JPH0763377B2 - 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体 - Google Patents
耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体Info
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- JPH0763377B2 JPH0763377B2 JP4262974A JP26297492A JPH0763377B2 JP H0763377 B2 JPH0763377 B2 JP H0763377B2 JP 4262974 A JP4262974 A JP 4262974A JP 26297492 A JP26297492 A JP 26297492A JP H0763377 B2 JPH0763377 B2 JP H0763377B2
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- bacillus subtilis
- heat
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、耐熱アルカリプロテア
ーゼ遺伝子、この耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を組
込んで得られる組換え体プラスミドpABT17、この組換え
体プラスミドpABT17から切出される耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結して得られる枯草
菌プラスミドベクターpABTts14およびその枯草菌プラス
ミドベクターpABTts14を形質転換して得られる形質転換
体に関するものである。
ーゼ遺伝子、この耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を組
込んで得られる組換え体プラスミドpABT17、この組換え
体プラスミドpABT17から切出される耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結して得られる枯草
菌プラスミドベクターpABTts14およびその枯草菌プラス
ミドベクターpABTts14を形質転換して得られる形質転換
体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アルカリプロテアーゼは、タンパク質の
ペプチド結合を特異的に加水分解する酵素であり、食
品，繊維，皮革等の工業において広く利用されている。
また、このアルカリプロテアーゼは、アルカリ性におい
て酵素活性を発揮し、好アルカリ性微生物により生産さ
れることが知られている。
ペプチド結合を特異的に加水分解する酵素であり、食
品，繊維，皮革等の工業において広く利用されている。
また、このアルカリプロテアーゼは、アルカリ性におい
て酵素活性を発揮し、好アルカリ性微生物により生産さ
れることが知られている。
【０００３】前述された好アルカリ性微生物から生産さ
れるアルカリプロテアーゼとして、例えば特公昭62-319
11号公報に記載されているアルカリプロテアーゼＮＦ−
１が知られている。このアルカリプロテアーゼＮＦ−１
はタンパク質のうちの特にゼラチンを良く分解するため
に、例えば特開昭62-160451 号公報に記載されているよ
うに写真フィルムから銀を回収するために用いられてい
る。このアルカリプロテアーゼＮＦ−１を用いる銀の回
収においては、従来の中性微生物により生産されるアル
カリプロテアーゼを用いる銀の回収よりもはるかに高い
回収率で銀を回収することができ、しかもそのアルカリ
プロテアーゼＮＦ−１を繰り返し使用することができ
る。
れるアルカリプロテアーゼとして、例えば特公昭62-319
11号公報に記載されているアルカリプロテアーゼＮＦ−
１が知られている。このアルカリプロテアーゼＮＦ−１
はタンパク質のうちの特にゼラチンを良く分解するため
に、例えば特開昭62-160451 号公報に記載されているよ
うに写真フィルムから銀を回収するために用いられてい
る。このアルカリプロテアーゼＮＦ−１を用いる銀の回
収においては、従来の中性微生物により生産されるアル
カリプロテアーゼを用いる銀の回収よりもはるかに高い
回収率で銀を回収することができ、しかもそのアルカリ
プロテアーゼＮＦ−１を繰り返し使用することができ
る。
【０００４】このアルカリプロテアーゼＮＦ−１のゼラ
チン分解能はそのゼラチン分解反応における反応温度が
高いほど高くなることが判明している。したがって、前
記写真フィルムからの銀の回収の際、温度を高くすれば
アルカリプロテアーゼＮＦ−１の銀の回収力は上昇す
る。
チン分解能はそのゼラチン分解反応における反応温度が
高いほど高くなることが判明している。したがって、前
記写真フィルムからの銀の回収の際、温度を高くすれば
アルカリプロテアーゼＮＦ−１の銀の回収力は上昇す
る。
【０００５】しかしながら、アルカリプロテアーゼＮＦ
−１は高温域においては熱安定性に欠けてその活性が低
下するために、反応温度域が制限されるという問題点が
ある。言い換えれば、このアルカリプロテアーゼＮＦ−
１は、例えばpH10で10分間の処理では、50℃までは安定
であり、60℃で50％の残存活性があり、65℃では完全に
失活するという問題点がある。
−１は高温域においては熱安定性に欠けてその活性が低
下するために、反応温度域が制限されるという問題点が
ある。言い換えれば、このアルカリプロテアーゼＮＦ−
１は、例えばpH10で10分間の処理では、50℃までは安定
であり、60℃で50％の残存活性があり、65℃では完全に
失活するという問題点がある。
【０００６】この問題点を解決するために本発明者らは
特願平3-262094号において、耐熱性に優れかつ高温域に
おいても高いタンパク質分解能を有する耐熱アルカリプ
ロテアーゼを提案している。なお、この耐熱アルカリプ
ロテアーゼは、次の特性を有するものである。分子量：
約30000 、水溶液の紫外線吸収スペクトル：275 〜280n
m に極大吸収、吸光係数（Ｅ１％，１cm，280nm ）：7.
