DK176102B1 - Muterede subtilisin-gener - Google Patents
Muterede subtilisin-gener Download PDFInfo
- Publication number
- DK176102B1 DK176102B1 DK199600361A DK36196A DK176102B1 DK 176102 B1 DK176102 B1 DK 176102B1 DK 199600361 A DK199600361 A DK 199600361A DK 36196 A DK36196 A DK 36196A DK 176102 B1 DK176102 B1 DK 176102B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- subtilisin
- residue
- amino acid
- substituted
- mutant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Description
i DK 176102 B1
Den foreliggende opfindelse angår mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en - aminosyresekvens med mindst . 80% homologi med 1 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel - 5 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 10 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationer ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet medfører 15 aminosyresubstitutioner og dermed ændret enzymfunktion. Nogle af disse muterede enzymer udviser fysiske egenskaber, som er fordelagtige ved industriel anvendelse, især inden for detergentindustrien, idet de giver subtilisin, som er mere stabilt over for oxidation, har større proteaseaktivitet og 20 udviser forbedrede vaskeegenskaber.
Enzymer, der spalter amidbindingerne i proteinsubstrater klassificeres som proteaser, eller (alternativt) peptidaser (se Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, 25 w.H. Freeman and Company, San Francisco, kap. 3),. Bakterier af Bacillus-arten secernerer to ekstracellulære proteaser , en neutral eller metalloprotease, og en alkalisk protease, som funktionelt er en serin endopeptidase, omtalt som subtilisin. Secernering af disse proteaser er blevet sammenkædet med den 30 bakterielle vækstcyklus med størst udtrykkelse af protease i den stationære fase, hvor sporedannelse også finder sted. Joliffe et al. (1980, J. Bacteriol 141: 1199-1208) har foreslået, at Bacillus-proteaser fungerer i cellevægsudskift- 4 ningen.
En serinprotease er et enzym, som katalyserer hydro- 35 2 DK 176102 B1 lysen af. peptidbindinger, i hvilke der er en essentiel serin-rest ved den aktive position (White, Handler og Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," 5. udg., McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272). i 5 Serinproteaseme har en molekylvægt inden for området 25.000 til 30.000. De inhiberes af diisopropylfluorofosfat, men i modsætning til metalloproteaser er de modstandsdygtige over for ethylenediamin-tetraeddikesyre (EDTA) (skønt de stabiliseres ved høj temperatur af kalciumioner). De hydroly-10 serer simple terminale estre og med hensyn til aktivitet ligner de eukaryotisk chymotrypsin, som også er en serinprotease.
Det andet udtryk, alkalisk protease, genspejler serinpro-teasens høje pH-optimum, fra pH 9,0 til 11,0 (se Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711-753).
15 Subtilisin er en serinprotease produceret af gram positive bakterier eller svampe. En lang række subtilisiner er identificeret, og aminosyresekvenserne fra mindst otte subtilisiner er bestemt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus-stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', 20 subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, Subtilisin amylosacchari-ticus og mesentericopeptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247; 5629-5631,- Stahl og Ferrari, 1984, J.Bac- teriol. 158: 411-418; Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811-819; Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913-8926; 25 Nedkov et al., 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421-430;
Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196: 228-232), og to svampe-subtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS. Lett. 183: 195-200) og proteinase K fra Tritirachium album (Jany og Mayer, 1985, 30 Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 485-492).
Subtilisiner er velkarakteriserede fysisk og kemisk.
Ud over kendskab til den primære struktur (aminosyresekvenser) hos disse enzymer er mere end 50 højopløsningsrøntgenstrukturer af subtilisin blevet bestemt, som aftegner sub-35 stratbinding, overgangstilstand, produkter, tre forskellige proteaseinhibitorer og definerer de strukturelle konsekvenser for naturlig variation (Kraut, 1977, Ann.Rev.Biochem. £6: 331- 3 DK 176102 B1 358). Tilfældige og stedsrettede mutationer af subtilisingenet er både opstået ud fra kendskab til de fysiske og kemiske egenskaber hos enzymer og har bidraget med oplysninger om ' subtilisins katalytiske aktivitet, substratspecificitet, - 5 tertiære struktur, etc. {Wells et al., 1987,
Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 84: 1219-1223; Wells et al., 1986,
Phil.Trans.R.Soc.Lond.A. 317: 415-423; Hwang og Warshel, 1987, Biochem. 26: 2669-2673; Rao et al., 1987, Nature 328: 551-554) .
10 Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre deter-15 gentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse,-cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter.
20 Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales 25 ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.
I en artikel (Estell et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:6518-6521) beskrives stedsrettet mutagenese anvendt til at erstatte methionin i position 222 i subtilisin BPN' med alle 30 19 aminosyrer. Det fandtes, at ved substitution ændredes de relative specifikke aktiviteter overfor substratet N-succinyl- L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid sig med 138% til 0,3% i forhold til vildtype subtilisin BPN', idet Cys substitutionen havde den højeste aktivitet. Ala- og Ser-substitutionerne 35 havde henholdsvis 53% og 35% af vildtypens aktivitet. Samtidig fandtes det, at Ala- og Ser-substituenteme havde forbedret resistens mod oxidation med H2Q2.
4 DK 176102 B1
Subtilisiner har fundet udbredt anvendelse inden for industrien, især detergentformuleringer, da de er nyttige til fjernelse af proteinholdige pletter. For at være effektive 5 skal disse enzymer imidlertid ikke blot være aktive under vaskeforhold, men skal også være forenelige med andre detergentkomponenter under opbevaring. For eksempel kan subtilisin anvendes sammen med amylaser, som er aktive over for stivelse; cellulaser, som vil nedbryde cellulosemateriale; lipaser, som 10 er aktive over for fedt; peptidaser, som aktive over for peptider og ureaser, som er effektive over for urinpletter. Formuleringen skal ikke blot beskytte andre enzymer mod nedbrydning fra subtilisin, men subtilisin skal være stabilt med hensyn til oxidation, kalciumbindende egenskaber, deter-15 gens og højt pH hos ikke-enzymatiske detergentkomponenter. Enzymets evne til at forblive stabilt i deres nærvær omtales ofte som dets vaskeevne eller vaskeegenskaber.
US patent nr. 3.770.587, der angår kemisk modifikation af proteolytiske enzymer, anvender således 20 sammenligninger mellem udgangsenzymet og det modificerede enzym i detergenter for at bestemme brugbarheden af de modificerede proteolytiske enzymer.
Den foreliggende opfindelse angår mutant 25 subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 30 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, 35 at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. Mutationerne 5 DK 176102 B1 skabes ved specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet, og i forskellige specifikke udførelsesformer besidder de muterede enzymer ændrede kemiske egenskaber omfattende, men ikke begrænset til forøget stabilitet over for oxidation, øget 5 proteolytisk evne og forbedret vaskeevne.
Den foreliggende opfindelse angår også, men er ikke begrænset til aminosyre- og DNA-sekvenserne for to proteaser hidrørende fra Bacillus lentus varianter, subtilisin 147 og subtilisin 309 så vel som mutationer af disse gener og tilsva-10 rende muterede enzymer.
Stedsrettet mutation kan effektivt fremstille muterede subtilisinenzymer, som kan tildannes til at passe til en række industrielle anvendelser, især inden for områderne detergent-og fødevareindustri. Den foreliggende opfindelse 15 angår delvist, men er ikke begrænset til mutanter af subtilisin 309 genet, som udviser forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet, og/eller forbedret vaskeevne.
20 Forkortelser A = Ala = Alanin V = Val = Valin L = Leu = Leucin I = Ile = Isoleucin 25 P = Pro = Prolin F = Phe = Phenylalanin W = Trp = Tryptophan M = Met = Methionin G - Gly = Glycin 30 S = Ser = Serin T = Thr = Threonin C = Cys = Cystein Y = Tyr = Ty ros in N = Asn = Asparagin 35 Q Gin = Glutamin D = Asp = Asparaginsyre E = Glu = Glutaminsyre 6 DK 176102 B1 K = Lys = Lysin R = Arg = Arginin H = His = Histidin 5
Beskrivelse af figurerne
Figur 1 illustrerer indsættelsen af en delmængde af fragmenter, hvis længder ligger i området fra 1,5 kb til 6,5 10 kb, frembragt ved delvis nedbrydelse af Bacillus lentus stamme 309 DNA med Sau 3A restriktionsendonuclease til Barn HI skåret plasmid pSX50. De to resulterende plasmider, pSX86 og pSX88 indeholdende subtilisin 309 genet i modsatte retninger er også vist.
15 Figur 2 illustrerer indsættelsen af Bacillus lentus stamme 147 DNA fragmenter i plasmid pSX86. Delvis nedbrydning af stamme 147 DNA blev udført med Sau 3A restriktionsendonuclease. Fragmenter med størrelser i området fra 1,5 til 6,5 kb blev derpå ligeret i Barn HI spaltet plasmid pSX56.
20 Produktet, pSX94 indeholder subtilisin 147 genet.
Figur 3 illustrerer åben dobbelt mutagenese under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2: 636-639). Den viser to plasmider, pSX93 og pSC119, begge stammende fra puC13. pSX93 indeholder et Xbal-25 Hindlll fragment af subtilisin 309 genet, og pSX119 indeholder resten af subtilisin 309 genet i et EcoRI-Xbal fragment. I (A) , spaltes plasmid pSX93 med Xbal og Clal, og de åbne molekyler blandes med pSX93 skåret med SacI, denatureres og baseparres igen til frembringelse af plasmider med en enkelt-30 strenget DNA region, som strækker sig inden for subtilisin 309 kodningssekvensen. Et syntetisk oligonucleotid, homologt med subtilisin 309 genet, men indeholdende en mutation, baseparres med den enkeltstrengede åbning, som derpå udfyldes, idet Klenow-fragmentet af DNA polymerase I og T4 DNA ligase anven-35 des. Ved replikation af plasmidet dannes dobbeltstrengede mutanter af subtilisin 309 genet. Samme fremgangsmåde anvendes i (B), idet plasmid pSX119 og EcoRI og Xbal enzymer anven- 7 DK 176102 B1 des til dannelse af mutationer i den tilsvarende region af subtilisin 309 genet.
Figur 4 illustrerer plasmid pSX92, som er et derivat af plasmid pSX62 bærende subtilisin 309 genet. Muterede frag-5 menter (d.v.s. Xbal - Clal, Xbal - Hindlll, eller EcoRI -Xbal), skåret ud af mutationsplasmiderne pSX93 eller pSX119 (se fig. 3) under anvendelse af de relevante restriktionsendo-nucleaser, blev indsat i plasmid pSX92 til ekspression i B. subtilis stamme DN 497.
10 Figur 5 illustrerer plasmid pSX143, som indeholder trunkerede former både af subtilisin 309 og subtilisin 147 genet. In vivo rekombination mellem homologe regioner af disse to gener kan resultere i aktive proteaser.
15 Opfindelsen angår mutationer af subtilisingenet, hvoraf nogle resulterer i ændringer i de kemiske karakteristika af subtilisinenzymet. Mutationer ved specifikke nuclein-syrer kan frembringes, og subtilisinformer kan udformes således, at de kan imødekomme behov ved industriel anvendelse.
20 Opfindelsen bygger delvist på den opdagelse, at mutationer af specifikke nucleinsyrer i subtilisingenet kan resultere i enzymer med ændrede egenskaber. I forskellige udførelsesformer kan der frembringes enzymer med forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteaseaktivitet eller 25 forbedret vaskeevne.
Med henblik på beskrivelsens klarhed og ikke for at begrænse opfindelsen skal den beskrives i fire dele: (a) den kemiske struktur hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 og 309; (b) fremgangsmåder til fremstilling af mutationer af 30 subtilisingenet; (c) ekspression af mutanter af subtilisin og (d) screening af subtilisinmutanter for ønskede kemiske egenskaber .
Kemiske strukturer hos kendte subtilisiner og subtilisin 147 35 og 309
Sekvensanalyse af subtilisin fra forskellige kilder kan afsløre den funktionelle betydning af den primære amino- 8 DK 176102 B1 syresekvens, og kan styre dannelsen af hidtil ukendte mutanter med bevidst modificerede funktioner. Sammenligning af amino-syresekvensen for forskellige subtilisin, medens deres fysiske eller kemiske egenskaber stilles over for hinanden, kan 5 afsløre specifikke målregioner, som sandsynligvis kan fremstille nyttige mutantenzymer.
Aminosyresekvenseme fra mindst otte subtilisiner er kendt. Disse omfatter seks subtilisiner fra Bacillus stammer, nemlig subtilisin 168, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg, 10 subtilisin DY, subtilisin amylosacchariticus og mesenterico-peptidase (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247: 5629 - 5631; Stahl og Ferrari, 1984, j.Bacteriol. 158; 411 - 418;
Vasantha et al., 1984, J.Bacteriol. 159: 811 - 819, Jacobs et al., 1985, Nucl.Acids Res. 13: 8913 - 8926; Nedkov et al., 15 1985, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366: 421 - 430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett. 196: 228 - 232), og to svampesubtilisiner, subtilisin thermitase fra Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS Lett. 183: 195 - 200) og proteinase K fra Tritirachium album limber (Jany og Mayer, 1985, Biol.Chem.
20 Hoppe-Seyler 366: 485-492).
I forbindelse med den foreliggende opfindelse anføres aminosyresekvenseme og .DNA-sekvenserne for to yderligere serinproteaser. Disse proteaser fås fra to Bacillus lentus varianter, 147 og 309, som er deponeret hos NCIB og tildelt 25 accessionsnumrene henholdsvis NCIB 10147 og NCIB 10309.
Deponeringerne skete henholdsvis 26. januar 1968 og 9. september 1968. Med hensyn til Budapesttraktaten anses deponeringsdatoen at være 31. marts 1982.
For bekvemmelighedens skyld benævnes proteaserne 30 fremstillet ud fra disse stammer henholdsvis subtilisin 147 og subtilisin 309, og generne, der koder for disse proteiner, betegnes subtilisin 147 og 309 generne.
I den foreliggende opfindelse anvendes udtrykket "subtilisinmateriale" til at betegne et proteinmateriale, som 35 indeholder en subtilisin som dets aktive ingrediens. Som det anvendes her og under definitionen af subtilisinmateriale, er en hvilken som helst serinprotease en subtilisin, som har 9 DK 176102 B1 mindst 80% aminosyresekvenshomologi med sekvenserne, der omtales ovenfor for subtilisin 309. Disse serinproteaser beskrives også heri som "homologe serinproteaser".
Tabel I sammenligner de afledte aminosyresekvenser 5 fra subtilisin 309, subtilisin 147, subtilisin BPN', subtilisin Carlsberg og subtilisin 168 (Spizizen et al., 1958,
Proc .Natl-Acad. Sci. U.S.A. 44^: 1072 - 1078) . Tabel II viser subtilisin 309 genets nucleinsyresekvens, og Tabel III viser subtilisin 147 genets nucleinsyresekvens. Sekvenserne for 10 subtilisin 309 eller 147 eller deres funktionelle ækvivalenter kan anvendes i overensstemmelse med opfindelsen. For eksempel kan de i Tabellerne I, II eller III viste sekvenser fra 309 eller 147 ændres ved substitutioner, additioner eller deletioner, som sørger for funktionelt ækvivalente molekyler. På 15 grund af degenerationen i nucleotidkodningssekvenserne kan andre DNA sekvenser, som i det væsentlige koder for den samme aminosyresekvens som vist i Tabel I, anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse. Disse omfatter, men er ikke begrænset til nucleotidsekvenser omfattende det hele eller 20 dele af subtilisin 309 eller 147 sekvenserne vist i Tabellerne II eller III, som ændres ved substitution af forskellige kodoner, som koder for den samme eller en funktionelt ækvivalent aminosyrerest inden for sekvensen, idet der således frembringes en stum ændring. For eksempel kan en eller flere 25 aminosyrerester inden for sekvensen substitueres med en anden aminosyrerest med lignende polaritet, der virker som en funktionel ækvivalent. Substitutioner for en aminosyre inden for sekvensen kan udvælges blandt andre medlemmer af den klasse, som aminosyren hører til. For eksempel omfatter de ikke-polære 30 (hydrofobe) aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, phenylalanin, tryptophan og methionin. De polære neutrale aminosyrer omfatter glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt 35 ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutamin-syre.
Nær overensstemmelse kan måles ved sammenligning af 10 DK 176102 B1 aminosyresekvenserne. Der findes mange metoder til sammenstilling af proteinsekvenser, men forskellene viser sig kun, når graden af overensstemmelse er ret lille. Metoderne beskrevet i Atlas of Protein Sequence and Structure, Margaret O. Dayhoff 5 ed., vol. 5, supp. 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D.C., p. 3 ff., med titlen SEARCH and ALIGN, definerer overensstemmelse. Det er kendt teknik, at beslægtede proteiner kan variere i antal af aminosyrer så vel som identitet af hver 10 aminosyre langs kæden. Det vil sige, at der kan forekomme deletioner eller indsættelser, når to strukturer sammenstilles med henblik på maksimal identitet. For eksempel har subtilisin Carlsberg kun 274 aminosyrer, medens subtilisin BPN’ har 275 aminosyrer. Sammenstilling af de to aminosyrer viser, at 15 Carlsberg ikke har en rest, der svarer til Asn56 fra subtilisin BPN'. Aminosyresekvensen fra Carlsberg synes derfor meget forskellig fra BPN', medmindre der anføres et hul ved lokation 56. Derfor kan det med en høj grad af sikkerhed forudsiges, at erstatning af Asn med Ser ved lokation 218 i subtilisin Carls-20 berg vil forøge thermostabiliteten, forudsat at resterne i Carlsberg nummereres med homologi til BPN’.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan de for subtilisin 309 og 147 bestemte sekvenser sammenlignes med sekvenser fra kendte subtilisiner (se tabel I) eller nyligt opdagede 25 subtilisiner for at udlede positioner for ønskede mutationer.
