JPH07508831A - 分子検出の為の光学的および電気的方法ならびに装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分子検出の為の光学的および電気的方法ならびに装置発明の背景 多くの用途に於いて、試料中の一つ又は複数の分子構造の存在を検出する必要が 生まれる。

分子レベルの構造は、一般的に細胞、抗体および抗抗体の如きリガンドを含む。

リガンドは、特定のレセプターにより確認される分子である。リガンドは、下記 に限定されることはないが、細胞膜レセプター、毒素（ｔｏｘｉｎｓ）　、毒液 （ｖｅｎｏ田ｓ）、オリゴ糖、蛋白質、バクテリアおよび単クロナール抗体に対 する作用物質ならびに拮抗物質を含むことが出来る。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ 塩基配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　）分析は、遺伝学的および疾病の診断、毒物学テ スト、遺伝研究、農業および医薬品の開発に極めて有用である。同様に、細胞お よび抗体検出は、疾病の診断にとって重要である。

分子構造検出に対しては、多くの技法が開発されている。ＤＮＡおよびＲＮＡ塩 基配列検出に於いては、オートラジオグラフィーと光学的検出が一般に使用され る。オートラジオグラフィーは、３２Ｐ又はｉｓ３を用いて実施されている。Ｄ ＮＡ塩基配列分析では、核酸断片が１２Ｐにより最終的にｌｆｆ１を与えられる 。これらの最終的に標識を与えられた断片は、サイズ別に分離され、次に特定の 時間にわたってＸ線フィルムを５光させる。フィルムの感光量はフィルムの領域 に隣接する放射能に直接関係する。

どのような放射性の標識の使用にも幾つかの短所がある。第一に、長時間に放射 性元素を被ばくすることにより、遺伝病、例えば癌を発生するリスクを高める。

従って、放射線の被ばく度を抑制するために、放射性マーカ又は標識を用いる際 には予防策が実施されねばならない。通常作業者は、放射線の被ばくを連続的に 監視する為の装置を着用せねばならない。更に妊婦は、胎児の遺伝学的な突然変 異を防止する為の措置を補足的に施されねばならない。

従来の放射性検出方式は、時間的かつ空間的に感度を制限されている、現在放射 性標識の使用時の空間的分解能は１ｍｍである。分解能を１ｍｍ以下に引き下げ るには、ハード及びソフトウェアが追加的に必要となる。

オートラジオグラフィックフィルムを用いる検出の感度は、放射性標識を持つ断 片がフィルムを感光させる時間の長さに直接関係する。従ってフィルムの感光時 間は、検出テスト部位内の放射能レヘルによって時間単位から日数単位にまたが ることがある。βスキャナは、ラジオグラフィー中のフィルム感光に必要な時間 を大幅に短縮することが出来る。

しかし、βスキャナの使用は、このタイプの検出の為のコストを著しく引き上げ るし、本質的に空間的分解能は低い。

蛍光標識を持つレセプターの光学的検出も、分子結合の検出に使用されてきた。

ＤＮＡ塩基配列分析のために簡単には、塩基用の特殊な蛍光染料が、オリゴヌク レオチドプライマ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｃｌｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　）又 はＤＮＡ重合酵素に伴って用いられる読み終りジデオキシヌクレオチド（ｄ４ｄ ｅｏχｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　）に共有結合される。各染料に対する適切な 吸収波長が選ばれて、染色を励起する為に使用される。染料の吸収スペクトルが 互いに接近している時には、全ての染料を励起する為の特定の波長が選ばれる。

特定の光学検出技法においては、二重鎖の核酸を染める染料、例えば臭化エチジ ウムを使用する。これらの染料の蛍光は、それが二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡに結 合される時には、結合されぬ染料又は−末鎖Ｄ　Ｎ　Ａに結合された染料の示す 蛍光に比較して約２０倍の高さを示す。このタイプの染料はハイブリッド形成（ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　）実験中にハイブリッド化されたＤＮＡ（又はＲ ＮＡ）の存在を検出する為に用いられる。従来の光学検出法の使用は塩基配列決 定の実験の能率を高められるが、それには大きな短所を伴う。

従って、分子構造を簡単に検出する為の安全で、低コストで、迅速かつ正確な方 法と装置の必要性が業界の中に高まっていた。

発明の要約 本発明によれば、予め定められたテスト部位での分子構造の存在を検出する為の 方法および装置が提供され、しかもこれは公知の装置に付随した短所および問題 を十分に解消し又は防止する。

本発明の電気的な実施例に於いては、分子構造を持つ物質が多数のテスト部位に 用いられ、各テスト部位は既知の分子構造に結合することの出来るプローブをそ の中に形成されている。電気信号がテスト部位に与えられ、テスト部位の電気的 特性は、プローブが付随の分子構造に又は付随の分子構造と共に結合（ハイブリ ッド化）したかを判定する為に検出される。

テスト部位は、超大規模集積（ｖｅｒｙ　ｌａｒｇｅ　５ｃａｌｅ　ｉｎｔｅｇ ｒａｔｅｄ　）（ＶＬＳＩ）回路法により、半導体チップ若しくはウェハ上又は それらの中に形成されたモノリシンク構造である。これにより、十分に安価で使 い捨ての可能な低コスト、小型のテスト装置が出来る。

本発明の一実施例によれば、テスト部位に形成されたコンデンサの損失の変化を 感知し、又はハイブリッド化された分子が存在する時のテスト部位の交流コンダ クタンスの変化を感知することにより、ハイブリッド化された分子を検出するこ とが出来る。或は上記に代わり、各テスト部位の２つの電極の間に通電ラインを 形成することにより、ハイブリッド化される分子の存在は、テスト部位に於ける ハイブリッド化される分子の形成に付随するＲＦ損失を測定することにより検出 することが出来る。

別の実施例に於いては、各テスト部位に微細機械加工を施された共振器が形成さ れ、共振器のハイブリッド化された分子の形成により生じる共振周波数の変化又 はＱ　（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｆａｃｔｏｒ）の変化が、何れの部位がハイブリッド 化された分子を含むかを調べる為に測定され得る。

上記に代わる本発明の光学的な実施例では、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレーが設 けられ、ＣＣＤアレーの各電極が隣接する適切なテスト部位に整合せしめられる 。ハイブリッド化された分子を持つテスト部位の照射光の吸収の増大による光の 減衰が、ハイブリッド化された分子を持つ部位を知る為に用いられる。ＣＣＤア レーは、それを用いるテスト部位アレーに一体化されることが出来る。上述の代 わりに、テスト部位アレーは別個の使い捨ての可能なプレートとすることも出来 る。

各テスト部位内でのプローブはすべて同じであるが、しかしテスト部位毎では異 なっている。ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基配列テストの為の試片は−ｇにオリゴヌクレ オチド鎖を以って形成されている。本発明の別の実施例によれば、プローブ鎖の 各々をカスタム化し又は識別できるように、各テスト部位のマイクロアレーの局 所的な感作又はオリゴヌクレオチド鎖の局所的な合成の為の光学的直接パターニ ングシステムが用いられる。

記載の発明の性格および長所は後述の明細書および添付の図面から更に理解する ことが出来る。

図面の簡単な説明 図１は、発明の好ましい実施例によるマイクロエレクトロニックセンサアレーの 部分透視図である。

図２は、図１の一部の拡大図である。

図３は、図２の電極部分の拡大図である。

図４は、図３の線ＩＶ−■Ｖに沿った断面図である。

図５Ａ−５Ｄは、テスト部位を形成する際の重要な工程を示す処理手順の断面図 である。

図６Ａ−６Ｈは、テスト部位の上記に代わる実施例を形成する際の重要な工程を 示す処理手順の断面図である。

図７は、結合されたテスト部位（曲ｍＡ）及び結合されぬテスト部位（曲線Ｂ） に与えた周波数に対して損失係数をプロットした図である。

図８は、蛇行した通電ラインを用いた上記に代わるテスト部位実施例の平面図で ある。

図９は、ｆ、からｆ２の周波数範囲を持つ印加交流入力電圧■８を用いたテスト 部位検出システムの概略図である。

図１０は、入力電圧■、に対してテスト部位の交流コンダクタンスをプロットし た図である。

図１１は、低周波数ｆ、から高周波数ｒ２に掃引される定振幅信号において時間 に対して■、をプロットした図である。

図１２は、図１１の入力端子波形に応答するテスト部位からの感知された出力電 圧■。をプロットした回である。

圀１３は、ｆ２からｆ、に下降する人力波形■、に応答するテスト部位からの感 知された　出力電圧■。をプロットした図である。

図１４は、機械的共振構造を用いて製作されたテスト部位の概略断面図である。

図１５は、ＣＣＤアレーを下に使用してテスト部位が形成されている、上記に代 わる実施例の概略断面図である。

図１６は、図１５に於ける如くテスト部位は使い捨てのプレートの中に形成され 、且つ別個のＣＣＤアレーを伴う場合の概略断面図である。

図１７は、テスト部位でのプローブの合成の為のシステムの概略図である。

図１８は、適切な場所でプローブを合成する為のマイクロ流体システムの概略図 である。

図１９は、図１８のマイクロ流体システムの概略断面図である。

図２０は、マイクロ流体ゲノセンサ実施例の概略図である。

図２１は、合成りＮＡプローブが予め定められたＤＮＡシーケンスに選択的に結 合する方法を示す概略図である。

図２２は、生物学的媒質中の分子を検出する為に用いられるテスト凹部の概略断 面図である。

図２３は、本発明の表面弾性波を用いた実施例を示す概略図である。

図２４は、発明の上記に代わるアドレス実施例の部分概略図である。

図２５Ａ−Ｄは、アレー感作の上記に代わる方法を示す一連の断面図である。

図２６Ａ−Ｄは、上記に代わるアレー感作法を示す、図２５Ａ−Ｄに於ける如き 一連の断面図である。

発明の詳細な説明 ■、システムの全容 本発明の好ましい実施例およびその長所は、各種の図面の類似および該当の部分 に対しては同じ番号の使用されている図面の図１−４および４Ａ−４Ｃを参照す ることにより理解することが出来る。

図１はＲＮＡおよびＤＮＡ塩基配列決定に関連して用いられる本発明の好ましい 実施例を示す。下記の如く本発明は細胞検出および抗体検出又はあらゆるハイブ リッド化された分子の検出に用いることも出来る。

シーケンサ１０は、Ｘ軸上の通電リードＸｉ、Ｘ２．Ｘ３−−−　ＸＮ、Ｙ軸上 の通電リードＹ１．Ｙ２．Ｙ３−−−　ＹＮにより電子的にアドレス可能なテス ト位置１２のＸ−Ｙアレーを含む、各Ｘ−ラインを連続的にアドレスする為のＸ −論理回路３６が検出およびｉ認回路４０に結合されている。類似の回路５６は Ｙ−ラインＹｌ−−−ＹＮに結合される。アレーｌ０１ＸおよびＹ論理回路３６ ．５６ならびに回路４０は、コストの兼ね合いによって単−半導体子ノプにより 実施されることが出来る。

下記に詳述されるテスト部位１２は、半導体フオトリソグラフイノクプロセノシ ング技術を用い半導体ウェハに形成される。各テスト部位は多数のプローブ２２ （図４を参照）を備えており、且つこれらは既知の分子構造（以下゛ターゲソビ と称す）に結合されることが出来る。ターゲットには、例えば、ポリヌクレオチ ド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、抗体又は抗抗体の如きバイオポリマが含まれること が出来るであろう、ＲＮＡ又はＤＮＡシーケンサの場合には、合成プローブは、 例えばオリゴヌクレオチドを含むことが出来る。特定のテスト部位でのすべての プローブは同じである。しかし、それぞれのテスト部位１２のプローブは、単一 アレ−１０の中で異なった多数のターゲット（又はターゲット分子の中のサブシ ーケンス）の同時検出の為に、ある既知のシーケンスで異なっている。

