JPH04148700A - 遺伝物質検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の目的は、疾病の原因となる。ウィルス。

細菌等の外来性の遺伝物質、あるいは、生物中の特定の
遺伝情報を担う遺伝物質の有無および変異を検出する方
法に関する。

〔従来の技術〕

標的となる核酸（ＤＮＡ又はＲＡ　Ｎ　）試料、または
標的ＤＮＡまたまＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮ
ＡまたはＲＮＡ断片である核酸プローブ、のいずれか一
方を固相に固定したハイブリダイゼーション反応を用い
る従来の遺伝物質検呂法は、プロシーデインゲス　オブ
　サイエンス　ニー　ニス　ニー　８０巻（１９８３年
）第２７８頁から２８２頁（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０（１９８３）　ｐ　ｐ　２
７８〜２８２）に記載されている。

この方法は、まず、電気泳動によって分子量分離したＤ
ＮＡ断片試料をニトロセルロース膜上に転写、固定した
後、この膜をＲＩ　　（放射性同位元素）標識されたＤ
ＮＡプローブと含む溶液に浸してハイブリダイゼーショ
ン反応を行う０反応後、未反応ＤＮＡプローブを洗浄に
より膜から流い流す。その後で、膜に結合したまま残っ
ているＤＮＡプローブをオートラジオグラフィにより検
出することにより、標的遺伝物質の有無を判定する。ま
た、上記ハイブリダイゼーション反応で形成されるハイ
ブリッド体は、塩基配列の相補性が高い程、ＤＮＡ断片
試料とＤＮＡプローブは強く結合し、高い温度でも解離
することがない、そこで、ＤＮＡ断片試料がＤＮＡプロ
ーブと完全な相補性をもつ場合には解離せず、相補性が
不完全な場合には解離するような温度で洗浄を行うこと
により、ＤＮＡ断片試料がＤＮＡプローブと完全な相補
性を持つか否か判定できる。相補性が完全な場合には、
ＤＮＡプローブは膜に結合したまま残って検出されるが
、そうでない場合には、ＤＮＡプローブは膜から洗い流
されて検出されない。

また、血液２便等の試料中の細菌、ウィルス等の外来性
の標的遺伝物質を検出する方法が、特開昭５８−３１９
９８に開示されている。この方法では、精製した試料中
のＤＮＡを加熱等により変性させて一本鎖とした後、こ
れをニトロセルロースなどのフィルターに固定する０次
に、検査したい細菌。

ウィルスの遺伝子と相補的な塩基配列を持つＲＩ標識さ
れたＤＮＡプローブを反応させた後、このフィルターを
洗浄する。もし、被検者が細菌、ウィルスに感染してお
り、試料中にその遺伝子が含まれていれば、これにＤＮ
Ａプローブがハイブリダイゼーション反応により結合し
てフィルター上に残る。これをオートラジオグラムによ
り検出することにより、標的遺伝物質の有無を判定でき
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、核酸プローブの標識にＲＩを用いるた
め、その検出にオートラジオグラフィを必要とした。こ
の方法１よ自動装置化に適さないばかりでなく、検出に
長時間を必要とする。また、定量的な計測も難しい。さ
らに作業者の放射線被爆を防止しなければならないとい
う問題もあった。

本発明の目的は、核酸プローブの非ＲＩ標識を実現し、
スループットが大きく、かつ精度の高い定量的な測定が
可能であり、さらに自動装置化に適した遺伝物質を検出
方法を提供することにある。

また併せて方式の非ＲＩ化により作業者を放射線被爆か
ら解放できる。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明では、標的遺伝物質
の互いに排他的な部分に相補的な二種類の核酸プローブ
を用意する。一方は、固体基質に固定し、他方は微粒子
に固定する。上記核酸プローブと標的遺伝子とのハイブ
リダイゼーション反応によるサンドインチハイブリッド
体の形成により、微粒子を上記固体基質に固定する。基
質上に固定された微粒子数により標的遺伝物質の有無を
検出できるようにしたものである。

また、固体基質に固定化された微粒子数の溶液中での光
散乱あるいは光音響法による計測、あるいはフローセル
中での計測を実現するために、変性条件下でハイブリッ
ド体の解離反応を起こすようにしたものである。

さらに、標的遺伝物質中に遺伝子変異の検出を可能とす
るために、未反応の微粒子固定核酸プローブの洗浄を標
的遺伝物質と上記二種類の核酸プローブの相補性が不完
全なハイブリッド体を解離せしめる温度で行うようにし
たものである。

