MXPA06001510A - Receptores de degustacion hetero-oligomericos t1r, lineas celulares que expresan tales receptores y compuestos de degustacion. - Google Patents

Receptores de degustacion hetero-oligomericos t1r, lineas celulares que expresan tales receptores y compuestos de degustacion.

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MXPA06001510A
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Abstract

La invencion se relaciona a compuestos que se unen especificamente a un receptor T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 o fragmentos o subunidades del mismo. La presente invencion se relaciona tambien al uso de receptores de sabor hetero-oligomericos y quimericos que comprenden T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 en ensayo para identificar compuestos que responden especificamente a estimulos de sabor acre y estimulos de sabor dulce. Ademas, la invencion se relaciona a la base constitutiva de lineas celulares que co-expresan estable o temporalmente una combinacion de T1R1 y T1R3; o T1R2 y T1R3; bajo condiciones constitutivas o inducibles. El uso de estas lineas celulares en ensayos basados en celulas para identificar compuestos moduladores de sabor acre y dulce se proporciona tambien, particularmente ensayos de seleccion de rendimiento elevado que detectan actividad receptora por el uso de formacion de imagenes fluorometricas.

Description

RECEPTORES DE DEGUSTACIÓN HETERO-OLIGO ÉRICOS T1R, LINEAS CELULARES QUE EXPRESAN TALES RECEPTORES Y COMPUESTOS DE DEGUSTACIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente ¡nvención, se relaciona en parte al descubrimiento de que los receptores T1R se agrupan para formar receptores de degustación funcional. Particularmente, se ha descubierto que la co-expresión de T1R1 y T1R3 resulta en un receptor de degustación que responde a estímulo de sabor acre, incluyendo glutamato monosódico. También, se ha descubierto que la co-expresión de los receptores T1R2 y T1R3 resulta en un receptor de degustación que responde al estímulo de sabor que incluye edulcorantes de origen natural y artificial. También, la presente invención se relaciona al uso de receptores de degustación hetero-oligoméricos que comprenden T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 en ensayos para identificar compuestos que responden respectivamente a estímulo de sabor acre y estímulo de sabor dulce. La invención se relaciona también a quimeras y versiones truncadas de T1R1, T1R2 y T1R3, así como quimeras de receptores T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 que comprenden subunidades de ser humano, de rata o de ser humano y rata. Además, la invención se relaciona a la construcción de líneas celulares que co-expresan estable o temporalmente una combinación de T1R1 y T1R3; o T1R2 y T1R3, incluyendo versiones truncadas o quiméricas de estas subunidades así como receptores quiméricos que comprenden subunidades de tipo silvestre o quiméricas; bajo condiciones constitutivas o inducibles. Se proporciona también el uso de estas líneas celulares en ensayos basados en células para identificar compuestos moduladores de degustación acre y dulce, ensayos de selección de rendimiento particularmente elevado que detectan la actividad receptora por el uso de formación de imágenes fluorométricas. La ¡nvención se relaciona también a compuestos que se unen a receptores T1R1/T1R3, T1R2/T1R3, así como subunidades quiméricas y truncadas T1R1, T1R2 y T1R3 y receptores quiméricos.
Descripción de la Técnica Relacionada El sistema de degustación proporciona información sensorial acerca de la composición química del mundo externo. Se cree que los mamíferos tienen al menos cinco modalidades de degustación básica: dulce, amargo, ácido, salado y acre. Véase por ejemplo., Kawamura eí al., Introduction to Umami: A Basic Taste (1987); Kinnamon et al., Ann. Rev. Physiol., 54:715-31 (1992); Lindemann, Physiol. Rev., 76:718-66 (1996); Stewart ef al., Am. J. Physiol., 272:1-26(1997). Cada modalidad de degustación se piensa que es mediada por un receptor o receptores de proteína distintos que se expresan en las células receptoras de degustación encontradas en la superficie de la lengua (Lindemann, Physol., Rev. 76:718-716 (1996)). Los receptores de degustación que reconocen el estímulo de sabor amargo, dulce y acre que pertenecen a la superfamilia del receptor acoplado con la proteína G (GPCR) (Hoon et al., Cell 96:451 (1999); Adier et al., Cell 100:693 (2000)). (Otras modalidades de degustación se creen se median por canales iónicos). Los receptores acoplados con proteína G median muchas otras funciones fisiológicas, tales como la función endocrina, función exócrina, frecuencia cardiaca, lipólisis y metabolismo de carbohidrato. El análisis bioquímico y la clonación molecular de un número de tales receptores ha revelado muchos principios básicos con respecto a la función de estos receptores. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,691,188 describe cómo un ligando se une a un GPCR, el receptor experimenta un cambio conformacional que conduce a la activación de una proteína G heterotrimérica promoviendo el desplazamiento de GDP unido por GTP en la superficie de la subunidad Ga y la disociación subsecuente de la subunidad Ga a partir de las subunidades Gß y G?. Las subunidades Ga libres y los complejos Gß? activan elementos corriente abajo de una variedad de trayectorias de transducción de señal. Los receptores T1R se hipotetizaron previamente para funcionar como receptores de sabor dulce (Hoon et al., Cell 96:541-51 (1999); Kitagawa et al., Biochem Biophys Res. Commun. 283:236-42 (2001); Max et al., Nat. Genet. 28:58-63 (2001); Montmayeur et al, Nat. Neurosci. 4: 412-8 (2001); Sainz et al., J. Neurochem. 77: 896-903 (2001)), y Nelson et al. (2001) y Li et al (2002) han demostrado recientemente que los T1R2 y T1R3 de rata y ser humano respectivamente, actúan en combinación para reconocer el estímulo de sabor dulce. Sin embargo, permanece en la técnica una necesidad para agentes saborizantes nuevos y mejorados. Por ejemplo, uno de los cinco sabores básicos conocidos es el sabor "sabroso" o "acre" del glutamato monosódico ("MSG"). El MSG se conoce que produce reacciones adversas en algunas gentes, pero se ha logrado muy poco progreso para identificar sustitutos artificiales para el MSG. Se sabe que unos cuantos materiales de origen natural pueden incrementar o mejorar la efectividad del MSG como un agente saborizante sabroso, de manera que menos MSG sería necesaria para una aplicación saborizante dada. Por ejemplo, los compuestos de monofosfato de inosina (IMP) o monofosfato de guanosina (GMP) de nucleótido de origen natural se conocen que tienen un efecto multiplicador en el sabor apetitoso del MSG, pero el IMP y el GMP son muy difíciles y caros de aislar y purificar a partir de fuentes naturales o sintetizar, y por lo tanto tienen sólo aplicación práctica limitada para necesidades más comerciales en composiciones alimenticias o medicinales. Compuestos menos caros que proporcionaría el sabor del MSG mismo, o mejorarían las efectividades de cualquier MSG que se presenta podría ser de un valor muy elevado. De manera similar, el descubrimiento de compuestos que son ya sea nuevos edulcorantes de "Alta Intensidad" (es decir, son muchas veces más dulces que la sacarosa) serían de valor. Lo que se necesita en la técnica es la identificación y caracterización de los receptores de degustación los cuales funcionan como receptores dulces y acre, los ensayos para identificar los compuestos que modulan (mejoran o bloquean) el sabor dulce y acre, y los compuestos que se unen específicamente a estos receptores.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona receptores quiméricos que comprenden varias combinaciones de los T1R humanas y de ratas, tales como el receptor T1R2/T1R3 quimérico que comprende una subunidad T1R2 humana y una subunidad T1R3 de rata; un receptor T1R2/T1R3 quimérica que comprende una subunidad T1R2 de rata y una subunidad T1R3 humana; una subunidad del receptor T1R2 quimérica que comprende un dominio extracelular humano, un dominio de transmembrana de rata y un dominio intracelular de rata; y una subunidad del receptor T1R3 quimérica que comprende un dominio extracelular de rata, un dominio de transmembrana humano y un dominio intracelular humano.
La presente invención proporciona también compuestos que se unen específicamente a T1R1, T1R2, T1R3, T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3, o subunidades aisladas, fragmentos, quimeras o versiones truncadas de los mismos como se describe en la presente. La presente invención se relaciona al descubrimiento de que diferentes combinaciones de los T1R, cuando se co-expresan, producen receptores de sabor funcional que responden al estímulo de degustación. Particularmente, la presente invención se relaciona al descubrimiento de que la co-expresión de T1R2 y T1R3 resulta en un receptor de gusto hetero-oligomérico que responde a un estímulo de sabor dulce. También, la presente invención se relaciona al descubrimiento de que la co-expresión de T1R1 y T1R3 resulta en un receptor de gusto hetero-oligomérico que responde a un estímulo de sabor acre tal como glutamato monosódico. La presente invención se relaciona también a líneas celulares que co-expresan T1R1 y T1R3, incluyendo de ser humano o de rata, o T1R2 y T1R3, incluyendo de ser humano o de rata. En modalidades preferidas, estas líneas celulares expresarán cantidades elevadas de receptores, ya sea constitutiva o induciblemente. Estas líneas celulares incluyen células que expresan T1R1 y T1R3 o T1R2 y T1R3 temporal o establemente. También, la presente invención proporciona ensayos, de preferencia ensayos de selección de rendimiento elevado, que utiliza el receptor de degustación T1R2/T1R3, o el receptor T1R1/T1R3, de preferencia ensayos basados en células de rendimiento elevado, para identificar compuestos que modulan el sabor dulce o acre. La invención proporciona también ensayos que incluyen pruebas de sabor para confirmar que estos compuestos modulan el sabor dulce o acre. La invención se relaciona también a compuestos que se unen al dominio extracelular N-terminal de T1R2, compuestos que se unen al dominio rico en cisteína de T1R2, compuestos que se unen al Dominio de Transmembrana de T1R2, compuestos que se unen al Dominio de Transmembrana de T1R3, compuestos que se unen al Dominio de Transmembrana de T1R2 de h2TM/h3TM del receptor truncado, y compuestos que se unen al Dominio de Transmembrana de T1R3 de h2TM/h3TM del receptor truncado, por ejemplo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 contiene un alineamiento de secuencia de los T1R de ser humano y de rata, receptor de percepción de calcio y el receptor de glutamato metabotrópico de rata. I-Catálogo de humano y rata 11 Rs. La Figura 2 contiene los resultados experimentales de amplificación de RT-PCr que muestran que hT1R2 y hT1R3 se expresan en el tejido del gusto, l-genómico; ll-hT1R2 y hT1R3 se expresan en el epitelio de la lengua humana. Los productos de amplificación específica de ADNc puede amplificarse del ADNc preparado de la papila circunvalar humana removida. La Figura 3a-3b contiene datos funcionales (respuestas de calcio intracelular) producidas por diferentes estímulos de sabor dulce en células HEK que expresan establemente Gß?s que se transfectan temporalmente con los T1R2, T1R3 y T1R2/T1R3 humanos en varias concentraciones de estímulo de sabor dulce (Figura 3a) l-Funciones T1R2T/T1R3 humanas como un receptor de sabor dulce; las respuestas de dosis de T1R2/T1R3 humanos para varios estímulos de sabor dulce (Figura 3b); respuestas de T1R2/T1R3 humanos a sacarosa en la presencia de gurmarina y las respuestas del receptor ß2-adrenérgico endógenas a ¡soproterenol en la presencia de gurmarina. I-Sacarosa, Gurmarina, Isoproterenol. La Figura 3c contiene la respuesta normalizada de diferentes edulcorantes. I-Respuesta Normalizada, ll-Endulzante (mM). La Figura 4 contiene respuestas de calcio intracelulares en células HEK que expresan establemente Ga15, temporalmente transfectadas con hT1R2/hT1R3, rT1R2/rT1R3, hT1R2/rT1R3 y rT1R2/hT1R3 en respuesta a 350 mM de sacarosa, 25 mM de triptofano, 15 mM de aspartame, y 0.05% de monelina. I-T1R2 puede controlar la especificidad de ligando T1 R2/T1 R3; II-Sacarosa; lll-Aspartame. La Figura 5 contiene los resultados de un ensayo basado en el reactor de placa de fluorescencia en donde las células HEK que expresan establemente Ga15 se transfectaron temporalmente con hT1R2 y hT1R3 o hT1R3 solas y en contacto con Fluo-4 de tinte de calcio y un estímulo de sabor dulce (12.5 mM de ciclamato). La Figura 6 contiene curvas de respuesta de dosis normalizada las cuales muestran que hT1R2 y hT1R3 funcionan en combinación como el receptor dulce humano basado en su interacción específica de dosis con varios estímulos dulces (trp, ciclamato, sacarosa, neotame, aspartame, sacarina y Acek). I-Curvas de Respuesta de Dosis Normalizada; ¡¡-Porcentaje de respuesta maximal; ¡¡¡-Concentración; IV-Trp, Cilamato, Sacarosa, Neotame, Aspartame, Sacarina y Acek. La Figura 7 contiene información estructural con relación a mGluRl y T1R1 que demuestran que se observan residuos de unión de ligando clave en estas moléculas. I-Residuos de enlace de ligando clave de mGlurRI se conservan en T1R1. La Figura 8a-8c contiene datos funcionales que muestran células HEK que expresan establemente Ga15 que se transfectan temporalmente con T1R1/T1R3 que responden al glutamato en un ensayo basado en calcio intracelular. La Figura 8a muestra que el calcio intracelular se incrementa en respuesta para incrementar la concentración de glutamato, I-Funciones T1 R1/T1 R3 humano como un receptor de prueba acre, ll-GIutamato (mM); la Figura 8b muestra respuestas de calcio intracelulares a IMP (2 mM), glutamato (0.5 mM) y 0.2 mM de IMP, l-Glutamato y la Figura 8c muestra las respuestas de T1R1/T1R3 humanas para el glutamato en la presencia y ausencia de 0.2 mM de IMP, I-Respuesta Normalizada, ll-Glutamato (nM). Las Figuras 9a-9b contienen respectivamente los resultados de un ensayo de tinción inmunofluorescente utilizando hT1R2 etiquetado con Myc y un experimento FACS que muestra que la incorporación del péptido PDZIP (SEC. DE IDENT. NO.: 1) mejora la expresión de un T1R (hT1R2) en la membrana de plasma. /- PDZIP facilita la expresión de superficie de T1R2 humano. ¡¡-Tinción inmunofluorescente de hT1R2 etiquetado con Myc indica que PDZIP significativamente incrementa la cantidad de proteína T1R2 humana en la membrana de plasma. Ill-Los datos del análisis FACS que demuestra el mismo resultado. hT1R2 etiquetado con Myc: Línea Verde. Etiquetado Myc; IV-T1R2 humano con PDZIP: línea negra. La Figura 10a a la 10b contienen datos de formación de imágenes de calcio que demuestran que h1TR2/hT1R3 responden a diferentes estímulos dulces. ¡-Datos de formación de imágenes de calcio que demuestran que h1TR2/hT1 R3 responden a diferentes estímulos dulces. La Figura 11 muestra las respuestas de las líneas celulares que expresan establemente hT1R1/hT1R3 por formación de imágenes fluorescentes automatizadas a estímulo de sabor acre. /- hT1R1/hT1R3, Constante ¡MP (0.5mM); ll-Clon 137, Clon 118, ¡¡¡-Porcentaje de Respuesta de lonomicina; IV-Glutamato (mM). La Figura 12 muestra las respuestas de una línea celular que expresa establemente hT1R2/hT1R3 por formación de imágenes fluorescentes automatizadas a estímulo de sabor dulce. I-Respuesta de dosis VIPR , clon 8 hT1R2/hT1R3, ¡¡-Porcentaje de Respuesta de lonomicina, ¡¡¡-Sacarosa, D-Trp, Sacarina, Aspartame, IV-Conc (mM). La Figura 13 muestra las curvas de respuesta de dosis determinadas utilizando formación de imágenes fluorescentes automatizadas para una línea celular que expresa induciblemente el receptor de gusto T1R1/T1R3 para L-glutamato en la presencia o la ausencia de 0.2 mM de IMP. I-Porcentaje de Respuesta. Las Figuras 14 y 15 muestran la respuesta de una línea celular que expresa induciblemente el receptor de gusto T1R1/T1R3 humano (clon 1-17) a un panel de aminoácidos L. En la Figura 14, diferentes aminoácidos C a 10 mM se probaron en la presencia y ausencia de 1 mM de IMP, ¡-Veces de Estimulación. En la Figura 15, las respuestas de dosis para los aminoácidos activos se determinaron en la presencia de 0.2 mM de IMP. /-Respuesta normalizada, II- Aminoácidos (mM). La Figura 16 muestra que el lactisol inhibe las actividades receptoras del T1R2/T1R3 humano y T1R1/T1R3 humano. I-Respuesta normalizada, ll-Lactisol (mM), lll-Veces de incremento en los umbrales, IV-Sacarosa, D-Triptofan, MSG, MSG+IMP, NaCI, V-Lactisol (mM). El lactisol inhibe el dulce T1R2/T1R3 y los receptores acre T1R2/T1R3 y el dulce y sabor acre, (panel izquierdo) respuesta de las células HEK-Ga15 temporalmente infectadas con T1R2/T1 R3 (círculos) a 10 mM L-glutamato y células HEK~G 15 temporalmente infectada con T1 R2/T1 R3 (cuadros) a 150 mM sacarosa en ¡a presencia de las concentraciones variables de lactisol se muestran, (panel derecho) veces de incremento en los umbrales de detección de prueba en la presencia de 1 y 2 mM lactisol se muestran para la sacarosa de estímulo de sabor dulce y D-triptofan, el L-glutamato de estímulo de pruebga acre (MSG) y L-glutamato más 0.2 mM ¡MP, y cloruro de sodio. Los umbrales de detección se determinaron siguiendo el método de Schiffman et al. La Figura 17 muestra esquemas de quimeras T1R de seres humanos-ratas. Las quimeras se construyen combinando los dominios extracelulares humanos o de ratas a los dominios de transmembrana humanos o de rata respectivamente, como se muestra en h2-r2, r2-h2, h3-r3 y r3-h3. La Figura 18 muestra que la dihidrocalcona de neohesperidina (NHDC) mejora las actividades del receptor de gusto acre T1R1/T1R3. [Neohesperidin dihidrocalcona] = 5 µM. La curva de respuesta de dosis se cambia a la derecha 2.3 veces (panel izquierdo), y la respuesta de dosis de dosis de glutamato/IMP se cambia a la izquierda 2.1 veces. ¡-Relación EC50 = 2.3, II- ¡-Relación EC50 = 2.1. La Figura 19 muestra que los edulcorantes control no afectan las actividades del receptor de gusto acre T1R1/T1R3 [Esteviocida] = 0.5 mM [sacarina] = 1 mM. La respuesta de dosis del glutamato se muestra en el panel izquierdo, y la respuesta de dosis del glutamato/IMP se muestra en el panel derecho. La Figura 20 muestra mapas de NHDC al dominio de transmembrana de T1R3 humano, ¡-sacarosa. La Figura 21 muestra el mapeo de un compuesto al dominio de transmembrana T1R2 humano. ¡-Sacarosa. Las Figuras 22a-d muestran edulcorantes que mapean a diferentes subunidades/dominios del receptor dulce humano. La Figura 22a muestra respuestas de receptores dulces de seres humanos y de rata a sacarosa (200 mM), aspartame (10 mM), neotame (0.1 mM), ciclamato (10 mM) y sacarosa (200 mM) en la presencia de lactisol (1 mM) (Suc/Lac). Las células HEK-293T se transfectaron temporalmente con T1R2, T1R3 de humano y de ratas, y una quimera Ga-i5 Ga?5/¡|, y evaluados para calcio intracelular se incrementa en respuesta a edulcorantes. I-Sacarosa, Aspartame, Neotame, Ciclamato, Suc/Lac; ll-Humano, lll-Rata. La Figura 22b que muestra aspartame y neotame se mapearon al dominio extracelular N-terminal de T1R2 humano. Las combinaciones de las quimeras T1R se transfectaron temporalmente en células HEK-293T con Gai5/ii, y se evaluaron para respuestas a edulcorantes en las concentraciones listadas en 23a. La presencia o ausencia de respuesta es lo que es importante. ¡-Sacarosa, Aspartame, Neotame. La Figura 22c muestra que el ciclamato se mapeo al dominio de transmembrana C-terminal del T1R3 humano. ¡-Sacarosa, Ciclamato, Neotame. La Figura 22d que muestra lactisol se mapeo al dominio de transmembrana C-terminal de T1R3 humano. Diferentes combinaciones de quimeras T1R se transfectaron temporalmente en células HEK-293T con G Ga?5/p, y se evaluaron para respuestas a sacarosa (200 mM) y AceK (10 mM) en la ausencia o presencia de lactisol (1 mM). Las actividades en B, C y D representan el promedio ± SE de número de células de respuesta para cuatro campos de imagen de ~1,000 células confluentes. Las Figuras 23a-d muestran mutaciones en T1R2 o T1R3 que afectan selectivamente la actividad de diferentes edulcorantes. La Figura 23a muestra el alineamiento de secuencia del dominio de unión de ligando N-terminal de mGluRd de rata con los T1R2 de ser humano y de roedor. Los 8 aminoácidos críticos implicados en la unión de ligando en mGluRd se etiquetaron con *, tres de los 8 aminoácidos se conservan en T1R2 y se subrayan. La Figura 23b muestran dos mutaciones de punto en el dominio extracelular N-terminal T1R2 humano que suprime la respuesta a aspartame y neotame sin afectar el ciclamato. Las líneas celulares estables de hT1R2/hT1R3 (WT), hT1R2 S144A/hT1R3 (S144A) y hT1R2 E302A/hT1R3 (E302A) se generaron como se describe en los Ejemplos. Las respuestas de dosis de estas líneas estables se determinaron en FLIPR para sacarosa, aspartame, neomate y ciclamato. Las actividades representan el promedio ± SE de incrementos de pliegues en intensidades de fluorescencia para cuatro pozos registrados. La Figura 23c muestra el alineamiento de secuencia de los dominios de transmembrana T1R3 de ser humano y de roedor. Los tres bucles extracelulares se subrayan y se etiquetan EL1, 2 ó 3, de acuerdo a su orden en las secuencias de proteínas. La Figura 23d muestra mutaciones en el bucle extracelular de hT1R3 que suprimen la respuesta a ciclamato sin afectar el aspartame. Cada uno de los tres bucles extracelulares de hT1R3 se reemplazaron con la secuencia de proteína de rata de manera separada, y los mutantes hT1R3 resultantes se transfectaron temporalmente en células HEK-293T con Ga15/¡j, y se evaluaron para respuestas a sacarosa (200 mM), aspartame (10 mM) y ciclamato (10 mM). Las actividades representan el promedio ± SE del número de células de respuesta para cuatro campos formado en imágenes de ~1,000 células confluentes. I-Sacarosa, Aspartame, Ciclamato. Las Figuras 24a-b muestran que el T1R2 humano se requiere para el acoplamiento de Ga?s- La Figura 24a muestra respuestas de receptores dulces quiméricos, de seres humanos y de ratas a sacarosa (200 mM) y AceK (10 mM). Las células Ga15 estables se transfectaron temporalmente con los T1R humanos, de rata o quiméricos, y se evaluaron para incrementos en calcio intracelular en respuesta a edulcorantes. I-Sacarosa. La Figura 24b muestra que el acoplamiento Ga-?5 se media por el T1R2 humano. Las actividades representan el promedio ± SE de número de células de respuesta para cuatro campos de producción de imágenes de ~1,000 células confluentes. ¡-Sacarosa. Las Figuras 25a-f muestran el efecto de lactisol y ciclamato en el receptor de acre T1R1/T1R3 humano. La Figura 25a muestra la respuesta de la línea celular estable T1R1/T1R3 a L-glutamato (5 mM) y L-glutamato/IMP (1/0.2 mM) en la ausencia o la presencia de lactisol (5 mM). I-Bactisol (mM). La Figura 25b muestra que las curvas de inhibición dependientes de dosis de lactisol se determinaron para L-glutamato (Glu), y L-glutamato con 0.2 mM de IMP (Glu/IMP), cada una de dos diferentes concentraciones. Los IC50 son 0.19 ± 0.02 mM y 0.21 ± 0.01 mM para L-glutamato a 8 y 80 mM; 0.35 ± 0.03 mM y 0.82 ± 0.06 mM para L-glutamato con IMP a 0.8 y 8 mM respectivamente. I-Lactisol (mM). La Figura 25c muestra que las respuestas de dosis para L-glutamato, con o sin 0.2 mM de IMP, se determinaron en la presencia de diferentes concentraciones de lactisol. En la presencia de 0, 25 ó 50 µM de lactisol, los EC50 son 9.9 ± 1.5 mM, 7.9 ± 0.5 mM y 7.0 ± 0.3 mM para L-glutamato; en la presencia de 0, 100 ó 200 µM de lactisol, los EC50 son 0.53 ± 0.04 mM, 0.71 ± 0.10 mM y 0.84 ± 0.10 mM para L-glutamato con IMP. Los valores representan el promedio ± SE para cuatro respuestas independientes. I-Sacarosa, ¡I-Veces de incremento en el umbral. ¡Il-Lactisol (mM). La Figura 25d muestra que los umbrales de detección para el estímulo de sabor dulce, acre y salado se determinaron en la presencia o ausencia de lactisol. El efecto de inhibición de lactisol se muestra como incrementos de pliegues en los umbrales de detección. Los "umbrales de detección" se definen como el límite más bajo de los degustadores detectables. Los valores del umbral de detección se promediaron sobre cuatro pruebas para tres sujetos. I-Glutamato (mM). La Figura 25e muestra que las respuestas de la línea celular estable T1R1/T1R3 humana al nivel del umbral de L-glutamato (4 mM) y el carbacol agonista receptor M2 endógeno se evaluaron en FLIPR en la ausencia o la presencia de varias concentraciones de ciclamato. La Figura 25f muestra que las respuestas de dosis de la línea celular estable T1R1/T1R3 humana se determinaron en FLIPR para L-glutamato con o sin 0.2 mM de IMP en la ausencia o la presencia de ciclamato (8 mM). Las actividades en B, C, E y F representan el promedio ± SE de incrementos de pliegues en intensidades de fluorescencia para cuatro pozos registrados. Las respuestas de dosis en B, C, E y F se reprodujeron al menos 6 veces independientemente. La Figura 26 muestra un modelo de trabajo para las relaciones de función-estructura del receptor de gusto dulce y de acre. Las flechas rellenas indican la activación directa, las flechas abiertas indican el mejoramiento, y las cabezas de las barras indican la inhibición. I-Aspartame, ll-Neotame, ¡¡¡-Proteína G, IV-Dulce, V-Ciclamato, Vl-Lactisol, Vil-Acre. La Figura 27a muestra todas las 16 combinaciones de los T1R y las quimeras, que se probaron para respuestas a edulcorantes y lactisol. rT1 R2/T1 R3H-R, rT1R2/hT1R3 y T1R2H-R/T1R3R-H muestran una respuesta significativa a ciclamato y pueden inhibirse por lactisol. Las quimeras T1R se transfectaron temporalmente en células HEK-293T con Ga15/il. Las actividades representan el promedio ± SE de número de células de respuesta para cuatro campos de formación de imágenes de ~1,000 células confluentes, cada unidad en el eje Y representa 50 células de respuesta. Abreviaturas: Su (sacarosa 100 mM); Suc/Lac (sacarosa 100 mM, lactisol 1 mM); AceK (acesulfame K 10 mMJ); AceK/Lac (acesulfame K 10 mM, lactisol 1 mM); ATM (aspartame 10 mM); NTM (neotame 10 mM); cyc (ciclamato 10 M). La Figura 27b muestra que las curvas de inhibición dependientes de dosis de lactisol del receptor dulce humano se determinaron para sacarosa (Suc), sacarina (Sac), y D-triptofano (D-Trp), cada una en dos diferentes concentraciones. Los IC50 son 19.6 ± 0.1 µM y 64.6 ± 0.3 µM para sacarosa a 50 mM y 120 mM; 22.6 ± 0.1 µM y 103 ± 7 µM para sacarina a 0.1 y 2 mM; 19.9 ± 0.2 µM y 168 ± 9 µM para D-triptofano respectivamente. I-Lactisol (mM). La Figura 27c muestra que las respuestas de dosis del receptor dulce humano para sacarosa, D-Trp y sacarina se determinaron con diferentes concentraciones de lactisol. En la presencia de 0, 10 ó 20 µM de lactisol, los EC5o son 19.4 ± 0.9 mM, 24.7 ± 1.0 mM y 31.3 ± 0.3 mM para sacarosa; 0.37 ± 0.02 mM, 0.60 ± 0.03 mM, 0.94 ± 0.08 mM para D-Trp; 42 ± 3 µM; 67 ± 6 µM, 118 ± 2 µM para sacarina. /-Endulzante (mM). Los valores representan el promedio ± SEM para cuatro respuestas independientes. Las respuestas de dosis en B y C se determinaron al menos 6 veces independientemente, y generaron resultados similares como se muestra aquí.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona compuestos que se unen específicamente a los receptores de sabor dulce y acre quiméricos y de tipo silvestre descritos en la presente. Se proporcionan además compuestos que se unen específicamente a las subunidades T1R2 y T1R3 quiméricas o truncadas de tipo silvestre de los receptores dulces y acre. La unión al receptor dulce T1R2/T1R3 define un género grande de moléculas. Las respuestas receptoras a cada edulcorante probado, incluyendo azúcares de carbohidrato, aminoácidos y derivados, proteínas dulces, y edulcorantes sintéticos. En el tiempo promedio, el receptor exhibe estéreo-actividad para ciertos edulcorantes, por ejemplo, responde a D-triptofano, pero no a L-triptofano, que está en correlación con los datos de fisiología de sabor. De este modo, los compuestos de la invención unen específicamente receptores quiméricos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan al receptor T1R2/T1R3 quimérico que comprenden una subunidad T1R2 humana y una subunidad T1R3 de rata; un receptor T1R2/T1R3 quimérico que comprende una subunidad T1R2 de rata y una subunidad T1R3 humana; una subunidad receptora T1R2 quimérica que comprende un dominio extracelular humano, un dominio de transmembrana de rata y un dominio intracelular de rata; y una subunidad del receptor T1R3 quimérico comprende un dominio extracelular de rata, un dominio de transmembrana humano y un dominio intracelular humano. La invención proporciona receptores de sabor funcional, de preferencia receptores de sabor humano, que se reproducen por la co-expresión de una combinación de diferentes T1R, de preferencia T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, y las secuencias o fragmentos de ácido nucleico aislado correspondiente, quimeras, o variantes de los mismos que en la co-expresión resultan en un receptor de gusto funcional, es decir, un receptor de gusto dulce (T1R2/T1R3) o un receptor de gusto acre (T1R1/T1R3). Los T1R, una familia de clase de los receptores acoplados con la proteína C G (los GPCR), se expresan selectivamente en el tejido del sabor (Hoon, M.A., et al., Cell, 1999. 96(4): p. 541-51, Bachmanov, A. A., et al., Chem Senses, 2001. 26(7): p. 925-33, Montmayeur, J. P., et al., Nat Neurosci, 2001, 4(5); p. 492-8, Max, M., et al., Nat Genet, 2001. 28(1): p. 58-63, Kitagawa, M., et al., Biochem Biophys Res Común, 2001. 283(1): p. 236-42 y Nelson, G., et al., Cell, 2001. 106(3): p. 381-90). La expresión funcional de los T1R en las células HEK293 revelaron que diferentes combinaciones de los T1R responden al estímulo de sabor dulce y acre (Nelson, G., et al., Cell, 2001. 106(3): p. 381-90, Li, X., et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 2002. 99(7): p. 4692-6). T1R2 y T1R3, cuando se co-expresan en 293 células, reconocen diversos edulcorantes naturales y sintéticos. [Por la razón mencionada anteriormente re "diverso", por favor considere si se necesita esta sección para ser permitible. Si no, se eliminará. Se puede discutir], mientras T1R1 y T1R3 reconoce el L-glutamato de estimulo de sabor acre, y esta respuesta se mejora por 5'-ribonucleótidos, un sello del sabor acre. Los datos abrumadores confirman que los T1R más bien median los sabores dulces y acre de ratón (Damak, S., et al., Science, 2003 301(5634): p. 850-3, Zhao, G. Q., et al., Cell 2003 Oct 31; 115(3): 255-66). La clase de los GPCR C posee un dominio extracelular N-terminal grande, con frecuencia se refiere como el dominio de trampa de mosca Venus (VFD) (Pin, J. P., Pharmacol Ther, 2003 98(3): p. 325-54) y se conoce que funcionan como cualesquiera homodímeros, en los casos de receptores de glutamato metabotrópico (mGluRs) y el receptor de sensación de calcio (CaR), o heterodímeros, en el caso del receptor del tipo B de ácido ?-aminobutírico (GABAßR). Los datos de expresión funcionales muestran un mecanismo heterodímero para los T1R: ambos T1R1 y T1R2 necesitan ser co-expresados con T1R3 para ser funcionales, lo que se soporta por los patrones de expresión traslapantes de los T1R en lengua de roedores. Se establece en la presente que los miembros de familia T1R actúan en combinación con otros miembros de familia T1R funcionan como receptores de sabor dulce y acre. Como se describe en detalle adicional infra en los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las células heterólogas que co-expresan hT1R2 y hT1R3 se activan selectivamente por estímulo de sabor dulce en una manera que refleja sabor dulce humano. Por ejemplo, las células HEK-293Ga15 que co-expresan hT1R2 y hT1R3 responden específicamente a ciclamato, sacarosa, aspartame y sacarina, y las respuestas de dosis para estos compuestos se correlacionan con los umbrales de detección de sabor sicofísico. También, como se soporta por los datos en los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las células que co-expresan hT1R1 y hT1R3 se activan selectivamente por glutamato (glutamato monosódico) y 5'-ribonucleótidos en una manera que refleja el sabor acre humano. Por ejemplo, las células HEK-293-Ga15 que co-expresan hT1R1 y hT1R3 responden específicamente a glutamato y la respuesta de dosis para este compuesto de sabor acre se correlaciona a su umbral de detección de sabor sicofísico. Además, los 5'-ribonucleótidos tales como IMP mejoran la respuesta de glutamato del receptor T1R1/T1R3, una característica de sinergismo del sabor acre. Además, como se muestra por los datos experimentales en los ejemplos, se ha demostrado que las células que coexpresan estable e induciblemente T1R1/T1R3 responden selectivamente al L-glutamato y L-aspartato de estímulo de sabor acre y sólo responden débilmente a otros L-aminoácidos, y a concentraciones mucho más elevadas, proporcionando además evidencia de que el receptor de T1R1/T1R3 puede utilizarse en ensayos para identificar compuestos que modulan (mejoran o bloquean) el estímulo de sabor acre. Ejemplos de compuestos que se unen específicamente al receptor dulce y modulan el sabor dulce pueden encontrarse en la Tabla 5. Las Tablas 1-4 proporcionan ejemplos de compuestos que se unen específicamente al receptor de acre y modulan el sabor acre.