電解溶液１８中にターゲットを含む試料物質が、アレーｌＯに注がれる時に、タ ーゲットは、各テスト部位１２に形成された多数の凹部４２の中の付随のプロー ブ２２と結合する。充分な結合時間を経た後、アレー１０の表面が水洗いされる ことにより、余剰のターゲット又は他の結合されなかった分子構造が取り除かれ る。残りのターゲット構造の大部分は、特定のテスト部位１２に於いて、微細加 工を施されたアレー１０に設定されたプローブに結合する。次に、各テスト部位 １２は、論理回路３６及び５６により電子的に点検され、ターゲットが当該テス ト部位に結合したか否かが確かめられる。ターゲットを結合した、即ちハイブリ ッド化した分子を持つテスト部位は、電気的パラメータを変化させている筈であ るから、この変化がＸ及びＹリードによりテスト部位に接続された検出回路４０ により、検出されることが出来る。この樺に電子アドレス動作により、特定のタ ーゲット／プローブ結合の検出が、微細加工されたアレーｌＯの中の各テスト部 位１２に於いて果たされ、これにより洗滌後に残るターゲットの組成をめること が出来る。

ＤＮＡ塩基配列決定の例に対しては、識別回路４０は、この回路により検出され たターゲット（核酸）の組成に基づいて、図２１に関連して記載された塩基配列 分析を実施する。

注二回路４０は、例えば、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）又 はアクティブマトリクス液晶ディスプレイ（ＡＭＬＣＤ）装置をアドレスする際 に用いられる行及び列アドレス技法を用いて、トランジスタスイッチ（図示され ていない）により、テスト部位に接続されるのが望ましい。

＋１．テスト部位 テスト部位１２は、好ましくは単結晶シリコン、若しくはガラス、石英、アルミ ナ等の如き均等物であるウェハ又は基板３４上のモノリシック構造として形成さ れるのが好ましい。最初に、リードＲχ１．ＲＸ２、ＲＸ３−−−−ＲＸＮ及び ＲＹｌ、ＲＹ２．ＲＹ３−−−−ＲＹＮ　（図１に示された如き）に接続された ＸおよびＹ抵抗３２のオプション抵抗アレーが、基板３４上への適切な材質の金 属蒸着又はスパッタリングにより形成されることが出来る。リードは、成る一端 に於いて、各テスト部位の下に部位するニクロム、タングステン、又はプラチナ の如き抵抗性材料を使用した抵抗３２に、又他端では、後述されるプローブ合成 目的の為に、Ｘ−抵抗一輪理回路３８及びＹ−抵抗一輪理回路５日に夫々接続さ れる。

或は、上記の代わりに、抵抗３２は、ドーピングされたポリシリコン、又は、タ ングステン若しくはタンタル若しくはプラチナのケイ化物又は窒化物又は酸化窒 化物を、公知の技法、例えば化学蒸着（ＣＶＤ）、分子線エピタキシー（ＭＢＥ ）、金属有機ＣＶＤ　（ＭＯＣＶＤ）又は類似の半導体プロセスを用いて付着す ることにより、形成されることが出来る。

次に、図５Ａ−５０に示すように、抵抗３２並びに抵抗ＲＸ及びＲＹアドレスラ インが形成された後、厚い（約５０００人）ＳｉＯ□フィルム５０が、ＣＶＤに より層３２上に形成される。そして、５ＩｉＮｎの如きマスク材料の約５００人 の薄い層２８が次に、例えば化学蒸着（ＣＶＤ）により５ｉＯｚフイルム５０上 に形成される（図５Ａ）。

注：図５Ａ−５Ｄに於いては、単一のテスト部位１２で占められるウェハ３４の 断面が示されているに過ぎない。遥かに多くの、即ち約７百万のかかる部位が、 単一の３インチシリコンウェハ上に、公知の技術を用いて製作されテストされる ことが出来ると理解すべきである。

図５Ａの断面図に示された前駆構造は、次に処理されることにより上及び下の７ 状を示す電極構造を形成し、その一部の図３１Ｖ−ＩＶにおける断面が、図４に 詳細に示されている。

最初に、約２ミクロン幅の開口５４が５ｉｓＮ４層２８の中に、フォトリソグラ フィー及び反応性イオンエツチングにより形成される（図５Ｂ）。次に、約４０ ００人の厚みの５ｉＯｚ層５０が、緩衝処理されたＨＦの如き酸溶液を用いてエ ツチングされることにより、陥没５４″が形成される（図５Ｃ）。

次に、上および下の電極２１及び２０が、Ｔｉ２６の接着層（３００人）の連続 的な電子ビーム蒸着に続＜２０００人の接触メタライジング（Ａｕ）１６により 、それぞれ形成される。残りの５ｉ３Ｎｎフイルム２８の側面エツジは、下側の 電極２０のフィンガの幅を決める為の精密セルファライニングマスクとして使用 されることにより、上及び下の電極の間のショートの起こらぬ精密な間隔を定め ることが出来ることに、留意が必要である。従って、凹部部位は、低い印加電圧 でテストされることが出来る。また、電極は、ターゲラ［）ＮＡｌＢを持つ水性 ＤＮＡ溶液の体積に比較して、凹部中の比較的大きな容積を内存する（図４を参 照）。上下の電極間の間隔は、ターゲ７）ＤＮＡ分子の長さく又は溶液中での直 径）のオーダであることが肝要である。従って、ターゲットＤＮＡのｔ種間スペ ース中の溶液に対する比は高く、これにより、電気計測中のターゲットＤＮＡの 有無に対する感度を最大に高めることが出来る。

図３及び図５に示された電極フィンガの長さは、約１００ミクロンであり、又電 極のセントの幅は又約１００ミクロンであり、しかも各フィンガは図４に示され た如く２ミクロンの幅及び２ミクロンの間隔を持つ相互間に軍状化された設計に より、多数の周辺電極と試料体積をウェハの小さい面積の中に収めることが可能 となる。その°°試料”キャパシタンスの部位に引き込まれるリードにより生じ る寄生的キャパシタンスに対する比は、高い値を持つ。

次に、図６Ａ−６Ｆの模式的なシーケンス断面図に、テスト部位１２Ａを作る為 の上記に代わるプロセスが、関連して記載されている。注：特記されぬ限り、層 の厚みは図５Ａ−５Ｄに示された値と同じである。

Ｓ　ｉ　Ｏｘ　ＦＪ５０がＳｉ基板３４上で成長せしめられる（図６Ａ）。

ＳｉＯ□フィルムは、エツチングされることにより、２ミクロンの周期的な間隔 を互いの間に持つ２ミクロン幅の凹部５４のアレーが形成される（図６Ｂ）。フ ォトリソグラフィー及び反応性イオンエツチングが約０．５ミクロンの深さ迄使 用されることにより、凹部５４が形成される。約２０００人のポリシリコンフィ ルム５１が、例えばＣＶＤにより、５ｉ０２層５０上に形成される（図６０）、 凹部の底および表面上のフィルム５１の領域は、ポリシリコン５１の側壁を残し て、反応性イオンエツチング（図６Ｄ）により除去される。側壁は、Ｗ、Ｔｉ又 はＰｔを用いたケイ化物化により、選択的にメタライジング５１°される（図６ Ｅ）、最後に、Ｎｉ又はＡｕｔ極６１がケイ化物側壁５１°上に無電解メッキに より形成される（図６Ｆ）。図６Ｇ及び６Ｈは、夫り図６Ｅ及び６Ｆに代わる実 施例である。図６Ｇに於いてはテスト部位の底は、この場合には波形の形成によ り肌理を与えられることで表面積を増やされる；これに対し図６Ｈに於いては、 電極６１及び底壁の両方に波形が形成される。この肌理を与える表面処理により 、特定の部位の表面積が増大し、付着するプローブが多くなり従って感度が高ま る。

ＩＩＩ　、　ｉｉｉ子ハイブリッド化検出法Ａ、一般的な方法論 図１−４に記載のセンサアレー１０は、本発明によれば、各テスト部位１２に於 けるターゲラ［ｌＮＡ鎖のを無を感知する為のゲノセンサとして使用されること が出来る。

解読テストでは、多数の比較的短いオリゴヌクレオチド鎖（プローブ２２）が各 テスト部位１２に於いて成長せしめられ又設置されるが、その際ストランドの一 端は部位の一つ又は以上の表面に取り付けられる。

特定の部位に於ける全ての鎖のコード化シーケンスは判明しており、且つ同しで あるのに対し、各部位のコード化シーケンスは異なっておりアレーに於いて特有 である。未知の（ターゲット）ＤＮＡの長い鎖を含む自のコードシーケンスの一 部に対する補体を持つ位置に於いて、オリゴヌクレオチド鎖（ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ　５ｔｒａｎｄｓ　）　２２に固く結合するが、他の凹部ではか かる結合は行われない。実際には、結合の弱いターゲットのミスマンチがいくら か起こり得るが、しかし、これらは凹部を、適切なイオン濃度と温度を持つ適切 な溶液を用いてリンスすることにより、緩和されること力咄来る。従って、リン ス後には、アレーの中での多数の凹部は、有意な量の結合又はハイブリッド化さ れたＤＮＡを含み、その他は水性？８液中に当初のオリゴヌクレオチド鎖を含む に過ぎない。

凹部は、次に、各部位に於いて電極１６及び２０を用いることにより、シーケン スを電気的に調べられる。ハイブリッド化されたＤＮＡを持つ部位は、記録され る。例えば、ハイブリッド化されたＤＮＡを持たぬ部位は、かかるＤＮＡを持つ ものとは異なった電気的性質を持ち、従って記録はされない。水性溶液中のＤＮ Ａ分子の共振周波数では、溶液の複素比誘電率ε、−ε゛−ｊε”の虚数部分ε “は、ＤＮＡを持たぬ水性＋８液に対する値よりもほぼ１０から１００倍大きい 係数となり得る。下記の方法Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥは、各部位１２に於いて、ε”に 於けるこの差異を測定又は検出するように設計されている。このデータベースか ら回路４０に於けるコンピュータ゛平行処理（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）″又は パニューラルネノトワーク”アルゴリズムは、未知のＤＮＡの全コード化シーケ ンスを再構築する。

Ｂ、を置去係数テスト 図７は結合した（ハイブリッド化した）ＤＮＡ　（曲線Ｂ）及び結合せぬＤＮＡ 　（曲線Ａ）に与えた周波数の対数に対して、損失係数をプロットすることによ り、ＤＮＡが結合するか否かによって損失係数Ｄ＝ε”／ε゛が如何に相違する かを示す。注：測定された特定の試料によって図７の曲線は逆になる場合がある 。即ち曲線Ｂが、結合せぬＤＮＡを示すことがある。を置去係数に於けるこの差 異は、図１−６に於ける如く形成されたテスト部位に於いて、ハイプリント化さ れたＤＮＡの有無を知るのに用いられる。各テスト部位に於ける損失係数は、回 路４０内のＬＣＲメータの如き公知の計装により測定される。メータは、論理回 路３６及び５６を経由して各部位１２に次々と接続される。

Ｃ０交流コンダクタンステスト 同様に、ハイブリッド化したＤＮＡの有無は、各テスト部位での交流コンダクタ ンスＧＡＣ＝ε”Ａ／ｄを測定することにより検出することが出来る；ここで、 Ａは一つの電極の有効面積であり、ｄは電極間の有効距離である。特定のＤＮＡ 分子の弛緩周波数（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）では、交流コ ンダクタンスは、ＤＮＡの存在せぬ時のコンダクタンスに比較して１００倍以上 も高まる。図９は、このテストが如何に実施されるかを模式的に示している。パ ルス化された又は周波数走査された波形は、各テスト部位１２Ｂの電極２１Ｂ及 び２０Ｂの間に与えられる。プローブ２２が各電極上に形成され、ターゲット分 子の水性溶液がテスト部位１２Ｂの凹部４２Ｂの中に形成される。ハイブリッド 化したＤＮＡの存在は、図１Ｏに示された如きＤＮＡの共振周波数に於いて検出 される。個別の周波数でのＧ又はＲ＝１／Ｇを測定する為に、ＬＣＲメータを用 いることが出来る。上記に代わって、図９及び１０に関連して考察された如く、 Ｇは周波数の関数として測定されることが出来る。

