JP2000279169A - ポリヌクレオチド分離方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】標的ポリヌクレオチドを効果的に分取する。 【解決手段】表面に独立した領域を有する基板の各領域
に特定の塩基配列を有するプローブを固定し、これに試
料溶液中相補性のあるポリヌクレオチドを結合させると
ともに、前記基板上の独立した領域のそれぞれの領域の
部分を順次温度をあげた後温度を下げて溶液を回収する
ことによりそれぞれのプローブに対応するポリヌクレオ
チドを分離して得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、複数の異なる配列
を持ったポリヌクレオチドの混合試料あるいは細胞より
特定の塩基配列を持つポリヌクレオチドのみを選択的に
分離回収する方法および装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡの特定の塩基配列を高速かつ簡便
に検出するために使用されるものの一つにＤＮＡチップ
がある。これは半導体微細加工技術で用いられるマイク
ロパターニングの技術とＤＮＡの相補性とを利用したも
のである。基板上の２次元に領域分割された各領域上
に、様々な配列を持つ塩基長８−９程度のプローブとし
ての一本鎖のオリゴヌクレオチドをそれぞれ固定してお
き、この基板上にＤＮＡを含む試料溶液を滴下して、基
板上の各領域のプローブと結合させ、この結合の際、同
時に蛍光色素を結合させることにより、このプローブと
試料溶液中のＤＮＡとの結合の程度を光学的に観測する
ことで試料溶液中のＤＮＡの塩基配列を解析する。

【０００３】プローブとしての特定のオリゴヌクレオチ
ド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を固相に捕捉する方法は、た
とえば、米国特許４，４４６，２３７に開示されてい
る。この方法では、特定のオリゴヌクレオチドを含む溶
液を加熱し、オリゴヌクレオチドを変性させて一本鎖と
した後、これを、ニトロセルロース膜表面に固定する。
また、プローブとしての特定のオリゴヌクレオチドを固
相に捕捉する他の方法は、S R Rasmussen et al, Analy
tical Biochemistry 198, 128〜142(1991)に記載されて
いる。この方法では、オリゴヌクレオチドの５’末端の
リン酸基を１−メチルイミダゾールと１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用
いて活性化し、２級アミンを導入したポリスチレンマイ
クロプレートの表面に固定する。この方法では２級アミ
ンと活性化した５’末端のリン酸基が反応するのでオリ
ゴヌクレオチドの５’末端側がマイクロプレート表面に
共有結合で固定される。

【０００４】このように、プローブとしての特定のオリ
ゴヌクレオチドが膜表面に固定されていれば、これと相
補性のあるポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を
選択的にこれに結合させることができるから、試料溶液
中に含まれるポリヌクレオチドを解析することができる
のであり、ＤＮＡチップはこの考え方を基礎としたもの
である。

【０００５】一方、選択的に分離回収しようとするポリ
ヌクレオチドを、チップ上に固定されたプローブによっ
て捕獲し、次にチップ全体を加熱し熱変性によって捕獲
されたプローブ上のポリヌクレオチドをチップから分取
する手法に関しては、すでに米国特許５，６０７，６４
６に岡野らが報告している。

【０００６】また、ゲル中のポリヌクレオチドの電気泳
動の速度差を用いて、特定のポリヌクレオチドを選択的
に分離回収しようとすることも広く行われている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術で述べた
ＤＮＡチップによる遺伝子解析技術は、基板上に形成さ
れた長さが８−９塩基ほどのプローブ（特定の一本鎖オ
リゴヌクレオチド）と試料溶液中のポリヌクレオチド
（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の一本鎖ポリヌクレオチドと
を相補的に結合させることにより捕獲し、観察する技術
であり、基板上のプローブに捕獲されたＤＮＡあるいは
ＲＮＡ一本鎖ポリヌクレオチドをさらに選択的に基板上
から分離し回収することについては考慮されていなかっ
た。

【０００８】また、従来は分離、回収したいポリヌクレ
オチドを細胞から直接的に抽出することは考えられてい
なかった。

【０００９】さらに、従来の電気泳動を用いた分離技術
では、ポリヌクレオチドの移動度は互いに相対的なもの
であり泳動条件の変化によって変動してしまい、分離回
収された試料溶液成分の同定が必要であった。また拡散
により泳動中のポリヌクレオチドが互いに混ざってしま
う可能性があり、正確に極微量のポリヌクレオチドを分
離、精製することは困難であった。

【００１０】本発明のポリヌクレオチド分離方法および
装置は特定の塩基配列を持つ微量のポリヌクレオチド
（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を高精度、高速に選択的に分
離、回収する方法および手段を提供することを目的とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するため、基板上の分割された表面の各領域をそれぞ
れ異なる塩基配列のプローブ（特定のオリゴヌクレオチ
ド）で修飾し、該プローブに試料溶液中のポリヌクレオ
チド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を結合させ、次いで、基
板の特定の領域のみを選択的に加熱して、前記プローブ
に相補的に結合しているポリヌクレオチドのみを該プロ
ーブから遊離させることにより、試料溶液中から希望す
るポリヌクレオチドのみを選択的に分離、回収すること
を提案するものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】図１は本発明のポリヌクレオチド
分離方法および装置が遺伝子の解析および選択的な回収
処理の中で占める位置を説明するための遺伝子処理のフ
ロー図である。８０１および８０２は準備過程であり、
それぞれ、検体細胞導入および検体液体導入の過程であ
る。本発明は細胞自体を検体とする場合および体液を検
体とする場合のいずれにも対応できる。８０３は細胞内
から細胞の内容物を抽出する過程である。８０４はＰＣ
Ｒ増幅の過程であり、分取したいポリヌクレオチドの濃
度の薄いときは実行される。８０５は本発明の特徴的な
過程であり、複数の独立した領域に試料成分を固定する
過程である。８０６は固定された試料成分の状況を観察
解析する過程である。８０７は独立した領域から試料成
分を分離して回収する過程である。

【００１３】以下、具体的に説明するように、本発明で
は、複数の独立した領域に試料成分を固定する過程をも
つことと、この領域からそれぞれの成分を分離して回収
することとにより、効率的な分取が可能となる。

【００１４】実施例Ｉ 図２は本発明の第１の実施例の基本構成を示す模式図で
ある。１は基板であり、その表面に分離、回収したい標
的ポリヌクレオチドを捕獲固定する。１３は基板ベース
である。１４は標的ポリヌクレオチド捕獲領域であり、
基板ベース１３の表面に光露光技術により１ミクロン四
方程度に分割され、２次元に展開されている。この標的
ポリヌクレオチド捕獲領域１４の表面には、各領域ごと
に配列の異なる塩基長８−９塩基程度のプローブ（一本
鎖オリゴヌクレオチド）が複数本結合している。このプ
ローブは試料溶液中の標的ポリヌクレオチドと相補性の
あるオリゴヌクレオチドである。したがって、標的ポリ
ヌクレオチド捕獲領域１４の面に試料溶液が来ると、プ
ローブと標的ポリヌクレオチドとが結合する。すなわ
ち、標的ポリヌクレオチドがプローブに捕獲される。そ
して、プローブと標的ポリヌクレオチドとが結合すると
き蛍光色素が同時に結合するものとされている。３１は
ヒーターであり、基板１の背面に設けられ、基板１の全
体の表面を室温程度から９５℃程度まで加熱することが
出来る。１５は対物レンズである。前記基板１は対物レ
ンズ１５の光軸に対して垂直に配置されている。１６は
蛍光観察用光源、１７は集束光照射用赤外レーザー光源
であり、光源のそれぞれは対物レンズ１５の光軸に対し
て垂直に配置される。１８１，１８２はそれぞれダイク
ロイックミラーであり、対物レンズ１５の光軸とそれぞ
れの光源１６、１７の光軸とが交わる位置に配置され
て、光源１６、１７から照射された光を対物レンズ１５
に誘導する。また、ここで用いられる光源１６の光、蛍
光色素の発する蛍光、光源１７の光の波長は互いに異な
っているものを用いることが望ましい。１５１はバンド
パスフィルターであり、光源１６の光はこれを通過する
ことにより前記蛍光色素を励起するのに適当な波長に絞
られる。対物レンズ１５に誘導された励起光は集光さ
れ、基板１上に捕獲、固定された標的ポリヌクレオチド
とともに結合した蛍光色素を励起する。励起された蛍光
色素は、基板上の各領域のプローブに捕獲された標的ポ
リヌクレオチドの量に比例した強度の蛍光を発する。１
８３はミラーであり、前記標的ポリヌクレオチドの量に
比例した強度で発生された蛍光が再び対物レンズ１５を
介して集められた光を反射する。１５２はエミッション
フィルターであり、検出したい蛍光の波長域の光のみを
選択的に透過させるものである。１９１は検出器であ
り、エミッションフィルター１５２を透過した蛍光の強
度を検出する。

【００１５】したがって、対物レンズ１５と基板１とを
相対的に動かして、基板１の表面を対物レンズ１５に誘
導された励起光によって順次スキャンして、蛍光色素が
発する蛍光強度の空間的な分布を蛍光像より知ることに
より、基板に固定されたプローブに捕獲された試料溶液
中の標的ポリヌクレオチドの量の空間的な分布を蛍光像
として得ることができる。ここで標的ポリヌクレオチド
の蛍光を観察する場合に用いる励起光は、標的ポリヌク
レオチドとともに結合した蛍光色素を励起する場合には
可視領域の波長の光で蛍光を発する蛍光色素を用いるこ
とが望ましい。標的ポリヌクレオチドとともに結合した
蛍光色素による発光に代えて、標的ポリヌクレオチドの
自家蛍光を観察することができる。この場合には励起光
の波長として２８０ｎｍから４００ｎｍの近紫外波長領
域を用いることが望ましい。

