TW393489B - Recombinant antibodies for human therapy - Google Patents

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五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央橾準局負工消费合作社印裝 用於人類治療之重组抗體 發阴範園：本申謓案為紐曼等人的部分延_ (Hew®ar> et. a Π ，其 為美國專利應用系列第07/856,281號，於1992.03.23.建 檔，同時，其亦為美國專利應用糸列第〇 7 / 7 3 5 , 0 6 4號的部 分延續，此建檔於1 9 9 I . 0 7 . 2 5 .，這些專利案倒，包含繪 圖，均列為本發明之參考文獻。本發明乃關於用於人類治 療的電姐抗體，及此類抗體之生產方法。 發阴背暑 鼠類單株抗鸦被用於人類疾病診治和解決基本的生物研 究問題。這些試劑亦同時用於臨肿試驗，如慢性和急性人 類病症的治療，如：白血病•稱巴癌，固體腫瘤（例：直 曝，乳房*肝臟之腾瘤)，ATDS和自髑.免疫病症。 被創造出的老鼠/人類嵌合抗體顯示具有原老鼠抗髏的 结合特性和结合了人類固定區後的有效功能。例見’·卡白 利等人（C a b i 1 U e t. a ί .)美國專利4 , 8 1 6 , 5 6 7 ;匈曼克 等人（S h o e m a k e r e t . a i .)美國專利4 , 9 7 8 , 7 4 5 ;畢佛等 人（Β e a ν e「s e t. a 1 .)美國專利4 , 9 7 5 , 3 6 9 ;和伯斯等人 (Β o s s e t . a 1 .)美國專利4 , 8 1 β , 3 9 7 ;這些均列入本篇 之參考文獻。一般而言，這些重組抗體乃由已存在的鼠類 難合瘤萃取D Ν Α製筒之基因庫而構築得。尼西木拉等人 (Ν ΐ s h i m u r a e t. a l . )47癌症研究（Cancer Research) 9 9 9 ，1 9 8 7。將此基因庫K表現正確抗體K段 --------j. — 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .4:線 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公嫠） 83. 3.10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 组合型式的窜鍵和羥鐽蒒選可變區基因。將選殖所得的可 變區棊因殖人表琨載體，此載體中巳包括適宜的人類重鍵 或鞔踺固定區基因之選殖匣。將此嵌合基因於所.選的綑胞 株屮表現，通常為鼠類骨癌细跑株。 此類嵌合抗體曾陂用於人類治療。然而，對抗.此類嵌合 抗體的抗髏曾在許多荼例由人類接受者產生3這櫂抗一嵌 含抗體的抗體將會阻礙K联合抗體治療的持續性： · 7 理奇等人（ε「1 i c h e t a 1 )，3 4，臨牀化學(Clinical . Chemistry) 16 81，1 9 8 8，7 理奇等人（E r i i c h e t a 1)，7 ，融含瘤（Η V h r i d 0 m a ) 3 8 5，1 9 8 8，x 理奇等人（E r i i c h e r. a ! )，6 ，融合瘤 1 51 ，1 9 8 7，K 及 >：；理奇等人，1 k 類杭.轉融含摇(Human Antibody Hvbridomas) 2 3 · 1 990 ( ft 本篇應用而言，並不為先前之技術)描述人類單株抗髏被 認為在體闪人類治療上比老r單株抗體為佳：他們也假設 非人類之靈長類抗髏，如：黑挥猩單株抗體，由於其结構 與人類抗體相當接近，因此在人體中可被接受。因為人類 抗體在雷瑟斯猴中（Rhesus monkey )不具免疫性（即，不 引發抗髏反應〉> 他們預測靈長類抗體在人體中也不具免 疫性。他們指岀若靈長類抗體與人類免疫球蛋白具有相同 的固定區域结構，或，至少其差異性較人類彼此之免疫球 蛋白差異性小，則，於人體中測試此杭髏是不需要的。所 Μ，他們認為黑猩猩抗體可用於人類治療上。 (請先閱讀背面之注意事\填寫本頁 裝 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4洗格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 發明摘要： 本發明乃關於收大及選殖舊世紀堠子（此處指“堠類” ，洌：彿彿或诵猴！免疫球蛋白可變區域之抗原结合部分 編碼基因*將此基因與選殖之人類，黑猩猩或其他猴類固 定區域編碼基因融合（若需要，與人類，黑梶猩或其他猴 子外園編fig基因），和將其表琨為人/猴重组抗體，或完 整的猴類熏組抗體。更甚者，本發明乃關於這$重組抗髀 (此名稱包拮韬將來自二種不同抗體基因的D Η A融含所產 _ 一 生的抗髑，不論來自同榑，例：二棟不同的候抗聘基因* 如：R h e s u s和C y η 〇 m ο 1 g u s猴，而得的候-候重姐抗體）作 為人類疾病治療的免疫診療試劑之用途。本發明乃莘於此 發現：演化上相距的猴類（例：彿彿或獮候（含： c y η 〇 m ο 1 〇 g u s，和R h e s u s猴）），與黑握猩不同的是，不僅 足R與人類不同而在這些堠禮内產生對抗人類抗原的抗體 (即使是相對應固定區域的人類抗原，例C D 4和C D 5 4 )，也 足Μ相似到產生與人類抗體極相近的抗體，因此，當這呰 猴類抗體或由其衍生之重組抗體使用於人類時不產生宿主 抗-抗髑免疫反應。 與先前使用於人類治療抗體不同的是，本發明中抗體不 含下列的缺點，例：⑴作慢性診治時，重複注射此抗髏至 人體内不引發人類抗一抗體（H A A )反應的免疫性* (.2)與人 類抗髏相較之下具較短的半生期，（3)與人體细胞或補體相 - 反應時缺乏效應功能。沒有這些缺點乃是利用本發明中抗 體做人類診療的優勢。例如，於慢性人類疾病中，包括自 .^ί —^1 » 111 ---.--1 - 1^, -1— 士·----- H (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .11 Λ 線 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐〉 83. 3.10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 磚免疫疾病，或任何需長期葩用此抗體的疾病，對於€覆 便用抗賻治療最大的障礙即為宿王對治療抗體的免疫反應 •'對不同患者之間Η A 反應的發生是很難預潮的.。這類反 應主要針對抗體分子的固足區域，雖然，不是唯一的地方 ，一a發生之浚將會排斥或降低Μ此抗體或同此異型 (i s 〇 t: y p e )的抗體治療的功效。 - Η Α ί\的問題有可能藉使用人類單株抗體而克$。然而，· lit趨勢’ 15_涉δ於人11中給予各題抗原ί伊丨’人類抗原’〜 此名稱表示任何蛋白質，胜狀或其於人體中出琨的相似物 具抗原性或免疫性的部分）來產生抗體，故面臨倫埋，臨 床和免授學限制之桃戰。用以克服這問題的應用趨勢，包 栝產生具適當的專一性和所需功效的抗體，Μ及用此抗體 生產輋姐抗鵂。這搏重姐抗髏一般含由被免疫的猴鹘中得 到抗餺的可變區適宜部份和由"'人類或黑猩猩中獲得抗賻的 固定區。因此，單株抗體的專一性和高親和性被保存，涇 由人類或黑猩猩固定區域所表現的所需效應子功能也被選 取。 本發明更基於一放大猴類免疫球蛋白基因的方法，例： 藉聚合酶鎖鏈反應（P C R )，由猴類白血球中取岀之R Η A ， 以合成具專一性的寡聚核苷酸引子對重和輕链多麥異基因 族反應。將被放大的基因或適宜的部分（例：補體決定區 域（C D R )—編碼區域；見溫德，大英專利應用第G B 2 1 S 8 i3 3 8 A號，亦列入本«之參考文獻）選殖入表現載體中， 其含有人類或黑猩猩固定區域基因Μ生產猴類/人類重組 ---------裝_ (請先閱讀背面之注意事/ 填寫本頁 訂 線 本紙張尺度適用申國國家梂準（CNS ) Α4規^ ( 210X297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央標準局属工消費合作社印製 抗_，或含有堠類固定區域基因K生產完整的猴所需的同 梨蓽組抗體。這些抗體表琨了於髏内给予之後可定位及/ 或殺死E確的目標细胞（洌：瘤细胞）的免疫翳療試劑= 因此，苜先 > 本發明指出將堠抗體基因中可愛區之抗原 辨認部位選殖的方法。此方法包括提供核酸，例：由猴而 得的R N A ，將R Η i\轉為C I) Η A (利用逆轉錄_ )，提供與编碼 5 ’抗餺基因引導序列之C D N A序列亙補的引子，將C 13 N A與引 子接觸後生成雜交複合物並且將此CDNA放大產生編碼候子 一 抗體荜因可赛區的核酸。 “抗原-辨認部位”表示於猴子抗賴的可變區域的一或 多涸部分•其在抗髏中負貴结合和/或辨認目榑抗原（或 e p U 〇 p e或原栈型）。洌如：其包括了 C D R區域（如下 )或完祭的變異區域，或此二區域的结合包括在密碼區任 何的奰化可引發使此區域與人''類更相近而非與猴類更相近 *但，卻不改變抗餺的專一性结.'合特性者。若只有完整變 異區域的部分被使用，而餘下的部分，洌：所諝的“外圍 ”，乃由其他抗體所提供*較佳的由人類或黑猩猩抗體（ 如下）並且如上述技術被列入本篇參考文獻。 名稱“可變區域”，“引導序列” * “固定區域”和“ 外圍” Μ其平常的名稱來使用，其實例列於下文及上述技 術內容並列人太篇之參考文獻。 於較佳具體實例中，引導序列為人類，黑獲猩或堠類引 導序列約6 0個鹸基，例見圖1 。 电請者曾發琨猴類，黑猩猩和人類可變區域引導序列相 ----^------參-- (請先閲讀背面之注意事/ 填寫本頁) 訂 線 本紙張尺度逍用中囷國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印袈 當地相Μ，為了其中一挿設計的引子可適用於其他揷類的 放大。 此方法中，RNA被故大至足Μ產生足夠的核酸，並得Κ 將此核酸作為接下夾的轉殖用。 第二，本發明指出生產對抗人類抗原的抗體的方法，此 抗體在人體中不具免疫性。此法涉及於堠中取得對抗人類 抗原之猴抗髑*並分離出編碼猴抗髑中可赛區j充原-辨認· 部分的堠核酸。將所提供的含人類抗體固定區域的密碼核_. —- ·， 酸與猴類核酸接連而生成嫿組核酸。將此秉姐核酸表琨齑 生所希望的杭髀。另外，也可用黑猩猩或堠類固定區域调 碼核酸來生成重钼抗體。人類與黑挥獨在固足區域的胺苺 酸序列上只有很少的差異（即，他們為同源）*同時，若將 猴類固定區域核酸用來組成重组沆體也可利用標進技術將 猴類與人類之間的差異改掉^本發明中最重要的一點為所 產生的抗體必須較猴類固定區域有更低的免疫性W確保當 重组抗體使用於人髑内時不會有任何嚴電的免疫反懕發生 。（此抗體區域於此處被指為同源區域）。所K，重組抗 體被設計為與人類抗體在胺基酸序列上有相同的功能，即 :其與人類或黑猩猩有同:淤的抗體固定區域*整鵂而言> 此抗體必須如同人類抗體*可降低對此抗體所產生的不必 要免疫反.應，並含有猴類抗體抗原结合部位。 “非免疫性”表示抗體不會引起足夠的抗體反應*足Μ 降低在大部分人體中Κ連缜使用抗體達到足夠時間Κ得療 效的有效性，例，與鼠類或鼠類-人類重組抗體相較。較 ---------裝------訂-----71線ί 「 (請先閱讀背面之注意事命填寫本頁) 本紙張尺度適用申國國家株率（〔阳）戍4規格（210><297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 佳地，妝未観察到抗體反應： 較具體而言，此方法包祜不朽化產生堠類抗體的細胞， 洌：藉融合瘤融合，K Heroes p a p i o 病毒鹑肜，單一 B 细胞選殖（又稱為“暫時不朽化” ），Μ及產生重姐免疫球 蛋白基因蓮。更具體而言*此法包含由猴類周邊血液白血 球，脾_，骨髓或淋巴结中蒒選Β细胞；選擇產生合適抗 體的選殖株；由不朽化细胞株中選出含杭體的免疫球蛋白 苺因；並於生產细胞株中再表琨此基因（即•生產缃胞株 一 表示可引起生產足夠抗體用於人類治療的細胞株）。 第三，本發明表示出重組抗體由人類或黑搾猩固定區域 和堠子可雯區域的抗原结合部份生成，或由第一猴子固足 區域，和第二，不同的猴類可變區之抗原辨認部位生成： 相關地，本發明亦顯出藉不朽化猴類Β -湘胞產生對抗人 類抗原之望株抗體，或卩a b，（卩3 b ) 2 ，鞔键或重鍵雙體， 或任何的最小貢組片段，如卩v或S C A (單一璉抗體）或其 他的兔疫活性片段（例，C D K -區域）。此類片段可做為免疫 抑制劑。另外，本發明之抗體可接於效應子或報告分子上 。例如，本發明中之抗體可含有一大環，可用於鉗合重金 臑原子或毒素，如：蓖麻毒素.，藉共價橋结搆接觸。另外 ，F c片段或完整抗體分子的C Η 3域可K酵素或毒素分子取 代，同時，部分免疫球蛋白鍵可鍵结於多胜駄效應子或受 體分子。雙專一性抗體也可藉標準程序建造。 另一方面，本發明亦表示了藥劑组成，其中發明中抗體 (請先閱讀背面之注意事/.填寫本頁 裝- •V5 線 本紙張尺度適用申國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部中央標準局男工消费合作社印装 ?玻用於治療及預防用途。壯類抗體也被用為免疫毒素，即 ，κ二桶姐成分特邀化的分子 > 特別被用於在活聘闪或活 賵外殺死所選擇的细胞。其中一姐成分為细胞毒.素試劏， 當接觸到细胞或被細胞吸收浚可使细跑致死：第二禅组成 分·被解為“傅送媒介”，則提供將毒素試劑傳送至持定 细胞的方法，如··致癌细胞。這二榫姐成分被K熟知的化 學或基因稃序將其Μ化學性鍵结一起。例如，；i细胞毒素· 試劑為蛋白質而第二個姐成分為完整的免疫球蛋白，其連一 . — · · · 接可由異雙功能交互連结子，洌：碳化二亞胺*戊二酸盏 及其類似物。多搏免疫毒素的生斋熟知為本發明中： 相關地，本發明亦指出含人/堠重m抗體的密暍的核酸 -具p而言，此核酸解媽了人類或黑猩猩固定區域及堠類 可變區抗原辨認部位；同時，並純化此核酸，即，與其目 然發生的生物組成分離，或更'佳地，並以均值薜方式提供 •Λ 另一方面，本發明更指出由至少一種補體決定區域 ((:D R s )所生成之C1)卜接枝抗體，即，胺基酸殘基（Μ卡巴 特（Kabat)標準胺基酸標示糸统〉31-35((：01^1)，50-6 5 ( C D R 2 )，和9 5 - 10 2 (C D R 3 )於特定的重鏈，Μ及於特 足輕鏈之胺基酸殘基2 4 - 3 4 (C D R Γ) ，5 0 - 5 i3 ( C D R 2 )， — 和89- 97 (CDR 3 )，其均為舊世紀猴類可寒區，和第二個 稩類免疫球蛋白可變區域外圍。C D R -接枝抗體可與原有猴 〆 類抗髏相同的抗原结合。其抗髑固定區乃由人類或黑猩猩 免疫球蛋白衍生而來。執行此方面的方法可見於瓊斯等人 -me ' -10 - 本紙張尺度適用申國國家梂準（CNS ) 格（210X297公釐） 83.3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 線 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (Jones e t a l) , 3 2 1 H 然 Nature 522，1985中所發表：. 這鋪CDR接枝&可掖改變•若需要確定他們更接近人類所 擁有者，K降低發生於此抗體之逆反應的可能性： 具騁而言，這方法包枯由埔候中選擇或不朽化其細胞* 此細胞乃負貴生產抗體，並由細胞中：携取免疫球蛋白基因 ;選飧並定序負貴生產抗體的基因；選擇人類可變區外園 序列（較佳地，與補猴可變區域外圍有很大的同源性）;· 並將铺候C D R序列取代為人類C D R序列Μ及於人類外園區_ __. ^ · *— 作小部分修飾此區段包拮使杭鹘對其抗原保有親和性 “小部分修飾”表示於外阐部分少於6俩胺基酸將會被 其他胺基酸取代。通常只有當此胺基酸涉及空間相互反應 使絮構區域在一足型態下，使抗體能辨識所需的抗原時Τ 進行此銪取代或修飾·：這樣的修飾可反應出與人類抗體相 較之Τ *候類抗髑中不同的胺·荖酸組成。洌如•於人類抗 髁中在蓽鑲CDR 3 * 92- '94之前的胺基酸序列通常為半胱 胺酸-丙胺酸-精胺酸（少數抗體中精胺酸被絲胺酸或纈 胺酸取代）；在某呰猴類抗體中，此序列為半胱胺酸-丙 胺酸-絲胺酸；所Κ >在此例中，較佳地在第9 4 Μ胺基酸 使用絲胺酸（見圖i) D )。 更甚者，本發明指出治療擁有特殊抗原人類的方法，冽 ，患有疾病者。方法中包括施予足夠療效劑量專一於眈特 定抗原的重姐抗體，其中此重m抗體乃含人類或黑猩猩固 定區及堠類可變區之抗原辨認部位，或先一段猴類固定區 ，再接著一段不同猴類可變區的抗原辨認部位。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 Λ 線 本纸張尺度逋用申國國家標準（CNS ) Α4洗格（210X297公釐〉 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 對h述各方面具體而言，抗原為牌瘤抗原，渉及免疫異 常的抗原，涉及自體免疫反應的抗原，宿主细胞所表琨的 受體，或選自人類抗原C D 5 8， V U 4 < α 4召1 into grin), CD2, L F A 3 , ELAM, S.AM, CD25, C i) 4 , C019, C D 2 0 ,人類了 细胞受體，C D 3 , C D 8 , C D 2 3 , C D 4 1 , C D 4 4 , i： D 4 Γ) , (: D 7 1 , 了 N F α , T M F θ , T n 抗原，i L - 1 , LL - 8， C 5 a ,吸附分子，洌：V C A M , i: D 5 4 , (: D 2 8，C D U a , CD1U, CD18,和 Cmib，neu 致癌基因產物，MDR-l(P-_ 蛋白），TG F «及其受體，和P DG F之杭原；H此電组抗體乃 作用於賴與補體或殺手湘胞作用而消除（殺死C去除）不需 要的细胞（例，杭-C D 4)或作用為细胞毒素劑或使噬细胞结 合於Fc受餺。另外，抗體可遮蔽或激發受體功能，或中和 活性可溶性產物，如：i n t. e r丨e n k U s , 了 N F和C 5 a 。 另一方面，本發明也陳述Γ上述抗體或其H段之藥學组 合物。根撺本發明之组合物或產物可方便地Μ溶液形式供 給用於非經腸道的或a内的或口服的施藥方式：抗體的適 當製劑可與他種適宜試劑混合，κ增加其臨肘應用率。 本發明的其他特性及儍點將可由下列較佳地具體陳述或 申請專利範圍處明顯表示。 較佯蚀亘髑陳沭 圖示將苜先被簡潔地描述。 圖示說明 ---------^-- f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) "‘線 -12 - 本紙張尺度逍用申國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7 五、.發明説明（） 圖1_為陴列表铃述在9涸不同的Lg重It引導序列和1 0個 猴類U重鍊引導序列之2 0個密碼子； 圖2為多揷.的I g鍵结構圖樣表，S：中K限制酶位置' 及用 來收大的引子顯示引導序列、可變區及固定區的相對位置 » 圖3為用以表規人類或嵌合抗體的重鏈匣載遛圖樣表； 阃4為設計來表琨人類或嵌合抗-體的輕_匣載聘圖樣表 •圖5和圖β為分別設 c Ο Ν Α表琨免疫球蛋白之 白基因K縱列方式前後 榑記； 計用W由K a p p a_或1 a m b d a.輕筆 載髁圖表。於此載·體中，免疫球蛋.. 排列，並Μ新阑素轉敗薛豳為選擇 圖7- 1 * 7- 2和圖8表示本發明中所用各棰引導序列引 子之核酸序列ί圖8中的引子'相對應於Μ下所列的序列 1 閱 讀 背 ιέ 冬 Ϊ 事 項肩' 再 填 % 裝 本衣 頁 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝

Li) Nos 1-12 )； 圖9 A至9 Η分別為人類 V Η 5序列和V Κ I和V Κ IT 圖10為人類_與猴類在 列比較；^ 圖1 Γ表示本發明中之 阔1 2為X圖1 〇中所示 圖1 3和14乃分別為抗 列； 圖1 5為表示抗-C D 5 4 和猴類在V Η 1 , V Η 2，V Η 3 , V Η 4及 和V i a nt b d a ϋ序列之比較表； V Η 3序列之比較，並與人類V Η 2序. 抗體與人類CD4抗原结合之圖形； 之抗體抑制1F3结合之圖形； -C D 4 V Η及V L區域之部份核苷酸序 活性之_ ; Κ及 13 本紙張尺度逋用申國國家橾準（CNS ) ΑΊ規格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 圖1 ft為.質體表規特性之比較圖表。 候頌杭餺 舊世紀猴類包枯所指的彿裨及捅堠（包含R h e S u s候和 C y η o ra o U u s堠）：本發明提供了所申請發明之多棟猴類基 因之詳細使用。發明不限於這些洌證，同時可應用至其他 Μ世紀候類。 , 如阖2所指\其Κ圖樣表示了編碼免疫球蛋白爾鏈， _ I _ -*· --- K a p p a , i a m M a锊鏈之苺因的一般结構。這S璉均由A T 起始密碼，再接著约長β 0個鹼基的引導序列*再接著编碼 免疫妹蛋白可濩區及該免疫球蛋白固定區之區域形成。圖 1中顯示了含不同重璉的引導序列或訊息牲肽之賁洌。瑄 類序列及在候類中相當者可涇由已熟知的標進技術決定， 如f所述。 " 圖1中在下商部分所表示的序.列為人類引導序列。申請 者曾發現設計與此引導區域互補的引子可用來枚大猴類中 I g基因。相類似地，與猴類引導序列同種的引子（見圖1 中上半部）可用來放大猴類免疫球蛋白基因，也可用來放 大人類免疫球蛋白基因。 使用這類引子於搮準放大程序中，可分離出編碼各種猴 一 類免疫球蛋白之基因並決定编磚抗體可變區的序列。下面 將述及這種冽子。下列分析所得结果將列入圖9 A至9 Η及圖 10。令人驚訝地*申請者發規雖然在猴中可產生與人類抗 原相當相近的抗體，但在此類抗體可變區外圍的序列卻與 ' -14 - 本紙張λ度適用申國國家揉準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填窍本頁) 裝 訂 .Λ線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 人頷抗髏無法分辨。即，於候類中所親察得到的免疫琺蛋 曰序列多變異件的量與在人類中覬察所得者類Μ ·同時， 若不經由夾源分析則無法決定此抗髀是來自人或堠： 因此，舉例而言，如圖1 ϋ所指，人類V Η 3區域之胺基酸 序洲乃與堠類相較。人類自身的抗體具有33 - 9δ%的同源 性*而候子抗fi與人類V Η 3區域相較之下卻有α〇 - 9 5 %同 源性。相反地，人類V Η 2區域與人類V Η 3區域只有β 0 %同-.. 碑:性。[於此圖洌及其他，於任何位置上若出琨相问的胺一 _ _. 一 · —· 基酸則Μ虛猓表示，若出琨不同的胺基商則以標準蜇字母 碼表示。於無法有一致胺基酸榑示的位置，則Κ X表示 ]◊相iW地，於圖9 Α至9 Η分別表示了 y Η 1 , V Η 2 , V Η 3 , V Η 4 和V Η 5 Μ及V Κ I和V Κ Ε , V 1 a md b a瓜之同源性·'再一次地 ，於猴免疫球蛋白區Μ及人類之可變區包括免疫球蛋白J 區域序列仍保有具有意義的「ST源性。如此高的同源性與在 ； 人類抗髅之間所觀察得到的相Μ.。 決定序列方法如下洌中所述。使用該技藝中常用之技術 可理解到這呰簧例並不限於本發明，並且相當的结果，蛋 株抗體以及嵌合抗體可經由已熟知的技術的相似程序而得 。見例：美國專利 4，S 1「)，5 β 7 ; 4 , 9 7 8 , 7 4 5 ; 4，9 7 Γ) , 3 6 9 ; 4 , 8 1 β , 3 9 ?，如上。洌如：於選殖得編碼猴可變區之基因 ~ 後，可將此基因與含堠或人固定區密碼基因接連，再把該 融合棊因在持殊的生產細胞株中表現以獲得所需的抗體： - 下列乃為這類程序供给的例子。 於下列洌子中，方法中第一步乃涉及由猴子周邊血液或 ' -15 - 本紙張XJL逍用申國國家標準（CNS ) Α4ίΜ6· ( 210X297公釐〉 83.3. 10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

、1T • A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 脾蹣湘陏中抽取所有的A B细胞可由被免疫過的堠類 周遏血液或淋巴结中取得，可直接使用戎作篩選性薄展。 樓展可由Ηργρρ^ pnpiot^毒轉形，與異源的骨癌细胞融合 後作進一步篩選，或於被激發的人類Τ湘胞存在F作限制 件稀釋來選殖屋一 Β細胞。 W非特異性（寡-dT或隨機六聚髁 > 或特異性t免疫球蛋 白C Η 1或（:K或C i a m b d a固定區域）募聚核苷酸引子將所有._ . 的R N A Μ逆轉錄酶轉換成蜇股（S S ) i; D N A。將此反應淹生的、胃 . '-Π» * 蛋股C ϋ N A 聚含_链鎖反應放大，其中，S S C D Ν ί\與去氧 核苷三磷薛，C Ν Α聚合画（例，熱S足聚合酶）和具專一 性的引子掖用來枚大讀或粹璉可缚區免疫球蛋白基因。所 使用的引子為蜇股合成的茑聚核苷長2 0 - 4 0個鹸基，含某 些簡併鹼苺可與免疫球蛋白5 '引導序列结合3 6涸不同的 5 ’引導序列引子（見，圖7 - Ί加入限制_位置（洌，LlL I )設計用夾政大猴類霞键可變區家族，此法乃基於此候 類基因與人類重鍵可簿區基因家族相類似之故。Μ這6個 5 ’引導序列中每一涸引子，同時也使用另一個加入限制酶 位置（例，Ihi Γ )與相關的同異型（例，U G , I g Μ , [ g A 或U E )的固定區域具專一性的3 ’引子。相似的，對於候 “ppa和1 ambda羥鍵|其他對的引子被用放大適當的輕键 ~ 可變區（圖7 - 2 )。 為了加入不同的 > 唯一的限制酶位置也使用其他的引子 而得Μ將P i: R -政大的D N A有方向性的選殖入擁有相同限制 酶位置的合宜表現載體中。亦可使用一系列與併有I -16- 本紙張尺度逋用申國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 83.3 10,000 ---------^-- (請先閱讀背面之注意事A 填寫本頁)