También, como se soporta por ios datos experimentales en los ejemplos, se ha demostrado que las líneas celulares que co-expresan T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 responden respectivamente al estímulo de sabor acre o dulce y una manera de respuesta de dosis cuantitativa que soporta además una conclusión que se une específicamente al receptor T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 pueden utilizarse para definir agonistas y antagonistas receptores, por ejemplo, sustituyentes MSG, bloqueadores acre, edulcorantes artificiales y naturales novedosos y bloqueadores de dulce. También, como se soporta por los datos en los ejemplos experimentales, se ha demostrado que el lactisol bloqueador de sabor dulce inhibe tanto el receptor de dulce T1R2/T1R3 y el receptor de gusto acre T1R1/T1R3. Los compuestos provistos en la presente, mejoran, imitan, modulan o bloquean el sabor dulce o acre. El hecho de que el lactisol inhibe tanto los receptores T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 sugiere que los receptores pueden compartir una subunidad común que se une por el lactisol y potencialmente otros moduladores de sabor. Por lo tanto, esto demuestra que algunos compuestos que mejoran, imitan, modulan o bloquean el sabor dulce, pueden tener un efecto similar en el sabor acre o viceversa. Además, como se soporta por los datos en los ejemplos experimentales, se ha demostrado que las líneas celulares que co-expresan establemente los T1R, es decir, T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3, cuando se evalúan por producción de imágenes de fluorescencia automatizada responden muy efectivamente a varios estímulos de sabor dulce y acre, es decir, en magnitudes sustancialmente mayores que las células temporalmente transfectadas. De este modo, estas líneas celulares se adaptan especialmente bien para uso en ensayos de selección de rendimiento elevado para identificar compuestos que modulan, bloquean, imitan o mejoran el sabor dulce o acre. Sin embargo, la invención abarca también ensayos que utilizan células que expresan temporalmente un T1R o una combinación de los mismos. Además, aunque la solicitud contiene datos que demuestran algunos de los T1R, que actúan en combinación, particularmente T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3, y que tales combinaciones receptoras pueden utilizarse en ensayos, de preferencia ensayos en rendimiento elevado, se debe observar que la invención objeto abarca también ensayos que utilizan T1R1, T1R2 y T1R3 solos o en combinación con otras proteínas, por ejemplo, otros GPCR. Existen diferencias en el sabor dulce en seres humanos y en roedores en términos de especificidad del ligando, la eficiencia de acoplamiento de proteína G, así como la sensibilidad a inhibidores. Las diferencias de especies en la especificidad de ligando T1R pueden utilizarse para demostrar que el receptor de gusto dulce funcionan más bien como un complejo heteromérico, y que existe más de un sitio de unión de ligando en el receptor. Además, se ha demostrado un enlace funcional entre los receptores dulces y acre mediados por T1R3 (Ejemplo 16). Ambos receptores dulces de ser humano y de rata pueden acoplarse eficientemente a un Ga15 quimérico con la secuencia de cola C-terminal a partir de Ga15 (Ga?s/?i). Por ejemplo, T1R2/T1R3 humano, pero no de rata responde selectivamente a un grupo de edulcorantes, incluyendo aspartame, neotame y ciclamate. Esto es consistente con datos de fisiología de sabor. Estas diferencias en la especificidad del agonista pueden utilizarse para mapear sus sitios de unión en el receptor. Un T1R quimérico puede generarse entre genes de ser humano y de rata, con una unión inmediatamente antes del dominio de transmembrana. Cada quimera T1R consiste por lo tanto de dos mitades, el dominio extracelular N-terminal, y el dominio de transmembrana e ¡ntracelular C-terminal, a partir de diferentes especies. Por ejemplo, un T1R2 quimérico, llamado T1R2-R, tiene una secuencia a partir del término N de T1R2 humano combinado a una secuencia T1R2 C-terminal. Las respuestas a estas quimeras pueden probarse entonces (Figura 22). Los compuestos novedosos y el sabor novedoso, los degustantes y los mejoradores dulces se descubrieron en la serie química de los derivados amida. Los compuestos amida pueden comprender también ciertas subclases de derivados de amida o clases de derivados relacionados a amidas, tales como por ejemplo, ureas, uretanos, oxalamidas, acrilamidas y similares. Estos compuestos, cuando se utilizan junto con la sacarosa o solos, incrementan una respuesta in vitro y el incremento concomitante en la percepción dulce en el sabor humano. Estos compuestos mejoran otros degustantes dulces naturales y sintéticos. Ejemplos de estos compuestos se listan en la Tabla 5. En una modalidad, la invención proporciona compuestos novedosos, saborizantes, degustantes, mejoradores de sabor, mejoradores de sabor, compuestos modificadores de sabor y/o composiciones que los contienen. En una modalidad más específica, la invención proporciona nuevos saborizantes dulces, degustantes dulces, mejoradores de sabor dulces y modificadores de sabor dulce y composiciones que los contienen. Más particularmente, en otra modalidad, la invención se dirige a compuestos que modulan, inducen, mejoran o inhiben degustantes dulces naturales o sintéticos, por ejemplo, edulcorantes de origen natural y sintéticos. En otra modalidad, la invención proporciona composiciones, de preferencia composiciones adecuadas para consumo humano o animal, que contiene al menos un compuesto de la invención. Estas composiciones incluyen alimentos, bebidas y medicamentos, y aditivos alimenticios que cuando se agregan a los alimentos, las bebidas o los medicamentos modulan el buen gusto o el sabor de los mismos, particularmente mejorando el sabor dulce de los mismos. Otra modalidad de la invención se dirige al uso de un compuesto de la invención para modular el sabor dulce de un alimento, bebida o medicamento deseado, cuya composición puede comprender uno o más diferentes compuestos que producen un sabor dulce. Estos compuestos, cuando se utilizan junto con los edulcorantes de origen natural y sintéticos, no sólo incrementan una respuesta in vitro sino también intensifican el dulce y otras percepciones de buen gusto o sabor en la degustación humana. Estos compuestos específicos, cuando se utilizan junto con los degustantes dulces, tales como los edulcorantes de origen natural y sintéticos no sólo incrementan la respuesta T1R2/T1R3 in vitro sino también intensifican el sabor dulce y otras percepciones de buen gusto o sabor en la degustación humana. Los compuestos novedosos y el sabor nuevo, el degustante y los mejoradores de acre y los degustantes tales como amidas, ureas, amino-amidas, amido-amidas y ß-lactamas se describen también en la presente. Estos compuestos, cuando se utilizan junto con MSG o solos, incrementan una respuesta in vitro y la percepción acre en la degustación humana. Estos compuestos mejoran también otros degustantes acre sintéticos y naturales. Ejemplos de estos compuestos se listan en las Tablas 1-4. En una modalidad, la invención proporciona compuestos novedosos, saborizantes, degustantes, mejoradores de sabor, mejoradores de sabor, compuestos que modifican el sabor, y/o composiciones que los contienen. En una modalidad más específica, la invención proporciona novedosos saborizantes acre, degustantes acre, mejoradores de sabor acre y los modificadores de sabor acre y composiciones que los contienen. Más particularmente, en otra modalidad, la invención se dirige a compuestos que modulan (inducen, mejoran o inhiben) degustantes naturales o sintéticos acre, por ejemplo, glutamato monosódico (MSG). En otra modalidad, la invención proporciona composiciones, de preferencia composiciones adecuadas para consumo humano o animal, que contiene al menos un compuesto de la invención. Estas composiciones incluyen alimentos, bebidas y medicamentos, y aditivos alimenticios que cuando se agrega a los alimentos, bebidas o medicamentos modulan el buen gusto o el sabor de los mismos, particularmente mejorando el sabor acre de los mismos. Otra modalidad de la invención se dirige al uso de un compuesto de la invención que modula el sabor acre de un alimento, bebida o medicamento deseado, cuya composición puede comprender uno o más compuestos diferentes que producen un sabor acre, por ejemplo, MSG. Estos compuestos, cuando se utilizan junto con el MSG, no sólo incrementan una respuesta in vitro, sino también intensifican el acre y otras percepciones de buen gusto o sabor en la desgustación humana. Estos compuestos específicos, cuando se utilizan junto con los degustantes acre, tales como MSG, no sólo incrementan la repuesta T1R1/T1R3 in vitro sino también intensifican el sabor acre y otras percepciones de buen gusto o sabor en la degustación humana. Algunos de estos compuestos, cuando se degustan solo, producen percepción de acre humana. Los compuestos definidos por la unión específica a receptores específicos que utilizan los ensayos T1R presentes pueden utilizarse para modular el sabor de alimentos y bebidas. Los ensayos adecuados descritos en detalle adicional infra incluyen a modo de ejemplo ensayos de célula completos y ensayos bioquímicos, que incluyen ensayos de unión directa utilizando una de una combinación de diferentes receptores T1R, quimeras o fragmentos de los mismos, especialmente fragmentos que contienen dominios de unión de ligando N-terminales. Ejemplos de ensayos apropiados para uso en la invención se describen en mayor detalle infra y se conocen en el campo de GPCR. Pueden diseñarse ensayos que cuantifican la unión de diferentes compuestos o mezclas de compuestos a receptores de sabor T1R o combinaciones del receptor de gusto T1R o receptores T1R expresados en combinación con otras proteínas (sin T1R) heterólogas, por ejemplo, otros GPCR, o que cuantifican la activación de células que expresan los receptores de sabor T1R. Esto puede efectuarse por receptores de sabor que se expresan estable o temporalmente en células heterólogas tales como células HEK-293, CHO y COS. De este modo, esta característica fisicoquímica de los compuestos se utiliza para definir un género del compuesto que comparte esta característica. Los ensayos utilizarán de preferencia células que expresan también (preferiblemente de manera estable) una proteína G tal como G 15 o Ga16 u otras proteínas G promiscuas o variantes de la proteína G, o una proteína G endógena. Además, las proteínas Gß y G? pueden expresarse también en la presente. El efecto de un compuesto en el sabor dulce o acre al utilizar células o composiciones que expresan o contienen los receptores identificados anteriormente o combinaciones de receptores pueden determinarse por varios medios, incluyendo el uso de tintes sensibles al calcio, tintes sensibles al voltaje, ensayos cAMP, ensayos de unión directa que utilizan ligandos fluorescentemente etiquetados o ligandos radioactivos tales como 3H-glutamato, o ensayos transcripcionales (utilizando un reportero adecuado tal como luciferasa o beta-lactamasa). Los ensayos que pueden utilizarse con uno o más T1R de acuerdo a la ¡nvención incluyen a modo de ejemplo, ensayos que utilizan una selección genética para células vivas; ensayos que utilizan células completas o fragmentos de membrana o proteínas T1R purificadas; ensayos que utilizan segundos mensajeros tales como cAMP e IP3, ensayos que detectan el desplazamiento de arrestina a la superficie celular, ensayos que detectan la pérdida de la expresión receptora en la superficie celular (interiorización) por ligandos probados, ensayos de unión de ligando directo, ensayos de unión competitivo con inhibidores, ensayos que utilizan proteína traducida in vitro, ensayos que detectan los cambios conformacionales en la unión de un ligando (por ejemplo como se evidencia por proteólisis, fluorescencia o NMR), ensayos conductistas que utilizan animales no humanos transgénicos que expresan un T1R o combinación de T1R, tal como moscas, gusanos o ratones, ensayos que utilizan células infectadas con virus recombinantes que contienen genes T1R. También dentro del alcance de la invención están los análisis basados en estructuras en donde la estructura de cristal de rayos X de un T1R o un fragmento de T1R (o combinación de los T1R, o una combinación de un T1R con otra proteína) se determina y utiliza para pronosticar compuestos de técnicas de modelado molecular que se unirán a y/o mejorarán, imitarán, bloquearán o modularán el receptor T1R o combinación del receptor. Más particularmente, la invención abarca la determinación de la estructura de cristal de T1R1/T1R3 (de preferencia hT1R1/hT1R3) y/o T1R2/T1R3 (de preferencia hT1R2/hT1R3) y el uso de tales estructuras de cristal en los métodos de diseño basados en la estructura para identificar moléculas que modulan la actividad receptora T1R. La invención incluye especialmente ensayos bioquímicos conducidos utilizando células, por ejemplo, mamíferos, levaduras, insectos u otras células heterólogas que expresan uno o más receptores o fragmentos T1R de longitud total, de preferencia dominios N-terminales de T1R1, T1R2 y/o T1R3. El efecto de un compuesto en tales ensayos pueden determinarse utilizando ensayos de unión competitiva, por ejemplo, utilizando glutamato radioactivo de IMP, fluorescencia (por ejemplo, polarización de fluorescencia, FRET), o ensayos de unión GTP? 35S. Como se observa, en una modalidad preferida, tales ensayos utilizarán líneas celulares que co-expresan establemente T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 y una proteína G adecuada, tal como Ga15. Otras proteínas G apropiadas incluyen las proteínas G variantes o quiméricas descritas en la Solicitud de Patente No. de Serie 09/984,292 y 60/243,770, incorporada para referencia en su totalidad en la presente. Aún todavía, los receptores alterados pueden construirse y expresarse teniendo propiedades mejoradas, por ejemplo, expresión de superficie mejorada o acoplamiento de proteína G. Estas variantes T1R pueden incorporarse dentro de ensayos basados en células y bioquímicos. Se visualizó que los presentes descubrimientos que se relacionan a los T1R humanos se extenderán a otras especies, por ejemplo, roedores, puercos, monos, perros y gatos y quizás también a no mamíferos tales como peces. En este sentido, varios fragmentos T1R de pez se identificaron infra en el Ejemplo 1. Por lo tanto, la invención objeto tiene aplicación al seleccionar compuestos para uso en formulaciones de alimentos para animales. La invención incluye además aquella que utiliza variantes alélicas diferentes de varios de los T1R y combinaciones de los mismos, por lo que se permite la identificación de los compuestos que producen sensación de sabor específico en individuos que expresan aquellas variantes alélicas o compuestos que producen sensaciones de sabor específicas en todos los individuos. Tales compuestos pueden utilizarse para hacer alimentos generalmente más sabrosos. Los ácidos nucleicos que codifican T1R proporcionan también sondas valiosas para la identificación de células del gusto, ya que los ácidos nucleicos se expresan específicamente en células del gusto. Por ejemplo, las sondas para los polipéptidos T1R y las proteínas pueden utilizarse para identificar células del gusto presentes en foliato, circunvalato, y papila fungiforme, así como células del gusto presentes en las estrías gustativas, la cavidad oral, el epitelio gastrointestinal, y el epiglotis. En particular, los métodos para detectar los T1R pueden utilizarse para identificar células del gusto sensibles al estímulo de sabor dulce y/o acre u otro estímulo de sabor que representa otras modalidades de sabor. Por ejemplo, las células que expresan estable o temporalmente T1R2 y/o T1R3 serían pronosticadas a partir del trabajo en la presente para ser responsables del estímulo de sabor dulce. De manera similar, las células que expresan T1R1 y/o T1R3 se pronosticaría que son sensibles al estímulo de sabor acre. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas T1R y los polipéptidos de la invención pueden aislarse a partir de una variedad de fuentes, genéticamente diseñadas, amplificadas, sintetizadas, y/o expresadas recombinantemente de acuerdo con los métodos descritos en la WO 00/035374, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Una lista de los T1R que pueden expresarse de acuerdo con la invención se proporciona en los Ejemplos. Sin embargo, se debe e?fatizar que la ¡nvención abarca la expresión y el uso de otros de los T1R o fragmentos específicos, variantes, o quimeras construidas con base en tales secuencias T1R, y particularmente los T1R de otras especies. Como se describe, un aspecto importante de la invención es la pluralidad de métodos al seleccionar moduladores, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, mejoradores, agonistas y antagonistas, de estos GPCR específicos de células del gusto. Tales moduladores de transducción de sabor son útiles para la modulación de trayectorias de señalización de sabor. Estos métodos de selección pueden utilizarse para identificar agonistas y antagonistas de alta afinidad de la actividad de las células del gusto. Estos compuestos moduladores pueden entonces utilizarse en la industria alimenticia para personalizar un sabor, por ejemplo, para modular los sabores dulces y/o acre de alimentos. Esta invención rectifica la carencia previa de entendimiento con relación al sabor dulce y acre cuando identifica los T1R específicos y las combinaciones del receptor T1R que median la sensación de sabor dulce y acre. Por lo tanto, en general, esta solicitud se relaciona a los descubrimientos con relación a la clase T1R de los receptores acoplados con la proteína G específica del sabor y su función específica en la percepción de sabor y la relación de estos descubrimientos a un mejor entendimiento de la base molecular del sabor. La base molecular del sabor dulce y del sabor acre - el sabor del glutamato monosódico - es enigmático. Recientemente, una clase de tres miembros de los receptores de la proteína G específicos de sabor, llamados los T1R, se identificó. Al traslapar los patrones de expresión T1R y la demostración de que el receptor GABAB estructuralmente relacionado es heterodimérico sugiere que la función de los T1R como receptores de sabor heterodimérico. En los ejemplos infra, se describe la co-expresión funcional de T1R1, T1R2 y T1R3 humanos en células heterólogas; células que co-expresan T1R1 y T1R3 se activan por estímulo de sabor acre; células que co-expresan T1R2 y T1R3 se activan por el estímulo de sabor dulce. La actividad de T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 se correlaciona con los umbrales de detección sicofísicos. Además, el IMP de 5'-ribonucleótido se encontró que mejora la respuesta de T1R1/T1R3 a glutamato, una característica de sinergismo del sabor acre. Estos hallazgos demuestran que los T1R específicos y combinaciones particularmente diferentes de la función de los T1R como receptores de sabor dulce y acre. La percepción humana de lo amargo, dulce y acre se piensa que se media por los receptores acoplados de proteína G (Lindemann, B., Physiol. Res. 76:718-66 (1996)). Recientemente, la evaluación del genoma humano revela la clase T2R de los receptores de sabor amargo (Adier et al., Cell 100:613-702 (2000), Chandrasgekar et al., Cell 100:703-11 (2000); Matsunammi et al., Nature 404: 601-604 (2000)), pero los receptores para sabor dulce y acre no han sido identificados. Recientemente, se identificó otra clase de receptores de sabor candidatos, los T1R. Los T1R se identificaron primero por secuenciación a gran escala de una biblioteca de ADNc deducida derivada del tejido del gusto de rata, que identifica T1R1, y subsecuentemente por PCR degenerado basado en T1R1, que conduce a la identificación de T1R2 (Hoon et al., Cell 96:541-551 (1999)). Recientemente, se ha identificado un tercer y posiblemente miembro final de la familia T1R, T1R3, en el banco de datos del genoma humano (Kitagawa et al., Biochem Biophys. Res Commun. 283(1): 236-42 (2001); Max et al., Nat. Genet. 28(1): 58-63 (2001); Sainz et al., J. Neurochem. 77(3): 896-903 (2001); Montmayeur et al., Nat. Neurosci. 4, 492-8. (2001)). Contundentemente, T1R3 de ratón mapea a un intervalo genómico que contiene Sac, un lugar que influencia el sabor dulce en el ratón (Fuller et al, J. Hered. 65:33-6 (1974); Li et al., Mamm. Genome 12:13-16 (2001)). Por lo tanto, el T1R3 se pronosticó para funcionar como un receptor de gusto dulce. Recientes estudios de mapeo genético de resolución elevada han fortalecido la conexión entre el T1R3 de ratón y Sac (Fuller T.C., J. Hered. 65(1): 33-36 (1974); Li et al., Mammal. Genome 12(1): 13-16 (2001)). De manera interesante, todos los receptores de la familia C que han sido expresado funcionalmente hasta ahora -receptores de glutamato bastante metabotrópicos, el receptor GABAB, el receptor de sensación de calcio (Conigrave, A.D., Quinn, S. J. & Brown, E. M., Proc Nati Acad Sci U S A 97, 4814-9. (2000)) y un receptor olfativo de pescado (Speca, D.J. et al., Neuron 23, 487-98. (1999)) - ha demostrado activarse por aminoácidos. Esta característica común eleva la posibilidad de que los T1R reconozcan aminoácidos, y de que los T1R puedan implicarse en la detección de glutamato además de aminoácidos de sabor dulce. Alternativamente, una variante transcripcional del receptor de glutamato metabotrópico mGluR4 se ha propuesto para ser el receptor de gusto acre debido a su expresión selectiva en el tejido del gusto de rata, y la similaridad del umbral de activación del receptor al umbral de detección sicofísico del glutamato (Chaudhari et al., Nat. Neurosci. 3:113-119 (2000)). Esta hipótesis es difícil de compaginar con el nivel de expresión extremadamente bajo de la variante mGluR4 en el tejido del gusto, y el sabor de glutamato más o menos inalterado de ratones knockout (Chaudhari y Roper, Ann. N.Y. Acad. Sci. 855:398-406 (1998)). Además, la variante de sabor es estructuralmente implausible, careciendo no sólo de la mayoría de los residuos que forman el grupo de unión del glutamato del receptor de tipo silvestre, sino también de aproximadamente la mitad del dominio de unión del glutamato N-terminal globular (Kunishima et al., Nature 407:971-7 (2000)). El análisis comparativo de los patrones de expresión de T1R en roedores ha demostrado que T1R2 y posiblemente T1R1 se co-expresan cada uno con T1R3 (Hoon et al., Cell 96:541-51 (1999); Kitagawa et al., Biochem Biophy. Res. Commun. 283:236-242 (2001); Max et al., Nat. Genet. 28:58-63 (2001); Montmayeur et al., Nat. Neurosci 4:492-8 (2001); Sainz et al., J. Neurochem 77:896-903 (2001)). Además, la dimerización está emergiendo como un tema común de los receptores de la familia C: el glutamato metabotrópico y el receptor de sensación de calcio son homodímeros (Romomano et al., J. Biol. Chem. 271:28612-6 (1996); Okamoto et al., J. Biol. Chem. 273:13089-96 (1998); Han et al., J. Biol. Chem. 274:100008-13 (1999); Bai et al., J. Biol. Chem. 273:23605-10 (1998)), y el receptor GABAB estructuralmente relacionado es heterodimérico (Jones et al., Nature 396:674-9 (1998); Kaupmann et al., Nature 396:683-687 (1998); White et al., Nature 396:679-682 (1998); Kuner et al., Science 283:74-77 (1999)). Se ha demostrado por la co-expresión funcional de los T1R en células heterólogas que las funciones de T1R2 humanas en combinación con T1R3 humano es un receptor de gusto dulce y que las funciones de T1R1 humanas en combinación con T1R3 humano es un receptor del sabor acre. Los descubrimientos discutidos en la presente son especialmente significativos, ya que se ha entorpecido previamente el desarrollo de edulcorantes artificiales mejorados por la falta de ensayos para el sabor dulce. Ciertamente, los cinco edulcorantes artificiales, comerciales, comúnmente utilizados, todos los cuales activan hT1R2/hT1R3, se descubrieron accidentalmente. De manera similar, otros diferentes de la prueba sensorial, un proceso laborioso, no se evalúa para identificar compuestos que modulan el sabor acre. Estos problemas se alivian ahora debido a que se estabilizan por los resultados experimentales discutidos infra, los receptores de acre y de dulce humanos se han identificado, y los ensayos para estos receptores se han desarrollado, particularmente ensayos que utilizan células que expresan establemente un receptor de gusto T1R funcional, es decir, el receptor de gusto dulce o acre. Con base en esto, la invención proporciona ensayos para detectar y caracterizar compuestos que modulan el sabor, en donde los miembros de la familia T1R actúan, haciéndolo en las papilas del gusto, como moléculas reporteras para el efecto en el sabor dulce y acre de los compuestos que modulan el sabor. Particularmente provistos y dentro del alcance de la invención son los ensayos para identificar compuestos que modulan, ¡mita, mejoran y/o bloquean individualmente, los sabores dulces y acres. Los métodos para evaluar la actividad de los GPCR, y especialmente los compuestos que afectan la actividad de GPCR son bien conocidos y son aplicables al miembro de la familia T1R de la presente ¡nvención y combinaciones funcionales del mismo. Los ensayos adecuados se han identificados supra. La invención proporciona también compuestos que unen T1R1, T1R2, T1R3, T1R2/T1R3 o T1R1/T1R3, o cualquier fragmento, porción o subunidad de la misma, como se describe completamente. En particular, los GPCR objeto pueden utilizarse en ensayos, para por ejemplo, medir cambios en la unión del ligando, la concentración de ion, el potencial de membrana, el flujo de corriente, el flujo iónico, la transcripción, las interacciones del receptor-ligando, las concentraciones del segundo mensajero, in vitro e in vivo. En otra modalidad, los miembros de la familia T1R pueden expresarse recombinantemente en células, y la modulación de la transducción de sabor a través de la actividad de GPCR puede evaluarse midiendo los cambios en los niveles de Ca2+ y otros mensajes intracelulares tales como cAMP, cGMP o IP3.
En ciertos ensayos, un dominio de un polipéptido T1R, por ejemplo, un dominio extracelular, de transmembrana, o intracelular, se fusiona a un polipéptido heterólogo, por lo que se forma un polipéptido quimérico, por ejemplo, una proteína quimérica con actividad GPCR. Particularmente contemplado es el uso de fragmentos de T1R1, T1R2 o T1R3 que contienen el dominio de unión del ligando N-terminal. Tales proteínas son útiles, por ejemplo en ensayos para identificar ligandos, agonistas, antagonistas u otros moduladores de los receptores T1R. Por ejemplo, un polipéptido T1R puede expresarse en una célula eucariótica como un receptor quimérico con una secuencia chaperona que facilita el tráfico de membrana de plasma, o la maduración y direccionamiento a través de la trayectoria secretoria. La secuencia heteróloga óptima puede ser un péptido de interacción de dominio PDZ, tal como un fragmento PDZIP C-terminal (SEC. DE IDENT. NO.: 1). El PDZIP es una señal de exportación ER, que, de acuerdo a la presente invención, ha demostrado que facilita la expresión superficial de las proteínas heterólogas tales como los receptores T1R descritos en la presente. Más particularmente, en un aspecto de la ¡nvención, el PDZIP puede utilizarse para promover el objetivo propio de las proteínas de membrana problemáticas tales como los receptores olfativos, receptores de sabor T2R, y los receptores de sabor T1R descritos en la presente. Ejemplos de tales receptores quiméricos incluyen receptores trans-especie. Cualquier combinación de las subunidades receptoras a partir de varias especies pueden utilizarse juntas para formar un receptor quimérico, que puede utilizarse entonces para identificar degustantes, por ejemplo. Por lo tanto, contemplados en la presente como un receptor T1R2/T1R3 quimérico que comprende una subunidad T1R2 humana y una subunidad T1R3 de rata. También contemplado es un receptor T1R2/T1R3 quimérico que comprende una subunidad T1R2 de rata y una subunidad T1R3 humana. También contemplada es una subunidad del receptor T1R2 quimérico que comprende, un dominio extracelular de ser humano, un dominio de transmembrana de rata y un dominio intracelular de rata (SEC. DE IDENT. NOS.: 16 y 17, por ejemplo). También contemplada es una subunidad del receptor T1R3 quimérico que comprende, un dominio extracelular de rata, un dominio de transmembrana humano y un dominio intracelular humano (SEC. DE IDENT. NOS.: 18 y 19, por ejemplo). Tales receptores T1R quiméricos pueden expresarse en cualquier célula eucariótica, tal como células HEK-293. De preferencia, las células que contienen una proteína G, de preferencia una proteína G promiscua tal como Ga-?5 o Ga16 u otro tipo de proteína G promiscua capaz de unir un rango amplio de los GPCR a una trayectoria de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa C. La activación de tales receptores quiméricos en tales células puede detectarse utilizando cualquier método estándar, tal como detectando cambios en el calcio intracelular detectando la fluorescencia dependiente de FURA-2 en la célula. Si se prefieren células huéspedes que no expresan una proteína G apropiada, éstas pueden transfectarse con un gen que codifica una proteína G promiscua tal como aquellas descritas en la Solicitud Norteamericana No. de Serie. 60/243,770, la Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/984,297, presentada el 29 de octubre del 2001, y la Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/989,497, presentada el 21 de noviembre del 2001, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Métodos adicionales para evaluar moduladores de transducción de sabor incluyen ensayos de unión de ligando in vitro utilizando: polipéptidos T1R, porciones de los mismos, es decir, el dominio extracelular, región de transmembrana o combinaciones de los mismos, o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de un miembro de la familia T1R; células de cultivo de oocitos o tejido que expresan polipéptidos T1R, fragmentos, o proteínas de fusión; la fosforilación o desfosforilación de los miembros de la familia T1R; unión de proteína G a los GPCR; ensayos de unión de ligando; voltaje, potencial de membrana y cambios de conducción; ensayos de flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como cGMP, cAMP y trifosfato de inositol (IP3); y cambios en los niveles de calcio intracelular.
