JP2003066042A - バイオチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検出感度が向上したバイオチップを提供す
る。 【解決手段】 所定電圧が印加される一対の電極間に、
吸着シート及びプレート基材を介在し、該プレート基材
に電極間に流れる電流方向に軸線を有するように貫通孔
を開設し、当該貫通孔の内壁にプローブを化学的に結合
してなる、バイオチップ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオチップに関
するものである。より詳しくは、本発明は、プローブと
ハイブリダイゼーションしなかったサンプルを簡便にか
つ高率で除去できる、優れた検出感度を有するバイオチ
ップに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトゲノムの遺伝子情報が次々と
明らかにされてきており、このヒトゲノム配列の解読や
情報を基にして、疾患関連遺伝子の発現やヒト遺伝子の
多様性が探求され、最終的にゲノム創薬の開発および個
人の遺伝子プロフィールからの臨床評価（薬効や副作
用）の予測・予知を可能にするデータベースの構築が期
待されている。このためには、遺伝子多型なども絡め
た、遺伝子の体系的な発現プロファイリング、タイピン
グ、数理情報解析による総合的システムが希求されてお
り、ゆえにこのような総合的システムを可能にするバイ
オチップの開発が必要不可欠となってきている。

【０００３】このバイオチップは、数百〜一万種類以上
の遺伝子に対応するＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質断片な
どを顕微鏡スライドガラス等の基板上に微小量づつ整
列、固定化したものであり、遺伝子の作用を検出したい
サンプル中の予め蛍光色素等で標識されている遺伝子と
ハイブリダイゼーションさせ、バイオチップ内の遺伝子
（プローブＤＮＡ）とサンプル中の遺伝子（サンプルＤ
ＮＡ）を相補的に結合させて、反応後の蛍光色素の蛍光
位置及び強度を読み取ることによって、遺伝子の種類や
働きを評価することができる。このようなバイオチップ
を用いることにより、例えば、癌細胞と正常細胞の遺伝
子機能発現の差などを容易に検出することができ、この
バイオチップを用いたマイクロアレイ技術は数千〜数万
の遺伝子の大量解析が可能であるため、エイズ等の感染
症の遺伝子診断への応用、病気の遺伝子レベルでの解析
が飛躍的に発展することが期待される。

【０００４】このようなバイオチップとしては、従来か
ら、ガラスなどのプレート表面にポリＬ−リジン(poly-
L-lysine)を結合剤としてコーティングし、ここに、複
数種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体高分子か
らなるプローブをピンを介してプレートの被覆面にスポ
ットし、この操作をすべてのプローブについて繰り返す
ことによって製造されており、例えば、プレート上の複
数の位置にプレートとプローブとを結合させる結合剤を
用いてプローブを植え付けたバイオチップにおいて、結
合剤が前記プローブが植え付けられている位置に局在さ
れたバイオチップ（特開２０００−１５７２７２号公
報）、相互に独立した貫通孔を備えた多孔質メンブレン
に被検物質を含むスポットを多数配置してなるマクロア
レイ（特開２００１−８３１６３号公報）などが既に報
告されている。

【０００５】また、このようにして製造されたバイオチ
ップは、一般的に、蛍光物質等で標識されたサンプルＤ
ＮＡと共にハイブリダイゼーション溶液に仕込まれ、反
応させることによって、相補的なバイオチップ内のＤＮ
Ａとサンプル中の遺伝子を結合（ハイブリダイズ）さ
せ、さらに、このプレートを水や緩衝液などで洗浄して
プローブＤＮＡと結合しなかった（プローブＤＮＡと相
補的でない）サンプルＤＮＡ（非結合サンプル）を除去
した後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡ
上の蛍光物質を光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励
起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出する
ことによって、どのプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡが
結合したかを検出する。このような方法では、プローブ
ＤＮＡと結合しなかったサンプルＤＮＡを除去するため
に水や緩衝液などでプレートを洗い流す工程が存在する
が、非結合サンプルが残っていると、非結合サンプルに
標識されている蛍光物質も励起されて発光するためノイ
ズとして検出され、全体として検出精度が悪くなるとい
う問題があった。逆に、洗浄を過度に行なうと、プロー
ブと結合したサンプルＤＮＡまでが流され、これによ
り、検出時ノイズやシグナルが低下し、その結果感度が
低くなる恐れがある。加えて、特に標識物質として放射
性物質を使用する場合などでは、放射性物質はヒトの臓
器に障害を与える恐れがあるため、プレートの洗浄で排
出される多量の洗浄液を、廃棄・処理する必要があり、
そのための設備や処置が必要であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、このような従来技術の問題点に鑑みてなされたもの
であり、ハイブリダイゼーション後のプローブと結合し
なかったサンプル成分だけを効率良く除去して、検出感
度を向上できるバイオチップを提供することを目的とす
る。