1 、水に可溶、メチルアルコール，エチルアルコール，
アセトンおよびエーテルに不溶、カゼインを基質にした
場合の至適pH：12〜13、2.5mM カルシウムイオン存在下
において40℃，１時間保温した場合にpH５〜12では安定
である。また、カゼインを基質にした場合の至適温度は
10mMカルシウムイオン存在下において85℃であり、pH10
で10分間の処理では60℃までは安定であり、80℃では50
％の残存活性があり、90℃では完全に失活する。さら
に、カルシウムイオンで安定化され、パラクロロマーキ
ュリック安息香酸またはエチレンジアミン四酢酸では失
活せず、ジイソプロピルクロロホスフェートでは失活
し、比活性は4080Ｕ／mgである。
特願平3-262094号において、耐熱性に優れかつ高温域に
おいても高いタンパク質分解能を有する耐熱アルカリプ
ロテアーゼを提案している。なお、この耐熱アルカリプ
ロテアーゼは、次の特性を有するものである。分子量：
約30000 、水溶液の紫外線吸収スペクトル：275 〜280n
m に極大吸収、吸光係数（Ｅ１％，１cm，280nm ）：7.
1 、水に可溶、メチルアルコール，エチルアルコール，
アセトンおよびエーテルに不溶、カゼインを基質にした
場合の至適pH：12〜13、2.5mM カルシウムイオン存在下
において40℃，１時間保温した場合にpH５〜12では安定
である。また、カゼインを基質にした場合の至適温度は
10mMカルシウムイオン存在下において85℃であり、pH10
で10分間の処理では60℃までは安定であり、80℃では50
％の残存活性があり、90℃では完全に失活する。さら
に、カルシウムイオンで安定化され、パラクロロマーキ
ュリック安息香酸またはエチレンジアミン四酢酸では失
活せず、ジイソプロピルクロロホスフェートでは失活
し、比活性は4080Ｕ／mgである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述さ
れた耐熱アルカリプロテアーゼは、アルカリプロテアー
ゼＮＦ−１に比べて比活性に劣るために、同量のタンパ
ク質を分解するにその耐熱アルカリプロテアーゼを多量
に必要とするという問題点がある。なお、前記アルカリ
プロテアーゼＮＦ−１の比活性は9000Ｕ／mgである。
れた耐熱アルカリプロテアーゼは、アルカリプロテアー
ゼＮＦ−１に比べて比活性に劣るために、同量のタンパ
ク質を分解するにその耐熱アルカリプロテアーゼを多量
に必要とするという問題点がある。なお、前記アルカリ
プロテアーゼＮＦ−１の比活性は9000Ｕ／mgである。
【０００８】本発明は、このような問題点を解決するこ
とを目的として、耐熱アルカリプロテアーゼの生産性が
向上される耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体
プラスミドpABT17，枯草菌プラスミドベクターpABTts14
およびその枯草菌プラスミドベクターpABTts14の形質転
換体を提供することである。
とを目的として、耐熱アルカリプロテアーゼの生産性が
向上される耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体
プラスミドpABT17，枯草菌プラスミドベクターpABTts14
およびその枯草菌プラスミドベクターpABTts14の形質転
換体を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス
属に属する微生物により生産される耐熱アルカリプロテ
アーゼの遺伝情報をコードする耐熱アルカリプロテアー
ゼ遺伝子が組込まれた組換え体プラスミドから切出され
る耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
連結して得られる枯草菌プラスミドベクターを形質転換
させ、この形質転換体を培養することにより前記耐熱ア
ルカリプロテアーゼの生産性を向上させることができる
ことを見出した。
属に属する微生物により生産される耐熱アルカリプロテ
アーゼの遺伝情報をコードする耐熱アルカリプロテアー
ゼ遺伝子が組込まれた組換え体プラスミドから切出され
る耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
連結して得られる枯草菌プラスミドベクターを形質転換
させ、この形質転換体を培養することにより前記耐熱ア
ルカリプロテアーゼの生産性を向上させることができる
ことを見出した。
【００１０】こうして、本発明による耐熱アルカリプロ