For at gøre dette skal nær overensstemmelse mellem de sammenlignede subtilisiner bestemmes.
Forsøg på at bestemme forholdet mellem subtilisins primære struktur og dens fysiske egenskaber har afsløret 30 betydningen af methionin-222 resten så vel som de i den aktive position funktionelle aminosyrer, nemlig asparaginsyre-32, histidin-64 og serin-221. Asparagin-155 og Serin-221 ligger inden for oxyanionbindingspositionent. Mutationer ved disse positioner mindsker sandsynligvis den proteolytiske aktivitet.
35 Ifølge den foreliggende opfindelse blev aminosyresekvenserne fra subtilisin 309 og 147 sammenlignet med hinanden og med andre subtilisinsekvenser (se Tabel II). Rester, som varierede 11 DK 176102 B1 mellem subtilisin 309 eller 147 og andre subtilisiner blev identificeret. For eksempel indeholder subtilisin 309 en serinrest ved rest 153, hvorimod subtilisin 147, BPN', Carls-berg og 168 indeholder en alaninrest. Hvis derfor serin 153 5 resten fra subtilisin 309 blev ændret til en alaninrest, kunne de fysiske egenskaber af subtilisin 309 ændres i en ønsket retning. På samme måde indeholder subtilisin 147 en serinrest ved position 218, hvorimod de andre subtilisiner udtrykte en asparaginrest. Fordi subtilisin 147 har forbedret thermosta-10 bilitet i forhold til andre subtilisiner, .kan mutation af asparagin 218 fra subtilisin 309 til en serinrest forbedre thermostabiliteten for subtilisin 309. Som et andet eksempel blev det sluttet, at eftersom Thr 71 er tæt på den aktive position, kunne indførelsen af en negativt ladet aminosyre, 15 såsom asparaginsyre, undertrykke oxidative angreb ved elektrostatisk frastødning. De for subtilisins fysiske egenskaber sandsynligvis mest relevante positioner er sådanne, i hvilke der er bevaring af aminorester mellem de fleste subtilisiner, for eksempel de ovenfor omtalte Asp-153 og Asn-· 20 218 og også Trp-6, Arg-170, Pro-168, His-67, Met-175, Gly-219,
Arg-275. Ved mutation af nucleinsyresekvenserne således at en aminosyre, som er forskellig fra andre subtilisiner substitueres med en aminosyre, som stemmer overens, kan resultatet være en mere stabil form for subtilisin.
25 Wells et al. (1987, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 84: 1219 - 1233) har anvendt sammenligning af aminosyresekvenser og positionrettet mutation til at frembringe subtilisinsub-stratspecificitet. Forskellige subtilisiners katalytiske aktiviteter kan være væsentlig forskellige over for udvalgte 30 substrater. Wells har vist, at kun tre aminosyresubstitutioner kan bevirke, at B. amyloliquefaciens subtilisins substratspecificitet nærmer sig B. licheniformis subtilisins, enzymer, som er forskellige med faktor 10 - 50 med hensyn til katalytisk effektivitet i deres naturlige tilstand. Sammenlignings-35 analyse mellem subtilisin 147 og 309 og andre subtilisiner har vist, at mutation af de følgende positioner kan ændre de fysiske eller kemiske egenskaber hos subtilisin: 6, 9, 11-12, 12 DK 176102 B1 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268 eller 275. Deletioner forekommer ved 5 følgende positioner i subtilisinerne 147 og/eller 309, indsættelse af passende aminosyrerester i disse positioner kunne forbedre oprindelsesenzymernes stabilitet: 1, 36, 56, 159, 164-166. Ifølge fremgangsmåden illustreret med disse eksempler, som ikke er begrænsende, fremkommer adskillige 10 mulige mutationspositioner.
Tabel I
Sammenligning af aminosyresekvens for forskellige proteaser 15 10 20 30 a) A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V- b) *-Q-T-V-P-W-G-I-S-F-I-N-T-Q-Q-A-H-N-R-G-I-F-G-N-G-A-R-V-A-V- c) A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K-A-F-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-20 d) A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V- e) A-Q-S-V-P-Y-G- I-S-Q-I-K-A-P-A-L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V- 40 50 60 a) L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D- b) L-D-T-G-I-*-A-T-H-P-D-L-R-I-A-G-G-A-S-F-I-S-S-E-P-*-S-Y-H-D-25 c) I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-K-V-A-G-G-A-S-M-V-P-S-E-T-N-P-F-Q-D- d) L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D- e) L-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-N-V-R-G-G-A-S-F-V-A-S-E-T-N-P-Y-Q-D- 70 80 90 30 a) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-bJ N-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-D-L-C) N-N-S-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L- d) G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L- e) G-S-S-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-S-P-S-A-S-L-35 100 110 120 a) Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H- t 13 DK 176102 B1 b) Y-A-V-K-V-L-D-R-N-G-S-G-S-L-A-S-V-A-Q-G-I-E-W-A-I-N-N-N-M-H- c) Y-A-V-K-V-L-G-A-D-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-A-N-N-M-D- d) Y-A-V-K-V-L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D- e) Y-A-V-K-V-L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-A-I-S-N-N-M-D-5 130 140 150 a) V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V- b) I-I-N-M-S-L-G-S-T-S-G-S-S-T-L-E-L-A-V-N-R-A-N-N-A-G-I-L-L-V- c) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-P-S-A-A-L-K-A-A-V-D-K-A-V-A-S-G-V-V-V-V-10 d) V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V- e) V-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-A-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S-S-G-I-L-V-A- 160 170 180 a) A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-15 b) G-A-A-G-N-T-G-R-*-Q-G-V-N-*-*-*-Y-P-A-R-Y-S-G-V-M-A-V-A-A-V- c) A-A-A-G-N-E-G-T-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-G-K-Y-P-S-V-I-A-V-G-A-V- d) A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V- e) A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P-S-T-I-A-V-G-A-V- 20 190 200 210 a) D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-
b) D-Q-N-G-Q-P-P-S-F-S-T-Y-G-P-E-I-E-I-S-A-P-G-V-N-V-N-S-T-Y-T-C) D-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-V-G-P-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P
d) D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P- 25 e) N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A-P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P- 220 230 240 a) G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S- b) G-N-R-Y-V-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-V-A-A-L-V-K-S-R-Y-P-S-30 C) G-N-K-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- d) T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N- e) G-G-T-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T- 35 a) W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-b) Y-T-N-N-Q-I-R-Q-R-I-N-Q-T-A-T-Y-L-G-S-P-S-L-Y-G-N-G-L-V-H-A-C) W-T-N-T-Q-V-R-S-S-L-E-N-T-T-T-K-L-G-D-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- 14 DK 176102 B1 d) L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V- e) W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A-T-Y-L-G-N-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V-
5 a) E-A-A-T-R
b) G-R-A-T-Q
c) Q-A-A-A-Q
d) E-A-A-A-Q
e) Q-A-A-A-Q
10 a = subtilisin 309 b = subtilisin 147 c = subtilisin BPN' 15 d = subtilisin Carlsberg e = subtilisin 168 * = angivet deletion 20
Der findes inden for teknikkens stade mange velkendte metoder til indføring af mutationer i gener. Efter en kort diskussion af kloning af subtilisingener, vil fremgangsmåder til dannelse af mutationer i subtilisingenet på både tilfæl-25 dige positioner og specifikke positioner blive diskuteret.
Det gen, der koder for subtilisin, kan klones fra en hvilken som helst Gram-positiv bakterie eller svamp ved hjælp af forskellige inden for teknikken velkendte metoder. Først skal der konstrueres et genom og/eller cDNA bibliotek af DNA, 30 idet der anvendes kromosomalt DNA eller messenger RNA fra organismen, der fremstiller den subtilisin, der skal undersøges. Hvis aminosyresekvensen af subtilisin er kendt, kan homologe, mærkede oligonucleotidprober derpå syntetiseres og anvendes til identifikation af kloner, der koder for subtili-35 sin, fra et genom bibliotek af bakterielt DNA eller fra et fungus cDNA bibliotek. Eller der kan anvendes en mærket oligonucleotidprobe indeholdende sekvenser, der er homologe 15 DK 176102 B1 med subtilisin fra en anden bakteriestamme eller svamp, som en probe til identifikation af subtilisinkodende kloner, idet hybridisering og vaskebetingelser med lavere stringens anvendes .
5 En yderligere metode til identifikation af subtili- sinproducerende kloner kunne indebære indsættelse af fragmenter af genom DNA i en udtrykkelsesvektor, såsom et plasmid, transformering af protease-negative bakterier med det fremkomne genome DNA bibliotek, og efterfølgende udspredning 10 af de transformerede bakterier på agar indeholdende et substrat for subtilisin, såsom skummetmælk. Bakterier indeholdende subtilisiribærende plasmid vil frembringe kolonier omgivet af en ring af klar agar, på grund af at skummetmælken nedbrydes af secerneret subtilisin.
15 Når først subtilisingenet er klonet i en egnet vek tor, såsom et plasmid, kan adskillige fremgangsmåder til indførelse af tilfældige mutationer i genet anvendes.
En fremgangsmåde kunne være indføring af det klonede subtilisingen som en del af en optagelig vektor i en muta-20 torstamme af Eschericia coli.
En anden fremgangsmåde ville indebære frembringelse af en enkeltstrenget form af subtilisingenet og derpå baseparring af DNA-fragmentet indeholdende subtilisingenet med et andet DNA-fragment, således at en del af subtilisingenet 25 forbliver enkeltstrenget. Denne diskrete, enkeltstrengede region kunne derpå udsættes for et hvilket som helst af en række mutagener, herunder, men ikke begrænset til, natrium-bisulfit, hydroxylamin, salpetersyrling, myresyre eller hydra-lazin. Et særligt eksempel på denne fremgangsmåde til dannelse 30 af tilfældige mutationer er beskrevet af Shortle og Nathans (1978, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 75: 2170-2174). Ifølge
Shortle og Nathans fremgangsmåde ville plasmidet bærende subtilisingenet blive "knækket" af et restriktionsenzym, som spalter inden for genet. Det fremkomne hak ville blive 35 udvidet til en åbning af exonucleasevirkningen fra DNA polymerase I. Den fremkomne enkeltstrengede åbning kunne derpå mutageniseres, ved at et hvilket som helst af de nævnte muta- 16 DK 176102 B1 genesemidler anvendtes.
Som en anden mulighed kan subt i lis ingenet fra en Bacillus-art omfattende den naturlige promoter og andre kontrolsekvenser klones i en plasmidvektor indeholdende repli-5 koner for både E. coli og B. subtilis, en selekterbar pheno-typisk markør og M13 replikationsorigo til fremstilling af enkeltstrenget plasmid DNA på superinfektion med hjælpefag IR1. Enkeltstrenget plasmid DNA indeholdende det klonede subtilisingen isoleres og baseparres med et DNA-fragment indehol-10 dende vektorsekvenser, men ikke subtilisins kodende region, hvilket bevirker til et åbent duplex molekyle. Mutationer indføres i subtilisingenet enten med natriumbisulfit, salpetersyrling eller myresyre eller ved replikation i en mutatorstamme af E. coli som beskrevet ovenfor. Eftersom 15 natriumbisulfit udelukkende reagerer med cytosin i et enkeltstrenget DNA, er de med dette mutagen skabte mutationer kun begrænset til de kodende regioner. Reaktionstid og bisulfit-' koncentration varieres i forskellige forsøg, således at der gennemsnitligt skabes fra en til fem mutationer per subtili-20 singen. Inkubation af 10 μg åbent dobbelt DNA i 4 M Na-bisul-fit, pH 6,0, i 9 minutter ved 37°C i en reaktionsvolumen på 400 μΐ, deaminerer ca. 1% cytosiner i den enkeltstrengede region. Den kodende region for modent subtilisin indeholder ca. 200 cytosiner afhængigt af DNA strengen. Reaktionstiden 25 kan med fordel varieres fra ca. 4 minutter (til frembringelse af en mutationsfrekvens på ca. 1 ud af 200) til ca. 20 minutter (ca. 5 ud af 200).
Efter mutagenese behandles de åbnede molekyler in vitro med DNA polymerase I (Klenow fragment) til dannelse af 30 fuldstændigt dobbeltstrengede molekyler og for at fiksere mutationerne. Kompetente E. coli transformeres derpå med det mutageniserede DNA til fremstilling af et forstærket bibliotek af mutante subtilisiner. Forstærkede mutant biblioteker kan også fremstilles ved dyrkning af plasmid DNA i en Mut D stamme 35 af E. coli, som forøger rækken af mutationer på grund af fejlbehæftet DNA-polymerase.
17 DK 176102 B1
Mutagenerne salpetersyrling og myresyre kan også anvendes til fremstilling af mutantbiblioteker. Fordi disse stoffer ikke er så specifikke for enkeltstrenget DNA som na-triumbisulf it, udføres mutagenesereaktioneme efter følgende 5 fremgangsmåde. Den kodende del af subtilisingenet klones i M13 phagen ifølge standardmetoder og enkeltstrenget DNA forberedes. Den enkeltstrengede DNA omsættes derpå med 1 M salpetersyrling, pH 4,3 i 15 - 60 minutter ved 23°C eller 2,4 M myresyre i 1 - 5 minutter i 23°C. Disse reaktionstidsområder 10 frembringer en mutationsfrekvens på fra 1 ud af 1000 til 5 ud af 1000. Efter mutagenese baseparres en universel primer med M13 DNA og dobbelt DNA syntetiseres, idet mutageniseret enkeltstrenget DNA anvendes som templat, således at den kodende del af subtilisingenet bliver fuldstændigt dobbeltstrenget. På 15 dette punkt kan den kodende region skæres ud af M13 vektoren med restriktionsenzymer og ligeres i en umutageniseret ekspressionsvektor, således at mutationer kun forekommer i restriktionsfragmentet (Myers et al., Science 229: 242 - 257 (1985)) .
20 Ifølge yderligere en fremgangsmåde kan mutationer dannes ved at underkaste to forskellige former for subtilisin in vivo rekombination. Ifølge denne fremgangsmåde fører homologe regioner inden for de to gener til en krydsning af tilsvarende regioner, hvilket resulterer i udvekslingen af 25 genetisk information. Dannelsen af hybride amylasemolekyler ifølge denne teknik er fuldstændigt beskrevet i dansk patent nr. 160840, som der herefter skal henvises til. Et eksempel på et plasmid, som kan danne hybride subtilisinformer er afbildet i fig. 5. Både subtilisin 309 og 147 generne, indført i 30 plasmid pSX143, er trunkerede og kan derfor ikke selv føre til subtilisinekspression. Hvis rekombinationen imidlertid forekommer mellem de to gener, for at korrigere manglen hidrørende fra trunkering, d.v.s. den N-terminale region af subtilisin 309 genet bliver kædet sammen med den C-terminale 35 region af subtilisin 147 genet, kan der fremstilles aktivt mutant subtilisin. Hvis pSX143 indføres i en proteasenegativ 18 DK 176102 B1 bakteriestamme, og bakterier, som udvikler en proteasepositiv phenotype, derpå selekteres, kan der identificeres forskellige mutanter, subtilisin 309/147 kimærer.
Når subtilisingenet er blevet klonet og de ønskede 5 mutationssteder fastlagt, kan disse mutationer indføres ved at anvende syntetiske oligonucleotider. Disse oligonucleotider indeholder nucleotidsekvenser, som flankerer de ønskede mutationspositioner; mutante nucleotider indsættes under oligonucleotidsyntese. Ifølge en foretrukket fremgangsmåde 10 skabes en enkeltstrenget DNA-åbning, som danner bro i subtilisingenet, i en vektor, der bærer subtilisingenet. Derpå baseparres det syntetiske nucleotid, der bærer den ønskede mutation, til en homolog del af det enkeltstrengede DNA. Den resterende åbning udfyldes derpå af DNA polymerase I (Klenow 15 fragment) og konstruktionen ligeres, idet der anvendes T4 ligase. Et specifikt eksempel på denne fremgangsmåde er beskrevet i Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:636-639). Ifølge Morinaga et al., fjernes et indre fragment fra genet, idet der anvendes restriktionsendonuclease. Vektoren/genet, 20 der nu indeholder en åbning, denatureres derpå og hybridiseres til en vektor/gen, som, i stedet for at indeholde en åbning, er blevet spaltet med en anden restriktionsendonuclease ved en position uden for det område, som er berørt af åbningen. En enkeltstrenget region i genet er derpå tilgængelig for 25 hybridisering med muterede oligonucleotider, den resterende åbning udfyldes af Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I, indskudene ligeres med T4 DNA ligase, og efter en replikationscyklus frembringes et dobbeltstrenget plasmid, som bærer den ønskede mutation. Ved fremgangsmåden ifølge Morinaga 30 undgås den yderligere manipulation konstruktion af nye restriktionspositioner, og derfor lettes dannelsen af mutationer ved multiple positioner. Ifølge US patentskrift nr. 4.760.025 (Estell et al., juli 26, 1988) er det muligt at indføre oligonucleotider, der bærer multiple mutationer ved 35 udførelse af mindre ændringer i kassetten; imidlertid kan endnu flere forskellige mutationer indføres på et hvilket som helst tidspunkt ifølge Morinaga-metoden, da en række 19 DK 176102 B1 oligonucleotider af forskellig længde kan indføres.