Ｄ、伝送損失検出テスト 伝送ライン上の信号損失も、又ε”を感知することが出来る。各テスト部位に於 いて、Ｘ及び７５４２間に伝送ライン１１を挿入することにより、ＤＮＡの如き ハイブリッド化した分子を電気的に検出することは、各テスト部位１２Ａに於い て、ライン１１に沿って通過する電磁波のＲＦ損失をスカラー測定することによ り可能である。ライン１１は、スト’Ｊ　ｙプライン（ｓｔｒｉｐｌｉｎｅ　） 　、マイクロストリップ（ｍｉｃｒｏｓｔｒｉｐ）　、ウェーブガイド（１１ａ ｖｅｇｕｉｄｅ　）　、コブラナールウエーブガイド（ｃｏｐｌａｎａｒｗａｖ ｅｇｕｉｄｅ）　、スロットライン（ｓｌｏｔｌｉｎｅ）又はコアキシャルライ ン（ｃｏａｘｉａｌ　１ｉｎｅ）の超小型のものを含むことが出来る。この方法 での感度を最高にする為に、テスト部位の凹部４２Ａは、図４の凹部よりも幅及 び／又は長さを比較的大きくされ、且つ凹部内の伝送ラインの長さは、それを蛇 行せしめることにより最大にされる。

巳、パルス及びチャープ（Ｃｈｉｒｐ　）検出性図１１に示された如く２周波数 走査された或はチャーブされた電圧波形Ｖｉが、各テスト部位に於いて電極間に 印加され、且つ生じた応答波形■。（周波数が増大するか減少するかにより図１ ２又は図１３）が解析され、ハイブリッド化したＤＮＡ周波数でのピーク値が示 されることで、ハイブリッド化したＤＮＡの存在がめられる０周波数走査された 波型を用いたハイプリント化したＤＮＡの弛緩周波数の測定により、ハイプリン ト化したＤＮＡの性質に関する補足的な情報、例えば架橋結合したか否かを得る ことが出来る。

Ｆ、微細機構的共振器検出法 この実施例に於いては、図１４に示された如き、シリコンウェハ３４Ｃに形成さ れたテスト部位に、多数の機械的共振構造が形成される。共振構造は、ウェハの 平面内のＸ方向に延びる下側の金属センサ電極２０Ｃ５及びＹ方向に延びるタン タルの如き金属又は窒化ケイ素を用いることが好ましい上側の薄膜共振フィルム ２１を持つ。通常薄膜サイズは、直径又は幅／長さに於いて約１００ミクロンで ある。空気であることが好ましい誘電体ギャップ６０が、上下の薄膜２ＩＣと２ ０Ｃとの間に形成される。

テスト部位の凹部４２Ｃは薄膜１６Ｃ上に、又、プローブ２２Ｃは凹部の表面に 形成される。ターゲラ）ＤＮＡ溶液１８Ｃは、テスト凹部４２Ｃに供給される。

上下の電極１６Ｃおよび２０Ｃの間の機械的空洞６０が共振器を形成する。この 共振器はキロヘルツからマルチメガヘルツの範囲内で共振周波数を持ち、共振線 幅は狭い。

共振器を横切って伝播するＲＦ信号は、ライン幅の狭い特徴的な高Ｑレスポンス を生じる。Ｑ又は共振周波数への移行は、共振器表面電極薄膜２ＩＣ上にハイブ リッド化した分子が存在することを示す。

薄膜電極２ＩＣは、化学蒸着法を用い窒化ケイ素の薄膜を以って構成されること が出来るが、この場合に、シリコン対窒素の比は充分コントロールされ、且つ室 温迄冷却された時のフィルム張力を調節する為に、昇温はコントロールされるこ とが必要である。薄膜はパターン化されていないシリコンウェハ上に形成され、 次に背面からシリコンウィンドー（ｓｉｌｉｃｏｎ　ｗｉｎｄｏｗ）をエツチン グで作ることにより分離されて独立構造となる。機械的共振器の例及び上記の用 途の構造の詳細は、Ｂｕｓｅｒ　ｅｔａｌ、”　５ｉｌｉｃｏｎ　Ｐｒｅｓｓｕ ｒｅ　５ｅｎｓｏｒ　Ｂａ５ｅｄ　Ｏｎ　ａ　Ｒｅｓｏｎａｔｉｎｇ　Ｅｌｅｍ ｅｎｔ　”５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、　Ａ、　２５−２７ 　（１９９１）　７１７−７２２　及びＰｒａｂ　ｅｔ　ａｌ。

１１Ｑ−Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　５ｈｉｆｔ　ｏｆ　Ｒｅ ｓｏｎａＬｉｎｇ　５ｉｌｉｃｏｎ　Ｄｉａｐｈｒａｇｍｓｉｎ　Ａｉｒ　”　 ５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ　Ａ、　２５−２７　（１９９１ ）　６７１−６９８から知ることが出来る。

Ｈ２表面弾性波又は電磁波検出法 同様のクラスの共振アレー検出器は、例えば表面弾性波（ＳＡＷ）又は表面電磁 波に用いることで、表面波素子により構成されることが出来る。ＳＡＷ検出器の 場合には図２３に示される如く、共振構造７００は音響変換器７０２及びＳＡＷ 反射器７０４を用いて形成される。波源７０８からの走査された周波数の波Ｗは 、音響媒体７０６（出来ればニオブ酸リチウム又は石英結晶）を通して発射され る１反射器７０４は独立した空洞共振を誘発し、且つこの共振は、メータ７０に 於いて、変換器で消費された電力を計測することにより検出される。テスト部位 ７１２は、媒体上に形成される。各部位には付随の変換器及び反射器を備えるこ とが出来、或はマルチプレクサ（Ｈｌｔｉｐｌｅｘｅｒ　）が複数基板の上に形 成されることにより単独変換器を複数の部位に接続することが出来る。

ターゲット／プローブ対を結合された部位は、共振周波数を移行させる。従って 、プローブが結合している部位は検出することが可能となる。

変換器７０２は、リチウムニオベート結晶基板７０６上に蒸着された相互に７状 化したアルミニウム薄膜構造を持つことが出来る０反射器７０４は、アルミニウ ム薄膜格子の構造を持つことが出来る。これらの構造をパターン化するには、標 準のフォトリソグラフィー及び蒸着を用いることが出来る。

上記に代わり、テスト部位を通過した後のＳＡＷ波の位相は、伝送ラインの中で 基板の中に形成された基準伝送ラインに比較され、且つ結合により生じた移相が 何れの部位に結合分子があるかを判定する為に用いられる。

Ｉｖ、光学的ハイブリッド比検出法 Ａ、モノリス的に集積化されたＣＣＤイメージ／読み取り次に、図１５の概略断 面図によれば、発明の別の実施例が示されているが、しかしこれはテスト凹部の 中のハイブリッド化した分子の有無を検出する為に、モノリシックに集積化され た電荷結合素子（ＣＣＤ）センサによる光学的検出を用いる。

ＣＣＤのアレー２００は、結像機能を果たす為にシリコンウェハ２１２上の集積 回路として形成される。ＣＣＤアレー２００は、光子（ｈυ）がハイブリッド化 していないテスト部位２１８Ａ上で跳ね返る時の検出器ゲート電極２２０の下に 形成された電荷を読み取る。

光の波長（ｈυ）は、ハイブリッド化したＤＮＡの一つの既知の吸収線に合致す る如く選ばれる。方法の持つ感度は、ハイブリッド化したＤＮＡの中に選択的に 挿入される臭化エチジウムの如き吸収染料を使用することにより高まる。光は、 ハイプリント化していないテスト部位２１８Ａを通過する時には減衰度は比較的 少ないが、ハイブリッド化したテスト部位２１８Ｂでは結合分子又は染料により 減衰する。

光子は、ハイブリッド化していない壁２１８Ａの下に在る電極２２０の下のシリ コンウェファ−２１２の中に電荷２２３を誘発する。かかる電荷は、次に公知の 方法でＣＣＤアレーから読み取られ、且つ処理されることにより、ハイブリッド 化した分子を含むテスト部位が識別される図１５のＣＣＤアレーゲノセンサ２０ ０は、Ｓｉエピタキシャルウエハ／基板２１２上の５ｉ０２のフィールド酸化物 （ｆｉｅｌｃｌ　ｏｘｉｄｅ　）層２１４を成長せしめることにより形成される 。ＣＣＤゲート電極２２０は、次に酸化物２１４上で、タンタル又はタングステ ンの金属をスパッタリングすることにより形成される。窒化ケイ素又はガラス、 Ｓ　ｉ　０２又はポリイミドの如き透光材料を使用することの好ましい誘電体又 はポリマ層２１６が、次に電極の上に形成される。次に、凹部２３０が、ゲート 電極２２０の直上の層２１６に形成される。凹部は、水性溶液から被ばくするこ とによるＣＣＤ装置の劣化を防止する為に、窒化ケイ素又は酸化アルミニウムの 如き薄い保護層（図示されず）により、不活性化される。標準的なリソグラフィ ー技法により、ゲートと凹部の部位が整合させられる。

次に、水性テスト溶！２２４を使用する前に各テスト部位２１Ｂを個別化する為 に、プローブ（図示されず）が、凹部２３０の中に形成される。

別の実施例に於いてはターゲット分子は、例えば蛍光染料、放射性同位元素又は 化学発光の如き公知の標識付はメカニズムの何れかを用いて標識を与えられる。

ＣＣＤアレーは、図１５に示された如く、エピタキシャルＳｉ基板２１２、フィ ールド酸化物２１４、ＣＣＤゲート２２０、誘電体層２１６及び凹部２３０を用 いて形成される。

テス）ｉＩ域には、夫々独特なプローブ（図示されず）及び標識タグを持つター ゲットを含むテスト溶液２２４を備える。ターゲットは、蛍光性、化学発光性又 は放射性の材料によりタグを施されることが出来る。

ハイプリント化していてタグを備えたＤＮＡを含むテスト部位は放射線を発し、 且つこれは、該当のＣＣＤゲート２２０の下の領域内に電荷の集まることにより 、検出することが出来る。

標識を持つターゲットの実施例では、アルミニウムにより形成されることの出来 るフィルタ２５０又はタングステン金属ゲート又は誘電体複数層干渉フィルタが 、凹部２３０及び金属電極２２０の間の誘電体層に形成されるのが望ましい。フ ィルタ２５０は励起放射線（ｈυ）又はα、β、１粒子を遮断し、且つ２次放出 ２４０を通過せしめる構造を持つ。２次放出は、励起により刺激された電子の如 き粒子又は光である。化学発光アプローチは、化学エネルギーの電磁放射への変 換を使用する。

好ましい物質は安定化された１、２−ジオックスエタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ 　）である。他の化学発光様式とは異なり、酵素を触媒とする１、２−ジオノク スエタン誘導体は、時間単位から日数単位の期間にわたり続くことのある光線信 号を発することがある。放射される光の波長は４７７ｍｍの近傍であり、放射は ｐＨをコントロールすることによりコントロールされることが出来る。４７７ｍ ｍでは用いられるべきＣＣＤの量子効率は約１３％に過ぎない；従ってケミルミ ネッセント信号は増幅されねばならぬ場合である。増幅の方法には、水溶巨大分 子（例えば生血清アルブミン）を加えて化学発光信号を増幅する手段が含まれる 。