【０００７】本発明の他の目的は、ハイブリダイゼーシ
ョン後のプローブと結合しなかったサンプル成分を容易
に除去できるバイオチップを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記諸目
的を達成するために鋭意検討を行なった結果、貫通孔の
内壁にプローブをスペーサーを介して化学的に結合させ
たプレート基材の両表面に電極構造を設けたバイオチッ
プを開発した。このような構造を有するバイオチップに
より、プローブと結合したサンプルは貫通孔内壁に保持
（結合）させたまま、電圧の印加という簡単な操作によ
って不要な非結合サンプル成分のみを効率良くかつ選択
的に除去でき、その結果、検出時ノイズが少なくなり検
出精度を向上させることができることを知得した。

【０００９】さらに、本発明者らは、さらに鋭意検討を
行なった結果、上記したようなバイオチップにおいて、
少なくとも一方の電極と基材との間に吸着シートを設け
ることによって、電圧の印加によって一定方向に流され
た非結合サンプルを吸着シートに吸着させ、洗浄液をだ
さずに、吸着シートを交換するだけで簡単に不要な非結
合サンプルを除去できることがでることを知得した。上
記知見に基づいて、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、上記目的は、下記（１）〜（１
０）によって達成される。

【００１１】（１） 所定電圧が印加される一対の電極
間に、吸着シート及びプレート基材を介在し、該プレー
ト基材に電極間に流れる電流方向に軸線を有するように
貫通孔を開設し、当該貫通孔の内壁にプローブを化学的
に結合してなる、バイオチップ。

【００１２】（２） 上記プローブは貫通孔の内壁にス
ペーサーを介して化学的に結合する、前記（１）に記載
のバイオチップ。

【００１３】（３） 上記貫通孔は独立した貫通孔であ
る、前記（１）または（２）に記載のバイオチップ。

【００１４】（４） 貫通孔内部にゲルが充填される、
前記（１）〜（３）のいずれか一に記載のバイオチッ
プ。

【００１５】（５） 上記プレート基材の導電率は１×
１０^-7〜１×１０^-20Ｓ／ｍである、前記（１）〜
（４）のいずれか一に記載のバイオチップ。

【００１６】（６） 上記吸着シートの導電率は１×１
０^-7〜１×１０^-20Ｓ／ｍである、前記（１）〜（５）
のいずれか一に記載のバイオチップ。

【００１７】（７） 上記プレート基材の比誘電率は２
〜１００である、前記（１）〜（６）のいずれか一に記
載のバイオチップ。

【００１８】（８） 上記吸着シートの比誘電率は２〜
１００である、前記（１）〜（７）のいずれか一に記載
のバイオチップ。

【００１９】（９） 少なくとも一方の電極が脱着可能
である、前記（１）〜（８）のいずれか一に記載のバイ
オチップ。

【００２０】（１０） 前記（１）〜（９）のいずれか
一に記載のバイオチップを用いた非結合物質の除去方
法。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明は、所定電圧が印加される
一対の電極間に、吸着シート及びプレート基材を介在
し、該プレート基材に電極間に流れる電流方向に軸線を
有するように貫通孔を開設し、当該貫通孔の内壁にプロ
ーブを化学的に結合してなる、バイオチップを提供する
ものである。

【００２２】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２３】まず、プローブとしてＤＮＡ（プローブＤ
ＮＡ）を用いた場合の本発明のバイオチップの一実施形
態を、図１及び２を参照しながら説明するが、ＤＮＡ以
外をプローブとして用いたバイオチップも本実施態様と
同様にして使用できる。本実施態様では、プローブＤＮ
Ａがスペーサーを介して貫通孔内壁に化学的に結合され
たバイオチップを用いている。

【００２４】図１は、本発明のバイオチップの一実施態
様を説明する図である。図１において、バイオチップ１
は、一対の電極５，６、ならびに当該電極間には電極５
側にプレート基材２が及び電極６側に吸着シート４がそ
れぞれ介在したサンドウイッチ構造を有し、かつプレー
ト基材２には厚み方向に沿って複数の貫通孔３が開設さ
れている。また、図２は、図１のバイオチップにおける
貫通孔３の断面の一実施態様を説明する図である。図２
において、貫通孔３の内壁には、プローブＤＮＡ ７が
スペーサー８を介して化学的に結合（固定）されてい
る。