Et muteret subtilisingen fremstilles ifølge de beskrevne fremgangsmåder eller en hvilken som helst fremgangsmåde inden for kendt teknik udtrykkes i enzymform, 5 idet en ekspressionsvektor anvendes. En ekspressionsvektor falder almindeligvis inden for definitionen af en kloningsvektor, eftersom en ekspressionsvektor oftest omfatter bestanddelene i en typisk kloningsvektor, d.v.s. et element, som tillader autonom replikation af vektoren i en mikro-10 organisme uafhængig af mikroorganismens genom og en eller flere phenotypiske markører til selektionsformål. En ekspressionsvektor omfatter kontrolsekvenser, der koder for en promoter, operator, ribosombindingssted, translationsinitieringssignal og eventuelt et repressorgen. For at tillade 15 secerneringen af det udtrykte protein, kan nucleotider, der koder for en "signalsekvens", indsættes inden genets kodningssekvens. Med henblik på ekspression under styringen af kontrolsekvenser, bindes et målgen, som skal behandles ifølge opfindelsen, operabelt til kontrolsekvenserne i den korrekte 20 læseramme. Promotersekvenser, som kan indføres i plasmid-vektorer, og som kan understøtte transskriptionen af det mutante subtilisingen, omfatter, men er ikke begrænset til, den prokaryote β-lactamasepromoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.Natl.Acad.Sci. , U.S.A. 75: 3727-3731) og tac 25 promoteren (DeBoer et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 80:21-25). Yderligere henvisninger kan også findes i "Useful proteins from recombinant bacteria" i Scientific American, 1980, 242: 74-94.
Ifølge en udførelsesform transformeres B. subtilis 3 0 med en ekspressionsvektor, der bærer det muterede DNA. Hvis ekspression skal ske i en secernerende mikroorganisme, såsom B. subtilis, kan en signalsekvens følge translationsinitiationssignalet og gå forud for den relevante DNA-sekvens. Signalsekvensen fungerer ved at transportere ekspressions-35 produktet til cellevæggen, hvor det spaltes fra produktet ved secernering. Det er hensigten, at udtrykket "kontrolsekvenser" 20 DK 176102 B1 som defineret ovenfor, skal omfatte en signalsekvens, når den er tilstede.
Til screening af mutanter kan transformeret B. subtilis dyrkes i nærvær af et filtermateriale (såsom nitro-5 cellulose), hvortil det secernerede ekspressionsprodukt (f.eks. enzym) binder. For at screene for et ekspressionsprodukt med en ønsket egenskab udsættes et filterbundet ekspressionsprodukt for betingelser, som adskiller det relevante ekspressionsprodukt fra det naturligt forekommende 10 ekspressionsprodukt. For eksempel kan det filterbundne ekspressionsprodukt udsættes for betingelser, som ville inaktivere et naturligt forekommende produkt. Bevaret enzymaktivitet, der følger ødelæggende behandling, viser, at mutationen giver enzymet øget stabilitet, og at det derfor er en 15 nyttig mutation.
Ifølge en udførelsesform for opfindelsen udføres screening for stabile varianter, idet der anvendes en prote-asedefekt B. subtilis stamme transformeret med variantplas-midet og spredt ud på plader som følger: et nitrocellulose-20 filter anbringes på en næringsbase i en petriskål, og et celluloseacetatfilter anbringes ovenpå nitrocellulosen. Kolonier dyrkes på celluloseacetatet, og protease fra individuelle kolonier secerneres gennem celluloseacetatet til nitrocellulosefiltret, hvor det bindes stabilt. Protease fra 25 hundereder af kolonier bindes til et enkelt filter, hvilket tillader efterfølgende screening af tusinder af forskellige varianter ved behandling af adskillige filtre.
Til identifikation af kolonier, der fremstiller subtilisin med forøget thermostabilitet, kan filtrene inku-30 beres i pufferopløsninger ved temperaturer, som vil inaktivere i det væsentlige al vildtypeaktivitet. Varianter med forøget stabilitet eller aktivitet beholder aktiviteten efter dette trin. Det passende behandlede filter dyppes derpå i en opløsning indeholdende Tosyl-L-Arg methyl ester (TAME) Benzoyl-Arg-35 ethyl-ester (BAEE), Acetyl-Tyr-ethyl-ester (ATEE) (Sigma) eller lignende forbindelser. Fordi TAME, BAEE og ATEE er substrater for proteaserne, spaltes de i de zoner på filtret, der 21 DK 176102 B1 indeholder subtilisinvarianter, som forbliver aktive efter behandling. Når spaltning forekommer, frigøres protoner i reaktionsblandingen og bevirker, at phenolrødt ændrer farve fra rød til gul på områder, der beholder proteaseaktivitet.
5 Denne fremgangsmåde kan anvendes til at screene for forskellige variantklasser blot med mindre modifikationer. For eksempel kunne filtrene behandles ved høj temperatur, ved høj pH, med denatureringsmidler, oxidationsmidler eller under andre betingelser, som normalt inaktiverer et enzym, såsom en 10 protease, for at finde resistente varianter. Varianter med ændret substratspecificitet kunne screenes ved at erstatte TAME, BAEE eller ATEE med andre substrater, som normalt ikke spaltes med naturligt forekommende vildtypesubtilisin.
Når først en variant med forstærket stabilitet er 15 identificeret ved screening, isoleres kolonien, hvorfra varianten er deriveret, og den ændrede subtilisin oprenses. Forsøg kan udføres med det oprensede enzym til bestemmelse af stabilitetsbetingelserne mod oxidation, thermisk inaktivering, denatureringstemperatur, kinetiske parametre så vel som andre 20 fysiske målinger. Det ændrede gen kan også sekvensbestemmes for at bestemme de aminosyreændringer, der er ansvarlige for den forbedrede stabilitet. Ved at anvende denne fremgangsmåde i er varianter med forbedrede vaskeegenskaber blevet isoleret.
25
Eksempel
Stedsspecifik mutation af subtilisingenet frembringer mutanter med nyttige kemiske egenskaber_ 30
Bakteriestammer B. subtilis 309 og 147 er varianter af Bacillus len-tus, deponeret hos NCIB og tildelt accessionsnumrene NCIB 10147 og NCIB 10309 og beskrevet i US patentskrift nr.
35 3.723.250 (27. marts 1973), som der skal henvises til. B.
subtilis DN 4 97 er beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der også skal henvises til, og er en aro+ transformant af RUB
22 DK 176102 B1 200 med kromosomalt DNA fra SL 438, en sporulerings- og proteasedeficient stamme fra Dr. Kim Hardy fra Biogen. E. coli MC 1000 r'm+ (Casadaban, M. J. og Cohen, S.N. (1980) , J.Mol.Biol. 138: 179-207, blev gjort r‘m+ ved hjælp af 5 konventionelle metoder og er også beskrevet i US patent nr. 5,036,002.
Plasmider pSX50 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002, som der 10 skal henvises til) er et derivat af plasmid pDN 1050 omfattende promoter-operatoren pi0lf B. pumilus xyn B genet og B. subtilis xyl R genet.
pSX65 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af plasmid pDN 1050, omfattende promoter-15 operatoren p202, B. pumilus xyn B genet, og B. subtilis xyl R genet.
pSX93 vist i figur 3a, er pUC13 (Vieira og Messing, 1982, Gene 19: 259-268) omfattende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet inklusiv terminatoren indsat 20 i en polylinkersekvens.
pSX119 er pUCl3 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309-genet indsat i polylinkeren.
pSX62 (beskrevet i US patent nr. 5,036,002 ovenfor) er et derivat af pSX52 (ibid.), som omfatter et fusionsgen 25 mellem kalveprochymosingenet og B. pumilus xyn B genet indsat i pSX50 (ovenfor). pSX62 blev frembragt ved indsættelse af E. coli rm B terminatoren i pSX52 bag prochymosingenet.
pSX92 blev fremstillet ved kloning af subtilisin 309 i plasmid pSX62 (ovenfor) skåret ved Clal og Hind III og fyldt 30 inden indsættelsen af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede subtilisin 309-gen.
Oprensning af subtilisiner 35
Fremgangsmåden angår en typisk oprensning af en fermentering i 10 liter skala af subtilisin 147 enzymet, 23 DK 176102 B1 subtilisin 309 enzymet eller mutanter deraf.
Ca. 8 liter næringsmedium blev centrifugeret ved 5000 opm i 35 minutter i 1 liters bægre. Supernatanterne blev indstillet til pH 6,5 under anvendelse af 10% eddikesyre og 5 filtreret på Seitz Supra S100 filterplader.
Filtraterne blev koncentreret til ca. 400 ml med en Amicon CH2A UF enhed udstyret med en Amicon S1Y10 UF patron. UF-koncentratet blev centrifugeret og filtreret inden adsorption på en Bacitracin affinitetssøjle ved pH 7. Proteasen blev 10 elueret fra Bacitracin søjlen med 25% 2-propanol og 1 M
natriumchlorid i en pufferopløsning med 0,01 M dimethylglutar-syre, 0,1 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 7.
Fraktionerne med proteaseaktivitet fra Bacitracin-15 oprensningstrinnet blev kombineret og anbragt på en 750 ml Sephadex G25 søjle {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutarsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.
Fraktioner med proteolytisk aktivitet fra Sephadex 20 G25 søjlen blev kombineret og en 150 ml CM Sepharose CL 6B
kationbyttersøj le {5 cm dia.) ækvilibreret med en puffer indeholdende 0,01 M dimethylglutaminsyre, 0,2 M borsyre og 0,002 M kalciumchlorid indstillet til pH 6,5.
Proteasen blev elueret med en lineær gradient af 0 -25 0,1 M natriumchlorid i 2 liter af samme puffer (0 - 0,2 M na triumchlorid i tilfælde af subtilisin 147).
I et sidste oprensningstrin blev proteaseholdige fraktioner fra CM Sepharose søjlen kombineret og koncentreret i en Amicon ultrafiltreringscelle udstyret med en GR81P 30 membran {fra De Danske Sukkerfabriker A/S).
Subtilisin 309 og mutanter Met 222 til Ala
Gly 195 til Glu
Asn 218 til Ser 35 Arg 170 til Tyr
Gly 195 til Glu, Arg 170 til Tyr
Gly 195 til Glu, Met 222 til Ala 24 DK 176102 B1 blev oprenset med denne fremgangsmåde.
5 Oligonucleotidsyntese
Alle umage primere blev syntetiseret på en Applied Biosystems 380 A DNA syntesiser og oprenset ved hjælp af poly-acrylamidgelelektroforese (PAGE).
10
Bestemmelse af oxidationsstabilitet
Det oprensede enzym fortyndes til et enzymindhold på ca. 0,1 mg/ml i 0,01 M dimethylglutarsyre, pH 7, og i den 15 samme puffer med 0,01 M pereddikesyre (pH 7).
Begge fortyndinger blev opvarmet til 50°C i 20 minutter. Proteolytisk aktivitet blev målt i fortyndingerne før og efter varmebehandlingen.
20
Prøve for proteolytisk aktivitet OPA Casein metode
Proteolytisk aktivitet blev bestemt med casein som substrat. En Caseinproteaseenhed (CPU) defineres som den 25 mængde enzym, der frigør 1 millimol primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) per minut under standardbetingelser, d.v.s. inkubation i 30 minutter ved 25°C og pH 9,5.
En 2% (w/v) caseinopløsning (Hammarstein fra Merck 30 AG, Vesttyskland) blev fremstillet med Universal Buffer beskrevet af Britton og Robinson (Journ.Chem.Soc. 1931, p.
1451), indstillet til pH 9,5.
To ml substratopløsning blev præinkuberet i et vandbad i 10 minutter ved 25°C. 1 ml enzymopløsning indeholdende 35 ca. 0,2 - 0,3 CPU/ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5) blev tilsat. Efter 30 minutters inkubation ved 25°C standsedes 25 DK 176102 B1 reaktionen ved tilsætning af et stopmiddel (5 ml af en opløsning indeholdende trichloreddikesyre {17,9 g), natriumacetat (29,9 g), og eddikesyre (19,8 g), og suppleret op til 500 ml med ionfrit vand). En blindprøve blev fremstillet på samme 5 måde som prøveopløsningen med undtagelse af, at stopmidlet blev tilsat før enzymopløsningen.
Reaktionsblandingerne blev holdt i 20 minutter i vandbad, hvorefter de blev filtreret gennem Whatman®42 papirfiltre.
10 Primære aminogrupper blev bestemt ved deres farve- udvikling med o-phthaldialdehyd (OPA).
Dinatriumtetraboratdecahydrat (7,62 g) og natrium-dodecylsulfat (2,0 g) blev opløst i 150 ml vand). OPA (160 mg) opløst i 4 ml methanol blev derpå tilsat sammen med 400 μΐ 15 beta-mercaptoethanol, hvorefter opløsningen blev suppleret op til 200 ml med vand.
Til OPA reagenset (3 ml) blev tilsat 40 μΐ af de ovenfor nævnte filtrater blanding. Den optiske tæthed (OD) ved 340 nm blev målt efter ca. 5 minutter.
20 OPA testen blev også udført med en serinstandard indeholdende 10 mg serin i 100 ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5). Pufferen blev anvendt som en blindprøve.
Proteaseaktiviteten blev beregnet fra målinger af den optiske tæthed ved hjælp af følgende formel: 25
CPU/ml enzymopløsning = (ODt - ODb) x Cser x Q
(ODser - ODb) X MWser X ti CPU/g enzympræparat = CPU/ml: b 30 i hvor 0Dt/ ODb, 0DSer og ODB er den optiske tæthed for henholdsvis prøveopløsningen, blindprøven, serinstandarden og pufferen, Cser serinkoncentrationen i mg/ml i standarden, MWser molekylvægten af serin. Q er fortyndingsfaktoren (i dette 35 tilfælde lig med 8) for enzymopløsningen og ti er inkubationstiden i minutter.
26 DK 176102 B1 I den følgende tabel V er vist resultater fra den ovenstående prøve i forhold til det oprindelige enzym.
<►
Prøve for vaskeegenskab 5 Prøvelapper (7 cm x 7 cm, ca. 1 g) blev fremstillet ved at passere krympebehandlet bomuldsstof (100% bomuld, DS 71) gennem karret i en Mathis vaske- og tørremaskine af typen TH (Werner Mathis AG, Zurich, Schweiz) indeholdende spinatsaft (fremstillet af frisk spinat) og derpå gennem maskinens tryk-10 valse for at fjerne overskydende spinatsaft.
Til slut blev tøjet tørret i en kraftig luftstrøm ved stuetemperatur, opbevaret ved stuetemperatur i 3 uger og derpå opbevaret ved -18°C inden anvendelse.
Prøverne blev udført isothermisk i en Terg-0-tometer 15 prøvevaskemaskine (beskrevet i Jay C. Harris "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd., 1954, p. 60-61) i 10 minutter ved 100 opm. Som detergent blev følgende standardpulverdetergent anvendt: 20 LAS, Nansa S 80 0,4 g/1 AE, Berol 0 65 0,15 g/1 Sæbe 0,15 g/1 STPP 1,75 g/1
Natriumsilikat 0,40 g/1 25 CMC 0,05 g/1 EDTA 0,01 g/1 I Na2S04 2,10 g/1
Perborat 1.00 g/1 TAED 0,10 g/1 30 TAED = Ν,Ν,Ν',N‘-tetraacetyl-ethylendiamin; pH blev indstillet med 4 N NaOH til 9,5. Vandet, der anvendtes, var ca. 9° GH (German Hardness).
Forsøgene blev udført ved enzymkoncentrationer på: 0, 35 0,05 CPU/1 og 0,1 CPU/1 og to uafhængige rækker forsøg blev udført for hver af mutanterne.
27 DK 176102 B1
Til hvert forsøg anvendtes otte tøj lapper og et bæger (800 ml) detergent. Af de otte lapper var fire rene og fire var plettede med spinatsaft. Efter vask blev lapperne skyllet i rindende vand i 25 minutter i en spand.
5 Lapperne/stykkerne blev derpå lufttørret natten over (beskyttet mod dagslys) og remissionen, R, bestemt på et E1REPHO 2000 spektrophotometer fra Datacolor S.A., Dietkikon, Schweiz, ved 460 nm.
Som målestok for vaskeevnen anvendtes differential-10 remission, AR, hvor AR er lig med remissionen efter vask med tilsat enzym minus remissionen efter vask uden enzym.
Prøve for thermostabilitet
Samme fremgangsmåde som ovenfor for vaskeevne blev 15 anvendt ved bedømmelse af thermostabiliteten hos de frembragte mutanter, ved at udføre prøven ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 60°C.
20 Kloning af subtilisin 309 og 147 gener
Kromosomalt DNA fra "309" stammen blev isoleret ved at behandle en celleopløsning med Lysozym i 30 minutter ved 37°C og derpå med SDS i 5 minutter ved 60°C. Derefter blev opløsningen ekstraheret med phenolchloroform (50:50), udfældet 25 med ethanol, og præcipitatet opløst igen i TE. Denne opløsning blev behandlet med RNase i 1 time ved 37°C.