*1T 線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 位置之抗賴蓽键引導序列3 ’端结合的引子*或一系列可與 併有KiLiL I位置之外爾一前23鹼基结合的引子，這痤均描 述於_7- 1。堠類免疫球蛋白重和鞔鍵可雯區基因可於 P U放大之後直接選殖入傳送載體Μ進行接下來的分子窀 理，若有需要的話，或直接殖人含人類電或輕漣固定區域 基因的表現載賻中。於表琨載賴中免疫球蛋白基因之分子 组態可能來自染色镅钼，其中.免疫球蛋白起動子/加強子· ·_ 及其他調iff區域Κ及内子Π n t r ο η ) /外子（e X r) η )聯接處之_ ’ _. — 分剳給予者/接受者序列均被包含_·_另外，嵌含型免疫球 蛋白基因可κ異源的病毒起動子/加強子序列將其插入 (:0卜14組態中： 葚钿冽〗：磘類抗fg的序列 圖7和8中表示了分別含穹及沒有限制誨位置的引子， 將其用於來自堠及/或人類C D Us免疫球蛋Θ基因的故大 。下述將提供詳細的程序。K慄準的胍異碲化Μ方法將 R Η Α由堠類的脾臟*周邊血液及淋巴结中分離出來。使用 以此法純化得之全部R N A之流分作為接下來故大反應的模 板。使用部分R fU與2 0 0箪位Μ ο 1 ο n e y鼠類白血病病毒逆 轉錄画和非特異性（寡-dT或隨機六聚鵂）或持異性（免疫 _ 球蛋白U G C Η 1區域或K a p p a璉固定區域C K )寡聚核苷引 子（500- 100微微莫耳）一起反應而得S股非密碼有意義 之罝股CDN A。利用這反懕產生的單股CDMAM聚合酶鐽鎖反 應（P C R )放大。將部分的單股C D N A與去氧核苷三磷酸（2 0 ' -17 - 本紙張尺度適用申國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請-先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 •Λ.線 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 u Μ )，熟猙定+性D N A聚合誨ί 2 - 5單位）和由人類衍生合成 的寡聚核苷引子（50微微莫亘)一起培養來收大爾或Μ键 可變區免疫球蛋白基因。 使用圖8之引子對，由來自許多基因家族的多種代表性 c y η 〇 m ο 1 g u s免疫球蛋白重和輕鍵可變區序列可极放大：將 這哇被放大的序列選殖人質體載ϋ P - 1U Li e s c r丨txU P B S >購 目史莊特金（S t r a t a s e n e )，C A )的E c 0 R V位置，並作為 D N A定序。D H A定序W含有頻人的外來D H A質體作為雙股-一 -*· ' D Η A掙板，同時，K慄進的鍵销终结定序法， 代表性的c y η ο π> 〇卜<? u s候類免疫球蛋白序列如圖9 A - 9 Η所 示。圖9Α- 9Η也包括了來自人類可彈·區苺因的一致胺基酸 序列代表了每一個主要的可變區基因族：每一段堠類與人 類一致序列同源性的百分比均表示出，坦，不含固定 cioma i η區Κ及i:DR區域對媒'定家族的猴類與人類同源性 的程度與同一家族中二段人類序.列一樣高。因此無法只經 由序列比較來判斷免疫球蛋白可濩區是來自舊世紀猴類或 人類。 婶 fr R N A 猴類抗原-專一性B细胞可由數挿方法取得：將被免疫 過的候淋巴结細胞與人/老鼠異骨髓瘤融合伴細胞株 K 5 Η β / B 5融合，接著K病毒轉形B细胞或藉試管内單一 B 細胞選殖技銜篩選融合瘤株：於後者，蛋一猴子Β细胞的 生長於活體外係利用與被抗體激發的人類Τ细胞共培養來 -18* -------1 —裝------訂-----{•線 (請先閱讀背面之注意事項再填窍本頁) 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） 81 3. 10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央樣準局負工消费合作社印裝 支持於训盤孔组織培養盤中，每一孔中置枚M-B细胞 與約1 50 ,000抗 CD3-激發的mytomyc in C-處理的人類丁 細胞。於二1期的培養期後Μ — B細胞擴展成為至少200 個已分化的漿細胞3將由這呰盤孔Φ所取得培養上清液Μ 山羊抗堠免疫球蛋白捕獲抗體藉E U S Α技術蒒檢免疫球蛋 B的出摁：· - 將由抗餺-專一性病毒轉形細胞或融合瘤而j#的細胞培. 養至足夠的數目來萃取R N A 。將經試管内單一 B细胞選殖- -一· 一- * * 技術潮得於免疫球蛋白1正反應的盤孔移出，K pH 7 . 5冷 的磷酸親水緩衝液清洙2次後雜心（lOOOxg，10分}。將已 清洗的細胞懸浮於丨0 0微升溶解溶液中U Η K異硫化氮） 2 Γ) m Μ檸棵酸納pH 7 .()，0 . 5 %甲基甘膠酸納，0 . I Μ 2 -硫 代乙醇）。加入1 0微升2 Μ醋酸納，pH 4 . 0，並混匀。加入 1 0 0微并水飽合酚去除蛋白質'，渴合後加入2 0微升的氛仿 /異戊酵（49 ·· 1 )。於振盪攪拌.和培養於冰上15分後，Μ 1 0 , 0 0 0 X S離心樣本2 0分。將水層移至另一新的試管中，加 入等髏積的異丙醇後於-2 0 t!培養1小時。於Η) , 0 0 0 X g離 心15分收集沉澱，K 70%酒精清洗後，再離心，並以 S p e e d i v a c ( S a v a n t)抽乾沉澱。將乾燥的iUU第二次溶於 1 0 0微升溶解缓衝液中。加人等體積異丙醇後於-2 0 t培 養1小時。於10, OOOxg雜心15分K集沉澱並70%酒精清洗 。將沉澱於S P e e d i V a c ( S a V a n t)中乾燥後，於7 0 %酒精中 - 儲存於-2 0 _;C直到使用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 Λ .線 -19 - 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部t央標準局負工消費合作社印製 合成蛋股c 1) Η A 將由蛋一盤孔中萃取所得的所有R N A溶解於3 2澈升的二 次蒸餾水中，並加入1微升（5 0 - 1 0 0微微莫耳）的引子（. 隨機六聚髑，寡d T或3 ’免疫球蛋白-專一性引子）以及 1 0徹升的Γ) X逆轉酶緩衝液（0 . 2 5 Μ T r i s - H C 1，pH 8 . 3， Ο . 3 7「) Μ Κ C 1 , 1 5 m Μ Μ g ί : U , 5 Ο m Μ ϋ Τ Τ 二硫化苟糖 (d i r. h i ο t h r e i t. ο 1 ))，將混合液於β 5 t加熱5 _分鐘後於冰._ . 上放置2分鐘。加熱之後，加人1微升K M A s i η (培洛美加-~ ，P r o ra e g a ) * 5徹升的5 m Μ去氧核穿二碟酸，Μ及1微升 (2 00單位）的Μ 〇丨ο n e y鼠_白血病病毒逆轉錄酶（B R L ') ，將此混合液於37t反應1 . 5小時。於逆_錄酶反應完成 之後，Μ酚/氯仿筮取單股C D HA / R Η A混合物，並將其通過 1鸯升β - 2 5 S Ε Ρ Η A丨)E X旋轉管柱。把通過胥柱的材質作為 P C R放大的s s c D N A,择板。"' ' iiV ± s s c D N A 將3 - 1 0微升的s s c D N A與1 0微升1 Ο X P C R媛衝液混合（ 5 0 0 m Μ K C 1，1 0 0 m Μ T r ί s - H C 1，pH 8 . 3 , 1 5 m Μ M g C 1 2 )，和 1 . β微升的1 . 2 5 m Μ去氧核苷三磷酸，5 Ο微微莫耳的專一性 免疫球蛋白5 ’引子，5 0微微莫耳的特異性免疫球蛋白3 ’引 — 子Μ及2 - 5塱位的熱穩定Ο Η ί\聚合酶（合成基因> S y n t h e t ί c (〗e n e t i c s ) 。Κ.水將反應體積補足為1 0 0微升 ，並K 1. 0 0微升的碟物油覆蓋。將反應混合物Μ下列溫度 作特定時間的反懕。 "m " -20 -本紙張尺度逋用申國國家標準（CNS ) A4规格（2丨OX297公釐） 83. 3 10,000 (請.先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 .Λ .線 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 94 :Γ，1分蕹 4 81，2分鐘 7 2 'C，2分鐘 將眈循環反覆進行30 - 3 5次，Μ 1 . 2 %璜脂睽和分子最搏 準作瑱脂凝膠霄泳來測定收大的產物。政大的免疫球蛋白 可淨區基因約在分子最3 5 0 - 5 0 0 b ρ之間。此P C R·放大產物 用於選飱入適當的霄體載體中广 _- 窖钿洌 2 :潠硝堠類抗龉基W 田於在c 1) N A階段堠類可變區基因序列與人類相對基因族 φ的基因無法被分辨，任何對堠/人嵌含抗體所激發的免 疫反應將與那些用Κ濟起人抗體分子者無多大的差別：利 用P C R的技術可加入具專一性的限制酶位置，包括：（但 不限於此）Sji_L[ ，Bg ί II ，ΚρπΊ和liui ，此乃發生於 P C R牧大反應中，利用如圖6所.示的引子可加入限制酶位 置於舊世紀猴可荽區序列。利用加入的特異性限制酶位置 為引子來放大特異載體中已存在的選殖基因，並且這呰限 制酶位置而後可用於將基因選殖入表現載體中。另外，K 這呰引子直接放大細胞中的R Μ A 。 已建造好的表現載體分為二類3第一類（見圖3和4 )可 使由P類選殖得之C0NA兔疫球蛋白可變區K唯一的限制酶 位置插入匣狀載髏，其中，免疫球蛋白基因Μ染色髅组態 - 排列。此種載體结合了免疫球蛋白故動子，由二個表現序 列合成的免疫球蛋白引導序列，二個選潁位置和 -21 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂 線 本纸張尺度適用申國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局具工消費合作社印裝

Nhs I：， 游分割给予序列，％疫球蛋曰加強子區域，人 頷固足區域基因（電或鞔漣）和下游聚腺嘌吟薛鞍化信號： 除此而外，尚包含了湘阂複製起點 > 用於细閑篩選的召-闪藤转酶基因和用於β 4 1 8篩選的新徽素轉膦薛函苺因或 用於哺轧動物细胞中皸騎酸蒒選的黃花色精-鳥糞磲呤譎 酹核塘轉化_ I ? p t )基因。重和輕键之表現載分別採用 新阑素轉碴0飞誨（N e 〇 )和黃花色精-鳥萬喋呤谧核糖轉... 化_ ( G p t,)基因為選擇信號。 .' 第二棟表現糸统（見圖5和β )使用K c D N A姐態存在的免 疫球蛋白基因：即，於5 ’引導序列和3 ’固定區域之間沒有 内子或分割位置存芹。此類載體使用異源的病毒改動子/ 加強子序列，使免疫球蛋白輋和輕鍵基因Μ前後方式排列 ，同時，亦有聚腺喋呤核苷藤胺化序列及可選擇的哺乳類 細胞標記（N e 〇 )。卜丨e 〇基因可1經由修飾之後弱化其轉譯> 例：改辨上游和基因起始位置的密碼，由ACC換成TCT -除此而外，亦包括二屬葉酸鹽邐原酶（dhfv)棊因用於下面 的K胺基甲胺苯酸基因放大。M c D N A组態選殖入表現載體 的堠類兔疫球蛋白可變區基因或由巳存在於穿梭載體 ί P B S )中之選殖序列放大，或直接由含有限制酶位置，在 重_為Sa i _[或Η I u I和Nh e I ;在K a p p a或i a m b d a輕镜為 i^L α和iujl i或a^u/1的r m a引子來放大。其他具潛力的 唯一限制酶位置並不被排除。 嵌合童和輕鍵免疫球蛋白基因Μ個別的或順序的方式（ 對於那呰染色髒構形者）或於同一儷載體上（對於cDN Α構 .~ 22 ' 本紙張尺度適用申國國家揉率（CNS > A4規格（210X297公釐） 83. 3.10 000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

、1T 4,線 A7 B7 五、發明説明（） 形者）以電搫穿孔方式引入生產细胞株中ύ Μ電擊穿孔方 式將線形D Ν Α结構引入中國黃金鼠卵巢（C Η 0 )细胞或老鼠 骨癌细胞之後*隨即將轉形體進行單一细胞選殖於9 6孔姐 織培養盤中。電擊穿孔條件乃使用(δΤΧ，聖地牙 哥San Diego)電擊穿孔設備及由含特定量載體DNA而付的 適量轉形體於1毫升丟棄式塑膠管中。將已適應生畏於不 含血淸培養基中的CH0细胞恝浮液（CHO-S SFH E負亞黃喋 呤和陶腺嘧啶，吉伯克G丨b c 〇)使吊於含病毒調節要素的構 築髑中。 -請 ka 閱 讀 背 Λ 意 事 項一Ν 填I裝 頁 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 次潠萌丨g可寒區域基1 將PCR反應所得的產物以酚/氯 S E P H A D E X G - 2 5旋轉管柱ύ若欲以 質體，則加入1微升MgCP2，0· 三磷酸和1微升Klenow DNA聚合酶 反應物中，並於3 7 °C反應1 5分鐘从 殖人質體之前，如下述將5 ’磷酸化 ATP，1微升T4聚核苷磷酸酶U0單 並於37 °C反應30分。放大後的片段 置則會先被適當的限制_切開，並 不需磷酸化。於與合宜的載體連接 均先K酚/氯仿萃取過。 連接反應中，1 0 %的瞵酸化或限 段先與約2毫微克適當的載體混合 仿萃取並通過1毫升 平頭的D N A片段選殖入 5毫升1 . 2 5 πι Μ去氧核苷 (5單位）至全部的P C R 補滿5 ’凸出。於平端選 ;加人5微升10mM 位）於反應混合物中， 若含有内在的限制酶位 可直接用於連接反懕而 之前，欲選殖入的片段 制酸切開的P C R放大片 (總體積8微升），此載 訂 I 線 23 - 本紙張尺度逍用申國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83.3.10,000 五、發明説明（ A7 B7 鸦先Μ限制_處理，對於平頭端選殖使用EcqR V消ib過之 pB Uescr ipt >對於凹凸端選殖則使闬Μ合宜的限刺酶切 割過的載 fl ΐ i: A Ε 5 . 2 或 6 . 0 或 p G e n e - Η 或 p G e n e X L 力 0 入 1微并1 0 x連接缓衝液（5 Ο 0 m Μ T「U - H C 1，出 7 · β ' 1 Ο ϋ πι Μ Μ f? C 丨？， 1 Ο nt Μ Α ΐ Ρ , 1 Ο m Μ 二碲化苟糖），1 微升 U D Η Α連接酶Π屋位）並將反應於1 4 :Γ中進行整夜。Κ標 進的氯化鈣鞞形法將連接後產物搏形能勝任的C ο I i Η Β1 (Π細胞J。被轉形之紐阑K生^於含抗生素 A m p i c i 1 1 i η的L R璜脂凍中夾豨選。將被選出的個別克降 培養於弇杭生素A m ρ丨c丨Η U的L Β培養液屮整夜浚* Κ標準 的鹸溶解方法萃取質體DNA >於限制®分析後可決定那一 個選殖株中含插入的免疫球蛋白棊因，製蔺其[)N A Κ定序 亩序澴硝某芮 K檷準播终结法決定選頻得免疫球蛋白可變區基因之序 列。將含有選殖插入基因的雙股質體D N A作為定序横板。 於定序之前*將雙股DNA K化學法變性。丨)NA定序乃使用 T 7 D N A聚合酶：S E Q1] E N A S Ε ί聯邦合眾生化公司，克里夫 蘭得 * Ο Η ； United States Biochemical Corporation, C 1 e v e U n d，D H )，放射性擇示《去氧A 了 P，及下列序列引子 :(Γ) ' C A fi A G C T (〕(1 G T A C G T C ίΤΓ Γ, A 3 ’）及 (5 ’ iH:CCCC/\Gi\fir』TGCTC:nT』G3 ’）分別用於免疫球蛋白ΰ重鍵 αί 變區 5 ’ —> 3 ' * 3 ' —> 5 ’ 方向。 24 - 本纸張Λ度適用申國國家橾準（CNS ) A4^WS· ( 210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貞工消費合作社印装 (5 . C A G A G C T fi (】G T A C G T fi A A C C 3 ')和 (5 ’ GnCTTfiAAfiCTCCTCAiUfiGS ’分別用在免疫球蛋白 1 a si b d 3鸦镇可變區5 ’——> 3 ' * 3 '——> 5 ’方向。反應產物Μ 6 %'聚丙薛胺凝Ρ分離後間讀。 數檳轉世紀候免疫球蛋白竜和輕鐽可變區基因之定序结 果概述於圖9 A - 9 Η中。先前文獻從未發表c y η 〇 iivo 1 g u s免疫 球蛋白基因的選殖和足序；也從未比較過人和_ · c y η 〇 m ο 1 g u s V區域基因的同源性上單一黑褐摇多要異 _ 丨a m b h基因和相對的人類基因同源性比較结果顯示Η有在 架構區域有2 %的不同。 |g染和篩潠 於訂定殖入重和輕鏈坷變區基因的序列後，將其次選殖 入適當的載體中用K表現。C些載體可為Μ染色髏組態與 免疫球蛋白要素共建（如圖3和4所示）或為使用c D Ν Α组態 與病毒調節要素共建者（圖5和6 )。於起始放大步驟可設 計將合宜的限制酶位置（和H )插入P C R放大引子 中或含限制酶位置的逆放大引子可被用來放大選殖入穿梭 載體中之免疫球蛋白基因。另外，由R Η A直接作P C R放大 後，可將免疫球蛋白可赛區基因殖入表現載體中，因此無 ~ 需次選殖。 - 雷墼孪礼 雷擊穿孔乃用於將重和輕鍵染色體組構築體Μ共轉染方 -25 - 本紙張尺度適用申國國家標準（匚呢）八4«你（210父297公釐） 83.3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝

、1T .Λ— 線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央樣準局負工消费合作社印製 式，或砍序將爾和羥鍵染色髏組構築髏_染入Sp 2/0細 胞中··於序列轉除霉擊穿孔嵌合輕鏈構铤體之後隨卽Μ蔺 敔酸蒒選。篩選生長於9 盤孔中選殖株之培養上清液，利 用ία 1 s a技術偵潮是否生產抗人類輕_固定區之輕鐽抗ώ 清，Μ得最高輕鏈表現選殖株：接著，Μ含堠/人嵌合重 鍵免疫球蛋白搆築體的載體作電擊穿孔輕璉轉染株可篩選 出表現所希望專一性反型態之嵌合杭髑的轉染细胞株。 輕_構築聘ρ ί; Ε Ν Ε X - L (圖3和4 )利用如Τ之方法W霄擊_ 一 · · 穿孔轉染至鼠類贵癌湘胞株Sp 2/0。在轉染緩銜液中 (2 7 2 m Μ 蔗糖，7 m Μ 磷酸納，pH 7 . 4，1 m Μ M g C U.) K 1 X 1 0 7 /毫开濃度的S ρ 2 Λ) 胞與5 0微克含輕鍵基因的 P G R Ν Η X - U昆合，同時，p fi Ε Ν Ε X - L已先W限制酶Ejlh. if作切 開成線形。將妞胞置砍於1毫升可棄式塑膠分光光度計測 試管中，並Μ 3 . 5分餐相距插'入平板電楝於管中，使用 Β Τ X - 1 0 0 ( Β Τ X公司）轉染装置，給.予细胞-脈衝雷流5 0 0徽 秒，使約50%细胞死亡。此數值於給予细胞脈衝S流之轉 染前即訂定*此乃於無13 Ν Α存在下，增加電壓，並於24小 時後測定细胞存活率。Μ作圖繪出電壓對细胞存活率之圖 ，Μ相對於50%細胞死亡的雷壓數值作為Κ後電擊穿孔簧 驗使用。使甩ΒΤΧ- 100装置，最適當的數值經發現為Κ 2 0 0振幅強度的脈衝進行5 0 0微秒。完畢後，將细胞置於 冰上恢復15分後，將其移至含Dulbecco、modified E a g [ e ’ s m e d i u m ( D Μ Ε Μ )有 Γ) % 眙牛血清和 1 0 % S p 2 / 0 調整 培養基的96盤孔姐織培養盤。细胞置放的濃度為於經遇藥 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 -π 線 -26 - 本紙張尺度逍用申國國家標準*( CNS > A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央梯準局負工消費合作社印製 物篩選後其生長為每3孔約有1孔生長。對於電擊穿孔實 驗這參數的訂定乃在每一盤孔中&人不同數目绳過電擊穿 孔的细胞（1 0 0 0 - 1 (), 0 0 0 )並選擇已併入質體.的湘.胞：於篩 選後2- 31期計數茛每一培養盤上顯示有細胞生畏之盤孔 數目：因此，由3個正反應之1所計數的细胞數目•此乃 關於對特定質體的濃度，可作為下次實驗用。_ 直接於霄擊罕孔後將细胞放入不含藥物的培養棊屮。分._ _ , 別針對綑胞可表琨新阑岽轉磷酸誨或鳥冀素轉磷酸酶活性 一 •一· 中於雷擊萃孔後2天加入含G 4 U或阑酚酸之新鲜培養基 。第一星期，每隔2天餵赛細胞；其後* 一虽期餵養2次 即可：·用举的濃度的訂定 < 巧將湘胞培養於含漸增高濃度 的鵷物中並追踪其存活率。用举漓度乃2倍於丨〇〇 %死亡 率的a ◊對於SP 2/0約每毫升1徽克殲酚酸即可，對於G 4 1 8則需約8 0 0微克 /毫升 细胞可用多種方式進行霄擊穿.孔，同時將含重和羥il染 色體的載體（P G ε Η E X - Η和P (1 Ε Κ ε X - L ) —起電擊穿孔或只將輕 鏈作霄擊穿孔。對於後者，利用E L ί S Α技術蒒選高度表現 嵌合免疫球蛋白輕鏈的選殖株。將這些選殖株培養後K霄 擊穿孔方式加入含重鏈的載體。若使用c D N A縱排基因搆築 體，首先K限制酶I直線化表現載體（TC AE 5 . 2或 ~ TC AE 6 )。Μ —雷擊穿孔作用即足Μ嵌人重和輕漣基因 2- 3星期後自於適當藥物存在_F仍可持續生長的慇孔取其 上清液，K E U S A技術分析是否分泌出嵌合免疫球蛋白輕 練或完整的免疫球蛋白。如上所述，M c D N A組態存在的免 ’ -27 - 本紙乐尺度適用t國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐> 83. 3.10,000 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 -線 A7 B7五、發明説明（） 疫球蛋白蓽因K霄擊穿孔殖入已適應於K懸浮方式生長在 不含血清培養基的S P 2 / 0细胞或中國黃金鼠卵巢（（:H G )细 胞：CH(]細胞使用ΒΤΧ600霄擊穿孔装置進行，設定條件於 可達到抗（i 4 1 8最多數的選殖體：此乃為2 1 0伏特，4 0 0 i/F和U歐姆：霄擊穿孔之後，計數細胞，於轉染逯衝液 清洗，懸浮於相同缓衝液後，於冰上置牧1 5分i調整细胞 罕1 X 107活细胞/毫升和將400 u I绌胞懸泮液置於0 . 4邐· 升無閑可丢棄式石英管（BTX公司）：將25微克的K Not I _ 一· ^ · · 直線化的T (: A卜：5 . 2或ΐ C A E R載體1) N A ，其中弇選殖之诵堠 免疫球蛋白可莠區域基因再次丨微克/毫升懸浮於TE緩衝 液（1 0 m Μ _[ r i s， 1 ra Μ K D T A , pH 8 . 0 )中 > 並加入细胞懸浮 液中雪擊穿孔Μ使用自動充雪及脈衝紐使儀器放霄進行 反ϋ。將石英管於冰上放15分> Κ不含血清焙養《稀釋為 120毫升並故人六涸96孔的培'養盤中（20(m井每孔中含約 6 ,讣7電擊穿孔或3 , 3 3 3活细胞.）。不同的霄擊穿孔參數 針對此湘胞株而設，並Κίΐ 418 40 0微克/毫升來篩選： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 丨線 經濟部中央標準局®;工消费合作社印装 篩撰杭體牛姦 Μ加下的E U S Α技術測試由轉染株所分泌的人，候或嵌 合（人/猴）抗體··將9 6孔平底培養盤（黛娜技術 Dynatech)披Mh存於披Μ緩衡液{碳酸納0.8毫克/鼍 升* δ炭餞氫納1 . 5 5毫克/毫升，pH 9 . β )之山羊抗-人 IsG或kappa (濃度為200 ns/孔），並於4 培養至少 * 2 8 - 本紙張乂度適用中國國家揉frCNS 了 A4規格（210X297公釐) 83^3.7〇,000 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 1 M、時去除彼Μ缓衝液，K丨2 0微升阻撺缓衝液行遮蔽 反應（1 %牛血清曰蛋曰於磷酸潢衝發液中含0.2 %發氮 It納)«並於3 7 t’培養1小時：至多加入1 2 5澈升則胞上 清液於含·阴撺緩銜液的孔中並於37 if培養2小時·· Μ P BS 清洗培養盤5次。加入Μ稀釋缓衝液（1 %牛血清白蛋白 ，0 . 0 5 % 0 土溫-2 0，0 . 0 2 % #氮化納於P B S中）稀釋為 I : 1 0 0 0 - 1 : 5 0 0 0的1 0 0徽升辣根過氧化物分解滴慄示 的山芊抗-U G (或k a p p a )抗體：將盤培養於3 7 _'C下1小 時，再K P B S清洗5次。嵌合抗聘以每孔中加入1 0 0歃升 的過氯化氮及受質，3 , 3 ' , Γ) , 5 ’ -四甲基對二氨苺聯茏（1: 1 v / v )進行偵测。於2至5分後Η每孔屮加入1 () 0微并2 Μ的碲馥结束呈色反應。 一般該技铥中習用的技術可達成與上述一致的方i去:此 類技術的例子包括藉融合瘤副r合使所選的B湘胞不朽化， 如上述，Μ細胞株K 5 Η 6 / B 5，由.卡洛等人，1 6 4，當酴駱 隻期刊 1 56 6，1 9 8 (5 所發表 U: a r ο 丨 i e t a i , 1 i5 4 R x p e r i m β n t a i M ft d i c i n ft 1 5 6 6, 1 9 8 6.)或相當的細胞株， 如S P A Z 4 (由仙得而來S a n d ο z ,見爾利其等人，3 4臨牀 化 S 168 1 > 1 98 8 ； Ehrlich e t. a i , 34 Clin. C h p. m . 1 6 8 1 , 1 9 8 8 )。使用已發表的方法學藉標準技術可建立類 似的细胞株。另外*免疫球蛋白基因可選殖自：！a)以 Heroes oaoio作病毒轉形而不朽化的细胞，如馬可佛等人 (Markora et. ai., 30 V〇pr Virusol 5 4 9，19 8 5 )所述 ，或W相當的病毒轉形；（b)由單一 B细胞選殖只有暫時的 * - 29 - ---------^ II f (請先閱讀背面之注意事+犮填寫本頁)

*1T 線 本紙張尺度適用中國國家樑準（CNS ) ( 210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 “不朽fb ” ，見艾馬洛索及利帕斯克1 4 5 免搀學朗刊 315 5 - 19 9 0; A m a r 〇 s 〇 And L i p s k e 145, J . Immunology :Π55，1990所述或ία藉使用熏組免疫球蛋白細菌噬酹體 基丙産，如体斯等人，2 4 6 14 m 1 2 7 5 > 1989; (Hose e t . a i . , 24(5 S c i ^ n c ft 1275. 1989)和麥克凱佛帝等人，348 冃然 5 5 2, 1 9 9 0 ( M c C a f f e r t y e t a 1 , 3 4 8 H只 tur5 52. 1 9 9 0 )所述。篩選含選殖株之適苜抗體可绢上述的技術，. 或該技藝中熟知的技術完成。並將所需免疫球蛋白棊因由__ 不朽化.湘胞株中取得3除此而外，由分離的猴B細胞產生 的抗鸦可作為人_治療而不需菀捭去生成為嵌合抗體 可賴榑進技衡得人固定區，K該技每中所熟知之技術得 任何所需的異梨，並將候抗磚可變區與人固定區域連接。 抗特別湘胞表面受體的嵌合抗體尤其好使用於人的兔疫治 療，包栝：Ci)4， [CAMS, (:()19, CD20，CD8, Ci)lla， CDllb，Cl)28, CD18, (:!Ur), Ci)Tl 和 ΐ(:Ρ 當确你η :潠萌及弄fi,對C D4有惠一袢的堠/人嵌合杭餺 下列所述為本發明方法及抗體的一特殊黃施例： 齑牛候不朽彳h R细朐秩 將成熟c y π 〇 m 〇丨g u s堠（白沙新墨西哥藥長類中心_) Μ 150- 300徽克的可溶性CD4 (SCD4)或來自CD4 Κ反嗶細胞 株S u ρ Ή細胞膜（1 X 1 0 3细胞），並使同標進佐劑，進行肌 肉Τ注射方式免疫，注射多處。每2 - 3星期作一次免疫反 -30 - ， 本紙張尺度速用+國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

、1T -4丨線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央揉隼局貝工消费合作社印製 應共B次：Κ 1 0 0微克s C D 4追加注射至堠大犍之一的腹股 溝區域，並a—星期之後κ外科手術去除同一腿的祜羯淋 巴结。由切割此椋巴结組織1#取淋巴球*並K無.阑1) Μ K Μ培 養液冲洙。將細胞懸浮液通過耐龍菏纱，並W 1 0 0 0 X g雞心 1 0分收集湘胞。 約1 X 1 0 *淋巴球被懸浮於Tr> U -氮化胺緩衝液Π 6 π> Μ , pH 7 . 5 >中並溫熱至37 Τ'，5分鏑Μ溶解紅血球。Κ離心.... 收集淋巴球，並再懸浮於L -白胺薛甲基酯（L Μ Κ )並於3 7 Τ' 中反嗶4 5分。將L Μ Κ筠理的细胞Κ耐龍網過滤並離心。力D 人1鸯并胎牛血清，將細胞恝浮並於不含血清的R Ρ Μ 1清洗 2次.、將湘胞計數後混合置人屋一 5 0毫升尖頂離心管中， 竑加人同數最，已先Μ不含血清之培養液清洗2次的 Κ 6 Η β / Β 5異骨癌细胞。將妞胞溫和地懸浮於1毫升5 0 %P£G (聚乙烯二π酵），緩慢-地加入並輕微捎拌1分鏞+;將綑胞於5分辑内再懸浮加入20.+毫升不含μ清的培養液， 溫和地混勻Μ稀釋P Kfi Μ不含血清的培養基洗2次後， 細胞Κ 5 X 1 0 5 / 0 . 1毫升的濃度懸浮於R Ρ Μ I培養基（其中 含2 0 %胎牛血清和g e n t a m y c i η )中，並W每孔敉入〇 . 1毫 开方式置於9 β孔徽組缴培養盤。於每一孔中加入等體積的 Η AT培養液（0.1毫升），於_選之前，使雜交株生長丨4- — 17夭。 誦撰牛萑杭-C D 4之融合fffl朐雜v秩 測定抗-CD4專一性的方法如下：將ELISA盤K濃度100 __ - 31 - 本紙張尺度逍用申國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

