As formulações de aerossóis tipicamente compreendem o ingrediente ativo suspenso ou dissolvido em um propulsor de aerossol adequado, tal como um clorofluorcarboneto (CFC) ou um hidrofluorcarboneto (HFC). Os propulsores de CFC adequados incluem o tricloromonofluormetano (propulsor 11), o diclorote- trafluormetano (propulsor 114), e o diclorodifluormetano (propulsor 12). Os propulsores de HFC adequados incluem o tetrafluoretano (HFC- 134a) e o heptafluorpropano (HFC-227). O propulsor tipicamente compreende 40%-99,5%, p.ex., 40%-90% em peso da composição de inalação total. A formulação pode compreender excipientes que incluem cossolventes (p.ex., etanol) e tensoativos (p.ex., lecitina, trioleato de sorbitan e similares). Os outros excipientes possíveis incluem o polieti- leno glicol, a polivinilpirrolidona, a glicerina e similares. As formulações de aerossóis são acondicionadas em latas e uma dose adequada é liberada por meio de uma válvula de medição (p.ex., conforme fornecida por Bespak, Valois ou 3M ou, alternativamente, por Aptar, Coster ou Vari).

[00129] A administração tópica ao pulmão pode também ser obtida por uso de uma formulação não pressurizada, tal como uma solução ou suspensão aquosa. Estas podem ser administradas por meio de um nebulizador, p.ex., um que possa ser de mão e portátil ou para uso em casa ou hospital (i.e., não portátil). A formulação pode compreender excipientes, tais como água, tampões, agentes de ajuste da tonicidade, agentes de ajuste do pH, tensoativos e cossolventes. As formulações líquidas e de aerossol em suspensão (quer sejam pressurizadas, quer sejam não pressurizadas) tipicamente conterão o composto da invenção na forma finamente dividida, por exemplo, com uma D50 de 0,5-10 μm, p.ex., aproximadamente 1-5 μm. As distribuições dos tamanhos das partículas podem ser representadas usando valores de D10, D50 e D90. O valor mediano de D50 das distribuições dos tamanhos das partículas é definido como o tamanho de partícula em micra que divide a distribuição na metade. A medição derivada da difração a laser é mais acuradamente descrita como uma distribuição do volume e, consequentemente, o valor de D50 obtido usando este procedimento é mais significativamente referido como um valor de Dv50 (mediano para uma distribuição do volume). Conforme usado neste documento, os valores de Dv referem-se às distribuições dos tamanhos das partículas medidas usando difração a laser. Similarmente, os valores de D10 e D90, usados no contexto da difração a laser, são considerados significar os valores de Dv10 e Dv90 e referem-se ao tamanho de partícula pelo qual 10% da distribuição situam-se abaixo do valor de D10, e 90% da distribuição situam-se abaixo do valor de D90, respectivamente.

[00130] A administração tópica ao pulmão pode também ser obtida por uso de uma formulação de pó seco. Uma formulação de pó seco conterá o composto da divulgação na forma finamente dividida, tipicamente com um diâmetro médio de massa (MMAD) de 1-10 μm ou uma D50 de 0,5-10 μm, p.ex., aproximadamente 1-5 μM. Os pós do composto da invenção na forma finamente dividida podem ser preparados por um processo de micronização ou processo similar de redução do tamanho. A micronização pode ser efetuada usando um moinho de jato, tal como aqueles fabricados por Hosokawa Alpine. A distribuição do tamanho de partícula resultante pode ser medida usando difração a laser (p.ex., com um instrumento Malvern Mastersizer 2000S). A formulação tipicamente conterá um diluente topicamente aceitável, tal como a lactose, a glicose ou o manitol (preferivelmente a lactose), normalmente de tamanho de partícula comparativamente grande, p.ex., um diâmetro médio de massa (MMAD) de 50 μm ou mais, p.ex., 100 μm ou mais ou uma D50 de 40-150 μm. Conforme usado neste documento, o termo "lactose" refere-se a um componente contendo lactose, incluindo o mono-hidrato de a-lactose, o mono-hidrato de β- lactose, a a-lactose anidra, a β-lactose anidra e a lactose amorfa. Os componentes de lactose podem ser processados por micronização, peneiramento, moagem, compressão, aglomeração ou secagem por pulverização. As formas comercialmente disponíveis de lactose em diversas formas estão também incluídas, por exemplo, os produtos Lactohale® (lactose de grau de inalação; DFE Pharma), InhaLac®70 (lactose peneirada para inalador de pó seco; Meggle), Pharmatose® (DFE Pharma) e Respitose® (lactose de grau de inalação peneirada; DFE Pharma). Em uma modalidade, o componente de lactose é selecionado a partir do grupo que consiste em mono-hidrato de a-lactose, a-lactose anidra e lactose amorfa. De preferência, a lactose é o mono- hidrato de a-lactose.

[00131] As formulações de pós secos podem também conter outros excipientes. Desse modo, em uma modalidade, uma formulação de pó seco de acordo com a presente divulgação compreende o estearato de magnésio ou cálcio. Tais formulações podem ter estabilidade química e/ou física superior, especialmente quando tais formulações também contiverem a lactose.

[00132] Uma formulação de pó seco é tipicamente liberada usando um dispositivo de inalador de pó seco (DPI). Os sistemas de distribuição de pós secos de exemplo incluem SPINHALER®, DISKHALER®, TURBOHALER®, DISKUS®, SKYEHALER®, ACCUHALER® e CLI-CKHALER®. Os exemplos adicionais de sistemas de distribuição de pós secos incluem ECLIPSE, NEXT, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, MONODOSE, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHA- LER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIP- TA, ORIEL dry powder inhaler, MICRODOSE, PULVINAL, EASYHA- LER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR e PROHALER.

[00133] Em uma modalidade, um composto da presente invenção é proporcionado como uma formulação de pó seco micronizado, por exemplo, compreendendo a lactose de um grau adequado.

[00134] Desse modo, como um aspecto da invenção, proporciona- se uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção na forma particulada em combinação com a lactose particu- lada, a dita composição opcionalmente compreendendo o estearato de magnésio.

[00135] Em uma modalidade, um composto da presente invenção é proporcionado como uma formulação de pó seco micronizado, com-preendendo a lactose de um grau adequado e o estearato de magnésio, enchida em um dispositivo, tal como o DISKUS. De modo adequado, tal dispositivo é um dispositivo de múltiplas doses, por exemplo, a formulação é enchida em blisters para uso em um dispositivo de dose de múltiplas unidades, tal como o DISKUS.

[00136] Em outra modalidade, um composto da presente invenção é proporcionado como uma formulação de pó seco micronizado, por exemplo, compreendendo a lactose de um grau adequando, enchida em cápsulas de cobertura dura para uso em um dispositivo de dose individual, tal como o AEROLISER.

[00137] Em outra modalidade, um composto da presente invenção é proporcionado como uma formulação de pó seco micronizado, com-preendendo a lactose de um grau adequado e o estearato de magnésio, enchida em cápsulas de cobertura dura para uso em um dispositivo de dose individual, tal como o AEROLISER.

[00138] Em outra modalidade, um composto da presente invenção é proporcionado como um pó fino para uso em uma forma de dosagem de inalação, onde o pó está em partículas finas com uma D50 de 0,5-10 μm, p.ex., aproximadamente 1-5 μm, que tenham sido produzidas por um processo de redução do tamanho que não a micronização por moinho de jato, p.ex., secagem por pulverização, congelamento por pulverização, microfluidização, homogeneização em alta pressão, cristalização de fluido supercrítico, cristalização ultrassônica ou combinações destes métodos, ou outros métodos de formação de partícula adequados, conhecidos na técnica, que sejam usados para produzir partículas finas com um tamanho de partícula aerodinâmico de 0,5-10 μm. A distribuição do tamanho da partícula resultante pode ser medida usando difração a laser (p.ex., com um instrumento Malvern Mastersizer 2000S). As partículas podem compreender o composto sozinho ou em combinação com outros excipientes adequados que possam auxiliar o processamento. As partículas finas resultantes podem formar a formu-lação final para a liberação para os seres humanos ou podem opcio-nalmente ser adicionalmente formuladas com outros excipientes ade-quados, para facilitar a liberação em uma forma de dosagem aceitável.

[00139] O composto da invenção pode também ser administrado de modo retal, por exemplo, na forma de supositórios ou enemas, que incluem as soluções aquosas ou oleosas, bem como as suspensões e as emulsões e as espumas. Tais composições são preparadas seguindo procedimentos padrões, bastante conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os supositórios podem ser preparados misturando-se o ingrediente ativo com uma base de supositório con- vencional, tal como a manteiga de cacau ou outros glicerídeos. Neste caso, o fármaco é misturado com um excipiente não irritante adequado, o qual é sólido nas temperaturas comuns, porém líquido na temperatura retal e, portanto, derreterá no reto para liberar o fármaco. Tais materiais são a manteiga de cacau e os polietileno glicóis.

[00140] Em geral, para as composições pretendidas serem administradas topicamente ao olho, na forma de colírios ou unguentos para os olhos, a quantidade total do composto da presente invenção será cerca de 0,0001 até menos do que 4,0% (p/p).

[00141] De preferência, para a administração ocular tópica, as composições administradas de acordo com a presente invenção serão formuladas como soluções, suspensões, emulsões e outras formas de dosagens. As soluções aquosas são, em geral, preferidas, com base na facilidade de formulação, assim como na capacidade de um paciente de administrar tais composições facilmente por meio de instilação de uma a duas gotas das soluções nos olhos afetados. Entretanto, as composições podem também ser suspensões, géis viscosos ou semi- viscosos, ou outros tipos de composições sólidas ou semissólidas. As suspensões podem ser preferidas para os compostos que forem moderadamente solúveis em água.

[00142] Uma alternativa para a administração ao olho é a injeção intravítrea de uma solução ou suspensão do composto da presente invenção. Além disso, o composto da presente invenção pode também ser introduzido por meio de implantes ou inserções oculares.

[00143] As composições administradas de acordo com a presente invenção podem também incluir diversos outros ingredientes, incluindo, porém não limitados aos, agentes de tonicidade, tampões, tensoa- tivos, polímero estabilizador, conservantes, cossolventes e agentes formadores de viscosidade. As composições farmacêuticas adequadas da presente invenção incluem um composto da invenção formulado com um agente de tonicidade e um tampão. As composições farma-cêuticas da presente invenção podem adicional e opcionalmente incluir um tensoativo e/ou um agente lenitivo e/ou um polímero estabilizador.

[00144] Diversos agentes de tonicidade podem ser empregados para ajustar a tonicidade da composição, preferivelmente àquela das lágrimas naturais para composições oftálmicas. Por exemplo, o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o cloreto de magnésio, o cloreto de cálcio, os açúcares simples, tais como a dextrose, a frutose, a galactose, e/ou simplesmente os polióis, tais como os álcoois de açúcares manitol, sorbitol, xilitol, lactitol, isomaltitol, maltitol, e os hidrolisados de amido hidrogenado podem ser adicionados à composição para igualar a tonicidade fisiológica. Tal quantidade de agente de tonicidade variará, dependendo do agente particular a ser adicionado. Em geral, entretanto, as composições terão um agente de tonicidade em uma quantidade suficiente para fazer com que a composição final tenha uma os- molalidade oftalmicamente aceitável (geralmente cerca de 150-450 mOsm, preferivelmente 250-350 mOsm e mais preferivelmente a apro-ximadamente 290 mOsm). Em geral, os agentes de tonicidade da in-venção estarão presentes na faixa de 2 a 4% p/p. Os agentes de toni-cidade preferidos da invenção incluem os açúcares simples ou os álcoois de açúcares, tais como o D-manitol.

[00145] Um sistema de tampão apropriado (p.ex., fosfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio ou ácido bórico) pode ser adicionado às composições para impedir o deslocamento do pH sob as condições de armazenagem. A concentração particular variará, dependendo do agente empregado. De preferência, entretanto, o tampão será escolhido para manter um pH alvo dentro da faixa de pH 5 a 8, e mais preferivelmente para um pH alvo de pH 5 a 7.

[00146] Os tensoativos podem opcionalmente ser empregados para liberar concentrações maiores do composto da presente invenção. Os tensoativos funcionam para solubilizar o composto e estabilizar a dis-persão de colóides, tal como a solução micelar, a microemulsão, a emulsão e a suspensão. Os exemplos de tensoativos que podem op-cionalmente ser usados incluem o polissorbato, o poloxâmero, o estea- rato de poliosil 40, o óleo de polioxil mamona, o tiloxapol, o Triton, e o monolaurato de sorbitan. Os tensoativos preferidos a serem empregados na invenção têm um balanço de hidrófilo/lipófilo "HLB" na faixa de 12,4 a 13,2 e são aceitáveis para uso oftálmico, tais como o Tri- tonX114 e o tiloxapol.