Ca. 30 pg kromosomalt DNA blev delvist nedbrudt med restriktionsenzym Sau 3A (New England Biolabs) og fragmenter fra ca. 1,5 kb til ca. 6,5 kb blev isoleret på DEAE cellulose-30 papir fra en 1% agarosegel {subtilisingenet i andre arter er ca. 1,2 kb langt).
Som vist i fig. 1 blev fragmenterne baseparret og ligeret til BamHI skåret plasmid pSX50 (beskrevet i US patentansøgning nr. 039,298 indleveret 17. april, 1987, som der 35 henvises til). Plasmiderne blev derpå transformeret til kompetent B. subtilis DN 497.
28 DK 176102 B1
Cellerne blev derpå bredt ud på LB agarplader med 10 mM phosphat, pH 7, 6 μ9^1 kloramphenicol, og 0,2% xylose for at inducere xyn-promoteren i plasmidet. Pladerne indeholdt også 1% skummetmælk, så de proteaseproducerende transformanter 5 kunne detekteres ved den klare ring, hvor skummetmælken var nedbrudt.
Kloner, der udtrykte protease, blev fremstillet med en frekvens på 10"4. Der fandtes to kloner indeholdende plasmider, der bærer genet for subtilisin 309, pSX86 og pSX88.
10 Genet blev derpå sekvensbestemt, idet fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert anvendtes. Den fremkomne nucleotidsekvens fra subtilisin 309 er vist i tabel II.
29 DK 176102 B1
Tabel il
Subtilisin 309 genet 5 Signal ATGAAGAAACCG TTGGGGAAAATT GTCGCAAGCACC GCACTACTCATT TCTGTTGCTTTT 1 pro
AGTTCATCGATC GCATCGGCTGCT GAACAACGAAAA GAAAAATATTTA ATTGGCTTTAAT
82
10 GAGCAGGAAGCT GTCAGTGAGTTT GTAGAACAAGTA GAGGCAAATGAC GAGGTCGCCATT
CTCTCTGAGGAA GAGGAAGTCGAA ATTGAATTGCTT CATGAATTTGAA ACGATTCCTGTT
TTATCCGTTGAG TTAAGCCCAGAA GATGTGGACGCG CTTGAACTCGAT CCAGCGATTTCT
15 Mature
TATATTGAAGAG GATGCAGAAGTA ACGACAATGGCG CAATCAGTGCCA TGGGGAATTAGC
334
CGTGTGCAAGCC CCAGCTGCCCAT AACCGTGGATTG ACAGGTTCTGGT GTAAAAGTTGCT
20 GTCCTCGATACA GGTATTTCCACT CATCCAGACTTA AATATTCGTGGT GGCGCTAGCTTT
GTACCAGGGGAA CCATCCACTCAA GATGGGAATGGG CATGGCACGCAT GTGGCCGGGACG
ATTGCTGCTTTA AACAATTCGATT GGCGTTCTTGGC GTAGCGCCGAGC GCGGAACTATAC
25
GCTGTTAAAGTA TTAGGGGCGAGC GGTTCAGGTTCG GTCAGCTCGATT GCCCAAGGATTG
GAATGGGCAGGG AACAATGGCATG CACGTTGCTAAT TTGAGTTTAGGA AGCCCTTCGCCA
Xbal
30 AGTGCCACACTT GAGCAAGCTGTT AATAGCGCGACT TCTAGAGGCGTT CTTGTTGTAGCG
GCATCTGGGAAT TCAGGTGCAGGC TCAATCAGCTAT CCGGCCCGTTAT GCGAACGCAATG
GCAGTCGGAGCT ACTGACCAAAAC AACAACCGCGCC AGCTTTTCACAG TATGGCGCAGGG
35
CTTGACATTGTC GCACCAGGTGTA AACGTGCAGAGC ACATACCCAGGT TCAACGTATGCC
Clal
AGCTTAAACGGT ACATCGATGGCT ACTCCTCATGTT GCAGGTGCAGCA GCCCTTGTTAAA
40 CAAAAGAAC C CA TCTTGGTCCAAT GTACAAATCCGC AATCATCTAAAG AATACGGCAACG
AGCTTAGGAAGC ACGAACTTGTAT GGAAGCGGACTT GTCAATGCAGAA GCGGCAACACGC
Stop
TAA
45 1141
Samme fremgangsmåde som ovenfor anvendtes til kloning af subtilisin 147 genet med undtagelse af, at DNA fragmenter 50 blev ligeret i plasmid pSX56 (også beskrevet i U.S. patent nr. 5,036,002 ovenfor) der som angivet i fig. 2 i stedet for xyn DK 176102 B1 30 promoteren indeholder xyl promoteren. Der fandtes en klon indeholdende et plasmid pSX94, der bærer genet for subtilisin 147. Sekvensen for dette gen er vist i tabel III nedenfor.
5
Tabel III
Subtilisin 147 genet 10 Signal
ATGAGACAAAGT CTAAAAGTTATG GTTTTGTCAACA GTGGCATTGCTT TTCATGGCAAAC
1 Pro
CCAGCAGCAGCA GGCGGGGAGAAA AAGGAATATTTG ATTGTCGTCGAA CCTGAAGAAGTT
73
15 TCTGCTCAGAGT GTCGAAGAAAGT TATGATGTGGAC GTCATCCATGAA TTTGAAGAGATT
CCAGTCATTCAT GCAGAACTAACT AAAAAAGAATTG AAAAAATTAAAG AAAGATCCGAAC
Mature GTAAAAGCCATC GAAGAGAATGCA GAAGTAACCATC AGTCAAACGGTT CCTTGGGGAATT 20 280
TCATTCATTAAT ACGCAGCAAGCG CACAACCGCGGT ATTTTTGGTAAC GGTGCTCGAGTC
GCTGTCCTTGAT ACAGGAATTGCT TCACACCCAGAC TTACGAATTGCA GGGGGAGCGAGC
25 TTTATTTCAAGC GAGCCTTCCTAT CATGACAATAAC GGACACGGAACT CACGTGGCTGGT
ACAATCGCTGCG TTAAACAATTCA ATCGGTGTGCTT GGTGTACGACCA TCGGCTGACTTG
TACGCTCTCAAA GTTCTTGATCGG AATGGAAGTGGT TCGCTTGCTTCT GTAGCTCAAGGA
30
ATCGAATGGGCA ATTAACAACAAC ATGCACATTATT AATATGAGCCTT GGAAGCACGAGT
GGTTCTAGCACG TTAGAGTTAGCT GTCAACCGAGCA AACAATGCTGGT ATTCTCTTAGTA
35 GGGGCAGCAGGT AATACGGGTAGA CAAGGAGTTAAC TATCCTGCTAGA TACTCTGGTGTT
ATGGCGGTTGCA GCAGTTGATCAA AATGGTCAACGC GCAAGCTTCTCT ACGTATGGCCCA
i GAAATTGAAATT TCTGCACCTGGT GTCAACGTAAAC AGCACGTACACA GGCAATCGTTAC
40
GTATCGCTTTCT GGAACATCTATG GCAACACCACAC GTTGCTGGAGTT GCTGCACTTGTG
AAGAGCAGATAT CCTAGCTATACG AACAACCAAATT CGCCAGCGTATT AATCAAACAGCA
45 ACGTATCTAGGT TCTCCTAGCCTT TATGGCAATGGA TTAGTACATGCT GGACGTGCAACA
Stop CAATAA 1084 50 31 DK 176102 B1
Frembringelse af stedsspecifikke mutationer af subtilisin 309 genet__
Stedsspecifikke mutationer blev udført ifølge
Morinaga et al. (Biotechnology, ovenfor). Følgende oligonucle-5 otider anvendtes til indføring af mutationerne: a) Gly-195 Glu:
En 27 mer umage primer, Nor-237, som også danner et nyt SacI restriktionssite 10 5' CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGG 3 ' NOR-237 5' GTATGGCGCAGAGCTCGACATTTGTCGC 3'
SacI
15 b) Gly-195 Asp:
En 23-mer umage primer, NOR-323, som også danner en ny Bglll site
AT
5 1 CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTC3’ 20 3' CATACCGCGTCTAGAACTGTAAC 5'
Bglll e) Ser-153 Ala:
En 18-mer umage primer, NOR-324, som også danner en 25 ny PvuII site
G
5' CTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGT 3' NOR-324 3·CATCGCCGTCGACCCTTA 5'
PvuII
30 f) Asn-218 Ser:
En 23-mer umage primer, NOR-325, som også danner en ny MspI site
TC
35 5' TATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATG 3' NOR-324 3' TACGGTCGAATAGGCCATGTAGC 51
MspI
32 DK 176102 B1 g) Thr-71 Asp:
En 23-mer umage primer, NOR-483,
GAC
5' TGTGGCCCGGGACGATTGCTGCTT 3 ' 5 NOR-483 3' ACACCGGCCCCCTGTAACGACGAA 5' h) Met-222 Cys og Gly-219_Cys:
En 32-mer umage, NOR-484,
T TGT
10 5' CAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTC 3' 219 222 NOR-484 3' GTCGAATTTGACATGTAGCACACGATGAGGAG 5' 15 i + j) Gly-195 Glu og Met-222 Ala eller Met-222 Cys:
For disse dobbelte mutanter udførtes kombinationer af NOR-237 og NOR-235 eller NOR-236 ved at forbinde de enkelte mutante DNA-fragmenter.
20 k) Ser-153 Ala og Asn-218 Ser:
En kombination af NOR-324 og NOR-325 blev udført som beskrevet ovenfor.
Åben duplex mutagenese udførtes med plasmid pSX93 som templat. pSX93 er vist i fig. 3a og 3b, og er pUC13 (Vieira, 25 J. og Messing, J.; 1982, Gene 19: 259-268) indeholdende et 0,7 kb Xbal-Hindlll fragment af subtilisin 309 genet omfattende terminatoren indsat i polylinkeren. Terminatoren og Hindlll site er ikke vist i Tabel II.
Til indføring af mutationerae i den N-terminale del 30 af enzymet anvendtes plasmid pSX119. pSX119 er pUC13 indeholdende et EcoRI-Xbal fragment af subtilisin 309 genet indsat i polylinkeren. Templaterne pSX93 og pSXH9 dækker således hele subtilisin 309 genet.
Mutationerne a), b) og e) udførtes ved at skære pSX93 35 med Xbal og Clal som angivet på fig. 3a; c), d) , f) og h) udførtes ved at skære pSX93 med Xbal og Hindlll som angivet i fig. 3b.
33 DK 176102 B1
Mutation g) udførtes tilsvarende i pSX119 ved at skære med EcoRI og Xbal.
De dobbelte mutanter i) og j) fremstilledes ved at skære 0,7 kb Xba-HindIII fragmentet fra a) delvist med HgiAI 5 (HgiAI skærer også i SacI, som blev indført ved mutationen).
Dette 180 bp Xbal-HgiAI fragment og 0,5 kb HgiAI fragmentet fra henholdsvis c) og d) mutanterne blev ligeret til det store Hindlll-Xbal fragment fra pSX93.
Den dobbelte mutant k) fremstilledes som ovenfor ved 10 at kombinere mutanterne e) og f).
Efter baseparring, udfyldning og ligering anvendtes blandingen til at transformere E. coli MC 1000 r'm+. Mutanter blandt transformanterne blev screenet for kolonihybridisering som beskrevet i Vlasuk et al.; 1983, J.Biol.Chem., 258: 7141-15 7148 og i Vlasuk, G.P. og Inouye, S.: p. 292-303 i "Experimental Manipulation of Gene Expression” Inouye, M.
(ed.) Academic Press, New York. Mutationerne bekræftedes ved hjælp af DNA sekvensbestemmelse.
20 Udtrykkelse af mutante subtilisiner
Efter sekvensbekræftelse af den korrekte mutation blev de muterede DNA fragmenter indsat i plasmid pSX92, som anvendtes til fremstilling af mutanterne.
Plasmid pSX92 er vist i fig. 4 og fremstilledes ved 25 kloning af Sub 309 genet i plasmid pSX62 skåret ved Clal, udfyldt med Klenow fragmentet fra DNA polymerase I og skåret med Hindlll inden indsættelse af fragmenterne Dral-Nhel og Nhel-Hindlll fra det klonede Sub 309 gen.
For at udtrykke mutanterne blev de muterede frag-30 menter (Xbal-Clal, Xbal-Hindlll eller EcoRI-Xbal) udskåret fra den passende mutation henholdsvis plasmid pSX93 eller pSX119 og indsat i pSX92.
Det muterede pSX92 anvendtes derpå til transformation af B. subtilis stamme DN497, som derpå dyrkedes i det samme 35 medium og under samme betingelser som anvendt til kloning af det oprindelige gen.
Efter passende dyrkning udvandtes de muterede enzymer 34 DK 176102 B1 og oprensedes.
Oxidationsstabilitet af mutante subtilisiner 5 Mutanterne a) og d) blev afprøvet for oxidations- stabilitet i 0,01 M pereddikesyre efter 20 minutter ved 50°C og pH 7. Den oprindelige stamme NCIB 10309 protease anvendtes som reference.
Resultaterne er vist i tabel IV nedenfor, som viser 10 restproteolytisk aktivitet i de varmebehandlede prøver i forhold til prøver, der ikke er behandlet med oxidationsmiddel eller varme.
15 Tabel iv
Oxidationsstabilitet over for pereddikesyre
Enzym Restaktivitet efter 20 minutter ved 50°C
20 _uden oxidationsmiddel med oxidationsmiddel sub 309 89% 48% mutant a 83% 45% mutant d 92% 93% 25 Det ses, at mutant d (Met 222 til Ala) udviser overlegen oxidationsstabilitet i forhold til det oprindelige enzym og mutant a.
Alle mutanter undtagen g) og h) er også blevet 3 0 afprøvet kvalitativt i 100 - 500 ppm hypochlorit ved stuetemperatur og 35°C, pH 6,5 og 9,0 i fra 15 minutter til 2 timer.
Disse forsøg viste, at mutanter c), d), i) og j) (alle Met-222) kunne modstå 3-5 gange mere hypochlorit end de andre mutanter.
35 Ved afprøvning i et flydende detergent af den sædvan lige type fandt man, at mutant f) udviste overlegen stabilitet 35 DK 176102 B1 i sammenligning med både de øvrige mutanter og det oprindelige enzym.
5 Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner
Den proteolytiske aktivitet hos forskellige mutanter blev afprøvet mod casein som proteinsubstrat ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i tabel V.
Af tabellen ses, at mutant a) udviser forbedret akti-10 vitet i sammenligning med det oprindelige enzym. Det ses også, at Met-222 mutanterne har lavere aktivitet end det oprindelige enzym, men på grund af deres forbedrede oxidationsstabilitet er deres anvendelse i detergentforbindelser indeholdende oxidanter ikke udelukket.
15
Tabel V
Proteolytisk aktivitet hos mutante subtilisiner 20 Mutant Relativ aktivitet
Ingen 100 a) 120 b) 100 e) 100 25 f) 100 i) 20 j) 30 30 Vaskeevne hos mutante subtilisiner
Vaskeevnen hos forskellige mutanter blev afprøvet på spinatsaft ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Resultaterne er vist i Tabel VI.
Af tabellen ses, at alle de afprøvede mutanter 35 udviste forbedret vaskeevne i forhold til det oprindelige enzym, og at mutanterne i) og j) er tydeligt bedre.
36 DK 176102 B1
Tabel VI
Vaskeevne hos mutanten
5 AR
Mutant Koncentration (CPU/1) 0,05 0,1 ingen 14,4 20,4 a) 18,8 21,5 10 b) 16,9 19,7 e) 15,4 21,8 f) 16,6 19,3 i) 21,6 22,1 j) 20,6 22,6 15 95% konfidensinterval: ±0,9
Termostabilitet hos mutante subtilisiner 20 Thermostabiliteten af mutant f) blev afprøvet over for vildtype enzymet ved at anvende vaskeevneprøven ved henholdsvis 40°C og 60°C. Resultaterne er vist i tabel VII.
Af tabellen ses, at mutant f) ved 60°C udviser en meget forbedret vaskeevne sammenlignet med vildtype enzymet, 25 hvorimod vaskeevnen af mutant f) kun er lidt bedre ved 4 0°C end af vildtype enzymet.
37 DK 176102 B1
Tabel VII
Vaskeevne ved forskellige temperaturer
AR
5 Mutant Koncentration {CPU/1) 0,05 0,1 ingen (40°C) 14,4 20,4 f) (40°C) 16,6 19,3 ingen <60°C) 15,1 24,9 10 f) <60°C) 30,4 31,3 95% konf idens interval +0,9 (40°C) og +0,7 (60°C) 15 Diskussion
Subtilisin gener blev klonet fra 147 og 309 varianterne af Bacillus lentus, og de klonede gener sekvensbestemt.
Ved at sammenligne de afledte aminosyresekvenser for subtili-sin 14 7 og 3 09 med hinanden og med andre subtilisinsekvenser 20 blev der identificeret steder, som ved mutation kunne ændre det oprindelige enzyms fysiske egenskaber. Stedsrettet muta-genese anvendtes til at frembringe mutationer adskillige steder i subtilisin 309 genet. De resulterende mutante enzymer blev derpå udtrykt i en Bacillus stamme og afprøvet mod 25 forskellige fysiske og kemiske parametre. Adskillige af mutanterne viste sig af have forbedret stabilitet over for oxidation, forøget proteolytisk evne eller forbedret vaskeevne sammenlignet med det oprindelige subtilisin 309 enzym. Disse mutanter udviser egenskaber, der er ønskværdige for enzymer i 30 detergentsammensætninger.
