KR100624459B1

KR100624459B1 - 생체분자의 전기적 검출 방법

Info

Publication number: KR100624459B1
Application number: KR1020050010183A
Authority: KR
Inventors: 유규태; 정성욱; 민준홍; 남궁지나; 최수형; 심저영
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2006-09-19
Also published as: KR20060089101A; US20060246478A1; US20100181209A1; US7659149B2

Abstract

본 발명은 바이오 FET에 의해 생체분자를 검출하는 방법에 관한 것으로서,

(a) 바이오 FET의 게이트 표면에 금(Au)을 포함하는 층을 형성하는 단계;

(b) 게이트와 떨어져 있는 기판 상에 고정된 프로브와, 그 프로브에 불완전하게 결합된 티올기(-SH)-포함 생체분자를 형성하는 단계;

(c) 상기 프로브와 타겟 분자가 포함된 시료를 반응시키는 단계; 및

(d) 상기 바이오 FET의 소스 및 드레인 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 정확성과 재현성을 지니며 신호대 잡음비가 높은 검출 방법을 제공한다.

Description

생체분자의 전기적 검출 방법{Method for electrically detecting biomolecule}

도 1a은 종래 기술에 의한 전형적인 바이오 FET의 단면을 나타낸 도면이다.

도 1b는 종래 기술에 의한 바이오 FET의 형태 및 드바이 길이를 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 1c는 도 1b에 나타낸 종래의 방법 중 한 방법에 따라, 바이오 FET를 이용하여 Kethley 4200을 통해 전류 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따른 일실시예를 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명의 방법에 따른 또 다른 일실시예를 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 타겟을 검출하는 경우, 소스 및 드레인 사이의 채널에 흐르는 전류 값을 검출한 것을 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명의 리포좀을 이용한 방법에 의해 타겟을 검출하는 경우, 소스 및 드레인 사이의 채널에 흐르는 전류 값을 검출한 것을 나타낸 도면이다.

< 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 >

10, 20... 전해질 용액 11, 21, 31... 기판

12a, 22a... 소스 12b, 22b... 드레인

13, 23... 게이트 14, 24... 산화층

15, 25... 폴리 실리콘층 16, 26... 금속층

17, 28, 29... 프로브 분자 30... 리포좀

본 발명은 바이오 FET(field effect transistor)를 이용하여 생체분자를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로브 생체분자 및 타겟 생체분자의 결합 여부를 전기적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.

전기적인 신호로 생체분자(Biomolecule)를 검출하는 센서 중 트랜지스터(transistor : TR)를 포함하는 구조를 지닌 TR 기반의 바이오센서(biosensor)가 있다. 이는 반도체 공정을 이용하여 제작한 것으로, 전기적인 신호의 전환이 빠르고, IC와 MEMS의 접목이 용이한 장점이 있어, 그 동안 이에 대한 많은 연구가 진행되어 왔다.

FET를 사용하여, 생물학적 반응(biological reaction)을 측정하는 것의 원천특허로 1980년 출원 된 미국특허 제 4,238,757호가 있다. 이는 항원(antigen)-항체(antibody) 반응을 표면 전하 밀도(surface charge concentration) 변화로 인한 반도체 반전층의 변화를 전류로 측정하는 바이오 센서에 관한 것으로 생체분자 중 단백질(protein)에 관한 것이다. 1986년에 출원 된 미국 특허 제 4,777,019호는 생물학적 단량체(biological monomers)를 게이트 표면에 흡착시켜 상보적인 (complementary) 단량체와의 혼성화(hybridization) 정도를 FET로 측정하는 것이다. 그 뒤, 1998년 출원 된 미국 특허 제 5,846,708호는 CCD(charged coupled device)를 사용하여 결합된 생체분자에 의한 흡광 현상으로 혼성화 여부를 측정하는 방법을 개시하였다. 그리고, 미국 특허 제 5,466,348호 및 제 6,203,981호에서는 TFT(thin film transistor)를 사용하며, 회로를 접목시켜 신호대 잡음비(S.N ratio)를 향상시키는 내용을 개시하였다.

