CN117062801A - 单甲基奥瑞他汀e化合物的制备和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种MMAE的制备和纯化方法。所述方法具有温和的合成和纯化条件，可有效地防止因过高温度引起的产物手性的变化，极大地减少降解杂质的产生，并且提高产物的纯度和产率。此外，本发明提供的所述制备和纯化方法具有良好稳定性并且更适合于规模化生产。通过本发明提供的所述制备和纯化方法制备的所述MMAE具有高于99％的纯度，并且可完美地满足临床药物要求。
Description
技术领域
本发明涉及化合物合成的技术领域，特别地涉及单甲基奥瑞他汀E化合物(即，MMAE)的制备和纯化方法。
技术背景
MMAE(单甲基奥瑞他汀E，也称为甲基奥瑞他汀E)(奥瑞他汀的全合成衍生物)可通过抑制微管蛋白聚合而有效地抑制有丝分裂，并且已广泛用作细胞毒性组分(即，药物部分)以合成抗体-药物偶联物来治疗癌症。
抗体药物偶联物(ADC)是一类抗肿瘤药物，并且包括三种组分：抗体、连接子和药物。其原理在于，抗体的选择性靶向能力与药物部分的细胞毒性功效组合，接着借助于抗体的靶向特异性来特异性地识别肿瘤细胞表面上的抗原，经由细胞的内吞作用实现细胞进入，通过细胞中的蛋白酶释放药物部分，并且因此实现杀死肿瘤细胞，同时避免杀死非目标组织的目的。
目前，已知存在大量天然和化学合成的细胞毒素，但仅极小一部分的药物结构可应用于ADC。这主要是因为可用作ADC负载的毒素必须具有复杂的性质，诸如高细胞毒性效能和小分子量。因此，在ADC领域中高度寻求奥瑞他汀化合物(诸如MMAE)。目前，出售的许多ADC药物的抗体上的连接子-毒素结构是Mc-Val-Cit-PAB-MMAE。然而，MMAE的当前出售价格极高。主要原因是当前合成和纯化方法仍不成熟，许多药物的合成方法是复杂的，并且纯化方法是不成熟的，这导致最终产物的产率较低、纯度较低且杂质(尤其是单一杂质)含量较高。虽然出于临床用药的安全性，用于临床用途的药物必须具有极高纯度和极低杂质，但大部分的当前方法不能满足临床用药的标准要求，这也是可商购获得的MMAE的价格高的主要原因之一。
发明内容
本发明提供一种能够获得极高纯度MMAE(如式I中所示的结构式)的制备和纯化方法，所述MMAE可充分满足临床药物的质量要求。
所述方法的制备途径如下：
所述方法包括以下步骤：
(1)将化合物1溶解在适当量的第一有机溶剂中以形成溶液A；
(2)将足够量的HCl-1,4-二烷溶液添加到所述溶液A中以进行隔热反应(insulation reaction)，并且去除Boc保护基；
(3)在所述反应结束之后，将步骤(2)的反应溶液倒入足够量的第一低极性溶剂中，在搅拌之后丢弃滤液，并且固体残余物在干燥之后成为化合物2；
(4)将获得的化合物2和适当量的化合物3溶解在第二有机溶剂中以形成溶液B；
(5)将第一多肽缩合剂溶解在适当量的第三有机溶剂中以形成溶液C，其中所述第一多肽缩合剂的摩尔数大于步骤(4)的所述化合物3的摩尔数；
(6)将所述溶液C添加到所述溶液B中以形成溶液D；
(7)将适当量的第一有机碱添加到所述溶液D中以进行隔热反应；
(8)在步骤(7)的所述反应结束之后，将足够量的第二低极性溶剂和纯化水添加到步骤(7)的反应系统中以进行萃取，并且收集有机相；
(9)将步骤(8)中收集的所述有机相依次用适当量的盐酸溶液、纯化水和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并且干燥以获得化合物4；
(10)将所述化合物4溶解在第四有机溶剂中以形成溶液E；
(11)将足够量的二乙胺添加到所述溶液E中以进行隔热反应，从而去除Fmoc保护基；
(12)在所述反应结束之后，将适当量的第五有机溶剂和纯化水添加到步骤(11)的反应系统中以进行萃取，收集有机相，经无水硫酸钠干燥，并且在减压下浓缩；
(13)通过甲苯:甲醇的洗脱系统对步骤(12)中在减压下获得的浓缩物进行层析纯化，并且在减压下浓缩收集的洗脱液；
(14)在用第六有机溶剂将步骤(13)中在减压下获得的浓缩产物溶解之后，过滤，并且在减压下浓缩滤液；以及
(15)真空干燥在步骤(14)中在减压下获得的浓缩产物以获得所述MMAE。
此外，步骤(1)中的所述第一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(1)中的所述第一有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:2；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1-3；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1.5-2.5。
此外，步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的浓度为约4mol/L；优选地，步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为约3-7mol/L；并且更优选地，步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为3.5-4.5mol/L。
此外，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-8；更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-7；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:6。
此外，逐滴地添加步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液，并且在所述逐滴添加期间，将所述反应系统的内部温度维持在-5℃至5℃之间。
此外，步骤(2)中的所述隔热反应的温度为10℃-15℃。
此外，步骤(3)中的所述第一低极性溶剂选自正己烷、石油醚和正庚烷；并且优选地，所述第一低极性溶剂选自正己烷。
此外，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:16；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:10-25；更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:12-20；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-17。
此外，步骤(4)中的所述第二有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；优选地，所述第二有机溶剂是DMF；并且更优选地，在步骤(4)中，所述化合物2与所述化合物3的摩尔量相同。
此外，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-7。
此外，步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂选自HATU、DIC、DCC、EDC、HCTU、DEPBT、EEDQ和CDI；并且优选地，步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂是HATU。
此外，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的摩尔比为约1:1.2；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.01-1.5；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.1-1.4；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.2-1.3。