[00147] Os agentes adicionais que podem ser adicionados às com-posições oftálmicas dos compostos da presente invenção são demul- centes que funcionam como um polímero estabilizador. O polímero estabilizador deve ser um exemplo iônico/carregado com preferência para uso ocular tópico, mais especificamente, um polímero que carregue carga negativa sobre a sua superfície, que possa exibir um potencial zeta de (-)10-50 mV para a estabilidade física e capaz de produzir uma dispersão em água (i.e., solúvel em água). Um polímero estabilizador preferido da invenção seria o polieletrólito, ou os polieletrólitos se mais do que um, da família dos poliacrilatos reticulados, tais como os carbômeros e o Pemulen(R), especificamente o Carbômero 974p (poli(ácido acrílico)), a 0,1-0,5% p/p.

[00148] Outros compostos podem também ser adicionados às com-posições oftálmicas do composto da presente invenção, para aumentar a viscosidade do veículo. Os exemplos de agentes que aumentam a viscosidade incluem, porém não estão limitados aos: polissacarí- deos, tais como o ácido hialurônico e os seus sais, o sulfato de con- droitina e os seus sais, as dextranas, os diversos polímeros da família da celulose; os polímeros de vinila; e os polímeros de ácido acrílico.

[00149] Os produtos oftálmicos tópicos são tipicamente acondicionados na forma de múltiplas doses. Conservantes são, assim, requeri- dos para prevenir a contaminação microbiana durante o uso. Os con-servantes adequados incluem: o cloreto de benzalcônio, o clorobuta- nol, o brometo de benzododecínio, o metil parabeno, o propil parabeno, o álcool feniletílico, o edentato dissódico, o ácido sórbico, o poli- quatêrnio-1, ou outros agentes conhecidos para aqueles versados na técnica. Tais conservantes são tipicamente empregados em um nível de 0,001 a 1,0% p/v. As composições de doses de unidades da presente invenção serão estéreis, porém tipicamente não conservadas. Tais composições, portanto, em geral, não conterão conservantes.

[00150] O profissional médico, ou outra pessoa versada, será capaz de determinar uma dosagem adequada para o composto da presente invenção e, consequentemente, a quantidade do composto da invenção que deve ser incluída em qualquer formulação farmacêutica particular (quer esteja na forma de dosagem de unidade, quer esteja de outra forma).

[00151] Um composto de fórmula (I) tem atividade terapêutica. Desse modo, em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um composto conforme descrito neste documento, para uso no tratamento de uma ou mais das condições acima mencionadas.

[00152] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona o uso de um composto como descrito neste documento, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais das condições acima mencionadas.

[00153] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de tratamento de uma ou mais das condições acima men-cionadas, que compreende administrar a um paciente uma quantidade efetiva de um composto da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto.

[00154] Pretende-se que a palavra "tratamento" inclua a profilaxia, bem como o tratamento terapêutico. O tratamento de condições ou distúrbios também inclui o tratamento de suas pioras.

[00155] Um composto da presente invenção pode também ser ad-ministrado em combinação com um ou mais outros ingredientes ativos, p.ex., ingredientes ativos adequados para tratar as condições acima mencionadas.

[00156] Por exemplo, as combinações possíveis para o tratamento de distúrbios respiratórios incluem as combinações com esteróides (p.ex., budesonida, dipropionato de beclometasona, propionato de flu- ticasona, furoato de mometasona, furoato de fluticasona, ciclesonida), agonistas beta (p.ex., terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol, vilanterol, olodaterol, indacaterol, reproterol, fenoterol), xantinas (p.ex., teofilina), antagonistas anticolinérgicos ou muscarínicos (p.ex., ipratró- pio, tiotrópio, aclidínio, umeclidínio ou glicopirrônio, por exemplo, como o sal de brometo), inibidores da cinase PI3 e agentes antivirais (p.ex., zanamivir, oseltamivir, por exemplo, como o fosfato, peramivir e lani- namivir).

[00157] Em uma modalidade, proporciona-se um composto da invenção para uso como um medicamento a ser administrado em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais, p.ex., selecionados a partir de corticosteróides, agonistas beta, xantinas, antagonistas muscarínicos e inibidores da cinase PI3. Adequadamente, o ago- nista beta é um agonista beta2.

[00158] Em uma modalidade, o composto da divulgação é administrado por inalação e um corticosteróide é administrado oralmente ou por inalação, em combinação ou separadamente.

[00159] Em uma modalidade, o composto da divulgação é administrado por inalação e um agonista beta2 é administrado oralmente ou por inalação, em combinação ou separadamente.

[00160] Em uma modalidade, o composto da divulgação é administrado por inalação e um antagonista muscarínico é administrado oral- mente ou por inalação, em combinação ou separadamente.

[00161] Em uma modalidade, o composto da divulgação é administrado por inalação, em combinação ou separadamente com um ou mais de um corticosteróide, um agonista beta2 e um antagonista mus- carínico, todos administrados oralmente ou por inalação.

[00162] Ademais, para o tratamento de distúrbios gastrointestinais (tais como a doença de Crohn ou a colite ulcerativa), as combinações possíveis incluem as combinações com, por exemplo, um ou mais agentes selecionados a partir da lista que compreende:

[00163] - ácido 5-aminossalicílico, ou um seu pró-medicamento (tal como sulfasalazina, olsalazina ou bisalazida);

[00164] - corticosteróides (p.ex., prednisolona, metilprednisolona, ou budesonida);

[00165] - imunossupressores (p.ex., ciclosporina, tacrolimus, meto- trexato, azatioprina ou 6-mercaptopurina);

[00166] - anticorpos anti-TNFα (p.ex., infliximab, adalimumab, certo- lizumab pegol ou golimumab);

[00167] - anticorpos anti-IL12/IL23 (p.ex., ustekinumab) ou inibido res de IL12/IL23 de pequenas moléculas (p.ex., apilimod);

[00168] - Anticorpos anti-α4β7 (p.ex., vedolizumab);

[00169] - bloqueadores de MAdCAM-1 (p.ex., PF-00547659);

[00170] - anticorpos contra a4-integrina de molécula de adesão de células (p.ex., natalizumab);

[00171] - anticorpos contra a subunidade de receptor de IL2 α (p.ex., daclizumab ou basiliximab);

[00172] - inibidores de JAK3 (p.ex., tofacitinib ou R348);

[00173] - inibidores de Syk e seus pró-medicamentos (p.ex., fosta- matinib e R-406);

[00174] - Inibidores de fosfodiesterase-4 (p.ex., tetomilast);

[00175] - HMPL-004;

[00176] - probióticos;

[00177] - Dersalazina;

[00178] - semapimod/CPSI-2364; e

[00179] - inibidores da cinase proteica C (p.ex., AEB-071).

[00180] Para o tratamento dos distúrbios dos olhos (tais como a ce- ratoconjuntivite seca ou a uveíte), as combinações possíveis incluem as combinações com, por exemplo, um ou mais agentes selecionados a partir da lista que compreende:

[00181] - corticosteróides (p.ex., dexametasona, prednisolona, tri- ancinolona acetonida, difluprednato ou fluocinolona acetonida);

[00182] - imunossupressores (p.ex., ciclosporina, voclosporina, aza- tioprina, metotrexato, micofenolato mofetil ou tacrolimus);

[00183] - anticorpos anti-TNFα (p.ex., infliximab, adalimumab, certo- lizumab pegol, ESBA 105 ou golimumab);

[00184] - anticorpos anti-IL-17A (p.ex., secukinumab);

[00185] - inibidores de mTOR (p.ex., sirolimus);

[00186] - VGX-1027;

[00187] - inibidores de JAK3 (p.ex., tofacitinib ou R348); e

[00188] - inibidores da cinase proteica C (p.ex., AEB-071).

[00189] Consequentemente, outro aspecto da invenção proporciona um composto de fórmula (I) em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais, por exemplo, um ou mais ingredientes ativos descritos acima.

[00190] Similarmente, outro aspecto da invenção proporciona um produto de combinação compreendendo:

[00191] (A) um composto da presente invenção; e

[00192] (B) um ou mais outros agentes terapêuticos,

[00193] onde cada um dos componentes (A) e (B) é formulado em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[00194] Neste aspecto da invenção, o produto de combinação pode ser uma formulação farmacêutica individual (combinação) ou um kit de partes.

[00195] Desse modo, este aspecto da invenção inclui uma formulação farmacêutica incluindo um composto da presente invenção e outro agente terapêutico, em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável (formulação esta que é a seguir referida como uma "preparação combinada").

[00196] Ela também inclui um kit de partes compreendendo os componentes:

[00197] (i) uma formulação farmacêutica incluindo um composto da presente invenção em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável; e

[00198] (ii) uma formulação farmacêutica incluindo um ou mais outros agentes terapêuticos, em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável,

[00199] componentes (i) e (ii) estes que são, cada um, proporcionados em uma forma que seja adequada para a administração em combinação com o outro.

[00200] O componente (i) do kit de partes é, desse modo, o componente (A) acima mencionado, em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Similarmente, o componente (ii) é o componente (B) acima mencionado, em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[00201] Os um ou mais agentes terapêuticos (i.e., o componente (B) acima mencionado) podem ser, por exemplo, quaisquer dos agentes mencionados acima em relação ao tratamento de distúrbios respiratórios, gastrointestinais e dos olhos.

[00202] Se o componente (B) for mais do que um agente terapêutico adicional, estes agentes terapêuticos adicionais podem ser formu- lados um com o outro ou formulados com o componente (A) ou eles podem ser formulados separadamente.

[00203] Em uma modalidade, o componente (B) é um outro agente terapêutico. Em outra modalidade, o componente (B) é dois outros agentes terapêuticos.

[00204] O produto de combinação (uma preparação combinada ou o kit de partes) deste aspecto da invenção pode ser usado no tratamento ou na prevenção de uma doença inflamatória, p.ex., as doenças inflamatórias mencionadas acima, tais como:

[00205] - distúrbios respiratórios, incluindo a COPD (incluindo a bronquite crônica e o enfisema), a asma, a asma pediátrica, a fibrose cística, a sarcoidose, a fibrose pulmonar idiopática, a rinite alérgica, a rinite e a sinusite, especialmente a asma, ou a COPD (incluindo a bronquite crônica e o enfisema);

[00206] - doenças ou distúrbios dos olhos, incluindo a conjuntivite alérgica, a conjuntivite, a ceratoconjuntivite seca (olho seco), o glau-coma, a retinopatia diabética, o edema macular (incluindo o edema macular diabético), a oclusão da veia retinal central (CRVO), a dege-neração macular relacionada à idade (AMD) seca e/ou úmida, a infla-mação da catarata pós-operatória ou, particularmente, a uveíte (incluindo a uveíte posterior, anterior e total), a rejeição ao transplante de enxerto da córnea e células límbicas;

[00207] - doenças ou distúrbios da pele, incluindo a dermatite alér gica, a dermatite de contato, a dermatite atópica ou a psoríase; e

[00208] - doenças ou distúrbios gastrointestinais, incluindo a ente- ropatia sensível ao glúten (doença celíaca) esofagite eosinofílica, doença intestinal do enxerto versus hospedeiro ou, particularmente, a colite ulcerativa ou a doença de Crohn.

[00209] Os aspectos da invenção descritos neste documento (p.ex., o composto, as combinações, os métodos e os usos acima menciona- dos) podem ter a vantagem que, no tratamento das condições descritas neste documento, eles podem ser mais convenientes para o médico e/ou o paciente do que, ser mais eficazes do que, ser menos tóxicos do que, ser de atuação mais longa do que, ter melhor seletividade sobre, ter uma faixa mais ampla de atividade do que, ser mais potentes do que, produzir menos efeitos colaterais do que, ter um melhor perfil farmacocinético e/ou farmacodinâmico do que, ter mais propriedades adequadas no estado sólido do que, ter melhor estabilidade do que, ou podem ter outras propriedades farmacológicas úteis sobre, compostos, combinações, métodos (tratamentos) ou usos similares, conhecidos na técnica anterior para uso no tratamento daquelas condições ou em outros contextos.