【００１６】前記蛍光色素の蛍光強度は、熱消光効果に
より、温度上昇の割合に応じて減少する。これを利用し
て、本実施例では基板上の標的ポリヌクレオチド捕獲領
域の局所的な温度上昇を計測することができる。図２で
示した装置では、検出器１９１で検出した標的ポリヌク
レオチドとともに結合した蛍光色素の蛍光強度の変化
を、解析装置１９２で蛍光強度変化の温度依存性をもと
に解析し、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を見積
もることができる。

【００１７】赤外レーザー光源１７で発生した赤外光
は、ダイクロイックミラー１８２により下方に反射さ
れ、対物レンズ１５により集光され、基板１上に形成さ
れた標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４に照射される。
標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４では基板１の上に形
成された薄膜層あるいは微粒子層が赤外光を吸収し、熱
を発生するので試料溶液中の局所的な温度を上昇させる
ことができる。対物レンズ１５によって基板１表面で集
束されるレーザー光源からの集束光の集束位置は、対物
レンズ１５を移動させるか、あるいは基板１を移動させ
ることによって任意に決定できる。また捕獲されている
標的ポリヌクレオチドの損傷を避けるため、標的ポリヌ
クレオチドが吸収を持つ波長領域の光を用いないことが
望ましい。たとえば波長８００ｎｍ以上の近赤外光、波
長４００ｎｍ以上の可視光を用いるのがよい。

【００１８】一般にＤＮＡやＲＮＡなどの一本鎖ポリヌ
クレオチドは、プローブなどの他の一本鎖ポリヌクレオ
チドと相補的関係がある時、水素結合による塩基対を形
成して二本鎖ポリヌクレオチドを形成するが、試料溶液
の温度を９５℃程度以上に上昇させると、この水素結合
に由来する核酸塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドが解離
し一本鎖ポリヌクレオチドになることが知られている。
従って、基板上の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域
１４に赤外集束光を照射し、その温度を９５℃まで上昇
させることにより、特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領
域でプローブに結合した標的ポリヌクレオチドを選択的
に分離させることができる。

【００１９】また、基板１上に面電極を配置して、この
面電極と基板１との間に交流電場を印加すると、基板１
上のプローブおよび基板１上の試料溶液中のポリヌクレ
オチドを伸長させることができる。その結果、プローブ
と試料溶液中のポリヌクレオチドの非特異結合を減少さ
せるとともに、集束光によるプローブと標的ポリヌクレ
オチド対の解離を効果的に達成することができる。

【００２０】また、プローブとハイブリダイズした標的
ポリヌクレオチドの解離温度は、その結合した水素結合
の量に比例して高くなるため、解離温度を調節すること
によって標的ポリヌクレオチドとプローブとの結合のマ
ッチングの程度に応じた選択的なポリヌクレオチドの分
取も可能である。すなわち、プローブに結合した標的ポ
リヌクレオチドは温度を徐々に上げて行くと水素結合が
少ない標的ポリヌクレオチドから解離を始める。したが
って、前記解析装置部１９２で得られた温度の情報をも
とにレーザー光源１７の出力を帰還制御し、標的ポリヌ
クレオチド捕獲領域１４の温度を調節することによっ
て、特異的結合の程度を勘案しながら選択的に標的ポリ
ヌクレオチドを分取できる。

【００２１】また、テトラエチルアンモニウムクロライ
ド等の４級アンモニウム塩を試料溶液中に加えること
で、プローブに結合した標的ポリヌクレオチドの解離温
度のばらつきをほぼそろえることも可能である。

【００２２】図３に基板上の標的ポリヌクレオチド捕獲
領域１４の特定の領域を加熱する第１の手段を示す。本
実施例では、基板ベース１３は表面に配置された導電性
膜１３１と熱伝導性絶縁基板１３２とより構成されてい
る。導電性膜１３１上には、複数の標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、
１４６が配置されている。各標的ポリヌクレオチド捕獲
領域は酸化アルミ薄層などの光吸収層２１と断熱層２２
の二層構造となっている。また、各標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域の表面には、塩基長８−９塩基程度のプロー
ブ（オリゴヌクレオチド）４１、４２、４３、４４、４
５、４６が結合している。図では、これらのプローブの
内、プローブ４１、４２、４３、４６のみに、標的ポリ
ヌクレオチド４１’、４２’、４３’、４６’が結合し
ている状態を模式的に示している。したがって、標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域を蛍光観察によって同定するこ
とで、試料溶液中のポリヌクレオチドのうち、プローブ
と結合した標的ポリヌクレオチドの対応を見積もること
ができる。図の例では、領域１４１、１４２、１４３、
１４６ではプローブと標的ポリヌクレオチドが相補的結
合をしているが、領域１４４、１４５では相補的結合が
なされていない。このことより試料溶液中には領域１４
４、１４５に配置されたプローブと相補的関係を持つポ
リヌクレオチドがないことがわかる。

【００２３】つぎに、プローブ４２に標的ポリヌクレオ
チド４２’が結合している標的ポリヌクレオチド捕獲領
域１４２に、対物レンズ１５より集束光５１を照射す
る。領域１４２の光吸収層２１が集束光５１を吸収し発
熱する。領域１４２の光吸収層２１の発熱により、領域
１４２の近傍が９５℃程度の高温になると、プローブ４
２と標的ポリヌクレオチド４２’の間の水素結合がはず
れ、領域１４２に捕獲されていた標的ポリヌクレオチド
４２’のみが選択的に基板１よりはずれる。このとき集
束光の集光された領域の大きさが一つの標的ポリヌクレ
オチド捕獲領域の大きさより小さい場合は、この標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域内に集光領域が収まるように光
軸を調節すればよい。また、標的ポリヌクレオチド捕獲
領域が集束光の集束領域より小さい場合には、各標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域間の隙間を十分にとって、一つ
の領域のみが集束光によって加熱されるように、標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域を配置することが望ましい。な
お、本図では、図を見やすくするために、標的ポリヌク
レオチド捕獲領域にプローブ１本のみを示したが、実際
には、各領域とも同一の塩基配列を持ったプローブが複
数固定されているのが普通である。

【００２４】また、本実施例では基板ベース１３表面に
導電性膜１３１が配置されているから、上述したよう
に、基板１の上面に対向する電極板（図示しない）を設
け、両者の間に、交流電場を印加することでプローブや
ポリヌクレオチドを引き伸ばすことができる。これによ
って、結合時の誤った結合や、標的ポリヌクレオチド捕
獲領域を加熱して標的ポリヌクレオチドをプローブから
解離させるとき立体構造的な絡まり等を防ぎ、効率的に
処理を行うことができる。

【００２５】さらに基板ベース１３に熱伝導性絶縁基板
１３２を用いることで、集束光５１を照射しない場合の
冷却効果を改善することもできる。

【００２６】本実施例での光吸収層２１は蒸着によって
作製してもよいが、塗布、散布によって作製してもよ
い。また標的ポリヌクレオチド捕獲領域の形状は、光リ
ソグラフィのマスクを用いることで、正方形、長方形あ
るいは集束光の形状にあった円形あるいは楕円形の形状
をとってもよい。

【００２７】図４に、基板１上の特定の領域を加熱する
第２の手段を示す。図３の例では、光吸収特性を持った
薄層２１が標的ポリヌクレオチド捕獲領域に形成されて
いたが、本実施例では光吸収特性を持ち、かつ標的ポリ
ヌクレオチド捕獲領域の大きさに比して十分に小さな光
吸収特性を持った微粒子２３が標的ポリヌクレオチド捕
獲領域に分散して配置されている。微粒子は各領域に１
個以上載っているものとする。本実施例でも、断熱層２
２を各領域に設けて、その上面に微粒子２３を配置す
る。基板１が、導電性膜１３１と熱伝導性絶縁基板１３
２とより構成されている基板ベース１３から構成されて
いる点は図３の例と同じである。

【００２８】集束光５１を特定の標的ポリヌクレオチド
捕獲領域１４２に照射すると、領域中の微粒子２３が光
を吸収して発熱し、領域１４２の近傍のみ昇温させるこ
とができるから、表領域１４２の面のプローブに結合し
ている標的ポリヌクレオチドのみを特異的にプローブか
ら解離させることができる。この実施例では、微粒子２
３を用いることで、図３の例の集束光の集束範囲より小
さな領域を特異的に加熱することが可能であるが、標的
ポリヌクレオチド捕獲領域と集束光の集束領域の大きさ
の関係は図３の例と同じである。本実施例での微粒子２
３からなる光吸収層は微粒子の塗布、散布によって作製
することができる。また形状についても、図３の例と同
様、任意の形状がとれる。

【００２９】図５に基板１上の特定の領域を加熱する第
３の手段を示す。本実施例では、図４と同様に、集束光
の波長領域に吸収を持つ微粒子２４による昇温を利用す
るが、この微粒子２４を集束光５１によって、光ピンセ
ットの要領で捕獲し、この捕獲した微粒子２４をプロー
ブと標的ポリヌクレオチドを解離させたい標的ポリヌク
レオチド捕獲領域に配置する点において異なる。このと
き、光ピンセットの特性より対物レンズ１５の開口数は
１２以上であることが望ましい。なお、本実施例でも、
断熱層２２を各領域に設ける。基板１が、導電性膜１３
１と熱伝導性絶縁基板１３２とより構成されている基板
ベース１３から構成されている点は図３の例と同じであ
る。光ピンセットの要領で微粒子２４を捕獲する点を除
けば、図４と同様であるので、図に関するその他の説明
は省略する。