此外，步骤(5)中的所述第三有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第三有机溶剂是DMF。
此外，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2-6；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2.5-4；并且更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
此外，在步骤(6)中，将所述溶液C逐滴地添加到所述溶液B中，并且在所述逐滴添加期间整个反应系统的内部温度为0℃-5℃。
此外，步骤(7)中的所述第一有机碱是选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶的一者或多者；并且优选地，步骤(7)中的所述第一有机碱是N,N-二异丙基乙胺。
此外，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的摩尔比为约1:3；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:2-5；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:3-4。
此外，将步骤(7)中的所述第一有机碱逐滴地添加到所述溶液D中，并且所述隔热反应的温度为0℃-5℃。
此外，步骤(8)中的所述第二低极性溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和四氢呋喃；并且优选地，步骤(8)中的所述第二低极性溶剂是甲基叔丁基醚。
此外，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:20.2:20.2；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-25:15-25；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-24:20-24；并且更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-21:20-21。
此外，步骤(8)中的所述第二低极性溶剂与所述纯化水的体积相同。
此外，步骤(9)中的所述盐酸溶液的浓度为约0.05mol/L；优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.02-0.08mol/L；更优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.04-0.06mol/L；并且更优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.05mol/L。
此外，步骤(9)中的所述氯化钠溶液的浓度为约30％；并且优选地，步骤(9)中的所述氯化钠溶液的所述浓度为20％-40％。
此外，步骤(9)中的所述盐酸溶液、所述纯化水和所述氯化钠溶液的体积等于步骤(8)中的所述第二低极性溶剂的体积。
此外，步骤(10)中的所述第四有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、三氯甲烷和四氯化碳；优选地，步骤(10)中的所述第四有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:7；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-10；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8。
此外，其中步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的重量-体积比(g/mL)为约1:3.5；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-5；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
此外，将步骤(11)中的所述二乙胺逐滴地添加到所述溶液E中，并且在逐滴添加过程中，将所述溶液的内部温度保持在0℃与5℃之间；并且步骤(11)中的所述隔热反应的温度为20℃-30℃。
此外，步骤(12)中的所述第五有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和甲苯；并且优选地，步骤(12)中的所述第五有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:7:10；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10:5-15；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-8:9-12。
此外，步骤(13)中的所述层析纯化中所使用的硅胶是200-300目硅胶；所述洗脱系统是体积比(V/V)为10-20:1的甲苯:甲醇；优选地，所述洗脱系统最初为体积比(V/V)为约20:1的甲苯:甲醇。在TLC检测到仅可看到产物时(例如，仅产物斑点)，所述洗脱系统变为体积比(V/V)为约10:1的甲苯:甲醇。当然，可能不更换洗脱系统，并且此处更换洗脱系统的目的是使产物更快速地洗脱并且节省生产过程的时间和成本。
此外，TLC检测的显影剂是体积比(V/V)为约5:1的甲苯:甲醇。
此外，步骤(14)中的所述第六有机溶剂选自甲醇、甲苯和乙腈；并且优选地，步骤(14)中的所述第六有机溶剂是甲醇。
此外，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(14)中的所述第六有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3-10。
此外，可将步骤(14)的过程重复1至5次。
本发明还提供一种下式中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
所述方法包括以下步骤：
(1-1).将化合物1溶解在适当量的第七有机溶剂中以形成溶液F；
(1-2).将足够量的HCl-1,4-二烷溶液添加到所述溶液F中以进行隔热反应，并且去除Boc保护基；以及
(1-3).在所述反应结束之后，将步骤(1-2)的反应溶液倒入足够量的第三低极性溶剂中，在搅拌之后丢弃滤液，并且固体残余物在干燥之后成为化合物2。
此外，步骤(1-1)中的所述第七有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(1-1)中的所述第一有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:2；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1-3；并且更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1.5-2.5。
此外，步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的浓度为约4mol/L；优选地，步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为约3-7mol/L；并且更优选地，步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为3.5-4.5mol/L。
