JP4741967B2

JP4741967B2 - 遺伝子の発現解析方法及び抗原の検出方法

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Publication number: JP4741967B2
Application number: JP2006088317A
Authority: JP
Inventors: 光史岩館; 是松永; 剛田中
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY; Casio Computer Co Ltd
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY; Casio Computer Co Ltd
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: JP2007263703A

Description

本発明は、遺伝子の発現解析方法及び抗原の検出方法に関する。

様々な生物種の遺伝子の発現解析を行うためにＤＮＡチップや抗体チップ等の生体高分子分析チップやその読取装置が開発されている。生体高分子分析チップは、プローブとなる既知の塩基配列のｃＤＮＡや抗体をスライドガラス等の固体担体上にマトリックス状に整列固定させたものである（例えば特許文献１参照）。例えば、ＤＮＡチップ及びその読取装置を用いた遺伝子の発現解析は次のようにして行う。

まず、既知の塩基配列を有した複数種類のｃＤＮＡ（以下、プローブＤＮＡという）をスライドガラス等の固体担体に整列固定させたＤＮＡチップを準備する。次に、検体からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、標識物質で標識したものを用意する（以下、標識ＤＮＡという）。ここで、標識物質には蛍光物質や化学発光基質、あるいは化学発光基質を発光させる酵素等を用いることができる。
次に、標識ＤＮＡをＤＮＡチップ上に添加すると、標識ＤＮＡが相補的なプローブＤＮＡとハイブリダイズすることによりＤＮＡチップ上に固定される。

次いで、ＤＮＡチップを読取装置にセッティングし、読取装置にて分析する。読取装置は、ＤＮＡチップに対して二次元的に移動する集光レンズ及びフォトマルチプライヤーによってＤＮＡチップを走査する標識物質により発した光を集光レンズで集光させ、光強度をフォトマルチプライヤーで計測することで、ＤＮＡチップの面内の光強度分布を計測し、これにより、ＤＮＡチップ上の光強度分布が二次元の画像として出力される。出力された画像内で光強度が大きい部分には、プローブＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有した標識ＤＮＡが含まれていることを表している。従って、二次元画像中のどの部分の蛍光強度が大きいかによって検体で発現しているｍＲＮＡを同定することができる。
特開２０００−１３１２３７号公報

ところで、複数の光電変換素子を二次元アレイ状に配列してなる固体撮像デバイスの受光面にＤＮＡや抗体等のプローブ分子をスポットした生体高分子分析チップが開発されている。このような生体高分子分析チップでは、スポットに付着した標識ＤＮＡ等の生体高分子を標識する標識物質により発生する光を各光電変換素子により計測する。固体撮像デバイスの受光面にスポットが点在しており、受光面に付着された生体高分子と光電変換素子との間の距離が近いために標識物質から発した光の減衰を抑えることができるために、僅かな光量でも計測が可能であるという利点がある。

上記のような生体高分子分析チップにおいて、標識物質として化学発光基質を発光させるための酵素を用いた場合には、化学発光基質を含む溶液をスポットに滴下し、酵素による化学反応に基づいて励起された化学発光基質が基底状態に戻るときに発する光を計測する。しかし、標識物質の励起された化学発光基質が基底状態に戻るまでの時間に化学発光基質が溶液中に拡散すると、光電変換素子による信号量が減り、Ｓ／Ｎ比が低下する。