[00210] Em relação aos compostos da técnica anterior, em pelo menos algumas modalidades, espera-se que o composto de fórmula (I) tenha uma ou mais das seguintes características:

[00211] - que exiba propriedades que sejam particularmente ade quadas para a administração tópica/local (p.ex., após a administração tópica/local, a geração de altas concentrações no tecido-alvo, porém baixas concentrações plasmáticas ou sistêmicas do composto de fórmula (I) e/ou a depuração rápida do composto de fórmula (I) do plasma ou da circulação sistêmica);

[00212] - que tenha um risco reduzido de exposição extravascular após administração intravenosa (p.ex., devido a um baixo volume de distribuição para o composto de fórmula (I));

[00213] - que exiba uma potência superior com relação às cinases e/ou a um painel de cinases selecionadas, tais como a MAPKα p38, a MAPKy p38, a Src e a p59-HCK;

[00214] - que exiba baixa ou nenhuma atividade inibitória contra as cinases de Olaharsky, particularmente a GSK3α;

[00215] - que exiba baixa ou nenhuma atividade inibitória contra a cinase Syk;

[00216] - que exiba indução reduzida da β-catenina e/ou inibição da mitose nas células;

[00217] - que não exiba nenhuma inibição dependente do tempo, ou exiba menos inibição dependente do tempo, dos membros da super- família de P450 do citocromo; e/ou

[00218] - que produza menos metabólitos problemáticos (p.ex., me- nos tóxicos), p.ex., após administração a um paciente. SEÇÃO EXPERIMENTAL

[00219] As abreviações usadas neste documento são definidas abaixo (Tabela 1). Pretende-se que quaisquer abreviações não definidas levem seu significado em geral aceito. Tabela 1: Abreviações AcOH ácido acético glacial Ac2O anidrido acético Aq b aquoso amplo BEH híbrido ligado ao etileno BINAP 1,1‘-binaftil-2,2‘-diamina Boc terc-butoxicarbonila CSH híbrido de superfície carregada d dublete Δ deslocamento químico DCM diclorometano DIAD azodicarboxilato de di-isopropila DMF N,N-dimetilformamida DMSO sulfóxido de dimetila (ES+) (ES-) Et ionização por eletropulverização, modo positivo ionização por eletropulverização, modo negativo etila EtOAc acetato de etila EtOH etanol h hora(s) HATU 3-óxido hexafluorfosfato de 1- [bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]piridínio base de Hunig IPA N,N-dii-sopropiletilamina álcool isopropílico iPrOAc acetato de isopropila m multiplete (M+H)+ (M-H)- Me íon molecular protonado íon molecular desprotonado metila MeCN acetonitrila MeOH metanol MHz megahertz min minuto(s) m/z razão de massa para carga RMN ressonância magnética nuclear (espectroscopia) Pd2(dba)3 Ph tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (0) fenila q TA quarteto temperatura ambiente HPLC cromatografia líquida de alto desempenho s singlete Sat saturado SCX troca catiônica suportada sobre sólido (resina) t triplete tBu terc-butila THF tetraidrofurano TFA ácido trifluoracético UV ultravioleta AKT homólogo do oncogene viral do timoma de rato v- akt 1 ATP adenosina-5'-trifosfato BALF fluido de lavagem broncoalveolar BSA soro albumina bovina COPD doença pulmonar obstrutiva crônica CXCL1 ligante de quimiocina (motivo C-X-C) 1 COX2 subunidade de oxidase de citocromo c II DSC calorimetria por varredura diferencial DSS dextrana sulfato de sódio DTT ditiotreitol células d-U937 células U-937 diferenciadas com PMA DVS Sorção de vapor dinâmica dsRNA RNA de fita dupla ELISA ensaio imunológico por ligação com enzima FACS separação de células ativada por fluorescência FBS soro bovino fetal FRET transferência de energia ressonante por fluores-cência GM-CSF CSF2: fator estimulador de colônia de granulócito- macrófago GSK3α cinase glicogênio sintase 3α GSK3β HBSS cinase glicogênio sintase 3β solução de sal balanceada de Hank HCK cinase de célula hemopoiética HRV rinovírus humano IBD doença inflamatória do intestino IC50 Concentração inibitória de 50% ICAM-1 molécula de adesão intercelular 1 IFN interferon IL-2 interleucina 2 IL-8 interleucina 8 JNK cinase N terminal c-Jun KC quimioatraente de ceratinócito LPMC célula mononuclear da lâmina própria LPS lipopolissacarídeo MAPK cinase proteica ativada por mitógeno MAPKAP-K2 cinase proteica ativada por cinase proteica ativada por mitógeno-2 MKK4 cinase da cinase proteica ativada por mitógeno 4 MKK6 cinase da cinase proteica ativada por mitógeno 6 MOI multiplicidade de infecção MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio OD densidade óptica PBMC célula mononuclear sanguínea periférica PBS solução salina tamponada com fosfato da Dulbec- co PHA fito-hemaglutinina PI3 fosfoinositida 3 cinase PMA phorbol 12-miristato 13-acetato REC50 concentração efetiva de 50% relativa RNA ácido ribonucleico RNAi interferência de RNA RSV vírus sincicial respiratório SDS dodecil sulfato de sódio SMS sistemas de medições da superfície SRC homólogo do oncogene viral do sarcoma v-src (Schmidt-Ruppin A-2) (aviário) Syk tirosina cinase do baço TCID50 dose infecciosa da cultura de tecido de 50% TGA análise termogravimétrica TLR3 receptor toll-like 3 TNBS ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico TNFα fator de necrose tumoral alfa URTI infecção do trato respiratório superior XPD difração de raios X de pó XRD difração de raios X

Exemplos de Química Procedimentos Gerais

[00220] Todos os materiais de partida e solventes foram obtidos de fontes comerciais ou preparados de acordo com a citação da literatura. A não ser que apresentado de outro modo, todas as reações foram agitadas. As soluções orgânicas foram rotineiramente secadas sobre sulfato de magnésio anidro. As hidrogenações foram efetuadas sobre um reator de fluxo H-cube Thales sob as condições apresentadas.

[00221] A cromatografia em coluna foi efetuada sobre cartuchos de sílica pré-acondicionados (malha 230-400, 40-63 μm), usando a quantidade indicada. A SCX foi adquirida da Supelco e tratada com ácido clorídrico a 1M antes do uso. Salvo apresentação em contrário, a mistura de reação a ser purificada foi primeiramente diluída com MeOH e tornada ácida com algumas gotas de AcOH. Esta solução foi carregada diretamente sobre a SCX e lavada com MeOH. O material desejado foi então eluído por lavagem com NH3 a 0,7 M em MeOH. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho de Fase Reversa Preparativa

[00222] Efetuada usando detecção por UV a 215 e 254 nm com uma coluna de 5 μm, 19x50 mm, X-Select Prep-C18 da Waters, eluin- do com um gradiente de H2O-MeCn contendo 0,15 v/v de ácido fórmi- co durante 10 min, ou uma coluna de 5 μm, 19x50 mm, X-Bridge Prep- C18 da Waters, eluindo com um gradiente de H2O-MeCN contendo 0,1% de bicarbonato de amônio durante 10 min.

Métodos Analíticos

[00223] Cromatografia Líquida de Alto Desempenho de Fase Reversa

[00224] Método 1: XSelect CSH C18 da Waters, 2,5 μm (4,6 x 30 mm) a 40 °C; vazão 2,5-4,5 mL min-1, eluída com um gradiente de H2O-MeCN contendo 0,1% v/v de ácido fórmico durante 4 min empregando detecção por UV a 254 nm. Informação sobre o gradiente: 03,00 min, alterado gradualmente de 95% de H2O-5% de MeCN para 5% de H2O-95% de MeCN; 3,00-3,01 min, mantido em 5% de H2O- 95% de MeCN, vazão aumentada para 4,5 mL min-1; 3,01-3,50 min, mantido a 5% de H2O-95% MeCN; 3,50-3,60 min, retornado para 95% de H2O-5% de MeCN, vazão reduzida para 3,50 mL min-1; 3,60-3,90 min, mantido em 95% de H2O-5% de MeCN; 3,90-4,00 min, mantido em 95% de H2O-5% de MeCN, vazão reduzida para 2,5 mL min-1.

[00225] Método 2: XBridge BEH C18 da Waters, 2,5 μm (4,6 x 30 mm) a 40 °C; vazão 2,5-4,5 mL min-1, eluída com um gradiente de H2O-MeCN contendo bicarbonato de amônio a 10 mM durante 4 min empregando detecção por UV a 254 nm. Informação sobre o gradiente: 0-3,00 min, alterado gradualmente de 95% de H2O-5% de MeCN para 5% de H2O-95% de MeCN; 3,00-3,01 min, mantido em 5% de H2O-95% de MeCN, vazão aumentada para 4,5 mL min-1; 3,01-3,50 min, mantido em 5% H2O-95% de MeCN; 3,50-3,60 min, retornado para 95% de H2O-5% de MeCN, vazão reduzida para 3,50 mL min-1; 3,60-3,90 min, mantido em 95% de H2O-5% de MeCN; 3,90-4,00 min, mantido em 95% de H2O-5% de MeCN, vazão reduzida para 2,5 mL min-1. Espectroscopia de RMN 1H

[00226] Os espectros de RMN 1H foram adquiridos sobre um espec- trômetro Avance III da Bruker, a 400 MHz, usando solvente não deute- rado residual como referência e, salvo especificação em contrário, foram corridos em DMSO-d6. Exemplos Exemplo 1A: 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia Intermediário A: 3- terc- Butil-1- p -tolil-1 H-pirazol-5-amina

[00227] A uma solução agitada de cloridrato de p-tolil-hidrazina (100 g, 630 mmol) em EtOH (1251 mL) foram adicionados a 4,4-dimetil-3- oxopentanonitrila (88 g, 699 mmol) e o HCl (62,5 mL, 750 mmol). A mistura resultante foi agitada ao refluxo durante a noite. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e concentrada in vacuo até cerca de 1/3 do volume original. A mistura de reação foi, em seguida, resfriada em um banho de gelo e levada para aproximadamente pH 8-9 com NaOH aq. 6M. A mistura de reação foi extraída com éter dietílico (500 mL) e a fase orgânica lavada com água (2 x 300 mL) antes de ser secada sobre sulfato de magnésio e concentrada in vacuo, para proporcionar um sólido laranja. O sólido foi suspenso em isohexano e agitado ao refluxo por 2,5 h antes de ser resfriado e filtrado enquanto ainda quente, para produzir o produto do subtítulo 3-terc- butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina como um sólido marrom claro (76,5 g, 52%); Tr 1,31 min (Método 1); m/z 230 (M+H)+ (ES+); RMN 1H δ: 1,20 (9H, s), 2,32 (3H, s), 5,10 (2H, br s), 5,35 (1H, s), 724 (2H, d), 7,42 (2H, m). Intermediário B: (3-(terc-Butil)-1-(p-tolil)-1 H-pirazol-5-il)carbamato de fenila

[00228] Uma solução de 3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-amina (Intermediário A) (20 g, 87,0 mmol) em acetato de isopropila (240 mL) foi adicionada a uma solução de carbonato de sódio agitada (11,3 g, 106 mmol) em água (80 mL). Após 10 min, o cloroformato de fenila (12,1 mL, 96 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi diluída com água (160 mL), as camadas foram separadas e os orgânicos foram lavados com água (2 x 80 mL), salmoura (80 mL), secados (MgSO4) e concentrados in vacuo. O sólido amarelo resultante foi suspenso em 10% de éter/iso-hexano (320 mL) e agitado até que uma suspensão uniforme fosse obtida. O sólido foi coletado por filtração e lavado com iso-hexano para produzir o composto do subtítulo (3-(terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)carbamato de fenila como um pó branco (27,3 g, 88%); Tr 2,65 min (Método 1); m/z 350 (M+H)+ (ES+); RMN 1H δ:1,29 (9H, s), 2,37 (3H, s), 6,35 (1H, s), 7,10-7,23 (3H, sobrepondo m), 7.33-7.46 (6H, sobrepondo m), 9,99 (1H, s). Intermediário C: (4-((2-Cloropiridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc- butila

[00229] A uma mistura de 2-cloro-4-(clorometil)piridina (30 g, 185 mmol) e (4-hidroxinaftalen-1-il)carbamato de terc-butila (40,0 g, 154 mmol) em acetonitrila (200 mL) foi adicionado o carbonato de césio (75 g, 231 mmol) e a mistura resultante foi aquecida até 55 °C. Após 16 h, a mistura de reação foi diluída com MeOH a 30% em DCM (600 mL) e água (400 mL). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com uma quantidade adicional de MeOH a 30% em DCM (2 x 600 mL) e os orgânicos foram concentrados in vacuo para produzir o produto bruto. O produto bruto foi triturado com o MeOH (200 mL), sonicado por cerca de 5 min e transformado em pasta por 1 dia. O sólido resultante foi coletado por filtração e lavado com o MeOH (2 x 10 mL) para produzir o composto do subtítulo (4-((2-cloropiridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila como um sólido amarelo (43 g, 70%); Tr 2,60 min (Método 1); m/z 383 (M-H)- (ES-); RMN 1H δ:1,47 (9H, s), 5,41 (2H, s), 6,98 (1H, d), 7,36 (1H, d), 7,55-7,61 (3H, sobrepondo m), 7,65 (1H, m), 7,94 (1H, m), 8,29 (1H, m), 8,45 (1H, m), 9.00 (1H, bs). Intermediário D (protegido): (4-((2-((6-Etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila

[00230] Uma mistura de (4-((2-cloropiridin-4-il)metóxi)naftalen-1- il)carbamato de terc-butila (Intermediário C) (1050 mg, 2,73 mmol), 6- etilpirazin-2-amina (437 mg, 3,55 mmol), e carbonato de césio (1333 mg, 4,09 mmol) em 1,4-dioxana (15 mL) foi degaseificada com nitrogênio por 5 min. Uma solução de Pd2(dba)3 (125 mg, 0,136 mmol) e BINAP (170 mg, 0,273 mmol) em 1,4-dioxana (5 mL) foi adicionada, e a mistura de reação agitada a 90 °C por 6 h. A mistura de reação foi deixada esfriar e foi agitada a temperatura ambiente por 16 h, em seguida, diluída com 10% de MeOH/DCM (25 mL) e filtrada através de um tampão de Celite, lavada com 10% de MeOH/DCM (15 mL) adicio- nal. O solvente foi removido in vacuo e o produto bruto foi combinado com o MeOH (15 mL) e transformado em pasta por 3 h. O sólido laranja resultante foi isolado por filtração, em seguida, combinado com uma solução de MeOH/EtOH (5 mL) e agitado por 72 h. Novamente, o sólido laranja resultante foi isolado por filtração, em seguida a acetona (20 mL) foi adicionada e a mistura foi transformada em pasta por 2 h. O sólido residual foi filtrado, e o filtrado foi evaporado para dar o composto do subtítulo (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila (360 mg, 27%); Tr 2,6 min (Método 2); m/z 472 (M+H)+ (ES+); RMN 1H δ: 1,18 (3H, t), 1,47 (9H, s), 2,63 (2H, q), 5,36 (2H, s), 6,99 (1H, d), 7,06 (1H, d), 7,36 (1H, d), 7,53-7,63 (2H, m), 7,90-8,06 (3H, sobrepondo m), 8,29 (1H, d), 8,36 (1H, m), 8,91 (1H, s), 8,96 (1H, s), 10,06 (1H, s). Intermediário D: N-(4-(((4-aminonaftalen-1-il)óxi)metil)piridin-2-il)-6-