【００２５】本発明のバイオチップは、公知の方法を適
宜組合わせることによって製造される。本発明のバイオ
チップの製造方法の一実施形態を、簡単に説明する。な
お、本実施態様は、プローブＤＮＡがスペーサーを介し
て貫通孔内壁に化学的に結合されたバイオチップの製造
について説明する。すなわち、予め所望の配列を化学合
成等により合成してプローブＤＮＡを調製し、このよう
にして合成されたプローブＤＮＡの末端である水酸基ま
たはリン酸基を、スペーサーと化学的に結合させて前駆
体を含む溶液を調製する。次に、この溶液を、スポッテ
ィング法、インクジェット法等の公知の方法でプレート
基材上にアレイ状に印刷する。または、前駆体を含む溶
液中にプレート基材を浸積させ、前駆体のスペーサーの
反応基とプレート基材の反応基とを反応させることによ
り、プローブＤＮＡをスペーサーを介してプレート基材
表面上に固定させてもよい。この際、前駆体を含む溶液
は、前駆体に加えて、通常、溶媒、ｐＨ調整剤、塩類等
を含む。また、必要に応じてキレート剤等を含んでもよ
い。溶媒としては、水などが挙げられ、ｐＨ調整剤とし
ては、塩酸、硝酸、硫酸などの鉱酸、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの水酸化
物、または緩衝液などが挙げられる。または、始めにプ
レート基材の反応基とスペーサーの反応基を、上記と同
様の印刷または浸漬によって反応・結合させた後、スペ
ーサーの他方の反応基をプローブＤＮＡの末端である水
酸基またはリン酸基と化学的に結合させることによっ
て、本発明のバイオチップを製造してもよい。

【００２６】本発明において使用されるプレート基材
は、特に制限されず、当該分野において使用されるのと
同様のものが使用できる。電気泳動によるプローブＤＮ
Ａに結合しなかった（即ち、プローブＤＮＡと相補性を
有さない）サンプル（非結合サンプル）の除去効率、除
去速度などを考慮すると、プレート基材の導電率は、好
ましくは１×１０^-7〜１×１０^-20Ｓ／ｍ、より好まし
くは１×１０^-10〜１×１０^-20Ｓ／ｍ、最も好ましくは
１×１０^-15〜１×１０^-20Ｓ／ｍである。プレート基材
の導電率が１×１０^-7Ｓ／ｍを超えると、電圧印加時に
過剰な電流が流れ、電気泳動に有効な電圧が与えられな
くなる場合がある。また、電気泳動による非結合サンプ
ルの除去効率、除去速度などを考慮すると、プレート基
材の比誘電率は、好ましくは２〜１００、より好ましく
は４〜１００である。この際、プレート基材の比誘電率
が２未満であると、電気泳動に有効な電圧が与えられな
くなる場合がある。

【００２７】このようなプレート基材の材質の具体例と
しては、プローブまたはスペーサーが結合できるような
反応基を有し、好ましくは上記導電率や比誘電率を有す
る材質であれば特に制限されるものではなく、公知の材
料を使用することができる。具体的には、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネー
ト、ポリエチレンテレフタレートやポリブチレンテレフ
タレート等のポリエステル、ナイロン６、ナイロン１１
やナイロン６６等のポリアミド、ポリイミド、フェノー
ル樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ
塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレ
ンおよびアクリル樹脂等のプラスチック；ガラス、水
晶、カーボン、シリカゲル、およびグラファイト等の無
機高分子；金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石
およびパラマグネット等の常温固体金属；セルロース、
セルロース誘導体、キチン、キトサン、アルギン酸およ
びアルギン酸塩等の天然高分子；ならびにアパタイト、
アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素および炭化
ホウ素等のセラミックなどが挙げられる。これらのう
ち、上記したような導電率及び比誘電率、さらには以下
に述べるような貫通孔の形成しやすさなどを考慮する
と、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネー
ト、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリイ
ミド、フェノール樹脂、アクリル樹脂、ガラス、水晶、
セルロース、セルロース、セルロース誘導体、アルミ
ナ、シリカ等が好ましい。

【００２８】本発明において、プレート基材の厚みは、
特に制限されずに、プローブ及びサンプルの種類や大き
さ、プローブの結合量、基材に形成される貫通孔内壁と
プローブまたはスペーサーとの結合し易さ、ならびにプ
ローブとサンプルとの結合（ハイブリッド形成）性など
を考慮して適宜選択される。上記点を考慮すると、プレ
ート基材の厚みは、好ましくは０．０１〜１×１０⁴μ
ｍ、より好ましくは０．１〜５×１０³μｍである。こ
の際、プレート基材の厚みが１×１０⁴μｍを超える
と、サンプルをプレート基材に滴下するのに必要な量が
増大する恐れがあり、プレート基材の厚みが０．０１μ
ｍ未満であると、十分量のプローブを貫通孔内壁に結合
できず、また基材の強度（剛性）が不足して取り扱いに
支障をきたす恐れがある。