テアーゼ遺伝子は、下記の配列表の塩基配列で表される
ことを特徴とするものである。
テアーゼ遺伝子は、下記の配列表の塩基配列で表される
ことを特徴とするものである。
【配列表３】
【００１１】前記耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子は、
バチルス属（Bacillus sp.）に属する微生物より生産さ
れる耐熱アルカリプロテアーゼの遺伝情報をコードし得
る。また、前記バチルス属に属する微生物は、Bacillus
sp. B18-1株（微工研菌寄No.12563）であり得る。
バチルス属（Bacillus sp.）に属する微生物より生産さ
れる耐熱アルカリプロテアーゼの遺伝情報をコードし得
る。また、前記バチルス属に属する微生物は、Bacillus
sp. B18-1株（微工研菌寄No.12563）であり得る。
【００１２】なお、前記耐熱アルカリプロテアーゼの特
性は、次の通りであり得る。 （ａ）分子量：約30000 （ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定）、 （ｂ）水溶液の紫外線吸収スペクトル：極大吸収は275
〜280nm 、 （ｃ）吸光係数（Ｅ１％，１cm，280nm ）：7.1 、 （ｄ）溶解性：水に可溶、メチルアルコール，エチルア
ルコール，アセトンおよびエーテルに不溶、 （ｅ）カゼインを基質にした場合の至適pH：12〜13、 （ｆ）pH安定性：2.5mM カルシウムイオン存在下におい
て、40℃，１時間保温した場合、pH５〜12で安定、 （ｇ）カゼインを基質にした場合の至適温度：10mMカル
シウムイオン存在下において85℃、 （ｈ）熱安定性：pH10で10分間の処理では60℃までは安
定であり、80℃では50％の残存活性があり、90℃では完
全に失活、 （ｉ）安定化および阻害：カルシウムイオンで安定化さ
れ、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリック安息香酸）ま
たはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では失活せ
ず、ＤＥＰ（ジイソプロピルクロロホスフェート）では
失活、 （ｊ）比活性：4080Ｕ／mg。
性は、次の通りであり得る。 （ａ）分子量：約30000 （ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定）、 （ｂ）水溶液の紫外線吸収スペクトル：極大吸収は275
〜280nm 、 （ｃ）吸光係数（Ｅ１％，１cm，280nm ）：7.1 、 （ｄ）溶解性：水に可溶、メチルアルコール，エチルア
ルコール，アセトンおよびエーテルに不溶、 （ｅ）カゼインを基質にした場合の至適pH：12〜13、 （ｆ）pH安定性：2.5mM カルシウムイオン存在下におい
て、40℃，１時間保温した場合、pH５〜12で安定、 （ｇ）カゼインを基質にした場合の至適温度：10mMカル
シウムイオン存在下において85℃、 （ｈ）熱安定性：pH10で10分間の処理では60℃までは安
定であり、80℃では50％の残存活性があり、90℃では完
全に失活、 （ｉ）安定化および阻害：カルシウムイオンで安定化さ
れ、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリック安息香酸）ま
たはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では失活せ
ず、ＤＥＰ（ジイソプロピルクロロホスフェート）では
失活、 （ｊ）比活性：4080Ｕ／mg。
【００１３】一方、本発明による組換え体プラスミドpA
BT17は、前述の塩基配列で表される耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を大腸菌プラスミドpBR322に組込んで得ら
れることを特徴とするものである。
BT17は、前述の塩基配列で表される耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を大腸菌プラスミドpBR322に組込んで得ら
れることを特徴とするものである。
【００１４】また、本発明による枯草菌プラスミドベク
ターpABTts14は、前記組換え体プラスミドpABT17から切
出される耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を枯草菌の発現ベクターpISAts412 に図１に示され
