JPH10113179A - 変異ズブチリシン - Google Patents
変異ズブチリシンInfo
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- JPH10113179A JPH10113179A JP9268984A JP26898497A JPH10113179A JP H10113179 A JPH10113179 A JP H10113179A JP 9268984 A JP9268984 A JP 9268984A JP 26898497 A JP26898497 A JP 26898497A JP H10113179 A JPH10113179 A JP H10113179A
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- JP
- Japan
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- subtilisin
- enzyme
- mutant
- gene
- residue
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ズブチリシンの新規な変異体を提供する。
【解決手段】 突然変異体のズブチリシン酵素であっ
て、次の位置：６，９，１１−１２，１９，２５，３６
−３８，５４−５９，６７，６８，７１，８９，１０
４，１１１，１１５，１２０，１２１−１２２，１２
４，１２８，１４０，１５３，１５４，１５６，１５８
−１６５，１６８，１７０，１７２，１７５，１８０，
１８２，１８６，１８７，１９１，１９４，１９５，１
９９，２１９，２２６，２３４−２３８，２４１，２６
０−２６２，２６５，２６８、または２７５の１個所又
はそれ以上の個所でアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基
で置換されることにより、又は１種もしくはそれ以上の
アミノ酸残基の挿入もしくは欠失により変化している、
前記酵素。
て、次の位置：６，９，１１−１２，１９，２５，３６
−３８，５４−５９，６７，６８，７１，８９，１０
４，１１１，１１５，１２０，１２１−１２２，１２
４，１２８，１４０，１５３，１５４，１５６，１５８
−１６５，１６８，１７０，１７２，１７５，１８０，
１８２，１８６，１８７，１９１，１９４，１９５，１
９９，２１９，２２６，２３４−２３８，２４１，２６
０−２６２，２６５，２６８、または２７５の１個所又
はそれ以上の個所でアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基
で置換されることにより、又は１種もしくはそれ以上の
アミノ酸残基の挿入もしくは欠失により変化している、
前記酵素。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ズブチリシン（su
btilisin) 酵素の化学的特性の変化を生じさせるズブチ
リシン遺伝子の変異に関する。ズブチリシン遺伝子の特
異的核酸での変異はアミノ酸置換を生じ、その結果、酵
素の機能変換が起こる。これらの変異酵素の中には、産
業上の用途、特に洗浄剤工業において有利な物性を示し
て、酸化に対してより安定で、プロテアーゼ活性がより
大きく、そして改善された洗浄性を示すズブチリシンを
生成するものがある。
btilisin) 酵素の化学的特性の変化を生じさせるズブチ
リシン遺伝子の変異に関する。ズブチリシン遺伝子の特
異的核酸での変異はアミノ酸置換を生じ、その結果、酵
素の機能変換が起こる。これらの変異酵素の中には、産
業上の用途、特に洗浄剤工業において有利な物性を示し
て、酸化に対してより安定で、プロテアーゼ活性がより
大きく、そして改善された洗浄性を示すズブチリシンを
生成するものがある。
【０００２】
２．１．桿菌プロテアーゼ タンパク質基質におけるアミド結合を開裂する酵素は、
プロテアーゼ、即ち、ペプチダーゼ（相互に交換して用
いられる）として分類される〔ワルシュ（Walsh)等、１
９７９年、「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mecha
nisms)」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー (W.H.and Company)、サンフランシスコ、第３
章参照〕。桿菌種の細菌は、２種類の細胞外種のプロテ
アーゼ、即ち、中性又はメタロプロテアーゼと、機能的
にはズブチリシンと呼ばれるセリンエンドペプチダーゼ
であるアルカリ性プロテアーゼを分泌する。
プロテアーゼ、即ち、ペプチダーゼ（相互に交換して用
いられる）として分類される〔ワルシュ（Walsh)等、１
９７９年、「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mecha
nisms)」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カ
ンパニー (W.H.and Company)、サンフランシスコ、第３
章参照〕。桿菌種の細菌は、２種類の細胞外種のプロテ
アーゼ、即ち、中性又はメタロプロテアーゼと、機能的
にはズブチリシンと呼ばれるセリンエンドペプチダーゼ
であるアルカリ性プロテアーゼを分泌する。
【０００３】これらのプロテアーゼの分泌は細菌の成長
周期と連結しており、芽抱形成も生じるとき、定常期に
プロテアーゼの最大の発現が生じる。ジョリフェ（Joli
ffe)等（１９８０年、ジェイ・バクテリアル（J.Bacter
ial), 141 : 1199〜1208) は、桿菌プロテアーゼは細胞
壁ターンオーバーにおいて機能を果たすことを教示して
いる。
周期と連結しており、芽抱形成も生じるとき、定常期に
プロテアーゼの最大の発現が生じる。ジョリフェ（Joli
ffe)等（１９８０年、ジェイ・バクテリアル（J.Bacter
ial), 141 : 1199〜1208) は、桿菌プロテアーゼは細胞
壁ターンオーバーにおいて機能を果たすことを教示して
いる。
【０００４】２．２．ズブチリシン セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基があ
るペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である〔ホワ
イト（White)、ハンドラー (Handler)及びスミス (Smit
h)、１９７３年、「生化学の原理（Principles of Bioc
hemistry) 」、第５版、マグローヒル・ブック・カンパ
ニー、ニューヨーク、第２７１〜２７２頁〕。
るペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である〔ホワ
イト（White)、ハンドラー (Handler)及びスミス (Smit
h)、１９７３年、「生化学の原理（Principles of Bioc
hemistry) 」、第５版、マグローヒル・ブック・カンパ
ニー、ニューヨーク、第２７１〜２７２頁〕。
【０００５】セリンプロテアーゼの分子量は、２５，０
００〜３０，０００の範囲である。セリンプロテアーゼ
は、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害さ
れるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）耐性がある〔但し、カルシウム
イオンにより高温で安定化される〕。また、セリンプロ
テアーゼは、単純末端エステル類を加水分解し、そして
真核性キモトリプシンと活性が類似している。
００〜３０，０００の範囲である。セリンプロテアーゼ
は、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害さ
れるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）耐性がある〔但し、カルシウム
イオンにより高温で安定化される〕。また、セリンプロ
テアーゼは、単純末端エステル類を加水分解し、そして
真核性キモトリプシンと活性が類似している。
【０００６】セリンプロテアーゼの代替用語であるアル
カリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの最適pHが
９．０〜１１．０と高いことを反映した用語である〔プ
リースト（Priest) 、１９７７年、バクテリオロジカル
・レビュー（Bacteriological Rev.),41,711〜753 〕。
ズブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生され
るセリンプロテアーゼである。多種多様のズブチリシン
が同定され、そして少なくとも８種のズブチリシンのア
ミノ酸配列が決定された。
カリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの最適pHが
９．０〜１１．０と高いことを反映した用語である〔プ
リースト（Priest) 、１９７７年、バクテリオロジカル
・レビュー（Bacteriological Rev.),41,711〜753 〕。
ズブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生され
るセリンプロテアーゼである。多種多様のズブチリシン
が同定され、そして少なくとも８種のズブチリシンのア
ミノ酸配列が決定された。
【０００７】これらには、細菌株由来の６種のズブチリ
シン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ (subtilisin Carls
berg)、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミノサッカ
リチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mesentericop
eptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・ケム
（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール (Stahl)
及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バクテリオル
(J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Vasantha)
等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacteriol),15
9:811〜819 、ジャコブズ等、1985年、核酸研究 (Nucl.
Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Nedkov)
等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−
セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜430 ；
スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス・レタ
ー (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
シン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ (subtilisin Carls
berg)、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミノサッカ
リチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mesentericop
eptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオル・ケム
（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール (Stahl)
及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バクテリオル
(J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Vasantha)
等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacteriol),15
9:811〜819 、ジャコブズ等、1985年、核酸研究 (Nucl.
Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Nedkov)
等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−
セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜430 ；
スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス・レタ
ー (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
【０００８】２種のカビズブチリシン、即ち、サーモア
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム（Tritirachiu
m album) 〔ジェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1
985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイ
ラー (Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :584〜492 〕が含
まれる。
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム（Tritirachiu
m album) 〔ジェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1
985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイ
ラー (Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :584〜492 〕が含
まれる。
【０００９】ズブチリシンは、物理的にも化学的にも十
分に特性決定がなされている。これらの酵素の一次構造
（アミノ酸配列）の知見の他に、ズブチリシンの５０を
超える高分解能Ｘ線構造が測定され、基質の結合、転移
状態、生成物、３種の異なるプロテアーゼ阻害因子を示
すとともに、自然変異における構造上の重要性が明らか
にされた〔クラウト（Kraut)、1977年、アン・レブ・バ
イオケム (Ann.Rev.Biochem.),46,331〜358 〕。
分に特性決定がなされている。これらの酵素の一次構造
（アミノ酸配列）の知見の他に、ズブチリシンの５０を
超える高分解能Ｘ線構造が測定され、基質の結合、転移
状態、生成物、３種の異なるプロテアーゼ阻害因子を示
すとともに、自然変異における構造上の重要性が明らか
にされた〔クラウト（Kraut)、1977年、アン・レブ・バ
イオケム (Ann.Rev.Biochem.),46,331〜358 〕。
【００１０】ズブチリシンのランダム変異及び部位特異
的変異は、両方とも、酵素の物理的性質及び化学的性質
の知見並びに論文に掲載されたズブチリシンの触媒活
性、基質特異性、三次構造等に関する情報に起因するも
のである〔ウエルズ（Wells)等、1987年、プロク・ナト
ル・アカド・ (Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、84：1219
〜1223；ウエルズ等、1986年、フィル・トランス・アー
ル・ソサ・ロンド・エイ(Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.),3
17 :415〜423;ワング (Hwang)及びワーシェル (Warshe
l)、1987年、バイオケム (Biochem.),26: 2669〜2673；
ラオ（Rao)等、1987年、ネーチャー、328 :551〜554 〕
的変異は、両方とも、酵素の物理的性質及び化学的性質
の知見並びに論文に掲載されたズブチリシンの触媒活
性、基質特異性、三次構造等に関する情報に起因するも
のである〔ウエルズ（Wells)等、1987年、プロク・ナト
ル・アカド・ (Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、84：1219
〜1223；ウエルズ等、1986年、フィル・トランス・アー
ル・ソサ・ロンド・エイ(Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.),3
17 :415〜423;ワング (Hwang)及びワーシェル (Warshe
l)、1987年、バイオケム (Biochem.),26: 2669〜2673；
ラオ（Rao)等、1987年、ネーチャー、328 :551〜554 〕
