JP2004531544A - ペンタペプチド化合物及びそれに関する使用 - Google Patents

Abstract

ペンタペプチド化合物を開示する。該化合物は生物学的活性、例えば細胞毒性を有する。標的基及びペンタペプチド部分を有するプロドラッグ、並びにその前駆体も開示する。例えば、標的剤、例えば抗体に結合するための反応性部位として機能し得る反応性リンカーを有する前駆体を開示する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は米国特許出願第10/001.191号、2001年11月1日出願の部分継続出願であり、その出願は米国特許出願第09/845,786号、2001年4月30日出願の部分継続出願であって、それらの開示事項についてはその全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【０００２】
本発明は生物学的に活性な有機化合物及びその前駆体、より特異的に述べるならばペンタペプチド、ならびにそれらのペンタペプチドを含有する組成物、ならびにそれらの、例えば細胞傷害剤としての使用方法に向けられたものである。
【背景技術】
【０００３】
天然の起源からいくつかの短いペプチド化合物が単離され、それらに生物活性があることが見出された。それらの化合物の類似体も調製され、そのいくつかについては生物活性が認められた。例えば、オーリスタチンE (Auristatin E) (Pettit, G. R., Barkoczy, J.「修飾フェネチルアミドを有する腫瘍阻害テトラペプチド」"Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides"米国特許第5,635,483号)は海洋の天然産物の合成類似体であり、ドラスタチン10、これはチューブリンの重合を抗癌剤であるビンクリスチンとチューブリン上の同じ部位に結合することによって阻害するものである(Pettit, G. R.「ドラスタチン」"The dolastatins" Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 1997,70,1-79)。ドラスタチン10、オーリスタチンPE、及びオーリスタチンEは4個のアミノ酸を含む直鎖状のペプチドで、それらのアミノ酸のうちの3個はこのクラスの化合物に独特なものである。ドラスタチン10及びオーリスタチンPEはともに現在ヒトでの臨床試験中である。これらの薬剤の構造的な相異はそのC末端の残基で、ドラスタチン10ではチアゾールフェネチルアミンであるがオーリスタチンEではノルエフェドリンユニットに置換されている。
【０００４】
下記の参照文献ではドラスタチン及びオーリスタチン化合物ならびにそれらの類似体について開示されている。
【０００５】
「抗腫瘍作用を有するドラスタチン10類似体としてのペプチド誘導体の調製」"Preparation of peptide derivatives as dolastatin 10 analogs with antitumor effects", Sakakibara, Kyoichi ; Gondo, Masaaki; Miyazaki, Koichi; Ito, Takeshi ; Sugimura, Akihiro; Kobayashi, Motohiro. (Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd., Japan; Sakakibara,Kyoichi; Gondo, Masaaki; Miyazaki, Koichi; Ito, Takeshi; Sugimura, Akihiro; Kobayashi, Motohiro). PCT国際特許公開 WO 9633212 Al (1996);
「癌阻害ペプチドとしてのドラスタチン10類似体の調製」"Preparation of dolastatin 10 analogs as cancer inhibitory peptides", Pettit, George R.; Srirangam, Jayaram K. (Arizona Board of Regents, USA). PCT国際特許公開 WO 9614856 Al (1996);
「抗癌剤としてのテトラ-及びペンタペプチド ドラスタチン類似体の調製」"Preparation of tetra-and pentapeptide dolastatin analogs as anticancer agents", Pettit, George R.; Srirangam, Jayaram K.; Williams, Michael D. (Arizona Board of Regents, USA). 欧州特許出願 EP 695757 A2 (1996);
「抗癌剤としてのドラスタチン10類似体ペンタペプチドアミド及びエステルの調製」"Preparation of dolastatin 10 analog pentapeptide amides and esters as anticancer agents", Pettit, George R.; Srirangam, Jayaram K. (Arizona Board of Regents, USA). 欧州特許出願 EP 695758 A2 (1996);
「抗癌剤としてのドラスタチン類似体ペンタペプチドメチルエステルの調製」"Preparation of dolastatin analog pentapeptide methyl esters as anticancer agents", Pettit, George R.; Williams, Michael D.; Srirangam, Jayaram K. (Arizona Board of Regents, USA). 欧州特許出願 EP 695759 A2 (1996);
「抗癌剤としての新規のペプチド誘導体の調製」"Preparation of novel peptide derivative as antitumor agent", Sakakibara, Kyoichi; Gondo, Masaaki ; Miyazaki, Koichi ; Ito, Takeshi; Sugimura, Akihiro; Kobayashi, Motohiro. (Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd., Japan). PCT国際特許公開 WO 9509864 Al (1995);
「抗癌剤としてのテトラペプチド誘導体の調製」"Preparation of tetrapeptide derivatives as antitumor agents", Sakakibara, Kyoichi; Gondo, Masaaki; Miyazaki, Koichi. (Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd., Japan). PCT国際特許公開 WO 9303054 Al (1993);
「抗悪性腫瘍剤 365。ドラスタチン10 SARプローブ」"Antineoplastic agents 365. Dolastatin 10 SAR probes", Pettit, George R.;Srirangam, Jayaram K.; Barkoczy, Jozsef ; Williams, Michael D.; Boyd, Michael R.; Hamel, Ernest; Pettit, Robin K.; Hogan, Fiona; Bai, Ruoli; Chapuis, Jean-Charles ; McAllister, Shane C.; Schmidt, Jean M., Anti-Cancer Drug Des. (1998), 13(4), 243-277;
「抗悪性腫瘍剤 337。ドラスタチン10の構造的修飾体の合成」"Antineoplastic agents. 337. Synthesis of dolastatin 10 structural modifications", Pettit, George R.; Srirangam, Jayaram K.; Barkoczy, Jozsef; Williams, Michael D.; Durkin, Kieran P. M.; Boyd, Michael R.; Bai, Ruoli; Hamel, Ernest; Schmidt, Jean M. ; Chapius, Jean-Charles, Anti-Cancer Drug Des. (1995), 10(7), 529-44; 及び
「新規のドラスタチン10類似体の合成と抗腫瘍活性」"Synthesis and antitumor activity of novel dolastatin 10 analogs", Miyazaki, Koichi; Kobayashi, Motohiro; Natsume, Tsugitaka; Gondo, Masaaki; Mikami, Takashi; Sakakibara, Kyoichi ; Tsukagoshi, Shigeru, Chem. Pharm. Bull. (1995), 43(10), 1706-18。
【発明の開示】
【０００６】
当分野ではよりすぐれた抗腫瘍剤が必要とされている。ドラスタチン10及びその類似体ではin vitroデータは有望であったが、臨床試験では治療薬としての作用を達成するために必要な投与量での顕著な全身毒性によってその有効性が減殺されている。本発明はこのような要求を満たそうとするものであり、本明細書中に開示するようなさらなる利点を提供する。
【０００７】
本出願の第2節中に記載の参照文献の記載はその参照文献が本出願の先行技術であると認めたものではない。
【０００８】
本発明の要旨
1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化１】

【０００９】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００１０】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴はR⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
R⁹は、
【化２】

【００１１】

【００１２】
（式中、
R¹⁰は
【化３】

【００１３】
から選択され、
R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択されるものであり、
R¹³は
【化４】

【００１４】
であり、
R¹⁴は直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され、
R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択され、
R¹⁶はアリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-（pは1−5である）から選択され、
R¹⁷は
【化５】

【００１５】
（YはOまたはSである）から選択される。）
から選択される。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化６】

【００１６】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００１７】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、それぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、そして
R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、R²⁰は単結合または二重結合によって"x"と標識される炭素に結合できる。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化７】

【００１８】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００１９】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、それぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、そして
R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、R²⁰は単結合または二重結合によって"x"と標識される炭素に結合できる。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化８】

【００２０】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００２１】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化９】

【００２２】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００２３】
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化１０】

【００２４】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００２５】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、そして
R¹⁸は水素、ヒドロキシル保護基、及びO R¹⁸が＝Oを表すような直接の結合、から選択される。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化１１】

【００２６】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００２７】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
R¹⁹はヒドロキシ-及びオキソ-置換低級アルキルから選択される。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化１２】

【００２８】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【００２９】
［式中、それぞれの位置において独立して
R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R²は水素及び低級アルキルから選択され、
R³は低級アルキルであり、
R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
R⁹は
【化１３】

【００３０】
（式中、
R¹⁰は
【化１４】

【００３１】
から選択され、
R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、それぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、
R¹⁴は直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され、
R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択される。）
から選択される。］
場合によって、R⁹は
【化１５】

【００３２】
であり、R¹⁰は
【化１６】

【００３３】
である。
【００３４】
場合によって、R⁹は
【化１７】

【００３５】
であり、R¹⁰は
【化１８】

【００３６】
である。
【００３７】
場合によって、R⁹は
【化１９】

【００３８】
であり、R¹⁰は
【化２０】

【００３９】
である。
【００４０】
場合によって、R⁹は
【化２１】

【００４１】
であり、R¹⁰は
【化２２】

【００４２】
である。
【００４３】
別の1態様においては、本発明は上述の生物学的活性を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、及び製薬上許容し得る担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含んでなる組成物を提供する。
【００４４】
別の1態様においては、本発明は細胞を殺滅させる方法を提供し、その方法は上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の致死量を細胞に投与することを含んでなる。
【００４５】
別の1態様においては、本発明は細胞を殺滅させる方法を提供し、その方法は、
a. 上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物を細胞に送達して、該化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物を細胞内に侵入させ；
b. mAbを該化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の残存部分から切断し；
c. 該化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の該残存部分を用いて細胞を殺滅させる、ことを含んでなる。
【００４６】
別の1態様においては、本発明はヒトまたはその他の動物の体内の腫瘍細胞または癌細胞を殺滅させる、またはその増殖を阻害する方法を提供し、その方法は、該ヒトまたは動物に治療上有効な量の上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物を投与することを含んでなる。
【００４７】
また別の1態様においては、本発明は細胞を殺滅する、またはその増殖を阻害する方法を提供し、その方法は：
a. 本発明の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは上述の組成物を細胞に送達し、該化合物を細胞内に侵入させ；
b. 抗体を該化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の残存部分から切断し、
c. 該化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の該残存部分を用いて細胞を殺滅させる、ことを含んでなる。
【００４８】
また別の1態様においては、本発明はヒトまたはその他の動物の体内の腫瘍細胞または癌細胞を殺滅させる、またはその増殖を阻害する方法を提供し、その方法は、上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の有効量をそれを必要とするヒトまたはその他の動物に投与することを含んでなる。
【００４９】
別の1態様においては、本発明は癌を治療する方法を提供し、その方法は、上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の有効量をそれを必要とするヒトまたはその他の動物に投与することを含んでなる。
【００５０】
また別の1態様においては、本発明は自己免疫抗体を産生する細胞を殺滅させる、またはその増殖を阻害する方法を提供し、その方法は、上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の有効量をそれを必要とするヒトまたはその他の動物に投与することを含んでなる。
【００５１】
また別の1態様においては、本発明は自己免疫疾患を治療する方法を提供し、その方法は、上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の有効量をそれを必要とするヒトまたはその他の動物に投与することを含んでなる。
【００５２】
さらに別の1態様においては、本発明は感染性疾患を治療する方法を提供し、その方法は、上述の化合物またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物、あるいは組成物の有効量をそれを必要とするヒトまたはその他の動物に投与することを含んでなる。
【００５３】
本発明のこれらの態様及び関連する態様はより詳細に下記に述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明の態様は多数あるが、その中でも本発明は生物活性、例えば細胞毒性を有する短いペプチドを含有する化合物、及びそれらの化合物の例えば癌治療における使用方法を提供する。本発明の化合物について説明する前に、本明細書中に用いている下記の定義について述べる。
【００５５】
定義
本明細書で用いている下記の用語はここに示した意味である：
「被験動物」としては、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、及びネコが含まれる。家禽を含むトリも適切な被験動物である。
【００５６】
「アリール」とは、コンジュゲートされたπ電子系を有する少なくとも1つの環を有する芳香族を意味し、それには炭素環アリール及びヘテロ環アリールが含まれる。本発明の特別な態様においては、該アリール基(及び下記に示すアリーレン基)は1個以上の芳香環の一部として5〜14、または6〜12、または6〜10個の原子を有する。1態様においては、該アリールまたはアリーレンは炭素環式化合物である。「炭素環アリール」とは、芳香環の環を形成する原子が全て炭素原子である芳香族を意味する。炭素環アリール基としてはモノサイクリック炭素環アリール基及びポリサイクリック基が含まれ、それらの全ては任意で置換することができる。代表的な置換炭素環アリール基としては、インデン及びフェニルを1個以上の低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロ、及びシアノなど置換基、またはそれらから選択されたもので置換したものが含まれる。「ヘテロ環アリール」、これは「ヘテロアリール」とも呼ばれるが、これは1から9個の炭素原子を有し、残りの原子がヘテロ原子であるアリール基を意味し、そのようなものとしては、「化学と物理のハンドブック」"Handbook of Chemistry and Physics," 第49版, 1968, R. C. Weast編; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH中に記載されているヘテロ環系が含まれる。特に、Section C, 「有機化合物命名法 B.基本的なヘテロ環系」Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systemsを参照せよ。適切なヘテロ原子としては、酸素、窒素、及びS(O)_iが含まれ、このiは0、1、または2である。ヘテロアリール基の適切な例としては、限定はされないが、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドール、ベンゾピラゾール、クマリン、イソキノリン、ピロール、チオフェン、フラン、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、キノリン、ピリミジン、ピリジン、ピリドン、ピラジン、ピリダジン、イソチアゾール、イソキサゾール、及びテトラゾールが含まれる。「アリール基」はもう一つの別の基と結合するが、「アリーレン」は別の2つの基と結合するアリール基を意味する。例えば、フェニル
【化２３】

【００５７】
はアリール基であり、パラフェニレン
【化２４】

【００５８】
はアリーレン基の一例である。その他のアリーレン基としてはオルト-またはメタ-フェニレン及びナフタレンがある。
【００５９】
「アリーレン(低級アルキレン)」とはアリーレン基とアルキレン基から形成された基を意味し、それは共同して別の2つの基と結合する。例えば、X-アリーレン(低級アルキレン)-Yではアリーレンアルキレン基はX及びYと結合し、それは低級アルキレン、例えばメチレン(-CH₂)及びアリーレン(例えば、
【化２５】

【００６０】
）から形成されてアリール(低級アルキレン)、例えば
【化２６】

【００６１】
が作製される。
【００６２】
「炭素環式化合物」とは、環を形成する原子が炭素である、飽和、不飽和または芳香族モノサイクリック環を意味する。C_5-7炭素環式化合物とは、環を形成する5、6、または7個の炭素原子を有する全ての炭素環式化合物を意味する。そのような炭素環式化合物の例としては、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、及びフェニルが含まれる。
【００６３】
「式の化合物」、「構造の化合物」、「本発明の化合物」などの用語中に用いられている「化合物」とは、化学的化合物それ自体、ならびに、明白に言明されているか否かにかかわらず、また文脈で下記のものを除外すると明確に述べられていない限りは、下記のものを意味し、及び包含する：化合物の非晶質及び結晶の形態のもの(これらの形態が混合物の一部としてまたは別々になったものとして存在する多型性のものをも含む)；該化合物の遊離酸及び遊離塩基の形態のもの、これは典型的には本明細書で提示した構造で示された形態である；該化合物の異性体、これは光学異性体、及び互変異性体を意味し、ここで光学異性体にはエナンチオマー及びジアステレオマー、キラル異性体及び非キラル異性体、ならびに光学異性体には単離された光学異性体と、ラセミ及び非ラセミ混合物を含む光学異性体の混合物を含む；ここで異性体は単離された形態で、または1種以上の他の異性体と混合された形態のものの場合がある；該化合物の同位体、それには重水素-及びトリチウム-含有化合物が含まれ、また、治療上及び診断上有効な放射性同位体を含む放射性同位体が含まれる；該化合物の多量体、それには二量体、三量体、その他の形態が含まれる；該化合物の塩、好ましくは製薬上許容し得る塩、それに酸付加塩及び塩基付加塩が含まれ、有機の対イオン及び無機の対イオンを有する塩が含まれ、両性イオンの形態、ある化合物が2個以上の対イオンと会合している場合には2個以上の対イオンは同じものであっても異なるものであってもよい；ならびに化合物の溶媒化合物、それには半溶媒化合物、モノ溶媒化合物、ジ溶媒化合物その他が含まれ、有機溶媒化合物及び無機溶媒化合物が含まれ、該無機溶媒化合物には水和物が含まれる；ある化合物が2種以上の溶媒分子と会合している場合には、その2種以上の溶媒分子は同じものであっても異なるものであってもよい。場合によっては本明細書で言及している本発明の化合物には、上述の形態うちの1種、例えば塩及び溶媒化合物などを明確に言及していることもあるが、このような言及は単に強調するために行っているものであり、上記で定義したような他の形態のものを排除することは意図していない。
【００６４】
「直接の結合」とは、隣接する2個の原子を結びつけている一対の電子対を意味する。従って、2個の原子が1つの直接の結合で隔てられている場合は、それらの2個の原子は共有結合によって結びつけられている。1個の直接の結合が1個の原子(X)にのみ付いておりXが隣接する原子(Y)と結合している場合には、その直接の結合とはXとYの間の第2の結合を示す、すなわちその直接の結合は、そうでなければYに結合している水素が取り除かれてXとYとの間の二重結合となる。例えば、C-O-RであってRが直接の結合であればC=Oを示す。
【００６５】
「ヒドロキシル保護基」としては、限定はされないが、メトキシメチルエーテル、2-メトキシエトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、ベンジルエーテル、p-メトキシベンジルエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、t-ブチルジメチルシリルエーテル、トリフェニルメチルシリルエーテル、酢酸エステル、置換された酢酸エステル、ピバル酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、及びp-トルエンスルホン酸塩が含まれる。
【００６６】
「それぞれの位置において独立して」及び「それぞれ独立して」は同義語であり、選択する場合は全てその他の選択とは独立に行うことを意味する。例えば、ある変動物が2つのオプションから選択され、その変動物が2回出現する場合には、1つの出現で選択されたオプションは、その変動物の第2回目の出現の際に選択されるオプションをどう選ぶかについてなんの影響も与えない。
【００６７】
「脱離基」とは、別の官能基で容易に置換されうる官能基を意味する。好ましい脱離基は求核剤によるS_N2置換によって置き換えられるものである。そのような脱離基は当分野ではよく知られており、そのようなものとしてはハロゲン化物(例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、メタンスルホン酸塩(メシラート)、p-トルエンスルホン酸塩(トシラート)、トリフルオロメタンスルホン酸塩、及びトリフルオロメチルスルホン酸塩が含まれる。
【００６８】
「低級アルキル」とは、直鎖状または分岐のある鎖、環状または非環状、一価の飽和炭化水素、ハロ炭素、または1から10個の炭素原子のヒドロハロ炭素ラジカルを意味する。種々の態様においては、該低級アルキル基は1〜8個、1〜6個、1〜5個、または1〜4個の炭素を有する。従って、該アルキル基は任意でハロゲン置換したものとすることができ、それではハロ炭素は炭素とハロゲンのみを含有し、ヒドロハロ炭素は炭素、ハロゲン、及び水素を含有する。代表的な低級アルキル基としては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが含まれる。「低級アルキレン」とは、2つの基と結合している低級アルキル基を意味し、それは例えば(-CH₂-)_1-8、(-CH₂-)_1-6、(-CH₂-)_1-5、または(-CH₂-)_1-4である。例えば、メチル(-CH₃)は低級アルキル基であり、メチレン(-CH₂-)は低級アルキレン基である。ヒドロキシ、またはオキソ置換低級アルキルとは、低級アルキル基の1個の水素が-OHで置換されている低級アルキル基(ヒドロキシ置換低級アルキルの場合)、または低級アルキル基の1個の炭素上の2個の水素が=Oで置換されているもの(オキソ置換低級アルキルの場合)を意味する。
【００６９】
本明細書で用いている「抗体」という用語は免疫グロブリン分子、または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち対象の標的またはその一部分の抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含んでいる分子を意味し、そのような標的としては、限定はされないが、癌細胞または自己免疫疾患に関連の自己免疫抗体を産生する細胞が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子はどのようなタイプのもの(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、どのようなクラスのもの(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)、または免疫グロブリンサブクラスのものであってもよい。本発明で用いられる抗体は好ましくはモノクローナルなもので、そして、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、双特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が含まれ、これらのいずれかの単鎖抗体、sFv、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、Fab発現ライブラリによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及びエピトープ結合フラグメントであって癌細胞抗原、ウイルス抗原、及び微生物抗原と免疫特異的に結合するものが含まれる。
【００７０】
本明細書の化学構造中で用いている短い略号「mAb」には、いかなる抗体をも包含し、すなわち、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分のいかなるものをも包含する。
【００７１】
本明細書で用いている「ウイルス抗原」という用語には、限定はされないが、免疫応答を引き出すことのできるウイルスペプチド、ポリペプチド、タンパク質(例えば、HIV gp120、HIV nef、RSV F糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、HTLV tax、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(例えば、gB、gC、gD、及びgE)ならびにB型肝炎表面抗原)の全てが含まれる。本明細書で用いている「微生物抗原」という用語は、限定はされないが、免疫応答を引き出すことのできる微生物ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、多糖、または脂質分子(例えば、細菌、真菌、病原性原虫、または酵母のポリペプチドでそれには、例えば、LPS及び莢膜多糖5/8)が含まれる。
【００７２】
「製薬上許容し得る塩」及び「その塩」とは、製薬上重要な分子の有機または無機の塩を意味する。製薬上許容し得る塩としては、酢酸イオン、コハク酸イオン、またはその他の対イオンなどの別の1分子を含む形のものが含まれる。該対イオンは親の化合物の電荷を安定化させるような有機または無機の部分とすることができる。さらに、製薬上重要な有機分子はその構造中に2個以上の荷電された原子を有するものとすることができる。多価に荷電された原子が該分子の一部となっている場合には複数の対イオンを有するものとすることができる。従って、製薬上許容し得る塩の分子は1個もしくは2個以上の荷電原子を含んだものとすることができ、また1個または2個以上の対イオンをも含んだものとすることができる。所望の電荷の分布は薬剤の投与方法に従って定められる。製薬上許容し得る塩の例は当分野ではよく知られており、本発明の範囲としてはそれらに限定されないが、代表的なものはPhysician's Desk Reference、The Merck Index、Tha Pharmacopoeia 及びGoodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics中に見出すことができる。そのような塩は典型的には酸付加塩、すなわちあるペンタペプチド化合物に酸を加えて形成させた塩、または塩基付加塩、すなわちあるペンタペプチド化合物に塩基を加えて形成させた塩である。本発明のペンタペプチド化合物は少なくとも1個のアミノ基を有しており、従って酸付加塩はこのアミノ基と形成されうるものであり、その酸付加塩とは該アミノ酸の遊離塩基の生物学的有効性と特性を保持しかつ生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではないような塩を意味し、そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、及び類似のものなどの無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、アスコルビン酸、コハク酸、ゲンチシン酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、パモ酸（pamoic acid）、及び類似のものなどの有機酸と形成されたものである。
【００７３】
アミノ部分を含んでいる本発明の組成物中に含まれる化合物は、上述の酸に加えて種々のアミノ酸と製薬上または化粧品製造上許容し得る塩を形成することができる。本発明の組成物に含まれている化合物であって酸性のものは種々の製薬上許容し得るカチオンと塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、とりわけ、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム、及び鉄塩が含まれる。
【００７４】
「製薬上許容し得る溶媒化合物」とは、溶媒と本発明の化合物の会合したものであって、本発明の生物学的に活性のあるペンタペプチド化合物の生物学的な有効性と特性を保持している溶媒化合物を意味する。製薬上許容し得る溶媒化合物を形成する溶媒の例としては、限定はされないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが含まれる。当業者であれば溶媒和された形態が溶媒和されていない形態と生物学的に同等であって、本発明の範囲内に包含することが意図されていることを理解することとなろう。Sykes, RA., 「有機化学のメカニズムへのガイドブック」"Guidebook to Mechanism in Organic Chemistry", 第6版(1986, John Wiley & Sons, N.Y.)は溶媒化合物について記述している代表的な参照文献である。
【００７５】
癌について述べている場合には、「治療する」という用語は、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍細胞の複製を阻害すること、腫瘍負荷を全体として軽減させること、及び癌に伴う1種以上の症状を改善すること、のうちのいずれかまたは全てを含んでいる。
【００７６】
自己免疫疾患について述べている場合には、「治療する」という用語は、自己免疫抗体を産生させることのできる細胞の複製を阻害すること、自己免疫抗体の負荷を軽減させること、及び自己免疫疾患に伴う1種以上の症状を改善すること、のうちのいずれかまたは全てを含んでいる。
【００７７】
感染性疾患について述べている場合には、「治療する」という用語は、感染性物質の複製を阻害すること、感染性物質の負荷を軽減させること、及び感染性疾患に伴う1種以上の症状を改善すること、のうちのいずれかまたは全てを含んでいる。
【００７８】
下記の略号が本明細書中で用いられ、それらはここに示した定義である：t-Bocはtert-ブトキシカルボニル、DCCはジシクロヘキシルカルボジイミド、DIADはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、Fmocは9-フルオレニルメトキシカルボニル、DEPCはシアノリン酸ジエチル、DMAPは4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン、PyBropはブロモ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、TEAAは酢酸トリエチルアンモニウム、TFAはトリフルオロ酢酸、及びZはベンジルオキシカルボニルである。
【００７９】
「R²⁰は、標的部分と反応可能な反応性部位を有する反応性リンカーである」というフレーズ中で、「反応性部位」とはリガンドと反応してそのリガンドと反応性リンカーとの間に共有結合を作ることのできる機能性部分を意味する。本発明の1態様においては、該反応性部位は、チオール、アミノ、及びヒドロキシル、好ましくはチオール及びアミノから選択された官能基と反応する。チオール基とアミノ基は双方ともタンパク質中に存在し、チオール基は例えば、タンパク質中のジスルフィド結合の還元によって作られ、アミノ基は例えば、タンパク質のリジン部分に存在する。
【００８０】
本発明の好ましい1態様においては、該反応性リンカーはチオール基と反応する反応性部位を有する。例えば、その反応性部位は式
【化２７】