１．２−ジオソクスエタンを用いることに対する利点は数多い。放射線を被ばく せぬことの外に、この方法は実施が比較的簡単である（試薬および機器が高価で はない）。最後にこの方法のハックグラウンドノイズレヘルは低く、且つ可動範 囲は広い。

上記に代わる図１６に示された如き２ピ一ス方式に於いては、プローブ部位アレ ー２００′は、例えば１０ミルの厚みのパイレンクスプレート２７０の如き別個 の薄い透明基板上に形成されている。この別個のプレートには、別個のプローブ プレートを別個のＣＣＤアレー２６０上に自動的に正確に重ねることを可能にす る為に、エツチング又はプリントされた格子（図示されていない）の如き精密な 位置合わせ機能をマーキングされる。プローブプレートの各アレ一部位は、それ ぞれに特定のプローブにより増悪される。ＣＣＤアレーは、次に図１５のブロッ キングフィルタ２５０を用い又は用いることなく製作される。成る実施例に於い てはＣＣＤ上にプレートの像を形成する為のレンズを用いることなしに、ＣＣＤ アレー上の見当合わせされた近接部位にプローブプレートをセットすることによ り、分析が行われる。プレートの照射は、図１５に関連する上記に於いて考察さ れた実施例の何れの場合とも同様である。

別の代案方式は、別個のプローブプレート２００　“をレンズを用いて、ＣＣＤ アレー２６０上に像を結ばせるものである。この方法によれば、２次蛍光が用い られる場合に対しては、プレートとＣＣＤアレーとの間の切り離しを大きくされ ることが可能であり、又プローブプレートを斜めに励起することにより、励起と 蛍光の分離も可能となる。画像形成時の拡大又は縮小が可能である為に、プロー ブプレート寸法はＣＣＤとは別個に最適化されることが出来る。

これらの形状の何れに対しても、プローブアレーのモニターに用いられるＣＣＤ 装置は従来のタイプで、且つ紫外線及び可視スペクトラムに対して感度を発揮す るものであり得る。上記に代わるアプローチは、ケイ化プラチナ又はケイ化イリ ジウム赤外イメージヤ−（ｉｍａｇｅｒ）の如き赤外感熱アレー検出器を使用す ることである。後者を用いる方法によれば、ハイブリッド化又は抗体反応の如き 生化学反応中のプローブアレーから発せられる熱を直接モニターすることが可能 である。ＤＮＡのハイブリッド化及び他の発熱反応は、反応中の熱特性により直 接検出することが可能である。物体（例えばハイブリッド化したＤＮＡ）の赤外 伝達および反射の性質は、物体の分子の赤外線作用による振動及び回転モードに 起因する新たな吸収性を持つ新しい分子の結合体の形成のもたらす反応体とは明 確に識別される。図１５及び１６の構造では、熱的性質は従来の可視波長又は赤 外線検出装置アレーの中の熱により発生するノイズからもモニタリングが可能で ある。この場合には、生化学反応により生じた熱は薄い構造体の層を通る伝熱作 用により伝えられ、且つ電極２２の上のノイズバースト（ｎｏｉｓｅ　ｂｕｒｓ ｔ　）として１足えられる。アレーは又、図１５の構造に於いて赤外線、可視光 線又は紫外線をフラッド照射される（ｆ　Ｉｏｏｄ−１ｒｒａｄｉａ　ｔｅｄ　 ）ことも出来る。この場合に、光は、物体の状態（例えばハイブリッド化したＤ ＮＡ）の持つ吸収帯域内に於いて特定的に選ばれる。非反応状態では、フラッド 照射は凹部を通して伝達され、且つフィルター２５０により反射される。必要な 反応の生じた凹部は、フラッド照射波長に於いて吸収性を持つことになる。吸収 の行われた後に、フラッド照射は自動的に熱に変換し、且つ反応凹部部位の下の 装置の中に伝えられた後に検出される。

■、プローブの形成 Ａ、一般事項 アレー１０を形成する一つの方法は、アレーの中のテスト部位１２に付着するプ ローブを用いる。希望のターゲットのタイプにより、テスト部位１２に各種のプ ローブを付着させることが出来る。オリゴヌクレオチド、単−若しくは二重鎖の ＤＮＡ又はＲＮＡ、抗体又は抗原−抗体複合体、腫瘍細胞又はこの分野の熟練者 により知られている他のテストプローブを使用することが出来る６１０−ブは、 テスト部位に、凹部４２の表面上の固体支持基板に固定されることによりテスト 部位に取り付けられるか、又は、図４に於ける如く、電極１６又は２０に直接取 り付けられる。凹部４２の表面を形成するのに用いられることの出来る固体支持 基板は、ガラス、ポリスチレン、ポリイミド、二酸化ケイ素および窒化ケイ素の 如き有機又は無機の基板を含む。

固体支持基板は、選ばれたプローブとの間に共有リンケージ（ｃｏｖａｌｅｎｔ 　ｌｉｎｋａｇｅｓ　）を形成させることの出来る表面化学性能を作り出す機能 を与えられねばならない。−例を挙げれば、ガラス支持体はエボキシンランとの 反応を通してエポキシ基による機能を与えられることが出来る。支持体上のエポ キシ基は５°−アミノ−誘導体化されたオリゴヌクレオチドプローブと反応する ことにより、本明細書に参照されているＰａｒｋａｍ及びＬｏｕｄｏｎ、　ＢＢ ＲＣＩ　：　１　６　（１９７８）に記載された如き２次アミンリンケージを形 成する。この共有リンケージの形成により、プローブ２６は希望のアレーの中の 支持面に付着する。機能化されたポリスチレン表面の例には、Ｋｒｅｍｓｋｙ、 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：　 ２８９１−２９０９に記載された如き、ヒドラジドにより活性化されたポリスチ レンに接合された５°アルデヒドまたはカルボン酸誘導体、並びにＬｕｎｄ、　 ｅｔ　ａｔ、　（１９８８）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　＋６　；　 １０８６１−１０８８０に記載されているが如き、ノアゾ化により活性化された ポリスチレンに接合された５゛アミノ誘導、およびアミノ−機能化されたポリス チレンに接合された５゛燐酸塩誘導体がある。但し上記の文献は参照されること によりこの文献の一部を構成するものである。

プローブを電極に直接取り付けるには、電極表面が、プローブとの結合を形成す ることの　出来る材料を用いて製作されねばならない、プローブを直接取り付け ることを可能にする為に、電極の表面に使用することの出来る材料には、金、酸 化ニオブ、酸化イリジウム、プラチナ、チタン、タンタル、タングステンおよび 他の金属の如き導電性金属材料が含まれる。これらの導電金属は、Ｗｈｉｔｅｓ ｉｄａｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｌａｎｇｍｉｕｒ６：８７−９６およ び）ｌｉｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｊ、　Ａ＋＋、　Ｃｈｅｗ 、　Ｓｏｃ、　１１３：１１２８−１１３２に記載されているが如きプローブに 用いられている有機チオール基とのリンケージにより、プレート面上に直接安定 した結合部を形成すること力咄来る。但し、上記の文献は参照されることにより この明細書の一部を構成するものである。−例として５゛端又は３゛端にチオー ル基による標識を持つ合成りＮＡプローブは、プレートの中で金の如き金属と安 定した結合を形成することにより、直接取り付けられたプローブのアレーを作り 出す。

（以下余白） Ｂ、アレーの感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　）各テスト部位のプローブは 、既知の分子又は細胞ターゲットに対して特定的に結合することが出来ねばなら ない。プローブはチップ外で形成（合成）され、且つ各テスト部位へマイクロピ ペット（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅｓ）のロボント操作により挿入することが出 来る。この実施例では、プローブは、テスト部位の金、５ｉＣ）ｚ又は他の材料 に上述の如き化学的リンク機能によりリンクされる。この方法は低密度プローブ アレー（センナ当り約１００未満）を作るのには充分である。

上記に代わる方法として、プローブは各テスト部位に於いて合成されることが出 来る。この方法は、試片合成の鍵を握る段階が温度に依存する事実を利用するも のである。部位を選択する形で表面の温度を高めることにより、プローブは化学 的にアレー内の特定のテスト部位に導くことが出来る。このアプローチは、図１ ７の部分概略図に示されている。

この実施例の例として、テスト部位４１２のアレー４００が、以前に図１−４に 示された如く形成される。このアプローチの実施例に於いて、プローブは利用し 得る５ｉＣｈ表面上で合成される。プローブの合成を始めるには、リンカ（Ｉｉ ｎｋｅｒ）が最初に表面に取り付けられる。リンカの取り付けには、テスト部位 はエポキシ７ラント（ｅｐｏｘｙｓｉｌａｎｔ　）　（液Ａ）に浸漬されるが、 この液はエポキシを表面に共有的にリンクする。エポキシは次に加水分解され、 更に塩化トリチルでブロックされる（ｂｌｏｃｋｅｄ　）ことにより、利用可能 な一次水酸基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ　）を保護するプローブ合成を始める為にアレ ーは、次に、保護剤を除去する溶液、通常ジクロロアセテートをアルコールで希 釈したものの中に浸漬される、レーザ４１６から発射されるレーザビーム４１４ が、次に、アレーを横切る形でガルバノメータ走査システム４１８により機械的 に走査される。レーザの目的は、選ばれたテスト部位での表面を加熱することに 在る。ビームの作用は、保護機能を解除することの必要なテスト部位４１２のみ を照射する如くプログラミングされている論理およびスイッチング回路４２０に よりコントロールされる。照射後保護除去剤が取り除かれることにより、照射さ れた部位にはＯＨ基が露出する。自由ＯＨ基を持つテスト部位は、核酸塩基を加 えるのに用いることが出来るようになる。

ＤＮＡプローブ合成はこの時アレー上で行うことが出来る。この為にはフォスフ オールアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　）　、フォスフオトリエ ステ）Ｌｔ　（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ　）又はハイドロジエンフオス フオネート（ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｈｏｓρｈｏｎａ　ｔｅ　）法の如き既知の 化学法が何れも利用可能である。チップは活性化され、ベースを備えた前駆体の 一つ、例えばアデノシン（Ａ）を含む溶液に浸漬され、且つこれにより、先行の ステ・ノブで照射されたテスト部位はＡにリンクされる。

オリゴヌクレオチド合成に一般に用いられた如き標準リン酸ジエステル法によれ ば、チップは保護剤除去剤に再浸漬され、次に再び照射される。例えばグアノシ ン（Ｇ）が付着すべきテスト部位が照射されると仮定する。照射後に活性化した Ｇが加わり第２フオスフオシエステル結合の合成プロセスが反復される。

既定のサイクルが、次にチミジンに対し、次にシトシンに対して、チップ上で行 われる。上記を総合すれば核酸塩基は４つ存在する為にプローブアレーを１核酸 サブユニツトだけ延長するには、４サイクルの照射が必要となる。１０ヘースの 長さのプローブのアレーを合成するには４０サイクルが必要となる。

レーザによる反応の開始は、局所的な加熱又は光化学により起きる。

光化学的合成を開始する為に、好ましい実施例は、可視波長又はＵ■アルゴンイ オンレーザとガルバノメータ走査システムの組み合わせを使用する。合成反応は 温度に対して著しく敏感であることが知られているから、上記に代わる案として 、アルゴンレーザ又は赤外レーザを使用することにより、アレ一部位の局所加熱 法による合成を開始することが出来上記の方法は、熱を利用してアドレスするこ との出来る保護剤除去の原理に基づき、固体サポート上のペプチド又は他のポリ マープローブの合成にも用いること力咄来る。例えば、ペプチド合成の場合には 選択された部位でのペプチド合成は通常希釈されたベース（ｂａｓｅ）でのｆ− ｍｏｃ保３１Ｍを熱により除去し、次にキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ　）およ びペプチド合成の通常の他の工程を用いて実施される。