本発明は、上記の問題を解決し、より感度の良好な遺伝子の発現解析方法及び抗原の検出方法を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は、
内部に溶液が注入されるウェルと、前記ウェル内に、間隔を空けて設けられた一対の第一電極及び第二電極と、前記第一電極と前記第二電極との間に配置され、ウェル側に受光面を向けて設けられた光電変換素子と、を備えた撮像装置と、
前記光電変換素子の受光面の近傍に設けられ、前記ウェルに注入される溶液内の特定の生体高分子と結合する既知の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡであるプローブと、
を有した生体高分子分析チップを用いた遺伝子の発現解析方法であって、任意の細胞内から抽出されたＲＮＡを鋳型として作成された酵素標識ＤＮＡを含む溶液を前記ウェル内に注入し、次に、前記プローブに溶液内の酵素標識ＤＮＡの一部をハイブリダイズさせ、その後、酵素標識ＤＮＡを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態で且つ溶液中で電荷を帯びた蛍光物質を生成し、且つ溶液中で電荷を帯びた化学発光基質を含む溶液を前記ウェル内に注入するとともに、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第一電界を発生し、前記第一電界によって前記第一電極及び前記第二電極の一方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、その後、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第二電界を発生し、前記第二電界によって前記第一電極及び前記第二電極の他方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、
内部に溶液が注入されるウェルと、前記ウェル内に、間隔を空けて設けられた一対の第一電極及び第二電極と、前記第一電極と前記第二電極との間に配置され、ウェル側に受光面を向けて設けられた光電変換素子と、を備えた撮像装置と、
前記光電変換素子の受光面の近傍に設けられ、前記ウェルに注入される溶液内の特定の抗原と結合する抗体であるプローブと、
を有した生体高分子分析チップを用いた抗原の検出方法であって、任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、次に、前記プローブに溶液内の特定の抗原とを結合させ、次いで、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させるとともに、前記特定の抗原に結合しなかった第二の抗体を除去し、その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態で且つ溶液中で電荷を帯びた蛍光物質を生成し、且つ溶液中で電荷を帯びた化学発光基質を含む溶液を前記ウェル内に注入するとともに、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第一電界を発生し、前記第一電界によって前記第一電極及び前記第二電極の一方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、その後、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第二電界を発生し、前記第二電界によって前記第一電極及び前記第二電極の他方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。

本発明によれば、ウェル内の第一電極及び第二電極に印加する電圧によって第一電極及び第二電極間で電荷を帯びた蛍光物質または化学発光基質を第一電極側、第二電極側に移動させ、化学発光基質が酵素と接触する回数が増え、反応速度を高めることができ、より多くの蛍光物質を生成させることができ、また、ウェル内の励起状態の蛍光物質を局在化させて蛍光を集光することができる。したがって、使用する化学発光基質の全体量を抑えることができる。

以下に、本発明を実施するための最良の形態について図面を用いて説明する。但し、以下に述べる実施形態には、本発明を実施するために技術的に好ましい種々の限定が付されているが、発明の範囲を以下の実施形態及び図示例に限定するものではない。

＜第１実施の形態＞
〔１〕生体高分子分析チップの全体構成
図１は、本発明を適用した第１の実施形態における生体高分子分析チップ１の概略平面図であり、図２は、図１の切断面IIに沿った矢視断面図である。

この生体高分子分析チップ１は、固体撮像デバイス１０及び固体撮像デバイス１０上に固体撮像デバイス１０を囲むように設けられた格子枠状の隔壁５０を備えた撮像装置と、隔壁５０及び固体撮像デバイス１０によりマトリクス状に形成された各ウェル５２内に点在した複数のスポット６０，６０，…と、を具備する。なお、図１では２行×２列のマトリクスを示すが、本発明はさらに多くの行及び列からなるマトリクスを有していてもよい。

〔２〕固体撮像デバイス
ここで、図１、図２を用いて固体撮像デバイス１０について説明する。
透明基板１７は、後述する蛍光体が発する光を透過する性質（以下、光透過性という。）を有するとともに絶縁性を有し、石英ガラス等といったガラス基板又はポリカーボネート、ＰＭＭＡ等といったプラスチック基板である。

この固体撮像デバイス１０においては、光電変換素子としてダブルゲート型電界効果トランジスタ（以下、ダブルゲートトランジスタという。）２０が利用され、複数のダブルゲートトランジスタ２０，２０，…が透明基板１７上において二次元アレイ状に特にマトリクス状に配列され、これらダブルゲートトランジスタ２０，２０，…が窒化シリコン（SiN）等の保護絶縁膜３２によってまとめて被覆されている。

図３はダブルゲートトランジスタ２０を示す平面図である。図３に示すように、ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…は何れも、受光部である半導体膜２３と、ボトムゲート絶縁膜２２を挟んで半導体膜２３の下に形成されたボトムゲート電極２１と、トップゲート絶縁膜２９を挟んで半導体膜２３の上に形成されたトップゲート電極３１と、半導体膜２３の一部に重なるよう形成された不純物半導体膜２５と、半導体膜２３の別の部分に重なるよう形成された不純物半導体膜２６と、不純物半導体膜２５に重なったソース電極２７と、不純物半導体膜２５に重なったドレイン電極２８と、を備え、半導体膜２３において受光した光量に従ったレベルの電気信号に変換するものである。