[00231] O TFA (1,485 mL, 19,09 mmol) foi adicionado a uma solução de (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1- il)carbamato de terc-butila (Intermediário D (protegido)) (360 mg, 0,763 mmol) em DCM (15 mL), e a mistura de reação agitada a temperatura ambiente por 4 h, em seguida concentrada in vacuo. O resíduo foi combinado com a solução sat. de hidrogenocarbonato de sódio e agitado a temperatura ambiente por 16 h. O sólido foi filtrado, lavando com acetonitrila, e secado sob vácuo para dar o composto do subtítulo N-(4-(((4-aminonaftalen-1-il)óxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina como um sólido bege (200 mg, 69%); Tr 2,14 min (Método 2); m/z 372 (M+H)+ (ES+); RMN 1H δ: 1,20 (3H, t), 2,64 (2H, q), 5,18-5,24 (4H, sobrepondo m), 6,59 (1H, d), 6,82 (1H, d), 7,03 (1H, d), 7,41-7,51 (2H, sobrepondo m), 7,98-8,01 (2H, m), 8,04 (1H, m), 8,22-8,29 (2H, sobre-pondo m), 8,91 (1H, s), 10,04 (1H, s). 1 -(3-( terc- Butil)-1-(p-tolil)-1 H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia

[00232] A trietilamina (0,013 mL, 0,093 mmol) foi adicionada a uma solução de (3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)carbamato de fenila (Intermediário B) (0,042 g, 0,121 mmol) e N-(4-(((4-aminonaftalen-1- il)óxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina (Intermediário D) (0,093 g, 0,250 mmol) em THF (1,5 mL), a 40 °C. A mistura de reação foi agitada a 40 °C por 40 min, em seguida resfriada até a TA e agitada por 3 dias, e em seguida concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia sobre sílica gel (coluna de 12 g, 0 a 5% de MeOH em DCM) para dar um sólido não totalmente branco-marrom. O produto foi purificado novamente por HPLC preparativa (Gilson, Ácida (Ácido fórmico a 0,1%), Ácida, coluna X-Select Prep-C18, 5 μm, 19 x 50 mm, da Waters, 45-75% de MeCN em Água) para proproporcionar o composto do título 1-(3-(terc-bulil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia como um sólido não totalmente branco (0,029 g, 49%); Tr 2.26 min (Método 1); m/z 627 (M+H)+ (ES+), 625 (M-H)- (ES-); RMN 1H δ: 1.18 (3H, t), 1,28 (9H, s), 2,40 (3H, s), 2,63 (2H, q), 5,36 (2H, s), 6,36 (1H, s), 7,02 (1H, d), 7,07 (1H, dd), 7,37 (2H, m), 7,45 (2H, m), 7,56-7,67 (3H, sobrepondo m), 7,94 (1H, m), 7,99 (1H, s), 8,02 (1H, s), 8,30 (1H, d), 8,39 (1H, m),8,60 (1H, s), 8,81 (1H, s), 8,92 (1H, s), 10,08 (1H, s). Exemplo 1B: 1 -(3-( terc- butil)-1 -(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (batelada di- ferente)

[00233] A 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (10,0 g) foi agitada em acetonitrila (770 mL) a 22 °C. A mistura heterogênea foi aquecida até a temperatura de refluxo, a uma taxa de 3 °C/min, e o refluxo foi mantido por 2,5 h. A mistura foi semeada com a 1-(3-(terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin- 4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia cristalina (100 mg). A mistura foi linearmente resfriada até 20 °C por 18 h, em seguida novamente aquecida até a temperatura de refluxo e refluxada por 2 h, em seguida linearmente resfriada até 22 °C por 18 h. O produto sólido foi filtrado, lavado com a acetonitrila (77 mL) e secado por 18 h, a 45 °C, in vacuo, para dar a 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino) piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (8,73 g). Exemplo 2A: maleato de 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 2) Intermediário C: (4-((2-Cloropiridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc- butila

[00234] A acetonitrila (420 mL) foi adicionada à 2-cloro-4- (clorometil)piridina (1,05 eq, 59,5 g), e a mistura agitada a 20 °C. O (4- hidroxinaftalen-1-il)carbamato de terc-butila (90,8 g) foi adicionado à mistura, em seguida o carbonato de potássio (72,6 g) foi adicionado. A mistura heterogênea foi aquecida até 55 °C, a uma taxa de 1,0 K/min.

[00235] A mistura foi agitada por 16 h a 55 °C, em seguida a mistura de reação foi resfriada até 22 °C. A água (1260 mL) foi adicionada por 30 min e a mistura foi agitada por 30 min a 22 °C.

[00236] O precipitado foi filtrado e lavado duas vezes com 200 mL de água. O produto foi secado in vacuo a 50 °C por 20 h, para dar o (4-((2-cloropiridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila (100,0 g, 90,6%). Intermediário D (protegido): (4-((2-((6-Etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila

[00237] A dioxana (125 mL) foi adicionada ao (4-((2-cloropiridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butila (Intermediário C) (9,6 g) e a mistura agitada a 20 °C. O carbonato de césio (2 eq, 16,3 g) e a 2- amino-6-etilpirazina (1,5 eq, 4,8 g) foram adicionados à mistura agitada a 20 °C. O argônio foi purgado através da mistura de reação. O tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (0,05 eq, 1,14 g) e a BINAP ra- cêmica (0,10 eq, 1,56 g) foram adicionadas à mistura de reação. A mistura foi agitada por uns 15 min adicionais, a 20 °C. A mistura foi aquecida até 90 °C a uma taxa de 1,5 K/min, em seguida, agitada por 12 h a 90 °C. A mistura foi resfriada até 20 °C e a agitação continuou por umas 6 h adicionais. A mistura heterogênea foi filtrada sobre o Ce- lite, e o filtro lavado com dioxana (duas vezes 5 mL). O filtrado foi concentrado in vacuo a 2 kPa (20 mbar) e 50 °C. O resíduo foi dissolvido em etanol (150 mL). A cristalização espontânea ocorreu. A mistura heterogênea foi agitada por 3 h a 22 °C. O precipitado foi filtrado e lavado com etanol (10 mL). O produto foi secado in vacuo a 50 °C, por 20 h, para dar o (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1- il)carbamato de terc-butila (9,05 g, 76,8%). Intermediário D: N-(4-(((4-aminonaftalen-1-il)óxi)metil)piridin-2-il)-6- etilpirazin-2-amina

[00238] A acetonitrila (200 mL) foi adicionada ao (4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)carbamato de terc- butila (Intermediário D (protegido)) (10,5 g) e a mistura heterogênea foi agitada a 20 °C. O ácido sulfúrico (4,5 eq, 5,5 mL) foi adicionado por 2 h a 20 °C. A mistura heterogênea foi agitada por umas 2 h adicionais a 20 °C. A amônia aquosa (10 eq, 17 mL) foi adicionada à mistura de reação por 15 min e a temperatura foi mantida a 20 °C por resfriamento. A água (33,4 mL) foi adicionada à mistura heterogênea por 5 min a 20 °C. Após agitar por 30 min a 20 °C, a mistura foi resfriada até 5 °C e agitada por umas 2 h adicionais a 5 °C. O precipitado foi filtrado e lavado com a água (33,4 mL) e o 2-propanol (18 mL). O produto foi secado a 50 °C in vacuo por 24 h para dar a N-(4-(((4-aminonaftalen-1- il)óxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina (6,2 g, 75%). 1 -(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia

[00239] O 2-metiltetraidrofurano (1809 mL) foi adicionado à N-(4- (((4-aminonaftalen-1-il)óxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina (In-termediário D) (41,3 g) e a mistura foi agitada a 20 °C. O (3-(terc-butil)- 1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)carbamato de fenila (1,2 eq, 51,3 g) foi adicio- nado à mistura. A trietilamina (0,25 eq, 3,9 mL) foi adicionada e a mistura agitada por uns 10 min adicionais a 20 °C. A mistura de reação heterogênea foi aquecida até 48 °C por 30 min e mantida a 48 °C por 3,5 h. Após 10 min a 48 °C, a mistura tornou-se homogênea, e foi semeada com a 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia cristalina (60 mg). A mistura de reação foi deixada resfriar até 20 °C e agitada por umas 16 h adicionais. O precipitado formado foi filtrado e lavado com o 2-metiltetraidrofurano (duas vezes 139 mL). O produto foi secado por 18 h, a 45 °C in vacuo, para dar a 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol- 5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1- il)ureia (54,1 g, 77,5%). maleato de 1 -(3-( terc- butil)-1 -(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 2)

[00240] A 2-butanona (4442 mL) foi adicionada à 1-(3-(terc-butil)-1- (p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (111,04 g) e agitada a 20 °C. A mistura he-terogênea foi aquecida até 65 °C e tornou-se uma solução homogênea. O SilicaMetS Thiol (sequestrante de metal) (5,55 g) foi adicionado e a mistura agitada por 30 min a 65 °C. O Norit A Supra (carvão ativado) (5,55 g) adicionado e a mistura agitada por uns 20 min adicionais a 65 °C. A mistura foi filtrada quente sobre o Celite. O filtro foi lavado com a 2-butanona quente (1555 mL) (60 °C). A 2-butanona (2887 mL) foi adicionada ao filtrado e levada até 60 °C enquanto se agitava.

[00241] O ácido maléico (1,0 eq, 20,56 g) foi dissolvido em 2- butanona (555 mL). A solução de ácido maléico foi adicionada à solu- ção de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin- 2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia por 80 min a 65 °C. Após 10% da solução de ácido maléico serem adicionados, a mistura foi semeada com o maleato de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5- il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia cristalino (Forma 2). A mistura foi mantida agitando por 1 h a 60 °C, em seguida, resfriada não linearmente com um exponente de 2,3, por 6 h, até 5 °C. O precipitado foi filtrado e lavado duas vezes com a 2- butanona (278 mL). O produto foi secado a 45 °C in vacuo por 20 h para dar o maleato de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 2) (113,8 g, 86,5%). Exemplo 2B: maleato de 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 2) (batelada diferente)

[00242] A 2-butanona (750 mL) foi adicionada à 1-(3-(terc-butil)-1- (p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (7,50 g) e a mistura foi agitada. A mistura foi aquecida até 60 °C por 20 min. Uma solução de ácido maléico (1,39 g) em 2-butanona (12 mL) foi adicionada à mistura por 5 min. A cristalização espontânea ocorreu após aproximadamente a metade da solução de ácido maléico ser adicionada. A mistura foi agitada por 30 min a 60 °C, em seguida, resfriada até 5 °C por 6 h com uma mudança gradual exponencial (exponente = 2,3), em seguida, agitada por 30 min a 5 °C, depois, aquecida para 65 °C por 30 min, depois, agitada por 30 min a 65 °C, depois, resfriada até 5 °C por 6 h com uma rampa exponencial (exponente = 2,3), em seguida, agitada por 30 min a 5 °C, depois, aquecida a 65 °C por 30 min, depois, agitada por 30 min a 65 °C, em seguida, resfriada até 5 °C por 6 h com uma mudança gradual exponencial (exponente = 2,3). O produto foi filtrado e lavado du- as vezes com a 2-butanona (50 mL), subsequentemente secado a 45 °C in vacuo para dar o maleato de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol- 5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1- il)ureia (Forma 2) (7,0 g). Exemplo 2C: maleato de 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 1)

[00243] O maleato de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (15 mg) foi dissolvido em THF (100 vol.) a 50 °C e uma temperatura formando um ciclo entre 50 °C e a temperatura ambiente por 24 h (4 h em cada temperatura). A solução foi, em seguida, mantida no refrigerador por 24 h, após a que o material sólido (Forma 1) foi isolado. Exemplo 2D: maleato de 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia (Forma 1) (batelada diferente)

[00244] A 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia foi dissolvida em THF (40 vol.) a 50 °C e 1 eq de ácido maléico foi adicionado. A amostra foi deixada maturar entre a TA e 50 °C (4 h em cada tempera-tura) por 2 dias. O material sólido (Forma 1) foi isolado. Exemplo 3: bateladas micronizadas Exemplo 3A: 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia na forma mi- cronizada

[00245] A 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6- etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia micronizada foi preparada pelo material de micronização do Exemplo 1B, em um dispositivo de micronização Hosokawa Alpine Spiral Jet Mill 50 AS (5 cm) (pressão de 100 kPa (1,0 bar)) (alimentação manual). Os parâme- tros de volume do tamanho das partículas determinados por difração a laser usando um Malvern Mastersizer 2000S (dispersão em água/Tween 80, 0,1% p/v) são dados na tabela abaixo: Dv10 (mícron) Dv50 (mícron) Dv90 (mícron) 0,15 1,54 10,76

Exemplo 3B: maleato de 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia Forma 2 na forma micronizada

[00246] O maleato de 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino) piridin-4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia mi- cronizado (Forma 2) foi preparado pelo material de micronização do Exemplo 2B, em um dispositivo de micronização Hosokawa Alpine Spiral Jet Mill 50 AS (5 cm) (pressão de 100 kPa (1,0 bar)) (alimentação manual). Os parâmetros de volume do tamanho das partículas determinados por difração a laser usando um Malvern Mastersizer 2000S (dispersão em água/Tween80, 0,1%p/v) para o material de entrada e de saída são dados na tabela abaixo: Dv10 (mícron) Dv50 (mícron) Dv90 (mícron) Material de entrada (Exemplo 2B) 3 9 128 Material de saída (Exemplo 3B) 1,21 2,18 4,00

Exemplo 4: Composições contendo lactose que contêm a 1-(3-( terc- butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin- 4-il)metóxi)naftalen-1-il)ureia como base livre e maleato (Forma 2), adequadas para inalação.

