CN111004802A - 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用 - Google Patents

特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111004802A
CN111004802A CN201911415312.8A CN201911415312A CN111004802A CN 111004802 A CN111004802 A CN 111004802A CN 201911415312 A CN201911415312 A CN 201911415312A CN 111004802 A CN111004802 A CN 111004802A
Authority
CN
China
Prior art keywords
p38mapk
expression
gene
shrna
specifically inhibiting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911415312.8A
Other languages
English (en)
Inventor
徐新云
王冰玉
毛吉炎
李柏茹
秦双建
郑凯
蔡颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Center For Disease Control And Prevention (shenzhen Health Inspection Center Shenzhen Institute Of Preventive Medicine)
Original Assignee
Shenzhen Center For Disease Control And Prevention (shenzhen Health Inspection Center Shenzhen Institute Of Preventive Medicine)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Center For Disease Control And Prevention (shenzhen Health Inspection Center Shenzhen Institute Of Preventive Medicine) filed Critical Shenzhen Center For Disease Control And Prevention (shenzhen Health Inspection Center Shenzhen Institute Of Preventive Medicine)
Priority to CN201911415312.8A priority Critical patent/CN111004802A/zh
Publication of CN111004802A publication Critical patent/CN111004802A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024—Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用。一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点，其中，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。上述shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中p38MAPK基因的表达。

Description

特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体及其构建方法和应用。
背景技术
p38MAPK是分子质量为38kb的一种细胞内激酶，可介导应激、炎性细胞因子及细菌产物等多种刺激引起细胞反应，也可以通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平，对细胞的功能调节具有重要作用。p38MAPK是介导炎症反应的重要信号通路，核因子κB(NF-κB)是该信号通路下游的重要转录因子，信号通路的级联激活会增加NF-κB的表达并促进其转位进入细胞核，以激活白细胞介素6(IL-6)、TNF-α等多种炎症因子。此外，p38MAPK信号传导通路在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等机制中起重要调节作用。当细胞内的信息传递出现异常时，就可能会产生肿瘤。
现有技术中有利用p38MAPK-siRNA干扰p38MAPK基因mRNA表达，但其存在干扰效果不够明显，转染效率低，细胞毒性大，且无法实现长效稳定干扰的缺点。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够明显特异抑制p38MAPK基因的表达效果且效果稳定的shRNA。
一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，包括载体及插入在所述载体中的上述shRNA。
在其中一个实施例中，插入在所述载体中的shRNA为双链核苷酸片段，所述双链核苷酸片段的两条链分别如SEQ ID No.4～SEQ ID No.5所示；或所述双链核苷酸片段的两条链分别SEQ ID No.6～SEQ ID No.7所示；或所述双链核苷酸片段的两条链分别如SEQ IDNo.8～SEQ ID No.9所示。
在其中一个实施例中，所述载体为慢病毒载体。
在其中一个实施例中，所述载体为pLVX-shRNA1，所述载体包括BamHI酶切位点、EcoRI酶切位点及KpnI酶切位点，所述shRNA包括BamHI酶切位点粘性末端及EcoRI酶切位点粘性末端，所述shRNA正向插入所述BamHI酶切位点和所述EcoRI酶切位点之间。
一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体的构建方法，包括以下步骤：
提供双链核苷酸片段，所述双链核苷酸片段包括上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA；及
将所述双链核苷酸片段插入慢病毒载体中，得到所述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
一种特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒，通过如下步骤制得：
将上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体转染入宿主细胞中；及
对转染后的所述宿主细胞扩增表达，获得所述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒。
在其中一个实施例中，所述宿主细胞为293FT细胞。
一种重组工程菌，所述重组工程菌内含有上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体及上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒中的至少一种。
上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒或上述重组工程菌在制备治疗p38MAPK基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