る制限開裂地図で連結して得られることを特徴とするも
のである。
ターpABTts14は、前記組換え体プラスミドpABT17から切
出される耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を枯草菌の発現ベクターpISAts412 に図１に示され
る制限開裂地図で連結して得られることを特徴とするも
のである。
【００１５】さらに、本発明による形質転換体は、前記
枯草菌プラスミドベクターpABTts14をアルカリプロテア
ーゼおよび／または中性プロテアーゼの欠損株を宿主と
して形質転換して得られることを特徴とするものであ
る。
枯草菌プラスミドベクターpABTts14をアルカリプロテア
ーゼおよび／または中性プロテアーゼの欠損株を宿主と
して形質転換して得られることを特徴とするものであ
る。
【００１６】
【作用】本発明における耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝
子の供与体を、例えばバチルス属（Bacillus sp.）に属
する微生物から単離精製する。このバチルス属に属する
微生物としては、例えばBacillus sp. B18-1株（微工研
菌寄No.12563）を用い、このBacillus sp. B18-1株は19
92年４月２日の日本農芸化学会大会において本発明者ら
により”Bacillus sp. B18' 由来の耐熱・耐アルカリ性
プロテアーゼ遺伝子のクローニングと塩基配列の解析”
においてBacillus sp. B18' と発表された菌株である。
この菌株（Bacillus sp. B18-1株）から染色体ＤＮＡを
抽出し、この抽出された染色体ＤＮＡを用いて染色体Ｄ
ＮＡジーンライブラリーを作製する。次に、この染色体
ＤＮＡジーンライブラリーからの耐熱アルカリプロテア
ーゼ遺伝子のクローニングを行う。次いで、この耐熱ア
ルカリプロテアーゼ遺伝子を大腸菌プラスミドに組込ん
で組換え体プラスミドを得、この組換え体プラスミドか
ら切出される耐熱アルカリプロテアーゼを含むＤＮＡ断
片を枯草菌の発現ベクターに連結して枯草菌プラスミド
ベクターを得る。最後に、この枯草菌プラスミドベクタ
ーをアルカリプロテアーゼおよび／または中性プロテア
ーゼの欠損株を宿主として形質転換させて形質転換体を
得る。
子の供与体を、例えばバチルス属（Bacillus sp.）に属
する微生物から単離精製する。このバチルス属に属する
微生物としては、例えばBacillus sp. B18-1株（微工研
菌寄No.12563）を用い、このBacillus sp. B18-1株は19
92年４月２日の日本農芸化学会大会において本発明者ら
により”Bacillus sp. B18' 由来の耐熱・耐アルカリ性
プロテアーゼ遺伝子のクローニングと塩基配列の解析”
においてBacillus sp. B18' と発表された菌株である。
この菌株（Bacillus sp. B18-1株）から染色体ＤＮＡを
抽出し、この抽出された染色体ＤＮＡを用いて染色体Ｄ
ＮＡジーンライブラリーを作製する。次に、この染色体
ＤＮＡジーンライブラリーからの耐熱アルカリプロテア
ーゼ遺伝子のクローニングを行う。次いで、この耐熱ア
ルカリプロテアーゼ遺伝子を大腸菌プラスミドに組込ん
で組換え体プラスミドを得、この組換え体プラスミドか
ら切出される耐熱アルカリプロテアーゼを含むＤＮＡ断
片を枯草菌の発現ベクターに連結して枯草菌プラスミド
ベクターを得る。最後に、この枯草菌プラスミドベクタ
ーをアルカリプロテアーゼおよび／または中性プロテア
ーゼの欠損株を宿主として形質転換させて形質転換体を
得る。
【００１７】
【実施例】次に、本発明による形質転換体の作製の具体
的な一実施例について図面を参照しつつ説明する。な
お、図１は、本発明による形質転換体である枯草菌にお
けるベクタープラスミドの作製図である。
的な一実施例について図面を参照しつつ説明する。な
お、図１は、本発明による形質転換体である枯草菌にお
けるベクタープラスミドの作製図である。
【００１８】・染色体ＤＮＡジーンライブラリーの作製 まず、Bacillus sp.B18-1 株の染色体ＤＮＡを、次のよ
うに調整する。Bacillus sp. B18-1株を、100ml Ｌ培地
（トリプトン，イーストエキストラクトおよびＮａＣｌ
を含む培地）を含む500ml 容フラスコ内で一夜、37℃で
培養した後、遠心分離する。この遠心分離により得られ