[00247] As composições foram preparadas misturando-se os ingredientes como segue:

*Lactohale LH200 **Fonte: Peter Greven (Grau: Ligamed MF-2V; grau vegetal) Exemplo 5: Caracterização e teste da estabilidade Caracterização física do ingrediente ativo Espectrometria por infravermelho (IV) - Refletância Total Micro Atenuada (microATR)

[00248] As amostras foram analisadas usando um acessório de mi- croATR adequado. número de varreduras: 32 resolução: 1 cm-1 faixa de comprimentos de onda: 4000 a 400 cm-1 aparelho: Espectrômetro Thermo Nexus 670 FTIR detector: DTGS com windows KBr divisor de feixe: Ge em KBr acessório de micro ATR: Harrick Split Pea com cristal de Si

[00249] O espectro do IV de uma amostra do material do Exemplo 2A, mostrado na figura 1, reflete os modos vibracionais da estrutura molecular do Exemplo 1 como seu sal de maleato. XRD de Pó

[00250] A análise por difração de raios X de pó (XPD) sobre o material de Forma 2 foi realizada em um difratômetro PANanalytical (Philips) X'PertPRO MPD. O instrumento é equipado com um tubo de raios X Cu LFF.

[00251] O composto foi espalhado sobre um suporte de amostra de base zero. Parâmetros do instrumento: tensão do gerador: 45 kV amperagem do gerador: 40 mA geometria: Bragg-Brentano estágio: estágio de girador Condições de medição: modo de varredura: contínuo faixa de varredura: 3 a 50° 2θ tamanho da etapa: 0,02°/etapa tempo de contagem: 30 s/etapa tempo de revolução do girador: 1 s tipo de radiação: CuKa Trajetória do feixe incidente: Trajetória do feixe difratado: fenda de divergência program.: 15 mm anteparo antidispersão longo: + fenda Soller: 0,04 rad fenda Soller: 0,04 rad máscara do feixe: 15 mm filtro de Ni: + fenda antidispersão: 1° detector: X'Celerador faca do feixe: +

[00252] A análise por difração de raios X de pó (XPD) sobre o mate- rial de Forma 1 foi realizada sobre um difratômetro Bruker AXS C2 GADDS. O composto foi levemente prensado sobre uma lâmina de vidro. Parâmetros do instrumento: tensão do gerador: 40 kV amperagem do gerador: 40 mA geometria: reflexão (=Bragg-Brentano) Estágio: estágio XYZ automatizado Condições de medição: modo de varredura: contínuo faixa de varredura: 3 a 30° 2θ tamanho da etapa: 0,05°/etapa tempo de contagem: 120 s tipo de radiação: CuKa detector: HiStar 2-dimensional

[00253] Espelho de múltiplas camadas Single Gobel acoplado com um colimador de furos de 0,3 mm

[00254] O padrão de XRD de pó de uma amostra do material do Exemplo 2A, mostrado na figura 2, mostra picos de difração sem a presença de um halo, indicando que o composto está presente como um produto cristalino. Esse padrão da XRD é característico do polimorfo cristalino Forma 2.

[00255] O padrão da XRD de pó de uma amostra do material do Exemplo 2D, mostrado na figura 3, mostra picos de difração sem a presença de um halo, indicando que o composto está presente como um produto cristalino. Esse padrão de XRD é característico do polimorfo cristalino Forma 1. Calorimetria por varredura diferencial (DSC)

[00256] Cerca de 3 mg do composto de teste foram transferidos para um recipiente de amostra de alumínio padrão da Instrumento-TA. O recipiente de amostra foi fechado com a tampa apropriada e a curva de DSC registrada sobre um Q1000 MTDSC da Instrumento-TA, equipado com uma unidade de resfriamento RCS.

[00257] Os seguintes parâmetros foram usados: temperatura inicial: 25°C taxa de aquecimento: 10°C/min temperatura final: 300°C fluxo de nitrogênio: 50 mL /min

[00258] A curva de DSC de uma amostra do material do Exemplo 2A, mostrado na figura 4, revela a fusão com decomposição do produto em torno de 198,6 °C (Forma 2). Análise termogravimétrica (TGA)

[00259] O composto de teste foi transferido para um recipiente de amostra de alumínio. A curva termogravimétrica foi registrada em um termogravímetro Q500 da TA Instrumentos. Os seguintes parâmetros foram usados: temperatura inicial: temperatura ambiente taxa de aquecimento: 20°C/min fator de resolução: 4 condição final: 300°C ou <80[(p/p)%]

[00260] Um gráfico da TGA de uma amostra do material do Exemplo 2A é mostrado na figura 5. Nenhuma perda de peso foi registrada na região de temperatura a partir da temperatura ambiente até 175 °C. A perda de peso acima de 175 °C é devida à evaporação e à decomposição do produto. Sorção de vapor dinâmica (DVS)

[00261] Cerca de 20 mg do composto de teste foram transferidos para uma sorção de vapor dinâmica SMS e registrou-se a mudança de peso em relação à umidade atmosférica, a 25 °C.

[00262] Os seguintes parâmetros foram usados: secagem: 60 min. sob nitrogênio seco equilíbrio: 60 min/Etapa. pontos de medição da UR (%): primeiro grupo: 5, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 segundo grupo: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0

[00263] O teste da DVS foi efetuado em uma amostra do material do Exemplo 2A (ver as figuras 6 e 7). Durante a etapa de secagem inicial, uma perda de peso de 0,3% foi registrada. O produto não preceu ser higroscópico.

[00264] O produto após a DVS foi investigado por XRD e IV e per-maneceu na mesma forma de estado sólido antes do teste que depois do teste (dados não mostrados). Nenhuma indicação para a dissociação do sal foi observada. Microscopia Eletrônica por Varredura (SEM)

[00265] Para os experimentos de SEM, os dados foram coletados em um Microscópio Eletrônico por Varredura Phenom Pro. Uma pequena quantidade de amostra foi montada sobre um porta-amostra de alumínio usando a fita adesiva dupla-face de condução. Uma camada fina de ouro foi aplicada usando um metalizador (20 mA, 120 s).

[00266] As amostras de material de Forma 1 e Forma 2 do sal de maleato do composto da invenção foram inspecionadas pela SEM. O produto da Forma 1 tinha uma morfologia do tipo agulha. O produto da Forma 2 tinha uma morfologia do tipo placa. A morfologia do tipo placa da Forma 2 é mais adequada para a preparação de um produto inalado do que a morfologia do tipo agulha da Forma 1. Resumo dos resultados da caracterização física do ingrediente ativo

[00267] O material testado era cristalino com base na XRD e funde- se com decomposição em torno de 198,6 °C. Nenhuma perda de peso foi observada entre a temperatura ambiente e 175 °C pela TGA. O ma-terial pareceu não ser higroscópico. Não houve nenhuma evidência da conversão ou da dissociação do estado sólido do sal. Essas proprie-dades confirmam a adequabilidade do sal de maleato do composto de fórmula (I) como um fármaco candidato. Caracterização física do ingrediente ativo na forma micronizada

[00268] Uma amostra de material do Exemplo 3B foi estudada por IV, XRD de pó, DSC, TGA e DVS em uma maneira similar àquela descrita acima para o material do Exemplo 2A. Os resultados do IV e da XRD de pó foram substancialmente os mesmos (dados não mostrados). O material testado era cristalino com base na XRD e funde-se com a decomposição em torno de 194,6 °C, de acordo com a DSC. O material não pareceu ser higroscópico (dados não mostrados). Não houve nenhuma evidência da conversão ou dissociação do estado sólido do sal (dados não mostrados). Essas propriedades confirmam a adequabilidade do sal de maleato do composto da fórmula (I), na forma micronizada, como um fármaco candidato. Teste da estabilidade física - estabilidade das misturas de lactose

[00269] As composições dos Exemplos 4a, 4b e 4c foram armazenadas por 3, 6 e 13 semanas, sob condições de 40 °C/75% de UR, 50 °C/80% de UR e 50 °C/UR ambiente. Os padrões da XRD e os espectros do IV foram obtidos no tempo zero e nos pontos de tempo três (os parâmetros de teste eram os mesmos como descritos para a caracterização do ingrediente ativo, acima). Nenhuma diferença relevante nos padrões da XRD ou nos espectros do IV foi observada entre o tempo zero e quaisquer dos pontos de tempo (dados não mostrados). Nenhuma mudança ou dissociação na forma do estado sólido do sal foi observada. Teste da estabilidade química - estabilidade do ingrediente ativo e misturas

Método UPLC para a determinação da degradação

[00270] As amostras foram extraídas com uma mistura de solventes (DMSO/água 80:20) (7 mL) em um frasco pequeno de 10 mL. A cro- matografia UPLC foi realizada usando os seguintes parâmetros:

[00271] Coluna: Supelco Ascentis Express C18, 150 mm de com primento x 3,0 mm de d.i., tamanho de partícula de 2,7 μm

[00272] Temperatura da Coluna: 30 °C

[00273] Temperatura do Autoamostrador: 5 °C

[00274] Vazão: 0,40 mL /min

[00275] Fase Móvel:

[00276] Solvente A: 10 mM de acetato de amônio (0,771 g/L) + 0,1% v/v de ácido trifluoracético em água

[00277] Solvente B: acetonitrila/álcool isopropílico 70:30 (v/v)

[00278] Gradiente:

[00279] Tempo de corrida da análise: 36 min

[00280] Tempo de coleta de dados: 30 min

[00281] Volume de injeção: 5 μL

[00282] Comprimento de ondas: varredura entre 200 e 400 nm

[00283] Comprimento de ondas usado para os cálculos da uniformi dade do conteúdo: 334,0 nm

[00284] As composições dos Exemplos 4d, 4e, 4f, 4g, 4h e 4i foram armazenados por 14 e 30 dias, sob condições de 50 °C/75% de UR, 60 °C/30% de UR, 60 °C/50% de UR, 70 °C/10% de UR, 70 °C/ 75% de UR e 80°C/50% de UR.

[00285] A degradação foi medida no ponto zero e nos pontos de tempo 7, 14 e 30 dias, por UPLC, e os resultados são mostrados na figura 8, placas A a F.

[00286] A porcentagem de degradação total para as composições contendo o sal de maleato, Forma 2 do ingrediente ativo, foi sempre menor do que aquela para as composições equivalentes contendo a base livre do ingrediente ativo, indicando que o sal de maleato, Forma 2, é mais estável nestas formulações. A porcentagem de degradação total para as composições contendo o sal de maleato, Forma 2 do ingrediente ativo em concentração mais elevada, foi menor do que aquela para as composições contendo o sal de maleato, Forma 2 do ingrediente ativo em concentração menor, nestas formulações.

[00287] Em estudos similares no material do Exemplo 1B e do Exemplo 2B (i.e. material não micronizado e não misturado), em que as amostras foram armazenadas por até 30 dias, sob condições de 50oC/75% de UR, 60 °C/50% de UR, 70 °C/10% de UR, 70 °C/75% de UR e 80 °C/50% de UR, foram obtidos resultados similares qualitativamente, i.e., a porcentagem de degradação total para o sal de malea- to foi sempre menor do que aquela para a base livre (dados não mostrados).