一种药物组合物，包括上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒或上述重组工程菌。
本研究在抑制p38MAPK基因表达的方面进行了大量的探索，预料不到地发现，上述shRNA通过与p38MAPK基因中部分序列特异性地结合而持续、稳定、高效地特异抑制p38MAPK基因表达。经试验证实，含有上述shRNA的shRNA重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高。p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02中p38MAPK基因表达明显受到抑制，其基因表达量较肝细胞L02下降了68％；p38MAPK基因沉默后的L02细胞，p38MAPK蛋白表达下降了64％。而对照组的肝细胞L02中p38MAPK基因表达几乎无影响，并且将p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02连续传代培养20代后，收集并分别检测p38MAPK基因和蛋白的表达量，p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02中p38MAPK基因和蛋白的表达与最初的检测结果一致，说明特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中p38MAPK基因的表达。
附图说明
图1为实施例1中shRNA重组载体的双酶切电泳图；
图2为实施例1中pLVX-MARK1-shRNA1重组载体的部分测序结果图；
图3为实施例1中pLVX-MARK1-shRNA2重组载体的部分测序结果图；
图4为实施例1中pLVX-MARK1-shRNA3重组载体的部分测序结果图；
图5为实施例1中pLVX-shRNAC重组载体的部分测序结果图；
图6为实施例2中肝细胞L02分别转染四种病毒后所对应的p38MAPK的mRNA表达情况；
图7为实施例3的qPCR结果；
图8为实施例3中Western blot检测电泳结果图；
图9为实施例3中Western blot检测的定量结果图；
图10～图16依次PM2.5对c-fos、c-myc、k-ras、p53、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9表达影响的结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点。特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA中的靶序列的互补序列能够靶向p38MAPK基因的特定序列，从而使得p38MAPK基因的表达受到抑制。
在其中一个实施例中，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示。
在其中一个实施例中，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示。
在其中一个实施例中，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
茎环结构用于使shRNA呈茎环。进一步地，茎环结构的碱基序列为5'-TTCAAGAGA-3'。
终止位点为RNA聚合酶的转录终止位点。在其中一个实施例中，终止位点为RNAPoly III聚合酶的转录终止位点。进一步地，终止位点的碱基序列为5'-TTTTT-3'。
在其中一个实施例中，shRNA还包括与载体相应的酶切位点粘性末端，使shRNA能够与酶切后的载体连接。进一步地，shRNA从5'端到3'端包括依次连接的BamHI酶切位点粘性末端、靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列、终止位点以及EcoRI酶切位点粘性末端。
当然，需要说明的是，shRNA中的酶切位点粘性末端不限于为BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端，还可以是其他酶切位点粘性末端，只要使得shRNA与载体能够连接以构成shRNA重组载体即可。
在其中一个实施例中，shRNA以双链核苷酸片段的形式存在。双链核苷酸片段形式的shRNA能够插入病毒载体中，以转染宿主细胞，进而持续、稳定、高效且特异性地抑制宿主细胞中p38MAPK基因的表达。
进一步地，shRNA的两条链分别如SEQ ID No.4～SEQ ID No.5所示。其中，正义链如SEQ ID No.4所示，反义链如SEQ ID No.5所示。
进一步地，shRNA的两条链分别如SEQ ID No.6～SEQ ID No.7所示。其中，正义链如SEQ ID No.6所示，反义链如SEQ ID No.7所示。
进一步地，shRNA的两条链分别如SEQ ID No.8～SEQ ID No.9所示。其中，正义链如SEQ ID No.8所示，反义链如SEQ ID No.9所示。
本研究在抑制p38MAPK基因表达方面进行了大量的探索，预料不到地发现，上述shRNA通过与p38MAPK基因中部分序列特异性地结合而持续、稳定、高效地抑制p38MAPK基因表达。经试验证实，含有上述shRNA的shRNA重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高。p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02中p38MAPK基因表达明显受到抑制，其基因表达量较肝细胞L02下降了68％；p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02，p38MAPK蛋白表达下降了64％。而对照组的肝细胞L02中p38MAPK基因表达几乎无影响，说明特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中p38MAPK基因的表达。
一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，包括载体及插入在载体中的上述shRNA。
具体地，载体包括基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列以及启动子序列。
在其中一个实施例中，抗性基因序列包括氨苄青霉素抗性基因序列。
多克隆位点序列含有多个限制内切酶单一识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
在其中一个实施例中，载体为慢病毒载体。进一步地，慢病毒载体为pLVX-shRNA1。选用pLVX-shRNA1是因为pLVX-shRNA1载体带有puromycin抗性筛选标签，可用于筛选细胞株，快速、高效完成细胞株鉴定。
pLVX-shRNA1包括BamHI酶切位点、EcoRI酶切位点及KpnI酶切位点。pLVX-shRNA1的BamHI酶切位点对应于shRNA的酶切位点，pLVX-shRNA1的EcoRI酶切位点对应于shRNA的EcoRI酶切位点，从而在BamHI、EcoRI酶切之后形成相应的粘性末端，而使酶切后的载体与酶切后的shRNA形成特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
pLVX-shRNA1的KpnI酶切位点能够与其BamHI酶切位点配合，以验证shRNA是否成功插入pLVX-shRNA1。
在其中一个实施方式中，shRNA正向插入慢病毒载体的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。