また、微粒子の検出を高感度かつ高精度に行えるように
、微粒子を蛍光体化したものである。

〔作用〕

標的遺伝物質の互いに排他的な部分に相補的な二種類の
核酸プローブと標的遺伝物質をハイブリダイゼーション
条件下で反応させると、標的遺伝物質を中心とした。上
記三種の核酸のサンドイッチハイブリッド体が形成され
る。この時、一方の核酸プローブを固体基質に固定化し
、他方の核酸プローブに微粒子を固定しておくことによ
り、微粒子が固体基質に固定されることになる。

固定基質としては、試験管等の反応容器の内面あるいは
、反応容器中に投入した、ガラス等からできた粒子のよ
うなものでもよい。また核酸プローブに固定化する微粒
子は、ポリスチレン、ガラス、ナイロン、ゴムその他の
化学物質、および赤血球その他の生体物質から作製でき
る。ここで、固体基質に固定された微粒子は、試料中の
標的遺伝物質の量に比例することになるので、上記固定
化微粒子数を計測することにより、標的遺伝物質の定量
が可能となり、標的遺伝物質中の目的遺伝子の有無が検
出できる。ただし、未反応の微粒子固定核酸プローブの
固体基質表面への残存により目的遺伝物質の定量性が損
われるので、微粒子計測前の洗浄による除去が必要であ
る。固体基質への固定化された微粒子の計測は、顕微鏡
下での計数によって行うことができる。

微粒子の計測を溶液中で行うことにより、計測の簡便化
が実現できる。固体基質にサンドイッチハイブリダイゼ
ーション反応によって固定化された微粒子は、加熱ある
いは溶液のアルカリ性化による変性条件下で、核酸二本
鎖ハイブリッドの解離により、溶液中に分散することに
なる。溶液中の微粒子数は、光をこの溶液中に入射した
時の散乱光強度、あるいは、光音響分光法により、発生
する音波の強度から容易に計測できる。

また、微粒子の計測をフローセル中で行うことにより、
計測の簡便化と高精度化が実現できる。

変性条件下で溶液中に分散した微粒子をフローセルに導
き、フローセル中に設けられた検出領域を通過する微粒
子を検出することにより、微粒子１個１個を計測できる
。微粒子の検出は光散乱、光吸収、蛍光検出などにより
実現できる。

上述のように、ハイブリダイゼーション反応で形成され
る核酸のハイブリッド体は、塩基配列の相補性が高い程
強く結合し、高い温度でも解離することがない。そこで
目標遺伝物質と核酸プローブが完全な相補性をもつ場合
には解離せず、相補性が不完全な場合には解離するよう
な温度で洗浄することにより、目標遺伝物質中に遺伝子
変異が存在し、核酸プローブとの相補性が不完全な状態
で固定化された微粒子を洗い流すことができる。

この条件下で微粒子を計測することにより、核酸プロー
ブと完全に相補的な目標遺伝物質のみを検出できる。核
酸プローブとして正常遺伝物質に相補的なものを用いる
ことにより正常遺伝物質の検出が可能となり、また、変
異を含む遺伝物質に相補的なものを用いることにより、
遺伝物質中の異常検出が可能となる。

また、微粒子を蛍光性、すなわち蛍光体で標識すること
により、微粒子の顕微鏡下の計測、溶液中での検出、フ
ローセル中での検出を感度良く行うことができるため、
測定精度が向上する。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。

本実施例では、ＤＮＡ試料としてプラスミドの一種であ
る二本鎖のＭＢＬＩｌｐ８ＲＦＤＮＡを用いた。ＭＢＤ
ＮＡに相補的な第１のプローブとして、ＤＮＡシーケン
ス用のプライマーとして用いられる。

２１ｍａｒのオリゴヌクレオチドである、（５−ＣＧＴ
ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’　）の配
列のものを用いた。第２のプローブとしてこれと３００
塩基程離れた、（・５　’　−ＧＴＧＡＧＡＣＧＧＧＣ
ＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴ−３’　）の配列をもつ２１ｍａ
ｒを用いた。

上記、第１のプローブをポリスチレンビーズに固定し、
第２のプローブをガラス基盤に固定したポリスチレンピ
ースは、０．２μｍの直径で１表面に蛍光体であるＦＩ
ＴＣ（フロロセインイソチオシアネート）が標識されて
おり、またポリスチレン表面にはカルボキシ基が存在す
るものを用いた。上記オリゴヌクレオチドの５′側に１
００ｍｅｒのポリＡをつなぎ、その５′側をアミノ化し
て、ポリスチレンのカルボキシ基と結合した。

ガラス基盤としては、顕微鏡のスライドグラス様のもの
を用いた。このガラスの表面をそれぞれ４ｍ間隔で平面
状に展開した２ｍ径の部分を除いてテフロン処理した。

上記２１１１１１径の部分に第２のＤＮＡプローブを固
定した。

上記固定は以下の手順で行った。まずガラス表面をアミ
ノシラン化してアミノ基を導入する。

方、ＤＮＡプローブの５′に１００＋＋＋ｅｒのポリＡ
をつなぎ、これに、イミダゾール、エチレンジアミン、
無水ＥＤＴＡを順次反応させ、カルボキシル基を導入す
る。これとガラス表面のアミノ基を結合させることによ
り、第２のプローブをガラス表面に固定した。