【００２９】また、本発明において使用されるプレート
基材では、その両面に設置される電極間に流れる電流方
向に軸線を有するように、貫通孔、好ましくは独立した
貫通孔が形成される。なお、本明細書において、「独立
した貫通孔」とは、好ましくは基材表面にほぼ垂直方向
に（即ち、プレート基材の厚み方向に沿って）、プレー
ト基材両面を貫通し、かつ貫通孔内の空隙が連続的に繋
がらずに相互に独立して存在する孔を意味する。このよ
うな網目構造により孔と孔とが連続した繋がりを持たな
い独立した貫通孔をプレート基材に形成することによ
り、被検物質を含むサンプルを基材に滴下した場合に、
貫通孔内にはサンプルが浸透するが横方向への拡散は抑
えることができ、その結果、電圧の印加による非結合サ
ンプルの除去が容易になる。網目構造におけるような孔
内部の間隙を伝って基材の横方向にサンプルが浸透する
ことがないからである。

【００３０】本発明において、プレート基材に形成され
る貫通孔の形状は、円筒状、三角柱状、四角柱状、六角
柱状、乳房状、氷柱状など、プレート基材両面を貫通す
るものであれば特に制限されないが、円筒状、四角柱
状、六角柱状等、プレート基材の厚み方向で貫通孔の孔
径が実質的に等しい形状が好ましく、プローブとサンプ
ルとの結合のしやすさを考慮すると、特に円筒状が好ま
しい。したがって、プレート基材もまた、被検物質（例
えば、ＤＮＡ）を含むサンプル溶液を貫通孔内部に浸透
できる構造を有するものであれば特に制限されず、例え
ば、スポンジ、高級水性樹脂、連続発泡体等が挙げられ
る。

【００３１】本発明において、貫通孔の孔径は、その内
壁に結合されるプローブの結合量、プローブやスペーサ
ーの大きさ（長さ）や種類、プレート基材の材質、大き
さや厚み、ならびに貫通孔の形状などによって適宜選択
され、特に制限されるものではないが、例えば、貫通孔
の平均孔径は、通常、０．０１〜１×１０⁴μｍ、好ま
しくは０．１〜５×１０³μｍである。この際、貫通孔
の平均孔径が下限を下回ると、滴下したサンプルはプレ
ート基材表面上のみに拡散して貫通孔内部にまで浸透し
ない恐れがあり、逆に上限を超えると、プレート基材上
に十分な数の貫通孔を形成できず経済的でない場合があ
る上、貫通孔内への浸透量が増大しすぎて、必要以上の
サンプル量が必要になる場合がある。また、貫通孔は、
プレート基材全体にわたってほぼ均一な孔径を有するも
のが特に好ましい。

【００３２】本発明において、プレート基材への貫通孔
の形成方法は、特に制限されるものではなく、例えば、
荷電粒子線やレーザー等を照射してプレート基材に細孔
を形成し、この細孔にアルカリ処理によるエッチングを
施す方法、マスキングをしてフォトリソグラフィーによ
り細孔を作製する方法等の、公知の方法を同様にして使
用できる。または、貫通孔を有するプレート基材は、市
販品をそのまま使用してもよく、例えば、ニュクリポア
ー（登録商標）メンブレンフィルター（米国ニュクリポ
アー社製品）、アノディスク（whatman社製）などが挙
げられる。

【００３３】また、本発明においては、貫通孔内にゲル
が充填されていてもよい。このような構造により、環境
（例えば、温度や湿度）の変化による影響をあまり受け
ずに安定してプローブが貫通孔内壁に固定化される；電
圧の印加による非結合プローブの除去が容易である；貫
通孔内壁に結合されたプローブが空気と接することなく
かつ一定の湿度が保たれているため、プローブの保存安
定性を向上することができる；また、空気中の浮遊雑
菌、ウィルス、その他のプローブを変化させる化学種と
の直接接触を妨げるなどの利点がある。この際使用でき
るゲルとしては、特に制限されるものではなく、公知の
ゲルが同様にして使用できる。具体的には、ポリアクリ
ルアミドゲル、寒天、ゼラチン、ヒドロキシアパタイ
ト、ポリウレタンゲル、シリコーンゲル、キセロゲル、
キトサンゲルなどが挙げられる。また、ゲルは、貫通孔
内全部を充填するものであってもあるいは貫通孔の一部
のみを充填するものであってもよいが、上記ゲルによる
利点を考慮すると、貫通孔内全部を充填することが好ま
しい。貫通孔内のゲルは、湿潤状態であってもあるいは
乾燥状態であってもいずれでもよいが、保存時は取り扱
いなどを考慮して乾燥状態であることが好ましい。な
お、乾燥状態の場合であっても、使用時にバイオチップ
を被検物質を含む溶液中に浸漬すると、自然に当該液体
を吸収して湿潤状態（ゲル状）を呈して、その中で被検
物質とプローブが結合し、さらにこれに電圧を印加する
と非結合サンプルは、いわゆるゲル電気泳動によりゲル
内を吸着シート側に移動して、吸着シート内に保持され
る。