た固形分を10mlのＴＥ緩衝液（トリス(50mM)−ＥＤＴＡ
(50mM)；pH8.0 ）で洗浄した後、３mlのしょ糖( 15％)
−トリス(50mM,pH8.0)−ＥＤＴＡ(50mM)−リゾチーム(5
mg/ml)に懸濁して、37℃で30min 放置する。この後、３
mlの１％ザルコシル−トリス(50mM,pH8.0)−ＥＤＴＡ(5
0mM)を添加して混合する。次いで、5.4gのＣｓＣｌと
0.3mlのエチジウムブロマイド液(10mg/ml) とを加えた
後、超遠心機で遠心分離する。この超遠心機による遠心
分離終了後、ＤＮＡ区分を注射器で抜き取り、この抜き
取ったＤＮＡ区分に対してｎ−ブタノールで３回抽出を
繰り返して前記エチジウムブロマイドをそのＤＮＡ区分
から除去する。このエチジウムブロマイドが除去された
ＤＮＡ区分（以下、染色体ＤＮＡと表記する。）をトリ
ス(10mM,pH7.5)−ＥＤＴＡ(0.1mM) 中で透析して４℃で
保存する。次に、この得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
Hind III（以下、Hind IIIと表記する。）で分解してフ
ェノール処理したものと、例えば大腸菌プラスミドpBR3
22を同様にHind IIIで分解してフェノール処理したもの
（前記分解された染色体ＤＮＡと同じ接着末端を有す
る。）とをＴ４リガーゼにより連結してプラスミドを得
る。このプラスミドを例えば大腸菌（E.coli）JM109 に
トランスフェクションすることにより染色体ＤＮＡジー
ンライブラリーを作製する。
うに調整する。Bacillus sp. B18-1株を、100ml Ｌ培地
（トリプトン，イーストエキストラクトおよびＮａＣｌ
を含む培地）を含む500ml 容フラスコ内で一夜、37℃で
培養した後、遠心分離する。この遠心分離により得られ
た固形分を10mlのＴＥ緩衝液（トリス(50mM)−ＥＤＴＡ
(50mM)；pH8.0 ）で洗浄した後、３mlのしょ糖( 15％)
−トリス(50mM,pH8.0)−ＥＤＴＡ(50mM)−リゾチーム(5
mg/ml)に懸濁して、37℃で30min 放置する。この後、３
mlの１％ザルコシル−トリス(50mM,pH8.0)−ＥＤＴＡ(5
0mM)を添加して混合する。次いで、5.4gのＣｓＣｌと
0.3mlのエチジウムブロマイド液(10mg/ml) とを加えた
後、超遠心機で遠心分離する。この超遠心機による遠心
分離終了後、ＤＮＡ区分を注射器で抜き取り、この抜き
取ったＤＮＡ区分に対してｎ−ブタノールで３回抽出を
繰り返して前記エチジウムブロマイドをそのＤＮＡ区分
から除去する。このエチジウムブロマイドが除去された
ＤＮＡ区分（以下、染色体ＤＮＡと表記する。）をトリ
ス(10mM,pH7.5)−ＥＤＴＡ(0.1mM) 中で透析して４℃で
保存する。次に、この得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
Hind III（以下、Hind IIIと表記する。）で分解してフ
ェノール処理したものと、例えば大腸菌プラスミドpBR3
22を同様にHind IIIで分解してフェノール処理したもの
（前記分解された染色体ＤＮＡと同じ接着末端を有す
る。）とをＴ４リガーゼにより連結してプラスミドを得
る。このプラスミドを例えば大腸菌（E.coli）JM109 に
トランスフェクションすることにより染色体ＤＮＡジー
ンライブラリーを作製する。
【００１９】・染色体ＤＮＡジーンライブラリーからの
Bacillus sp. B18-1株由来の耐熱アルカリプロテアーゼ
遺伝子のクローニング 前記染色体ＤＮＡジーンライブラリーに保存された大腸
菌のコロニー形成後、コロニーハイブリダイゼーション
により耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むクローン
の選択を行う。この一連の操作は常法（ Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)）による
ものであって、コロニーハイブリダイゼーションに用い
られるプローブは、次の塩基配列を持つ合成ＤＮＡオリ
ゴマー(26mer) を32Ｐにより放射能識別したものであ
る。 5'CC(G/A/T/C)TGGGG(G/A/T/C)A T(A/T/C)TC(G/A/T/C)TT(T/C)AT 20 (A/T/C)AA(T/C)AC3' 26 なお、この合成ＤＮＡオリゴマーは、前記Bacillus sp.
