JP2020130094A - 核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測方法、および核酸配列計測装置 - Google Patents

核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測方法、および核酸配列計測装置 Download PDF

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Abstract

【課題】チップ間およびスポット間の光量のばらつきの影響を受けず、検出感度に優れる核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測方法及び核酸配列計測装置を提供する。【解決手段】ターゲット３０が供給されない場合には、結合部を介する結合が維持されて、ドナー蛍光分子１１を励起すると、ドナー蛍光分子１１に接近したアクセプター蛍光分子２１にエネルギーが移動し、アクセプター蛍光分子２１が蛍光を呈する。ターゲット３０が供給された場合には、検出部にターゲット３０が結合して結合部を介する結合が解消され、アクセプター蛍光分子２１がドナー蛍光分子１１から離れることによりドナー蛍光分子１１が蛍光を呈する。【選択図】図２

Description

本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイス、該核酸配列計測用デバイスを用いる核酸配列計測方法等に関する。
ＤＮＡチップを用いて特定の核酸の有無や量を計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、互いに独立した蛍光プローブおよび消光プローブが、結合部を介して結合が維持されて消光分子により蛍光分子の蛍光が消光され、ターゲットが供給された場合には、検出部にターゲットが結合して結合部を介する結合が解消され、消光分子が蛍光分子から離れることにより蛍光分子が蛍光を呈する核酸配列計測用デバイスが知られている（特許文献１）。
また、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、励起光を照射する励起光照射手段と、この励起光を照射することにより、基準となる蛍光信号を発生する基準蛍光信号発生手段と、前記基準となる蛍光信号により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量を校正する校正手段と、を備える光量計測装置が知られている（特許文献２）。
特許第５９２８９０６号公報 特開２０１１−１７７２１号公報
しかし、特許文献１の方法では、蛍光プローブと消光プローブの結合による消光が不完全である場合、ターゲットが存在しないときの蛍光（オフセット光）が存在するため少量のターゲットによる蛍光分子の蛍光光量変化の検出下限の制約になっている。また、この方法では、蛍光プローブのみの蛍光光量変化を検出しているため検出感度が十分ではない。
さらに、前記オフセット光は、ターゲットとのハイブリダイゼーションが生じていない場合の、蛍光プローブと消光プローブが結合している状態で、消光分子で消光されない、蛍光分子の蛍光であり、ターゲットとのハイブリダイゼーションにより、蛍光プローブと消光プローブの結合が解消され、消光分子から離れた蛍光分子が増加すると、前記オフセット光は減少するが、特許文献１の方法では、このオフセット光を測定することができない。
一方、特許文献２の光量計測装置では、ＤＮＡチップのハイブリダイズ前後の光量を比較する際に、ターゲットが含まれないネガティブコントールとなるサンプルをハイブリダイゼーション反応させたＤＮＡチップの画像と、ターゲットが含まれるサンプルをハイブリダイゼーション反応させたＤＮＡチップの画像を取得する必要がある。そのためＤＮＡチップの画像の検出光量を比較する際にチップ間、スポット間の光量にばらつきがあり、この光量のばらつきが検出下限の制約となっている。
また、この光量計測装置では、同一チップのハイブリダイズ前後の光量を比較する際に、ハイブリダイズ前のＤＮＡチップの画像を取得し、ＤＮＡチップを一度バイオチップ読取装置からインキュベーターに移してハイブリダイズ反応を促進した上で、再度この装置でＤＮＡチップの画像を取得する必要があり作業が煩雑である。
さらに、この光量計測装置を用いて、２色のレーザーの励起による蛍光物質の蛍光画像を取得しようとすると、それぞれの蛍光物質の蛍光画像を取得する際に装置の構成を変更する必要があるため、２色の蛍光画像の取得にタイムラグが生じ２色の蛍光画像の相関を正しく取ることができない。
本発明の目的は、チップ間およびスポット間の光量のばらつきの影響を受けず、検出感度に優れる核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測方法、及び核酸配列計測装置を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］ ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
結合部および基端を有し、かつ、ドナー蛍光分子が所定の位置に付加されたドナー蛍光プローブと、
結合部および基端を有し、かつ、アクセプター蛍光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
前記ドナー蛍光プローブの基端および前記消光プローブの基端がそれぞれ固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部とが、互いに相補的な配列を有し、
前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブの少なくとも一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列を有する検出部を有し、
前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定される、
ことを特徴とする核酸配列計測用デバイス。
［２］ 前記ターゲットと前記検出部とのハイブリダイゼーションが生じていない場合、前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブとの結合が維持されることにより、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光され、前記アクセプター蛍光分子が蛍光を呈し、