ボトムゲート電極２１は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに透明基板１７上に形成されている。また、透明基板１７上には横方向に延在する複数本のボトムゲートライン４１，４１，…が形成されており、横方向に配列された同一の行のダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のそれぞれのボトムゲート電極２１が共通のボトムゲートライン４１と一体となって形成されている。ボトムゲート電極２１及びボトムゲートライン４１は、導電性及び遮光性を有し、例えばクロム、クロム合金、アルミ若しくはアルミ合金又はこれらの合金からなる。

ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のボトムゲート電極２１及びボトムゲートライン４１，４１，…はボトムゲート絶縁膜２２によってまとめて被覆されている。すなわち、ボトムゲート絶縁膜２２は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，…に共通して形成された膜である。ボトムゲート絶縁膜２２は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン（SiN）又は酸化シリコン（SiO₂）からなる。

ボトムゲート絶縁膜２２上には、複数の半導体膜２３がマトリクス状に配列するよう形成されている。半導体膜２３は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立して形成されており、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０においてボトムゲート電極２１に対して対向配置され、ボトムゲート電極２１との間にボトムゲート絶縁膜２２を挟んでいる。半導体膜２３は、平面視して略矩形状を呈しており、受光した蛍光の光量に応じた量の電子−正孔対を生成するアモルファスシリコン又はポリシリコンで形成された層である。

半導体膜２３上には、チャネル保護膜２４が形成されている。チャネル保護膜２４は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立してパターニングされており、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０において半導体膜２３の中央部上に形成されている。チャネル保護膜２４は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。チャネル保護膜２４は、パターニングに用いられるエッチャントから半導体膜２３の界面を保護するものである。半導体膜２３に光が入射すると、入射した光量に従った量の電子−正孔対がチャネル保護膜２４と半導体膜２３との界面付近を中心に発生するようになっている。この場合、半導体膜２３側にはキャリアとして正孔が発生し、チャネル保護膜２４側には電子が発生する。

半導体膜２３の一端部上には、不純物半導体膜２５が一部、チャネル保護膜２４に重なるようにして形成されており、半導体膜２３の他端部上には、不純物半導体膜２６が一部、チャネル保護膜２４に重なるようにして形成されている。不純物半導体膜２５，２６は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立してパターニングされている。不純物半導体膜２５，２６は、ｎ型の不純物イオンを含むアモルファスシリコン（ｎ⁺シリコン）からなる。

不純物半導体膜２５上には、ソース電極２７が形成され、不純物半導体膜２６上には、ドレイン電極２８が形成されている。ソース電極２７及びドレイン電極２８はダブルゲートトランジスタ２０ごとに形成されている。縦方向に延在する複数本のソースライン４２，４２，…及びドレインライン４３，４３，…がボトムゲート絶縁膜２２上に形成されている。縦方向に配列された同一の列のダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のソース電極２７は共通のソースライン４２と一体に形成されており、縦方向に配列された同一の列のダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のドレイン電極２８は共通のドレインライン４３と一体に形成されている。ソース電極２７、ドレイン電極２８、ソースライン４２及びドレインライン４３は、導電性及び遮光性を有しており、例えばクロム、クロム合金、アルミ若しくはアルミ合金又はこれらの合金からなる。

ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のソース電極２７及びドレイン電極２８並びにソースライン４２，４２，…及びドレインライン４３，４３，…は、トップゲート絶縁膜２９によってまとめて被覆されている。トップゲート絶縁膜２９は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，…に共通して形成された膜である。トップゲート絶縁膜２９は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。

トップゲート絶縁膜２９上には、複数のトップゲート電極３１がダブルゲートトランジスタ２０ごとに形成されている。トップゲート電極３１は、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０において半導体膜２３に対して対向配置され、半導体膜２３との間にトップゲート絶縁膜２９及びチャネル保護膜２４を挟んでいる。また、トップゲート絶縁膜２９上には横方向に延在する複数本のトップゲートライン４４，４４，…が形成されており、横方向に配列された同一の行のダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のトップゲート電極３１が共通のトップゲートライン４４と一体に形成されている。トップゲート電極３１及びトップゲートライン４４は、導電性及び光透過性を有し、例えば、酸化インジウム、酸化亜鉛若しくは酸化スズ又はこれらのうちの少なくとも一つを含む混合物（例えば、錫ドープ酸化インジウム（ＩＴＯ）、亜鉛ドープ酸化インジウム）で形成されている。

ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のトップゲート電極３１及びトップゲートライン４４，４４，…は保護絶縁膜３２によってまとめて被覆され、保護絶縁膜３２は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，…に共通して形成された膜である。保護絶縁膜３２は、絶縁性及び光透過性を有し、窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。

保護絶縁膜３２の上面には、各ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…の左右側方に、それぞれ電極３３ａ，３３ｂが設けられている。また、保護絶縁膜３２の上面には、縦方向に配列された同一の列の電極３３ａ，３３ｂと一体となって縦方向に延在する複数本の電極ライン３４ａ，３４ｂが形成されている。電極３３ａ，３３ｂは、電極３３ａと電極３３ｂとの間の距離が電極ライン３４ａと電極ライン３４ｂとの間の距離より短く設定されるように、電極３３ａの対向辺と電極３３ｂの対向辺が互いに突出下形状となっている。電極３３ａ，３３ｂ及び電極ライン３４ａ，３４ｂは導電性を有し、例えば、クロム、クロム合金、アルミ若しくはアルミ合金又はこれらの合金等の遮光性を有する導電体、あるいは、酸化インジウム、酸化亜鉛若しくは酸化スズ又はこれらのうちの少なくとも一つを含む混合物（例えば、錫ドープ酸化インジウム（ＩＴＯ）、亜鉛ドープ酸化インジウム）等の光透過性を有する導電体で形成されている。

電極３３ａ，３３ｂ及び電極ライン３４ａ，３４ｂは保護絶縁膜３５によってまとめて被覆される。保護絶縁膜３５は、絶縁性及び光透過性を有し、窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。

以上のように構成された固体撮像デバイス１０は、保護絶縁膜３５の表面を受光面としており、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０の半導体膜２３において受光した光量を電気信号に変換するように設けられている。

〔３〕隔壁
隔壁５０は保護絶縁膜３５上に密着され、各ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…の上部にウェル５２を形成する。なお、１つのウェル５２に二つ以上のダブルゲートトランジスタ２０が配置されるようにしてもよい。隔壁５０は不透明であり、ダブルゲートトランジスタ２０に隣接するウェル５２から光が入ることを防いでいる。

〔４〕スポット
次に、スポット６０について説明する。図１に示すように、各ウェル５２には、固体撮像デバイス１０の上面にスポットが形成されている。各スポット６０は、図２に示すように、プローブとなる既知の塩基配列のｃＤＮＡ（プローブＤＮＡ６１）や抗体等の溶液を滴下し、乾燥して形成される。以下ではプローブとして既知の塩基配列のｃＤＮＡを用いた場合について説明する。

１つのスポット６０では同じ塩基配列の一本鎖のプローブＤＮＡ６１が多数集まった群集が固体撮像デバイス１０の上面に固定化され、スポット６０ごとにプローブＤＮＡ６１は異なる塩基配列となっている。プローブＤＮＡ６１としては、既知のｍＲＮＡの塩基配列、またはその一部と同一の、あるいは相補的な塩基配列のＤＮＡが用いられる。具体的には、例えば、後述する酵素標識ＤＮＡで用いるのと同じ細胞検体から作成したｃＤＮＡライブラリを用いることができる。

１つのスポット６０は各ウェル５２内のダブルゲートトランジスタ２０上に重なるように形成されている。なお、１つのスポット６０に重なったダブルゲートトランジスタ２０の数は異なっていてもよい。

〔５〕分析装置
生体高分子分析チップ１を分析装置７０にセッティングして生体高分子分析チップ１を用いるので、まず分析装置７０について図４を用いて説明する。図４は分析装置７０の構成を示したブロック図である。

分析装置７０は、生体高分子分析チップ１に接続され、固体撮像デバイス１０を駆動する電極ドライバ７３、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７５、ドレインドライバ７６と、これらを制御するコンピュータ７１と、コンピュータ７１から出力された信号により出力（表示又はプリント）を行う出力装置７７と、を備える。出力装置７７はプロッタ、プリンタ又はディスプレイである。