此外，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-8；更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-7；并且甚至更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:6。
此外，逐滴地添加步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液，并且在所述逐滴添加期间，将所述反应系统的内部温度维持在-5℃至5℃之间。
此外，步骤(1-2)中的所述隔热反应的温度为10℃-15℃。
此外，步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂选自正己烷、石油醚和正庚烷；并且优选地，步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂选自正己烷。
此外，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:16；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:10-25；更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:12-20；并且更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-17。
本发明还提供一种下式中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
所述方法包括以下步骤：
(2-1).将化合物2和适当量的化合物3溶解在第八有机溶剂中以形成溶液G；
(2-2).将第二多肽缩合剂溶解在适当量的第九有机溶剂中以形成溶液H，其中所述第二多肽缩合剂的摩尔数大于步骤(2-1)中的所述化合物3的摩尔数；
(2-3).将所述溶液H添加到所述溶液G中以形成溶液I；
(2-4).将适当量的第二有机碱添加到所述溶液I中以进行隔热反应；
(2-5).在所述反应结束之后，将足够量的第四低极性溶剂和纯化水添加到步骤(2-4)的反应系统中以进行萃取，并且收集有机相；以及
(2-6).将步骤(2-5)中收集的所述有机相依次用适当量的盐酸溶液、纯化水和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并且干燥以获得化合物4。
此外，步骤(2-1)中的所述第八有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第八有机溶剂是DMF。
此外，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8；并且更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-7。
此外，步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂选自HATU、DIC、DCC、EDC、HCTU、DEPBT、EEDQ和CDI；并且优选地，步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂是HATU。
此外，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的摩尔比为约1:1.2；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.01-1.5；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.1-1.4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.2-1.3。
此外，步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第九有机溶剂是DMF。
此外，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2-6；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
此外，在步骤(2-3)中，将所述溶液H逐滴地添加到所述溶液G中，并且在所述逐滴添加期间整个反应系统的内部温度为0℃-5℃。
此外，步骤(2-4)中的所述第二有机碱是选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶的一者或多者；并且优选地，步骤(2-4)中的所述第二有机碱是N,N-二异丙基乙胺。
此外，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的摩尔比为约1:3；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:2-5；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:3-4。
此外，在步骤(2-4)中，将所述第二有机碱逐滴地添加到所述溶液I中，并且所述隔热反应的温度为0℃-5℃。
此外，步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和四氢呋喃；优选地，步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂是甲基叔丁基醚。
此外，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:20.2:20.2；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-25:15-25；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-24:20-24；并且更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-21:20-21。
此外，步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂与纯化水的体积相同。
此外，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的浓度为约0.05mol/L；优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.02-0.08mol/L；更优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.04-0.06mol/L；并且更优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.05mol/L。
本发明还提供一种式(I)中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
所述方法包括以下步骤：
(3-1).将化合物4溶解在第十有机溶剂中以形成溶液J；
(3-2).将足够量的二乙胺添加到所述溶液J中以进行隔热反应，从而去除Fmoc保护基；
(3-3).在所述反应结束之后，将适当量的第十一有机溶剂和纯化水添加到步骤(3-2)的所述反应系统中以进行萃取，收集有机相，经无水硫酸钠干燥，并且在减压下浓缩；
(3-4).通过甲苯:甲醇的洗脱系统对步骤(3-3)中在减压下获得的浓缩物进行层析纯化，并且在减压下浓缩收集的洗脱液；
(3-5).在用第十二有机溶剂将步骤(3-4)中在减压下获得的浓缩产物溶解之后，过滤并且在减压下浓缩滤液；以及