TFT를 사용하는 경우, 실리콘 기판에 형성시키는 트랜지스터에 비해 비용을 줄일 수 있으며, 기판 면적을 크게 하여 집적도를 향상시킨 어레이 형태의 칩을 제작할 수 있는 장점이 있다. 이와 같은 FET를 바이오 센서로 사용하는 경우에는 종래의 방식에 비해 비용 및 시간이 적게 들고, IC(integrated circuit)/MEMS 공정과의 접목이 용이하다는 점에서 큰 장점을 지니고 있다.

도 1은 종래 기술에 의한 전형적인 바이오 FET의 단면을 나타낸 도면이다. n형 또는 p형으로 도핑된 기판(11) 상에 양측부에 기판(11)과 반대 극성으로 도핑된 소스(12a) 및 드레인(12b)이 형성되어 있으며, 소스(12a) 및 드레인(12b)과 접촉하며 기판(11) 상에는 게이트(13)가 형성되어 있다. 여기서 게이트(13)는 일반적으로 산화층(14), 폴리 실리콘층(15) 및 금속층(16)으로 형성되며, 게이트 전극층(16)에는 프로브(probe) 생체분자(17)가 부착된다. 프로브 생체분자(17)는 소정의 타겟 생체분자와 수소 결합 등에 의해 결합하며, 결합 시 생기는 전류 변화를 전기적인 방법으로 측정하여 프로브 생체분자(17)와 타겟 생체분자와의 결합 여부를 측정한다.

그러나, 상기한 바와 같은 종래 기술들은 전해질 용액(10)(electrolyte)내에서 하전된 생체분자의 측정시 정확성과 재현성이 신뢰성 있게 확보되지 못한 문제점이 있다. 이를 상세히 설명하면, 바이오 FET를 전해질 용액 내부에서 그 게이트(13) 표면의 프로브 생체분자(17)에 타겟 생체분자를 결합시키게 된다. 이때, 전해질 용액(10) 내의 생체분자 주변의 이온들의 쉴딩(ionic shielding) 현상에 의해 하전된 생체분자들이 결합하는 게이트(13) 표면(FET gate surface)으로 소정 거리(Debye length) 이상으로 떨어진 경우, 게이트(13) 표면의 전기적 포텐셜(potential)에 영향을 주지 못한다. 이에 따라, 게이트(13) 표면 전위를 정확히 측정하기 어렵게 된다. 따라서, 게이트(13) 표면에 프로브 생체분자(17)의 고정화(immobilization) 여부 및 프로브 생체분자(17)와 타겟 생체분자의 혼성화(hybridization) 여부의 검출 시 그 재현성과 정확성이 떨어지게 된다.

상기와 같은 이온 쉴딩을 없애기 위하여, 전해질 용액의 이온 농도를 낮춤으로써, 드바이 길이(Debye length)를 증가시키고자 하는 시도가 있었으나, 이온 농도를 낮출 경우, 예를 들어 0.01M 이하의 NaCl로 할 경우, 혼성화 효율이 낮아짐으로써, 검출 효율이 떨어진다는 문제점이 있었다.

또한 미국 특허 제 5,466,348 호에서는, 이온 쉴딩을 없기 위하여 건조 환경에서 측정할 수 있는 장치를 개시하고 있으나, 실제 적용에 그 한계가 있으며, 별도의 장비를 요구한다는 문제점이 있었다.

또한 미국 특허 제 6,203,981 호에서는 두 개의 트랜지스터를 이용하여, 기본 노이즈를 줄임으로써 신호대 잡음비를 높이고자 하였으나, 원하는 만큼의 신호 증폭 효과를 얻지 못하였다.

미국 특허 제 6,482,639B2호에서는 하전된 생체분자(charged biomolecule) 뿐만 아니라 하전되지 않은 생체분자(uncharged biomolecule)도 측정되며, 레퍼런스 전극(reference electrode)과 게이트 표면(gate surface) 사이에서의 생체분자의 흡착/결합으로 인한 캐패턴스(capacitance) 변화에 의해 생체분자를 측정하였다. 그러나, 이 특허에서도 바이오 FET에 대한 센싱(sensing) 측면에서의 재현성과 정확성이 문제점이 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 바이오 FET 표면에 프로브 생체분자와 타겟 생체분자의 혼성화 여부를 정확하게 검출할 수 있으며, 신호 증폭 효과가 높은, 바이오 FET를 이용한 생체분자 검출 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,

를 포함하는, 전해질 용액 내에서 바이오 FET를 이용한 생체분자의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 의하면, 상기 생체분자, 프로브 및 타겟은, DNA, RNA, 또는 단백질이다.