【００３０】本実施例では、微粒子２４による昇温は、
微粒子２４が配置された領域の微粒子２４の近傍のみで
あるから、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の大きさと集
束光の集束領域の大きさとは本質的に関係ない。すなわ
ち、集束光の集束領域が複数の標的ポリヌクレオチド捕
獲領域を覆う場合にも、微粒子２４による昇温は微粒子
２４が配置された領域の微粒子２４の近傍のみであるか
ら、解離される標的ポリヌクレオチドは微粒子２４が配
置された標的ポリヌクレオチド捕獲領域のものにかぎら
れる。したがって、本実施例では、標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域の密度を高くすることができるメリットがあ
る。

【００３１】図６に、図２で示した本実施例の基本構成
を用いたポリヌクレオチド分離セル７の基板１との関係
を中心としたより詳しい構造の例を示す。

【００３２】この図ではポリヌクレオチド分離セル７の
一部を内部が見えるように切り欠いて示している。また
図７にこのポリヌクレオチド分離セルのＡ−Ａ断面図
を、図８にＢ−Ｂ断面図を示す。

【００３３】ポリヌクレオチド分離セル７には、セル上
板７２１、セル下板７２２と複数のスペーサー７２３に
よって仕切られた３つの試料溶液室７３１、７３２、７
３３がある。セル上板７２１は光透過性の素材で作れら
れている。３つの試料溶液室は、それぞれ、試料溶液出
入り口７１１、７１２、７１３から試料溶液の出し入れ
を行うことができる。また、各試料溶液室間は連通孔７
１４、７１５があり、この孔を通じて試料溶液の移動が
行われる。図２で示したプローブが固定された基板１
は、試料溶液室７３２のセル下板７２２上に固定されて
おり、また基板１上には電場を印加する電極板１３１が
組み込まれている。また、試料溶液室７３１、７３２、
７３３それぞれの側壁面には電極７５１、７５２、７５
４、７５５が付加されており、セル上板内面にも試料溶
液室７３２の上方に電場が加えられるように、メッシュ
状に電極７５３が配置されている。基板１の温度は放熱
板３３付きのペルチエ素子３２、３４、３５によって０
℃から９５℃まで調節することができる。また試料溶液
室７３１、７３２、７３３それぞれの温度をペルチエ素
子３２、３４、３５それぞれを独立に動作させることに
よって０℃から９５℃まで調節することができ、各試料
溶液室で他の部屋の温度を変化させることなくＰＣＲ反
応を行ったり、変性反応を行うことが出来る。また対物
レンズ１５で観察する基板１の位置を移動させるため
に、セル７は治具７４１によってレール７４２、７４
３、７４４上に固定されており、ステッピングモーター
（図示しない）によって自在に２次元面上を移動させる
ことができる。

【００３４】図９Ａ−Ｃに、図６−８で示したポリヌク
レオチド分離セルを用いた核酸分離プロセスを説明する
タイムテーブルを示す。まず試料溶液室７３１に導入さ
れたポリヌクレオチドを含む試料溶液は図９Ａに示され
たような経時的な温度変化を２０〜３０サイクル程度与
えることで前処理としてのＰＣＲ増幅がなされる。すな
わち、最初の変性の過程で二本鎖ポリヌクレオチドが一
本鎖ポリヌクレオチドとされる。次いで、試料溶液中の
プローブとのアニーリング、これに続くポリメラーゼ伸
長反応を行わせて、ポリヌクレオチドを倍増する過程を
繰り返し行う。この時の温度制御はペルチエ素子３２に
よって行われ、試料溶液室７３１内の試料溶液全体に対
して行われるものである。つぎに、増幅されたポリヌク
レオチドを含む試料溶液は、図９Ｂに示されるような過
程で特定の塩基配列を持ったポリヌクレオチドのみが分
離される。すなわち、試料溶液導入過程では電極７５
１、７５５を陰極に、電極７５４と基板１上の電極を陽
極にして、試料溶液室７３１の試料溶液中のポリヌクレ
オチドを試料溶液室７３２に誘導する。次にペルチエ素
子３４によって試料溶液室７３２内の試料溶液を９５℃
まで加熱し試料溶液中のポリヌクレオチドの水素結合を
はずし、一本鎖とする。次に３７℃まで温度を下げて基
板１上の標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブとの
結合を行わせる。そして、捕獲領域のプローブと結合し
なかった試料溶液中のポリヌクレオチドを、今度は電極
７５１を陽極とすることで再び試料溶液室７３１に戻
す。つぎに蛍光観察技術によって基板１上のどの領域に
標的オリゴヌクレオチドが結合したか確認する。そして
標的ポリヌクレオチドが基板１上のプローブと結合した
領域の情報（図２の蛍光の強度検出器１９１の出力）を
基に、基板１上の一つの標的ポリヌクレオチド捕獲領域
に集束光を照射することでその領域でプローブと結合し
た標的ポリヌクレオチドをプローブからはずすことがで
きる。このとき電極７５３と基板１表面の電極１３１と
の間で交流電場を発生させて標的ポリヌクレオチドを伸
長させておく。さらにレンズ１５から集束光５１を与え
て、基板１上の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の
標的ポリヌクレオチドのみをプローブから解離させなが
ら電極７５５を陽極とすることで試料溶液室７３３に目
的とする標的ポリヌクレオチドのみを導入する。このと
き、電極７５１を陽極に保ち、電極７５２を陰極にする
ことで、試料溶液室７３１にある試料溶液中のプローブ
と結合しなかったポリヌクレオチドは、試料溶液室７３
１に保持され、試料溶液室７３２あるいは７３３に移動
することはない。さらに、電極に電場を加えつづけなが
ら溶液出入り口７１３より試料溶液室７３３にＰＣＲに
必要な成分を導入する。その後、図９Ｃで示した後処理
ＰＣＲをペルチエ素子３５によって２０〜３０サイクル
程度行うことで試料溶液室７３３に導入された試料溶液
から希望するポリヌクレオチドを選択的に高精度にかつ
高速に分離、回収、増幅することができる。また、一
度、試料溶液室７３３の増幅された試料溶液を回収した
後、基板１を移動させて、基板１上の他の標的ポリヌク
レオチド捕獲領域に対して、再び同様に図９Ｂで示され
た分離過程、図９Ｃで示された後処理ＰＣＲ過程を繰り
返せば、順次、基板１の各標的ポリヌクレオチド捕獲領
域に捕獲されたポリヌクレオチドを選択回収、増幅する
ことができる。

【００３５】なお、図９Ａ−Ｃで説明したタイムスケジ
ュールでは、温度の低下については特別な操作をするこ
とを説明しなかったが、たとえば、図６のペルチェ素子
３２、３４および３５を積極的に放熱に使用よるしてそ
れぞれの部屋全体の冷却を短時間で行うことができる。
また、標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブに結合
しているポリヌクレオチドを解離させるための局所変性
後の冷却のために、各に標的ポリヌクレオチド捕獲領域
毎にペルチェ素子を設けることが可能であることは言う
までもなかろう。

【００３６】実施例ＩＩ 本実施例は、実施例Ｉがプローブと結合した標的ポリヌ
クレオチドを解離させるために、各標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域の温度制御を収束光照射によって行ったのに
代えて、基板１に埋め込まれた発熱体を利用する構造と
した点において異なるのみで、その他の点においては本
質的に同じである。以下図１０−１５を参照しながら説
明する。

【００３７】図１０は本発明の第２の実施例の標的ポリ
ヌクレオチド捕獲領域を持つ基板１と標的ポリヌクレオ
チド捕獲領域における捕獲状態を検知するための光学系
との関係を示す図である。図１０と図２，３と対照して
明らかなように、本実施例では、基板１は、表面に標的
ポリヌクレオチド捕獲領域を配置する導電性膜１３１、
次いで、温度制御部１３３と熱伝導性絶縁基板１３２と
よりなる基板ベース１３から構成されている。また、導
電性膜１３１の表面には、複数の標的ポリヌクレオチド
捕獲領域１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１
４６が配置されるとともに、温度制御部１３３の内部に
は各標的ポリヌクレオチド捕獲領域を独立に温度制御す
るための電極およびこれによって発熱させられる発熱体
が埋め込まれている。各標的ポリヌクレオチド捕獲領域
は酸化アルミ薄層などのプローブ結合層２２１と電気的
な絶縁体層２２２の二層構造となっている。さらに、各
標的ポリヌクレオチド捕獲領域の表面には、塩基長８−
９塩基程度のプローブ（オリゴヌクレオチド）４１、４
２、４３、４４、４５、４６が結合している。図では、
これらのプローブの内、プローブ４１、４２、４３、４
６のみに、これらと相補的な関係を持つ標的ポリヌクレ
オチド４１’、４２’、４３’、４６’が結合している
状態を模式的に示している。

【００３８】また、本実施例でも、標的ポリヌクレオチ
ド４１’、４２’、４３’、４６’がプローブ４１、４
２、４３、４６と結合するとき蛍光色素を同時に結合す
る構成としたときは、蛍光色素を励起して、これが発す
る蛍光を検知して、各領域についてのプローブと標的ポ
リヌクレオチドとの結合の程度を蛍光強度より見積もる
ことができる。さらに、温度上昇による熱消光効果によ
り蛍光色素の蛍光強度が温度上昇の割合に応じて減少す
ることを利用して、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の局
所的な温度上昇を計測することができる。また、蛍光色
素の蛍光強度の変化を、蛍光強度変化の温度依存性をも
とに解析し標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を見積
もることができる。なお、本実施例でも実施例Ｉと同じ
物または均等物には同じ参照符号を付した。