(3-6).真空干燥在步骤(3-5)中在减压下获得的浓缩产物以获得所述MMAE。
此外，步骤(3-1)中的所述第十有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(3-1)中的所述第十有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:7；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-10；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8。
此外，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的重量-体积比(g/mL)为约1:3.5；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-5；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
此外，逐滴地添加步骤(3-2)中的所述二乙胺，并且在逐滴添加过程中，将内部温度保持在0℃与5℃之间；并且步骤(3-2)中的所述隔热反应的温度为20℃-30℃。
此外，步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和甲苯；并且优选地，步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂是二氯甲烷。
此外，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:7:10；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10:5-15；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-8:9-12。
此外，步骤(3-4)中的所述层析纯化中所使用的硅胶是200-300目硅胶；所述洗脱系统是体积比(V/V)为10-20:1的甲苯:甲醇；优选地，所述洗脱系统最初为体积比(V/V)为约20:1的甲苯:甲醇；并且在TLC检测到仅可看到产物时，所述洗脱系统变为体积比(V/V)为约10:1的甲苯:甲醇。
此外，TLC检测的显影剂是体积比(V/V)为约5:1的甲苯:甲醇。
此外，步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂选自甲醇、甲苯和乙腈；并且优选地，步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂是甲醇。
此外，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3-10。
此外，可将步骤(3-5)的过程重复1至5次。
本发明提供的MMAE的制备和纯化方法具有温和的合成和纯化条件，可有效地防止因过高温度引起的产物手性的变化，极大地减少降解杂质的产生，提高产物的纯度并且增加产物的产率。此外，本发明提供的制备和纯化方法具有良好稳定性并且更适合于规模化生产。通过本发明提供的制备和纯化方法制备的MMAE具有高于99％的纯度，并且可完美地满足临床药物要求。
附图说明
图1是化合物2的层析图。
图2是化合物4的层析图。
图3是化合物MMAE的层析图。
具体实施方式
下文结合具体实施方案以非限制性细节进一步描述了本发明的技术解决方案。应指出，以下实施方案仅说明本发明的技术概念和特性，并且其目的是使得本领域技术人员能够理解本发明的内容并因此实施本发明，而不能限制本发明的保护范围。根据本发明的精神进行的所有等效改变或修改应包括在本发明的保护范围内。
实施例1化合物2的制备和纯化
将115.05g化合物1(273.58mmol)和230mL二氯甲烷(V二氯甲烷/W化合物1＝2.0)添加到反应烧瓶中。将内部温度控制为0℃-5℃，逐滴地添加690mL的4mol/L HCl-1,4-二烷溶液 在逐滴添加之后，使温度升高到10℃，并且将温度保持在10℃-15℃以反应1h。在对超高效液相层析采样来监测反应之后，对UPLC进行采样以每0.5h监测反应，并且取得样本以检测化合物1的剩余量。当化合物1的剩余量低于1.0％时，反应被视为完成。
在反应完成之后，在搅拌下将上述反应溶液缓慢地倒入含有1840mL正己烷(V正己烷/W化合物1＝16.0)的反应烧瓶中(可提前将正己烷冷却到0℃-5℃)。继续搅拌30min并且倾析上清液。在30℃-35℃下用隔膜真空泵将反应烧瓶中的固体真空干燥1±0.5h。连续使用油泵以在真空下在室温(18℃-26℃)下干燥不少于12小时的时间，并且当重量不改变时获得化合物2(产率为119％，纯度为95.4％，并且最大单一杂质为1.4％)。其层析图示出于图1中。
实施例2化合物4的制备和纯化
将114.17g化合物2(301.52mmol)、192.31g化合物3(301.52mmol)和1160mL DMF(VDMF/W化合物3＝6.0)顺序地添加到反应烧瓶中，再将139.04g HATU(365.67mmol)溶解在580mL DMF(VDMF/W化合物3＝3.0)中，并且形成HATU的DMF溶液。将内部温度控制在0℃-5℃，并且将HATU的DMF溶液逐滴地添加到化合物2和化合物3的DMF溶液中。在完成逐滴添加之后，将内部温度控制在0℃-5℃，持续20±2min。然后，在将内部温度控制在0℃-5℃，逐滴地添加118.07g N,N-二异丙基乙胺(913.50mmol)；在逐滴添加之后，将温度保持在0℃-5℃以反应1h。对UPLC进行采样以监测反应，然后每0.5h进行采样以检测化合物3的剩余量。当化合物3的剩余量低于6.0％时，反应被视为完成。
在反应完成之后，将反应溶液转移到30L玻璃反应器中，并且依次添加3900mL甲基叔丁基醚和3900mL纯化水(提前冷却到0℃)以进行萃取，并且分离有机相。另外用3900mL甲基叔丁基醚将水相萃取两次。合并有机相。
用3900mL的0.05mol/L盐酸溶液(提前冷却到0℃)洗涤上述有机相，并且收集有机相。用3900mL纯化水(V纯化水/W化合物3＝20.2)(提前冷却到0℃)洗涤有机相，并且收集有机相。之后用3900mL的30％氯化钠水溶液洗涤有机相，并且收集有机相。然后，搅拌有机相并且用388.48g无水硫酸钠将所述有机相干燥0.5h。滤出干燥剂，用1950mL甲基叔丁基醚洗涤滤饼并合并滤液，然后在30℃-35℃下在减压下将所述滤液浓缩为发泡体。将油泵真空干燥至少1h，并且当重量不改变时，获得化合物4(产率为112％，纯度为88.6％，并且最大单一杂质为5.6％)。其层析图示出于图2中。
实施例3MMAE的制备和纯化
将307.22g化合物4(326.75mmol)和1900mL二氯甲烷添加到反应烧瓶中。将内部温度控制在0℃-5℃，并且逐滴地添加950mL二乙胺。在逐滴添加之后，使温度升高到20℃以开始定时反应，并且将温度保持在20℃-30℃以反应10h。对UPLC进行采样以监测反应，然后每1h对UPLC进行采样以监测反应，进行采样以检测化合物4的剩余量。当化合物4的剩余量低于1.0％时，反应被视为完成。
在反应完成之后，将反应溶液转移到30L玻璃反应器中，添加1900mL二氯甲烷，用2700mL纯化水(提前冷却到0℃)洗涤两次，并且分离有机相。搅拌有机相并且用542.04g无水硫酸钠将所述有机相干燥0.5h，滤出干燥剂，用810mL二氯甲烷洗涤滤饼，并且合并滤液。将滤液在30℃-35℃下在减压下浓缩为发泡体。使用油泵来在室温(18℃-26℃)下真空干燥至少1h，并且当重量不改变时获得粗MMAE。
在清洁层析柱之后，填充柱：将13986.14g硅胶(200-300目)和40L甲苯搅拌到均匀流体状态，然后分批转移到层析柱(静置1h)，并且将5-8cm的甲苯保持在硅胶顶部处，并将硅胶表面上的甲苯排出。