【００８１】
のマレイミドとすることができ、この式で炭素-炭素の二重結合は求核基、例えばチオール基と反応する。あるいはまた、その反応性部位は式
【化２８】

【００８２】
を有するものとすることができ、この式でXは、求核基、例えばタンパク質上で見られるようなチオール基で置換することのできる脱離基である。
【００８３】
本発明の別の好ましい1態様においては、該反応性リンカーはアミンまたはアミノ基と反応する反応性部位を含んでいる。適切なアミン反応性部位としては、限定はされないが、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルなどの活性化されたエステル、ならびにイソチオシアネート、イソシアナート、無水物、酸塩化物、及びスルホニルクロリドなどのその他の反応性の官能基が含まれる。これらの官能基は本発明の反応性リンカーのための反応性部位を提供する。
【００８４】
本発明の多数の化合物は下記の一般式のノルエフェドリン部分を有する：
【化２９】

【００８５】
1実施形態においては、該化合物のノルエフェドリン部分は下記に示すような(1S, 2R)の立体化学的配置を取る：
【化３０】

【００８６】
別の実施形態においては、該化合物のノルエフェドリン部分は(1S, 2S)、(1R, 2S)、または(1R, 2R)の立体化学的配置を取る。
【００８７】
化合物
1態様においては、本発明は一般構造として「薬剤-リンカー-ターゲティング作用物」とあらわされる化合物を提供し、ここで該薬剤は本明細書で開示しているとおりペンタペプチドであり、該ターゲティング作用物は抗体である。当業者であれば理解しうるように、このような化合物は通常は抗体コンジュゲートまたは抗体治療用薬剤コンジュゲートとして知られている。そのような化合物は下記の構造を有し、本明細書ではプロドラッグとも呼ばれる。
【化３１】

【００８８】
(及びこれの製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物)
この構造でそれぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、またはR⁴とR⁵が共同して部分式-(CR^aR^b)_n-の炭素環式化合物を形成し、この式でR^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択されたものであり、nは2、3、4、5、及び6から選択されたものであり；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R⁹は、
【化３２】

【００８９】

【００９０】
から選択され；R¹⁰は、
【化３３】

【００９１】
から選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択されるものであり；R¹³は、
【化３４】

【００９２】
であり；R¹⁴は、直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され；R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択され；R¹⁶はアリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、ここでpは1−5であり；R¹⁷は、
【化３５】

【００９３】
から選択され、ここでYはOまたはSである。
【００９４】
本発明の任意の実施形態は以下のようなものがある：R¹は水素である；R¹及びR²はメチルである；R³はイソプロピルである；R⁴は低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、R⁵は水素及びメチルから選択される；R⁴は低級アルキルから選択され、R⁵は水素及びメチルから選択される；R⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成する；R⁶は低級アルキルである；R⁸は水素である。
【００９５】
別の任意の実施形態においては、R⁹は
【化３６】

【００９６】
であり、R¹⁰は
【化３７】

【００９７】
から選択される。1実施形態においては、R¹⁰は
【化３８】

【００９８】
であり；別の1実施形態においては、R¹⁰は
【化３９】

【００９９】
である。
【０１００】
好ましい1実施形態においては、R¹⁴はアリーレン及び低級アルキレンから選択され；R¹⁵は低級アルキル及びアリールから選択され；R¹⁶は低級アルキレンである。
【０１０１】
別の任意の1実施形態においては、R⁹は
【化４０】

【０１０２】
であり、R¹⁰は
【化４１】

【０１０３】

【０１０４】
から選択される。好ましい1実施形態においては、R¹⁴はアリーレン及び低級アルキレンから選択され；R¹⁵は低級アルキル及びアリールから選択され；R¹⁶は低級アルキレンである。
【０１０５】
別の任意の1実施形態においては、R⁹は
【化４２】

【０１０６】
であり、R¹³は
【化４３】

【０１０７】
である。好ましい1実施形態においては、R¹⁵は低級アルキルであり；R¹⁶は低級アルキレンである。
【０１０８】
別の任意の1実施形態においては、R⁹は
【化４４】

【０１０９】
である。好ましい1実施形態においてはR¹⁶は低級アルキレンである。
【０１１０】
別の任意の1実施形態においては、R⁹は
【化４５】

【０１１１】
である。好ましい1実施形態においては、R¹⁶は低級アルキレン及びアリーレンから選択される。
【０１１２】
1実施形態においては、R¹⁷は
【化４６】

【０１１３】
である。別の1実施形態においては、R¹⁷は
【化４７】

【０１１４】
である。別の1実施形態においては、R¹⁷は
【化４８】

【０１１５】
であり、ここでYはOまたはSである。
【０１１６】
例えば、本発明は以下の式のプロドラッグ、
【化４９】

【０１１７】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１１８】
さらに、本発明は以下の式のプロドラッグを提供する。
【化５０】

【０１１９】
さらに、本発明は以下の式のプロドラッグ、
【化５１】

【０１２０】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１２１】
さらに、上述のプロドラッグに加えて、本発明はプロドラッグを調製するために用いることのできる中間体の化合物をも提供する。それらの中間体化合物は反応性リンカー基R²⁰を含んでおり、そのR²⁰が標的部分、例えばmAbと反応することができるように反応性部位を有している。
【０１２２】
1態様においては、本発明は以下の式の中間体化合物、
【化５２】

【０１２３】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１２４】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、ここでR²⁰は単結合または二重結合のいずれかで"x"と標識された炭素と結合したものとすることができる。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の中間体化合物、
【化５３】

【０１２５】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１２６】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、ここでR²⁰は単結合または二重結合のいずれかで"x"と標識された炭素と結合したものとすることができる。］
別の1態様においては、本発明は以下の式の中間体化合物、
【化５４】

【０１２７】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１２８】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、またはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。］
前述の中間体化合物のいずれかにおいて、さらに別の態様では、R²⁰は以下の式のヒドラゾン
【化５５】

【０１２９】
を含んでなり、この式でR¹⁴は、直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択されたものであり；R¹⁵は、水素、低級アルキル、及びアリールから選択され；R¹⁶は、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択されたもので、ここでpは1−5である。
【０１３０】
さらに、前述の中間体化合物のいずれかにおいて、さらに別の態様では、R²⁰は以下の式のヒドラゾン
【化５６】

【０１３１】
を含んでなり、この式でR¹⁴は、直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され；R¹⁵は、水素、低級アルキル、及びアリールから選択され；R¹⁶は、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、ここでpは1−5である。
【０１３２】
さらにまた、前述の中間体化合物のいずれかにおいて、さらに別の態様では、R²⁰は以下の式のヒドラゾン
【化５７】

【０１３３】
を含んでなり、この式でR¹⁶は、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、ここでpは1−5であり、xは炭素原子であり、また上述の各中間体の構造式中でxと記されたものと同じものである。
【０１３４】
前述したとおり、反応性リンカー基R²⁰には標的部分と反応することのできる反応性部位が含まれ、それによって間接的にその標的部分を薬剤に連結することができる。下記はR²⁰基の一部分とすることのできる代表的な反応性部位である。例えば、下記の反応性部位のいずれでも、完全なR²⁰構造を形成するために上述のヒドラゾン構造のいずれと連結させることもできる。1態様においては、R²⁰は以下の式
【化５８】

【０１３５】
を有する反応性部位を含んでなる。別の1態様においては、R²⁰は以下の式
【化５９】

【０１３６】
を有する反応性部位を含んでなり、この式でXは脱離基である。別の1態様においては、R²⁰は以下の式
【化６０】

【０１３７】
を有する反応性部位を含んでなり、この式でXは脱離基である。
【０１３８】
例えば、本発明は以下の式の中間体化合物、
【化６１】

【０１３９】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物、
［式中、R⁴はiso-プロピル及びsec-ブチルから選択され、R⁵は水素である。］
【化６２】

【０１４０】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物、を提供する。
【０１４１】
上述のプロドラッグに加えて、上述のとおりのそれに対する直接の前駆体、それらは中間体化合物と呼んでいるが、本発明はそれらの中間体化合物に対する前駆体をも提供する。本発明の1態様においては、これらの中間体化合物に対する前駆体はカルボニル基を有する。下記に詳述するとおり、カルボニル基はR²⁰基を有し、そのR²⁰基の一部として反応性部位を有する中間体化合物を調製するために都合よくヒドラジン誘導体と反応する。従って、さらなる1態様においては、本発明はこれらの中間体化合物のための前駆体を提供し、ここでそれらの前駆体はカルボニル基または容易に酸化されてカルボニル基となりうるヒドロキシル基のいずれかを有する。
【０１４２】
1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化６３】

【０１４３】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１４４】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、またはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁹はヒドロキシ-及びオキソ-置換低級アルキルから選択される。種々の任意の実施形態においては：R¹は水素であり；またはR¹及びR²はメチルであり；及び/または、R³はiso-プロピルであり;及び/またはR⁴は低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されたものであってR⁵は水素及びメチルから選択され；またはR⁴は低級アルキルから選択されたものであってR⁵は水素及びメチルから選択されたものであり；またはR⁴及びR⁵が共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；及び/またはR⁶は低級アルキルであり；及び/またはR⁸は水素であり；及び/またはR¹⁹は、オキソ-置換低級アルキルである。］
本発明のこの態様の代表的な化合物は
【化６４】

【０１４５】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物である。
【０１４６】
別の1態様においては、本発明は以下の式の化合物、
【化６５】

【０１４７】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１４８】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R⁹は、
【化６６】

【０１４９】
から選択され；R¹⁰は、
【化６７】

【０１５０】
から選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R¹⁴は直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され；R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択される。］
本発明のこの態様の種々の実施形態においては：R¹⁰は
【化６８】

【０１５１】
であるか；またはR¹⁰は
【化６９】

である。本発明のこの態様のいくつかの特別な化合物は下記の構造を有する化合物、
【化７０】

【０１５２】

【０１５３】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物であり、この式でR⁴はiso-プロピルまたはsec-ブチルであり、R⁵は水素である。
【０１５４】
本発明のさらに別の態様においては、下記の構造を有するペンタペプチドの薬剤を提供する。これらの構造において、該薬剤はR²⁰基を該分子中に導入するために任意でヒドラジン誘導体またはその他の反応基と直接的に反応しうるカルボニル基を含んだものとすることができる。従って、1実施形態においては、本発明は以下の式のペンタペプチド薬剤、
【化７１】

【０１５５】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１５６】
［式中、それぞれの位置において独立して：R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、またはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁸は水素、ヒドロキシ保護基、及び直接の結合、この場合はO R¹⁸は＝Oとなるが、これらから選択される。］
例えば、本発明は以下の式の化合物
【化７２】

【０１５７】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
別の1実施形態においては、本発明は以下の式のペンタペプチド薬剤、
【化７３】

【０１５８】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１５９】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁸は、水素、ヒドロキシ保護基、及び直接の結合、この場合はO R¹⁸は＝Oとなるが、これらから選択される。］
例えば、本発明は以下の式の化合物
【化７４】

【０１６０】

【０１６１】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供し、この式でR⁴はiso-プロピルであり、R⁵は水素である。
【０１６２】
別の1実施形態においては、本発明は以下の式のペンタペプチド薬剤、
【化７５】

【０１６３】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１６４】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁹はヒドロキシ-及びオキソ-置換低級アルキルから選択される。］
例えば、本発明は以下の式の化合物
【化７６】

【０１６５】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１６６】
さらに種々の実施形態においては、本発明のペンタペプチドは上記の3種類の一般構造のうちの１つを有しており、その構造で、R¹は水素であり；またはR¹及びR²はメチルであり；及び/または、R³はiso-プロピルであり;及び/またはR⁴は低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されたものであってR⁵は水素及びメチルから選択され；またはR⁴は低級アルキルから選択されたものであってR⁵は水素及びメチルから選択され；またはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；及び/またはR⁶は低級アルキルであり；及び/またはR⁸は水素であり；及び/またはR¹¹は水素であり；及び/または-OR¹⁸は=Oであり；及び/またはR¹⁹は、オキソ-置換低級アルキルである。
【０１６７】
一般的合成法
上記で詳述した種々の態様において、本発明は薬剤-リンカー-リガンドのコンジュゲート、ならびにその前駆体を提供する。本発明の薬剤-リンカー-リガンドコンジュゲートは、そのコンジュゲートを細胞、特に腫瘍細胞に送達された際にそのコンジュゲートがリガンドから薬剤を遊離する形で部分的に分解し、その際、リンカーからのいくつかの残基は薬剤に付着したままとなり、典型的にはリンカーのいくつかの残基はリガンドに付着したままの状態となる。次いでその薬剤(または薬剤-リンカー残基)は細胞毒性の作用で腫瘍細胞を殺滅するか、または少なくとも腫瘍細胞の増殖を低減させる。薬剤-リンカー-リガンドコンジュゲートはプロドラッグとすることがおそらく好ましい。該リガンドは典型的には、そのプロドラッグを腫瘍細胞の近傍に局在させることとなるターゲッティング部分である。
【０１６８】
該プロドラッグは下記の基本構造、
【化７７】

【０１６９】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物であり、該プロドラッグのリンカー-リガンド部分はそのa、b、またはcのいずれかの位置で薬剤と結合している。下記に詳述するとおり、このようなコンジュゲートはヘテロ二官能性リンカーを用いて都合よく調製される。本発明の好ましい1態様においては、そのヘテロ二官能性リンカーとしては、一方の末端がチオール受容体、すなわち、チオール基のイオウ原子がチオール受容体と共有結合を形成するようにチオール基と反応する化学的部分であるものが含まれる。チオール受容体は当分野ではよく知られており、代表的なチオール受容体基はマレイミド基及びハロアセタミド基である。チオール受容体基はリガンドの付着に好都合な部位を提供する。ヘテロ二官能性リンカーの好ましい1態様では、リンカーのもう一方の末端は、ヒドラジン基を有するものである。ヒドラジン基はヘテロ二官能性リンカーの末端基として有用であるが、それはヒドラジン基が容易にカルボニル基、すなわちアルデヒド及びケトン基と反応するからであり、そのカルボニル基は本明細書に開示しているとおりペンタペプチド内に容易に組み入れられヒドラゾン結合が作られる。コンジュゲート内へのヒドラゾンの組み入れは所望のpH感受性をコンジュゲートに付与するために特に好ましい。従って、酸性細胞内コンパートメント(例えば、リソソーム)中のような低pH条件下ではヒドラゾン基は切断されてリガンドから薬剤を放出する。好ましいリンカーは酸に不安定なリンカーで、低pH条件、すなわちpHが6未満、好ましくは5未満の条件下で切断されるものである。
【０１７０】
本発明の薬剤は一般的にはペンタペプチドとされるものである。典型的には、本発明のペンタペプチド薬剤は選択されたアミノ酸及び/もしくは修飾アミノ酸の間、ならびに/またはペプチド断片間にペプチド結合を導入することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野でよく知られている液相合成法(E. SchroderとK. Lubke, 「ペプチド」"The Peptides", 第1巻, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照せよ)で調製することができる。
【０１７１】
本発明のペンタペプチドを調製するための好ましい方法は、ジペプチド及びトリペプチドの調製、適切な縮合条件下でワンポット反応でこれらの2つの断片の化学量論的に等価な結合を必要とする。このアプローチは下記のスキーム1〜3に示している。このようにトリペプチド6はスキーム1で示すように調製することができ、ジペプチド9はスキーム2で示すように調製することができる。スキーム3に示すように2つの断片6と9は縮合させてペンタペプチド(10)を得ることができる。
【化７８】

【０１７２】
スキーム1に示すとおり、PG保護アミノ酸1(ここでPGとはアミン保護基を意味し、例えばベンジルオキシカルボニル(これは好ましいPGであり、本明細書ではZと示している)、R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、またはR⁴とR⁵が共同して部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される)の炭素環式化合物を形成し、t-ブチルエステル2(ここでR⁶は、水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルである)と、適切な縮合条件下、例えば、PyBropとジイソプロピルエチルアミンの存在下で、またはDCCを用いてカプルされる(例えば、Miyazaki, K.ら, Chem. Pharm. Bull. 1995, 43(10), 1706-1718が行ったように)。
【０１７３】
適切な保護基PG、及び会見の基を保護基で防護する適切な合成法法は当分野ではよく知られている。例えば、Greene, T. W.とWuts, P. G. M.,「有機合成での保護基」"Protective Groups in Organic Synthesis", 第2版, 1991, John Wiley & Sonsを参照せよ。保護されたアミノ酸で好ましいものはPG-Ileであり、特に好ましいのはPG-Valであるが、その他の適切な保護されたアミノ酸としては限定はされないが、PG-シクロヘキシルグリシン、PG-シクロヘキシルアラニン、PG-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸、PG-アルファ-アミノイソ酪酸、PG-フェニルアラニン、PG-フェニルグリシン、及びPG-tert-ブチルグリシンが含まれる。Z、すなわちベンジルオキシカルボニルは好ましい保護基である。Fmocは別の好ましい保護基である。好ましいt-ブチルエステル2はドライソロイシンt-ブチルエステルである。
【０１７４】
クロマトグラフィーで精製した後、例えばPGがベンゾイルオキシカルボニルの場合にはH₂とエタノール中に10%Pd-Cを含む液を用い、またはFmoc保護基の場合にはジエチルアミンを用いて、ジペプチド3の保護基を除去する。この結果得られたアミンはアミノ酸5と容易にペプチド結合を形成する(ここでR¹は、水素及び低級アルキルから選択されたものであり；R²は、水素及び低級アルキルから選択されたものであり；R³は、低級アルキルである)。市販のN,N-ジメチルバリンなどのN,N-ジアルキルアミノ酸はアミノ酸5として好ましいものである。その他のN,N-ジアルキルアミノ酸は既知の方法に従って還元的bisアルキル化によって調製することができる(例えば、Bowman, R. E, Stroud, H. H., J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340を参照せよ)。Fmoc-Me-L-Val及びFmoc-Me-L-グリシンはN-ものアルキル誘導体の合成のためのアミノ酸5として好ましい2種である。アミン4とアミノ酸5はトリエチルアミンを塩基として用い、カップリング試薬DEPCを用いて都合よく結合させてトリペプチド6が得られる。
【０１７５】
ジペプチド9は、スキーム2に示すとおり、例えばトリエチルアミンを添加したDEPCなどの、ペプチド化学ではよく知られた縮合剤を用いて、修飾されたアミノ酸t-Boc-ドラプロリン7(例えば、Pettit, G.R.ら, Synthesis, 1996, 719-725を参照せよ)を、市販の(1S, 2R)-ノルエフェドリン、L-もしくはD-フェニルアラニノール、または合成p-アセチルフェネチルアミン8(Shavel, J., Bobowski, G., 1969, 米国特許第3,445,518号)と縮合させることによって容易に調製することができる。
【化７９】

【０１７６】
スキーム3はトリペプチド6とジペプチド9とをお互いに連結させてペンタペプチド10を形成させる方法を示したものである。これらの2種類の断片の連結は、例えば、TFAを用いてBoc及びT-ブチルエステルの切断をそれぞれ容易にし、その後、例えば過剰な塩基(トリエチルアミンもしくは同等物)の存在下でDEPCもしくは類似のカップリング試薬を用いた縮合条件で行って所望の産物を中程度だが許容しうる収率で得ることができる。
【化８０】

【０１７７】
N-モノアルキルペンタペプチド10を得るためには、最後のカップリングの後にジエチルアミンで処理することによってN末端アミノ酸からFmoc基を除去しなければならない(下記の一般的方法Eを参照せよ)。
【０１７８】
a、b、及びcを適切に選択すれば、本発明は以下の式のペンタペプチド、
【化８１】