【００３９】図１１に、図１０に示す基板１のＡ−Ａ断
面図を示す。基板１は熱伝導性絶縁基板１３２、温度制
御部１３３および導電性膜１３１が積層された構造であ
る。最上層の導電性膜１３１の表面には標的ポリヌクレ
オチド捕獲領域となるプローブ結合層２２１と電気的な
絶縁体層２２２の二層構造が形成されている。温度制御
部１３３には面電極２２６の層、発熱体２２５の層およ
び面電極２２４の層が形成されている。面電極２２６の
層と面電極２２４の層のそれぞれの電極はマトリクッス
状に交差する形であり、この交差する位置が各発熱体２
２５の位置に対応するとともに各標的ポリヌクレオチド
捕獲領域の位置と対応するように形成されている。熱伝
導性絶縁基板１３２には、各標的ポリヌクレオチド捕獲
領域に対応して温度計測用のサーミスタ２３１の層が埋
め込まれており、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温
度を計測することができる。

【００４０】図１２Ａ−図１２Ｃに、第２の実施例の基
板１の温度制御部１３３のＢ−Ｂ断面、Ｃ−Ｃ断面およ
びＤ−Ｄ断面の断面図を示す。面電極２２６と面電極２
２４は直交する形であり、この交差点に発熱体層２２５
を挟み込んでいる。従って面電極２２６と面電極２２４
とに電位差を与えて電流を流すと、この交差点にある発
熱体２２５のみが発熱する。すなわち、面電極２２６と
面電極２２４とを適当に選択して電位差を与えるとこの
交差点に対応する位置の標的ポリヌクレオチド捕獲領域
の温度をあげることができる。

【００４１】図１０に示す基板１を前述した図６−８に
示したポリヌクレオチド分離セル７の基板１として置換
することができるが、ここでは、もっとシンプルな例を
説明する。

【００４２】図１３に第２の実施例のポリヌクレオチド
分離セル２５１とその関連装置のブロック図を示す。図
１４に第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２５１
のＧ−Ｇ断面図を示す。ポリヌクレオチド分離セル２５
１は光透過性を持った容器によって作られておりセル内
の基板１を光学的に観察することができる。セル２５１
にはポリヌクレオチドを含む試料を注入する試料溶液注
入管２５２と、基板１の特定の標的ポリヌクレオチド捕
獲領域で捕獲された標的ポリヌクレオチドを取り出す取
り出し管２５３が接合しており矢印５７，５８の方向に
前記溶液を流すことができる。またセル２５１内上面に
は透明電極（図示しない）が配置されており、基板１の
導電性膜１３１との間に電位差を持たせることができ
る。特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域に対応する発
熱体を発熱させたり、標的ポリヌクレオチド捕獲領域に
直流電場あるいは交流電場を発生させるために、本実施
例は直流電源２５４，交流電源２５５，制御回路２５６
を持っており、後に示す手順に従って、サーミスタ２３
１からの温度情報をもとに基板１の状態を制御すること
ができる。

【００４３】図１５に第２の実施例のポリヌクレオチド
分離セルの分離プロセスを説明するタイムテーブルを示
す。

【００４４】セル２５１に導入された試料は、図１５に
示されるような過程で特定の塩基配列を持ったポリヌク
レオチドのみが分離される。

【００４５】（１）試料溶液の導入過程では基板１の導
電性膜１３１を陽極に、セル上面の透明電極を陰極にし
て、溶液中のポリヌクレオチドを基板１の表面に誘導す
る。また、基板１の導電性膜１３１とセル上面の透明電
極との間で交流電場を発生させることでポリヌクレオチ
ドを伸長させてもよい。この状態では、温度制御部１３
３中のすべての電極２２４、２２６を導通させ、すべて
の発熱体２２５を発熱させ、基板１の表層の温度を９５
℃まで上昇させる。

【００４６】（２）次に３７℃まで温度を低下させる。
これで標的ポリヌクレオチド捕獲領域に固定されたプロ
ーブと試料溶液中の標的ポリヌクレオチドは結合する。

【００４７】（３）つぎに、基板１の表層を７２℃程度
まで上昇させ、基板１の導電性膜１３１を陰極に、セル
上面の透明電極を陽極にして非特異的にプローブに結合
したポリヌクレオチドを試料溶液とともに除去する。

【００４８】（４）セル２５１中の溶液を交換した後、
温度制御部１３３中の電極２２４、２２６のそれぞれ一
つを導通させ、発熱体２２５の一つを発熱させ、標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域の一つを９５℃まで昇温させ、
この領域のプローブと結合している標的ポリヌクレオチ
ドを解離させ溶液とともに回収する。

【００４９】（５）同様な手順を各標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域について行うことで、各領域のプローブに結
合した標的ポリヌクレオチドを順次取り出すことができ
る。

【００５０】この場合、実施例Ｉで説明したと同様に、
あらかじめ、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域について
の標的ポリヌクレオチドの結合状況を検出器１９１、解
析装置１９２からの温度情報をもとに検出して、回収し
たいポリヌクレオチドの結合している標的ポリヌクレオ
チド捕獲領域についてのみ、上述の温度制御を行うもの
とすれば、処理効率を上げることができる。

【００５１】実施例ＩＩＩ 第３の実施例は、プローブを安定に固定するように工夫
された標的ポリヌクレオチド捕獲領域を持つ基板１の構
成に関するものである。具体的には、捕獲領域の表面を
酸化膜層とした金属膜とするとともに、シランカップリ
ング反応でプローブを安定に固定できる構造とした基板
１を提案するものである。

【００５２】本実施例による基板１の製作手順を説明す
る。厚さ０４ｍｍで２４ｍｍ角のガラス基板を用意して
ＮａＯＨ（１Ｍ）溶液に浸し、３０分間超音波洗浄す
る。超純水で流水洗浄した後、１１０℃１５分間ベーク
する。真空蒸着装置を用いてクロム（Ｃｒ）を蒸着す
る。厚みは３ｎｍである。エタノールで洗浄する。３−
グリシドキシプロピルトリメトキシシランの原液に５分
間浸淅した後、５０％のエタノール溶媒に溶解した４％
の３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの溶液
に３０分間浸し、時々撹拌する。溶液から取り出して、
１１０℃で３０分間ベークし、シランカップリング試薬
で金属表面にグリシドキシ基を導入して基板１を得る。

【００５３】図１６は第３の実施例による基板１でプロ
ーブを安定に固定できた様子を示す図である。本実施例
の基板１はガラス基板３０２の表面にＣｒ層３０３が蒸
着されさらにその表面が酸化膜３０４になっている。シ
ランカップリング層３０５によりプローブが固定されて
いる。プローブを安定に固定できることを確認するため
に、本実施例では、標的ポリヌクレオチド捕獲領域３０
６および３０７のそれぞれに、シランカップリング層３
０５を介して固定されたプローブ３１１および３１２に
末端が蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識された
５２１ｂｐおよび６２５ｂｐの長さのポリヌクレオチド
をそれぞれ結合させた。

【００５４】本実施例による基板１の効果を確認するた
めに行った比較実験の結果について説明する。

【００５５】まず、本実施例の構成の基板、Ｃｒに代え
てアルミニューム（Ａｌ）をガラス３０２の表面に蒸着
した基板およびガラス３０２の表面に直接シランカップ
リング処理した基板のそれぞれについて比較する。本実
施例の構成の基板としてＣｒをガラス３０２の表面の全
面にわたって５４ｎｍ蒸着した二つの基板を調製した。
６００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率は５３〜５６％であ
った。Ｃｒに代えてＡｌをガラス３０２の表面の全面に
わたって蒸着した基板のＡｌ膜の厚さは１５ｎｍのもの
を用意した。製作の手順は本実施例と同じである。この
基板の６００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率は１９〜２５
％であった。金属膜を蒸着しないガラス自体の６００ｎ
ｍ〜８００ｎｍの光透過率はほぼ８４％である。この程
度の透過率であれば、蛍光色素、たとえば、スルホロー
ダミン１０１（吸収極大５９４ｎｍ、蛍光６１５ｎｍ）
で標識した標的ポリヌクレオチドを励起光アルゴン（Ａ
ｒ、５１４ｎｍ）やヘリーム−ネオン（Ｈｅ−Ｎｅ、５
４５ｎｍ）で励起することによる蛍光でプローブに捕獲
された標的ポリヌクレオチドを検出することができる。

【００５６】図１７（Ａ）から図１７（Ｃ）は第３の実
施例の基板による効果を確認する実験結果を説明する図
である。

【００５７】図１７（Ａ）はＣｒを５４ｎｍ蒸着した第
３の実施例の基板、図１７（Ｂ）はＣｒに代えてＡｌを
１５ｎｍの厚みに蒸着した基板、図１７（Ｃ）は金属蒸
着膜を持たない基板のそれぞれについて、シランカップ
リング層３０５を介して固定されたプローブ３１１およ
び３１２に末端が蛍光色素スルフォローダミン１０１で
標識された５２１ｂｐおよび６２５ｂｐの長さのポリヌ
クレオチドをそれぞれ結合させる処理を行った。この状
態でレーザー共焦点顕微鏡でスキャンした結果を相対蛍
光強度および透過率について測定した結果を示す。横軸
に基板上のスキャン位置を、縦軸に実線３３０はレーザ
ー顕微鏡で検出される蛍光（５８０ｎｍ以上）分布と透
過光強度分布をそれぞれ示す図である。波線３３１は３
８０ｎｍから４５０ｎｍの透過率分布を示す。

【００５８】図１７（Ａ）から分かるように、本実施例
の基板では、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識
されたポリヌクレオチドが結合している領域ＣＡ全域に
わたって一定の蛍光強度３３０が得られた。他の部分か
らの蛍光強度３３０は十分低い。また、３８０ｎｍから
４５０ｎｍの透過率は、いずれの部位においてもほぼ一
定である。このことは、プローブの固定から標的ポリヌ
クレオチドの結合までの種々の反応操作においてＣｒ層
が安定に保持されており、ガラス３０２の表面からの剥
離が無いことを示している。