上記の代わり、“接着剤”層がテスト部位に対し走査されたレーザ照射により局 所的に活性化され（図２６Ａ−Ｄ）（又は活性を停止され）、又は局所的に施さ れる（図２５Ａ−Ｄ）。この実施例に於いては、希望のアレーの部位の接着性を 光化学的又は熱的に変化させる為に、紫外線、可視光線又は赤外レーザが用いら れる。例えば、タイプＡのプローブ溶液は、アレー上で洗滌されることにより、 希望の部位でのタイプＡの試片の局所的な接着が実現される。タイプＡプローブ 溶液は、次に、システムからや速に洗い流され、新たなアレ一部位に第２のレー ザ照射が施され、且つタイプＢプローブ溶液がタイプＢプローブを接着する為に 用いられる。このプロセスは、アレー全体を感作する為に反復されるアレーの感 作は、ガルバノメータ若しくは回転ミラーの如き走査光学装置、又はコンピュー タコントロールされたＸ−Ｙステージを持つ固定レーザビームを用いる、ＣＷア ルゴンイオン又はＣＷ　Ｎｄ：ＹＡＧレーザを利用することにより実施されるこ とが出来る。゛接着剤”層での活性化又は活性停止は、パルス化Ｎｄ：ＹＡＧレ ーザ又はエフシマーレーザの如き短パルス化されたレーザを用いて実施されるの が望ましい。

°“保護除去”の為に単純に“接着剤”層９０２をカバーし、次に“接着剤”の 上に施された不活性化された材料９０４を剥離することにより、°“接着剤゛を 露出せしめるのは優れたアプローチである（図２６Ａ−Ｄを参照）、゛°接着剤 ”層の例は、エポキシ、チオール又は親水性の、例えば水和された表面である。

不活性化材料は、フッ素を端末に持つフル才力−ボン又は誘導体又はへキサメチ ルジシリザン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌｉｚａｎｅ）の如き疎水性の材 料を用いることが出来る。

図２５Ａ−Ｄおよび２６Ａ−Ｄは、゛接着剤”アプローチを用いたプローブ形成 の２つの代案を示している。更にその各々は、テスト部位を活性化するのに２つ の選択可能な方法を示す。一つの方法は、テスト部位のＦに埋め込まれたヒータ ーエレメント９０６の如きプログラム可能なエレメントを使用することによりテ スト部位に熱反応を誘発し、これによりプローブが接着すべき接着剤層９２０を 作り又はデポジットする。完全に合成されたプローブ９１２は部位の上で洗滌さ れ、且つ露出した接着剤層部位９２０に接着する１図２５Ｄ０次の別の部位が形 成されるか又は露出せしめられ、且つ別のプローブが付着する。上記に代わり、 図２５Ｂに於けるが如き外部照射が接着剤層を形成するのに用いられ；或は図２ ６Ｂ及びＣに於けるが如く不活性化層９０４を剥離し、且つ接着剤層９０２を露 出せしめる為にも外部照射が用いられる。

走査されたレーザビームの使用に加え、上記に代わる“直接パターニング法が、 レーザ又は強力ランプにより照射されるスイッチングの可能な、ミラーアレー又 は液晶ディスプレイの如き、再構築可能な（ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｂｌｅ）　 ”光弁″４１５（図１７の点線により示された）を持つ定常照明ビームを用いて 、実施することが出来る。照明された“光弁″は、センサーアレー４００上にレ ンズシステム（図示されず）により結像される。゛光弁”に於けるビクセルエレ メント（ｐｉｘｅｌ　ｅｌｅ＋ｗｅｎｔｓ）は、電子的にスイッチオン又はスイ ッチオフされることにより、センサアレーの中で感作されるべき領域を選ぶこと が出来る。この目的の為の優れた“光弁１装置はＪ、　Ａ、　Ｎｅｆｆ　ｅｔ　 ａｌ、により発表されている（Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＥＥＥ、　Ｖｏｌ 、　７８．　Ｎｏ、５．　Ｍａｙ　１９９０）。

プローブのチップ上での合成の為の別のアプローチは７参照されることによりこ の明細書の一部を構成する１９９０年１２月１３日のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏ口ａ １Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｄａｔｅを持つＡｆｆｙｍａｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ４こ譲渡されたＰｉｒｒｕｎｇｅｔ　ａｌ、による、”Ｖｅｒｙ　Ｌａ ｒｇｅ　５ｃａｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ”の標題を持つＰＣＴ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ ｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＷＯ９０／１５０７０　＆こ記載されている。このアプ ローチは、部位や表面での熱化学反応よりも、レーザによる保護基の光化学反応 に基づくものである。

プローブ鎖を合成する為の別の方法は、隣接部位を余り加熱することなく予め定 められたアレーテスト部位を局所的に加熱する為に、図１及び４に関連して記載 されている埋め込み抵抗３２を用いる。この方法によれば、選ばれた抵抗の間の 電圧の印加に応じて、短いオリゴヌクレオチド鎖の如きプローブの熱により誘発 される合成がその場所で行われる、上記に代わり、反応が必要な凹部に隣接する ものを除き、全ての抵抗に大電流が流されることが出来る。この方法では、非合 成凹部は希望の合成温度以上の温度に保たれ、これによりこれらの凹部で合成反 応の起きることが阻止される。

発明の電気的にアドレスすることの可能なテスト部位アレーは、特定の凹部又は ウェルの行又は列の電極に電圧を印加することにより、この凹部の中で合成反応 を電子的に誘発し又は触媒作用を働かせることが可能となる。

電圧は、凹部の近傍に在る溶液から化学反応物を引き出し及び／又は凹部の中の 特定の化学反応に対して触媒作用を働かせる為に使用されることが出来る。

更に、ターゲット分子構造と完成したプローブとの間のノ＼イブリ、７ト化は、 ターゲット溶液がテスト部位に施された直後の電極への電圧の印加により、増加 されることが出来る。電圧の印加なしでは、ターゲ・ント分子構造は溶液を通っ てプローブ迄拡散せねばならなし）。かかる拡散フ。

ロセスの非効率性の故に、有意なハイプリント化を起こすには１．５から２時間 を必要とするが、この時でもノ＼イブリッド化せぬプローブ形成よ可成りの数に のぼる。電圧は、電荷を持つターゲ・ノド構造を電極の傍の又は電極に付着した プローブに迄直接用き付けること力咄来、この結果、ハイブリッド化の率、及び 特定の実験に於いて都合よく作り出すことの出来るターゲット／プローブハイブ リッド化の総数は増加することになる。その後、ハイブリッド化せぬターゲット 分子およびミスマツチターゲット分子の洗滌（除去）には、逆バイアスをかけら れた電圧を印加することが出来る。この技法は、各テスト部位に電極を備えてい る図１から９の電子ゲノセンサに適用し得るのみならず、各テスト部位の中若し くは下に在る電極を用いるか又はこの目的で各テスト部位は一つ若しくは２つ以 上の追加電極を製作することにより、微小機械的な共振器およびＣＣＤをベース とするアプローチの両者も用いることが可能である。

上記の代わりに、個別の凹部に印加される電圧により、最後に記載の上記の方法 と同様に、“接着剤１層又は接着剤不活性化層を蒸発させるに充分な電流サージ がウェル構造を通過させられることが出来る。アレーの感作は、電気ヒユーズの アレーの電子プログラミングに位ている。

次に、図１８及び１９に従って、テスト部位に於いて、独特のゲノセンサブロー プをその場所で合成する為の微小流体システムが記載される。この実施例に於い ては、試薬給源３５２はチャネルＬＬ、Ｌ２−−−−ＬＮを介して、適切な基板 ３４１に形成された該当のマイクロチャネルバルブＶ　１．Ｖ２−−−−　ＶＮ に個別に流体的に接合される。バルブｖ１−ＶＮは、溶液がマニホールドライン Ｌ４に流れることを可能にする。

微小流体ぜん動ポンプＰ１は、溶液を窒化ケイ素又は二酸化ケイ素の如きレーザ 放射透過フィルム３４４及び３４３に包まれているアレー１０”に送り込む。

レーザ４１６°からの放射は、上述の走査又は結像法に従って、基板３４１の中 に形成される個別のテスト部位１２′に選択的に集中せしめられる。テスト部位 のレーザ走査は、入力溶液がバルブＶ　１−ＶＮを用いて迅速に切り替えられる 時に、個別の部位の局所的な活性化を誘発する。

流体システム全体及びアレーは、半導体の単一チノブ又はＳｉ、ガラス、Ａ　Ｉ 　ｔ　Ｃｈ等の誘電体材料上に形成されることが出来る。チャネル３４２は、基 板３４１の中に、従来のフォトリソグラフィー及びエンチング液を用い、又は微 細機械加工技術により、エツチングされる。テスト部位１２’のアレー１０”は 、図１−６に関連して記載された如く基板の中に形成される。

図１９に示された微小流体フローシステムは、下記の如く形成されること力咄来 る。フォトレジスト材料が、例えばパイレックスガラスを以って構成された基板 ３４１上に、スピンコードされる。＠小チャネル構造は、次に、フォトレジスト の中に標準的なフオソリトグラフイーを用いてパターン化され、且つチャネル構 造３４３及び３４２を含むパターンは、緩衝されたＨＦを用いたエツチングによ り基板の中に移される。

チタン酸ジルコン酸鉛の如き圧電物質又はＰＶＤＦポリマ、及び金属電極から成 ることの望ましい薄膜アクチュエータ層３４４が、次に微小チャネル構造に結合 される。感作中にアレー１０″は、出来ればエラストマー０−リング３４５を用 いて微小流体システムに対してシールされる。この分野のスペシャリストには知 られている往復運動する薄膜アクチュエータ層は、圧電物質の代わりに形状記憶 金属を使用するか又は静電的に変形した不動態材料、例えば電極（図示されず） に印加されたＤＣ電圧により偏向したアルミニウムフィルムをベースとして形成 される。

フローチャネル構造の量産は、上記のフォトリソグラフィー法を用いることによ り可能である。成る種のチャネル形状に対しては、塩素雰囲気中でのノリコンの エツチング用に開発された如きレーザ微細機械加工法を用いることが可能である 。フォトリソグラフィー又は微細機械加工の何れかを用い雌型のモールドを作る ことが可能であり、且つこれから例えば熱圧着法により雄型が型取られる。

Ｖｌ、　＠小塊体分子検出 上記に考察されるアレーは、質量並列型板（ｍａｓｓｉνｅｌｙ　ｐａｒａｌｌ ｅｌｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）の原理で機能する。成る代案的アプローチが図２０ に示される。このシステムは、ナノリットル又はピコリットル溶液量を以って作 動する拘束の直列的な微小流体検出器である。このシステムは、微細加工された 毛細管チャネルのシステム、主チャネルＣ１に接続されたバルブＶｌ−ＶＮ＋３ 、及び上述の如く形成された単列（又は数列の）高域度検出アレー４８０から成 る。未知の分子を含む溶液の定常的であるが低流量の流れが、図１８及び１９に 関して上述された方法を用いて混合される。未知の溶液は、流体の流れの中の給 源５ｌ−３Ｎ＋３からの既知の独特のオリゴヌクレオチド鎖のハツチ（ｂａｔｃ ｈｅｓ　）を含む溶液と同様に小量で、連続的に混合される。検出器４８０は、 流れを監視することにより、何れのオリゴヌクレオチドハツチがハイブリッド化 反応に於ける未知の分子と反応したかを調べる。ハイプリント化は、溶液が検出 器の前を流れる時に、溶液の電気的又は光学的な性質に於ける特性の移行又は識 別の可能なスペクトル特性を観察することにより、電気的又は光学的に上述の如 く検出されることが出来る。図２０．１８及び１９のこのシステムの重要な特徴 は、パンチが拡散により誘発されるスミアリング（ｓｍｅａｒｉｎｇ）を生しる ことなく流れ−を連続的に処理することを可能にする、無効流量が極めて小さく 流体の流れの速い広汎なチャネル又は毛細管ネットワークが使用されることであ る。この構想は、大型のチューブとバルブを使用する際には非実用的であり、従 ってかかるネットワークを最小化することが好ましい。最近の実験に於いて、我 々は図１９に関連する上記の方法を用い、シリコン中に１から１０μｍ径のフロ ーチャネルのレーザによる微小化学ミリング（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｉ ｌｌｉｎｇ　）の可能性を実証した。Ｓｉウェハ上に存在する微小機械加工され たネットワークの廉価な型取りは、射出成型又はエンボス加工により果たされる ことが出来よう。バルブは一体化された電気アクチュエータを必要とするが、こ れは装置上の又は装置外のマイクロプロセッサによりスイッチングされることが 出来る。