【００１１】２．３．ズブチリシンの産業上の用途 ズブチリシンは、タンパク様の汚れを除去するのに有効
であることから、産業上、特に洗浄剤配合物において多
大な実用性があることが判明した。しかしながら、これ
らの酵素が効果的であるには、洗浄条件化で活性を有す
る必要があるだけでなく、貯蔵中に他の洗浄剤成分と適
合しなければならない。
であることから、産業上、特に洗浄剤配合物において多
大な実用性があることが判明した。しかしながら、これ
らの酵素が効果的であるには、洗浄条件化で活性を有す
る必要があるだけでなく、貯蔵中に他の洗浄剤成分と適
合しなければならない。
【００１２】例えば、ズブチリシンは、澱粉に対して活
性なアミラーゼとの組み合わせ、セルロース性物質を消
化するセルラーゼとの組み合わせ、脂肪に対して活性な
リパーゼとの組み合わせ、ペプチドに対して活性なペプ
チダーゼとの組み合わせ、及び尿による汚れに対して効
果的なウレアーゼとの組み合わせで用いられることがあ
る。配合物は他の酵素をズブチリシンによる消化から保
護しなければならないだけでなく、ズブチリシンは酸化
力、カルシウム結合性、洗浄力及び高pHの非酵素洗浄剤
成分に関して安定でなければならない。酵素が安定して
存在できる能力は、洗浄性と称されることがよくある。
性なアミラーゼとの組み合わせ、セルロース性物質を消
化するセルラーゼとの組み合わせ、脂肪に対して活性な
リパーゼとの組み合わせ、ペプチドに対して活性なペプ
チダーゼとの組み合わせ、及び尿による汚れに対して効
果的なウレアーゼとの組み合わせで用いられることがあ
る。配合物は他の酵素をズブチリシンによる消化から保
護しなければならないだけでなく、ズブチリシンは酸化
力、カルシウム結合性、洗浄力及び高pHの非酵素洗浄剤
成分に関して安定でなければならない。酵素が安定して
存在できる能力は、洗浄性と称されることがよくある。
【００１３】
【発明の概要】本発明は、ズブチリシン遺伝子の変異に
関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素の化学的
特性を変更させるものもある。変異は、ズブチリシン遺
伝子の特異的核酸で生じ、そして種々の具体的実施態様
では、変異酵素の化学的性質が変化して、酸化安定性が
増加し、タンパク質分解活性が増加し、洗浄性が向上し
たりするが、これらには限定されない。
関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素の化学的
特性を変更させるものもある。変異は、ズブチリシン遺
伝子の特異的核酸で生じ、そして種々の具体的実施態様
では、変異酵素の化学的性質が変化して、酸化安定性が
増加し、タンパク質分解活性が増加し、洗浄性が向上し
たりするが、これらには限定されない。
【００１４】また、本発明は、バシラス・レンタス（Ba
cillus lentus)変異体、ズブチリシン１４７及びズブチ
リシン３０９由来の２種のプロテアーゼのアミノ酸配列
及びＤＮＡ配列、さらにこれらの遺伝子の変異及び対応
する変異酵素に関するが、これらのには限定されない。
サイト特異的変異では、特に洗浄剤及び食品技術分野に
おける多数の産業上の用途に適するようにすることので
きる変異ズブチリシン酵素を効果的に産生することがで
きる。また、本発明は、部分的には、酸化安定性の向
上、プロテアーゼ活性の増加及び／又は洗浄性の向上を
示すズブチリシン３０９遺伝子の変異体に関するがこれ
らには限定されない。
cillus lentus)変異体、ズブチリシン１４７及びズブチ
リシン３０９由来の２種のプロテアーゼのアミノ酸配列
及びＤＮＡ配列、さらにこれらの遺伝子の変異及び対応
する変異酵素に関するが、これらのには限定されない。
サイト特異的変異では、特に洗浄剤及び食品技術分野に
おける多数の産業上の用途に適するようにすることので
きる変異ズブチリシン酵素を効果的に産生することがで
きる。また、本発明は、部分的には、酸化安定性の向
上、プロテアーゼ活性の増加及び／又は洗浄性の向上を
示すズブチリシン３０９遺伝子の変異体に関するがこれ
らには限定されない。
【００１５】３．１．略語 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
【００１６】
【発明の具体的な説明】本発明は、ズブチリシン遺伝子
の変異に関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素
の化学的特性を変化させるものもある。変異は特異的核
酸で生じるので、ズブチリシンの形態は産業上の用途の
必要性に合わせて設計できる。本発明は、部分的には、
ズブチリシン遺伝子における特異的核酸の変異により、
性質が変換された酵素が得られるという知見に基づいて
いる。種々の実施態様において、酸化安定性の向上、プ
ロテアーゼ活性の増加又は洗浄性の向上した酵素を生成
できる。
の変異に関し、これらの変異の中にはズブチリシン酵素
の化学的特性を変化させるものもある。変異は特異的核
酸で生じるので、ズブチリシンの形態は産業上の用途の
必要性に合わせて設計できる。本発明は、部分的には、
ズブチリシン遺伝子における特異的核酸の変異により、
性質が変換された酵素が得られるという知見に基づいて
いる。種々の実施態様において、酸化安定性の向上、プ
ロテアーゼ活性の増加又は洗浄性の向上した酵素を生成
できる。
【００１７】説明を明瞭に行うために、本発明を以下の
４つ部分に分けて説明するが、本発明はこれらには限定
されない：（ａ）公知のズブチリシン及びズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９の化学構造；（ｂ）ズブ
チリシン遺伝子における変異を生じさせる方法；（ｃ）
ズブチリシンの変異体の発現；及び（ｄ）所望の化学的
性質についてのズブチリシン変異のスクリーニング。
４つ部分に分けて説明するが、本発明はこれらには限定
されない：（ａ）公知のズブチリシン及びズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９の化学構造；（ｂ）ズブ
チリシン遺伝子における変異を生じさせる方法；（ｃ）
ズブチリシンの変異体の発現；及び（ｄ）所望の化学的
性質についてのズブチリシン変異のスクリーニング。
【００１８】５．１．公知のズブチリシン及びズブチリ
シン１４７及びズブチリシン３０９の化学構造 種々の起源からのズブチリシンの配列分析から、一次ア
ミノ酸配列の機能的重要性が分かり、そして慎重に変更
した機能を用いて新規な変異体を生成することができ
る。異種の形態のズブチリシンのアミノ酸配列を、物理
的性質又は化学的性質を対比しながら比較すると、有用
な変異酵素を産生すると思われる特異的な標的領域があ
ることが分かる。
シン１４７及びズブチリシン３０９の化学構造 種々の起源からのズブチリシンの配列分析から、一次ア
ミノ酸配列の機能的重要性が分かり、そして慎重に変更
した機能を用いて新規な変異体を生成することができ
る。異種の形態のズブチリシンのアミノ酸配列を、物理
的性質又は化学的性質を対比しながら比較すると、有用
な変異酵素を産生すると思われる特異的な標的領域があ
ることが分かる。
【００１９】ズブチリシンのアミノ酸配列は、少なくと
も８種類知られている。これらには、細菌株由来の６種
のズブチリシン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリ
シンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ（subtilis
in Carlsberg) 、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ
ノサッカリチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mese
ntericopeptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオ
ル・ケム（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール
(Stahl)及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バク
テリオル (J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Va
santha) 等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacter
iol), 159 :811〜819;ジャコブス（Jacobs) 等、核酸研
究 (Nucl.Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Ne
dkov) 等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホ
ッペ−セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜
430 ；スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス
・レター (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
も８種類知られている。これらには、細菌株由来の６種
のズブチリシン、即ち、ズブチリシン１６８、ズブチリ
シンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ（subtilis
in Carlsberg) 、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミ
ノサッカリチカス及びメサンテリコペプチダーゼ（mese
ntericopeptidase) 〔栗原等、1972年、ジェイ・バイオ
ル・ケム（J.Biol.Chem.),247 : 5629〜5631；スタール
(Stahl)及びフェラリ (Ferrari), 1984、ジェイ・バク
テリオル (J.Bacteriol), 158 :411〜418;バサンサ (Va
santha) 等、1984年、ジェイ・バクテリオル (J.Bacter
iol), 159 :811〜819;ジャコブス（Jacobs) 等、核酸研
究 (Nucl.Acids Res.), 13: 8913〜8926；ネドコフ（Ne
dkov) 等、1985年、バイオロジカル・ケミストリー・ホ
ッペ−セイラー（Biol.Chem.Hoppe-Seyler),366 :421〜
430 ；スベンドセン（Svendsen) 等、1986年、フェブス
・レター (FEBS Lett), 196 :228〜232)〕と、
【００２０】２種のカビズブチリシン、即ち、サーモア
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム・リンバー (T
ritirachium album limber)由来のプロテアーゼｋ〔ジ
ェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1985年、バイオ
ロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイラー (Biol.Che
m.Hoppe-Seyler),366 :485〜492 〕が含まれる。
クチヨミセス・バルガリス（Thermoactinymyces vulgar
is) 由来のズブチリシンサーミターゼ〔メロウン（Melo
un)等、1985年、フェブス・レター (FEBS Lett), 183 :
195〜200 〕及びトリチラウム・アルブム・リンバー (T
ritirachium album limber)由来のプロテアーゼｋ〔ジ
ェニ−（Janey)及びメイヤー (Mayer)、1985年、バイオ
ロジカル・ケミストリー・ホッペ−セイラー (Biol.Che
m.Hoppe-Seyler),366 :485〜492 〕が含まれる。
【００２１】本発明に関連して、更に２種のセリンプロ
テアーゼのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が明らかとなっ
た。これらのプロテアーゼは、２種のバシラス・レンタ
ス変異体（１４７及び３０９）に由来のものである。こ
れらは、それぞれバシラス・レンタス（Bacillus lentu
s)C303、及びバシラス・レンタス（Bacillus lentus)C3
60としてＮＣＩＢにブダペスト条約に基き国際寄託さ
れ、それぞれ、寄託番号ＮＣＩＢ第１０１４７号及びＮ
ＣＩＢ第１０３０９号が与えられた。便宜上、上記の株
により産生したプロテアーゼを、それぞれズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９と命名し、そしてこれら
のタンパク質をコードしている遺伝子をズブチリシン１
４７遺伝子及びズブチリシン３０９遺伝子と称する。
テアーゼのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が明らかとなっ
た。これらのプロテアーゼは、２種のバシラス・レンタ
ス変異体（１４７及び３０９）に由来のものである。こ
れらは、それぞれバシラス・レンタス（Bacillus lentu
s)C303、及びバシラス・レンタス（Bacillus lentus)C3
60としてＮＣＩＢにブダペスト条約に基き国際寄託さ
れ、それぞれ、寄託番号ＮＣＩＢ第１０１４７号及びＮ
ＣＩＢ第１０３０９号が与えられた。便宜上、上記の株
により産生したプロテアーゼを、それぞれズブチリシン
１４７及びズブチリシン３０９と命名し、そしてこれら
のタンパク質をコードしている遺伝子をズブチリシン１
４７遺伝子及びズブチリシン３０９遺伝子と称する。
【００２２】本発明において使用される用語「ズブチリ
シン物質（subtilisin material)」とは、活性成分とし
てズブチリシンを含有するタンパク様物質を意味する。
本明細書で使用されている用語「セリンプロテアーゼ
（serine protease)」とは、ズブチリシン物質の定義に
従って、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９、ズ
ブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシ
ンカールズベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンア
ミノサッカリチカス、メサンテリコペプチダーゼ、サー
ミターゼ、タンパク質分解酵素Ｋ及びサーモミコラーゼ
に関して上記で述べた配列と少なくとも３０％、好まし
く５０％、より好ましくは８０％のアミノ酸配列の相同
性があるズブチリシンである。これらのセリンプロテア
ーゼは、本明細書において、「相同性セリンプロテアー
ゼ（homologous serine protease) 」とも称する。
シン物質（subtilisin material)」とは、活性成分とし
てズブチリシンを含有するタンパク様物質を意味する。
本明細書で使用されている用語「セリンプロテアーゼ
（serine protease)」とは、ズブチリシン物質の定義に
従って、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９、ズ
ブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシ
ンカールズベルグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンア
ミノサッカリチカス、メサンテリコペプチダーゼ、サー
ミターゼ、タンパク質分解酵素Ｋ及びサーモミコラーゼ
に関して上記で述べた配列と少なくとも３０％、好まし
く５０％、より好ましくは８０％のアミノ酸配列の相同
性があるズブチリシンである。これらのセリンプロテア
ーゼは、本明細書において、「相同性セリンプロテアー
ゼ（homologous serine protease) 」とも称する。
【００２３】第Ｉ表は、演繹により推定したズブチリシ
ン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブチリシン１
６８のアミノ酸配列を比較したものである〔スピズィー
ゼン（Spizizen) 等、1958年、プロク・ナトル・アカド
・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、44: 1072〜107
8〕。第II表にズブチリシン３０９遺伝子の核酸配列を
示し、そして第III 表にズブチリシン１４７遺伝子の核
酸配列を示す。本発明において、ズブチリシン３０９若
しくは１４７又はそれらの機能的等価物の配列を使用す
ることができる。
ン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブチリシン１
６８のアミノ酸配列を比較したものである〔スピズィー
ゼン（Spizizen) 等、1958年、プロク・ナトル・アカド
・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、44: 1072〜107
8〕。第II表にズブチリシン３０９遺伝子の核酸配列を
示し、そして第III 表にズブチリシン１４７遺伝子の核
酸配列を示す。本発明において、ズブチリシン３０９若
しくは１４７又はそれらの機能的等価物の配列を使用す