[00288] A partir destes resultados, parece que o sal de maleato do composto da invenção é quimicamente mais estável (sozinho e em combinação com a lactose) do que a forma de base livre. Exemplo 6: Teste biológico Métodos experimentais para o teste biológico Ensaio de inibição de enzima

[00289] As atividades inibitórias de enzimas do composto divulgado neste documento foram determinadas por FRET, usando peptídeos sintéticos marcados com fluoróforos tanto doadores quanto receptores (Z-LYTE, Life Technologies, Paisley, UK). Inibição da Enzima MAPKα p38

[00290] As atividades inibitórias do composto da invenção contra a isoforma de MAPKα p38 (MAPK14: Life Technologies) foram avaliadas indiretamente, determinando-se o nível de ativação / fosforilação do peptídeo-alvo da molécula à jusante de MAPKα p38, MAPKAP-K2. A enzima (40 ng/mL, 2,5 μL) foi incubada com o composto de teste (2,5 μL de qualquer um de 40 μg/mL, 12 μg/mL, 4 μg/mL, 1,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,12 μg/mL, 0,04 μg/mL, 0,012 μg/mL, 0,004 μg/mL ou 0,0012 μg/mL) por 2 h na TA. Os peptídeos da FRET (8 μM, 2,5 μL) e o MA- PKAP-K2-alvo inativo de p38α (Life Technologies, 2000 ng/mL), e a solução de ATP apropriada (2,5 μL, 40 μM) foram então adicionados à mistura de enzima / composto e incubados por 1 h na TA. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado por 1 h, antes da detecção em uma leitora de microplacas por fluorescência (EnVision, Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Inibição da Enzima MAPKY p38

[00291] As atividades inibitórias do composto da invenção contra a p38MAPKY (MAPK12: Life Technologies) foram avaliadas determinando-se o nível de ativação / fosforilação do peptídeo-alvo. A enzima (800 ng/mL, 2,5 μL) foi incubada com o composto de teste (2,5 μL em qualquer de 40 μg/mL, 12 μg/mL, 4 μg/mL, 1,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,12 μg/mL, 0,04 μg/mL, 0,012 μg/mL, 0,004 μg/mL ou 0,0012 μg/mL) por 2 h na TA. Os peptídeos da FRET (8 μM, 2,5 μL), e a solução de ATP apropriada (2,5 μL, 400 μM) foram então adicionados à mistura de enzima / composto e incubados por 1 h na TA. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado por 1 h, antes da detecção em uma leitora de microplaca por fluorescência (EnVision, Perkin Elmer). Inibição das Enzimas Hck, c-Src e Syk

[00292] As atividades inibitórias do composto da invenção contra as enzimas Hck, c-Src e Syk (Life Technologies) foram avaliadas em um modo similar àquele descrito acima. A enzima relevante (1000 ng/mL, 1400 ng/mL ou 2000 ng/mL, respectivamente, 2,5 μL) foi incubada com o composto de teste (qualquer de 40 μg/mL, 12 μg/mL, 4 μg/mL, 1,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,12 μg/mL, 0,04 μg/mL, 0,012 μg/mL, 0,004 μg/mL ou 0,0012 μg/mL, 2,5 μL cada) por 2 h na TA. Os peptídeos da FRET (8 μM, 2,5 μL), e as soluções de ATP apropriadas (2,5 μL, 800 μM para c-Src, e 60 μM de ATP para HCK e Syk) foram então adicionados às misturas de enzimas / compostos e incubados por 1 h na TA. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado por 1 h, antes da detecção em uma leitora de microplaca por fluorescência (EnVision, Perkin Elmer). Inibição da Enzima GSK 3α

[00293] As atividades inibitórias do composto da invenção contra a isoforma da enzima GSK 3α (Life Technologies) foram avaliadas em um modo similar àquele descrito acima. A proteína GSK3α (500 ng/mL, 2,5 μL) foi incubada com o composto de teste (2,5 μL em qualquer de 40 μg/mL, 12 μg/mL, 4 μg/mL, 1,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,12 μg/mL, 0,04 μg/mL, 0,012 μg/mL, 0,004 μg/mL ou 0,0012 μg/mL) por 2 h na TA. O peptídeo da FRET (8 μM, 2,5 μL), o qual é um alvo de fos- forilação para a GSK3α, e o ATP (40 μM, 2,5 μL) foram então adicionados à mistura de enzima / composto e a mistura resultante incubada por 1 h na TA. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado por 1 h, antes da detecção em uma leitora de microplaca por fluorescência (EnVision, Perkin Elmer).

[00294] Em todos os casos, a protease específica para sítio cliva o peptídeo não fosforilado somente e elimina o sinal da FRET. Os níveis de fosforilação de cada reação foram calculados usando a razão de emissão de cumarina (doador) sobre a emissão de fluoresceína (receptor), para a qual as baixas razões indicam alta fosforilação e as altas razões indicam baixos níveis de fosforilação. A porcentagem de inibição de cada reação foi calculada em relação ao controle não inibido e a concentração inibitória de 50% (valor de IC50) foi então calcula- da a partir da curva de resposta à concentração. Ensaios Celulares (empregados nos Exemplos)

[00295] Os ensaios celulares a seguir foram empregados para avaliar o composto da presente invenção e os resultados são dados infra. Liberação de TNFα/ IL-8 induzida por LPS nas Células d-U937

[00296] As células U937, uma linhagem celular monocítica humana, foram diferenciadas em células do tipo macrófago por incubação com PMA (100 - 200 ng/mL) por 48 até 72 h. As células foram pré- incubadas com concentrações finais do composto de teste por 2 h e foram então estimuladas com LPS (0,1 μg/mL; de E. Coli: O111:B4, Sigma) por 4 h. O sobrenadante foi coletado para a determinação das concentrações de TNFα e IL-8 por ELISA de encaixe (Duo-set, R&D systems). A inibição da produção de TNFα foi calculada como uma porcentagem daquela obtida por 10 μg/mL de BIRB796 em cada concentração de composto de teste por comparação contra o controle veículo. A concentração efetiva de 50% relativa (REC50) foi determinada a partir da curva de resposta à concentração resultante. A inibição da produção de IL-8 foi calculada em cada concentração do composto de teste por comparação com o controle veículo. A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada a partir da curva de resposta à concentração resultante. Expressão da ICAM-1 induzida por Poly I:C nas Células BEAS2B

[00297] A Poly I:C foi usada nestes estudos como um imitador do vírus do RNA, simples. A mistura de Poly I:C-Oligofectamina (2% de Oligofectamina ± 1 μg/mL de Poly I:C, 25 μL; Life Technologies e Invi- vogen Ltd., San Diego, CA, respectivamente) foi transfectada em células BEAS2B (células epiteliais bronquiais humanas, ATCC). As células foram pré-incubadas com concentrações finais dos compostos de teste por 2 h e o nível de expressão da ICAM-1 sobre a superfície celular foi determinado por ELISA baseado em células. No ponto de tempo 18 h após a transfecção com poly I:C, as células foram fixadas com 4% de formaldeído em PBS (100 μL) e então a peroxidase endógena foi inibida pela adição de tampão de lavagem (100 μL, 0,05% de Tween em PBS: PBS-Tween) contendo 0,1% de azida de sódio e 1% de peróxido de hidrogênio. As células foram lavadas com tampão de lavagem (3 x 200 μL). Após bloquear os poços com 5% de leite em PBS-Tween (100 μL) por 1 h, as células foram incubadas com anticorpo anti-ICAM- 1 humana (50 μL; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) em 1% de BSA PBS durante a noite a 4°C.

[00298] As células foram lavadas com PBS-Tween (3 x 200 μL) e incubadas com o anticorpo secundário (100 μL; anti-IgG de coelho conjugado à HRP, Dako Ltd., Glostrup, Dinamarca). As células foram então incubadas com o substrato (50 μL) por 2-20 min, seguido pela adição de solução de interrupção (50 μL, H2SO4 a 1N). O sinal da ICAM-1 foi detectado por leitura da absorbância a 450 nm contra um comprimento de ondas de referência de 655 nm, usando um espectro- fotômetro. As células foram então lavadas com PBS-Tween (3 x 200 μL) e os números totais de células em cada poço foram determinados por leitura da absorbância a 595 nm após coloração com Violeta Cristal (50 μL de uma solução a 2% em PBS) e eluição por solução a 1% de SDS (100 μL) em PBS. As leituras de OD 450-655 medidas foram corrigidas para o número de células por divisão com a leitura de OD595 em cada poço. A inibição da expressão da ICAM-1 foi calculada em cada concentração de composto de teste por comparação com o controle veículo. A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada a partir da curva de resposta à concentração resultante. Ensaio da Mitose da Célula

[00299] Os mononucleócitos sanguíneos periféricos (PBMCs) de pacientes saudáveis foram separados do sangue integral (Quintiles, Londres, UK) usando um gradiente de densidade (Histopaque®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, UK). As PBMCs (3 milhões de células por amos-tra) foram subsequentemente tratadas com 2% de PHA (Sigma- Aldrich, Poole, UK) por 48 h, seguido por uma exposição de 20 h a concentrações variadas dos compostos de teste. Em 2 h antes da coleta, as PBMCs foram tratadas com demecolcina (0,1 μg/mL; Life Technologies, Paisley, UK,) para capturar as células na metáfase. Para observar as células mitóticas, as PBMCs foram permeabilizadas e fixadas por adição de Intraprep (50 μL; Beckman Coulter, França), e coloridas com anti-fosfo-histona 3 (0,26 ng/L; no. 9701; Cell Signalling) e iodeto de propídio (1 mg/mL; Sigma-Aldrich como anteriormente descrito (Muehlbauer P.A. e col., Mutation Res., 2003, 537, 117-130). A fluorescência foi observada usando um citômetro de fluxo ATTUNE (Life Technologies), canalizando para os linfócitos. A porcentagem de inibição da mitose foi calculada para cada tratamento em relação ao tratamento com veículo (0,5% de DMSO). O Efeito dos Compostos de Teste sobre a Viabilidade da Célula: Ensaio de MTT

[00300] As células U937 diferenciadas foram pré-incubadas com cada composto de teste (concentração final 10 μg/mL em 200 μL dos meios indicados abaixo), sob dois protocolos: o primeiro, por 4 h em meios RPMI1640 com 5% de FCS, e o segundo, em meios RPMI1640 com 10% de FCS, por 24 h. O sobrenadante foi substituído com meios novos (200 μL) e a solução de estoque de MTT (10 μL, 5 mg/mL) foi adicionada a cada poço. Após incubação por 1 h, os meios foram removidos, o DMSO (200 μL) foi adicionado a cada poço e as placas foram agitadas levemente por 1 h, antes da leitura da absorbância em 550 nm. A porcentagem de perda de viabilidade da célula foi calculada para cada poço em relação ao tratamento com veículo (0,5% de DMSO). Consequentemente, um aumento aparente na viabilidade da célula para o tratamento com fármaco em relação ao veículo é tabela- do como uma porcentagem negativa. Produção de citocinas em macrófagos da saliva tratados com LPS de pacientes com COPD

[00301] Os pacientes com COPD inalaram uma solução nebulizada de 3% (p/v) de solução salina hipertônica usando um nebulizador ul- trassônico (Devilbiss, Carthage, MO), com aspiração periódica por 5 min. Este procedimento foi repetido um máximo de três vezes até ser obtida saliva suficiente. As amostras de saliva foram homogeneizadas e misturadas vigorosamente usando um misturador de redemoinho em solução a 0,02% v/v de ditiotreitol (DTT). As amostras foram suspensas novamente em PBS (40 mL), seguido por centrifugação a 1500 rpm a 4°C por 10 min, para obter as pelotas de células da saliva. As pelotas foram lavadas com PBS (40 mL). As células da saliva foram então suspensas novamente em 4 mL de meio sem soro de macrófa- gos (macrófago-SFM, Life technologies, contendo 20 U/mL de penicilina, 0,02 mg/mL de estreptomicina e 5 μg/mL de anfotericina B) e semeadas sobre placa de 96 poços de alta ligação, seguido por incubação por 1 h a 37 °C e a 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se unissem ao fundo da placa. As células sobre a placa foram lavadas com macrófago-SFM novo (200 μL/poço) para remover os neutrófilos e outras células contaminadas. As células aderentes (principalmente os macrófagos da saliva) sobre a placa foram usadas para análise adicional. As provocações da saliva foram conduzidas na Quintiles Drug Research Unit no Guys Hospital e a aprovação das regras de conduta e o consentimento informado escrito foram obtidos por Quintiles.

[00302] Onde apropriado, 1 μL de uma solução contendo o composto de teste ou o artigo de referência nas concentrações apresentadas (0,1 μg/mL, 0,01 μg/mL, ou 0,001 μg/mL) ou, alternativamente, 1 μL de DMSO como o controle de veículo foi adicionado a cada poço (200 μL nos meios) e as células foram incubadas por 2 h. As células foram es- timuladas com solução de LPS (50 μL, concentração final: 1 μg/mL) e incubadas por 18 h a 37 °C e 5% de CO2. O sobrenadante foi então coletado e mantido a -80 °C. Kits luminex adequados foram usados para medir os analitos selecionados. Após descongelamento do so- brenadante, os glóbulos de anticorpos magnéticos foram multiplexados e incubados em uma placa de 96 poços com solução de base, padrão, ou o volume apropriado de amostra, durante a noite, com agitação, a 4 °C. Após lavagem duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem fornecido pelo kit por poço, usando um lavador de placas magnético, os glóbulos foram incubados por 1 h na TA com a solução de anticorpo conjugado à biotina fornecido pelo kit, com agitação. A solução de es- treptavidina foi adicionada por 30 min, com agitação, na TA. Após lavagem com 200 μL de tampão de lavagem por poço, os glóbulos foram suspensos novamente em fluido de revestimento (150 μL) e analisados imediatamente. O nível de cada analito no sobrenadante foi calculado usando o software Xcel Fit, com uma equação de 4 ou 5 parâmetros, usando cada curva padrão. As inibições de cada produção de ci- tocina foram calculadas em cada concentração por comparação com o controle de veículo. Liberação de IL-8 induzida por Rinovírus

[00303] O rinovírus humano RV16 é obtido da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Os estoques virais são gerados por infecção das células MRC5 com o HRV até 80% das células serem citopáticas.

