JPH01299463A - Ｄｎａ検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子診断あるいは遺伝子マツピング装置に関
し、特に短時間にＤＮＡパターンを得ることのできる遺
伝子診断装置に関する。

〔従来の技術〕

遺伝子に起因した病気の診断や遺伝子による個体の識別
には遺伝子診断法が用いられている。遺伝子を用いたフ
ィンガープリント法を例に説明する。この場合の目的は
遺伝子が各個人で異なる事を利用して識別する事と親子
などの血縁者の場合には類似点が多い事を利用して親子
判別するなどである。人の遺伝子中には短かい一定の配
列を持ったＤＮＡが繰り返し現われる。しかし、個人に
よりその繰り返しの頻度や場所が異なる。そこでまず、
この部分に水素結合でくっつく　（ハイブリダイゼーシ
ョン）いわゆる相補的なりＮＡオリゴマーを作製する。

このオリゴマーはあらかじめ放射性元素で標識しておく
、これを通常プローブと呼ぶ、解析しようとする２本鎖
ＤＮＡを特定の配列を認識して切断する制限酵素で切断
する。このようにして得たＤＮＡ断片をアガロースゲル
を用いて電気泳動分離する。泳動分離したＤＮＡをナイ
ロンフィルター上に写し取り、二本鎖ＤＮＡを変性させ
て一本鎖にすると共にフィルタ、−上に固定する。この
フィルター上のＤＮＡにプローブＤＮＡをハイブリダイ
ズさせる。この手法はサザンプロット法と呼ばれている
。相補的なくりかえし配列の存在するＤＮＡ断片部にプ
ローブＤＮＡは付着するので、このＤＮＡバンドパター
ンをフィルムに転写する。このパターンは人により異な
るが同一人物の遺伝子バンドパターンは一定である。ま
た、親子では類似部分が多いので種々の鑑定に用いられ
る。

遺伝子上の制限酵素の位置を調べるマツピングにも類似
の方法が用いられている。この種の従来技術に関しては
、日本法医学雑誌４１巻３号２３６頁〜２４１頁（１９
８７年）に記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

これら従来技術ではフィルター上にＤＮＡ断片を写し取
り、更にバンドパターンをフィルムに転写するというや
っかいなプロセスがあり、手間と時間を要していた。更
に放射性元素を用いる必要がある難点もあった。

また、ＤＮＡシーケンサ−などで用いられているように
標識に蛍光Ｍ４識を用いゲルを泳動中に光学的に測定し
ようとすると１分離ゲルにアガロースを用いているため
に散乱光が大きく高感度測定ができない。

本発明はこれら難点を解消し、簡単に短時間でＤＮＡバ
ンドパターンを得るためになされたものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、ＤＮＡプローブを蛍光４Ｍ諏し、相補的な
部分を含む試料ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた状態
でアガロースゲル電気泳動分離し、ゲルからＤＮＡ断片
をバッファ液中に流出させて光照射し、実時間でＤＮＡ
断片から出る蛍光を観測する事により達成される。

［作用〕 蛍光標識したＤＮＡをハイブリダイズさせ、泳動分離し
ながら実時間でバンド検出することにより、サザンプロ
ットおよびオートラジオグラフィなど手間のかかるプロ
セスを省略できる。また、分離にはアガロースゲルが通
常用いられるが、１九は白ｉ♂おり光を照射すると散乱
光が強く検出されて蛍光測定の障害となる。ここではア
ガロースゲルからＤＮＡ断片を引き出した後にレーザー
照射し、散乱による測定障害を除いている。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する６ゲル
板（アガロース板ン７はバッファＩ＆槽中に設置され、
バッファ液１０がゲル板７上面まで満たされている。Ｄ
ＮＡ断片と蛍光Ｓ識したプローブをハイブリダイズした
試料は試料注入井戸９中に注入され、電極１３と１３′
の間にかけられた電界に従がって泳動する。短かいＤＮ
Ａから順にゲル断面１４に到達するが、これらＤＮＡプ
ローブ付ＤＮＡ断片はゲル中がらバッファー液１゜中に
流出する。レーザー光１１はゲル断面１４近傍のバッフ
ァー液１０を端面１４に沿って照射され、流出してくる
ＤＮＡ断片を励起して蛍光信号を得る。泳動時間から遺
伝子上の特定配列の位置を知ることができる。蛍光信号
はレンズ、フィルター系３および光重増幅器付のライン
センサーあるいはビジコンカメラ４で検出され、データ
処理機５に送られる。光照射部６の厚みは十分狭くし、
ＤＮＡ断片群が拡散により照射部以外の所を通過しない
ようしている。