Claims (13)
1. Mutant subtilisinenzym, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens med mindst 80% homologi med 5 aminosyresekvensen for subtilisin 309 som angivet i Tabel 1(a), som kan fremstilles af B. lentus C360 (NCIB 10309), og at aminosyreresten ved en eller flere af positionerne: 6, 9, 11, 12, 19, 25, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 68, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121, 122, 140, 175, 180, 182, 186, 10 187, 191, 194, 195, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 241, 260, 261, 262, 265, 268 eller 275 ændres ved substitution med en anden aminosyrerest, eller, at en eller flere aminosyrerester indsættes ved en eller flere af positionerne: 36, 56, 159 eller 164-165. 15
2. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 6 substitueres med tyrosin og/eller resten ved position 68 substitueres med cystein eller methionin og/eller resten ved position 71 substitueres med 20 asparaginsyre eller glutaminsyre og/eller resten ved position 175 substitueres med isoleucin.
3. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at resten ved position 195 substitueres med glutaminsyre 25 eller asparaginsyre og/eller resten ved position 275 substitueres med glutamin, eller resten ved position 19 substitueres med glycin og resten ved position 219 substitueres med cystein. 3 0
4. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(a).
5. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1, kendetegnet 35 ved, at det omfatter aminosyresekvensen i det væsentlige som afbildet i Tabel I(b). DK 176102 B1
6. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, * kendetegnet ved, at tryptophanresten ved position 6 substitueres med tyrosin, og/eller valinresten ved position 68 * 5 substitueres med cystein eller methionin; og/eller threoninresten ved position 71 substitueres med asparaginsyre eller glutaminsyre; og/eller methioninresten ved position 175 substitueres med isoleucin,* og/eller glutaminsyreresten ved position 195 substitueres med glycin eller asparaginsyre; 10 og/eller glutaminresten ved position 275 substitueres med arginin.
7. Mutant subtilisinenzym ifølge krav 1 og 5, kendetegnet ved, at argininresten ved position 19 substitueres 15 med glycin og glycinresten ved position 219 substitueres med cystein.
8. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for et subtilisinenzym 20 omfattende en aminosyresekvens som afbildet i Tabel 1(a) eller i Tabel I(b).
9. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 309 25 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel II.
10. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleotidsekvens, der koder for subtilisin 147 enzymet i det væsentlige som afbildet i Tabel III. 30
11. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at nucleinsyresekvensen ifølge krav 8, 9 eller 10 er blevet ændret således at det koder for en subtilisinmutant ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7. 35
12. Anvendelse af rekombinant DNA molekyle ifølge et DK 176102 B1 hvilket som helst af kravene 8 til 11 til frembringelse af et subtilisinenzym.
13. Detergentkomposition, kendetegnet ved, at det 5 omfatter et subtilisinenzym ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK6488 | 1988-01-07 | ||
DK161290 | 1990-07-04 | ||
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
DK36196 | 1996-03-29 | ||
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK36196A DK36196A (da) | 1996-03-29 |
DK176102B1 true DK176102B1 (da) | 2006-06-12 |
Family
ID=8089323
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
DK199600361A DK176102B1 (da) | 1988-01-07 | 1996-03-29 | Muterede subtilisin-gener |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK006488A DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Enzymer |
DK199001612A DK175697B1 (da) | 1988-01-07 | 1990-07-04 | Muterede subtilisin-gener |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US5741694A (da) |
EP (4) | EP0675196A3 (da) |
JP (3) | JPH0675504B2 (da) |
AT (1) | ATE136329T1 (da) |
DE (1) | DE68926163T2 (da) |
DK (3) | DK6488D0 (da) |
WO (1) | WO1989006279A1 (da) |
Families Citing this family (683)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5185258A (en) | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
PT89702B (pt) * | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
BR9006827A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicoes detergentes enzimaticas |
US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
DK316989D0 (da) * | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
BR9006832A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicao detergente enzimatica |
US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
DK0493398T3 (da) * | 1989-08-25 | 2000-05-22 | Henkel Research Corp | Alkalisk, proteolytisk enzym og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
US5541062A (en) * | 1990-02-23 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for preparing protein processing enzymes |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5733473A (en) * | 1990-11-14 | 1998-03-31 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergent composition containing lipase and protease |
DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
US6967080B1 (en) * | 1990-12-05 | 2005-11-22 | Novozymes A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
EP0561907B1 (en) * | 1990-12-05 | 1998-09-02 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
ATE159757T1 (de) * | 1990-12-21 | 1997-11-15 | Novo Nordisk As | Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich |
GB9027836D0 (en) * | 1990-12-21 | 1991-02-13 | Unilever Plc | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
US5646028A (en) * | 1991-06-18 | 1997-07-08 | The Clorox Company | Alkaline serine protease streptomyces griseus var. alkaliphus having enhanced stability against urea or guanidine |
EP0525610A3 (en) * | 1991-07-27 | 1993-03-24 | Solvay Enzymes Gmbh & Co. Kg | Process for increasing the stability of enzymes and stabilized enzymes |
US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
SK43094A3 (en) * | 1991-10-16 | 1994-09-07 | Unilever Nv | Aqueous enzymatic detergent compositions |
US5371198A (en) * | 1991-12-16 | 1994-12-06 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
US5623059A (en) * | 1992-03-09 | 1997-04-22 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
KR950702633A (ko) * | 1992-07-17 | 1995-07-29 | 한스 발터 라벤 | 고알칼리성 세린 프로테아제(high alkaline serine proteases) |
JPH0763377B2 (ja) * | 1992-09-03 | 1995-07-12 | 大阪府 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドpABT17、枯草菌プラスミドベクターpABTts14およびその枯草菌プラスミドベクターpABTts14の形質転換体 |
DE4231726A1 (de) * | 1992-09-23 | 1994-03-24 | Cognis Bio Umwelt | Mutierte subtilisinartige Serinproteasen |
GB9220669D0 (en) * | 1992-09-30 | 1992-11-11 | Unilever Plc | Detergent composition |
US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
ES2287931T3 (es) * | 1993-10-14 | 2007-12-16 | THE PROCTER & GAMBLE COMPANY | Composiciones limpiadoras que contienen proteasa. |
MA23346A1 (fr) | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
US5677272A (en) * | 1993-10-14 | 1997-10-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US5837458A (en) * | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6599730B1 (en) | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
AU703378B2 (en) * | 1994-06-23 | 1999-03-25 | Unilever Plc | Dishwashing compositions |
US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
BR9608149B1 (pt) * | 1995-05-05 | 2012-01-24 | processos para efetuar mutação no dna que codifica uma enzima de subtilase ou sua pré- ou pré-pró-enzima e para a manufatura de uma enzima de subtilase mutante. | |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US5837517A (en) | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
US20120165241A1 (en) * | 1995-05-05 | 2012-06-28 | Unilever Plc | Subtilase Variants |
US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
AU4773197A (en) | 1996-11-04 | 1998-05-29 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
KR100561826B1 (ko) | 1996-11-04 | 2006-03-16 | 노보자임스 에이/에스 | 섭틸라제 변종과 조성물 |
US6077662A (en) * | 1996-11-27 | 2000-06-20 | Emory University | Virus-like particles, methods and immunogenic compositions |
ATE220502T1 (de) * | 1997-04-09 | 2002-08-15 | Danisco | Verbessertes verfahren zur herstellung von mehlteigwaren sowie produkte hergestellt aus solchen teigwaren unter verwendung von glyzerinoxidase |
US6140475A (en) | 1997-04-11 | 2000-10-31 | Altus Biologics Inc. | Controlled dissolution crosslinked protein crystals |
KR20010023468A (ko) | 1997-08-29 | 2001-03-26 | 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 | 프로테아제 변이체 및 조성물 |
ATE385254T1 (de) | 1997-08-29 | 2008-02-15 | Novozymes As | Proteasevarianten und zusammensetzungen |
EP0913458B1 (en) * | 1997-10-22 | 2004-06-16 | The Procter & Gamble Company | Liquid hard-surface cleaning compositions |
AR016969A1 (es) * | 1997-10-23 | 2001-08-01 | Procter & Gamble | VARIANTE DE PROTEASA, ADN, VECTOR DE EXPRESIoN, MICROORGANISMO HUESPED, COMPOSICIoN DE LIMPIEZA, ALIMENTO PARA ANIMALES Y COMPOSICIoN PARA TRATAR UN TEXTIL |
ES2367505T3 (es) | 1997-10-23 | 2011-11-04 | Danisco Us Inc. | Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes. |
US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
EP1032655B1 (en) | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
US6936249B1 (en) | 1998-04-15 | 2005-08-30 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
US6642011B2 (en) | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
WO2000005396A1 (en) * | 1998-07-21 | 2000-02-03 | Danisco A/S | Foodstuff |
US6461849B1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-10-08 | Novozymes, A/S | Modified polypeptide |
US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
JP4723087B2 (ja) | 1998-11-27 | 2011-07-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 脂質分解酵素変異体 |
CA2352534A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Children's Hospital And Regional Medical Center | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:h7 from other strains |
ATE504651T1 (de) | 1998-12-18 | 2011-04-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1- und i-s2-untergruppen mit einem zusätzlichen aminosäurerest in einer aktiven schleifenregion |
JP4745503B2 (ja) | 1999-03-31 | 2011-08-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | アルカリα−アミラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれらをコードする核酸 |
AU3419200A (en) | 1999-03-31 | 2000-10-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same |
KR20000065867A (ko) | 1999-04-09 | 2000-11-15 | 손경식 | 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주 |
EP1183340B1 (en) | 1999-05-20 | 2008-09-03 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 126 and 127 |
DE60040284D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-30 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 129 und 130 |
WO2000071689A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 127 and 128 |
ATE408676T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 132 und 133 |
DE60040287D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-30 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 128 und 129 |
WO2000071691A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 125 and 126 |
EP1210415A2 (en) * | 1999-07-22 | 2002-06-05 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions |
EP1214426A2 (en) | 1999-08-31 | 2002-06-19 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
US6727085B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
EP1287123B1 (en) * | 2000-04-03 | 2011-03-02 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variant |
US20020192792A1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-12-19 | Palle Schneider | Laccase mutants |
CA2419896C (en) | 2000-08-21 | 2014-12-09 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6541234B1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
EP1975229A3 (en) | 2000-10-13 | 2009-03-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
CN100497617C (zh) | 2000-10-13 | 2009-06-10 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体 |
US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
EP1201753B1 (en) * | 2000-10-31 | 2008-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
AU758744B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-03-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain |
EP1201752A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-02 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a Bacillus strain |
US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
RU2311458C2 (ru) | 2001-03-23 | 2007-11-27 | Джененкор Интернэшнл, Инк. | Белки, вызывающие измененную иммуногенную реакцию, и способы их получения и использования |
DE10121463A1 (de) * | 2001-05-02 | 2003-02-27 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
EP3000881A3 (en) | 2001-05-15 | 2016-07-20 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
BR0209154A (pt) | 2001-05-18 | 2004-07-20 | Danisco | Processo de preparação de uma massa com uma enzima |
DK2298868T3 (da) | 2001-06-26 | 2015-04-20 | Novozymes As | Polypeptider med cellobiohydrolase I-aktivitet og polynukleotider, der koder for samme |
DK200101090A (da) * | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
JP2005535284A (ja) | 2001-12-31 | 2005-11-24 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 免疫反応の変化を生じるプロテアーゼ、ならびにその製造および利用方法 |
AU2003210552A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
EP1530631B1 (en) * | 2002-01-16 | 2013-08-07 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
CN1703511A (zh) | 2002-02-26 | 2005-11-30 | 金克克国际有限公司 | 免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白 |
JP2005520546A (ja) | 2002-03-27 | 2005-07-14 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | フィラメントコーティングを有する粒体 |
DK1495128T3 (da) | 2002-03-29 | 2014-08-11 | Genencor Int | Forstærket proteinekspression i Bacillus |
DK1520012T3 (da) | 2002-07-01 | 2009-04-27 | Novozymes As | Monopropylenglycol tilsat til fermenteringsmedium |
JP4694966B2 (ja) | 2002-07-30 | 2011-06-08 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | エアロゾル生成を低減する製剤 |
EP1549745B1 (en) | 2002-10-01 | 2011-01-05 | Novozymes A/S | Family gh 61 polypeptides |
SG188669A1 (en) * | 2002-10-02 | 2013-04-30 | Catalyst Biosciences Inc | Method of generating and screening for proteases with altered specificity |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
TWI319007B (en) | 2002-11-06 | 2010-01-01 | Novozymes As | Subtilase variants |
BRPI0317124B1 (pt) | 2002-12-11 | 2016-05-17 | Novozymes As | composição detergente, e, processos para lavar um tecido e uma superfície dura |
WO2004056981A2 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase ii activity and polynucleotides encoding same |
US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
US20050196766A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
DE602004030000D1 (de) | 2003-01-17 | 2010-12-23 | Danisco | Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel |
EP1590455B1 (en) | 2003-01-27 | 2010-03-17 | Novozymes A/S | Stabilization of granules |
US7294499B2 (en) * | 2003-01-30 | 2007-11-13 | Novozymes A/S | Subtilases |
EP1923455A3 (en) | 2003-02-18 | 2009-01-21 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
US7413888B2 (en) | 2003-05-02 | 2008-08-19 | Novozymes, Inc. | Variants of beta-glucosidases |
CA2526341C (en) | 2003-05-07 | 2013-02-19 | Novozymes A/S | Variant subtilisin enzymes (subtilases) |
EP1675941B1 (en) | 2003-06-25 | 2013-05-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same |
EP1660637A4 (en) | 2003-08-25 | 2009-10-21 | Novozymes Inc | VARIANTS OF GLYCOSIDE HYDROLASES |
JP4880469B2 (ja) | 2003-10-23 | 2012-02-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤中で改良された安定性を有するプロテアーゼ |
CN1902310B (zh) | 2003-10-28 | 2011-09-21 | 诺维信股份有限公司 | 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸 |
CN1875098A (zh) | 2003-10-30 | 2006-12-06 | 诺和酶股份有限公司 | 新家族的碳水化合物结合组件 |
GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
WO2008090395A1 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Danisco A/S | Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells |
US7718408B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
JP5059412B2 (ja) | 2004-01-06 | 2012-10-24 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | アリシクロバシラスsp.のポリペプチド |
CN104726431B (zh) | 2004-01-30 | 2018-06-01 | 诺维信股份有限公司 | 具有分解纤维增强活性的多肽及其编码多核苷酸 |
CN1942584B (zh) | 2004-02-13 | 2011-07-27 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
GB0405637D0 (en) * | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
EP1735433B1 (en) * | 2004-04-02 | 2010-12-08 | Novozymes A/S | Subtilase variants having altered immunogenicity |
EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
US7148404B2 (en) | 2004-05-04 | 2006-12-12 | Novozymes A/S | Antimicrobial polypeptides |
AU2005245516A1 (en) * | 2004-05-20 | 2005-12-01 | Warnex Research Inc. | Polynucleotides for the detection of escherichia coli 0157:h7 and escherichia coli 0157:nm verotoxin producers |
US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
BRPI0512776A (pt) | 2004-07-05 | 2008-04-08 | Novozymes As | variante de uma alfa-amilase tipo termamil originária, construto de dna, vetor de expressão recombinante, célula, composição, aditivo de detergente, composição detergente, composição de lavagem de roupa manual ou automática, uso de uma variante de alfa-amilase ou composição, e, método de produzir uma variante |
EP2275522A3 (en) * | 2004-07-16 | 2011-09-21 | Danisco A/S | Enzymatic oil-degumming method |
CN101040052A (zh) | 2004-09-10 | 2007-09-19 | 诺维信北美公司 | 防止、去除、减少或破坏生物膜的方法 |
ATE533843T1 (de) | 2004-09-21 | 2011-12-15 | Novozymes As | Subtilasen |
DK1794296T3 (da) | 2004-09-21 | 2012-07-30 | Novozymes As | Subtilaser |
WO2006032279A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Novozymes A/S | Subtilases |
US7666630B2 (en) | 2004-09-30 | 2010-02-23 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same |
DK1877551T4 (da) | 2005-04-27 | 2014-03-31 | Novozymes Inc | Polypeptider, der har endoglucanaseaktivitet, og polynukleotider, der koder for samme |
EP2385111B1 (en) | 2005-07-08 | 2016-09-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
EP1967584B1 (en) | 2005-08-16 | 2011-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides of strain bacillus SP. P203 |
ATE530642T1 (de) | 2005-08-16 | 2011-11-15 | Novozymes As | Subtilasen |
NZ589570A (en) | 2005-09-30 | 2012-06-29 | Novozymes Inc | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
WO2007036235A1 (en) | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Novozymes A/S | Immobilization of enzymes |
WO2007107573A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having antimicrobial activity |
WO2007113241A1 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Novozymes A/S | A stabilized liquid enzyme composition |
CA2649267C (en) | 2006-04-14 | 2014-08-12 | Genencor International, Inc. | One-step treatment of textiles |
US20090215663A1 (en) | 2006-04-20 | 2009-08-27 | Novozymes A/S | Savinase variants having an improved wash performance on egg stains |
CN101473032B (zh) | 2006-06-21 | 2013-08-21 | 诺维信北美公司 | 脱浆和煮炼方法 |
DK2046819T3 (da) | 2006-07-21 | 2015-06-22 | Novozymes Inc | Fremgangsmåder til forøgelse af secernering af polypeptider med biologisk aktivitet |
AU2007284126B2 (en) | 2006-08-11 | 2013-12-19 | Novozymes Biologicals, Inc. | Bacteria cultures and compositions comprising bacteria cultures |
US20080057528A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of hydrogen peroxide released by enzyme-catalyzed oxidation of an analyte |
US20080221008A1 (en) | 2006-10-06 | 2008-09-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions and the use of enzyme combinations therein |
US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
US8034766B2 (en) | 2006-10-27 | 2011-10-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for prion decontamination |