【００３４】または、中空糸を複数本束ねたもの（中空
糸束）を、本発明による独立貫通孔を有するプレート基
材として使用してもよい。この際、中空糸の中空部分が
本発明による貫通孔に相当する。このような中空糸束と
しては、例えば、特開２００１−１３３４５３号公報に
開示されるものが使用できる。この際の中空糸束の孔
径、孔の形状；全体としての基材の大きさ、厚みなどは
上記記載と同様のものが使用できる。

【００３５】本発明において、プローブとしては、目的
とするサンプル（被検物質）に合わせて適宜選択される
ものであり、特に制限されないが、例えば、デオキシリ
ボ核酸［ＤＮＡ（ｃＤＮＡを包含する）］、リボ核酸
（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド
核酸（ＯＰＮＡ）、オリゴヌクレオチド等の、天然若し
くは化学合成された核酸またはタンパク質、酵素、抗
体、多糖類などが挙げられる。なお、本発明に用いるプ
ローブは、市販のものでも、標準的な化学合成によって
製造されたものであっても、または、真核細胞若しくは
原核細胞由来のものであってもよい。例えば、プローブ
として核酸を用いる場合には、生細胞からのＤＮＡやＲ
ＮＡの調製は、公知の方法、例えば、ＤＮＡの抽出につ
いては、Blinらの方法(Blin et al., Nucleic Acids Re
s. 3: 2303 (1976))などの方法が、また、ＲＮＡの抽出
については、Favaloroらの方法(Favaloro et al., Meth
ods Enzymol.65:718 (1980))などの方法が使用できる。
さらに、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体
ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断
したＤＮＡ断片、インビトロで酵素等により合成された
ＤＮＡ、あるいは化学合成されたオリゴヌクレオチド等
をプローブとして使用してもよい。

【００３６】また、本発明において、プローブは、プレ
ート基材（貫通孔内壁）がプローブと結合できるような
反応基を有する場合には、直接貫通孔内壁に化学的に結
合してもよいが、スペーサーを介して貫通孔内壁に化学
的に結合してもよい。後者の場合は、特にプレート基材
（貫通孔内壁）がプローブと結合できるような反応基を
持たない場合には有効である。さらに、本発明におい
て、プローブは、貫通孔内壁に化学的に結合することは
必須であるが、必要であれば、プレート基材表面に化学
的に結合していてもよい。

【００３７】本発明において、プローブをスペーサーを
介して貫通孔内壁に結合させる場合に使用されるスペー
サーは、一方の末端はプレート基板と化学的に結合し、
かつ他方の末端はサンプルと特異的に化学結合する。し
たがって、本発明によるスペーサーは、一方の末端にサ
ンプルとの反応性（例えば、ＤＮＡの場合には、その末
端である水酸基もしくはリン酸基との反応性）を有する
第一の反応基を有し、かつ他方の末端にはプレート基材
との反応性を有する第二の反応基を有する公知の直鎖状
の脂肪族炭化水素、ポリアミノ酸、カルボジイミド基や
イソシアネート基からなるものが使用できる。このよう
なスペーサーの具体的な材質としては、ポリＬ−リジン
(poly-L-lysine)、ポリカルボジイミドなどが挙げられ
る。これらのうち、ポリＬ−リジン(poly-L-lysine)が
好ましく使用される。また、プローブとスペーサーとの
結合方法は、特に制限されず、公知の方法が使用でき
る。例えば、プローブとしてＤＮＡ（プローブＤＮＡ）
を用いた場合では、プローブＤＮＡとスペーサーを緩衝
液等の溶液中で混合してプローブＤＮＡの末端である水
酸基またはリン酸基を、スペーサーと化学的に結合させ
る方法などが挙げられる。

【００３８】本発明において、プローブをスペーサーを
介さず直接プレート基材（貫通孔内壁）に結合させる場
合の結合方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき
る。例えば、被検物質がＤＮＡ、ＲＮＡ等のポリヌクレ
オチドである際には、ポリヌクレオチド含有サンプルを
２×ＳＳＣ等の緩衝液に溶解し、この溶液をプレート基
材に滴下した後、ベーキング処理（熱乾燥処理）、紫外
線照射処理等を施すことによって、滴下したサンプル溶
液中のポリヌクレオチドをプレート基材上に固定するこ
とができる。より具体的には、サンプル溶液をプレート
基材に滴下後、１２０ＫＪ程度の紫外線をプレート基材
に照射することによって、滴下されたサンプル中のポリ
ヌクレオチドがプレート基材の貫通孔内壁に効果的に固
定することができる。