前記ターゲットと前記検出部とのハイブリダイゼーションが生じた場合、前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部との結合が解消されることにより、前記アクセプター蛍光分子から離れた前記ドナー蛍光分子が蛍光を呈することを特徴とする［１］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［３］ 前記ドナー蛍光プローブが、前記検出部を有することを特徴とする［１］または［２］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［４］ 前記消光プローブが、前記検出部を有することを特徴とする［１］または［２］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［５］ 前記基板が平板であり、前記固相面が、該平板の一平面であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［６］ 前記ドナー蛍光プローブの結合部の少なくとも一部が前記検出部として機能することを特徴とする［１］〜［３］および［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［７］ 前記消光プローブの結合部の少なくとも一部が前記検出部として機能することを特徴とする［１］、［２］、［４］および［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［８］ 前記ドナー蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ドナー蛍光プローブの途中であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［９］ 前記アクセプター蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記消光プローブの途中であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１０］ 前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブの両方が、前記検出部を有する、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１１］ ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
（ａ）前記ターゲットを含むサンプルを調製するステップ、
（ｂ）前記サンプルを前記核酸配列計測用デバイスに供給するステップ、
（ｃ）核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ、
（ｄ）前記サンプル中の前記ターゲットと前記核酸配列計測用デバイス中のドナー蛍光プローブまたは消光プローブの少なくとも一方とをハイブリダイゼーション反応させるステップ、および
（ｅ）前記反応後、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ、
を含み、
前記核酸配列計測用デバイスは、
結合部および基端を有し、かつ、ドナー蛍光分子が所定の位置に付加されたドナー蛍光プローブと、
結合部および基端を有し、かつ、アクセプター蛍光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
前記ドナー蛍光プローブの基端および前記消光プローブの基端がそれぞれ固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部とが、互いに相補的な配列を有し、
前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブの少なくとも一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列を有する検出部を有し、
前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定される、
ことを特徴とする核酸配列計測方法。
［１２］ 前記ハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光分子の蛍光量の変化から、ハイブリダイズしたターゲットの分子数を算出することを特徴とする［１１］に記載の核酸配列計測方法。
［１３］ 前記ハイブリダイゼーション反応前後のアクセプター蛍光分子の蛍光量の変化から、ハイブリダイゼーション反応していないターゲットの分子数を算出することを特徴とする［１１］に記載の核酸配列計測方法。
［１４］ ［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイスと、
前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量と、アクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定する蛍光読取装置と、
を有する、核酸配列計測装置。
［１５］ 前記サンプルの存在下で、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量と、アクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定する、［１４］に記載の核酸配列計測装置。
［１６］ 前記ターゲットと前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブとをハイブリダイズさせるための撹拌機能を備える、［１４］または［１５］に記載の核酸配列計測装置。
［１７］ 前記核酸配列計測用デバイスからの蛍光を２色に分離し、同時に蛍光を測定する機能を備える、［１４］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸配列計測装置。
本発明の核酸配列計測用デバイスによれば、アクセプター蛍光分子の蛍光を測定することで結合が維持されているプローブセットの量を計測することができる。また、ドナー蛍光分子の蛍光のオフセット光を、アクセプター蛍光分子の蛍光として検出し、定量することができる。そのため、アクセプター蛍光分子の蛍光により、ドナー蛍光分子のオフセット光を演算で減算することができ、ターゲットとのハイブリダイゼーションによるドナー蛍光分子の蛍光の変化を高精度に検出することができる。
また、ターゲットとのハイブリダイゼーション反応の進行によるドナー蛍光分子の蛍光増加と負の相関があるアクセプター蛍光分子の蛍光減少を捉えることができ、相関を二重でとることができることにより、検出感度を向上させることができる。
さらに、チップ間およびスポット間の光量のばらつきの影響を受けず、検出下限を下げることができる。
本発明の核酸配列計測方法によれば、アクセプター蛍光分子の蛍光を測定することで結合が維持されているプローブセットの量を計測することができる。また、ドナー蛍光分子の蛍光のオフセット光を、アクセプター蛍光分子の蛍光として検出し、定量することができる。そのため、アクセプター蛍光分子の蛍光により、ドナー蛍光分子のオフセット光を演算で減算することができ、ターゲットとのハイブリダイゼーションによるドナー蛍光分子の蛍光の変化を高精度に検出することができる。
また、ターゲットとのハイブリダイゼーション反応の進行によるドナー蛍光分子の蛍光増加と負の相関があるアクセプター蛍光分子の蛍光減少を捉えることができ、相関を二重でとることができることにより、検出感度を向上させることができる。
さらに、チップ間およびスポット間の光量のばらつきの影響を受けず、検出下限を下げることができる。
また、本発明の核酸配列計測方法によれば、ラべリング工程が不要なうえ、洗浄工程を省略することによってハイブリダイズの実験にかかる手間がさらに短縮され、作業時間とともにコストが削減される。さらに、洗浄工程の不備による性能悪化、光量低下、背景光上昇、あるいはバラつきの発生等を回避することが可能となる。従来の手法では、洗浄の仕方や、洗浄度、洗浄のムラなどに起因するシグナルや背景光の上昇とバラつきのリスクが発生するが、本発明によればこのようなリスクを回避できる。それによりアレイ面上でより均一な結果を得ることができ、検出の再現性も向上する。