Además, la invención proporciona métodos para detectar el ácido nucleico T1R y la expresión de proteína, permitiendo la investigación de la regulación de transducción de sabor y la identificación específica de las células receptoras de sabor. Los miembros de la familia T1R proporcionan también sondas del ácido nucleico útiles para investigaciones de paternidad y de forense. Los genes T1R son también útiles como sondas del ácido nucleico para identificar células receptoras de sabor, tales como células receptoras de sabor de foliato, fungiformes, circunvalares, estrías gustativas y epiglotis. Los receptores T1R pueden utilizarse también para generar anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para identificar células receptoras de sabor. Funcionalmente, los polipéptidos T1R comprenden una familia de siete receptores acoplados de proteína G de transmembrana, las cuales se cree que están implicadas en la transducción de sabor y pueden interactuar con una proteína G para mediar la transducción de señal de sabor (véase, por ejemplo, Fong, Cell Signal, 8:217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol., 6:180 (1994)). Estructuralmente, las secuencias de nucleótidos de los miembros de la familia T1R codifican polipéptidos relacionados que comprenden un dominio extracelular, siete dominios de transmembrana, y un dominio citoplásmico. Los genes de la familia T1R relacionados a partir de otras especies comparten al menos aproximadamente 50% y opcionalmente 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia nucleótido sobre una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, opcionalmente 100, 200, 500 ó más nucleótidos de longitud a las secuencias del ácido nucleico T1R descritas en la presente en los Ejemplos, o variantes moderadamente modificadas de los mismos, o codifican polipéptidos que comparten al menos aproximadamente 35 a 50%, y opcionalmente 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia de aminoácido sobre una región de aminoácido de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos de longitud a una secuencia de polipéptido T1R descrita infra en las variantes moderadamente modificadas de los ejemplos de los mismos. Varias secuencias o dominios de aminoácido consenso han identificado también que son característicos de los miembros de la familia T1R. Por ejemplo, los miembros de la familia T1R comprenden normalmente una secuencia que tiene al menos aproximadamente 50%, opcionalmente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95-99% o mayor, identidad a secuencias 1 y 2 consenso T1R (SEC. DE IDENT. NOS.: 2 y 3, respectivamente). Estos dominios conservados pueden utilizarse de este modo para identificar miembros de la familia T1R, por identidad, por hibridización específica o por amplificación, o por unión específica por anticuerpos elevados contra un dominio. Las secuencias consenso T1R incluyen a modo de ejemplo las siguientes secuencias: Secuencia 1 Consenso de la Familia T1R: (SEC. DE IDENT. NO.: 2) (TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE(WL)(RHG)E Secuencia 2 Consenso de la Familia T1R: (SEC. DE IDENT. NO.: 3) (LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML) Estas secuencias consenso son inclusivas de aquellas encontradas en los polipéptidos T1R descritos en la presente, pero los miembros de la familia F1R a partir de otros organismos pueden esperarse que comprendan secuencias consensos que tienen aproximadamente 75% de identidad o más de las secuencias consenso inclusive descritas específicamente en la presente. Las regiones específicas del nucleótido T1R y las secuencias de aminoácido pueden utilizarse para identificar variantes polimórficas, homólogos de inter-especies, y alelos de los miembros de la familia T1R. Esta identificación puede hacerse in vitro, por ejemplo, bajo condiciones de hibridización rigurosa o PCR (por ejemplo, utilizando cebadores que codifican las secuencias consenso T1R identificadas anteriormente), o utilizando la información de secuencia en un sistema de computadora para la comparación con otras secuencias de nucleótido. Diferentes alelos de genes T1R dentro de una sola población de especie serán también útiles para determinar si diferencias en las secuencias alélicas controlan las diferencias en la percepción de sabor entre los miembros de la población. La amplificación del tipo PCR clásica y las técnicas de clonación son útiles para aislar nuevos T1R, por ejemplo, en donde los cebadores degenerados son suficientes para detectar genes relacionados a través de las especies. Normalmente, la identificación de variantes y aielos polimórficos de los miembros de la familia T1R pueden hacerse comparando una secuencia de aminoácido de aproximadamente 25 aminoácidos o más, por ejemplo, 50-100 aminoácidos. La identidad de los aminoácidos de aproximadamente al menos 35 a 50%, y opcionalmente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95-99% o demuestra normalmente que una proteína es una variante polimórfíca, un homólogo de inter-especie, o alelo de un miembro de la familia T1R. La comparación de secuencia puede realizarse utilizando cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencia discutidos posteriormente. Los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos T1R o una región conservada de los mismos pueden utilizarse también para identificar alelos, homólogos de inter-especies, y variantes polimórficas. Las variantes polimórficas, los homólogos de inter-especies y los alelos de los genes T1R pueden confirmarse examinando la expresión específica de célula de sabor del gen T1R putativo o de la proteína. Normalmente, los polipéptidos T1R que tienen una secuencia de aminoácido en la presente pueden utilizarse como un control positivo en comparación al polipéptido T1R putativo para demostrar la identificación de una variante o alelo polimórfico del miembro de la familia T1R. Las variantes polimórficas, alelos y homólogos de inter-especie se espera que retengan la estructura de siete transmembranas de un receptor acoplado con la proteína G. Para detalle adicional, véase WO 00/06592, la cual describe miembros de la familia T1R relacionados, los GPCR-B3, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia en una manera consistente con esta descripción. Los receptores GPCR-B3 se refieren en la presente como rT1R1 y mT1R1. Adicionalmente, véase WO 00/06593, que también describe miembros de la familia T1R relacionados, los GPCR-B4, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia en una manera consistente con esta descripción. Los receptores GPCR-B4 se refieren en la presente como rT1R2 y mT1R2. Como se discute previamente, la invención incluye también ensayos basados en estructuras que utilizan la estructura cristalina de rayos X de un T1R o combinación de T1R, por ejemplo, hT1R2/hT1R3 o hT1R1/hT1R3, para identificar moléculas que modulan la actividad del receptor T1R y por lo tanto modulan el sabor dulce y/o acre. La presente invención proporciona también ensayos, de preferencia ensayos de rendimiento elevado, para identificar moléculas que mejoran, imitan, bloquean y/o modulan los receptores T1R. En algunos ensayos, un dominio particular de un miembro de la familia T1R se utiliza en combinación con un dominio particular de otro miembro de la familia T1R, por ejemplo, un dominio o una región extracelular, de transmembrana o intracelular. En otras modalidades, un dominio extracelular, una región de transmembrana o una combinación de los miembros puede unirse a un sustrato sólido, y utilizarse, por ejemplo, para aislar ligandos, agonistas, antagonistas o cualesquiera otras moléculas que pueden unir y/o modular la actividad de un polipéptido T1R. Varias mutaciones y sustituciones conservadoras se visualizan para estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, está dentro del nivel de experiencia en la técnica para realizar sustituciones de aminoácido utilizando protocolos conocidos de tecnología de gen recombinante incluyendo PCR, clonación genética, mutagénesis sitio-dirigida del ADNc, transfección de células huéspedes, transcripción in vitro. Las variantes podrían entonces seleccionarse para actividad.
Definiciones Como se utiliza en la presente, los siguientes términos tienen los significados asignados a ellos a menos que se especifique de otra manera. "Células del gusto" incluyen células neuroepiteliales que se organizan dentro de grupos para formar papilas del gusto de la lengua, por ejemplo, células de foliato, fungiformes y circunvalares (véase por ejemplo, Roper et al., Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353 (1989)). Las células del gusto se encuentran también en el paladar y otros tejidos, tales como el esófago y el estómago. "T1R" se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados con la proteína G que se expresan en células del gusto tales como células de foliato, fungiformes y circunvalares, así como células del paladar y el esófago (véase por ejemplo, Hoon et al., Cell, 96:541-551 (1999), incorporada en la presente para referencia en su totalidad). Los miembros de esta familia se refieren también como GPCR-B3 y TR1 en la WO 00/06592 así como GPCR-B4 y TR2 en la WO 00/06593. GPCR-B3 se refiere también en la presente como rT1R1, y GPCR-B4 se refiere como rT1R2. Las células receptoras de sabor pueden identificarse también en la base de la morfología (véase por ejemplo, Roper, supra) o por la expresión de proteínas específicamente expresadas en las células del gusto. Los miembros de la familia T1R pueden tener la capacidad de actuar como receptores para transducción de sabor dulce, o para distinguirse entre varias otras modalidades de sabor. Las secuencias T1R representativas incluyendo hT1R1, hT1R2 y hT1R3 se identifican infra en los ejemplos. Los ácidos nucleicos "T1R" codifican una familia de los GPCR con regiones de siete transmembranas que tienen una "actividad receptora acoplada con la proteína G", por ejemplo, pueden unirse a las proteínas G en respuesta al estímulo extracelular y promueve la producción de segundos mensajeros tales como 1P3, cAMP, cGMP y Ca2+ a través de la estimulación de enzimas tales como fosfolipasa C y adenilato ciclasa (para una descripción de la estructura y la función de los GPCR, véase por ejemplo, Fong, supra y Baldwin, supra). Una sola célula de sabor puede contener muchos distintos polipéptidos T1R. El término familia "T1R" se refiere por lo tanto a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos de inter-especie que: (1) tienen al menos aproximadamente 35 a 50% de identidad de secuencia de aminoácido, opcionalmente alrededor de 60, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a un polipéptido T1R, de preferencia aquellos identificados en el Ejemplo 1, sobre una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) se une específicamente a anticuerpos elevados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácido de preferencia seleccionada a partir del grupo que consiste de la secuencia de polipéptido T1R descrita en el Ejemplo 1 y variantes modificadas moderadamente del mismo; (3) se codifican por la molécula de ácido nucleico que hibridiza específicamente (con un tamaño de al menos aproximadamente 100, opcionalmente al menos aproximadamente 500-1000 nucleótidos) bajo condiciones de hibridización rigurosa a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de las secuencias del ácido nucleico T1R contenidas en el Ejemplo 1, y variantes moderadamente modificadas del mismo; o (4) comprende una secuencia al menos aproximadamente 35% a 50% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido T1R identificada en el Ejemplo 1. Topológicamente, los T1R descritos en la presente tienen un "dominio N-terminal" también llamado "dominio extracelular" que comprende un "dominio de trampa de moscas Venus" y un "dominio rico en cisteína"; los "dominios de transmembrana" comprenden regiones de siete transmembranas, y bucles citoplásmicos y extracelulares correspondientes; y un "dominio C-terminal" (véase, por ejemplo, Hoon ef al., Cell, 96: 541-551 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-187 (1991)). Estos dominios se han identificado estructuralmente utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como programas de análisis de secuencia que identifican dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (Stryer, Biochemistry, (3rd ed. 1988). Tales dominios son útiles para hacer proteínas quiméricas y para ensayos in vitro de la invención, por ejemplo, ensayos de unión de ligando. La unión específica de un compuesto de estos dominios estructuralmente definidos proporciona una definición estructural para el compuesto. Los "dominios extracelulares" se refieren por lo tanto a los dominios de los polipéptidos T1R que se proyectan a partir de la membrana celular y se exponen a la cara extracelular de la célula. Tales dominios generalmente incluyen el "dominio N Terminal" que se expone a la cara extraceiular de la célula, y pueden incluir opcionalmente porciones de los bucles extracelulares del dominio de transmembrana que se exponen a la cara extracelular de la célula, es decir, los bucles entre las regiones 2 y 3 de transmembrana, entre las regiones 4 y 5 de transmembrana y entre las regiones 6 y 7 de transmembrana. La región de "dominio N Terminal" inicia en el término N y se extiende a una región cercana al inicio del primer dominio de transmembrana. Más particularmente, en una modalidad de la invención, este dominio inicia en el término N y finaliza aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición 563 en el aminoácido más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. Estos dominios extracelulares son útiles para ensayos de unión de ligando in vitro, ambos de fase soluble y sólida. Además, las regiones de transmembrana descritas posteriormente, pueden unir el ligando ya sea en combinación con el dominio extracelular, y son por lo tanto también útiles para ensayos de unión de ligando in vitro. El "dominio rico en cisteína" se refiere al dominio de los polipéptidos. Esta secuencia conservada contiene varios residuos Cys altamente conservados que forman puentes disulfuro, y se sitúan fuera de la membrana celular. Esta región corresponde al dominio de los miembros de la familia T1R y se encuentra en todas las tres subunidades, T1R1-T1R3. La secuencia rica en cisteína se encuentra en aminoácidos 510-566 de T1R1, 508-565 de T1R2 y 512-568 o T1R3. El "dominio de transmembrana", el cual comprende las siete "regiones de transmembrana", se refiere al dominio de polipéptidos T1R que yace dentro de la membrana en plasma y puede también incluir los bucles citoplásmicos (intracelulares) y extracelulares correspondientes. En una modalidad, esta región corresponde al dominio de miembros de la familia T1R que inicia aproximadamente en el residuo de ácido glutámico conservado en la posición 563 de aminoácido más o menos 20 aminoácidos y finaliza aproximadamente en el residuo de aminoácidos de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos. Las sietes regiones de transmembrana y los bucles extracelulares y citoplásmicos pueden identificarse utilizando métodos estándares, como se describe en Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)), o en Stryer, supra. Los "dominios citoplásmicos" se refieren a los dominios de los polipéptidos T1R que encaran el interior de la célula, por ejemplo, el "dominio C-terminal" y los bucles intracelulares del dominio de transmembrana, por ejemplo, el bucle intracelular entre las regiones 1 y 2 de transmembrana, el bucle intracelular entre las regiones 3 y 4 de transmembrana, y el bucle intracelular entre las regiones 5 y 6 de transmembrana. El "dominio C Terminal" se refiere a la región que se extiende a través del final del último dominio de transmembrana y el término C de la proteína, y el cual se ubica normalmente dentro del citoplasma. En una modalidad, esta región inicia en el residuo de aminoácido de tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa en el término C del polipéptido. El término "región de unión de ligando" o "dominio de unión de ligando" se refiere a secuencias derivadas de un receptor de gusto, particularmente un receptor de gusto que incorpora sustancialmente al menos el dominio extracelular del receptor. En una modalidad, el dominio extracelular de la región de unión de ligando puede incluir el domino N Terminal y, opcionalmente, porciones del dominio de transmembrana, tal como los bucles extracelulares del dominio de transmembrana. La región de unión de ligando puede ser capaz de unir un ligando, y más particularmente un compuesto que mejora, imita, bloquea y/o modula el sabor, por ejemplo, el sabor dulce o acre. La frase "heteromultímero" o "complejo heteromultimérico" en el contexto de los receptores o polipéptidos T1R de la invención se refiere a una asociación funcional de al menos un receptor T1R y otro receptor, normalmente otro polipéptido receptor T1R (o, alternativamente otro polipéptido receptor sin T1R). Para claridad, la co-dependencia funcional de los T1R se describe en esta solicitud como reflejando su posible función como complejos del receptor de gusto heterodimérico. Sin embargo, como se discute previamente, la co-dependencia funcional puede reflejar alternativamente una interacción indirecta.
Por ejemplo, T1R3 puede funcionar solamente para facilitar la expresión superficial del T1R1 y T1R2, que puede actuar independientemente como receptores de sabor. Alternativamente, un receptor de gusto funcional puede comprender solamente de T1R3, que se procesa diferencialmente bajo el control de T1R1 o T1R2, análogo al procesamiento dependiente de RAMP del receptor relacionado con el calcio. La frase "efectos funcionales" en el contexto de los ensayos para compuestos de prueba que modulan la transducción de sabor mediada por el miembro de la familia T1R incluye la determinación de cualquier parámetro que está indirecta o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Éste incluye la unión de ligando, cambios en el flujo iónico, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión de proteína G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, ensayos basados en el cambio de conformación, transducción de señal, interacciones de receptor-ligando, segundas concentraciones mensajeras (por ejemplo, cAMP, cGMP, 1P3, o Ca2+ intracelulares), in vitro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos que incrementan o disminuyen la liberación neurotransmisora o de hormona. Por "determinar el efecto funcional", en el contexto de los ensayos significa ensayos para un compuesto que incrementa o disminuye un parámetro que está indirecta o directamente bajo la influencia de un miembro de la familia T1R, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Tales efectos funcionales pueden medirse por cualquier medio conocido por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbencia, índice refractivo), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, diseño), cromatográficas, o de solubilidad, sujeción de parche, tintes sensibles a voltaje, corrientes de celda completas, flujo de radioisótopo, marcadores inducibles, expresión genética de T1R de oocito; expresión T1R de célula de cultivo de tejido; activación transcripcional de genes T1R; ensayos de unión de ligando; voltaje, potencial de membrana y cambios de conductancia; ensayos de flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como cAMP, cGMP, y trifosfato de inositol (IP3), cambios en los niveles de calcio ¡ntracelular; liberación neurotransmisora, ensayos conformacionales y similares. Un "sabor o degustante" se refiere en la presente a un compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que induce en un sujeto, la percepción de olor y/o sabor, que incluye dulce, ácido, salado, amargo y acre y otros. El sujeto puede ser un ser humano, animales, y/o un ensayo biológico, tal como aquel descrito y citado en esta solicitud. Un "modificador de buen gusto o sabor" en la presente se refiere a un compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que modula, incluyendo, la mejora o potencialización, la inhibición e inducción del olor y/o sabores de los degustantes naturales o sintéticos en un sujeto. Un "mejorador de buen gusto o sabor" en la presente se refiere a un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que mejora los sabores u olores de los degustantes naturales o sintéticos, por ejemplo, glutamato monosódico (MSG) para sabor acre y fructosa para sabor dulce. "Degustante acre" o "compuesto acre" en la presente se refiere a un compuesto o una sal biológicamente aceptable del mismo que produce un sabor acre detectable en un sujeto, por ejemplo, MSG. "Degustante dulce" o "compuesto dulce" en la presente, se refiere a un compuesto o sal biológicamente aceptable del mismo que produce un sabor dulce detectable en un sujeto, por ejemplo, fructosa. Un "modificador de sabor acre" en la presente, se refiere a un compuesto o sal biológicamente aceptable del mismo que modula, incluyendo mejorar o potencializar, inhibe e induce el sabor acre de los degustantes acre naturales o sintéticos, por ejemplo, glutamato monosódico (MSG) en un sujeto. Un "modificador de sabor dulce" en la presente se refiere a un compuesto o una sal biológicamente aceptable del mismo que modula, incluyendo mejorar o potencializar, inhibe e induce el sabor dulce de degustantes dulces naturales o sintéticos, por ejemplo, fructosa en un sujeto. Una "cantidad que mejora el sabor" en la presente se refiere a una cantidad de un compuesto que es suficiente para mejorar el sabor de los degustantes naturales o sintéticos, por ejemplo, glutamato monosódico (MSG) para sabor acre o fructosa para sabor dulce. "Categoría de Sopa Húmeda" significa sopas húmeda/líquidas independientemente de la concentración o recipiente, incluyendo Sopas congeladas. Para el propósito de esta definición la o las sopas significan un alimento preparado a partir de carne, pollo, pescado, vegetales, granos, frutas y otros ingredientes, cocinado en un líquido, el cual puede incluir piezas visibles de algunos o todos estos ingredientes. Puede ser claro (como un caldo) o espeso (como un potaje), fino, hecho puré o grasoso, listo para servir, semicondensado o condensado y puede servirse caliente o frío, como un primer plato o como el plato principal de una comida o como un entremés (bebido en sorbos como una bebida). La sopa puede utilizarse como un ingrediente para preparar otros componentes de comida y puede variar de caldos (consomé) a salsas (crema o sopas a base de queso). "Categoría de Alimento Culinario y Deshidratado" significa: (i) productos de ayuda para cocinar tales como: polvos, granulos, pastas, productos líquidos concentrados, incluyendo caldos concentrados, caldos y productos similares a caldos en cubos prensados, tabletas o polvo o en forma granulada, que se venden de manera separada como un producto terminado o como un ingrediente dentro de un producto, salsas y mezclas de recetas (independientemente de la tecnología); (ii) Comida tales como: sopas deshidratadas y secas congeladas, incluyendo mezclas de sopas deshidratadas, sopas deshidratadas instantáneas, sopas deshidratadas listas para cocinarse, preparaciones ambientales o deshidratadas de platos fáciles de hacer, comidas y entradas de servicio sencillo que incluyen pastas, platillos de papas y arroz; y (iii) Productos para aderezar comidas tales como: condimentos, marinadas, aderezamientos para ensaladas, mezclas de recetas líquidas, concentrados, salsas o mezclas de salsas, incluyendo mezclas de recetas para ensaladas, vendidas como un producto terminado o como un ingrediente dentro de un producto, ya sea deshidratado, líquido o congelado. La "Categoría de Bebidas" significa bebidas, mezclas y concentrados de bebidas, incluyendo pero sin limitarse a alcohólicas o no alcohólicas listas para tomar y en polvo secas. Otros ejemplos de alimentos y bebidas en donde los compuestos de acuerdo a la invención pueden incorporarse incluyen a manera de ejemplo bebidas carbonatadas y no carbonatadas, por ejemplo sodas, jugos, bebidas alcohólicas y no alcohólicas, productos de confitería, por ejemplo tortas, galletas, pasteles, caramelos, gomas masticables, gelatinas, helados, sorbetes, budines, mermeladas, jaleas, aderezos para ensaladas, y otros condimentos, cereales y otros alimentos para desayunos, frutas en conserva y compotas y similares. Adicionalmente, los compuestos objeto pueden utilizarse en preparaciones de sabor para agregarse a alimentos y bebidas. En los ejemplos preferidos, la composición comprenderá otro modificador de sabor o degustación tal como un degustante dulce. En algunos casos, las sales biológicamente aceptables de los compuestos objeto pueden utilizarse. Ejemplos de tales sales incluyen sales de metal álcali y alcalinotérreo, sales orgánicas, y similares. Ejemplos específicos incluyen sales de potasio, de sodio, de calcio y de magnesio, sales de ácido clorhídrico o sulfúrico, sales de etanolamina y similares. La sal se seleccionará de manera que sea biológicamente segura para ingestión y no afecte adversamente las propiedades moduladoras del sabor dulce del compuesto. Como se utiliza en la presente, el término "producto medicinal" incluye tanto sólidos como líquidos, que son materiales no tóxicos que se pueden ingerir, los cuales tienen valores medicinales tales como jarabes para la tos, gotas para la tos, aspirinas y tabletas medicinales masticables. Un producto para higiene oral incluye sólidos y líquidos tales como pasta de dientes y enjuagues bucales. Un "portador excipiente comestible o medicinalmente aceptable" es un medio que se utiliza para preparar una forma de dosis deseada del compuesto inventivo. Un portador comestible o medicinalmente aceptable incluye solventes, diluyentes u otro vehículo líquido; auxiliares de dispersión o suspensión; agentes activos de superficie; agentes isotónicos; agentes espesantes o emulsificantes, conservadores; aglutinantes sólidos; lubricantes y similares. Los "inhibidores", "activadores", "mejoradores" y "moduladores" de genes T1R o proteínas se utilizan para referirse a moléculas inhibidoras, de activación, de mejoración identificadas utilizando ensayos in vitro e in vivo para transducción de sabor, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos e imitadores. Los homólogos son compuestos que por ejemplo se unen a, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, evitan retardan la activación, inactivan, desensibilizan o desregulan la transducción de sabor, por ejemplo antagonistas. Los activadores y mejoradores o compuestos que por ejemplo se unen a, mejoran, estimulan, incrementan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan, o sobrerregulan la transducción de sabor, por ejemplo agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: las proteínas extracelulares que se unen a activadores o al inhibidor (por ejemplo, ebnerina y otros miembros de la familia portadora hidrofóbica); proteínas G; cinasas (por ejemplo homólogos de la rodopsina cinasa y del receptor adrenérgico beta cinasas que están implicados en la desactivación y la desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan receptores. Los moduladores pueden incluir versiones genéticamente modificadas de los miembros de la familia T1R, por ejemplo con actividad alterada, así como con ligandos de origen natural y sintético, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares. Tales ensayos para inhibidores y activadores incluyen por ejemplo, expresar miembros de la familia T1R en células o membranas celulares, aplicando compuestos moduladores putativos como en la presencia o ausencia de degustantes, por ejemplo degustantes dulces y luego determinando los efectos funcionales en la transducción del sabor, como se describe anteriormente. Las muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia T1R que se tratan con un mejorado potencial, un activador, un inhibidor o un modulador se comparan a las muestras control sin el inhibidor, el activador o el modulador para examinar la extensión de la modulación. Las muestras control positivas (por ejemplo un degustante dulce sin agregar moduladores) se asignan a un valor de actividad T1R relativa de 100%. El "EC5o" se define como la cantidad de un compuesto que produce 50% de la respuesta máxima que el compuesto puede producir, ya sea como un activador, un mejorador o un modulador. Se determinó una curva de respuesta de dosis dependiente de dosis para un compuesto, y la concentración del compuesto que corresponde 50% de la respuesta máxima se derivó a partir de la curva, en un ejemplo. El "IC50" se define como la cantidad de un compuesto que produce 50% del efecto máximo que el compuesto puede producir como un inhibidor. Con respecto a los degustantes y mejoradores dulces, después de que se identifica un compuesto, las puntuaciones de sus actividades se dan como el porcentaje de la intensidad de fructosa máxima (%). En la respuesta de dosis del compuesto, un EC50 puede calcularse para reflejar la potencia del compuesto como un agonista dulce. En la presente invención, un EC50 más bajo que aproximadamente 100 mM es indicativo de compuestos que inducen la actividad de T1R2/T1R3 como un agonista dulce. De preferencia, un acierto positivo para que un agonista dulce tenga un valor de EC50 de menos de aproximadamente 1 mM; más preferiblemente menos de aproximadamente 10 µM. En los experimentos de ensayo de mejoramiento dulce, una respuesta de dosis de fructosa se activó y una segunda respuesta de dosis de fructosa se activó con una cierta cantidad de un compuesto candidato a cada una de las concentraciones de fructuosa al mismo tiempo. Después, la relación de EC50 puede calcularse con base en las siguientes definiciones: Relación de EC50 = EC50 (fructosa)/EC50 (fructosa + [Compuesto]) En donde "[compuesto]" se refiere a la concentración del compuesto utilizado para producir (o mejorar o potencializar) la respuesta de dosis de la fructosa. Aquellas concentraciones podrían variar a partir de un pM a un mM, más preferido, a partir de un nM a µM bajo. Un mejorador dulce potente tendría una Relación EC50 elevada a una concentración baja del compuesto utilizado. En la presente invención, una relación de EC50 de más de 1 es indicativa de un compuesto que modula (potencializa) la actividad de T1R2/T1R3 y es un mejorador dulce. De preferencia, un acierto positivo tendrá valores de relación de EC50 de al menos 1.20, de preferencia variando desde al menos 1.50 a 100 o aún más elevada. En contraste, los agonistas competentes (aquellos degustantes dulces que se unen recíprocamente de manera exclusiva) o inhibidores siempre producen valores de relación de EC50 menores de 1, tales como de 0-1. Con respecto a los degustantes y mejoradores acres, las puntuaciones de sus actividades pueden darse como porcentaje (%) de la intensidad de MSG máxima. En la respuesta de dosis del compuesto, un EC50 puede calcularse para reflejar la potencia del compuesto como agonista acre. En la presente invención, un EC50 de menos de aproximadamente 10 mM es indicativo de compuestos que inducen actividad de T1R1/T1R3 y un agonista acre. De preferencia, un acierto positivo para un agonista acre tendrá valores de EC5o de menos de aproximadamente 1mM; más preferiblemente variando de aproximadamente un pM aproximadamente un µM bajo. En los experimentos de ensayo de mejoramiento, una respuesta de dosis de MSG se activó y una segunda respuesta de dosis de MSG se activó con una cierta cantidad de un compuesto candidato en cada una de las concentraciones de MSG al mismo tiempo. Entonces, se calcula la relación EC50 con base en las siguientes definiciones: Relación EC50 = EC5o (MSG)/EC50 (MSG + [Compuesto]) en donde "[compuesto]" se refiere a la concentración del compuesto utilizado para producir (o mejorar o potencializar) la respuesta de dosis de MSG. Aquellas concentraciones pueden variar a partir de un pM a un mM, más preferido, de un nM bajo a µM. Un mejorador acre potente tiene una Relación de EC 0 elevada en una concentración baja del compuesto utilizado. En la presente invención, una relación de EC o de más de 1 es indicativa de un compuesto que modula (potencializa) la actividad de T1R1/T1R3 y un mejorador acre. De preferencia, un acierto positivo tiene valores de relación EC50 de al menos 1.20, de preferencia variando desde al menos 1.50 a 100 o aún más elevado. Las muestras de control negativo (por ejemplo de tampón sin un estímulo de sabor agregado) se asignan a un valor de actividad T1R relativo de 0%. La inhibición de T1R se logra cuando una mezcla de la muestra control positiva y un resultado modulador en el valor de actividad T1R relativo al control positivo es aproximadamente 80%, opcionalmente 50% ó 25-0%. La activación de un T1R por un modulador solo se logra cuando el valor de actividad T1R relativo a la muestra control positiva es 10%, 25%, 50%, 75%, opcionalmente 100%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200-500%, o 1000-3000% más elevado. Los términos "purificados", "sustancialmente purificados", y "aislados" como se utiliza en la presente se refieren al estado que es libre de otro, compuestos disimilares con los cuales el compuesto de la invención se asocia normalmente en su estado natural, de manera que el objeto "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado" comprende al menos 0.5%, 1%, 5%, 10% ó 20%, y más preferiblemente al menos 50% ó 75% de la masa, en peso, de una muestra dada. En una modalidad preferida, estos términos se refieren al compuesto de la invención que comprende al menos 95% de la masa, en peso, de una muestra dada. Como se utiliza en la presente, los términos "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado" cuando se refieren a un ácido nucleico o proteína, se refieren también a un estado de purificación o concentración diferente que aquel que ocurre naturalmente en los mamíferos, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración mayor de aquella que ocurre naturalmente en los mamíferos, especialmente en el cuerpo humano, incluyen (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados, o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los cuales no se asocian normalmente en los mamíferos especialmente al cuerpo humano, están dentro del significado de "aislados". El ácido nucleico o la proteína o las clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en la presente, pueden aislarse, o de otra manera asociarse con estructuras o compuestos a los cuales no se asocian normalmente en la naturaleza, de acuerdo a una variedad de métodos y procesos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. El término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un desoxi-ribonucleótido o un oligoneucleótido-ribonucleótido en cualquier forma de una sola o doble hebra. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras similares a ácido nucleico con estructuras sintéticas (véase por ejemplo, Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, ed., F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the N.Y. Academy of Sciences, Vol. 600, Eds., Baserga ef al. (NYAS 1992); Milligan J. Med. Chem. 36:1923-1937 (1993); Antisense Research and Applications (1993, CRC Press), WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, Toxicol, Appl. Pharmacol. 144:189-197 (1997); Strauss-Soukup, Biochemistry 36:8692-8698 (1997); Samstag, Antisense Nucleic Acid Drug Dev,6:153-156 (1996)). A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular abarca también implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias, así como la secuencia lo indica explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado pueden lograrse generando por ejemplo secuencias en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con residuos de base mezclada y/o desoxi-inosina (Batzer ef al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka ef al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini ef al., Mol. Cell. Probes, 8.91-98 (1994)). El término ácido nucleico se utiliza intercambiablemente con un gen, un ADNc, un ARNm, un oligonucleótido y un polinucleótido. Los términos "polipéptidos", "péptido" y "proteínas" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos es un imitador químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácido de origen natural y un polímero de aminoácido de origen no natural. El término "dominio de desplazamiento de membrana de plasma" o simplemente "dominio de desplazamiento" significa un dominio polipéptido que, cuando se incorpora dentro de una secuencia de codificación de polipéptido, puede con mayor eficiencia "unir" o "desplazar" la proteína híbrida ("fusión") a la membrana de plasma que sin el dominio. Por ejemplo, un "dominio de desplazamiento" puede derivarse a partir del término amino del polipéptido receptor de rodoxina bovina, un receptor de 7-transmembrana. Sin embargo, la rodoxina a partir de cualquier mamífero puede utilizarse, como lo pueden otras secuencias que facilitan el desplazamiento. De este modo, el dominio de desplazamiento es particularmente eficiente en desplazar proteínas de fusión 7-transmembrana a la membrana de plasma, y una proteína (por ejemplo un polipéptido receptor de sabor) que comprende un dominio de desplazamiento terminal amino será transportado a la membrana de plasma más eficientemente que sin el dominio. Sin embargo, si el dominio N-terminal del polipéptido se activa en la unión, como con los receptores T1R de la presente invención, el uso de otros dominios de desplazamiento puede preferirse. Por ejemplo, un péptido de interacción de dominio PDZ como se describe en la presente puede utilizarse. El "dominio de desplazamiento", "dominio de unión de ligandos", y las composiciones receptoras quiméricas descritas en la presente incluyen también "análogos" o "variantes conservadoras" e "imitadores" ("péptidomiméticos") con estructuras y actividad que corresponden sustancialmente a las secuencias ejemplares. De este modo, los términos "variante conservadora" o "análogos" o "imitador" se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido modificada, de manera que el o los cambios no alteran sustancialmente la estructura y/o actividad del polipéptido (de la variante conservadora), como se define en la presente. Estas incluyen variaciones conservadoramente modificadas de una secuencia de aminoácido, es decir sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos de aquellos residuos que no son críticos para actividad de proteína, o sustitución de aminoácidos con residuos que tienen propiedades similares (por ejemplo, acídica, básica, positiva o negativamente cargada, polar o no polar, etc.) de manera que las sustituciones de aminoácidos aún críticos no alteran sustancialmente la estructura y/o la actividad. Más particularmente, las "variantes conservadoramente modificadas" se aplican tanto a secuencias de aminoácido como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, codifican la alanina del aminoácido. De este modo, en cada posición en donde una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente, la cual codifica un polipéptido, describe también cada posible variación silente del ácido nucleico. Alguien de experiencia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es de manera ordinaria el único codón para la metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para el triptofano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico, la cual codifica un polipéptido, es implícita en cada secuencia descrita. Las tablas de sustitución conservadoras proporcionan aminoácidos funcionalmente similares que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una línea directiva ejemplar para seleccionar sustituciones conservadoras incluyen (un residuo original seguido por una sustitución ejemplar): ala/gly o ser; arg/lys; asn/gln o his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/ala o pro; his/asn o gln; ¡le/leu o val; leu/ile o val; lys/arg o gln o glu; met/leu o tyr o ¡le; phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp o phe; val/ile o leu. Una línea directiva ejemplar alternativa utiliza los siguientes seis grupos, cada uno conteniendo aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanita (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (I); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); (véase también, por ejemplo, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984); Schutlz and Schimer, Principies of Protein Structure, Springer-Vrlag (1979)). Alguien de experiencia en la técnica apreciará que las sustituciones identificadas anteriormente no son sólo posibles sustituciones conservadoras. Por ejemplo, para algunos propósitos se pueden estimar todos los aminoácidos cargados como sustituciones conservadoras entre sí ya sea si son positivos o negativos. Además, las sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones que alteran, agregan o eliminan un aminoácido sencillo o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada pueden considerarse también "variaciones conservadoramente modificadas". Los términos "imitador" y "péptidomimético" se refiere a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente la misma estructura y/o características funcionales de los polipéptidos, por ejemplo, dominios de desplazamiento, dominios de unión de ligandos, o receptores quiméricos de la invención. El imitador puede componerse ya sea completamente de análogos sintéticos, no naturales de aminoácidos, o puede ser una molécula quimérica de aminoácidos péptidos parcialmente naturales y análogos no naturales parcialmente de aminoácidos. El imitador puede incorporar también cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales siempre y cuando tales sustituciones no alteren sustancialmente la estructura y/o la actividad del imitador. Como con los polipéptidos de la invención, los cuales son variantes conservadoras, la experimentación rutinaria determinará si un imitador está dentro del alcance de la invención, es decir, que su estructura y/o su función no se alteran sustancialmente. Las composiciones imitadoras polipeptídicas pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de conexión de residuo diferentes de los enlaces de unión de amida naturales ("unión peptídica"); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir inducen o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo una vuelta beta, una vuelta gamma, una hoja beta, una conformación de hélice alfa y similares. Un polipéptido puede caracterizarse como un imitador cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos diferentes de las uniones peptídicas naturales. Los residuos peptidomimétícos individuales pueden unirse por uniones peptídicas, otras uniones químicas o medios de acoplamiento, tales como por ejemplo glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodi¡mida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a la unión de amida ("unión peptídica") incluyen enlaces, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C( = O)-CH2-, para -C( = O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH = CH), éter (CH.2-0), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4), tiazol, retroamida o éster (véase por ejemplo, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY (1983)). Un polipéptido puede caracterizarse también como un imitador conteniendo todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural; los residuos no naturales se describirán bien en la literatura científica y de patente. Una "etiqueta" o una "porción detectable" es una composición detectable por medio espectroescópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico o químico. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos de electrón, enzimas (por ejemplo como se utiliza comúnmente en una ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo incorporando una radioetiqueta en el péptido utilizado para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. Una "sonda de ácido nucleico etiquetada u oligoneucleótido" es aquella que se une, ya sea covalentemente a través de un enlazador o una unión química, o no covalentemente, a través de uniones iónicas, de Van Der Waals, electroestáticas o de hidrógeno a una etiqueta de manera que la presencia de la sonda puede detectarse detectando la presencia de la etiqueta unida a la sonda. Como se utiliza en la presente, una "sonda de ácido nucleico u oligonucleótido" se define como un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico objetivo de una secuencia complementaria a través de uno o más tipos de uniones químicas, usualmente a través del emparejamiento de una base complementaria, usualmente a través de la formación de unión de hidrógeno. Como se utiliza en la presente, una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C ó T) o modificadas (7-deazaguanosina, inosina, efe). Además, las bases en una sonda pueden unirse por un enlace diferente de una unión fosfodiéster, siempre y cuando no interfiera con la hibridización. De este modo, por ejemplo, las sondas pueden ser ácidos nucleicos peptídicos en donde las bases constituyentes se unen por uniones peptídicas en lugar de enlaces de fosfodiéster. Se entenderá por un experto en la técnica que las sondas pueden unir secuencias objetivo que carecen de complementariedad completa con la secuencia de sonda que depende de la severidad de las condiciones de hibridización. Las sondas se etiquetan opcionalmente de manera directa como con isótopos, cromóforos, lumíforos, cromógenos, o se etiquetan indirectamente tales como con biotina a la cual un complejo de estreptavidina puede unirse después. Al evaluar la presencia y ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia seleccionada. El término "heterólogos" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce normalmente de manera recombinante, teniendo dos o más secuencias a partir de los genes no relacionados dispuestos para realizar un nuevo ácido nucleico funcional, Por ejemplo, un promotor a partir de una fuente y una región que codifica a partir de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión). Un "promotor" se define como una disposición de secuencias de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como en el caso de un promotor del tipo de polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor incluye también opcionalmente elementos mejoradores o represores distales, que pueden ubicarse tanto como varios miles de pares de bases a partir del sitio de inicio de la trascripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un productor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. El término "operablemente enlazado" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, o una disposición de los sitios de unión del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia. Como se utiliza en la presente, "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o de otra manera manipulado in vitro (por ejemplo "polinucleótido recombinante") a métodos para utilizar polinucleótidos recombinantes para producir productos genéticos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. Los "medios recombinantes" abarcan también la ligación de ácidos nucleicos que tiene varias regiones o dominios de codificación o secuencias promotoras a partir de diferentes fuentes dentro de un cásete o vector de expresión para expresión de por ejemplo, expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de desplazamiento de la invención y una secuencia de ácido nucleico amplificada utilizando un cebador de la invención. Como se utiliza en la presente, una "línea celular estable" se refiere a una línea celular, la cual establemente, es decir durante un periodo prolongado, expresa una secuencia nucleica heteróloga, es decir un T1R o una proteína G. En las modalidades preferidas, tales líneas celulares estables se producirán transfectando células apropiadas, normalmente células de mamíferos, por ejemplo células HEK-293, con un vector linearizado que contiene una construcción de expresión T1R, es decir T1R1, T1R2 y/o T1R3. Más preferiblemente, tales líneas celulares estables se producirán co-transfectando dos plásmidos linearizados que expresan hT1R1 y hT1R3 o hT1R2 y hT1R3 y un procedimiento de selección apropiado para generar líneas celulares que tiene estos genes integrados establemente en la presente. Más preferiblemente, la línea celular expresará también establemente una proteína G tal como Ga?s. La frase "hibridiza selectivamente (o específicamente) a" se refiere a la unión, duplicación o híbridización de una molécula solamente a una secuencia nucleótido particular bajo condiciones de hibridización severas cuando esa secuencia se presenta en una mezcla compleja (por ejemplo ADN o ARN de biblioteca o celular total). La frase "condiciones de hibridización severa" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará en su secuencia objetivo normalmente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas son secuencias dependientes y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía extensiva a la hibridización de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de resistencia iónica definido. El Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida, pH, y concentración nucleica) en donde el 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio (como las secuencias objetivo se presentan en exceso, a Tm, 50% de las sondas se ocupan en equilibrio). Condiciones severas serán aquellas en donde la concentración salina es menor de aproximadamente 1.0 M de ion de sodio, en forma normal aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de sodio (u otras sales) un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura está al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo mayores de 50 nucleótidos). Condiciones severas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridización selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la de los antecedentes, opcionalmente una hibridización de 10 veces la de los antecedentes. Las condiciones de hibridización severa ejemplares pueden ser como sigue: 50% de formamida, 5x de SSC, y 1% de SDS, incubando a 42°C, o 5x de SSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, con lavado en 0.2x de SSC, y 0.1% de SDS a 65°C. Tales etapas de hibridizaciones y lavado pueden llevarse a cabo por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60; o más minutos. Los ácidos nucleicos que no hibridizan entre sí bajo condiciones severas se relacionan aún sustancialmente si los polipéptidos que los codifican se relacionan sustancialmente. Esto ocurre, por supuesto cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos hibridizan normalmente bajo condiciones de hibridización moderadamente severas, "condiciones de hibridización moderadamente severas" ejemplares incluyen una hibridízación en un tampón de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 1X SSC a 45°C. Tales hibridizaciones y etapas de lavado pueden llevarse a cabo por ejemplo, por 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos. Una hibridización positiva es al menos dos veces la de los antecedentes. Aquellos de experiencia ordinaria reconocerán fácilmente que la hibridización alternativa y las condiciones de lavado pueden utilizarse para proporcionar condiciones de severidad similar. "Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de soporte a partir de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se unen específicamente y reconocen un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como un gran número de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Un "anticuerpo quimérico" es una molécula del anticuerpo en donde (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia de manera que el sitio de unión antigénica (región variable) se enlaza a una región constante de una clase diferente o alterada, una función efectora y/o una especie, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, una toxina, una hormona, un factor de crecimiento, un fármaco, etc.; o (b) la región variable o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia con una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada. Un anticuerpo "anti-T1R" es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que une específicamente un polipéptido codificado por un gen T1R, un ADNc, o una subsecuencia del mismo. El término "inmunoensayo" es un ensayo que utiliza un anticuerpo que une específicamente un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, focalizar y/o cuantificar el antígeno. La frase "une específicamente (o selectivamente)" o reacciona específicamente (o selectivamente) con", cuando se refiere a una molécula o una composición, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la molécula en una población heterogénea de otros biológicos. De este modo, bajo las condiciones designadas, las moléculas especificadas se unen a un receptor particular al menos dos veces ef trasfondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra. La unión específica a un receptor bajo tales condiciones puede requerir un receptor que se seleccione por su especificidad para una molécula particular. Con respecto a los anticuerpos, una variedad de formatos de inmunoensayo pueden utilizarse para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se utilizan de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica). Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de trasfondo o ruido y más normalmente más de 10 a 100 veces el trasfondo. La frase "se asocia selectivamente con" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para "hibridizarse selectivamente" con otro como se define anteriormente, o la capacidad de un anticuerpo para "unirse selectivamente (o específicamente) a una proteína", como se define anteriormente. El término "vector de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante para el propósito de sobreexpresar una secuencia de ácido nucleico de la invención in vitro o in vivo, constitutiva o indeciblemente, en cualquier célula, incluyendo una célula procariótica, de levaduras, hongos, plantas, insectos o mamíferos. El término incluye sistemas de expresión lineal o circular. El término incluye sistemas de expresión que permanecen episomales o integrados dentro del genoma de célula huésped. Los sistemas de expresión pueden tener la capacidad de auto replicarse o no, es decir, conducir solamente la expresión transitoria en una célula. El término incluye los "casetes" de expresión recombinante que contienen sólo los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante. Por "célula huésped" se quiere decir una célula que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o la expresión del vector de expresión. Las células huéspedes pueden ser células procarióticas, tales como E. coli o células eucarióticas tales como células de levaduras, insectos, anfibios, gusanos o de mamífero, tales como CHO, Hela, HEK-293, y similares, por ejemplo, células cultivadas, ex-plantas y células in vivo.