B18-1株より精製された耐熱アルカリプロテアーゼのＮ
末端アミノ酸配列（日本農芸化学会誌、66〔３〕（平成
４年３月５日）p.262 社団法人日本農芸化学会）に基づ
いて作製されたものである（前記配列表参照）。このよ
うにして、約1000個のコロニーからプローブにハイブリ
ダイゼーションする１個のクローンを選択する。
Bacillus sp. B18-1株由来の耐熱アルカリプロテアーゼ
遺伝子のクローニング 前記染色体ＤＮＡジーンライブラリーに保存された大腸
菌のコロニー形成後、コロニーハイブリダイゼーション
により耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むクローン
の選択を行う。この一連の操作は常法（ Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)）による
ものであって、コロニーハイブリダイゼーションに用い
られるプローブは、次の塩基配列を持つ合成ＤＮＡオリ
ゴマー(26mer) を32Ｐにより放射能識別したものであ
る。 5'CC(G/A/T/C)TGGGG(G/A/T/C)A T(A/T/C)TC(G/A/T/C)TT(T/C)AT 20 (A/T/C)AA(T/C)AC3' 26 なお、この合成ＤＮＡオリゴマーは、前記Bacillus sp.
B18-1株より精製された耐熱アルカリプロテアーゼのＮ
末端アミノ酸配列（日本農芸化学会誌、66〔３〕（平成
４年３月５日）p.262 社団法人日本農芸化学会）に基づ
いて作製されたものである（前記配列表参照）。このよ
うにして、約1000個のコロニーからプローブにハイブリ
ダイゼーションする１個のクローンを選択する。
【００２０】ここで、この選択されたクローン中に挿入
されているBacillus sp. B18-1株由来の染色体ＤＮＡは
耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子のＮ末端を含んでいた
がＣ末端を含んでいないことが確認されたために、更に
前記クローン中に挿入されている染色体ＤＮＡを用いて
プローブを作製して、同様にコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。このようにして、耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子のクローニングを行い、大腸菌プラスミド
pBR322に耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子が挿入された
組換え体プラスミドpABT17を得る。
されているBacillus sp. B18-1株由来の染色体ＤＮＡは
耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子のＮ末端を含んでいた
がＣ末端を含んでいないことが確認されたために、更に
前記クローン中に挿入されている染色体ＤＮＡを用いて
プローブを作製して、同様にコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。このようにして、耐熱アルカリプロテ
アーゼ遺伝子のクローニングを行い、大腸菌プラスミド
pBR322に耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子が挿入された
組換え体プラスミドpABT17を得る。
【００２１】・耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子の枯草
菌ベクターへの導入と枯草菌への形質転換 組換え体プラスミドpABT17から制限酵素EcoRI と制限酵
素DraIとにより切出される耐熱アルカリプロテアーゼ遺
伝子が含まれる1.4kb のＤＮＡ断片をブランティング処
理する。このブランティング処理されたＤＮＡ断片を例
えば枯草菌の発現ベクターpISAts412 にＴ４ＤＮリガー
ゼを用いて連結することにより枯草菌プラスミドベクタ
ーpABTts14を得る。この枯草菌プラスミドベクターpABT
ts14の枯草菌への形質転換は、宿主としてアルカリプロ
テアーゼおよび中性プロテアーゼ両欠損株であるバチル
ス ズブチリス（Bacillus subtilis ）DB104 株（Jour
nal of Bacteriology, 160〔 442〕,(1984) ）と、中性
プロテアーゼの欠損株であるバチルス ズブチリスMT-2
株（Journal of Bacteriology, 154〔831-837 〕,(198
3) ）とを用いてスピザイゼンの方法（Journal of Bact
eriology,81〔741-746 〕,(1961) ）により行った。こ
の形質転換体を25μg/mlテトラサイクリンとガゼインと