[00304] As células BEAS2B são infectadas com o HRV em uma MOI de 1,2 e incubadas por 1 h, a 33 °C, com agitação suave, para promover a absorção. As células são então lavadas com PBS, meios novos adicionados e as células são incubadas por umas 72 h mais. O sobrenadante é coletado para o ensaio de concentrações de IL-8 usando um kit de desenvolvimento de ELISA Duoset (R&D systems, Minneapolis, MN). Os compostos são adicionados 2 h antes da infecção por HRV e 1 h após a infecção, quando o HRV não infectado for removido por lavagem. Ensaios Celulares (não empregados nos Exemplos)

[00305] Os ensaios celulares a seguir puderam ser empregados para avaliar o composto da presente invenção. Liberação de IL-8 induzida por Rinovírus (variação do método acima mencionado) e Expressão da ICAM-1

[00306] O rinovírus humano RV16 é obtido da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Os estoques virais são gerados infectando-se as células Hela com o HRV até 80% das células serem cito- páticas.

[00307] As células BEAS2B são infectadas com o HRV em uma MOI de 5 e incubadas por 1 a 2 h, a 33 °C, com agitação suave, para promover a absorção. As células são então lavadas com PBS, meios novos adicionados e as células são incubadas por umas 72 h mais. O sobrenadante é coletado para o ensaio das concentrações de IL-8 usando um kit de desenvolvimento de ELISA Duoset (R&D systems, Minneapolis, MN).

[00308] O nível de expressão da ICAM-1 da superfície celular é de-terminado por ELISA baseado em células. Em 72 h após a infecção, as células são fixadas com 4% de formaldeído em PBS. Após inibição da peroxidase endógena por adição de 0,1% de azida de sódio e 1% de peróxido de hidrogênio, os poços são lavados com tampão de lavagem (0,05% de Tween em PBS: PBS-Tween). Após bloqueio do poço com 5% de leite em PBS-Tween por 1 h, as células são incubadas com anticorpo anti-ICAM-1 humana em 5% de BSA PBS-Tween (1:500) durante a noite. Os poços são lavados com PBS-Tween e incubados com o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho conjugado à HRP, Dako Ltd.). O sinal da ICAM-1 é detectado por adição do subs- trato e leitura a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 655 nm, usando um espectrofotômetro. Os poços são então lavados com PBS-Tween e os números de células totais em cada poço foram determinados por leitura da absorbância a 595 nm após coloração com Violeta Cristal e eluição por solução a 1% de SDS. As leituras de OD450-655 medidas são corrigidas para o número de células dividindo-se com a leitura de OD595 em cada poço. Os compostos são adicionados 2 h antes da infecção por HRV e 1 a 2 h após a infecção, quando o HRV não infectado for removido por lavagem. Liberação de TNFα / IL-8 induzida por LPS em Células PBMC

[00309] As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) de pacientes saudáveis são separadas do sangue integral usando um gradiente de densidade (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). As PBMCs são semeadas em placas de 96 poços e tratadas com os compostos na concentração desejada, por 2 h, antes da adição de 1 ng/mL de LPS (Escherichia Coli 0111:B4 da Sigma Aldrich), por 24 h, sob condições de cultura de tecido normais (37oC, 5% de CO2). O so- brenadante é coletado para a determinação das concentrações de TNFα por ELISA de encaixe (Duo-set, R&D systems) e a leitura sobre a leitora de microplaca por fluorescência (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). A concentração na inibição de 50% (IC50) da produção de IL-8 e TNFα é calculada a partir da curva de resposta às doses. Liberação de IL-2 e IFN gama nas células PBMC estimuladas com CD3/CD28

[00310] As PBMCs de pacientes saudáveis são separadas do sangue integral usando um gradiente de densidade (Lymphoprep, AxisShield Healthcare). As células são adicionadas a uma placa de 96 poços revestida com uma mistura de anticorpos monoclonais CD3/CD28 (0,3 μg/mL da eBioscience e 3 μg/mL da BD Pharmingen, respectivamente). O composto na concentração desejada é então adicionado aos poços e a placa deixada por 3 dias sob condições de cultura de tecido normais. Os sobrenadantes são coletados e a liberação de IL-2 e IFN gama determinada por ELISA de Encaixe (Duo-set, R&D System). A IC50 é determinada a partir da curva de resposta à dose. Liberação de IL-8 induzida por IL-1β nas células HT29

[00311] As células HT29, uma linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano, são preparadas em uma placa de 96 poços (24 h) e pré-tratadas com os compostos na concentração desejada, por 2 h, antes da adição de 5 ng/mL de IL-1β (Abcam) por 24 h. Os sobrena- dantes são coletados para a quantificação da IL-8 por ELISA de Encaixe (Duo-set, R&D System). A IC50 é determinada a partir da curva de resposta à dose. Proliferação das células T

[00312] As PBMCs de pacientes saudáveis são separadas do sangue integral usando um gradiente de densidade (Lymphoprep, AxisShield Healthcare). A fração de linfócitos é primeiramente enriquecida para células T CD4+ por separação de células magnética negativa conforme as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec 130-091-155). As células T CD4+ T nunca antes tratadas são então separadas usando seleção magnética positiva das células CD45RA+, usando microglóbu- los, conforme as instruções do fabricante (130-045-901). As células são preparadas a 2x105 células por poço em 100 μL de RPMI/10% de FBS sobre placa de fundo plano de 96 poços (Corning Costar). 25 μL do composto de teste são diluídos até a concentração apropriada (8x a conc. Fnal), em meio normal, e adicionados a poços em duplicata sobre a placa para obter uma faixa de respostas às doses de 0,03 ng/mL - 250 ng/mL. O DMSO é adicionado como um controle negativo. As placas são deixas pré-incubar por 2 h, antes do estímulo com 1 μg/mL de anti-CD3 (OKT3; eBioscience). Após 72 h, o meio em cada poço é substituído com 150 μL de meio novo contendo 10 μM de BrdU (Ro- che). Após 16 h, o sobrenadante é removido, a placa é secada e as células fixadas por adição de 100 μL de solução de fixar/desnaturar a cada poço, por 20 min, conforme as instruções do fabricante (Roche). As placas são lavadas uma vez com PBS, antes da adição do anticorpo de detecção anti-BrdU, e incubadas por 90 min, na temperatura ambiente. As placas são então lavadas suavemente 3x com o tampão de lavagem fornecido e desenvolvidas por adição de 100 μL de solução de substrato. A reação é interrompida por adição de 50 μL de H2SO4 a 1 M, e leitura para a absorbância a 450 nm sobre uma leitora de placa (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). A IC50 é determinada a partir da curva de resposta à dose. Ensaio das Biopsias Humanas

[00313] As biopsias das mucosas intestinais são obtidas das regiões inflamadas do cólon de pacientes com IBD. O material de biopsia é cortado em pequenos pedaços (2-3 mm) e colocado sobre grades de aço, em uma câmara de cultura de órgãos, a 37 °C, em uma atmosfera de 5% de CO2/95% de O2, em meios sem soros. O controle de DMSO ou os compostos de teste na concentração desejada são adicionados ao tecido e incubados por 24 h, na câmara de cultura de órgãos. O so- brenadante é coletado para a determinação dos níveis de IL-6, IL-8, IL- 1β e TNFα por ELISA da R&D. A porcentagem de inibição da liberação de citocinas pelos compostos de teste é calculada em relação à liberação de citocinas determinada para o controle de DMSO (100%). Liberação de IL-2 e IFNY nas células LPMC estimuladas com CD3/CD28 de pacientes com IBD

[00314] As células mononucleares da lâmina própria (LPMCs) são isoladas e purificadas da mucosa inflamada com IBD de amostras ci-rúrgicas ou da mucosa normal de amostras cirúrgicas como se segue:

[00315] A mucosa é removida das camadas mais profundas das amostras cirúrgicas com um bisturi e cortada em fragmentos de 3-4 mm de tamanho. O epitélio é removido por lavagem dos fragmentos de tecido três vezes com 1 mM de EDTA (Sigma-Aldrich, Poole, UK) em HBSS (Sigma-Aldrich), com agitação, usando um agitador magnético, descartando o sobrenadante após cada lavagem. A amostra é subse-quentemente tratada com a colagenase tipo 1A (1 mg/mL; Sigma- Aldrich) por 1 h, com agitação, a 37 °C. A suspensão de células resul-tante é então filtrada usando um coador de células de 100 μm, lavada duas vezes, suspensa novamente em meio RPMI-1640 (Sigma- Aldrich) contendo 10% de soro de bezerro fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, e usada para a cultura de células.

[00316] As LPMCs recentemente isoladas (2x105 células/poço) são estimuladas com 1 μg/mL de α-CD3/α-CD28 por 48 h, na presença de controle de DMSO ou de concentrações apropriadas de composto. Após 48 h, o sobrenadante é removido e testado quanto à presença de TNFα e IFNY por ELISA da R&D. A porcentagem de inibição da liberação de citocinas pelos compostos de teste é calculada em relação à liberação de citocinas determinada para o controle de DMSO (100%). Inibição da liberação de citocinas de miofibroblastos isolados de paci-entes com IBD

[00317] Os miofibroblastos da mucosa inflamada com IBD são isolados como se segue:

[00318] A mucosa é dissecada e descartada e as amostras de mucosa de 1 mm de tamanho são cultivadas a 37 °C em uma incubadora de CO2 umidificada, em meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) suplementado com 20% de FBS, 1% de ami- noácidos não essenciais (Invitrogen, Paisley, UK), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 50 μg/mL de gentamicina, e 1 μg/mL de anfotericina (Sigma-Aldrich). As colônias estabelecidas de miofibroblastos são semeadas em frascos de cultura de 25 cm2 e cultivadas em DMEM suplementado com 20% de FBS e antibióticos até pelo menos a passagem 4, para proporcionar uma quantidade suficiente para uso nos experimentos de estimulação.

[00319] As monocamadas subconfluentes de miofibroblastos são então semeadas em placas de 12 poços, a 3x105 células por poço, são exauridas em meio sem soro por 24 h, a 37 °C, 5% de CO2, antes de serem cultivadas por 24 h, na presença de controle de DMSO ou con-centrações apropriadas de composto. Após 24 h, o sobrenadante é removido e testado quanto à presença de IL-8 e IL-6 por ELISA da R&D. A porcentagem de inibição da liberação de citocinas pelos compostos de teste é calculada em relação à liberação de citocinas determinada para o controle de DMSO (100%). Desgranulação de neutrófilos humanos

[00320] Os neutrófilos são isolados do sangue periférico humano como se segue:

[00321] O sangue é coletado por venipuntura e anticoagulado por adição de EDTA: solução salina tamponada com fosfato estéril a 1:1 (PBS, sem Ca+/Mg+). A dextrana (3% p/v) é adicionada (1 parte de solução de dextrana para 4 partes de sangue) e o sangue deixado em repouso por aproximadamente 20 min, na TA. O sobrenadante é cuidadosamente disposto em camadas em um gradiente de densidade (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare) e centrifugado (15 min, 2000 rpm, sem refrear). O sobrenadante é aspirado e a pelota de células é suspensa novamente em solução salina estéril (0,2%) por não mais do que 60 segundos (para lisar as hemácias). Um volume de 10 vezes de PBS é então adicionado e as células centrifugadas (5 min, 1200 rpm). As células são suspensas novamente em HBSS+ (solução de sal balanceada de Hank (sem vermelho fenol) contendo citocalasina B (5 μg/mL) e 1 mM de CaCl2) para obter 5 x 106 células/mL.