Compuestos Como se discute anteriormente, existen diferentes dominios en los receptores T1R. T1R1, T1R2 y T1R3 contiene cada uno un dominio extracelular N-terminal (también conocido como el dominio de trampa de moscas Venus), dominios de transmembrana que comprenden siete regiones de transmembrana, y bucles citoplásmicos y extracelulares correspondientes; un dominio rico en cisteína y un dominio C-terminal. Cada región define un conjunto específico de compuestos que se unen específicos a esa región. En seres humanos, los dominios extracelulares N-terminales comprenden aminoácidos 1 a 560 de hT1R2 y aminoácidos 1 a 563 de hT1R3. En ratas, el dominio extracelular N-terminal comprende aminoácidos 1 a 564 de rT1R2, y aminoácidos 1 a 568 de rT1R3. En seres humanos, el dominio de transmembrana C-terminal y el dominio extracelular comprenden aminoácidos 561 a 839 de hT1R2, y aminoácidos 564 a 852 de hT1R3. En ratas, el dominio de transmembrana C-terminal y el dominio intraceluiar comprenden aminoácidos 565 a 842 de rT1R2, y los aminoácidos 569 a 858 de rT1R3. Los receptores de glutamato metabotrópico (mGluR) son otra clase de receptores acoplados con proteína G de la clase C que responden al glutamato. Estos se encuentran principalmente en el cerebro y el tejido neuronal en donde juegan un papel en la señalización neuronal. El dominio extracelular N-terminal mGluR puede enlazarse covalentemente a un T1R para crear receptores quiméricos. El receptor mGluR puede ser cualquiera de mGluRI-mGluRd, por ejemplo. Diferentes ligandos se unen a diferentes dominios en diferentes subunidades tanto de receptores de acre como de dulce. Por ejemplo, el aspartame y el neotame se unen al dominio extracelular N-terminal de T1R2, mientras que el ciclamato, la neohesperidina dihidrocalcona (NHDC), y el lactisol se unen al dominio de transmembrana de T1R3. Debido a que T1R3 es una de las dos subunidades en el receptor de gusto acre T1R1/T1R3, el ciclamato, el NHDC y el lactison pueden interactuar con T1R3 en el receptor de gusto acre T1R1/T1R3 también. El ciclamato y el NHDC mejoran la actividad del receptor de prueba acre, mientras que el lactisol inhibe el receptor de acre. Los compuestos de unión específica de la invención que se relacionan a degustantes acre comprenden amidas. Los compuestos amida comprenden también ciertas sub-clases de derivados amida o clases de derivados relacionadas a amidas, tales como por ejemplo, ureas, uretanos, oxalamidas, acrilamidas y similares. Las moléculas que interactúan con el dominio de transmembrana de T1R2, por ejemplo, puede ser moduladores de sabor dulce, y moléculas que interactúan con el dominio de transmembrana de T1R3 pueden ser moduladores de sabor dulce y/o sabor acre. T1R2/T1R3 humano reconoce un grupo de edulcorantes que no se reconocen por T1R2/T1R3 de rata, y ser humano pero ningún T1R2/T1R3 de rata se inhibe por el lactisol. Cuando el dominio extracelular del T1R2 humano se reemplaza por su contraparte de rata, el receptor humano pierde la capacidad de reconocer el aspartame, indicando que esta parte del T1R2 humano se requiere para la unión al aspartame. De manera inversa, cuando el dominio extracelular de T1R2 de rata se reemplazó por su contraparte humana, el receptor de rata adquiere la capacidad para reconocer al aspartame, indicando que esta parte del T1R2 humano es suficiente para unirse al aspartame. Por el mismo principio, el dominio de transmembrana de T1R3 humano se requirió y suficiente para La Tabla 6 muestra las abreviaturas utilizadas para representar varios receptores quiméricos de rata/humanos y subunidades del receptor.
TABLA 6 hT1R2 - T1R2 humano hT1R3 - T1R3 humano rT1R2 - T1R2 de rata rT1R3 - T1R3 de rata hT1R2/rT1R3 un receptor compuesto de T1R2 humano y T1R3 de rata rT1R2/hT1R3 un receptor compuesto de T1R2 de rata y un T1 R3 humano hT1R2/h3-r3 - un receptor compuesto de T1R2 humano y un T1R3 quimérico con un dominio extracelular N-terminal humano y transmembrana de rata y el dominio C-terminal rT1R2/r3-h3 - un receptor compuesto de T1R2 de rata y un T1R3 quimérico con un dominio extracelular N-terminal de rata y transmembrana humana y el dominio C-terminal h2-r2/rT1R3 - un receptor compuesto de T1R2 quimérico con un dominio extracelular N-terminal humano y una transmembrana de rata y el dominio C-terminal y el T1R3 de rata r2/h2/rT1R3 - un receptor compuesto de un T1R2 quimérico con un dominio extracelular N-terminal y una transmembrana humana y el dominio C-terminal y T1R3 de rata h2-h1/hT1R3 - un receptor compuesto de un T1R quimérico con un dominio extracelular N-terminal T1R2 humano y la transmembrana T1R1 humana y el dominio C-terminal y el T1R3 humano h1-h2/hT1R3 - un receptor compuesto de un T1R quimérico con un dominio extracelular N-terminal T1R1 humano y la transmembrana T1R2 humana y el dominio C-terminal y T1R3 humano h2-mGlu R1/he-mGluR1 - un receptor compuesto de un dominio extracel ular N-terminal a pa rtir de hT1 R2 covalentemente enlazad o al dominio C-terminal y de transmembrana de mGluRl y el dominio extracelular N- terminal de hT1R3 covalentemente enlazad o a la transmemb rana y el dominio C-terminal de mGluRl h1-mGlu 1R/h3-mGluR1 - un receptor compuesto de un dominio extracel ular N-terminal a pa rtir de hT1R1 covalentemente enlazad o a la transmemb rana y al dominio C-terminal de mGluRl y un dominio extracelular N-terminal a partir de hT1R3 covalentemente enlazado a la transmembrana y al dominio C- terminal de mGluRl mGluRl -h2/mGIuR1-h3 - un receptor compuesto de un dominio extracel ular N-terminal a pa rtir de mGlurRI covalentemente enlazad o a la transmemb rana y al dominio C-terminal de hT1R2 y un dominio extracelular N- -terminal a partir de mGluRl covalenl temente enlazado a la transmembrana y al dominio C- terminal de hT1R3 mGluRl -h1/mGluR1-h3 - un receptor compuesto de un dominio extracel ular N-terminal a pa rtir de mGluRl covalentemente enlazad o a la transmemb rana y al dominio C-terminal de hT1R1 y un dominio extracelular N- -terminal a partir de mGluRl covalenl [emente enlazado a la transmembrana y al dominio C- terminal de hT1R3 Se describen en la presente compuestos de origen natural que se unen específicamente al receptor T1R2/T1R3 que comprende hT1R2/hT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a neotame, aspartame, ciclamato, lactisol, el Compuesto 883360, el Compuesto 6542888, el Compuesto 403249, el Compuesto 6364395, Ácido dihidroxibenzoico (DHB), el Compuesto 65432888, y neohesperidina dihidrocalcona (NHDC) los ejemplos adicionales se encuentran en las Tablas 1-4. Los compuestos no peptídicos orgánicos, pueden ser de aproximadamente el tamaño de una caja de dimensiones de 15x8x8 angstroms, más preferiblemente la dimensión debe ser 12x5x5 angstroms. Se describen también compuestos que se unen específicamente a un receptor T1R2/T1R3 que comprende hT1R2/rT1R3, pero no a rT1R2/hT1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a aspartame y neotame.
Ejemplos adicionales se encuentran en la Tabla 5. Se describen también compuestos que se unen específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a neotame, azúcares de carbohidrato de aspartame (por ejemplo, sacarosa, fructosa, glucosa, tagatosa, eritritol, sorbitol, maltosa, xilitol, lactosa y galactosa, así como todos los otros azúcares de carbohidrato). Ejemplos adicionales se encuentran en la Tabla 5. Se describen también compuestos que se unen específicamente al Dominio de Trampa de Moscas Venus (VFD) de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al dominio de trampa de moscas Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3. Más específicamente, se describen también compuestos que se unen específicamente a residuos 144 y 302 de aminoácidos del dominio de trampa de moscas Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a aspartame, neotame, carbohidratos y aminoácidos dulces, tales como D-Trp, Ala y Gly. Se describen también compuestos que se unen específicamente a la región rica en cisteína de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al receptor T1R2/T1R3 que comprende rT1R2/hT1R3, pero no hT1R2/rT1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a ciclamato, NHDC, lactisol, el Compuesto 883360, el Compuesto 403249 y el Compuesto 6364395. Ejemplos adicionales se encuentran en la Tabla 5. Se describen también compuestos que se unen específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a hT1R2/h3-r3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a ciclamato, NHDC, lactisol, el Compuestos 883360, el Compuesto 403249 y el Compuesto 6364395. Se describen también compuestos que se unen específicamente a un bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio C Terminal de la subunidad T1R3 del receptor T1R2/T1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al dominio extracelular N-terminal humano de la subunidad T1R3 del receptor T1R2/T1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al Dominio de Trampa de Moscas Venus (VFD) de T1 R3 del receptor hT1R2/hT1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a aspartame, neotame, carbohidratos y aminoácidos dulces, tales como D-Trp, Ala y Gly. Se describen también compuestos que se unen específicamente al Dominio de Transmembrana de T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3. Se describen también compuestos que se unen específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana humano de la subunidad T1R3 de T1R2/T1R3. Ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a ciclamato. El compuesto de la invención no incluye sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol, sorbitol, xilitol, ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, sucralosa y alitame, neotame, perilartina, SC-45467, SC-40014, monelina, NC-002740-01 , taumatina, CC-00100, NC-00420, alitame, SC-44102, dulcina, NC-00576, Ácido slicirrízico, esteviosida, Na-Sacarina, D-triptofano, ciclamato, DHB, Ácido Glicólico, glicina, D(-)fructosa, homofuronol, D(-)tagatosa, maltosa, D( + )glucosa, D-sorbitol, D( + )galactosa, a-lactosa, LQfructosa, L( + ) Compuesto 403249 y glucosa. Opcionalmente, un compuesto de la invención no es también el Compuesto 6364395. Se describen también en la presente compuestos que se unen a una región truncada de un dominio T1R. Por ejemplo, se describen compuestos que se unen específicamente al dominio TM de T1R2 de un receptor dulce truncado que comprende h2TM/h3TM, compuestos que se unen específicamente al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado que comprende h2TM/h3TM, compuestos que se unen específicamente al dominio TM de T1R2 de un receptor quimérico que comprende mGluR-h2/mGluR-h3, compuestos que se unen específicamente al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico que comprende mGluR-h2/mGIuR-h3, compuestos que se unen al dominio TM de T1R1 de un receptor apetitoso truncado que comprende h1TM/h3TM, un compuesto que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado que comprende h1TM/h3TM, compuestos que se unen al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico que comprende mGluR-h1/mGluR-h3, y compuestos que se unen al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico que comprende mGluR-h1/mGluR-h3. Las SEC. DE IDENT. NOS.: 29-33 representan estos receptores truncados. Los compuestos de la invención no incluyen glutamato monosódico ("MSG"), monofosfato de inosina (IMP) o monofosfato de guanosina (GMP), sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol, sorbitol, xilitol, ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, sucralosa, alitame, glutamato monosódico ("MSG"), monofosfato de inosina (IMP) o monofosfato de guanosina (GMP) o monofosfato de adenosina. El compuesto 403249 es (5-(4H-benzo[d][1 ,3]oxatiin-2-il)-2-metoxifenol, mientras que el Compuesto 6364395 es 3-(3-hidroxi-4-metoxifenetil)benzo[d]isoxazol-4,6-diol. Los compuestos descritos anteriormente pueden demostrar un incremento dependiente del compuesto en la fluorescencia con una actividad comparada a la actividad máxima para fructosa de al menos 25% en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Lector de Placa de Intensidad Fluorométrica, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Para ejemplos de este protocolo, véanse los Ejemplos 12 y 18. Los compuestos pueden demostrar también una disminución dependiente del compuesto en el EC50 para un edulcorante por al menos dos veces en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Molecular Devices). Además, en un ensayo basado en células, el compuesto puede resultar en al menos 10 de entre 100 células transfectadas con un receptor de tipo silvestre o quimérico que muestra un incremento dependiente del compuesto en fluorescencia. Un ejemplo de un ensayo basado en célula puede encontrarse en el Ejemplo 24. El compuesto puede demostrar también un incremento dependiente de un compuesto de al menos 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, dos veces o mayor, o cualquier número entre ellos, en el número de células fluorescentes en respuesta a un nivel sub-máximo de un edulcorante. La respuesta puede medirse por fluorescencia, niveles de calcio, niveles de IP3, niveles de cAMP, unión de GTP?S, o una actividad de gen reportero (por ejemplo, luciferasa, beta-galactosidasa). Además, los compuestos descritos en la presente pueden tener una o más de las siguientes características en una célula: un EC50 disminuido comparado a un control de al menos aproximadamente 50%, un nivel de Ca2+ intracelular incrementado por al menos aproximadamente 25%, un cAMP ¡ntracelular incrementado por al menos aproximadamente 25%, un cGMP intracelular incrementado por al menos aproximadamente 25%, un IP3 intracelular incrementado por al menos aproximadamente 25%, o una unión de proteína G incrementada de GTP?S por al menos aproximadamente 25%.
Métodos para Utilizar los Compuestos Se describen también métodos para modular el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal, que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor de los mismos, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que modula el buen gusto apetitoso de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se modula el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para inhibir el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que inhibe el sabor apetitoso de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se inhibe el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para incrementar el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que incrementa el sabor apetitoso de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se incrementa el sabor apetitoso de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para modular el sabor dulce de un producto comestible o medicinal que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que modula el sabor dulce de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se modula el sabor dulce de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para inhibir el sabor dulce de un producto comestible o medicinal que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que inhibe el sabor dulce de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se inhibe el sabor de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para incrementar el sabor dulce de un producto comestible o medicinal que comprende proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o el precursor del mismo con al menos una cantidad que incrementa el sabor dulce de al menos un compuesto de origen no natural como se describe en la presente, o una sal comestiblemente aceptable del mismo, de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; por lo que se incrementa el sabor dulce de un producto comestible o medicinal. Se describen también métodos para mejorar la percepción del sabor acre que comprende poner en contacto un receptor de acre con ciclamato y NHDC, y sus derivados, así como métodos para mejorar la percepción del sabor acre que comprenden poner en contacto un receptor de acre con derivados lactisol de acre. Se describen también métodos para mejorar la percepción del sabor dulce que comprende poner en contacto un receptor dulce con ciclamato y NHDC, y sus derivados. Se describen también métodos para mejorar la percepción del sabor dulce que comprenden poner en contacto un receptor dulce con derivados lactisol.
Aislamiento y Expresión de Polipéptidos T1R. El aislamiento y la expresión de los T1R, o fragmentos o variantes de los mismos, de la invención pueden realizarse como se describe posteriormente. Los cebadores PCR pueden utilizarse para la amplificación de ácidos nucleicos que codifican las regiones de unión del ligando del receptor de gusto, y las bibliotecas de estos ácidos nucleicos pueden generarse opcionalmente. Los vectores de expresión individuales o colectores de vectores de expresión pueden utilizarse entonces para infectar o transfectar células huéspedes para la expresión funcional de estos ácidos nucleicos o bibliotecas. Estos genes y vectores pueden hacerse y expresarse in vitro o in vivo. Alguien de experiencia reconocerá que los fenotipos deseados para alterar y controlar la expresión del ácido nucleico pueden obtenerse modulando la expresión o la actividad de los genes y los ácidos nucleicos (por ejemplo, promotores, mejoradores y similares) dentro de los vectores de la invención. Cualquiera de los métodos conocidos descritos para incrementar o disminuir la expresión o actividad pueden utilizarse. La ¡nvención puede practicarse junto con cualquier método o protocolo conocido en la técnica, que se describe bien en la literatura científica y de patente. Las secuencias del ácido nucleico de la invención y otros ácidos nucleicos utilizados para practicar esta ¡nvención, ya sea ARN, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, pueden aislarse a partir de una variedad de fuentes diseñadas genéticamente, amplificadas y/o expresadas recombinantemente. Cualquier sistema de expresión recombinante puede utilizarse, incluyendo además de células de mamífero, por ejemplo sistemas bacteriales, de levaduras, de insectos o plantas. Alternativamente, estos ácidos nucleicos pueden sintetizarse in vitro por técnicas de síntesis químicas bien conocidas como se describe en por ejemplo, Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982); Adams, Am. Chem. Soc. 105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radie. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blommers, Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth, Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); Patente Norteamericana No. 4,458,066. Los fragmentos de ADN de doble hebra pueden obtenerse entonces ya sea sintetizando la hebra complementaria y templando las hebras juntas para condiciones apropiadas, o agregando la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como por ejemplo, para generar mutaciones en secuencias, subclonación, sondas de etiquetado, secuencias y/o hibridización y similares se describen bien en la literatura científica y de patente. Véase por ejemplo, Sambrook, ed., Molecular Cloning: a Laboratory manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols en Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques en Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Los ácidos nucleicos, los vectores, las cápsidas, los polipéptidos y similares pueden analizarse y cuantificarse por cualquiera de un número de medios generales bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo métodos bioquímicos analíticos tales como NMR, espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de rendimiento elevado (HPLC), cromatografía de capa delgada (TLC) y cromatografía de hiperdifusión, varios métodos inmunológicos, por ejemplo reacciones de precipitina fluida o en gel, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RÍA), e inmunoensayos absorbentes unidos a enzima (los ELISA), ensayos inmunofluorescentes, análisis Southern, análisis Northern, análisis de transferencia de punto, electroforesis en gel (por ejemplo SDS-PAGE), RT-PCR, PCR cuantitativo, otros métodos de amplificación de ácido nucleico u objetivo o de señal, radioetiquetado, conteo por centelleo, y cromatografía por afinidad. Los cebadores de oligonucleótido pueden utilizarse para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos que codifican las regiones de unión de ligando del receptor del sabor. Los ácidos nucleicos descritos en la presente pueden clonarse o medirse también cuantitativamente utilizando técnicas de amplificación. Los métodos de amplificación se conocen también en la técnica, incluyen por ejemplo una reacción de cadena de polimerasa, PCR (PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, ed. Innis. Academic Press, N.Y. (1990) y PCR Strategies, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y. (1995), reacción de cadena ligasa (LCR) (véase por ejemplo, Wu, Genomics 4: 560 (1989); Landegren, Science 241:1077, (1988); Barringer, Gene 89:117 (1990)); amplificación por transcripción (véase por ejemplo, Kwoh, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)); y, replicación de secuencia auto-sostenida (véase por ejemplo, Guatelli, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)); amplificación de replicasa Q Beta (véase por ejemplo, Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491 (1997)); ensayo de amplificación de replicasa Q-beta automatizada (véase por ejemplo, Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271 (1996)) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger, Methods Enzymol. 152:307-316 (1987); Sambrook; Ausubel; Patentes Norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan, Biotechnology 13:563-564 (1995). Los cebadores pueden diseñarse para retener la secuencia original del receptor "donador" de 7-membranas. Alternativamente, los cebadores pueden codificar residuos aminoácidos que son sustituciones conservadoras (por ejemplo hidrofóbicas para el residuo hidrofóbico, véase la discusión anterior) o sustituciones funcionalmente benignas (por ejemplo, no evitan la inserción de membrana en plasma, no provocan desdoblamiento por peptidasa, no provocan pliegues anormales del receptor y similares). Una vez amplificados, los ácidos nucleicos, ya sea individualmente o como bibliotecas, pueden clonarse de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica, si se desea, dentro de cualquiera de una variedad de vectores utilizando los métodos biológicos moleculares de rutina; los métodos para clonar ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,426,039. Los pares cebadores pueden diseñarse para amplificar selectivamente regiones de unión de ligando de las mismas de la familia T1R. Estas regiones pueden variar por diferentes ligandos o degustantes. De este modo, lo que puede ser una región de unión mínima para un degustante, puede ser muy limitante para un segundo degustante. Por consiguiente, las regiones de unión de ligando de diferentes tamaños que comprenden diferentes estructuras de dominio extracelular pueden amplificarse. Los paradigmas para diseñar pares cebadores degenerados se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, un programa de computadora estratégico COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP) es accesible como http://blocks.fhcrc.org/codehop.html, y se enlaza directamente a partir del sitio de alineación de secuencia múltiple BlockMaker para predicción cebadora híbrida empezando con un conjunto de secuencias de proteínas relacionadas, como regiones de unión de ligando del receptor de gusto conocidas (véase por ejemplo, Rose, Nucleic Acids Res. 26:1628-1635 (1998); Singh, Biotechniques 24:318-319 (1998)). Se conocen bien medios para sintetizar pares cebadores oligoneucleótidos en la técnica. Los pares de base "naturales" o pares de base sintéticos pueden utilizarse. Por ejemplo, el uso de nucleobases artificiales ofrece un enfoque versátil para manipular la secuencia cebadora y generar una mezcla más compleja de productos de amplificación. Varias familias de nucleobases artificiales son capaces de asumir múltiples orientaciones de unión de hidrógeno a través de las rotaciones de unión internas para proporcionar un medio para degenerar el reconocimiento molecular. La incorporación de estos análogos dentro de una sola posición de un cebador PCR permite la generación de una biblioteca compleja de productos de amplificación. Véase por ejemplo, Hoops, Nucleic Acids Res. 25:4866-4871 (1997). Las moléculas no polares pueden también utilizarse para imitar la forma de las bases de ADN naturales. Una forma de unión sin hidrógeno que imita la adenina puede replicar eficiente y selectivamente contra una forma no polar que ¡mita la timina (véase por ejemplo, Morales, Nat. Struct. Biol. 5:950-954 (1998)). Por ejemplo, dos bases degeneradas pueden ser la base 6H, 8H-3,4-dihidropirimido[4,5-c]oxazin-7-ona o la primera base N6-metoxi-2,6-diaminopurina (véase por ejemplo, Hill, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:4258-4263 (1998)). Los cebadores degenerados ejemplares de la invención incorporan el análogo 5'-Dimetox¡tritil-N-benzoil-2'-desoxi-C¡tidina,3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (el término "P" en las secuencias, véase anteriormente). Este hidrógeno análogo de pirimidina se une con purinas, incluyendo residuos A y G. Las variantes polimórficas, alelos homólogos de inter-especie que son sustancialmente idénticos a un receptor de gusto descrito en la presente pueden aislarse utilizando las sondas de ácido nucleico descritas anteriormente. Alternativamente, las bibliotecas de expresión pueden utilizarse para clonar polipéptidos T1R y variantes polimórficas, alelos y homólogos de inter-especie de los mismos, detectando homólogos expresados inmunológicamente con antisueros o anticuerpos purificados hechos contra un polipéptido T1R, que reconocen también y se unen selectivamente al homólogo T1R. Los ácidos nucleicos que codifican las regiones de unión de ligando de los receptores de sabor pueden generarse por amplificación (por ejemplo, PCR) de las secuencias de ácido nucleico apropiadas utilizando pares cebadores degenerados. El ácido nucleico amplificado puede ser un ADN genómico a partir de cualquier célula o tejido o ARNm o ADNc derivado de las células que expresan el receptor de gusto. En una modalidad, las secuencias que codifican proteínas híbridas que comprenden ácidos nucleicos que codifican los T1 R combinados a las secuencias de desplazamiento pueden construirse. Se proporcionan también los T1R híbridos que comprenden los motivos de desplazamiento y dominios de unión de degustantes de otras familias de receptores quimio-sensoriales, particularmente receptores de sabor. Estas secuencias de ácido nucleico pueden enlazarse operablemente a elementos control transcripcionales o traslacionales, por ejemplo secuencias de iniciación de trascripción y traducción, promotores y mejoradores, terminadores de trascripción y traducción, poliadenilación, secuencias y otras secuencias útiles para transcribir ADN en ARN. En la base de los casetes de expresión recombinantes, vectores y transgénicos, puede emplearse un fragmento promotor para dirigir la expresión del ácido nucleico deseado en todas las células o tejidos deseados. En otra modalidad, las proteínas de fusión pueden incluir secuencias de desplazamiento C-terminal o N-terminal. Además, las proteínas de fusión pueden comprender elementos adicionales, por ejemplo para detección de proteínas, purificación u otras aplicaciones. La detección y la purificación que facilita los dominios incluyen, por ejemplo péptidos quelantes de metal tales como tractos de polihistidina, módulos de histidina-triptofano, u otros dominios que permiten la purificación en metales inmovilizados; proteína de unión de maltosa; dominio de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada; o el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad de FLAGS Immunex Corp. Seattle, WA). La inclusión de secuencias del enlazador desdoblable tales como el Factor Xa (véase por ejemplo, Ottavi, Biochimie 80:289-293 (1998)), motivo de reconocimiento de la subtilisina proteasa (véase por ejemplo, Polyak, Protein Eng. 10:615-619 (1997)); enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA), y similares entre el dominio de desplazamiento (para expresión de membrana de plasma eficiente) y el resto del polipéptido recientemente traducido pueden utilizarse para facilitar la purificación. Por ejemplo, una construcción puede incluir un polipéptido que codifica una secuencia de ácido nucleico enlazada a 6 residuos de histidina seguidos por un tioredoxin, un sitio de desdoblamiento de enterocinasa (véase por ejemplo, Williams, Biochemistry 34:1787-1797 (1995)), y un dominio de desplazamiento C-terminal. Los residuos de histidina facilitan la detección y la purificación mientras que los sitios de desdoblamiento de enterocinasa proporcionan un medio para purificar la o las proteínas deseadas a partir del resto de la proteína de fusión. Se describen bien tecnologías que se relacionan a vectores que codifican proteínas de fusión y a la aplicación de proteína de fusión en la literatura científica y de patente, véase por ejemplo, Kroll, DNA Cell Biol. 12:441-53 (1993). Los vectores de expresión, ya sea como vectores de expresión individuales o como bibliotecas de vectores de expresión, que comprenden las secuencias de codificación de dominio de unión de ligando pueden introducirse dentro de un genoma o dentro del citoplasma o un núcleo de una célula y se expresan por una variedad de técnicas convencionales, se describirán en la literatura científica y de patente. Véase por ejemplo, Roberts, Nature 328:731 (1987); Berger supra; Schneider, Protein Exp. Purif. 6435:10 (1995) Sambrook; Tijssen; Ausubel. La información del producto a partir de los fabricantes de reactivos biológicos y equipo experimental proporciona también información con respecto a métodos biológicos conocidos. Los vectores pueden aislarse de fuentes naturales, obtenidas a partir de tales fuentes como ATCC o bibliotecas GenBank, o preparados por métodos sintéticos o recombinantes. Los ácidos nucleicos pueden expresarse utilizando casetes y vectores de expresión o virus que son estables o temporalmente expresados en células (por ejemplo, sistemas de expresión episomales). Los marcadores de selección pueden incorporarse dentro de los casetes y vectores de expresión para conferir un fenotipo seleccionable en células y secuencias trasformadas. Por ejemplo, los marcadores de selección pueden codificar el mantenimiento y la replicación episomal de manera que la integración dentro del genoma huésped no se requiera. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a antibióticos (por ejemplo cloranfenicol, kanamicina, G418, blasticidina, higromicina) o resistencia al herbicida (por ejemplo, clorosulfuron o Basta) para permitir la selección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase por ejemplo, Blondelet-Rouault, Gene 190:315-317 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:992-997 (1997)). Debido a que los genes marcadores seleccionables que confieren resistencia a sustratos como neomicina o higromicina pueden sólo utilizarse en cultivo de tejidos, los genes de quimio-resistencia se utilizan también como marcadores seleccionables in vitro e in vivo. Una secuencia de ácido nucleico quimérica puede codificar un dominio de unión de ligando T1R dentro de cualquier polipéptido de 7-transmembrana. Debido a que los polipéptidos receptores de 7-transmembrana tienen secuencias primarias similares y estructuras secundarias y terciarias, dominios estructurales (por ejemplo dominio extracelular, dominios TM, dominio citoplásmico, etc.) pueden identificarse fácilmente por análisis de secuencia. Por ejemplo, el modelado de homología, análisis Fourier y la detección de periodicidad helicoidal pueden identificar y caracterizar los siete dominios con una secuencia de receptor 7-transmembrana. Los algoritmos de transformación Fourier Rápido (FFT) puede utilizarse para evaluar los periodos dominantes que caracterizan los perfiles de propiedad hidrofóbica y la variabilidad de secuencias analizadas. El mejoramiento de la detección de periodicidad y el índice de periodicidad alfa helicoidal pueden hacerse como por ejemplo Donnelly, Protein Sci. 2:55-70 (1993). Otros algoritmos de modelación y alineamiento se conocen bien en la técnica, véase por ejemplo, Peitsch, Receptors Channels 4:161-164 (1996); Kyte & Doolittle, J. Med. Biol., 157:105-132 (1982); Cronet, Protein Eng. 6:59-64 (1993). La presente invención incluye también no sólo el ADN y las proteínas que tienen las secuencias de aminoácido y ácido nucleico específicas, sino también fragmentos de ADN, particularmente fragmentos de por ejemplo 40, 60, 80, 100, 150, 200 ó 250 nucleótidos, o más, así como fragmentos de proteína de por ejemplo 10, 20, 30, 50, 70, 100 ó 150 aminoácidos, o más. Opcionalmente, los fragmentos del ácido nucleico pueden codificar un polipéptido antigénico, el cual es capaz de unirse a un anticuerpo elevado contra un miembro de la familia T1R. Además, un fragmento de proteínas de la invención puede opcionalmente ser un fragmento antigénico, el cual es capaz de unirse a un anticuerpo que se eleva contra un miembro de la familia T1R. Se contemplan también proteínas quiméricas, que comprenden al menos 10, 20, 30, 50, 70, 100 ó 150 aminoácidos o más, de uno de al menos uno de los polipéptidos T1R descritos en la presente, acoplados a aminoácidos adicionales que representan todos o parte de otro GPCR, de preferencia un miembro de la superfamilia de 7-transmembrana. Estas quimeras pueden hacerse a partir de los receptores presentes y otro GPCR, o pueden hacerse combinando dos o más de los presentes receptores T1R. En una modalidad, una porción de la quimera corresponde a, o se deriva del dominio extracelular de un polipéptido T1R de la invención. En otra modalidad, una porción de la quimera corresponde a, o se deriva del dominio extracelular y uno o más de los dominios de transmembrana de un polipéptido T1R descrito en la presente, y la porción o porciones restantes pueden originarse de otro GPCR. Los receptores quiméricos son bien conocidos en la técnica, y las técnicas para crearlos y la selección y límites de dominios o fragmentos de los receptores acoplados de proteína G para la incorporación de la presente son bien conocidos también. De este modo, este conocimiento de aquellos expertos en la técnica puede utilizarse fácilmente para crear tales receptores quiméricos. El uso de tales receptores quiméricos puede proporcionar, por ejemplo una característica de selectividad de sabor de uno de los receptores descrito específicamente en la presente, acoplado con las características de traducción de señal de otro receptor, tal como un receptor bien conocido utilizado en los sistemas de ensayo de la técnica anterior. Como se observa anteriormente, tales quimeras, análogos al receptor T1R nativos o combinación o asociación del receptor T1R nativo se unirán a, y/o se activarán por moléculas que afectan normalmente el sabor dulce o sabor acre. Los receptores T1R quiméricos funcionales o combinaciones receptoras son moléculas que cuando se expresan solas o en combinación con otros T1R u otros GPCR (que pueden por si mismos ser quiméricos) se unen a, o los cuales se activan por el estímulo del gusto, particularmente el estímulo de sabor dulce (T1R2/3) o acre (T1R1/3). Las moléculas que producen el sabor dulce incluyen edulcorantes naturales y artificiales tales como sacarosa, aspartame, xilitol, ciclamato, et al. Las moléculas que producen sabor acre incluyen glutamato y análogos de glutamato y otros compuestos que se unen a T1R1 y/o T1R3 nativo, tal como 5'-nucleótidos.