を含む寒天プレートに塗布し、37℃で一夜培養し、ハロ
ーを形成するコロニーを取得する。
菌ベクターへの導入と枯草菌への形質転換 組換え体プラスミドpABT17から制限酵素EcoRI と制限酵
素DraIとにより切出される耐熱アルカリプロテアーゼ遺
伝子が含まれる1.4kb のＤＮＡ断片をブランティング処
理する。このブランティング処理されたＤＮＡ断片を例
えば枯草菌の発現ベクターpISAts412 にＴ４ＤＮリガー
ゼを用いて連結することにより枯草菌プラスミドベクタ
ーpABTts14を得る。この枯草菌プラスミドベクターpABT
ts14の枯草菌への形質転換は、宿主としてアルカリプロ
テアーゼおよび中性プロテアーゼ両欠損株であるバチル
ス ズブチリス（Bacillus subtilis ）DB104 株（Jour
nal of Bacteriology, 160〔 442〕,(1984) ）と、中性
プロテアーゼの欠損株であるバチルス ズブチリスMT-2
株（Journal of Bacteriology, 154〔831-837 〕,(198
3) ）とを用いてスピザイゼンの方法（Journal of Bact
eriology,81〔741-746 〕,(1961) ）により行った。こ
の形質転換体を25μg/mlテトラサイクリンとガゼインと
を含む寒天プレートに塗布し、37℃で一夜培養し、ハロ
ーを形成するコロニーを取得する。
【００２２】・耐熱アルカリプロテアーゼの枯草菌にお
ける生産 枯草菌プラスミドベクターpABTts14を保持するバチルス
ズブチリスDB104 株およびバチルス ズブチリスMT-2
株それぞれを、25μg/mlテトラサイクリンを含むＬ培地
において培養し、元株であるBacillus sp. B18-1株と耐
熱アルカリプロテアーゼの生産性の比較を行った。この
結果、全蛋白量あたりのプロテアーゼ活性は、元株が
0.9ユニットであったのに対して、バチルス ズブチリ
スDB104 株が 5.5ユニット、バチルス ズブチリスMT-2
株が 3.5ユニットであり、生産性の増大が見られた。な
お、プロテアーゼ活性の測定は Amoryの方法（Journal
of Bacteriology, 169〔324-333 〕,(1987) ）に基づい
て行ったものであり、 440nmにおける 0.1の吸収の増加
を酵素活性の１ユニットとして表示する。
ける生産 枯草菌プラスミドベクターpABTts14を保持するバチルス
ズブチリスDB104 株およびバチルス ズブチリスMT-2
株それぞれを、25μg/mlテトラサイクリンを含むＬ培地
において培養し、元株であるBacillus sp. B18-1株と耐
熱アルカリプロテアーゼの生産性の比較を行った。この
結果、全蛋白量あたりのプロテアーゼ活性は、元株が
0.9ユニットであったのに対して、バチルス ズブチリ
スDB104 株が 5.5ユニット、バチルス ズブチリスMT-2
株が 3.5ユニットであり、生産性の増大が見られた。な
お、プロテアーゼ活性の測定は Amoryの方法（Journal
of Bacteriology, 169〔324-333 〕,(1987) ）に基づい
て行ったものであり、 440nmにおける 0.1の吸収の増加
を酵素活性の１ユニットとして表示する。
【００２３】
【発明の効果】以上のように本発明によれば、耐熱性に
優れるとともに高温域においても高いタンパク質分解能
を有する耐熱アルカリプロテアーゼの生産性を向上させ
ることができる。
優れるとともに高温域においても高いタンパク質分解能
を有する耐熱アルカリプロテアーゼの生産性を向上させ
ることができる。
【図１】本発明の一実施例にかかる枯草菌におけるベク
タープラスミドの作製図である。
タープラスミドの作製図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 堅田 勉 大阪府大阪市淀川区加島４丁目６番23号 日本化学機械製造株式会社内
Claims (9)
- 【請求項１】 下記の塩基配列で表されることを特徴と
する耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子。 【配列表１】 - 【請求項２】 当該耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子
は、バチルス属（Bacillus sp.）に属する微生物により
生産される耐熱アルカリプロテアーゼの遺伝情報をコー
ドすることを特徴とする請求項１に記載の耐熱アルカリ
プロテアーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 前記バチルス属に属する微生物は、Baci
llus sp. B18-1株（微工研菌寄No.12563）であることを
特徴とする請求項２に記載の耐熱アルカリプロテアーゼ
遺伝子。 - 【請求項４】 前記耐熱アルカリプロテアーゼは、下記