本研究在抑制p38MAPK基因表达的靶序列的选择、shRNA的选择、载体的选择以及shRNA插入位点等方面进行了方面进行了大量的探索，预料不到地发现，将上述shRNA插入慢病毒表达载体中，成功构建能够特异性抑制p38MAPK基因的shRNA重组载体。将该shRNA重组载体转染到人源细胞中的转染效率高，表达载体的用量少，且该shRNA重组载体能够持续、稳定、高效地抑制p38MAPK基因表达。
一实施方式的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体的构建方法，包括以下步骤：
S110、提供上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA中的任意一种。
具体地，通过基因合成的方式获得shRNA的正义链及反义链。然后将正义链和反义链混合，退火形成shRNA。
S120、将shRNA插入慢病毒载体中，得到特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
具体地，将shRNA插入到经过限制性内切酶BamHI和限制性内切酶EcoRI双酶切处理后的慢病毒载体中，得到特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
进一步地，慢病毒载体先经过限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切处理，打开缺口，形成慢病毒载体的酶切位点粘性末端，使得特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA与慢病毒载体的酶切位点粘性末端连接，从而获得抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
具体地，用限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切慢病毒载体后，再用DNA连接酶将shRNA连接到双酶切处理后的pLVX-shRNA1的BamHI酶切位点与EcoRI酶切位点之间，获得特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。进一步地，慢病毒载体为pLVX-shRNA1。DNA连接酶为T4DNA连接酶。
在其中一个实施例中，得到特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体后，还包括对特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体进行扩增和鉴定。
上述特异抑制p38MAPK基因表达的表达载体的构建方法操作简单，通过将含有靶序列的shRNA插入慢病毒载体中，成功地构建能够特异性抑制p38MAPK基因的shRNA重组载体。实验结果表明该shRNA重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，表达载体的用量少，且能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中p38MAPK基因的表达。
一实施方式的特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒，通过如下步骤制得：将上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体转染进入宿主细胞中，对转染后的宿主细胞扩增表达，获得特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒。
具体地，宿主细胞为293FT细胞。将特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体与包装载体混合并共转染到293FT细胞中，并培养转染后的293FT细胞，收集上清并过滤，即为特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒的上清液。
进一步地，培养转染后的293FT细胞的时间为24h～48h。使用Lenti-X GoStix试剂盒检测病毒滴度。
需要说明的是，包装载体也可以是其他载体，只要能够与特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体配合促进其扩增及分泌即可。当然，包装载体还也可以省略，只要shRNA重组载体自身能够扩增及分泌即可。
上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒，能够转导到人源细胞中，且该慢病毒能够持续、稳定、高效地抑制该人源细胞中p38MAPK基因表达。
一实施方式的p38MAPK基因表达受抑制的细胞，通过如下步骤制备得到：用上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒感染的肝细胞L02，并培养感染后的肝细胞L02，得到p38MAPK基因表达受抑制的细胞。
具体地，培养肝细胞L02至细胞汇合度至60％～90％，用上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒感染肝细胞L02，并于36.5℃～38℃下培养24小时～48小时，得到p38MAPK基因表达受抑制的细胞。
一实施方式的重组工程菌，含有上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体及上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒中的至少一种。
上述重组工程菌含有上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体及上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒中的至少一种，能够持续、稳定、高效地抑制p38MAPK基因表达。
上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒在制备治疗p38MAPK基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
一实施方式的药物组合物，能够用于治疗p38MAPK基因异常表达相关的疾病，尤其是因PM2.5导致的癌症。该药物组合物包括上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、上述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、上述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒或上述重组工程菌。
可以理解，该药物组合物中还可以包括药学上可接受的辅助剂。
以下为具体实施例部分
以下实施例中，如未特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
构建特异抑制p38MAPK基因表达的表达载体
(1)制备shRNA