Ｖｌｌ　、プローブ結合メカニズム 合成りＮＡプローブを使用するシーケンシングの為の結合メカニズムの模式的図 解が、図２１に示されている。ハイブリッド化によるンーケンシング（ＳｂＨ） は、ＤＮＡから成る窒素性の塩基を解読する確認機構を提供する為の、自然塩基 対合特性を開発する新しいシーケンシングアプローチである。図２１には、ＤＮ Ａ試料の部分塩基配列８０２が右に示されている。試料ＤＮＡに於ける４つのベ ース８０４は、表面に付着する短い合成りＮＡ片８０６を用いて特定的に配合さ れる。サポートに結合しているＤＮＡ“プロープパは、試料“ターゲソビＤＮＡ ８０２の完全に補完的な塩基配列の出現に対する確認エレメントとして作用する 。

ＤＮＡ試料試料ターヒント基配列を解読する為に、大型のＤＮＡプローブの七ノ ドを使用する構想が下記に説明されている０例ＩはＤＮＡ試料の塩基配列の一部 を示し、且つこれは分析の前に加熱することにより、−末鎖の形に変換されてい る。特定のプローブ長さく例えば、６５゜５３６すべての８−塩基プローブ）に 対するあらゆる可能な塩基配列をあられす−セノトの合成りＮＡプローブに試料 ＤＮＡを露出せしめ、次に何れのプローブがターゲットＤＮＡに特定的に結合し たかを検出することにより、ＤＮＡ試料に含まれるオリゴヌクレオチド配列の完 全リストを作ることが出来る。例Ｉ＋（下記）に示されたケースでは、リストさ れた８ｍｅ　ｒプローブのみが、試料ＤＮＡ配列に従ってハイブリッド化する。

次に、オリゴヌクレオチドの内容からターゲットＤＮＡの完全な配列を作り出す のに、オーハーラソピングアルゴリズムが用いられる。

（以下余白） ［例１］ 未知の一本鎖ＤＮＡ　（ターゲソ日 ＡＴＣＧＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＴＣ ［例Ｉ＋］ ハイブリッド化した合成遺伝プローブ Ｔ　Ａ　Ｇ’ＣＧ　Ａ　Ａ　Ｔ ＡＧＣＧＡＡＴＧ ＧＣＧＡＡＴＧＣ ＣＧＡＡＴＧＣＣ ＧＡＡＴＧＣＣＡ ＡＡＴＧＣＣＡＴ ＡＴＣ，ＣＣＡＴＴ ＴＧＣＣＡＴＴＡ ＧＣＧＡＴＴＡＣ Ｖｌｌ＋、応用法 ＤＮＡおよびＲＮＡ検出に関する本発明の商用的利用には、遺伝研究、遺伝およ び感染症の診断、毒物テスト、個体の識別、農業上の識別、増殖の最適化、汚染 物の検出による品質保証並びに突然変異の検出による職場での危険性のスクリー ニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　）が含まれる。

現在ヒトには４．０００から５．０００の遺伝疾患があると推定され、且つこれ らの場合には、遺伝子に於ける突然変異性の変化が遺伝子生成物を破壊又は阻止 することにより、重大な医学的な状態に到らしめている。影響を蒙る遺伝子およ び蛋白質（遺伝子の生成物）は、今のところヒトの遺伝疾患の一部に対して確認 されているに過ぎないが、その数は着実に増えつつある。突然変異が疾患に付随 していることが確認されたヒト遺伝疾患の幾つかの例には、膵嚢胞性繊維症、フ エニールケトン尿症、アルツハイマー症、癌、デュシェーヌ筋ジストロフィー及 び家族性高コレステロール血症が含まれる。成る症例において、疾患には一つ又 は極めて僅かな特定の突然変異が関係するが、全部でなくとも多くの遺伝疾患は 、影響を蒙った遺伝子に関連して出現する多数の突然変異のすべてに起因してい ることが明らかになりつつある。前者の場合には、欠陥のある遺伝子の存在が、 単純なりＮＡハイブリッド化検出テストの使用により検出されることが可能であ り、このテストでは、合成りＮＡプローブは、ワイルドタイプ（ｗｉｌｄ　ｔｙ ｐｅ　）及び突然変異性のＤＮＡシーケンスを識別する為に用いられる。後者の ケースでは、疾患に付随することのある突然変異に対する全ての遺伝子を調査す る為に、ＤＮＡシーケシングは大きな負担となる。

疾患に関連する遺伝子内の突然変異を検出することの重要性は、劣性遺伝疾患の キャリアをスクリーニングすることによって遺伝的カウンセリングや子供を作る べきでないことの告知ができるようになること及び治療的措置を可能にすること のある出生前診断を行う為の手段の両者に在る。オリゴヌクレオチドプローブを 適切に選択することにより、シーケンサ１０は、ターゲット遺伝子内のすべての 突然変異を迅速に検出する新しいターゲット遺伝子ＤＮＡシーケング手順に到ら しめることにより、遺伝疾患の診断及び特に各種の突然変異が欠陥を生せしめる ことのある時のキャリアの特定を容易にする。多分より重要であるのは、成るタ ーゲット遺伝子内の何れの突然変異が成る疾色に実際に関与しているか、及び何 れの突然変異が無害の多形現象を示すか、を発見することを目的とした集団検診 に役立つことを保障し得る迅速で高能率な手順である。この情報は、突然発生す る変異および治療法の開発を容易にする、価値ある構造−機能の関係の特定の探 知の為のテクノロジーの簡単化に役立つことが期待される。

本発明は遺伝疾患に限定されることはない；この発明は、感染病源体の迅速かつ 高能率の識別に対して使用されることが出来る。ウィルス又は微生物の各種又は 株は、アレー１０の中でのバイブリフト化の独特の診断パターンをもたらすこと が予測されている。

上述の遺伝子をターゲットとする突然変異の検出は、環境研究上、例えば細胞が 化学物質を慢性的に被ばくすることにより誘発する突然変異の検出の為の重要な 用途を持つ。同様に、本発明は、職場に於いて化学物質又は放射線を被ばくする ことのある従業員の個人毎の検査に用いられることが出来る（例えば循環リンパ 球集団の中の突然変異に対する定期スクリーニングによる）。このテクノロジー の重要な用途は、特定の遺伝子の大規模な及びポイント的な突然変異の特性化に より、突然変異誘発性の危険の予測的モデル、例えばヒポキサンチン−グアニン −ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎ ｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　）　（ＨＰ ＲＴ）に対するものを開発することである。

高密度アレーは、ゲノムシーケンシングに於ける多数の用途を見い出し、且つヒ トゲノムに於ける３０億の塩基対のすべての配列を決定する現在のヒユーマンゲ ノムプロジェクト（ＨＣ；Ｐ）の作業に於いて、重要な役割を果たすと考えられ る。しかし、より重要なことは迅速で高能率のシーケシングテクノロジーが利用 し得ることにより生じる、新たなヒユーマンゲノムプロジェクトである。多数の 個人から得られたヒトゲノムの反復的ＤＮＡシーケンス分析を実施する必要性は 、複合多重遺伝子疾患状態（ｃｏｍｐｌｅｘ　ｎ＋ｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ　ｄｉｓ ｅａｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　）及び他の遺伝傾向を特性化する為に存在す ることになる。この作業は、現在のＨＯＰが完了した後も長く続き、バイオメデ ィカルサイエンスに革命的な進歩をもたらすことになろう。

本発明のもう一つの有望視される用途は、”　Ｄ　Ｎ　Ａの分！’Ｉ　（ｔｙｐ ｉｎｇ）”であり、この場合には１個人間のＤＮＡシーケンスの間の差異が分析 される。成る人のＤＮＡに於ける大量の多形性のマーカを同時にスクリーニング する為の本発明のシーケンサは、時間と労作を要する現在のｒｅｓｔｒｉｃｔｉ ｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＲＦ　 Ｌ　Ｐ　）分析技術に比して大きな利点を持つ。ＤＮＡ分類は犯罪科学及び実父 確定検査に於いて重要な役割を果たすことがある。更に兵役中のすべての人々を ＤＮＡ分類することに関心がある。

価値ある新しい植物および家畜が遺伝子のエンジニアリングにより開発されるの で、農業上の産物の供給源および所有権を確認する為に、ＤＮＡ分類する必要性 が生まれるであろう。ヒト、植物及び動物に於けるゲノムシーケンシングから得 られるシーケンス情報は、医薬品を開発し、且つ改善された穀物および家畜を創 り出す為の遺伝子エンジニアリング技術の応用を増やすことになる。例には、疾 病および苛酷な気候に対する耐性のより高い株、並びに大きな収量又は高い栄養 価を持つ穀物が含まれる。

本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡ以外の分子構造、例えば細胞及び抗体の如きターゲ ットの検出に関連して使用されることが出来る。表ＩＩ＋は、ターゲットとして 使用される他の分子構造に対する使用可能なプローブのタイプを示す。但し、記 載のプローブタイプに限定されることを意味するものではない。

プローブタイプ 叉ユアユ上　１０−ブ ＤＮＡ、ＲＮＡ　オリゴヌクレオチド 抗体　抗源（ペプチド）、抗抗体 細胞　抗体、蛋白 ホルモンレセプター　ホルモン Ａｖｉｄｅｎ　ビオチン 免疫グロブリン　プロティンＡ 酵素　酵素ファクタ（［：１ｚｙｓｅ　Ｆａｃｔｏｒ　）レクチン　特定の炭水 化物 検出装置がプローブとしてペプチド又は他の抗源を用いる時には、図２２に示さ れた如き生物体液中の抗体を検出することが利用可能であるこの実施例に於いて は、ペプチド抗ａ（プローブ２２）は、一端にシランを、又、多端にエポキシ又 は他のペプチド特有の基を持つものの如き双機能クロスリンカ（ｂｉｆｕｎｃｔ ｉｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、テスト凹部１２Ａ（図６Ｈに 示された如きものに類偵の）の底に於いて５ｉＣｈ５０に付着せしめられる。

処理された表面は、次に、抗体を含む液１８を用いて装置される（ターゲットＴ ）。抗体は巨大分子（クラスにより１５０，０００から９５０，０００分子量） である為に、結果的に得られるターゲット／プローブ結合はテスト凹部１２Ａの 誘電率に大きな変化をもたらす。効果の大きさは、ターゲット抗体に特定の第２ 抗体を用いてターゲット／プローブ複合体を処理することにより、追加的に増幅 されることが出来、これにより非常に大きな複合体を作り出すことが出来る。

抗体／抗源および抗体量相互作用の親和性並びに選択性は公知であり、且つ既存 のクラスのバイオテクノロジーに対する基礎である（ＥＬＩＳＡ分析法、免疫組 織化学及びその他）。この明細書に記載されたテクノロジーは、新しいマイクロ エレクトロニック検出方式に於ける公知の結合相互作用を用いる。