将262.17g粗MMAE溶解在500mL二氯甲烷中；将粗MMAE的二氯甲烷溶液缓慢地倒入筛中，并且在添加之后，排出样本表面上的液体以确保样本的上表面是平坦的，并且将2896.58g无水硫酸钠添加到硅胶柱的顶端。使用30L双层玻璃反应器来制备洗脱液，将洗脱液冷却到2℃-8℃，并且首先用235.2L的甲苯:甲醇＝20:1(V/V)系统进行洗脱，并且直到色带完全流出才进行检测。在色带流出之后，开始薄层层析(TLC)检测(显影剂为V甲苯:V甲醇＝5:1，碘用于显色)，当仅可看到产物时，替代地使用140.8L的甲苯:甲醇＝10:1(V/V)来继续洗脱，直到产物完全流出(TLC检测不到产物)。
合并MMAE的纯级分并且在35℃-40℃下在减压下将所述纯级分浓缩为发泡体。在用1200mL甲醇溶解之后，过滤产物并且在35℃-40℃下在减压下浓缩所述产物；将该操作重复两次。在油泵真空下在40℃-45℃下干燥10-18h之后，进行多次研磨直到获得均匀粉末。在继续干燥总共36小时之后，每6-12h开始采样以检测甲醇和甲苯溶剂残余物。当甲醇残余物低于或等于0.200％并且甲苯残余物低于或等于0.089％时，停止干燥以获得纯化的MMAE，其中产率为71.79％，纯度为99.8％并且单一杂质为0.2％。其层析图示出于图3中。
本发明已通过各种具体实施方案进行例示。然而，本领域普通技术人员应当理解，本发明不限于各个具体实施方案，而是普通技术人员可在本发明的范围内进行各种改变或修改，并且本说明书中的各个位置处提及的各种技术特征可在不脱离本发明的精神和范围的情况下彼此组合。此类修改和变化在本发明的范围内。
Claims (72)
1.一种式(I)中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
其中所述方法包括以下步骤：
(1)将化合物1溶解在适当量的第一有机溶剂中以形成溶液A；
(2)将足够量的HCl-1,4-二烷溶液添加到所述溶液A中以进行隔热反应，从而去除Boc保护基；
(3)在所述反应结束之后，将步骤(2)的反应溶液倒入足够量的第一低极性溶剂中，在搅拌之后丢弃滤液，并且固体残余物在干燥之后成为化合物2；
(4)将获得的化合物2和适当量的化合物3溶解在第二有机溶剂中以形成溶液B；
(5)将第一多肽缩合剂溶解在适当量的第三有机溶剂中以形成溶液C，其中所述第一多肽缩合剂的摩尔数大于步骤(4)的所述化合物3的摩尔数；
(6)将所述溶液C添加到所述溶液B中以形成溶液D；
(7)将适当量的第一有机碱添加到所述溶液D中以进行隔热反应；
(8)在步骤(7)的所述反应结束之后，将足够量的第二低极性溶剂和纯化水添加到步骤(7)的反应系统中以进行萃取，并且收集有机相；
(9)将步骤(8)中收集的所述有机相依次用适当量的盐酸溶液、纯化水和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并且干燥以获得化合物4；
(10)将所述化合物4溶解在第四有机溶剂中以形成溶液E；
(11)将足够量的二乙胺添加到所述溶液E中以进行隔热反应，从而去除Fmoc保护基；
(12)在所述反应结束之后，将适当量的第五有机溶剂和纯化水添加到步骤(11)的反应系统中以进行萃取，收集有机相，经无水硫酸钠干燥，并且在减压下浓缩；
(13)通过甲苯:甲醇的洗脱系统对步骤(12)中在减压下获得的浓缩物进行层析纯化，并且在减压下浓缩收集的洗脱液；
(14)在用第六有机溶剂将步骤(13)中在减压下获得的浓缩产物溶解之后，过滤，并且在减压下浓缩滤液；以及
(15)真空干燥在步骤(14)中在减压下获得的浓缩产物以获得所述MMAE。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述第一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(1)中的所述第一有机溶剂是二氯甲烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:2；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1-3；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与所述第一有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1.5-2.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的浓度为约4mol/L；优选地，步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为约3-7mol/L；并且更优选地，步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为3.5-4.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-8；更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-7；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:6。
6.根据权利要求1所述的方法，其中逐滴地添加步骤(2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液，并且在所述逐滴添加期间，将所述反应系统的内部温度维持在-5℃至5℃之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中的所述隔热反应的温度为10℃-15℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的所述第一低极性溶剂选自正己烷、石油醚和正庚烷；并且优选地，所述第一低极性溶剂选自正己烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:16；优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:10-25；更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:12-20；并且更优选地，步骤(1)中的所述化合物1与步骤(3)中的所述第一低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-17。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述第二有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；优选地，所述第二有机溶剂是DMF；并且更优选地，在步骤(4)中，所述化合物2与所述化合物3的摩尔量相同。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与所述第二有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-7。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂选自HATU、DIC、DCC、EDC、HCTU、DEPBT、EEDQ和CDI；并且优选地，步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂是HATU。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的摩尔比为约1:1.2；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.01-1.5；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.1-1.4；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第一多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.2-1.3。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中的所述第三有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第三有机溶剂是DMF。