【００３９】また、本発明において、プローブをスペー
サーを介してプレート基材（貫通孔内壁）に結合させる
場合の、プローブとスペーサーとの結合方法及びスペー
サーとプレート基材（貫通孔内壁）との結合方法もま
た、特に制限されず公知の方法が使用できる。例えば、
プローブとスペーサーとの結合方法としては、上記プロ
ーブとプレート基材（貫通孔内壁）との結合で記載した
のと同様の方法などが使用できる。また、スペーサーと
プレート基材（貫通孔内壁）との結合方法としては、例
えば、アンモニウムイオン等を含有する塩基性接着剤や
塗料のようなカチオン性ポリマーあるいはポリＬ−リジ
ン(poly-L-lysine)でプレート基材表面をコーティング
することによって、イオン結合や疎水性結合による被検
物質のプレート基材上への吸着・固定を促進する方法；
スポッティング法、インクジェット法、フォトリソグラ
フィー法などが使用できる。また、プレート基材表面を
ポジティブチャージすることによっても、表面がマイナ
スチャージされている被検物質の吸着・固定を促進する
方法を用いてもよい。

【００４０】本発明のバイオチップを用いて検出される
サンプルは、本発明のバイオチップを用いてハイブリダ
イゼーションなどの方法によって解析する対象となり得
る物質（被検物質）すべてであり、特に制限されるもの
ではないが、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ等のポリヌク
レオチド、あるいは化学合成されたオリゴヌクレオチ
ド、ペプチド等といった生体高分子などが挙げられる。

【００４１】本発明において使用される吸着シートは、
プローブＤＮＡと結合せずに電圧の印加により一定方向
に流されるサンプルＤＮＡを保持・堅持することを目的
としてプレート基材と電極間に設けられる。このため、
吸着シートは、非結合サンプルＤＮＡが流れる電極とプ
レート基材表面との間に設けられれば十分であるが、必
要に応じて、両電極とプレート基材両面との間に設けら
れてもよい。また、電気泳動による非結合サンプルの除
去効率、短絡防止などを考慮すると、吸着シートの導電
率は、好ましくは１×１０^-7〜１×１０^-20Ｓ／ｍ、よ
り好ましくは１×１０^-10〜１×１０^-20Ｓ／ｍ、最も好
ましくは１×１０^-15〜１×１０^-20Ｓ／ｍである。逆
に、吸着シートの導電率が１×１０^-7Ｓ／ｍを超える
と、電圧印加時に過剰電流が流れ短絡する場合がある。
また、電気泳動による非結合サンプルの除去効率、除去
速度を考慮すると、吸着シートの比誘電率は、好ましく
は２〜１００、より好ましくは２〜５０、最も好ましく
は２〜７である。吸着シートの比誘電率が１００を超え
ると、プレート基材に電気泳動時に有効な電圧が与えら
れなくなる場合がある。

【００４２】吸着シートの材質の具体例としては、非結
合サンプルを効率良く吸着できかつ一旦吸着した非結合
サンプルを流出しない（堅持できる）ものであれば特に
制限されず、当該分野において使用されるのと同様の材
質が同様にして使用できる。プレート基材からの離型
性、電極との密着性、上記導電率や比誘電率、入手のし
やすさなどを考慮すると、濾紙、メンブレンフィルタ
ー、ポリアクリルアミド、セーム、人工セーム、ポリア
クリル酸ソーダゲル、不織布、スポンジ、パルプなどが
挙げられる。これらのうち、濾紙、人工セーム、不織
布、メンブレンフィルターが好ましい。また、本発明に
よる吸着シートは、電圧の印加により吸着した非結合サ
ンプルＤＮＡを電場を切った後も保持（堅持）できるよ
うに、空隙を有する（多孔質である）ことがより好まし
い。この際、ポアサイズは、特に制限されず、非結合サ
ンプルＤＮＡを電圧の印加時に十分空隙中に保持できか
つ一旦保持した非結合サンプルＤＮＡは印加終了後であ
っても空隙から逃がさないようなサイズであればよく、
非結合サンプルＤＮＡの大きさに応じて適宜選択され
る。具体的には、吸着シートが多孔質である場合のポア
サイズは、０．０５〜１００μｍである。

【００４３】本発明において、電極の材質は、導電性材
料で有れば特に限定されず公知の電極が同様にして使用
できる。具体的には、銅、アルミニウム、鉄、ニッケル
等の金属；ＩＴＯ、ＡＴＯなどの金属酸化物；ＳＵＳな
どの金属合金；グラファイト、導電性プラスチック等が
挙げられる。また、電極とプレート基材との接合方法な
らびに電極と吸着シートとの接合方法は、特に制限され
ず公知の方法で行なうことができる。例えば、公知の接
着剤を用いて接合する方法；機械的に固定する方法；粘
着テープ（両面テープ等）で張り合わせる方法；溶媒を
電極及び吸着シート間に入れて、表面張力によりはりつ
かせる方法などが挙げられる。