ることができる。
【００２４】例えば、第Ｉ表、第II表又は第III 表に示
したズブチリシン３０９の配列又はズブチリシン１４７
の配列を、機能的に等価な分子を提供する置換、付加又
は欠失により変更することができる。例えば、ヌクレオ
チドをコードしている配列の縮退により、第Ｉ表に示し
たのと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮ
Ａ配列を、本発明の実施に用いることができる。
したズブチリシン３０９の配列又はズブチリシン１４７
の配列を、機能的に等価な分子を提供する置換、付加又
は欠失により変更することができる。例えば、ヌクレオ
チドをコードしている配列の縮退により、第Ｉ表に示し
たのと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮ
Ａ配列を、本発明の実施に用いることができる。
【００２５】これらには、配列内に同じ又は機能的に等
価なアミノ酸残基をコードしている異種のコドンの置換
により変更してサイレント変化を生じさせる第II表又は
第III 表に示したズブチリシン３０９又はズブチリシン
１４７の全ての部分又は一部分を含有しているヌクレオ
チド配列が含まれるが、本発明はこれらのものには限定
されない。例えば、配列内の一種以上のアミノ酸残基
を、機能的に等価に作用する同様の極性の別のアミノ酸
で置換することができる。配列内のアミノ酸の置換物
は、別の種類のアミノ酸から選択することができる。
価なアミノ酸残基をコードしている異種のコドンの置換
により変更してサイレント変化を生じさせる第II表又は
第III 表に示したズブチリシン３０９又はズブチリシン
１４７の全ての部分又は一部分を含有しているヌクレオ
チド配列が含まれるが、本発明はこれらのものには限定
されない。例えば、配列内の一種以上のアミノ酸残基
を、機能的に等価に作用する同様の極性の別のアミノ酸
で置換することができる。配列内のアミノ酸の置換物
は、別の種類のアミノ酸から選択することができる。
【００２６】非極性（疎水性) アミノ酸としては、例え
ば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及び
ヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ
酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げら
れる。
ば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロ
リン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ
ンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及び
ヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ
酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げら
れる。
【００２７】類似性は、アミノ酸配列を比較することに
より測定できる。アミノ酸配列を整列させるには多くの
方法があるが、それらの差がはっきりするのは、関連性
がかなり小さいときだけである。「図解：タンパク質配
列とタンパク質構造（Atlasof Protein Sequence and S
tructure)」、マーガレット・オー・デイホフ（Margare
t O.Dayhoff) 編集、第５巻、補遺２、１９７６年、ナ
ショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーシ
ョン（National Biochemical Research Foundation) 、
ジョウジタウン・ユニバーシティ・メディカルセンター
(Gergetown University Medical Center)、ワシントン
ＤＣ、第３頁以下、〔題名リサーチ・アンド・アライン
（RESEARCH and ALIGN) に記載されている方法により、
関連性が定義できる。
より測定できる。アミノ酸配列を整列させるには多くの
方法があるが、それらの差がはっきりするのは、関連性
がかなり小さいときだけである。「図解：タンパク質配
列とタンパク質構造（Atlasof Protein Sequence and S
tructure)」、マーガレット・オー・デイホフ（Margare
t O.Dayhoff) 編集、第５巻、補遺２、１９７６年、ナ
ショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーシ
ョン（National Biochemical Research Foundation) 、
ジョウジタウン・ユニバーシティ・メディカルセンター
(Gergetown University Medical Center)、ワシントン
ＤＣ、第３頁以下、〔題名リサーチ・アンド・アライン
（RESEARCH and ALIGN) に記載されている方法により、
関連性が定義できる。
【００２８】当該技術分野において周知のように、同族
タンパク質は、アミノ酸の数だけでなく鎖に沿った各ア
ミノ酸の同一性においても異なることがある。即ち、２
つの構造を同一性が最大となるように整列させたとき、
欠失又は挿入が見られることがある。例えば、ズブチリ
シンカールズベルグはアミノ酸の数が２７４個であるの
に対して、ズブチリシンＢＰＮ′は２７５個のアミノ酸
を有している。２つの配列を整列させると、カールズベ
ルグにはズブチリシンＢＰＮ′のＡｓｎ５６に対応する
残基がないことが分かる。
タンパク質は、アミノ酸の数だけでなく鎖に沿った各ア
ミノ酸の同一性においても異なることがある。即ち、２
つの構造を同一性が最大となるように整列させたとき、
欠失又は挿入が見られることがある。例えば、ズブチリ
シンカールズベルグはアミノ酸の数が２７４個であるの
に対して、ズブチリシンＢＰＮ′は２７５個のアミノ酸
を有している。２つの配列を整列させると、カールズベ
ルグにはズブチリシンＢＰＮ′のＡｓｎ５６に対応する
残基がないことが分かる。
【００２９】このように、ギャップを位置５６に記録し
ない限り、カールズベルグのアミノ酸配列はＢＰＮ′と
は非常に異なるように思われる。したがって、カールズ
ベルグ中の残基がＢＰＮ′に対して相同となるように番
号が付けられていれば、ズブチリシンカールズベルグの
位置２１８のＡｓｎに対してＳｅｒを置換することによ
り、熱安定性が増加することが、高度の確信を持って予
測できる。本発明によれば、ズブチリシン３０９及びズ
ブチリシン１４７の配列を、公知のズブチリシン（第Ｉ
表参照）新規に見出したズブチリシンと比較して、所望
の変異の位置を演繹推定できる。これを行うために、比
較するズブチリシンの類似性を測定する必要がある。
ない限り、カールズベルグのアミノ酸配列はＢＰＮ′と
は非常に異なるように思われる。したがって、カールズ
ベルグ中の残基がＢＰＮ′に対して相同となるように番
号が付けられていれば、ズブチリシンカールズベルグの
位置２１８のＡｓｎに対してＳｅｒを置換することによ
り、熱安定性が増加することが、高度の確信を持って予
測できる。本発明によれば、ズブチリシン３０９及びズ
ブチリシン１４７の配列を、公知のズブチリシン（第Ｉ
表参照）新規に見出したズブチリシンと比較して、所望
の変異の位置を演繹推定できる。これを行うために、比
較するズブチリシンの類似性を測定する必要がある。
【００３０】ズブチリシンの一次構造とその物理的性質
との関係を実験で測定したところ、メチオニン−２２２
残基だけでなく活性部位において機能的なアミノ酸、即
ち、アスパラギン酸−３２、ヒスチジン−６４及びセリ
ン−２２１も重要であることが判明した。アスパラギン
−１５５とセリン−２２１は、オキシアニオン結合部位
内にある。これらの位置での変異は、タンパク質分解活
性を減少させると思われる。本発明により、ズブチリシ
ン３０９のアミノ酸配列とズブチリシン１４７のアミノ
酸配列とを互いに比較するとともに、他のズブチリシン
（第II表参照)とも比較した。
との関係を実験で測定したところ、メチオニン−２２２
残基だけでなく活性部位において機能的なアミノ酸、即
ち、アスパラギン酸−３２、ヒスチジン−６４及びセリ
ン−２２１も重要であることが判明した。アスパラギン
−１５５とセリン−２２１は、オキシアニオン結合部位
内にある。これらの位置での変異は、タンパク質分解活
性を減少させると思われる。本発明により、ズブチリシ
ン３０９のアミノ酸配列とズブチリシン１４７のアミノ
酸配列とを互いに比較するとともに、他のズブチリシン
（第II表参照)とも比較した。
【００３１】ズブチリシン３０９又はズブチリシン１４
７と他のズブチリシンとの間で異なる残基を同した。例
えば、残基１５３で、ズブチリシン３０９はセリン残基
を含んでいるのに対して、ズブチリシン１４７、ズブチ
リシンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブ
チリシン１６８はアラニン残基を含んでいる。したがっ
て、ズブチリシン３０９のセリン１５３残基をアラニン
残基に変更すれば、ズブチリシン３０９の物性は所望の
方法に変化するであろう。同様に、ズブチリシン１４７
は位置２１８にセリン残基を含んでいるのに対して、他
のズブチリシンはアスパラギン残基を発現した。
７と他のズブチリシンとの間で異なる残基を同した。例
えば、残基１５３で、ズブチリシン３０９はセリン残基
を含んでいるのに対して、ズブチリシン１４７、ズブチ
リシンＢＰＮ′、ズブチリシンカールズベルグ及びズブ
チリシン１６８はアラニン残基を含んでいる。したがっ
て、ズブチリシン３０９のセリン１５３残基をアラニン
残基に変更すれば、ズブチリシン３０９の物性は所望の
方法に変化するであろう。同様に、ズブチリシン１４７
は位置２１８にセリン残基を含んでいるのに対して、他
のズブチリシンはアスパラギン残基を発現した。
【００３２】ズブチリシン１４７は他のズブチリシンよ
りも熱安定性が向上しているので、ズブチリシン３０９
のアルカリ性２１８をセリン残基に変異させることによ
り、ズブチリシン３０９の熱安定性が向上する。別の例
を挙げると、Ｔｈｒ７１は活性部位に近接しているの
で、アスパラギン酸等の負に帯電したアミノ酸を導入す
ると、静電反発による酸化攻撃が抑制される可能性があ
る。
りも熱安定性が向上しているので、ズブチリシン３０９
のアルカリ性２１８をセリン残基に変異させることによ
り、ズブチリシン３０９の熱安定性が向上する。別の例
を挙げると、Ｔｈｒ７１は活性部位に近接しているの
で、アスパラギン酸等の負に帯電したアミノ酸を導入す
ると、静電反発による酸化攻撃が抑制される可能性があ
る。
【００３３】ズブチリシンの物性に最も関連していると
思われる部位は、ほとんどのアミノ酸の間にアミノ酸残
基の保存されている所、例えば、上記したＡｓｐ−１５
３及びＡｓｎ−２１８、さらにＴｒｐ−６，Ａｒｇ−１
７０，Ｐｒｏ−１６８，Ｈｉｓ−６７，Ｍｅｔ−１７
５，Ｇｌｙ−２１９，Ａｒｇ−２７５である。他のズブ
チリシンとは異なるアミノ酸を、一致するアミノ酸で置
換するようにして各配列を変異させることにより、より
安定なズブチリシンが得られる。
思われる部位は、ほとんどのアミノ酸の間にアミノ酸残
基の保存されている所、例えば、上記したＡｓｐ−１５
３及びＡｓｎ−２１８、さらにＴｒｐ−６，Ａｒｇ−１
７０，Ｐｒｏ−１６８，Ｈｉｓ−６７，Ｍｅｔ−１７
５，Ｇｌｙ−２１９，Ａｒｇ−２７５である。他のズブ
チリシンとは異なるアミノ酸を、一致するアミノ酸で置
換するようにして各配列を変異させることにより、より
安定なズブチリシンが得られる。
【００３４】ウエルズ等（１９８７年、プロク・ナトル
・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)米国、04: 1219
〜1223〕は、ズブチリシン基質特異性を工作するため
に、アミノ酸配列と部位特異的変異とを比較した。選択
された基質に対する種々のズブチリシンの触媒活性は、
著しく異なることがある。ウエルズは３個のアミノ酸を
置換したときだけ、バシラス・アミロリクエファシーナ
（B.amyloliquefaciena)ズブチリシン基質特異性が生
じ、未変性状態における触媒効率とは１０〜５０倍異な
る酵素であるバシラス・リッチェンフォーミス（B.lich
enformis) ズブチリシンの基質特異性に似てくることを
示した。
・アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)米国、04: 1219
〜1223〕は、ズブチリシン基質特異性を工作するため
に、アミノ酸配列と部位特異的変異とを比較した。選択
された基質に対する種々のズブチリシンの触媒活性は、
著しく異なることがある。ウエルズは３個のアミノ酸を
置換したときだけ、バシラス・アミロリクエファシーナ
（B.amyloliquefaciena)ズブチリシン基質特異性が生
じ、未変性状態における触媒効率とは１０〜５０倍異な
る酵素であるバシラス・リッチェンフォーミス（B.lich
enformis) ズブチリシンの基質特異性に似てくることを
示した。
【００３５】ズブチリシン１４７とズブチリシン３０９
と他のズブチリシンとを比較したところ、下記の部位を
変異させることによりズブチリシンの物理性質又は化学
的性質を変えることができることが分かった：６，９，
１１〜１２，１９，２５，３６〜３８，５３〜５９，６
７，７１，８９，１０４，１１１，１１５，１２０，１
２１〜１２２，１２４，１２８，１３１，１４０，１５
３〜１６６，１６８，１６９〜１７０，１７２，１７
５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９１，１９
４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２２，２２
６，２３４〜２３８，２４１，２６０〜２６２，２６
５，２６８又は２７５。
と他のズブチリシンとを比較したところ、下記の部位を
変異させることによりズブチリシンの物理性質又は化学
的性質を変えることができることが分かった：６，９，
１１〜１２，１９，２５，３６〜３８，５３〜５９，６
７，７１，８９，１０４，１１１，１１５，１２０，１
２１〜１２２，１２４，１２８，１３１，１４０，１５
３〜１６６，１６８，１６９〜１７０，１７２，１７
５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９１，１９
４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２２，２２
６，２３４〜２３８，２４１，２６０〜２６２，２６
５，２６８又は２７５。
【００３６】ズブチリシン１４７及び／又はズブチリシ
ン３０９の１，３６，５６，１５９，１６４〜１６６の
位置に欠失が生じ、これらの部位に適当なアミノ酸残基
を挿入すると親酵素の安定性が高まる。上記した例で説
明した方法に準じて、多数の変異の可能性のある部位が
明らかとなる。
ン３０９の１，３６，５６，１５９，１６４〜１６６の
位置に欠失が生じ、これらの部位に適当なアミノ酸残基
を挿入すると親酵素の安定性が高まる。上記した例で説
明した方法に準じて、多数の変異の可能性のある部位が
明らかとなる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】５．２．ズブチリシン遺伝子において変異
を生成する方法 遺伝子に変異を導入する方法は、当該技術分野において
数多く知られている。ズブチリシン遺伝子のクローニン
グについて簡単に述べた後で、ズブチリシン遺伝子内の
ランダムな部位及び特異的な部位の両方に変異を生成す
る方法について説明する。
を生成する方法 遺伝子に変異を導入する方法は、当該技術分野において
数多く知られている。ズブチリシン遺伝子のクローニン
グについて簡単に述べた後で、ズブチリシン遺伝子内の
ランダムな部位及び特異的な部位の両方に変異を生成す
る方法について説明する。
【００４３】５．２．１．ズブチリシン遺伝子のクロー
ニング ズブチリシンをコードする遺伝子は、グラム陽性菌又は
カビから当該技術分野において公知の種々の方法により
クローニングできる。まず、ＤＮＡのゲノミックライブ
ラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、検討すべき
ズブチリシンを産生する微生物から染色体ＤＮＡ又はメ
ッセンジャーＲＮＡを用いて造成する必要がある。
ニング ズブチリシンをコードする遺伝子は、グラム陽性菌又は
カビから当該技術分野において公知の種々の方法により
クローニングできる。まず、ＤＮＡのゲノミックライブ
ラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、検討すべき
ズブチリシンを産生する微生物から染色体ＤＮＡ又はメ
ッセンジャーＲＮＡを用いて造成する必要がある。
【００４４】次に、もしズブチリシンのアミノ酸配列が
公知であるならば、相同な標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成し、それを用いて細菌ＤＮＡのゲノミックラ
イブラリーからズブチリシンをコードしているクローン
を同定することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンとより低いストリンジェンシーの洗浄条件を利用し