RU2459867C2 (ru) | 2006-12-21 | 2012-08-27 | ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН | КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ПОЛИПЕПТИДА α-АМИЛАЗЫ ИЗ BACILLUS, ВИД 195, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
CN101617035A (zh) | 2007-02-20 | 2009-12-30 | 诺维信公司 | 用于洗衣的酶泡沫处理 |
BRPI0808513A2 (pt) | 2007-03-09 | 2014-08-19 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa-amilase de espécies de bacillus alcalifílico, composições compreendendo variantes de alfa-amilase e métodos de uso |
AU2008226792B2 (en) | 2007-03-12 | 2013-06-06 | Danisco Us Inc. | Modified proteases |
AU2008231038B2 (en) | 2007-03-23 | 2013-07-11 | Novozymes Biologicals, Inc. | Preventing and reducing biofilm formation and planktonic proliferation |
DE102007016139A1 (de) | 2007-03-30 | 2008-10-02 | Jenabios Gmbh | Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen |
US20100190682A1 (en) | 2007-04-30 | 2010-07-29 | Sang-Kyu Lee | Use of protein hydrolysates to stabilize metalloprotease detergent formulations |
WO2008141281A1 (en) | 2007-05-10 | 2008-11-20 | Danisco Us Inc., Genencor Division | A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
DE102007047433A1 (de) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Lanxess Deutschland Gmbh | Flüssigwasch- und Flüssigreinigungsmittel |
KR20100088675A (ko) | 2007-11-05 | 2010-08-10 | 다니스코 유에스 인크. | 변경된 특성을 지닌 바실러스 종 ts-23 알파-아밀라아제의 변이체 |
AR069168A1 (es) | 2007-11-05 | 2010-01-06 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa -amilasas con propiedades alteradas |
CN101903519B (zh) | 2007-12-21 | 2013-07-31 | 丹尼斯科美国公司 | 杆菌中增强的蛋白质生产 |
US20110034367A1 (en) | 2008-02-01 | 2011-02-10 | Novozymes A/S | Liquid Enzyme Composition |
CA2713582C (en) | 2008-02-04 | 2017-02-21 | Danisco Us Inc. | Ts23 alpha-amylase variants with altered properties |
US20090217463A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | Philip Frank Souter | Detergent composition comprising lipase |
WO2009111258A2 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising lipase |
RU2510662C2 (ru) | 2008-03-26 | 2014-04-10 | Новозимс А/С | Стабилизированные жидкие ферментные композиции |
US9528114B2 (en) | 2008-03-28 | 2016-12-27 | Danisco Us Inc. | Method for amplifying locus in bacterial cell |
CA2722889A1 (en) | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Danisco Us Inc. | New chimeric alpha-amylase variants |
US8691743B2 (en) | 2008-05-14 | 2014-04-08 | Novozymes A/S | Liquid detergent compositions |
EP2698434A1 (en) | 2008-06-06 | 2014-02-19 | Danisco US Inc. | Uses of an alpha-amylase from Bacillus subtilis |
MX2010013123A (es) | 2008-06-06 | 2011-01-14 | Danisco Inc | Alfa-amilasas variantes de bacillus subtilis y metodos de uso de las mismas. |
JP5492879B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-05-14 | ダニスコ・ユーエス・インク | 改善された性質を有するゲオバチルスステアロセレモフィリス(Geobacillusstearothermophilus)アルファアミラーゼ(AmyS)変異体 |
DK2291526T3 (da) | 2008-06-06 | 2014-10-06 | Danisco Us Inc | Saccharificering af enzymsammensætning med bacillus subtilis alpha-amylase |
JP5661621B2 (ja) | 2008-07-07 | 2015-01-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 酵素含有ポリマー粒子を含む酵素組成物 |
EP2149786A1 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-03 | Unilever PLC | Improvements relating to detergent analysis |
WO2010028941A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Unilever Plc | Dispenser and pretreater for viscous liquids |
BRPI0920891B1 (pt) | 2008-09-25 | 2023-01-10 | Danisco Us Inc | Mistura de alfa-amilase e método para produção de um açúcar fermentável |
EP2358878B1 (en) | 2008-11-20 | 2014-10-15 | Novozymes Inc. | Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
US7771983B2 (en) | 2008-12-04 | 2010-08-10 | Novozymos, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
EP2376527A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-10-19 | Novozymes Inc. | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP2202290A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-06-30 | Unilever PLC | A flowable laundry composition and packaging therefor |
EP2213723A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-04 | Novozymes A/S | Isomaltose for fungus fermentation |
EP2401371A1 (en) | 2009-02-27 | 2012-01-04 | Novozymes A/S | Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production |
CN102341495A (zh) | 2009-03-10 | 2012-02-01 | 丹尼斯科美国公司 | 巨大芽孢杆菌菌株DSM90相关的α-淀粉酶及其使用方法 |
MX2011010041A (es) | 2009-04-01 | 2011-11-18 | Danisco Us Inc | Composiciones y metodos que comprenden variantes de alfa-amilasa con propiedades alteradas. |
WO2010117511A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Danisco Us Inc. | Halomonas strain wdg195-related alpha-amylases, and methods of use, thereof |
AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
EP2478096B1 (en) | 2009-09-17 | 2017-05-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
MX2012003387A (es) | 2009-09-25 | 2012-04-10 | Novozymes As | Uso de variantes de proteasa. |
AU2010299799B2 (en) | 2009-09-25 | 2015-10-29 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
MX2012003473A (es) | 2009-09-29 | 2012-05-22 | Novozymes Inc | Polipeptidos que tienen actividad celulitica mejorada y polinucleotidos que codifican para los mismos. |
DK2483296T3 (da) | 2009-09-30 | 2015-11-02 | Novozymes Inc | Polypeptider med cellulolytisk forbedrende aktivitet og polynukleotider, der koder for dem |
BR112012007390A2 (pt) | 2009-09-30 | 2015-09-15 | Novozymes As | polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado, métodos para produzir o polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degragar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo, molécula inibidora de filamento duplo, e, composição detergente |
CA2778471A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Danisco Us Inc. | Methods for reducing blue saccharide |
US20120220513A1 (en) | 2009-12-29 | 2012-08-30 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Detergency Enhancing Effect |
US9045514B2 (en) | 2010-01-22 | 2015-06-02 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Methods for producing amino-substituted glycolipid compounds |
CN102884197A (zh) | 2010-01-29 | 2013-01-16 | 诺维信公司 | 具有酶预处理的沼气生产方法 |
WO2011100667A1 (en) | 2010-02-14 | 2011-08-18 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
WO2011102933A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Danisco Us Inc. | Amylase from nesterenkonia and methods of use, thereof |
CN102858968B (zh) | 2010-02-25 | 2015-07-01 | 诺维信公司 | 溶菌酶的变体及编码该变体的多核苷酸 |
KR101904484B1 (ko) | 2010-04-26 | 2018-11-30 | 노보자임스 에이/에스 | 효소 과립 |
BR112012028033B1 (pt) | 2010-06-22 | 2021-04-27 | Novozymes A/S | Método para desprender pelos em couro cru ou peles, processos para depilação de couro cru ou peles, e, para preparar um azul molhado |
CN103154263A (zh) | 2010-08-19 | 2013-06-12 | 诺维信公司 | 诱导的孢子形成筛选方法 |
US20130111677A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-05-09 | Novozymes A/S | Concentrated Soak Wash |
KR20130102537A (ko) | 2010-08-30 | 2013-09-17 | 노보자임스 에이/에스 | 두 번 불림 세탁 |
US20130266554A1 (en) | 2010-09-16 | 2013-10-10 | Novozymes A/S | Lysozymes |
GB201015672D0 (en) | 2010-09-20 | 2010-10-27 | Unilever Plc | Improvements relating to fabric treatment compositions comprising targeted benefit agents |
EP2622070B1 (en) | 2010-09-30 | 2016-08-03 | Novozymes, Inc. | Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
MX2013003236A (es) | 2010-09-30 | 2013-05-30 | Novozymes Inc | Variantes de polipeptidos que tienen actividad potenciadora celulolitica y polinucleotidos que codifican a los mismos. |
DK2640833T3 (da) | 2010-11-18 | 2016-11-28 | Novozymes Inc | Kimære polypeptider med cellulolytisk forbedrende aktivitet og polynukleotider, der koder for dem |
CN103339260A (zh) | 2011-01-04 | 2013-10-02 | 诺维信公司 | 从含果胶和木素纤维素的材料产生生物气的方法 |
WO2012101149A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
WO2012104176A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | Novozymes A/S | Use of browned glucose as a feed substrate |
ES2686944T3 (es) | 2011-02-15 | 2018-10-22 | Novozymes North America, Inc. | Mitigación de olor en máquinas de limpieza y procesos de limpieza |
WO2012110563A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
WO2012110562A2 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
US20140038876A1 (en) | 2011-02-16 | 2014-02-06 | Novozymes A/S | Detergent Compositions Comprising Mettaloproteases |
GB201102865D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
GB201102857D0 (en) | 2011-02-18 | 2011-04-06 | Danisco | Feed additive composition |
BR112013016830A2 (pt) | 2011-02-23 | 2017-03-01 | Novozymes Inc | polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, método de produzir o polipeptídeo, de produzir um mutante de uma célula parental, de inibir a expressão de um polipeptídeo, de produzir uma proteína, de degradar ou converter um material celulósico, de produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo, molécula de rna de fita dupla, composição, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de células |
WO2012135659A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Novozymes A/S | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
MX2013011617A (es) | 2011-04-08 | 2013-11-21 | Danisco Us Inc | Composiciones. |
DE102011007313A1 (de) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverfahren |
DK2702162T3 (da) | 2011-04-29 | 2020-05-18 | Novozymes Inc | Fremgangsmåder til forbedring af nedbrydningen eller omdannelsen af celluloseholdigt materiale |
EP2537918A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-26 | The Procter & Gamble Company | Consumer products with lipase comprising coated particles |
WO2012175401A2 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-27 | Novozymes A/S | Particulate composition |
MX349517B (es) | 2011-06-24 | 2017-08-02 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de proteasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
US20140106427A1 (en) | 2011-06-28 | 2014-04-17 | Novozymes A/S | Biogas From Enzyme-Treated Bagasse |
KR20140056237A (ko) | 2011-06-30 | 2014-05-09 | 노보자임스 에이/에스 | 알파-아밀라제 변이체 |
CN112662734A (zh) | 2011-06-30 | 2021-04-16 | 诺维信公司 | 用于筛选α-淀粉酶的方法 |
JP6306504B2 (ja) | 2011-07-01 | 2018-04-04 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 液体洗剤組成物 |
MX346246B (es) | 2011-07-01 | 2017-03-13 | Novozymes As | Composicion de subtilisina estabilizada. |
US10711262B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-07-14 | Novozymes A/S | Storage-stable enzyme granules |
CN109022518A (zh) | 2011-07-22 | 2018-12-18 | 诺维信北美公司 | 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 |
EP2744898A1 (en) | 2011-08-15 | 2014-06-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulase activity and polynucleotides encoding same |
JP2014530598A (ja) | 2011-09-22 | 2014-11-20 | ノボザイムスアクティーゼルスカブ | プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド |
TR201909896T4 (tr) | 2011-09-23 | 2019-07-22 | Novozymes As | Tekstilde renk değiştirme. |
EP3246404B1 (en) | 2011-10-28 | 2019-02-27 | Danisco US Inc. | Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants |
US10351834B2 (en) | 2011-11-21 | 2019-07-16 | Novozymes, Inc. | GH61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
US9701952B2 (en) | 2011-11-25 | 2017-07-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
WO2013076269A1 (en) | 2011-11-25 | 2013-05-30 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
EP3272862A1 (en) | 2011-12-16 | 2018-01-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same |
CN104105403B (zh) | 2011-12-19 | 2017-11-14 | 诺维信生物农业公司 | 生物杀虫剂方法和组合物 |
EP2607468A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
JP2015504660A (ja) | 2011-12-20 | 2015-02-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | サブチラーゼ変異体およびそれをコードするポリヌクレオチド |
BR112014014410A2 (pt) | 2011-12-22 | 2019-09-24 | Danisco Us Inc | composições e métodos que compreendem uma variante de enzima lipolítica |
IN2014DN03298A (da) | 2011-12-22 | 2015-06-26 | Danisco Us Inc | |
DK3382003T3 (da) | 2011-12-29 | 2021-09-06 | Novozymes As | Detergentsammensætninger med lipasevarianter |
ES2644007T3 (es) | 2012-01-26 | 2017-11-27 | Novozymes A/S | Uso de polipéptidos con actividad de proteasa en piensos para animales y en detergentes |
US10093911B2 (en) | 2012-02-17 | 2018-10-09 | Novozymes A/S | Subtilisin variants and polynucleotides encoding same |
ES2582608T3 (es) | 2012-02-17 | 2016-09-14 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Composiciones detergentes que comprenden variantes de subtilasa |
EP2823026A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-01-14 | Novozymes A/S | Detergent composition and substitution of optical brighteners in detergent compositions |
US10087401B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-10-02 | Monosol, Llc | Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same |
US20150291922A1 (en) | 2012-03-29 | 2015-10-15 | Novozymes A/S | Use of Enzymes For Preparing Water Soluble Films |
US9394092B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-07-19 | Monosol, Llc | Powdered pouch and method of making same |
CA2868308A1 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Novozymes, Inc. | Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same |
CN104271723B (zh) | 2012-05-07 | 2021-04-06 | 诺维信公司 | 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码其的核苷酸 |
CA2870830A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
CN104302753A (zh) | 2012-05-16 | 2015-01-21 | 诺维信公司 | 包括脂肪酶的组合物及其使用方法 |
EP4026902A1 (en) | 2012-06-08 | 2022-07-13 | Danisco US Inc. | Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers |
EP2861749A1 (en) | 2012-06-19 | 2015-04-22 | Novozymes Bioag A/S | Enzymatic reduction of hydroperoxides |
BR112014031882A2 (pt) | 2012-06-20 | 2017-08-01 | Novozymes As | uso de um polipeptídeo isolado, polipeptídeo, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, e para o tratamento de proteínas, uso de pelo menos um polipeptídeo, aditivo de ração animal, ração animal, e, composição detergente |
KR101380740B1 (ko) | 2012-06-29 | 2014-04-11 | 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 | 이듀로네이트-2-설파타제의 정제 |
US9150841B2 (en) | 2012-06-29 | 2015-10-06 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase |
FI3553172T3 (fi) | 2012-08-16 | 2023-03-21 | Novozymes As | Menetelmä tekstiilin käsittelemiseksi endoglukanaasilla |
CN104583412A (zh) | 2012-08-16 | 2015-04-29 | 丹尼斯科美国公司 | 采用棒曲霉α-淀粉酶和支链淀粉酶由淀粉制备葡萄糖的方法 |
CN104619838A (zh) | 2012-08-22 | 2015-05-13 | 诺维信公司 | 来自微小杆菌属的金属蛋白酶 |
EP2888360B1 (en) | 2012-08-22 | 2017-10-25 | Novozymes A/S | Metalloproteases from alicyclobacillus sp. |
BR112015003726A2 (pt) | 2012-08-22 | 2019-09-24 | Novozymes As | composição detergente, uso de uma composição e de um polipeptídeo, e, método para remoção de uma nódoa de uma superfície. |
AR093330A1 (es) | 2012-11-01 | 2015-06-03 | Novozymes As | Metodo para la remocion de adn |
US20180112203A1 (en) | 2012-11-20 | 2018-04-26 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
BR112015012982A2 (pt) | 2012-12-07 | 2017-09-12 | Novozymes As | composição detergente, método de lavagem para têxtil, têxtil lavado, e, uso de uma desoxirribonuclease |
JP6499081B2 (ja) | 2012-12-11 | 2019-04-10 | ダニスコ・ユーエス・インク | アスペルギルス・フミガタス(Aspergillusfumigatus)由来のグルコアミラーゼを発現するトリコデルマ・レーシ(Trichodermareesei)宿主細胞、及びその使用方法 |
EP2931911A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Danisco US Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification |
WO2014090940A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Novozymes A/S | Removal of skin-derived body soils |
CN104903461A (zh) | 2012-12-20 | 2015-09-09 | 丹尼斯科美国公司 | 将支链淀粉酶和来自土曲霉的α-淀粉酶用于糖化的方法 |
CN104869841A (zh) | 2012-12-21 | 2015-08-26 | 诺维信公司 | 具有蛋白酶活性的多肽和编码它的多核苷酸 |
DK3354728T3 (da) | 2012-12-21 | 2020-07-27 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase-varianter |
WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
WO2014106593A1 (en) | 2013-01-03 | 2014-07-10 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
WO2014164834A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
US20160024440A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-28 | Novozymes A/S | Enzyme and Inhibitor Containing Water-Soluble Films |
CN111394202B (zh) | 2013-04-23 | 2022-04-26 | 诺维信公司 | 具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物 |
US20160075976A1 (en) | 2013-05-03 | 2016-03-17 | Novozymes A/S | Microencapsulation of Detergent Enzymes |
US10351833B2 (en) | 2013-05-14 | 2019-07-16 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
WO2014183921A1 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
WO2014191170A1 (en) | 2013-05-30 | 2014-12-04 | Novozymes A/S | Particulate enzyme composition |
EP3786269A1 (en) | 2013-06-06 | 2021-03-03 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
PE20160799A1 (es) | 2013-06-12 | 2016-09-03 | Earth Alive Clean Tech Inc | Supresor de polvo |
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
EP3011020A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase from bacillaceae family member |
FI3013956T3 (fi) | 2013-06-27 | 2023-05-23 | Novozymes As | Subtilaasivariantteja ja niitä koodittavia polynukleotideja |
US20160145596A1 (en) | 2013-06-27 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same |
WO2015000969A2 (de) | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Basf Se | Verwendung einer gelförmigen polymerzusammensetzung, erhältlich durch polymerisation eines säuregruppenhaltigen monomers in gegenwart einer polyetherverbindung in formulierungen für die maschinelle geschirrreinigung |
WO2015001017A2 (en) | 2013-07-04 | 2015-01-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having anti-redeposition effect and polynucleotides encoding same |
WO2015004102A1 (en) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP3696264B1 (en) | 2013-07-19 | 2023-06-28 | Danisco US Inc. | Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant |
RU2670946C9 (ru) | 2013-07-29 | 2018-11-26 | Новозимс А/С | Варианты протеазы и кодирующие их полинуклеотиды |
CN105358684A (zh) | 2013-07-29 | 2016-02-24 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
EP3339436B1 (en) | 2013-07-29 | 2021-03-31 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising protease variants |
WO2015049370A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Novozymes A/S | Detergent composition and use of detergent composition |
WO2015050723A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
US20160186102A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-06-30 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
UA119331C2 (uk) | 2013-11-08 | 2019-06-10 | Новозімес Біоаґ А/С | Композиції та способи для обробки від шкідників |
WO2015077278A1 (en) | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Novozymes Bioag A/S | Compositions and methods comprising chromobacterium for controlling plant nematode pests and plant insect pests |
MX2016006489A (es) | 2013-11-20 | 2016-08-03 | Danisco Us Inc | Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso. |
WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
WO2015091989A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
US10463701B2 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-05 | DuPont Nutrition BioScience ApS | Blends of Bacillus strains and enzymes |
US10287591B2 (en) | 2013-12-31 | 2019-05-14 | Danisco Us Inc | Enhanced protein expression |
CN105849121B (zh) | 2014-01-22 | 2020-12-29 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
WO2015134729A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
WO2015134737A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
CN106103721B (zh) | 2014-03-12 | 2020-01-03 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
JP6591998B2 (ja) * | 2014-03-28 | 2019-10-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 低pHでのタンパク質結晶の再可溶化 |
EP3126479A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
DK3129457T3 (da) | 2014-04-11 | 2018-09-17 | Novozymes As | Detergentsammensætning |
EP3131921B1 (en) | 2014-04-15 | 2020-06-10 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