【００４４】本発明において、電極は、それぞれ、プレ
ート基材および/または吸着シートに固定されていても
あるいは脱着可能であってもよいが、少なくとも一方の
電極が脱着可能であることが好ましく、バイオチップの
使用後の吸着シートの交換の簡便さ及びサンプルのプレ
ート基材表面への滴下のし易さなどを考慮すると、少な
くとも吸着シート側の電極は脱着可能であることがより
好ましく、電極と吸着シートが組み合わされた形態（即
ち、図１において、吸着シート４及び電極６が接合され
た形態）で脱着可能であることが最も好ましい。この
際、電極とプレート基材および/または吸着シートとを
脱着可能とする方法としては、特に制限されないが、電
極をプレート基材および/または吸着シートと単に重ね
合わせれば十分であるが、または粘着テープ（両面テー
プ等）でゆるく張り合わせるなどによってもよい。

【００４５】また、本発明では、プローブＤＮＡとサン
プルＤＮＡとの結合工程後に、電極５，６間に電圧を印
加して電気泳動することによって非結合サンプルＤＮＡ
を貫通孔から流しだして、吸着シートに保持（除去）す
るものであるが、この際の電場の強さ及び印加時間は、
サンプルの種類や大きさ（長さ）などによって、適宜選
択できる。

【００４６】本発明のバイオチップを用いることによ
り、ハイブリダイゼーション後のプローブと結合しなか
ったサンプル成分を容易にかつ選択的に除去できる。し
たがって、本発明はまた、本発明のバイオチップを用い
た非結合物質の除去方法を提供するものである。

【００４７】ここで、本発明のバイオチップを使用した
非結合物質の除去方法の一実施態様を以下に説明する。

【００４８】図３は、本発明のバイオチップを利用した
ハイブリダイゼーションの原理を説明した図である。図
３（ａ）に示すように、蛍光物質１０で標識したサンプ
ルＤＮＡ９を、ハイブリダイゼーション溶液に適当量仕
込んで、サンプル溶液を調製する。なお、ハイブリダイ
ゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ(NaCl,tr
isodium citrate)、ＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)、
ＥＤＴＡ(ethylenediamidetetraacetic acid)、蒸留水
などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡ
の性質により適宜選択される。なお、上記実施態様にお
いては、サンプルＤＮＡを蛍光物質で標識したが、これ
に限定されるものではなく、発光物質、ラジオアイソト
ープ（³²Ｐや¹²⁵Ｉ等）を用いたオートラジオグラフィ
ーによってサンプルの検出が行なわれてもよい。また
は、被検物質が抗原や抗体等を含む血清成分である場合
は、従前のマイクロタイタープレートを用いた場合と同
様のイムノアッセイを行なうことができる。あるいは、
被検物質がアレルゲンとなり得る各種化学物質である場
合、種々のアレルギー検査方法等に応用することができ
る。

【００４９】次に、このハイブリダイゼーション溶液を
本発明のバイオチップ１のプレート基材２上にスポッテ
ィング法やインクジェット法等の公知の方法で印刷する
（図３（ａ））。なお、この際、ハイブリダイゼーショ
ン溶液を貫通孔内に十分浸透させるために、吸着シート
４及び電極６はプレート基材２からはずしておくことが
好ましい。これにより、プレート基材２の貫通孔３内
に、印刷されたハイブリダイゼーション溶液が素早く浸
透でき、貫通孔３の内壁に固定化されたプローブＤＮＡ
７と蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ９が相補的
である場合には、プローブＤＮＡ７及びサンプルＤＮＡ
９は相補的に結合して二重らせん構造をとる。一方、両
者が相補的でなければプローブＤＮＡ７とサンプルＤＮ
Ａ９とは結合せず、サンプルＤＮＡ（非結合サンプルＤ
ＮＡ）は貫通孔３内のハイブリダイゼーション溶液中に
遊離（浮遊）した状態で存在する（図３（ｂ））。次
に、吸着シート４、さらには電極６（または、予め吸着
シート４及び電極６を接合させたもの）を、プレート基
材２上に載せ、両電極５，６間に電圧を印加すると、ハ
イブリダイゼーション溶液中で遊離（浮遊）している非
結合サンプルＤＮＡは吸着シート４を有する電極６方向
に電気泳動され、最終的には吸着シート４に吸着され
る。一方、相補的に結合した（ハイブリダイゼーション
した）サンプルＤＮＡは貫通孔内壁に固定化されたプロ
ーブＤＮＡと結合して二重らせん構造をとっているた
め、両電極５，６間での電圧を印加（電気泳動）によっ
ても吸着シート４側に流されずに、貫通孔３内に維持さ
れる（図３（ｃ））。したがって、電気泳動終了後は、
貫通孔３内にはプローブＤＮＡ７及びサンプルＤＮＡ９
が相補的に結合したもののみが残されている。さらに、
非結合サンプルＤＮＡを保持した吸着シート４及び電極
６を取り除き（図４（ｄ））、サンプルＤＮＡ９（プロ
ーブＤＮＡと相補的に結合している）に標識している蛍
光物質１０をランプ１１の光で励起させ、蛍光物質１０
が励起して発光する光をＣＣＤ等の光センサー１２で検
出する（図４（ｅ））。この方法によれば、バイオチッ
プ１にはハイブリダイゼーションしたサンプルＤＮＡの
み存在するので、優れた検出精度が達成できる。