生液体中の粒子の拡散による巾の広がりωはＤを拡散係
数としてｗ＝＝ｆｆで与えられる。電界Ｅが存在する時
、ドリフト速度Ｖ（１は拡散係数Ｔ はボルツマン因子、Ｔは温度、ｅはＤＮＡの持つ電荷、
Ｑは泳動距離である。分離良く検出するにはωを小さく
した方が良い。このためにはＱを小さく、Ｅを大きくす
る必要がある６分析部ゲルの長さを一定とすると、ゲル
から出て光照射部に到る長さをできるだけ小さくする必
要がある。溶液中でのＤＮＡの泳動速度は電界強度５０
ｖ／■下で塩基長によらず約１■／分である６溶液中で
の電界強度を５　Ｖ　／　ｃｓとするとＩＫ塩基のＤＮ
Ａがｌａｎ泳動した時の拡散による広がりは室温で約０
．５ｍｍ　になる。レーザーの１１は通常０．３ｍｍ以
下なのでバッファー液抽出後の拡散による広がりは０．
３１ｍ以下が望ましい。このためにはゲル端面から光照
射部までの距離は５ｍ以下の方が良い。

また、電界強度はイオンの流れる部分の断面積に逆比例
するのでゲルから流出させて光検出部に到る部分の断面
積すなわち厚み（分析部の幅が一定なので）は薄い方が
良い。

第２図は実施例の分離部の変形例である。ゲル７から流
出した後のＤＮＡの拡散による泳動路間の干渉を防ぐた
めに泳動路をガラスあるいは石英（照射部）１５で区分
している。この場合検出器として泳動路毎に光電子増幅
管を用いる事もできる。また、第３図はレーザービーム
Ｉ１３より厚いアガロースゲル板７を使用した時でも高
感度で検出できるように検出部の幅を石英などで強制的
に狭くした例である。同様の事はゲルの厚みを検出部に
ゆくに従がって薄くする事でも達成できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、放射性元素Ｓ識を使うわずられしさや
、分１１ｉＤＮＡのフィルター転写などの手へ 間のかかるプロセスなしにＤＮＳパターン情報を計算機
で処理できる利点がある。このような光検出方式でアガ
ロースゲル分離板中を泳動中のＩ）ＮＡを測定しようと
すると、アガロースゲルからの散乱光が大きく高感度で
測定できない。ここではゲルから流出した直後に検出す
ることでこの雑魚をも解消した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の概念図である。第２図は本
発明の一実施例に用いるゲル分離部を区分したゲル板及
びバッファ液の見取図である。第３図は本発明の一実施
例に用いる計測部の幅を狭くしたゲル板及びバッファ液
の見取図である。 １・・・光源、２・・・ミラー、３・・・レンズ・フィ
ルター系、４・・・光検出器、５・・・データ処理機、
６・・・照射部、７・・・ゲル板、８・・・隔壁板、９
・・・試料注入井戸。 １０・・・バッファー液、１１・・・照射光、１２・・
・泳動槽、１３．１３’・・・電極、１４・・・ゲル端
面、１５・・・泳動路分離板、１６・・・上部カバー、
１７・・・段差第　ｌ　　閉 １　九番、 ３・・しンス”フィルター系 ソ　・＆禾十シ主入子声

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛍光標識された試料を電気泳動分離するためバッフ
   ァ液中に設置される分離ゲルと、該分離ゲルの両端に設
   置され、試料を電気泳動させるための電極と、試料を励
   起発光させる光を発生する励起光源と、試料からの蛍光
   を検出する蛍光検出手段を有する遺伝子診断装置におい
   て、上記光により試料を励起させる光励起領域を上記分
   離ゲルの終端ゲル面に沿つた上記バッファ液中に設けた
   ことを特徴とする遺伝子診断装置。 ２、上記分離ゲルとして不透明ゲルを用いる事を特徴と
   する請求項１記載の遺伝子診断装置。 ３、上記光励起領域の厚さが上記分離ゲルの厚さと等し
   いか、それよりも薄い事を特徴とする請求項１又は２記
   載の遺伝子診断装置。 ４、上記分離ゲルはガラス、石英などの透明物質で区分
   されている複数の泳動路を有する事を特徴とする請求項
   １乃至３のうちいずれかに記載の遺伝子診断装置。 ５、上記光励起領域は試料が流出してくる上記分離ゲル
   の終端ゲル面から５ｍｍ以下の区域に設けた事を特徴と
   する請求項１乃至５のうちいずれかに記載の遺伝子診断
   装置。