또한 본 발명의 바람직한 일실시예에 의하면, 상기 프로브와 상기 타겟 분자와의 결합력은, 상기 프로브와 상기 티올기-포함 생체분자와의 결합력보다 강하다.

따라서, 상기 (c) 단계에서, 상기 프로브와 상기 타겟 분자의 결합이 형성됨으로써, 티올기-포함 생체분자가 프로브로부터 분리되는 과정이 일어나는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 의하면, 상기 (d) 단계의 전류의 흐름은, 상기 생체분자의 티올기와 상기 게이트 표면의 금(Au)의 결합에 의해 생성된다.

또한 본 발명의 바람직한 일실시예에 의하면, 상기 (b) 단계의 불완전한 결합은, 상기 프로브와 타겟분자와의 결합력에 비해서 프로브와의 결합력이 상대적으로 약한 티올기 포함 생체분자에 의해 형성될 수 있다.

더 나아가 본 발명은,

전해질 용액 내에서 바이오 FET를 이용한 생체분자 검출 방법에 있어서,

(a) 게이트 표면에 형성된 금(Au)을 포함하는 층에 제 1 프로브를 고정화하는 단계;

(b) 티올기(-SH)-포함 화합물이 함유된 리포좀이 부착된 제 2 프로브를 제공하는 단계;

(c) 타겟 분자가 포함된 시료를 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 반응시킨 후 세척하는 단계;

(d) 리포좀을 파괴하는 단계; 및

(e) 상기 바이오 FET의 소스 및 드레인 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계;

를 포함하는 생체분자 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 의하면, 상기 제 1 프로브, 제 2 프로브 또는 타겟은, DNA, RNA, 또는 단백질이다.

상기 방법에 있어서, 상기 타겟의 일부는 제 1 프로브에 상보적이며, 타겟의 나머지 부분 중 적어도 일부는 제 2 프로브에 상보적이다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 티올기-포함 화합물은 머캡토헥산올, 시스테인 같은 티올기를 갖는 화합물이면 특별히 제한되지 않으며, 아스파테이트, 글루타메이트 같은 음이온분자가 포함된 것을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 리포좀 파괴는, 어떠한 수단에 의해서도 수행될 수 있으나, 바람직하게는 삼투압 차이를 제공함으로써 수행될 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 전류의 흐름은, (d) 단계에서의 리포좀의 파괴에 의해 방출된 화합물들의 티올기와 상기 게이트 표면의 금(Au)의 결합에 의해 생성되는 것이 바람직하다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명에 의한 바이오 FET를 이용한 생체분자 검출 방법에 대해 보다 상세하게 설명하고자 한다.

본 발명의 기본적인 원리를 설명하면 다음과 같다.

도 1a은 전해질 용액(10) 내에 장착된 바이오 FET의 게이트(13)상에 고정화에 의해 프로브 DNA(17)가 고정화된 것을 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하면, 기판(11)의 양쪽에 소정 물질로 도핑된 소스(12a) 및 드레인(12b)이 형성되어 있으며, 소스(12a) 및 드레인(12b)와 접촉하는 기판(11) 상에 게이트(13)가 형성되어 있다. 게이트(13)는 그 형태에 제한이 없으나, 일반적으로 게이트 절연층(14), 게이트 전극층(15) 및 프로브 생체분자(17)를 부착시키기 위한 금속 물질층(16)이 형성된다.

이 때, 바이오 FET는 게이트(13) 표면(surface)에 고정화되는 프로브 분자의 표면 전하 밀도(surface charge density)의 영향으로 생기는 기판 내의 채널 영역에 흐르는 전류 값의 변화를 측정하여, 그 변화에 따라, 프로브(17)의 고정화 여부 및 타겟과 프로브의 혼성화 여부를 측정한다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 프로브 생체분자, 예를 들어 프로브 DNA(17)는 기판(11) 상에 전하를 띄며 고정화된다. 부착된 프로브 DNA(17)의 양이 증가할 수록 표면 전하 밀도가 커지게 되며, 이에 따라 소스(12a) 및 드레인(12b) 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값이 커지게 된다. 여기서, 전해질 용액(10) 내에서 이온 쉴딩(ionic shielding)에 의한 하전된 생체분자들의 포텐셜 댐핑(potential damping) 정도가 드바이 길이(Debye length)에 의해 결정된다. 즉, 전해질 용액 내에서 고정화 또는 혼성화된 하전된 생체분자의 드바이 길이에 따라서 유효(effective)하게 바이오 FET의 채널 영역에 영향을 주는 정도가 달라진다.