生体高分子分析チップ１が分析装置７０にセッティングされた場合には、固体撮像デバイス１０の電極ライン３４ａ，３４ｂが電極ドライバ７３の端子に接続されるようになっている。同様に、トップゲートライン４４，４４，…がトップゲートドライバ７４の端子に、ボトムゲートライン４１，４１，…がボトムゲートドライバ７５の端子に、ドレインライン４３，４３，…がドレインドライバ７６の端子に、それぞれ接続されるようになっている。また、生体高分子分析チップ１が分析装置７０にセッティングされた場合、固体撮像デバイス１０のソースライン４２，４２，…が一定電圧源に接続され、この例ではソースライン４２，４２，…が接地されるようになっている。

電極ドライバ７３、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７５及びドレインドライバ７６は、協同して固体撮像デバイス１０を駆動するものである。

コンピュータ７１は、図示しないＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等を備え、電極ドライバ７３、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７５及びドレインドライバ７６に制御信号を出力することによって、電極ドライバ７３、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７５及びドレインドライバ７６に固体撮像デバイス１０の駆動動作を行わせる機能を有する。また、コンピュータ７１は入力した二次元の画像データ画像データに従った画像を出力装置７７に出力させる機能を有する。

また、コンピュータ７１はドレインドライバ７６から入力した電気信号をＡ／Ｄ変換することで、固体撮像デバイス１０の受光面に沿った光強度分布を二次元の画像データとして取得する機能を有する。

さらに、分析装置７０は、コンピュータ７１により制御される注入装置７９を備える。コンピュータ７１は注入装置７９を駆動し、分析装置７０にセットされた生体高分子分析チップ１の各ウェル５２に、後述する化学発光基質を含む溶液を滴下する。

〔６〕酵素標識ＤＮＡ
上記生体高分子分析チップ１で分析する試料としては、ＤＮＡを用いることができる。試料となるＤＮＡとしては、任意の細胞検体内で発現しているｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて得られたｃＤＮＡを用いることができる。ｃＤＮＡは例えばアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等、後述する化学発光基質の反応の触媒として機能する酵素で標識する。

ｃＤＮＡを酵素で標識するには、例えば、酵素で標識されたオリゴｄＴプライマや、標識されたｄＮＴＰミックスを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施すればよい。以下では、この標識されたｃＤＮＡを酵素標識ＤＮＡという。

〔７〕化学発光基質
酵素標識ＤＮＡを検出するのに用いる化学発光基質について説明する。化学発光基質としては、酵素標識ＤＮＡの標識に用いられた酵素を触媒として利用した化学反応により励起状態の蛍光物質を生成するものを用いることができる。
具体的には、例えばアルカリホスファターゼの基質となるジオキセタン系の誘導体や、ペルオキシダーゼの基質となるルミノール系の化合物を用いることができる。

ジオキセタン系の誘導体として、化学式１に示すアダマンチルジオキセタン塩素化誘導体（C₁₈H₁₉Cl₂O₇PNa₂）を例に挙げて説明する。アダマンチルジオキセタン塩素化誘導体はリン酸基を有し、アルカリホスファターゼの基質となる。

アルカリホスファターゼはアダマンチルジオキセタン塩素化誘導体のリン酸基を加水分解し、化学式２に示す不安定な中間体を形成する。

中間体は自然開裂し、化学式３に示すアダマンタノンと蛍光体とに分解される。この蛍光体は励起状態であり、蛍光体が基底状態に遷移するときのエネルギーが光として放出される。

なお、アルカリホスファターゼの基質となる化学発光基質はリン酸基を有しており、水溶液中で負に帯電している。また、化学発光基質の加水分解により生成する蛍光体も、水溶液中で負に帯電している。このため、化学発光基質及び蛍光体は、水溶液中で正電荷側へ移動する。