15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2-6；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2.5-4；并且更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(5)中的所述第三有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(6)中，将所述溶液C逐滴地添加到所述溶液B中，并且在所述逐滴添加期间整个反应系统的内部温度为0℃-5℃。
17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(7)中的所述第一有机碱是选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶的一者或多者；并且优选地，步骤(7)中的所述第一有机碱是N,N-二异丙基乙胺。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的摩尔比为约1:3；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:2-5；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(7)中的所述第一有机碱的所述摩尔比为1:3-4。
19.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤(7)中的所述第一有机碱逐滴地添加到所述溶液D中，并且所述隔热反应的温度为0℃-5℃。
20.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(8)中的所述第二低极性溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和四氢呋喃；并且优选地，步骤(8)中的所述第二低极性溶剂是甲基叔丁基醚。
21.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:20.2:20.2；优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-25:15-25；更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-24:20-24；并且更优选地，步骤(4)中的所述化合物3与步骤(8)中的所述第二低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-21:20-21。
22.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(8)中的所述第二低极性溶剂与所述纯化水的体积相同。
23.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(9)中的所述盐酸溶液的浓度为约0.05mol/L；优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.02-0.08mol/L；更优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.04-0.06mol/L；并且更优选地，步骤(9)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.05mol/L。
24.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(9)中的所述氯化钠溶液的浓度为约30％；并且优选地，步骤(9)中的所述氯化钠溶液的所述浓度为20％-40％。
25.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(9)中的所述盐酸溶液、所述纯化水和所述氯化钠溶液的体积等于步骤(8)中的所述第二低极性溶剂的体积。
26.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(10)中的所述第四有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(10)中的所述第四有机溶剂是二氯甲烷。
27.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:7；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-10；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与所述第四有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8。
28.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的重量-体积比(g/mL)为约1:3.5；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-5；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(11)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
29.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤(11)中的所述二乙胺逐滴地添加到所述溶液E中，并且在逐滴添加过程中，将所述溶液的内部温度保持在0℃至5℃之间；并且步骤(11)中的所述隔热反应的温度为20℃-30℃。
30.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(12)中的所述第五有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和甲苯；并且优选地，步骤(12)中的所述第五有机溶剂是二氯甲烷。
31.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:7:10；优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10:5-15；并且更优选地，步骤(10)中的所述化合物4与步骤(12)中的所述第五有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-8:9-12。
32.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(13)中的所述层析纯化中所使用的硅胶是200-300目硅胶；所述洗脱系统是体积比(V/V)为10-20:1的甲苯:甲醇；优选地，所述洗脱系统最初为体积比(V/V)为约20:1的甲苯:甲醇；并且在TLC检测到仅可看到产物时，所述洗脱系统变为体积比(V/V)为约10:1的甲苯:甲醇。