さらに、本発明の核酸配列計測方法によれば、ハイブリダイズのリアルタイム観察が可能となる。すなわち、ＤＮＡアレイに検出対象分子（ターゲット）を含む溶液を添加した状態のまま（ウェット状態）でのアレイ観察が可能となる。それにより洗浄の影響を排した状態の光量の確認やハイブリダイズのリアルタイム観察が可能となる。したがって、サンプル濃度が高く、ハイブリダイゼーションが早く進む場合など、状況によっては、より短時間でハイブリダイゼーションを終了させることが可能となる。
本発明の核酸配列計測装置によれば、ＤＮＡチップのスポット中の同一の位置座標において、同時点のハイブリダイズ反応の前後の光量変化を演算により算出することができるため、スポット中の固定化されたプローブのばらつき及びハイブリダイゼーション反応のばらつきを詳細に把握することができる。また、蛍光画像中で、ドナー蛍光分子の蛍光量（以下、ドナー蛍光量ともいう）とアクセプター蛍光分子の蛍光量（以下、アクセプター蛍光量ともいう）の変化の相関が大きいピクセルを選択して、光量変化を演算で算出することができ、高精度な測定が可能となる。
従来の核酸配列計測装置では、スポット全体の平均光量を演算で算出して光量変化を確認していたため、スポットの面分布でのプローブ分子の固定化量のむらやハイブリダイズ反応による光量変化のむらが存在する場合に、スポット中でハイブリダイズ反応による光量変化が認められる部位を見落としていた。本発明の核酸配列計測装置によれば、スポットの画像を取得することができるため、検出器の各ピクセルについて光量変化を確認することができ、詳細な光量変化を検出できる。また、ドナー蛍光量とアクセプター蛍光量の変化の相関が高いピクセルを選択することにより、ハイブリダイズ反応による光量変化の有無を正確に検出することができる。このため同一のタイミングで位置のずれがない、ドナー蛍光分子の蛍光画像（ドナー蛍光画像）と、アクセプター分子の蛍光画像（アクセプター蛍光画像）を取得することができ、より精度の高い解析が可能となる。
プローブの構成例を示す図である。 ターゲットを検出する原理を模式的に示す図である。 変形例を示す図であり、ドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子がプローブの途中に位置している例を示す図である。 変形例を示す図であり、（ａ）は、複数個所にドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子が付加された例を示す図、（ｂ）は、ターゲットが消光プローブに結合する例を示す図である。 核酸配列計測装置を示す構成図である。 波長で分離されたドナー蛍光画像とアクセプター蛍光画像の模式図である。 濃度の異なるターゲットをハイブリダイズさせたときのハイブリダイゼーション反応の光量変化を示す図である。 ターゲットがないときのアクセプター蛍光分子の蛍光量がドナー蛍光分子の蛍光量と等量になるようにアクセプター蛍光分子の蛍光量に乗算する係数を設定し、濃度の異なるターゲットのアクセプター蛍光分子の蛍光量に設定した係数をかけた数値をドナー蛍光分子の蛍光量から減算した補正光量を示す図である。
本発明の核酸配列計測用デバイスは、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
結合部および基端を有し、かつ、ドナー蛍光分子が所定の位置に付加されたドナー蛍光プローブと、
結合部および基端を有し、かつ、アクセプター蛍光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
前記ドナー蛍光プローブの基端および前記消光プローブの基端がそれぞれ固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部とが、互いに相補的な配列を有し、
前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブの少なくとも一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列を有する検出部を有し、
前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定される、
ことを特徴とする。
以下、本発明の核酸配列計測用デバイスの実施形態について説明する。
図１は、プローブの構成例を示す図である。
図１に示すように、本実施形態の核酸配列計測用デバイスは、基板などの固相面１００に、検出対象となる核酸であるターゲット３０の相補配列にドナー蛍光分子１１を付加したドナー蛍光プローブ１０と、アクセプター蛍光分子２１を付加した消光プローブ２０と、がそれぞれ固定されて構成される。本発明では、ドナー蛍光分子１１からアクセプター蛍光分子２１への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理が用いられ、アクセプター蛍光分子２１がドナー蛍光分子１１に接近すると、ドナー蛍光分子１１の励起により、ドナー蛍光分子１１からアクセプター蛍光分子２１へエネルギーが移動し、アクセプター蛍光分子が蛍光を呈するようになる。
ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子の組み合わせは、蛍光共鳴エネルギー移動が生じる組み合わせであれば特に制限はないが、蛍光共鳴エネルギー移動効率が高い、ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子の組合せが好ましい。蛍光共鳴エネルギー移動効率が高いドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子の組合せを選択することにより、さらに感度を向上させることができる。エネルギー移動が生じる、ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子の組み合わせの例と、それぞれの蛍光分子の励起波長と蛍光波長を表１に示す。下記の表１において、ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子のそれぞれの列の左右２種類の蛍光分子の組み合わせが、ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子の組み合わせの例を示している。
Figure 2020130094
図１に示すように、ドナー蛍光プローブ１０は、３’末端から設けられ、ターゲット３０の相補配列とされる数塩基分のＸ部１２と、Ｘ部１２に続いて設けられ、ターゲット３０の相補配列とされる検出配列１３と、検出配列１３に接続され５’末端まで続くリンカー１４と、を備え、ドナー蛍光プローブ１０の３’末端にドナー蛍光分子１１が固定される。
消光プローブ２０は、５’末端から設けられる数塩基分のＹ部２２と、Ｙ部２２に続いて設けられ、ターゲット３０の相補配列とされる検出配列２３と、検出配列２３に接続され３’末端まで続くリンカー２４と、を備え、消光プローブ２０の５’末端にアクセプター蛍光分子２１が固定される。
ドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０は、それぞれリンカー１４およびリンカー２４を介して固相面１００に固定化される。また、ドナー蛍光プローブ１０のＸ部１２の配列と消光プローブ２０のＹ部２２の配列とは、互いに相補的とされる。また、ドナー蛍光プローブ１０のＸ部１２と消光プローブ２０のＹ部２２とが互いに結合可能な位置にドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０が固定されるとともに、ドナー蛍光プローブ１０のＸ部１２と消光プローブ２０のＹ部２２とが結合したときに、アクセプター蛍光分子２１がドナー蛍光分子１１に接近し、ドナー蛍光分子に励起光が照射されると、ドナー蛍光分子１１からアクセプター蛍光分子２１にエネルギーが移動し、アクセプター蛍光分子が蛍光を呈するような位置関係が確保されている。
なお、本発明において相補的であるとは、一方の核酸配列が、他方の核酸配列と２本鎖状態を形成することのできる核酸配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。
また、ドナー蛍光プローブ１０とターゲット３０との親和性を、Ｘ部１２およびＹ部２２によるドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０との親和性よりも高く設計することが望ましい。
次に、本発明の核酸配列計測用デバイスによりターゲット３０を検出する原理について説明する。図２はターゲットを検出する原理を模式的に示す図である。
図２に示すように、ターゲット３０が存在しないときはドナー蛍光分子１１およびアクセプター蛍光分子２１がそれぞれ付加されたドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０とが結合することにより、ドナー蛍光分子１１とアクセプター蛍光分子２１が接近した状態にある。この状態でドナー蛍光分子に励起光が照射されると、励起されたドナー蛍光分子１１のエネルギーがアクセプター蛍光分子２１に移動し、ドナー蛍光分子１１は消光され、アクセプター蛍光分子２１が蛍光を呈する。
ターゲット３０が存在すると、ターゲット３０はドナー蛍光プローブ１０と結合する。ターゲット３０がドナー蛍光プローブ１０と結合すると、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０の結合が外れてアクセプター蛍光分子２１とドナー蛍光分子１１の距離が離れることで、ドナー蛍光分子からアクセプター蛍光分子へのエネルギー移動がなくなり、アクセプター蛍光分子からは蛍光は呈さなくなり、ドナー蛍光分子への励起光の照射によりドナー蛍光分子１１が蛍光を呈するようになる。したがって、蛍光読取装置での固相面１００の観察により、ドナー蛍光プローブ１０が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット３０）の有無を確認することができる。
本発明の核酸配列計測方法は上記実施形態に限定されず、以下のような種々の変形が可能である。
ドナー蛍光分子を付加したドナー蛍光プローブとアクセプター蛍光分子を付加した消光プローブの存在比を変えてそれぞれを固定化することで、対象分子が存在していないときの蛍光量を制御することができる。例えば、消光プローブをドナー蛍光プローブよりも多くすると、カップリングされるドナー蛍光分子の確率が高まり、ドナー蛍光分子の蛍光量が減少する。それによって対象分子が存在していないときのドナー蛍光分子の蛍光（オフセット光）を低く抑えることができる。また、ドナー蛍光プローブを消光プローブよりも多くすると、アクセプター蛍光分子へのエネルギー移動が生じる確率が低くなり、対象物質検出後に呈する蛍光（ハイブリダイズ光量）がより強くなる。
上記実施形態では、ドナー蛍光プローブ１０のＸ部１２の配列をターゲット３０と相補的なものとしているが、ドナー蛍光プローブ１０のＸ部１２および消光プローブ２０のＹ部２２の配列をターゲットの種類に関わらず共通化した配列としてもよい。この場合、Ｘ部１２およびＹ部２２をターゲットの種類と無関係に同一の構造とし、検出配列１３および検出配列２３のみをターゲットの種類に応じて変えればよいため、設計が容易となる。また消光／発光の特性が検出対象によらず一定となる利点がある。
また、ドナー蛍光プローブおよび消光プローブが固定される固相面は基板上の平面に限られない。ドナー蛍光プローブおよび消光プローブをビーズ表面に固定してもよい。ビーズの表面にドナー蛍光プローブおよび消光プローブを固定することにより、ドナー蛍光プローブおよび消光プローブがビーズを中心として放射状に広がった形状となる。この場合、プローブを固定する固相面の表面積が大きくなり、単位面積当たりのプローブ量を増やすことができる。また、検出対象分子を捕集したビーズをその大きさや磁気等で回収することで、検出対象分子の選択的な回収も可能となる。回収した分子は後工程における別の試験などに使用可能となる。
ドナー蛍光分子もしくはアクセプター蛍光分子はプローブの先端についていなくてもよい。図３は、ドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子がプローブの途中に位置している例を示している。図３の例では、ドナー蛍光分子１１およびアクセプター蛍光分子２１が、それぞれドナー蛍光プローブ１０Ａおよび消光プローブ２０Ａの途中に付加されている。ただし、ドナー蛍光分子１１からアクセプター蛍光分子２１へのエネルギー移動が生じるように、ドナー蛍光プローブ１０Ａおよび消光プローブ２０Ａが結合した状態において、アクセプター蛍光分子２１がドナー蛍光分子１１に接近するように互いに向き合う位置となるように設計することが望ましい。ドナー蛍光分子もしくはアクセプター蛍光分子をプローブの先端以外の位置に付加する場合には、プローブの先端にはさらに別の修飾が可能となる利点がある。
ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子はそれぞれ複数種類・複数個所に付加されてもよい。図４（ａ）は、複数個所にドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子が付加された例を示す図である。図４（ａ）の例では、ドナー蛍光プローブ１０Ｂにドナー蛍光分子１１，１１，１１が、消光プローブ２０Ｂにアクセプター蛍光分子２１，２１，２１が、それぞれ付加されている。複数のドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子を１つのプローブに付加する場合、それぞれのドナー蛍光分子またはアクセプター蛍光分子の種類を異なるものとしてもよい。１つのプローブに複数のドナー蛍光分子およびアクセプター蛍光分子を付加した場合、ターゲット３０が結合しない場合のアクセプター蛍光分子の蛍光量と、ターゲットが結合した際のドナー蛍光分子の蛍光量とが増加し、より高感度な検出が可能となる。また、対象分子が存在していないときのドナー蛍光分子の蛍光量が高く、アクセプター蛍光分子の蛍光検出のオフセット光となる場合には、ドナー蛍光分子の蛍光波長スペクトルのうちアクセプター蛍光分子の吸収波長スペクトルと被らない範囲の波長でありアクセプター蛍光分子の蛍光の検出波長の光を吸収するような分子をドナー蛍光分子としてドナー蛍光プローブに付加してもよい。この分子はアクセプター蛍光分子として消光プローブに付加してもよい。それによって対象分子が存在していないときのドナー蛍光分子の蛍光（オフセット光）を低く抑えることができる。また、対象分子が存在するときのアクセプター蛍光分子の蛍光量が高く、ドナー蛍光分子の蛍光検出のオフセット光となる場合には、励起光がアクセプター蛍光分子を直接励起しないように励起光源の範囲の波長の光を吸収するような分子をアクセプター蛍光分子として消光プローブに付加してもよい。それによって対象分子が存在するときのアクセプター蛍光分子の蛍光（オフセット光）を低く抑えることができる。