US10023852B2 (en) | 2014-05-27 | 2018-07-17 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
WO2015181118A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
CN106414729A (zh) | 2014-06-12 | 2017-02-15 | 诺维信公司 | α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
WO2016001319A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Improved stabilization of non-protease enzyme |
US10550381B2 (en) | 2014-07-04 | 2020-02-04 | Novozymes A/S | Variant proteases and amylases having enhanced storage stability |
EP3164486B1 (en) | 2014-07-04 | 2020-05-13 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
EP3201100A2 (en) | 2014-10-03 | 2017-08-09 | Monosol, LLC | Degradable materials and packaging made from same |
EP3172329A1 (en) | 2014-10-24 | 2017-05-31 | Danisco US Inc. | Method for producing alcohol by use of a tripeptidyl peptidase |
WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
US10287562B2 (en) | 2014-11-20 | 2019-05-14 | Novoszymes A/S | Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same |
US10457921B2 (en) | 2014-12-05 | 2019-10-29 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
JP7012533B2 (ja) | 2014-12-16 | 2022-02-14 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質発現の増強 |
WO2016096996A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity |
JP2017538433A (ja) | 2014-12-19 | 2017-12-28 | ダニスコ・ユーエス・インク | タンパク質の発現増大 |
WO2016097352A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
ES2813727T3 (es) | 2014-12-19 | 2021-03-24 | Novozymes As | Variantes de proteasa y polinucleótidos que las codifican |
US10798963B2 (en) | 2015-03-30 | 2020-10-13 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Milk-based protein hydrolysates and compositions made thereof |
MX2017012515A (es) | 2015-04-06 | 2018-01-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Proteasas para productos lacteos fermentados ricos en proteinas. |
US20180105772A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-04-19 | Novozymes A/S | Detergent composition |
WO2016162556A1 (en) | 2015-04-10 | 2016-10-13 | Novozymes A/S | Laundry method, use of dnase and detergent composition |
EP3298121B1 (en) | 2015-05-19 | 2019-03-20 | Novozymes A/S | Odor reduction |
EP3303536B1 (en) | 2015-06-02 | 2019-04-17 | Unilever PLC | Laundry detergent composition |
ES2665989T3 (es) | 2015-06-04 | 2018-04-30 | The Procter & Gamble Company | Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano |
ES2712459T3 (es) | 2015-06-04 | 2019-05-13 | Procter & Gamble | Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano |
ES2666186T3 (es) | 2015-06-05 | 2018-05-03 | The Procter & Gamble Company | Composición detergente líquida compactada para lavado de ropa |
EP3101102B2 (en) | 2015-06-05 | 2023-12-13 | The Procter & Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
EP3101107B1 (en) | 2015-06-05 | 2019-04-24 | The Procter and Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
WO2016198262A1 (en) | 2015-06-11 | 2016-12-15 | Unilever Plc | Laundry detergent composition |
EP3310908B1 (en) | 2015-06-16 | 2020-08-05 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
EP3310688A1 (en) | 2015-06-17 | 2018-04-25 | Novozymes A/S | Container |
BR112017027402B1 (pt) | 2015-06-26 | 2022-05-10 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método de tratamento doméstico de um tecido |
US20180171271A1 (en) | 2015-06-30 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Laundry detergent composition, method for washing and use of composition |
EP3317407B1 (en) | 2015-07-01 | 2021-05-19 | Novozymes A/S | Methods of reducing odor |
CN114292829A (zh) | 2015-07-06 | 2022-04-08 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
EP3350323B1 (en) | 2015-09-17 | 2021-04-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
ES2794837T3 (es) | 2015-09-17 | 2020-11-19 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones detergentes que comprenden polipéptidos que tienen actividad degradante de xantano |
WO2017055205A1 (en) | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Unilever Plc | Powder laundry detergent composition |
WO2017060505A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Novozymes A/S | Polypeptides |
WO2017066510A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Novozymes A/S | Cleaning of water filtration membranes |
WO2017064253A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
WO2017064269A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
CA2996749C (en) | 2015-10-28 | 2023-10-10 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising amylase and protease variants |
RU2754276C2 (ru) | 2015-11-09 | 2021-08-31 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Композиция кормовой добавки |
WO2017089366A1 (en) | 2015-11-24 | 2017-06-01 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
US10870838B2 (en) | 2015-12-01 | 2020-12-22 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
EP3387124B1 (en) | 2015-12-09 | 2021-05-19 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
CA3005292A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Basf Se | Method of purifying a protein from fermentation solids under desorbing conditions |
US20190002819A1 (en) | 2015-12-28 | 2019-01-03 | Novozymes Bioag A/S | Heat priming of bacterial spores |
MX2018007485A (es) | 2015-12-30 | 2018-08-01 | Novozymes As | Variantes de enzimas y polinucleotidos que las codifican. |
CN108884451A (zh) | 2016-01-29 | 2018-11-23 | 诺维信公司 | β-葡聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
EP3205392A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Microcapsules and process for preparation of microcapsules |
EP3205393A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Process for preparation of microcapsules |
BR112018016674B1 (pt) | 2016-02-17 | 2022-06-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
BR112018016129B1 (pt) | 2016-02-17 | 2022-06-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
WO2017162378A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Unilever Plc | Laundry detergent composition |
CN109072133B (zh) | 2016-03-23 | 2021-06-15 | 诺维信公司 | 具有dna酶活性的多肽用于处理织物的用途 |
WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
BR112018070468B1 (pt) | 2016-04-08 | 2022-07-12 | Unilever Ip Holdings B.V | Composição de detergente líquida aquosa para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
CN114480035A (zh) | 2016-04-08 | 2022-05-13 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
WO2017182295A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Basf Se | Liquid cleaning compositions |
BR112018072282A2 (pt) | 2016-04-29 | 2019-02-12 | Novozymes A/S | composições detergentes e usos das mesmas |
CN109415421B (zh) | 2016-05-03 | 2023-02-28 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
MX2018013556A (es) | 2016-05-09 | 2019-03-14 | Novozymes As | Polipeptidos variantes con rendimiento mejorado y uso de los mismos. |
US20190218479A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-07-18 | Novozymes A/S | Stabilized Liquid Peroxide Compositions |
WO2017220422A1 (en) | 2016-06-23 | 2017-12-28 | Novozymes A/S | Use of enzymes, composition and method for removing soil |
EP3478827A1 (en) | 2016-06-30 | 2019-05-08 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising surfactant and lipase variant |
WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
JP2019522988A (ja) | 2016-07-05 | 2019-08-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ペクチン酸リアーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド |
WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
CA3027272C (en) | 2016-07-13 | 2022-06-21 | The Procter & Gamble Company | Bacillus cibi dnase variants and uses thereof |
MX2019000621A (es) | 2016-07-14 | 2019-08-01 | Basf Se | Medio de fermentacion que comprende agente quelante. |
EP4357453A2 (en) | 2016-07-18 | 2024-04-24 | Novozymes A/S | Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof |
EP3497199A1 (en) | 2016-08-08 | 2019-06-19 | Basf Se | Liquid laundry formulation |
PL3284805T3 (pl) | 2016-08-17 | 2020-07-13 | The Procter & Gamble Company | Kompozycja czyszcząca zawierająca enzymy |
CN109844110B (zh) | 2016-08-24 | 2023-06-06 | 诺维信公司 | 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
EP3504331A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising xanthan lyase variants i |
WO2018037062A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Novozymes A/S | Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same |
CN109563451A (zh) | 2016-08-24 | 2019-04-02 | 汉高股份有限及两合公司 | 包含gh9内切葡聚糖酶变体i的洗涤剂组合物 |
CN109790491B (zh) | 2016-09-27 | 2021-02-23 | 荷兰联合利华有限公司 | 家用洗衣方法 |
US20200140786A1 (en) | 2016-09-29 | 2020-05-07 | Novozymes A/S | Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition |
EP3519547A1 (en) | 2016-09-29 | 2019-08-07 | Novozymes A/S | Spore containing granule |
EP3532592A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
CN110072986B (zh) | 2016-11-01 | 2023-04-04 | 诺维信公司 | 多核心颗粒 |
WO2018099762A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Basf Se | Stabilization of enzymes in compositions |
US20190292493A1 (en) | 2016-12-12 | 2019-09-26 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
CN110023469A (zh) | 2016-12-15 | 2019-07-16 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
JP7231228B2 (ja) | 2017-02-24 | 2023-03-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・リケニフォルミスにおける増加したタンパク質産生のための組成物及び方法 |
US11053483B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-07-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having DNase activity |
EP3601550A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-05 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
JP2020515269A (ja) | 2017-03-31 | 2020-05-28 | ダニスコ・ユーエス・インク | α−アミラーゼ組み合わせ変異体 |
CN110651039A (zh) | 2017-03-31 | 2020-01-03 | 诺维信公司 | 具有rna酶活性的多肽 |
US20200109388A1 (en) | 2017-04-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Recovery Process |
US20200109352A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptide compositions and uses thereof |
EP3607039A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Polypeptides |
CN110651029B (zh) | 2017-04-04 | 2022-02-15 | 诺维信公司 | 糖基水解酶 |
EP3385362A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising fungal mannanases |
ES2728758T3 (es) | 2017-04-05 | 2019-10-28 | Henkel Ag & Co Kgaa | Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas |
WO2018184817A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3967756A1 (en) | 2017-04-06 | 2022-03-16 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
US20200032170A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-01-30 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3607043A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
CN110709499A (zh) | 2017-04-06 | 2020-01-17 | 诺维信公司 | 清洁组合物及其用途 |
WO2018185285A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2018184816A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3619304A1 (en) | 2017-05-05 | 2020-03-11 | Novozymes A/S | Compositions comprising lipase and sulfite |
EP3401385A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-14 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain |
WO2018206300A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018206535A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same |
CA3058095A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2018224544A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
WO2019002356A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Novozymes A/S | ENZYMATIC SUSPENSION COMPOSITION |
WO2019008035A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Unilever Plc | LAUNDRY COMPOSITION FOR LAUNDRY |
CN110869480B (zh) | 2017-07-07 | 2021-08-13 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 增白组合物 |
CN111032856A (zh) | 2017-08-07 | 2020-04-17 | 诺维信公司 | 基于pH的FCA控制的用途 |
AR112778A1 (es) | 2017-08-07 | 2019-12-11 | Novozymes As | Fermentador equipado con eyector |
MX2020001606A (es) | 2017-08-18 | 2020-08-03 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasa. |
EP3655537A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains |
WO2019038057A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novozymes A/S | VARIANTS OF XANTHANE LYASE AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME |
US11525128B2 (en) | 2017-08-24 | 2022-12-13 | Novozymes A/S | GH9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same |
EP3673060A1 (en) | 2017-08-24 | 2020-07-01 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase variants ii |
US11624059B2 (en) | 2017-08-24 | 2023-04-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent compositions comprising GH9 endoglucanase variants II |
EP3682010A1 (en) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | Danisco US Inc. | Modified 5'-untranslated region (utr) sequences for increased protein production in bacillus |
US20200277553A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-09-03 | Novozymes A/S | Use of Enzymes for Improving Water Absorption And/Or Whiteness |
WO2019057902A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | Novozymes A/S | NEW POLYPEPTIDES |
CA3073362A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Novozymes A/S | Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants |
WO2019067390A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | The Procter & Gamble Company | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LIPASES |
EP3692147A1 (en) | 2017-10-02 | 2020-08-12 | Novozymes A/S | Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2019068715A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Novozymes A/S | POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES |
WO2019076800A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
US20200318037A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-10-08 | Novozymes A/S | Low dusting granules |
WO2019076833A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | PELLETS RELEASING LOW DUST QUANTITY |
US11866748B2 (en) | 2017-10-24 | 2024-01-09 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having mannanase activity |
CN111386340A (zh) | 2017-10-27 | 2020-07-07 | 宝洁公司 | 包含多肽变体的洗涤剂组合物 |
US20230416706A1 (en) | 2017-10-27 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Dnase Variants |
DE102017125559A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten |
BR112020008711A2 (pt) | 2017-11-01 | 2020-11-10 | Novozymes A/S | polipeptídeos e composições que compreendem tais polipeptídeos |
WO2019086530A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Novozymes A/S | Polypeptides and compositions comprising such polypeptides |
US11505767B2 (en) | 2017-11-01 | 2022-11-22 | Novozymes A/S | Methods for cleansing medical devices |
DE102017125558A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten |
DE102017125560A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten |
EP3703661A1 (en) | 2017-11-02 | 2020-09-09 | Danisco US Inc. | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
CN111315879A (zh) | 2017-11-09 | 2020-06-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含有机白色颜料的酶颗粒涂层 |
CN111465680A (zh) | 2017-11-29 | 2020-07-28 | 巴斯夫欧洲公司 | 组合物、其制备和用途 |
BR112020010648A2 (pt) | 2017-11-30 | 2021-02-02 | Unilever N.V. | composição detergente, composição detergente de lavanderia, método para aprimorar limpeza enzimática em água e uso de uma enzima protease |
EP3720954A1 (en) | 2017-12-04 | 2020-10-14 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
FI3735478T3 (fi) | 2018-01-03 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc | Mutantit ja geneettisesti modifioidut bacillus-solut ja niihin liittyvät menetelmät proteiinituotannon lisäämiseksi |
CN111868239A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 诺维信公司 | 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物 |
WO2019154954A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
EP3755793A1 (en) | 2018-02-23 | 2020-12-30 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants |
EP3765185B1 (en) | 2018-03-13 | 2023-07-19 | Novozymes A/S | Microencapsulation using amino sugar oligomers |
EP3775190A1 (en) | 2018-03-29 | 2021-02-17 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2019201793A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric. |
US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
WO2019201785A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
EP3784779A1 (en) | 2018-04-26 | 2021-03-03 | Basf Se | Lipase enzymes |
US20210115422A1 (en) | 2018-05-03 | 2021-04-22 | Basf Se | Amylase enzymes |
EP3775127B1 (en) | 2018-05-17 | 2022-07-20 | Unilever IP Holdings B.V. | Cleaning composition |
WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
WO2020002604A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
EP3814489A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-05-05 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
US20210071116A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-03-11 | Novozymes A/S | Detergent Compositions and Uses Thereof |
EP3818139A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3818138A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
WO2020008024A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
EP3818140A1 (en) | 2018-07-06 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
CN112805361A (zh) | 2018-07-31 | 2021-05-14 | 丹尼斯科美国公司 | 具有降低广义酸的PKA的氨基酸取代的变体α-淀粉酶 |
WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
CN112703246A (zh) | 2018-09-17 | 2021-04-23 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
US20210340466A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-11-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
WO2020070209A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
CN112969775A (zh) | 2018-10-02 | 2021-06-15 | 诺维信公司 | 清洁组合物 |
WO2020070014A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity |
CN113056476A (zh) | 2018-10-03 | 2021-06-29 | 诺维信公司 | 具有α-甘露聚糖降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 |
WO2020070249A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions |
WO2020069913A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
EP3677676A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
EP3861115A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
CN112805377A (zh) | 2018-10-05 | 2021-05-14 | 巴斯夫欧洲公司 | 在液体中稳定淀粉酶的化合物 |
EP3864124A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
BR112021006967A2 (pt) | 2018-10-12 | 2021-07-13 | Danisco Us Inc. | alfa-amilases com mutações que melhoram a estabilidade na presença de quelantes |
EP3647398A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins v |
EP3647397A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins iv |
WO2020099491A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity |
WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
EP3884023A1 (en) | 2018-11-20 | 2021-09-29 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
WO2020104157A1 (en) | 2018-11-20 | 2020-05-28 | Unilever Plc | Detergent composition |
EP3884026A1 (en) | 2018-11-20 | 2021-09-29 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
WO2020104158A1 (en) | 2018-11-20 | 2020-05-28 | Unilever Plc | Detergent composition |
JP2022513085A (ja) | 2018-11-20 | 2022-02-07 | デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス | 改変ロバスト高Tm-フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片 |
CN113056549B (zh) | 2018-11-20 | 2023-03-10 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
CN113302270A (zh) | 2018-12-03 | 2021-08-24 | 诺维信公司 | 低pH粉末洗涤剂组合物 |
EP3891277A1 (en) | 2018-12-03 | 2021-10-13 | Novozymes A/S | Powder detergent compositions |
EP3898919A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | Novozymes A/S | Detergent pouch comprising metalloproteases |
WO2020127796A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same |
US20220186177A1 (en) | 2019-02-20 | 2022-06-16 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed |
EP3927809A1 (en) | 2019-02-20 | 2021-12-29 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and trace element feed |
EP3702452A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising two proteases |
US20220235341A1 (en) | 2019-03-21 | 2022-07-28 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