の特性を有することを特徴とする請求項２または３に記
載の耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子。 （ａ）分子量：約30000 （ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定）、 （ｂ）水溶液の紫外線吸収スペクトル：極大吸収は275
〜280nm 、 （ｃ）吸光係数（Ｅ１％，１cm，280nm ）：7.1 、 （ｄ）溶解性：水に可溶、メチルアルコール，エチルア
ルコール，アセトンおよびエーテルに不溶、 （ｅ）カゼインを基質にした場合の至適pH：12〜13、 （ｆ）pH安定性：2.5mM カルシウムイオン存在下におい
て、40℃，１時間保温した場合、pH５〜12で安定、 （ｇ）カゼインを基質にした場合の至適温度：10mMカル
シウムイオン存在下において85℃、 （ｈ）熱安定性：pH10で10分間の処理では60℃までは安
定であり、80℃では50％の残存活性があり、90℃では完
全に失活、 （ｉ）安定化および阻害：カルシウムイオンで安定化さ
れ、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリック安息香酸）ま
たはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では失活せ
ず、ＤＥＰ（ジイソプロピルクロロホスフェート）では
失活、 （ｊ）比活性：4080Ｕ／mg。 - 【請求項５】 下記の塩基配列で表される耐熱アルカリ
プロテアーゼ遺伝子を大腸菌プラスミドpBR322に組込ん
で得られることを特徴とする組換え体プラスミドpABT1
7。 【配列表２】 - 【請求項６】 組換え体プラスミドpABT17から切出され
る耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
枯草菌の発現ベクターpISAts412 に、下記で示される制
限開裂地図で連結して得られることを特徴とする枯草菌
プラスミドベクターpABTts14。 【表１】 - 【請求項７】 枯草菌プラスミドベクターpABTts14をア
ルカリプロテアーゼおよび／または中性プロテアーゼの
欠損株を宿主として形質転換して得られることを特徴と
する形質転換体。 - 【請求項８】 前記アルカリプロテアーゼおよび中性プ
ロテアーゼの両欠損株の宿主として、バチルス ズブチ
リスDB104 株を用いることを特徴とする請求項７に記載
の形質転換体。 - 【請求項９】 前記中性プロテアーゼの欠損株の宿主と
して、バチルス ズブチリスMT-2株を用いることを特徴
とする請求項７に記載の形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4262974A JPH0763377B2 (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4262974A JPH0763377B2 (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678778A JPH0678778A (ja) | 1994-03-22 |
| JPH0763377B2 true JPH0763377B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=17383140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4262974A Expired - Fee Related JPH0763377B2 (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 耐熱アルカリプロテアーゼ遺伝子、組換え体プラスミドｐＡＢＴ１７、枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４およびその枯草菌プラスミドベクターｐＡＢＴｔｓ１４の形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0763377B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
-
1992
- 1992-09-03 JP JP4262974A patent/JPH0763377B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0678778A (ja) | 1994-03-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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