ハイブリダイゼーション反応は以下の手順で行なった。

試料となるＭＢＩ’１ＦＤＮＡと、第１のプローブを固
定した微粒子を試験管中で混合し、５分間保持する。こ
れをすばやく、上記ガラス基盤上の第２のプローブ固定
位置に滴下し、６５℃のインキュベータ中で１時間加温
する。加温後、室温まで徐冷する。その後、数回Ｂｕｆ
ｆｅｒ液で洗浄する。

反応が終了したガラス板２を、第１図（ａ）に示す顕微
鏡の試料保持台１にセットする。ガラス板２上のスポッ
ト３上に固定化された微粒子をレーザ光で照射する。レ
ーザ発振器４から出たレーザ光はコリメーションレンズ
５，６により適当なビーム径にし、フィルター７により
余分な波長の光を取り除いた後、ダイクロイックミラー
８で反射され、対物レンズ９で集光されて、微粒子の固
定されているスポット３領域に照射される。本実施例で
は、レーザとして４８８ｎｍで発振するＡｒ＋レーザを
用いた。レーザ光で励起されることにより、微粒子の蛍
光体ＦＩＴＣがら発した蛍光は、対物レンズ９で集めら
れ、ダイクロイックミラー８を透過し、蛍光波長領域の
光を選択的に透過するフィルター１０を通った後、光路
切り替え鏡１１の位置により、それぞれ接眼レンズ１２
あるいは１３を通して、肉眼またはカメラ１４で検出さ
れる。ガラス板の位置合わせは肉眼で行い、微粒子の計
測はカメラ１４の印画紙（図示せず）上の蛍光微粒子に
よる発光ポイント数を計数することにより行なった。こ
の発光ポイント数が最初のＤＮＡ試料に含まれていたＭ
ＢＲＦの量に比例する。

第１図（ｂ）は、本実施例を変形した例である。

この例では、蛍光による発光ポイントをカメラで印画紙
上に転写するかわりに、テレビカメラ１４で撮像し、信
号処理部１５で画像データをディジタル変換して、デー
タ処理部１６で、蛍光スポットを検出して計数する。試
料保持台１はコントローラ１７で制御された２軸移動機
構１８によって移動し、微粒子固定スポットに自動的に
位置合わせされる。

本発明の他の一実施例を第２図により説明する。

本実施例では、ＤＮＡ試料としてヒトのβ−グロビン遺
伝子を用いた。ＤＮＡプローブは、ヒトβ−グロビン遺
伝子の５′末端から１４〜３２番目の塩基配列と完全に
相補的なりＮＡ断片（３′ＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴ
ＣＡＧＡＣＧ−５’　）と同じく５３〜７２番目の塩基
配列と完全に相補的なりＮＡ断片（３′−ＣＣＡＣＴＴ
ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣ−５’　）　　を用いた
。上記ＤＮＡプローブを第１．第２のＤＮＡプローブと
して、上記実施例と同様な方法により、微粒子とガラス
製の試験管に固定した０本実施例ではガラス板のかわり
にガラス製の試験管で用いた。

ＤＮＡ試料としては、変異を含まない正常人のβ−グロ
ビン遺伝子（β＾）と５′末端から２０番目のアデノシ
ン（Ａ）がチミン（Ｔ）に変異した、鎌状赤血球貧血症
患者のβ−グロビン遺伝子（βＳ）をそれぞれ制限酵素
ＢａｍＨＩで切断したもの、すなわちβ−グロビン遺伝
子の５′末端付近を含む長さ約１８００塩基対のＤＮＡ
断片を使用した。

上記ＤＮＡ試料とＤＮＡプローブとのハイブリダイゼー
ション反応は上記実施例と同様にして行なった９本実施
例では、バッファ液での洗浄後。

試験管をＤＮＡプローブとＤＮＡ試料のハイブリッド体
が完全に相補的な場合にはハイブリッド体の解離が起こ
らず１点変異によりハイブリッド体の相補性が不完全な
場合には解離が起こるような温度（６５〜７０℃）下に
置き、洗浄操作を繰り返した。その後で、試験管にホル
ムアミドなどの変性剤を加え、９０℃で３０分間加温後
、氷水中で急冷した。