て、細菌又はカビの別の株由来のズブチリシンに相同な
配列を含んでいる標識オリゴヌクレオチドプローブをプ
ローブとして用いてズブチリシンをコードしているクロ
ーンを同定することができる。
公知であるならば、相同な標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成し、それを用いて細菌ＤＮＡのゲノミックラ
イブラリーからズブチリシンをコードしているクローン
を同定することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンとより低いストリンジェンシーの洗浄条件を利用し
て、細菌又はカビの別の株由来のズブチリシンに相同な
配列を含んでいる標識オリゴヌクレオチドプローブをプ
ローブとして用いてズブチリシンをコードしているクロ
ーンを同定することができる。
【００４５】ズブチリシン産生クローンのさらに別の同
定方法として、プラスミド等の発現ベクターにゲノミッ
クＤＮＡの断片を挿入し、得られるゲノミックＤＮＡラ
イブラリーでプロテアーゼ陰性バクテリアを形質転換
後、脱脂乳等のズブチリシンの基質を含む寒天上で形質
転換したバクテリアを平板培養することが挙げられる。
ズブチリシンを担持したプラスミドを含んでいるバクテ
リアは、分泌されたズブチリシンによる脱脂乳の消化に
より、透明な寒天の光輝により包囲されたコロニーを生
成する。
定方法として、プラスミド等の発現ベクターにゲノミッ
クＤＮＡの断片を挿入し、得られるゲノミックＤＮＡラ
イブラリーでプロテアーゼ陰性バクテリアを形質転換
後、脱脂乳等のズブチリシンの基質を含む寒天上で形質
転換したバクテリアを平板培養することが挙げられる。
ズブチリシンを担持したプラスミドを含んでいるバクテ
リアは、分泌されたズブチリシンによる脱脂乳の消化に
より、透明な寒天の光輝により包囲されたコロニーを生
成する。
【００４６】５．２．２．ズブチリシン遺伝子における
ランダム変異の生成 ズブチリシン遺伝子がプラスミド等の適当なベクターに
クローニングされたら、いくつかの方法を用いて遺伝子
にランダム変異を導入できる。一つの方法として、クロ
ーニングしたズブチリシン遺伝子を取り出しのできる
（retrievable)ベクターの一部分として大腸菌の突然変
異誘発株に組み込むことが挙げられる。
ランダム変異の生成 ズブチリシン遺伝子がプラスミド等の適当なベクターに
クローニングされたら、いくつかの方法を用いて遺伝子
にランダム変異を導入できる。一つの方法として、クロ
ーニングしたズブチリシン遺伝子を取り出しのできる
（retrievable)ベクターの一部分として大腸菌の突然変
異誘発株に組み込むことが挙げられる。
【００４７】別の方法として、一本鎖のズブチリシン遺
伝子を生成後、ズブチリシン遺伝子を含んでいる断片を
別のＤＮＡ断片とともに、ズブチリシンの一部分が一本
鎖で残るようにしてアニーリングすることが挙げられ
る。次に、この別個となった一本鎖領域を、亜硫酸水素
ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸又はヒ
ドララジン（これらには限定されない）をはじめとする
多数の変異誘発剤のいずれかに暴露する。
伝子を生成後、ズブチリシン遺伝子を含んでいる断片を
別のＤＮＡ断片とともに、ズブチリシンの一部分が一本
鎖で残るようにしてアニーリングすることが挙げられ
る。次に、この別個となった一本鎖領域を、亜硫酸水素
ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸又はヒ
ドララジン（これらには限定されない）をはじめとする
多数の変異誘発剤のいずれかに暴露する。
【００４８】ランダム変異を生成するこの方法の具体例
が、ショートル（Shortle)及びナサン（Nathan) 〔１９
７８年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 2170〜2174〕により記載されてい
る。ショートル・ナサン法によれば、ズブチリシン遺伝
子を担持しているプラスミドを、遺伝子内で開裂する制
限酵素により切断する。このニックを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのエキソヌクレアーゼを用いてギャップ内に広げ
る。次に、得られる一本鎖ギャップを、上記した変異誘
発剤のいずれか一つを用いて変異誘発する。
が、ショートル（Shortle)及びナサン（Nathan) 〔１９
７８年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 2170〜2174〕により記載されてい
る。ショートル・ナサン法によれば、ズブチリシン遺伝
子を担持しているプラスミドを、遺伝子内で開裂する制
限酵素により切断する。このニックを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのエキソヌクレアーゼを用いてギャップ内に広げ
る。次に、得られる一本鎖ギャップを、上記した変異誘
発剤のいずれか一つを用いて変異誘発する。
【００４９】また、天然プロモーター及び他の制御配列
を含んだ桿菌種由来のズブチリシンを、大腸菌と枯草菌
の両方のレプリコン、選択表現マーカー及び複製のＭ１
３起源を含んだプラスミドベクター内でクローニングし
て、ヘルパーファージＩＲ１で重感染により一本鎖プラ
スミドＤＮＡを産生させることができる。クローニング
したズブチリシン遺伝子を含んだ一本鎖プラスミドＤＮ
Ａを単離し、ベクター配列を有するがズブチリシンのコ
ード領域を含まないＤＮＡ断片とともにアニーリングし
てギャップ二重鎖分子を得る。
を含んだ桿菌種由来のズブチリシンを、大腸菌と枯草菌
の両方のレプリコン、選択表現マーカー及び複製のＭ１
３起源を含んだプラスミドベクター内でクローニングし
て、ヘルパーファージＩＲ１で重感染により一本鎖プラ
スミドＤＮＡを産生させることができる。クローニング
したズブチリシン遺伝子を含んだ一本鎖プラスミドＤＮ
Ａを単離し、ベクター配列を有するがズブチリシンのコ
ード領域を含まないＤＮＡ断片とともにアニーリングし
てギャップ二重鎖分子を得る。
【００５０】亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸又はギ酸を
用いるか、上記した大腸菌の変異誘発株中で複製するこ
とによりズブチリシン遺伝子に変異を導入する。亜硫酸
水素ナトリウムは一本鎖ＤＮＡ中のシトシンと過剰に反
応するので、この変異誘発剤で生成した変異はコード領
域に限られる。一種のズブチリシン当たり１〜５の変異
が生成するように実験ごとに反応時間及び亜硫酸水素ナ
トリウム濃度を変更する。
用いるか、上記した大腸菌の変異誘発株中で複製するこ
とによりズブチリシン遺伝子に変異を導入する。亜硫酸
水素ナトリウムは一本鎖ＤＮＡ中のシトシンと過剰に反
応するので、この変異誘発剤で生成した変異はコード領
域に限られる。一種のズブチリシン当たり１〜５の変異
が生成するように実験ごとに反応時間及び亜硫酸水素ナ
トリウム濃度を変更する。
【００５１】１０μｇのキャップ二重鎖ＤＮＡを４Ｍ亜
硫酸水素ナトリウム中において、反応容積４００μｌ
で、pH６．０、温度３７℃で９分間インキュベーション
することにより、一本鎖領域における約１％のシトシン
が脱アミノ化される。成熟ズブチリシンのコード領域
は、ＤＮＡ鎖に応じて約２００個のシトシンを含んでい
る。反応時間は、約４分間（２００個のうちの１個の変
異頻度で変異を生成するとき）〜約２０分間（２００個
のうちの約５個の変異）の範囲で変化させるのが有利で
ある。
硫酸水素ナトリウム中において、反応容積４００μｌ
で、pH６．０、温度３７℃で９分間インキュベーション
することにより、一本鎖領域における約１％のシトシン
が脱アミノ化される。成熟ズブチリシンのコード領域
は、ＤＮＡ鎖に応じて約２００個のシトシンを含んでい
る。反応時間は、約４分間（２００個のうちの１個の変
異頻度で変異を生成するとき）〜約２０分間（２００個
のうちの約５個の変異）の範囲で変化させるのが有利で
ある。
【００５２】変異誘発の後、ギャップ分子を、試験管内
においてＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理
して完全二本鎖分子を作製するとともに変異を固定す
る。次に、コンピテント菌としての大腸菌を変異誘発し
たＤＮＡで形質転換して変異ズブチリシンの増幅ライブ
ラリーを生成する。また、増幅変異ライブラリーは、プ
ラスミドＤＮＡを、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼによ
り変異の範囲が広がる大腸菌のＭｕｔＤ株中で成長させ
ることによっても製造できる。
においてＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理
して完全二本鎖分子を作製するとともに変異を固定す
る。次に、コンピテント菌としての大腸菌を変異誘発し
たＤＮＡで形質転換して変異ズブチリシンの増幅ライブ
ラリーを生成する。また、増幅変異ライブラリーは、プ
ラスミドＤＮＡを、誤りがちなＤＮＡポリメラーゼによ
り変異の範囲が広がる大腸菌のＭｕｔＤ株中で成長させ
ることによっても製造できる。
【００５３】また、変異誘発剤の亜硫酸及びギ酸を用い
て変異体ライブラリーを生成することもできる。これら
の薬品は、亜硫酸ナトリウムほどには一本鎖ＤＮＡに対
して特異的ではないので、変異誘発反応を、以下の手順
で行う。ズブチリシン遺伝子のコード領域を、常法によ
りＭ１３ファージ中でクローニングして、一本鎖ファー
ジＤＮＡを調製する。次に、一本鎖ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸
とpH４．３において２３℃の温度で１５〜６０分間反応
させるか、２．４Ｍギ酸と２３℃の温度で２〜５分間反
応させる。
て変異体ライブラリーを生成することもできる。これら
の薬品は、亜硫酸ナトリウムほどには一本鎖ＤＮＡに対
して特異的ではないので、変異誘発反応を、以下の手順
で行う。ズブチリシン遺伝子のコード領域を、常法によ
りＭ１３ファージ中でクローニングして、一本鎖ファー
ジＤＮＡを調製する。次に、一本鎖ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸
とpH４．３において２３℃の温度で１５〜６０分間反応
させるか、２．４Ｍギ酸と２３℃の温度で２〜５分間反
応させる。
【００５４】上記の反応時間では、１：１０００〜５：
１０００の変異度数が得られる。変異誘発の後、万能プ
ライマーをＭ１３ＤＮＡに対してアニーリングし、そし
て変異誘発した一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、ズブ
チリシン遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるよう
に二重鎖ＤＮＡを合成する。この時点で、コード領域を
Ｍ１３ベクターから制限酵素を用いて切断し、そして制
限断片においてのみ変異が生じるようにコード領域を未
変異誘発発現ベクターに結さつする〔マイヤー（Myers)
等、サイエンス、229: 242〜257(1985）〕。
１０００の変異度数が得られる。変異誘発の後、万能プ
ライマーをＭ１３ＤＮＡに対してアニーリングし、そし
て変異誘発した一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、ズブ
チリシン遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるよう
に二重鎖ＤＮＡを合成する。この時点で、コード領域を
Ｍ１３ベクターから制限酵素を用いて切断し、そして制
限断片においてのみ変異が生じるようにコード領域を未
変異誘発発現ベクターに結さつする〔マイヤー（Myers)
等、サイエンス、229: 242〜257(1985）〕。
【００５５】さらに別の方法において、２種の異なるズ
ブチリシンを生体内で組み換えを行うことにより変異を
生成することができる。この方法によれば、２つの遺伝
子内の相同領域により、対応する領域のクロスオーバー
が生じて、遺伝子情報の交換が起きる。この手法による
ハイブリッドアミラーゼ分子の生成は、１９８７年６月
２９日出願の米国特許出願第６７，９９２号に詳細に記
載されている。この特許出願に記載の内容全体は、本発
明に利用できる。ハイブリッドの形態のズブチリシンを
生成できるプラスミドの例を図６に示す。
ブチリシンを生体内で組み換えを行うことにより変異を
生成することができる。この方法によれば、２つの遺伝
子内の相同領域により、対応する領域のクロスオーバー
が生じて、遺伝子情報の交換が起きる。この手法による
ハイブリッドアミラーゼ分子の生成は、１９８７年６月
２９日出願の米国特許出願第６７，９９２号に詳細に記
載されている。この特許出願に記載の内容全体は、本発
明に利用できる。ハイブリッドの形態のズブチリシンを
生成できるプラスミドの例を図６に示す。
【００５６】プラスミドｐＳｘ１４３に組み込まれたズ
ブチリシン３０９とズブチリシン１４７の両方がトラン
ケーションされるので、それら自体ではズブチリシンの
発現はできない。しかしながら、２つの遺伝子の間に組
み換えが生じて、トランケーションにより生じた欠陥が
修正される。即ち、ズブチリシン３０９遺伝子のＮ末端
領域が、ズブチリシン１４７遺伝子のＣ末端領域に結合
された状態になり、活性な変異体ズブチリシンが産生さ
れる。
ブチリシン３０９とズブチリシン１４７の両方がトラン
ケーションされるので、それら自体ではズブチリシンの
発現はできない。しかしながら、２つの遺伝子の間に組
み換えが生じて、トランケーションにより生じた欠陥が
修正される。即ち、ズブチリシン３０９遺伝子のＮ末端
領域が、ズブチリシン１４７遺伝子のＣ末端領域に結合
された状態になり、活性な変異体ズブチリシンが産生さ
れる。
【００５７】もしｐＳｘ１４３をバクテリアのプロテア
ーゼ陰性株に組み込む場合には、プロテアーゼ陽性表現
形を発現するバクテリアを選択し、その後、種々の変異
体ズブチリシン３０９／１４７キメラーゼを同定でき
る。
ーゼ陰性株に組み込む場合には、プロテアーゼ陽性表現
形を発現するバクテリアを選択し、その後、種々の変異
体ズブチリシン３０９／１４７キメラーゼを同定でき
る。
【００５８】５．２．３．ズブチリシン遺伝子における
部位特異的変異の生成 ズブチリシン遺伝子がクローニングし、変異のための所
望の部位が確認できたら、合成オリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入できる。これらのオリゴヌクレオチド
は、所望の変異部位の側部に隣接してヌクレオチド配列
を含んでいる。変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド合成中に挿入される。好ましい方法においては、ズブ
チリシン遺伝子をブリッジしているＤＮＡの一本鎖ギャ
ップを、ズブチリシン遺伝子を担持しているベクター中
で生成する。
部位特異的変異の生成 ズブチリシン遺伝子がクローニングし、変異のための所
望の部位が確認できたら、合成オリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入できる。これらのオリゴヌクレオチド
は、所望の変異部位の側部に隣接してヌクレオチド配列
を含んでいる。変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド合成中に挿入される。好ましい方法においては、ズブ
チリシン遺伝子をブリッジしているＤＮＡの一本鎖ギャ
ップを、ズブチリシン遺伝子を担持しているベクター中
で生成する。
【００５９】その後、所望の変異を担持している合成ヌ
クレオチドを、一本鎖ＤＮＡの相同部分に対してアニー
リングする。次に、残存しているギャップをＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）で充填し、そして造成物を
Ｔ４リガーゼを用いて結合させる。この方法についての
具体例が、森永等（１９８４年、バイオテクノロジー、
２：６４６〜６３９）に開示されている。森永等によれ
ば、遺伝子内の断片は、制限エンドヌクレアーゼを用い
て取り除く。
クレオチドを、一本鎖ＤＮＡの相同部分に対してアニー
リングする。次に、残存しているギャップをＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）で充填し、そして造成物を
Ｔ４リガーゼを用いて結合させる。この方法についての
具体例が、森永等（１９８４年、バイオテクノロジー、
２：６４６〜６３９）に開示されている。森永等によれ
ば、遺伝子内の断片は、制限エンドヌクレアーゼを用い
て取り除く。
【００６０】次に、ベクター／遺伝子（この時点ではギ
ャップを含んでいる）を変性後、ギャップを含有せしめ
る代わりに、ギャップに含まれている領域以外の部位を
別のエンドヌクレアーゼで開裂したベクター／遺伝子に
対してハイブリダイゼーションを行う。次に、遺伝子の
一本鎖領域が変異オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ
ーションし、残存しているギャップにＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片を充填し、挿入物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、そして１サイクルの複製後に所望の変異