上記実施形態ではドナー蛍光プローブ１０の検出配列１３だけでなく、消光プローブ２０にも検出配列２３を設けているが、ドナー蛍光プローブのみにターゲットと相補的な検出配列を設けてもよい。ただし、両者のプローブに検出配列を設けることにより、ターゲットの結合頻度を高めることができると考えられる。
また、上記実施形態では、ターゲット３０がドナー蛍光プローブ１０に結合する設計としているが、ターゲットが消光プローブに結合する設計としてもよい。この場合、ターゲットが近接することによるドナー蛍光分子の特性の変化を回避できる。
図４（ｂ）は、ターゲット３０が消光プローブ２０Ｃに結合する例を示す図である。図４（ｂ）の例のように、消光プローブ２０Ｃにターゲット３０に対してより親和性のある配列を与え、ターゲット３０がドナー蛍光プローブ１０Ｃではなく、消光プローブ２０Ｃに結合するようにしてもよい。この場合、ドナー蛍光プローブ１０Ｃにもターゲットと相補的な検出配列を設けてもよいし、設けなくてもよい。
次に、本発明の核酸配列計測用デバイスの製造方法について説明する。
（１）溶液調製
まず、ドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０を混合したプローブ液を調製し、プローブ濃度を調整する。
（２）カップリング
次に、プローブ液を加熱後、急冷し、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０をカップリングさせる。これにより、Ｘ部１２およびＹ部２２を介してドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０が結合される。ここでは、例えば、プローブ液を９５℃に加熱後、５分間温度を保持し、その後、２５℃に急冷することでドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０をカップリングさせる。
（３）固相面への固定
次に、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０がカップリングした状態にあるプローブ液を固相面にスポットして、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０を固相面１００に固定化する。
（４）洗浄
次に、固相面１００を洗浄し、固定化されていない余剰のプローブを除去する。以上の手順により、ＤＮＡチップが製造される。
このように、Ｘ部１２およびＹ部２２を介して互いに結合された状態で、ドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０を固相面１００に結合させるので、ドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０の位置関係を適切に管理でき、ドナー蛍光分子からアクセプター蛍光分子へのエネルギー移動を適切に発揮させることが可能となるため、検出感度を良好なものとすることができる。
次に、本発明の核酸配列計測用デバイスを用いる核酸配列計測方法について説明する。
本発明の核酸配列計測方法は、本発明の核酸配列計測用デバイスを用いる核酸配列計測方法であって、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法である。
本発明の核酸計測方法は、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を含む。
（ａ）前記ターゲットを含むサンプルを調製するステップ、
（ｂ）前記サンプルを前記核酸配列計測用デバイスに供給するステップ、
（ｃ）本発明の核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ、
（ｄ）前記サンプル中の前記ターゲットと前記核酸配列計測用デバイス中のドナー蛍光プローブまたは消光プローブの少なくとも一方とをハイブリダイゼーション反応させるステップ、および
（ｅ）前記反応後、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ。
以下に上記各ステップについて説明する。
まず、目的とする特定の核酸配列を有するターゲット３０を含むサンプル５０の調製を行う（ステップ（ａ））。サンプル５０の調製において、特定の核酸配列を有する遺伝子（ターゲット３０）の増幅を行ってもよい。
遺伝子の増幅を行った段階で、遺伝子が増幅されたか否かを確認する試験を行い、遺伝子が増幅されている場合にのみ、後述するハイブリダイゼーション反応を行うようにしてもよい。
なお、遺伝子の存在の有無を検査するタイミングは、増幅終了後に限定されず、増幅反応中であってもよい。検査の手法としては、電気泳動、抗原抗体反応、質量分析やリアルタイムＰＣＲ法などを適宜、利用することができる。
また、核酸（ターゲット３０）はタンパク質や糖鎖などに結合させても良い。この場合には、核酸（ターゲット３０）に対するタンパク質や糖鎖などの相互作用が確認できる。
次に、ターゲット３０を含むサンプル５０を前記核酸計測用デバイスの固相面１００に供給する（ステップ（ｂ））。その後、核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定する（ステップ（ｃ））。
前述したように、ターゲット３０が存在しないときはドナー蛍光分子１１およびアクセプター蛍光分子２１がそれぞれ付加されたドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０とが結合することにより、ドナー蛍光分子１１とアクセプター蛍光分子２１が接近した状態にある。この状態でドナー蛍光分子に励起光が照射されると、励起されたドナー蛍光分子１１のエネルギーがアクセプター蛍光分子２１に移動し、ドナー蛍光分子１１は消光され、アクセプター蛍光分子２１が蛍光を呈する。
ただし、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０が結合している状態でも、消光プローブ２０のアクセプター蛍光分子２１ではドナー蛍光プローブ１０のドナー蛍光分子１１の蛍光を完全に消光しきれない。この消光しきれない蛍光が、ドナー蛍光分子１１のオフセット光となるが、このオフセット光は、ターゲット３０とドナー蛍光プローブ１０または消光プローブ２０の少なくとも一方とのハイブリダイゼーション反応が生じていないときのアクセプター蛍光分子２１の蛍光量として捉えることができる。そのため、ハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光分子１１の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量を測定し、ドナー蛍光分子１１の蛍光量とアクセプター蛍光分子２１の蛍光量とから演算でオフセット光量を算出することができる。そのため、ハイブリダイゼーション反応前後でハイブリダイゼーションした分子数をより正確に算出することができる。
次に、前記サンプル５０中のターゲット３０と、前記核酸配列計測用デバイス中のドナー蛍光プローブまたは消光プローブの少なくとも一方とをハイブリダイゼーション反応させる（ステップ（ｄ））。