上記手順に従って調整した反応液を蛍光測定用の光学セ
ルに移して、第２図に示す蛍光測定装置で測定した。光
学セン１９中の反応液２ｏにレーザ２１（Ａｒ＋レーザ
）からの波長４８８ｎｍの光を照射する０反応液中の微
粒子に標識されたＦＩＴＣから発する蛍光を集光レンズ
２２．バンドパスフィルター２４．レンズ２３により光
電子増倍管２５で検出する。光電子増倍管の出力電流は
信号処理部２６で電流−電圧変換、増幅、Ａ／Ｄ変換を
受けて、データ処理部２７で処理を受けてプリンタ等に
出力される。

上記手順で計測された蛍光量の大小により、ＤＮＡ試料
中のヒトのグロビン遺伝子の点変異の有無を検出できる
。

第２図（ｂ）は上記第２の実施例の変形例を示すもので
ある。この例では、上記実施例と同様の手順で調製した
反応液をフロー型の蛍光セルに導き、蛍光計測を行う、
同軸構造のフロー管２８の内側の管に導入された反応液
中の微粒子はシースフローとなってフロー管の先端から
流出する。これにレーザ光を照射し、その蛍光量を計測
する。

本実施例によれば、フロー中で蛍光微粒子を１個１個計
測できるので、精度の高い微粒子数の定量が可能となる
。

以上説明した実施例では蛍光標識した微粒子の例を中心
に述べたが、微粒子そのものを顕微鏡画像で、あるいは
溶液中で光散乱あるいは光音響分光的手法で計測できる
のは勿論である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ＲＩ標識を用いることなく。

試料中の特定のＤＮＡを検出・定量することができるの
で、作業者のＲＩ被爆の問題を避けることができる。

また、本発明の計測の方法は自動化に適した方式であり
、ＤＮＡの検出・定量の自動化装置を実現することがで
きる。

また、本発明によれば、貴転子中に存在する、点変異、
挿入、欠失などの異常を検出することができるので、Ｒ
１を用いない遺伝子変異検出のための自動化装置も実現
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）は、本発明の一実施例の構成図、
第２図（ａ）、（ｂ）は本発明の別の実施例の部分構成
図である。 １・・・試料保持台、２・・・ガラス板、３・・・スポ
ット、４・・・レーザ発振器、５．６・・・コリメーシ
ョンレンズ、７・・・フィルター　８・・・ダイクロイ
ックミラー９・・・対物レンズ、１０・・・フィルター
、１１・・・光路切り替え鏡、１２．１３・・・接眼レ
ンズ、１４・・・カメラ、１５・・・信号処理部、１６
・・・データ処理部、１７・・・コントローラ、１８・
・・２軸移動機構、１９・・・光学セル、２０・・・反
応液、２１・・・レーザ、２２・・・集光レンズ、２３
・・・バンドパスフィルター２４・・・レンズ、２５・
・・光電子増倍管、２６・・・信号処理部、２７・・・
データ処理部、２８・・・フロー管、第 図 １γ ｔ ダ 図 （久） （い

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、目標遺伝物質の一部分に相補的な核酸一本鎖プロー
   ブを固定した固体基質に、該目標遺伝物質をハイブリダ
   イゼーション反応により固定せしめる工程と、目標遺伝
   物質の上記一本鎖プローブとは排他的な部分に相補的な
   核酸一本鎖プローブに微粒子を固定したものを該固体基
   質に固定された該遺伝物質にハイブリダイゼーション反
   応により固定化せしめる工程と、未反応の微粒子固定核
   酸プローブを洗浄により、該固体基質から除去する工程
   と、該固体基質に固定化された微粒子数を計測すること
   により該目標遺伝物質を検出する工程から成る遺伝物質
   検出方法。 ２、請求項１記載の方法において、未反応微粒子固定核
   酸プローブを洗浄により、該固定基質から除去する工程
   で、洗浄を該目的遺伝物質と核酸プローブの相補性が不
   完全なハイブリッド体を解離せしめる温度で行うことに
   より、該目標遺伝物質中の変異を検出することを特徴と
   する、遺伝物質検出方法。 ３、請求項１もしくは３記載の方法において、該固体基
   質に固定化された微粒子固定一本鎖核酸プローブを変性
   条件下で該目標遺伝物質から解離せしめた後で、溶液中
   で該微粒子数を計測することにより、該目標遺伝物質を
   検出することを特徴とする遺伝物質検出方法。 ４、溶液中の微粒子を光散乱によって計測することを特
   徴とする請求項２もしくは３記載の遺伝物質検出方法。 ５、溶液中の微粒子を光を照射した時に生ずる音波を計
   測する、光音響法によって計測することを特徴とする請
   求項２もしくは３記載の遺伝物質検出方法。 ６、溶液中の微粒子をフローセルに導き、フローセルを
   通過する微粒子数を計測することを特徴とする請求項５
   記載の遺伝物質検出方法。 ７、該御粒子が蛍光性の微粒子であることを特徴とする
   請求項１、２、３もしくは６のいずれか記載の遺伝物質
   検出方法。