일반적인 FET는 게이트(13) 영역을 제외한 모든 표면은 전해질 용액(10) 내 에서의 이온 확산(ionic diffusion)을 방지하기 위해 패시베이션(passivation) 처리가 되어 있다. 게이트(13) 영역은 예를 들어, Au(16) 등으로 코팅하고, 프로브 DNA(17)들은 티올기를 갖도록 변형시킨다. 이 경우 프로브 DNA(17)의 티올기와 Au(16)가 자기조립 방법에 의해 결합함으로써, 게이트(13)에 프로브 DNA(17)가 고정되게 된다.

전해질 용액(10) 내부에 위치하는 바이오 FET의 소스(12a) 및 드레인(12b)에 소정의 전압을 가해주면서 관찰하면, 티올기를 갖는 프로브 DNA(17)들이 게이트(13)의 Au 층(16) 상에 결합되는 경우, 그리고 게이트(13) 표면에 고정화된 프로브 DNA(17)와 타겟 분자들이 혼성화되는 경우, 소스(12a) 및 드레인(12b) 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값에 직접적인 영향을 준다.

그런데, 본 발명자들이 관찰해 본 바, 도 1b 및 도 1c에 나타낸 것처럼, 금(Au)과 프로브 DNA(17)의 티올기가 결합하는 경우에는, 게이트 전극과 매우 가까운 거리가 되므로, 드바이 길이에 영향을 받지 않게 되어 전류 변화가 매우 크다. 반면, 프로브 DNA(17)와 타겟 분자의 혼성화는 게이트 전극으로부터 거리를 두고 일어나므로, 그로 인한 실제 전하량의 증가는 게이트 표면과의 거리에 지수적으로 반비례하게 되어, 상대적으로 전류 변화가 작게 된다. 도 1c의 그래프에서 뒷받침되는 것처럼, 금과 프로브 DNA(17)의 티올기와의 결합시 전류 변화는 202μA인 반면, 프로브 DNA(17)와 타겟 분자의 혼성화시 전류 변화는 25μA에 지나지 않아서, 신호가 매우 약하며, 신호 대 잡음비가 매우 안 좋은 문제점이 있었다.

본 발명은, 상기와 같은 문제점을 해결하여, 프로브와 타겟 분자의 결합시 큰 전류 변화를 나타낼 수 있는 검출 방법을 개발하고자 하였다. 더욱 구체적으로는, 큰 전류 변화를 나타낼 수 있는 금(Au)과 티올기의 결합이, 타겟 분자와 프로브의 혼성화 반응 시에, 그 반응 정도에 따라서 일어날 수 있도록 하는 것이 본 발명의 특징이다.

상기와 같은 특징을 구현하기 위한 본 발명의 검출 방법의 제 1 태양은, 전해질 용액 내에서 바이오 FET를 이용하여 생체 분자를 검출하는 방법으로서,

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

상기 본 발명에 따른 검출 방법을 도 2를 참조로 하여 더욱 상세히 설명한다.

종래의 방법에서처럼, 프로브(-SH 포함)를 게이트 표면(Au)에 고정화한 후, 프로브와 타겟 분자의 결합을 유도했을 때, 프로브의 고정화 시에 비해 타겟 분자의 결합 시 전류 변화가 너무 작았던 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는, 게이트와 떨어진 별도의 기판(31)에 프로브(28)를 부착하고, 이 프로브에, 티올기(-SH)를 갖는 생체분자(27)를 불완전하게 결합시킨다. 불완전한 결합이라 함은, 결합력이 상대적으로 약한 결합을 말하는 것으로, 예를 들어, DNA 사슬의 상보 결합의 경우, 완전히 상보적인 관계가 아닌, 미스매치 등을 포함하는 결합을 말한다. 이외 불완전한 결합을 형성할 수 있는 생체분자의 예로는, DNA 경우 타겟에 비해 상대적으로 짧은 티올기를 갖는 DNA사슬 등이 있다.