【０１７９】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供し、これらはa、b、及びcを適切に選択すれば本発明の薬剤となり、それらの薬剤は上述のとおり調製することができる。従って、本明細書で言及したとおり、本発明の薬剤は本発明のプロドラッグの分解産物と必ずしも同一でなくともよい。逆に、本発明の薬剤は上記の構造の、薬理学的に活性で、細胞毒性を有する化学物質であり、これらは本発明のプロドラッグを調製するために好都合であり、それらのプロドラッグは部分的に分解されて薬理学的に活性な作用物を放出することとなる。
【０１８０】
従って、1態様においては、本発明は以下の式を有する薬剤、
【化８２】

【０１８１】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１８２】
［式中、それぞれの位置において独立して：R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁸は、水素、ヒドロキシ保護基、及び直接の結合、この場合はO R¹⁸は＝Oとなるが、これらから選択される。
【０１８３】
別の1態様においては、本発明は以下の式を有する薬剤、
【化８３】

【０１８４】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１８５】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁸は、水素、ヒドロキシ保護基、及び直接の結合、この場合はO R¹⁸は＝Oとなるが、これらから選択される。］
別の1態様においては、本発明は以下の式を有する薬剤、
【化８４】

【０１８６】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供する。
【０１８７】
［式中、それぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹⁹はヒドロキシ-及びオキソ-置換低級アルキルから選択される。］
本発明のプロドラッグを調製するためには、該薬剤を直接的にリンカー、典型的にはヘテロ二官能性リンカーと反応させるか、またはそうでなければ該薬剤をヘテロ二官能性リンカー上の反応性部位と適切に反応する反応性部位を含ませるためにいくらか修飾させる。一般的には、該ヘテロ二官能性リンカーは次の構造を有する

【０１８８】
本発明の好ましい1実施形態においては、反応性部位No.1は該薬剤のカルボニル基と反応し、反応性部位No.2はリガンド上の官能基と反応し、反応性部位1と2は異なる官能基と反応する。
【０１８９】
当分野では多数のヘテロ二官能性リンカーが知られている。例えば、S.S.Wong, 「タンパク質のコンジュゲーションと架橋の化学」"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press Inc., Boston 1991を参照せよ。本発明の1態様においては、反応性部位No.1はヒドラジド(すなわち、式
【化８５】

【０１９０】
の基)である。本発明の1態様においては、反応性部位No.2はチオール受容基である。適切なチオール受容基としては、ハロアセトアミド基(すなわち、式
【化８６】

【０１９１】
の基でこの式でXはハライドである)、及びマレイミド基(すなわち式
【化８７】

【０１９２】
の基)である。本発明のヘテロ二官能性リンカー中でR¹⁶は、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択されたもので、ここでpは1−5である。
【０１９３】
一般に、適切なヘテロ二官能性リンカーとしては市販のマレイミドヒドラジド(例えば、β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド、ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド、及びMolecular Biosciences, Inc., Boulder, COから入手しうるSMCCヒドラジドが含まれる。あるいはまた、該ヘテロ二官能性リンカーは、ポリオキシエチレンベースのマレイミド酸(Frisch, B.ら, Bioconjugate Chem., 1996, 7:180-186)を含むマレイミド酸から既知の方法(King, H. D.ら, Bioconjugate Chem., 1999, 10:279-288)で容易に調製することができる。この方法に従えば、マレイミド酸はまず最初にそのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルに転換され、その後tert-ブチルカルバゾール酸と反応させる。精製しBocを除去した後、そのマレイミドヒドラジドは通常は良好な収率で得られる。ハロアセタミドヒドラジドヘテロ二官能性リンカーは市販の中間体、例えばスクシンイミジル 3-(ブロモアセトアミド)プロピオン酸塩、または[2-[2-(2-ブロモアセチルアミノ)-エトキシ]-エトキシ]-酢酸(Frisch, B.ら, Bioconjugate Chem., 1996, 7:180-186)から上述のtert-ブチルカルバソイル酸塩との反応によって調製することができる。
【０１９４】
本発明の別の1態様においては、反応性部位No.2はアミン反応性基である。適切なアミン反応性基としては、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルなどの活性化されたエステル、ならびにイソチオシアナート、イソシアナート、無水物、酸クロリド、及びスルフォニルクロリドなどのその他の反応性官能基が含まれる。
【０１９５】
前述したとおり、好ましい1実施形態においては、該薬剤の合成の際にはカルボニル基が存在するようにしなければならず、または容易にカルボニル基に転換しうる、またはカルボニル基を形成しうる少なくとも1個の基が存在するようにしなければならない。カルボニル基は下記の代表的な方法のいずれかによって該ペンタペプチド薬剤の一部分をなすようにするか、またはそれに添加することができる：
(1) 該薬剤のヒドロキシル基の酸化によってカルボニルを形成させる；
(2) 該薬剤のヒドロキシル基と、カルボニルもしくは保護されたカルボニルとヒドロキシル反応性基例えばカルボン酸もしくはエステルとの双方を含んでいる分子との反応。例えば、該薬剤のヒドロキシル基がエステル基に転換されるようにヒドロキシル基をケト酸またはケトエステルと反応させることができ、そこではエステル基がケト酸/エステルのケト基に結合されているが、そのように反応させることができる。
【０１９６】
(3) 該薬剤の合成の際、例えば、カルボニルを含有しているアミノ酸、アミン、もしくはペプチドを用いたペプチド合成の際に該薬剤にカルボニル基を導入する。
【０１９７】
例えば、該ペンタペプチド10がカルボニル基を含んでいる場合には、カルボニル反応性末端、例えば、ヒドラジン基を含んでいるヘテロ二官能性リンカーと直接的に反応させることができる。該ペンタペプチド10にカルボニル基を含まない場合には、そのペンタペプチドにヒドラジド反応性を付与するためにそのペンタペプチド中にカルボニル基を導入することができる。例えば、R⁹が
【化８８】

【０１９８】
のいずれかである場合には、該ペンタペプチド10は対応する酸化された化合物を提供するために酸化的条件下、例えば、クロロクロム酸ピリジニウム(PCC)/ピリジン(例えば、Synthesis, 1982, 245, 881, 総説を参照せよ)条件下におくことができ、そこでR⁹はそれぞれ
【化８９】

【０１９９】
である。
【０２００】
あるいはまた、該ペンタペプチドがカルボニル基を含んでいないが、ヒドロキシル基を含んでいる場合には、そのヒドロキシル基を変えてカルボニル基を供給することができる。ヒドロキシル官能基からカルボニル官能基を提供するための1方法はそのヒドロキシル基をケト酸と反応させることである。化学文献には多数のケト酸が報告されており、ケト酸のいくつかは市販もされている。ケト酸の多くは、α及びβ脂肪族ケト酸ではなくても、DCC/DMAP化学を用いてヒドロキシル基と容易に縮合させてケトエステル11を得ることができる(Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH, 1999, p.1937)。代表的なケト酸としては限定はされないが、レブリン酸、4-アセチル酪酸、7-オキソオクタノール酸、4-アセチル安息香酸、4-カルボキシフェニルアセトン、N-メチル-4-アセチル-3,5-ジメチル-2-ピロールカルボン酸、3-ベンゾイル-2-ピリジンカルボン酸、及び2-アセチルチアゾール-4-カルボン酸が含まれる。
【０２０１】
カルボニル基を提供するためのα-ケト酸の使用には、例えばジメチルケタールのようにカルボニル基をまず保護しておくことが必要である。ジメチルケタールはケト酸を濃硫酸中で過剰のオルトギ酸ジメチルで処理することによって容易に得ることができるが、この方法については例えば、LaMattina, J.L., Muse, D.E., J. Org. Chem. 1987, 52:3479-3481中に述べられているとおりである。保護を施した後、標準的なDCC/DMAPでメディエートするケト酸のカルボキシル基とペンタペプチドのヒドロキシル基との縮合法を用いてエステル結合を形成させることができる。水での処理と低真空度での乾燥後はこの物質をさらに精製することなく用いることができる。ひとたびエステル結合が形成されれば、ジメチルケタールは穏和な酸性条件下で加水分解されて所望のα-ケトエステル11を得ることができる。代表的なα-ケト酸としては、限定はされないが、ピルビン酸、2-ケト酪酸、2-チオフェングリオキシル酸、及びベンゾイルギ酸が含まれる。
【０２０２】
スキーム4に示したとおり、ペンタペプチドのβ-ケト酸エステルの調製はDMAPが促進するエチルβ-ケトエステルのエステル転移反応を経由して行うことができる(例えば、Otera, J. Chem. Rev., 1993, 93:1449-1470を参照せよ)。この点に反応に用いることのできる市販のβ-ケトエステルとしては、限定はされないが、エチルアセト酢酸、エチルβ-オキソ-3-フランプロピオン酸、及びエチル 3-(1-アダマンチル)-3-オキソプロピオン酸が含まれる。例えば、R⁹が
【化９０】

【０２０３】
から選択される場合には、R⁹のヒドロキシル基はケト酸と反応させてエステル結合を形成し、所望のカルボニル基を得ることができる。このようなカルボニルを含んでいる薬剤を調製するアプローチをスキーム4に示している。
【化９１】

【０２０４】
化合物11の式でR⁹は
【化９２】

【０２０５】
から選択される。
【０２０６】
ペンタペプチドのケトエステルは形成させた後は反応混液から単離して、例えばフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー、及び/または逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。
【０２０７】
反応性のカルボニル基(それはヘテロ二官能性リンカーと反応することができるものであるが)と該薬剤の残りの部分との結合のためにエステル結合を用いる替わりに、反応性のカルボニル基を該薬剤の残りの部分とエーテル結合を介して結合させることができる。すなわち、以下の式の化合物、
【化９３】

【０２０８】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物、
この式でそれぞれ独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R⁹は、
【化９４】

【０２０９】
から選択されたものであり；R¹⁰は、
【化９５】

【０２１０】
(すなわち、R¹⁴に加えて1個のエステル結合が、反応性カルボニル基と該分子の残りの部分との結合に用いられる)であるが、このような化合物を提供する替わりに、本発明は、R¹⁰が
【化９６】

【０２１１】
であり；(すなわち、R¹⁴に加えて1個のエーテル結合が、反応性カルボニル基と該分子の残りの部分との結合に用いられる)、いずれの場合でも(R¹⁴へのエーテルまたはエステル結合)、R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R¹⁴は、直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され；R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択される化合物をも提供する。
【０２１２】
R¹⁴へのエーテル結合を有するペンタペプチドの調製は、アミノアルコール(アミノ酸の類似体)を用いて容易に行うことができ、このアミノアルコールは多数の供給者から市販されており化学の文献中に記載されている。保護されたアミノ基(一般式で(保護基)HN-R-OH、ここでRは有機の部分である)を有するアミノアルコールはHO- R¹⁴-C(=O)- R¹⁵の式のアルコールと、例えばR¹⁴がアリールの場合、PPh₃、DIAD、及び適切な溶媒、例えばジオキサンの存在下でミツノブ反応を介して反応させて対応するアミノエーテルを得ることができる(そのアミノエーテルは、(保護基)HN-R-O- R¹⁴-C(=O)- R¹⁵の式のものである)。そのアミノ基から保護基を除去して、このアミノ基をカルボン酸またはそのシントンと反応させて、ペンタペプチドの調製への1ステップとしてペプチド(アミド)基を得ることができる。この化学反応は図16及び図17に示し、ここで代表的かつ好ましいアミノアルコールは化合物54である。
【０２１３】
ヘテロ二官能性リンカーと反応させた後、その結果得られる産物はリンカー部分に結合したペンタペプチド薬剤であり、そのリンカー部分は反応性のリンカー部分である。言い替えれば、該ペンタペプチド-リンカーコンジュゲートはリガンド上に存在する官能基と反応する基を含んでいる。
【０２１４】
従って、1態様においては、本発明は以下の式のペンタペプチド-リンカーコンジュゲート、
【化９７】

【０２１５】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供し、この式でそれぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。
【０２１６】
別の1態様においては、本発明は以下の式のペンタペプチド-リンカーコンジュゲート、
【化９８】

【０２１７】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供し、この式でそれぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。
【０２１８】
また別の1態様においては、本発明は以下の式のペンタペプチド-リンカーコンジュゲート、
【化９９】

