JP4806368B2 - 生体高分子の分析方法、遺伝子の発現解析方法、及び抗原の検出方法 - Google Patents
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次に、標識DNAをDNAチップ上に添加すると、標識DNAが相補的なプローブDNAとハイブリダイズすることによりDNAチップ上に固定される。
次に、前記ウェルの底部に設けられたプローブに溶液内の前記生体高分子の一部を結合させ、
その後、前記酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェル内に、酵素で標識した生体高分子を含む溶液を注入し、
次に、前記ウェルの底部に設けられたプローブに溶液内の前記生体高分子の一部を結合させ、
その後、前記酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。
次に、任意の細胞内から抽出されたRNAを鋳型として作成された酵素標識DNAを含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の酵素標識DNAの一部をハイブリダイズさせ、
その後、酵素標識DNAを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。
次に、任意の細胞内から抽出されたRNAを鋳型として作成された酵素標識DNAを含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の酵素標識DNAの一部をハイブリダイズさせ、
その後、酵素標識DNAを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。
次に、任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに溶液内の特定の抗原とを結合させ、
次いで、前記プローブに結合しなかった抗原を除去するとともに、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させ、
その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする抗原の検出方法。
受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、
酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェルの底部に、特定の抗原と結合する抗体をプローブとして設け、
次に、任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに溶液内の特定の抗原とを結合させ、
次いで、前記プローブに結合しなかった抗原を除去するとともに、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させ、
その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする。
〔1〕生体高分子分析チップの全体構成
図1は、本発明の実施形態に係る生体高分子分析チップ1の概略平面図であり、図2は、図1のII−II矢視断面図である。図3は図1のIII部拡大図であり、図4は図3のIV−IV矢視断面図である。この生体高分子分析チップ1は、DNAを検出するDNAチップである。
この生体高分子分析チップ1は、図1、図2に示すように、撮像装置2は、固体撮像デバイス10と、隔壁40と、スポット60とを備える。
ここで、図1〜図4を用いて固体撮像デバイス10について説明する。図2に示すように、固体撮像デバイス10は、透明基板11と、ボトムゲート絶縁膜13と、トップゲート絶縁膜21と、保護絶縁膜23と、保護絶縁膜25とを積層してなる。これらの層間に、複数のボトムゲートライン12a、ソースライン18a、ドレインライン19a、トップゲートライン22a、電極ライン24a及び、ダブルゲートトランジスタ20を形成するボトムゲート電極12、半導体膜14、チャネル保護膜15、不純物半導体膜16,17、ソース電極18、ドレイン電極19、トップゲート電極22、電極24が設けられている。
なお、図1では8行×8列の64個のダブルゲートトランジスタ20,20,…を備えるマトリクス状の二次元アレイを示すが、その数は任意であり、さらに多くの行及び列を有していてもよい。
隔壁40は保護絶縁膜25上に密着され、固体撮像デバイス10の受光面にウェル42を形成する。隔壁40は不透明であり、ダブルゲートトランジスタ20に隣接するウェル42から光が入ることを防いでいる。
図1、図2に示すように、ウェル42内にはスポット60が形成されている。各スポット60は、プローブとなる既知の塩基配列のcDNA(プローブDNA61)や抗体等の溶液をウェル42内に滴下し、乾燥して形成される。以下ではプローブとして既知の塩基配列のcDNAを用いた場合について説明する。
生体高分子分析チップ1を分析装置70にセッティングして生体高分子分析チップ1を用いるので、分析装置70について図5を用いて説明する。図5は分析装置70の構成を示すブロック図である。
なお、図5では2行×2列の4個のダブルゲートトランジスタ20,20,…のみが記載されているが、その数は任意であり、さらに多くの行及び列を有していてもよい。