[00322] 5 x 104 células são adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V e incubadas (30 min, 37 °C) com a con centração apropriada de composto de teste (0,3-1000 ng/mL) ou veículo (DMSO, 0.5% de conc final). A desgranulação é estimulada por adição de fMLP (conc final de 1 μM) que, após uma incubação adicional (30 min, 37 °C), as células são removidas por centrifugação (5 min, 1500 rpm) e os sobrenadantes transferidos para uma placa de 96 poços de fundo plano. Um volume igual de tetrametilbenzidina (TMB) é adicionado e, após 10 min, a reação terminada por adição de um volume igual de ácido sulfúrico (0,5 M) e leitura da absorbância em 450 nm (fundo a 655 nm subtraído). A concentração inibitória de 50% (IC50) é determinada a partir da curva de resposta à concentração resultante. Ensaio da citotoxidade da célula

[00323] 5 x 104 células TK6 (linhagem de células T linfoblástica) são adicionadas ao número apropriado de poços de uma placa de 96 poços, em 195 μL de meio (RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal). 5 μL de controle de DMSO (concentração final 0,5% v/v) ou composto de teste (concentração final 5 ou 1μg/mL) são adicionados aos poços e incubados a 37 °C, 5% de CO2. Após 24 h, a placa é centrifugada a 1300 rpm por 3 min e o sobrenadante descartado. As células são então suspensas novamente em 7,5 μg/mL de iodeto de propí- dio (PI) em PBS. Após 15 min, as células são analisadas por citometria de fluxo (BD accuri). A % de viabilidade é calculada como a % de células que são negativas ao PI nos poços de teste normalizados para o controle de DMSO. Exame In Vivo: Farmacodinâmica e Atividade Anti-inflamatória (em-pregado nos Exemplos)

[00324] Os exames in vivo a seguir foram empregados para avaliar o composto da presente invenção e os resultados são dados infra. Acúmulo de neutrófilos induzido por LPS em camundongos

[00325] Os camundongos Balb/c que não estavam em jejum foram dosados pela rota intratraqueal com veículo ou a substância de teste, nos tempos indicados (dentro da faixa de 2-8 h), antes do estímulo da resposta inflamatória por aplicação de uma provocação com LPS. No T = 0, os camundongos foram colocados em uma câmara de exposição e expostos ao LPS (7,0 mL, 0,5 mg/mL de solução em PBS por 30 min). Após umas 8 h mais, os animais foram anestesiados, cânulas foram inseridas em suas traqueias e extraiu-se com BALF infundindo e então removendo dos seus pulmões 1,0 mL de PBS por meio de cate- ter traqueal. As contagens de glóbulos brancos totais e diferenciais nas amostras de BALF foram medidas usando um hemocitômetro de Neubaur. Os esfregaços com citospina das amostras de BALF foram preparados por centrifugação a 200 rpm, por 5 min, na TA, e coloridos usando um sistema de coloração DiffQuik (Dade Behring). As células foram contadas usando microscopia com imersão em óleo. Os dados para as quantidades de neutrófilos em BAL são mostrados como média ± S.E.M. (erro padrão da média). A porcentagem de inibição do acúmulo de neutrófilos foi calculada para cada tratamento em relação ao tratamento com veículo. Modelo da Fumaça de Cigarro

[00326] Os camundongos A/J (machos, 5 semanas de idade) foram expostos à fumaça de cigarro (4% de fumaça de cigarro, diluídos com ar), por 30 min/dia, por 11 dias, usando um Sistema de Experimento de Inalação da Fumaça de Tabaco para pequenos animais (Modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tóquio, Japão). As substâncias de teste foram administradas de modo intranasal (35 μL de solução em 10% de DMSO/PBS) uma vez ao dia, por 3 dias, após a exposição final à fumaça do cigarro. Em 12 h após a última dosagem, cada um dos animais foi anestesiado, inseriu-se uma cânula na traqueia e o fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado. As quantidades de macrófagos e neutrófilos alveolares foram determinadas através de análise por FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA) usando o anticorpo anti-MOMA2 de camundongo (macrófa- go) ou o anticorpo anti-7/4 de camundongo (neutrófilo). O BALF foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado. O nível de quimioatraente de ceratinócito (KC; CXCL1) no BALF foi quantificado usando um kit de ELISA de KC de camundongo Quantikine® (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA). Exame In Vivo: Farmacodinâmica e Atividade Anti-inflamatória (não empregado nos Exemplos)

[00327] Os exames in vivo a seguir puderam ser empregados para avaliar o composto da presente invenção: Colite induzida por DSS em camundongos

[00328] Os camundongos machos BDF1, de 10-12 semanas de idade, que não estão em jejum, são dosados por gavagem oral duas vezes ao dia, com veículo, item de referência (5-ASA) ou composto de teste, um dia antes (Dia -1) do estímulo da resposta inflamatória por tratamento com DSS. No Dia 0 do estudo, o DSS (5% p/v) é administrado na água potável, seguido por dosagem BID do veículo (5 mL/kg), da referência (100 mg/kg) ou do composto de teste (5 mg/kg) por 7 dias. A água potável com o DSS é reabastecida a cada 3 dias. Durante o estudo, os animais são pesados todos os dias e observações sobre as fezes são feitas e registradas como uma nota, com base na consistência das fezes. Na hora do sacrifício no Dia +6, o intestino grosso é removido e o comprimento e o peso são registrados. As seções do cólon são obtidas para a análise por MPO, para determinar a infiltração de neutrófilos, ou para a pontuação da histopatologia, para determinar a gravidade da doença. Colite induzida por TNBS em camundongos

[00329] Os camundongos machos BDF1, de 10-12 semanas de idade, que não estão em jejum, são dosados por gavagem oral duas vezes ao dia, com veículo (5 mL/kg), item de referência (Budesonida 2,5 mg/kg) ou composto de teste (1, 5 ou 50 mg/kg), um dia antes (Dia -1) do estímulo da resposta inflamatória por tratamento com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (TNBS) (15 mg/mL em 50% de etanol / 50% de solução salina). No Dia 0 do estudo, o TNBS (200 μL) é administrado de modo intracolônico por meio de um cateter plástico, seguido por dosagem BID do veículo, da referência ou do composto de teste por 2 ou 4 dias. Durante o estudo, os animais são pesados todos os dias e observações sobre as fezes são feitas e registradas como uma nota, com base na consistência das fezes. Na hora do sacrifício no Dia 2 (ou Dia 4), o intestino grosso é removido e o comprimento e o peso registrados. As seções do cólon são obtidas para a análise por MPO, para determinar a infiltração de neutrófilos, ou para a pontuação en-volvendo a histopatologia, para determinar a gravidade da doença. Transferência adotiva em camundongos

[00330] No dia 0 do estudo, os camundongos fêmeos Balb/C são terminados e os baços obtidos para o isolamento das células CD45RBhigh (Usando o protocolo de Separação de células com SCID IBD ). Aproximadamente 4x105 células/mL de células CD45RBhigh são então injetadas IP (100 μL/camundongo) nos animais fêmeos SCID. No dia 14 do estudo, os camundongos são pesados e aleatorizados para grupos de tratamento com base no peso do corpo. No dia 21, os compostos são administrados BID, por meio de gavagem oral, em um veículo de óleo de amendoim, nos níveis de doses resumidos abaixo e um volume de dose de 5 mL/kg. O tratamento continua até o dia de estudo 42, em cujo ponto os animais sofrem necropsia 4 h após a administração antes do meio-dia. O comprimento e o peso do cólon são registrados e usados como um ponto final secundário no estudo como uma medição do edema do cólon. O cólon é então dividido em seis seções transversais, quatro das quais são usadas para a pontuação da histopatologia (ponto final primário) e duas são homogeneizadas para a análise de citocinas. O dado mostrado é a % de inibição da janela de indução entre animais nunca antes tratados e animais veículos, onde a maior inibição indica mais próximo ao fenótipo nunca antes tratado, sem doença. Resultados dos Exames In vitro e in vivo

[00331] Os resultados dos exames in vitro para o composto da invenção (forma de base livre) são demonstrados na Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5 abaixo e na figura 9. É feita uma comparação com um Composto de Referência estruturalmente relacionado N-(4-(4-(3- (3-terc-Butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-il)ureído)naftalen-1-ilóxi)piridin-2-il)-2- metoxiacetamida (Exemplo 1 do WO2010/112936), o qual tinha sido anteriormente descrito como um agente anti-inflamatório potente com efeitos antivirais, bem como com o propionato de fluticasona, que é um agente anti-inflamatório bastante conhecido. Tabela 2: Perfil para as Enzimas MAPKα e Y p38, HCK, c-Src, Syk e GSK3α dos Compostos de Teste

Tabela 3: Inibição da Liberação de TNFα e IL-8 Induzida por LPS e Expressão da ICAM Induzida por PolylC para os Compostos de Teste

Tabela 4: Efeito dos Compostos de Teste sobre a Viabilidade da Célu- la

[00332] Exame da viabilidade da célula: - e + indicam que o valor está abaixo e acima, respectivamente, do limite de nenhum efeito significativo, definido como 30% de inibição, a 10 μg/mL, no ponto de tempo indicado.

[00333] Média ± SEM Tabela 5: Efeito dos Compostos de Teste sobre a produção de citoci- nas em macrófagos da saliva tratados com LPS de pacientes com COPD

Resumo dos Resultados dos Exames in vitro e in vivo

[00334] O composto da invenção demonstra um perfil nos ensaios in vitro e in vivo consistente com a boa atividade anti-inflamatória. Ele tem atividade muito fraca nas cinases Syk e GSK3a (Tabelas 2 e 3).

[00335] O composto da invenção mostra atividade marcadamente menor nos sistemas de ensaios que medem o seu impacto sobre a viabilidade da célula, indicando que ele é provável de possuir um índice terapêutico superior sobre o Composto de Referência (Tabela 4).

[00336] O composto da invenção mostrou atividade anti-inflamatória superior em comparação com o propionato de fluticasona, no sistema de ensaio usado (Tabela 5).

[00337] O composto da invenção mostra uma inibição dependente da dose da IL-8 induzida por HRV (figura 9).

[00338] Em resumo, estes resultados sugerem que o composto da invenção tem propriedades anti-inflamatórias similares ao Composto de Referência divulgado acima e, vantajosamente, está associado com um índice terapêutico superior.

Claims (24)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está na forma de seu sal de maleato.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que está na forma de seu polimorfo cristalino de Forma 2 que apresenta posições de pico em um padrão de difração DRX em pó em 4,2, 8,4, 8,7, 11,0, 11,5, 12,6, 14,4, 14,9, 16,0, 17,0, 18,8, 19,5, 20,2, 21,7, 22,4, 23,8, 25,8 e 26,3 (± 0,2) graus 2-teta.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de fórmula (I), como definido na reivindicação 1 ou 2, em combinação com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de fórmula (I) como definido na reivindicação 1 ou 2 na forma particulada em combinação com a lactose particu- lada.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende o estea- rato de magnésio particulado.

7. Produto de combinação, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) um composto como definido na reivindicação 1 ou 2; e (B) um ou mais outros agentes terapêuticos selecionados dentre zanamivir, oseltamivir, peramivir, laninamivir, ácido 5- aminossalicílico, sulfassalazina, olsalazina, bisalazida, prednisoloína, metilprednisolona, budesonida, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, azatioprina, 6-mercaptopurina, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, ustekinumab, apilimod, vedolizumab, natalizumab, daclizumab, basiliximab, tofacitinib, fastamatnib, tetomilast, dersalazi- na, secukinumab, sirolimus, em que cada um dos componentes (A) e (B) é formulado em mistura com um adjuvante, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compo-sição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, ou produto de combinação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac-terizado pelo fato de que é para uso como um medicamento em com-binação com um ou mais outros agentes terapêuticos como definidos na reivindicação 7.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, com-posição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, ou produto de combinação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de COPD, asma, cerato- conjuntivite seca (olho seco), uveíte (incluindo a uveíte posterior, anterior e total), doença de Crohn ou colite ulcerativa, especialmente a COPD ou a asma.

11. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 ou 2, uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 6, ou um produto de combinação como definido na reivindica- ção 7, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medi-camento para o tratamento de COPD (incluindo a bronquite crônica e o enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgica, rinite, sinusite, conjuntivite alérgica, conjuntivite, ceratoconjuntivite seca (olho seco), glaucoma, retinopatia diabética, edema macular (incluindo o edema macular diabético), oclusão da veia retinal central (CRVO), degeneração macular relacionada à idade (AMD) seca e/ou úmida, inflamação da catarata pós- operatória, uveíte (incluindo a uveíte posterior, anterior e total), rejeição ao transplante de enxerto da córnea e células límbicas, enteropa- tia sensível ao glúten (doença celíaca), esofagite eosinofílica, doença intestinal do enxerto versus hospedeiro, doença de Crohn, colite ulce- rativa, IBD, artrite reumatoide ou osteoartrite.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, com-posição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, ou produto de combinação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de pioras das doenças inflamatórias, em particular, pioras virais, ou no tratamento de infecções virais, em pacientes com uma ou mais condições crônicas, tais como a insuficiência cardíaca congestiva, a COPD, a asma, o diabetes, o câncer, e/ou em pacientes imunossuprimidos, por exemplo, pós- transplante de órgãos.

13. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a

ou um derivado do mesmo, em que o grupo amino está pro-tegido, ou um sal do mesmo.

14. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (VII)

15. Composto de fórmula (III) de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um composto de fórmula (VIII)

em que P1 representa um grupo de proteção de amina; ou um sal do mesmo.

16. Formulação farmacêutica em pó seco, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

17. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o composto está na forma de seu sal maleato.

18. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o composto é como definido na reivindicação 3.

19. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com a reivindicação 169, caracterizada pelo fato de que o composto está na forma de sua base livre.

20. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que o composto está numa forma finamente dividida com um diâmetro médio de massa (MMAD) de 1 a 10 μm.

21. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizada pelo fato de que o composto é micronizado.

22. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizada pelo fato de que compreende um diluente selecionado dentre lactose, glicose e manitol.

23. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o diluente é lactose, especialmente α-lactose monohidratada.

24. Formulação farmacêutica em pó seco de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende estearato de magnésio ou cálcio.

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