【０２１９】
ならびにその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物を提供し、この式でそれぞれの位置において独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R²⁰は、R²⁰が標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。
【０２２０】
スキーム5に示すとおり、ヘテロ二官能性リンカーとカルボニルを含有しているペンタペプチド薬剤との間のヒドラゾン結合形成、これはその後リガンドと処理されるが、これによって式Iの化合物が提供されることとなる。該薬剤のヘテロ二官能性リンカーとの反応は適切な溶媒、例えば、無水MeOHまたはDMSO中で、好ましくは少量の酸、例えば0.01% AcOHまたはTFAの存在下で室温で行うことができる。アプライすべきヒドラジドの相対量と反応の完了またはほぼ完了するまでに要する時間はカルボニル基の性質によって異なる。芳香族及びα-カルボニル基は通常ヒドラジドをより過剰に必要とし、反応時間もより長く必要である。ドキソルビシン-mAbのコンジュゲートを調製するために用いられるKing, H. D.ら, Bioconjugate Chem., 1999, 10:279-288の方法を、本発明のコンジュゲートを調製するために用いることができる。安定なヒドラゾンは逆相HPLCで精製することができる。ヒドラゾンの安定性は、典型的には、対応するケトエステルの性質によって変わる。
【０２２１】
該リガンドは好ましくは、該コンジュゲートを被験動物の所望の位置へと向かわせるターゲティングリガンドである。好ましいターゲティングリガンドは抗体、例えば、キメラもしくはヒト化抗体、またはそのフラグメントである。
【０２２２】
本発明の組成物及び方法に用いることのできるポリクローナル抗体は免疫した動物由来の異種の抗体分子の集合である。ある対象の抗原に対するポリクローナル抗体の作製のためには、当分野でよく知られた種々の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体の作製のためには、種々の宿主動物に対象の抗原もしくはその誘導体を注射することによって免疫することができ、そのような宿主動物としては、限定はされないが、ウサギ、マウス、ラット、その他が含まれる。免疫応答を増大させるために宿主動物種の如何によって種々のアジュバントを用いることができ、そのようなアジュバントとしては、限定はされないが、フロイントのアジュバント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットのヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(bacille Calmette-Guerin)及びcorynebacterium parvumなどのヒトのアジュバントとして有用な可能性のあるものが含まれる。このようなアジュバントも当分野ではよく知られている。
【０２２３】
本発明の組成物と方法中で用いることのできるモノクローナル抗体はある特定の抗原(例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原など)に対する抗体の均一な集団である。対象の抗原に対するモノクローナル抗体は、培養液中で継代される細胞系統による抗体酸性のためのものとして当分野で既知のいずれかの技法を用いて調製することができる。そのような方法としては、限定はされないが、KohlerとMilstein (1975, Nature 256, 495-497)によって初めて報告されたハイブリドーマ技法、より最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら, 1983, Immunology Today, 4:72)、及びEBV-ハイブリドーマ技法(Coleら, 1985, 「モノクローナル抗体と癌治療」"Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が含まれる。このような抗体は免疫グロブリンのどのクラスのものであってもよく、それらとしては、IgG、IgM、IgE、IgA、及びIgD、ならびにそれらのサブクラスが含まれる。本発明で用いられるmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養することができる。
【０２２４】
本発明の組成物と方法中で用いることのできるモノクローナル抗体としては、限定はされないが、ヒトモノクローナル抗体、またはキメラヒト-マウス(またはその他の動物種)モノクローナル抗体が含まれる。ヒトモノクローナル抗体は当分野で既知の多数の技法のいずれかによって作製することができる(例えば、Tengら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:7308-7312; Kozborら, 1983, Immunology Today, 4:72-79; 及びOlsson ら, 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16)。
【０２２５】
本発明はさらに二重特異性抗体の使用を提供する。二重特異性抗体の作製方法は当分野では既知である。完全長の二重特異性抗体の伝統的な作製法は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖のペアの同時発現に基づくもので、ここでその2つの鎖は異なる特異性を持っている(Milsteinら, 1983, Nature 305:537-539)。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組み合わせが起こるので、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は10種類の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、その中で正しい二重特異性構造を有するものは1種のみである。その正しい分子の精製、それは通常はアフィニティークロマトグラフィーステップで行われるが、その精製はかなり面倒なものであり、産物の収率は低い。
【０２２６】
類似の方法はPCT公開 WO 93/08829(1993年5月13日公開)、及びTrauneckerら, 1991, EMBO J. 10:3655-3659中に開示されている。
【０２２７】
上記とは異なり、より好ましいアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体の可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)は免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合される。この融合は好ましくは免疫グロブリン重鎖の、少なくともヒンジ部、CH2、及びCH3領域を含んでなる定常ドメインと行われる。融合体の少なくとも1つは、軽鎖との結合に必要な部位を含んでいる、第1の重鎖定常領域(CH1)を有するものであることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトする。このことによって、構築物中で用いられる3種のポリペプチド鎖の不均等な比率が最適な収率をもたらす場合には、3種類のポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を与えることとなる。しかし、少なくとも2種類のポリペプチド鎖が同じ比率で発現されることが高い収率をもたらす、またはその比率が特別な意味を持たないような場合には、それら2種または3種全てのポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０２２８】
このアプローチの好ましい1実施形態においては、該二重特異性抗体は、一方のアームに第1の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、もう一方のアームにハイブリッド重鎖-軽鎖ペア(第2の結合特異性を提供する)からなる。この非対称の構造によって所望の二重特異性抗体を望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが可能となることが見出されたが、それは二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することによって分離が容易になっているからである。このアプローチは、PCT公開 WO 94/04690(1994年3月3日公開)中に開示されており、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【０２２９】
二重特異性抗体の作製に関してさらに詳細には、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 1986, 121:210を参照せよ。
【０２３０】
本発明は免疫特異的に癌細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原と結合する抗体の機能的に活性なフラグメント、誘導体、または類似体の使用を提供する。機能的に活性な、とは、該フラグメント、誘導体、または類似体が、そのフラグメント、誘導体、または類似体のもととなった抗体が認識するものと同じ抗原を認識する抗-抗イディオタイプ抗体を引き出しうるものであることを意味する。特に、好ましい1実施形態においては、該免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、フレームワーク及び該抗原を特異的に認識するCDR配列のC末端であるCDR配列を欠失させることによって増強することができる。どのCDR配列が抗原と結合するか調べるために、該CDR配列を含んでいる合成ペプチドをその抗原との結合アッセイに用いることができ、そのアッセイは当分野で既知のどのようなアッセイ方法によっても行うことができる(例えば、BIAコアアッセイ)。
【０２３１】
本発明の他の実施形態では本発明での使用に適する抗体のフラグメントの使用が含まれており、そのようなフラグメントとしては、限定はされないが、F(ab')2フラグメント、(これは可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖CH1ドメインを含んでおり、抗体分子のペプシン消化によって作製されるものである)、及びFabフラグメント(これはF(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元して作製することができるものである)が含まれる。本発明はまた、本発明での使用に適した抗体の重鎖及び軽鎖二量体、またはその何らかの最小限のフラグメント、例えばFvsもしくは単鎖抗体(SCA)(例えば、米国特許第4,946,778号; Bird, 1988, Science 242:423-42; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 及びWardら, 1989, Nature 334:54454)、あるいは、対象の抗体と同じ特異性を有するその他の何らかの分子を提供する。
【０２３２】
さらに、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体、それはヒト及びヒト以外の部分を含んでなり、標準的なDNA技法を用いて作製しうるものであるが、それらも本発明の範囲内にある。キメラ抗体は別々の動物種からの別々の部分が1つの分子となったもので、例えば、マウスモノクローナル由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである(例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号; 及びBossら, 米国特許第4,816,397号を参照すればよく、これらはその全体を本明細書中に参照により組み入れる)。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物種からの1つ以上の相補性決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有するヒト以外の動物種からの抗体分子である(例えば、Queen, 米国特許第5,585,089号を参照すればよく、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる)。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当分野で既知の組換えDNA技法、例えばPCT公開 WO 87/02671; 欧州特許出願第184,187号; 欧州特許出願第171,496号; 欧州特許出願第173,494号; PCT公開 WO 86/01533; 米国特許第4,816,567号; 欧州特許出願第125,023号; Betterら, 1988, Science 240:1041-1043; Liuら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:34393443; Liuら, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sunら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimuraら, 1987, Cane. Res. 47:999-1005; Woodら, 1985, Nature 314:446-449; 及びShawら, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oiら, 1986, Bio/Techniques 4:214; 米国特許第5,225,539号; Jonesら, 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyanら, 1988, Science 239:1534; ならびにBeidlerら, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060; これらの各々はその全体を本明細書中に参照により組み入れるが、これらに記載の方法を用いて作製することができる。
【０２３３】
完全にヒトのものである抗体はヒトの患者の治療には特に望ましいものである。そのような抗体は、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子の発現はできないがヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子の発現は行えるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。そのようなトランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば対象のポリペプチドの全てまたは一部分を用いて、通常の方法で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技法を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスの体内にあるヒト免疫グロブリントランスジーンはB細胞分化の間に再構成され、次いでクラススイッチ及び体細胞変異が行われる。従って、このような技法を用いて治療上有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を産生させることができる。ヒト抗体を産生させるためのこの技術の総説としては、LonbergとHuszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照せよ。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの技術についてのさらに詳細な論述及びそのような抗体を産生させるためのプロトコールについては、例えば、米国特許第5,625,126号; 米国特許第5,633,425号; 米国特許第5,569,825号; 米国特許第5,661,016号; 及び米国特許第5,545,806号; これらの各々はその全体を本明細書中に参照により組み入れるが、これらを参照せよ。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)及びGenpharm (San Jose, CA)などの企業が上述のものと類似の技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を供給している。
【０２３４】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は「guided selection」と呼ばれる技法を用いて作製することができる。このアプローチでは、選択されたヒト以外の動物種のモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択をガイドするために用いられる(Jespersら, 1994, Bio/technology 12:899-903)。
【０２３５】
本発明での使用に適する抗体としては、Fc受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾(例えば置換、欠失、または付加)のある抗体が含まれる。特に、本発明での使用に適する抗体としては、FcドメインとFcRn受容体との相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基に修飾のある抗体が含まれる(例えば、PCT公開 WO 97/34631を参照すればよく、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる)。
【０２３６】
ある癌細胞抗原に免疫特異的な抗体は何らかの機関から(例えば、大学の科学者またはGenentechなどの企業)入手することができ、または当業者には既知の何らかの方法、例えば化学合成もしくは組換え発現技法によって作製することができる。ある癌細胞抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベースもしくはそれに類似のデータベース、公表文献、またはルーティンのクローニング及び配列分析によって得ることができる。
【０２３７】
特別な1実施形態においては、癌の治療または予防用の既知の抗体が、本発明の組成物と方法に従って用いられる。癌の治療に用いることのできる抗体の例としては、限定はされないが、ハーセプチン(R) (Trastuzumab; Genentech, CA)(これは転移性乳癌患者の治療用のヒト化抗HER2 モノクローナル抗体である(Stebbing, J., Copson, E., とO'Reilly, S. 「進行した乳癌でのハーセプチン(trastuzamab)の使用」"Herceptin (trastuzamab) in advanced breast cancer", Cancer Treat Rev. 26:287-90,2000); リタキサン(rituximab; Genentech)(これは非ホジキンリンパ腫患者の治療用のキメラ抗CD20モノクローナル抗体である); オバレックス(AltaRex Corporation, MA)(これは卵巣癌治療用のマウス抗体である);Panorex (Glaxo Wellcome, NC)(これは結腸直腸癌治療用のマウスIgG_2a抗体である); BEC2 (ImClone Systems Inc., NY)(これは肺癌治療用のマウスIgG抗体である); IMC-C225 (Imclone Systems Inc., NY)(これは頭頚部癌治療用のキメラIgG抗体である); Vitaxin (MedImmune, Inc., MD)(これは肉腫治療用のヒト化抗体である); Campath I/H (Leukosite, MA)(これは慢性リンパ性白血病(CLL)の治療用のヒト化IgG1抗体である); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA)(これは急性骨髄性白血病(AML)の治療用のヒト化IgG抗体である); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ)(これは非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化IgG抗体である); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA)(これは非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化抗体である); Oncolym (Techniclone, Inc., CA)(これは非ホジキンリンパ腫の治療のためのマウス抗体である); Allomune (BioTransplant, CA)(これはホジキン病または非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化抗CD2 mAbである); anti-VEGF (Genentech, Inc., CA)(これは肺癌と結腸直腸癌の治療のためのヒト化抗体である); CEAcide (Immunomedics, NJ)(これは結腸直腸癌の治療のためのヒト化抗CEA抗体である); IMC-1 C 11 (ImClone Systems, NJ)(これは結腸直腸癌、肺癌、及び悪性黒色腫の治療のための抗KDRキメラ抗体である); ならびにCetuximab (ImClone, NJ)(これは上皮成長因子陽性の癌の治療のための抗EGFRキメラ抗体である)が含まれる。
【０２３８】
癌の治療に有用なその他の抗体としては、限定はされないが、次の抗原に対する抗体が含まれる：CA125 (卵巣癌)、CA15-3 (癌腫)、CA19-9 (癌腫)、L6 (癌腫)、 Lewis Y (癌腫)、Lewis X (癌腫)、α-フェトプロテイン(癌腫)、CA 242 (結腸直腸癌)、 MUC1 (癌腫)、胎盤アルカリフォスファターゼ(癌腫)、前立腺特異的抗原(前立腺癌)、前立腺酸性フォスファターゼ(前立腺癌)、上皮成長因子(癌腫)、MAGE-1とMAGE-3 (癌腫)、抗トランスフェリン受容体(癌腫)、IL-2受容体(T細胞白血病及びリンパ腫)、CD20 (非ホジキンリンパ腫)、CD52 (白血病)、CD33 (白血病)、CD22 (リンパ腫)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(癌腫)、CD38 (多発性骨髄腫)、ならびにCD40 (リンパ腫)が含まれる。いくつかの特別に有用な抗体としては、BR96 mAb (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrom, I., Hellstrom, K. E., 「異種移植されたヒト癌腫のBR96-ドキソルビシンイムノコンジュゲートによる治癒」"Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates", Science 1993, 261:212-215)、BR64 (Trail, PA., Willner, D., Knipe, J., Henderson, A. J., Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., (Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K. E., 及びHellstrom, I., 「癌腫に対して反応性のBR64-ドキソルビシンイムノコンジュゲートの安定性、力価、及び効力に及ぼすリンカーを変更することの影響」"Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates", Cancer Research 1997, 57:100-105, CD40抗原に対するmAb、例えばS2C6 mAb (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., 及びWahl, A. F., 「抗CD40抗体 SGN-14のアゴニストとしての性質及びin vivoの抗腫瘍活性」"Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14", Cancer Res. 2000, 60:3225-3231)など、ならびにCD30抗原に対するmAb、例えばAC 10 (Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D.,及びPodack, E. R., 「巨大顆粒リンパ腫細胞系統YTに及ぼすCD30の機能的影響」"Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT", J. Immunol., 151:5896-5906, 1993)などが含まれる。腫瘍関連抗原と結合するその他の多数の内在化抗体を本発明に用いることができ、それらは総説に述べられている(Franke, A. E., Sievers, E. L., 及び Scheinberg, D. A.,「細胞表面の受容体を標的とした急性骨髄性白血病の治療：総説」"Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review", Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15:459-76; Murray, J. L., 「固形腫瘍のモノクローナル抗体での治療：時代が到来した」"Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age", Semin Oncol. 2000, 27:64-70; Breitling, F., 及びDubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998)。
【０２３９】
本発明での自己免疫疾患の治療に有用な抗体としては、限定はされないが、抗核抗体; 抗dsDNA; 抗ssDNA; 抗カルジオリピン抗体IgM、IgG; 抗リン脂質抗体IgM、IgG; 抗SM抗体; 抗ミトコンドリア抗体; 抗甲状腺抗体; 抗ミクロソーム抗体; 抗サイログロブリン抗体; 抗SCL-70抗体; 抗Jo抗体; 抗U1RNP抗体; 抗LA/SSB抗体; 抗SSA抗体; 抗SSB抗体; Anti Perital Cells Antibody; 抗ヒストン抗体; 抗RNP抗体; C-ANCA; P-ANCA; 抗セントロメア抗体; 抗Fibrillarin抗体、ならびに抗GBM抗体が含まれる。
【０２４０】
特別な1実施形態においては、ウイルス感染または微生物感染の治療または予防のための既知の抗体が、本発明の組成物と方法に従って用いられる。ウイルス感染または微生物感染の治療に用いることのできる抗体の例としては、限定はされないが、Synagis (Medlmmune, Inc., MD)(これはRSV感染患者の治療のためのヒト化抗RSウイルスモノクローナル抗体である); PR0542 (Progenics)(これはHIV感染の治療のためのCD4融合抗体である); Ostavir (Protein Design Labs, Inc., CA)(これはB型肝炎ウイルス感染の治療のためのヒト抗体である); Protovir (Protein Design Labs, Inc., CA)(これはサイトメガロウイルス(CMV)感染の治療のためのヒト化IgG1抗体である);及び抗LPS抗体が含まれる。
【０２４１】
感染性疾患の治療に有用なその他の抗体としては、限定はされないが、病原性を有する細菌(化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes), 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae), 淋菌(Neisseria gonorrheae), 髄膜炎菌(Neisseria meningitidis), ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae), ボツリヌス菌(Clostridium botulinum), ウェルシュ菌(Clostridium perfringens), 破傷風菌(Clostridium tetani), インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae), 肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae), Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus), コレラ菌(Vibrio colerae), 大腸菌(Escherichia coli), 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa), Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, セレウス菌(Bacillus cereus), Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, ペスト菌(Yersinia pestis), Yersinia pseudotuberculosis, 志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae), フレクス赤痢菌(Shigella flexneri), ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei), ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium), 梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum), Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, 結核菌(Mycobacterium tuberculosis), Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, マイコプラズマ種(Mycoplasma spp.), 発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazeki), ツツガムシ病リケッチア(Rickettsia tsutsugumushi), クラミジア種(Chlamydia spp.)); 病原性の真菌(Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); 原虫(Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria) ; または蠕虫(Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, 及びhookworms)から得られる抗原に対する抗体が含まれる。
ウイルス性疾患の治療のための、本発明で有用なその他の抗体としては、病原性を有するウイルスの抗原に対する抗体が含まれ、そのような抗体の例としては、限定はされないが、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、アデノウイルス、パポバウイルス、エンテロウイルス、ピコルナウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、百日咳ウイルス、アルボウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、非A非B肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス及びヒト免疫不全ウイルスが含まれる。
【０２４２】
本発明で用いるための適切な抗体は抗体の合成法として当分野で既知のどの方法でも作製することができ、特に化学合成によって、または組換えでの発現によって作製することができ、好ましくは組換え発現技法による作製である。
【０２４３】
本発明での使用に適した抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体の組換えによる発現には、その抗体をコードする核酸の構築を必要とする。その抗体のヌクレオチド配列が既知である場合は、その抗体をコードする核酸配列を化学的に合成したオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ(例えば、Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17:242)、このことには、簡潔に述べれば、その抗体をコードする配列の一部分を含むオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせ、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングと連結、次いで連結したオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅が含まれる。
【０２４４】
あるいはまた、抗体をコードする核酸分子は適切な起源から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有しているクローンが入手し得ないがその抗体の配列が既知である場合には、その抗体をコードする核酸は適切な起源(例えば、抗体cDNAライブラリー、またはその免疫グロブリンを発現している何らかの組織または細胞から作製されたcDNAライブラリー)から、その配列の3'及び5'末端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いたPCR増幅、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって得ることができる。
【０２４５】
ある特定の抗原を特異的に認識する抗体が(またはその免疫グロブリンをコードする核酸をクローニングするためのcDNAライブラリの起源が)入手し得ない場合には、ある特定の抗原に対して特異的な抗体を当分野で既知の何らかの方法、例えばウサギなどの動物を免疫してポリクローナル抗体を作製するか、あるいはより好ましくは、モノクローナル抗体を例えばKohlerとMilstein (1975, Nature, 256:495-497)が報告しているように、またはKozborら(1983, Immunology Today 4:72)もしくはColeら(1985, 「モノクローナル抗体と癌治療」"Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が報告しているように作製することによって得ることができる。あるいはまた、該抗体の少なくともFab部分をコードするクローンは、Fab発現ライブラリー(例えば、Huseら, 1989, Science, 246:1275-1281が報告しているように)を、その特異的な抗原と結合するFabフラグメントのクローンについてスクリーニングすることによって、または抗体ライブラリー(例えば、Clacksonら, 1991, Nature 352:624; Haneら, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937を参照せよ)をスクリーニングすることによって得ることができる。
【０２４６】
該抗体の少なくとも可変ドメインをコードする核酸配列がひとたび得られれば、それをその抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいるベクター中に導入することができる(例えば、PCT公開 WO 86/05807; PCT公開 WO 89/01036; 及び米国特許第5,122,464号を参照せよ)。完全な抗体分子を発現させることのできる、完全な軽鎖または重鎖を含んでいるベクターは入手可能である。従って、該抗体をコードする核酸は、鎖間のジスルフィド中に参加している1個以上の可変領域システイン残基を、スルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基と置換(または欠失)させるために必要なヌクレオチドの置換もしくは欠失を導入するために用いることができる。このような改変はヌクレオチド配列中に特定の変異または欠失を導入するための方法として当分野で既知のいずれか、例えば、限定はされないが、化学的突然変異導入及びin vitro部位指定突然変異導入が挙げられる(Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551)。
【０２４７】
さらに、「キメラ抗体」の作製のために開発された、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子から得た遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とともにスプライシングすることによる技法(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 ;Neubergerら, 1984, Nature, 312:604-608 ;Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454)を用いることができる。上述のとおり、キメラ抗体はその分子中に別々の動物種から由来した別々の部分がある分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体などである。
【０２４８】
あるいはまた、単鎖抗体を作製するためのものとして報告されている技法(米国特許第4,694,778号; Bird, 1988, Science 242:423-42; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 及びWardら, 1989, Nature, 334:544-54)を単鎖抗体を作製するために適用することができる。単鎖抗体はアミノ酸1個の架橋を介してFv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、その結果単鎖のポリペプチドが得られる。大腸菌(E.coli)中で機能を有するFvフラグメントのアセンブリーを行うための技法も用いることができる(Skerraら, 1988, Science, 242:1038-1041)。
【０２４９】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを既知の技法で作製することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定はされないが：F(ab')2フラグメント、これは抗体分子のペプシン消化によって作製することができ、Fabフラグメント、これはF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製することができる。
【０２５０】
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られれば、その抗体の産生のためのベクターを当分野ではよく知られた技法を用いて組換えDNA技術によって作製することができる。当業者によく知られた方法を、該抗体のコード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含んでいる発現ベクターを構築するために用いることができる。そのような方法としては、例えば、組換えDNA技法、合成技法、及びin vivo 遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら(1990, 「分子クローニング、実験室マニュアル」"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)及びAusubelら(編, 1998, 「分子生物学の今日のプロトコール」"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY)に記載されている技法を参照せよ。
【０２５１】
ある抗体のヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクター、またはある抗体のヌクレオチド配列を従来の技法(例えば、電気穿孔法、リポソームによるトランスフェクション、及びリン酸カルシウム沈殿)によって宿主細胞へ移送することができ、次いでそのトランスフェクトされた細胞を従来の技法で培養して本発明の抗体を産生させることができる。特別な実施形態においては、その抗体の発現は構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、または組織に存在する特定のプロモーターによって調節される。
【０２５２】
本発明の組換え抗体を発現させるために用いられる宿主細胞は大腸菌などの細菌細胞、または好ましくは特に組換え免疫グロブリン分子全体の発現のためには真核細胞とすることができる。とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞をヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと共に用いるものは免疫グロブリンの効果的な発現系である(Foeckingら, 198, Gene, 45:101; Cockettら, 1990, Bio/Technology, 8:2)。
【０２５３】
本発明の免疫グロブリン分子を発現するためには、種々の宿主-発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主-発現ベクター系はそれによって該抗体のコード配列が産生されその後精製されることとなるヴィークルであるが、それのみならず適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると本発明の免疫グロブリン分子をin situで発現する細胞をも意味している。そのような系としては限定はされないが、免疫グロブリンコード配列を含んでいる組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば大腸菌及び枯草菌)などの微生物；免疫グロブリンコード配列を含んでいる組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces Pichia)；免疫グロブリンコード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；免疫グロブリンコード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)及びタバコモザイクウイルス(TMV))を感染させた、または免疫グロブリンコード配列を含んでいる組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)、または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含んでいる組換え発現構築物を細胞内に入れている哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞)が含まれる。
【０２５４】
細菌の系では、発現しようとする抗体での使用に応じて多数の発現ベクターのうち有利なものを選択することができる。例えば、そのようなタンパク質を抗体の医薬組成物の作製のために多量産生させようとする場合には、容易に精製しうる融合タンパク質産物の高レベルでの発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定はされないが、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら, 1983, EMBO J. 2:1791)(このベクターでは融合タンパク質が産生されるように、該抗体コード配列は個々にlacZコード領域とインフレームでベクター中に連結されている)；pINベクター(InouyeとInouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van HeekeとSchuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 及び類似のものが含まれる。pGEXベクターも外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために用いることができる。通常はそのような融合タンパク質は可溶性で溶解させた細胞から吸着及びマトリックスグルタチオン-アガロースビーズへ結合させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することによって容易に精製することができる。pGEXベクターはクローン化された標的遺伝子産物がGST部分から放出されうるように、トロンビンまたは第IXa因子プロテアーゼ切断部位を含んだデザインとなっている。
【０２５５】
昆虫の系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子発現のためのベクターとして用いられる。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。該抗体コード配列は個々にウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドロン遺伝子)中にクローン化してAcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
【０２５６】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスをベースとした発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、対象の抗体コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及びtripartiteリーダー配列に連結することができる。次いで、キメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノム中に、in vitroまたはin vivoの組換えによって挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)に挿入すると感染細胞中で生存し該免疫グロブリン分子を発現することのできる組換えウイルスが得られることとなる(例えば、LoganとShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359を参照せよ)。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためには特別な開始シグナルも必要とされる。そのようなシグナルとしては、ATG開始コドン、及びその隣接配列が含まれる。さらにその開始コドンは所望のコード配列と同一相にあってそのインサート全体の翻訳を確実に行うものでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、その他を含めることによって向上させることができる(Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照せよ)。
【０２５７】
さらに、宿主細胞株は、所望の特別な様式で挿入された配列の発現に変化を与える、または遺伝子産物を修飾及びプロセスするものを選ぶことができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば糖鎖付加)及びプロセシング(例えば切断)はそのタンパク質の機能に重要なものとなりうる。種々の宿主細胞系は特徴的で特異的な、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシングと修飾のためのメカニズムを有している。発現される外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングが行われることを確保するために適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的のために、1次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物の糖鎖付加、及びリン酸化のための細胞内装置を有する真核生物の宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20及びT47D、CRL7030、ならびにHs578Bstが含まれる。
【０２５８】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収率な産生には、安定な発現が好ましい。例えば、抗体を安定に発現する細胞系統を作製することができる。ウイルス性の複製起点を含んでいる発現ベクターを用いずに、宿主細胞を適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他)によって制御されるDNA、及び選択マーカーで形質転換することができる。外来DNAを導入した後、加工した細胞を富栄養培地中で1〜2日間増殖させ、次いで、選択培地にスイッチすることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、そのプラスミドが細胞の染色体中に安定に組み込まれ、増殖して細胞増殖巣を形成し、それが今度はクローン化されて細胞系統へと拡張することができる。この方法を抗体を発現する細胞系統を作るために有利に用いることができる。このような加工された細胞系統は、該抗体と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価に特に有用である。
【０２５９】
多数の選択系を用いることができ、そのような系としては限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell, 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaとSzybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell, 22:817)遺伝子を、tk-、hgprt-、またはaprt-細胞中でそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を下記の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：dhfr(これはメトトレキセートへの抵抗性を付与する)(Wiglerら, 1980, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); gpt(これはミコフェノール酸への抵抗性を付与する)(MulliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); neo(これはアミノグリコシドG-418への抵抗性を付与する)(Clinical Pharmacy, 12:488-505; WuとWu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; 及びMorganとAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-217; May, 1993, TIB TECH, 11(5):155-215)。組換えDNA技術の業界で一般的に知られている方法で利用することのできるものは、Ausubelら(編, 1998, 「分子生物学の今日のプロトコール」"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY); Kriegler, 1990, 「遺伝子移送と発現, 実験室マニュアル」"Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY; 及びDracopoliら編, 1994, 「ヒト遺伝学の今日のプロトコール」"Current Protocols in Human Genetics"の第12章と13章, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol., 150:1に記載されている。ならびにhygro(これはハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する)(Santerreら, 1984, Gene, 30:147)。
【０２６０】
抗体の発現量はベクターの増幅によって増大させることができる(総説としてBebbingtonとHentschel, 「DNAクローニングにおける、哺乳類細胞中のクローン化された遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用」"The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", 第3巻, (Academic Press, New York, 1987)を参照せよ)。抗体を発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能なものである場合には、宿主細胞の培養液中に存在するインヒビターの量を増加させるとマーカー遺伝子のコピー数を増加させることとなる。その増幅された領域は、抗体のヌクレオチド配列と関連しているので、抗体の産生も増加することとなる(Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257)。
【０２６１】
宿主細胞は本発明の2種類の発現ベクター、第1のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードし、第2のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードするもので、これらで同時トランスフェクトすることができる。これらの2種類の同一の選択マーカーを含むようにすることができ、それによって重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの等量の発現が可能となる。あるいはまた、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの双方をコードする単一のベクターを用いることができる。そのような場合には、毒性のある遊離の重鎖が過剰となることを防ぐために、軽鎖は重鎖の前に置くようにすべきである(Proudfoot, 1986, Nature, 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197)。重鎖及び軽鎖のためのコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでなるものとすることができる。
【０２６２】
組換えによって抗体が発現されれば、その抗体を抗体の精製法として当分野で既知の何らかの方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインAなどの特異的抗原を用いたアフィニティー、sizing カラムクロマトグラフィー)、遠心、differential solubility、またはその他のタンパク質の精製のための標準的な技法のいずれかによって、精製することができる。
【０２６３】
内在化させた（internalizing）モノクローナル抗体、例えば、BR96、AC10、herceptin、及びS2C6などは、本発明の抗体として好ましいものである。リガンドは、リガンド上にある遊離のチオール基、または遊離のアミノ基を介してリンカーと適切に結合される。例えば、リガンドが抗体である場合には、前述したとおり、その遊離のチオール基は抗体中に存在するジスルフィド基をジチオスレイトールで還元することによって作製することができる(Trail, P. A.ら, Science, 1993, 261:212-215; 及びFirestone, R. A., Willner, D., Hofstead, S. J., King, H. D., Kaneko, T., Braslawsky, G. R., Greenfield, R. S., Trail, P. A., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Casazza, A. M., Hellstrom, I., とHellstrom, K. E.,「イムノコンジュゲートBR96-Doxの合成と抗腫瘍活性」"Synthesis and antitumor activity of the immunoconjugate BR96-Dox", J. Controlled Rel., 1996, 39:251-259)。あるいはまた、抗体のリジンを塩酸アミノチオラン(Traut試薬)と反応させて遊離のチオール基を導入することができる。あるいはまた、抗体の遊離のアミノ基は適切な官能基、例えば活性化エステル、イソチオシアナート、イソシアナート、無水物、またはアシルクロリド官能基を有するリンカー-薬剤と直接的に反応させることができる。本発明の薬剤-リンカー-リガンドコンジュゲートはそのリガンドに対する特異的抗原を発現している細胞集団の治療のための特異性と治療的薬剤活性を共に保持している。そのコンジュゲートのヒドラゾン結合は血清中では安定であるが、酸性の細胞内コンパートメント中で切断されて強力な薬剤を遊離させることとなる。このアプローチは、標的細胞系統と非標的細胞系統との高い選択性、例えば、約1000倍までの選択性を有するコンジュゲートを提供するために用いることができる。
【０２６４】
スキーム5は、カルボニルを含有する薬剤がヘテロ二官能性リンカーを介してリガンドとのコンジュゲーションを行って式Iの化合物を形成することを示している。
【化１００】

【０２６５】
式Iの化合物中で、それぞれの位置で独立して：R¹は水素及び低級アルキルから選択され；R²は水素及び低級アルキルから選択され；R³は低級アルキルであり；R⁴は、R⁵が水素及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択されるか、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、nは2、3、4、5、及び6から選択される）の炭素環式化合物を形成し；R⁶は水素及び低級アルキルから選択され；R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり；R⁸は水素及び低級アルキルから選択され；R⁹は、
【化１０１】

【０２６６】
から選択され；R¹⁰は、
【化１０２】

【０２６７】
から選択され；R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され；R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、mは0−5であって、R¹²はそれぞれ独立して選択され；R¹³は
【化１０３】

【０２６８】
であり；R¹⁴は、直接の結合、アリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され；R¹⁵は水素、低級アルキル、及びアリールから選択され；R¹⁶はアリーレン(低級アルキレン)、低級アルキレン、アリーレン、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、ここでpは1−5であり；R¹⁷は、
【化１０４】