〔８〕サンプルの処理
酵素標識ＤＮＡの処理方法について説明する。まず、作業者が、酵素標識ＤＮＡを含有した溶液（以下、酵素標識ＤＮＡ溶液という）を各ウェル５２内に注入する。酵素標識ＤＮＡ溶液を注入する前に各ウェル５２内に酵素標識ＤＮＡが泳動するためのバッファー溶液が入れられていてもよく、酵素標識ＤＮＡ溶液自体が泳動用のバッファー溶液を兼ねていてもよい。なお、酵素標識ＤＮＡ溶液を各ウェル５２内のスポット６０，６０，…に順次又は同時に滴下してもよい。このとき、酵素標識ＤＮＡが一本鎖となるように酵素標識ＤＮＡ溶液は加熱されている。

次いで、プローブＤＮＡ６１と酵素標識ＤＮＡとがハイブリダイゼーションを引き起こすように、生体高分子分析チップ１の各ウェル５２を所定の温度に冷却する。すると、各ウェル５２内に注入された酵素標識ＤＮＡ溶液内の酵素標識ＤＮＡのうち、当該ウェル内のスポット６０のプローブＤＮＡ６１と相補的なものは、プローブＤＮＡ６１とハイブリダイズする。一方、プローブＤＮＡ６１と相補的ではない酵素標識ＤＮＡは、そのスポット６０には結合しない。
その後、ウェル５２内の酵素標識ＤＮＡ溶液を洗浄用バッファー溶液で洗い流し、酵素標識ＤＮＡのうちプローブＤＮＡ６１とハイブリダイズしなかったものをウェル５２内から除去する。

〔９〕サンプルの検出
次に、酵素標識ＤＮＡの検出方法について図５〜図８を用いて説明する。
上記処理を行った固体撮像デバイス１０を分析装置７０にセッティングし、電極ドライバ７３、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７５及びドレインドライバ７６をコンピュータ７１に接続し、コンピュータ７１を起動する。

次に、コンピュータ７１により電極ドライバ７３を制御し、電極ライン３４ａ，３４ｂに正電圧を印加し、電極３３ａ，３３ｂを正に帯電させる。

次に、コンピュータ７１により注入装置７９を制御し、各ウェル５２に化学発光基質８１を含む溶液を注入（図５）すると、化学発光基質８１は負に帯電しているので、そのほとんどが正に帯電した電極３３ａ，３３ｂに引き寄せられる（図６）。
全てのウェル５２に化学発光基質８１を含む溶液を注入し終わったら、電極ライン３４ｂに正電圧を印加したまま、電極ライン３４ａには、電極ライン３４ｂの電圧に対して負となる電圧であって、各化学発光基質８１が帯電している電荷量及び各蛍光体８２が帯電している電荷量も大きい負の電荷量が電極３３ａに帯電するような負電圧を印加し、電極３３ａと電極３３ｂとの間で電界が生じる。それと同時に、分析装置７０による光量データの計測動作を開始する。なお、電極ライン３４ａと電極ライン３４ｂとの間にも電界は発生するが、電極ライン３４ａと電極ライン３４ｂとの間の距離は、電極３３ａと電極３３ｂとの間の距離よりも長いので、電極ライン３４ａと電極ライン３４ｂとの間の電界は電極３３ａと電極３３ｂとの間で電界よりも小さい。

電極ライン３４ａに電極ライン３４ｂの電圧に対して負となる電圧を印加すると、電極３３ａの近傍の化学発光基質８１は、化学式１に示すような構造であるために、ウェル５２内でナトリウムイオンと解離して負に帯電しているので、相対的に正に帯電している電極３３ｂに向かって移動を開始する。つまり、電極ライン３４ａと電極ライン３４ｂとの間では電極３３ａと電極３３ｂとの間よりも電界が十分強くないので、スポット６０の化学発光基質８１は電極ライン３４ｂに向かって移動せずに電極３３ｂに向かって移動することになる。
化学発光基質８１が電極３３ａの近傍から電極３３ｂの近傍へ移動する経路には、スポット６０があるため、プローブＤＮＡ６１に酵素標識ＤＮＡ６２がハイブリダイズしたウェル５２では、酵素標識ＤＮＡ６２を標識する酵素６３により化学発光基質８１が加水分解され、不安定な中間体を経て励起状態の蛍光体８２が生成される（図７）。なお、蛍光体８２も化学式３に示すように負に帯電しているため、正に帯電した電極３３ｂに向かって移動を開始する。