上記生体高分子分析チップ1で分析する試料としては、DNAを用いることができる。試料となるDNAとしては、任意の細胞検体内で発現しているmRNAを抽出し、逆転写酵素を用いて得られたcDNAを用いることができる。cDNAは例えばアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等、後述する化学発光基質の反応の触媒として機能する酵素で標識する。
酵素標識DNAを検出するのに用いる化学発光基質について説明する。化学発光基質としては、酵素標識DNAの標識に用いられた酵素を触媒として利用した化学反応により励起状態の蛍光物質を生成するものを用いることができる。
具体的には、例えばアルカリホスファターゼの基質となるジオキセタン系の誘導体や、ペルオキシダーゼの基質となるルミノール系の化合物を用いることができる。
磁性粒子の材料としては、例えばニッケル粒子や鉄粒子、Fe3O4、γ-Fe2O3、Co-γ-Fe2O3、(NiCuZn)O・(CuZn)O・Fe2O3、(MnZn)O・Fe2O3、(NiZn)O・Fe2O3、SrO・6Fe2O3、BaO・6Fe2O3等の各種磁性体を用いることができ、これと高分子材料(例えばナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等)とを組み合わせて粒子状に形成してもよい。
以下、酵素標識DNA62をプローブDNA61とハイブリダイゼーションさせる方法について図7、図8を用いて説明する。
まず、作業者が、酵素標識DNA62を含有した溶液(以下、酵素標識DNA溶液という)を各ウェル42内に注入する。酵素標識DNA溶液を注入する前に各ウェル42内に酵素標識DNA62が泳動するためのバッファー溶液が入れられていてもよく、酵素標識DNA溶液自体が泳動用のバッファー溶液を兼ねていてもよい。なお、酵素標識DNA溶液を各ウェル42内のスポット60,60,…に順次又は同時に滴下してもよい。このとき、酵素標識DNA62が一本鎖となるように酵素標識DNA溶液は加熱されている。
その後、ウェル42内の酵素標識DNA溶液を洗浄用バッファー溶液で洗い流し、酵素標識DNAのうちプローブDNA61とハイブリダイズしなかったものをウェル42内から除去する。
酵素標識DNA62の検出方法について図9〜図14を用いて説明する。
まず、制御装置80は、注入装置79を駆動し、分析装置70にセットされた生体高分子分析チップ1の各ウェル42に、化学発光基質91を固定した磁性粒子90を含む溶液を注入する(図12)。
次に、制御装置80は、右側の電磁石78Rに通電を開始する(ステップS5)。その後、制御装置80は、記憶装置82に記憶されたカウント数Tを一定時間毎に1減じた値に書き換える(ステップS6)。これをT=0となるまで繰り返す(ステップS7→No)。
T=0となったら(ステップS7→Yes)、制御装置80は、右側の電磁石78Rへの通電を停止する(ステップS8)。
次に、制御装置80は、左側の電磁石78Lに通電を開始する(ステップS10)。その後、制御装置80は、記憶装置82に記憶されたカウント数Tを一定時間毎に1減じた値に書き換える(ステップS11)。これをT=0となるまで繰り返す(ステップS12→No)。
T=0となったら(ステップS12→Yes)、制御装置80は、左側の電磁石78Lへの通電を停止する(ステップS13)。
M=0となったら(ステップS15→Yes)、制御装置80は電極ドライバ73を駆動して電極ライン24aに正電圧を印加するのを停止し(ステップS16)、攪拌動作を終了する。
図15は本実施形態の変形例に係る分析装置170の構成を示すブロック図である。なお、第1実施形態における分析装置70と同様の構成については、下2桁に同符号を付して説明を割愛する。
本変形例においては、固体撮像デバイス110の左右に電磁石178R,178Lが設けられているほか、前側に電磁石178Fが、後側に電磁石178Bが設けられている。
なお、電磁石178R,178L,178F,178Bに1つずつ順番に電圧を印加してもよいし、2つずつ交互に電圧を印加してもよい。
第1実施形態においては、生体高分子分析チップ1で分析する試料として、検体内で発現しているmRNAから逆転写酵素により合成されたDNAを用いたが、検体内で発現している特定のタンパク質または糖鎖等を抗原と結合する抗体(以下、プローブ抗体という)をプローブとして用いてもよい。
プローブ抗体64にサンプル溶液中の抗原65が結合するのに充分な時間が経過した後、ウェル42内のサンプル溶液をバッファー溶液で洗い流し、サンプル溶液中の抗原65のうちプローブ抗体64と結合しなかったものをウェル42内から除去する。
以後、第1実施形態の〔10〕と同様にして、各ウェル42に化学発光基質を含む溶液を注入し、分析装置70による光量データの計測動作を行う。
例えば、上記実施の形態では、プローブとして既知の塩基配列の一本鎖DNAや抗体を用いたが、その他の既知の生体高分子や低分子等を用いてもよい。例えば、抗原となるペプチドやタンパク、糖鎖、低分子リガンド、既知の細胞等を用いてもよい。
20 ダブルゲートトランジスタ(光電変換素子)
40 隔壁
42 ウェル
60 スポット
61 プローブDNA(プローブ)
62 酵素標識DNA
63,67 酵素
64 プローブ抗体(プローブ)
65 抗原
66 酵素標識抗体
70,170 分析装置(生体高分子分析装置)
78R,78L,178R,178L,178F,178B 電磁石
90 磁性粒子
91 化学発光基質
92 蛍光体
Claims (9)
- 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェル内に、酵素で標識した生体高分子を含む溶液を注入し、