【０２６９】
から選択されたもので、ここでYはOまたはSである。
【０２７０】
組成物
別の態様においては、本発明は上述のペンタペプチド薬剤、及びそのペンタペプチド薬剤に基づいた上述のプロドラッグを製薬上許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて提供する。便宜上、本発明のペンタペプチド薬剤及びプロドラッグを単に本発明の化合物と呼ぶこととする。従って、本発明は、上述の本発明の化合物を、製薬上許容し得る担体と混合して含有する医薬組成物または動物薬組成物(以後単に医薬組成物と呼ぶ)を提供する。本発明はさらに、上述の化合物の有効量を製薬上許容し得る担体と共に含有する組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。
【０２７１】
本発明の医薬組成物は、それを被験動物に投与することのできるようないかなる形態であってもよい。例えば、該組成物は固体、液体、または気体(エアロゾル)の形態とすることができる。典型的な投与経路としては、限定はされないが、経口、局所、非経口、舌下、直腸、経膣、眼内、及び鼻腔内が含まれる。本明細書で用いている非経口という用語は皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内への注射または輸注技法を含む。好ましくは該組成物は非経口的に投与される。本発明の医薬組成物はそれに含まれている有効成分が、被験動物に投与された際に生物学的に利用される形のものとなるように製剤化される。被験者に投与される組成物は1または2投与量ユニットの形態をとり、それは例えば錠剤1個を単回投与量ユニットとすることができ、エアロゾルの形態の本発明の化合物の容器は投与量ユニットの複数回分を容れることができる。
【０２７２】
該医薬組成物の調製に用いられる材料は用いられる量で製薬上純粋かつ無毒なものでなければならない。当業者であれば該医薬組成物中の有効成分の最適な投与量が種々の要素によって異なることは明らかであろう。関連する要素としては、限定はされないが、被験者のタイプ(例えば、ヒト)、有効成分の特有の形態、投与の様式、及び用いる組成物が含まれる。
【０２７３】
通常は、該医薬組成物には、本発明の活性化合物の1種以上を(ここで用いている"a"及び"an"とは、この明細書全体を通じて「1個以上の」ということを意味する)1種以上の担体と混合したものを含む。担体は、該組成物を、例えば錠剤または粉末の形態となるように、微粒子とすることができる。担体は、組成物と共に、例えば経口シロップまたは注射用液剤とするために、液体のものとすることができる。さらに、例えば、吸入投与などに有用なエアロゾルの組成物を提供するために、担体を気体のものとすることができる。
【０２７４】
経口投与を意図する場合には、該組成物は好ましくは固体または液体の形態のいずれかとし、ここで固体または液体としている形態には、半固体、半液体、懸濁液、及びゲルの形態が含まれる。
【０２７５】
経口投与のための固体組成物としては、該組成物を粉末剤、顆粒剤、圧縮した錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、ウエファー、または類似の形態に製剤化することができる。そのような固体組成物は典型的には1種以上の不活性希釈剤または食用担体を含有する。さらに、1種以上の下記の補助剤を添加することができる：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの結合剤；でんぷん、乳糖、またはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Primogel、トウモロコシデンプン、及び類似のものなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、またはSterotexなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などのglidant；ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの着香剤、及び着色剤。
【０２７６】
該組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形態である場合には、そのカプセル剤には、上述のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油などの液状の担体を含有させることができる。
【０２７７】
該組成物は、液状の形態、例えばエリキシル、シロップ、溶液、乳剤、または懸濁液とすることができる。その液体は、2つの例としては経口投与用、または注射での送達用とすることができる。経口投与を意図している場合には、好ましい組成物は、本発明の化合物の他に1種以上の甘味剤、保存剤、着色剤、及び風味増強剤を含有する。注射による投与のための組成物中には、1種以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、及び等張化剤を含ませることができる。
【０２７８】
本発明の液状の医薬組成物は、それが溶液、懸濁液、または類似の形態のいずれであっても、下記の補助剤の1種以上を含めることができる：注射用水、食塩液、好ましくは生理食塩液、リンゲル液、等張の塩化ナトリウム、溶媒または懸濁用液として用いうる合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール、またはその他の溶媒などの無菌の溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤(バッファー)；塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧調整剤。非経口投与用の製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルの注射筒、または複数回投与用バイアル瓶中に容れることができる。生理食塩液は好ましい補助剤である。注射用の医薬組成物は無菌であることが好ましい。
【０２７９】
非経口投与または経口投与のいずれかを意図した液状組成物は、適切な投与量が得られるような本発明の化合物の量を含有していなければならない。典型的にはこの量とは、組成物中で本発明の化合物が少なくとも0.01%あることである。経口投与を意図する場合には、この量とは、組成物の重量の0.1%から約80%の間で変動する量である。好ましい経口投与用組成物は、本発明の化合物の約4%から約50%の間の量を含有するものである。本発明で好ましい組成物と製剤は、非経口での投与量ユニットが、活性化合物の重量で0.01%から2%の間の量を含有する。
【０２８０】
本発明の化合物、または組成物は都合のよい経路であればいかなる経路によっても投与することができ、そのような経路としては、例えば、点滴注射またはボーラス注射、上皮または粘膜・皮膚性の内膜を介する吸収(例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜、その他)が挙げられ、また、別の生物活性物質と共に投与することができる。投与は全身または局所とすることができる。種々の送達システム、例えば、リポソーム中への被包、微粒子、マイクロカプセル、カプセル、その他が知られており、本発明の化合物または組成物を投与するために用いることができる。ある実施形態においては、2種以上の化合物または組成物が被験者に投与される。投与方法としては、限定はされないが、経口投与及び非経口投与；非経口投与としては、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、大脳内、心室内、鞘内、膣内、経皮、経直腸、吸入、または局所的に耳、鼻、目、または皮膚に投与することが含まれる。好ましい投与方法は実施者の裁量に委ねられ、部分的には治療を要する部位(例えば癌または自己免疫疾患の部位)がどこであるかによる。
【０２８１】
好ましい1実施形態においては、本発明の化合物または組成物は非経口的に投与される。
【０２８２】
より好ましい1実施形態においては、本発明の化合物または組成物は静脈内に投与される。
【０２８３】
特別な実施形態においては、1種以上の化合物または組成物を局所的に治療を要する領域に投与することが望ましいであろう。このことは、例えば、限定はされないが、手術中の局所輸注で、局所塗布、例えば手術後に創傷への包帯と共に使用して、注射で、カテーテルを使用して、坐剤として、またはインプラントで、該インプラントは多孔性のもの、無孔性のもの、もしくはゼラチン状物質であって、それにはsialastic膜などの膜、または線維が含まれる。1実施形態においては、投与は癌、腫瘍、または悪性腫瘍もしくは悪性腫瘍の前の状態の組織への直接注射によって行うことができる。別の1実施形態においては、投与は自己免疫疾患の部位(または以前そうであった部位)への直接注射によって行うことができる。
【０２８４】
ある実施形態においては、1個以上の化合物または組成物を中枢神経系に心室内及び鞘内注射を含む何らかの適切な経路で送り込むことが望ましいであろう。心室内投与は心室内カテーテルを、たとえばオムマヤレザバーなどのレザバーにつなぐことによって容易に行うことができる。
【０２８５】
肺への投与も例えば、吸入器もしくはネブライザーとエアロゾル化剤を用いた剤型で、または、フッ化炭素もしくは合成の肺界面活性剤中での灌流を介して、行うことができる。ある実施形態においては、該化合物または組成物は伝統的な結合剤及びトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤に製剤化することができる。
【０２８６】
別の1実施形態においては、本発明の化合物を小胞、特にリポソームにいれて送達させることができる(Langer, Science, 249:1527-1533(1990); Treatら, 「感染症と癌の治療におけるリポソーム」"Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer", Lopez-Berestein and Fidler(編), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein, 上述の文献, pp.317-327を参照せよ。全体としてこの文献を参照せよ。)
また別の1実施形態においては、該化合物または組成物を放出制御システムを用いて送達することができる。1実施形態においては、ポンプを用いることができる(Langer, 上述の文献; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwaldら, Surgery, 88:507(1980); Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574(1989)を参照せよ)。別の1実施形態においては、ポリマー性材料を用いることができる(「放出制御の医学への応用」"Medical Applications of Controlled Release", LangerとWise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); 「薬剤のバイオアベイラビリティー制御、ドラッグデザインと性能」"Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance", SmolenとBall(編), Wiley, New York (1984); RangerとPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61(1983)を参照せよ; また、Levyら, Science, 228:190(1985); Duringら, Ann. Neurol., 25:351(1989); Howardら, J. Neurosurg., 71:105(1989)をも参照せよ)。別の1実施形態においては、放出制御システムを、該化合物または組成物の標的の近傍、例えば、脳に置くことができ、それによって全身投与の場合に必要とされる量のごく一部の投与しか必要としないこととなる(例えば、Goodson, 「放出制御の医学への応用」"Medical Applications of Controlled Release", 上述の文献, 第2巻, pp.115-138(1984)を参照せよ)。Langerの総説((Science, 249:1527-1533 (1990))中に述べられているその他の放出制御システムを用いることができる。
【０２８７】
「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはヴィークルを意味し、それを用いて本発明の化合物が投与される。そのような医薬用担体は、水や油、それには石油、動物油、植物油、または合成のものが含まれ、例えば落花生油、鉱物油、、ごま油、及び類似の油などが挙げられるが、それらの液体とすることができる。医薬用担体は、食塩液、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状ケイ素、尿素、及び類似のものとすることができる。さらに、補助剤、安定化剤、濃化剤、及び着色剤を用いることができる。被験者に投与する際には、本発明の化合物または組成物、及び製薬上許容し得る担体は無菌であることが好ましい。該化合物が静脈内に投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩液、ブドウ糖水溶液、及びグリセリン溶液も液体の担体として用いることができ、特に注射溶液用に用いることができる。適切な医薬用担体としては、また、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び類似のものなどの賦形剤も含まれる。本発明の組成物は、所望により、少量の加湿剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することができる。
【０２８８】
本発明の組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を容れたカプセル剤、粉末剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、スプレー、懸濁液、またはその他の形態で、使用に適する形態を取ることができる。1実施形態においては、製薬上許容し得る担体はカプセルである(例えば米国特許第5,698,155号を参照せよ)。適切な医薬用担体のその他の例については、E. W. Martinの「レミントンの製薬科学」"Remington's Pharmaceutical Sciences"中に記載されている。
【０２８９】
好ましい1実施形態においては、本発明の組成物は通常行われている方法に従ってヒトへの静脈内投与を行いうる医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈投与用の化合物は無菌で等張の水性バッファーでの溶液である。必要に応じて、該組成物はまた、可溶化剤を含むことができる。静脈投与用の組成物は任意で注射部位の疼痛軽減のためにリグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。通常は、成分は別々に、または一緒に混合してユニット投与量の形態、例えば、凍結乾燥粉末、または水分不含の濃縮物を、アンプルまたはサシェットなどの活性成分の量を表示した気密容器に容れて供給される。該化合物が点滴で投与される場合には、その化合物は、例えば無菌の医薬グレードの水または食塩液を含有している輸注用ボトルと共に供給することができる。該化合物が注射で投与される場合には、無菌の注射用水または食塩液のアンプルを、その成分を投与前に混合するために、提供することができる。
【０２９０】
経口投与用の組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、顆粒剤、粉末剤、乳剤、カプセル剤、シロップ、またはエリキシルの形態とすることができる。経口投与される組成物には任意で、1種以上のもの、例えば、果糖、アスパルテーム、もしくはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウインターグリーン油、もしくはチェリーなどの香料；着色剤；及び保存剤などを含有させて服用の際に心地よい医薬品を提供することができる。さらに、錠剤または丸剤では、該組成物をコートして崩壊及び消化管内での吸収を遅らせ長い時間をかけて徐々に作用させるようにすることができる。経口投与される化合物には、浸透圧の点で活性の駆動化合物を取り囲む選択的透過性を有する膜もまた、適切なものである。これら後者の足場(プラットフォーム)の場合には、カプセルを取り囲む環境から液体が駆動化合物によって吸収され、それが膨潤して孔を通じて薬剤または薬剤の組成物が放出される。これらの送達のプラットフォームは、即時放出剤型のスパイクを有するプロフィール(放出曲線)とは反対に、本質的に０次の送達プロフィールを提供する。グリセロールモノステアラートまたはグリセロールステアラートなどの徐放性材料も用いることができる。経口投与用の組成物には、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、その他の標準的な担体を含めることができる。そのような担体は好ましくは医薬グレードのものである。
【０２９１】
ある特定の疾患または病状の治療に有効な該化合物またはその製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物の量はその疾患または病状の性質の如何により、それは標準的な臨床の技法で定めることができる。さらに、最適な投与量の範囲を求めるために、in vitroまたはin vivoのアッセイを任意で行うことができる。該組成物中で用いるべきと正確な投与量はまた、投与経路、疾患または病状の重篤度の如何にもより、担当医の判断及び各患者の状況に従って決定すべきである。しかし、非経口投与または経口投与のいずれかを意図している液状の組成物の投与量の範囲は、適切な投与量が得られることとなるような本発明の化合物の量を含んだものでなければならない。典型的には、この量は組成物中で重量比でその化合物が少なくとも約0.01%である。経口投与を意図する場合には、この量を組成物の重量の約0.1%から約80%までの範囲で変えることができる。好ましい経口投与用組成物は組成物の重量の約4%から約50%の化合物を含有する。本発明の好ましい組成物及び製剤は、非経口投与の投与量ユニットが、その非経口投与量ユニットの重量の約0.01%から約2%、好ましくは約0.01%から約2%の化合物を含有するように調製される。静脈注射用には、製剤は好ましくは、患者に投与される量が約1から約250mg/kg体重の所望のコンジュゲートの量となるように調製される。好ましくは、投与される量は約4から約25mg/kg体重のコンジュゲートである。
【０２９２】
該医薬組成物は局所投与を意図したものとすることができ、その場合には、担体は溶液、乳剤、軟膏、またはゲル基剤を含んでなる適切なものとすることができる。例えば、基剤は下記の1種以上のものを含んでなるものとすることができる：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱物油、水やアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤及び安定化剤。濃化剤を局所投与用の医薬組成物中に加えることができる。経皮投与を意図する場合には、該組成物は経皮パッチ、またはイオン導入器具を含めることができる。局所用剤型は本発明の化合物を約0.1%から約10%(ユニット液量あたりの重量)の濃度で含有させることができる。
【０２９３】
該組成物は、例えば直腸内で融解して薬剤を放出する坐剤の形態で直腸投与用とすることができる。直腸投与用の組成物は、適切な非刺激性の賦形剤として油性の基剤を含有することができる。そのような基剤としては、限定はされないが、ラノリン、カカオ脂、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０２９４】
該組成物には固体または液状の投与ユニットの物理的形態を改変する種々の物質を含めることができる。例えば、該組成物には、有効成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を含めることができる。そのようなコーティングシェルを形成する物質は、典型的には不活性であって、例えば、砂糖、シェラック、及びその他の腸溶性コーティング剤から選択することができる。あるいはまた、その有効成分をゼラチンカプセル中に容れることができる。
【０２９５】
本発明の医薬組成物は気体状の投与ユニットからなるものとすることができ、例えばエアロゾルの形態中に容れることができる。エアロゾルという用語は、コロイド状のものから加圧パッケージまでの範囲の様々なシステムを意味する。薬剤の送達は液状化もしくは圧縮ガスによって、または有効成分を送り込むポンプシステムによって行うことができる。本発明の化合物のエアロゾルは有効成分を送達するために、単相、二相、または三相システムで送達させることができる。エアロゾルの送達には、必要な、容器、アクチベーター、ヴァルヴ、副容器、スペーサー、及び類似のものが含まれ、それらを併せてキットとすることができる。好ましいエアロゾルは当業者であれば不適当な実験を行うことなく決定することができる。
【０２９６】
本発明の医薬組成物は、それが固体、液体、または気体の形態のいずれであっても、癌の治療に用いられる1種以上の既知の医薬品を含有することができる。
【０２９７】
該医薬組成物は製薬業界でよく知られた方法で調製することができる。例えば、注射で投与することを意図した組成物は、本発明の化合物を水と混合して溶液の形態となるように調製することができる。均一な溶液または懸濁液の形成を容易にするために界面活性剤を添加することができる。界面活性剤は本発明の化合物と非共有結合で相互作用して、水性の送達システム中での活性化合物の溶解または均一な懸濁を可能にする。
【０２９８】
化合物の生物学的活性と有用性
本発明は、生物学的に活性な化合物及びプロドラッグ(集合的に、化合物、または本発明の化合物、とする)、本発明の化合物の調製方法、本発明の化合物を含んでなる医薬組成物、ならびに被験動物における癌及びその他の腫瘍の治療方法を提供する。例えば、本発明は、製薬上許容し得る様式で、本発明の化合物または組成物の製薬上有効な量を用いて、被験動物が治療されることとなる腫瘍を治療するための方法で用いられる化合物と組成物を提供する。
【０２９９】
癌の治療
本発明の化合物と組成物は哺乳類の癌の治療のための様々な状況で用いることができる。該mAb-ペンタペプチドコンジュゲートは細胞毒性を有する薬剤を腫瘍細胞に送達するために用いることができる。理論に拘束はされないが、該抗体は腫瘍関連抗原と結合すると、受容体がメディエートするエンドサイトーシスによって細胞内部に取り込まれてエンドソーム及びリソソームに入り込む。これらの細胞内小胞は酸性であり、薬剤とmAbとの間の酸に感受性のリンカー結合、例えばヒドラゾン結合の加水分解を誘導することができる。さらに、エステル結合をプロテアーゼ及びエステラーゼで切断することができ、それらの酵素はリソソーム内に豊富に存在しているものである。放出された薬剤は細胞質内を自由に移動して細胞傷害活性を誘導する。あるいはまた別の1実施形態においては、その薬剤は細胞外でコンジュゲートから切断された後に細胞内に侵入する。
【０３００】
ある特定の腫瘍のタイプに対するmAbの特異性は、該イムノコンジュゲートで治療されることとなる腫瘍を指令する。例えば、BR96-ペンタペプチドコンジュゲートは肺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、及び膵臓癌を含む抗原陽性癌を治療するために用いることができる。抗CD30-ペンタペプチドコンジュゲート及び抗CD40-ペンタペプチドコンジュゲートは血液の悪性腫瘍の治療に用いることができる。
【０３０１】
本発明の化合物、組成物、及び方法を用いて治療することのできるその他の特定のタイプの癌としては、限定はされないが、表１に示したものが含まれる。
【０３０２】
表１
固形癌としては、限定はされないが、次のものが含まれる：
線維芽細胞肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、咽喉癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、甲状腺髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、原発性肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウイルムス腫瘍、子宮頚部癌、子宮体癌、睾丸癌、小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫，星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫。
【０３０３】
血液の癌としては、限定はされないが、次のものが含まれる：
急性リンパ性白血病"ALL"、急性リンパ性B細胞白血病、急性リンパ性T細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病"AML"、急性前骨髄球性白血病"APL"、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ性白血病、急性未分化型白血病、慢性骨髄性白血病"CML"、慢性リンパ性白血病"CLL"、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫。
【０３０４】
急性及び慢性白血病 : リンパ芽球性、骨髄性、リンパ性、骨髄細胞性の白血病。
【０３０５】
真正赤血球増加症。
【０３０６】
リンパ腫：
ホジキン病、非ホジキンリンパ腫。
【０３０７】
多発性骨髄腫。
【０３０８】
ワルデンストレーム・マクログロブリン血症。
【０３０９】
Ｈ鎖病。
【０３１０】
本発明の化合物及び組成物はまた、標的を設定しない形態の化学療法剤としても用いることができる。例えば、該ペンタペプチド薬剤はそれ自体を、または該薬剤リンカーコンジュゲートから抗体部分を除いたものを卵巣、CNS、腎臓、肺、結腸、悪性黒色腫、及び血液の腫瘍に対して用いることができる。
【０３１１】
非常に強力な薬剤を腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体とコンジュゲートさせると特別なターゲティングがもたらされ、従ってこれらの化合物の全身毒性を低減させる。pH感受性のリンカーは血液中でのコンジュゲートの安定性をもたらすが、酸性の細胞内コンパートメント内では加水分解されて活性薬剤を放出しうる。
【０３１２】
自己免疫疾患の治療
本発明の化合物、その製薬上許容し得る塩及び溶媒化合物、ならびに組成物はまた、自己免疫疾患に関連する自己抗体を産生する細胞を殺滅するかまたは増殖を阻害することによって、自己免疫疾患の治療にも用いることができる。
【０３１３】
本発明の化合物、組成物、及び方法で治療することのできる特定のタイプの自己免疫疾患としては、限定はされないが、表２に示すものが含まれる。
【０３１４】
表２
活動性慢性肝炎、アディソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、関節炎、アトピー性アレルギー、ベーチェット病、心筋症、セリアック病、コーガン症候群、寒冷凝血素症、クローン病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、紅斑、線維筋痛、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、グレーブス病、ギラン-バレー症候群、橋本病、特発性副腎萎縮、特発性肺線維症、IgA腎症、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、Lambert-Eaton筋無力症候群、扁平苔癬、ルポイド肝炎、狼瘡、リンパ球減少症、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、多内分泌腺機能低下症候群、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺亢進、B型インスリン抵抗性、I型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症。
【０３１５】
他の治療法との組み合わせによる癌の治療
癌または新生物疾患、それには限定はされないが新生物、腫瘍、転移、または制御されない細胞の増殖を特徴とする疾患もしくは障害のいかなるものをも含み、それらは本発明の化合物及び組成物の投与によって治療または予防することができる。
【０３１６】
別の実施形態においては、本発明の化合物、またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の1種以上を含んでなる組成物が、放射線療法及び/または化学療法剤の1種もしくは組み合わせ、好ましくはその化学療法剤での癌の治療が難治性でないことが見出されているような1種以上の化学療法剤と共に投与される。本発明の化合物、またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物はその癌の治療として手術を行った患者に対しても投与することができる。
【０３１７】
別の特別な1実施形態においては、本発明は、化学療法及び/または放射線療法での治療に難治性を示した癌の治療もしくは予防のための方法を提供する。
【０３１８】
特別な1実施形態においては、本発明の化合物、またはその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物の1種以上を含んでなる組成物は化学療法または放射線療法と同時に投与される。別の特別な1実施形態においては、化学療法または放射線療法は、本発明の組成物の投与の前または後、好ましくは少なくとも、本発明の治療剤の投与後、1時間、5時間、12時間、1日間、1週間、1ヶ月間、より好ましくは数ヶ月間(例えば、3ヶ月間まで)に実施される。
【０３１９】
本発明の組成物の投与と同時に、または投与前もしくは投与後に行われる化学療法または放射線療法は当分野で既知のどのような方法によっても行うことができる。化学療法剤は好ましくは、一連のセッションで投与され、上記に列挙した化学療法剤のいずれか1種または組み合わせで投与することができる。放射線療法に関しては、治療しようとする癌のタイプの如何によってどのような放射線療法プロトコールをも用いることができる。例えば、限定はされないが、X線照射を行うことができ；とりわけ高エネルギーのメガボルテージ(1MeVのエネルギーより大きなエネルギーでの照射)を深部の腫瘍に用いることができ、電子ビーム及び常用電圧でのX線照射を皮膚癌に用いることができる。γ線放射性のラジオアイソトープ、例えば放射性のラジウム、コバルト、及びその他の元素などを、組織を放射線に暴露するために投与することもできる。
【０３２０】
さらに、本発明は、化学療法または放射線療法では毒性が強すぎることが立証されているかまたは立証されうる場合、例えば、治療を受ける被験者にとって許容しがたい、または耐えられない副作用がもたらされるような場合、本発明の組成物を化学療法または放射線療法の代替法として用いる、癌または新生物疾患の治療方法を提供する。本発明の組成物での治療を受ける被験者は、任意で、手術、放射線療法、または化学療法などの他の治療方法を、どの治療法が許容しうるか、または耐えられるかの如何によって用いて治療を受けることができる。
【０３２１】
本発明の組成物はまた、ある種の癌、それらは限定はされないが、白血病及びリンパ腫をふくむものだが、それらの治療のためにin vitroの治療法でも用いることができ、そのような治療法は自家の幹細胞移植を含まれている。この方法には多くのステップが含まれ、患者の自家の造血幹細胞を取り、癌細胞を全て取り除き、次いで患者体内に残っている骨髄細胞集団を、高投与量の本発明の組成物の投与＋/−多量の放射線療法で根絶させ、移植する幹細胞をその患者に輸注して戻し入れ、骨髄機能の復旧と患者の回復の間は指示的ケアが行われるものである。
【０３２２】
組み合わせ治療
本発明の特定の実施形態においては、該化合物ならびにその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物は少なくとも1つの他の治療用薬剤と組み合わせて用いることができる。
【０３２３】
該化合物及び他の治療薬剤は付加的に作用するか、またはより好ましくは、共同して作用することができる。好ましい1実施形態においては、ある化合物を含んでなる組成物は1種以上の付加的治療薬剤の投与と同時に投与され、その薬剤は該化合物を含んでいる組成物と同一組成物の一部であるか、または異なる組成物中にあるものとすることができる。別の1実施形態においては、該化合物を含んでなる組成物は、別の治療薬剤の投与に先駆けて、またはその投与の後に、投与される。
【０３２４】
特定の実施形態においては、該化合物は1種以上の抗癌剤及びその製薬上許容し得る塩または溶媒化合物と組み合わせて用いられる。適切な抗癌剤としては、限定はされないが、メトトレキセート、タキソール、L-アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カーボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、トポテカン、ナイトロジェンマスタード、シトクサン、エトポシド、5-フルオロウラシル、BCNU、イリノテカン、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、及びドセタキセルが含まれる。好ましい1実施形態においては、本発明の1種以上の組成物が、1種以上の化学療法剤、または抗癌剤、それらとしては限定はされないが表３に示したものが含まれ、それらと組み合わせて、癌または新生物疾患の治療または予防のために用いられる。
【０３２５】
表３
アルキル化剤
ナイトロジェンマスタード： シクロフォスファミド、イフォスファミド、トロフォスファミド、クロラムブシル
ニトロソウレア： カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)
アルキルスルフォン酸塩： ブスルファン、トレオスルファン、
トリアジン: ダカルバジン
白金含有化合物: シスプラチン、カーボプラチン
植物アルカロイド
ビンカアルカロイド: ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン
タキソイド: パクリタキセル、ドセタキセル
DNA トポイソメラーゼ阻害剤
Epipodophyllins : エトポシド、テニポシド、トポテカン、9-aminocamptothecin、カンプト(イリノテカン)、
マイトマイシン類: マイトマイシン C
代謝拮抗剤
抗葉酸剤:
DHFR 阻害剤: メトトレキセート、トリメトレキセート
IMPデヒドロゲナーゼ阻害剤 : ミコフェノール酸、Tiazofurin、リバビリン、EICAR
リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤: ヒドロキシウレア、デフェロキサミン
ピリミジン類似体:
ウラシル類似体 5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、Ratitrexed
シトシン類似体 シタラビン(ara C)、シトシンアラビノシド、フルダラビン、
プリン類似体: メルカプトプリン、チオグアニン
ホルモン療法剤 :
受容体アンタゴニスト:
抗エストロゲン剤： タモキシフェン、ラロキシフェン、メゲストロール
LHRH アゴニスト: goscrclin、酢酸ロイプロリド
抗アンドロゲン剤 : フルタミド、ビカルタミド
レチノイド / デルトイド
ビタミン D3 類似体: EB 1089、CB 1093、KH 1060
光線力学療法剤: vertoporfin (BPD-MA)、Phthalocyanine、 photosensitizer Pc4、Demethoxy-hypocrellin A (2BA-2-DMHA)、
サイトカイン類： インターフェロン-α、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子
その他:
イソプレニル化阻害剤 : ロバスタチン
ドーパミン作用性神経毒素: 1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン
細胞サイクル阻害剤: スタウロスポリン
アクチノマイシン類: アクチノマイシン D、ダクチノマイシン
ブレオマイシン類 : ブレオマイシン A2、ブレオマイシン B2、ペプロマイシン
アントラサイクリン類: ダウノルビシン、ドキソルビシン (アドリアマイシン)、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、
MDR 阻害剤: ベラパミル
Ca²⁺ATPase阻害剤: thapsigargin
別の好ましい1実施形態においては、自己免疫疾患の治療のために、該化合物を1種以上の免疫抑制剤及びその製薬上許容し得る塩もしくは溶媒化合物と組み合わせて用いることができる。好ましい1実施形態においては、そのような免疫抑制剤としては、限定はされないが、シクロスポリン、シクロスポリンA、mycophenylate mofetil、sirolimus、tacrolimus、enanercept、プレドニゾン、及びアザチオプリンが含まれる。
【０３２６】
また別の1実施形態においては、その他の治療用薬剤も治療に伴って起こりうる副作用の低減のための補助剤として用いることができ、それは例えば、制吐剤などである。適切な制吐剤としては、限定はされないが、メトクロプロミド、ドンペリドン、プロクロルペラジンプロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシンモノエタノールアミン、alizapride、アゼセトロン、ベンズキナミド、bietanautine、bromopride、ブクリジン、clebopride、シクリジン、ジメンヒドリネート、ジフェニドール、dolasetron、メクリジン、methallatal、metopimazine、nabilone、oxyperndyl、pipamazine、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカナビノール、thiethylperazine、チオプロペラジン、及びtropisetronが含まれる。
【０３２７】
本発明の化合物と組成物はまた、癌と自己免疫疾患の合併を同時に治療するために、単独で、または、1種以上の抗癌剤、及び1種以上の免疫抑制剤と組み合わせて用いることもできる。
【０３２８】
本発明の遊離の薬剤は標的を定めない形態の化学療法剤として用いることもできる。例えば、本発明のペンタペプチドを卵巣、CNS、肺、結腸、悪性黒色腫、及び血液の腫瘍に対して用いることができる。
【０３２９】
これらの非常に強力な薬剤を腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体にコンジュゲートさせると特異的なターゲティングがもたらされ、従ってこれらの化合物の全身毒性が低減される。pH感受性のリンカーはコンジュゲートの血液中での安定性をもたらすはずであるが、安定化されても細胞内の酸性のコンパートメント内で加水分解されて活性な薬剤を放出するはずである。
【０３３０】
下記の実施例は説明のために示すものであり、限定するものではない。
【０３３１】
実施例
実施例1-4に記載の化学反応は図1-3に示したスキームで説明している。実施例5及び6に記載の化学反応は図4に示したスキームで説明している。実施例7に記載の化学反応は図5に示したスキームで説明している。化合物36を調製するための実施例8に記載の化学反応は図6に示したスキームで説明し、化合物36の抗体へのコンジュゲーションは図10に説明している。化合物38を調製するための実施例9に記載の化学反応は、図7に示したスキームで説明している。実施例10及び11に記載の化合物40a及び40bを作製するための化学反応は、図8に示し、40aの抗体へのコンジュゲーションは図11で説明している。実施例12に記載の薬剤-リンカー-mAb 42の調製は図9に示したスキームで説明している。実施例13に記載のペンタペプチド47とヘテロ二官能性リンカーとの反応は図12に示したスキームで説明し、このスキームでは薬剤-リンカー-抗体コンジュゲートmAb-S-48の形成をも示している。図13のスキームは、実施例14に記載のペンタペプチド49の調製法を示している。実施例15、16、17、及び18で示した合成に関する説明はそれぞれ、図14、15、16、及び17に示したスキームで説明している。
【０３３２】
カップリング方法 A ： DEPC を用いたペプチド合成
無水CH₂Cl₂(10mL)中に[2S-[2R^*(αS^*,βS^*)]]-1-[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]-p-メトキシ-α-メチル-2-ピロリジンプロパン酸(t-Boc-ドラプロリン(20) 0.27 g, 0.94ミリモル)を含む冷却した溶液(氷浴)に定められたアミン(1.03ミリモル, 1.1eq.)を添加し、その後トリエチルアミン(0.40mL, 2.8ミリモル, 3.0eq.)及びDEPC(0.17 mL, 90 %, 1.03ミリモル, 1.1 eq.)を添加する。この結果得られる溶液をアルゴン雰囲気下で12時間撹拌する。溶媒を室温、減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフィーにかける(シリカゲルカラム、溶出液としてヘキサン-アセトン 4:1を使用)。TLC分析で選択した画分から溶媒を蒸発させた後、残渣を真空下で一晩乾燥してアミドを得る。
【０３３３】
カップリング方法 B ： PyBrop を用いたペプチド合成
アミノ酸(1.0eq.)、必要であればカルボキシル保護基を含有したアミノ酸を無水CH₂Cl₂中に溶解し、その後ジイソプロピルエチルアミン(1.5eq.)を添加した。Fmoc-、Z-、またはジメチルアミノ酸/ペプチド(1.1eq.)を１部、固体で添加し、溶解させた混合物にPyBrop(1.2eq.)を添加した。反応はTLCまたはHPLCでモニターした。
【０３３４】
一般的方法 C ：ペンタペプチド合成
CH₂Cl₂(10ml)中にジペプチド及びトリペプチド(各1eq.)を含む溶液とトリフルオロ酢酸(5mL)を2時間撹拌する(N₂雰囲気下で氷浴)。反応はTLC、または好ましくはHPLCでモニターすることができる。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエン中に溶解する。溶媒を再度、真空下で除去し、このプロセスを反復する。残渣を高度真空下で12時間乾燥し、乾燥CH₂Cl₂中に溶解し、その後ジイソプロピルエチルアミン(1.5eq.)を添加する。残渣の如何によるが、ペプチドをPyBropまたはDEPC(1.2eq.)のどちらかを用いてカップリングさせることができる。この反応混液をTLCかHPLCでモニターする。
【０３３５】
一般的方法 D ：水素化分解を介する Z- の除去
大きな、重い壁面を有するフラスコを用いて、Z-で保護されたアミノ酸またはペプチドの溶液をエタノール中に溶解した。10%パラジウムまたは炭素を添加し(0.1% w/w ペプチド)、その混合液をH₂に導入した。反応の進行はHPLCでモニターし、典型的には1〜2時間以内に反応の完了が見られた。フラスコの内容物を、あらかじめ洗浄したセライトのパッドを通過させてろ過し、次いでそのセライトをメタノールで洗う。溶出液を蒸発させて油状とし、トルエン中に溶解し、再度蒸発させる。
【０３３６】
一般的方法 E ：ジエチルアミンを用いた Fmoc- の除去
Fmoc-含有の化合物をCH₂Cl₂中に溶解し、それに等量のジエチルアミンを添加する。反応の進行はTLC(またはHPLC)でモニターし、反応は通常は2時間以内で完了する。溶媒を真空中で除去し、残渣をトルエン中に取り再度濃縮する。残渣を高度真空下で少なくとも1時間乾燥する。
【０３３７】
一般的方法 F ：ヒドラゾンの形成
ヒドラゾン形成は室温で無水MeOH、0.01% AcOH(典型的には、10mgの薬剤あたり1mL)中で行う。反応時間(6時間〜5日間)及びヒドラジドの量(2〜30eq.)は用いるケトンによって変わる。反応の進行はC₁₈RP-HPLCでモニターする。典型的には、新たに形成されたアシルヒドラジンは親のケトンと比較すると保持時間がより低い。反応完了後、その反応混液にDMSO(1〜2mL)を添加し、減圧下でメタノールを除去する。分取HPLCでの精製のため、残渣を直接C₁₈RPカラム(Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 100mM TEAAバッファー, pH 7.0中にMeCNの直線的グラディエントを10%から95%まで、流速4mL/分)にロードする。適切な画分を減圧下で濃縮し、アセトニトリル(4 x 25mL)と同時蒸発させ、最後に高度真空で2日間乾燥する。
【実施例１】
【０３３８】
化合物 29a の調製
【化１０５】

【０３３９】
化合物 14a の調製
化合物14aはカップリング方法Bに従って化合物12と13aを反応させて調製した。その反応混液を濃縮した後、残渣を逆相分取用HPLCカラム(Varian Dynamax カラム 21.4 mm x 25 cm, 5μ, 100オングストローム, 25% MeCN水溶液 20 mL/minでのアイソクラティックな溶出を用いた)上に直接的に注入して望ましくないジアステレオマーを除去した。純粋な画分を濃縮して澄明な油として産物を得た。収率 14a: 0.67 g (55 %); ES-MS m/z 493.4 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 256 nm。
【０３４０】
化合物 15a の調製
化合物14aを保護基除去法Dに従って処理して、化合物15aを得た。
【０３４１】
化合物 18a の調製
化合物15aと16をカップリングさせ、その性質はPettitら, J. Chem. Soc. Perk I, 1996, 859に報告されたとおりであった。
【０３４２】
[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2- ヒドロキシ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-1- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]- ピロリジン -l- カルボン酸 -t- ブチルエステル (25) の調製
t-Boc-ドラプロリン20及び(lS,2R)-ノルエフェドリン21をDEPCとトリエチルアミンの存在下で一般的方法Aに従って結合させて(米国特許第5,635,483号, Pettitら、も参照せよ)化合物25を得た。
【０３４３】
N,N- ジメチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2- ヒドロキシ - メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- バリナミド (29a, オーリスタチン E) の調製
化合物18a及び25を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ(1:1)、その後、DEPC及びトリエチルアミンで処理して方法Cを用いて化合物29aを得た。この化合物の合成も米国特許第5,635,483号、及びPettitら, Anti-Cancer Drug Des. 1998, 243に報告されている。
【実施例２】
【０３４４】
化合物 29b の調製
【化１０６】

【０３４５】
化合物 14b の調製
カップリング方法Bに従って、このペプチドを化合物12及び13aを用いて調製した。反応混液を濃縮した後、残渣をC₁₈分取用HPLC(Varian Dynamax カラム 21.4 mm x 25 cm, 5μ, 100オングストローム, 25% MeCN水溶液 20 mL/minでのアイソクラティックな溶出を用いた)で精製して望ましくないジアステレオマーを除去した。純粋な画分を濃縮して澄明な油を得た。収率 14b: 0.67g (55 %); R_f0.32 (4:1 ヘキサン-アセトン); UV λmax 215, 256 nm ;¹H NMR (CDC13) δ 7.14-7.40 (5 H, m), 6.19 (1 H, d, J=9.3 Hz), 5.09 (2 H, s), 4.53 (1 H, dd, J=6.6, 9.3 Hz), 3.34 (3 H, s), 2.97(3 H, s), 2.25-2.50 (2 H, m), 1.50-1.78 (3 H, m), 1.46 (9 H, s), 0.99 (3 H, d, J= 6.9 Hz), 0.96 (3 H, d, J=6.9 Hz), 0.89 (3 H, t, J=6.9 Hz), 0.83 (3 H, t, J=7.2 Hz)。
【０３４６】
化合物 15b の調製
保護基除去法Dに従って化合物14bを処理して化合物15bを得た。
【０３４７】
化合物 18b の調製
化合物15bと16を方法Aを用いて結合させ、化合物18bを得た：収率 18b: 0.19g (82%); ES-MS m/z 500.5 [M+ H]⁺; Rf 0.12 (4:1 ヘキサン-アセトン); UV λ_max215 nm。
【０３４８】
N,N- ジメチル -L- バリル -N-[(1S, 2R)-4-[(2S)-2-[(lR, 2R)-3-[[(lR, 2S)-2- ヒドロキシ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- イソロイシナミドの調製
一般的方法Cに従って、化合物18b及び25を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びトリエチルアミンで処理した。その反応混液を分取用HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 100mM 炭酸トリエチルアンモニウム水溶液中のMeCNの直線的グラディエントを10%から100%まで40分で、その後0%バッファーで20分間、流速20mL/分)で精製した。産物は、所望のHPLC画分の濃縮後、わずかに灰色がかった白色の固体として単離された。収率 29b: 85mg(60%); ES-MS m/z 746.5 [M+ H]⁺; UV λ_max215nm。
【実施例３】
【０３４９】
化合物 31a の調製
【化１０７】

【０３５０】
化合物 19a の調製
方法Aを用いて化合物15aと17を結合させて化合物19aを得た： 107mg(50%); ES-MS m/z 694.7 [M+ H]⁺; R_f0.64(1:1 ヘキサン-EtOac); UV λ_max215, 265nm。
【０３５１】
化合物 30a の調製
一般的方法Cに従って、化合物19a及び25(実施例１に記載のとおり調製)を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びトリエチルアミンで処理した。その反応混液をHPLCでモニターし、4時間後、水を加えて層を分離した。乾燥後(MgSO₄)、内容物をろ過し、溶媒を除去して化合物30aを得て、それをさらに精製することなく次のステップに用いた。 30a: 127mg(91%); ES-MS m/z 940.9 [M+ H]⁺。
N- メチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2- ヒドロキシ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- バリナミド (31a) の調製
Fmoc-で保護されたペプチドを保護基除去法Eに従ってジエチルアミンで処理した。HPLCでは12時間後に反応の完了が観察された。その反応混液を濃縮して油を得て、それを分取用HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを25%から70%まで5分間で、その後70%で30分間、流速20mL/分)で精製した。所望のHPLC画分をプールし、濃縮して、わずかに灰色がかった白色の固体を得た。収率 31a: 37mg (38%); ES-MS m/z 718.7 [M+ H]⁺; UV λ_max215 nm。
【実施例４】
【０３５２】
化合物 31b の調製
【化１０８】

【０３５３】
化合物 19b の調製
方法Aを用いて化合物15bと17を結合させて化合物19bを得た： 収率19b: 0.50g(73%); UV λ_max215, 265nm。
【０３５４】
化合物 30b の調製
一般的方法Cに従って、化合物19b及び25(実施例１に記載のとおり調製)を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びトリエチルアミンで処理した。その反応混液を分取用HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを25%から70%まで5分間で、その後70%で30分間、流速20mL/分)で精製した。所望のHPLC画分を濃縮して、産物をわずかに灰色がかった白色の固体として単離した。収率 30b: 64mg (53%); ES-MS m/z 955.2 [M+ H]⁺; UV λ_max215,265 nm。
【０３５５】
N- メチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2- ヒドロキシ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- バリナミド (31b) の調製
Fmoc-で保護されたペプチド30bを保護基除去法Eに従ってジエチルアミンで処理した。HPLCでは2時間後に反応の完了が観察された。その反応混液を濃縮して油を得た。過剰のエーテルを添加して白色の沈殿を得て、内容物を0℃まで3時間冷却した。産物をろ過し、高度真空下でその固形物を乾燥した。収率 31b: 47mg (95%); ES-MS m/z 732.8 [M+ H]⁺; UV λ_max215 nm。
【実施例５】
【０３５６】
化合物 32 の調製
【化１０９】

【０３５７】
[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S)- ヒドロキシメチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]- ピロリジン -1- カルボン酸 -t- ブチルエステル (26) の調製
一般的方法Aに従って、t-Boc-ドラプロリン(20)と(S)-(-)-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール(L-フェニルアラニノール、22)からジペプチド26を合成した。収率 26: 0.50g (55%); ES-MS m/z 421.0 [M+ H]⁺; R_f0.24 (100 % EtOAc); UV λ_max215, 256 nm。^lH NMR (CDC1₃) δ 7.14-7.40 (5 H, m), 6.19 (1 H, d, J=7.8 Hz), 4.11-4.28 (1 H, m), 3.44 (3 H, s), 3.20-3.84 (5 H, m), 2.80-3.05 (2 H, m), 2.20-2.38 (2 H, m), 1.65-1.98 (4 H, m), 1.48 (9 H, s), 1.16 (3 H, d, J=5.7 Hz)。
【０３５８】
化合物 32 の調製
一般的方法Cに従って、化合物26(42mg, 0.1ミリモル, 1eq.)及び18a(65mg, 0.13ミリモル, 1.3eq.)を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びジイソプロピルエチルアミンで処理した。その反応混液を分取用HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを25%から70%まで5分間で、その後70%で30分間、流速20mL/分)で精製した。所望のHPLC画分を濃縮して、産物をわずかに灰色がかった白色の固体として単離した。収率 32: 60mg (80%); ES-MS m/z 732.2 [M+ H]⁺; UV λ_max215,265 nm。
【実施例６】
【０３５９】
化合物 33 の調製
【化１１０】

【０３６０】
[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R)- ヒドロキシメチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]- ピロリジン -1- カルボン酸 -t- ブチルエステル (27) の調製
一般的方法Aに従って、t-Boc-ドラプロリン(20)と(R)-(+)-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール(D-フェニルアラニノール、23)からジペプチド27を合成した。収率 27: 0.53g (58 %); ES-MS m/z 421.0 [M+ H]⁺; R_f0.24 (100 % EtOAc); UV λ_max215, 256 nm。¹H NMR (CDC1₃) δ 7.14-7.40 (5 H, m), 6.19 (0.5 H, d, J=5.4 Hz), 5.75 (0.5 H, d, J=5.4 Hz), 4.10-4.23 (1 H, m), 3.38 (3 H, s), 3.10-3.85 (4 H, m), 2.82-2.96 (2 H, m), 2.10-2.36 (2 H, m), 1.66-1.87 (4 H, m), 1.47 (9 H, bs), 1.16 (1.5 H, d, J=6.6 Hz), 1.08 (1.5 H, d, J=5.7 Hz)。
【０３６１】
化合物 33
一般的方法Cに従って、化合物27(42mg, 0.1ミリモル, 1eq.)及び18a(65mg, 0.13ミリモル, 1.3eq.)を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びジイソプロピルエチルアミンで処理した。その反応混液を分取用HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを25%から70%まで5分間で、その後70%で30分間、流速20mL/分)で精製した。所望のHPLC画分を濃縮して、産物をわずかに灰色がかった白色の固体として単離した。収率 33: 34mg (46%); ES-MS m/z 732.1 [M+ H]⁺; UV λ_max215,265 nm。
【実施例７】
【０３６２】
化合物 34 の調製
【化１１１】

【０３６３】
化合物 28 の調製
ジペプチド28はBoc-ドラプロリン20とp-アセチルフェネチルアミン(米国特許第3,445,518号, 1969)とを、カップリング方法Bに従って反応させて調製する。反応混液を濃縮した後、残渣を逆相分取HPLC、またはSiO₂クロマトグラフィーで精製する。
【０３６４】
N,N- ジメチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[( アセチルフェニル ) エチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- バリナミド (34) の調製
一般的方法Cに従って、ジペプチド28とトリペプチド18aを塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びジイソプロピルエチルアミンでカップリング反応を行う。その反応混液を、他のペプチド化合物で既に述べたような通常の分取HPLC法で精製する。
【実施例８】
【０３６５】
化合物 36 の調製
N,N- ジメチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R)-2- オキソ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- バリナミド (35) の調製
CH₂Cl₂(2mL)とピリジン(50μL)中にオーリスタチン E(29a)(10mg, 0.014ミリモル, 1eq.)を含む溶液にクロロクロム酸ピリジニウム(PCC)(13.6mg, 0.06ミリモル, 4.5eq.)を添加した。その反応混液を室温で3時間撹拌した。その反応混液のHPLC分析では、10.2分の位置のピークが異なるUVスペクトル(max 245nm, ショルダー 280nm)を有する新たな11.3分の位置のピークへと完全に転換したことを示していた。その産物をCH₂Cl₂中のMeOHの段階グラディエントを0%から10%として、シリカゲルカラム(120 x 12mm)上でフラッシュクロマトグラフィーで精製した。真空中で濃縮した後、残渣をヘキサンと共に粉砕して白色固体を得た。収率 35: 6.4mg (64%); R_f0.3 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1); UV λ_max215, 245 nm。 HRMS m/z : 実測値 730.5119 [M+ H]⁺。C₄₀H₆₈N₅O₇は計算上730.5108を必要とする。
【０３６６】
ヒドラゾン 36 の調製
化合物35から一般的方法Fに従って、30eq.のマレイミドカプロイルヒドラジドと3日間反応させることによって化合物36を調製した。収率 36: 無色のガラス状物質2.4mg (43 %); UV λ_max215, 240 (ショルダー) nm。 HRMS m/z: 実測値 937.6131 [M+ H]⁺. C₅₀H₈₁N₈O₉は計算上937.6127を必要とする。
【実施例９】
【０３６７】
化合物 38 の調製
オーリスタチン E のレブリン酸エステル (37) の調製
無水CH₂Cl₂(1mL)中にオーリスタチン E(29a, 3.6mg, 0.005ミリモル, 1eq.)を含む溶液にレブリン酸(2.5μL, 0.025ミリモル, 5eq.)を添加した後、DCC(5mg, 0.025ミリモル, 5eq.)とDMAP(1mg, cat)を添加した。室温で一晩反応させた後、C₁₈RP-HPLCで分析したところ、新規のより疎水性の産物の形成が認められた。沈殿したDCUをろ過して除いた。この結果得られたケトエステルを、CH₂Cl₂中のMeOHの段階グラディエントを0%から10%として、シリカゲル上での分取クロマトグラフィーを用いて単離した。収率 37 : 無色のガラス状物質として3.3mg (80.5%); R_f0.35 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; ES-MS m/z 830 [M+ H]⁺; UV λ_max215 nm。
【０３６８】
ヒドラゾン 38 の調製
化合物37とマレイミドカプロイルヒドラジド(2eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を6時間として化合物38を調製した。収率 38: 白色固体1.3mg (46 %); ES-MS m/z 1037 [M+ H]⁺; UV λ_max215nm
【実施例１０】
【０３６９】
化合物 40a の調製
オーリスタチン E の 4- アセチル安息香酸エステル (39a) の調製
無水CH₂Cl₂(5mL)中にオーリスタチン E(29a, 50mg, 0.07ミリモル, 1eq.)を含む溶液に4-アセチル安息香酸(23.5mg, 0.14ミリモル, 2eq.)を添加した後、DCC(30mg, 0.14ミリモル, 2eq.)とDMAP(5mg, cat)を添加した。室温で一晩反応させた後、C₁₈RP-HPLCで分析したところ、新規のより疎水性の産物の形成が認められた。沈殿したDCUをろ過して除いた。この結果得られたケトエステルを、CH₂Cl₂中のMeOHの段階グラディエントを0%から10%として、シリカゲル上での分取クロマトグラフィーを用いて単離した。この産物をCH₂Cl₂中に5% MeOHを含む液で溶出した。収率 39a: 白色固体57mg (90%) ; R_f0.43 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; UV λ_max215, 250 nm。 HRMS m/z : 実測値 878.5669 [M+H]⁺. C₄₉H₇₆N₅O₉は計算上878.5643を必要とする。 C₄₉H₇₅N₅0₉x H₂0 の計算値は : C, 65.67; H, 8.66; N, 7.81。実測値は : C, 66.05; H, 8.61; N, 7.80。
【０３７０】
ヒドラゾン 40a の調製
化合物39aとマレイミドカプロイルヒドラジド(3eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を12時間として化合物40aを調製した。収率 40a: 固体 3mg (65%); λ_max215, 295 nm。HRMS m/z : 実測値 1085.6665 [M+ H]⁺. C₅₉H₈₉N₈O₁₁は計算上1085.6651を必要とする。C₅₉H₈₈N₈O₁₁x H₂0の計算値は : C, 64.22 ; H, 8.22; N, 10.16。 実測値: C, 64.27; H, 8.21; N, 9.92。
【実施例１１】
【０３７１】
化合物 40b の調製
N,N- ジメチル -L- バリル -N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2- ヒドロキシ -1- メチル -2- フェニルエチル ] アミノ ]-l- メトキシ -2- メチル -3- オキソプロピル ]-1- ピロリジニル ]-2- メトキシ -l-[(1S)-1- メチルプロピル ]-4- オキソブチル ]-N- メチル -L- イソロイシナミドの 4- アセチル安息香酸エステル (39b) の調製
化合物39bは、実施例１０に記載のとおり、化合物29bをCH₂Cl₂中に4-アセト安息香酸と、DCC、DMAPを添加した溶液中で反応させることによって調製した。収率 39b: 白色固体10.7mg (80%); R_f0.37 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; UV λ_max215, 250 nm。 HRMS m/z : 実測値 892.5775 [M+ H]⁺。 C₅₀H₇₈N₅O₉は計算上892.5800を必要とする。
【０３７２】
ヒドラゾン 40b の調製
化合物39bとマレイミドカプロイルヒドラジド(5eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を18時間として化合物40bを調製した。収率 40b: 固体4.8mg (50%); ES-MS m/z : 1099 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 295 nm。
【実施例１２】
【０３７３】
化合物 42 の調製
DMSO(100μL)中に39a(5mg, 0.0056ミリモル)を含む溶液に、無水MeOH(0.9mL)を添加した後、1% AcOH/MeOH(10μL)を添加した。(3-ブロモアセタミド)-プロピオニルヒドラジド(41)(0.025ミリモル, 4.5eq.)をその溶液に添加した。この反応液を室温で24時間置いた。C₁₈-RPカラム分析ではより低い保持時間の新規化合物の形成が認められた。この反応混液にDMSO(1mL)を添加し、メタノールを減圧下で除去した。残渣を分取HPLCでの精製のためにC₁₈-RPカラム(Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 100mM TEAAバッファー, pH 7.0中にMeCNの直線的グラディエントを10%から95%まで、流速4mL/分)上に直接ロードした。適切な画分を減圧下で濃縮し、アセトニトリル(4 x 25mL)と同時蒸発させ、最後に高度真空で乾燥した。 収率 42: 固体4.0mg (66%); ES-MS m/z : 1084 [M+ H]⁺, 1086 ; λ_max215, 295 nm。
【実施例１３】
【０３７４】
化合物 48 の調製
【化１１２】

【０３７５】
化合物 47
下記に示す化合物47は、実施例１０に記載のとおり、化合物32(8.8mg, 0.012ミリモル)を、CH₂Cl₂中に4-アセト安息香酸と、DCC、DMAPを添加した溶液中で反応させることによって調製した。収率 47: 白色固体7.3mg (70%); R_f0.4 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; ES-MS m/z 878.9 [M+ H]⁺; λ_max215, 250 nm。
【化１１３】

【０３７６】
ヒドラゾン 48 の調製
化合物47(6.4mg, 0.007ミリモル)とマレイミドカプロイルヒドラジド(4eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を4時間として化合物48を調製した。収率 48: 無色のガラス状物質4.3mg (57%); ES-MS m/z : 1085.7 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 294 nm。
【実施例１４】
【０３７７】
化合物 49 の調製
【化１１４】

【０３７８】
化合物49(上記に示す構造)は、実施例１０に記載のとおり、化合物33(8.0mg, 0.01ミリモル)を、CH₂Cl₂中に4-アセト安息香酸と、DCC、DMAPを添加した溶液中で反応させることによって調製した。収率 49: 白色固体8.1mg (92%); R_f0.37 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; λ_max215, 250 nm。HRMS m/z : 実測値 878.5653 [M+ H]⁺。C₄₉H₇₆N₅0₉は計算上878.5643を必要とする。
【実施例１５】
【０３７９】
化合物 51 の調製
【化１１５】

【０３８０】
オーリスタチン E の 5- ベンゾイル吉草酸エステルの調製
化合物50(下記に示す構造)は、実施例１０に記載のとおり、オーリスタチン E(29a, 10mg, 0.014ミリモル)を、CH₂Cl₂中に5-ベンゾイル吉草酸と、DCC、DMAPを添加した溶液中で反応させることによって調製した。収率 50: 淡黄色の油 10mg (79%); R_f0.34 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1) ; UV λ_max215nm。HRMS m/z : 実測値 920.6139 [M+ H]⁺。C₅₂H₈₂N₅0₉は計算上920.6113を必要とする。
【化１１６】

【０３８１】
ヒドラゾン 51 の調製
化合物50(5mg, 0.0054ミリモル)とマレイミドカプロイルヒドラジド(5eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を12時間として化合物51を調製した。収率 51: 白色固体3.5mg (57%); UV λ_max215, 280 nm。HRMS m/z : 実測値 1127.7132 [M+ H]⁺。C₆₂H₉₅N₈O₁₁は計算上1127.7120を必要とする。
【実施例１６】
【０３８２】
化合物 53 の調製
【化１１７】

【０３８３】
オーリスタチン E のアセト酢酸エステルの調製
無水トルエン(5mL)中にオーリスタチン E(29a, 10mg, 0.014ミリモル, 1eq.)、アセト酢酸エチル(9μL, 0.07ミリモル, 5eq.)、及びDMAP(3.5mg, 0.029ミリモル, 2eq.)を含む溶液を10時間還流した。その反応混液を減圧下で濃縮して乾燥させた。残渣を2mLのCH₂Cl₂中に再溶解し、その産物をCH₂Cl₂に10% MeOHを含む液中でシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収率 52 (下記に示す構造): 無色のガラス状物質7mg (60%); R_f0.4 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1); ES-MS m/z : 816.9 [M+ H]⁺; UV λ_max215 nm。
【化１１８】

【０３８４】
ヒドラゾン 53 の調製
化合物52とマレイミドカプロイルヒドラジド(10eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を12時間として化合物53を調製した。ヒドラゾン53は反応速度の研究用に単離することなく用いた。 UV λ_max215nm。
【実施例１７】
【０３８５】
化合物 57 の調製
Boc- フェニルアラニノール -p- アセチルフェノキシエーテル (56) の調製
無水ジオキサン(20mL)中に(S)-(-)-Boc-フェニルアラニノール(54, 0.50g, 2.0ミリモル, 1.0eq.)、4-ヒドロキシアセトフェノン(55, 0.30g, 2.2ミリモル, 1.1eq.)、及びトリフェニルホスフィン(0.80g, 3.0ミリモル, 1.5eq.)を含む溶液を0℃に冷却した。ジイソプロピルアゾジカルボン酸(0.62mL, 3.0ミリモル, 1.5eq.)を2分かけて滴下して添加し、反応は逆相HPLCでモニターした。24時間後、溶媒を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを10%から100%まで40分で、その後100%で20分間、流速20mL/分)で精製した。所望の画分を濃縮して、白色の固体として産物を得た。収率 56: 0.54g (74%); ES-MS m/z 370.2 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 275 nm。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.96 (2 H, d, J=6.9 Hz), 7.18-7.35 (5 H, m), 6.94 (2 H, d, J=8.4 Hz), 4.92 (1 H, bd, J=8.1 Hz), 4.14-4.28 (1 H, m), 3.91-4.02 (2 H, m), 2.99-3.04 (2 H, m), 2.58 (3 H, s), 1.45 (9 H, s)。
【０３８６】
ジペプチド 57 の調製
10mL CH₂Cl₂-TFA(2:1)中に化合物56(70mg, 0.19ミリモル, 1.0eq.)を含む溶液をN₂雰囲気に2時間置いた。HPLCでは反応が完了したことを示していた。その反応混液を濃縮して油を得て、その油はごく少量のジクロロメタン中に取り、ヘキサンで沈殿させた。白色の固体を集め、高度真空下で20時間乾燥した。遊離アミンとt-Boc-ドラプロリン(20)を一般的方法Aに従ってDEPC(1.5eq.)及びトリエチルアミン(3.0eq.)の存在下で結合させた。24時間後、溶媒を真空中で除去し、残渣を分取HPLC(C₁₈-RP, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 水中のMeCNの直線的グラディエントを10%から100%まで40分で、その後100%で20分間、流速20mL/分)で精製した。所望の画分を濃縮して、白色の固体として産物を得た。収率 57: 52mg (51%); ES-MS m/z 538.9 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 275 nm。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.92 (2 H, d, J =7.2Hz), 7.18-7.33 (5 H, m), 6.94 (2 H, d, J=7.5Hz), 6.69 (1/2 H, bd, J=7.2 Hz), 5.98 (1/2 H, bd, J=7.5Hz), 4.46-4.57 (1 H, m), 3.96-4.08 (2 H, m), 3.48-3.88 (3 H, m), 3.38 (3 H, s), 2.92-3.26 (3 H, m), 2.56 (3 H, s), 2.23-2.40 (1 H, m), 1.55-1.90 (4 H, m), 1.49 (4.8 H, s), 1.45 (4.2 H, s), 1.18 (3 H, d, J=6.9Hz)。
【実施例１８】
【０３８７】
化合物 59 の調製
化合物 58 の調製
一般的方法Cに従って、化合物57(25mg, 0.046ミリモル, 1eq.)及び18a(34mg, 0.07ミリモル, 1.5eq.)を塩化メチレン中でトリフルオロ酢酸存在下で結合させ、その後、DEPC及びジイソプロピルエチルアミンで処理した。その反応混液をCH₂Cl₂中のMeOHの段階グラディエントを0%から10%として、シリカゲルカラム上で分離した。産物は5% MeOHで溶出し、濃縮後白色固体として得られた。収率 58: 33mg (85%); R_f0.35 (CH₂Cl₂/MeOH, 10/1); ES-MS m/z 850.7 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 271 nm。
【化１１９】

【０３８８】
ヒドラゾン 59 の調製
化合物58(33mg, 0.04ミリモル)とマレイミドカプロイルヒドラジド(5eq.)から一般的方法Fに従って、反応時間を17時間として化合物59を調製した。収率 59: 無色のガラス状物質 17.3mg (40%); ES-MS m/z : 1057.9 [M+ H]⁺; UV λ_max215, 265 nm。
【実施例１９】
【０３８９】
細胞毒性研究：化合物 29a 及び 39a
いくつかの細胞系統でin vitro細胞毒性実験を行って、オーリスタチン E(29a)の活性をケトエステル39aの活性と比較した。このエステルは広範な細胞系統で細胞毒性を示し、それはL2981細胞でのオーリスタチン E(29a)と同程度の細胞毒性から、Daudi バーキットリンパ腫細胞での約17分の1の細胞毒性までの範囲であった(表４)。
【０３９０】
表４
ｍAb-オーリスタチン Eコンジュゲートの評価のために用いられた細胞系統、及びオーリスタチン E(29a)とケトエステル誘導体(39a)との相対的細胞毒性効果

表4に示した結果を得るために、細胞を薬剤に1〜2時間暴露させ、72時間後に3H-チミジンのDNA中への取り込みによって細胞毒性を測定した。抗原の発現はフローサイトメトリーで測定し、平均蛍光強度(MFI)で表した。
【０３９１】
さらに化合物39aのヒト血清中での安定性を調べるための研究を行い、37℃で120時間インキュベートした後も加水分解は検出されなかった。さらに、化合物39aを、ヒト、アカゲザル、モルモット、及びウサギのそれぞれの肝臓の精製エステラーゼに長時間暴露させたが、化合物39aのオーリスタチン E(29a)への転換は認められなかった。従って、化合物39aはオーリスタチン Eのプロドラッグではないものと考えられるが、それよりもベンジルエステルとしての活性を示す。
【実施例２０】
【０３９２】
細胞毒性研究：化合物 29a 、 39a 、 32 、 33 、 47 、 49 、 50 、 52 、及び 58
in vitro細胞毒性実験を行って、オーリスタチン E(29a)と本発明の薬剤の活性を比較した。3396細胞とKarpas細胞を薬剤にそれぞれ1時間及び2時間暴露した。細胞を洗浄し、96時間後にミトコンドリアの状態を調べるためにXTTを用いて細胞毒性を測定した。結果は表5に示す。
【０３９３】
表５
オーリスタチン E(29a)と誘導体の相対的細胞毒性

【実施例２１】
【０３９４】
ヒドラゾン加水分解に及ぼす構造的な影響
穏和な酸性条件下での効率的なヒドラゾン加水分解のために必要な構造的条件を分析するために、本発明のペンタペプチドのC末端と構造的に関連している一連のノルエフェドリン誘導体(表6)を調製した。
【０３９５】
表６
ヒドラゾン加水分解速度を調べた化合物
【化１２０】

【０３９６】
DCCの存在下でのN-アセチルノルエフェドリンと種々のケト酸との縮合によって対応するケトエステルが形成された。マレイミドカプロイルヒドラジドと反応させるとヒドラゾンが形成された。37℃でpH5及び7.2での安定性をHPLCを用いて測定した。2-メルカプトエタノール(2eq.)を添加して、反応性のマレイミド官能基形成性化合物43〜46をin situで抑制した。メルカプトエタノール付加化合物43〜45はpH5と7.2の双方で不安定であった(表7)。これに対して、ベンジルヒドラゾン46はpH 7.2では非常に緩徐に加水分解されたが、pH 5では半減期5時間で加水分解された。化合物46の加水分解で形成される産物は親のケトエステルであった。
【０３９７】
表７
ノルエフェドリンのチオエーテル修飾ヒドラゾンの37℃での加水分解

【実施例２２】
【０３９８】
mAb- 薬剤コンジュゲートの調製
リン酸塩緩衝食塩液, pH7.2中にモノクローナル抗体(mAb)(5-10mg/mL)を含有する溶液を、ジチオスレイトール(65eq.)で37℃で45分間還元する。低分子量物質の分離はSephadex G25カラムでサイズ排除クロマトグラフィーで行い、mAb中のスルフヒドリル含量は5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を用いて既に報告されているとおりの方法で(Riddles, P. W., Blakeley, R. L.とZerner, B.(1979)「エルマン試薬：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-再検討」"Ellman's reagent: 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination", Anal. Biochem. 94:75-81)測定した。典型的には、mAbあたり6〜9個の遊離のスルフヒドリル基がある。
【０３９９】
還元したmAbにアセトニトリル(最終容量の12%)を添加した後、アセトニトリル:DMSOを9:1とした1mM溶液中に薬剤(反応性リンカー)36、38、40a、40b、48、51、または59を添加して最終の薬剤濃度がmAbのスルフヒドリル基より1.9倍高い濃度となるようにする。室温で60分間置いた後、グルタチオン(最終濃度1mM)及び酸化グルタチオン(最終濃度5mM)を添加し、その溶液をさらに10分間置く。限外ろ過(Amicon, YM30フィルター)をろ液中に低分子量物質が認められなくなるまで繰り返して結合していない薬剤を除去する。濃縮されたタンパク質をSephadex G25でゲルろ過し、タンパク質画分をプールしたものにポリスチレンビーズを少量添加し、その溶液を0.4ミクロンのフィルターで除菌ろ過する。タンパク質濃度は280nmで測定する(E0.1% 1.4)。
【０４００】
遊離の薬剤濃度は逆相クロマトグラフィーで薬剤-(反応性リンカー)標準品の標準溶液に対しての値を測定する(C₁₈, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 5mM リン酸アンモニウムバッファー, pH7.0中のMeCNの直線的グラディエントを10%から90%まで10分で、その後90%MeCNで5分間、流速1mL/分)。典型的には、精製したコンジュゲート標品中には、遊離の薬剤は0.5%未満である。結合した薬剤はその連結した薬剤をmAbから1容のpH1.5水性塩酸バッファーで室温で15分間加水分解し、ホウ酸バッファー, pH8でその溶液を中和し、薬剤濃度を逆相HPLCを上述のとおり用いて分析する。典型的には、4〜7個の薬剤/mAbである。
【実施例２３】
【０４０１】
チオエーテル修飾リンカーとイムノコンジュゲートの加水分解
化合物 36 、 38 、 40a 、 40b 、 48 、 51 、 53 、及び 59 のチオエーテルの合成
化合物36、38、40a、40b、48、51、53、及び59のメルカプトエタノール付加化合物をin situで、対応するマレイミドヒドラゾン(10% PBS、10% DMSO水溶液中に0.3mM)と2eq.のメルカプトエタノールを室温で15分間反応させて調製した。HPLC分析では(C₁₈, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 5mM リン酸アンモニウムバッファー, pH7.0中のMeCNの直線的グラディエントを10%から90%まで10分で、その後90%MeCNで5分間、流速1mL/分)親のヒドラゾンよりも保持時間が0.3〜1分少ない、新たなピークが認められた。反応混液は加水分解速度の検討に直接用いた。
【０４０２】
化合物 36 、 38 、 40a 、 40b 、 48 、 51 、 53 、及び 59 のチオエーテルのヒドラゾン結合加水分解 の反応速度
チオエーテル溶液(10% PBS、10% DMSO水溶液中に0.3mM)を最終の塩濃度が30mMとなるように100mM NaOAc, pH5.0、または100mM Na₂HPO₄, pH7.2のいずれかで調整し、HPLCシステムの温度制御自動サンプラー中で37℃でインキュベートした。定められた時間間隔でアリコート(10μL)を取り、出発材料の消失はHPLCで215nmでモニターした(C₁₈, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 5mM リン酸アンモニウムバッファー, pH7.0中のMeCNの直線的グラディエントを10%から90%まで10分で、その後90%MeCNで5分間、流速1mL/分)。結果は出発材料であるヒドラゾンのパーセントで示した。ヒドラゾンの半減期はこれらの曲線から計算し、表８に示している。
【０４０３】
イムノコンジュゲート加水分解の反応速度
10% DMSO水溶液、50mM バッファー(NaOAc, pH5.0、または50mM Na₂HPO₄, pH7.2のいずれか)中のコンジュゲート(1mg/mL)を、HPLCシステムの温度制御オートサンプラー中で37℃でインキュベートした。定められた時間間隔でアリコート(100μL)を取り、薬剤の形成(ケト-エステル)をHPLCで250nmでモニターした(C₁₈, Varian Dynamax カラム, 5μ, 100 オングストローム, 5mM リン酸アンモニウムバッファー, pH7.0中のMeCNの直線的グラディエントを10%から90%まで10分で、その後90%MeCNで5分間、流速1mL/分)。対応するピーク(標準品と比較することによって明確に定めた)を合算して遊離の薬剤を定量した。結果は放出された薬剤合計の百分率で示した。イムノコンジュゲートの半減期はこれらの曲線から計算し表８に示している。
【０４０４】
表８
チオエーテル修飾リンカーとイムノコンジュゲートの37℃での加水分解