【００５９】図１７（Ｂ）から分かるように、Ｃｒに代
えてＡｌを蒸着した基板では、蛍光色素スルフォローダ
ミン１０１で標識されたポリヌクレオチドが結合してい
る筈の領域ＣＡの透過率が顕著に高くなっている。これ
は、プローブの固定反応においてＡｌ蒸着面が溶解して
いることを意味する。Ａｌ蒸着面はＤＮＡやＲＮＡを溶
解させる一般的な溶液である１０ｍＭトリス塩酸−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７５）で溶解してしまう結果
が得られ、Ａｌを蒸着した基板は水溶液を用いる反応系
には利用できないことがわかる。この結果、プローブの
固定は実質的に出来ておらず、したがって、蛍光色素ス
ルフォローダミン１０１で標識されたポリヌクレオチド
の結合もなく、全体に蛍光強度３３０は十分低い。

【００６０】図１７（Ｃ）から分かるように、ガラス表
面を直接シランカップリング反応させてプローブを固定
した基板では、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標
識されたポリヌクレオチドが結合している領域ＣＡが他
のプローブを固定していない部分より蛍光強度３３０が
高くなっているから、プローブを固定する機能を果たす
ことが出来ていることはわかる。しかし、本実施例の基
板と比較して蛍光強度３３０が場所によってバラ付いて
いる。これはプローブが均一に固定されていないことを
示唆するものである。

【００６１】これらの結果から明らかなように、Ｃｒを
蒸着した本実施例による基板がプローブを安定に保持し
標的ポリヌクレオチドを捕獲するのに有利であることが
分かる。なお、Ｃｒに限らず弱アルカリ溶液に安定な金
属で数ｎｍから１０ｎｍの厚さに、ガラス基板に蒸着し
たものが優れていることがわかる。具体的には、表面が
酸化膜で覆われ、９５℃の弱アルカリ溶液に溶解しずら
いものであれば良いが、金や白金は酸化膜を作らないた
めシランカップリング反応を行うことができないので利
用できない。ステンレスは、弱アルカリに安定で、酸化
膜を形成するなど、Ｃｒと良く似た性質をもつ。しか
し、理由はわからないがシランカップリング反応を用い
た活性残基の導入ができないので除外する。同様な検討
から少なくてもＴｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍ
ｏ、Ｗ、のいずれかの金属が有効であることがわかって
いる。

【００６２】次ぎに、図１８（Ａ）、図１８（Ｂ）を参
照して、本実施例による基板によってプローブに捕獲さ
れた標的ポリヌクレオチドを効果的に解離させ回収でき
ることについて説明する。図１８（Ａ）および図１８
（Ｂ）は図１６に示した領域３０６および３０７のそれ
ぞれに、シランカップリング層３０５を介して固定され
たプローブに捕獲された５’末端がスルフォローダミン
１０１で標識された５２１ｂｐおよび６２５ｂｐのポリ
ヌクレオチドについての実験結果である。基板表面は２
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７５）２０マイクロリッ
トルで覆われている。

【００６３】図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）はそれぞ
れの領域３０６および３０７を、それぞれの領域をまた
いでレーザースキャニング（５１４ｎｍ）を行い、蛍光
検出（５１０ｎｍ〜５８０ｎｍ）した結果を示す。横軸
に基板上のスキャン位置を、縦軸にレーザー顕微鏡で検
出される相対蛍光強度分布を示す。３３５は相対蛍光強
度を示す線であり、領域３０６および３０７のいずれも
全域にわたってほぼ一定の蛍光が検出される。次に領域
３０６のみ１０５３ｎｍのＹＡＧレーザー１０ｍＷ（ス
ポット径５ｎｍ）でスキャニングする。その結果、図１
８（Ａ）では破線３３６に示すように、スキャニング後
の相対蛍光強度分布はＹＡＧレーザーによるスキャニン
グの部位３３３では相対蛍光強度が約１／１０に低下し
ていた。領域３０７については、相対蛍光強度３３５、
３３６ともに変化はない。

【００６４】図１９は本実施例によるポリヌクレオチド
の分取について説明する電気泳動の結果を模式的に示す
図である。

【００６５】３４０はマーカーのレーンである。３４１
と３４２は基板１の領域３０６と３０７で捕獲したポリ
ヌクレオチドと同じ物を準備して電気泳動で測定した結
果を示すレーンである。それぞれ、５２１ｂｐと６２５
ｂｐのバンドが明瞭に現われている。３４３および３４
４は、基板１の領域３０６を１０５３ｎｍのＹＡＧレー
ザー１０ｍＷ（スポット径５ｎｍ）でスキャニングした
後の基板１の表面の緩衝液を回収しＰＣＲ増幅し、ＰＣ
Ｒ増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で測定した結
果を示すレーンである。レーン３４３には５２１ｂｐの
バンドが明瞭に検出されが、レーン３４４には６２５ｂ
ｐのバンドが表れていない。このことは、回収された緩
衝液をＰＣＲ増幅した溶液中にはＹＡＧレーザー１０ｍ
Ｗ（スポット径５ｎｍ）でスキャニングした領域３０６
から解離されたポリヌクレオチドのみが存在していたこ
とを示す。本実施例によれば、プローブの固定および捕
獲したポリヌクレオチドの効果的な分取ができる。

【００６６】実施例ＩＶ 上述の実施例Ｉ−ＩＩＩが基板１が平面であったのに対
し、第４の実施例では、細管の内面を利用する構造とし
て、ポリヌクレオチドの分取に必要となる試料溶液の量
を低減する。

【００６７】図２０および図２１は第４の実施例で採用
できる細管の外面およびＡ−Ａ断面図である。

【００６８】４０１は細管であり、ガラス細管等の光透
過性の細管である。４１２は管壁であり、この内面には
クロム等の実施例ＩＩＩで示した金属からなる管内被覆
４１３が施されている。この被覆面の表面は金属の空気
酸化によって生じた安定酸化物となっている。被覆面上
に円筒状にプローブが固定された標的ポリヌクレオチド
捕獲領域４１４、４１５が配置されている。各標的ポリ
ヌクレオチド捕獲領域４１４、４１５、には、各領域固
有のプローブが密に固定されており、試料溶液中のポリ
ヌクレオチドのうちこれらと相補的なポリヌクレオチド
のみをそれぞれの領域に捕獲することができる。また、
細管４０１の外面にはマーカー４１１が内面の各標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域の境界位置に記されており、細
管外面から各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の位置を確
認することができる。

【００６９】図２２は標的ポリヌクレオチド捕獲領域に
プローブを固定するための構造の例を説明する図であ
る。

【００７０】実際、図２１で示したように同心円状に独
立したオリゴヌクレオチドのプローブ層を細管内面に形
成するには、たとえば以下のような手法を用いる。ま
ず、細管４０１の管内全域をシラノール基とエポキシ基
を両端に持つ二価性試薬と反応させることでエポキシ基
４１６を管内表面の全領域に生やす。すると管内壁は撥
水性を持つようになり試料水溶液を弾くようになる。つ
ぎに特定の領域４１５の表面に結合させたい核酸試料溶
液を液滴の形態で管４０１内に導入する。すると管内壁
は撥水性を持つため液は球状となり管内壁と最小限の接
触面積で同心円状に接触する。この液滴を領域４１５ま
で誘導し、しばらく放置することで所定の領域のみで前
記エポキシ基４１６の自由端と５末端をアミノ基修飾し
た核酸プローブとを結合させる。反応させた核酸プロー
ブを含む試料液滴は反応後すみやかに細管４０１から取
り出す。同様に異なる試料液滴を導入して別の領域で反
応させることを繰り返すことで図２１に示したような構
造を形成することができる。

【００７１】この第４の実施例により試料溶液中の標的
ポリヌクレオチドを分取するためのタイムテーブルは、
図１５に示す図と同じであるので、説明は省略する。

【００７２】図２３は第４の実施例のポリヌクレオチド
分離装置の全体構成を示す図である。４３１はポリヌク
レオチド分離モジュールであり、内部に図２０および図
２１で説明した細管４０１が組み込まれている。細管４
０１の両端は細管接合部４３２、４３３に接合されてい
る。容器４３４に保持された試料溶液、容器４３５に保
持された洗浄液、容器４３６に保持された洗浄液および
エアフィルタ４３７を通過した空気がセレクタ４３８に
よって選択され、ポンプ４３９によって細管接合部４３
２に導入される。４００はコントローラーであり、本実
施例の装置のコントロールおよび電源供給手段を代表し
て示すものである。ポリヌクレオチド分離モジュール４
３１より排出された溶液は、細管接合部４３３を通過し
て、ＰＣＲ増幅等の後処理プロセス４４１へ送られる。
コントローラー４００には装置の各部から必要なデータ
が集められ、これに応じて各部に必要な操作信号が送出
されるわけであるが、これらの具体的な構成と装置各部
との接続については詳細を省略する。上述のタイムテー
ブルおよび以下の説明によって当業者が容易に実現でき
る。

【００７３】図２４は第４の実施例のポリヌクレオチド
分離モジュール４３１のＢ−Ｂ断面を示す図である。モ
ジュール４３１内には、細管４０１の管壁に光を導入す
る光源４４２、細管４０１の各標的ポリヌクレオチド捕
獲領域に対応してドーナツ状の発熱源４４３、細管より
内面へプラズモン励起された励起光によって励起された
標的ポリヌクレオチド捕獲領域の蛍光あるいは細管表面
のマーカー４１１を検出する光検出プローブ４４４およ
び細管の温度を検出する熱検出プローブ４４５が並列に
配置されている。また、細管接合部４３２、４３３内に
はそれぞれ電極４５１、４５２が配置されており、細管
４０１内の試料溶液成分を電気泳動によって回収するこ
とができる。また電極コネクタ４５３によって細管４０
１の内面被覆４１３に電位を与えることができ、これに
よって細管内面の表面から核酸成分を遠ざけたり引き寄
せたりすることができる。