【００５０】加えて、このように電気泳動後に非結合サ
ンプルＤＮＡを保持した吸着シートを取り除くという簡
単な操作によって、非結合サンプルＤＮＡのみを効率よ
くかつ選択的に除去することができると同時に、貫通孔
内にはプローブＤＮＡ及びサンプルＤＮＡが相補的に結
合したもののみが残されるので、このバイオチップを用
いれば、検出時ノイズやシグナルの低下が抑制でき、ゆ
えに検出感度を向上することができる。

【００５１】

【発明の効果】上述したように、本発明は、所定電圧が
印加される一対の電極間に、吸着シート及びプレート基
材を介在し、該プレート基材に電極間に流れる電流方向
に軸線を有するように貫通孔を開設し、当該貫通孔の内
壁にプローブを化学的に結合してなる、バイオチップに
関するものである。本発明のバイオチップによると、ハ
イブリダイゼーションによりプローブと結合したサンプ
ルは貫通孔内壁に保持（結合）させ、プローブと結合し
なかった非結合サンプルは貫通孔内に遊離（浮遊）さ
せ、さらに電圧の印加という簡単な操作によって不要な
非結合サンプル成分のみを選択的にかつ効率良く除去で
きるので、検出時ノイズが少なくなり検出精度を向上さ
せることができる。

【００５２】また、本発明は、本発明のバイオチップを
用いた非結合物質の除去方法に関するものである。本発
明の方法によれば、ハイブリダイゼーション後に所定の
電圧を印加することによってプローブと結合しなかった
非結合サンプルを吸着シート側に流して吸着させるの
で、洗浄液をださずに、吸着シートを交換するだけで簡
単に不要な非結合サンプルを除去できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、本発明のバイオチップの一実施態様を説明
する図である。

【図２】は、本発明のバイオチップにおける貫通孔の断
面の一実施態様を説明する図である。

【図３】は、本発明によるバイオチップを利用したハイ
ブリダイゼーションの原理の一部を説明した図である。

【図４】は、本発明によるバイオチップを利用したハイ
ブリダイゼーションの原理の残りの部分を説明した図で
ある。

【符号の説明】

１…バイオチップ、 ２…プレート基材、 ３…貫通孔、 ４…吸着シート、 ５，６…電極、 ７…プローブＤＮＡ、 ８…スペーサー、 ９…サンプルＤＮＡ、 １０…蛍光物質、 １１…ランプ、 １２…光センサー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/04 Ｇ０１Ｎ 27/30 Ｚ 27/30 37/00 １０２ 27/447 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｅ ３３１Ｋ ３１５Ｋ ３１５Ｂ ３２５Ａ (72)発明者 増田 豪 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12号 株式会社日本触媒内 (72)発明者 吉田 理 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12号 株式会社日本触媒内 (72)発明者 ▲土▼▲橋▼ 幸生 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12号 株式会社日本触媒内 (72)発明者 向山 正治 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12号 株式会社日本触媒内 Ｆターム(参考） 2G060 AA08 AD05 AE40 AF08 AF11 AG05 AG11 HD03 KA15 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B029 AA07 BB20 CC03 CC10 FA12 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 所定電圧が印加される一対の電極間に、
   吸着シート及びプレート基材を介在し、該プレート基材
   に電極間に流れる電流方向に軸線を有するように貫通孔
   を開設し、当該貫通孔の内壁にプローブを化学的に結合
   してなる、バイオチップ。
2. 【請求項２】 当該プローブは貫通孔の内壁にスペーサ
   ーを介して化学的に結合する、請求項１に記載のバイオ
   チップ。
3. 【請求項３】 該貫通孔は独立した貫通孔である、請求
   項１または２に記載のバイオチップ。
4. 【請求項４】 少なくとも一方の電極が脱着可能であ
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオチッ
   プ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のバ
   イオチップを用いた非結合物質の除去方法。