化学発光基質８１及び蛍光体８２が電極３３ａの近傍から電極３３ｂの近傍へ移動するのに充分な時間が経過したら、コンピュータ７１は電極ドライバ７３を駆動し、電極３３ａを負電圧から正電圧に切り換えて電極３３ａに正電荷を帯電させるとともに、電極３３ｂを正電圧から負電圧に切り換えて電極３３ｂに負電荷を帯電させる。すると、電極３３ｂ側に移動していた未反応の化学発光基質８１及び蛍光体８２は、正に帯電した電極３３ａに向かって移動する。
このときも、化学発光基質８１が電極３３ｂの近傍から電極３３ａの近傍へ移動する経路において、スポット６０があるため、プローブＤＮＡに酵素標識ＤＮＡ６２がハイブリダイズしたウェル５２では、酵素標識ＤＮＡ６２を標識する酵素６３により化学発光基質８１が加水分解され、励起状態の蛍光体８２が生成される（図８）。

以後、同様に、電極３３ａ，３３ｂの正負を交互に切り替えることで、ウェル５２内で化学発光基質８１を移動させることができる。このため、化学発光基質８１が酵素６３と接触する回数または確率が増え、反応速度を高めることができ、より多くの蛍光体８２を生成させることができる。
電極の切り替え回数が所定の回数に達したら、コンピュータ７１は電極ドライバ７３を停止する。

励起状態の蛍光体８２が基底状態に遷移するときに蛍光（主に可視光波長域）が放出され、対応するダブルゲートトランジスタ２０に蛍光が入射して電子−正孔対が発生する。より多くの蛍光体８２を生成させることで、より多くの蛍光がダブルゲートトランジスタに入射し、より多くの電子−正孔対が発生する。したがって、シグナルがバックグラウンドノイズと比較して大きくなり、ＳＮ比を向上させることができる。
その後、各ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のそれぞれの光量データを取得し、ＲＡＭに記憶する。

作業者は、ＲＡＭに記憶された各ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のそれぞれの光量データを出力装置７７により出力することで得られた画像データより、各スポット６０，６０，…におけるハイブリダイゼーションの有無を確認することができる。ハイブリダイゼーションが起きていれば、そのスポット６０のプローブＤＮＡ６１と相補的な塩基配列のｍＲＮＡが細胞検体内で発現していることがわかる。

＜第２実施形態＞
第１の実施形態では、生体高分子分析チップ１で分析する試料として、検体内で発現しているｍＲＮＡから逆転写酵素により合成されたＤＮＡを用いたが、検体内で発現しているタンパク質や糖鎖等の抗原を試料としてもよい。この場合、既知のタンパク質や糖鎖等の抗原と結合する抗体（以下、プローブ抗体という）をプローブとして用いる。

具体的には、生体高分子分析チップ１の各ウェル５２にプローブ抗体を含む溶液を滴下し、乾燥してスポット６０を形成する。なお、各ウェル５２に滴下されるプローブ抗体はそれぞれ異なるタンパク質を抗原とし、同じスポット６０を形成する抗体は同一の抗原決定基を認識する。このようなプローブ抗体として、モノクローナル抗体を用いることができる。

次に、サンプルとなる抗原を含む溶液（以下、サンプル溶液という）を各ウェル５２内に注入する。
プローブ抗体にサンプル溶液中の抗原が結合するのに充分な時間が経過した後、ウェル５２内のサンプル溶液をバッファー溶液で洗い流し、サンプル溶液のうちプローブ抗体と結合しなかったものをウェル５２内から除去する。

次に、各ウェル５２に、プローブ抗体が認識するのと同じ抗原の異なる抗原決定基を認識する抗体を酵素で標識したもの（以下、酵素標識抗体という）の溶液（以下、酵素標識抗体溶液という）を注入する。
プローブ抗体に結合した抗原と酵素標識抗体とが結合するのに充分な時間が経過した後、ウェル５２内の酵素標識抗体溶液をバッファー溶液で洗い流し、酵素標識抗体溶液のうち抗原と結合しなかったものをウェル５２内から除去する。
以後、第１実施形態の〔９〕サンプルの検出と同様にして、各ウェル５２に化学発光基質を含む溶液を注入し、分析装置７０による光量データの計測動作を行う。