次に、前記ウェルの底部に設けられたプローブに溶液内の前記生体高分子の一部を結合させ、
その後、前記酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする生体高分子の分析方法。 - 前記生体高分子分析装置は、前記酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極がそれぞれ設けられていることを特徴とする請求項1に記載の生体高分子の分析方法。
- 前記生体高分子分析装置は、前記ウェルの底部に既知の塩基配列を有する一本鎖DNAであるプローブを設けることを特徴とする請求項1または2に記載の生体高分子の分析方法。
- 前記生体高分子分析装置は、前記ウェルの底部に特定の抗原と結合する抗体であるプローブを設けることを特徴とする請求項1または2に記載の生体高分子の分析方法。
- 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、
酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェル内に、酵素で標識した生体高分子を含む溶液を注入し、
次に、前記ウェルの底部に設けられたプローブに溶液内の前記生体高分子の一部を結合させ、
その後、前記酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする生体高分子の分析方法。 - 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェルの底部に、既知の塩基配列を有する一本鎖DNAをプローブとして設け、
次に、任意の細胞内から抽出されたRNAを鋳型として作成された酵素標識DNAを含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の酵素標識DNAの一部をハイブリダイズさせ、
その後、酵素標識DNAを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする遺伝子の発現解析方法。 - 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、
酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェルの底部に、既知の塩基配列を有する一本鎖DNAをプローブとして設け、
次に、任意の細胞内から抽出されたRNAを鋳型として作成された酵素標識DNAを含む溶液を前記ウェル内に注入し、
次に、前記プローブに溶液内の酵素標識DNAの一部をハイブリダイズさせ、
その後、酵素標識DNAを標識する酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする遺伝子の発現解析方法。 - 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
前記ウェルを囲繞するように配置された複数の電磁石と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェルの底部に、特定の抗原と結合する抗体をプローブとして設け、
次に、任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに溶液内の特定の抗原とを結合させ、
次いで、前記プローブに結合しなかった抗原を除去するとともに、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させ、
その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
その後、適宜電圧を印加して前記複数の電磁石による磁界を交互に発生させる過程を経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする抗原の検出方法。 - 受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置と、
前記撮像装置の受光面側に固定され、内部に溶液が注入されるウェルと、
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酵素に基づく化学反応によって生じる蛍光物質を電気的に引き寄せるため、前記各光電変換素子の受光面側に電極と、を備えた生体高分子分析装置の前記ウェルの底部に、特定の抗原と結合する抗体をプローブとして設け、
次に、任意の抗原を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに溶液内の特定の抗原とを結合させ、
次いで、前記プローブに結合しなかった抗原を除去するとともに、酵素により標識されかつ前記プローブと同一の抗原の異なる抗原決定基と結合する第二の抗体を含む溶液を前記ウェル内に注入し、前記プローブに結合した特定の抗原に第二の抗体を結合させ、
その後、第二の抗体を標識する酵素が触媒として機能する化学反応により電荷を帯びた励起状態の蛍光物質を生成する化学発光基質が固定された磁性粒子を含む溶液を前記ウェル内に注入し、
前記電極に前記蛍光物質を引き寄せるように電圧を印加する過程と、
前記複数の電磁石に適宜電圧を印加して磁界を交互に発生させる過程とを経て、
生成した励起状態の蛍光物質より放出される蛍光を前記光電変換素子により検出することを特徴とする抗原の検出方法。
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