여기에 타겟을 포함하는 시료가 주입되면, 프로브와 불완전하게 결합하고 있던 티올기(-SH)-포함 생체 분자(27)는 프로브(28)로부터 떨어지게 되고, 상대적으로 프로브와 완전한 결합(DNA의 경우는 완전 상보 결합)이 가능한 타겟이 프로브(28)에 경쟁적으로 대신 결합하게 된다. 타겟과 프로브와의 결합력이 훨씬 크게 되므로, 이와 같은 과정이 가능하게 된다.

이와 같이 프로브로부터 떨어진 티올기-포함 생체 분자(27)는, 게이트 표면으로 내려와 게이트 표면의 금(Au)(26)과 결합을 일으키게 되고, 소스(22a)과 드레인(22b) 큰 전류 변화가 생김으로써, 타겟과 프로브의 혼성화 여부의 검출이 가능하게 된다.

상기 방법에 있어서, 상기 프로브, 타겟, 생체분자는 DNA, RNA, 또는 단백질 어떠한 것도 가능하며, 단백질은 항원, 항체, 기질 단백질, 효소, 조효소 등 어떠한 생체분자라도 가능하다.

상기 프로브로의 결합은, 핵산 혼성화, 항원-항체 반응, 효소 결합 반응 등 당업계에 알려진 어떠한 생체분자의 결합이라도 가능하다.

상기와 같은 특징을 구현하기 위한 본 발명의 검출 방법의 제 2 태양은, 전해질 용액 내에서 바이오 FET를 이용하여 생체 분자를 검출하는 방법으로서,

(d) 리포좀을 파괴하는 단계; 및

를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법이다.

상기 방법을 도 3을 참조로 하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 상기 제 2 태양에 의하면, 게이트 표면(Au)에 제 1 프로브(28)를 먼저 고정화한다. 고정화 방법은 제한이 없으며, 당업계에 알려진 어떠한 방법이라도 사용할 수 있다.

그 다음, 반응이 일어나는 전해질 용액 내에 리포좀(30)이 부착된 제 2 프로브(29)를 첨가한다. 상기 리포좀(30)에는 티올기(-SH)를 갖는 화합물이 포함된 형태가 된다. 상기 티올기-포함 화합물은 머캡토헥산올, 시스테인 같은 티올기를 갖는 화합물이면 특별히 제한되지 않으나, 아스파테이트, 글루타메이트 같은 음이온분자가 포함된 것도 바람직하다.

여기에 타겟을 포함하는 시료를 넣어주면, 타겟과 제 1 프로브(28) 및 제 2 프로브(29)가 반응하여 결합을 일으키게 된다. 결합을 일으킨 후, 세척을 행하여, 결합되지 않은 여분의 프로브를 제거한다.

그리고 나서, 리포좀을 파괴하면, 티올기를 갖는 화합물이 방출되어 게이트 표면의 금(Au)과 결합하게 되고, 소스(22a) 및 드레인(22b) 사이의 채널 영역에 전류가 흐르게 됨으로써, 검출이 가능하다.

이와 같이 본 발명은, 큰 전기적 신호를 발생시킬 수 있는 금(Au)-SH의 결합을 타겟의 결합의 여부와 그 양에 따라서 일어나게 함으로써, 보다 정확한 검출이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예

실시예 1 : DNA 프로브의 고정 및 타겟 DNA와의 혼성화

1. DNA 프로브의 고정화

도 2에 나타낸 바와 같이, 게이트는 산화층(24), 폴리실리콘층(25) 및 및 금속층(Au층)을 포함하고 있으며, p-채널 바이오 FET를 사용하였고, 레퍼런스 바이오 FET는 게이트 전극층 상에 금속층(Au층)을 포함하고 있지 않아 생체분자의 고정화가 일어나지 않도록 하였다.

먼저, 실리콘 기판 칩(31) 실리콘 산화막 패드위에 감마-아미노프로필트리에톡시실란 (GAPS)로 코팅후 PEG와 아미노기로 5'말단이 관능기화된 DNA를 다음과 같이 고정화 시켰다.

즉, 기판(31) 상에 GAPS를 스핀 코팅 후, 50 % DMSO를 포함하는 0.1M NaHCO₃ pH 9 용액 중의 6 mM PEG (Aldrich 사, 분자량 10,000)에 5'-말단이 아미노헥실기로 관능기화된 프로브 폴리뉴클레오티드 (5'-ATGACAATGAGTATGCCTA-3')를 각각 20 μM의 농도로 용해시켜서 막과 반응시킴으로써, 프로브의 고정이 일어나도록 하였다.

프로브를 고정화시킨 후, 프로브의 일부에 상보적이며 티올기를 포함하도록 변형된 DNA(이하,'허들 DNA'라고 함)(5'-SH-TAGGCATACTCATTG-3')를 상기 프로브와 혼성화 반응시켰다. 이 때 바이오 FET는 다른 채널에서 밸브를 통해서 막혀있으므로 티올기를 포함한 변형된 상기 허들 DNA가 바이오 FET의 게이트 표면에 붙는 것을 방지 시켰다. 혼성화 후 프로브와 반응하지 않은 허들 DNA를 세척을 통해서 제거했다.

2. 타겟 DNA와의 혼성화

상기 프로브가 고정화 되어있는 실리콘 산화막 패드를 포함한 미세유로와, 바이오 FET와 레퍼런스 BioFET을 포함하고 있는 미세유로 사이 밸브를 열어서 서로 통하게 한 뒤 1uM 농도의 타겟 DNA(5'-TAG GCA TAC TCA TTGTCAT-3')를 주입시켰다.

3. 미스매치 타겟과의 혼성화

상기 프로브가 고정화 되어있는 실리콘 산화막 패드를 포함한 미세유로와, 바이오 FET와 레퍼런스 BioFET을 포함하고 있는 미세유로 사이 밸브를 열어서 서로 통하게 한 뒤 1uM 농도의 미스매치 타겟 DNA를 (5'-TGT TCT CTT GTC TTG-3') 주입 시켰다.

4. 측정 방법

Kiethley 4200 parameter analyzer를 사용하여 전압을 인가하고 바이오 FET의 전류변화를 측정하였다. 기준 전극을 통해 게이트에 -2 V의 전압을 인가하고, 드레인과 소스 사이에도 -2V의 전압을 인가한 후 드레인과 소스 사이의 전류를 측정했다.

상기 1.-4.의 과정을 3회 반복 실험하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같았다.

	미스매치 주입	완전 매치 주입
실험 1	11μA	20μA
실험 2	2μA	25μA
실험 3	32μA	60μA

상기 3 회의 실험치의 평균값을 내어 도 4에 나타내었다. 이 때, 각 칩에는 바이오 FET와 게이트 표면에 금속층 (Au 층)을 포함하고 있지 않는 레퍼런스 바이오 FET가 형성되어 있다. 레퍼런스 바이오 FET는 Au층을 포함하고 있지 않아, 티올기를 갖는 DNA와의 고정화가 일어나지 않는다. 도 4에서와 같이, 레퍼런스 바이오 FET의 경우 미스매치와 타겟 DNA주입시 전류의 변화량이 미세한데 반해, Au층을 포함하고 있는 바이오 FET의 경우, 미스매치 DNA반응은 미세하지만 매치 타겟 DNA와의 반응 시 약 20 uA 이상의 전류 증가 있었다.

실시예 2: 리포좀을 이용한 검출 방법

1. DNA 프로브의 고정화

도 3에 나타낸 바와 같이, 게이트는 산화층(24), 폴리실리콘층(25) 및 및 금속층(Au층)을 포함하고 있으며, p-채널 바이오 FET를 사용하였고, 레퍼런스 바이오 FET는 게이트 전극층 상에 금속층(Au층)을 포함하고 있지 않아 생체분자의 고정화가 일어나지 않도록 하였다.

Au층 게이트 표면에 티올-변형된 프로브 DNA(5'-SH-ATGACAATGAGTATGCCTA -3')를 SAM (self assembly monolayer) 방법으로 고정화 시켰다.

2. 타겟 DNA와의 혼성화

리포좀-에폭시를 5'말단 아민에 부착시킨 타겟 유전자 (리포좀-에폭시-NH₂-TAG GCA TAC TCA TTGTCAT-3')를 주입하였다. 리포좀은 머캡토헥산올을 (MCH)를 포함하고 있다.

상기 주입된 타겟 유전자를 프로브 DNA와 40℃에서 3 시간 동안 반응시켜 혼성화시켰다.

3. 리포좀 파괴

메탄올을 주입하여, 리포좀을 파괴시켰다.

이와 같은 방법에 의한 실험을 실시한 후, 실시예 1에서와 같은 방법으로 전류 값을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서도 알 수 있는 바와 같이, 전류 변화는, 머캡토헥산올을 포함하고 있는 리포좀-에폭시가 연결되어있는 아민 변형된 매치 타겟 유전자를 고정화된 프로브 유전자와 혼성화 후, 리포좀을 파괴시켜 나온 머캡토헥산올에 의해서 일어나 게 된다. 리포좀 연결된 타겟 유전자 주입후 메탄올을 주입하여 리포좀 파괴 후 약 40uA 의 전류 증가를 확인할 수 있었다.

상기와 같은 실험 결과를 토대로 하여, 리포좀에 타겟이 아닌 제 2의 프로브를 결합시켜서 넣어 준 후, 타겟을 주입하여, 도 3과 같은 샌드위치 형태의 결합이 일어나게 한 후, 삼투압 차이에 의해 리포좀을 파괴하여 전류 변화를 측정함으로써 타게 유전자 유무를 확인하는 것도 가능함을 알 수 있다.

상기한 설명에서 많은 사항이 구체적으로 기재되어 있으나, 그들은 발명의 범위를 한정하는 것이라기보다, 바람직한 실시예의 예시로서 해석되어야 한다. 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 의하여 정하여 질 것이 아니고 특허 청구범위에 기재된 기술적 사상에 의해 정하여져야 한다.

본 발명에 의하여 전해질 용액 내에서 바이오 FET를 사용하여 생체분자를 검출하는 방법은, 신호증폭 효과가 크고, 신호대 잡음비를 증가시킴으로써 높은 재현성 및 정확성을 가지고 측정할 수 있다.

Claims

전해질 용액 내에서 바이오 FET(field effect transistor)를 이용한 생체분자 검출 방법에 있어서,

(a) 바이오 FET의 게이트 표면에 금(Au)을 포함하는 층을 형성하는 단계;

(b) 게이트와 떨어져 있는 기판 상에 고정된 프로브와, 그 프로브에 불완전 하게 결합된 티올기(-SH)-포함 생체분자를 형성하는 단계;

(c) 상기 프로브와 타겟 분자가 포함된 시료를 반응시키는 단계; 및

(d) 상기 바이오 FET의 소스 및 드레인 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계;

를 포함하는 생체분자 검출 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로브 또는 타겟이, DNA, RNA, 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생체분자가, DNA, RNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로브와 상기 타겟 분자와의 결합력이, 상기 프로브와 상기 티올기-포함 생체분자와의 결합력보다 강한 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계가, 상기 프로브와 상기 타겟 분자의 결합이 형성됨으로써, 티올기-포함 생체분자가 프로브로부터 분리되는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (d) 단계의 전류의 흐름이, 상기 생체분자의 티올기와 상기 게이트 표면의 금(Au)의 결합에 의해 생성되는 것임을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
전해질 용액 내에서 바이오 FET를 이용한 생체분자 검출 방법에 있어서,

(a) 게이트 표면에 형성된 금(Au)을 포함하는 층에 제 1 프로브를 고정화하는 단계;

(b) 티올기(-SH)-포함 화합물이 함유된 리포좀이 부착된 제 2 프로브를 제공하는 단계;

(c) 타겟 분자가 포함된 시료를 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 반응시킨 후 세척하는 단계;

(d) 리포좀을 파괴하는 단계; 및

(e) 상기 바이오 FET의 소스 및 드레인 사이의 채널 영역에 흐르는 전류 값을 측정하는 단계;

를 포함하는 생체분자 검출 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 타겟이, DNA, RNA, 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 타겟의 일부는 제 1 프로브에 상보적이며, 타겟의 또 다른 일부는 제 2 프로브에 상보적인 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 7 항에 있어서 상기 티올기-포함 화합물은 머캡토헥산올, 또는 시스테인인 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (d) 단계의 리포좀 파괴가, 삼투압의 차이를 형성함으로써 수행하는 것을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 (e) 단계의 전류의 흐름이, (d) 단계에서의 리포좀의 파괴에 의해 방출된 화합물들의 티올기와 상기 게이트 표면의 금(Au)의 결합에 의해 생성되는 것임을 특징으로 하는 생체분자 검출 방법.