【００７４】図２５は図２４に示した実施例のポリヌク
レオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図であ
る。本例では基本構成は図２４に示した実施例と同じで
あるが、分離されたポリヌクレオチドを回収するときに
導入する洗浄液を液滴４７１にしたところが異なる。図
２３に示したセレクタ４３８を調節することで、細管４
０１内にタンク４３６の洗浄液の液滴４７１を導入した
後、エアフィルタ４３７を通過した空気によって液滴４
７１を押し出し、回収したい標的ポリヌクレオチド捕獲
領域まで進ませ、液滴４７１がその領域を覆うようにす
る。次にリークバルブ４６１、４６２を開放させ発熱源
４４３による局所発熱によって膨張した細管４０１内の
空気を逃がすことで、液滴４７１の位置が移動しないよ
うにする。その後、その領域の温度を解離温度以上に上
げてプローブから標的ポリヌクレオチドを解離させる。
次いで、リークバルブ４６１、４６２を閉じ、エアフィ
ルタ４３７を通過した空気によって液滴４７１を細管接
合部４３３まで押し出し標的ポリヌクレオチドを回収す
る。本例の場合、液滴が接するのは特定の標的ポリヌク
レオチド捕獲領域であるため、仮に、他の領域の温度が
解離温度に達したとしても、液滴中に混入することがな
く、より高精度に分離された回収を行うことができる。
また、本例では発熱はポリヌクレオチド分離モジュール
４３１内の発熱源４４３による局所発熱としたが、標的
ポリヌクレオチド捕獲領域全体を覆う形状の一つの発熱
源を用いる場合にも、同様に高精度の分離、回収が出来
る。

【００７５】図２６は図２４に示した実施例のポリヌク
レオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図であ
る。本例では、細管４０１の内部に設けられた光源４４
２、発熱源４４３、光検出プローブ４４４および熱検出
プローブ４４５を省略し、これに代わる光学系を細管４
０１の外部に設けたものである。すなわち、実施例Ｉの
実施例である図２，６に示す構造で基板１に代えて細管
４０１を利用した形である。したがって図２の光学系と
同じ物が使えるが、図では簡略化するため対物レンズ１
５のみを示した。

【００７６】細管接合部４３２、４３３に接合された細
管４０１をレール４４６上で移動させ、対物レンズ１５
により所定のポリヌクレオチド捕獲領域の細管内の状態
を観察すると同時に集束光を細管の前記領域に照射する
ことによって、細管内の集束点近傍のみを局所加熱する
ことができる。この時、細管を円周方向に回転すること
のできる構造とすれば、細管内の円周面方向の領域全体
のポリヌクレオチドの捕獲状況を観察、加熱し回収する
ことができる。

【００７７】図２７は図２６に示した実施例のポリヌク
レオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図であ
る。本例は、細管４０１の外部に光学系を設けたもので
ある点については図２６と同じであるが、細管内部の各
標的ポリヌクレオチド捕獲領域に設けたと同じ光学系を
一組だけ細管外部に配置したモジュール４３１として、
これを細管４０１に対してレール４８１上を移動させる
構造とした点において異なる。これにより、装置を全体
的に小型化できる。

【００７８】実施例 Ｖ 上記実施例Ｉ−ＩＶにおいては、標的ポリヌクレオチド
が試料溶液の中にある場合であったが、本実施例は、細
胞自体から、直接、標的ポリヌクレオチドを分取するこ
とを狙いとするものである。もちろん、本実施例でも、
結局はポリヌクレオチドを含む試料溶液の形になった状
態で分取するわけであるが、標的ポリヌクレオチド捕獲
領域に細胞を導入した上で試料溶液の形にするものであ
るので、試料溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在比率
が高いものとなり、前処理としてのＰＣＲ等を省略でき
るケースが増加する。また、本実施例によれば、細胞毎
に細胞の核酸、蛋白質などの内容物を得ることもでき
る。

【００７９】図２８は本実施例の基本要素を示す図であ
る。

【００８０】１は基板であり、その表面に、先の実施例
で説明したのと同様の標的ポリヌクレオチド捕獲領域５
１１が形成されている。５２１はコントローラーであ
り、標的ポリヌクレオチド捕獲領域５１１に細胞５６１
を捕獲固定するために、捕獲領域５１１の電極と、基板
１に対向して設けられた接地電極５１４との間に直流あ
るいは交流電場を印加する。５２６は直流あるいは交流
電場を印加しあるいは接地するための電源回路、５２５
は選択スイッチである。５１２はペルチエ素子、５１３
は温度センサーであり、各標的ポリヌクレオチド捕獲領
域に近接して基板１内に埋め込まれている。５２３は温
度計測および制御部であり、温度センサー５１３の信号
を入力するとともに、ペルチエ素子５１２により、各標
的ポリヌクレオチド捕獲領域を独立してその表面温度を
制御する。どの領域の温度を制御するかはコントローラ
ー５２１からの指示による。

【００８１】図２９は図２８で説明した基本要素を持つ
ポリヌクレオチド分離セルと光学系を組み合わせた本実
施例の基本構成を示す図である。図３０は図２９で説明
した分離セルのＡ−Ａ断面を示す図である。

【００８２】５４１はポリヌクレオチド分離セルであ
り、５４２および５４３は試料導入管および試料排出管
であり、これらを通じて細胞試料、あるいは洗浄液等が
分離セルに導入され、また分離セルより細胞残骸、蛋白
質、精製した核酸試料等が回収される。分離セル５４１
の内部には図３０に示すように、基板１上に標的ポリヌ
クレオチド捕獲領域が形成されるとともに、本実施例で
は、試料導入管５４２から導入された細胞試料を標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域に導くための電極５５１、５５
２、５５３、−−−−が配列され、これらに配線が接続
されている。この図では上部電極５１４は表れない。各
標的ポリヌクレオチド捕獲領域には、それぞれの標的ポ
リヌクレオチドと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドで
あるプローブが固定されている。

【００８３】ポリヌクレオチド分離セル５４１の内部は
図２で説明したのと同じ光学系で監視できる。すなわ
ち、前記基板１を対物レンズ１５の光軸に対して垂直に
配置し、蛍光観察用光源１６からの励起光をバンドパス
フィルター１５１、ダイクロイックミラー１８１を介し
て対物レンズ１５に誘導する。対物レンズ１５に誘導さ
れた励起光によって、基板１上に捕獲、固定された標的
ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素は励起さ
れ、励起された蛍光色素は、基板上の各領域のプローブ
に捕獲された標的ポリヌクレオチドの量に比例した強度
の蛍光を発する。前記標的ポリヌクレオチドの量に比例
した強度で発生された蛍光が再び対物レンズ１５を介し
て集められ、エミッションフィルター１５２を介して、
検出したい蛍光の波長域の光のみを選択的に検出器１９
１に導入して分離セル５４１の内部を知ることができ
る。

【００８４】一般に、細胞は加熱することにより細胞膜
の一部が破れ核酸、蛋白質などの内容物の遊離が見られ
る。したがって、細胞を含む試料溶液をポリヌクレオチ
ド分離セル５４１に導入した後、基板１上の特定の標的
ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を９５℃まで上昇させ
ることにより、その領域にある細胞を破壊して内容物を
遊離させるとともに、二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖
ポリヌクレオチドに解離させることができる。その後、
この捕獲領域の温度を３７℃まで下げると、これらの標
的ポリヌクレオチドの内その領域のプローブと相補的な
一本鎖ポリヌクレオチドをプローブに捕獲することがで
きる。特定の捕獲領域の温度を制御するためには、この
領域に対応するペルチエ素子５１２を選択して電流を流
せば良い。

【００８５】以下図３１（Ａ）−図３１（Ｅ）および図
３２（Ａ）−図３２（Ｄ）を参照して本実施例によって
血液細胞から直接に細胞の内容物および標的ポリヌクレ
オチドを分取する方法を説明する。

【００８６】まず、血液試料のイオン強度を低下させ、
赤血球を破壊し、血液試料中の細胞が白血球のみになる
ように調製する。図３１（Ａ）は基板１の表面に標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域５５１、５５２、５５３−−−
が形成されている状態を示す図である。図３１（Ｂ）は
ポリヌクレオチド分離セル５４１に血液試料がセル内に
導入され白血球５６１が基板１の表面上を漂遊している
状態を示す図である。この状態で、標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域５５１、５５２、５５３−−−の電極と電極
５１４との間に交流電場を印加し、白血球５６１を標的
ポリヌクレオチド捕獲領域に引き寄せる。このときは電
極５１４と各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の電極間に
生ずる電場密度の勾配が、各標的ポリヌクレオチド捕獲
領域において密となる。また、この時用いる交流電場と
しては周波数１ｋＨｚ以上、１０Ｖ／ｍｍ以上が望まし
い。図３１（Ｃ）は交流電場によって白血球が標的ポリ
ヌクレオチド捕獲領域に引き寄せられ、各領域に白血球
が配置された状態を示す図である。この状態で、蛍光標
識した抗原物質をセル５４１内に導入する。図３１
（Ｄ）は抗原物質に対して抗体反応する白血球（図にハ
ッチングを付した白血球５６２、５６３）のみが標識さ
れた蛍光を発する様になった状態を示す図である。ただ
し、このとき基板表面の温度は４℃程度に冷却し、細胞
中のｍＲＮＡ等の量がマーカー抗原との結合によって変
化しないように制御することが望ましい。温度が低下し
た場合でもＢ細胞等の表面に存在する抗体部の結合能に
顕著な差は見られない。そこで、図２９で説明した光学
系により、蛍光を発する白血球のある標的ポリヌクレオ
チド捕獲領域の位置を検出器１９１の出力により同定す
ることができる。この後、これらを一つづつ順番に加熱
し、破壊することで、前記抗原物質と反応性をもつ細胞
の内容物を試料溶液中に遊離させることが出来る。図３
１（Ｅ）は各領域に固定された白血球のうち白血球５６
３のみが破壊された結果、これが基板１上から無くなっ
た状態を示す図である。したがって、この状態で、交流
電場を他の細胞には印加したままで、ポリヌクレオチド
分離セル５４１中の試料溶液を回収すれば特定の白血球
中の内容物を取り出すことが出来る。