-1T Λ-線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局爲工消费合作社印製 毫澈克/'孔之電組s C D 4彼蓋並§1 Μ 1 %存於P 8 S之牛血清 曰蛋R想蝻。由每一慇孔屮取5 0礅丹融合塯上清液並與涇 s Π) 4谀蓋之培養盤培養反應6 0分鐘。Κ ί 1 2 5標示之山羊抗 -人戎山羊抗-堠U培考β 〇分键作结合测定：Κ蒸餾水洗 4次後，以伽瑪潮定潢計數盤孔。E反應盤孔需作雙《覆 潮定，同時 > 由這些孔所得之融合塯細胞作3次次轉殖， 首先K每盤孔5個細胞，接著2次Μ每盤孔I個細胞。在· _. 此階段蒒選抗-s C [) 4 IF.反應结合细胞表商C D 4的能力。此_ ' _. 4 --- 潮試乃鉍抑制鼠類厘株伉賴，名為1 F3 ，结合罕含CD4湘 胞株S u p ΊΊ來進行。簡明地說，此法乃賴將不同讀的堠抗 -CD4和10毫微克的12S[-擇示1F3與3x 105SupTl細胞/ 孔一起搭養於9 6孔培養鹄中：於室溫（約2 0 - 2 5 Γ )下培 « 1小時後，Κ油真空過濾方式將湘胞移出至玻璃纖雄濾 躂+·' K P BS清洗濾膜數次後》Κ伽瑪测定廉計歟訂定I F 3 结合至S u ρ ΐ 1湘胞上被候融含瘤上清液抑制情形。 選出一可能的選殖株，其生產對1 F 3有強烈抑制性的抗 髁。我們所選出的選殖株為使用人異型試劑的異型者，同 時*發規其為帶有lambda輕鐽的UG2。將此細胞株培養至 足夠數目Μ選殖其免疫球蛋白基因。 由獮類不朽化_朐中撰铕番筘錚耩6Τ寒區某芮 利用上述眼異硫化氮方法由1 X 1 0 7捩不朽化Β細胞中分 離出全部R Η Α 。Κ寡聚-d ΐ寡聚核苷酸引子和逆轉錄酶， 如上述，使用十分之一的全部R Ν Α生成單股c D N A :十分之 * - 32 - 本纸張尺度適用f國國家梯準（CNS > A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

、1T α-線 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 一的s s c D N A則' 又被用於設立P (: R反應：此6個P C R反應 每一涸均包括如阃7 - 1所示的含I限制酶位置的6個 對5 ’ V μ家族具專一性‘專聚核ΐί引子其中之一者以及含Ik i位置U 3 ’固定區域寡聚核苷酸，同樣的，5個P C R反 應，利用5個含1ί位置的5 ' 1 a m b d a引導序列寡聚核苷 酸引子之其中一種以及含I位置之3 ’ i a m b da固定區域 引子夾進行反應。反應條件如上述。每個PC K反應均作三. 電渭。將電鏈和輕键的放大產物進行1 . 2 %瑱脂凝睽雷泳_ 。V Η 4窜謎引子（序例[丨）.Ν 0 . : 1 3 : 5 ’ A!: T A A i】Τ ί: Γ』A (: A ΐ G A A Α ί： Α Π: ΐ Π Τ (]「; Τ Τ ί: T Τ 3 ’）W 及 ί a m b ci a 引子 (序列 i D · N () . : 1 4 : 5 ’ A T C A C A (1 A T (: ΐ C T C A C i: A T A (: (: T fi C T (: i: (: (: T C T (: (: T C C 3 ’）於瑱脂 膠體電泳上呈琨很強的帶。將這柴反應的產物用來選殖入 含人類U (] 1和人類U m b d a固定'區域序列的載體TC A E 6 : 依序將此二棰可變區域基因選.婚入表棍載體T C A E 6中。 首先，將重鏈PCR產物與載體TCAE 6分別以限制_ S_3lL I 和I反應後，產物以酚/氮仿萃取，再通過 S E P H A D Κ X G - 2 5旋轉管柱。K 了 4 D N A連接酶於1 4 t下進行 反應整夜將PC R產物與切開的載體接連起來。約500毫徽 克的D 於1 0微升體積内進行連接反懕 > 同時插入/載體 的莫互比為10 ·· 1 。將連接好的產物用Μ轉形XL - ΓΜ色能 勝任细胞（史塔特金，Stratasene)並將轉形後綑胞培養於 含5 0微克/毫升Α πι ρ ί c ίΐΐ ί η的L B洋菜膠上：桃出對 ΐ· ' A m ρ ί c丨H i η有抗性的選殖株並培養5 κι 1的菌液。利用標準 --------I 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-1T 4 線 -33 - 本紙張XJt逍用申國國家揉準（CNS ) A4瓦格（210X297公釐) ： 83. 3.10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 的鹼溶解方法柚取質膈浚* Μ限制酾i及tLLe. ί切割 並將產物進行1 . 2 %瑱脂膠體雷泳：將含有約4 5 0 b Ρ插人 I) N A的質體作為接下來選殖輕鏈可荽區的摸板由輕鍵 PCR所得的產物及含電键基因的筲騁分別Μ限制B^JL II及 άχη ϋ切割後進行連接反應·、Μ小型筲餺培養，Μ BjlL il 及kUL II切割反應蒒選：含約400 - 450 bp插入-DN A者被 認為有！ΐ 反應。把含 la_L I / tUii 1 R ϋ / ixr. II 插 入D N A的罾猬大最培養以用為1) K A的定序： · 縱排之嵌合抗賻表琨載餺TCAE 5.2和TCAK 6乃衍生自載 聘（:L 0 Η，其又為載體R L ϋ Η 1 0 b的衍生物（2 5 :]、科巣 11-7 9 - 199 1 ； 25 3 S r i ft nr ^ 7 7 - 7 9, 1 9 9 1).'同樣的， R i.· D Η 1 0 b 又為表琨載鸮 'Γ N D ( 7 ，ΰ_ΚΑ H51- 661 - 1988) 的衍生物。 R L ί) Κ 1 0 h與載體了 Ν I)的相異'' 點如下：二氡葉酸邐原酶 (DHFR)轉錄毘（故動子，cDNA及聚甲醢胺化區域）被置於组 織胞漿素原活化子匣U - P A表現匣）和新羧素轉磷酸酶 (N E 0 )匣之間，而使得此三匣依序縱排並依相同的轉錄方 向。除此而外*在C L D N中D K F R基因的故動子被取代為老鼠 召球蛋白主要啟動子（3分孑和妞朐牛物期刊 1246- 54 > 1 9 8 3 ； Hoi. Ceil Biol. 1 2 4 ί3 - 5 4，1 9 8 3 ) Κ 及 t - Ρ A c DN Α被多連接子取代。所有三個真核轉錄匣（表規， DHFR, ΗΕ0)可利用内限制核酸_ ίϋϋ ί切割而與細菌質體 D M A ( ρ U C 9衍生物）分離。 i- C L D N與R L D N 1 0 b不同之菀在於由於在多連接子之前的 一 34 - ---------^ — ( (請先閱讀背面之注意事項异填寫本頁) --5¾ Ί 線 本纸張A度適用中國國家標準（CNS ) ( 210X297公嫠） 83. 3. 10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 R 〇 u s L ΐ R巳蒞人頦_狍大型病毒（C Μ 〇 m e g a U v i r u s )立邸 早基[Si 動子加強子所取代：（41，陏> 521 > 1985 ； 41 C R i i，521 ，1985)： 表現載餺TCAf·: 5. 2和ΐ(:ΑΚ 6與CLDN不同蕤在於： 1 )含4洞依序縦排之轉錄匣：（而非3 fi ) (a， 由聚合酶鍵鎖反應故大來自cDHA衍生之人類免疫球 蛋白輕辆固定區：於’Π: A K 5 . 2中為入類免疫球蛋白·.. 輕鏈K a p d a固定區域（K a b a t定數胺基酸1 0 8 - 2 1 4，.. _ 一- ~ ~ 異型U Η 〇 t y p e ) K m 3 )，於T(: A Ε β中為人類免疫球蛋 白輕鍵丨a m b d a固定區域（K a h a t定數胺基酸1 0 8 -2 1 5，萋因型（)z負，M c g負< K e負異型）： <b) 人類免疫球蛋白電鐽固定區；於比二者中人類免疫 球蛋白電箍乃為衍生自利用聚合酶鐽鎖反應放大的 gamma 1固定區（Kabaf:定數胺基務114- 478異梨 G m [ a , G πι I z t 0 tc. PHPR ;含自己的輿核敢動子和聚腺喋呤釀胺化區域 Ο (d) ΝΕΟ ;也含有自我的真核敗動子和聚腺喋呤藤胺化 區域。 2 )人類免疫球蛋白輕和重键匣含有合成的信號序列用Κ分 一 泌免疫球蛋白鏈 3)人類兔疫球蛋白輕和重鍵匣含具專一性的D連接子可 一 使插入之輕和重鐽免疫球蛋白可變區得Μ維捋轉譯間讀架 構而不改赛正常免疫球蛋白中之胺基酸序列。所較述之加 -35 - 本纸張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4i^格（210X297公釐） 83.3.10,000 ---------裝-- r 《請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丁 -1-°

"I 線 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 人改赛，促成載體ΪΠΑΕ 5 · 2和Τ(: ΑΕ ΰ之搆築：由抗- CD4異 融合瘤拥胞株Ε9.1選殖免疫球蛋白释和輋鍵可變區基因至 TGAE 6建造了貯存註冊於ATCC之溝築體，此搆筚聘含有 c y η 〇 m 〇丨g u s候免疫球蛋白重键可赛區Μ及c y η 〇 m ο 1 g u s候免 疫球蛋白輕鍵可荽區，其序列分別如圖13和14所示，乃由 杭-CD4融合瘤细胞株E9 . 1中選殖而來：輋鍵固定區乃源自 人類之g a m m a 1同梨和Γ! m [ a , () m丨？，異梨，：' 1 a m b ci 3輕键固定 區同樣來自人類之0 z負，m c g負苺因型和K e負異型：將免 _. 授球蛋白基丙選殖入哺乳動物表現載體'ΓΠ A E β，如圆6所 示，當W霄墼荜孔頻入哺轧動物细胞株（:H (] fff牽生候/人 抗-CD4嵌合杭鹘。此處所述之DMA構築髏已被用於轉形閑 株XL- 1 , B I uft，於含有抗生素Amp i c i I I i η中篩選，並懸浮 於含1 5呢甘油的無閑L Β培養基中貯存。 另一俩有效的表現系統為！Τ含選擇記號的密鈣荖因修飾 Μ增加電系統選飱所需序列之. '毫垄洌如，損霄主要選 擇記號之轉譯起始與未被損害的載體相較，會造成較.少的 抗藥性選頻株，但，每一俩選殖株卻可表琨較高的共連接 基因產物.。例如：轉譯起始乃為蛋白質合成的第一個步驟 。將新飆素轉磷酸酶基因（G 418抗性基因）的轉譯起始位 置由一致的K 〇 z a k (序列-c c A c c ή T G ίΐ) ft為較差的K 〇 z a K (序 列-c c T c c Α ΐ β C )。G 4 1 8抗性基因之轉譯起始受損導致： U有效地降低（5倍）來自每俩細胞Κ相同最霣餺D Η Α轉殖 所得的Γ; 4 1 8抗性選殖株數冃，2 )每画選殖株中有效m加 共連接葛因的表現量。這雙選殖珠中含一致的K 〇 2 a k *經 ~ - 36 - i !叫丨裝丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、π 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4«l格（2i〇X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標隼局貝工消费合作社印製 筛選结粜7:; %生產少於25毫徽克/'毫升，只有3 %生產高 ΙΓΜ 0 0毫徽克/毫升。坦對那呰涇過改變的，含較差 Kozak的選薄株*篩選结果，δ %生產少於25毫撤克/毫 升，而68宄的克陪生產高於100毫徹克/毫升。更具專一 性地，如圖1 β所指（其中T C A Ε 5 . 2含一致的Κ ο z a k ，而 T C A卜：1 2含較差的K 〇 z a k )，有2 5 8 ii選狼株丨糸來自2個K 25微克，含一致的（未改變的）轉譯開始位置之新蔺素鞞Ml · 酸海苺因的ί) Μ A進行霄擊穿孔者。2 (Η個這類選殖株（7 8 _ ~ % )不表槻仟何可偵潮到的基因產物（即，〈2 5笼微克/' 毫升的嵌合免疫球蛋白），只有8個選殖株（3 % )表現高 於1 0 0毫微克/毫升。有9 8個選殖株來自6個Κ 2 5微克含 被改箩轉譯開始泣置之ϋ Ν Α進行雷聲穿孔者：這些選殖株 中，β 3 %表現超過丨0 0毫微克/毫升，R有8 %表現少於 2 5毫徽克/毫升。 '' D Ν Α定序 質體D Η A係自1 0 0 m 1的培養物製備得。Μ 2 . 5 Μ氯化納 和2 0你聚乙烯二元醇！ 6體積）與（1體積）質體D Ν Α混合後 置於冰上1 5分作進一步純化。Μ 1 〇，0 〇 0 X g離心2 0分後，Μ 7 0 酒精洗沉殺，再離心並从S p e e d i ν a c (. S a ν a n t)抽乾：. 將D M A沉澱M ] 5 0 - 2 5 0毫微克/毫升濃度再溶解於去離子 水中。5微克雙股D N A K仙格（S a n g e「）技術進.行足序反應 。使用與表現載髏中插入的輕鏈或重鏈上游和下游部分同 源的定序弓i子。將插入D H A K 5 ' —> 3 ’和3 ’ —> 5 '的方向 Λ -37 - 本纸張尺度逍用申國國家標準（CNS ) Μ规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