を担持している二重鎖プラスミドが産生する。
ャップを含んでいる）を変性後、ギャップを含有せしめ
る代わりに、ギャップに含まれている領域以外の部位を
別のエンドヌクレアーゼで開裂したベクター／遺伝子に
対してハイブリダイゼーションを行う。次に、遺伝子の
一本鎖領域が変異オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ
ーションし、残存しているギャップにＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片を充填し、挿入物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、そして１サイクルの複製後に所望の変異
を担持している二重鎖プラスミドが産生する。
【００６１】森永の方法では、新規な制限部位を造成す
る追加の操作が必要なく、したがって、複数の部位に変
異を生成するのが容易となる。１９８８年７月２６日発
行のエステレ（Estelle)による米国特許第４，７６０，
０２５号では、カセットを多少変更することにより、複
数の変異を担持しているオリゴヌクレオチドを導入する
ことが可能であるが、森永の方法では種々の長さの多数
のオリゴヌクレオチドを導入できるので、森永の方法の
方がより多種類の変異を一度に導入できる。
る追加の操作が必要なく、したがって、複数の部位に変
異を生成するのが容易となる。１９８８年７月２６日発
行のエステレ（Estelle)による米国特許第４，７６０，
０２５号では、カセットを多少変更することにより、複
数の変異を担持しているオリゴヌクレオチドを導入する
ことが可能であるが、森永の方法では種々の長さの多数
のオリゴヌクレオチドを導入できるので、森永の方法の
方がより多種類の変異を一度に導入できる。
【００６２】５．３．ズブチリシン変異体の発現 本発明によれば、上記した方法又は当該技術分野におい
て公知の代替法により製造した変異ズブチリシン遺伝子
は、発現ベクターを用いて酵素の形態で発現できる。発
現ベクターは、一般的に、クローニングベクターの定義
の範囲に入る。これは、発現ベクターは、通常、典型的
なクローニングベクター、即ち、微生物のゲノムとは無
関係に微生物中においてベクターの自律複製を可能とす
る要素、並びに選択のための表現形マーカーを含んでい
るからである。
て公知の代替法により製造した変異ズブチリシン遺伝子
は、発現ベクターを用いて酵素の形態で発現できる。発
現ベクターは、一般的に、クローニングベクターの定義
の範囲に入る。これは、発現ベクターは、通常、典型的
なクローニングベクター、即ち、微生物のゲノムとは無
関係に微生物中においてベクターの自律複製を可能とす
る要素、並びに選択のための表現形マーカーを含んでい
るからである。
【００６３】発現ベクターは、プロモーターをコードし
ている制御配列、オペレーター、リボソーム結合部位、
翻訳開始信号及び必要に応じてリプレッサー遺伝子を含
んでいる。発現タンパク質を分泌させるために、「シグ
ナル配列（signal sequence)」を、遺伝子のコード配列
の前に挿入してもよい。制御配列方向の発現の場合、本
発明により処理されるべき標的遺伝子を、適当な読み取
り枠の制御配列に適切に結合する。
ている制御配列、オペレーター、リボソーム結合部位、
翻訳開始信号及び必要に応じてリプレッサー遺伝子を含
んでいる。発現タンパク質を分泌させるために、「シグ
ナル配列（signal sequence)」を、遺伝子のコード配列
の前に挿入してもよい。制御配列方向の発現の場合、本
発明により処理されるべき標的遺伝子を、適当な読み取
り枠の制御配列に適切に結合する。
【００６４】プラスミドベクターに組み込むことので
き、そして変異体ズブチリシン遺伝子の転写を補助する
ことのできるプロモーター配列は、原核βラクタマーゼ
プロモーター〔ビラ−カマロフ（Villa-Kamaroff) 等、
1978年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 3727〜3731〕と、ｔａｃプロモー
ター〔デボア（DeBoer) 等、1983年、プロク・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、80: 21〜
25〕を含むが、これらには限定されない。
き、そして変異体ズブチリシン遺伝子の転写を補助する
ことのできるプロモーター配列は、原核βラクタマーゼ
プロモーター〔ビラ−カマロフ（Villa-Kamaroff) 等、
1978年、プロク・ナトル・アカド・サイ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)、米国、75: 3727〜3731〕と、ｔａｃプロモー
ター〔デボア（DeBoer) 等、1983年、プロク・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Natl.Acad.Sci.)、米国、80: 21〜
25〕を含むが、これらには限定されない。
【００６５】このことについては、「組み換えバクテリ
ア由来の有用なタンパク質 (Usufulproteins from reco
mbinant bacteria)」,1980,242:74〜94にも記載があ
る。一実施態様によれば、枯草菌は、変異ＤＮＡを担持
している発現ベクターにより形質転換される。もし発現
が枯草菌等の分泌微生物中で起こる場合には、シグナル
配列を翻訳開始シグナルの後で且つ意図するＤＮＡ配列
に先立つようにする。シグナル配列は、発現産生物を細
胞壁まで輸送する役割を果たし、分泌にともない産生物
から開裂する。上記で使用した用語「制限配列（contro
l sequence)」は、シグナル配列が存在する場合にはそ
れを含む。
ア由来の有用なタンパク質 (Usufulproteins from reco
mbinant bacteria)」,1980,242:74〜94にも記載があ
る。一実施態様によれば、枯草菌は、変異ＤＮＡを担持
している発現ベクターにより形質転換される。もし発現
が枯草菌等の分泌微生物中で起こる場合には、シグナル
配列を翻訳開始シグナルの後で且つ意図するＤＮＡ配列
に先立つようにする。シグナル配列は、発現産生物を細
胞壁まで輸送する役割を果たし、分泌にともない産生物
から開裂する。上記で使用した用語「制限配列（contro
l sequence)」は、シグナル配列が存在する場合にはそ
れを含む。
【００６６】５．４．変異体ズブチリシンのスクリーニ
ング 変異体をスクリーニングするために、形質転換した枯草
菌を、濾材（ニトロセルロース等）の存在下で培養でき
る。この場合、分泌した発現産生物（例えば、酵素）が
濾材に結合する。所望の特性を有する発現産生物をスク
リーニングするために、意図する発現産生物と野生型発
現産生物とを識別できる条件下にフィルターに結合した
産生物を置く。逆処理して酵素活性が保持されていると
きには、変異により酵素の安定性が高まり、したがっ
て、その変異が有用であることを示している。
ング 変異体をスクリーニングするために、形質転換した枯草
菌を、濾材（ニトロセルロース等）の存在下で培養でき
る。この場合、分泌した発現産生物（例えば、酵素）が
濾材に結合する。所望の特性を有する発現産生物をスク
リーニングするために、意図する発現産生物と野生型発
現産生物とを識別できる条件下にフィルターに結合した
産生物を置く。逆処理して酵素活性が保持されていると
きには、変異により酵素の安定性が高まり、したがっ
て、その変異が有用であることを示している。
【００６７】本発明の一実施態様において、安定な変異
株のスクリーニングを、変異株プラスミドで形質転換し
たプロテアーゼ欠乏枯草菌株を用いて行い、以下のよう
にプレーティングする。ニトロセルロースフィルターを
ペトリ皿内の栄養基剤上に配置し、そして酢酸セルロー
スフィルターをニトロセルロースの上部に配置する。コ
ロニーが酢酸セルロース上に成長し、個々のコロニーか
らプロテアーゼが酢酸セルロースを通過してニトロセル
ロースフィルター上に分泌され、そこで安定に結合す
る。
株のスクリーニングを、変異株プラスミドで形質転換し
たプロテアーゼ欠乏枯草菌株を用いて行い、以下のよう
にプレーティングする。ニトロセルロースフィルターを
ペトリ皿内の栄養基剤上に配置し、そして酢酸セルロー
スフィルターをニトロセルロースの上部に配置する。コ
ロニーが酢酸セルロース上に成長し、個々のコロニーか
らプロテアーゼが酢酸セルロースを通過してニトロセル
ロースフィルター上に分泌され、そこで安定に結合す
る。
【００６８】何百ものコロニーからプロテアーゼが単一
のフィルターに結合するので、続いて多数のフィルター
を処理することにより何千もの異なる変異株がスクリー
ニングできる。熱安定性が高まったズブチリシンを産生
しているコロニーを同定するために、フィルターを、実
質的に全ての野性型活性を不活性化する温度において、
緩衝液中でインキュベーションできる。安定性又は活性
が高まった変異株は、この工程の後でも活性を保持して
いる。
のフィルターに結合するので、続いて多数のフィルター
を処理することにより何千もの異なる変異株がスクリー
ニングできる。熱安定性が高まったズブチリシンを産生
しているコロニーを同定するために、フィルターを、実
質的に全ての野性型活性を不活性化する温度において、
緩衝液中でインキュベーションできる。安定性又は活性
が高まった変異株は、この工程の後でも活性を保持して
いる。
【００６９】次に、適当に処理したフィルターを、トル
シ−Ｌ−Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）ベンゾリ−
Ａｒｇ−エチルエステル（ＢＡＥＥ）、アセチル−Ｔｙ
ｒ−エチルエステル（ＡＴＥＥ）（シグマ社製）又はこ
れに類似の化合物を含有している溶液に浸漬する。ＴＡ
ＭＥ，ＢＡＥＥ及びＡＴＥＥはプロテアーゼに対して基
質であるので、処理後に活性状態のままである変異ズブ
チリシンを含有しているフィルター上で開裂する。開裂
が生じるとともに、反応でプロトンが放出され、プロテ
アーゼ活性を保持している領域でフェノールレッドの色
が赤から黄色に変化する。
シ−Ｌ−Ａｒｇメチルエステル（ＴＡＭＥ）ベンゾリ−
Ａｒｇ−エチルエステル（ＢＡＥＥ）、アセチル−Ｔｙ
ｒ−エチルエステル（ＡＴＥＥ）（シグマ社製）又はこ
れに類似の化合物を含有している溶液に浸漬する。ＴＡ
ＭＥ，ＢＡＥＥ及びＡＴＥＥはプロテアーゼに対して基
質であるので、処理後に活性状態のままである変異ズブ
チリシンを含有しているフィルター上で開裂する。開裂
が生じるとともに、反応でプロトンが放出され、プロテ
アーゼ活性を保持している領域でフェノールレッドの色
が赤から黄色に変化する。
【００７０】この操作を使用して、わずかにしか変更し
ていない異種の変異株をスクリーニングできる。例え
ば、フィルターを、高温、高pHで、変性剤、酸化剤を用
いるか、通常プロテアーゼ等の酵素を不活性化して耐性
のある変異株を見つけ出す他の条件下で処理する。基質
特異性が変化した特異株は、ＴＡＭＥ，ＢＡＥＥ又はＡ
ＴＥＥの代わりに、通常野性型ズブチリシンにより開裂
されない他の基質を用いることによりスクリーニングで
きる。
ていない異種の変異株をスクリーニングできる。例え
ば、フィルターを、高温、高pHで、変性剤、酸化剤を用
いるか、通常プロテアーゼ等の酵素を不活性化して耐性
のある変異株を見つけ出す他の条件下で処理する。基質
特異性が変化した特異株は、ＴＡＭＥ，ＢＡＥＥ又はＡ
ＴＥＥの代わりに、通常野性型ズブチリシンにより開裂
されない他の基質を用いることによりスクリーニングで
きる。
【００７１】安定性が高まった変異株をスクリーニング
で同定したら、変異株を得たコロニーを単離し、変異し
たズブチリシンを精製する。精製酵素について実験を行
い、酸化、熱不活性化、変性温度、動的パラメーターに
対する安定性だけでなく、他の物理的測定値の条件も測
定した。変異遺伝子の配列決定を行って、安定性の向上
をもたらすアミノ酸の変化を測定することもできる。こ
の操作法を用いて、洗浄性の向上した変異株を単離し
た。
で同定したら、変異株を得たコロニーを単離し、変異し
たズブチリシンを精製する。精製酵素について実験を行
い、酸化、熱不活性化、変性温度、動的パラメーターに
対する安定性だけでなく、他の物理的測定値の条件も測
定した。変異遺伝子の配列決定を行って、安定性の向上
をもたらすアミノ酸の変化を測定することもできる。こ
の操作法を用いて、洗浄性の向上した変異株を単離し
た。
【００７２】６．実施例：ズブチリシン遺伝子の部位特
異的変異による有用な化学的特性を有する変異体の生成 ６．１．材料及び方法 ６．１．１．細菌株 Ｂ．ズブチリス （B.subtilis) ３０９及び１４７は、バ
シラスレンタス（Bacillus lentus) の変異株であり、
寄託番号ＮＣＩＢ １０１４７及びＮＣＩＢ１０３０９
としてＮＣＩＢに寄託され、そして、１９７３年３月２
７日に発行されたアメリカ特許第３，７２３，２５０号
（引用により明細書に組込まれる）に記載されている。
異的変異による有用な化学的特性を有する変異体の生成 ６．１．材料及び方法 ６．１．１．細菌株 Ｂ．ズブチリス （B.subtilis) ３０９及び１４７は、バ
シラスレンタス（Bacillus lentus) の変異株であり、
寄託番号ＮＣＩＢ １０１４７及びＮＣＩＢ１０３０９
としてＮＣＩＢに寄託され、そして、１９７３年３月２
７日に発行されたアメリカ特許第３，７２３，２５０号
（引用により明細書に組込まれる）に記載されている。
【００７３】Ｂ．ズブチリスＤＮ４９７は、アメリカ出
願番号第０３９，２９８号（また引用により明細書に組
込まれる）に記載されており、そしてＳＬ４３８、すな
わちBiogenのDr.Kim Hardyから得られた胞子形成及びプ
ロテアーゼ欠失性株からの染色体ＤＮＡを有するＲＵＢ
２００のａｒｏ+ 形質転換体である。Ｅ．コリMC1000r
- m+ (Casa-daban,M.J.及びCohen,S.N.(1980),J.Mol.B
iol.138 :179〜207)は、従来の方法によりｒ- ｍ+ にさ
れ、そしてアメリカ出願番号第０３９，２９８号にも記
載されている。
願番号第０３９，２９８号（また引用により明細書に組
込まれる）に記載されており、そしてＳＬ４３８、すな
わちBiogenのDr.Kim Hardyから得られた胞子形成及びプ
ロテアーゼ欠失性株からの染色体ＤＮＡを有するＲＵＢ
２００のａｒｏ+ 形質転換体である。Ｅ．コリMC1000r
- m+ (Casa-daban,M.J.及びCohen,S.N.(1980),J.Mol.B
iol.138 :179〜207)は、従来の方法によりｒ- ｍ+ にさ
れ、そしてアメリカ出願番号第０３９，２９８号にも記
載されている。
【００７４】６．１．２．プラスミド ｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメリ
カ特許出願第０３９，２９８号に記載され、そして引用
により明細書に組込まれている）は、プロモーター−オ
ペレーターＰ1 Ｏ1 、Ｂ．パミラス（B.pumilus)ｘｙｎ
Ｂ遺伝子及びＢ．ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プ
ラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。
カ特許出願第０３９，２９８号に記載され、そして引用
により明細書に組込まれている）は、プロモーター−オ
ペレーターＰ1 Ｏ1 、Ｂ．パミラス（B.pumilus)ｘｙｎ
Ｂ遺伝子及びＢ．ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プ
ラスミドｐＤＮ１０５０の誘導体である。
【００７５】ｐＳＸ６５（アメリカ特許出願第０３９，
２９８、前記に記載される）は、プロモーター−オペレ
ーターＰ2 Ｏ2 、Ｂ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子及びＢ．
ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プラスミドｐＤＮ１
０５０の誘導体である。図３に示されるｐＳＸ９３は、
ポリリンカー配列に挿入されるターミネーターを含むズ
ブチリシン３０９遺伝子の０．７kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを含んで成るｐＵＣ１３（Vieira及
びMessing,1982,Gene 19:259〜268)である。
２９８、前記に記載される）は、プロモーター−オペレ
ーターＰ2 Ｏ2 、Ｂ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子及びＢ．
ズブチリスｘｙｌＲ遺伝子を含む、プラスミドｐＤＮ１
０５０の誘導体である。図３に示されるｐＳＸ９３は、
ポリリンカー配列に挿入されるターミネーターを含むズ
ブチリシン３０９遺伝子の０．７kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを含んで成るｐＵＣ１３（Vieira及
びMessing,1982,Gene 19:259〜268)である。
【００７６】ｐＳＸ１１９は、ポリリンカー中に挿入さ
れるズブチリシン３０９遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