【００８７】図３２（Ａ）は標的ポリヌクレオチド捕獲
領域の一つ６１６にプローブ６７１が固定されている状
況を示す図である。図３２（Ｂ）は、上述のようにし
て、該捕獲領域６１６に白血球６６２が誘引され、捕獲
された状態を示す図である。このように白血球６６２が
捕獲領域６１６に誘引された後、試料溶液を交換し、こ
のｐＨを４程度まで低下させる。これは、蛋白質のｐＫ
値がほぼ４以上であり、ｐＨを４以下にすることで蛋白
質が持つ総電荷が正となり、ポリヌクレオチドが持つ電
荷が負であることから容易に直流電場中で分離すること
が出来るためである。このようなｐＨ条件下でペルチェ
素子５１２によって捕獲領域６１６の温度を上げ、白血
球を破壊する。そこで、標的ポリヌクレオチド捕獲領域
６１６の電極を陽極、対向する面の電極５１４を陰極と
すると、ポリヌクレオチド６６４は捕獲領域６１６に集
まり、蛋白質６６３は対向する電極５１４の面に電気泳
動される。図３２（Ｃ）は、ポリヌクレオチド６６４お
よび蛋白質６６３が電気泳動により移動する様子を模式
的に示す図である。この状態で容器内の溶液を交換する
ことで、蛋白質とポリヌクレオチドを簡単に分離するこ
とが出来る。なお、この時、当然のことながら、標的ポ
リヌクレオチド捕獲領域に固定されているプローブ６７
１と相補的なポリヌクレオチドはこれと結合する。

【００８８】次に、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の電
極を陰極、対向する電極５１４を陽極とすると、捕獲領
域６１６上でプローブ６７１に結合した標的ポリヌクレ
オチド６６６は領域６１６上に残るが、結合しなかった
ポリヌクレオチドは試料溶液中に遊離する。したがっ
て、この時の試料溶液を回収すると、白血球６６２中の
ポリヌクレオチドの内、プローブ６７１と結合しなかっ
たものを溶液中に回収することが出来る。図３２（Ｄ）
は、プローブ６７１に結合しなかったポリヌクレオチド
６６５が電気泳動により移動する様子を模式的に示す図
である。

【００８９】最後に、特定の標的ポリヌクレオチド捕獲
領域の温度を９５℃程度まで上昇させることで、その領
域のプローブに結合した特定の標的ポリヌクレオチドが
遊離することから、この時の試料溶液を回収することで
目的としたｍＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチドを回収
することが出来る。

【００９０】一つの白血球について本手順を終了した
後、同様に次の白血球に付いて同じ手順をとれば、順次
１白血球ずつ目的とするｍＲＮＡ等の標的ポリヌクレオ
チドを回収することができる。また、マーカー標識によ
る染色で、異なる２種類以上のマーカーで染色し、異な
るフィルターで観察することで、複数の条件に合致する
細胞を選択し、回収してもよい。

【００９１】また、標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプ
ローブに標的ポリヌクレオチドが結合した状態で、標的
ポリヌクレオチドの総量を、光学系の信号により、定量
的に測定することが出来る。したがって、本実施例は、
Ｂ細胞等の白血球中のｍＲＮＡの総量を検査することに
も応用でき、特定の抗原に対して反応性を持った白血球
の活性を見積もることにより、高速かつ簡便に病状を知
ることも出来る。

【００９２】もちろん、この実施例が白血球に限らず、
任意の細胞について行えるものであることは言うまでも
ない。

【００９３】

【発明の効果】本発明によれば、効率良く且つ高精度に
標的ポリヌクレオチドを分取できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のポリヌクレオチド分離方法および装置
が遺伝子の解析および選択的な回収処理の中で占める位
置を説明するための遺伝子処理のフロー図である。

【図２】本発明の第１の実施例の基本構成を示す模式図
である。

【図３】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する
第１の手段を示す模式図である。

【図４】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する
第２の手段を示す模式図である。

【図５】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する
第３の手段を示す模式図である。

【図６】第１の実施例のポリヌクレオチド分離セルの具
体的な構造を示す模式図である。

【図７】図６で示したセルのＡ−Ａ断面図である。

【図８】図６で示したセルのＢ−Ｂ断面図である。

【図９】Ａ−Ｃは本発明の第１の実施例の核酸分離プロ
セスを示すタイムテーブルである。

【図１０】本発明の第２の実施例の標的ポリヌクレオチ
ド捕獲領域を持つ基板１と標的ポリヌクレオチド捕獲領
域における捕獲状態を検知するための光学系との関係を
示す図である。

【図１１】図１０に示す基板１のＡ−Ａ断面図を示す。

【図１２】Ａ−Ｃに第２の実施例の基板１の温度制御部
１３３のＢ−Ｂ断面、Ｃ−Ｃ断面およびＤ−Ｄ断面の断
面図を示す。

【図１３】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２
５１とその関連装置のブロック図を示す。

【図１４】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２
５１のＧ−Ｇ断面図を示す。

【図１５】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セルの
分離プロセスを説明するタイムテーブルを示す。

【図１６】本発明の第３の実施例による基板１でプロー
ブを安定に固定できた様子を示す図である。

【図１７】（Ａ）から（Ｃ）は第３の実施例の基板によ
る効果を確認する実験結果を説明する図である。

【図１８】（Ａ）、（Ｂ）は第３の実施例による基板に
よってプローブに捕獲された標的オリゴヌクレオチドが
効果的に解離、回収出来ることを説明する図である。

【図１９】本実施例による二本鎖ポリヌクレオチドの分
取について説明する電気泳動の結果を模式的に示す図で
ある。

【図２０】第４の実施例で採用できる細管の外面図であ
る。

【図２１】第４の実施例で採用できる細管のＡ−Ａ断面
図である。

【図２２】標的ポリヌクレオチド捕獲領域にプローブを
固定するための構造の例を説明する図である。

【図２３】第４の実施例のポリヌクレオチド分離装置の
全体構成を示す図である。

【図２４】第４の実施例のポリヌクレオチド分離モジュ
ール４３１のＢ−Ｂ断面を示す図である。

【図２５】図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分
離モジュール４３１の変形例を示す図である。

【図２６】図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分
離モジュール４３１の変形例を示す図である。

【図２７】図２６に示した実施例のポリヌクレオチド分
離モジュール４３１の変形例を示す図である。

【図２８】第５の実施例の基本要素を示す図である。

【図２９】図２８で説明した基本要素を持つポリヌクレ
オチド分離セルと光学系を組み合わせた本実施例の基本
構成を示す図である。

【図３０】図２９で説明した分離セルのＡ−Ａ断面を示
す図である。

【図３１】（Ａ）は図２８で説明した基板の表面に標的
ポリヌクレオチド捕獲領域が形成されている状態を示す
図、（Ｂ）はポリヌクレオチド分離セル内に血液試料が
導入され白血球が基板の表面上を漂遊している状態を示
す図、（Ｃ）は交流電場によって白血球が標的ポリヌク
レオチド捕獲領域に引き寄せられ、各領域に白血球が配
置された状態を示す図、（Ｄ）は抗原物質に対して抗体
反応する白血球のみが標識された蛍光を発する様になっ
た状態を示す図、（Ｅ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領
域の各領域に固定された白血球のひとつのみが破壊され
た結果、これが基板上から無くなった状態を示す図であ
る。

【図３２】（Ａ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域の一
つにプローブが固定されている状況を示す図、（Ｂ）は
標的ポリヌクレオチド捕獲領域に白血球が誘引され、捕
獲された状態を示す図、（Ｃ）はポリヌクレオチドおよ
び蛋白質が電気泳動により反対方向に移動する様子を模
式的に示す図、（Ｄ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域
のプローブに結合しなかったポリヌクレオチドが電気泳
動により移動する様子を模式的に示す図である。

【符号の説明】

１…基板、１３…基板ベース、１３１…導電性膜、１３
２…熱伝導性絶縁基板、１４、１４１、１４２、１４
３、１４４、１４５、１４６…核酸結合領域、１５…対
物レンズ、１５１…バンドパスフィルター、１５２…エ
ミッションフィルター、１６…蛍光観察用光源、１７…
レーザー光源、１８１、１８２…ダイクロイックミラ
ー、１８３…ミラー、１９１…検出器、１９２…解析装
置部、２１…光吸収層、２２…断熱層、２３、２４…微
粒子、３１…ヒーター、３２、３４、３５…ペルチエ素
子、３３…冷却板、４１、４３、４４、４７…基板上に
固定したオリゴヌクレオチドと結合した核酸試料、４
２、４５、４６…基板上に固定したオリゴヌクレオチ
ド、５１…集束光、７…核酸分離セル、７１１、７１
２、７１３…試料出入り口、７１４…孔、７２１…セル
上板、７２２…セル下板、７２３…スペーサー、７３
１、７３２、７３３…試料室、７４１…核酸分離セル保
持治具、７４２、７４３、７４４…レール、７５１、７
５２、７５３、７５４、７５５…電極。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平11−18004 (32)優先日 平成11年１月27日(1999．1．27) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 加藤 宏一 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地株式会社 日立製作所基礎研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB50 CB01 CB21 DA12 FA29 FB02 FB07 FB12 FB15 GC15 HA09 JA05 4B024 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 AA24 AA25 BB01 BB20 CC01 CC02 CC03 CC08 CC11 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QA18 QA20 QQ08 QQ09 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR41 QR55 QR66 QR82 QS34 QS39 QX02