Por ejemplo, un dominio tal como un dominio de unión de ligando, un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, un dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico, un dominio N-terminal, un dominio C-terminal, o cualquier combinación de los mismos, pueden enlazarse covalentemente a una proteína heteróloga. Por ejemplo, un dominio extracelular T1R puede enlazarse a un dominio de transmembrana GPCR heterólogo, o un dominio extracelular GPCR heterólogo puede enlazarse a un dominio de transmembrana T1R. Otras proteínas heterólogas de elección pueden utilizarse; por ejemplo, proteína fluorescente verde. También, dentro del alcance de la invención están células huéspedes para expresar los T1R, fragmentos, quimeras o variantes de la invención. Para obtener niveles elevados de expresión de un gen clonado o ácido nucleico, tal como los ADNc que codifican los T1R, fragmentos o variantes de la invención, alguien con experiencia subclona normalmente la secuencia de ácido nucleico de interés dentro de un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de transcripción/traducción, y si hay, para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión de ribosoma para iniciación trasnacional. Los promotores bacterianos adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. Sin embargo, los sistemas de expresión bacterianos o eucarióticos pueden utilizarse.
Cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótido extraños en células huéspedes pueden utilizarse. Estos incluyen el uso de la transfección de fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores de plasma, vectores virales y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir el ADN genómico, el ADNc, el ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (véase por ejemplo, Sambrook, ef al.) Es sólo necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular utilizado sea capaz de introducir exitosamente al menos una molécula de ácido nucleico en la célula huésped capaz de expresar el T1R, el fragmento o una variante de interés. Después que el vector de expresión se introduce dentro de las células, las células transfectadas se cultivan bajo condiciones de expresión de sabor del receptor, el fragmento o una variante de interés, la cual se recupera entonces a partir del cultivo utilizando técnicas estándares. Ejemplos de tales técnicas son bien conocidos en el arte. Véase por ejemplo, WO 00/06593, que se incorpora para referencia en una manera consistente con esta descripción.
Detección de Polipéptido T1R Además de la detección de los genes T1R y la expresión genética utilizando tecnología de hibridización de ácido nucleico, se pueden también utilizar inmunoensayos para detectar los T1R, por ejemplo, para identificar la célula receptoras de sabor, y las variantes de los miembros de la familia T1R. Los inmunoensayos pueden utilizarse para analizar cuantitativa o cualitativamente los T1R. Una vista general de la tecnología aplicable puede encontrarse en Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (1988). 1. Anticuerpos para Miembros de la Familia T1R Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con un miembro de la familia T1R se conocen por aquellos con experiencia en la técnica (véase por ejemplo, Coligan, Current Protocols in ¡mmunology (1991); Harlow & Lañe, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed. 1986); y Kohier & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)). Tales técnicas incluyen la preparación de anticuerpos por selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares, así como una preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales inmunizando conejos o ratones (véase por ejemplo, Huse ef al., Science, 246:1275-1281 (1989); Ward ef al, Nature, 341:544-546 (1989)). Un número de inmunógenos que comprenden T1R pueden utilizarse para producir anticuerpos específicamente reactivos con un miembro de la familia T1R. Por ejemplo, un polipéptido T1R recombinante, o un fragmento antigénico del mismo, pueden aislarse como se describe en la presente. Las regiones antigénicas adecuadas incluyen, por ejemplo las secuencias consenso que se utilizan para identificar miembros de la familia T1R. Las proteínas recombinantes pueden expresarse en células eucarióticas o procarióticas como se describe anteriormente, y purificarse como se describe generalmente de manera anterior. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Alternativamente, puede utilizarse un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente y se conjuga a una proteína portadora como un inmunógeno. La proteína de origen natural puede utilizarse también ya sea en forma pura o impura. El producto se inyecta entonces dentro de un animal capaz de producir anticuerpos. Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales pueden generarse, para uso subsecuente en inmunoensayos para medir la proteína. Los métodos de producción de anticuerpos policlonales se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, una cepa congénita de ratones (por ejemplo, ratones BALB/C) o conejos se inmuniza con la proteína utilizando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización estándar. La respuesta inmune del animal a la preparación inmunogénica se monitorea tomando pruebas de sangre y determinando el título de reactividad al T1R. Cuando los títulos apropiadamente elevados del anticuerpo al inmunógeno se obtienen, la sangre se recolecta a partir de animales y se preparan los antisueros. La fraccionación adicional de los antisueros para enriquecer anticuerpos reactivos a la proteína pueden hacerse si se desea (véase Harlow & Lañe, supra). Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por varias técnicas familiares por aquellos expertos en el arte. Brevemente, las células del bazo a partir de un animal inmunizado con un antígeno deseado pueden inmortalizarse, comúnmente por fusión con una célula de mieloma (véase Kohier & Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519 (1976)). Métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que se originan a partir de células inmortalizadas sencillas se seleccionan para producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y la producción de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células puede mejorarse por varias técnicas, incluyendo la inyección dentro de la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar las secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de las mismas seleccionando una biblioteca de ADN a partir de células B humanas de acuerdo al protocolo general subrayado por Huse ef al., Science, 246:1275-1281 (1989).
Los anticuerpos monoclonales y los sueros policlonales se recolectan y se titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Normalmente, los antisueros policlonales con una cantidad de 104 o mayor se seleccionan y prueban para su reactividad cruzada contra polipéptidos sin T1R, o aún otros miembros de la familia T1R u otras proteínas relacionadas a partir de otros organismos, utilizando inmunoensayo de unión competitivo. Los antisueros policlonales específicos y los anticuerpos monoclonales se unirán usualmente con un Kd de al menos aproximadamente 0.1 mM, más usualmente al menos aproximadamente 1 pM, opcionalmente al menos aproximadamente 1.0 pM o mejor y opcionalmente 0.01 pM o mejor. Una vez que los anticuerpos específicos del miembro de la familia T1R están disponibles, las proteínas T1R individuales y los fragmentos de proteínas pueden detectarse por una variedad de métodos de inmunoensayos. Para una revisión de procedimientos inmunológicos e inmunoensayo, véase Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden realizarse en cualquiera de las diversas configuraciones, que se revisan extensivamente en Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); y Harlow & Lañe, supra. 2. Ensayos de Unión Inmunológicos Las proteínas T1R, los fragmentos, y las variantes pueden detectarse y/o cuantificarse utilizando cualquier número de ensayos de unión inmunológicos bien reconocidos (véase por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288 y 4,837,168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, véanse también Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991). Los ensayos de unión inmunológicos (o inmunoensayos) utilizan normalmente un anticuerpo que se une específicamente a una proteína o antígeno de elección (en este caso un miembro de la familia T1R o una subsecuencia antigénica del mismo). El anticuerpo (por ejemplo anti-T1R) puede producirse por cualquiera de un número de medios bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica y como se describe anteriormente. Los inmunoensayos con frecuencia utilizan también un agente de etiquetado para unirse específicamente a, y etiquetar el complejo formado por el anticuerpo y el antígeno. El agente de etiquetado puede por sí mismo ser una de las porciones que comprende el complejo de anticuerpo/antígeno. De este modo, el agente de etiquetado puede ser un polipéptido T1R etiquetado o un anticuerpo anti-T1R etiquetado. Alternativamente, el agente de etiquetado puede ser una tercera porción, tal como un anticuerpo secundario que se une específicamente al complejo de anticuerpo/Ti R (un anticuerpo secundario es normalmente específico a anticuerpos de las especies a partir de las cuales se deriva el primer anticuerpo). Otras proteínas capaces de unir específicamente regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G puede utilizarse también como el agente de etiquetado. Estas proteínas exhiben una reactividad no inmunogénica fuerte con regiones constantes de ¡nmunoglobulina a partir de una variedad de especies (véase por ejemplo, Kronval ef al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol., 135:2589-2542 (1985)). El agente de etiquetado puede modificarse con una porción detectable, tal como biotina, a la cual otra molécula puede unirse específicamente, tal como estreptavidina. Una variedad de porciones detectables son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. A través de los ensayos, las etapas de incubación y/o lavado pueden requerirse después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos a varias horas, opcionalmente desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, el antígeno, el volumen de solución, las concentraciones y similares. Usualmente, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden conducirse durante un rango de temperaturas, tales como 10°C a 40°C.
A. Formatos de Ensayo no Competitivos Los inmunoensayos para detectar un polipéptido T1R en una muestra pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los cuales la cantidad de antígeno se mide directamente. En un ensayo "intercalado" preferido, por ejemplo, los anticuerpos anti-T1R pueden encontrarse directamente a un sustrato sólido en donde se inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados capturan entonces el polipéptido T1R presente en la muestra de prueba. El polipéptido T1R se inmoviliza entonces, se une entonces por un agente de etiquetado, tal como un segundo anticuerpo T1R que soporta una marca. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de una marca, pero este puede, a su vez unirse por un tercer anticuerpo etiquetado específico a anticuerpos de las especies a partir de las cuales el segundo anticuerpo se deriva. El segundo y tercer anticuerpos se modifican normalmente con una porción detectable, tal como biotina, a la cual otra molécula se une específicamente, por ejemplo, estreptavidina, para proporcionar una porción detectable.
B. Formatos de Ensayo Competitivos En los ensayos competitivos, la cantidad del polipéptido T1R presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un polipéptido T1R conocido, agregado (exógeno) desplazado (rivalizado fuera) a partir de un anticuerpo anti-T1R por el polipéptido T1R desconocido presente en una muestra. En un ensayo competitivo, una cantidad conocida del polipéptido T1R se agrega a una muestra y la muestra se pone en contacto entonces con un anticuerpo que se une específicamente al T1R. La cantidad del polipéptido T1R exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración del polipéptido T1R presente en la muestra. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo se inmoviliza en un sustrato sólido. La cantidad del polipéptido T1R unida al anticuerpo puede determinarse ya sea midiendo la cantidad del polipéptido T1R presente en un complejo T1 R/anticuerpo, o alternativamente midiendo la cantidad de la proteína no combinada restante. La cantidad del polipéptido T1R puede detectarse proporcionando una molécula T1R etiquetada. Un ensayo de inhibición de hapteno es otro ensayo competitivo preferido. En este ensayo, el polipéptido T1R conocido se inmoviliza en un sustrato sólido. Una cantidad conocida de anticuerpo anti-T1R se agrega a la muestra, y la muestra se pone en contacto entonces con el T1R inmovilizado. La cantidad del anticuerpo anti-T1R unida al polipéptido T1R inmovilizado conocido es inversamente proporcional a la cantidad del polipéptido T1R presente en la muestra. De nuevo, la cantidad del anticuerpo inmovilizado puede detectarse detectando ya sea la fracción inmovilizada del anticuerpo o la fracción del anticuerpo que permanece en la solución. La detección puede ser directa en donde el anticuerpo se etiqueta o indirecta por la adición subsecuente de la porción etiquetada que une específicamente al anticuerpo como se describe anteriormente.
C. Determinaciones de la reactividad Cruzada Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva pueden utilizarse también para determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, una proteína al menos parcialmente codificada por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente pueden inmovilizarse a un soporte sólido. Las proteínas (por ejemplo, polipéptidos T1R y homólogos) se agregan al ensayo que rivalizan para la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas agregadas para rivalizar para la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara a la capacidad del polipéptido T1R codificado por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente para rivalizar consigo misma. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula, utilizando cálculos estándares. Aquellos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas agregadas listadas anteriormente se seleccionan y agrupan. Los anticuerpos de reacción cruzada se remueven opcionalmente a partir de los antisueros agrupados por inmunoabsorción con las proteínas consideradas agregadas, por ejemplo, homólogos distantemente relacionados. Además, los péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que representan motivos conservados que se utilizan para identificar miembros de la familia T1R pueden utilizarse en determinaciones de reactividad cruzada. Los antisueros inmunoabsorbidos y agrupados se utilizan entonces en un inmunoensayo de unión competitiva como se describe anteriormente para comparar una segunda proteína, se piensa que quizás sea un alelo o una variante polimórfica de un miembro de la familia T1R, a la proteína inmunogénica (es decir, el polipéptido T1R codificado por las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente). Con el fin de hacer esta comparación, las dos proteínas se evalúan cada una en un amplio rango de concentraciones y la cantidad de cada proteína requerida para inhibir 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se determina. Si la cantidad de la segunda proteína requerida para inhibir 50% de unión es menor de 10 veces la cantidad de la proteína codificada por las secuencias del ácido nucleico descritas en la presente requerida para inhibir 50% de unión, entonces la segunda proteína se une específicamente a los anticuerpos policlonales generados a un inmunógeno T1R. Los anticuerpos que se elevan contra los motivos conservados de T1R pueden también utilizarse para preparar anticuerpos que se unen específicamente solo a los GPCR de la familia T1R, pero no a los GPCR a partir de otras familias. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un miembro particular de la familia T1R pueden hacerse substrayendo los anticuerpos reactivos cruzados utilizando otros miembros de la familia T1R. Los anticuerpos policlonales específicos de especies pueden hacerse en una forma similar. Por ejemplo los anticuerpos específicos a T1R1 humano pueden hacerse sustrayendo anticuerpos que son reactivos cruzados con secuencias ortólogas, por ejemplo T1R1 de rata o T1R1 de ratón.
D. Otros formatos de ensayo Se utiliza el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia del polipéptido T1R en la muestra. La técnica generalmente comprende separar las proteínas de la muestra por electroforesis en gel en la base del peso molecular, transfiriendo las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o un filtro de nylon derivado), incubando la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido T1R. Los anticuerpos de polipéptido anti-T1R se unen específicamente al polipéptido T1R en el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden etiquetarse directamente o alternativamente pueden detectarse de manera subsecuente utilizando anticuerpos etiquetados (por ejemplo, anticuerpos antiratón de oveja etiquetados) que se unen específicamente a los anticuerpos anti-T1R. Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos de liposoma (LIA), que utilizan liposomas diseñados para unir moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los químicos liberados se detectan entonces de acuerdo a técnicas estándares (véase Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev., 5:34-41 (1986)).
E. Reducción de unión no específica Alguien con experiencia en la técnica apreciará que es con frecuencia deseable minimizar la unión no específica en inmunoensayos. Particularmente, cuando el ensayo implica un antígeno o un anticuerpo inmovilizado en un sustrato sólido, es deseable minimizar la cantidad de unión específica al sustrato. Medios para reducir tal unión específica son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Típicamente, esta técnica implica recubrir el sustrato con una composición de proteína. En particular, las composiciones de proteínas tales como albúmina de suero de bovino (BSA), leche pulverizada sin grasa, y gelatina se utilizan ampliamente con leche pulverizada que es la más preferida.
F. Etiquetas La etiqueta particular o el grupo detectable utilizado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención, siempre y cuando no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que tiene una propiedad física o química detectable. Tales etiquetas detectables se han desarrollado bien en el campo de los inmunoensayos y, en general, puede aplicarse la mayoría de las etiquetas útiles en tales métodos a la presente invención. De este modo, una etiqueta es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADSTM). Tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo de Texas, rodamina y similares), radioetiquetas (por ejemplo 3H, 125l, 14C, 35S), enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatos alcalinos y otros comúnmente utilizados en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidales o perlas de vidrio o de plástico coloreadas (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, efe). La etiqueta puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Como se indica anteriormente, una amplia variedad de etiquetas puede utilizarse, con la elección de la etiqueta dependiendo de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el compuesto, requerimientos de estabilidad, instrumentación disponible, y prohibiciones desechables. Etiquetas no radioactivas se unen con frecuencia por medios indirectos. Generalmente, una molécula ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando se une entonces a otras moléculas (por ejemplo, estreptavidina) molécula, la cual es inherentemente detectable o covalentemente detectable o covalentemente unida a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Los ligandos y sus objetivos pueden utilizarse en cualquier combinación adecuada con anticuerpos que reconocen un polipéptido T1R, o anticuerpos secundarios que reconocen anti-T1R. Las moléculas pueden también conjugarse directamente a los compuestos de generación de señal, por ejemplo, por conjugación con una enzima o un fluoróforo. Las enzimas de interés como etiquetas serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, estearasas, y glicosidasas, u oxidotasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalacinedionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de varios sistemas de producción de etiquetado o de señal que pueden utilizarse, véase la Patente Norteamericana No. 4,391,904. Los medios para detectar etiquetas son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. De este modo, por ejemplo, en donde la etiqueta es una etiqueta radioactiva, los medios para detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como en autorradiografía. Cuando la etiqueta es una etiqueta fluorescente, ésta puede detectarse estimulando el fluorocromo con la longitud de onda apropiada de luz y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente, por medio de una película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados de carga (los CCD) o fotomultiplicadores y similares. De manera similar, las etiquetas enzimáticas pueden detectarse proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, las etiquetas colorimétricas sencillas pueden detectarse simplemente observando el color asociado con la etiqueta. De este modo, en varios ensayos de varilla graduada, el oro conjugado con frecuencia parece rosa, mientras que varias perlas conjugadas parecen del color de la perla. Algunos formatos del ensayo no requieren del uso de componentes etiquetados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación pueden utilizarse para detectar la presencia de los anticuerpos objetivo. En este caso, las partículas recubiertas con antígeno se aglutinan por muestras que comprenden anticuerpos objetivo. En este formato, ninguno de los componentes necesitan ser etiquetados y la presencia del anticuerpo objetivo se detecta por simple inspección visual.
Detección de Moduladores Las composiciones y métodos para determinar ya sea un compuesto de prueba específicamente se une a un receptor T1R de la invención, tanto in vitro como in vivo, se describen posteriormente. Muchos aspectos de la fisiología celular pueden monitorearse para evaluar el efecto de la unión de ligando a un polipéptido T1R de la invención. Estos ensayos pueden realizarse en células intactas que expresan un receptor quimiosensorial, en células permeabilizadas, o en fracciones de membranas producidas por métodos estándares o in vitro en proteínas de nuevo sintetizadas. Los receptores de sabor in vivo se unen a degustantes e inician la transducción del estímulo químico en las señales eléctricas. Una proteína G activada o inhibida a su vez alterará las propiedades de las enzimas objetivos, los canales y otras proteínas efectuadas. Algunos ejemplos son la activación de la cGMP fosfodiesterasa por transduccina en el sistema visual, la adenilato ciclasa por la proteína G estimuladora, la fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G del mismo origen y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. Las consecuencias corriente abajo pueden examinarse también tal como la generación del d iaci Ig licerol y IP3 por fosfolipasa C, y a su vez, para la movilización de calcio por IP3. Las proteínas T1R o polipéptidos del ensayo se seleccionarán de preferencia a partir de un polipéptido que tiene la secuencia de polipéptido T1R seleccionado a partir de aquellas descritas en el Ejemplo 1, o fragmentos o variantes moderadamente modificadas de los mismos. Opcionalmente, los fragmentos y variantes pueden ser fragmentos antigénicos y variantes que se unen a un anticuerpo anti-T1R. Opcionalmente, los fragmentos y variantes pueden unirse a, o activarse por edulcorantes o degustantes acres. Alternativamente, las proteínas o polipéptidos T1R del ensayo pueden derivarse de una célula huésped eucariótica y pueden incluir una sub-secuencia de aminoácido que tiene identidad de secuencia de aminoácido a los polipéptidos T1R descritos en el Ejemplo 1, o fragmentos o variantes moderadamente modificadas de los mismos. Generalmente, la identidad de secuencia de aminoácidos será al menos 35 ó 50%, u opcionalmente 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. Opcionalmente, las proteínas o polipéptidos T1R de los ensayos pueden comprender un dominio de una proteína T1R, tal como un dominio extracelular, una región de transmembrana, un dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico, un dominio de unión de ligando, y similares. Además, como se describe anteriormente, la proteína T1R o un dominio de la misma pueden unirse covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica utilizada en los ensayos descritos en la presente. Los moduladores de la actividad receptora T1R se prueban utilizando proteínas o polipéptidos T1R como se describe anteriormente, ya sea recombinantes o de origen natural. Las proteínas o polipéptidos T1R pueden aislarse, co-expresarse en una célula, co-expresarse en una membrana derivada de una célula, co-expresarse en tejido, o en un animal, ya sea recombinante o de forma natural. Por ejemplo, rebanadas de lengua, células disociadas a partir de una lengua, células transformadas, o membranas pueden utilizarse. La modulación puede probarse utilizando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos experimentales infra, se ha descubierto que ciertos 5' nucleótidos, por ejemplo 5' IMP o 5' GMP mejoran la actividad del L-glutamato para activar el receptor de sabor acre, o bloquea la activación del receptor de sabor acre por el estímulo de sabor acre tal como L-glutamato y L-aspartato. 1. Ensayos de unión in vitro La transducción puede examinarse también in vitro con reacciones en estado soluble o sólido, utilizando los polipéptidos T1R de la invención. En una modalidad particular, los dominios de unión de ligando T1R pueden utilizarse in vitro en reacciones en estado soluble o sólido para evaluar la unión de ligando. Por ejemplo, el dominio N-terminal T1R se predice para involucrarse en la unión de ligando. Más particularmente, los T1R pertenecen a una sub-familia GPCR que se caracteriza por segmentos N-terminales extracelulares, de aproximadamente 600 aminoácidos grandes. Estos segmentos N-terminales se piensa que forman los dominios de unión de ligando, y son por lo tanto útiles en ensayos bioquímicos para identificar agonistas y antagonistas T1R. Es posible que el dominio de unión del ligando pueda formarse por las porciones adicionales del dominio extracelular, tal como los bucles extracelulares del dominio de transmembrana. Los ensayos de unión in vitro se han utilizado con otros GPCR que se relacionan a los T1R, tal como los receptores de glutamato metabotrópico (véase por ejemplo, Han y Hampson, J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999)). Estos ensayos podrían implicar desplazar un ligando radioactivo o fluorescentemente etiquetado, midiendo los cambios en fluorescencia intrínseca o cambios en susceptibilidad proteolítica, etc. La unión de ligandos a un complejo hetero-multimérico de los polipéptidos T1R de la invención puede probarse en la solución, en una membrana de bicapa, unida opcionalmente a una fase sólida, en una monocapa lípida, o en vesículas. La unión de un modulador puede probarse utilizando, por ejemplo, cambios en características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbencia, índice refractivo) propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, diseño), cromatográficas o de solubilidad. En otra modalidad de la invención, un ensayo de GTP?35S puede utilizarse. Como se describe anteriormente, en la activación de un GPCR, la subunidad Ga del complejo de proteína G se estimula para intercambiar el GDP unido por GTP. La estimulación mediada por ligandos de la actividad de intercambio de proteínas G puede medirse en un ensayo bioquímico midiendo la unión de GTP?35S radioactivamente etiquetados a la proteína G en la presencia de un ligando putativo. Normalmente, las membranas que contienen el receptor quimiosensorial de interés se mezclan con un complejo de proteínas G. Los inhibidores y/o activadores potenciales y los GTP?35S se agregan al ensayo, y la unión de los GTP?35S a la proteína G se mide. La unión puede medirse por conteo por centello líquido o por cualquier otro medio conocido en la técnica, incluyendo ensayos de proximidad de centello (SPA). En otros formatos de ensayos, pueden utilizarse GTP?S etiquetados fluorescentemente. 2 Ensayos de Polarización de Fluorescencia En otra modalidad, los ensayos basados en Polarización de Fluorescencia ("FP") pueden utilizarse para detectar y monitorear unión de ligandos. La polarización de fluorescencia es una técnica de laboratorio versátil para medir de la unión en equilibrio, la hibridización del ácido nucleico y la actividad enzimática. Los ensayos de polarización de fluorescencia son homogéneos en que no requieren una etapa de separación tal como la centrifugación, la filtración, la cromatografía, la precipitación o la electroforesis. Estos ensayos se hacen en tiempo real, directamente en solución y no requieren una fase inmovilizada. Los valores de polarización pueden medirse repetidamente y después de la adición de reactivos ya que medir la polarización es rápido y no destruye la muestra. Generalmente, esta técnica puede utilizarse para medir los valores de polarización de fluoróforos a partir de niveles picomolares a micromolares bajos. Esta sección describe cómo la polarización de fluorescencia puede utilizarse en una forma simple y cuantitativa para medir la unión de ligandos a los polipéptidos T1R de la invención. Cuando una molécula fluorescentemente etiquetada se estimula con luz polarizada plana, ésta emite luz que tiene un grado de polarización que es inversamente proporcional a su rotación molecular. Las moléculas grandes, fluorescentemente etiquetadas permanecen relativamente estacionarias durante el estado excitado (4 nanosegundos en el caso de la fluoresceína) y la polarización de la luz permanece relativamente constante entre la excitación y la emisión. Pequeñas moléculas fluorescentemente etiquetadas giran rápidamente durante el estado excitado y la polarización cambia significativamente entre la excitación y la emisión. Por lo tanto, pequeñas moléculas tienen valores de polarización bajos y grandes moléculas tienen valores de polarización elevados. Por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado con fluoresceína de una sola hebra tiene un valor de polarización relativamente bajo, pero cuando se hibridiza a una hebra complementaria, tiene un valor de polarización más elevado.
Cuando se utiliza FP para detectar y monitorear la unión del degustante que puede activar o inhibir los receptores quimiosensoriales de la invención, los degustantes etiquetados con fluorescencia o degustantes auto-fluorescentes pueden utilizarse. La polarización (P) de fluorescencia se define como: p = I?tíu-Int± En donde p es la intensidad de la luz de emisión paralela al plano de luz de excitación e Int ± es la intensidad de la luz de emisión perpendicular al plano de luz de excitación. P, que es una relación de intensidades de luz, es un número sin dimensión. Por ejemplo, el sistema Beacon® y Beacon 2000™ puede utilizarse junto con estos ensayos. Tales sistemas expresan normalmente la polarización en unidades de milipolarización (1 Unidad de Polarización = 1000 unidades mP). La relación entre la rotación molecular y el tamaño se describe por la ecuación Perrin y el lector se refiere a Jolley, M.E. (1991) en Journal of Analytical Toxicology, pp. 236-240, que da una explicación completa de esta ecuación. Brevemente, la ecuación Perri establece que la polarización es directamente proporcional al tiempo de relajación rotacional, el tiempo que toma una molécula que gira a través de un ángulo de aproximadamente 68.5° de tiempo de relajación rotacional es relativo a la viscosidad (?), temperatura absoluta (T), volumen molecular (V), y la constante de gas (R) por la siguiente ecuación: 3?V Tiempo de Relajación Rotacional=- RT El tiempo de relajación rotacional es pequeño (« 1 nanosegundo) para moléculas pequeñas (por ejemplo, fluorescencia) y grandes (« 100 nanosegundos) para moléculas grandes (por ejemplo, inmunoglobulinas). Si la viscosidad y la temperatura se mantienen constantes, el tiempo de relajación rotacional, y por lo tanto la polarización, se relaciona directamente al volumen molecular. Los cambios en el volumen molecular pueden deberse a interacciones con otras moléculas, la disociación, la polimerización, la degradación, la hibridización o los cambios conformacionales de la molécula fluorescentemente etiquetada. Por ejemplo, la polarización de fluorescencia se ha utilizado para medir el desdoblamiento enzimático de polímeros etiquetados con fluoresceína grandes por proteasas, ADNasas y ARNasas. Se ha utilizado también para medir la unión en equilibrio para las interacciones de proteína/proteína, unión de anticuerpo/antígeno y la unión de proteína/ADN.