図９に示すように、プローブ抗体６４に抗原６５が結合し、抗原６５に酵素標識抗体６６が結合したウェル５２では、酵素標識抗体６６の酵素６７により化学発光基質８１が加水分解され、中間体を経て励起状態の蛍光体８２が生成される。蛍光体８２から放出される蛍光は、ダブルゲートトランジスタ２０により検出される。

作業者は、ＲＡＭに記憶された各ダブルゲートトランジスタ２０，２０，…のそれぞれの光量データを出力装置７７により出力することで得られた画像データより、各スポット６０，６０，…における抗原６５の有無を確認することができる。このため、ウェル５２内の抗体の種類により、検体内でどのような抗原が発現しているかを直接確認することができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されることなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の改良並びに設計の変更を行ってもよい。

例えば、上記実施の形態では、プローブとして既知の塩基配列の一本鎖ＤＮＡや抗体を用いたが、その他の既知の生体高分子や低分子等を用いてもよい。例えば、抗原となるペプチドやタンパク、糖鎖、低分子リガンド、既知の細胞等を用いてもよい。

本発明を適用した第１の実施形態における生体高分子分析チップ１の概略平面図である。図１の切断面IIに沿った矢視断面図である。固体撮像デバイス１０の画素である光電変換素子の電極構造を示した平面図である。分析装置７０の構成を示したブロック図である。酵素標識ＤＮＡの検出方法についての説明図である。酵素標識ＤＮＡの検出方法についての説明図である。酵素標識ＤＮＡの検出方法についての説明図である。酵素標識ＤＮＡの検出方法についての説明図である。抗原の検出方法についての説明図である。

符号の説明

１生体高分子分析チップ
１０固体撮像デバイス
２０ダブルゲートトランジスタ（光電変換素子）
３３ａ，３３ｂ電極
５２ウェル
６０スポット
６１プローブＤＮＡ
６２酵素標識ＤＮＡ
６３，６７酵素
６４プローブ抗体
６５抗原
６６酵素標識抗体
８１化学発光基質
８２蛍光体

Claims

内部に溶液が注入されるウェルと、前記ウェル内に、間隔を空けて設けられた一対の第一電極及び第二電極と、前記第一電極と前記第二電極との間に配置され、ウェル側に受光面を向けて設けられた光電変換素子と、を備えた撮像装置と、
前記光電変換素子の受光面の近傍に設けられ、前記ウェルに注入される溶液内の特定の生体高分子と結合する既知の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡであるプローブと、
を有した生体高分子分析チップを用いた遺伝子の発現解析方法であって、
任意の細胞内から抽出されたＲＮＡを鋳型として作成された酵素標識ＤＮＡを含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の酵素標識ＤＮＡの一部をハイブリダイズさせ、
その後、酵素標識ＤＮＡを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態で且つ溶液中で電荷を帯びた蛍光物質を生成し、且つ溶液中で電荷を帯びた化学発光基質を含む溶液を前記ウェル内に注入するとともに、
第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第一電界を発生し、前記第一電界によって前記第一電極及び前記第二電極の一方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、
その後、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第二電界を発生し、前記第二電界によって前記第一電極及び前記第二電極の他方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする遺伝子の発現解析方法。
内部に溶液が注入されるウェルと、前記ウェル内に、間隔を空けて設けられた一対の第一電極及び第二電極と、前記第一電極と前記第二電極との間に配置され、ウェル側に受光面を向けて設けられた光電変換素子と、を備えた撮像装置と、
前記光電変換素子の受光面の近傍に設けられ、前記ウェルに注入される溶液内の特定の抗原と結合する抗体であるプローブと、
を有した生体高分子分析チップを用いた抗原の検出方法であって、
任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の特定の抗原を結合させ、
次いで、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させるとともに、前記特定の抗原に結合しなかった第二の抗体を除去し、
その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態で且つ溶液中で電荷を帯びた蛍光物質を生成し、且つ溶液中で電荷を帯びた化学発光基質を含む溶液を前記ウェル内に注入するとともに、
第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第一電界を発生し、前記第一電界によって前記第一電極及び前記第二電極の一方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、
その後、第一電極及び第二電極に電圧を印加して前記第一電極及び前記第二電極の間に第二電界を発生し、前記第二電界によって前記第一電極及び前記第二電極の他方側に前記蛍光物質または前記化学発光基質を引き寄せ、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする抗原の検出方法。