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の手順よりなるポリヌクレオチド分離
   方法。表面に独立した複数の領域を有する基板の各領域
   に特定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプ
   ローブを固定すること、 該基板上にポリヌクレオチドを含む試料溶液を供給する
   こと、該試料溶液を所定の温度にあげた後温度を下げて
   前記各プローブと相補性のあるそれぞれのポリヌクレオ
   チドを各プローブに結合させること、 該基板上の溶液を試料溶液からポリヌクレオチドを含ま
   ない溶液に交換すること、および前記基板上の独立した
   複数の領域のうち一つの領域の基板表面の温度を所定の
   温度にあげることで、前記領域に固定されたプローブと
   相補的に結合したポリヌクレオチドのみを解離させ、こ
   れを回収すること。
2. 【請求項２】以下のものよりなるポリヌクレオチド分離
   装置。表面の独立した複数の領域にそれぞれ特定の塩基
   配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを固定
   された基板、 該基板上にポリヌクレオチドを含む試料溶液を供給する
   手段、 該基板上の溶液を試料溶液からポリヌクレオチドを含ま
   ない溶液に交換する手段、 該試料溶液を所定の温度にあげる温度制御手段、 前記基板上の独立した複数の領域のうち特定の一つの領
   域の部分のみの基板表面の温度を所定の温度にあげる温
   度制御手段、および前記基板上の試料溶液を回収する手
   段。
3. 【請求項３】前記基板上の各領域のプローブに捕獲され
   たポリヌクレオチドに関する蛍光色素の蛍光強度、ある
   いはポリヌクレオチド自体が持つ自家蛍光の強度を前記
   基板の各領域について定量的に検出する手段を有する請
   求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
4. 【請求項４】前記蛍光観察に用いる励起光の波長として
   ２８０ｎｍより６５０ｎｍの光を用いる請求項３記載の
   ポリヌクレオチド分離装置。
5. 【請求項５】定量的に検出した前記基板の各領域に捕獲
   された核酸試料あるいは前記基板表面に付加された蛍光
   色素の蛍光強度の変化、あるいは前記核酸試料の自家蛍
   光の強度変化より前記各領域の温度を解析する手段を有
   する請求項３記載のポリヌクレオチド分離装置。
6. 【請求項６】前記蛍光色素より発せられた蛍光の強度を
   検出する手段によって得られた前記基板の各領域の温度
   に関する解析結果を基に、基板表面の特定の領域の温度
   を回帰制御する手段を有する請求項５記載のポリヌクレ
   オチド分離装置。
7. 【請求項７】サーミスタあるいは熱電対により前記各領
   域の温度を解析する手段を有する請求項２記載のポリヌ
   クレオチド分離装置。
8. 【請求項８】前記サーミスタあるいは熱電対により前記
   各領域の温度を解析する手段によって得られた前記基板
   の各領域の温度に関する解析結果を基に、基板表面の特
   定の領域の温度を回帰制御する手段を有する請求項７記
   載のポリヌクレオチド分離装置。
9. 【請求項９】前記基板の各領域に設けられた高い光吸収
   特性を持つ薄膜層あるいは微粒子層と、集束光を前記基
   板上の特定の領域の薄膜層あるいは微粒子層に選択的に
   照射する手段を備え、前記特定の微小領域が選択的に照
   射される光の光吸収によって局所的に加熱されるもので
   ある請求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
10. 【請求項１０】前記微小領域を加熱するために用いる集
    束光の波長として核酸が吸収を持たない波長の光を用い
    る請求項９記載のポリヌクレオチド分離装置。
11. 【請求項１１】表面に各々異なるプローブを固定した分
    割された複数の領域を持つ基板において、４００ｎｍよ
    り長波長の光を吸収する物質が塗布あるいは散布あるい
    は蒸着されていることを特徴とする請求項９項のポリヌ
    クレオチド分離装置。
12. 【請求項１２】前記蛍光観察用に用いる励起光の波長、
    蛍光観察する光の波長、および微小領域を加熱する集束
    光の波長が互いに異なっている請求項９記載のポリヌク
    レオチド分離装置。
13. 【請求項１３】基板に比して極めて高い光吸収特性を持
    つ微粒子球と、開口数１２以上の集束光によって生じる
    光輻射圧によって溶液中に浮遊する前記微粒子を捕獲す
    る手段と、前記微粒子を前記光輻射圧による捕獲手段に
    よって前記基板上の特定の領域近傍に自在に移動させ基
    板上の特定の領域を局所的に加熱する手段を有する請求
    項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
14. 【請求項１４】前記基板の各領域各々に付加された発熱
    体層のアレーと、前記発熱体層の一つを発熱させること
    によって特定の微小領域を局所的に加熱する手段とを有
    する請求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
15. 【請求項１５】前記基板の形状が管状であり、その内表
    面に各々異なる核酸プローブを固定した分割された複数
    の領域を持つ細管に試料核酸溶液を導入する手段と、前
    記プローブと前記試料溶液中のポリヌクレオチド成分と
    を結合させるための温度制御手段と、前記管内の基板表
    面のプローブと結合しなかった試料溶液中のポリヌクレ
    オチドを除去する手段と、前記細管内の複数の領域のう
    ちの特定の領域を加熱しその領域のプローブに結合した
    前記試料溶液中のポリヌクレオチド成分を解離させる手
    段と、前記解離した核酸成分を回収する手段からなる請
    求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
16. 【請求項１６】前記内面に各々異なる核酸プローブを固
    定した分割された複数の領域を持つ細管に試料核酸溶液
    を導入する手段と、前記プローブと前記試料溶液成分と
    を結合させるための温度制御手段と、前記管内の基板表
    面のプローブと結合しなかった試料溶液中のポリヌクレ
    オチドを除去する手段と、前記細管内の複数の領域のう
    ちの特定の領域のみに接するように核酸を含まない液滴
    を配置する手段と、前記細管を加熱し前記液滴が接した
    領域のみの核酸プローブに結合した前記試料溶液成分を
    解離させる手段と、前記解離した核酸成分を含む液滴を
    回収する手段からなる請求項１５記載のポリヌクレオチ
    ド分離装置。
17. 【請求項１７】前記内面に各々異なるプローブを固定し
    た円筒状に分割された複数の領域を持つ細管と、前記細
    管に試料溶液および洗浄液および空気を導入する手段
    と、前記細管の前記各領域を各々独立に加熱する手段
    と、前記細管の特定の領域を加熱しその領域の核酸プロ
    ーブに結合した前記試料溶液成分を解離させ回収する手
    段からなる請求項１６記載のポリヌクレオチド分離装
    置。
18. 【請求項１８】前記基板表面に金属の薄膜層を有し、前
    記金属薄膜層の表面に形成された金属酸化物と架橋剤に
    よって前記プローブが結合している請求項２記載のポリ
    ヌクレオチド分離装置。
19. 【請求項１９】金属酸化膜層が３５０ｎｍ以上６３３ｎ
    ｍ未満の範囲のコヒレント光あるいは連続波長からなる
    光を吸収する請求項１８記載のポリヌクレオチド分離装
    置。
20. 【請求項２０】金属酸化膜層が６３３ｎｍ以上１０５３
    ｎｍ以下の範囲のコヒレント光あるいは連続波長からな
    る光を吸収する請求項１８記載のポリヌクレオチド分離
    装置。
21. 【請求項２１】活性残基ＡとリンカーＲと酸化表面を有
    する金属Ｍｅからなる一般式Ａ−Ｒ−Ｏ−Ｍｅからなる
    金属表面を有し、活性残基Ａを介してポリヌクレオチド
    プローブを固定した構造を持つ請求項１８記載のポリヌ
    クレオチド分離装置。
22. 【請求項２２】酸化表面を有する金属表面にシランカッ
    プリング試薬により活性残基を導入し、概活性残基を介
    してポリヌクレオチドプローブを固定した構造を持つ請
    求項２１記載のポリヌクレオチド分離装置。
23. 【請求項２３】活性残基Ａがグリシドキシ基で、アミノ
    基を有するポリヌクレオチドプローブを固定した構造を
    持つ請求項２１記載のポリヌクレオチド分離装置。
24. 【請求項２４】金属酸化膜層がＣｒ、Ｔｉ、Ｖ、Ｆｅ、
    Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｗ、のいずれかの金属酸化物を有す
    ることを特徴とする請求項１８記載のポリヌクレオチド
    分離装置。
25. 【請求項２５】前記基板表面に直流電場を印加する手段
    を有する請求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
26. 【請求項２６】試料をふくむ溶液のｐＨを４以下にして
    前記直流電場を印加して核酸プローブで修飾された基板
    表面に核酸成分のみを引き寄せる手段を有する請求項２
    ５記載のポリヌクレオチド分離装置。
27. 【請求項２７】前記基板表面に交流電場を印加する手段
    を有する請求項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
28. 【請求項２８】試料溶液を保持する容器と、２次元に分
    割された複数の領域を持ち、表面の前記各領域がそれぞ
    れ核酸プローブで修飾された基板と、前記基板の各領域
    に独立に交流あるいは直流電場を印加する手段と、前記
    基板の各領域を独立に発熱させる手段と、前記捕獲され
    た細胞が存在する領域を確認し、かつ、マーカーによっ
    て染色された細胞の位置を確認する手段とを有する請求
    項２記載のポリヌクレオチド分離装置。
29. 【請求項２９】前記各領域が各々独立に６０℃以上９５
    ℃以下まで加熱することが可能な発熱手段を用いた請求
    項２記載のポリヌクレオチド分離装置。