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备四种shRNA的两条链。四种特异性干扰MAPK1的shRNA：MAPK1-1、MAPK1-2、MAPK1-3及shRNAC，其中，shRNAC为对照组，MAPK1-1含有如SEQ ID No.1所示的靶序列；MAPK1-2含有如SEQ ID No.2所示的靶序列；MAPK1-3含有如SEQ ID No.3所示的靶序列；shRNAc含有如SEQ ID No.10所示的靶序列。其中，MAPK1-1的正义链(MAPK1-T1)如SEQ ID No.4所示，MAPK1-1的反义链(MAPK1-D1)如SEQ ID No.5所示，MAPK1-2的正义链(MAPK1-T2)如SEQ ID No.6所示，MAPK1-2的反义链(MAPK1-D2)如SEQID No.7所示，MAPK1-3的正义链(MAPK1-T3)如SEQ ID No.8所示，MAPK1-3的反义链(MAPK1-D3)如SEQ ID No.9所示，shRNAC的正义链(shRNAC-TC)如SEQ ID No.11所示，shRNAC的反义链(shRNAC-DC)如SEQ ID No.12所示。具体序列如表1所示。
表1
Figure BDA0002351035970000051
Figure BDA0002351035970000061
(2)特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体的构建
将pLVX-shRNA1用EcoR1和BamH1双酶切，37℃酶切30min后，再次添加限制性内切酶37℃酶切30min。酶切反应体系如下：
表2
Figure BDA0002351035970000062
将酶切后的载体进行琼脂糖凝胶电泳回收，具体操作见OMEGA的Gel ExtrationKit(D2500-01)说明书。
(3)MAPK1-shRNA的退火
按表3将MAPK1-shRNA的双链混合均匀，然后放置于沸水中，让其自然冷却至室温(26℃)，退火完成。接着在退火完成后的MAPK1-shRNA中再加入1mLddH2O。
表3
Figure BDA0002351035970000063
(4)重组干扰载体的构建
将退火后形成的具有粘性末端MAPK1-1片段、MAPK1-2片段、MAPK1-3片段及shRNAC片段分别与酶切后pLVX-shRNA1相连接。连接的反应体系如表4所示，16℃连接过夜，得到MAPK1-1、MAPK1-2、MAPK1-3及shRNAC对应的连接产物。
表4
Figure BDA0002351035970000064
Figure BDA0002351035970000071
(5)转化
各取6μL连接产物转化100μL JM107感受态细胞：将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃热激70s，立即置冰上放置2min,加入预热至室温的150μL TB培养基，250rpm，37℃恒温摇床培养1h，用移液器取100μL均匀的涂在含100μg/mL Ampicillin抗性的TB平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。
(6)阳性克隆子质粒抽提与酶切鉴定
挑取TB平板上的单克隆，加入TB培养基培养利用质粒小提试剂盒提取重组质粒，然后将质粒KpnI+BamHI、KpnI+EcoRI酶切鉴定，结果如图1所示。
在图1中，maker泳道对应于DNA Maker；MAPK1-1(K+B)泳道对应于pLVX-shRNA1与MAPK1-1的连接产物经转化，然后BamH1、KpnI双酶切的产物；MAPK1-1(K+E)泳道对应于pLVX–shRNA1与MAPK1-1的连接产物经转化，然后EcoRI、KpnI双酶切的产物；MAPK1-2(K+B)泳道对应于pLVX–shRNA1与MAPK1-2的连接产物经转化，然后BamH1、KpnI双酶切的产物；MAPK1-2(K+E)泳道对应于pLVX–shRNA1与MAPK1-2的连接产物经转化，然后EcoRI、KpnI双酶切的产物；MAPK1-3(K+B)泳道对应于pLVX–shRNA1与MAPK1-3的连接产物经转化，然后BamH1、KpnI双酶切的产物；MAPK1-3(K+E)泳道对应于pLVX–shRNA1与MAPK1-3的连接产物经转化，然后EcoRI、KpnI双酶切的产物；shRNAC(K+B)泳道对应于pLVX–shRNA1与shRNAC的连接产物经转化，然后BamH1、KpnI双酶切的产物；shRNAC(K+E)泳道对应于pLVX–shRNA1与shRNAC的连接产物经转化，然后EcoRI、KpnI双酶切的产物。
pLVX-shRNA1具有BamH1酶切位点、KpnI酶切位点及EcoRI酶切位点，但EcoRI酶切位点与shRNA的EcoRI的粘性末端结合形成shRNA重组载体后，该EcoRI酶切位点不能再次被EcoRI酶切开，因此，shRNA重组载体在被EcoRI、KpnI双酶切时，只有KpnI一个酶切位点被切开，电泳时只出现一条分子量超过5000bp的条带。因此，由图1初步判定具有粘性末端的MAPK1-1、MAPK1-2、MAPK1-3及shRNAC均成功插入pLVX-shRNA1。
(7)测序
挑取酶切鉴定后的阳性克隆的细菌进行培养，并将培养后的细菌菌液进行测序鉴定，测序由金维智公司进行，测序鉴定结果如图2～5所示。图2为MAPK1-1与pLVX-shRNA1构成的shRNA重组载体(即pLVX-MARK1-shRNA1)的部分测序图，MAPK1-1的正义链位于47位～105位。图3为MAPK1-2与pLVX-shRNA1构成的shRNA重组载体(即pLVX-MARK1-shRNA2)的部分测序图，MAPK1-2的正义链位于54位～111位。图4为MAPK1-3与pLVX-shRNA1构成的shRNA重组载体(即pLVX-MARK1-shRNA3)的部分测序图，MAPK1-3的正义链位于46位～102位。图5为shRNAC与pLVX-shRNA1构成的shRNA重组载体(即pLVX-shRNAC)的部分测序图，shRNAC的正义链位于52位～109位。因此，由图2～图5可知，MAPK1-1、MAPK1-2、MAPK1-3及shRNAC均成功插入pLVX-shRNA1。
实施例2
特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒的制备
(1)慢病毒的包装：按照Lenti-XTMLentiviral Expression Systems试剂盒说明书步骤将pLVX-MARK1-shRNA1、pLVX-MARK1-shRNA2、pLVX-MARK1-shRNA3及pLVX-shRNAC分别包装慢病毒，得到对应的MARK1-shRNA1病毒、MARK1-shRNA2病毒、MARK1-shRNA3病毒及MARK1-C病毒。具体操作为：
a.在37℃、5％CO2条件下大量培养293T细胞，消化下来的细胞均匀铺板。
b.待细胞的融合率在90％时，准备转染。充分混匀转染试剂、包装质粒、
目的质粒后，滴入培养皿中进行转染。
c.转染48h后取出293T细胞，收集病毒上清。
(2)将步骤(1)得到的慢病毒浓缩纯化，每种慢病毒的浓缩纯化均为：10000RPM、4℃离心病毒10min，收集病毒上清。将病毒上清置于超速离心机离心管中，配平离心管，50000RPM，4℃离心病毒2h，去掉上清，保留沉淀的病毒，加入1mL的PBS溶解病毒，利用0.22μm的过滤器过滤溶解的病毒。最后将过滤好的病毒检测滴度，并分装。
(3)采用RT-qPCR法测定步骤(2)得到的每种慢病毒的滴度，具体为：
a.慢病毒RNA提取：分别取100μL的MARK1-shRNA1病毒、MARK1-shRNA2病毒、MARK1-shRNA3病毒及MARK1-C病毒、LV-GFP(标准品107TU，带有荧光标记的慢病毒)慢病毒，利用trizol提取总RNA，方法参考trizol说明书。最后用50μL的DEHP水溶解RNA。
b.反转录：将RNA反转录为cDNA，采用反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagentKit)进行cDNA逆转录合成，冰上配制见表5的逆转录体系(10μL)：