'II —線 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 進行定序反應。將由不同的PCR反應所得的2個選琯株的 抗-CD4鞔辨和抗-CD4電璉進行平行定序K決定是否在PCR 反應中加入任何的核W酸改變。所選的重鏈和輕.Μ選薄侏 於祭個序列中均相間，確認在放大反應中並未引起任何錯 誤。抗-CD4桌和輕鐽序列如罔13和14所示Μ反序列表中 Ν 〇 s · ] 5 和 1 β 亦-¾。 - 羌掴候/人嵌合杭-Γ, D 4 _. ^ 表規載體T C A K 5 . 2和T C A Κ β不僅能被用於细胞株S p 2 和C Η 0中作1定的嵌入表規，旦由於其亦含有S V 4 0起 始，因此，fc可用來於細胞株C 0 S中作短暫的表現。C i) S 細胞表琨進行如Τ :於轉染前一天接搏COS妞跑* Μ使隔 天能有50- 70%的流動性。去除培養液，同時Κ轉染缓衝 液清洗 2 次（TB-140mM Na(〕i，25mM TrU. 5raM KC1, (),5 m Μ N a d PiU , 1 m M Mg(: U , 1 m Μ (: a ί 丨 2 )。在每一盤中加 .請 先 閱 讀 背 A 意 事 項一、 I 填 寫奘 本衣 頁 訂 入3 0微克K氛化铯純化 球蛋白鏈之T C A Κ 6質體 毫升存於T B中）混合。 。將D K A溶液去除並換 ，Μ Ί’ B清洗细胞2次。 毫升新鲜培養液在3 7 TJ 次並Μ —般的DME Μ培養 清液Π 0 0 // Γ)作不同的 測抗體的存在。Κ山羊 得含抗-C D 4猴/人嵌 與3毫升D E A Ε聚葡萄 將D K A與細胞於3 TC 入3毫升的20%甘油 將细胞放入含10 0 w 中3 - 5小時之後> K 72小時。將取自轉染 稀釋，利用E L I S A為 抗人類1 a m b (1 a用來披 合重和羥免疫 糖（1毫微克/ 中培養1小時 1 . 5 - 2 . 5 分後 Μ氣奎因之5 培養液清洗2 後C0S细胞上 基本的技術檢 蓋96孔偵測盤 線 -3 8 - 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 並K過氧化物分解誨標示的山羊抗-\類UG為偵測抗體 ，亦於標準的EL ISA條件下。COS细胞可產生10到40毫澈 克/毫升的猴/人嵌合抗體，將更大體積的上清液濃滴 1 0倍後用於直接结合U A至C D 4 .反應SI丨Ρ ΐ〗细胞。分別 Κ原夾完祭的堠抗體及不相關的人類免疫球蛋白作正和負 對照姐：（圖11丨。更深人的，以堠杭-C D 4 iG候/人嵌合抗 -4用夾抑制高親和性老鼠抗-C丨)4 ( 1 F 3 )抗_轉之结合力（. 圖12 ')。可見堠/人霞組抗體UTCC No · 690 30)不僅與 (:D 4 [F.反憋細胞结合，同時，可Μ約相同濃度的祭猬候抗 鵂或1. F 3本身的效力抑制1 F 3對i: D 4的结合性。 F述為本發明方法和抗體之簧例：' 奮钿冽4 :產牛候類對杭人類淋F1抜抗原的抗體 將成熟的C y η 〇 m 〇丨g u s猴類（白’沙新墨西哥蚕長類中心）Η 肌肉下注射方式* Μ 5 X 1 0 s完整.C i) 5 4正反應人類淋巴球作 多菀免疫。S B细胞（人類B淋巴株）和活化的周逷人淋巴球 交互使用，細胞K先培養於P 〇 i< e w e e d分裂素（2 . 5毫克/毫 升），P h o r b ο 1鼠醋酸鹽（40毫微Μ )和植物凝血素（4牽克/ 孔'! Μ _進佐劑混合之混合物激質·'每2 - 3星期免疫一次 持薄δ涸月。於不同的時間間隔Τ篩選來自被免疫動物血 清中抑制鼠類抗體，ίΗ Η 1 0 (已知可结合至[C Α Μ - 1 )之结合 力。蔣fS和最的84Η10结合至中國黃金鼠卵巢細胞（CH0) *並漸次增高對猴血清的稀釋最，同時，此C Η 0細胞已先 被含人C D Γ) 4 C D Η Α表現載體轉染，並已鋪選過為能高度表 (請先閱讀背面之注意事項再填巧本頁) 裝 訂 丨線 -39 - 本纸張尺度適用中國國家i準了cSs ) A4規格（210X297公釐) 83. 3. 10,000 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 現细胞表闻C D !5 4者。對84 Η 1 0结合的抑制件如圖1 5所示： 其他能認識另外人類淋巴球抗原之鼠類蛋株抗.體也利用 Μ相同免疫法所’携的猴血清作測試。 用徐 - 如上述方法（或相當技術）所產生的抗體*可W.親合性和. 大小選擇的色阍分析法组合來純化以鑑認其功能性生物分_ ^^ -V · _ 析。這些分析包祜專一性和结合親和力的決定以及效應子 與表琨丨司型结合之功能，例：A D C C，或補體固定化。這類. 抗體可用作為被動性或主動性治療試劑，對抗許多人類疾 病，包括B細胞淋巴癌，感染疾病包括A 11) S，自體免疫Μ 及發炎性疾病和移植。這呰抗體或者以原始態使用*或用 作物抗體/嵌合劑，抗體/藥'物或抗體/毒素複合物之部 分。除此而外，完整的抗體或抗:體片段（F a b 2 , F a b，F ν ) 可作為影像試劑或為可能的疫苗或免疫原用於主動性免疫 治療中產生抗-本我型態（ί d i 〇 t y p e )反應。 利用該技藝中習用技術所熟知之標準方法&i訂定產生療 效所需之抗體用量。一般而言，抗髏由標準技術存於藥劑 上可接受的緩衝液中被供給，並K任何所需的途徑施用。 鑑於目前所申請專利抗體的有效性K及人類對其之Η受性 ，有可能分別地給予這些抗體Κ克服多種的疾病或人類所 宣稱的疾病。 本發明的抗-(:D 4重組抗髏（或其片段）也可用於引發免 " -40 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 線 本紙張尺度適用申國國家榇準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） A7 B7 明疫!1 II免抗 本物之 動明 统需II 系所本 疫it之 免其量 之或劑 物類的 動人毒 或發無 人引 ， 制性的 抑療效 發治有 引或予 , 性给物 即防藉動 , 預，他 應於法其 反關方或 •制有的類 抑此制人 疫因抑至 為試 意排 用測 途及 利應。用性 可反驗之抗 力球•試 <懕對 能巴來反的 的淋性制後 應合制抑植 反混抑疫移 制，被免官 抑例製發Ϊ器 疫，複引或 免範胞可織 發示细有組 引來 T 具防 於試量體預 對測測抗或 物準取之療 合標獲明治 化之苷發來 中設核本jffi 明而腺上可 發的胸莨們 本目以事他 此或 指 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 經濟部中央橾準局属工消费合作社印製 斥性（例，腎，心，肺，骨髓，皮If，腦下垂體等）；治 療或預防自體免疫，發炎，複製及過度生產疾病，以及免 疫性調節之皮if性疾病（例，風溼性關節炎，紅斑性狼瘡 ，条統性紅斑性狼瘡，淋巴性甲狀腺腫*多發性硬化，重 症肌無力，第1型糖尿病•葡萄膜炎，腎病雯，牛皮癣， 異位性皮炎，接觸性皮if炎，濕疹狀皮炎，皮脂漏性皮炎 ，扁平苔解，天疱瘡，良性天疱瘡，大泡性表皮鬆澥，風 疹塊，血管水腫，脈管炎，紅斑，皮廣性嗜伊紅血球過多 ，旋狀禿髮等）；治療可逆的胆塞性氣道疾病，腸胃發炎 和過敏（例，腹腔疾病*直腸炎，晴伊紅血球過多胃腸炎 ，著色性_麻疹，局部性迴腸炎和潰瘍性结腸炎）和與食 物有關的過敏（例，偏頭痛，鼻炎和溼疹）。 本發明之技術可由不斷的測定來決定出一有效而無毒性 的抗體量足Μ引發免疫抑制反懕。一般而言，有效劑量約 ί· 為每天每公斤骽重給予〇. 05至100毫克的量。

、1T 線 -41 - 本紙張Λ度逋用f國國^揉準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央橾準局男工消费合作杜印氧 本發明之抗體（或其片段）亦可用於治療哺乳勤物的腫廇 。更特別地，其應可用於減少腫瘤的大小，抑制腫瘤的生 畏和/或延長有腫.瘤動物的命。以此為根據，本發明亦 有關於治療人或其他動物腫瘤的方法，藉給予這漾的人或 動物有效，無毒的抗體劑量。也需有此技術可藉不斷的测 試而訂定出治療致癌性腫瘤有效的，無毒劑量*但一般而 言，有效劑量為每天每公斤體重給予0 . 0 5至1 0?毫克的量 0 本發明中之抗體可根據前述的治療方法給予人或動物足 夠的劑量以產生達治療或預防的功效。此類本發明之抗體 可以習用劑量型式藉已知技術製備，與傅統上藥劑可接受 的殺體或稀釋劑姐成來給予人或動物。藉此技術可了解到 藥劑上可接受的載體或稀釋劑是Μ將與其姐合的有效成汾 的量，給予的途徑和其他已知變數來描述。 本發明之抗體（或其片段）被使.用給予的途徑有口服，非 經腸道，藉吸入或局部給予。此處所指“非經腸道的”包 括靜.脈内，肌肉内，皮下，直腸，陰道或會陰内給予。對 非經腸道較佳的給予途徑乃Μ皮下或肌肉内注射。 使用本發明之化合物用Κ預防性或治療性引發免疫抑萌1 或醫療性治療致癌性腫瘤之每日非經腸道或口眼劑量範g 一般為約〇·〇5至100 ，但，較佳為0.5至1〇毫克，每公斤 體重每天。 本發明之抗體亦可以吸入方式施予。“吸入”表示由鼻 內或口腔吸入服用。此類方式的大珞型態為，如：噴霧處 -42 - -------y丨裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *-* 丨線 本纸張尺度逋用中國國家揉率（CNS ) A4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準爲負工消费合作社印製 方或計齡計鼉吸人器，可用傳统方法製蔺3本發明化合物 較佯的使用ϋ!昜一般為約1 〇至1 ο 〇毫克。 本發明之抗體可Κ局部用藥方式拖予。局部用藥表示非 系統性給予，包括應用本發明之抗賵（或其Η段）外在的於 皮嗛，或口腔内部Μ及將抗體滴人耳，眼和鼻内，但並不 直接進入血流。糸統性给予表示口服，靜脈注射，會陰内 和肌肉下注射，所需用Μ達到預防或治療效果坑餺的最將··-陳所選用自1_抗聘*治療的條件本菡及嚴格性Μ及被治療的-動物而有不同*但，最根太的差異在於豁師使用本發明 抗餺合苴的局部治療劑最，一般約在1罕100奄克每天每 公斤賵重- Μ Τι 雖然可將抗鵂或其片段獨自~施用*然較佳地，將其W藥 劑配方表規。有效成汾的貴，對·於局部使用而言*由 0 . 0 0 1 % 至1 0 % Vi / \例·由配方重暈之i %至2 % >雖然 其量可高達1 0 % w / w但，較佳地不超過5 w / w ，更佳地 為由配方之0 . 1 %至1 % w / w。 太發明的局部配方包括有效組成與一或多掉可接受的載 髑及選擇性的任何其他治療组成分：載餺必須“可接受的 ”與其他配方中成分相容而且不為害接受者。 合用於局部給予的配方包括液體或半液態配製品適用於 穿透皮慮至需要治療_，如搏劑*轧液，？L霜，油晉或糊 狀液K及可用於S，眼的滴劑。 -43 - (請先閣讀背面之注意事+#•填寫本頁) 裝

、1T 線 本纸張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 83. 3. 10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 银裤太發明中之滴劏πί包括a _水溶液或油狀液或懸浮 液羿Εΐη容解有效成份至合苜的水溶液屮含殺闻和/或防阑 試劑和/或其他合適的防胬劑，最好包括界面活性劑：所 得的溶液可緙由過滹後II置於合官的容器中封緊，藉高壓 滅阑殺閑或於9 (Γ - 1 0 (TC屮雄持半小時·:另外，溶衩可碚 過濾殺閑後Κ無Μ的技術輯置於容器中：合適的殺菌及防 聚劑可置入滴劑中的例子為笼棊硝酸汞或其讁酸翻 (0 . 0 0 2妬），茏殺克氣罸ί 0 ·()丨％ )和氯化己炔讁薛額 .1 _. ^ -—— (〇 . 〇 1呢）。適官羿蔺油狀溶液的溶劏包括甘油，稀釋的酒 精和丙某乙醇： 根棟太發明之轧液包栝那些可用於皮锊和眼# :眼用乳 液包栝無閑水溶液選擇性含殺阐劑Κ及Κ類似滴劑製漘法 夾製茼：轧液戎擦劑可用於皮曄者可包括加垤乾悻的試劑 K反冷卻皮曄，如酒精或丙爾'，和/或溼潤劑，如甘油或 油頷，如闰麻油或花生油。 . 根據本發明之轧霜，油脅或糊狀為活性成份的半固狀配 方之外用藥。其製備藉將細顆粒或粉狀的活性成份羯自或 於水狀或非水狀溶液中潖合製為溶液或懸浮液，K適合的 儀器於脂吠或非油脂基礎下。此基礎可包括碳水化合物如 硬，軟或液狀石臟，甘油，蜂騰，金屬皂；黏液；自然的 一 油脂如，杏仁，玉米，花生> Μ麻或橄欖油；羊毛脂或其 衍生物，戎脂肪酸如硬脂酸或油酸與酵類如丙二酵或巨元 醇。此配方可加入任何合宜的界面活性劑如陰雞子，陽離 子戎非離子化界面活化如山梨醇讁或聚氧乙烯之衍生物： ' -44 - 本紙張又度適用申國國家橾準（CNS〉A4洗格（210X297公釐） 83.3. 10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

T --f ,線 五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消资合作社印装 懸浮劑如夭然膠》維素衍生物或無機衍生物如矽薄土和 其他成份，如羊毛脂亦可包栝 由此技II可了解到每一劑最對發明中抗體及其.衍生片段 之最適當的最和間隔乃由治療之條件的本質及R容來決定 ，梨態，途徑及给予菀，治療的動物，則最適官的條件乃 可藉傳统技術夾訂足。太發明亦建議採用的最適最的治療 時間*即，對每天所給予本發明中之抗體及其_片段的劑1 · 數，必須限定天數，這可由發明中所使用的傳统治療決定_ —- - 測試法◊ 無需更深入的間述，本發明相信利用上述所敎*用本發 明诖到最奸的效果。T面將述及閫釋的範例，但，不於任 何方面限制本發明的範園， 樹森甜合物 ，' 作成膠囊形式之本發明睜葵組合物係藉將樺準二片式硬 動物膠膠囊M50毫克的本發明抗體或其片段（M粉末型式 )，丨0 0毫克的轧糖，3 2毫克的滑石和8毫克的硬脂酸鎂 充填而製備得。 非經暖菹的注射相含物 作成適用於注射施藥的本發明翳_組合物為係籍將1 . 5 % ( Μ重最計）的本發明抗體或其片段置於1 0 % ( K體積計 )丙二酵和水中攒拌而製得。經過濾使此溶液為無爾 -45 - 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 '1Τ -線 A7 B7五、發明説明（） 本發明的抗體或其片段丨.〇克， Η色軟石_至1 0 0克。 將本發明之抗髀或其片段分散於小聘撗的載餺中Μ牽生 平滑的，均勻的產物：將此分散液充填於可崩落的金屬管 中。 - 局部乳箱刨合物 本發明的杭餺或其Η段1 . 0克 賫拉縢（；；P ( Ρ 〇 丨 a W ?3 X G Ρ ) 2 0 0 2 0 . 0 克 無水羊毛脂2 . 0克 白色蜂臓2 . 5克 羥基笼甲酸甲酯0 . 1克 蒸餾水至1 0 0 . 0克 i 將寶泣蜂臟和羊毛脂一起.加熱至6 0 :C =加入羥基笼 甲酸甲詣溶液後Μ高速搜拌得均質溶液·。降溫至5 (TC。加 入本發明抗體或其片段並攪伴》Μ慢速搜拌冷卻此组合物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝

、1T --線 經济部中央標準局爲工消费合作社印装 局部轧液胡合物 本發明之抗體或其片段〗.0克 山梨糖S月桂酸_0.fi克 聚山梨榑酸脂2 0 0.6克 鲸補硬脂基醇1 . 2克 ' -46 - 本紙張尺度遑用申國國家標率（CNS>A4规格（210X297公釐〉 83.3.10,000 A7 B7五、發明説明（） 經濟部中央標準局負工消费合作社印«. K油ii . 0克 羥基笼甲誃甲詣〇 . 2克 純化的水B . P .至丨0 0 . 0 0毫升（B . P .=大英國協绰典） 將捽基茏甲酸甲諶和甘油溶於70牽升* 75 t：水中。於 7 5 Γ將山梨糖單月梓酸酗，聚山梨辋酸讁20和辣撖硬脂基 酵一起熔化並加入水溶液中：所得的乳化液為均霣的，Μ 持缄攒伴降溫並將本發明的抗體或其Η段加入_刺餘的水中.· 作為懸浮液。將整假懸浮液攪拌至均霄化。 ..' 眼闬滴翻胡含物 太發明的杭髀或其Η段（）.5克 捽基笼甲鸹甲龅0 . (Π克 羥甚茏甲酸丙詣0 . 0 4克 純化的7k Β . Ρ .至1 0 0 . 0 0毫开 於7!S:C F將羥基笼甲酸甲讁和.丙酯溶於70毫升纯化水中 ，將所得溶液冷卻。加入本發明之抗體或其片段，K滤膜 (0 . 0 2 2 //. m孔徑）過滹使其無爾，並K無阑包装至合宜的無 菌容器中。 吸人给予的诩合物 " 對容積為1 5 - 2 0毫升的噴容器：將1 0毫克本發明的抗 髑或其Η段與0.2- 0.5%濶滑劑》如聚山梨糖酸酯85或油 一· 酸，混合，並將此混合物混於推進劑中，如氟利昂 (f「e ο η ) *較佳地是（1 . 2二氯四氟乙烷）和二氟氯甲烷之 -47 - 本紙張尺度適用申國國家揉準（CNS ) Α4规格（210X297公嫠） 83. 3.10 000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 -f' — 線 A7 B7五、發明説明（） m合，'祓置入遘當的嘍霧容器中用於鼻内或口腔吸入给予 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 06 Λ给予的诩含物 對容積為15- 20毫升的嗔孬容器：將10毫克本發明之抗 鹘或其片段溶於乙醇< β - 8毫升），並加人0 . 2 - -0 . 5 %潤滑 劑，如聚山梨_酸詣8 5或油酸，混合，並將此混合物混於·<·· 推進劑中，如氣利昂（f r e ο η )，較佳地是（1 . 2二氮四氟乙-一 - 垸）和二氟氯甲垸之組合，並置入適當的嗥稃容器中用於 患内或口腔吸入给予。 π發明之杭P及醫每組合物持別適用於非羿腸道给予即 ，皮F，肌肉闪或靜脈内注射。非經腸道給予的組合物一 般包祜含本發明抗體或其片段的溶液或其溶於可接受的載 髑，特別是水溶液載體之調和'式混合液。可使用各類的水 溶液載镧，例：水，媛衡的水液.，0 . 4 %生埋食發水》 0.3%甘胺酸，及其類似者。這些溶液為無胬態•且通常. 不含顆粒物。這些溶液可藉習用，熟知的技術滅菌。姐成 中包括了藥學上可接受的輔肋劑作為調節生理條件之所需 ，如pH調節劑和緩衝劑等。於此藥劑配方中本發明抗體或 其片段的漓度可有很大的不同，即，由少於約0 . 5 % *通 常為至少1 %至高逹〗5或2 0 % ( Μ重最計）*且主要Μ流髏 Ρ橫，黏度等來選擇，乃根搏所選使用的型式。 因此*本發明之翳藥劑組合物用於肌肉下注射可被製備 為含有〗毫升無菌緩衝的水，和50毫克本發明的抗體或其 ---------批衣-- (請先閱讀背面之注意事ί 填寫本頁) 訂 線 __ - 48 - 本紙張尺度適用申困國家橾準（CNS ) A4«UM 210X297公釐） 83. 3.10,000 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央樣準局—工消費合作社印装 Η段·'相W地，本發明之翳藥俎含物用於靜脈內注射可製 備為弇250毫升的無阑林格式液（Ringer、solution)和 15 〇 ·毫克本發明抗_或其片段。製備非绳腸道可使m組合 物之確甯方法乃為熟知的或該習於該技鉍者顯而易知的， a更詳细述於，例，雷明賴藥劑科璺.15th e d ( Remington’s P h a r m a c ft u t~. c： a 丨 S c ί e η Ί )馬克(Mack ) if! 版公司，伊斯顿（E a s t. ο n )賓州（P e η n s y丨v a n i a ) i併入本篇 列為#考文獻3 一 本發明的抗賻《或其Η段Μί K冷凍乾惓作保存用，並於 使用前* μ合適的載髀再窜m。κ習用免·疫球蛋白潮試此 法非常有效a可使用已知的冷凍乾燥和重m技漸： 根摊所預期的结果*本發明之翳藥組合物可用於預防和 /或治療兩。於治療用，组合物被用來施予已羅患疾病的 患者，以足夠的最治愈或至少'遏止其惡化：·於預防用，含 此抗鹘或其調和液之組合物將給.予未患病的患者κ加強患 者的抵抗力。 翳藥俎合物的單次或多次使用乃K處方海師所選的劑量 及凿態而辑·'在任何情況*本發明的翳藥劑組合物可供給 改變的太發明抗賴（或其片段）的量足κ有效治療患者。 尚需注意的是龙發明之抗體可用來設計與合成胜眯或非 胜肽化合物（擬態），其也可用於與抗蒲相同的療效。見* 例，沙朗格瑞等人，科a 25H » 792- 795(1 991 )， (Saragovi e t a i . S c i ft η o e 2 5 3，7 9 2 - 7 9 5 ( 1 9 9 1 } i c -49 - 本紙張尺度適用申國國家標準（CMS ) A4g ( 210X297公釐） 81 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r I丨裝 、y» τ 線 A7 B7五、發明説明（） 寄存 阐株 li. coii XL-l Blue，抗 CD4 於 ΐίΙΕβ/寄存 β/UCC 並 給干號磚6 9030:此寄存係於1992年7月9日：' 由請者及其設計者了解他們的貴任去取代這些Μ種在此 註冊專利结束之前，於最後一次要求菌種之後5年，或 30年，此乃較久者 > 且亦其貴任注意此專利註冊的儲存* 在其時此儲存將開政予大眾。直到耶時此儲存_將可取用於- 專利的訂約者於3 7 C . F . R ·卜1 4師和3 Γ) U . S . C . 1 1 2節的- . ^ - 條約下。 其他的具體實冽將包_括於下列的申請範圍中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕

T '-線 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 -50 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4殊格（210Χ297公釐〉 83. 3.10,000 Λ 6 η 6 經濟郎屮央榀毕.JTA工消你合作杜印3i 五、發明説明（48) (1) 一般資料： (i )申謫者：雷諾 Α.紐曼（Roland A. Nevaan) 納比爾漢那（Nabil Hanna) 雷諾 W.瑞伯（Roland W. Raab) (ii)發明題目：用於人類治療的混雜抗體 (iii )序列數目：16 (iv )連络地址： ίΑ)收件人：里昂和里昂（Lyon & Lyon) ©街名：611 西六街（611 West Sixth Street) 〇城市：洛杉磯（L. A.) - O州名：加州（C. A.) 0國名：美國 :(F)郵通區號：021 1 1 - 2658 (v )電腦可讀型式： (A)媒介型式：3.5”碟片· 1.44Mb記憶量 (B電腦：IBM相容 〇 運作系统：IBM P.C. D0S(5.0版） 〇 軟體：W 〇 r d P e r f e c t (5.0 版） (vi )目前應用資料： (A)應用號碼 ©存檔日期： Ο分類 (vii )先前應用資枓·· 先前所有懕用•包括懕用*如下述：2 -50 - 本紙張尺度遑用中明®家楳毕（CNS)T4規tM210x297公延) 81. 6. 10,000¾ (H) c請先閲詻背而之注意本項#填寫本頁) 裝· 線- / 五、發明説明（49) 經濟部屮央找準^cx工消作合作社印奴 (Αί 懕用號碼：0 7 / 8 5 6，2 8 1 (Β 存樓日期：23-03-1992 (Α)應用號碼：07/735.064 ©存檔日期：25-07-1991 (vi)代理人/律師資料： (A)姓名：瓦爾堡 * 理査 J..(Warbur.g. R. ichard J.) ©註i號碼：3 2,3 2 7 〇參考資料/摘要號碼：198/158. (ix)電傳資料： (A?電話：（213M89- 1600 · (B 傳真：（213)955-0440 Ο 電報：67-3510 (2)：序利ΤΠ ΜΠ: 1 的咨料 (i )序列特徴 (A)長度：17 ⑭型態：核酸 〇股數：單股 Ο脫譜學：直線 (X i)序列描述：序列I D N 0 : 1 : CCATGGACTG GACCTGG 17 () 席刟ΤΠ Nil : 2的iff料 (i )序列特微 (A)長度：20 ©型態：核酸 -51 - 本紙尺度边用中a困家標毕（CNS) 規怙（210x297公龙） 81. 6. 10,000ft (H) c請先閱讀背而之注意事項再場寫本頁) Λ 6 Π 6 經濟部屮央找準杓貝工消费合作杜印虹 五、發明説明（50) Ο股数：單股 Ο脫譜學：直線 (X i)序列描述：序列ID Ν 0 : 2 : ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (4) 序利ΤΠ ΝΠ: 3的資料 (i )序列特激 (AJ長度：20 Θ型態：核酸 〇股数：單股 Ο脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID N0: 3 : CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (5) ：席利TD NO: 4的资料 (i )序列特激 (A)長度：20 ©型態：核酸 Ο股數：單股 Ο脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID N0: 4 : ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (6) 席列ί Π ΝΠ : 5的咨料 (i )序列特徴 (A)長度：20 ©型態：核酸 -52 - 本紙張尺度边用中a®家炫毕(CNS)'fM規格（210x297公龙） 81. 6.】〇·〇〇〇張(H) c請先閲讀背而之注意事項#蜞寫本頁) 裝- 經濟部屮央榀準杓β工消作合作社印31 Λ 6 _—— Η 6 五、發明説明（51) Ο股数：單股 Ο脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID NO: 5 : ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (7) 序利ΤΙ) ΜΠ: fi的資料 (i )序列特徴 钩長度：20 (B型態：核酸 Ο股数：單股 〇脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID N0: 6 : ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20 (8) :序利ΤΓ) ΝΠ: 7的咨料 (i )序列特徴 (A)長度：16 (B型態：核酸 Ο股数：單股 Ο脫譜學：直線 (X丨）序列描述：序列I D N 0 : 7 : TTGGGGCGGA TGCACT 16 (9) 序列TI) 8的资料 (i )序列持徴 ㈧長度：17 (B型態：核酸 {請先閲講背而之注意事項#堝寫本頁) 裝· 訂_ 線- -53 - 本紙張尺度逍用中Β囷家楳iMCNS)例規怙（210x297公¢) 81. 6· ]〇,〇〇〇* (H) B6 經濟部屮央橾準：：Γ卩工消作合作杜印製 五、發明説明（52) Ο股數：單股 Ο脫譜學：直線 (X i)序列描述：序列ID NO : 8 : GATGGGCCC TTGGTGGA 17 (10)庠刟ΤΠ ΝΠ: 9的窨料 (i )序列特徴 CA)長度：21 (B型態：核酸 〇股數：單股 〇脫譜學：直線 (X i)序列描述：序列ID H0 : 9 : GATGACCCAG TCTCCAGCCTC 21 (11〉痒剂ΤΠ ΝΠ: 10的资料 (i )序列特激 iAJ長度：21 ©型態：核酸 Ο股數：單股 〇脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID NO: 10 : CTCACTTGCT GCACAGGGTCC 21 (12)序刟ΤΠ ΝΠ: 11 的资料 (i )序列特激 (A)長度：19 ®型態：核酸 -54 - 本紙张尺度边用中明®家楳平（CNS)〒4規格（210x297公度) 81. 6· 1〇,〇〇〇張（H) 先 閲 讀- 背 而 之 注 意 事 項 # 填 % 本 頁 Λ 6 Β 6 經濟部屮央ιί準而β工消伢合作社印51 五、發明説明（5 3) Ο股數：單股 Ο脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID NO: 11 : AAGACAGATG GTGCAGCCA 19 (1 3 )序？1丨TI) Ν Π : 1 ?的眘料 (i )序列特激 (A)長度：20 (B型態：核酸 、 Ο股數：單股 Ο脫譜學：直線 (xi)序列描述：序列ID N0: 12 : GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (14) 席？HTD ΜΠ: 的资糾 (i )序列特徴 (AJ長度：31 (B型態：核酸 Ο股数：單股 〇脫譜學：直線 (X i )序列描述：序列I D N 0 : 1 3 : ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCTT 31 (15) 序列Τί) ΚΠ: 14的资料 (i )序列待激 (A?長度：39 (B型態：核酸 人請先閲办背而之注意事項洱填寫本頁) 裝- 訂_ Λ -55 - 本紙張又度遑用中® Η 家樣if(CNS) TM規怙（210χ297ϋϊ ： '~ 81. 6. 10,000ft (Η) Λ 6η 6 五、發明説明（54) Ο股數.:，單股 — ο睨譜學：直線： (X U序列描述：序列I D Ν 0 : 1 4 : ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC 39. 經濟部中央櫺準扃员工消费合作社印製 (1 6 )序列 ID KQ ： 1 5 的 資料· (i )序列持徵 (A) 長 度： 423 (B 型 態： 稜 酸 〇 股 數： em 早 股 〇 脫 譜學： 直線 -- (X i )序列描述 :序 列 ID NO ： 15 GAC •-H CAC CTG TGG TTC TTC. CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AG Λ 4Ξ TC-G C-TC TTG TCC CAC- GTG CAG CTG CAG GAG GCG GGC CCA GG-. CTG GTG So AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC 14 4 ATC AGC GGT C':‘C T.vr T?*.T TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG 192 GGA CTG GAG TC-G ATC GGC TAC ATC ΤΛΤ GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT 2<0 TAC ΛΛΤ CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACQ TCC 2SS AAG AAC CTC TTC TCC CTG p人i· CTG AGG TCT GTG • ACC GCC GCG GAC ACG 336 GCC GTC TAT TAC TGT GCC AGT ΑΛΤ AT A TTG AAA TAT CTT CAC TGG ΤΤΛ 3SA ΤΤΛ TAC TCG CGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC rcc TCA 423 先 閲 in 背 面之 注 意事 項 存 寫 本 η 本紙»尺度边用中國Η家楳準(CNS) Τ4規格(210X297公*) 五、發明説明（55) Π7) g ?τΐ τn nq ： τ fi m料 (i )序列特徴 ㈧長度：387 (B型態：核酸 〇股數：單股. (D脫譜學:直線、 (X i)序列描述：序列1 D NO 16