前記サンプル５０中のターゲット３０と、前記核酸配列計測用デバイス中のドナー蛍光プローブまたは消光プローブの少なくとも一方とがハイブリダイゼーション反応すると、ターゲット３０がドナー蛍光プローブ１０または消光プローブ２０の少なくとも一方と結合し、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０の結合が外れてアクセプター蛍光分子２１とドナー蛍光分子１１の距離が離れることで、ドナー蛍光分子１１からアクセプター蛍光分子２１へのエネルギー移動がなくなり、アクセプター蛍光分子２１からは蛍光は呈さなくなり、ドナー蛍光分子１１への励起光の照射によりドナー蛍光分子１１が蛍光を呈するようになる。
次に、ハイブリダイゼーション反応後、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量（ドナー蛍光量）とアクセプター蛍光分子の蛍光量（アクセプター蛍光量）とを蛍光読取装置６０で測定する（ステップ（ｅ））。
蛍光読取装置６０で、ドナー蛍光プローブ１０が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット３０）の有無を確認することができ、またハイブリダイズした対象核酸（ターゲット３０）を定量することができる。またこの時、溶液中に含まれる捕集されていないターゲット３０は蛍光を呈さないために、洗浄する必要がない。したがって、ターゲット溶液存在下で、溶液を通して核酸配列計測用デバイスの固相面１００を観察することが可能である。このため、洗浄の影響を排した状態での光量が測定できるとともに、ハイブリダイゼーション中のリアルタイム測定も可能となる。
また、蛍光読取装置として後述する本発明の核酸計測装置を用いることにより、同一座標のハイブリダイズ前後の画像が取得でき、また同時刻の波長で分離されたドナー蛍光画像と、アクセプター蛍光画像を取得することができ、ドナー蛍光画像及びアクセプター蛍光画像を解析することにより、ハイブリダイゼーション反応したターゲットの分子数を算出することもできる。
また、本発明の核酸配列計測方法により、ハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光分子１１の蛍光変化量から、ハイブリダイゼーション反応したターゲット分子３０の分子数を算出することができる。例えば、既知の分子数を有するターゲット分子３０の標準液を用いてハイブリダイゼーション反応を行い、反応前後のドナー蛍光分子１１の蛍光変化量を測定して、分子数と蛍光変化量の関係を示した検量線を予め作成しておく。この検量線と、サンプルを用いたハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光分子１１の蛍光変化量とから、ハイブリダイゼーション反応したターゲット分子３０の分子数を算出することができる。
同様に、ハイブリダイゼーション反応前後のアクセプター蛍光分子２１の蛍光変化量から、ハイブリダイゼーション反応をしていないターゲット分子３０の分子数を算出することもできる。例えば、既知の分子数を有するターゲット分子３０の標準液を用いてハイブリダイゼーション反応を行い、反応前後のアクセプター蛍光分子２１の蛍光変化量を測定して、分子数と蛍光変化量の関係を示した検量線を予め作成しておく。この検量線と、サンプルを用いたハイブリダイゼーション反応前後のアクセプター蛍光分子２１の蛍光変化量とから、ハイブリダイゼーション反応していないターゲット分子３０の分子数を算出することができる。
また、ターゲット分子３０が存在しないときのアクセプター蛍光分子２１の蛍光量が、ドナー蛍光分子１１の蛍光量と等量になるようにアクセプター蛍光分子２１の蛍光量に乗算する係数を設定し、ターゲット分子３０のアクセプター蛍光分子２１の蛍光量に、設定した前記係数を乗じた数値を、ドナー蛍光分子１１の蛍光量から減算した補正蛍光量を算出することができる。この補正蛍光量を、既知の分子数を有するターゲット分子３０の標準液を用いて、分子数と補正蛍光量との関係を示した検量線を予め作成しておく。この検量線と、サンプルを用いたハイブリダイゼーション反応の補正蛍光量とから、ハイブリダイゼーション反応したターゲット分子３０の分子数を算出することができる。
次に、本発明の核酸配列計測装置について説明する。
本発明の核酸配列計測装置は、本発明の核酸配列計測用デバイスと、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量と、アクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定する蛍光読取装置とを有する。
図５は本発明の核酸配列計測装置６０を示す構成図である。本発明の核酸配列計測装置はＤＮＡチップ（核酸配列計測用デバイス）４０のターゲット３０がドナー蛍光プローブ１０にハイブリダイズする前後の画像を取得するため、ハイブリダイズ前の画像を取得後、温調ステージ８２によりＤＮＡチップ４０の温度を上昇させてハイブリダイゼーション反応を進行させ、再び常温に下げた状態でハイブリダイズ後の画像を取得する。
温調ステージ８２は、ターゲット３０とプローブとのハイブリダイゼーションを促進するために、ターゲット３０とプローブとの反応中に、振とうまたはＤＮＡチップ４０の回転、ボルテックスミキサー等による撹拌機能があることが好ましい。
核酸配列計測装置６０の光学系では、レーザー光源６１から出射されたレーザー光はミラー７３を介してダイクロイックミラー７４で反射されＤＮＡチップ４０を照射する。照射された光がＤＮＡチップ４０上にあるドナー蛍光分子に対する励起光となり、レーザー光源６１の波長とドナー蛍光分子１１の励起波長が重なる場合、ドナー蛍光分子１１が励起状態になる。
前記したように、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０が結合している場合にはドナー蛍光分子１１は消光され、アクセプター蛍光分子２１が蛍光を呈する。ターゲット３０が存在し、ドナー蛍光プローブ１０と消光プローブ２０の結合が解かれた場合にはドナー蛍光分子１１が蛍光を呈し、アクセプター蛍光分子２１は蛍光を呈さなくなる。
ＤＮＡチップ４０から放出された蛍光は、ダイクロイックミラー７４を透過し撮像光学系であるイメージスプリット光学系８１を介して、２色に分離され、ＣＣＤカメラ６３の検出素子上に波長で分離された２枚の同座標の画像が別々に結像し検出される。これにより同一座標のハイブリダイズ前後の画像が取得でき、また同時刻の波長で分離された２枚の画像を取得することができる。またＣＣＤカメラ６３一台での検出が可能となる。
図６は波長で分離された２枚のＣＣＤカメラ画像の模式図である。図６に示したように、本発明の核酸配列計測装置により得られる画像は、同一スポットのハイブリダイズ前後の画像を取得することができる。そのため、チップ間、スポット間の光量のばらつきの影響を受けない。
また、波長で分離したドナー蛍光画像１０１とアクセプター蛍光分子からの蛍光画像（アクセプター蛍光画像）１０２を同時に取得できるためタイムラグがなく、画像の相関を正しくとることができる。
また、ハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光画像１０１から蛍光変化量を演算し、ハイブリダイゼーション反応した分子数を算出することができ、ハイブリダイゼーション反応前後のアクセプター蛍光画像１０２から蛍光変化量を演算し、ハイブリダイゼーション反応をしていない分子数を算出することができる。蛍光変化量の演算は、スポット全体の平均光量を使用してもよいし、スポット画像の各ピクセルの蛍光変化量を使用してもよい。
