WO2004061451A1 - 反応性チップと、このチップを用いた標的物質の結合検出方法 - Google Patents

反応性チップと、このチップを用いた標的物質の結合検出方法 Download PDF

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WO2004061451A1
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capture probe
reactive chip
vibrating
detecting
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PCT/JP2004/000038
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Yasuko Yoshida
Toshikazu Hirota
Yukihisa Takeuchi
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Ngk Insulators, Ltd.
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Definitions

  • Reactive chip and method for detecting binding of target substance using this chip Reactive chip and method for detecting binding of target substance using this chip
  • the invention of this application relates to a reactive chip and a method for detecting a target substance using the chip. More specifically, mishybridization between the target substance and the capture probe can be eliminated, and accurate detection can be performed in a short period of time. Moreover, various detection means and targets can be selected. It relates to a new reactive chip that can be used and a new method for detecting target substances using this chip.
  • DNA or RNA when DNA or RNA is the target substance, the double-stranded and single-stranded DNA fragments, polynucleotide strands, and oligonucleotide strands capable of complementary binding (hybridization) are captured. These are used as probes, and these are called DNA chips (or DNA arrays) (see, for example, Patent Documents 1-4 and Non-patent Documents 1 and 2). Also, in the case of protein chips, proteins and peptides, and specifically Receptors and antibodies that bind form a target substance-capture probe relationship.
  • the binding of the target substance on the reactive chip is performed, for example, by bringing a sample (sample solution) containing a labeled target substance into contact with the reactive chip, reacting for a certain period of time, binding the target substance to the capture probe, and then unbinding. After removing the substance, the position of the label on the reactive chip is detected to determine to which capture probe the target substance has bound. It is also possible to quantify the amount of the target substance by measuring the intensity of the label signal. In the case of a conventional reactive chip, the sample solution and the reactive chip are separated so that the target substance in the sample solution can approach and bind to the corresponding capture probe by natural diffusion. It had been reacting for a long time.
  • the accuracy of detection of the target substance by the reactive chip depends on the specific binding between the target substance and the capture probe.
  • the target DNA and the probe DNA bind with perfect complementarity with each other, but in reality, even a few mismatches cause the target DNA to bind to the probe DNA.
  • the danger of this mismatch binding was extremely high.
  • the invention (nanochip) of Patent Document 5 is known.
  • probe DNA is immobilized on the surface of an electrode, and target DNA and probe DNA are hybridized while a positive direct current is applied to the electrode. Since the DNA fragment (target DNA) is negatively charged, it can quickly approach and bind to the positively charged probe DNA. After the hybridization reaction is completed, a negative direct current is applied to the electrodes. As a result, both the probe DNA and the target DNA become negatively charged, and the target DNA mismatched to the probe DNA is excluded from the probe DNA. Only target DNA that is rejected and bound by correct complementarity remains in the probe DNA.
  • this nanochip uses the fact that DNA is usually negatively charged, so it cannot be applied to protein chips that use proteins or peptides.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,474,796
  • Patent Document 2 US Patent No. 5,605,662
  • Patent Document 3 International Publication No. 95/251 1 16 Pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication No. 95/35505 Pamphlet
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Publication No. 2001-501301
  • Non-Patent Document 1 Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614-
  • Non-Patent Document 2 Heller, R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and it is possible to shorten the reaction time for a wide range of target substances, and to effectively prevent mismatch binding.
  • the challenge is to provide a new reactive chip that enables highly accurate detection.
  • the first invention of this application is a reactive chip characterized in that a capture probe that binds to a target substance is fixed to each of three or more vibrating surfaces arranged on a substrate. .
  • a second invention is an aspect of the first invention, wherein each vibrating surface has a vibration chip having a vibration generating section in which a piezoelectric / electrostrictive element is interposed between the first electrode and the second electrode. It is.
  • a third invention is an embodiment of the second invention, which is a reactive chip on which a capture probe fixing surface is coated.
  • a fourth invention is an aspect of the second or third invention, wherein the substrate has a thin region and a peripheral thick region, and a reactive chip having a vibration generating portion on an upper surface of the thin region. It is.
  • the substrate has a thin region and a thick region surrounding the thin region, and a reactive chip having a vibration generating portion on a lower surface of the thin region.
  • a sixth invention is an aspect of the second to fifth inventions, wherein each of the lead wires of the first electrode and the second electrode is a reactive chip that is independent for each vibration generation unit.
  • a seventh invention is a reactive chip according to another aspect of the second to fifth inventions, wherein a lead wire of one of the first electrode and the second electrode is common.
  • An eighth invention is an aspect of the second to seventh inventions, which is a reactive chip including a unit for measuring a resonance frequency of the piezoelectric / electrostrictive element.
  • the ninth invention is another aspect of the second to seventh inventions, wherein the first electrode surface is a capture probe fixing surface, and the first electrode and the second electrode are connected to an AC power supply.
  • it is a reactive chip that is also conductive to DC power.
  • a tenth invention is still another aspect of the second to seventh inventions, and is a reactive chip in which different types of capture probes are fixed to each vibrating surface.
  • An eleventh aspect of the present invention is the reactive chip according to one aspect of the tenth aspect of the present invention, wherein the reactive chip includes means for measuring a resonance frequency of the piezoelectric / electrostrictive element.
  • a twelfth invention is directed to another aspect of the tenth invention, wherein the first electrode surface is a capture probe fixing surface, the first electrode and the second electrode are an AC power source, and a DC power source. This is a reactive chip that is also conductive.
  • a thirteenth invention is still another aspect of the second to seventh inventions, wherein three or more vibration surfaces are in the same row, or four or more vibration surfaces are n (n is 2 or more) X m (m is (2 or more) are reactive chips with the same type of capture probe fixed to each vibrating surface in the same row.
  • a fourteenth invention is an aspect of the thirteenth invention, which is a reactive chip including means for measuring a resonance frequency of the piezoelectric Z electrostrictive element.
  • a fifteenth invention is another aspect of the thirteenth invention, wherein the first electrode surface is a capture probe fixing surface, and the first electrode and the second electrode are connected to a DC power supply in addition to the AC power supply. Are also conductive chips.
  • a sixteenth invention is a still further aspect of the second to seventh inventions, wherein three or more vibrating surfaces are in the same row, or four or more vibrating surfaces are n (n is 2 or more) X m (m is 2 or more) are arrayed in a grid pattern, and the reactive tips have fixed capture probes that bind to different parts of the target substance on the same row of vibrating surfaces.
  • a seventeenth invention is an aspect of the sixteenth invention, wherein the piezoelectric Z-electrostrictive element has a resonance circuit. 04 000038
  • An eighteenth invention is directed to another aspect of the sixteenth invention, wherein the first electrode surface is a capture probe fixing surface, the first electrode and the second electrode are an AC power supply, and a DC power supply. This is a reactive chip that is also conductive.
  • a nineteenth invention is a method for detecting a target substance that binds to a capture probe, wherein a sample containing a labeled target substance is obtained while the vibration surface of the reactive chip according to the tenth invention is vibrated.
  • This is a method for detecting a target substance, which comprises contacting a capture tip of a reactive chip with a capture probe, stopping vibration of the vibrating surface, and detecting a target substance bound to the capture probe using a label as an index.
  • the twentieth invention is an aspect of the nineteenth invention, which is a detection method of vibrating a vibrating surface and bringing a sample into contact with a capture probe in a state where a temperature is changed with time.
  • a twenty-first invention is a method for detecting a target substance that binds to a capture probe, comprising: reacting a sample containing a target substance with a vibrating surface of the reactive chip according to the eleventh invention.
  • a twenty-second aspect is an aspect of the twenty-first aspect, wherein the vibrating surface of the reactive chip is vibrated, and the sample is brought into contact with the probe while the temperature is changed over time.
  • a twenty-third invention is a method for detecting a target substance that binds to a capture probe, wherein a sample containing a labeled target substance is obtained by vibrating the vibrating surface of the reactive chip according to the twelfth invention.
  • a twenty-fourth invention is a method for detecting the affinity of a plurality of types of target substances for a capture probe, wherein each of the vibration surfaces of the same row vibration surface of the reactive chip of the thirteenth invention is vibrated at different amplitudes.
  • a twenty-fifth invention is an aspect of the twenty-fourth invention, and is a detection method for bringing a sample into contact with a capture probe while vibrating a vibrating surface and changing a temperature over time.
  • a twenty-sixth invention is a method for detecting the affinity of a plurality of kinds of target substances for a capture probe, wherein the same row vibration surface of the reactive chip of the fourteenth invention is vibrated at different amplitudes, The target substance is brought into contact with the capture probe of the reactive chip, and the change in the resonance frequency of the piezoelectric electrostrictive element is used as an index to detect the degree of affinity of the target substance for each capture probe.
  • a twenty-seventh aspect is an aspect of the twenty-sixth aspect, wherein the vibrating surface of the reactive chip is vibrated, and the sample is brought into contact with the capture probe while the temperature is changed with time.
  • a twenty-eighth invention is a method for detecting the affinity of a plurality of types of target substances for a capture probe, wherein each of the vibration surfaces of the same row vibration surface of the reactive chip of the fifteenth invention is vibrated at a different amplitude. In this state, various labeled target substances are brought into contact with the capture probe of the reactive chip, and the vibration of the vibrating surface is stopped.
  • a method for detecting a target substance comprising applying a negative DC current to a certain first electrode for a certain period of time, and detecting a degree of affinity of the target substance bound to the capture probe for each probe using a label as an index.
  • a twenty-ninth aspect of the present invention is a method for detecting a mutation of a target substance, wherein a sample containing a labeled target substance is washed with the reactive chip in a state where the same row vibration plane of the reactive chip of the sixteenth aspect is vibrated.
  • a method for detecting a target substance comprising: detecting a mutation in a target substance by bringing the probe into contact with a capture probe, stopping vibration of the vibrating surface, and detecting a target substance bound to the capture probe using the label as an indicator. It is.
  • a thirtieth aspect of the present invention is a method for detecting a mutation of a title substance, wherein a sample containing a target substance is reacted with the reactive chip in a state where the same row of vibrating surfaces of the reactive chip of the seventeenth aspect are vibrated.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance, comprising detecting the presence or absence of a target substance by using a change in the resonance frequency of a piezoelectric Z-electrostrictive element as an index to detect a mutation of the target substance.
  • a thirty-first invention is a method for detecting a mutation of a target substance, wherein the sample containing the labeled target substance is captured with the reactive chip of the eighteenth invention vibrated in the same row of vibrating surfaces. After contacting the probe with the probe and stopping the vibration of the vibrating surface, a negative DC current is applied to the first electrode, which is the probe fixed surface, for a certain period of time, and the target substance bound to the capture probe is used as a marker as an index.
  • This is a method for detecting a target substance, which comprises detecting a mutation in the target substance by detecting the mutation. ' ⁇
  • FIG. 1 is a side view showing an example of the basic structure of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 2 is a side view showing another example of the basic structure of the reactive chip of the present invention. 8
  • FIG. 3 is a plan view and a side view showing still another example of the basic structure of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 4 is a side view showing one embodiment of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 5 is a side view showing another embodiment of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 6 is a side view showing still another embodiment of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 7 is a plan view and a side view showing still another embodiment of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 8 is a plan view showing still another embodiment of the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing an example of the arrangement of the capture probe in the reactive chip of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing another arrangement example of the capture probe in the reactive chip of the present invention.
  • the squares indicate the vibrating surface, and the difference between the alphabet letters indicates that the capture probe is different.
  • Fig. 11 is a schematic diagram (left) showing still another example of the arrangement of the capture probe in the reactive chip of the present invention, and the normal state when chromosomal abnormality etc. was detected using this reactive chip. It is the schematic diagram (right) which illustrated the connection state of the chromosome.
  • the square indicates the vibrating surface, and the wavy line communicating with the lateral vibrating surface indicates the vibrator. Differences between letters and numbers indicate that the capture probes are different.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing still another arrangement example of the capture probe in the reactive chip of the present invention.
  • the squares indicate the vibrating surface, and the differences in alphabetic letters and numbers indicate that the capture probes are different.
  • Fig. 13 is an example of the arrangement of the capture probe shown in Fig. 11 (left) and a schematic diagram (right) illustrating the binding state when a chromosomal abnormality (amplification) is detected using this reactive chip. .
  • the square indicates the vibrating surface, and the wavy line communicating with the lateral vibrating surface indicates the vibrator. Differences between letters and numbers indicate that the capture probes are different.
  • Fig. 14 is a schematic diagram (right) illustrating an example of the arrangement of the capture probe illustrated in Fig.
  • FIG. 11 shows the binding state when a chromosomal abnormality (deletion) is detected using this reactive chip.
  • the squares indicate the vibrating surface, and the wavy lines communicating with the horizontal vibrating surfaces indicate the vibrator
  • the difference between the alphabetic characters and numbers indicates that the capture probe is different.
  • FIG. 16 shows an example of the arrangement of the capture probe shown in Fig. 12 (left) and the chromosomal differences using this reactive chip. Is illustrated schematically a coupling state of the detected (substituted) (right). Squares indicates the vibrating surface, the difference of the alphabetic characters and numbers show that Kiyapuchiyapuro one blanking is different. 'REFERENCE NUMERALS
  • the first invention of this application is characterized in that a capture probe that binds to a target substance is fixed to each of three or more vibrating surfaces arranged on a substrate. This is a reactive chip.
  • the “substrate” is a slide glass plate, a ceramic plate, a resin plate such as plastic, a metal plate, etc. used for a normal DNA chip or protein chip.
  • “Capture probes” are biomolecules that specifically bind to a target substance.
  • the target substance is a DNA fragment derived from genomic DNA (eg, cDNA)
  • the capture probe is used to hybridize with these DNA fragments based on complementarity, such as a single-stranded DNA fragment, an RNA fragment, and a nucleotide chain. (Polynucleotides of 100 bases or more or oligonucleotides of less than 100 bases).
  • the target substance is a protein
  • a protein for example, a receptor protein
  • a peptide that specifically binds to a part of the amino acid sequence an antibody capable of binding to a peptide of the protein, or its Fab , F (ab ') 2 , Fv fragments and the like can also be used as capture probes.
  • a microorganism such as a complex biomolecule having a sugar chain, a biological tissue piece, a cell, or a yeast may be used as the capture probe.
  • These capture probes can be arranged on a substrate by a known method, similarly to a conventional DNA chip or protein chip.
  • a method of synthesizing a DNA fragment (for example, about 25 mer) on a substrate or a method of fixing a DNA fragment on a substrate by spotting can be adopted.
  • the spotting method it is preferable to use the ink jet method disclosed in JP-A-2001-116750 and JP-A-2001-186881.
  • the spots are fixed on the substrate by adding moisture to the spots (holding the humidity at about 80% for a certain period of time), baking by drying at high temperature, and immobilizing by chemical treatment. You.
  • spotting may be repeatedly performed as disclosed in JP-A-2001-186880.
  • immobilizing proteins, peptides, tissue fragments, cells, etc., a biospecific adsorbent, organic polymer, etc. are coated on the immobilization surface in advance, and the capture probe is immobilized on this coating layer.
  • the capture probe is fixed to each of three or more vibrating surfaces.
  • the individual “vibrating surfaces” are arranged on the substrate with a distance of about 100 to 1000 mm, and the size of each vibrating surface is a circle with a diameter of about 50 to 500 im or a side of about 50 to 500 Can be square.
  • This vibration surface vibrates at a specific frequency and amplitude.
  • a vibration surface can be created, for example, by disposing an appropriate vibration generator (for example, an electromagnet or a low-frequency generator) on the lower surface of the probe fixing surface of the substrate.
  • an appropriate vibration generator for example, an electromagnet or a low-frequency generator
  • the configuration of the second invention is adopted.
  • a second invention is a reactive chip in which each vibrating surface has a vibrating portion in which a piezoelectric / electrostrictive element is interposed between a first electrode and a second electrode.
  • the vibrating surface may have a structure as shown in FIG. 1, for example. In other words, in the example of FIG.
  • a piezoelectric electrostrictive element (20) is inserted between the first electrode (11) and the second electrode (12) to form a vibration generator (40).
  • the vibration generating section (40) is fixed on the substrate (30) to form a vibration surface (50).
  • the piezoelectric / electrostrictive element (20) is turned on. Although it expands and contracts continuously in the direction of arrow X according to the pressure frequency, the substrate (30) does not expand and contract, and as a result, vibration in the direction of arrow Y occurs on the vibrating surface (50).
  • the frequency of the oscillation changes with the voltage frequency, and the amplitude changes with the magnitude of the voltage.
  • the relationship between the first electrode (11), the second electrode (12) and the piezoelectric electrostrictive element (20) can be as shown in FIGS. 2 and 3.
  • the first electrodes (11) are arranged above and below the piezoelectric / electrostrictive element (20), and the second electrode (12) is inserted between the piezoelectric / electrostrictive elements (20).
  • the amount of vibration in the Y direction increases due to the expansion and contraction of the piezoelectric electrostrictive element (20) in the X direction.
  • the comb-shaped first electrode (11) and the second electrode (12) are arranged side by side on the substrate (30), and the piezoelectric / electrostrictive element (20) is arranged therebetween. .
  • the piezoelectric electrostrictive element (20) is a known piezoelectric / electrostrictive body or antiferroelectric substance, for example, lead zirconate, lead titanate, lead magnesium niobate, lead nickel niobate, zinc niobate Uses ceramics such as lead, lead manganese niobate, lead antimonate stannate, lead manganese tandastate, lead cobalt niobate, barium titanate, etc., alone or in combination with any combination of these can do.
  • a material mainly containing components composed of lead zirconate, lead titanate and lead magnesium niobate is preferably used.
  • Such a material has a high electromechanical coupling coefficient and a high piezoelectric constant, has low reactivity with the substrate (30) when the piezoelectric / electrostrictive element (20) is sintered, and has a predetermined composition. This is because they can be formed stably.
  • the above ceramics include lanthanum, calcium, stonium, molybdenum, tungsten, barium, niobium, zinc, nickel, manganese, cerium, cadmium, chromium, cobalt, antimony, iron, yttrium, tantalum, Oxides such as lithium, bismuth, and tin, or combinations of any of these, or ceramics to which other compounds are appropriately added may be used.
  • the first electrode (11) and the second electrode (12) are preferably made of a conductive metal that is solid at room temperature, for example, aluminum, titanium, chromium, iron, cobalt, nickel, Metals such as copper, zinc, niobium, molybdenum, ruthenium, palladium, orifice, silver, tin, tantalum, tungsten, iridium, platinum, gold, lead and the like, or alloys combining any of these can be used.
  • a cermet material in which the same material as the piezoelectric / electrostrictive element (20) or the substrate (30) is dispersed in these metals may be used.
  • the vibration generating section (40) and the vibration surface (50) with the above materials, for example, in the case of the structure of FIG. 1, after forming the second electrode (12) on the substrate (30), The piezoelectric / electrostrictive element (20) is fired on the second electrode (12), and finally the first electrode (11) is formed.
  • the first electrode (11), the second electrode (12), and the piezoelectric / electrostrictive element (20) can be formed by integrally firing on a substrate (30).
  • the shaping of the vibrating surface (50) by such integral firing is particularly preferable in the case of the structure shown in FIGS.
  • the first electrode (11), the second electrode (12), and the portions of the respective lead wires that come into contact with the labeling substance may be insulated.
  • this coating material insulating glass or resin can be used.
  • the resin examples include a fluorocarbon resin having excellent chemical stability, for example, a tetrafluoroethylene resin-based Teflon (Teflon PTFE manufactured by DuPont), a tetrafluoroethylene copolymer and a hexafluoropropylene copolymer resin
  • a fluorocarbon resin having excellent chemical stability
  • Teflon PTFE Teflon PTFE manufactured by DuPont
  • Teflon PTFE Teflon tetrafluoride perfluoroalkyl vinyl ether copolymer resin-based Teflon (Teflon PFA)
  • Teflon PFA Teflon tetrafluoride perfluoroalkyl vinyl ether copolymer resin-based Teflon
  • PTFE / PFA composite Teflon Teflon
  • FIG. 4 is a side sectional view showing one embodiment of the reactive chip of the second invention.
  • the second electrode (12), the piezoelectric / electrostrictive element (20), and the first electrode (11) are integrally laminated on the surface of the substrate (30). Then, a capture probe (60) is arranged on the surface of the first electrode (11).
  • the capture probe (60) can be directly fixed to the surface of the vibration generating section (40) as in the example of FIG. 4 or, as illustrated in FIG. 5, the surface of the vibration generating section (40). And the capture probe (60) may be fixed to the coating layer (70) (third invention). That is, the coating layer (70) is a material for facilitating the fixation of the capture probe (60).
  • the polynucleotide L lysine layer It is appropriately selected from silane agents such as minopropyltriethoxysilane and derivatives thereof, biotin-specific adsorbing substances such as biotin-Z-avidin, organic polymers such as polyacrylamide-nylon membranes, and the like. 4 and 5, the substrate (30) has a thin region (31) and a thick region (32) around the thin region (31), and the thin region (31) has a vibration generating portion ( The vibrating surface (50) provided with 40) is provided (fourth invention).
  • silane agents such as minopropyltriethoxysilane and derivatives thereof
  • biotin-specific adsorbing substances such as biotin-Z-avidin
  • organic polymers such as polyacrylamide-nylon membranes
  • the thick region (32) and the thin region (31) are formed by extending the lower end of the thick region (32), for example, as shown in FIG. It can be hollow. Such a structure is preferable for improving the overall rigidity of the substrate (30).
  • the vibration generating section (40) can be disposed below the thin region (31) of the substrate (fifth invention).
  • the reactive chip of the present invention includes a first electrode (11) and a second electrode (12) drawn out from respective vibration generating parts (40) as illustrated in the plan view of FIG.
  • the lead wires (13) and (14) of (1) can be made independent for each vibration generator (the sixth invention). This allows each vibrating surface (50) to vibrate at a different frequency or amplitude.
  • either one of the first electrode (11) and the second electrode (12) may have a common lead wire (a seventh invention). For example, in the example of FIG.
  • the lead wire (13) of the first electrode (11) is common, and processing of the lead wire can be simplified.
  • the electrode leads on the vibrating surfaces in the same row may be shared, and the vibrating surfaces in the same row may be vibrated at the same amplitude.
  • the reactive chip according to the eighth invention of this application has means for measuring a resonance frequency of a vibrating surface.
  • the principle and specific method for measuring the resonance frequency are basically the same as those of the invention previously filed by the present applicant (Republication 99/034176, Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-201265).
  • the measuring means can be configured according to the methods described in Table 99/034176 and JP-A-08-201265.
  • the resonance frequency of the vibrating surface changes when any substance is attached to the vibrating surface from the outside or when the specific gravity or viscosity of the sample liquid in contact with the vibrating surface changes. This can be detected as a change in the electrical constant of a circuit including the piezoelectric / electrostrictive element.
  • the surface of the first electrode is a capture probe fixing surface, and the first electrode and the second electrode are electrically connected to not only an AC power source but also a DC power source.
  • this reactive chip can vibrate the vibrating surface by supplying AC power to the first electrode and the second electrode.
  • the reactive chip can apply positive or negative DC current to the first electrode, which is the capture probe fixed surface.
  • a tenth invention is a reactive chip in which different types of capture probes are fixed to each vibrating surface.
  • the term “heterologous” in this case means that, for example, a DNA fragment has a different base sequence, and a peptide has a different amino acid sequence.
  • different capture probes A to P are fixed to 16 vibration surfaces.
  • the reactive chip according to the tenth aspect can be used for the target substance detection method according to the nineteenth aspect.
  • the method of invention 19 is a method of detecting a target substance that binds to a capture probe, comprising reacting a sample containing a labeled target substance with the vibrating surface of the reactive chip according to the tenth invention vibrated.
  • the method is characterized in that the probe is brought into contact with the capture probe of the flexible chip, the vibration of the vibrating surface is stopped, and the target substance bound to the capture probe is detected using the label as an index.
  • the method of the present invention is characterized by adding a step of "vibrating the capture-probe fixing surface" when detecting a target substance in a normal reactive chip.
  • this vibration causes the target substance in the sample solution that comes into contact with the reactive chip to diffuse more strongly than spontaneous diffusion, resulting in specific binding between the target substance and the capture probe. Is promoted. Furthermore, by performing hybridization while the capture probe is vibrated, binding or non-specific adsorption due to mismatch can be eliminated or reduced. This makes it possible to detect DNA fragments (for example, SNPs) having different single bases and molecules having different steric structures as binding to the corresponding capture probes.
  • the time interval at which the vibrating surface is vibrated can be set as appropriate according to the type of the capture probe and the type of the target substance.For example, in the case of a DNA chip, it can be set to about 1 second to 32 hours. .
  • the vibration frequency of the vibrating surface can be about 10 to 1 MHz, and the amplitude can be about 0.001 to 10 m.
  • an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, a fluorescent protein, or the like can be used for labeling the target substance, depending on the type of the substance.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of the substrate.
  • peroxidase, / 3 Galactosidase, alkaline phosphatase, darcosoxidase, acetylcholinesterase, glucose-16-phosphoryl dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can also be used.
  • enzyme inhibitors, coenzymes, and the like can also be used.
  • known substances can be used depending on the type of the enzyme to be used. For example, when peroxididase is used as the enzyme, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzicin is used.
  • fluorescein isothiocyanate FITC
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • Fluorescent proteins are proteins that emit fluorescence when irradiated with excitation light. For example, green fluorescent protein (GFP) derived from luminescent jellyfish and its mutants EGFP, EYFP (yellow fluorescent), ECFP (blue fluorescent ), DsRedl
  • the labeling substance and the target substance as described above can be integrated by a bond based on, for example, a hydrogen bond, a hydrophobic bond, an ionic bond, a coordinate bond, or the like.
  • a fluorescent protein has a known polynucleotide sequence encoding the same, a fluorescent protein-labeled DNA fragment, a fluorescent protein-labeled protein or a peptide can be easily prepared by a known genetic engineering method. it can.
  • a substrate that decomposes and develops color by the action of an enzyme is added, and the amount of decomposition of the substrate is optically measured.
  • the enzyme activity is determined by the measurement, and this is converted into the amount of the bound target substance, and the amount of the target substance is calculated from the comparison with the standard value.
  • radioactive isotopes measure the radiation dose emitted by the radioisotope using a scintillation counter or the like.
  • fluorescent dyes or fluorescent proteins use a fluorescence microscope. What is necessary is just to measure the amount of fluorescence with a measuring device combining the above.
  • the reactive chip according to the eleventh aspect is an embodiment of the reactive chip according to the tenth aspect, wherein the reactive chip includes "means for measuring a resonance frequency of a piezoelectric electrostrictive element" as in the eighth aspect. Chip.
  • the reactive chip of the eleventh invention can be used for the method for detecting a target substance of the twentieth invention.
  • a method according to a twentieth aspect is a method for detecting a target substance that binds to a capture probe, comprising reacting a sample containing the target substance with the vibrating surface of the reactive chip according to the eleventh aspect vibrated.
  • this method is a method of detecting a target substance by using, as an index, a change in the resonance frequency of the vibration surface caused by the binding of the target substance to the capture probe. According to this method, it is possible to detect the target substance without labeling. In addition, the binding amount of the target substance can be measured in real time over time. Further, the target substance can be labeled, and the detection can be performed with higher accuracy by combining the method with the detection using the label as an index in the same manner as in the method of the nineteenth aspect.
  • the reactive chip of the eleventh invention can be used for the method for detecting a target substance of the twenty-first invention.
  • the method according to a twentieth aspect is an aspect of the method according to the twentieth aspect, wherein the sample is brought into contact with a probe in a state where the vibrating surface of the reactive chip is vibrated and the temperature is changed over time.
  • This is a method of detecting a target substance over time using the change in the resonance frequency of the electrostrictive element as an index.
  • the temperature of the hybridization reaction is changed within a certain period of time (for example, every 10 minutes) to about 38 to 98 ° C while the vibrating surface is vibrated.
  • the Tm (melting temperature) of each labeled DNA can be detected by measuring the mass of the target DNA hybridized to the small probe DNA.
  • a reactive chip according to a twelfth invention is directed to another aspect of the tenth invention, wherein the first electrode surface is a capture probe fixing surface, and the first electrode and the second electrode are connected to an AC power supply.
  • the chip of the twelfth invention can be used for the target substance detection method of the twenty-second invention.
  • a method according to a twenty-second invention is a method for detecting a target substance that binds to a capture probe, wherein the sample containing a labeled target substance is produced while the vibration surface of the reactive chip according to the twelfth invention is vibrated. Contact with the probe of the reactive chip to stop the vibration of the vibrating surface, then apply a negative DC current to the first electrode, the fixed surface of the capture probe, for a certain period of time. It is characterized by detecting the bound target substance.
  • This method combines the method of the nineteenth invention with the method using a nanotip described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-503307, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-501301, etc.
  • the direct current is a force that can be appropriately adjusted depending on the solution to be used, the size of the vibrating surface, the DNA concentration, and the like. 0 :: ⁇ 1000 nanoampere, preferably 1 to 30 nanoampere, is 1 to 180 nanoampere.
  • the current can be applied for seconds, preferably about 10 to 60 seconds.
  • a reactive chip according to a thirteenth aspect is the still another aspect of the second to seventh aspects, wherein three or more vibrating surfaces are in the same row, or four or more vibrating surfaces are n (n is 2
  • This is a reactive chip that is arranged in a grid of X m (m is 2 or more) and the same type of capture probe is fixed to each vibrating surface in the same row.
  • the “identical species” in this case means that, for example, the DNA fragments have completely the same nucleotide sequence, and the peptides have the completely identical amino acid sequence.
  • the same key is applied to each of the four vibrating surfaces in the first row.
  • a method according to a twenty-third aspect is a method for detecting the affinity of a plurality of types of target substances for a capture probe, wherein each of the vibrating planes of the same row vibrating plane of the reactive chip according to the thirteenth aspect has a different amplitude.
  • sorting over time can be performed using the mass measured by the difference in the resonance frequency as an index. Hybridization with change is possible.
  • the labeled DNA and the probe DNA are combined by combining the vibration of the capture probe fixing surface and the negative charging of the capture probe. Affinity can be detected with higher accuracy.
  • a reactive chip according to a sixteenth aspect is the still another aspect of the second to seventh aspects, wherein three or more vibrating surfaces are in the same row, or four or more vibrating surfaces are n (n is 2 or more) X
  • These reactive chips are arranged in a matrix of m (m is 2 or more), and capture probes that bind to different parts of the target substance are fixed on the same row of vibrating surfaces.
  • "to bind to a different site of the target substance” means, for example, to bind to a region having a different base sequence of a DNA fragment, or to bind to a region having a different full length amino acid sequence of a peptide.
  • the capture probes A1 to A4 corresponding to the four regions are fixed to the four vibration planes in the first row in order from the end of the body DNA (A), and the chromosomes (B) to (D
  • the capture probes corresponding to the four regions are fixed respectively.
  • capture probes corresponding to various combinations of the four regions are fixed on the 4 ⁇ 4 lattice vibration surface in order from the end of the chromosomal DNA (A). Then, such a reactive chip of the sixteenth invention can be used for the target substance detection method of the twenty-seventh invention.
  • a method according to a twenty-seventh invention is a method for detecting a mutation in a target substance, wherein a sample containing a labeled target substance is reacted with the reactive chip in a state where the same row vibration plane of the reactive chip of the sixteenth invention is vibrated. The vibration of the vibrating surface is stopped by detecting the target substance bound to the capture probe using the target as an index, thereby detecting mutation of the target substance.
  • “mutation” means deletion, substitution, insertion, amplification, repetition and the like. More specifically, it refers to these mutations in chromosomal DNA, corresponding mutations in mRNA and cDNA, or similar mutations in their expression products, such as proteins and peptides.
  • each probe is The target substance binds.
  • the amount of binding to probes 3 and 4 doubles as shown in FIG. 13, it is detected that the chromosomal DNA region 3-4 corresponding to these probes 3 and 4 is amplified. be able to.
  • FIG. 14 when the probe binds to the probes 1, 2 and 4, but does not bind to the probe 3, it is confirmed that the chromosomal DNA region 3 corresponding to the probe 3 is deleted. Can be detected. Further, by fixing the capture probe in the configuration of FIG.
  • insertion or substitution of chromosomal DNA can be detected.
  • a probe whose target substance (chromosomal DNA) is A1 to A4 alone, and When bound to the Al + 2 and A3 + 4 probes, it is possible to detect the insertion of the X sequence between regions 2 and 3 of the chromosomal DNA as shown in the right column of Fig. 15. .
  • the substitution in regions 3 and 4 of the chromosomal DNA can be detected.
  • mutation of the target substance can be detected using the mass measured by the difference in the resonance frequency as an index.
  • the mass is detected as 6/4 times, and in the example of Fig. 14, the mass is detected as 3/4 times.
  • the mutation in the labeled DNA is further reduced by combining the vibration of the capture probe-immobilized surface with the negative charge of the capture probe. It can be detected with high accuracy.
  • the invention of this application is not limited by the above examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
  • the invention of this application enables a new reactivity that can shorten the reaction time for a wide range of target substances, and also effectively prevents mismatch binding and enables highly accurate detection. Tips are provided.
  • a new method for detecting a target substance using the reactive chip is provided. With this detection method, it is possible to detect minute differences in the target substance, which were not possible with a conventional reactive chip.

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Abstract

広範な標的物質に対して、反応時間の短縮を可能とし、しかもミスマッチ結合を効果的に予防して高精度な検出を可能とする新しい反応性チップを提供する。すなわち、この発明の反応性チップは、基板(30)上に整列配置された3以上の振動面(50)のそれぞれに、標的物質に結合するキャプチャープローブ(60)が固定されており、各振動面は第1電極(11)と第2電極(12)間に圧電/電歪素子(20)を介在させた振動発生部(40)を有する。

Description

明細書
反応性チップと、 このチップを用いた標的物質の結合検出方法
技術分野 この出願の発明は、 反応性チップと、 このチップを用いた標的物質の検出方法 に関するものである。 さらに詳しくは、 標的物質とキヤプチヤープローブとのミ スハイブリダイゼーションを排除することができ、 'しかも短時間による正確な検 出が可能であり、 さらには検出の手段や対象を様々に選択することのできる新し い反応性チップと、 このチップを用いた標的物質の新しい検出方法に.関するもの である。
背景技術 遺伝子の構造や遺伝子発現様式の大量かつ迅速な解析を目的として'、 様々な反 応性チ.ップ.が用いられている。 この反応性チップは、.スラィ,ドガラス：等の.基板上— に数千から数万種以上の異なるキヤプチヤープロ一'ブがスポットとして整列固定 されており、 蛍光等によって標識した標的物質のキヤプチャ一プローブへの結合 の有無を指標として、 標的物質の特定やサンプル中における標的物質の量を定量 することができるようになつている。 チップ上に固 '定されるキヤプチヤープロ一 ブは、 解析する標的物質の種類によって異なる。 例えば DNA や RNA が標的物 質となる場合は、 それらと相補性結合 （ハイブリダィゼ一シヨン） が可能な 2本 鎖および 1本鎖 DNA断片やポリヌクレオチド鎖、' オリゴヌクレオチド鎖等がキ ャプチヤープローブとして採用され、 これらは DNAチップ （または DNA ァレ ィ） と呼ばれている （例えば、 特許文献 1— 4、 非特許文献 1、 2 を参照） 。 ま た、 タンパク質チップの場合には、 タンパク質やペプチドと、 それらと特異的に 結合する受容体や抗体が、 標的物質一キヤプチヤープローブの関係を構成する。 反応性チップにおける標的物質の結合は、 例えば、 標識化標的物質を含む試料 (サンプル溶液） を反応性チップに接触させ、 一定時間反応させて標的物質をキ ャプチヤープローブに結合させ、 非結合の物質を除去した後、 反応性チップ上の 標識位置を検出することによって、 標的物質がどのキヤプチヤープローブに結合 したかを判定する。 また、 標識シグナルの強度を測定することによって、 標的物 質の量を定量化することも可能である。 従来の反応性チップの場合には、 サンプル溶液中の標的物質が自然拡散によつ て対応するキヤプチヤープローブに接近し、 結合することができるように、 サン プル溶液と反応性チップとを長時間に渡って反応させていた。 このため、 検出結 果を得るまでに、 多くの時間を必要とするという問題点を有していた。 また、 反応性チップによる標的物質の検出精度は、 標的物質とキヤプチャ一プ ローブとの特異的な結合に依存している。 例えば DNA チップの場合、 標的 DNA とプローブ DNA が互いの完全な相補性によって結合することが理想であ るが、 実際には、 数個のミスマッチによっても標的 DNA はプローブ DNA に結 合してしまう可能性がある。 特に、 標的 DNAがザン.プル溶液中で自然拡散によ りプローブ； DNA に接近'し'た場合には、 このミスマッチ結合 （ミス八イブリ'ダイ ゼ一シヨン） の危険性は極めて高かった。 ' この.ような問題点を解決する DNAチップとして、. 特許文献 5の発明 （ナノチ ップ） が知られている。 このナノチップは、 電極表面にプロ一ブ DNA を固定し、 この電極に正の直流電流を通電した状態で標的 DNAとプローブ DNA とをハイ プリダイゼーションさせる。 DNA断片 （標的 DNA) は負に電荷しているため、 正の電荷をもつプローブ DNA に短時間で接近し、 結合することができる。 そし て、 ハイブリダィゼーシヨン反応が終了した後は、 電極に負の直流電流を流す。 これによつて、 プローブ DNA と標的 DNAが共に負に電荷した^態となり、 プ ローブ DNAに対してミスマッチ結合している標的 DNAはプローブ DNAから排 斥され、 正しい相補性によって結合した標的 DNA のみがプローブ DNA に残る。 ただし、 このナノチップの場合には、 DNA が通常は負に電荷していることを 利用しているため、 夕ンパク質やべプチドを利用するタンパク質チップには適用 することができない。
参考文献 特許文献 1 :·米国特許第 5,474,796号明細書
特許文献 2：米国特許第 5，605，662号明細書
特許文献 3：国際公開第 95/251 1 16号パンフレツト
特許文献 4：国際公開第 95/35505号パンフレツ ト
特許文献 5：特表 2001-501301号公報
非特許文献 1： Schena, M. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614-
10619, 1996.
非特許文献 2： Heller, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150- 2155, 1997.
発明の開示 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 広範 な標的物質に対して、 反応時間の短縮を可能とし、 しかもミスマッチ結合を効果 的に予防,して高精度な検出を可能とする新しい反応性チップを提供することを課 題としている。 + またこの出願の発明は、 前記の反応性チップを用いた新しい標的物質検出方法 を提供するこ を課題としている。 この出願の第 1 の発明は、 基板上に整列配置された 3 以上の振動面のそれぞれ に、 標的物質に結合するキヤプチヤープローブが固定されていることを特徴とす る反応性チップである。 第 2 の発明は、 前記第 1 発明の一態様であって、 各振動面がそれぞれ、 第 1 電極と第 2 電極間に圧電/電歪素子を介在させた振動発生部を有する反応性チ ップである。 第 3 の発明は、 前記第 2 発明の一態様であって、 キヤプチヤープローブ固定 面がコ一ティングされている反応性チップである。 第 4の発明は、 前記第 2 または第 3発明の一態様であって、 基板が肉薄領域 とその.周囲の肉厚領域を有し、 肉薄領域の上面に振動発生部を有する反応性チッ プである。 第 5 の発明は、 前記第 2 または第 3発明の別の態様であって、 基板が肉薄領 域とその周囲の肉厚領域を有し、 肉薄領域の下面に振動発生部を有する反応性チ ップである。 第 6の発明は、 前記第 2から第 5発明の一態様であって、 第 1電極と第 2電 極のそれぞれのリ一ド線が、 振動発生部毎に独立である反応性チップである。 第 7の発明は、 前記第 2から第 5発明の別の態様であって、 第 1電極と第 2 電極のいずれか一方のリ一ド線が共通である反応性チップである。 第 8の発明は、 前記第 2から'第 7発明の一態様であって、 圧電 /電歪素子の 共振周波数を測定する手段を有する反応性チップである。 第 9の発明は、 前記第 2から第 7発明の別の態様であって、 第 1電極表面が キヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1 電極 よび第 2 電極が、 交流電源に 加え、 さらに直流電源にも導通している反応性チップである。 第 10の発明は、 前記第 2から第 7発明のさらに別の態様であって、 各振動面 に、 それぞれ異種のキヤプチヤープローブを固定した反応性チップである。 第 1 1 の発明は、 前記第 10発明の一態様であって、 圧電 /電歪素子の共振周 波数を測定する手段を有する反応性チップである。 第 12発明は、 前記第 10発明の別の態様であって、 第 1電極表面がキヤプチ ヤープロ一ブ固定面であり、 第 1 電極および第 2 電極が、 交流電源に加え、 さ らに直流電源にも導通している反応性チップである。 第 13発明は、 前記第 2から第 7発明のさらにまた別の態様であって、 3以上 の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (nは 2以上） X m (mは 2以 上） の格子状に整列配置し、 同一列の各振動面に同一種のキヤプチヤープローブ を固定した反応性チップである。 第 14 の発明は、 前記第 13発明の一態様であって、 圧電 Z電歪素子の共振周 波数を測定する手段を有する反応性チップである。 第 15の発明は、 前記第 13発明の別の態様であって、 第 1電極表面がキヤプ チヤ一プローブ固定面であり、 第 1 電極および第 2 電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している反応性チップである。 第 16の発明は、 前記第 2 'から第 7発明のまたさらに別の態様であって、 3以 上の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (n は 2 以上） X m (m は 2 以上） の格子状に整列配置し、 同一列の振動面に、 標的物質の異なる部位に結合 するキヤプチヤープローブをそれぞれ固定した反応性チップである。 第 17 の発明は、 前記第 16発明の一態様であって、 圧電 Z電歪素子の共振周 04 000038
6 波数を測定する手段を有する反応性チップである。 第 18の発明—は、 前記第 16発明の別の態様であって、 第 1電極表面がキヤプ チヤ一プローブ固定面であり、 第 1 電極および第 2 電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している反応性チップである。 第 19 の発明は、 キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方法で あって、 前記第 10発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識化標 的物質を含む試料を反応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の 振動を停止し、 標識を指標としてキヤプチヤープローブに結合した標的物質を検 出することを特徴とする標的物質の検出方法である。 第' 20.の発明は、 第 19発明の一態様であって、 振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた状態で試料をキヤプチヤープローブに接触させる検出 方法である。 第 21 の発明は、 キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方法で あって、 前記第 1 1 発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標的物質 を含む試料を反応性チップのプロ一ブに接触させ、 圧電 電歪素子の共振周波数 の変化を指標として標的物質を検出する標的物質の検出方法である。 第 22 の発明は、 前記第 21 発明の一態様であって、 反応性チップの振動面を 振動させると共に、 温度を経時的に変化させた状態でプローブに試料を接触させ、 圧電ノ電歪素子の共振周波数の変化を指標として標的物質を経時的に検出する検 出方法である。 第 23 の発明は、 キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方法で あって、 前記第 12発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識化標 的物質を含む試料を反応性チップのプローブに接触させ、 振動面の振動を停止し た後、 キヤプチヤープローブ固定面である第 1電極に負の直流電流を一定時間通 電し、 標識を指標としてキヤプチャ一プローブに結合した標的物質を検出するこ とを特徴とする標的物質の検出方法である。 第 24 の発明は、 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を 検出する方法であって、 前記第 13発明の反応性チップの同一列振動面の各振動 面を異なる振幅で振動させた状態で、 各種の標識化標的物質を反応性チップのキ ャプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を指標としてキヤ プチヤープローブに結合した標的物質のそれぞれのプローブに対する親和性の程 度を検出することを特徵とする標的物質の検出方法である。 第 25 の発明は、 前記第 24発明の一態様であって、 振動面を振動させると共 に、 温度を経時的に変化させた状態で試料をキヤプチヤープローブに接触させる 検出方法である。 第 26 の発明は、 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を 検出する方法であって、 前記第 14発明の反応性チップの同一列振動面を異なる 振幅で振動させた状態で、 標的物質を反応性チップのキヤプチヤープローブに接 触させ、 圧電ノ電歪素子の共振周波数の変化を指標として標的物質のそれぞれの キヤプチヤープローブに対する親和性の程度を検出する標的物質の検出方法であ る。 第 27 の発明は、 前記第 26発明の一態様であって、 反応性チップの振動面を 振動させる.と共に、 温度を経時的に変化させた状態でキヤプチヤープローブに試 料を接触させ、 圧電 /電歪素子の共振周波数の変化を指標として標的物質の有無 を経時的に検出する検出方法である。 第 28 の発明は、 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を 検出する方法であって、 前記第 15発明の反応性チップの同一列振動面の各振動 面を異なる振幅で振動させた状態で、 各種の標識化標的物質を反応性チップのキ ャプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止した後、 プローブ固定面で ある第 1電極に負の直流電流を一定時間通電し、 標識を指標としてキヤプチヤー プローブに結合した標的物質のそれぞれのプローブに対する親和性の程度を検出 することを特徴とする標的物質の検出方法である。 第 29 の発明は、 標記物質の変異を検出する方法であって、 前記第 16発明の 反応性チップの同一列振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質含む試料を反 応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を 指標としてキヤプチャ一プローブに結合した標的物質を検出することによって、 標的物質の変異を検出することを特徴とする標的物質の検出方法である。 第 30 の発明は、 標記物質の変異を検出する方法であって、 前記第 17発明の 反応性チップの同一列振動面を振動させた状態で、 標的物質を含む試料を反応性 チップのキヤプチヤープロ一ブに接触させ、 圧電 Z電歪素子の共振周波数の変化 を指標として標的物質の有無を検出することによって、 標的物質の変異'を検出す ることを特徴とする標的物質の検出方法である。 第 31 の発明は、 標記物質の変異を検出する方法であって、 前記第 18発明の 反応性チップの同一列振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質含む試料を反 応性チップのキヤプチャ一プローブに接触させ、 振動面の振動を停止した後、 プ ローブ固定面である第 1電極に負の直流電流を一定時間通電し、 標識を指標とし てキヤプチヤープローブに結合した標的物質を検出することによって、 標的物質 の変異を検出することを特徴とする標的物質の検出方法である。 ' ■
図面の簡単な説明 図 1 は、 この発明の反応性チップにおける基本構造の一例を示した側面図で ある。 図 2 は、 この発明の反応性チップにおける基本構造の別の例を示した側面図 8
9 である。 図 3 は、 この発明の反応性チップにおける基本構造のさらに別の例を示した 平面図および側面図である。 図 4は、 この発明の反応性チップの一実施例を示した側面図である。 図 5は、 この発明の反応性チップの別の実施例を示した側面図である。 図 6 は、 この発明の反応性チップのさらに別の実施例を示した側面図である。 図 7 は、 この発明の反応性チップのまたさらに別の実施例を示した平面図お よび側面図である。 図 8 は、 この発明の反応性チップのさらにまた別の実施例を示した平面図で ある。 図 9 は、 この発明の反応性チップにおけるキヤプチヤープロ一ブの配置例を 示した模式図である。 四角は振動面を示し、 アルファベット文字の違いは、 キヤ プチヤ一プローブが異なることを示す。 図 10 は、 この発明の反応性チップにおけるキヤプチヤープローブの別の配置 例を示した模式図である。 四角は振動面を示し、 アルフ.ァベット文字の違いは、 キヤプチヤープローブが異なることを示す。 図 1 1 は、 この発明の反応性チップにおけるキヤプチヤープローブのさらに別 の配置例を示した模式図 （左） と、 この反応性チップを用いて染色体異常等'を検 出した場合の正常染色体の結合状態を例示した模式図 （右） である。 四角は振動 面を示し、 横方向の振動面に連通する波線は振動子を示す。 アルファベット文字 および数字の違いは、 キヤプチヤープローブが異なることを示す。 図 12 は、 この発明の反応性チップにおけるキヤプチヤープローブのまたさら に別の配置例を示した模式図である。 四角は振動面を示し、 アルファベット文字 および数字の違いは、 キヤプチヤープロ一ブが異なることを示す。 図 13 は、 図 11 に例示したキヤプチャ一プローブの配置例 （左） と、 この反 応性チップを用いて染色体異常 （増幅） を検出した場合の結合状態を例示した模 式図 （右） である。 四角は振動面を示し、 横方向の振動面に連通する波線は振動 子を示す。 アルファベット文字および数字の違いは、 キヤプチヤープローブが異 なることを示す。 図 14 は、 図 11 に例示したキヤプチヤープローブの配置例 （左） と、 この反 応性チップを用いて染色体異常 （欠失） を検出した場合の結合状態を例示した模 式図 （右〉 である。 四角は振動面を示し、 横方向の振動面に連通する波線は振動 子を示す。 アルファベット文字および数字の違いは、 キヤプチャ一プローブが異 なることを示す。 図 15 は、 図 12 に例示したキヤプチヤープローブの配置例 （左） と、 この反 応性チップを用いて染色体異常 （挿入） を検出したの結合状態を例示した模式図 (右） である。 四角は振動面を示し、 アルファベット文字および数字の違いは、 キヤプチヤープローブが異なることを示す。 図 16 は、 図 12 に例示したキヤプチヤープローブの配置例 （左） と、 この反 応性チップを用いて染色体異常 （置換） を検出したの結合状態を例示した模式図 (右） である。 四角は振動面を示し、 アルファベット文字および数字の違いは、 キヤプチヤープロ一ブが異なることを示す。 ' 符号の説明
1 1 第 1電極
12 第 2電極' 1
13、 14 リード線
20 圧電 /電歪素子'
30 基板
31 肉薄領域
32 肉厚領域
40 振動発生部
50 振動面
60 キヤプチヤープローブ
70 コーティング層
発明を実施するための最良の形態 この出願の第 1 発明は、 基板上に整列配置された 3 以上の振動面のそれぞれ に、 標的物質に結合するキヤプチヤープロ一ブが固定されていることを特徴とす る反応性チップである。
「基板」 は、 通常の DNAチップやタンパク質チップ等に使用されるスライド グラス板やセラミックス板、 プラスチック等の樹脂板、 金属板等である。 「キヤ プチヤープローブ」 は、 標的物質と特異的に結合する生体分子である。 例えば、 標的物質がゲノム DNA由来の DNA断片 （例えば cDNA等） の場合には、 キヤ プチヤープローブは、 相補性に基づいてこれら DNA 断片とハイブリダィズする 1本鎖の DNA 断片、 RNA 断片、 ヌクレオチド鎖 （100 塩基以上の.ポリヌクレ ォチドまたは 100 塩基未満のオリゴヌクレオチド） 等である。 また、 標的物質 がタンパク質の場合は、 そのアミノ酸配列の一部に特異的に結合するタンパク質 (例えばレセプタータンパク質） やペプチド等、 あるいはタンパク質のェピ卜一 プに結合することができる抗体またはその Fab、 F(ab') 2、 Fv断片等をキヤプチ ャ一プローブとすることもできる。 さらには、 糖鎖を有する複合生体分子、 生体 組織片、 細胞、 酵母等の微生物をキヤプチヤープローブとしてもよい。 これらのキヤプチヤープローブは、 従来の DNAチップやタンパク質チップと 同様に、 公知の方法で基板上に配置することができる。 例えば、 DNA チップの 場合には、 基板上に DNA断片 （例えば 25 mer程度） を合成する方法や、 DNA 断片をスポッティング法によって基板上に固定する方法を採用することができる。 またスボッティング法の場合には、 特開 2001- 1 16750 号公報ゃ特開 2001- 186881号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが好ましレ スポッティングの後は、 通常の反応性チップ製造と同様にして、 スポットに対す る水分付加 （湿度〜 80%程度に一定時間保持） 、 高温乾燥によるべ一キング、 薬液処理による固定化処理等を行うことによって、 各スポットを基板上に固定す る。 さらに、 スポッティング法による反応性チップの製造では、 特開 2001- 186880号公報に開示されているような、 スポッティング重ね打ちを行うように してもよい。 タンパク質やペプチド、 組織片ゃ細胞等を固定する場合には、 生体 特異的吸着物質や有機高分子等を予めその固定面にコ一ティングし、 このコ一テ ィング層にキヤプチヤープローブを固定するようにすればよい。 第 1 発明の反応性チップにおいて、 キヤプチヤープローブは 3 以上の振動面 にそれぞれ固定される。 個々の 「振動面」 は、 100~ 1000 ΠΙ 程度の距離をも つて基板上に整列配置され、 各振動面の大きさは、 直径 50〜500 i m 程度の円 形、 または一辺が 50〜500 程度の方形とすることができる。 この振動面は、 特定の周波数や振幅で振動する面である。 このような振動面は、 例えば、 基板の プローブ固定面の下面に適当な振動発生装置 （例えば、 電気磁石や低周波発生装 置） を配設することによって作成することができるが、 この出願においては、 第 2発明の構成を好ましい態様とする。 第 2発明は、 各振動面がそれぞれ、 第 1電極と第 2電極間に圧電 /電歪素子 を介在させた振動部を有する反応性チップである。 この場合の振動面は、 例えば 図 1 に示したような構造とすることができる。 ずなわち、 図 1 の例では、 第 1 電極（1 1)と第 2 電極（12)との間に圧電 電歪素子 (20)を挿入して振動発生部 (40) を構成し、 この振動発生部 (40)を基板 (30)上に固定して振動面（50)としている。 第 1 電極 i l l)と第 2電極（12)に交流電圧を印加すると、 圧電 /電歪素子 (20)が電 圧周波数に応じて矢印 X 方向に連続的に伸縮するが、 基板 (30)は伸縮しないた め、 振動面 (50)には結果として矢印 Y方向の振動が発生する。 振動の周期は電圧 周波数に、 振幅は電圧の大きさに応じて変化する。 第 1電極（1 1)、 第 2電極（12) および圧電ノ電歪素子 (20)の関係は、 図 2 および図 3 に例示したようにするこ ともできる。 図 2の例では、 圧電 /電歪素子 (20)の上下に第 1電極（1 1)を配し、 圧電 /電歪素子 (20)の間に第 2電極（12)を挿入している。 この構成では、 圧電 電歪素子 (20)の X方向への伸縮が増すことによって、 Y方向への振動量が大きく なる。 また図 3の例では、 櫛型の第 1電極（1 1)および第 2電極（12)を基板 (30)上 に対向並置し、 その間に圧電 /電歪素子 (20)を配置している。 この場合には、 圧 .電/電歪素子 (20)の電界誘起歪の縦効果を用いて Y方向の振動を得ているため、 少ない電圧で十分な振動を得ることができる。 圧電ノ電歪素子 (20)は、 公知の圧電 /電歪体または反強誘電体であって、 例え ば、 ジルコン酸鉛、 チタン酸鉛、 マグネシウムニオブ酸鉛、 ニッケルニオブ酸鉛、 亜鉛ニオブ酸鉛、 マンガンニオブ酸鉛、 アンチモンスズ酸鉛、 マンガンタンダス テン酸鉛、 コバルトニオブ酸鉛、 チタン酸バリウム等のセラミックスを単独で、 あるいは、 これらのいずれかを組み合わせた成分を含有するセラミックスを採用 することができる。 特に、 ジルコン酸鉛とチタン酸鉛およびマグネシウムニオブ 酸鉛からなる成分を主成分とする材料が好適に用いられる。 このような材料は、 高い電気機械結合係数と圧電定数を有することに加え、 圧電 /電歪素子 (20)の焼 結時における基板 (30)との反応性が小さく、 所定の組成のものを安定に形成する ことができるためである。 . さらに、 上記のセラミックスに、 ランタン、 カルシウム、 スト口ンチウム、 モ リブデン、 タングステン、 バリウム、 ニオブ、 亜鉛、 ニッケル、 マンガン、 セリ ゥム、 カドミウム、 クロム、 コバルト、 アンチモン、 鉄、 イットリウム、 タンタ ル、 リチウム、 ビスマス、 スズ等の酸化物、 もしくはこれらいずれかの組み合わ せ、 または他の化合物を適宜に添加したセラミックスを用いてもよい。 たとえば、 ジルコン酸鉛とチタン酸鉛およびマグネシウムニオブ酸鉛を主成分とし、 これに ランタンゃストロンチウムを含有するセラミックスを用いることもまた好ましく、 さらに、 マンガンを加えたものは圧電材料の機械的品質係数 （Q 値） が大きく、 反応性チップの構造面からだけでなく、 材料面からも Q 値を大きくすることが でき、 好ましい。 第 1電極（1 1)および第 2電極（12)は、 室温で固体である導電性の金属で構成さ れていることが好ましく、 たとえば、 アルミニウム、 チタン、 クロム、 鉄、 コバ ルト、 ニッケル、 銅、 亜鉛、 ニオブ、 モリブデン、 ルテニウム、 パラジウム、 口 ジゥム、 銀、 スズ、 タンタル、 タングステン、 イリジウム、 白金、 金、 鉛等の金 属単体あるいはこれらのいずれかを組み合わせた合金を用いることができる。 さ らに、 これらの金属に圧電 /電歪素子 (20)あるいは基板 (30)と同じ材料を分散さ せたサ一メット材料を用いてもよい。 以上の材料によって振動発生部 (40)および振動面 (50)を形成するには、 例えば、 図 1 の構造の場合には、 基板 (30)上に第 2 電極（12)を形成した後、 この第 2 電 極（12)上に圧電/電歪素子 (20)を焼成し、 最後に第 1 電極（1 1)を形成する。 ある いは第 1電極（1 1)、 第 2電極（12)および圧電/電歪素子 (20)を基板 (30)上に一体 焼成して形成することもできる。 このような一体焼成による振動面 (50)の成形は、 図 2、 図 3の構造の場合には特に好ましい。 さらに、 第 1電極（1 1)およぴ第 2電極（12)、 並びにそれぞれのリード線の標識 物質に接する箇所は絶縁被覆してもよい。 この被覆材料としては、 絶縁性のガラ スまたは樹脂を使用することができる。 樹脂としては、 化学的安定性に優れたフ ッ素樹脂、 例えば、 四フッ化工チレン樹脂系テフロン （デュポン （株） 製のテフ ロン PTFE) 、 四フッ化工チレン .六フッ化プロピレン共重合体樹脂系テフロン (テフロン FEP) 、 四フッ化工チレン 'パーフロロアルキルビニルエーテル共 重合体樹脂系テフロン （テフロン PFA) 、 PTFE/PFA複合テフロン等が例示で きる。 また、 シリコーン樹脂 （中でも熱硬化型のシリコーン樹脂） や、 エポキシ 樹脂、 アクリル樹脂等も目的に応じて使用することができる。 さらに、 絶縁性樹 脂に無機 ·有機充填材を添加し、 振動面 (50)の剛性を調整することも好ましい。 なお、 振動面 (50)の厚みを薄くすると、 例えば、 後述する共振周波数測定の際 の感度が向上するが、 その一方で、 剛性が低下するといつた問題が生ずるため、 基板 (30)および振動発生部 (40)からなる振動面 (50)の厚みの合計は 5〜50 ^ m程 度とすることが好ましい。 図 4 は、 第 2 発明の反応性チップの一実施例を示した側断面図である。 この 図 4に例示した反応性チップは、 基板 (30)の表面に第 2電極（12)、 圧電 /電歪素 子 (20)および第 1電極（1 1)を積層一体化している。 そして、 第 1電極（1 1)の表面 にキヤプチヤープローブ (60)を配設している。 キヤプチャ一プローブ (60)は、 こ の図 4の例のように振動発生部 (40)の表面に直接固定することもでき、 または図 5 に例示したように、 振動発生部 (40)の表面をコ一ティングし、 このコ一ティン グ層（70)にキヤプチャ一プローブ (60)を固定するようにしてもよい （第 3発明） 。 すなわち、 このコーティング層（70)は、 キヤプチヤープローブ (60)の固定を容易 とするための材料であって、 キヤプチヤープローブ (60)の種類によって、 例えば ポリヌクレオチド L リジン層、 ァァミノプロピルトリエトキシラン等のシラン 剤およびその誘導体、 ピオチン Zアビジン等の生体特的吸着物質、 ポリアクリル アミドゃナイロン膜等の有機高分子等から適宜に選択される。 図 4および図 5の例において、 基板 (30)は、 肉薄領域 (31)とその周囲の肉厚領 域 (32)とを有し、 肉薄領域（31)が、 その上面に振動発生部 (40)を備えた振動面 (50)となっている （第 4発明） 。 このような肉薄領域 (31)と肉厚領域 (32)を設け ることによって、 反応性チップ全体の剛性を維持し、 かつ振動面（50)において好 適な振動を発生させることができる。 この肉厚領域 (32)と肉薄領域 (31)は、 例え ば図 6に例示したように、 肉厚領域 (32)の下端を延設させ.て、 肉薄領域 (3 1)の下 方を空洞とすることもできる。. このような構造は、 基板 (30)の全体的剛性の向上 のために好ましい。 さらにまた、 この発明の反応性チップは、 図 7 に例示したように、 その振動 発生部 (40)を基板の肉薄領域 (31)の下方に配設することもできる （第 5発明） 。 このように構成を採用することによって、 表面がフラットな反応性チップが容易 に実現できる。 また、 振動発生部 (40)がサンプル溶液に直接触れることがないた め、 チップの耐久性が向上し、 さらに、 後述する共振周波数の測定の場合にもノ ィズの影響を排除してより正確な測定が可能となる。 この発明の反応性チップは、 さらに別の態様として、 図 7 の平面図に例示し たように、 それぞれの振動発生部 (40)から引き出される第 1電極（1 1)と第 2電極 ( 12)のそれぞれのリ一ド線（13) (14)を、 振動発生部毎に独立とすることができる (第 6発明） 。 これによつて、 それぞれの振動面 (50)を異なった周波数または振 幅で振動させることが可能となる。 あるいは、 さらに別の態様として、 第 1 電 極（1 1)と第 2電極（12)のいずれか一方のリード線を共通とす.ることもできる （第 7発明） 。 例えば、 図 8の例では、 第 1電極（1 1)のリード線（13)を共通としてお り、 リード線の加工を簡略化することが可能となる。 また、 4以上の振動面を格 子状に配置する場合には、 同一列の振動面における電極リード線を共通とし、 こ の同一列の振動面を同一振幅で振動させるようにしてもよい。 この出願の第 8 発明の反応性チップは、 振動面の共振周波数を測定する手段 を有している。 この共振周波数の測定に関する原理と具体的方法等は、 この出願 人が先に特許出願した発明 （再表 99/034176 公報、 特開平 08-201265 号公 報） と基本的に同一であり、 再表 99/034176公報および特開平 08-201265号 公報に記載の方法に従って測定手段を構成することができる。 すなわち、 このよ うな共振周波数は、 具体的には、 振動面に外部から何らかの物質が付着した時や、 振動面に接するサンプル液の比重や粘度が変化した時に、 振動面の共振周波数が 変化することを、 圧電 /電歪素子を含む回路の電気的定数の変化として検出する ことができる。 この出願の第 9 発明の反応性チップは、 第 1 電極表面がキヤプチヤープロ一 ブ固定面であり、 第 1 電極および第 2 電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電 源にも導通している。 すなわち、 この反応性チップは、 第 1 電極および第 2 電 極に対する交流電源の通電によって振動面を振動させることができることに加え、 キヤプチャ一プローブ固定面である第 1 電極に正または負の直流電流を通電さ せることができる。 このような直流電流の通電は、 特表 2001-501301号公報の 記載に準じて行うことができる。 第 10発明は、 各振動面に、 それぞれ異種のキヤプチヤープローブを固定した 反応性チップである。 この場合の 「異種」 とは、 例えば DNA 断片であればそれ ぞれの塩基配列が異なること、 ぺプチドであればアミノ酸配列が異なることを意 味する。 例えば、 図 9 の例では、 16個の振動面に A~P までの異なるキヤプチ ヤープローブが固定されている。 そして、 この第 10発明の反応性チップは、 第 19発明の標的物質検出方法に使用することができる。 発明 19 の方法は、 キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方法 であって、 前記第 10発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識化 標的物質を含む試料を反応性チップのキヤプチャ一プローブに接触させ、 振動面 の振動を停止し、 標識を指標としてキヤプチャ一プローブに結合した標的物質を 検出することを特徴とする。 この発明の方法は、 通常の反応性チップにおける標的物質の検出に際して 「キ ャプチヤ一プローブ固定面を振動させる」 工程を付加することを特徴とする。 す なわち、 この振動によって、 反応性チップに接触するサンプル溶液内の標的物質 が、 自然拡散の程度よりもさらに強く拡散され、 その結果として、 標的物質とキ ャプチヤープローブとの特異的結合が促進される。 さらに、 キヤプチャ一プロ一 プを振動させた状態でハイプリダイゼーションを行うことによって、 ミスマッチ による結合や非特異的吸着.を排除または低減することができる。 これによつて、 単一塩基が異なる DNA 断片 （例えば SNPs) や立体構造の異な.る分子を、 それ ぞれに対応したキヤプチヤープローブへの結合として検出することが可能となる。 なお、 振動面を振動させる時間間隔は、 キヤプチャ一プローブや標的物質の種 類等に応じて適宜に設定することができるが、 例えば DNAチップの場合は 1秒 〜32時間程度とすることができる。 また、 振動面の振動周波数は、 10~ 1 MHz 程度、 振幅は 0.001 ~ 10 m程度とすることができる。 この方法において、 標的物質の標識化は、 その物質の種類に応じて、 酵素、 放 射性同位体、 蛍光色素、 蛍光タンパク質等を使用することができる。 酵素は、 turnover number が大であること、 抗体と結合させても安定であること、 基質 を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 /3—ガラクトシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 ダルコ 一スォキシダ一ゼ、 アセチルコリンエステラ一ゼ、 グルコース一 6—リン酸化脱 水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。 また、 酵素阻害物質や 補酵素等を用いることもできる。 基質としては、 使用する酵素の種類に応じて公 知の物質を使用することができる。 例えば酵素としてペルォキシダ一ゼを使用す る場合には、 3,3'，5，5'—テトラメチルベンジシンを、 また酵素としてアルカリフ ォスファタ一ゼを用いる場合には、 パラ二トロフエノール等を用いることができ る。 放射性同位体としては、 i25Iや 3 H等を、 蛍光色素としては、 フルォレツセ ンスイソチオシァネート （FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネ一 ト （TRITC) 等を使用することができる。 また、 蛍光タンパク質とは励起光を照 射すると蛍光を発するタンパク質であり、 例えば、 発光クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質 (GFP)や、 その変異体である EGFP、 EYFP (黄色蛍光） 、 ECFP (青色蛍光） 、 DsRedl
(赤色蛍光） 、 DsRed2、 ゥミシィタケ由来の緑色蛍光蛋白質; hrGFPなどが例示できる。 以上のとおりの標識物質と標的物質とは、 例えば、 水素結合、 疎水結合、 イオン結合、 配 位結合等に基づく結合によって一体化することができる。 さらにまた、 蛍光タンパク質は それをコードするポリヌクレオチド配列が公知であることから、 蛍光タンパク質標識化 DNA断片や蛍光タンパク質標識化タンパク質またはべプチド等は公知の遺伝子工学的方法 によって容易に調製することもできる。 以上の標識を指標としてキヤプチヤープローブに結合した標的物質を検出するには、 例 えば酵素標識の場合には、 酵素作用によって分解して発色する基質を加え、 基質 の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、 これを結合標的物質 量に換算し、 標準値との比較から標的物質量が算出される。 放射生同位体を用い る場合には、 放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンタ一等に より測定する。 また、 蛍光色素や蛍光タンパク質を用いる場合には、 蛍光顕微鏡 を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。 第 1 1 発明の反応性チップは、 前記第 10発明の反応性チップの一態様であつ て、 前記第 8 発明と同様に 「圧電ノ電歪素子の共振周波数を測定する手段」 を 有する反応性チップである。 この第 1 1 発明の反応性チップは、 第 20発明の標 的物質検出方法に使用することができる。 第 20発明の方法は、 キヤプチャ一プローブと結合する標的物質を検出する方 法であって、 前記第 1 1 発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標的 物質を含む試料を反応性チップのプローブに接触させ、 圧電ノ電歪素子の共振周 波数の変化を指標として標的物質を検出することを特徴としている。 すなわち、 この方法は、 キヤプチヤープローブへの標的物質の結合によって生 じる振動面の共振周波数の変化を指標として標的物質の検出を行う方法である。 この方法によれば、 標的物質を標識することなく検出することが可能となる。 ま た、 標的物質の結合量を、 経時的にリアルタイムで測定することもできる。 さら に、 標的物質を標識して、 前記第 19発明の方法と同様に標識を指標とする検出 と組み合わせて、 より高精度の検出を行うこともできる。 さらに第 1 1 発明の反応性チップは、 第 2 1 発明の標的物質検出方法に使用す ることもできる。 第 21 発明の方法は、 前記第 20発明の方法の一態様であって、 反応性チップ の振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた状態でプローブに試料 を接触させ、 圧電ノ電歪素子の共振周波数の変化を指標として標的物質を経時的 に検出する方法である。 例えば、 DNA チップの場合、 振動面を振動させた状態 でハイブリダィゼーシヨン反応の温度を 38〜98°C程度まで'一定の時間内 （例え ば 10 分間隔） で変化させ、 その間にキヤプチヤープローブ DNAにハイブリダ ィズした標的 DNA の質量を測定することによって、 各標識 DNA の Tm (融解 温度） を検出することができる。 第 12発明の反応性チップは、 前記第 10発明の別の態様であって、 第 1電極 表面がキヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1 電極おょぴ第 2 電極が、 交流 電源に加え、 さらに直流電源にも導通している反応性チップである。 この第 12 発明のチップは、 第 22発明の標的物質検出方法に使用することができる。 第 22発明の方法は、 キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方 法であって、 前記第 12発明の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識 化標的物質を含む試料を反応性チップのプローブに接触させ、 振動面の振動を停 止した後、 キヤプチヤープローブ固定面である第 1 電極に負の直流電流を一定 時間通電し、 標識を指標としてキヤプチャ一プローブに結合した標的物質を検出 することを特徴とする。 この方法は、 前記第 19 発明の方法と、 特表平 09- 503307号公報、 特表 2001-50130 1号公報等に記載されたナノチップによる方 法とを組み合わせたものであり、 特に前記第 12 発明の反応性チップを DNAチ' ップとして使用するための方法である。 キヤプチャ一プローブ固定面の振動と、 キヤプチヤープローブを負に電荷させることを組み合わせることによって、 標識 DNAとプローブ DNAのミスマッチ結合を効率良く排除することができる。 直流電流は、 使用される溶液、 振動面の寸法、 DNA の濃度等により適宜とす ることができる力 0:：!〜 1000 ナノアンペア、 好ましくは 1 ~ 30 ナノアンペア 程度の電流を 1〜 180秒、 好ましくは 10~ 60秒程度、 通電させることができる。 次に、 第 13発明の反応性チップは、 前記第 2から第 7発明のさらにまた別の 態様であって、 3以上の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (nは 2以 上） X m (m は 2 以上） の格子状に整列配置し、 同一列の各振動面に同一種の キヤプチヤープローブを固定した反応性チップである。 この場合の 「同一種」 とは、 例えば DNA 断片であればそれぞれの塩基配列が 全く同一であること、 ぺプチドであればアミノ酸配列が完全に同一であることを 意味する。 例えば、 図 10の例では、 第 1列の 4つの振動面にそれぞれ同一のキ ャプチヤープローブ (A)が固定されており、 第 2〜4 列には、 それぞれ同一のキ ャプチヤ一プローブ (B)、 （C)および (D)が固定されている。 そして、 この第 13発 明の反応性チップは、 第 23発明の標的物質検出方法に使用することができる。 第 23 発明の方法は、 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和 性を検出する方法であって、 前記第 13 発明の反応性チップの同一列振動面の各 振動面を異なる振幅で振動させた状態で、 各種の標識化標的物質を反応性チップ のキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を指標として キヤプチャ一プローブに結合した標的物質のそれぞれのプローブに対する親和性 の程度を検出することを特徴とする。 すなわちこの方法によれば、 同一列振動面の各振動面を異なる振幅で振動させ た状態で、 標的物質とキヤプチャ一プローブとのハイブリダィゼ一シヨンを行し、 標識を指標としてプローブに結合した標的物質量を検出することによって、 親和 力の強い標的物質から順次にソーティングすることが可能となる。 また、 第 14 発明の反応性チップを用いた第 24発明の方法では、 共振周波数の違いによって 測定される質量を指標として経時的なソーティングを行いことができ、 第 25 発 明の方法では、 温度変化を伴うハイブリダィゼ一シヨンをことができる。 さらに、 第 15発明の反応性チップを用いた第 26発明の方法では、 キヤプチャ一プロ一 ブ固定面の振動と、 キヤプチヤープローブを負に電荷させることを組み合わせる ことによって、 標識 DNA とプローブ DNA との親和性をさらに高精度で検出す ることができる。 第 16発明の反応性チップは、 前記第 2から第 7発明のまたさらに別の態様で あって、 3以上の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (nは 2以上） X m (m は 2 以上） の格子状に整列配置し、 同一列の振動面に、 標的物質の異な る部位に結合するキヤプチャ一プローブをそれぞれ固定した反応性チップである。 この場合の 「標的物質の異なる部位に結合する」 とは、 例えば DNA断片であれ ばその塩基配列の異なる領域に結合すること、 ぺプチドであればその全長アミノ 酸配列の異なる領域に結合することを意味する。 例えば、 図 1 1 の例では、 染色 体 DNA(A)の端から順次に 4つの領域に対応するキヤプチヤープローブ A1〜A4 を第 1列の 4つの振動面に固定し、 第 2〜4列には染色体 (B)〜(D)の 4領域に対 応するキヤプチヤープローブをそれぞれ固定している。 また、 図 12 の例では、 4 X 4 の格子状の振動面に、 染色体 DNA(A)の端から順次に 4 つの領域の様々な 組み合わせに対応するキヤプチャ一プローブをそれぞれ固定している。 そして、 このような第 16発明の反応性チップは、 第 27発明の標的物質検出 方法に使用することができる。 第 27発明の方法は、 標記物質の変異を検出する方法であって、 前記第 16発 明の反応性チップの同一列振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質含む試料 を反応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標 識を指標としてキヤプチャ一プローブに結合した標的物質を検出することによつ て、 標的物質の変異を検出することを特徴とする。 ここで、 「変異」 とは欠失、 置換、 挿入、 増幅、 反復等を意味する。 さらに具体的には、 染色体 DNA のこれ らの変異や、 それに対応した mRNAや cDNAの変異、 あるいはそれらの発現産 物であるタンパク質やべプチドの同様の変異を意味する。 例えば、 図 1 1 の構成でキヤプチヤープローブを固定した場合、 標的物質 （染 色体 DNA) が正常であれば、 図 1 1 の右図に示したように、 各プローブに対し てそれぞれに標的物質が結合する。 しかし、 図 13に示したようにプローブ 3お よび 4に対する結合量が 2倍となる場合には、 これらのプローブ 3および 4に 対応する染色体 DNA領域 3-4が増幅していることを検出することができる。 ま た、 図 14に示したように、 プローブ 1、 2および 4には結合し、 プローブ 3に 対する結合がない場合には、 プローブ 3に対応する染色体 DNA領域 3が欠失し ていることを検出することができる。 さらに、 図 12 の構成でキヤプチャ一プローブを固定することによって、 例え ば染色体 DNAの挿入や置換を検出することができる。 例えば、 図 15 の左欄に 示したように、 標的物質 （染色体 DNA) が A1〜A4 単独のプローブ、 および Al+2 と A3+4のプローブに結合した場合には、 図 1 5の右欄に示したように染 色体 DNAの領域 2 と 3の間に X配列が挿入していることを検出できる。 また、 図 16の左欄に示したように、 染色体 DNAが A1〜A4単独のプローブ、 Al+2、 A2+4、 A3+4、 A1+2+4 プローブに結合した場合には、 図 16 の右欄に示したよ うに染色体 DNAの領域 3と 4が置換していることを検出できる。 また、 第 17発明の反応性チップを用いた第 28発明の方法では、 共振周波数 の違いによって測定される質量を指標として標的物質の変異を検出することがで きる。 例えば図 13 の例では質量は 6/4倍に、 図 14 の例では質量は 3/4倍と して検出される。 さらに、 第 18発明の反応性チップを用いた第 29発明の方法 では、 キヤプチヤープローブ固定面の振動と、 キヤプチヤープローブを負に電荷 させることを組み合わせることによって、 標識 DNA における変異をさらに高精 度で検出することができる。 もちろん、 この出願の発明は以上の例によって限定されるものではなく、 細部 については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
産業上の利用可能性
'
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 広範な標的物質に対し て、 反応時間の短縮を可能とし、 しかもミスマッチ結合を効果的に予防して高精 度な検出を可能とする新しい反応性チップが提供さえる。 また、 この反応性チッ プを用いた新しい標的物質検出方法が提供される。 この検出方法では、 従来の反 応性チップでは不可能であった、 標的物質の微量な相違をも検出することが可能 となる。

Claims

請求の範囲
1. 基板上に整列配置された 3 以上の振動面のそれぞれに、 標的物質に結合す るキヤプチヤープローブが固定されていることを特徵とする反応性チップ。
2. 各振動面がそれぞれ、 第 1電極と第 2電極間に圧電 /電歪素子を介在させ た振動発生部を有する請求項 1の反応性チップ。
3. キヤプチャ一プローブの固定面がコ一ティングされている請求項 2 の反応 性チップ。
4. 基板が肉薄領域とその周囲の肉厚領域を有し、 肉薄領域の上面に振動発生 部を有する請求項 2または 3の反応性チップ。
5. 基板が肉薄領域とその周囲の肉厚領域を有し、 肉薄領域の下面に振動発生 部を有する請求項 2または 3の反応性チップ。
6. 第 1電極と第 2電極のそれぞれのリード線が、 振動発生部毎に独立である 請求項 2から 5のいずれかの反応性チップ。
7. 第 1電極と第 2電極のいずれか一方のリ一ド線が共通である請求項 2から 5のいずれかの反応性チップ。
8. 振動面の共振周波数を測定する手段を有する請求項 2から 7のいずれかの 反応性チップ。
9. 第 1電極表面がキヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1電極および第 2 電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している請求項 2 から 7 の いずれかの反応性チップ。
10. 各振動面に、 それぞれ異種のキヤプチヤープローブを固定した請求項 2 から 7のいずれかの反応性チップ。 .
1 1. 圧電 /電歪素子の共振周波数を測定する手段を有する請求項 10の反応性 チップ。
12. 第 1 電極表面がキヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1 電極および第 2電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している請求項 10 の反応 性チップ。
13. 3以上の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (nは 2以上） X m (m は 2 以上） の格子状に整列配置し、 同一列の各振動面に同一種のキヤプチ ヤープローブを固定した請求項 2から 7の反応性チップ。
14. 振動面の共振周波数を測定する手段を有する請求項 13の反応性チップ。
15. 第 1 電極表面がキヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1 電極および第 2電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している請求項 13 の反応 性チップ。
16. 3以上の振動面を同一列、 または 4以上の振動面を n (nは 2以上） X m (m は 2 以上） の格子状に整列配置し、 同一列の振動面に、 標的物質の異なる 部位に結合するキヤプチヤープローブをそれぞれ固定した請求項 2.から 7 の反 応性チップ。
17. 振動面の共振周波数を測定する手段を有する請求項 16の反応性チップ。
18. 第 1 電極表面がキヤプチヤープローブ固定面であり、 第 1 電極および第 2電極が、 交流電源に加え、 さらに直流電源にも導通している請求項 16 の反応 性チップ。
19. キヤプチヤープローブと結合する標的物質を検出する方法であって、 請 求項 10 の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質を含む試 料を反応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を指標としてキヤプチヤープローブに結合した標的物質を検出することを特 徵とする標的物質の検出方法。
20. 振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた状態で試料をキ ャプチヤープローブに接触させる請求項 19の検出方法。
21. キヤプチャ一プローブと結合する標的物質を検出する方法であって、 請 求項 1 1 の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標的物質を含む試料を反 応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の共振周波数の変化を指 標として標的物質を検出する標的物質の検出方法。
22. 反応性チップの振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた 状態でキヤプチヤープローブに試料を接触させ、 振動面の共振周波数の変化を指 標として標的物質を経時的に検出する請求項 21の検出方法。
23. キヤプチャ一プローブと結合する標的物質を検出する方法であって、 請 求項 12 の反応性チップの振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質を含む試 料を反応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止した 後、 キヤプチヤープローブ固定面である第 1電極に負の直流電流を一定時間通電 し、 標識を指標としてキヤプチヤープロ一ブに結合した標的物質を検出すること を特徴とする標的物質の検出方法。
24. 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を検出する方 法であって、 請求項 13 の反応性チップの同一列振動面の各振動面を異なる振幅 で振動させた状態で、 各種の標識化標的物質を反応性チップのキヤプチヤープロ —ブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を指標としてキヤプチャ一プロ一 ブに結合した標的物質のそれぞれのキヤプチヤープローブに対する親和性の程度 を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
25. 振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた状態で試料をキ ャプチヤ一プローブに接触させる請求項 24の検出方法。
26. 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を検出する方 法であって、 請求項 14 の反応性チップの同一列振動面を異なる振幅で振動させ た状態で、 標的物質を反応性チップのキヤプチヤープローブに接触させ、 振動面 の共振周波数の変化を指標として標的物質のそれぞれのキヤプチヤープローブに 対する親和性の程度を検出する標的物質の検出方法。
27. 反応性チップの振動面を振動させると共に、 温度を経時的に変化させた 状態でキヤプチヤープローブに試料を接触させ、 振動面の共振周波数の変化を指 標として標的物質の有無を経時的に検出する請求項 26の検出方法。
28. 複数種の標的物質のキヤプチヤープローブに対する親和性を検出する方 法であって、 請求項 15 の反応性チップの同一列振動面の各振動面を異なる振幅 で振動させた状態で、 各種の標識化標的物質を反応性チップのキヤプチヤープロ ーブに接触させ、 振動面の振動を停止した後、 プローブ固定面である第 1 電極 に負の直流電流を一定時間通電し、 標識を指標としてキヤプチヤープローブに結 合した標的物質の.それぞれのプロ一ブに対する親和性の程度を検出することを特 徵とする標的物質の検出方法。
29. 標記物質の変異を検出する方法であって、 請求項 16の反応性チップの同 一列振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質含む試料を反応性チップのキヤ プチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止し、 標識を指標としてキヤプ チヤ一プローブに結合した標的物質を検出することによって、 標的物質の変異を 検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
30. 標記物質の変異を検出する方法であって、 請求項 17の反応性チップの同 一列振動面を振動させた状態で、 標的物質を含む試料を反応性チップのキヤプチ ヤープローブに接触させ、 振動面の共振周波数の変化を指標として標的物質の有 無を検出することによって、 標的物質の変異を検出することを特徴とする標的物 質の検出方法。
31. 標記物質の変異を検出する方法であって、 請求項 18の反応性チップの同 一列振動面を振動させた状態で、 標識化標的物質含む試料を反応性チップのキヤ プチヤープローブに接触させ、 振動面の振動を停止した後、 プローブ固定面であ る第 1電極に負の直流電流を一定時間通電し、 標識を指標としてキヤプチヤープ ローブに結合した標的物質を検出することによって、 標的物質の変異を検出する ことを特徴とする標的物質の検出方法。
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