ACC ATG GAC TCT tec cca AGG AAA C?G C^TC TTC TCT GTC GAG ACT GCT GGT

GCC TGG GCG GCC GGA CAG AGT GTA ATC ΤΛΤ GGC TCC GCC GGG GAT CAT

GCT CTG crp TCC TAT GAG ACG GCC GGG CAG TGG TAC GCT GAC AGO AAC TC.' GGG GAT GAG GCT TGG GTC TTC

CTC CTC GGC TTG AGT CAG TTC ACC TGT CAG CAG AAG GAA CGG CCC AAC ,\CC GCC GAC TAT TAC GGC GGA GGG

CTC CTT GCT CCT CGC TCA GGG GGA GAC CCA CCG CAG TCA GGG ATC ^CC CTG ACC TGT CAG C-TG ACC CGG CTG

CAC ΤΤΊ ACA-GTG TCC GTG AAC C-TT GGA GCC CCT GTG CCT GCG CGA AGC GGG TGG GAC AGT ACC GTC CTA 4S 96 144 192 240 2SS 336 334 3S7 (請先閲讀背面之注意亊項#填寫本頁) 裝. 線_ 經濟部中央楳準扃员工消费合作社印製 本紙張尺度逍用中國《家楳準(CNS)甲4規格(210x2974*)

Claims (1)

1. 第81105967號專利申請案 Μ 中文申請專利範圍修正本(89年元月）租

   1. 一種嵌合抗體，其包括： (1) 一人類抗體重鏈的固走區域； 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (2) 該人類抗體輕鏈的固定區域； (3) 對於一人類抗原具專一性之舊世紀黎抗體重鏈的可 變區；及 (4) 該舊世紀猴抗體輕鏈之可變區。 2 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗體可專一性 地結合一人類抗原。 3 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該舊世紀猴係選 自狒拂’ Rhesus, cynomolgus狼所組成之群。 4 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該舊世紀猴為 Cynomolgus猴 〇. 5 根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗體可專一性 地與選自下列的人類抗原結合，CD58, VCAM，VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41，CD44，CD54，TNFa，TNF/3, Τη抗原，IL-1, IL-8 ’人類 T -細胞受體，CD3, CD28，CD8, CDlla，CDllb, CD18, CD5a, CDllc，CD45, neu 致癌基因產物，MDR- 1， TGFa，TGFa 受體，PDGF及 CD71。 6 ·根據申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗原結合區域 包括舊世紀猴可變區域之互樣決定區域。 7 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗原結合部位 包括整個舊世紀猴類的可變區域。 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝· 訂 第81105967號專利申請案 Μ 中文申請專利範圍修正本(89年元月）租

   1. 一種嵌合抗體，其包括： (1) 一人類抗體重鏈的固走區域； 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (2) 該人類抗體輕鏈的固定區域； (3) 對於一人類抗原具專一性之舊世紀黎抗體重鏈的可 變區；及 (4) 該舊世紀猴抗體輕鏈之可變區。 2 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗體可專一性 地結合一人類抗原。 3 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該舊世紀猴係選 自狒拂’ Rhesus, cynomolgus狼所組成之群。 4 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該舊世紀猴為 Cynomolgus猴 〇. 5 根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗體可專一性 地與選自下列的人類抗原結合，CD58, VCAM，VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41，CD44，CD54，TNFa，TNF/3, Τη抗原，IL-1, IL-8 ’人類 T -細胞受體，CD3, CD28，CD8, CDlla，CDllb, CD18, CD5a, CDllc，CD45, neu 致癌基因產物，MDR- 1， TGFa，TGFa 受體，PDGF及 CD71。 6 ·根據申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗原結合區域 包括舊世紀猴可變區域之互樣決定區域。 7 .根據申請專利範圍第1項的抗體，其中該抗原結合部位 包括整個舊世紀猴類的可變區域。 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝· 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 六、申請專利範圍 8· —種編碼包含第一舊世紀猴免疫球蛋白抗原結合部位 之重組抗微的核酸，其中.該核酸可使用一核酸序列分 離，該核酸序列係選自SEQ ID NOS 1 - 12組成之群 SEQ ID NO: 1: CCATC-GACTG GACCTGG SEQ ID NO: 2: ATGGACATAC TTTGTTCCAC SEQ ID NO: 3: CCATGGAGTT TGGGCTGAGC SEQ ID NO: 4 ATGAAACA.CC TGTGGTTCTT SEQ ID NO: 5: ATGGGGTCAA CCGCCATCCT SEQ ID NO: 6: ATGTCTGTCT CCTircCTCAT v SEQ ID NO: 7: TTGGGGCGGA TGCACT SEQ ID NO: 3: GATGGGCCC TTGGTGGA SEQ ID NO: 9: _ GATGACCCAG TCTCCAGCCTC -2- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） AS B8 C8 D8六、.申請專利範園 經濟部_央標隼局貝工消費合作社印«. SEQ ID NO： IQ： CTCACTTGCT GCACAGGGTCC Y VR M SEQ ID NO: 11: AAGACAGATG GTGCAGCCA SEQ ID NO： 12: GGAACAGAGT GACCGAGGGG 9 .根據申請專利範圍第8項的核酸，其中該重組抗體包含 人固定區域。 10. 根據申請專利範圍第8項的核酸，其中該抗體包含人之 抗體的架構區域。 11. 根據申請專利範圍第8項的核酸，其中該抗原辨識部分 包含來自於舊世紀猴抗體之完整可變區。 12. 根據申請專利範圍第8項的核酸，其中該抗原辨識部分 包含來自第一舊世紀猴可變區的一或多個CDR區域。 13. 根據申請專利範圍第8，9或10項的核酸，其中該舊世 紀猴類乃選自由狒狒，Rhesus和cynomolgus猴所組成的 群中。 14. 一種分離舊世紀猴抗體基因之可變區域的方法，包含 下列步驟：_ 將來自於該舊世紀糇之核酸，及與編碼該抗體基因之 5 '引導序列之核酸互補的引子接觸，其中窣核酸序列 -3- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 線 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 申請專利範圍 A8 Β8 CS D8 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 係選自包含如申請專利範圍第8項中所示之SEQ ID N〇s Μ2组成之群，以生成雜史複合體；及 放大此雜交複合鸪中的核酸以產生擴大的核酸。 15·根據申請專利範圍第14項的方法，其中該核酸為DNa 或 cDNA。 16.根據申請專利範圍第14項的方法，其中該引子與人類 或舊世紀猴枝體基因之5 ·引導序列的非編碟股互補。 Π.根據申請專利範圍第14項的孝法’其中該放大步驟可 產生足夠的核酸置入載體中。 18. —種分離舊世紀猴技體基因可變區域的方法，包含下 列步驟： 將來自舊世紀猴的RNA與逆轉縴酶接觸以生成cQNA 將該cDNA與編碼抗體基因之5 |引導序列處之該cDNA 互補之引子接觸，其中該序列係選自包含如申請專利 範圍第8項中所示之SEQ ID NOS M2組成之群，以生成 雖交複合體，及放大該雜交複合體中之核酸以產生擴 大的核酸。 19. 一種申請專利範圍第1項的抗體之方法，該抗體對人類 不具免疫性，其包含下列步驟： (a) 在舊世紀狼内引發對抗該抗原之舊世紀猴抗體， (b) 分離ΙΪ .碼舊世紀猴抗體的可變區之抗原結合區域之 舊世紀猴核酸， 4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 線 A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 ’申請專利範圍 (幻提供編碼人類抗微之人類固定區域之人類核酸， (d) 連接舊世紀猴核酸及人類核酸以生成重組核酸，及 (e) 表現該重組核酸以產生重組抗體。 20. 根據申請專利範圍第」9項的方法，其中該抗原結合區 域包括舊世紀猴可變區域的互補決定區域。 21. 根槔申請專利範圍第！ 9項的方法，其中該抗原結合區 域包含完整的舊世紀猴可變區域》 22. 根據申請專利範圍第1 9項的方法，其中該方法的b}之 前及a)之後進一步包括使可生產該舊世紀猴抗體之細胞 不朽化的步驟。 23. 根據申請專利範圍第1 9項的方法，進一步包含鑑定是 否該重組抗體結合至該人類抗原之步驟。 24. 根據申請專利範圍第2 2項的方法’其中該不朽化-係基 融合瘤融合。 2孓根據申請專利範圍第2 2項的方法，其中該不朽化係薇 病毒轉形。 26·根據申請專利範圍第2 2項的方法，其中該不朽化係藉 單一 B細胞選殖。 27.根據申請蓴利範圍第2 2項的方法，其中該重组抗體係 .製造於可表現重組免疫球蛋白之基因庫。 28·根據申請專利範圍第22項的方法，其中該人類固定區 係經選擇1使其具有所需的同型（isotype)。 29.根據申請專利範圍第2 2項的方法，其中該方法的b)之 請 先 閎 讀 背 之 注 I 頁. 裝 訂 線 -5- 本紙法尺度遑用中國國家揉準（CNS ) A4洗格（210X297公嫠） 六、·中請專利範固 前及a)之後進一步包-括自該舊世紀猴選擇B細胞，其中 該B -細胞表現該舊世紀棱抗體.。 30. 根據申請專利範固第2 2項的方法，其中該B細胞係得 .自周邊血液淋巴球，淋巴結，骨髓或脾臟_。 31. 根據申.請專利範圍第22項的方法，其中該方法的b)之. 煎及a)之後進一步包含篩選該舊世紀猴細胞以生產該 舊世紀猴抗體。 32. 根據申請專利範圍第22項的方法，其中，慈表現#在生 雇細胞株中進行。 33. 根據申請專利範圍第2 2項的方法，其中該分離係包含 纯化該可變區之免痕球蛋白基因。 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印裝 (請先Η讀背面之注意事項再填寫本頁) 34-根據审請專利範圍第1 9-26項中任一項的方法，其中 ΐ袁抗原係選自：GD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3., ELAM， LAM, CD25, CD4, CD 19,. CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFa，TNFyS，Τη抗原，IL-1, IL-8,人類 T-細胞受體，CD3, CD28, CD8, CD18, CD1 la,-CD1 lb, CD1 lc, CD5a, CD45, neu, 致瘙基因產物，MDR-1, TGF a，TGF α受體，pdGF，及 CD71所組成之群。 35. —種重組核酸，其係編碼申請專利範圍第1項之抗體。 36:根據申請專利範圍第3 5項之重組核酸，包含至少一段 SEQ ID NOS. 15或16可變區的CDR區域 • 6 - 本纸伕尺度速用中國國家標準（CNS) Α4说格（210Χ297公釐） Λ8 Β8 C8 D8 六、.申請專利範圍SEQ ID NO: 15: GAC ΛΤΟ CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA 48 TGG GTC TTG TCC O.G GTG CAG CTG CAG GAG CCG GGC CCA GGA CTG GTG 96 AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC 144 ATC AGC GGT GAC TnT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG 192 GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC A.TC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT 24 0 TAC ΑΛ.Τ CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC 23S AAC AAC CTC TTC TCC CTG ΑΑΛ CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG 336 GCC GTC TAT TAC TGT GCG AGT ^.T ΑΤΛ TTG TAT CTT CAC TGG TTA 284 TTA TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 423 SEQ ID NO: 16: ACC ATG GCC TGG GCT CTG CT.G CTC CTC GGC CTC CTT OCT CAC TTT ACA 48 GAC TCT GCG GCC TCC^ TAT GAG TTG'AGT CAG CCT CGC TCA * GTG TCC GTG 96 TCC CC^ GGA CACi Λ-CG GCC GGG TTC ACC TGT "GGG GGA GAC AAC GTT GGA 14 4 AGG ΛΑΑ AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG 192 / CTG GTC ATC TAT GC7 GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA 240 TTC TCT GGC TCC ΛΛΟ TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGC 283 GTC GAG C-CC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT 336 ACT GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGX GGG ACC CGG CTC- ACC GTC CTA 384 GGT " 387 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 經濟部中央橾準局員工消費合作.社印«. 37. 根li申請專利範圍第1項的抗體，其與醫藥上可接受之 載劑可用於製備一醫藥組合物。 38. 根據申請.·專利範圍第3 7項的抗體，-其中該抗體專一性 地與下列抗原緒合：CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, -7- 本紙伕尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4说格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A8 B8 C8 D8七、·申請專利範圍 ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF α , TNF/3 , Τη 杬原，IL-1, IL-8,人類 T -細胞受 體，CD3, CD28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, CD5a, CD45, neu 致癌基因產物，MDR-1, TGF a，TGF α 受體， PDGF,及 CD71。 39. —種抗-CD4抗體，其包括編碼如申請專利範圍第3 6項 所示SEQ ID N0:16及SEQ ID N0:15之DNA序列編碼之可 變輕鏈及可變重鏈區域。 40. 根據申請專利範圍第3 9項的抗體，其中該抗體係嵌合 重組抗體，其包含人類固定區域，其係用於得到該可. 變輕鍵及可變重鏈區域。 41. 根據申請專利範圍第4 0項的抗體，其中該人類固定區 域係選自人類伽馬1 ( gamma 1)，人類卡巴（kappa)及人類 浪達（lambda)所組成之群。 42. 根據申請專利範圍第4 1項的抗體，其中該抗體係藉 ATCC編號69030而製得。 43. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該重組抗體係使 用載體表現，該載體包括含有經改變之轉錄起始序列 之其導致相對於不含有該經改變的轉錄起始序列之選 擇悻標記基因的損害轉錄起始。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、1T 線 -8- 本紙張尺度逋用中國國家梂準（CNS ) Α4说格（210Χ29'/公釐）