表5
Figure BDA0002351035970000081
反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束，加入90μL的RNase FreedH2O
稀释cDNA，-20℃保存。
c.荧光定量检测：以LV-GFP慢病毒cDNA为标准品，qPCR检测各组慢病毒的Ct值。其中qPCR反应体系如下表6所示：
表6
Figure BDA0002351035970000082
其中，表6中的PCR Forward primer的核苷酸序列为：5’-TGTTGGGCACTGACAATTC-3’(SEQ ID No.31)；PCR Reverse primer的核苷酸序列为：5’-CCGAAGGGACGTAGCAGAAG-3’(SEQ ID No.32)。
标准曲线分析后继续进行建立融解曲线的反应：在55℃～95℃的区间内进行熔解实验：反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s 40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s，标准曲线、熔解曲线和相对定量值。反应结束后，得出标准曲线、熔解曲线和相对定量值。
根据标准曲线，计算出各种病毒的滴度。MARK1-shRNA1病毒、MARK1-shRNA2病毒、MARK1-shRNA3病毒及MARK1-C病毒的滴度分别为7.45×107TU、8.06×107TU、7.71×107TU、8.27×107TU。
(4)检测步骤(2)得到的每种慢病毒的干扰效果：
a.接种肝细胞L02六孔板中，3×105个细胞每孔，培养18h后细胞融合度达到50％左右，加入10μL(1×107TU)的病毒上清。
b.继续培养细胞24h，然后去除含慢病毒的培养基，加入新鲜的RPIM1640完全培养基再培养24h。
c.提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA。
d.利用cDNA为模板，荧光定量PCR检测p38MARK1基因的相对表达量。荧光定量PCR的反应体系见表7。表7中，p38MARK1基因的PCR Forward primer的序列为5’-ATCCTTATGATCAGTCCTTTG-3’(SEQ ID No.13)；p38MARK1基因的PCR Reverse primer的序列为5’-ATCAGGACTCCATCTCTTCTT-3’(SEQ ID No.14)。荧光定量PCR的反应条件：在55℃～95℃的区间内进行熔解实验。95℃30s，1循环，55℃30s，40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s，
表7
Figure BDA0002351035970000091
e.反应结束后，得出标准曲线、熔解曲线和相对定量值。根据检测的数据对各组细胞p38MARK1基因相对表达量进行分析。结果如表8及图6所示。图6中“c”组对应于MARK1-C病毒；“m1”组对应于MARK1-shRNA1病毒；“m2”组对应于MARK1-shRNA2病毒；“m3”组对应于MARK1-shRNA3病毒。图6的纵坐标为p38MARK1基因相对表达量。
表8
Figure BDA0002351035970000092
Figure BDA0002351035970000101
MARK1-shRNA1病毒、MARK1-shRNA2病毒及MARK1-shRNA3病毒可以有效的特异抑制p38MARK1基因表达，其中MARK1-shRNA2病毒干扰效果最佳。
实施例3
p38MAPK基因沉默细胞株构建与鉴定
(1)利用MARK1-shRNA2病毒构建p38MAPK基因沉默细胞株；具体操作如下：
a.接种肝细胞L02六孔板中，3×105个细胞每孔，培养18h后细胞融合度达到50％左右，加入10μL(1×107TU)的病毒上清。
b.继续培养细胞24h，然后去除含慢病毒的培养基，加入新鲜的RPIM1640完全培养基再培养24h。
c.48h后，向感染病毒的细胞加入1μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)。每隔2d换液一次，筛选时间为7d。
d.筛选完成后，去除培养瓶中含嘌呤霉素(Puromycin)的完全培养基，加入正常的完全培养基使细胞正常生长，得到p38MAPK基因沉默细胞株。
(2)实时荧光定量PCR(qPCR)鉴定步骤(1)得到病毒对应的p38MAPK基因沉默细胞株：
1)将肝细胞L02和步骤(1)得到的四种p38MAPK基因沉默细胞分别接种至6孔板。细胞密度达到80％-90％时，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RTreagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。逆转录结束后，加入50μL的RNase Free dH2O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。
2)取各组细胞的cDNA 1μL为模板，以GAPDH为内参，qPCR检测p38MAPK相对表达量其中，p38MAPK的引物序列为：5’-ATCCTTATGATCAGTCCTTTG-3’(SEQ ID No.13)和5’-ATCAGGACTCCATCTCTTCTT-3’(SEQ ID No.14)；GAPDH的引物序列为：5’-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3’(SEQ ID No.15)和5’-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’(SEQ IDNo.16)；设置反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s 40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测肝细胞L02及p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02两组细胞中p38MAPK基因相对表达量，qPCR结果如图7所示。图7的纵坐标为p38MARK1基因相对表达量。
由图7可以看出，p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02株的p38MAPK基因表达明显受到抑制，基因表达量较肝细胞L02下降了68％。
(3)Western blot鉴定p38MAPK基因沉默细胞株
分别取肝细胞L02、p38MAPK基因沉默细胞1瓶(25cm2细胞培养瓶)，去培养基，用冷PBS洗3次，加入200μL细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μL的EP管中，4℃继续裂解30min，12000rpm，4℃离心20min，最后加入5×SDS-PAGESample Loading Buffer，100℃变性5min,进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；将蛋白电转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h；分别加入p38MAPK抗体、GAPDH抗体，4℃室温孵育过夜，TBST洗膜3次，每10min一次，再加入二抗，室温孵育1h,TBST洗膜3次，每10min一次，加入Western blot化学发光试剂后进行成像分析；Western blot结果如图8～图9所示，图9中，1指未处理的肝细胞L02组，2指经MAPK1-2shRNA干扰的肝细胞L02组，图9的纵坐标为p38MAPK的相对含量。由图8～图9可以看出，Western blot结果与Q-PCR结果相符，p38MAPK基因沉默后的肝细胞L02细胞株，p38MAPK蛋白表达下降了64％。以上结果说明p38MAPK基因沉默细胞株构建成功。