【実施例２４】
【０４０５】
hBR96-S-42 コンジュゲートの調製
3.0mgのhBR96を含有している450μLのPBS, pH7.2に、水中に100mMのジチオスレイトール(DTT)を含む液50μLを添加した。その混液を37℃で30分間インキュベートした。1mM DTPA含有のPBSを用いてPD10カラム(Pharmacia)から溶出させることによって還元反応液から過剰のDTTを除去した。タンパク質濃度(A₂₈₀、1mg/mL溶液の吸光度を1.4と仮定)と、DTNBで処理したタンパク質のアリコートのA₄₁₂を測定し、モル吸光係数を14,150と仮定することによって、抗体あたりの遊離のチオールの数として8.5が得られた。
【０４０６】
還元した抗体溶液1.2mLのpHを150μLの500mM ホウ酸ナトリウム/500mM NaCl, pH8.7を添加することによって8.7に挙げた。150μLのDMSO中に化合物42を抗体の12倍過剰に含んでいる溶液を調製した。その化合物42の溶液を還元した抗体溶液中に激しく撹拌しつつ添加し、その反応混液を室温で約3時間インキュベートした。その反応混液に十分な量の200mM テトラチオン酸ナトリウムを添加することによって反応を抑制してその溶液を1mMとした。
【０４０７】
反応を抑制した混液を、イオン交換樹脂マトリックス上に固定化し、部分有機溶媒溶液で洗い、そのマトリックスから溶出して精製し、バッファーをPBSに交換した。反応を抑制した混液を、25mM Tris, pH9("Eq. バッファー")中に35mLまで希釈し、次いでEq. バッファーで平衡化したEMD TMAEカラム上にロードした。固定化したコンジュゲートを20% アセトニトリル/80% Eq.バッファーの混合液で洗い、次いで0.5M NaCl/19mM Tris, pH9で溶出した。画分をサイズ排除クロマトグラフィーで分析しプールした。溶出したコンジュゲートを遠心限外ろ過で濃縮し、次いでPBS中でPD10カラムを通して溶出し、2.0mg/mL(A₂₈₀に基づく)の溶液を1.2mL作製した。C₁₈カラムを通したコンジュゲートの溶出ではコンジュゲートされていない薬剤は全て検出限界(〜0.2μM)であることが示された。pH1.7のバッファーで15分間コンジュゲートを処理した後、C₁₈HPLC分析を行うと薬剤が共有結合で抗体とコンジュゲートしていることが示された。加水分解したコンジュゲートから得られたHPLCピーク面積を39aの標準曲線と比較することによって、ある与えられた量のコンジュゲートに付着する薬剤の量が求められた；A₂₈₀で求めた抗体の濃度と比較することによって3.2個の薬剤/hBR96の比率が得られた。H3396細胞をこのコンジュゲートで処理すると約1.5μg/mLのIC₅₀で細胞増殖を阻害した。
【実施例２５】
【０４０８】
mAb-S-36 についての in vitro 細胞毒性データ
mAb-S-36コンジュゲートの、L2987ヒト肺腺癌細胞(BR96抗原が強陽性、S2C6抗原が弱陽性)、及びKato IIIヒト胃癌細胞(BR96抗原が強陽性、S2C6抗原が陰性)に及ぼす細胞毒性を図18A、18B、及び18Cに示している。これらの図は薬剤とmAb-薬剤コンジュゲートのin vitroでの、L2987ヒト肺腺癌細胞に対する細胞毒性(図18Aと図18B)、ならびにKato IIIヒト胃癌細胞に対する細胞毒性(図18Aと図18C)を示している。L2987細胞はBR96(LeY)及びS2C6(CD40)によって認識される抗原が陽性であるが、LeY抗原を高レベルで発現している。Kato III細胞はLeY抗原が陽性で、CD40については陰性である。細胞をコンジュゲートに2時間暴露し、洗い、細胞毒性は3日後にチミジン取り込みのアッセイを用いて測定した。
【０４０９】
オーリスタチン E(29a)とケトン誘導体35は、L2987細胞及びKato III細胞に対してドキソルビシンよりも少なくとも100倍細胞毒性が強い(図18A)。この2つの細胞系統に対して、BR96-S-36コンジュゲートはS2C6-S-36と比較して効力が強いことを示し、このことは、ある程度の免疫的特異性があることを示唆している。BR96-S-36の低い効力はおそらくはそのpH5での安定性のためと思われ(表８)、そのことはコンジュゲートされた薬剤のうちの小部分のみがこのアッセイ条件では2日間の間に放出されたにすぎないことを示唆している。
【実施例２６】
【０４１０】
mAb-S-40a についての in vitro 細胞毒性データ
特定のコンジュゲートのいくつかの細胞系統に対する細胞毒性を図19Aと19Bに示している。これらの図はオーリスタチン Eとオーリスタチン E含有コンジュゲートのL2987ヒト肺腺癌細胞に対する細胞毒性を示し(図19A)；AC10-S-40aで処理された種々の血液細胞系統に対する細胞毒性(図19B)を示している。全てのアッセイで細胞を薬剤に2時間暴露させ、洗い、細胞毒性は72時間後に³H-チミジン取り込みを用いて測定した。
【０４１１】
L2987細胞(図19A)に対してBR96-S-40aはS2C6-S-40aより有意に細胞毒性が強く、それはCD40に比較してLeY抗原の発現が増大していることを反映していた(表４)。AC10-S-40aコンジュゲートのいくつかの血液細胞系統に対する効果を図19Bに示している。最も感受性の高い細胞は、L540 ホジキンリンパ腫及びKarpas退形成大細胞リンパ腫で、双方ともCD30抗原を強く発現している。L428細胞系統、これはCD30抗原の発現については中等度であるが、この細胞系統はAC10-S-40aコンジュゲートによる影響がより少なかった。抗原陰性の対照の細胞系統であるDaudiがコンジュゲートに対して全く感受性がないことから、細胞毒性の効力は免疫学的に特異的であるものと思われる。この研究での興味深い知見の１つは、CD30を強く発現しているIM-9(表４)もAC10-S-40aに対して感受性がないことであった。さらに分析すると、他の細胞系統とは異なり、IM-9は結合したコンジュゲートを内部化しなかったことが見出された。したがって、これらの結果は、活性が発揮されるには特異的な結合のみならず抗原の内部化（internalization）が必要であることを示している。
【実施例２７】
【０４１２】
mAb-S-40a コンジュゲートの in vivo での活性
皮下にL2987肺腺癌または3396ヒト乳癌異種移植片を有するヌードマウスに、コンジュゲートまたは薬剤を図20A及び20Bに示すスケジュールで注射した。BR96-S-40aコンジュゲートは2種の腫瘍細胞系統に結合したが、IgG-S-40aは結合しなかった。動物は全て、毎日全般的健康状態をモニターし、3〜8日ごとに体重と腫瘍増殖についてモニターした。腫瘍容積は次の式を用いて推定した：最も長い場所の寸法 ｘ 垂直方向の寸法の2乗/2。mAb-S-40aコンジュゲートの使用に伴う毒性は見られなかった。これらの効果をオーリスタチン Eの最大耐容投与量での効果と比較した。インプラントはエストラジオールを60日間にわたって放出し、その時点で実験を終了した。
【実施例２８】
【０４１３】
mAb-S-40a 、 mAb-S-48 、 mAb-S-51 、及び mAb-S-59 についての in vitro 細胞毒性データ
これらのコンジュゲートのH3396ヒト乳癌細胞(BR96抗原は強陽性)に対する細胞毒性は図21に示している。このデータを得るために、RPMI培地中のL2987細胞を96ウエルのプレート中に蒔き(細胞5000個/ウエル)、37℃で24時間置いた後、培地(0.05mL)中にコンジュゲートを入れた液の様々な濃度のものをサンプルに添加した(3回測定)。37℃で1時間置いた後、細胞を洗い、インキュベーションはさらに24時間継続し、その時点で細胞を再度洗った。さらに3日間後にXTTを細胞の生存のインジケーターとして用いて、細胞毒性を測定した。データはこれらのコンジュゲートは全てがH3396細胞に対して非常に強い細胞毒性を示したが、化合物48、51、及び59から調製したBR96コンジュゲートは、BR96-40aよりも強力であることを示している。
【０４１４】
本明細書で言及した公表物、特許、及び特許出願はその全てを、あたかも各公表物、または特許出願が、参照によって特にかつ個々に組み入れられているかのような程度と同程度に、本明細書中に参照により組み入れる。例えば、「総合的有機化学での変換：官能基調製へのガイド」"Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations", 第2版, Richard C. Larock, John Wiley and Sons, Inc., 1999、及び特にその中で言及されている参照文献は本明細書に全ての目的で参照により組み入れる。
【０４１５】
上記の記述から、本発明の特定の実施形態が本明細書では説明の目的で述べられているが、種々の改変を、本発明の精神と範囲から乖離することなく行いうることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０４１６】
【図１】本発明の化合物の調製に有用な特定のトリペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図２】本発明の化合物の調製に有用な特定のジペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図３】トリペプチド及びジペプチドからのペンタペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図４】トリペプチド及びジペプチドからのペンタペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図５】トリペプチド及びジペプチドからのペンタペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図６】ペンタペプチドをヘテロ二官能性リンカーと結合させてリガンド(特にmAb)反応性薬剤分子を作製する合成スキームを示す。
【図７】ペンタペプチドをヘテロ二官能性リンカーと結合させてリガンド(特にmAb)反応性薬剤分子を作製する合成スキームを示す。
【図８】ペンタペプチドをヘテロ二官能性リンカーと結合させてリガンド(特にmAb)反応性薬剤分子を作製する合成スキームを示す。
【図９】リガンド、及び特にmAbを薬剤反応性リンカーコンジュゲートと結合させて本発明のプロドラッグを作製する合成スキームを示す。
【図１０】リガンド、及び特にmAbを薬剤反応性リンカーコンジュゲートと結合させて本発明のプロドラッグを作製する合成スキームを示す。
【図１１】リガンド、及び特にmAbを薬剤反応性リンカーコンジュゲートと結合させて本発明のプロドラッグを作製する合成スキームを示す。
【図１２】リガンド、及び特にmAbを薬剤反応性リンカーコンジュゲートと結合させて本発明のプロドラッグを作製する合成スキームを示す。
【図１３】化合物４９の調製に用いられる合成スキームを示す。
【図１４】ペンタペプチドをヘテロ二官能性リンカーと結合させて薬剤反応性リンカーコンジュゲート５１を作製する合成スキームを示す。
【図１５】化合物５３の調製に用いられる合成スキームを示す。
【図１６】本発明の化合物の調製に有用な特別なジペプチドの調製法を説明する合成スキームを示す。
【図１７】ペンタペプチド(58)をヘテロ二官能性リンカーと結合させて薬剤反応性リンカーコンジュゲート５９を作製する合成スキームを示す。
【図１８Ａ】薬剤及びmAb-薬剤コンジュゲートの(A)及び(B)L2987ヒト肺腺腫細胞、ならびに(A)及び(B)Kato III ヒト胃癌細胞に対するin vitroでの細胞毒性を示す。
【図１８Ｂ】薬剤及びmAb-薬剤コンジュゲートの(A)及び(B)L2987ヒト肺腺腫細胞、ならびに(A)及び(B)Kato III ヒト胃癌細胞に対するin vitroでの細胞毒性を示す。
【図１８Ｃ】薬剤及びmAb-薬剤コンジュゲートの(A)及び(B)L2987ヒト肺腺腫細胞、ならびに(A)及び(B)Kato III ヒト胃癌細胞に対するin vitroでの細胞毒性を示す。
【図１９】図１９Ａ及び図１９ＢはオーリスタンE及びオーリスタンE含有コンジュゲートの、L2987ヒト肺腺癌細胞(図１９Ａ)及びAC10-S-40aで処理した種々の血液細胞系統(図１９Ｂ)に対する細胞毒性を示す。
【図２０】図２０Ａ及び図２０Ｂは、2つの図で示したスケジュールに従ってコンジュゲートまたは薬剤を皮下にL2987肺腺癌移植片または3396ヒト乳癌移植片を持つヌードマウスに注射したときに観察された腫瘍の容積の中央値を示す。
【図２１】本発明の薬剤コンジュゲートのH3396ヒト乳癌細胞に対する細胞毒性を示す。

Claims (96)

1. 以下の式の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
   

   

   ［式中、それぞれの位置において独立して
   R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
   R²は水素及び低級アルキルから選択され、
   R³は低級アルキルであり、
   R⁴はR⁵がH及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
   R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
   R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
   R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
   R⁹は
   

   

   

   （式中、
   R¹⁰は
   

   

   から選択され、
   R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
   R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、ｍは０−５であって、R¹²はそれぞれ独立して選択されるものであり、
   R¹³は
   

   

   であり、
   R¹⁴は直接の結合、低級アルキレン、アリーレン及びアリーレン（低級アルキレン）から選択され、
   R¹⁵は水素、低級アルキル及びアリールから選択され、
   R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、アリール（低級アルキレン）、及び-(CH₂OCH₂)_pCH₂-（ｐは１−５である）から選択され、
   R¹⁷は
   

   

   （ＹはＯまたはＳである）から選択される。）
   から選択される。］
2. R¹が水素である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
3. R¹及びR²がメチルである、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
4. R³がイソプロピルである、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
5. R⁴が低級アルキル、アリール及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
6. R⁴が低級アルキルから選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
7. R⁴及びR⁵が共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成する、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
8. R⁶が低級アルキルである、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
9. R⁸が水素である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
10. R⁹が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
11. R¹⁰が、
    

    

    である、請求項１０記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
12. R¹⁰が、
    

    

    である、請求項１０記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
13. R¹⁴がアリーレン及び低級アルキレンから選択され、R¹⁵が低級アルキル及びアリールから選択され、R¹⁶が低級アルキレンである、請求項１０記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
14. R⁹が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
15. R¹⁰が、
    

    

    である、請求項１４記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
16. R¹⁰が、
    

    

    である、請求項１４記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
17. R¹⁴がアリーレン及び低級アルキレンから選択され、R¹⁵が低級アルキル及びアリールから選択され、R¹⁶が低級アルキレンである、請求項１４記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
18. R⁹が
    

    

    であり、R¹³が
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
19. R¹⁵が低級アルキルであり、R¹⁶が低級アルキレンである、請求項１８記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
20. R⁹が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
21. R¹⁶が低級アルキレン及びアリーレンから選択される、請求項２０記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
22. R⁹が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
23. R¹⁶が低級アルキレン及びアリーレンから選択される、請求項２２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
24. R¹⁷が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
25. R¹⁷が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
26. R¹⁷が、
    

    

    である、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
27. R¹⁷が、
    

    

    であり、ＹがＯまたはＳである、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
28. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
29. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
30. 以下の構造：
    

    

    を有し、R⁴がiso-プロピル及びsec-ブチルから選択される、請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
31. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
32. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項１記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
33. 以下の式：
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴は、R⁵がＨ及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、ｍは０−５であってそれぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、そして
    R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、R²⁰は単結合または二重結合によって「ｘ」と標識される炭素に結合できる。］
    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
34. 上記反応性部位が、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、無水物、酸塩化物、及びスルホニルクロリドから選択される、請求項３３記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
35. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁴は直接の結合、アリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン及びアリーレンから選択され、
    R¹⁵は水素、低級アルキル及びアリールから選択され、
    R¹⁶は低級アルキレン、アリーレン（低級アルキレン）、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    から選択されるヒドラゾンを含む、請求項３３記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
36. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項３５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
37. 以下の構造：
    

    

    を有し、R⁴がiso-プロピル及びsec-ブチルから選択され、R⁵が水素である、請求項３５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
38. 以下の式：
    

    

    を有する請求項３５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
39. 以下の式：
    

    

    を有する請求項３５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
40. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、ｘは請求項２７でｘと記された炭素を示し、
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    のヒドラゾンを含む、請求項３３記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
41. 以下の式：
    

    

    を有する請求項４０記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
42. 以下の式：
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴は、R⁵がＨ及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_{5- 7}炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、ｍは０−５であってそれぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、そして
    R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基であり、R²⁰は単結合または二重結合によって「ｘ」と標識される炭素に結合できる。］
    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
43. 上記反応性部位が、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、無水物、酸塩化物、及びスルホニルクロリドから選択される、請求項４２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
44. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁴は直接の結合、アリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン及びアリーレンから選択され、
    R¹⁵は水素、低級アルキル及びアリールから選択され、
    R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、そして
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    から選択されるヒドラゾンを含む、請求項４２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
45. 以下の式：
    

    

    を有する請求項４４記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
46. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    のヒドラゾンを含む、請求項４２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
47. 以下の式：
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴は、R⁵がＨ及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
    R²⁰は、標的部分と反応することが可能な反応性部位を有する反応性リンカー基である。］
    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
48. 上記反応性部位が、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、無水物、酸塩化物、及びスルホニルクロリドから選択される、請求項４７記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
49. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁴は直接の結合、アリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン及びアリーレンから選択され、
    R¹⁵は水素、低級アルキル及びアリールから選択され、
    R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、そして
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    のヒドラゾンを含む、請求項４７記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
50. R²⁰が以下の式：
    

    

    ［式中、
    R¹⁵は水素、及び低級アルキルから選択され、
    R¹⁶はアリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、アリーレン、及びｐが１−５である-(CH₂OCH₂)_pCH₂-から選択され、そして
    R¹⁷は
    

    

    （Ｘは脱離基である。）
    から選択される。］
    のヒドラゾンを含む、請求項４７記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
51. 以下の式：
    

    

    の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
52. 以下の式：
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴は、R⁵がＨ及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、そして
    R¹⁸は水素、ヒドロキシル保護基、及びOR¹⁸が＝Ｏを表すような直接の結合、から選択される。］
    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
53. R¹が水素である、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
54. R¹及びR²がメチルである、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
55. R³がイソプロピルである、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
56. R⁴が低級アルキル、アリール及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
57. R⁴が低級アルキルから選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
58. R⁴及びR⁵が共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎが２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成する、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
59. R⁶が低級アルキルである、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
60. R⁸が水素である、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
61. R¹¹が水素である、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
62. -OR¹⁸が=Ｏである、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
63. R¹⁸が水素である、請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
64. 以下の構造：
    

    

    を有する請求項５２記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
65. 以下の式：
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴は、R⁵がＨ及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
    R¹⁹はヒドロキシ−及びオキソ−置換低級アルキルから選択される。］
    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
66. R¹が水素である、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
67. R¹及びR²がメチルである、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
68. R³がiso-プロピルである、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
69. R⁴が低級アルキル、アリール、及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
70. R⁴が低級アルキルから選択され、R⁵がH及びメチルから選択される、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
71. R⁴及びR⁵が共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎが２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成する、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
72. R⁶が低級アルキルである、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
73. R⁸が水素である、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
74. R¹⁹がオキソ置換低級アルキルである、請求項６５記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
75. 以下の構造：
    

    

    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
76. 以下の式の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
    

    

    ［式中、それぞれの位置において独立して
    R¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R²は水素及び低級アルキルから選択され、
    R³は低級アルキルであり、
    R⁴はR⁵がH及びメチルから選択される場合に低級アルキル、アリール及び-CH₂-C_5-7炭素環式化合物から選択され、あるいはR⁴及びR⁵は共に部分式-(CR^aR^b)_n-（R^a及びR^bは独立して水素及び低級アルキルから選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）の炭素環式化合物を形成し、
    R⁶は水素及び低級アルキルから選択され、
    R⁷はsec-ブチルまたはiso-ブチルであり、
    R⁸は水素及び低級アルキルから選択され、そして
    R⁹は
    

    

    （式中、
    R¹⁰は
    

    

    から選択され、
    R¹¹は水素及び低級アルキルから選択され、
    R¹²は低級アルキル、ハロゲン、及びメトキシから選択され、ｍは０−５であって、それぞれのR¹²は独立して選択されるものであり、
    R¹⁴は直接の結合、アリーレン（低級アルキレン）、低級アルキレン、及びアリーレンから選択され、
    R¹⁵は水素、低級アルキル及びアリールから選択される。）
    から選択される。］
77. R¹⁰が
    

    

    である、請求項７６記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
78. R¹⁰が
    

    

    である、請求項７６記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
79. 以下の構造：
    

    

    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
80. 以下の構造：
    

    

    を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
81. 以下の構造：
    

    

    を有し、R⁴がiso-プロピルまたはsec-ブチルであり、R⁵が水素である、請求項７６記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物。
82. 請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物、及び製薬上許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
83. 請求項５１、６２、６３または７４のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物、及び製薬上許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
84. 請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の致死量と細胞を接触させることを含む、細胞を殺滅させる方法。
85. 請求項５１、６２、６３または７４のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の致死量を細胞に投与することを含む、細胞を殺滅させる方法。
86. 以下の段階：
    ａ．請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物を細胞に送達して該化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物を該細胞に侵入させ、
    ｂ．化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の残存部分からｍＡｂを切断し、そして
    ｃ．化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の残存部分で細胞を殺滅させる、
    を含む、細胞を殺滅させる方法。
87. 請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の治療的有効量を治療の必要なヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは他の動物における腫瘍細胞または癌細胞を殺滅させるか、またはその増殖を阻害する方法。
88. 請求項５１、６２、６３または７４のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の治療的有効量を治療の必要なヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは他の動物における腫瘍細胞または癌細胞を殺滅させるか、またはその増殖を阻害する方法。
89. 請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の有効量を治療の必要な動物被検体に投与することを含む、癌の治療方法。
90. 請求項５１、６２、６３または７４のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の有効量を治療の必要な動物被検体に投与することを含む、癌の治療方法。
91. 請求項１〜３２のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の有効量を治療の必要な動物被検体に投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
92. 請求項５１、６２、６３または７４のいずれか１項記載の化合物またはその製薬上許容し得る塩若しくは溶媒化合物の有効量を治療の必要な動物被検体に投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
93. 有効量の抗癌剤を投与することを更に含む、請求項８９記載の方法。
94. 有効量の抗癌剤を投与することを更に含む、請求項９０記載の方法。
95. 有効量の免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項９１記載の方法。
96. 有効量の免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項９２記載の方法。

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