US20220170001A1 (en) | 2019-03-25 | 2022-06-02 | Basf Se | Amylase Enzymes |
EP3947665A2 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Basf Se | Amylase enzymes |
WO2020200198A1 (en) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | Novozymes A/S | Liquid dishwashing detergent compositions |
WO2020201403A1 (en) | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
EP3953462A1 (en) | 2019-04-10 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
BR112021020439A2 (pt) | 2019-04-12 | 2022-05-24 | Novozymes As | Variantes estabilizadas de glicosídeo hidrolase |
WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
BR112021022167A2 (pt) | 2019-05-16 | 2022-01-18 | Unilever Ip Holdings B V | Composição de lavanderia auxiliar, método para administrar enzimas a tecidos, método para aprimorar o benefício amaciante de um condicionador de tecido e uso de uma composição de lavanderia auxiliar |
WO2020249546A1 (en) | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Basf Se | Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation |
US20220306791A1 (en) | 2019-06-14 | 2022-09-29 | Basf Se | Aqueous polymer dispersions suitable as opacifiers in liquid formulations |
WO2020260006A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent compositions |
WO2020260038A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent composition |
US20220372400A1 (en) | 2019-06-28 | 2022-11-24 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
WO2020260040A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Unilever Plc | Detergent composition |
BR112021025261A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-04-26 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido |
BR112021023398A2 (pt) | 2019-06-28 | 2022-01-04 | Unilever Ip Holdings B V | Composição detergente, método doméstico de tratamento de um têxtil e uso de um álcool de sulfato de éter |
JP2022538360A (ja) | 2019-07-01 | 2022-09-01 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 酵素を安定化するためのペプチドアセタール |
EP3994273A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-05-11 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
WO2021001400A1 (en) | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
PL3959326T3 (pl) | 2019-07-05 | 2023-10-09 | Basf Se | Przemysłowy sposób fermentacji dla komórek bakteryjnych z wykorzystaniem kultury wstępnej okresowej z zasilaniem |
CA3146541A1 (en) | 2019-07-09 | 2021-01-14 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Fat coated particulate enzyme compositions |
US20220403298A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-12-22 | Novozymes A/S | Enzymatic emulsions for detergents |
CN114615894A (zh) | 2019-08-16 | 2022-06-10 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 包含乳杆菌菌株组合的用于消化道健康的组合物 |
JP2022545465A (ja) | 2019-08-22 | 2022-10-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アミラーゼバリアント |
CN114787329A (zh) | 2019-08-27 | 2022-07-22 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物 |
EP4022020A1 (en) | 2019-08-27 | 2022-07-06 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase |
WO2021043764A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-11 | Unilever Global Ip Limited | Detergent composition |
WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
EP4031644A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Detergent composition |
CN114423851A (zh) | 2019-09-19 | 2022-04-29 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
US20220340843A1 (en) | 2019-10-03 | 2022-10-27 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
AR120142A1 (es) | 2019-10-07 | 2022-02-02 | Unilever Nv | Composición detergente |
WO2021074430A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Basf Se | Storage-stable hydrolase containing liquids |
CN114828642A (zh) | 2019-10-21 | 2022-07-29 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 用于消化道健康的组合物 |
US20220403359A1 (en) | 2019-10-24 | 2022-12-22 | Danisco Us Inc | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
US20230009832A1 (en) | 2019-11-20 | 2023-01-12 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Thermostable phytase variants |
CN113891931A (zh) | 2019-11-29 | 2022-01-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 组合物和可以用于该类组合物的聚合物 |
WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
CN115103602A (zh) | 2019-12-19 | 2022-09-23 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 日粮配制品 |
WO2021122121A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins ix |
US20220411773A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having proteolytic activity and use thereof |
WO2021122118A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins vi |
EP4077617A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Novozymes A/S | Stabilized liquid boron-free enzyme compositions |
KR20220121235A (ko) | 2019-12-20 | 2022-08-31 | 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 | 디스페르신 및 카르보히드라제를 포함하는 세정 조성물 |
US20230340442A1 (en) | 2020-01-15 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus licheniformis |
US20230407208A1 (en) | 2020-01-29 | 2023-12-21 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Laundry detergent product |
WO2021152120A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2021152123A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2021158927A1 (en) | 2020-02-07 | 2021-08-12 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed compositions for animal health |
WO2021160818A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Basf Se | Mannanase variants |
US20230240334A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-08-03 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed compositions |
EP3892708A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersin variants |
US20230143128A1 (en) | 2020-04-08 | 2023-05-11 | Novozymes A/S | Carbohydrate binding module variants |
WO2021214059A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity |
EP3907271A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Cleaning composition, use and method of cleaning |
EP4158011A1 (en) | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
CN115698246A (zh) | 2020-06-08 | 2023-02-03 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 提高蛋白酶活性的方法 |
JP2023530443A (ja) | 2020-06-18 | 2023-07-18 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 組成物及びその使用 |
WO2021259099A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Novozymes A/S | Use of cellulases for removing dust mite from textile |
EP3936593A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions and uses thereof |
KR20230038177A (ko) | 2020-07-09 | 2023-03-17 | 바스프 에스이 | 조성물 및 그의 응용 |
WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
WO2022023250A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms |
CN116322625A (zh) | 2020-08-24 | 2023-06-23 | 诺维信公司 | 包含果聚糖酶的口腔护理组合物 |
US20230313165A1 (en) | 2020-08-25 | 2023-10-05 | Novozymes A/S | Variants of a family 44 xyloglucanase |
CN116096845A (zh) | 2020-08-28 | 2023-05-09 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 洗涤剂组合物 |
CN116157496A (zh) | 2020-08-28 | 2023-05-23 | 联合利华知识产权控股有限公司 | 表面活性剂和洗涤剂组合物 |
CA3186910A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Rolf Thomas Lenhard | Protease variants with improved solubility |
WO2022043042A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
US20230303951A1 (en) | 2020-08-28 | 2023-09-28 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Detergent composition |
EP4204526B1 (en) | 2020-08-28 | 2024-04-24 | Unilever IP Holdings B.V. | Surfactant and detergent composition |
EP4213641A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Novozymes A/S | Animal feed comprising insects or insect meal |
BR112023005106A2 (pt) | 2020-09-22 | 2023-04-18 | Basf Se | Composição líquida, formulação de detergente líquida, e, usos de pelo menos um diol (exceto 1,2-proanodiol) e das formulações de detergente |
WO2022074037A2 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
CN117241678A (zh) | 2020-10-16 | 2023-12-15 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 用于动物健康的饲料组合物 |
WO2022083949A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Basf Se | Compositions and their use |
EP4232539A2 (en) | 2020-10-20 | 2023-08-30 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having dnase activity |
EP4237525A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Use of lipoxygenase |
EP4237552A2 (en) | 2020-10-29 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
US20230407209A1 (en) | 2020-11-13 | 2023-12-21 | Novozymes A/S | Detergent Composition Comprising a Lipase |
WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
EP4256020A1 (en) | 2020-12-07 | 2023-10-11 | Unilever IP Holdings B.V. | Detergent compositions |
AU2021394636A1 (en) | 2020-12-07 | 2023-06-08 | Unilever Global Ip Limited | Detergent compositions |
EP4015629A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Basf Se | Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents |
EP4032966A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition with sulfite scavenger |
US20240124805A1 (en) | 2021-01-28 | 2024-04-18 | Novozymes A/S | Lipase with low malodor generation |
WO2022169933A2 (en) | 2021-02-03 | 2022-08-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Compositions for gut health |
EP4039806A1 (en) | 2021-02-04 | 2022-08-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants with im-proved stability |
WO2022171872A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Stabilized biological detergents |
WO2022171780A2 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
WO2022189521A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
WO2022194673A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
EP4060036A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
EP4314222A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Novozymes A/S | Detergent composition with reduced polymer content |
WO2022268885A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Alpha-amylase polypeptides |
WO2023023644A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Danisco Us Inc. | Polynucleotides encoding novel nucleases, compositions thereof and methods thereof for eliminating dna from protein preparations |
WO2023041694A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Unilever Ip Holdings B.V. | Detergent composition |
AU2022349014A1 (en) | 2021-09-27 | 2024-04-04 | International N&H Denmark Aps | Feed additive compositions and methods for using the same |
WO2023061827A1 (en) | 2021-10-13 | 2023-04-20 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023066741A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Basf Se | Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use |
WO2023088776A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088777A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023088761A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
WO2023114988A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
WO2023110599A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Basf Se | Compositions and their applications |
WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
EP4206309A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-05 | Novozymes A/S | Protein particles with improved whiteness |
WO2023148086A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
EP4234664A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | Evonik Operations GmbH | Composition comprising glucolipids and enzymes |
WO2023165507A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents |
WO2023165950A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
WO2023194204A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
WO2023227332A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer and a protease |
WO2023227331A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition comprising a specific methyl ester ethoxylate surfactant and a lipase |
WO2023227421A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an alkoxylated zwitterionic polyamine polymer, and a fragrance |
WO2023227375A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry liquid composition comprising a surfactant, an aminocarboxylate, an organic acid and a fragrance |
WO2023227335A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid composition comprising linear alkyl benzene sulphonate, methyl ester ethoxylate and alkoxylated zwitterionic polyamine polymer |
WO2023227356A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition containing enzyme |
CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
WO2023233025A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid detergent product |
WO2023247348A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
WO2023247664A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
WO2024012894A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Basf Se | Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations |
WO2024056334A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056333A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056332A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
WO2024056278A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Unilever Ip Holdings B.V. | Washing machine and washing method |
EP4349944A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349948A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349942A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349943A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349946A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Unit dose fabric treatment product |
EP4349947A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
EP4349945A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-10 | Unilever IP Holdings B.V. | Laundry liquid composition |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1234445A (da) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
US3929887A (en) | 1970-05-18 | 1975-12-30 | Endo Lab | Alkylenepoly(aralkylamines) and the salts thereof |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
US5801038A (en) * | 1984-05-29 | 1998-09-01 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
JP2599946B2 (ja) * | 1986-01-15 | 1997-04-16 | アムジェン,インコーポレイテツド | ズブチリシン類似体 |
US4980288A (en) * | 1986-02-12 | 1990-12-25 | Genex Corporation | Subtilisin with increased thermal stability |
US5013657A (en) * | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
EP0260299A4 (en) * | 1986-02-12 | 1988-11-24 | Genex Corp | MUTAGENESIS AND SCREENING PROCESS AND PRODUCT OBTAINED. |
US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
ES2068181T3 (es) * | 1986-04-30 | 1995-04-16 | Genencor Int | Mutantes de la carbonil hidrolasa no humana, secuencias de adn y vectores que codifican las mismas y huespedes transformados con dichos vectores. |
WO1988006624A2 (en) * | 1987-02-27 | 1988-09-07 | Gist-Brocades N.V. | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
JP3155984B2 (ja) * | 1987-04-06 | 2001-04-16 | ノヴォザイムズ・アクティーゼルスカブ | タンパク質の安定化のための金属イオン結合部位における静電的相互作用の操作 |
US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
DK97190D0 (da) * | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5766898A (en) * | 1990-12-05 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
DE69226182T2 (de) * | 1991-05-01 | 1999-01-21 | Novo Nordisk As | Stabilisierte enzyme und waschmittelzusammensetzungen |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
AU4773197A (en) * | 1996-11-04 | 1998-05-29 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
ATE385254T1 (de) * | 1997-08-29 | 2008-02-15 | Novozymes As | Proteasevarianten und zusammensetzungen |
KR20010023468A (ko) * | 1997-08-29 | 2001-03-26 | 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 | 프로테아제 변이체 및 조성물 |
US6780629B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6773907B2 (en) * | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
EP1032655B1 (en) * | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
EP1287123B1 (en) * | 2000-04-03 | 2011-03-02 | Maxygen, Inc. | Subtilisin variant |
US20020192792A1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-12-19 | Palle Schneider | Laccase mutants |
US6799287B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-09-28 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and apparatus for verifying error correcting codes |
US7109016B2 (en) * | 2000-08-21 | 2006-09-19 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
US6893855B2 (en) * | 2000-10-13 | 2005-05-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
DK200101090A (da) * | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
US7888093B2 (en) * | 2002-11-06 | 2011-02-15 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
US20070161531A1 (en) * | 2005-07-08 | 2007-07-12 | Novozymes A/S | Subtilase variants |
-
1988
- 1988-01-07 DK DK006488A patent/DK6488D0/da not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-01-06 EP EP95107678A patent/EP0675196A3/en not_active Ceased
- 1989-01-06 AT AT89901711T patent/ATE136329T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-06 WO PCT/DK1989/000002 patent/WO1989006279A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-06 EP EP05004172A patent/EP1538204A3/en not_active Withdrawn
- 1989-01-06 JP JP1501511A patent/JPH0675504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-06 EP EP04025116A patent/EP1498481A1/en not_active Withdrawn
- 1989-01-06 EP EP89901711A patent/EP0396608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-06 DE DE68926163T patent/DE68926163T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-07-04 DK DK199001612A patent/DK175697B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016202A patent/JP2726799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/486,415 patent/US5741694A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/486,846 patent/US6506589B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 DK DK199600361A patent/DK176102B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9268984A patent/JPH10113179A/ja active Pending
-
2002
- 2002-11-27 US US10/306,089 patent/US6808913B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 US US10/310,730 patent/US6835821B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 US US10/313,853 patent/US6908991B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-21 US US10/896,177 patent/US20050003986A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK175697B1 (da) | 2005-01-24 |
DK36196A (da) | 1996-03-29 |
US20030148495A1 (en) | 2003-08-07 |
US5741694A (en) | 1998-04-21 |
US6808913B2 (en) | 2004-10-26 |
EP0396608B1 (en) | 1996-04-03 |
EP0396608A1 (en) | 1990-11-14 |
DE68926163T2 (de) | 1996-10-02 |
US6506589B1 (en) | 2003-01-14 |
JPH0675504B2 (ja) | 1994-09-28 |
EP0675196A2 (en) | 1995-10-04 |
JPH06292577A (ja) | 1994-10-21 |
DE68926163D1 (de) | 1996-05-09 |
DK161290D0 (da) | 1990-07-04 |
US20050003986A1 (en) | 2005-01-06 |
JP2726799B2 (ja) | 1998-03-11 |
EP1498481A1 (en) | 2005-01-19 |
US6908991B2 (en) | 2005-06-21 |
WO1989006279A1 (en) | 1989-07-13 |
ATE136329T1 (de) | 1996-04-15 |
EP1538204A2 (en) | 2005-06-08 |
US20030175933A1 (en) | 2003-09-18 |
JPH03503477A (ja) | 1991-08-08 |
DK161290A (da) | 1990-09-07 |
EP0675196A3 (en) | 1995-11-22 |
EP1538204A3 (en) | 2007-07-04 |
US20030186378A1 (en) | 2003-10-02 |
DK6488D0 (da) | 1988-01-07 |
US6835821B2 (en) | 2004-12-28 |
JPH10113179A (ja) | 1998-05-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK176102B1 (da) | Muterede subtilisin-gener | |
JP3471797B2 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 | |
FI105481B (fi) | Uudet proteolyyttiset entsyymit ja niiden käyttö pesuaineissa | |
JP5603164B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP2002533080A (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4768128B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4768129B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4647787B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4611529B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4611530B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 | |
JP4647788B2 (ja) | 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |