JPH03282353A - Ｄｎａ及びｒｎａの定量方法 - Google Patents
Ｄｎａ及びｒｎａの定量方法Info
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- JPH03282353A JPH03282353A JP8560890A JP8560890A JPH03282353A JP H03282353 A JPH03282353 A JP H03282353A JP 8560890 A JP8560890 A JP 8560890A JP 8560890 A JP8560890 A JP 8560890A JP H03282353 A JPH03282353 A JP H03282353A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は迅速かつ簡易なりＮＡ及びＲＮＡの定量方法に
関する。
関する。
［従来の技術］
従来、大腸菌等の細菌由来の２本鎖ＤＮＡと１本ｍＲＮ
Ａからなる菌体抽出液中のＤＮＡやＲＮＡを定量するに
は、電気泳動による分子量マーカーを用いた定量法や、
酸処理によりＤＮＡ、ＲＮＡを分解し、それぞれの糖部
分の反応性の違いによって定量する方法等が用いられて
いた。
Ａからなる菌体抽出液中のＤＮＡやＲＮＡを定量するに
は、電気泳動による分子量マーカーを用いた定量法や、
酸処理によりＤＮＡ、ＲＮＡを分解し、それぞれの糖部
分の反応性の違いによって定量する方法等が用いられて
いた。
［発明が解決しようとする課題］
従来の電気泳動法では分子量マーカーの調製が必要、濃
度の調製が必要、ゲルの作製に手間がかかる、サンプル
をゲルにアプライするのに手間がかかる、定量性が良く
ない等の面で問題が指摘され、また、酸処理を用いる方
法では、ＤＮＡ、 ＲＮＡの分解が１００％であるか否
かの確認が必要となり、糖部分に対する反応性の測定も
煩雑な操作が必要である等、迅速性、定量性の観点から
実用性に問題が指摘されている。
度の調製が必要、ゲルの作製に手間がかかる、サンプル
をゲルにアプライするのに手間がかかる、定量性が良く
ない等の面で問題が指摘され、また、酸処理を用いる方
法では、ＤＮＡ、 ＲＮＡの分解が１００％であるか否
かの確認が必要となり、糖部分に対する反応性の測定も
煩雑な操作が必要である等、迅速性、定量性の観点から
実用性に問題が指摘されている。
このように、従来のＤＮＡ、ＲＮＡ定量法には、多くの
欠点がみられ、これらの課題を解決することが、当該技
術分野で強く要請され、これまで種々の試みがなされて
いるが、未だ実用上満足する定量法は見い出されていな
い。
欠点がみられ、これらの課題を解決することが、当該技
術分野で強く要請され、これまで種々の試みがなされて
いるが、未だ実用上満足する定量法は見い出されていな
い。
本発明の目的は、まさにこの点にあり、かかる課題を克
服したＤＮＡ、ＲＮＡの定量方法を提供することにある
。
服したＤＮＡ、ＲＮＡの定量方法を提供することにある
。
［課題を解決するための手段］
本発胡者は、上記目的を達成すべく種々研究を重ねた結
果、試料溶液を加熱処理及び／又はアルカリ処理し、処
理前後の該溶液の吸光度を測定することにより、ＤＮＡ
及びＲＮＡを迅速かつ簡易に定量することができること
を見い出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至
った。
果、試料溶液を加熱処理及び／又はアルカリ処理し、処
理前後の該溶液の吸光度を測定することにより、ＤＮＡ
及びＲＮＡを迅速かつ簡易に定量することができること
を見い出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至
った。
即ち、本発明は２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＲＮＡからなる溶
液をＤＮＡの熱変性が起こる約９３℃以上に加熱処理し
及び／又はアルカリ処理し、処理前後の該溶液の吸光度
を測定することを特徴とするＤＮＡ及びＲＮＡの定量方
法に関する。
液をＤＮＡの熱変性が起こる約９３℃以上に加熱処理し
及び／又はアルカリ処理し、処理前後の該溶液の吸光度
を測定することを特徴とするＤＮＡ及びＲＮＡの定量方
法に関する。
ここで、測定の対象となり得るＤＮＡ及びＲＮＡの由来
は、特に制限されずＤＮＡが２本鎖でＲＮＡが１本鎖で
あればどのようなものでもよい。
は、特に制限されずＤＮＡが２本鎖でＲＮＡが１本鎖で
あればどのようなものでもよい。
通常、細菌由来の２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＲＮＡが対象と
され、例えば大腸菌由来のプラスミドＤＮＡと１本鎖Ｒ
ＮＡが挙げられ、これらの菌体抽出液が試料溶液として
用いられる。２本鎖ＤＮＡは環状のものであっても線状
のものであっても良い。
され、例えば大腸菌由来のプラスミドＤＮＡと１本鎖Ｒ
ＮＡが挙げられ、これらの菌体抽出液が試料溶液として
用いられる。２本鎖ＤＮＡは環状のものであっても線状
のものであっても良い。
加熱処理は加熱により、２本鎖構造をもつＤＮＡの水素
結合が切れて１本鎖になる温度まで加熱する必要があり
、通常約９３℃以上とし、約９３〜１００℃の範囲が好
ましい。
結合が切れて１本鎖になる温度まで加熱する必要があり
、通常約９３℃以上とし、約９３〜１００℃の範囲が好
ましい。
加熱の手段は特に限定されないが、通常湯煎法及びヒー
トブロック法等の方法が用いられる。アルカリ処理は、
加熱処理の場合と同様に、アルカリ処理により、２本鎖
のＤＮＡを１本鎖にするに必要な条件下で行なえばよい
。
トブロック法等の方法が用いられる。アルカリ処理は、
加熱処理の場合と同様に、アルカリ処理により、２本鎖
のＤＮＡを１本鎖にするに必要な条件下で行なえばよい
。
通常、ＮａＯＨ，ＮａＨＣＯ２，Ｎａｚ ＣＯ３゜ＫＯ
Ｈ等を用いて６５〜８０℃において処理し、また必要に
応じて９３〜１００℃で５〜１０分間熱処理してもよい
。具体的には、例えば、終濃度０．５Ｎ ＮａＯＨで
６５℃１０分間加温することにより、アルカリ処理する
ことができる。
Ｈ等を用いて６５〜８０℃において処理し、また必要に
応じて９３〜１００℃で５〜１０分間熱処理してもよい
。具体的には、例えば、終濃度０．５Ｎ ＮａＯＨで
６５℃１０分間加温することにより、アルカリ処理する
ことができる。
２本鎖構造のＤＮＡを１本鎖にする手段としての前記加
熱処理、アルカリ処理は、それぞれ単独で、又は両者を
組み合わせて行なってもよい。
熱処理、アルカリ処理は、それぞれ単独で、又は両者を
組み合わせて行なってもよい。
吸光度の測定は、核酸の定量に適した波長が用いられ約
２６０ｎｍの付近、例えば２５８ｎｍでの測定が挙げら
れる。
２６０ｎｍの付近、例えば２５８ｎｍでの測定が挙げら
れる。
本発明のＤＮＡ、ＲＮＡの定量方法は、前記の処理の前
後の吸光度を測定することに特徴を有している。即ち、
前記の処理により２本鎖構造のＤＮＡが水素結合が切断
されて１本鎖になり、塩基対の重ね合わせ（ｓｔａｃｋ
ｉｎｇ）が破壊されるので、例えば２５８ｎｍの吸光度
は処理前に比較して処理後は増加がみられる。
後の吸光度を測定することに特徴を有している。即ち、
前記の処理により２本鎖構造のＤＮＡが水素結合が切断
されて１本鎖になり、塩基対の重ね合わせ（ｓｔａｃｋ
ｉｎｇ）が破壊されるので、例えば２５８ｎｍの吸光度
は処理前に比較して処理後は増加がみられる。
この現象は、試料溶液中に１本鎖のＲＮＡのみが存在し
ている場合には生じないものであり、２本鎖ＤＮＡが存
在していれば、生ずる吸光度の差を利用して定量するこ
とができる。
ている場合には生じないものであり、２本鎖ＤＮＡが存
在していれば、生ずる吸光度の差を利用して定量するこ
とができる。
処理前の吸光度は通常、室温付近で測定されるが、２本
鎖ＤＮＡの２本鎖構造が崩壊し、１本鎖構造にならない
範囲であれば、特に温度に限定はなく、室温から約７５
℃付近までであればよい。
鎖ＤＮＡの２本鎖構造が崩壊し、１本鎖構造にならない
範囲であれば、特に温度に限定はなく、室温から約７５
℃付近までであればよい。
ＤＮＡ及びＲＮＡは処理前と処理後の測定により得られ
た吸光度の差から算出され、例えば大腸菌由来の菌体抽
出液を試料溶液とする場合は下記の計算式により算出さ
れる。
た吸光度の差から算出され、例えば大腸菌由来の菌体抽
出液を試料溶液とする場合は下記の計算式により算出さ
れる。
［式エコε、Ｘ ｘ Ｘｉ＋ ｅ ２Ｘ ’Ｊ Ｘ１＝
処理前の吸光度［式２］ ＩＣ０Ｄ］ ε、Ｘ
Ｘ Ｘｉｌ、４ ＣＯＤ：］ Ｚ ［０
０］Ｌ式３コＺ＋ε２Ｘ ｙ Ｘ １＝処理後の吸光度
ここでＸはＤＮＡの濃度（ｍｇ ／ ｍ １ ）をｙは
ＲＮＡの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を、１は光路長１ ｃｍを
意味する。２は処理後のＤＮＡのみが示す吸光度を、ε
１．ε２は吸光係数であり、例えば、２５８ｎｍの場合
ε１＝２０ ［ｃｄ／ｍｇコ 、 εｚ＝ ２
２ 、 ５ ［ｃｎｆ／ ｍｇ］である。
処理前の吸光度［式２］ ＩＣ０Ｄ］ ε、Ｘ
Ｘ Ｘｉｌ、４ ＣＯＤ：］ Ｚ ［０
０］Ｌ式３コＺ＋ε２Ｘ ｙ Ｘ １＝処理後の吸光度
ここでＸはＤＮＡの濃度（ｍｇ ／ ｍ １ ）をｙは
ＲＮＡの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を、１は光路長１ ｃｍを
意味する。２は処理後のＤＮＡのみが示す吸光度を、ε
１．ε２は吸光係数であり、例えば、２５８ｎｍの場合
ε１＝２０ ［ｃｄ／ｍｇコ 、 εｚ＝ ２
２ 、 ５ ［ｃｎｆ／ ｍｇ］である。
吸光度１を示す２本鎖が処理後は吸光度が１．４を示す
ことが既に知られているが（Ｊ、 Ｍａｒｍｕｒ＆ Ｐ
。
ことが既に知られているが（Ｊ、 Ｍａｒｍｕｒ＆ Ｐ
。
Ｄｏｔｙ ： Ｎａｔｕｒｅ １８３．１４２７（１９
５９））、これらの吸光度の比を示したものである。
５９））、これらの吸光度の比を示したものである。
［実施例］
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
実施例１
２本鎖ＤＮＡ にシンの精子）９．３７５（■／ｍ１）
の２０ｍＭ）リス（ｐＨ８）溶液１μ！に水１ｔｔｌを
加え、さらに１０ｍＭＴｒ ｉ ｓ （ｐＨ８）を７μ
！加え、容量９μｍとした。次に酵母由来ｔ −ＲＮＡ
１ 、 １ ［ｍｇ／ｍｌ］の２０ｍＭＴｒｉｓ（
ｐＨ８）をさらに加えて、１３．５ｔｔｉとした。
の２０ｍＭ）リス（ｐＨ８）溶液１μ！に水１ｔｔｌを
加え、さらに１０ｍＭＴｒ ｉ ｓ （ｐＨ８）を７μ
！加え、容量９μｍとした。次に酵母由来ｔ −ＲＮＡ
１ 、 １ ［ｍｇ／ｍｌ］の２０ｍＭＴｒｉｓ（
ｐＨ８）をさらに加えて、１３．５ｔｔｉとした。
上記１３．５μｌ溶液の１．５μβづつを、エッペンド
ルフチューブにとり、一方には、ｌＮＮａＯＨ１，５ｔ
ｔｌｌを加え、６５℃で１０分熱処理し、もう一方は１
０ｍＭＴｒ ｉ ５ＨＣｊｉ’ （ｐＨ８）９９８．５
μβ加えて、容量１ｍｌとした（対照サンプル側）。