上記の方法の商用的用途は、血液試料又は他の生物体液中に於いて、何百何千の 異なった抗体又は他の蛋白の存在を同時に検出するものである。これは、血液型 の決定、エイズの如きウィルス感染の検出、又は癌の診断に特に作用である。こ れは又、研究用の手段として極めてを用である。これは、ＥＬＩＳＡ分析法及び 抗体／抗源の相互作用を検出する為の他の生化学的方法に代わり又はその用途を 拡大する。

検出器がプローブとしてペプチド、抗体又は細胞に結合する他の分子を用いる時 には、検出器は、生物体液中の特定の細胞のタイプを検出するのに用いることが 出来る。

この実施例に於いては、プローブ２２は抗体、蛋白又は脂肪表面に結合すること の知られている他の分子を用いる。この場合のターゲットＴは、プローブ２２を 用いた結合の為のレセプターＴを持つ無傷の細胞である。

細胞を含む流体溶液が検出器に加えられる。ターゲ・ノド／プローブ結合相互作 用の後に、結合により細胞に接合された検出器凹部が出現する、細胞は電流を通 すことはなく低周波誘電性の緩和（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ）を示すので、細胞の結合は凹部の中の絶対導電性（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｃｏｎ ｄｕｃｔｉｏｎ）に於ける変化（Ｃｏｕｌｔｅｒの原理の変形）によるか又は低 周波誘電性の緩和効果の誘発により検出されること力咄来る。

上記の方法の商用上の用途は、細胞表面の性質の変化した細胞、特に血中又は他 の体液の中の細胞の存在を検出することにある。固体組織からの細胞は、標準組 織分散法を用いた後に分析されることが出来るであろう、かかる検出器は、科学 研究手段としてと同様にウィルス感染の診断及び癌の診断に有用である。これは 蛍光顕微鏡検査及び蛍光励起細胞分離補集法に代わり得るものである。

ＩＸ、効果 現在の微細加工技術により、均一な密度及び物性を示すマルチメガピットメモリ を廉価に作り出すことが可能である。従って、数百方にのぼることの考えられる 個別の生物学的テスト凹部を含むアレーが、標準的な電子機器に比較して同等の コストで小型化されること力咄来る。例えば、百方の生物学的テスト部位を含む アレーが、１ｃｍＸ１　ｃｍのサイズに収められること力咄来る。更にかかる方 法で製作される装置の均一な電気的特性は、多くの他のアプローチよりも検出感 度を遥かに高める上述の微細加工された電子検出器及び光吸収ＣＣＤ検出器の一 つの重要な利点は、検出法がターゲット／プローブの分子結合を直接検出するこ とを可能にする点に在る。従って、毒性のある蛍光性、放射性又は化学的マーカ が、ターゲット又はプローブに取り付けられる必要はない。

寧ろ検出には、適切な電気信号又は周波数シフトが捉えられるだけで良い。この 様な信号又はシフトは、オリゴヌクレオチドに対するＤＮＡ及びＲＮＡの如き多 くのターゲット／プローブには当然起きる。しかし、電子検出器の中での信号又 はシフトが、結合後に弱まるか又は存在しなくなる時には、電荷を持つ分子マー カがターゲットに取り付けられることが出来る。更に電子検出器での検出は、微 細加工されたアレーが腐蝕性の生物学的溶液に接触する時には時間的にあいまい となることのある強度の特性の変化とは異なり、周波数特性の変化により観察さ れる。従って装置はクリーニングされ、且つその精度に影響を蒙ることなく、何 回も繰り返して使用されることが出来る。検出の方法は、電極の成る種の腐蝕に 耐えるが、長期にわたって使用するには不活性化層がプレートを被覆する為に使 用されることが出来る。

本発明のもう一つの利点は、検出測定を行う為にテスト部位を調べるのに用いら れる電子回路が、生物学的アレーを含むウェハ上に直接加工されることが出来る ことである。スイッチマトリックス、信号処理回路及び工矛ルギー給源は、アレ ー上での検出の迅速化を容易にする為に、同じチップ上に設けられることが出来 る。従って、ウェハ上の能動回路の装着により、実験コストは大幅に減少するこ とも考えられる。

テスト部位１２に取り付けられたプローブ２２の密度は、感度を直接決定する。

マイクロエレクトロコンク法では、一本ｔＸ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の短い（ハイブリ ッド化の行われていない）ものと長い（ハイブリッド化の行われた）ものとの間 には、係数において１０倍の差異がある。一方、染料挿入光学法の場合は、係数 において３倍の差異しかない。

大抵の実施例に於いて、放射性フィルムの使用を不用とすることは、テスト時間 を凍らすことになる。何故ならばフィルムの感光が不要となるからである。試料 の製作時間は大幅に短縮される、何故ならば核酸断片には標識を与える必要がな いからである。検出法は迅速である；測定は充分な分子結合の完了と同時に行わ れるからである。更に測定プロセスは、アレーの中の各テスト部位をアクセスす る為の極めて迅速な方法を提供する為に、チップ上のマイクロプロセッサコント ロールにより自動化されることが出来る。

これらのタイプの検出装置に用いられるマイクロエレクトロニックチクノロノー は、かかる種類の実験のコストを劇的に引き下げる。メガピントメモリチップ及 びメガピクセルＣＣＤイノ−ジングチ・７プを製造する際に用いられる有効な量 産技術の使用されることが決め手である。

本発明及びその利点が詳細に記載されたが、各種の変更、置換及び改変が付随の 請求範囲に定められた発明の精神と範囲を逸脱することなくこの中に加えられる ことが出来るものと理解される。

例えば、図１の回路３６．５６．３８．５８及び４０の如きゲノセンサ（ｇｅｎ ｏｓｅｎｓｏｒ　）アレーの能動回路は、凹部又は同じ基板のアレーとモノリソ ツクに一体化されることが出来る。スイッチマトリックス、アナログテスト回路 及び、アナログ又はデジタル（マイクロプロセツサ）コントローラは、同しウェ ハ上に加工されることにより、電気的テストを実施又は簡単化すること力咄来る 。図２４に示された如（ＴＲＸＩの如きトランジスタは、例えばサンプリングさ れている時を除き、各部位を電気的に切り離す為に、該当のテスト部位１２に隣 接する各基板の中に一体化されること力咄来る。この為に各行に対してアドレス ラインＡ３を追加することが必要になるが、寄性的キャパシタンス及び使用され ぬラインからの偽信号を解消する。これらの好まざる効果が大幅に解消すること は、第２のアドレスライン及び部位１２のＹ側に接合されたトランジスタセット により果たされる。

広汎な種類の信号処理及びパターン認識機能を実施することの出来るＣＣＤ回路 にューラルネットワークを用いたＣＣＤを含む）が実証された。ＣＣＤデータ処 理回路とゲノセンサアレーとの一体化は、Ｄ’ＮＡ検出および解読の手段を簡単 化し、且つ図１５及び１６に関連して記載された集積化されたＣＣＤイメージヤ と共用できる。

発明は溶液が使用されるウェットタイプのテストに関して説明された；プローブ 及びハイブリッド化されたプローブ／ターゲットの組み合わせが、乾燥した媒質 又はゲル中で行われる“乾式”又は“ゲル”アプローチを使用することは全面的 に可能である。

（以下余白） （ｆｌ　ｔｏ　ｆ２） ｆ　ＤＮＡ ターゲットＤＮＡ拮已輩記グ１ 合成りＮＡブローブ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　、庁内整理番号ＧＯＩＮ　２１／６４ 　Ｚ　９１１８−２Ｊ２１／７８　Ｃ８３１０−２Ｊ ２２１００　Ｚ　９３１０−２Ｊ ２７１００　Ｚ　９１１５−２Ｊ ２９／１２　９１１５−２Ｊ ５３／４８３　Ｅ　７０５５−２Ｊ ３３１５６６　７０５５−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ （７１）出願人　ヒユーストン・アドバンスト・リサーチ・センター アメリカ合衆国、テキサス州　７７３８１゜ザ・つ・レドランズ、リサーチ・フ オレスト・ドライブ　４８００ （７２）発明者　ポリス・マーク・エイアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 ０１７４２　、コンコード、スタフオードシャー・レーン　４５ （７２）発明者　ニーリック・ダニエル・ジエイアメリカ合衆国、マサチューセ ッツ州 ０２１７３　、レキシントン、グランド・ブレイス１１ Ｉ （７２）発明者　マーフィー・アール・アレンアメリカ合衆国、マサチューセッ ツ州 ０１７１９　、ボックスポロ、ヒル・ロード　４１１（７２）発明者　コシキ・ パーナート・ビーアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 ０１７２０　、アクトン、フォート・ポンド・ロード　３９ （７２）発明者　ラスマン・デニス・ディーアメリカ合衆国、マサチューセッツ 州 ０１７２１、アッシュランド、イースト・ブラフ・ロード　４２ フロントページの続き （７２）発明者　チェノ・チャンリー アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 ０１７７６　、　シュドベリー、ブラソフ・ミル・ロード　１９ （７２）発明者　マシューズ・リチャード・エイチアメリカ合衆国、マサチュー セッツ州 ０１８２４　、チェルムスフォード、ワイルデス・ロード　３０ （７２）発明者　パーク・バリー・イーアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 ０２１７３　、　レキシントン、シェアバーン・ロード　１７ （７２）発明者　エガース・ミッチ・ディーアメリカ合衆国、テキサス州　７７ ３８１゜ザ・ウッドランズ、プラム・コープ・コート　１０ コート　８