フラグメントを有するｐＵＣ１３である。ｐＳＸ６２
（アメリカ特許出願第０３９，２９８号、前記に記載さ
れる）は、ウシプロキモシン遺伝子とｐＳＸ５０（前
記）中に挿入されるＢ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子との間
の融合遺伝子を含んで成る、ｐＳＸ５２の誘導体であ
る。ｐＳＸ６２は、プロキモシン遺伝子の後ろのｐＳＸ
５２中にＥ．コリｒｒｎＢターミネーターを挿入するこ
とによって生成された。
れるズブチリシン３０９遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
フラグメントを有するｐＵＣ１３である。ｐＳＸ６２
（アメリカ特許出願第０３９，２９８号、前記に記載さ
れる）は、ウシプロキモシン遺伝子とｐＳＸ５０（前
記）中に挿入されるＢ．パミラスｘｙｎＢ遺伝子との間
の融合遺伝子を含んで成る、ｐＳＸ５２の誘導体であ
る。ｐＳＸ６２は、プロキモシン遺伝子の後ろのｐＳＸ
５２中にＥ．コリｒｒｎＢターミネーターを挿入するこ
とによって生成された。
【００７７】ｐＳＸ９２は、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII
で切断されたプラスミドｐＳＸ６２（前記）中にズブチ
リシン３０９をクローン化することにより生成され、そ
してそのクローン化されたズブチリシン３０９遺伝子か
らのＤｒａＩ−ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII フ
ラグメントの挿入の前、フィルインされた。
で切断されたプラスミドｐＳＸ６２（前記）中にズブチ
リシン３０９をクローン化することにより生成され、そ
してそのクローン化されたズブチリシン３０９遺伝子か
らのＤｒａＩ−ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII フ
ラグメントの挿入の前、フィルインされた。
【００７８】６．１．３．ズブチリシンの精製 この方法は、ズブチリシン１４７酵素、ズブチリシン３
０９酵素又はそれらの突然変異体の１０ｌ規模発酵の典
型的な精製に関係する。およそ８ｌの発酵ブイヨンを、
１ｌのビーカー中で３５分間、５０００rpm で遠心分離
した。その上清液を、１０％酢酸を用いてpH６．５に調
整し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で
濾過した。
０９酵素又はそれらの突然変異体の１０ｌ規模発酵の典
型的な精製に関係する。およそ８ｌの発酵ブイヨンを、
１ｌのビーカー中で３５分間、５０００rpm で遠心分離
した。その上清液を、１０％酢酸を用いてpH６．５に調
整し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で
濾過した。
【００７９】その濾液を、Amicon S1Y10 UF 遠心分離機
を備えるAmicon CH2A UFユニットを用いて、約４００ml
に濃縮した。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして濾過
し、その後、pH７でBacitracinアフィニティーカラム上
に吸着した。pH７に調整された、０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む緩衝溶液中、２５％の２−プロパノール
及び１Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて、プロテアーゼ
をBacitracinカラムから溶離した。
を備えるAmicon CH2A UFユニットを用いて、約４００ml
に濃縮した。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして濾過
し、その後、pH７でBacitracinアフィニティーカラム上
に吸着した。pH７に調整された、０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む緩衝溶液中、２５％の２−プロパノール
及び１Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いて、プロテアーゼ
をBacitracinカラムから溶離した。
【００８０】Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活
性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により平
衡化された７５０mlのSephadex G25カラム（直径５cm）
に適用した。Sephadex G25カラムからのタンパク質分解
活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチ
ルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化
カルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により
平衡化された１５０mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交
換カラム（直径５cm）に適用した。
性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチル
グルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カ
ルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により平
衡化された７５０mlのSephadex G25カラム（直径５cm）
に適用した。Sephadex G25カラムからのタンパク質分解
活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチ
ルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化
カルシウムを含む、pH６．５に調整された緩衝液により
平衡化された１５０mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交
換カラム（直径５cm）に適用した。
【００８１】プロテアーゼを、同じ緩衝液（０〜０．２
Ｍの塩化ナトリウム）２ｌ中、０〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムの直線グラジェントを用いて溶離した。最終精製
段階において、CM Sepharoseカラムからのプロテアーゼ
含有画分を組合し、そしてＧＲ８１Ｆ膜（Danish Sugar
Facturies Inc. からの) を備えるAmicon限外濾過セル
で濃縮した。
Ｍの塩化ナトリウム）２ｌ中、０〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムの直線グラジェントを用いて溶離した。最終精製
段階において、CM Sepharoseカラムからのプロテアーゼ
含有画分を組合し、そしてＧＲ８１Ｆ膜（Danish Sugar
Facturies Inc. からの) を備えるAmicon限外濾過セル
で濃縮した。
【００８２】ズブチリシン３０９及び突然変異体、 Ｍｅｔ２２２〜Ａｌａ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ Ａｓｎ２１８〜Ｓｅｒ Ａｒｇ１７０〜Ｔｙｒ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ，Ａｒｇ１７０〜Ｔｙｒ Ｇｌｙ１９５〜Ｇｌｕ，Ｍｅｔ２２２〜Ａｌａ を、この方法により精製した。
【００８３】６．１．４．オリゴヌクレオチド合成 すべての不適正（ミスマッチ）プライマーを、Applied
Biosystems 380A DNA合成機により合成し、そしてポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し
た。
Biosystems 380A DNA合成機により合成し、そしてポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し
た。
【００８４】６．１．５．酸化安定性の決定 精製された酵素を、pH７の０．０１Ｍジメチルグルタル
酸及び０．０１Ｍの過酢酸（pH７）を有する同じ緩衝液
により約０．１mg／mlの酵素含有濃度に希釈する。両組
の希釈溶液を５０℃に２０分間加熱した。希釈溶液中の
タンパク質分解活性を、加熱処理の前及び後で測定し
た。
酸及び０．０１Ｍの過酢酸（pH７）を有する同じ緩衝液
により約０．１mg／mlの酵素含有濃度に希釈する。両組
の希釈溶液を５０℃に２０分間加熱した。希釈溶液中の
タンパク質分解活性を、加熱処理の前及び後で測定し
た。
【００８５】６．１．６．タンパク質分解活性について
のアッセイ ＯＰＡ−カゼイン法 タンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて決
定した。１つのカゼインプロテアーゼ単位（CPU)を、標
準条件、すなわち２５℃及びpH９．５で３０分間のイン
キュベーション下で、１分当たり一次アミノ基１ミリモ
ルを生成する酵素の量（セリン標準液との比較により決
定される）として定義される。
のアッセイ ＯＰＡ−カゼイン法 タンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて決
定した。１つのカゼインプロテアーゼ単位（CPU)を、標
準条件、すなわち２５℃及びpH９．５で３０分間のイン
キュベーション下で、１分当たり一次アミノ基１ミリモ
ルを生成する酵素の量（セリン標準液との比較により決
定される）として定義される。
【００８６】カゼイン（Hammarstein,Merck A.G., 西ド
イツにより供給される）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液を、Brit
ton 及びRobinson (Journ.Chem.Soc. 1931, 1451ペー
ジ) により記載される、pH９．５に調整されたUniversa
l Butterにより調製した。基質溶液２mlを、水浴中で１
０分間２５℃で予備インキュベートした。Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１ml当たり約０．２〜０．３CP
U を含む酵素溶液１mlを添加した。２５℃での３０分間
のインキュベーションの後、その反応を、停止剤（脱イ
オン水により５００mlまで希釈された、トリクロロ酢酸
１７．９ｇ、酢酸ナトリウム２９．９ｇ及び酢酸１９．
８ｇを含む溶液５ml）の添加により停止せしめた。ブラ
ンクを、試験溶液として同じ方法で調製した。但し、停
止剤は、酵素溶液の前に添加された。
イツにより供給される）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液を、Brit
ton 及びRobinson (Journ.Chem.Soc. 1931, 1451ペー
ジ) により記載される、pH９．５に調整されたUniversa
l Butterにより調製した。基質溶液２mlを、水浴中で１
０分間２５℃で予備インキュベートした。Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１ml当たり約０．２〜０．３CP
U を含む酵素溶液１mlを添加した。２５℃での３０分間
のインキュベーションの後、その反応を、停止剤（脱イ
オン水により５００mlまで希釈された、トリクロロ酢酸
１７．９ｇ、酢酸ナトリウム２９．９ｇ及び酢酸１９．
８ｇを含む溶液５ml）の添加により停止せしめた。ブラ
ンクを、試験溶液として同じ方法で調製した。但し、停
止剤は、酵素溶液の前に添加された。
【００８７】反応混合物を、水浴中に２０分間保持し、
その後それらをWhatman(商標）濾紙を通して濾過した。
一次アミノ基を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）に
よるそれらの色の展開により決定した。四硼酸＝ナトリ
ウム１０水和物（７．６２ｇ）及びドデシル硫酸ナトリ
ウム（２．０ｇ）を、水１５０mlに溶解した。次に、メ
タノール４ml中に溶解されたＯＰＡ（１６０mg）を、β
−メルカプトエタノール４００μｌと共に添加し、その
後、その溶液を水により２００mlにした。
その後それらをWhatman(商標）濾紙を通して濾過した。
一次アミノ基を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）に
よるそれらの色の展開により決定した。四硼酸＝ナトリ
ウム１０水和物（７．６２ｇ）及びドデシル硫酸ナトリ
ウム（２．０ｇ）を、水１５０mlに溶解した。次に、メ
タノール４ml中に溶解されたＯＰＡ（１６０mg）を、β
−メルカプトエタノール４００μｌと共に添加し、その
後、その溶液を水により２００mlにした。
【００８８】ＯＰＡ試薬（３ml）に、上記濾液４０μｌ
を添加し、そして混合した。３４０nmでの光学密度を、
約５分後に測定した。ＯＰＡ試験をまた、Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１００mlにセリン１０mgを含む
セリン標準液により行なった。緩衝液を、ブランクとし
て使用した。プロテアーゼ活性を、次の式により光学密
度測定値から計算した：
を添加し、そして混合した。３４０nmでの光学密度を、
約５分後に測定した。ＯＰＡ試験をまた、Britton-Robi
nson緩衝液（pH９．５）１００mlにセリン１０mgを含む
セリン標準液により行なった。緩衝液を、ブランクとし
て使用した。プロテアーゼ活性を、次の式により光学密
度測定値から計算した：
【００８９】
【数１】 ここで、ＯＤt ，ＯＤb ；ＯＤser 及びＯＤB は、試験
溶液、ブランク、セリン標準液及び緩衝液の光学密度で
あり、Ｃser は、標準液中でのセリンの濃度mg／mlであ
り、μＷser はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液
のための希釈係数（この場合、８に等しい）であり、そ
してｔi はインキュベーション時間（分）である。次の
第Ｖ表においては、上記アッセイからの結果が、親酵素
に比較して示される。
溶液、ブランク、セリン標準液及び緩衝液の光学密度で
あり、Ｃser は、標準液中でのセリンの濃度mg／mlであ
り、μＷser はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液
のための希釈係数（この場合、８に等しい）であり、そ
してｔi はインキュベーション時間（分）である。次の
第Ｖ表においては、上記アッセイからの結果が、親酵素
に比較して示される。
【００９０】６．１．７．洗浄性についてのアッセイ 試験布（７cm×７cm、約１ｇ）を、ホウレンソウのジュ
ース（新鮮なホウレンソウから生成された）を含む、Ma
this Washing及びDrying Unit タイプＴＨ（Werner Mat
his AG,Zurich 、スイス) の容器を通して及び次に、過
剰のホウレンソウのジュースを除去するためにその機械
の圧力ロールを通して所望する綿 (１００％綿、ＤＳ７
１）の布を通すことによって製造した。
ース（新鮮なホウレンソウから生成された）を含む、Ma
this Washing及びDrying Unit タイプＴＨ（Werner Mat
his AG,Zurich 、スイス) の容器を通して及び次に、過
剰のホウレンソウのジュースを除去するためにその機械
の圧力ロールを通して所望する綿 (１００％綿、ＤＳ７
１）の布を通すことによって製造した。
【００９１】最後に、その布を、室温で強い空気流下で
乾燥せしめ、室温で３週間保存し、そして続いて、使用
する前、−１８℃で保持した。試験は、Terg−Ｏ−tome
ter 試験洗浄機（Jay C.Harris "Detergency Evaluatio
n and Testing",Interscience Publishers Ltd.,1954,
60〜61ページに記載される）により、１０分間、１００
rpm で恒温で行なわれた。洗剤として、次の標準粉末洗
剤を使用した：
乾燥せしめ、室温で３週間保存し、そして続いて、使用
する前、−１８℃で保持した。試験は、Terg−Ｏ−tome
ter 試験洗浄機（Jay C.Harris "Detergency Evaluatio
n and Testing",Interscience Publishers Ltd.,1954,
60〜61ページに記載される）により、１０分間、１００
rpm で恒温で行なわれた。洗剤として、次の標準粉末洗
剤を使用した：
【００９２】 ＬＡＳ，Ｎａｎｓａ Ｓ ８０ ０．４ ｇ／ｌ ＡＥ，Ｂｅｒａｌ Ｏ ６５ ０．１５ｇ／ｌ 石けん ０．１５ｇ／ｌ ＳＴＰＰ １．７５ｇ／ｌ 珪酸ナトリウム ０．４０ｇ／ｌ ＣＭＣ ０．０５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ ０．０１ｇ／ｌ Ｎａ2 ＳＯ4 ２．１０ｇ／ｌ 過硼酸塩 １．００ｇ／ｌ ＴＡＥＤ ０．１０ｇ／ｌ
【００９３】ここで、ＴＡＥＤ＝Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−