A. Ensayos de Rendimiento Elevado en Estado Sólido y Soluble En aún otra modalidad, la invención proporciona ensayos solubles que utilizan un complejo polipéptido T1R hetero- oligomérico; o una célula o tejido co-expresa polipéptidos T1R. De preferencia, la célula comprenderá una línea celular que coexpresa establemente un receptor de sabor T1R1/T1R3 funcional (acre) del receptor de sabor T1R2/T1R3 (dulce). En otra modalidad, la invención proporciona una fase sólida basada en ensayos in vitro en un formato de rendimiento elevado, en donde los polipéptidos T1R, o la célula o el tejido que expresan los polipéptidos T1R se une a un sustrato de fase sólida o un compuesto que estimula el sabor y se pone en contacto con un receptor T1R, y se detecta la unión utilizando una etiqueta apropiada o anticuerpo que se eleva contra el receptor T1R. En los ensayos de rendimiento elevado de la invención, es posible tamizar varios miles de diferentes moduladores o ligandos en un solo día. En particular, cada pozo de una placa microtituladora puede utilizarse para operar un ensayo por separado contra un modulador potencial seleccionado, o, si van a observarse efectos de tiempo de concentración o de incubación, cada 5-10 pozos pueden probar un solo modulador. De este modo, una placa microtituladora estándar sencilla puede evaluar aproximadamente 100 (por ejemplo 96) moduladores. Si se utilizan 1536 placas de pozo, entonces una sola placa puede evaluarse fácilmente desde aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 diferentes compuestos. Es también posible evaluar múltiples compuestos en cada pozo de placa. Es posible evaluar varias diferentes placas por día; tamizar ensayos por hasta aproximadamente 6,000-20,000 diferentes compuestos es posible utilizando los sistemas integrados de la invención. Más recientemente, se han desarrollado enfoques microfluidos para manipulación de reactivos. La molécula de interés puede unirse al componente en estado sólido, directa o indirectamente, a través de un enlace no covalente, por ejemplo, a través de una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquiera de una variedad de componentes. En general, una molécula la cual se une a la etiqueta (un aglutinante de etiqueta) se fija a un soporte sólido, y la molécula etiquetada de interés (por ejemplo, la molécula de transducción de sabor de interés) se une al soporte sólido por interacción de la etiqueta y el aglutinante de etiqueta. Un número de etiquetas y aglutinantes de etiqueta pueden utilizarse, con base en las interacciones moleculares conocidas se describirá en la literatura. Por ejemplo, en donde una etiqueta tiene un aglutinante natural, por ejemplo, biotina, proteína A, o proteína G, o puede utilizarse junto con aglutinantes de etiqueta apropiados (avidina, estreptividina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos a moléculas con aglutinantes naturales tales como biotina son también aglutinantes de etiqueta apropiados y ampliamente disponibles (véase, SIGMA Immunochemicals 1998 catálogo SIGMA, St. Louis MO). De manera similar, cualquier compuesto hapténico o antigénico puede utilizarse en combinación con cualquier anticuerpo apropiado para formar un par de aglutinantes de etiqueta/etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están comercialmente disponibles y muchos anticuerpos adicionales se describen en la literatura. Por ejemplo, en una configuración común, la etiqueta es un primer anticuerpo y el aglutinante de etiqueta es un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo. Además de las interacciones de anticuerpo-antígeno, las interacciones de receptor-ligando son también apropiadas como pares de etiqueta y de etiqueta-aglutinante. Por ejemplo, los agonistas y antagonistas de receptores de membrana celular (por ejemplo, interacciones de receptor-ligando celular tales como transferrina, c-kit, ligandos de receptores virales, receptores de citosina, receptores de quimiocina, receptores de interleucina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia de cadereína, la familia de la integrina, la familia de la selectina y similares; véase por ejemplo, Pigott & Power, The Adhesión Molecule Facts Book I (1993)). De manera similar, las toxinas y los venenos, epítopes virales, las hormonas (por ejemplo, opiatos, esteroides, etc), receptores intracelulares (por ejemplo, los cuales median los efectos de varios ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona de tiroides, retinoides y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (ambas configuraciones poliméricas lineales y cíclicas), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar con varios receptores celulares. Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, sulfuros de poliarileno, polisiloxanos, poliimidas y poliacetatos pueden formar también una etiqueta apropiada o un aglutinante de etiqueta. Muchos otros pares de aglutinantes de etiqueta/etiqueta son también útiles en sistemas de ensayos descritos en la presente, como sería aparente para alguien con experiencia en la revisión de esta descripción. Los enlazadores comunes tales como péptidos, poliéteres y similares pueden servir como etiquetas, e incluyen secuencias de polipéptido, tales como secuencias poly gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Tales enlazadores flexibles se conocen por personas con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los enlazadores de poli(etilenglicol) están disponibles de Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces su If ?h id ri lo o enlaces heterofuncionales. Los aglutinantes marcados se fijan a sustratos sólidos utilizando cualquiera de una variedad de métodos actualmente disponibles. Los sustratos sólidos se derivan o funcionan comúnmente al exponer toda o una porción del sustrato a un reactivo químico el cual fija un grupo químico a la superficie la cual es reactiva con una porción del aglutinante marcado. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para la unión a una porción de cadena más larga incluirían grupos amina, hidroxilo, tiol y carboxilo. Los aminoalquilsilanos y los hidroxialquilsilanos pueden utilizarse para hacer funcionar una variedad de superficies, tales como superficies vitreas. La base esencial de tales disposiciones de biopolímero de fase sólida se describe bien en la literatura. Véase por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) (describiendo síntesis de fase sólida de por ejemplo, péptidos); Geysen ef al., J. Immun. Meth., 102:259-274 (1987) (describiendo la síntesis de los componentes o broches de fase sólida); Frank & Doring, Tetrahedron, 44:60316040 (1988) (describiendo síntesis de varias secuencias de péptido en discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry, 39(4):718-719 (1993); y Kozal ef al., Nature Medicine, 2(7):753759 (1996) (describiendo todas las disposiciones de biopolímeros fijos a sustratos sólidos). Los métodos no químicos para fijar aglutinantes de etiqueta incluyen otros métodos comunes, tales como calor, reticulación por radiación UV y similares. 3 Ensayos basados en células En una modalidad preferida del tratamiento, una combinación de las proteínas o polipéptidos de T1R se co-expresa temporal o establemente en una célula eucariótica ya sea en formas no modificadas o como receptores quiméricos, de variante o truncados con o preferiblemente sin una secuencia heteróloga, chaperona que facilita su maduración y se dirige hacia la trayectoria secretora. Tales polipéptidos T1R pueden expresarse en cualquier célula eucariótica tal como las células HEK293. De preferencia, las células comprenden una proteína G funcional, por ejemplo, Ga15 o la proteína G quimérica previamente identificada, u otra proteína G que es capaz de acoplar el receptor quimérico a una trayectoria de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa C. También, de preferencia una célula se producirá, la cual co-expresa establemente T1R1/T1R3 ó T1R2/T1R3 como células que se han encontrado (como se muestra en los ejemplos experimentales) que exhiben respuestas mejoradas para estímulo de sabor (con relación a las células que expresan temporalmente la misma combinación T1R). La activación de los receptores T1R en tales células puede detectarse utilizando cualquier método estándar, tal como detectando cambios en el calcio intracelular detectando la fluorescencia dependiente de Fluo-4 en la célula. Tal ensayo es la base de los hallazgos experimentales presentados en esta solicitud. Los receptores GPCR activados con frecuencia son sustratos para cinasas que fosforilan el extremo C-terminal del receptor (y posiblemente otros sitios también). De este modo, los activadores promoverán la transferencia de 32P a partir de ATP radioetiquetado al receptor, que puede evaluarse con un contador de centelleo. La fosforilación del extremo C-terminal promoverá la unión de proteínas similares a arrestina e interferirá con la unión de las proteínas G. Para una revisión general de la transducción de señal GPCR y métodos para evaluar la transducción de señal, véase por ejemplo, Methods in Enzymology, vols. 237 y 238 (1994) y volumen 96 (1983); Bourne, ef al., Nature 10:349:117-27 (1991); Bourne ef al., Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher ef al., Annu. Rev. Biochem., 67:653-92 (1998). La modulación T1R puede evaluarse comparando la respuesta de polipéptidos T1R tratados con un modulador T1R putativo a la respuesta de una muestra control no tratada o una muestra que contienen un control "positivo" conocido. Tales moduladores T1R putativos pueden incluir moléculas que inhiben o activan la actividad del polipéptido T1R. En una modalidad, las muestras control (no tratadas con activadores o inhibidores) se les asigna un valor de actividad T1R relativo de 100. La inhibición de un polipéptido T1R se logra cuando el valor de actividad T1R relativo al control es aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%. La activación de un polipéptido T1R se logra cuando el valor de actividad T1R relativo al control es 110%, opcionalmente 150%, 200-500% o 1000-2000%. Los cambios en el flujo de ion pueden evaluarse determinando cambios en la polarización iónica (es decir, el potencial eléctrico) de la célula o membrana que expresa un polipéptido T1R. Un medio para determinar cambios en la polarización celular es midiendo cambios en la corriente (por lo que se miden los cambios en la polarización) con técnicas de tensión de bloqueo y tensión de parche (véase por ejemplo, el modo de "célula unida", el modo "al revés" y el modo de "célula entera", por ejemplo, Ackerman ef al., New Engl. J Med., 336:1575-1595 (1997)). Las corrientes de célula entera se determinan convenientemente utilizando el estándar. Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujo de ion radioetiquetados y ensayos de fluorescencia utilizando tintes sensibles al voltaje (véase por ejemplo, Vestergarrd-Bogind ef al., J. Membrana Biol., 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269277 (1997); Daniel ef al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrana Biology, 137:59-70 (1994)). Los efectos de los compuestos de prueba en la función de los polipéptidos pueden medirse examinando cualquiera de los parámetros descritos anteriormente. Cualquier cambio fisiológico adecuado que afecta la actividad de GPCR puede utilizarse para evaluar la influencia de un compuesto de prueba en los polipéptidos de esta invención. Cuando las consecuencias funcionales se determinan utilizando células o animales intactos, se puede medir también una variedad de efectos tales como liberación de transmisor, liberación de hormonas, cambios transcripcionales tanto en marcadores genéticos conocidos como no caracterizados (por ejemplo, transferencias Northern), cambios en el metabolismo celular tal como crecimiento celular, o cambios en el pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como Ca2 + , IP3, cGMP o cAMP. Ensayos preferidos para los GPCR incluyen células que se cargan con tintes sensibles a ion o voltaje que reportan actividad receptora. Ensayos para determinar la actividad de tales receptores pueden utilizar agonistas y antagonistas conocidos para otros receptores acoplados con proteínas G como controles para evaluar la actividad de los compuestos probados. En los ensayos para identificar compuestos moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas), los cambios en el nivel iónico en el voltaje de citoplasma o de membrana se verificarán utilizando un indicador de fluorescencia de voltaje de membrana o sensible a ion, respectivamente. Entre los indicadores sensibles a ion y sondas de voltaje que pueden emplearse están aquellos descritos en the Molecular Probes 1997 Catalog. Para los receptores acoplados con proteínas G, las proteínas G promiscuas tales como Ga15 y Ga16 puede utilizarse en el ensayo de elección. (Wilkie ef al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 88:10049-10053 (1991)). La activación receptora inicia los episodios ¡ntracelulares subsecuentes, por ejemplo, se incrementa en los segundos mensajeros. La activación de algunos receptores acoplados con proteínas G estimulan la formación de trifosfato de inositol (IP3) a través de hidrólisis mediada por fosfolipasa de fosfatidilinositol (Berridge & Irving, Nature, 312:315-21 (1984)). IPE a su vez estimula la liberación de los acopios de iones de calcio intracelulares. De este modo, un cambio en los niveles de ion de calcio citoplásmico, o un cambio en los segundos niveles mensajeros como IP3 pueden utilizarse para evaluar la función receptora acoplada de la proteína G. Las células que expresan tales receptores acoplados de proteína G pueden exhibir niveles de calcio citoplásmico incrementado como un resultado de contribución a partir de ambas liberaciones de calcio a partir de acopios ¡ntracelulares y el calcio extracelular penetra a través de canales iónicos de membrana en plasma. En una modalidad preferida, la actividad del polipéptido T1R se mide para co-expresar estable o temporalmente genes T1R, de preferencia establemente, en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que enlaza el receptor a una trayectoria de transducción de señal de fosfolipasa C (véase Offermanns & Simón, J. Biol. Chem., 270: 15175-15180 (1995)). En una modalidad preferida, la línea celular es HEK-293 (que no expresa normalmente genes T1R) y la proteína G promiscua es Ga15 (Offermanns & Simón, supra). La modulación de la transducción de sabor se evalúa midiendo cambios en los niveles de Ca2+ ¡ntracelulares, que cambia en respuesta a la modulación de la trayectoria de transducción de señal T1R. Los niveles de Ca2+ se miden opcionalmente utilizando tintes indicadores de Ca2+ fluorescente y formación de imágenes fluorométricas. En otra modalidad, la hidrólisis de fosfatidil inositol (Pl) puede analizarse de acuerdo a la Patente Norteamericana 5,436,128, incorporada en la presente para referencia.
Brevemente, el ensayo implica el etiquetado de células con 3H-mioinositol durante 48 o más horas. Las células etiquetadas se tratan con un compuesto de prueba durante una hora. Las células tratadas se lisan y se extraen en cloroformo-metanol-agua después de lo cual se separan los fosfatos de inositol por cromatografía de intercambio iónico y se cuantifican por conteo por centelleo. La estimulación de pliegues se determina calculando la relación de cpm en la presencia del agonista, a cpm en la presencia del control de tampón. Así mismo, la inhibición de pliegues se determina calculando la relación de cpm en la presencia de un antagonista, a cpm en la presencia de un control de tampón (que puede o no puede contener un agonista). Otros ensayos receptores pueden implicar determinar el nivel de nucleótidos cíclicos intracelulares, por ejemplo, cAMP o cGMP. En casos en donde la activación del receptor resulta en una disminución en los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser preferible exponer las células a agentes que incrementan niveles de nucleótidos cíclicos ¡ntracelulares, por ejemplo, fosfocolina, antes de agregar un compuesto que activa el receptor a las células en el ensayo. En una modalidad, los cambios en cAMP o cGMP intracelular pueden medirse utilizando inmunoensayos. El método descrito en Offermanns & Simón, J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995), puede utilizarse para determinar el nivel de cAMP. También, el método descrito en Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159-164 (1994), puede utilizarse para determinar el nivel de cGMP. Además, un equipo de ensayo para medir cAMP y/o cGMP se describe en la Patente Norteamericana 4,115,538 incorpora en la presente para referencia. En otra modalidad, los niveles de transcripción pueden medirse para evaluar los efectos de un compuesto de prueba en la transducción de señal. Una célula huésped que contiene polipéptidos T1R de interés se pone en contacto con un compuesto de prueba durante un tiempo suficiente para efectuar cualesquiera interacciones, y luego el nivel de expresión genética se mide. La cantidad del tiempo para efectuar tales interacciones pueden determinarse empíricamente, tales como activando un curso de tiempo y midiendo el nivel de transcripción como una función de tiempo. La cantidad de transcripción puede medirse utilizando cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica que es adecuado. Por ejemplo, la expresión de ARNm de la proteína de interés puede detectarse utilizando transferencias Northern o sus productos polipeptídicos pueden identificarse utilizando inmunoensayos. Alternativamente, los ensayos basados en la transcripción que utilizan el gen reportero pueden utilizarse como se describe en la Patente Norteamericana 5,436,128, incorporada para referencia en la presente. Los genes reporteros pueden ser, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa, beta-galactosidasa, beta-lactamasa y alcalin fosfatasa. Además, la proteína de interés puede utilizarse como un reportero indirecto a través de la unión a un segundo reportero tal como una proteína fluorescente verde (véase por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997)). La cantidad de transcripción se compara entonces a la cantidad de transcripción ya sea en la célula misma en la ausencia del compuesto de prueba o puede compararse con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que carece del o de los polipéptidos T1R de interés. Una célula sustancialmente idéntica puede derivarse de las mismas célula a partir de las cuales se prepara la célula recombinante, pero la cual no ha sido modificada por la introducción del ADN heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de prueba ha alterado de alguna manera la actividad de los polipéptidos T1R de interés. 4 Animales Transgénicos no humanos que expresan receptores quimiosensoriales Animales no humanos que expresan una combinación de secuencias receptoras de sabor T1R de la invención pueden ser utilizados para ensayos receptores. Tal expresión puede utilizarse para determinar si un compuesto de prueba se une específicamente a un complejo receptor de transmembrana de sabor de mamífero in vivo poniendo en contacto un animal no humano estable o temporalmente transfectado con ácidos nucleicos que codifican receptores quimiosensoriales o regiones de unión de ligando de los mismos con un compuesto de prueba y determinando si el animal reacciona al compuesto de prueba uniéndose específicamente al complejo de polipéptido receptor. Los animales transfectados o infectados con vectores de la invención son particularmente útiles para ensayos para identificar y caracterizar estímulo de sabor que puede unirse a uno específico o a conjuntos de receptores. Tales animales infectados de vectores que expresan secuencias receptoras de sabor humano pueden utilizarse para seleccionar in vivo el estímulo de sabor y su efecto en, por ejemplo, la fisiología celular (por ejemplo, en neuronas de sabor), en el CNS, o el comportamiento. Alternativamente, las líneas celulares estables que expresan un T1R o una combinación del mismo, pueden utilizarse como donadores de transferencia nucleica para animales transgénicos clonados, producidos que expresan establemente un T1R particular o una combinación. Métodos para utilizar la transferencia nucleica para producir animales clonados que expresan un ADN heterólogo deseado son el sujeto de varias patentes Norteamericanas expedidas conferidas a la Universidad de Massachussets (autorizada por Advanced Cell Technology, Inc.) y Roslin Institute (autorizada por Geron Corp.). Los medios para infectar/expresar los ácidos nucleicos y vectores, ya sea individualmente o como bibliotecas, son bien conocidos en la técnica. Una variedad de células individuales, órganos o parámetros de animales completos puede medirse por una variedad de medios. Las secuencias T1R de la invención puede co-expresarse por ejemplo en tejidos de gusto de animales al suministrar con un agente infectante, por ejemplo, un vector de expresión de adenovirus. Los genes receptores de sabor endógeno pueden permanecer funcionales y la actividad de tipo silvestre (nativa) puede presentarse aún. En otras situaciones, cuando es deseable que toda ia actividad receptora de sabor sea por el receptor híbrido exógeno introducido, se prefiere el uso de una línea knockout. Los métodos para la base constitutiva de animales transgénicos no humanos, particularmente ratones transgénicos, y la selección y la preparación de construcciones recombinantes para generar células transformadas son bien conocidos en la técnica. Constitutivo de una célula y un animal "knockout" se basa en la premisa de que el nivel de expresión de un gen particular en una célula de mamífero puede disminuirse o invalidarse completamente introduciendo en el genoma una nueva secuencia de ADN que sirve para interrumpir alguna porción de la secuencia de ADN del gen que se suprime. También, la "inserción de trampa genética", puede utilizarse para interrumpir un gen huésped, y las células madre embriónicas de ratón (ES) pueden utilizarse para producir animales transgénicos knockout (véase por ejemplo, Holzchu, Transgenic Res 6:97-106 (1997)). La inserción del exógeno es típicamente por la recombinación homologa entre las secuencias de ácido nucleico complementarias. La secuencia exógena es alguna porción del gen objetivo que se modifica, tal como secuencias reguladoras exónicas, intrónicas o transcripcionales reguladoras, o cualquier secuencia genómica que es capaz de afectar el nivel de la expresión del gen objetivo; o una combinación del mismo. El objetivo genético a través de la recombinación homologa en las células madre embriónicas pluripotenciales le permite a uno modificar precisamente la secuencia genómica de interés. Cualquier técnica puede utilizarse para crear, tamizar para propagar un animal knockout, por ejemplo, véase Bijvoet, Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Moreadith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1996); Tojo, Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321-328 (1997); Patentes Norteamericanas Nos. 5,616,491; 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059; 5,272,071; WO 91/09955; WO93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650. Los ácidos nucleicos de la invención pueden también utilizarse como reactivos para producir células humanas "knockout" y su progenie. Así mismo, los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse como reactivos para producir "knock-ins" en ratones. Las secuencias genéticas T1R de ser humano o de rata pueden reemplazar el T1R ortólogo en el genoma de ratón. De esta manera, se produce un ratón que expresa un T1R humano o de rata. Este ratón puede entonces utilizarse para analizar la función de los T1R de ser humano o de rata y para identificar ligandos para tales T1R. a. Moduladores Los compuestos probados como moduladores de un miembro de la familia T1R pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entidad biológica, tal como una proteína, un ácido nucleico o un lípido. Ejemplos de los mismos incluyen 51 IMP y 51 GMP. Esencialmente cualquier compuesto químico puede utilizarse como un modulador potencial o un ligando en los ensayos de la invención, aunque la mayoría de los compuestos que son solubles en soluciones acuosas se prueban. Los ensayos pueden diseñarse para tamizar bibliotecas químicas grandes automatizando las etapas de ensayo y proporcionando compuestos a partir de cualquier fuente conveniente; estos ensayos se activan normalmente en paralelo (por ejemplo, en formatos microtituladores o en placas microtituladoras en ensayos robóticos). Se apreciará que las bibliotecas químicas pueden sintetizarse por una de tantas reacciones químicas (por ejemplo, Senomyx proprietary chemistries). Adicionalmente, existen muchos proveedores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analitika (Buchs, Switzerland) y similares. En una modalidad preferida, los métodos de tamización de rendimiento elevado implican proporcionar una biblioteca de químicos o péptidos combinatoriales que contiene un gran número de compuestos que afectan el sabor potencial (compuestos de modulador o ligando potenciales). Tales "bibliotecas químicas combinatoriales" o "bibliotecas de ligandos" se tamizan entonces en uno o más ensayos, como se describe en la presente, para identificar aquellos miembros de las bibliotecas (especies o subclases químicas particulares) que despliegan una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos líderes" convencionales o pueden por sí mismos utilizarse como moduladores de sabor potencial o actual. De preferencia, tales bibliotecas se tamizarán contra células o líneas celulares que expresan establemente un T1R o una combinación de los T1R, es decir, T1R1/T1R3 o T1R2/T1R3 y de preferencia una proteína G adecuada, por ejemplo, Ga15. Como se muestra en los ejemplos infra, tales líneas celulares estables exhiben respuestas muy pronunciadas para estímulo de sabor, por ejemplo, estímulo de sabor acre o dulce. Sin embargo, las células y las líneas celulares que expresan temporalmente uno o más T1R pueden utilizarse también en tales ensayos. Una biblioteca química combinatorial es una colección de diversos compuestos químicos generados ya sea por síntesis química o por síntesis biológica, combinando un número de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatorial lineal tal como una biblioteca polipeptídica se forma combinando un conjunto de bloques de construcción químicos (aminoácidos) en cada forma posible para una longitud del compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Miles a millones de compuestos químicos pueden sintetizarse a través de tal mezclado combinatoria! de bloques de consírucción químicos. La preparación y ?a tamización de bibliotecas químicas combinatoriales es bien conocida por aquellos con experiencia en la técnica. Tales bibliotecas químicas combinatoriales incluyen, pero no se limitan a bibliotecas peptídicas (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,010,175, Furia, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991) y Houghton ef al., Nature, 354:84-88 (1991)). Otras químicas para generar bibliotecas químicamente diversas pueden utilizarse también. Tales químicas incluyen, pero no se limitan a: peptoides (por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, la Publicación PCT WO 93/20242), bi-oligómeros aleatorios (por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 92/00091); benzodiacepinas (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,288,514), diversómeros tales como hidan'toipas, berizodiacepinas y dipéptidós (Hobbs et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 90:6909-6913)), polipéptido vínílogos (Hagihara ef al., J. Arnera Chem. Soc, 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptidales con 'andamiaje de glucosa (Hirschmann ef al., J. Amer. Chem. Soc, 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánica análoga de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen ef al., J. Amer. Chem. Soc, 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho ef al., Science, 261:1303 (1993)), peptidil fosfonatos (Campbell ef al., J. Org. Chem., 59:658 (1994), bibliotecas de ácido nucleico (Ausubel, Berger and Sambrook, todos supra), bibliotecas de ácido péptido nucleico (Patente Norteamericana 5,539,083), bibliotecas de anticuerpos (Vaughn ef al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (Liang ef al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la Patente Norteamericana 5,593,853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (benzodiacepinas, Baum, C&EN, enero 18, página 33 (1993); tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente Norteamericana 5,549,974; pinrolidinas, Patentes Norteamericanas 5,525,735 y 5,519,134; compuestos morfolino, Patente Norteamericana 5,506,337; benzodiacepinas 5,288,514, y similares). Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatoriales están comercialmente disponibles (véase por ejemplo, 367 MPS, (Advanced Chem Tech, Louisville KY), Symphony (Rainin, Woburn, MA), 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA), 9050 Plus (Millipore, Bedford, MA)). Además, numerosas bibliotecas combinatoriales son por sí mismas comercialmente disponibles (véase por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Tripos, Inc., St. Louis, MO; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences; Columbia, MD; etc.). En un aspecto de la invención, los moduladores T1R pueden utilizarse en cualquier producto alimenticio, confiterías, composición farmacéutica, o ingrediente del mismo por lo que se modula el sabor del producto, la composición o el ingrediente en una manera deseada. Por ejemplo, los moduladores T1R que mejoran la sensación de sabor dulce pueden agregarse para endulzar un producto o una composición; los moduladores T1R que mejoran la sensación de sabor acre pueden agregarse a alimentos para incrementar sabores sabrosos. Alternativamente, los antagonistas T1R pueden utilizarse para bloquear el sabor dulce y/o acre. b. Equipos Los genes T1R y sus homólogos son herramientas útiles para identificar células receptoras quimiosensoriales, para determinaciones de forenses y de paternidad, y para examinar transducción de sabor. Los reactivos específicos del miembro de la familia T1R que hibridizan específicamente a ácidos nucleicos T1R, tales como sondas y cebadores T1R, y reactivos específicos T1R que se unen específicamente a un polipéptido T1R, por ejemplo, anticuerpos T1R se utilizan para examinar la expresión celular de sabor y la regulación de transducción de sabor. Los ensayos de ácido nucleico para la presencia del ADN y del ARN para un miembro de la familia T1R en una muestra incluyen numerosas técnicas se conocen por aquellos expertos en la técnica, tales como análisis southern, análisis northern, transferencias de punto, protección de ARNasa, análisis S1, técnicas de amplificación tales como PCR, e hibridización in situ.
En la hibridización in situ por ejemplo, el ácido nucleico objetivo se libera a partir de sus rodeos celulares de manera que están disponibles para la hibridización dentro de la célula mientras se conserva la morfología celular para la interpretación subsecuente y el análisis. Los siguientes artículos proporcionan una vista general de la técnica en hibridización in situ: Singer ef al., Biotechniques, 4:230250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, vol. Vil, pp. 189-226 (1984); y Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Ñames et al., eds. 1987). Además, un polipéptido T1R puede detectarse con varías técnicas de inmunoensayo descritos anteriormente. La muestra de prueba se compara típicamente tanto a control positivo (por ejemplo, una muestra que expresa un polipéptido T1R recombinante) como un control negativo. La presente invención proporciona también equipos para seleccionar moduladores de miembros de la familia T1R. Tales equipos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles y reactivos. Por ejemplo, tales equipos pueden comprender cualquiera o más de los siguientes materiales: ácidos nucleicos o proteínas de T1R, tubos de reacción, e instrucciones para probar la actividad T1R. Opcionalmente, el equipo contiene un receptor T1R biológicamente activo o una línea celular que expresa estable o temporalmente un receptor de sabor que contiene T1R biológicamente activo. Una amplia variedad de equipos y componentes pueden prepararse de acuerdo a la presente invención, dependiendo del usuario pretendido del equipo y las necesidades particulares del usuario.
EJEMPLOS Aunque la invención se ha descrito en detalle supra, los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar modalidades preferidas. Estos ejemplos se pretende que sean ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención. En las secuencias de proteínas presentadas en la presente, el código X o Xaa de una letra se refieren a cualquiera de los 20 residuos aminoácidos comunes. En las secuencias de ADN presentadas en la presente, los códigos N ó n de una letra se refieren a cualquiera de las cuatro bases A, T, C o G de neucleótidos comunes.
Ejemplo 1 Producción de Construcciones de expresión HT1R sin Intrón Se clonaron las construcciones de expresión HT1R sin Intrón por una combinación de métodos basados en ADN genómico y basados en ADNc. Para generar la construcción de expresión hT1R1 de longitud total, dos exones de codificación 5' identificados en un intervalo hT1R1 clonado (acceso # AL159177) se combinaron por traslape de PCR, y luego se unieron a un clon de ADNc de testículos truncados 50 La construcción de expresión hT1R2 se generó a partir de un intervalo genómico hT1R2 parcialmente secuenciado. Dos exones hT1R2 5' ausentes se identificaron seleccionando bibliotecas de escopeta del intervalo genómico clonado utilizando sondas derivadas a partir de la secuencia de codificación de rata correspondiente. Los exones de codificación se combinaron entonces por el traslape PCR para producir la construcción de expresión de longitud total. La construcción de expresión hT1R3 se generó por traslape de PCR a partir de un intervalo genómico hT1R3 secuenciado (acceso # AL139287). Se aisló el T1R3 de rata a partir de una biblioteca de ADNc derivada de tejido de sabor de rata utilizando un fragmento exón rT1R3 generado por PCR degenerado con base en hT1R3. El hT1R1 parcial, el ADNc, el rT1R2 ADNc, y las secuencias genómicas hT1R2 se obtuvieron a partir del Dr. Charles Zuker (University of California, San Diego). Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácido para las secuencias clonadas T1R identificadas anteriormente así como otras secuencias T1R parciales y de longitud total se establecen en la lista de secuencias. También, las siguientes traducciones conceptuales, que corresponden al término C de dos pares ortólogos de TIRs de pescado, se derivan a partir de fragmentos de secuencia genómica no publicada y se proporcionan. El TR1A del pez soplador se derivó del 'andamio 164' de acceso; T1RB del pez soplador se derivó del acceso LPC61711; T1RA del tetradon se derivó a partir del acceso AL226735; T1RB del tetradon se derivó a partir del acceso AL222381. Las ambigüedades en las traducciones conceptuales ('X') resultan a partir de ambigüedades en secuencias de bases de datos. Estas secuencias pueden encontrarse en la lista de secuencia. Adicionalmente, el número de acceso y las citas de referencia se relacionan a los T1R de ratón y de rata son variantes alélicas del mismo en el dominio público se establecen posteriormente: rT1R1 (Acceso # AAD18069) (Hoon et al., Cell 96 (4): 541-51 (1999)); rT1R2 (Acceso # AAD18070) (Hoon et ai., Cell 96(4): 541-59 (1999)); mT1 R1 (Acceso # AAK39437); mT1R2 (Acceso # AAK 39438); tnT1R3 (Acceso # AAK 55357) (Max et al., Nati Genet. 28(1): 58-63 (2001)); rT1R1 (Acceso # AAK7092) (Li et al., Mamm. Genome (12(1): 13-16 (2001)); mT1R1 (Acceso # NP 114073); mT1R1 (Acceso # AAK07091) (Li et al., Mamm. Genome (121 ): 13-16 (2001)); rT1R2 (Acceso # AAD18070) (Hoon et al., Cell 9664): 541-551 (1999)); mT1R2 (Acceso # NP114079); mT1R3 (Acceso # AAK39436); mT1R3 (Acceso # BAB47181); (Kitagawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 283(1 ):236-42 (2001)); mT1R3 (Acceso #NP114078); mT1R3 (Acceso # AAK55536) (Max et al., Nat. GEnet. 28(1):58-63 (2001)); y mT1R3 (Acceso No. AAK01937).