Claims (77)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の工程を具備する分子構造を特定化する為の方法：ａ）テスト部位のア レーを形成し、各部位は特定の分子構造との結合の可能なプローブをその中に形 成され、各テスト部位でのプローブが他のテスト部位のプローブとは異なり；ｂ ）テスト部位に試料物質を供給し； ｃ）テスト信号をテスト部位に送り；およびｄ）送られた信号から生じるテスト 部位の特性を検出することにより、何れのプローブが試料物質の分子構造に結合 したかを判定して、多数の分子構造を識別する。
2. ２．請求項１の方法において、テスト信号が電磁信号であり、且つ上記アレーを 下記の工程で形成する： ａ）基板の上の第１の層を形成し； ｂ）第１層の上に第２の層を形成し； ｃ）第１層の一部を露出する為に第２層中に第１層への開口を形成し；および ｄ）開口の中に１対の電極を形成して、この電極に上記テスト信号を送る。
3. ３．請求項２の方法において、上記１対の電極を形成する際に、開口が形成され た後に第２層上にメタライジングを施し；上記のメタライジングは、開口間の第 ２層の表面上に上部電極を、第１層の露出した部分に下部電極を形成する。
4. ４．請求項３の方法において、基板はシリコンを使用し、第１及び第２層はシリ コンを主成分とする誘電体を使用する。
5. ５．請求項４の方法において、第１及び第２層は夫々ＳｉＯ２及びＳｉ３Ｎ４で あり、且つメタライジングはＡＩ、Ｔｉ、Ｐｔ、Ｗ、Ｔａ、及びそれらのケイ化 物又はＡｕを用いる。
6. ６．請求項１の方法において、上記検出の工程は、テスト部位の誘電体的特性を 検出することを含む。
7. ７．請求項１の方法において、電気信号を送る工程は、パルス化された又は周波 数の変化する信号を送ることを含む。
8. ８．請求項１の方法において、各テスト部位は、電気信号の周波数域内で共振性 を持つ共振構造を用いて形成される。
9. ９．請求項８の方法において、上記検出工程は、Ｑに於ける変化又は共振構造の 共振周波数の変化の検出を含む。
10. １０．請求項１の方法において、上記試料物質は溶液又はゲルの中に在る。
11. １１．試料物質の中の分子構造を特定化する為の下記の要件を具備する装置： ａ）試料物質を受け入れる為の基板上に形成されたテスト部位、しかも各テスト 部位はその中に行及び列電極を形成されており、且つ各部位に於いてそれぞれの 電極に延びる行及び列リードを持つ構造である； ｂ）分子構造に結合する為の上記テスト部位に形成されたプローブ；ｃ）テスト 部位の電極に電子信号を送る為の回路；及びｄ）何れのプローブが試料物質の分 子構造に結合したかを断定する為に、テスト部位の電気的性質を検出する回路。
12. １２．請求項１１の装置において、テスト部位の下に形成された抵抗のアレーを 含む。
13. １３．請求項１１の装置において、上記電極は、ベースから延びる多数の導電性 フィンガを含む。
14. １４．請求項１３の装置において、上記フィンガの間の間隔は約３０ミクロン未 満である。
15. １５．請求項１４の装置において、上記多数の電極フィンガの第１のものは、上 記基板の中に形成された多数の凹部の下部に配置され、上記多数の電極フィンガ の第２のものは、上記第１フィンガの上の基板上に配置されている。
16. １６．請求項１１の装置において、上記プローブが、細胞プローブ、抗体プロー ブ又はペプチドプローブを含む基からの分子プローブを含む。
17. １７．試料物質中の分子構造の存在を断定する為の下記の要件を具備する装置： ａ）試料物質を受け入れる為の基板上に形成されたテスト部位アレｂ）分子構造 に結合する為のテスト部位に形成されたプローブ；及び ｃ）多数の検出器を持つ検出器アレーを備え、各検出器は該当のテスト部位に隣 接して配置され、しかも放射は上記テスト部位を通って伝播し、且つ結合された プローブを持つ部位ではプローブの結合されていないテスト部位とは異なった度 合いで吸収され、さらに、この吸収度合いの差異は上記検出器により感知されて 試料物質内の分子構造の存在を特定する為の信号を発信するために使用されてい る。
18. １８．請求項１７の装置において、上記テスト部位アレーは、検出器アレーとは 切り離すことの出来る使い捨ての可能なプレートを以って形成されている。
19. １９．請求項１７の装置において、テスト部位アレーが、検出器アレーと一体的 に形成されることにより、一体的な構造を形成する。
20. ２０．請求項１８の装置において、使い捨てプレートは石英、ガラス、グラステ ックス、ＡＩＯ３又はポリイミドにより形成されている。
21. ２１．請求項１１の装置において、各テスト部位に於ける電極が、伝送ラインに より互いに接合されている。
22. ２２．試料物質の中に分子構造の存在することを決定する為の下記の要件を具備 する回路： ａ）基板； ｂ）上記基板に形成されている多数のテスト部位；ｃ）テスト部位の端々の中に 形成されている電極；ｄ）電極の各々に延びるリード；及び ｅ）該当のテスト部位に形成されるプローブを備え、各テスト部位の上記プロー ブが構造的に同じであり、且つ異なったテスト部位のプローブは該当の予め定め られた分子構造との結合の為に異なった構造である。
23. ２３．請求項１１の装置において、更に、上記電極の一つにトランジスタスイッ チを介して接合されるアドレスリードを含む。
24. ２４．請求項１７の装置において、放射が、テスト部位に於ける、放射性、蛍光 性又は化学発光性の標識により生成されている。
25. ２５．請求項１７の装置において、放射が、テスト部位の光子照射により励起さ れた２次放射により生成されている。
26. ２６．請求項１７の装置において、放射が赤外放射であり、且つ検出器は熱エネ ルギーを感知するものである。
27. ２７．必要な場所に分子プローブを合成する為の下記の要件を具備する装置： ａ）合成されるべき分子を含むテスト部位のアレー；ｂ）選ばれた部位に光を照 射して、その選ばれた部位に於いて分子の合成を誘発させる光源。
28. ２８．請求項２７の装置において、上記光が可視波長域に在り、且つ光化学合成 を生じさせるものである。
29. ２９．請求項２７の装置において、上記光源が、テスト部位毎に走査されて局所 的な合成を誘発するさせるレーザである。
30. ３０．請求項２７の装置において、上記光線が、選ばれたテスト部位の局所的な 加熱を誘発することにより、分子の熱合成を行わしめるものである。
31. ３１．請求項２７の装置において、上記分子がオリゴヌクレオチド鎖を持つ。
32. ３２．必要な場所で分子プローブを合成する為の下記の要件を具備する装置： ａ）反応すべき前駆体分子を含むテスト部位のアレー；ｂ）テスト部位アレーに 隣接する部位に配置され、且つ各抵抗を該当のテスト部位の近傍に持つ抵抗のア レー；およびｃ）各テスト部位に於いて、分子を合成する為の熱反応を誘発させ るために、各抵抗を加熱する電源に各抵抗を接続する接続手段。
33. ３３．請求項１の装置において、上記テスト部位アレー及び抵抗アレーが一体化 された構造として形成されている。
34. ３４．必要な場所に分子構造を合成する為の下記の要件を具備する装置： ａ）反応すべき前駆体分子を含むテスト部位のアレーを有し；ｂ）各テスト部位 は、該当のテスト部位に於いて分子を合成する反応を誘発する為の電源に接続さ れた電極を含む。
35. ３５．請求項１の装置において、アレー及び電極は、一体化された構造として形 成されている。
36. ３６．物質中の分子構造の存在を決定する為の下記の要件を具備する装置： ａ）上記物質の供給源； ｂ）各種の分子と特定の形で結合する既知の分子を含む溶液の多数の供給源； ｃ）上記溶液の各々と上記物質とを選択的に混合する混合手段；および ｄ）物質の中での既知の分子と分子構造との間の結合が、混合された溶液内で出 現するのを検出する検出器。
37. ３７．請求項３６の装置において、検出器が光学的特性の変化を観察することに より結合を検出するものである。
38. ３８．請求項３６の装置において、検出器が電気的特性の変化を観察することに より結合を検出するものである。
39. ３９．請求項３５の装置において、多数の供給源が該当の毛細管に含まれ、しか も各毛細管は該当の供給源を上記物質の法れに接続するパルプを持つ。
40. ４０．請求項３９の装置において、上記毛細管およびバルブはシリコン中に形成 され、且つ１から１０ミクロンの範囲の直径を持つ。
41. ４１．分子構造を合成する為の下記の要件を具備する装置：ａ）テスト部位のア レー； ｂ）テスト部位の近傍に配置された化学反応体の供給源；ｃ）該当のテスト部位 に付随する電極；およびｄ）上記化学物質を該当のテスト部位に吸引する為に、 電圧を該当の電極に印加する手段。
42. ４２．合成されたプローブとターゲット分子との間のハイブリッド化を増やす為 の下記の要件を具備する装置：ａ）多数の上記プローブを含むテスト部位のアレ ー；ｂ）上記部位に付随する電極； ｃ）上記部位に与えられたターゲット分子の供給源；およびｄ）上記ターゲット 分子を上記プローブに吸引する為に、該当の電極に筆圧を印加する電圧源。
43. ４３．請求項１１の装置において、テスト部位が、基板の中に形成された凹部を 含む。
44. ４４．請求項４３の装置において、凹部が、肌理を持つ表面を以って形成されて いる。
45. ４５．請求項４４の装置において、肌理を持つ表面が、波形である。
46. ４６．請求項４５の装置において、電極の表面も波形である。
47. ４７．請求項１５の装置において、下部に於ける電極フィンガと上部に於ける電 極フィンガとの間の間隔は、ターゲットＤＮＡ分子の溶液中の直径のオーダー（ ｏｒｄｅｒ）である。
48. ４８．請求項６の方法において、誘電体特性が誘電率である。
49. ４９．請求項３７の方法において、電気的特性が誘電率である。
50. ５０．請求項１の方法において、試料物質が固体である。
51. ５１．請求項８の装置において、共振構造は伝送ラインであり、且つライン上を 伝播する信号の位相又は振幅に於ける変化が検出されるように構成されている。
52. ５２．試料物質の中の分子構造の存在を決定する為の下記の工程を具備する方法 ： ａ）特定の分子構造に結合するプローブが形成されているテスト部位のアレーを 形成し； ｂ）試料物質をテスト部位に供給し； ｃ）テスト部位を通過する放射を発し；およびｄ）プローブに結合する分子構造 の存在を決定する為に、該当のテスト部位により吸収される放射の差異を検出す る。
53. ５３．請求項５２の方法において、上記差異が、電荷結合素子（ＣＣＤ）によっ て形成された検出器のアレーにより検出される。
54. ５４．請求項５３の方法において、検出器のアレーが、テスト部位のアレーと一 体的に形成される。
55. ５５．請求項５３の方法において、検出器のアレーは、テスト部位のアレーから 切り離して形成される。
56. ５６．請求項５５の方法において、上記検出器のアレーが上記テスト部位のアレ ーと整合し、且つ放射がテスト部位を通過して検出器アレーに向かう。
57. ５７．請求項５６の方法において、放射が、光子、又は放射性の素粒子の放射で ある。
58. ５８．請求項５２の方法において、放射が、テスト部位の中で、放射性、化学的 、熱的、化学発光性又は蛍光性反応により生成される。
59. ５９．請求項５２の方法において、検出器は、結合反応が生じる際の熱エネルギ ーを検出する。
60. ６０．請求項１８の装置において、テスト部位が、プレートに形成された凹部の 中に形成された電極を含む。
61. ６１．請求項６０の装置において、上記凹部の表面が肌理を持つ。
62. ６２．請求項６１の装置において、肌理が波形を持つ。
63. ６３．請求項６０の装置において、電極の表面が肌理を持つ。
64. ６４．請求項６３の装置において、肌理が波形である。
65. ６５．基板の中に形成されたテスト部位へのプローブの取り付けの為の下記の工 程を具備する方法： ａ）基板の中にテスト部位を形成し； ｂ）上記プローブを接着する為の接着材料を上記テスト部位に形成し；および ｃ）上記プローブを上記接着材料に接触させる。
66. ６６．請求項６５の方法において、不活性化層が接着材料を覆い、且つ不活性化 層の一部分が選択的に除去されることにより、プローブと接着材料との間の接触 を選ばれた部位に起こす。
67. ６７．請求項６６の方法において、選択的に除去される部分がレーザ剥離により 除去される。
68. ６８．基板の中に形成されたテスト部位にプローブを付着する為の下記の工程を 具備する方法： ａ）基板の中にテスト部位を形成し； ｂ）プローブをテスト部位に付着させることの出来る接着材料をテスト部位に形 成し； ｃ）接着材料の上に保護コーティングを形成し；ｄ）選ばれた部位に於ける保護 コーティングを除去する反応を、選ばれた部位に於いて起こさせながら、保護除 去剤をコーティングに接触させ；および ｅ）保護を除去された部位にプローブを接触せしめて、プローブを接着材料に接 着する。
69. ６９．請求項６８の方法において、プローブが予め合成され且つテスト部位が凹 部から成り、接着材料はエポキシであり、保護コーティングはエポキシを加水分 解することにより形成され、保護除去剤はアセテートのアルコール溶液であり、 且つ反応は予め選ばれた部位に於いて部位を加熱することにより起きる。
70. ７０．請求項６８の方法において、反応は、選ばれたテスト部位を加熱する為に テスト部位に隣接して形成される抵抗に選択的に通電することにより、起きる。
71. ７１．請求項７０の方法において、選ばれないテスト部位は、所望の反応温度以 上の温度に維持される。
72. ７２．請求項６８の方法において、上記反応が、選ばれた部位を光を用いて照射 することにより起きる。
73. ７３．請求項７２の方法において、上記光線が可視光線又は紫外線であり、且つ 光化学反応が起きる。
74. ７４．請求項７２の方法において、上記光線が、テスト部位毎に走査されて反応 を引き起こすレーザから発している。
75. ７５．請求項７２の方法において、上記光線が、テスト部位の局所的な加熱を誘 発することにより反応を引き起こす。
76. ７６．請求項７２の方法において、上記光線は、選ばれた部位に光を投射する光 弁により生成される。
77. ７７．請求項２７の装置において、光源が、選ばれた部位へ光を投射する光弁で ある。