本発明の核酸配列計測装置は、ＣＣＤカメラ６３をコントロールするコンピュータと、画像の光量を計算する演算装置、画像と光量等を保存する記録装置を備えていてもよい。
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイス、前記核酸配列計測用デバイスを用いた核酸配列計測方法及び核酸配列計測装置に対し、広く適用することができる。
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
ドナー蛍光プローブ１０および消光プローブ２０を基板上に複数配置したＤＮＡチップ４０を作製し、ターゲット３０を前記ＤＮＡチップ４０に供給し、６０℃で３０分間反応させ、前記ＤＮＡチップからのドナー蛍光分子の蛍光量と、消光プローブからのアクセプター蛍光分子の蛍光量を測定した。その結果を図７に示す。なお、本実施例では、ドナー蛍光分子１１としてＣｙ３、アクセプター蛍光分子２５としてＣｙ５をそれぞれ用いた。
図７は、ターゲット３０がないとき、およびターゲット３０の濃度を増加させたときのドナー蛍光プローブ１０のドナー蛍光分子１１の蛍光であるドナー蛍光量と、消光プローブ２０のアクセプター蛍光分子２１の蛍光であるアクセプター蛍光量の変化を示した図である。
図７に示すように、ドナー蛍光分子の蛍光量は、ターゲット３０の濃度が増加するにしたがって増加した。また、アクセプター蛍光分子の蛍光量は、ターゲット３０の濃度が増加するにしたがって減少した。
次に、図７において、ターゲット３０がないとき（図７において、ターゲット濃度が０ｎＭのとき）のアクセプター蛍光分子の蛍光量がドナー蛍光分子の蛍光量と等量になるようにアクセプター蛍光分子の蛍光量に乗算する係数を設定し、各ターゲット３０の各濃度でのアクセプター蛍光分子の蛍光量に設定した係数をかけた数値をドナー蛍光分子の蛍光量から減算した補正光量を算出した。その結果を図８に示す。図８に示したように、ターゲット３０の濃度に対するドナー蛍光分子の蛍光量の増加の傾きに対して前記補正光量の増加の傾きは１．４倍程度に増加しており感度が向上していることが確認された。
図８では、補正後のターゲット３０がない場合の補正光量は０となっているが、実際にはドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量の相関のばらつきによって検出下限の信頼区間が決定される。ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量の相関はチップ間差、スポット間差、スポット内のプローブの固定量のむらの順にばらつきが大きいと考えられる。本発明の核酸配列計測装置は、スポット間差およびスポット内のプローブの固定量の影響を除去し、スポット内のプローブの固定量のむらに関しても蛍光画像の各ピクセルにおいて光量変化量を検出することができ相関が大きいピクセルを選択して蛍光光量を演算することで、ばらつきを小さく抑えることが可能となる。
１０ ドナー蛍光プローブ
１１ ドナー蛍光分子
１２ Ｘ部（結合部）
１３ 検出配列（検出部）
１４ リンカー（基端）
２０ 消光プローブ
２１ アクセプター蛍光分子
２２ Ｙ部（結合部）
２３ 検出配列（検出部）
２４ リンカー（基端）
４０ ＤＮＡチップ（核酸配列計測用デバイス）
６０ 蛍光読取装置（核酸配列計測装置）
６１ レーザー光源
６３ ＣＣＤカメラ
７３ ミラー
７４ ダイクロイックミラー
８１ イメージスプリット光学系
８２ 温調ステージ
１００ 固相面
１０１ ドナー蛍光画像
１０２ アクセプター蛍光画像
１１１ ドナー蛍光画像のプローブスポット
１１２ アクセプター蛍光画像のプローブスポット

Claims (17)

  1. ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
    結合部および基端を有し、かつ、ドナー蛍光分子が所定の位置に付加されたドナー蛍光プローブと、
    結合部および基端を有し、かつ、アクセプター蛍光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
    前記ドナー蛍光プローブの基端および前記消光プローブの基端がそれぞれ固定される固相面を有する基板と、
    を備え、
    前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部とが、互いに相補的な配列を有し、
    前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブの少なくとも一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列を有する検出部を有し、
    前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定される、
    ことを特徴とする核酸配列計測用デバイス。
  2. 前記ターゲットと前記検出部とのハイブリダイゼーションが生じていない場合、前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブとの結合が維持されることにより、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光され、前記アクセプター蛍光分子が蛍光を呈し、
    前記ターゲットと前記検出部とのハイブリダイゼーションが生じた場合、前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部との結合が解消されることにより、前記アクセプター蛍光分子から離れた前記ドナー蛍光分子が蛍光を呈することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列計測用デバイス。
  3. 前記ドナー蛍光プローブが、前記検出部を有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸配列計測用デバイス。
  4. 前記消光プローブが、前記検出部を有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸配列計測用デバイス。
  5. 前記基板が平板であり、前記固相面が、該平板の一平面であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  6. 前記ドナー蛍光プローブの結合部の少なくとも一部が前記検出部として機能することを特徴とする請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  7. 前記消光プローブの結合部の少なくとも一部が前記検出部として機能することを特徴とする請求項１、２、４および５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  8. 前記ドナー蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ドナー蛍光プローブの途中であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  9. 前記アクセプター蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記消光プローブの途中であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  10. 前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブの両方が、前記検出部を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