Ejemplo 2 Alineación de Secuencia de los T1R de Ser Humano y de Rata Las secuencias de T1R clonadas seleccionadas a partir de aquellas identificadas anteriormente se alinearon contra los T1R de rata correspondiente. Como se muestra en la Figura 1, el T1R1 humano, el T1R2 humano y el T1R3 humano y el T1R3 de rata se alinearon con los T1R previamente descritos (rT1R1 que tiene el Acceso # AAD18069 y rT1RT2 que tiene el Acceso # AAD18070), el receptor de glutamato metabótripo mGluRl de rata (Acceso # P23385); y el receptor sensible al calcio humano (Acceso # P41180). Para claridad de la comparación, el término C receptor sensible a calcio y mGluRl se truncan. Los siete segmentos de transmembrana potenciales se mantuvieron en azul. Los residuos que ponen en contacto el carbutilato de cadena lateral de glutamato en la estructura de cristal mGluRl se mantienen en rojo, y los residuos que ponen en contacto la porción de a-aminoácido de glutamato se mantienen en verde. Los residuos de cisterna del receptor de sensación de mGluRl y de calcio implicados en la formación basada en disulfuro de intersubunidad se rodean en púrpura. Estas cisternas no se conservan en T1R1 y T1R2, pero se ubican en una región degrada del alineamiento que contiene un residuo de cisteína T1R3 potencialmente análoga, también se hace circular.
Ejemplo 3 Demostración por RT-PCR ya que hT1R2 y hT1R3 se expresan en el tejido del gusto Como se muestra en la Figura 2, hT1R2 y hT1R3 se expresan en tejido de gusto: expresión de ambos genes puede detectarse por RT-PCR a partir de la papila circunvalar humana removida.
Ejemplo 4 Métodos para Expresión Heteróloga de los T1R en Células Heterólogas Un derivado HEK-293 (Chandrashekar et al., Cell 100(6): 703-11 (2000)), que se expresa establemente Ga15, se hizo crecer y mantener a 37°C en Medio Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado con 10% de FBS, aminoácido no esenciales MEM (Gibco BRL), y 3 µg/ml de blasticidina. Para experimentos de formación de imágenes de calcio, las células se sembraron primero sobre placas de cultivo de tejido de 24 pozos (aproximadamente 0.1 millones de células por pozo), y se transfectaron por lipofección con Mirus Translt-293 (Pan Vera). Para minimizar la desensibilización inducida por glutamato e inducida por glucosa, se reemplazó DMEM suplementado con DMEM/]GlutaMAX bajo en glucosa (Gibco BRL) aproximadamente 24 horas después de la transfección. 24 horas después, las células se cargaron con tinte de calcio Fluo-4 (Molecular Probes), 3 µM en tampón de PBS de Dulbecco (DPBS, GibcoBRL), durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 250 µl de DPBS, la estimulación se realizó a temperatura ambiente por la adición de 200 µl de DPBS suplementado con estímulo de sabor. La movilización de calcio se verificó en un microscopio Axiovert S100 TV (Zeiss) utilizando software Imaging Workbench 4.0 (Axon). Las respuestas de T1R1/T1R3 y T1R2/T1R3 fueron sorprendentemente transitorias -los incrementos de calcio raramente persistieron más de 15 segundos - y fueron asincronos. El número de células de respuesta fue de este modo relativamente constante con el tiempo; por lo tanto, las repuestas celulares se cuantificaron contando manualmente el número de células de respuesta en un punto de tiempo fijo, normalmente 30 segundos después de la adición del estímulo.
Ejemplo 5 T1R2/T1R3 Humano funciona como un receptor de sabor dulce Las células HEK que expresan establemente Ga15 se transfectaron temporalmente con T1R2, T1R3 y T1R2/T1R3 humano y se evaluaron para incrementos en calcio intracelular en respuesta a concentraciones incrementadas de sacarosa (Figura 3(a)). También, las respuestas de dosis T1R2/T1R3 se determinaron por varios estímulos de sabor dulce (Figura 3(b)). El porcentaje máximo de células de respuesta fue diferente para diferentes edulcorantes, variando de 10-30%. Para claridad, las respuestas de dosis se normalizaron al porcentaje máximo de células de respuesta. Los valores en la Figura 3 representan el promedio ± s.e. de cuatro respuestas independientes. Los círculos de eje-X marcan los umbrales de detección sicofísicas determinados por prueba de sabor. La gurmarina (dilución de 50 veces de un extracto acuoso filtrado de 10 g/l Gymnema silvestre) inhibió la repuesta de T1R2/T1R3 a 250 mM de sacarosa, pero no la repuesta del receptor ß2-adrenérgico endógeno a 20 µM isoproterenol (Figura 3(b)). LA Figura 3(c) contiene la repuesta normalizada de T1R2/T1R3 co-expresa líneas celulares a diferentes edulcorantes (sacarosa, aspartame, D-triptofano y sacarina).
Ejemplo 6 T1R2/T1R3 de rata funciona como un receptor de sabor dulce Las células HEK que expresan establemente Ga15 se transfectaron temporalmente con hT1R2/hT1R3, rT1R2/rT1R3, hT1R2/rT1R3, y rT1R3/hT1R3. Estas células transfectadas se evaluaron entonces para calcio intracelular incrementada en respuesta a 350 mM de sacarosa, 25 mM de triptofano, 15 mM de aspartame, y 0.05% de monelina. Los resultados con sacarosa y aspartame están contenidos en la Figura 4 e indican que rT1R2/rT1R3 también funciona con un receptor de sabor dulce. También, estos resultados sugieren que T1R2 pueden controlar la especificidad de ligando T1R2/T1R3.
Ejemplo 7 Respuestas de T1R2/T1R3 que utilizan un ensayo basado en fluorescencia automatizada Las células HEK que expresan establemente Ga15 se transfectaron temporalmente con hT1R2 y hT1R3. Estas células se cargaron con el tinte de calcio Fluo-4, y sus respuestas a un edulcorante se midieron utilizando un lector de placa de fluorescencia. La Figura 5 contiene respuestas de ciclamato (12.5 mM) para células que expresan hT1R2/hT1R3 y para células que expresan solamente hT1R3 (J19-22). Los resultados de fluorescencia obtenidos indican que las respuestas a este estímulo de prueba sólo ocurren en las células que expresan hT1R2/hT1R3. La Figura 6 contiene curvas de respuesta de dosis normalizadas, los resultados los cuales muestran que hT1R2 y hT1R3 funcionan juntos como un receptor de sabor humano basado en su interacción específica de dosis con varios estímulos dulces. Particularmente, la Figura 6 contiene respuestas de dosis para sacarosa, triptofano y varios otros edulcorantes comercialmente disponibles. Estos resultados indican que T1R2/T1R3 es un receptor de sabor dulce humano como un rango ordinario y los valores de umbral obtenidos en los valores de ensayo estrechamente reflejados para sabor dulce humano.
Ejemplo 8 Residuos de unión de ligando de mGluRl se conservan en T1R1 Como se muestra en la Figura 6, los residuos de unión de ligando claves de mGluRl se conservan en T1R1. La interacción de glutamato con mGluRl se muestra con varios residuos clave acentuados de acuerdo al mismo esquema de color como en la Figura 1.
Ejemplo 9 T1R1/T1R3 humano funciona como receptores de sabor acre Las células HEK que expresan establemente Ga15 se transfectaron temporalmente con T1R1, T1R3 y T1R1/T1R3 humano y se evaluaron para incrementos en el calcio intracelular en respuesta a concentraciones incrementadas de glutamato (Figura 8(a)), y 0.5 mM de glutamato), 0.2 mM de IMP, y 0.5 mM de glutamato más 0.2 mM de IMP (Figura 8(b)). Las repuestas de dosis T1R1/T1R3 humana se determinaron para glutamato en la presencia y la ausencia de 0.2 mM de IMP (Figura 8(c)). Los porcentajes máximos de células de respuesta fue aproximadamente 5% para glutamato y aproximadamente 10% para glutamato más IMP. Para claridad, las respuestas de dosis se normalizan al porcentaje máximo de células de respuesta. Los valores representan el promedio ± s.e. de cuatro respuestas independientes. Los círculos del eje X marcan los umbrales de detección de sabor determinados por la prueba de sabor.
Ejemplo 10 PDZIP como una Secuencia de Exportación La secuencia PDZIP de seis residuos (SVSTW (SEC de ID NO: 1) se fusionó al término C de hT1R2 y el receptor quimérico (es decir, hT1R2-PDZIP) se transfectó en una célula huésped HEK-293. La expresión superficial de hT1R2 se monitoreó entonces utilizando inmunofluorescencia y datos de exploración FACS. Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, la inclusión de la secuencia PDZIP incrementa la expresión superficial de hT1R2-PDZIP con relación a hT1R2. Más específicamente, la Figura 9A muestra una tinción inmunofluorescencia de hT1R2 etiquetada con myc demostrando que PDZIP incrementa significativamente la cantidad de la proteína hT1R2 en la membrana de plasma. La Figura 9B muestra los datos de análisis FACS que demuestran el mismo resultado - Las células que expresan hT1R2 etiquetadas con myc se indican por las líneas punteadas y las células que expresan hT1R2-PDZIP etiquetadas con myc se indican por la línea sólida. Particularmente, la Figura 10A muestra células huéspedes estables Ga15 no transfectadas en un tampón de HB, la Figura 10B muestra células huéspedes Ga15 estables transfectadas hT1R2-PDZIP en un grupo de edulcorantes No. 5 (sacarina, ciclamato de sodio, Acesulfame K y Aspartame-20 mM cada uno en tampón de HBS), la Figura 10C muestra células huésped estables Ga15 transfectadas con hT1R3-PDZIP en un grupo de edulcorantes No. 5, y la Figura 10D muestra células huéspedes estables Ga15 co-transfectadas con hT1R2-PDZIP/hT1R3 en un grupo de edulcorantes No. 5. Además, las Figuras 10E-10H muestran respuesta dependiente de dosis en células huéspedes estables Ga15 co-transfectadas con hT1R2/hT1R3 a sacarosa-E: o mM en tampón de HBS; F: 30 mM; G: 60 mM; y H: 250 mM. Las Figuras 10I-10L muestran las respuestas de células huéspedes estables Ga15 co-transfectadas hT1R2/hT1R3 a edulcorantes individuales - I: Aspartame (1.5 mM); J: Acesulfame K (1 mM); K: Neotame (20 mM); L: ciclamato de sodio (20 mM). Como se demuestra por imágenes de calcio de la Figura 10, hT1R2 y hT1R3 se requieren ambos para las actividades accionadas por el estímulo dulce.
Ejemplo 11 Generación de Líneas Celulares que Co-Expresan Establemente T1R1/T1R3 ó T1R2/T1R3 Las líneas celulares humanas que co-expresan establemente T1R1/T1R3 humano o T1R2/T1R3 humano se generaron transfectando vectores derivados de PEAK-10 linearizados (Edge Biosystems) y vectores derivados de pCDNA 3.1/ZEO (invitrogen) respectivamente conteniendo la construcción de expresión hT1R1 ó hT1R2 (plásmido SAV2485 para T1R1, SAV2486 para T1R2) y hT1R3 (plásmido SXV550 para T1R3) en una línea celular que expresa Ga?5. Específicamente, las líneas celulares estables T1R2/T1R3 se produjeron co-transfectando SAV2486 y SXV550 linealizadas en la línea celular HEK-293 de Aurora Bioscience que expresan establemente Ga 5. Las líneas celulares estables T1R1/T1R3 se produjeron co-transfectando SAV2485 y SXV550 linealizadas en la misma línea celular HEK-293 que expresa establemente Ga?5. Después de las transfecciones SAV2485/SXV550 y SAV2486/SXV550, se seleccionaron las colonias resistentes a zeocina y resistentes a puromicina, se expandieron y se probaron por formación de imágenes de calcio para respuestas a estímulo de sabor dulce o acre. Las células se seleccionaron en 0.005 mg/ml de puromicina (CALBIOCHEM) y 0.1 mg/ml de zeocina (Invitrogen) a 37°C en DMEM de glucosa baja suplementado con GlutaMAX, 10% de FBS dializado, y 0.03 mg/ml de blasticidina. Las colonias residuales se expandieron, y sus respuestas a estímulo de sabor dulce evaluadas por microscopio de Fluorescencia. Para formación de imágenes fluorimétricas automatizadas en instrumentación VI P R-l I (Aurora Biosciences), las células estables T1R2/T1R3 se sembraron primero en placas de 96 pozos (aproximadamente 100,000 células por pozo). Veinticuatro horas después, las células se cargaron con el tinte de calcio fluo-3-AM (Molecular Probes), 0.005 mM en PBs, durante una hora a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 70 µl de PBS, el estímulo se realizó a temperatura ambiente por la adición de 70 µl de PBS suplementado con estímulo de sabor. Las respuestas de fluorescencia (480 nm de excitación y 535 nm de emisión) a partir de 20 a 30 segundos después de la fluorescencia se midieron antes de la adición del compuesto, y se normalizaron a la respuesta a 0.001 mM de ionomicina (CALBIOCHEM), un ionóforo de calcio.
Se observó entonces que cuando estas líneas celulares se expusieron al estímulo dulce o acre, que para clones activos normalmente 80-100% de células responden a estímulo de sabor. Inesperadamente, la magnitud de respuestas de células individuales fue marcadamente más grande que aquella de las células temporalmente transfectadas. Con base en esta observación, los inventores probaron la actividad de las líneas celulares estables T1R por formación de imágenes de fluorescencia automatizada utilizando instrumentación VIPR de Aurora Bioscience como se describe anteriormente. Las respuestas de dos T1R1/T1R3 y una línea celular T1R2/T1R3 se muestran en la Figura 11 y la Figura 12 respectivamente. De manera remarcable, la combinación de números incrementados de células de respuesta y magnitudes de respuesta incrementada resulta en un incremento mayor de 10 veces en la actividad relativa a células temporalmente transfectadas. (A manera de comparación, la respuesta de porcentaje de ionomicina para células temporalmente transfectadas con T1R2/T1R3 fue aproximadamente 5% bajo condiciones óptimas). Además, las respuestas de dosis obtenidas para T1R2/T1R3 y T1R1/T1R3 humanas establemente expresadas correlacionadas con umbrales de detección de sabor humano. La actividad de T1R contundente de estas línea celulares estables sugieren que no están bien adaptadas para uso en la tamización de rendimiento elevado de bibliotecas químicas para identificar compuestos, por ejemplo, moléculas pequeñas, que modulan el receptor de sabor dulce o acre y que por lo tanto modulan, mejoran, bloquean o imitan el sabor dulce o acre.
Ejemplo 12 Generación de líneas celulares que co-expresan indeciblemente T1R1/T1R3 que responden selectivamente a estímulo de sabor acre Las 293 líneas celulares HEK de T1R1/T1R3 que expresan establemente el receptor de sabor acre despliegan actividad mejorada enorme con relación a las citas temporalmente transfectadas. Sin embargo, una desventaja es que pueden perder rápidamente la actividad durante la propagación celular. También, estos hallazgos muestran que (i) T1R1/T1R3 es un receptor de sabor acre, es decir, e (ii) que las líneas celulares que expresan enormemente T1R1/T1R3, de preferencia líneas celulares T1R1/T1R3 preferiblemente estables y/o inducibles pueden utilizarse en ensayos, de preferencia para tamización de rendimiento elevado de biblioteca químicas para identificar moduladores novedosos de sabor acre. Los moduladores que mejoran el sabor acre pueden utilizarse. Para superar la inestabilidad de las líneas celulares estables T1R1/T1R3, las células HEK-Ga15 se han diseñado para expresar induciblemente T1R1/T1R3 utilizando el sistema GeneSwitch (Invitrogen). Los vectores de expresión resistentes a zeocina derivados de p-Gene para T1R1 y T1R3 humano (plásmido SXV603 para T1R1 y SXV611 para T1R3) y un vector derivado de pSwitch resistente a puromicina que transporta la proteína GeneSwtich (plásmido SXV628) se linealizaron y co-transfectaron en la línea celular HEK-Ga?s. Se seleccionaron colonias resistentes a zeocina y resistentes a puromicina, se expandieron, se indujeron con cantidades variables de mifepristona, y se probaron por formación de imágenes de calcio para respuestas al estímulo de sabor acre. La expresión inducible T1R1/T1R3 resultó en actividad enorme. Por ejemplo, aproximadamente 80% de células inducidas pero sólo aproximadamente 10% de células temporalmente transfectadas responden a L-glutamato. Más específicamente, los vectores de expresión resistentes a Zeocina derivadas de pGEne que expresan T1R1 humano y T1R3 humano y un vector derivado de pSwitch resistente a puromicina que transporta la proteína GeneSwitch se linealizaron y co-transfectaron en células Ga?s. Las células se seleccionaron en 0.5 µg/ml de puromicina (CALBIOCHEM) y 100 µg/ml de Zeocina (Invitrogen) a 37°C en Medio Eagle Modificado con Dulbecco suplementado con GlutaMAX, (10% de FBS dializado, y 3 µg/ml de blasticidina. Las colonias resistentes se expandieron, y sus respuestas a estimulo de sabor acre siguiendo la inducción con 10"10 de mifepristona determinada por microscopía de fluorescencia después de los métodos de Li et al., PNAS 99(7): 4692-4696 (2002). Para formación de imágenes fluorométricas automatizadas en instrumentación FLIPR (Molecular Device), las células a partir de un clon (el clon 1-17 designado) se sembraron en placas de 96 pozos (aproximadamente 80,000 células por pozo) en la presencia de 10"10 M de mifepristone e incubaron durante 48 horas. Las células se cargaron entonces con el tinte de calcio fluo-4-AM (Molecular Probes), 3 µM en PBS, durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 50 µl de PBS, el estímulo se realizó a temperatura ambiente por la adición de 50 µl de PBS suplementado con diferente estímulo. En contraste a los sistemas de expresión de receptor acre T1R1/T1R3 transitorio previo que necesitó cuantificar la actividad del receptor T1R1/T1R3 al contar individualmente las células de respuesta (Li et al., PNAS 99(7): 4692-4696 (2002)) (debido a la baja actividad del receptor en la presente), el sistema de expresión inducible objeto resultó en un clon 1-17 que tiene actividad sustancialmente incrementada que permite la actividad receptora para cuantificarse determinando incrementos de fluorescencia máximos (480 nm de excitación y 535 nm de emisión) resumidos sobre campos de células de imagen. La fluorescencia máxima a partir de cuatro determinaciones independientes se promedió, se corrigió para la fluorescencia de fondo medida antes de la adición del compuesto, y normalizada a la respuesta a 0.002 mM de ¡onomicina (CALBIOCHEM). Estos resultados están contenidos en la Figura 13. Particularmente, la Figura 13 contiene una curva de respuesta de dosis determinada para L-glutamato en la presencia y ausencia de 0.2 mM de IMP. En la figura, cada valor representa la fluorescencia máxima sumada promedio (corregida para florescencia de fondo) para cuatro determinaciones independientes. Estas curvas de respuesta de dosis corresponden a aquellas determinadas para células transfectadas temporalmente con T1R1/T1R3. La selectividad del receptor de sabor T1R1/T1R3 acre se evaluó también seleccionando con diferentes L-aminoácidos. Los resultados obtenidos indican que T1R1/T1R3 se activan selectivamente por los L-aminoácidos de sabor acre (L-glutamato y L-aspartato). Los resultados de experimentos en donde la respuesta del clon 1-17 resultó al probarse en la presencia de diferentes L-aminoácidos que están contenidos en la Figura 14 y la Figura 15. La Figura 14 muestra los resultados de un experimento en donde la línea celular 1-17 se puso en contacto con diferentes L-aminoácidos en una concentración de 10 mM en la presencia y ausencia de 1 mM de IMP. La Figura 15 contiene una curva de respuesta de dosis para aminoácidos activos determinados en la presencia de 0.2 mM de IMP. Cada valor representa el promedio de cuatro determinaciones independientes. Los resultados obtenidos en estos experimentos soportan la especificidad y selectividad del receptor de sabor acre al estímulo de sabor acre. Mientras que el L-glutamato y el L-aspartato y el estímulo de sabor acre activan significativamente el receptor T1R1/T1R3 en diferentes concentraciones (véanse las Figuras 14 y 15), los otros L-aminoácidos que activan el receptor T1R1/T1R3 humano sólo activan el receptor débilmente y a concentraciones mucho más elevadas. Por lo tanto, estos resultados soportan la selectividad del receptor T1R1/T1R3 para estímulo de sabor acre y la adecuabilidad de este sistema de expresión estable inducible para uso en ensayos de tamización de rendimiento elevado utilizando instrumentación de formación de imágenes fluorométrica automatizada para identificar compuestos que activan el receptor de sabor acre, por ejemplo L-glutamato o L-aspartato, o que mejoran la actividad de L-glutamato para activar el receptor de sabor acre, por ejemplo, 5'-IMP o 5'-GMP, o bloquear la activación del receptor de sabor acre por estímulo de sabor acre como L-glutamato y L-aspartato. Los compuestos identificados utilizando estos ensayos tienen aplicación potencial como saborizantes en composiciones de alimentos y bebidas para imitar o bloquear el estímulo de sabor acre.
Ejemplo 13 El Lactisol inhibe las Actividades Receptoras de T1R2/T1R3 y T1R1/T1R3, y Sabor Acre y Dulce El Lactisol, un ácido aralquilcarboxílico, se piensa es un inhibidor de sabor dulce selectivo (véase por ejemplo, Lindley (1986) Patente Norteamericana 4,567,053; y Schiffman et al. Chem Senses 24:439-447 (1999)). Las respuestas de células HEK-Ga?5 transfectan temporalmente con T1R2/T1R3 a 150 mM de sacarosa en la presencia de concentraciones variables de lactisol se midieron. El lactisol inhibe la actividad de T1R2/T1R3 humano con un IC50 de 24 µM. El receptor de sabor acre T1R1/T1R3 y dulce T1R2/T1R3 puede compartir una subunidad común. Por lo tanto se ha teorizado que el lactisol, el cual inhibe el receptor de sabor dulce T1R2/T1R3, puede tener un efecto similar en el receptor de sabor acre T1R1/T1R3. Los presentes inventores probaron el efecto de lactisol en la respuesta de T1R1/T1R3 humano a 10 mM de L-glutamato. Como con el receptor dulce T1R2/T1R3, el lactisol inhibe T1R1/T1R3 con un IC50 de 165 µM. La inhibición de lactisol refleja probablemente el antagonismo en los receptores T1R en lugar de por ejemplo, la inhibición no específica de señalización mediada por Ga15 debido a la respuesta de receptores de acetilcolina muscarínica no se inhibió por lactisol. Los presentes inventores evaluaron entonces el efecto de lactisol en sabor acre humano. Los umbrales de sabor en la presencia de 1 y 2 mM de lactisol se determinaron por el L-glutamato de estímulo de sabor acre con o sin 0.2 mM de IMP, sacarosa de estímulo de sabor dulce y D-triptofano, y el cloruro de sodio de estímulo de sabor salado siguiendo los métodos de Schiffman et al. (Chem. Senses 24: 439-447 (1989)). Las concentraciones milimolares de lactisol incrementan dramáticamente los umbrales de detección para estímulo dulce y acre, peo no para sabor salado. Estos resultados están contenidos en la Figura 16. En conclusión, (i) estos hallazgos soportan además la hipótesis del inventor de que T1R1/T1R3 es el único receptor de sabor acre, e (ii) los receptores T1T1/T1R3 y T1R2/T1R3 pueden compartir un dominio de unión de lactisol estructuralmente relacionado. Aunque la siguiente descripción detallada anterior ha descrito varias modalidades de la presente invención, se entenderá que la descripción anterior es ilustrativa solamente y no limitante de la invención descrita. La invención va a limitarse sólo por las reivindicaciones que siguen.
Ejemplo 14 Mapeo de Sitios de Interacción de Ligando en el Receptor Dulce A través de la co-expresión de T1R2R-H con T1R3 humano, parte del receptor dulce humano (el dominio N-terminal de T1R2) se reemplazó con secuencia de proteínas de ratas. Las respuestas a aspartame y neotame se suprimen, mostrando que el dominio N-terminal de T1R2 humano se requiere para reconocer aspartame y neotame. De manera similar, el dominio N-terminal T1R2 de rata se reemplazó también con una secuencia de proteína humana co-expresando T1R2H-R con T1R3 de rata. El receptor quimérico adquiere la capacidad de responder a aspartame y neotame, sugiriendo que el mismo dominio de T1R2 humano es también suficiente (en el contexto de receptores dulces) para reconocer aquellos dos edulcorantes (Figura 22B). Estos datos de expresión funcional in vitro indican que los determinantes de interacción importantes se ubican en el dominio extracelular N-terminal. En contraste, el reemplazo de la mitad de T1R2 humano con la secuencia de proteína de rata no afecta su respuesta a ciclamato. Más bien, el dominio C-terminal de T1R3 humano se requiere y es suficiente, cuando se co-expresa con T1R2, para reconocer el ciclamato (FIGURA 22C). El dominio de transmembrana de la familia C de los GPCR ha demostrado que contiene sitios de unión para moduladores alostéricos (Gasparini, F., R. Kuhn, y J.P. Pin, Curr Opin Pharmacol 2002 Feb; 2(1):43-9). Este es el primer caso en la familia C GPCR, en donde un agonista se une directamente al dominio de transmembrana y activa el receptor en la ausencia de otro ligando. El lactisol, un ácido aralquilcarboxílico, es un inhibidor de sabor dulce humano específico, el cual tiene un efecto fisiológico en el sabor de roedores. Consistente con el efecto de sabor, el lactisol inhibe la respuesta de T1R2/T1R3 de ser humano pero no de rata a sacarosa en el sistema de ensayo (Figura 22A). La misma clase de experimentos de mapeo en el sitio de interacción de lactisol utilizando las quimeras T1R se realizó. Como el ciclamato, el lactisol requiere el dominio C-terminal T1R3 humano para inhibir la respuesta del receptor a sacarosa y acesulfame K. (Figura 22D). Este resultado demuestra además la importancia del dominio C-terminal T1R3 en la función receptora dulce. Las quimeras en todas las posibles 16 combinaciones se probaron, y todas las combinaciones funcionales generaron resultados consistentes con este modelo. Los estudios de mutagénesis se condujeron tanto en T1R2 como en T1R3 para reducir los aminoácidos esenciales en el reconocimiento del aspartame, el neotame y el ciclamato. Si el T1R2 y el T1R3 son responsables para reconocer edulcorantes diferentes, las mutaciones en el dominio N-terminal T1R2 afectaría las respuestas a aspartame y neotame, pero no al ciclamato. Además, las mutaciones en el dominio C-terminal T1R3 tendrían el efecto opuesto. Para seleccionar los residuos aminoácidos cruciales en el dominio N-terminal T1R2, la secuencia de T1R2 se alineó con mGluRl (Figura 23a). Entre los ocho residuos que son cruciales en la unión de ligando en mGluRl (Kunishima, N., et al., Nature, 2000. 407(6807); p. 971-7), se conservan tres en T1R2 humano (S144, Y218 y E302). Cada uno de los tres residuos se mutaron y los receptores resultantes se probaron para su respuesta a diferentes edulcorantes. La sustitución de Y218 a A suprime las respuestas a todos los edulcorantes probados, mostrando que Y218 es importante para la conformación total del receptor. Las dos otras variantes hT1R2, que contienen S144A y E302A, afectan selectivamente la respuesta a aspartame y neotame, pero no a ciclamato. Las líneas celulares estables que expresan variantes S144A y E302A hT1R2 (co-expresadas con hT1R3 de tipo silvestre y Ga?s) no respondieron a aspartame o neotame en las concentraciones fisiológicas, pero no respondieron a ciclamato (Figura 23B). Con el fin de mapear además el sitio de unión del ciclamato, los tres bucles extracelulares en el dominio C-terminal T1R3 se enfocaron. El alineamiento de los T1R3 humano y de roedor reveló múltiples diferencias en el aminoácido en los tres bucles extracelulares (Figura 23C). Reemplazando el bucle-2 ó el bucle-3 extracelular con secuencias de rata que suprime la respuesta de ciclamato sin afectar las respuestas de sacarosa o aspartame. En contraste, reemplazar el bucle 1 extracelular no tuvo efecto obvio en la respuesta al ciclamato, mostrando un papel importante para los bucles 2 y 3 en EC en ciclamato de reconocimiento (Figura 23D). Ninguno de aquellos reemplazos de bucles afectó el efecto de inhibición del lactisol, demostrando un diferente mecanismo de unión. En resumen, las sustituciones de aminoácido en T1R2 o T1R3 resultan en interferencia selectiva de actividades inducidas por diferentes edulcorantes, consistentes con los resultados receptores quiméricos. Los resultados anteriores demuestran que el receptor dulce humano funciona como un complejo heteromérico de T1R2 y T1R3. Ambas subunidades se requieren para reconocer diferentes edulcorantes, y los datos indican la existente de múltiples grupos de unión en el receptor para diferentes clases de agonistas. La presencia de múltiples sitios de unión de ligando proporciona la guía estructural y la definición para los compuestos de unión específicamente de la invención.
Ejemplo 15 Mapeo de las Interacciones de la proteína G receptora Los receptores dulces de ser humano y de rata son también diferentes en su eficiencia de acoplamiento de proteínas G. Aún cuando ambos receptores tanto humanos como de rata pueden acoplarse eficientemente a G<?i s/u, sólo el receptor humano puede acoplarse eficientemente a Ga?5 (Figura 24A). Esta diferente especie permite mapear las interacciones de proteínas G receptoras utilizando los mismos receptores quiméricos como se describe anteriormente. El T1R2, pero no el T1R3 parece ser crítico para el acoplamiento de Gai5, ya que reemplaza el término C del T1R2 humano con la secuencia de rata correspondiente que suprime el acoplamiento, y reemplaza la mitad C-termína! de T1R2 de rata con la secuencia humana que permite al receptor acoplarse a Ga?5 y responder a sacarosa y acesulfame K (Figura 24); La alteración de las secuencias C-terminales T1R3 no tuvo efecto en el acoplamiento de Ga?5 (Figura 24B). Esta observación demuestra el papel importante del T1R2 en el acoplamiento de proteínas G en el sistema de expresión funcional. Gustducin (Wong, G.T., K.S. Gannon, y R.F. Margolskee, Nature, 1996, 381(6585): p. 796-800) se ha propuesto para ser una proteína G endógena para el receptor de sabor dulce, y T1R2 puede ser la subunidad responsable para acoplamiento in vivo en células de sabor. GABAßR es el otro ejemplo de la familia C GPCR heteromérica, mientras que una subunidad (GABABR1) es responsable para la unión de ligando, y la otra (GABABR2) para acoplamiento de proteína G (Margeta-Mitrovic, M., Paroc Nati Acad Sci U S A, 2001. 98(25): p. 14643-8; Margeta-Mitrovic, M., Proc Nati Acad Sci U S A, 2001 98(25): p. 14649-54). El receptor dulce es diferente de GABABR en que T1R2 se requiere para el reconocimiento de ligando como para el acoplamiento de proteína G.
Ejemplo 16 El Lactisol Antagoniza T1R1/T1R3 Humano e Inhibe el Sabor Acre Humano Se hizo hipótesis de que la función de T1R1/T1R3 como receptores heteroméricos así como el receptor dulce, que el lactisol debe tener un efecto similar en la actividad T1R1/T1R3, ya que T1R3 es una subunidad común entre el dulce y los receptores acres. Más bien, el lactisol antagoniza T1R1/T1T3 humano. (Figura 25A). El lactisol actúa como un inhibidor no competitivo de T1R1/T1T3, ya que los valores de IC50 no son aparentemente dependientes de la concentración de glutamato (Figura 25B), y el lactisol reduce las actividades máximas del receptor sin cambiar significativamente el EC50 de agonistas (Figura 25C). Estos resultados demuestran que el lactisol se une a un sitio diferente de L-glutamato, y son consistentes con la hipótesis de que el grupo de unión de glutamato se ubica en T1R1. El lactisol parece ser un inhibidor competitivo del receptor dulce, ya que los IC50 son dependientes de las concentraciones de los edulcorantes, e incrementa los EC50 de los edulcorantes sin afectar significativamente las actividades máximas. El efecto de inhibición del lactisol se media por los receptores T1R ya que no tuvieron efecto en el receptor de acetilcolina muscarínico endógeno en células HEK o en un receptor ácido de ratón, mT2R5, expresado temporalmente en las células HEK. Como fue el caso para el receptor T1R2/T1R3, la inhibición de lactisol de la respuesta T1R1/T1R3 para el estímulo de sabor acre fuera reversible después del deslave y la reestimulación. Para correlacionar la actividad receptora con el comportamiento, se probó el efecto en el sabor acre humano. Como se predijo, las concentraciones milimolares del lactisol incrementa dramáticamente los umbrales de detección para el estímulo de sabor dulce y acre, pero no para el sabor salado (Figura 25D). El lactisol no se conoció previamente para ser un inhibidor de sabor acre. La correlación entre la actividad receptora y los resultados de sabor demuestran un papel crucial de los T1R en el sabor acre humano.