33.根据权利要求32所述的方法，其中TLC检测的显影剂是体积比(V/V)为约5:1的甲苯:甲醇。
34.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(14)中的所述第六有机溶剂选自甲醇、甲苯和乙腈；并且优选地，步骤(14)中的所述第六有机溶剂是甲醇。
35.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(10)中的所述化合物4与步骤(14)中的所述第六有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3-10。
36.根据权利要求1所述的方法，其中可将步骤(14)的过程重复1至5次。
37.一种下式中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
其中所述方法包括以下步骤：
(1-1).将化合物1溶解在适当量的第七有机溶剂中以形成溶液F；
(1-2).将足够量的HCl-1,4-二烷溶液添加到所述溶液F中以进行隔热反应，从而去除Boc保护基；以及
(1-3).在所述反应结束之后，将步骤(1-2)的反应溶液倒入足够量的第三低极性溶剂中，在搅拌之后丢弃滤液，并且固体残余物在干燥之后成为化合物2。
38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-1)中的所述第七有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(1-1)中的所述第七有机溶剂是二氯甲烷。
39.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:2；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1-3；并且更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与所述第七有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:1.5-2.5。
40.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的浓度为约4mol/L；优选地，步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为约3-7mol/L；并且更优选地，步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述浓度为3.5-4.5mol/L。
41.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-8；更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-7；并且甚至更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二/>烷溶液的所述重量-体积比(g/mL)为1:6。
42.根据权利要求37所述的方法，其中逐滴地添加步骤(1-2)中的所述HCl-1,4-二烷溶液，并且在所述逐滴添加期间，将反应系统的内部温度维持在-5℃至5℃之间。
43.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-2)中的所述隔热反应的温度为10℃-15℃。
44.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂选自正己烷、石油醚和正庚烷；并且优选地，步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂选自正己烷。
45.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:16；优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:10-25；更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:12-20；并且更优选地，步骤(1-1)中的所述化合物1与步骤(1-3)中的所述第三低极性溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-17。
46.一种下式中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
其中所述方法包括以下步骤：
(2-1).将化合物2和适当量的化合物3溶解在第八有机溶剂中以形成溶液G；
(2-2).将第二多肽缩合剂溶解在适当量的第九有机溶剂中以形成溶液H，其中所述第二多肽缩合剂的摩尔数大于步骤(2-1)中的所述化合物3的摩尔数；
(2-3).将所述溶液H添加到所述溶液G中以形成溶液I；
(2-4).将适当量的第二有机碱添加到所述溶液I中以进行隔热反应；
(2-5).在所述反应结束之后，将足够量的第四低极性溶剂和纯化水添加到步骤(2-4)的反应系统中以进行萃取，并且收集有机相；以及
(2-6).将步骤(2-5)中收集的所述有机相依次用适当量的盐酸溶液、纯化水和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并且干燥以获得化合物4。
47.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述第八有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第八有机溶剂是DMF。
48.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:6；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8；并且更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与所述第八有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-7。
49.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂选自HATU、DIC、DCC、EDC、HCTU、DEPBT、EEDQ和CDI；并且优选地，步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂是HATU。
50.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的摩尔比为约1:1.2；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.01-1.5；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.1-1.4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第二多肽缩合剂的所述摩尔比为1:1.2-1.3。
51.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂选自DMF、DMA、DMSO和DCM；并且优选地，所述第九有机溶剂是DMF。
52.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2-6；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-2)中的所述第九有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
53.根据权利要求46所述的方法，其中在步骤(2-3)中，将所述溶液H逐滴地添加到所述溶液G中，并且在所述逐滴添加期间整个反应系统的内部温度为0℃-5℃。
54.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-4)中的所述第二有机碱是选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶的一者或多者；并且优选地，步骤(2-4)中的所述第二有机碱是N,N-二异丙基乙胺。
55.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的摩尔比为约1:3；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:2-5；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:2.5-4；并且甚至更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-4)中的所述第二有机碱的所述摩尔比为1:3-4。
56.根据权利要求46所述的方法，其中在步骤(2-4)中，将所述第二有机碱逐滴地添加到所述溶液I中，并且所述隔热反应的温度为0℃-5℃。
57.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和四氢呋喃；并且优选地，步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂是甲基叔丁基醚。
58.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:20.2:20.2；优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:15-25:15-25；更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-24:20-24；并且更优选地，步骤(2-1)中的所述化合物3与步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:20-21:20-21。
59.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-5)中的所述第四低极性溶剂的体积与所述纯化水的体积相同。
60.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的浓度为约0.05mol/L；优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.02-0.08mol/L；更优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.04-0.06mol/L；并且更优选地，步骤(2-6)中的所述盐酸溶液的所述浓度为0.05mol/L。
61.一种式(I)中所示的化合物的制备和纯化方法：
所述方法的制备途径如下：
其中所述方法包括以下步骤：
(3-1).将化合物4溶解在第十有机溶剂中以形成溶液J；
(3-2).将足够量的二乙胺添加到所述溶液J中以进行隔热反应，从而去除Fmoc保护基；
(3-3).在所述反应结束之后，将适当量的第十一有机溶剂和纯化水添加到步骤(3-2)的反应系统中以进行萃取，收集有机相，经无水硫酸钠干燥，并且在减压下浓缩；
(3-4).通过甲苯:甲醇的洗脱系统对步骤(3-3)中在减压下获得的浓缩物进行层析纯化，并且在减压下浓缩收集的洗脱液；
(3-5).在用第十二有机溶剂将步骤(3-4)中在减压下获得的浓缩产物溶解之后，过滤并且在减压下浓缩滤液；以及
(3-6).真空干燥在步骤(3-5)中在减压下获得的浓缩产物以获得所述MMAE。
62.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-1)中的所述第十有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、三氯甲烷和四氯化碳；并且优选地，步骤(3-1)中的所述第十有机溶剂是二氯甲烷。
63.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:7；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:4-10；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与所述第十有机溶剂的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-8。
64.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的重量-体积比(g/mL)为约1:3.5；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-5；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-2)中的所述二乙胺的所述重量-体积比(g/mL)为1:3-4。
65.根据权利要求61所述的方法，其中逐滴地添加步骤(3-2)中的所述二乙胺，并且在逐滴添加过程中，将内部温度保持在0℃与5℃之间；并且步骤(3-2)中的所述隔热反应的温度为20℃-30℃。
66.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和甲苯；并且优选地，步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂是二氯甲烷。
67.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的重量-体积比(g/mL)为约1:7:10；优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:5-10:5-15；并且更优选地，步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-3)中的所述第十一有机溶剂和纯化水的所述重量-体积比(g/mL)为1:6-8:9-12。
68.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-4)中的所述层析纯化中所使用的硅胶是200-300目硅胶；所述洗脱系统是体积比(V/V)为10-20:1的甲苯:甲醇；优选地，所述洗脱系统最初为体积比(V/V)为约20:1的甲苯:甲醇；并且在TLC检测到仅可看到产物时，所述洗脱系统变为体积比(V/V)为约10:1的甲苯:甲醇。
69.根据权利要求61所述的方法，其中TLC检测的显影剂是体积比(V/V)为约5:1的甲苯:甲醇。
70.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂选自甲醇、甲苯和乙腈；并且优选地，步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂是甲醇。
71.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(3-1)中的所述化合物4与步骤(3-5)中的所述第十二有机溶剂的重量-体积比(g/mL)为约1:3-10。
72.根据权利要求61所述的方法，其中可将所述步骤(3-5)的过程重复1至5次。
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