实施例4
特异抑制p38MAPK基因表达对凋亡基因的影响
用肝细胞L02、p38MAPK基因沉默细胞作为实验对象，用PM2.5高剂量(50μg/mL)和阳性对照Cr+(10μM)染毒24h，同时设立空白对照组；荧光定量PCR检测癌基因(c-myc、c-fos、k-ras、p53)和凋亡基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)的相对表达量，其中，Q-PCR的c-myc的引物序列为：5’-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3’(SEQ ID No.17)和5’-TCCAGCAGAAGGTGATCCAGAC-3’(SEQ ID No.18)，c-fos的引物序列为：5’-TCTTACTACCACTCACCCGCAGAC-3’(SEQ ID No.19)和5’-GGAATGAAGTTGGCACTGGAGA-3’(SEQID No.20)，k-ras的引物序列为：5’-GCGTAGGCAAGAGTGCCTTGA-3’(SEQ ID No.21)和5’-GACCTGCTGTGTCGAGAATATCCA-3’(SEQ ID No.22)，p53的引物序列为：5’-AGAGCTGAATGAGGCCTTGGAA-3’(SEQ ID No.23)和5’-GAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC-3’(SEQID No.24)，Caspase-3的引物序列为：5’-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3’(SEQ ID No.25)和5’-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3’(SEQ ID No.26)，Caspase-8的引物序列为：5’-CAAATGCAAACTGGATGATGAC-3’(SEQ ID No.27)和5’-AGCAGGCTCTTGTTGATTTGG-3’(SEQ IDNo.28)，Caspase-9的引物序列为：5’-GCCCATATGATCGAGGACATCCA-3’(SEQ ID No.29)和5’-CACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAG-3’(SEQ ID No.30)。荧光定量PCR的结果如图10～图16所示。
图10是PM2.5对c-fos基因表达影响的结果图；图11是PM2.5对c-myc基因表达影响的结果图；图12是PM2.5对k-ras基因表达影响的结果图；图13是PM2.5对p53基因表达影响的结果图；图14是PM2.5对Caspase-3基因表达影响的结果图；图15是PM2.5对Caspase-8基因表达影响的结果图；图16是PM2.5对Caspase-9基因表达影响的结果图；图10～图16的纵坐标依次为c-fos、c-myc、k-ras、p53、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的相对表达量；由图10～图16可知p38MAPK基因沉默细胞(即L02-p38MAPK)的目的基因表达量与未处理的正常肝细胞L02相比，PM2.5染毒组的癌基因c-myc、k-ras、c-fos的表达分别下降了252.3％、47.0％、76.3％，抑癌基因p53表达上升了107.7.0％，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达分别下降了32.7％、18.3％、31.3％。Cr+染毒的阳性对照组的癌基因c-myc、c-fos、k-ras的表达分别下降了224.0％、141.3％、82.7％，抑癌基因p53表达上升了45.7％，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达分别下降了55.0％、46.0％、57.3％。
以上结果显示，实施例3构建的p38MAPK基因沉默的L02细胞株与未处理的正常L02细胞相比较，经PM2.5染毒处理后，癌基因和凋亡基因的表达皆有显著的变化，说明p38MAPK基因对PM2.5致L02细胞的凋亡和癌变有重要的作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）
<120> 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcagatcctc agagggtta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggacctcatg gaaacagat 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctgcattct ggagaaat 18
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gatccgcaga tcctcagagg gttaattcaa gagattaacc ctctgaggat ctgtttttt 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aattaaaaaa cagatcctca gagggttaat ctcttgaatt aaccctctga ggatctgcg 59
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gatccggacc tcatggaaac agatttcaag agaatctgtt tccatgaggt cctttttt 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aattaaaaaa ggacctcatg gaaacagatt ctcttgaaat ctgtttccat gaggtccg 58
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gatccgctgc attctggaga aatttcaaga gaatttctgc cagaatgcag ctttttt 57
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aattaaaaaa gctgcattct ggcagaaatt ctcttgaaat ttctccagaa tgcagcg 57
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagcgcaac tgagaagat 19
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatccgcagc gcaactgaga agatttcaag agaatcttct cagttgcgct gctttttt 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aattaaaaaa gcagcgcaac tgagaagatt ctcttgaaat cttctcagtt gcgctgcg 58