Ejemplo 17 El Ciclamato Mejora las Actividades Receptoras T1R1/T1R3 Humanas Con base en el mismo modelo heteromérico de los T1R (Figura 26), se predijo que el ciclamato modularía también la actividad del receptor acre T1R1/T1R3 humano actuando en T1R3. Aunque el ciclamato solo no tuvo efecto en T1R1/T1R3, éste mejoró la actividad del receptor en la presencia del L-glutamato (Figura 27E). Este efecto es específico para el T1R1/T1R3 humano, ya el ciclamato no tuvo efecto en las actividades del receptor de acetilcolina muscarínico endógeno en la presencia de carbacol (Figura 27E). Esto es notable que el ciclamato tiene los EC50 comparables para el receptor dulce (Figura 23B) y el receptor acre. El ciclamato dirigió a la izquierda reproduciblemente las curvas de respuesta de dosis para L-glutamato por ~2 veces en la presencia o ausencia de IMP (Figura 25F). El IMP tiene un efecto más dramático para mejorar el receptor, y el efecto del ciclamato se observa en la presencia de IMP (Figura 25F), sugiriendo un mecanismo diferente a partir de IMP al mejorar el receptor. IMP parece unirse a T1R1, ya que no tiene efecto en el receptor dulce. Otros edulcorantes, incluyendo sacarosa, aspartame, sacarina y D-triptofano no tuvieron efecto en las actividades de T1R1/T1R3 humano. En resumen, se ha demostrado que tanto T1R2 como T1R3 se requieren en un receptor dulce funcional, que el aspartame y el neotame requieren el dominio extracelular N-terminal de T1R2, el acoplamiento de proteínas G requiere la mitad C-terminal de T1R2, y que el ciclamato y el lactisol requieren el dominio de transmembrana de T1R3. Estos hallazgos demuestran los papeles funcionales diferentes de subunidades T1R en un complejo heteromérico y la presencia de los sitios de interacción del edulcorante múltiple en el receptor dulce. Debido a que T1R3 es la subunidad común en los receptores y acres, se predijo y confirmó el efecto de ciclamato y el lactisol en el receptor acre. Además, una correlación fue capaz de hacerse entre el efecto de lactisol en las actividades del receptor con el sabor. Con base en estas observaciones, un modelo se creo (Figura 26) para las relaciones de función de estructura de los receptores de sabor de la familia T1R. Los edulcorantes de carbohidrato naturales se unen al dominio N-terminal de T1R2, similar a aspartame y neotame, y existen otros sitios de unión en el receptor dulce también, por ejemplo, el dominio de transmembrana de T1R2. El receptor acre funciona similarmente como un complejo heteromérico, y MSG e IMP parece cada uno unirse a la subunidad T1R1, ya que no tiene ningún efecto en el receptor dulce, y el dominio de transmembrana de T1R1 es responsable para el acoplamiento de proteínas G.
Ejemplo18 Protocolo HTS para Degustantes Dulces Un derivado de línea celular HEK293 (Chandrashekar, J., Mueller, K.L., Hoon, M.A., Adier, E., FENA, L., Guo, W., Zuker, C.S., Ryba, N.J., Cel, 1 2000, 100, 703-711), que expresa establemente Ga15 y hT1R2/hT1R3 (Li, X., Staszewski, L., Xu, H., Durick, K., Zoller, M., Adier, E. Proc Nati Acad Sci U S A 2002, 99, 4692-4696, patente Mundial # WO 03/001876 A2, incorporada en la presente para referencia en su totalidad) se utilizó para identificar compuestos con propiedades de mejoramiento de sabor dulce. Los compuestos se seleccionaron ¡nicialmente con base en su actividad en la línea celular hT1 R2/hT1 R3-HEK293-Ga15 (Lí, et ai., vide supra). Se determinó la actividad utilizando un ensayo de formación de imágenes fluorométrico automatizado en un instrumento FLIPR (Lector de Placa de Intensidad Fluorométrica, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) (ensayo de FLIPR diseñado). Las células a partir del clon (células S-9 diseñadas) se sembraron en placas de 385 pozos (en aproximadamente 50,000 células por pozo) en un medio que contiene Glucosa Baja de DMEM (Invitrogen, Carisbad, CA), 10% de suero de bovino fetal dializado (Invitrogen, Carisbad, CA), 100 Unidades/ml de Penicilina G, y 100 µg/ml de Estreptomicina (Invitrogen, Carisbad, CA) (Li, et al., vide supra) véase también la Patente Mundial #WO 03/001876 A2). Las células S-9 se cultivaron durante 24 horas a 37°C. Las células S-9 se cargaron entonces con el tinte de calcio Fluo-3Am (Molecular probes, Eugene, OR), 4 µM en una solución salina de tampón de fosfato (D-PBS) (Invitrogen, Carisbad, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 24 µl de D-PBs, el estímulo se realizó en el instrumento FLIPR y a temperatura ambiente por la adición de 25 µl de D-PBS suplementado con diferente estímulo a concentraciones que corresponden a dos veces el nivel final deseado. La actividad receptora se cuantificó determinando los incrementos de fluorescencia máximos (utilizando una excitación de 480 nm y 535 nm de emisión) después de la normalización a la intensidad de fluorescencia basal medida antes de la estimulación. Para análisis de respuestas de dosis, se presentaron los estímulos por duplicados a 10 diferentes concentraciones que varían desde 60 nM a 30 µM. Las actividades se normalizaron a la respuesta obtenida con 400 mM de D-fructosa, una concentración que produce una respuesta receptora máxima. Los EC50 se determinaron utilizando una algoritmo de regresión no lineal (utilizando software Senomyx, Inc.) en donde el declive Hill, las asíntotas de fondo y las asíntotas superiores se permitieron variar. Resultados idénticos se obtuvieron cuando se analizan los datos de repuesta de dosis utilizando software comercialmente disponible para análisis de regresión no lineal tal como GraphPad PRISM (San Diego, CA). Con el fin de determinar la dependencia de hT1R2/hT1R3 para la respuesta celular a diferentes estímulos, los compuestos seleccionados se sometieron a un análisis similar en células HEK293-Ga15 (que no expresa el receptor dulce humano). Las células HEK293-Ga15 no muestran cualquier respuesta funcional en el ensayo FLIPR a D-Fructosa o cualesquiera otros conocidos edulcorantes. De manera similar, los compuestos descritos en la presente no inducen ninguna respuesta funcional cuando se utilizan células HEK293-Ga15 en el ensayo FLIPR.
Ejemplo 19 Mediciones del Mejoramiento de Sabor para Degustantates Dulces utilizando Voluntarios Humanos La tamización de degustantes de sabor sensorial: Los panelistas se probaron para sus capacidades para intensidades de rango y de tasa de soluciones que representan los cinco sabores básicos. Los panelistas varían y valoran la intensidad de cinco diferentes concentraciones de cada uno de los siguientes compuestos: sacarosa (dulce), cloruro de sodio (salado), ácido cítrico (ácido), cafeína (amargo) y glutamato monosódico (acre).
Los panelistas prueban un total de 25 muestras por sesión (5 muestras de cada uno de los 5 tipos de solución). En la primera sesión, los panelistas clasificaron las cinco concentraciones para intensidad del atributo en cuestión. Esto se repitió cuatro veces mas con otras muestras. En la segunda sesión, los panelistas clasificaron la intensidad de las cinco concentraciones de cada muestra utilizando una escala lineal llamada la "Escala de Magnitud Etiquetada" (LMS). La LMS se ancla con intensidades (por ejemplo, escasamente detectable, débil, moderada, fuerte, muy fuerte e imaginablemente más fuerte) para ayudar a los panelistas a clasificar las muestras. Las muestras se probaron en 10 ml de volúmenes a temperatura ambiente y se etiquetaron con códigos de unión de 3 dígitos. Las muestras se presentaron en orden contraequilibrado aleatorizado dentro de cada solución de muestra (por ejemplo, sacarosa, ácido cítrico, etc.). Con el fin de seleccionarse para la participación en la prueba, los panelistas necesarios para clasificar correctamente y muestras de índice para intensidad, con un número razonable de errores. Aproximadamente 25 gentes completaron exitosamente este procedimiento. Los panelistas seleccionados en el procedimiento anterior se cree calificaron para realizar procedimientos de Prueba de Sabor Preeliminares. Las pruebas de sabor preeliminares se utilizan para evaluar nuevos compuestos para la intensidad de sabores básicos y sabores finales. Un grupo pequeño de panelistas (n = 5) probó aproximadamente 5 concentraciones del compuesto (rango normalmente entre 1-100 uM, en ciclos de logaritmo diario, por ejemplo, 1, 3, 10, 30 y 100 uM) en agua o tampón y en una solución de 4% (p/v, 117 mM) de sacarosa para evaluar el mejoramiento. Normalmente, las muestras contienen también 0.1% de etanol para ayudar a la dispersión del compuesto en una solución basada en agua. Los panelistas evalúan los cinco sabores básicos (dulce, salado, ácido, amargo y acre) así como malos sabores (tales como químicos, metálicos, azufrosos) en la LMS. Las muestras se sirven en porciones de 10 ml a temperatura ambiente. El propósito de la prueba es determinar la concentración más elevada a la cual no existe mal sabor objetable y determina si el mejoramiento obvio del sabor dulce existe en cualquiera de las concentraciones probadas. Si el compuesto es efectivo y no tiene malos sabores objetables, éste se prueba con uno entrenado (panel experto) en un estudio más grande. Por ejemplo: Cinco panelistas evaluaron 1, 3, 10, 30 y 100 uM de XVI-3 en agua y en 4% de solución de sacarosa. Todas las muestras con el compuesto se equilibraron para etanol a 0.1% (auxiliares en la dispersión del compuesto). Se les pidió a los panelistas clasificaran los sabores básicos y los malos sabores utilizando la LMS para cada muestra probada. Cuando los panelistas observaron los edulcorantes en cualquier muestra, se les preguntó las muestras de referencia de sabor de sacarosa (2, 4, 6, 8% de sacarosa) para estimular edulcorantes equivalentes. Un panel entrenado (experto) se utilizó para evaluar además compuestos que no habían sido probados con la prueba de sabor preeliminar. Los panelistas para el panel entrenado se seleccionaron a partir del grupo más grande de panelistas de sabor habilitador. Los panelistas se entrenaron además en sabor dulce clasificando y evaluando experimentos utilizando soluciones de sacarosa. Los panelistas completaron una serie de clasificación, evaluación, y diferencia a partir de pruebas de referencia con soluciones dulces. En los experimentos de clasificación y evaluación, los panelistas evaluaron concentraciones de sacarosa (2, 4, 6, 8% (p/v) de sacarosa. Los compuestos probados para el panel entrenado se evaluaron en diferencia a partir de experimentos de referencia. Los panelistas se les dieron muestras de referencia de varias concentraciones (2, 4, 6 ó 8% (p/v) de sacarosa) y se les pidió las muestras de clasificación en una escala de -5 a +5 en términos de diferencia en sabor dulce a partir de la referencia (clasificación: -5 = sabor mucho menos dulce que la referencia; 0 = mismo sabor dulce como la referencia; +5 = sabor mucho más dulce que la referencia). Las muestras de prueba fueron soluciones que variarán cantidades de sacarosa y el compuesto. Normalmente, cada sesión comparada a la muestra de referencia (etiquetada como REF) a numerosas muestras de prueba (etiquetada con códigos de blindaje de 3 dígitos). Las pruebas normalmente incluyen varias muestras con concentraciones variables de sacarosa, así como una muestra ciega de la referencia misma, para evaluar exactitud de panel. Los compuestos se probaron contra la referencia en las muestras con y sin 4% ó 6% de sacarosa. Todas las muestras se presentaron en 10 ml de volúmenes de temperatura ambiente. Además, para determinar los edulcorantes del compuesto solo, una solución de referencia se preparó a la concentración designada y comparada a los edulcorantes umbral de sacarosa (2%).
Ejemplo 20 Protocolo THS para Degustantes Acres Las células HEK-Ga15 se diseñaron para expresar indeciblemente T1R1/T1R3 utilizando el sistema GeneSwitch (Invitrogen). Los vectores de expresión resistentes a zeocina derivados de p-Gene para T1R1 y T1R3 humano (plásmido SXV603 para T1R1 y SXV611 par T1R3) y un vector derivado pSwitch resistente a puromicina que porta la proteína GEneSwitch (plásmido SXV628) se linealizaron y co-transfectaron en la línea celular HEK-Ga15. Las colonias resistentes a zeocina y resistente a puromicina se seleccionaron, se expandieron, se indujeron con cantidades variables de mifepristona, y se probaron por formación de imágenes de calcio para respuestas para estímulo de sabor acre. Las células se seleccionaron en 0.5 µg/ml de puromicina (CAL BIOCHEM) y 100 µg/ml de Zeocina (Invitrogen) a 37°C en Medio Eagle Modificado con Dulbecco suplementado con GlutaMAX, (10% de FBS dializado, y 3 µg/ml de blasticidina. Las colonias resistentes se expandieron, y sus respuestas a estímulo de sabor acre después de la inducción con 10~10 M de mifepristona determinada por miscroscopía fluorescencia después de los métodos de Li, ef al., PNAS (2002) 99(7):4692-4696. Para formación de imágenes fluorométrica automatizada en la instrumentación FLIPR (Molecular Device), las células a partir de un clon (clon 1-17 designado) se sembraron en placas de 96 ó 384 pozos (aproximadamente 80,000 células por pozo) en la presencia de 1010 M de mifepristona y se incubaron durante 48 horas. Las-células se cargaron entonces con el tinte de calcio fluo-4-AM (Molecular Probes), 3 µM en PBS, durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 50 µl de PBS, la estimulación se realizó a temperatura ambiente por la adición de 50 µl de PBS suplementado con diferentes estímulos. La fluorescencia máxima a partir de cuatro determinaciones independientes se promedió, se corrigió para fluorescencia de trasfondo medida antes de la adición del compuesto, y se normalizaron a la respuesta a 0.002 mM de ionomicina (CALBIOCHEM).
Ejemplo 21 Protocolo de Prueba de Sabor para Degustantes Acres El entrenamiento básico de Sabores Sensoriales: Los sabores se entrenaron para evaluaron al sabor de las soluciones acuosas (5 ml de cada uno, "chapoteo y esputo") de los siguientes compuestos de sabor estándar utilizando la prueba del triángulo como se describe en la literatura: sacarosa (50 mM) para sabor dulce; ácido cítrico (5 mM) o ácido láctico (20 mM) para sabor ácido; NaCI (12 mM) para sabor salado, quinina (10 µM) o cafeína (1 mM) para sabor amargo; y el glutamato de monosodio (8 mM) para sabor acre o "sabroso". entrenamiento para Sabor Acre: Se les dio a los sabores 1-3 conjuntos de 6 MSG y/o muestras de MSG-IMP que varían desde 3-60 mM de MSG y 0-200 µM de IMP, cada uno dispuesto en la bandeja en concentración ascendente. Este ejercicio dio la práctica del sujeto haciendo evaluaciones de respuesta de dosis. Entonces, otro conjunto constituyó los mismos seis ejemplos, pero se les dio en orden aleatorio. Se le preguntó al sujeto entonces para disponer las muestras en intensidad ascendente y luego para evaluar su intensidad acre. Panelistas de Sabor Calificativo: Los sabores se sometieron a un estándar de dos pruebas de elección forzada alternativa (2AFC) con 5 pares de las muestras de prueba. Se les pidió hicieran una elección de la muestra más acre a partir de dos muestras (un par). La prueba contiene dos pares fáciles, dos con dificultad media y un par difícil. Los catadores que pudieron diferenciar los pares difíciles medios se seleccionaron como panelistas.
La prueba de sabor Piloto/Cualitativa del Candidato Mejorador Acre (UEC) por un grupo pequeño de panelistas: Las muestras de sabor de las concentraciones apropiadas (usualmente 1-50 µM) se hicieron en agua (uso de cantidad mínima de etanol si no es soluble); el UEC de sabor solo a 30 y/o 50 µM para atributos acres y otros. Se evalúan aquellos atributos de sabor en la Escala de Magnitud Etiquetada (LMS) apropiada en la boleta de tamización; si el UEC no tiene sabores acres/o bajos y otros, entonces se mueven hacia la prueba de discriminación; compara cierta concentración de MSG, por ejemplo, 12 mM y 12 mM de MSG + 30 µM de UEC para determinar si existe cualquier mejora; evaluar la intensidad acre percibida en la LMS apropiada en la boleta de tamización; variar la concentración del UE y/o MSG para encontrar la mejor combinación; decidir qué soluciones se utilizan en la tamización de panel; registrar todos los procedimientos y datos incluyendo la descripción de estudio, la preparación de la muestra, la disposición de la muestra, las boletas y la hoja de firma para panelistas, entrada y evaluación de datos. Tamización de Panel 2AFC de UEC: operar la tamización del panel con panelistas calificados utilizando protocolos generados a partir de la degustación piloto; registrar todos los procedimientos y datos, preparar el reporte resumen con conclusiones estadísticamente significativas, si las hay.
Ejemplo 22 Pruebas de Sabor Cuantitativas para Compuestos 2725761 y 3756807 Las pruebas de sabor cuantitativas para compuestos 2725761 y 3756807 se operaron de acuerdo a procedimientos presentados anteriormente. Se encontró que estos tienen alguna mejora para MSG; además de su efecto aditivo de la intensidad acre.
Ejemplo 23 Síntesis de Compuestos 2725761 y 3756807 Los compuestos 2725761 y 3756807 se preparan como se muestra en el Ejemplo 22, a partir de sus ácidos y aminas correspondientes. Los productos se purifican por métodos convencionales, por ejemplo, lavados acuosos básicos y acídicos, o HPLC preparativa. Las estructuras de aquellos compuestos se confirmaron con base en los métodos analíticos usuales, por ejemplo NMR y LCMS. Este método puede utilizarse también para sintetizar cualquiera de los compuestos encontrados en las Tablas 1-5.
Ejemplo 24 Ensayos con Base en Células Las células se cultivaron y mantuvieron a 37°C en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y aminoácidos no esenciales MEM (Gibco BRL); medios para células G«?5 también contuvo 3 µg mi"1 de blasticidina (Gibco BRL). Para experimentos de formación de imágenes de calcio, las células se sembraron primero en placas de cultivo de tejido de 48 pozos (aproximadamente 30,000 células por pozo) y transfectadas utilizando Mirus Translt-293 (PanVera). Las eficiencias de transfección, que se estimaron por co-transfección con un vector de expresión RFP, fueron normalmente alrededor de 60%. Para minimizar desensibilización inducida con glutamato e inducida con glucosa, el DMEM suplementado se reemplazó con DMEM suplementado con glucosa baja con GlutaMAX y 10% de FBS dializado (Gibco BRL) aproximadamente 24 horas después de la transfección. Después de 24 horas adicionales, las células se cargaron con el tinte de calcio fluo-4-AM (Molecular Probes), 3 µM en tampón de PBS de Dulbecco (DPBS, GibcoBRL), durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Después del reemplazo con 100 µl de DPBS, la estimulación se realizó a temperatura ambiente por la adición de 100 µl de DPBS suplementado con estímulos de sabor. La movilización de calcio se monitoreo en un microscopio Axiovert S100 equipado con un objetivo de flúor plano de 10X/0.5 LWD (Zeiss) y una cámara CCD enfriada (Princeton Instruments). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron a 480 nm de excitación y 535 nm de emisión, y se analizaron con software Imaging Workbench 4.0 (Axon Instruments). La actividad receptora T1R se cuantificó contando el número de células de respuesta 30 segundos después de la adición de estímulos.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar el sabor sabroso de un producto comestible o medicinal, caracterizado porque comprende: proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que incrementa el sabor sabroso de al menos un compuesto no natural seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto de origen no natural que se une a la región rica en cisteína del T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto de origen no natural que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína del T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3, un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM del T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; o una sal comestiblemente aceptable; de manera que se forma un producto comestible o medicinal modificado; y por lo que se incrementa el sabor sabroso de un producto comestible o medicinal, en donde el compuesto no es sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol, sorbitol, xilitol, ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, sucralosa, alitame, glutamato monosódico ("MSG") monofosfato de inosina (IMP), monofosfato de adenosina o monofosfato de guanosina (GMP). 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se une al dominio extracelular N-terminal de T1R1 del receptor T1R1/hT1R3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el compuesto es un saborizante acre, un degustante acre, un mejorador acre del sabor, o un modificador del sabor acre. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el compuesto mejora ei sabor acre del glutamato monosódico. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es adecuado para consumo humano o animal . 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es un alimento, una bebida, una medicina o un aditivo alimenticio. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es una sopa. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es un producto auxiliar para cocinar, un producto de solución en la comida o un producto de aderezo para comida. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es una bebida, una mezcla de bebidas, o un concentrado de bebidas. 1 1 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el compuesto es un agonista acre que tiene un valor EC de menos de 1 mM. 12. El método de conformidad con cualqu iera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el compuesto es un agonista acre que tiene un valor EC de menos de 1 µM . 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el compuesto es un mejorador acre que tiene una relación de EC50 de al menos 1 .2. 14. El producto comestible o medicinal modificado producido por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -13. 15. Un método para incrementar el sabor dulce de un producto comestible o medicinal, caracterizado porque comprende: proporcionar al menos un producto comestible o medicinal, o un precursor del mismo, y combinar el producto comestible o medicinal o precursor del mismo con al menos una cantidad que incrementa el sabor dulce de al menos un compuesto de origen no natural , seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1 R2/T1 R3 compuesto de hT1 R2/hT1 R3, pero no de rT1 R2/rT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1 R2/T1 R3 compuesto de hT1 R2/rT1 R3 pero no de rT1 R2/hT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal del T1 R2 del receptor hT1 R2/hT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al receptor T1 R2/T1 R3 compuesto de rT1 R2/hT1 R3 pero no de hT1 R2/rT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no a rT1R2/rT1R3 o a hT1R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisteína del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal humano de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana de la subunidad T1 R3 del T1 R2/T1 R3; o una sal comestiblemente aceptable del mismo; de manera que forma un producto comestibles o medicinal modificado; por lo que se incrementa el sabor dulce del producto comestible o medicinal; en donde el compuesto no es sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol , manitol, sorbitol , xilitol, ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides, o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, y alitame, neotame, perillartina, SC-45647, SC-40014, monelina, NC-002740-01 , taumatina, CC-00100, NC-00420, SC-44102, dulcina, NC-00576, Ácido glicirrízico, steviosida, Na-sacarina, D-triptofano, DHB, Ácido glicólico, glicina, homofuronol , D(-) tagatosa, maltosa, D-sorbitol, D (+) galactosa o a-lactosa. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1 5, caracterizado porque el compuesto se une específicamente al dominio extracelular N-terminal del T1 R2 del receptor hT1 R2/hT1 R3. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1 5, caracterizado porque el compuesto se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1 R2 del receptor hT1 R2/hT1 R3. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1 R3 del receptor hT1 R2/hT1 R3. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el compuesto es un saborizante dulce, un degustante dulce, un mejorador del sabor dulce, o un modificador de sabor dulce. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19 , caracterizado porque el compuesto mejora el sabor dulce de edulcorantes de origen natural o sintético. 21 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es adecuado para consumo humano o animal . 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es un alimento, una bebida, una medicina, o un aditivo alimenticio. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es una sopa. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es un producto auxiliar para cocinar, un producto de solución en comida, o un producto de aderezo para la comida. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es una bebida, una mezcla de bebidas, o un concentrado de bebidas. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el producto comestible o medicinal modificado es un producto de confitería. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el compuesto es un agonista dulce que tiene un valor de EC de menos de 1 mM. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-19, caracterizado porque el compuesto es un agonista dulce que tiene un valor EC de menos de 1 µM. 29. Un producto comestible o medicinal modificado, producido por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-28. 30. Un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3, compuesto del hT1R2/hT1R3 pero no de rT1R2/rT1R3. 31. Un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. 32. Un compuesto no natural que se une específicamente a una región rica en cisteína de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. 33. Un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3. 34. Un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3. 35. Un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3. 36. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/hT1R3, pero no de rT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/rT1R3, pero no de rT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de rT1R2/hT1R3, pero no de hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no rT1R2/rT1R3 o a hT1 R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1 R2 del receptor T1 R2/T1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1 R2 del receptor T1 R2/T1 R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisteína del T1 R2 del receptor hT1 R2/hT1 R3, un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1 R2 del receptor hT1 R2/hT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1 R3 del T1 R2/T1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de la T1 R3 del receptor hT1 R2/hT1 R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de la T1 R3 del receptor hT1 R2/hT1 R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrána humano de la subunidad T1 R3 del T1 R2/T1 R3; que demuestra un incremento dependiente del compuesto en actividad de fluorescencia de al menos 25% comparada a la actividad máxima para la fructosa en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Molecular Devices). 37. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/hT1R3, pero no de rT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/rT1R3, pero no de rT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de rT1R2/hT1R3, pero no de hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no rT1R2/rT1R3 o a hT1R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisteína del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3, un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana humano de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; que demuestra una disminución dependiente del compuesto en EC50 para un edulcorante por al menos dos veces en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Molecular Devices). 38. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/hT1R3, pero no de rT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/rT1R3, pero no de rT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de rT1R2/hT1R3, pero no de hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no rT1R2/rT1R3 o a hT1R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisterna del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3, un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de la T1R3 del receptor hT1R3/hT1R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana humano de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; que resulta en al menos 10 hasta 100 células transfectadas con un receptor de tipo silvestre o quimérico que muestra un incremento dependiente del compuesto en fluorescencia. 39. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/hT1R3, pero no de rT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/rT1R3, pero no de rT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de rT1R2/hT1R3, pero no de hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no rT1R2/rT1R3 o a hT1R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisteína del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3, un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana humano de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; que demuestra un incremento dependiente del compuesto de al menos dos veces el número de células de fluorescencia en respuesta a un nivel sub-máximo de un edulcorante. 40. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/hT1R3, pero no de rT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de hT1R2/rT1R3, pero no de rT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a un receptor T1R2/T1R3 compuesto de rT1R2/hT1R3, pero no de hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y rT1R2/r3-h3 pero no rT1R2/rT1R3 o a hT1 R2/h3-r3; un compuesto no natural que se une específicamente a hT1R2/hT1R3 y r2-h2/rT1R3, pero no a rT1R2/rT1R3 o a h2-r2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VDF) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3 y hT1R2/rT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente a residuos 144 y 302 aminoácidos del dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio de trampa de mosca Venus N-terminal de la subunidad T1R2 del receptor T1R2/T1R3, en donde el compuesto es aproximadamente 12x5x5 ángstroms; un compuesto no natural que se une específicamente a la región rica en cisteína del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3, un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) del T1R2 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Trampa de Mosca Venus (VFD) de la T1R3 del receptor hT1R2/hT1R3; un compuesto no natural que se une específicamente al Dominio de Transmembrana (TM) de la T1R3 del receptor hT1R3/hT1R3; y un compuesto no natural que se une específicamente al bucle 2 extracelular y al bucle 3 extracelular del dominio de transmembrana humano de la subunidad T1R3 del T1R2/T1R3; que demuestra un incremento dependiente del compuesto en la respuesta de las células a un nivel sub-máximo de un edulcorante de al menos 1.25 veces comparado a la respuesta al edulcorante solo. 41. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-40, caracterizado porque la respuesta se mide por fluorescencia, niveles de calcio, niveles de IP3, niveles de cAMP, unión de GTP?S, o actividad de gen reportero (por ejemplo, luciferasa, beta-galactosidasa). 42. Un receptor T1R2/T1R3 quimérico, caracterizado porque comprende una subunidad T1R2 de ser humano y una subunidad T1R3 de rata. 43. Un receptor T1R2/T2R3 quimérico, caracterizado porque comprende una subunidad T1R2 de rata y una subunidad T1R3 de ser humano. 44. Una subunidad del receptor T1R2 quimérico, caracterizada porque comprende un dominio extracelular humano, un dominio de transmembrana de rata y un domino intracelular de rata. 45. Una subunidad del receptor T1R3 quimérico, caracterizado porque comprende un dominio extracelular de rata, un dominio de transmembrana de rata y un dominio intracelular de ser humano. 46. Un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1 R1 del receptor T1R1/hT1R3. 47. Un compuesto no natural, que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3. 48. Un compuesto no natural, que se une al dominio extracelular N-terminal de la T1R3 del receptor T1R1/hT1R3. 49. Un compuesto no natural, que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3. 50. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une a un dominio extracelular N-terminal del T1R1 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de la T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VDF del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto del h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGIuR-h3; que demuestra incremento dependiente del compuesto en fluorescencia con una actividad comparada a la actividad máxima del glutamato de al menos 25% en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Molecular Devices). 51. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une a un dominio extracelular N-terminal del T1R1 del receptor T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de la T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VDF del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto del h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; que demuestra una disminución dependiente del compuesto en el EC50 para el glutamato por al menos dos veces en un ensayo basado en fluorescencia utilizando un instrumento FLIPR (Molecular Devices). 52. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une a un dominio extracelular N-terminal del T1R1 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de la T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VDF del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto del h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; que resulta en al menos 10 hasta 100 células transfectadas que muestran un incremento dependiente del compuesto en la fluorescencia medida con un microscopio fluorescente. 53. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une a un dominio extracelular N-terminal del T1R1 del receptor T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de la T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VDF del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto del h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; que resulta en un incremento dependiente del compuesto de al menos dos veces el número de células fluorescentes en respuesta a un nivel sub-máximo del glutamato. 54. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un compuesto no natural, que se une a un dominio extracelular N-terminal del T1R1 del receptor T1R2/T1R3; un compuesto no natural que se une al T1R1VFD del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de la T1R1 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R1 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio extracelular N-terminal de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al T1R3 VDF del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une a la región rica en cisteína de T1R3 del receptor T1R1/hT1R3; un compuesto no natural que se une al dominio T1R3 TM del receptor sabroso T1R1/T1R3; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor sabroso truncado compuesto del h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor dulce truncado compuesto de h1TM/h3TM; un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R1 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; y un compuesto no natural que se une al dominio TM de T1R3 de un receptor quimérico compuesto de mGluR-h1/mGluR-h3; que resulta en un incremento dependiente del compuesto en la respuesta de células a un nivel sub-máximo del glutamato de al menos 1 .25 veces comparado con la respuesta del glutamato solo. 55. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50-54, caracterizado porque la respuesta se mide por fluorescencia, niveles de calcio, niveles de I P3, niveles de cAMP, unión de FTII?S, o actividad genética reportera. 56. Un método para identificar compuestos que modulan la percepción del sabor identificando compuestos que se unen a, activan, inhiben , mejoran y/o modulan uno o más de los receptores seleccionados a partir del grupo que consiste de un receptor T1 R2/T1 R3 quimérico, caracterizado porque comprende una subunidad T1 R2 de ser humano y una subunidad T1 R3 de rata; un receptor T1 R2/T1 R3 quimérica, que comprende una subunidad T1 R2 de rata y una subunidad T1 R3 de ser humano; una subunidad del receptor T1 R2 quimérico que comprende, un dominio extracelular humano, un dominio de transmembrana de rata y un dominio intracelular de rata, y una subunidad del receptor T1 R3 quimérico que comprende, un dominio extracelular de rata, un dominio de transmembrana de ser humano y un dominio intracelular de ser humano. 57. Un método para identificar un compuesto, que modula la percepción del sabor dulce, caracterizado porque comprende comparar el efecto del compuesto en un receptor dulce para el efecto de un compuesto de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 30-40, y seleccionar un compuesto que tiene un mejoramiento de la percepción dulce aproximadamente igual a o mayor que el mejoramiento dulce del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 30-40. 58. Un método para identificar un compuesto que modula la percepción de sabor acre, caracterizado porque comprende el efecto del compuesto en un receptor acre al efecto de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-58, y seleccionar un compuesto que tiene un mejoramiento de la percepción sabrosa aproximadamente igual a, o mayor que el mejoramiento sabroso del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 49-58. 59. Un método para identificar compuestos que modulan la percepción del sabor identificando compuestos que se unen a, activan , inhiben y/o modulan un receptor expresado por una célula que expresa establemente uno o más receptores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-48. 60. Un método para mejorar la percepción del sabor acre, caracterizado porque comprende un receptor acre con ciclamato y NHDC, y sus derivados. 61 . Un método para mejorar la percepción del sabor acre, caracterizado porque comprende poner en contacto un receptor acre con derivados lactisol. 62. Un método para mejorar la percepción del sabor dulce, caracterizado porque comprende poner en contacto un receptor dulce con ciclamato y N HDC, y sus derivados. 63. Un método para mejorar la percepción del sabor dulce, caracterizado porque comprende poner en contacto un receptor dulce con derivados lactisol. 64. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-54, caracterizado porque el compuesto no es sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol , sorbitol , xilitol , ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides, o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, sucralosa, alitame, glutamato monosódico ("MSG"), monofosfato de inosina (IMP), monofosfato de adenosina, o monofosfato de guanosina (GMP). 65. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-54, caracterizado porque el compuesto no es sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol, sorbitol, xilitol , ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides, o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-K, ciclamato, sucralosa y alitame, neotame, perillartina, SC-45647, SC-40014, monelina, NC-002740-01 , taumatina, CC-00100 , NC-00420, SC-44102, dulcina, NC-00576, Ácido glicirrízicOj esteviosida, N-Sacarina, D-triptofano, DHB, Ácido glicólico, glicina, homofuronol, D(-) tagatosa, maltosa, D-sorbitol D(+) galactosa, a-lactosa, 5-(4H-benzo[d][1 ,3]oxatiin-2- il)-2-metoxifenol. 66. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-58 , caracterizado porque el compuesto no es sacarosa, fructosa, glucosa, eritritol, isomalto, lactitol, manitol , sorbitol , xilitol , ciertos terpenoides naturales conocidos, fiavonoides o edulcorantes de proteínas, di-péptidos, tri-péptidos, aspartame, sacarina, sucralosa, sacáridos halogenados, acesulfame-k, ciclamato, sucralosa, alitame, glutamato monosódico ("MSG"), monofosfato de inosina (I MP), monofosfato de adenosina, compuesto 6364395 o monofosfato de guanosina (GMP).
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