  11. ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
    （ａ）前記ターゲットを含むサンプルを調製するステップ、
    （ｂ）前記サンプルを前記核酸配列計測用デバイスに供給するステップ、
    （ｃ）核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ、
    （ｄ）前記サンプル中の前記ターゲットと前記核酸配列計測用デバイス中のドナー蛍光プローブまたは消光プローブの少なくとも一方とをハイブリダイゼーション反応させるステップ、および
    （ｅ）前記反応後、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量とアクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定するステップ、を含み、
    前記核酸配列計測用デバイスは、
    結合部および基端を有し、かつ、ドナー蛍光分子が所定の位置に付加されたドナー蛍光プローブと、
    結合部および基端を有し、かつ、アクセプター蛍光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
    前記ドナー蛍光プローブの基端および前記消光プローブの基端がそれぞれ固定される固相面を有する基板と、
    を備え、
    前記ドナー蛍光プローブの結合部と前記消光プローブの結合部とが、互いに相補的な配列を有し、
    前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブの少なくとも一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列を有する検出部を有し、
    前記ドナー蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記ドナー蛍光分子に接近した前記アクセプター蛍光分子により前記ドナー蛍光分子の蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定される、
    ことを特徴とする核酸配列計測方法。
  12. 前記ハイブリダイゼーション反応前後のドナー蛍光分子の蛍光量の変化から、ハイブリダイズしたターゲットの分子数を算出することを特徴とする請求項１１に記載の核酸配列計測方法。
  13. 前記ハイブリダイゼーション反応前後のアクセプター蛍光分子の蛍光量の変化から、ハイブリダイゼーション反応していないターゲットの分子数を算出することを特徴とする請求項１１に記載の核酸配列計測方法。
  14. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイスと、
    前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光量と、アクセプター蛍光分子の蛍光量とを測定する蛍光読取装置と、
    を有する、核酸配列計測装置。
  15. 前記サンプルの存在下で、前記核酸配列計測用デバイスからの、ドナー蛍光分子の蛍光と、アクセプター蛍光分子の蛍光とを測定する、請求項１４に記載の核酸配列計測装置。
  16. 前記ターゲットと前記ドナー蛍光プローブまたは前記消光プローブとをハイブリダイズさせるための撹拌機能を備える、請求項１４または１５に記載の核酸配列計測装置。
  17. 前記核酸配列計測用デバイスからの蛍光を２色に分離し、同時に蛍光を測定する機能を備える、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸配列計測装置。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009514A1 (en) * 2000-02-28 2004-01-15 Frutos Anthony G. Assembly for label-free detection of hybridized nucleic targets
JP2004016132A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Canon Inc 核酸の測定方法、及びその方法によって得られるデータ解析法
US20110281740A1 (en) * 2008-06-30 2011-11-17 Joseph Beechem Methods for Real Time Single Molecule Sequencing
JP2013514803A (ja) * 2009-12-21 2013-05-02 シージーン アイエヌシー Ｔｓｇプライマーターゲット検出
JP5928906B2 (ja) * 2013-08-27 2016-06-01 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5928906B2 (ja) 1978-10-31 1984-07-17 富士ゼロックス株式会社 自動原稿搬送装置
JP2011017721A (ja) 2010-09-24 2011-01-27 Yokogawa Electric Corp 光量計測装置および光量計測方法
MX2015001961A (es) * 2012-08-16 2015-09-10 Nvs Technologies Inc Metodos y sistemas para ensayos.
US10119161B2 (en) * 2015-12-10 2018-11-06 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and kits for joining fragmented nucleic acids together

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009514A1 (en) * 2000-02-28 2004-01-15 Frutos Anthony G. Assembly for label-free detection of hybridized nucleic targets
JP2004016132A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Canon Inc 核酸の測定方法、及びその方法によって得られるデータ解析法
US20110281740A1 (en) * 2008-06-30 2011-11-17 Joseph Beechem Methods for Real Time Single Molecule Sequencing
JP2013514803A (ja) * 2009-12-21 2013-05-02 シージーン アイエヌシー Ｔｓｇプライマーターゲット検出
JP5928906B2 (ja) * 2013-08-27 2016-06-01 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置

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