ルフチューブにとり、一方には、ｌＮＮａＯＨ１，５ｔ
ｔｌｌを加え、６５℃で１０分熱処理し、もう一方は１
０ｍＭＴｒ ｉ ５ＨＣｊｉ’ （ｐＨ８）９９８．５
μβ加えて、容量１ｍｌとした（対照サンプル側）。
それぞれ一部を電気泳動した写真を参考図に示す。
参考図中、レーンＮｏ、 ２がアルカリ処理後の泳動で
あるが、アルカリ処理により完全にＤＮＡが１本鎖にな
ったことが示される。アルカリ処理した側には、２ＮＨ
Ｃβ ０．７μｌを加えて中和し、さらに９９６． ３
ｕｆの１０ｍＭ）リス（ｐＨ８）を加え、容量を１ｍｌ
とした。
あるが、アルカリ処理により完全にＤＮＡが１本鎖にな
ったことが示される。アルカリ処理した側には、２ＮＨ
Ｃβ ０．７μｌを加えて中和し、さらに９９６． ３
ｕｆの１０ｍＭ）リス（ｐＨ８）を加え、容量を１ｍｌ
とした。
吸光度を処理前後に測定したが、その結果を第１図に示
す。その結果、２５８ｎｍでの処理前の吸光度は０．０
３７、処理後は０．０４６であった。
す。その結果、２５８ｎｍでの処理前の吸光度は０．０
３７、処理後は０．０４６であった。
大腸菌ＤＮＡでは、文献より吸光度１を示す２本鎖ＤＮ
Ａが変性後には、吸光度１．４を示す事が既知である（
Ｊ０Ｍａｒｍｕｒ＆Ｐ、 Ｄｏｔｙ ： Ｎａｔｕｒｅ
１８３゜１４２７（１９５９）） 、従って、上記の
ＤＮＡの濃度をＸ［ｍｇ／ｍｌコＲＮＡの濃度をｙ ［
ｍｇ／ｍｌ］とすると、（但し、Ｚは変性後のＤＮＡの
み示す吸光度）と示せる。ここで吸光係数は、 ε 、＝２０［ｃ＋＋ｆ／■コ ε２＝ ２２ 、 ５ ［ＣＩ＋！／ ｍｇ］である。
Ａが変性後には、吸光度１．４を示す事が既知である（
Ｊ０Ｍａｒｍｕｒ＆Ｐ、 Ｄｏｔｙ ： Ｎａｔｕｒｅ
１８３゜１４２７（１９５９）） 、従って、上記の
ＤＮＡの濃度をＸ［ｍｇ／ｍｌコＲＮＡの濃度をｙ ［
ｍｇ／ｍｌ］とすると、（但し、Ｚは変性後のＤＮＡの
み示す吸光度）と示せる。ここで吸光係数は、 ε 、＝２０［ｃ＋＋ｆ／■コ ε２＝ ２２ 、 ５ ［ＣＩ＋！／ ｍｇ］である。
これらを解いて、
ＤＮＡの濃度： ｘ ＝０．００１１３ ［ｍｇ／＋ｍ
ｌ］ＲＮＡの濃度： ｙ ＝０．０００５６ ［ｍｇ／
ｍｌコ理論上、上記１ｍ ｌ溶液に含まれるＤＮＡ及び
ＲＮＡの量は、 ＤＮＡ ： ９．３７５ ［μｇ／μｊ２］ Ｘｉμｎ
ｘ１．５［μＡ］／１３．５［μ、ｅコ ＝１．０４［
μｇ］ＲＮＡ：１．１［μｇ／μＡ］ｘ４，５μβＸＩ
、５［μｍ］／１３．５［μβ］ ＝０．５５ ［μｇ
］となり、実測値−真値は、 ＤＮＡでは１．１３［μｇ］ −１，０４［μｇココ−
，０９［μｇ］ＲＮＡでは０．５６［μｇココ−，５５
［μｇコ＝０．旧［μｇ］１１００ｎ （２本鎖ＤＮＡ
） ７０ｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ５０ｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ３０ｎｇ （２重鎮Ｄ Ｎ Ａ ＞ Ｌｏｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ヒＬ 、−’ｉ’土 第１図は、アルカリ処理前後の吸光度曲線を示す。
ｌ］ＲＮＡの濃度： ｙ ＝０．０００５６ ［ｍｇ／
ｍｌコ理論上、上記１ｍ ｌ溶液に含まれるＤＮＡ及び
ＲＮＡの量は、 ＤＮＡ ： ９．３７５ ［μｇ／μｊ２］ Ｘｉμｎ
ｘ１．５［μＡ］／１３．５［μ、ｅコ ＝１．０４［
μｇ］ＲＮＡ：１．１［μｇ／μＡ］ｘ４，５μβＸＩ
、５［μｍ］／１３．５［μβ］ ＝０．５５ ［μｇ
］となり、実測値−真値は、 ＤＮＡでは１．１３［μｇ］ −１，０４［μｇココ−
，０９［μｇ］ＲＮＡでは０．５６［μｇココ−，５５