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atccttatga tcagtccttt g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atcaggactc catctcttct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgacttca acagcgacac c 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgttgctgt agccaaattc gt 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctggtgctc catgaggaga 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tccagcagaa ggtgatccag ac 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcttactacc actcacccgc agac 24
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaatgaagt tggcactgga ga 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcgtaggcaa gagtgccttg a 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gacctgctgt gtcgagaata tcca 24
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agagctgaat gaggccttgg aa 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtcaggcc cttctgtctt gaac 24
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gactctggaa tatccctgga caaca 25
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aggtttgctg catcgacatc tg 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caaatgcaaa ctggatgatg ac 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agcaggctct tgttgatttg g 21
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcccatatga tcgaggacat cca 23
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cacaactttg ctgcttgcct gttag 25
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgttgggcac tgacaattc 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccgaagggac gtagcagaag 20

Claims (10)

1.一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA，其特征在于，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
2.一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，其特征在于，包括载体及插入在所述载体中的如权利要求1所述的shRNA。
3.根据权利要求2所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，其特征在于，插入在所述载体中的shRNA为双链核苷酸片段，所述双链核苷酸片段的两条链分别如SEQ IDNo.4～SEQ ID No.5所示；或所述双链核苷酸片段的两条链分别SEQ ID No.6～SEQ IDNo.7所示；或所述双链核苷酸片段的两条链分别如SEQ ID No.8～SEQ ID No.9所示。
4.根据权利要求2所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
5.根据权利要求2所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体，其特征在于，所述载体为pLVX-shRNA1，所述载体包括BamHI酶切位点、EcoRI酶切位点及KpnI酶切位点，所述shRNA包括BamHI酶切位点粘性末端及EcoRI酶切位点粘性末端，所述shRNA正向插入所述BamHI酶切位点和所述EcoRI酶切位点之间。
6.一种特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供双链核苷酸片段，所述双链核苷酸片段包括如权利要求1所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA；及
将所述双链核苷酸片段插入慢病毒载体中，得到所述特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体。
7.一种特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒，其特征在于，通过如下步骤制得：
将如权利要求2～5任一项所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体转染入宿主细胞中；及
对转染后的所述宿主细胞扩增，获得所述特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒。
8.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌内含有如权利要求1所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、如权利要求2～5任一项所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体及如权利要求7所述的特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒中的至少一种。
9.权利要求1所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、权利要求2～5任一项所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、权利要求7所述的特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒或权利要求8所述的重组工程菌在制备治疗p38MAPK基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA、权利要求2～5任一项所述的特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体、权利要求7所述的特异抑制p38MAPK基因表达的慢病毒或权利要求8所述的重组工程菌。