テトラアセチル−エチレンジアミン；pHは４ＮのＮａＯ
Ｈにより９．５に調整された。使用される水は、約９の
ＧＨ（Gernan Hardness)であった。試験は、０，０．０
５及び０．１ CPU／ｌの酵素濃度で行なわれ、そして２
つの独立した組の試験が、個々の突然変異体のために行
なわれた。
テトラアセチル−エチレンジアミン；pHは４ＮのＮａＯ
Ｈにより９．５に調整された。使用される水は、約９の
ＧＨ（Gernan Hardness)であった。試験は、０，０．０
５及び０．１ CPU／ｌの酵素濃度で行なわれ、そして２
つの独立した組の試験が、個々の突然変異体のために行
なわれた。
【００９４】８枚の布が、洗剤の１つのビーカー（８０
０ml）を用いて個々の試験のために使用された。それら
の布のうち、４枚はきれいで、そして他の４枚はホウレ
ンソウのジュースにより汚された。洗浄に続いて、それ
らの布を、バケツの中で２５分間、水道水によりフラッ
シュした。次に、それらの布を一晩、空気乾燥せしめ、
（日光に対して保護された）、そして規約反射率、Ｒ
を、４６０nmでDatacolor S.A.,Dietkikon、スイスから
のE1REPHO 2000分光光度計により決定した。洗浄能力示
差規約反射率の尺度として、ΔＲを使用し、ΔＲは、添
加された酵素による洗浄後の規約反射率−酵素添加によ
らない洗浄後の規約反射率に等しい。
０ml）を用いて個々の試験のために使用された。それら
の布のうち、４枚はきれいで、そして他の４枚はホウレ
ンソウのジュースにより汚された。洗浄に続いて、それ
らの布を、バケツの中で２５分間、水道水によりフラッ
シュした。次に、それらの布を一晩、空気乾燥せしめ、
（日光に対して保護された）、そして規約反射率、Ｒ
を、４６０nmでDatacolor S.A.,Dietkikon、スイスから
のE1REPHO 2000分光光度計により決定した。洗浄能力示
差規約反射率の尺度として、ΔＲを使用し、ΔＲは、添
加された酵素による洗浄後の規約反射率−酵素添加によ
らない洗浄後の規約反射率に等しい。
【００９５】６．１．８．熱安定性についてのアッセイ 洗浄性についての上記方法と同じ方法が、それぞれ４０
℃及び６０℃での試験を行なうことによって、生成され
た突然変異体の熱安定性を評価するために使用された。
℃及び６０℃での試験を行なうことによって、生成され
た突然変異体の熱安定性を評価するために使用された。
【００９６】６．２．結果 ６．２．１．ズブチリシン３０９及び１４７遺伝子のク
ローニング “３０９”株からの染色体ＤＮＡを、３７℃で３０分
間、リゾチームにより、及び次に６０℃で５分間、ＳＤ
Ｓにより細胞懸濁液を処理することにより単離した。続
いて、その懸濁液を、フェノールクロロホルム（５０：
５０）により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そ
してその沈殿物をＴＥに再溶解した。この溶液を、３７
℃で１時間、ＲＮａｓｅにより処理した。
ローニング “３０９”株からの染色体ＤＮＡを、３７℃で３０分
間、リゾチームにより、及び次に６０℃で５分間、ＳＤ
Ｓにより細胞懸濁液を処理することにより単離した。続
いて、その懸濁液を、フェノールクロロホルム（５０：
５０）により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そ
してその沈殿物をＴＥに再溶解した。この溶液を、３７
℃で１時間、ＲＮａｓｅにより処理した。
【００９７】約３０μｇの染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓ
ａｎ３Ａ（New England Biolabs)により一部消化し、そ
して約１．５kb〜約６．５kbのフラグメントを、１％ア
ガロースゲルからＤＥＡＥセルロース紙上で単離した
（他の種のズブチリシン遺伝子は約１．２kbの長さであ
る）。図１に概略されるように、そのフラグメントをア
ニールし、そしてＢａｍＨＩにより切断されたプラスミ
ドｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメ
リカ特許出願第０３９，２９８号に記載される、これは
引用により組込まれる）に連結した。次に、そのプラス
ミドを、コンピテントＢ．ズブチリスＤＮ４９７中に形
質転換せしめた。
ａｎ３Ａ（New England Biolabs)により一部消化し、そ
して約１．５kb〜約６．５kbのフラグメントを、１％ア
ガロースゲルからＤＥＡＥセルロース紙上で単離した
（他の種のズブチリシン遺伝子は約１．２kbの長さであ
る）。図１に概略されるように、そのフラグメントをア
ニールし、そしてＢａｍＨＩにより切断されたプラスミ
ドｐＳＸ５０（１９８７年４月１７日に出願されたアメ
リカ特許出願第０３９，２９８号に記載される、これは
引用により組込まれる）に連結した。次に、そのプラス
ミドを、コンピテントＢ．ズブチリスＤＮ４９７中に形
質転換せしめた。
【００９８】次に、その細胞を、１０mMのリン酸塩pH
７、６μｌ／mlのクロラムフェニコール及び０．２％の
キシロースを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、プラスミ
ドにおけるｘｙｎ−プロモーターを誘発した。そのプレ
ートはまた、プロテアーゼ産生形質転換体を、スキンミ
ルクが分解された場所での透明なかさにより検出するた
めに、１％スキンミルクも含んだ。
７、６μｌ／mlのクロラムフェニコール及び０．２％の
キシロースを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、プラスミ
ドにおけるｘｙｎ−プロモーターを誘発した。そのプレ
ートはまた、プロテアーゼ産生形質転換体を、スキンミ
ルクが分解された場所での透明なかさにより検出するた
めに、１％スキンミルクも含んだ。
【００９９】プロテアーゼ発現クローンを、１０-4の頻
度で生成した。２種のクローンは、ズブチリシン３０９
のための遺伝子を担持するプラスミド、ｐＳＸ８６及び
ｐＳＸ８８を有することが見出された。次に、その遺伝
子を、Maxam 及びGilbert の方法を用いて配列決定し
た。ズブチリシン３０９の推定されるヌクレオチド配列
は、表II表に示される。
度で生成した。２種のクローンは、ズブチリシン３０９
のための遺伝子を担持するプラスミド、ｐＳＸ８６及び
ｐＳＸ８８を有することが見出された。次に、その遺伝
子を、Maxam 及びGilbert の方法を用いて配列決定し
た。ズブチリシン３０９の推定されるヌクレオチド配列
は、表II表に示される。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】上記と同じ方法が、ズブチリシン１４７遺
伝子のクローニングのために使用された。但し、ＤＮＡ
フラグメントを、プラスミドｐＳＸ５６（アメリカ特許
出願第０３９，２９８号、前記にまた記載される）中に
連結し、そしてこれは、図２に示されるように、ｘｙｎ
プロモーターの代わりに、ｘｙｌプロモーターを有す
る。１つのクローンは、ズブチリシン１４７のための遺
伝子を担持するプラスミドｐＳＸ９４を有することが見
出された。この遺伝子のための配列は、下記第III 表に
示される。
伝子のクローニングのために使用された。但し、ＤＮＡ
フラグメントを、プラスミドｐＳＸ５６（アメリカ特許
出願第０３９，２９８号、前記にまた記載される）中に
連結し、そしてこれは、図２に示されるように、ｘｙｎ
プロモーターの代わりに、ｘｙｌプロモーターを有す
る。１つのクローンは、ズブチリシン１４７のための遺
伝子を担持するプラスミドｐＳＸ９４を有することが見
出された。この遺伝子のための配列は、下記第III 表に
示される。
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】６．２．２．ズブチリシン３０９遺伝子の
部位（サイト）特異的突然変異の発生 部位特異的突然変異はMorinagaらの方法（特にBiotechn
ology)により行なわれた。この突然変異をおこすため以
下のオリゴヌクレオチドが用いられた。
部位（サイト）特異的突然変異の発生 部位特異的突然変異はMorinagaらの方法（特にBiotechn
ology)により行なわれた。この突然変異をおこすため以
下のオリゴヌクレオチドが用いられた。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
【表１１】 この二重変異体に対し１個の変異体ＤＮＡフラグメント
を結合することによりＮＯＲ−２３７及びＮＯＲ−２３
５又はＮＯＲ−２３６の結合を行った。
を結合することによりＮＯＲ−２３７及びＮＯＲ−２３
５又はＮＯＲ−２３６の結合を行った。
【０１０８】ｋ）Ｓａｒ−１５３ Ａｌａ及びＡｓｎ−
２１８ Ｓｅｒ：上記と同様にＮＯＲ−３２４及びＮＯ
Ｒ−３２５の結合を行った。鋳型としてプラスミドｐＳ
Ｘ９３を用いて開裂重複突然変異を行った。ｐＳＸ９３
は図３及び図４に示してあり、ポリリンカーに挿入され
たターミネーターを含むズブチリシン３０９遺伝子の
０．７kbＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むｐ
ＵＣ１３である（Visira,J. 及びMessing J:1982,Gene
19:259〜268)。このターミネーター及びＨｉｎｄIII サ
イトは第IV表に示されていない。
２１８ Ｓｅｒ：上記と同様にＮＯＲ−３２４及びＮＯ
Ｒ−３２５の結合を行った。鋳型としてプラスミドｐＳ
Ｘ９３を用いて開裂重複突然変異を行った。ｐＳＸ９３
は図３及び図４に示してあり、ポリリンカーに挿入され
たターミネーターを含むズブチリシン３０９遺伝子の
０．７kbＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むｐ
ＵＣ１３である（Visira,J. 及びMessing J:1982,Gene
19:259〜268)。このターミネーター及びＨｉｎｄIII サ
イトは第IV表に示されていない。
【０１０９】酵素のＮ端部において突然変異を行なうた
めプラスミドｐＳＸ１１９を用いた。ｐＳＸ１１９はポ
リリンカーに挿入されたズブチリシン３０９遺伝子のＥ
ｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを有するｐＵＣ１３で
ある。こうして鋳型ｐＳＸ９３及びｐＳＸ１１９はズブ
チリシン３０９遺伝子全体をカバーする。突然変異
ａ），ｂ）、及びｅ）は図３に示すようにＸｂａＩ及び
ＣｌａＩによりｐＳＸ９３を切断することにより行な
い、ｃ），ｄ），ｆ）、及びｈ）は図４に示すようにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII によりｐＳＸ９３を切断するこ
とにより行った。
めプラスミドｐＳＸ１１９を用いた。ｐＳＸ１１９はポ
リリンカーに挿入されたズブチリシン３０９遺伝子のＥ
ｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを有するｐＵＣ１３で
ある。こうして鋳型ｐＳＸ９３及びｐＳＸ１１９はズブ
チリシン３０９遺伝子全体をカバーする。突然変異
ａ），ｂ）、及びｅ）は図３に示すようにＸｂａＩ及び
ＣｌａＩによりｐＳＸ９３を切断することにより行な
い、ｃ），ｄ），ｆ）、及びｈ）は図４に示すようにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII によりｐＳＸ９３を切断するこ
とにより行った。
【０１１０】突然変異ｇ）はＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩに
より切断することによりｐＳＸ１１９において行った。
重複突然変異体ｉ）及びｊ）はａ）からの０．７kbＸｂ
ａ−ＨｉｎｄIII フラグメントをＨｇｉＡＩにより一部
切断することにより形成された（ＨｇｉＡＩは突然変異
により形成されたＳａｃＩも切断する）。それぞれｃ）
及びｄ）突然変異からの１８０bpＸｂａＩ−ＨｇｉＡＩ
フラグメント及び０．５kbＨｇｉＡＩフラグメントはｐ
ＳＸ９３からの大きなＨｉｎｄIII −ＸｂａＩフラグメ
ントに縛られた。
より切断することによりｐＳＸ１１９において行った。
重複突然変異体ｉ）及びｊ）はａ）からの０．７kbＸｂ
ａ−ＨｉｎｄIII フラグメントをＨｇｉＡＩにより一部
切断することにより形成された（ＨｇｉＡＩは突然変異
により形成されたＳａｃＩも切断する）。それぞれｃ）
及びｄ）突然変異からの１８０bpＸｂａＩ−ＨｇｉＡＩ
フラグメント及び０．５kbＨｇｉＡＩフラグメントはｐ
ＳＸ９３からの大きなＨｉｎｄIII −ＸｂａＩフラグメ
ントに縛られた。
【０１１１】重複突然変異体ｋ）は突然変異体ｅ）及び
ｆ）を結合することにより形成された。アニーリング、
フィリング及び連結反応後、混合物をE.Coli MC 1000 r
- m+の形質転換に用いた。形質転換細胞の中の突然変
異体をVlasukら1983,J.Biol.Chem.258, 7141〜7148及び
Vlasuk G.P. 及びInouyeら、 p.292〜303,「Experiment
al Manipulation of Gene Expression" Academic Pres
s,New York に記載されているようにしてコロニーハイ
ブリッド法によりスクリーニングした。突然変異体はＤ
ＮＡ配列により確認された。
ｆ）を結合することにより形成された。アニーリング、
フィリング及び連結反応後、混合物をE.Coli MC 1000 r
- m+の形質転換に用いた。形質転換細胞の中の突然変
異体をVlasukら1983,J.Biol.Chem.258, 7141〜7148及び
Vlasuk G.P. 及びInouyeら、 p.292〜303,「Experiment
al Manipulation of Gene Expression" Academic Pres
s,New York に記載されているようにしてコロニーハイ
ブリッド法によりスクリーニングした。突然変異体はＤ
ＮＡ配列により確認された。
【０１１２】６．２．３．変異ズブチリシンの表示 正確な突然変異の配列確認後、突然変異ＤＮＡフラグメ
ントをプラスミドｐＳＸ９２に挿入し、これを突然変異
体の形成に用いた。プラスミドｐＳＸ９２は図５に示さ
れており、ＣｌａＩで切断され、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のKlenowフラグメントで満たされ、及びクローニングさ
れたＳｕｂ３０９遺伝子からのフラグメントＤｒａＩ−
ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII の挿入前にＨｉｎ
ｄIII で切断されたプラスミドｐＳＸ６２にＳｕｂ３０
９遺伝子をクローニングすることにより形成された。
ントをプラスミドｐＳＸ９２に挿入し、これを突然変異
体の形成に用いた。プラスミドｐＳＸ９２は図５に示さ
れており、ＣｌａＩで切断され、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のKlenowフラグメントで満たされ、及びクローニングさ
れたＳｕｂ３０９遺伝子からのフラグメントＤｒａＩ−
ＮｈｅＩ及びＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIII の挿入前にＨｉｎ
ｄIII で切断されたプラスミドｐＳＸ６２にＳｕｂ３０
９遺伝子をクローニングすることにより形成された。
【０１１３】突然変異体を示すため、突然変異フラグメ
ント（ＸｂａＩ−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 、
又はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）を適当な突然変異プラスミ
ドｐＳＸ９３又はｐＳＸ１１９より切り出しｐＳＸ９２
に挿入した。次いでＢ．ズブチリス株ＤＮ４９７を形質
転換するため突然変異ｐＳＸ９２を用い、親遺伝子のク
ローニングに用いた同じ培地及び同じ条件において増殖
させた。適当に増殖後、突然変異酵素を回収し精製し
た。
ント（ＸｂａＩ−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 、
又はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）を適当な突然変異プラスミ
ドｐＳＸ９３又はｐＳＸ１１９より切り出しｐＳＸ９２
に挿入した。次いでＢ．ズブチリス株ＤＮ４９７を形質
転換するため突然変異ｐＳＸ９２を用い、親遺伝子のク
ローニングに用いた同じ培地及び同じ条件において増殖
させた。適当に増殖後、突然変異酵素を回収し精製し
た。
【０１１４】６．２．４．変異ズブチリシンの酸化安定
性 突然変異体ａ）及びｂ）を５０℃及びpH７において２０
分後０．０１Ｍ過酢酸中のその酸化安定性についてテス
トした。結果を第IV表に示すが、これはオキシダントも
しくは熱により未処理のサンプルに対する熱処理したサ
ンプルの残留蛋白分解活性を示している。
性 突然変異体ａ）及びｂ）を５０℃及びpH７において２０
分後０．０１Ｍ過酢酸中のその酸化安定性についてテス
トした。結果を第IV表に示すが、これはオキシダントも
しくは熱により未処理のサンプルに対する熱処理したサ