［μｇコ＝０．旧［μｇ］１１００ｎ （２本鎖ＤＮＡ
） ７０ｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ５０ｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ３０ｎｇ （２重鎮Ｄ Ｎ Ａ ＞ Ｌｏｎｇ （２本鎖ＤＮＡ） ヒＬ 、−’ｉ’土 第１図は、アルカリ処理前後の吸光度曲線を示す。
参考図は、アルカリ処理した場合としない場合の電気泳
動の結果を示した写真を示す。
動の結果を示した写真を示す。
１：λ−旧ｒｄＩＩＩマーカ
２：アルカリ処理後
３：アルカリ処理前
第１図
手
続
補
正
書（方式）
％式％
事件の表示
欲
特願平
２−８５６０８
号
２゜
発明の名称
ＤＮＡ及びＲＮＡの定量方法
３゜
補正をする者
事件との関係 特許出願人
京都市中京区西ノ京桑原町１番地
（１９９） 株式会社 島津製作所
代表者 取締役社長 西へ條 實
４゜
代
理
人
６
補正命令の日付
平成
２年
７月３１日（庁発送日）
６゜
補正の対象
Claims (1)
- （１）２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＲＮＡからなる溶液を加熱
処理し及び／又はアルカリ処理し、処理前後の該溶液の
吸光度を測定することを特徴とするＤＮＡ及びＲＮＡの
定量方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8560890A JPH03282353A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Ｄｎａ及びｒｎａの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8560890A JPH03282353A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Ｄｎａ及びｒｎａの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03282353A true JPH03282353A (ja) | 1991-12-12 |
Family
ID=13863547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8560890A Pending JPH03282353A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Ｄｎａ及びｒｎａの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03282353A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004004064A (ja) * | 1992-04-23 | 2004-01-08 | Massachusetts Inst Of Technol <Mit> | 分子検出の為の光学的方法および装置 |
-
1990
- 1990-03-30 JP JP8560890A patent/JPH03282353A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004004064A (ja) * | 1992-04-23 | 2004-01-08 | Massachusetts Inst Of Technol <Mit> | 分子検出の為の光学的方法および装置 |
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