CN201911415312.8A 2019-12-31 2019-12-31 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用 Pending CN111004802A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911415312.8A CN111004802A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911415312.8A CN111004802A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111004802A true CN111004802A (zh) 2020-04-14

Family

ID=70119908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911415312.8A Pending CN111004802A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111004802A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019071144A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 Fulcrum Therapeutics, Inc. USE OF P38 INHIBITORS TO REDUCE DUX4 EXPRESSION

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019071144A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 Fulcrum Therapeutics, Inc. USE OF P38 INHIBITORS TO REDUCE DUX4 EXPRESSION

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FATEMEH KOUHKAN等: "MicroRNA-129-1 acts as tumour suppressor and induces cell cycle arrest of GBM cancer cells through targeting IGF2BP3 and MAPK1", 《J MED GENET》 *
吕智美: "P38MAPK通路在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用研究", 《万方学位论文数据库》 *
焦今文: "P38MAPK信号通路在卵巢上皮性癌顺铂耐药中的作用机制及逆转策略", 《万方学位论文数据库》 *
王泽等: "表达鹅源新城疫病毒NP、M基因重组慢病毒假病毒包装及稳定表达shRNA Vero细胞系的建立", 《中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108315330B (zh) CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用
CN108251423B (zh) CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用
CN107502608B (zh) 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
Grainger et al. Stress-inducible alternative translation initiation of human cytomegalovirus latency protein pUL138
Feederle et al. The members of an Epstein-Barr virus microRNA cluster cooperate to transform B lymphocytes
JP6903305B2 (ja) ヒト由来インターロイキン６のｓｉＲＮＡ、組換え発現ＣＡＲ−Ｔベクターおよびその構築方法と使用
WO2016197360A1 (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA
WO2016197355A1 (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA
WO2016197354A1 (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA
CN107523569B (zh) Pdcd1基因的用途及其相关药物
CN109022436B (zh) 特异抑制3β-HSD基因表达的shRNA重组载体构建与应用
CN109085365B (zh) 一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂
CN107252491B (zh) 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
CN103352052B (zh) 一种多顺反子双标表达慢病毒载体构建及应用
CN110964727A (zh) 特异抑制c-myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用
Wang et al. Functional characterization of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus open reading frame K8 by bacterial artificial chromosome-based mutagenesis
CN111004802A (zh) 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用
CN102260672B (zh) 抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA
CN115779084A (zh) 激活猪的tusc1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用
CN108866099A (zh) 特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法
CN111560374A (zh) 特异抑制c-fos基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用
CN103952410B (zh) 一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用
CN111534520A (zh) 特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用
CN112210556A (zh) 一组靶向干扰IL-33表达的shRNA、重组腺病毒载体及其构建方法和应用
CN112063620A (zh) 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200414

RJ01 Rejection of invention patent application after publication