ンプルの残留蛋白分解活性を示している。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】突然変異体ｄ（Ｍｅｔ２２２からＡｌａ）
が親酵素及び突然変異体ａにくらべすぐれた酸化安定性
を示すことがわかる。ｇ）及びｈ）を除くすべての突然
変異体を室温及び３５℃、pH６．５及び９．０、１５分
〜２時間１００〜５００ppm 次亜塩素酸塩で処理した。
このテストは、突然変異体ｃ），ｄ），ｉ）、及びｊ）
（すべてＭｅｔ−２２２）が他の突然変異体よりも３〜
５倍次亜塩素酸塩に耐えることを示した。通常のタイプ
の液体洗剤でテストした場合、突然変異体ｆ）が他の突
然変異体及び親酵素と比較してすぐれた安定性を示すこ
とがわかった。
が親酵素及び突然変異体ａにくらべすぐれた酸化安定性
を示すことがわかる。ｇ）及びｈ）を除くすべての突然
変異体を室温及び３５℃、pH６．５及び９．０、１５分
〜２時間１００〜５００ppm 次亜塩素酸塩で処理した。
このテストは、突然変異体ｃ），ｄ），ｉ）、及びｊ）
（すべてＭｅｔ−２２２）が他の突然変異体よりも３〜
５倍次亜塩素酸塩に耐えることを示した。通常のタイプ
の液体洗剤でテストした場合、突然変異体ｆ）が他の突
然変異体及び親酵素と比較してすぐれた安定性を示すこ
とがわかった。
【０１１７】６．２．５．変異ズブチリシンの蛋白質分
解活性 前記方法に従い、蛋白質基質としてのカゼインに対し種
々の突然変異体の蛋白質分解活性をテストした。結果を
第Ｖ表に示す。この表より突然変異体ａ）が親にくらべ
高い活性を示すことがわかる。また、Ｍｅｔ−２２２突
然変異体が親よりも活性が低いこともわかるが、その改
良された酸化安定性のためオキシダントを含む洗浄にお
ける使用は除外されない。
解活性 前記方法に従い、蛋白質基質としてのカゼインに対し種
々の突然変異体の蛋白質分解活性をテストした。結果を
第Ｖ表に示す。この表より突然変異体ａ）が親にくらべ
高い活性を示すことがわかる。また、Ｍｅｔ−２２２突
然変異体が親よりも活性が低いこともわかるが、その改
良された酸化安定性のためオキシダントを含む洗浄にお
ける使用は除外されない。
【０１１８】
【表１３】
【０１１９】６．２．６．変異ズブチリシンの洗浄性 前記方法に従い、ホウレンソウジュースに対し種々の突
然変異体の洗浄性をテストした。結果を第VI表に示す。
この表より、テストした突然変異体はすべて親酵素と比
較して改良された洗浄能を有し、突然変異体ｃ），
ｄ），ｉ）、及びｊ）は特にすぐれていることがわか
る。
然変異体の洗浄性をテストした。結果を第VI表に示す。
この表より、テストした突然変異体はすべて親酵素と比
較して改良された洗浄能を有し、突然変異体ｃ），
ｄ），ｉ）、及びｊ）は特にすぐれていることがわか
る。
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】６．２．７．変異ズブチリシンの熱安定性 ４０℃及び６０℃において洗濯適性テストを用いること
により野生タイプ酵素に対し突然変異体ｆ）の熱安定性
をテストした。結果を第VII 表に示す。この表より、突
然変異体ｆ）は６０℃において野生タイプ酵素にくらべ
改良された洗濯適性を示すが、４０℃では突然変異体
ｆ）の洗濯適性は野性タイプ酵素よりわずかのみすぐれ
ていることがわかる。
により野生タイプ酵素に対し突然変異体ｆ）の熱安定性
をテストした。結果を第VII 表に示す。この表より、突
然変異体ｆ）は６０℃において野生タイプ酵素にくらべ
改良された洗濯適性を示すが、４０℃では突然変異体
ｆ）の洗濯適性は野性タイプ酵素よりわずかのみすぐれ
ていることがわかる。
【０１２２】
【表１５】
【０１２３】６．３．考察 ズブチリシン遺伝子を、細菌バシラスレンタス（Bacill
us lentus)の１４７および３０９突然変異体からクロー
ン化し、クローン化した遺伝子を配列させた。ズブチリ
シン１４７および３０９突然変異体の推定アミノ酸配列
と、他のズブチリシンの配列と比較することにより、突
然変異の際、親酵素の物理的特性を変え得るサイトは同
一であった。ズブチリシン３０９遺伝子内において、こ
れらのいくつかのサイトで突然変異を生じさせるためサ
イト特異性変異誘発を用いた。
us lentus)の１４７および３０９突然変異体からクロー
ン化し、クローン化した遺伝子を配列させた。ズブチリ
シン１４７および３０９突然変異体の推定アミノ酸配列
と、他のズブチリシンの配列と比較することにより、突
然変異の際、親酵素の物理的特性を変え得るサイトは同
一であった。ズブチリシン３０９遺伝子内において、こ
れらのいくつかのサイトで突然変異を生じさせるためサ
イト特異性変異誘発を用いた。
【０１２４】得られた突然変異体の酵素を、バシラス菌
株内で発現させ、次いで種々の物理的および化学的パラ
メータを試験した。幾つかの突然変異体は、親ズブチリ
シン３０９酵素と比較して酸化に対する改良された安定
性、改良されたタンパク質分解能又は改良された洗浄性
を有することを示した。これらの突然変異体は、洗剤組
成物中に含まれる酵素中で望ましい特性を示す。
株内で発現させ、次いで種々の物理的および化学的パラ
メータを試験した。幾つかの突然変異体は、親ズブチリ
シン３０９酵素と比較して酸化に対する改良された安定
性、改良されたタンパク質分解能又は改良された洗浄性
を有することを示した。これらの突然変異体は、洗剤組
成物中に含まれる酵素中で望ましい特性を示す。
【図１】図１は、ＢａｍＨＩ切断プラスミドｐＳｘ５０
への、バシラス・レンタス株３０９ＤＮＡをＳａｕ３Ａ
制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化することにより
得られた長さ１．５kb〜６．５kbのサブセットの断片の
挿入を示す図である。反対の向きにズブチリシン３０９
を含んでいる得られる２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ
８６とｐＳｘ８８も公知である。
への、バシラス・レンタス株３０９ＤＮＡをＳａｕ３Ａ
制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化することにより
得られた長さ１．５kb〜６．５kbのサブセットの断片の
挿入を示す図である。反対の向きにズブチリシン３０９
を含んでいる得られる２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ
８６とｐＳｘ８８も公知である。
【図２】図２は、プラスミドｐＳｘ５６へのバシラス・
レンタス株１４７ＤＮＡ断片の挿入を示す図である。Ｓ
ａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼを用いて、株１４７Ｄ
ＮＡを部分的に消化した。次に、サイズが１．５〜６．
５kbの断片を、ＢａｍＨＩ開裂プラスミドｐＳｘ５６に
結合させた。生成物であるｐＳｘ９４はズブチリシン１
４７遺伝子を含有している。
レンタス株１４７ＤＮＡ断片の挿入を示す図である。Ｓ
ａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼを用いて、株１４７Ｄ
ＮＡを部分的に消化した。次に、サイズが１．５〜６．
５kbの断片を、ＢａｍＨＩ開裂プラスミドｐＳｘ５６に
結合させた。生成物であるｐＳｘ９４はズブチリシン１
４７遺伝子を含有している。
【図３】図３は、森永等の方法を用いたギャップ二本鎖
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ９３をＸｂａＩとＣｌａＩで開裂し、そしてギャ
ップ分子を、ＳｃａＩ切断ｐＳｘ９３と混合し、変性
し、そして再アニーリングを行って、ズブチリシン３０
９コード配列内に延びている一本鎖ＤＮＡの領域を有す
るプラスミドを生成する。ズブチリシン３０９遺伝子に
相同であるが変異を含んでいる合成オリゴヌクレオチド
を、一本鎖ギャップに対してアニーリング後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片とＴ４リガーゼを用いて充
填する。プラスミドを複製すると、ズブチリシン３０９
遺伝子の二本鎖変異体が生成する。
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ９３をＸｂａＩとＣｌａＩで開裂し、そしてギャ
ップ分子を、ＳｃａＩ切断ｐＳｘ９３と混合し、変性
し、そして再アニーリングを行って、ズブチリシン３０
９コード配列内に延びている一本鎖ＤＮＡの領域を有す
るプラスミドを生成する。ズブチリシン３０９遺伝子に
相同であるが変異を含んでいる合成オリゴヌクレオチド
を、一本鎖ギャップに対してアニーリング後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片とＴ４リガーゼを用いて充
填する。プラスミドを複製すると、ズブチリシン３０９
遺伝子の二本鎖変異体が生成する。
【図４】図４は、森永等の方法を用いたギャップ二本鎖
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ１１９とＥｃｏＲＩ酵素及びＸｂａＩ酵素を用い
て、同様の操作を行い、ズブチリシン遺伝子３０９の対
応領域に変異を生じさせる。
変異誘発を示す図である〔１９８４年、バイオテクノロ
ジー、２：６３６〜６３９）。この特徴は、ｐｕＣ１３
由来の２種のプラスミド、即ち、ｐＳｘ９３とｐＳｘ１
１９にある。ｐＳｘ９３はズブチリシン３０９遺伝子の
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片を含んでおり、そしてｐＳ
ｘ１１９はＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにおける断片中のズブ
チリシン３０９遺伝子の残部を含んでいる。プラスミド
ｐＳｘ１１９とＥｃｏＲＩ酵素及びＸｂａＩ酵素を用い
て、同様の操作を行い、ズブチリシン遺伝子３０９の対
応領域に変異を生じさせる。
【図５】図５は、ズブチリシン３０９を担持しているプ
ラスミドｐＳｘ６２の誘導体であるプラスミドｐＳｘ９
３を示す図である。適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて変異プラスミドｐＳｘ９３又はｐＳｘ１１９（図３
及び図４参照）から切除した変異断片（即ち、ＸｂａＩ
−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 又はＥｃｏＲＩ−
ＸｂａＩ）をプラスミドｐＳｘ９２に挿入し、枯草菌
（B.subtilis) 株ＤＮ４９７中で発現させた。
ラスミドｐＳｘ６２の誘導体であるプラスミドｐＳｘ９
３を示す図である。適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて変異プラスミドｐＳｘ９３又はｐＳｘ１１９（図３
及び図４参照）から切除した変異断片（即ち、ＸｂａＩ
−ＣｌａＩ，ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 又はＥｃｏＲＩ−
ＸｂａＩ）をプラスミドｐＳｘ９２に挿入し、枯草菌
（B.subtilis) 株ＤＮ４９７中で発現させた。
【図６】図６は、ズブチリシン３０９とズブチリシン１
４７を両方とも切形で含んでいるプラスミドｐＳｘ１４
３を示す図である。２種の遺伝子の相同性領域間の生体
内組み換えにより、活性プロテアーゼを生じさせること
ができる。
４７を両方とも切形で含んでいるプラスミドｐＳｘ１４
３を示す図である。２種の遺伝子の相同性領域間の生体
内組み換えにより、活性プロテアーゼを生じさせること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 スベン ブランネル デンマーク国，デーコー−2800 リング ビ，ベド スメデバッケン ７アー (72)発明者 ファニイ ノリス デンマーク国，デーコー−2900 ヘルレル プ，アールマンス アレ 34 (72)発明者 ステフェン ベー．ペーターセン デンマーク国，デーコー−2750 バルレル プ，スネペホイ 15 (72)発明者 レイフ ネールスコウ−ラウリドゥセン デンマーク国，デーコー−4600 ケーエ, ビルケベイ 10 (72)発明者 ビリ ヨハネス イェンセン デンマーク国，デーコー−2880 バクスバ エルト，スコウキルデン ６ (72)発明者 ドリト アースリング デンマーク国，デーコー−4000 ロスキル デ，スボゲルスレウ，フィアン ８
Claims (18)
- 【請求項１】 突然変異体のズブチリシン酵素（但し、
変異前のズブチリシン酵素がズブチリシン３０９又はズ
ブチリシン１４７である場合を除く）であって、次の位
置：６，９，１１−１２，１９，２５，３６−３８，５
４−５９，６７，６８，７１，８９，１０４，１１１，
１１５，１２０，１２１−１２２，１２４，１２８，１
４０，１５３，１５４，１５６，１５８−１６５，１６
８，１７０，１７２，１７５，１８０，１８２，１８
６，１８７，１９１，１９４，１９５，１９９，２１
９，２２６，２３４−２３８，２４１，２６０−２６
２，２６５，２６８、または２７５の１個所又はそれ以
上の個所でアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換さ
れることにより、又は１種もしくはそれ以上のアミノ酸
残基の挿入もしくは欠失により変化している、前記酵
素。 - 【請求項２】 １種もしくはそれ以上のアミノ酸残基
が、次の位置：３６，５６，１５９または１６４−１６
５の１個所またはそれ以上の個所で挿入されている、請
求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項３】 ６７位の残基が、グルタミン酸もしくは
アスパラギン酸によって置換されている、請求項１に記
載の突然変異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項４】 ６８位の残基が、システインもしくはメ
チオニンで置換されている請求項１に記載の突然変異体
のズブチリシン酵素。 - 【請求項５】 ７１位の残基が、アスパラギン酸もしく
はグルタミン酸で置換されている請求項１に記載の突然
変異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項６】 １６８位の残基が、アラニンで置換され
ている請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵
素。 - 【請求項７】 １７０位の残基が、チロシンによって置
換されている、請求項１に記載の突然変異体のズブチリ
シン酵素。 - 【請求項８】 １９５位の残基が、アスパラギン酸で置
換されている請求項１に記載の突然変異体のズブチリシ
ン酵素。 - 【請求項９】 ２１９位の残基が、メチオニンで置換さ
れている請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵
素。 - 【請求項１０】 １９位の残基が、グリシンで置換さ
れ、さらに２１９位の残基がシステインで置換されてい
る請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項１１】 ２１８位の残基が、セリンで置換され
ている請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵
素。 - 【請求項１２】 ２２２位の残基が、アラニンで置換さ
れている請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵
素。 - 【請求項１３】 ２１９位の残基がシステインで置換さ
れ、さらに２２２位の残基がシステインで置換されてい
る請求項１に記載の突然変異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項１４】 親酵素が、第Ｉ表（ｃ）で記載される
如きアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の突然変
異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項１５】 親酵素が、第Ｉ表（ｄ）で記載される
如きアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の突然変
異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項１６】 親酵素が、第Ｉ表（ｅ）で記載される
如きアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の突然変
異体のズブチリシン酵素。 - 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の変異体ズブチリシンをコードするＤＮＡ。 - 【請求項１８】 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれ
かに記載の変異体ズブチリシン酵素の製造方法であっ
て、該変異体ズブチリシン酵素を発現するために請求項
１７に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細
胞を培養し、次いで変異体ズブチリシン酵素を回収する
ことを特徴とする、前記製造方法。
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