CN115135628A - 快速高效点击释放的化合物 - Google Patents

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CN115135628A CN202080058257.6A CN202080058257A CN115135628A CN 115135628 A CN115135628 A CN 115135628A CN 202080058257 A CN202080058257 A CN 202080058257A CN 115135628 A CN115135628 A CN 115135628A
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hetero
aryl
radical
optionally
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CN202080058257.6A
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马克·斯特凡·罗比拉德
汉斯·米库拉
沃尔特·坦恩·霍伊夫
蕾法埃拉·罗辛
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Tek Wolcos Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Technische Universitaet Wien
Tek Wolcos Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本文公开的本发明涉及一种化合物、组合物、试剂盒及使用它们的方法，用于生物正交释放反应。特别地，本发明的化合物、组合物及试剂盒可用于实现快速有效的点击释放。本发明的化合物、组合物及试剂盒的应用包括体外及体内应用。

Description

快速高效点击释放的化合物
技术领域
本文公开的发明涉及化合物、组合、试剂盒和使用它们的方法，用于生物正交释放反应。
背景技术
与生物系统的各种功能正交的选择性化学反应称为生物正交反应(bio-orthogonal reaction)，发生在两个相互排斥反应的非生物基团之间。这些可用于选择性地修饰生化结构，例如蛋白质或核酸，它们通常在水中和接近环境温度下进行，并可应用于复杂的化学环境，例如在生物体中发现的化学环境。
生物正交反应广泛应用于化学合成、材料科学、化学生物学、诊断学和医学。生物正交反应尤其突出的应用领域包括用于药物应用的药物递送剂和前药，以及用于生物分析领域的各种可逆生物结合物和复杂的光谱生物探针。
一个突出的生物正交反应是反式环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)和四嗪(tetrazine，TZ)之间的逆电子需求Diels-Alder(inverse-electron-demand DielsAlder，IEDDA)反应。在以前的研究中，IEDDA反应用于预靶向放射免疫成像，使用反式环辛烯(TCO)标记的抗体或抗体片段治疗荷瘤小鼠，一天或几天后，通过给药并将放射性标记的四嗪探针选择性结合到肿瘤结合抗体的TCO标记上(R.Rossin,M.S.Robillard,Curr.Opin.Chem.Biol.2014,21,161-169)。
在IEDDA偶联的基础上，开发了一种释放反应，称为IEDDA哒嗪消除，一种“点击释放(click-to-release)”的方法，在偶联(conjugation)时提供瞬时和选择性释放(R.M.Versteegen，R.Rossin，W.ten Hoeve，H.M.Janssen，M.S.Robilard，Angew.Chem.Int.Ed.2013，52，14112-14116)。四嗪(即二烯)和烯烃(即亲二烯)之间的IEDDA反应产生4,5-二氢哒嗪(4,5-dihydropyridazine)，通常互变异构为1,4-和2,5-二氢哒嗪。研究表明，1,4-二氢哒嗪产品源自在烯丙基位置含有氨基甲酸酯连接的阿霉素(doxorubicin，Dox)和四嗪的TCO，易于通过电子级联机制消除CO2和Dox，最终提供芳香哒嗪。这种触发释放已在磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)、血清、细胞培养和小鼠中得到证实，并有望在医学、化学生物学和合成化学中得到广泛应用，包括触发药物释放、生物分子解封和捕获与释放策略。
通常情况下，IEDDA哒嗪消除能够在相对复杂的环境中，在一系列其他化学官能团存在的情况下，对广泛的底物进行控制操作。此控件可以是时间控件，也可以是空间控件。此操纵可以是多用途的，例如用于多种目的，包括但不限于激活、失活、释放、捕获或以其他方式改变附着于化学可裂解基团的结构。
IEDDA哒嗪消除法已应用于抗体的触发药物释放-能够参与IEDDA反应的药物结合物(antibody-drug conjugates，ADC)(图1)。ADC是一类很有前途的生物制药，它将单克隆抗体(单抗)(mAb)或mAb片段的靶向特异性与小分子毒素的效力结合起来。经典ADC被设计为与内化癌细胞受体结合，导致ADC被摄取，随后通过酶、硫醇或溶酶体pH在细胞内释放药物。将毒素导入肿瘤，同时最小化对健康组织的外周损伤，允许使用高效药物，从而改善治疗效果。使用IEDDA哒嗪消除法激活ADC可以靶向非内化受体，因为药物是通过化学而非生物方式切割的。
一般来说，前药(可能包含ADC)是IEDDA哒嗪消除反应的一个有趣应用，在该反应中，药物被一个部分去活化、结合或掩盖，并在IEDDA反应发生后被重新激活、释放或揭开。
上述技术的背景技术还包括WO2012/156919、WO2012156918A1、WO2014/081303和US20150297741。本文中，亲二烯(dienophile)，即前述TCO，用作化学上可切割的基团，例如合成化学中的保护基团，化学生物学、体外诊断和体内前药活化中的可裂解接头或掩膜。此基团以这样的方式连接到构建体(construct)(例如，分子、蛋白质、肽、聚合物、染料、表面)，使得亲二烯可以通过允许亲二烯与二烯(前述TZ)反应而引发从构建体释放亲二烯。亲二烯基是八元非芳香环烯基或烯基，尤其是TCO基。
在某些应用中，TCO是前药的一部分，前药首先注射到受试者的血液中，可能针对身体的某个部位，例如肿瘤。然后，一定比例的前药被固定在靶点，而另一个百分比则被身体清除。在数小时或数天后，施用包含四嗪的活化剂以从前药释放药物，优选仅在靶点处。四嗪本身也会以一定的清除率被身体清除。
通常，四嗪在初始步骤与含亲二烯丙基的结构(例如，含亲二烯丙基的前药)反应形成偶联物(conjugate)。这被称为点击偶联步骤(click conjugation step)。接下来，通过一个或多个机制，优选地从亲二烯构建体(例如：前药)中释放此构建体。应当理解，点击接合步骤中的高产率，即高点击接合产率，并不一定导致释放结构的高产率，即高药物释放产率。
从生物正交性的角度来看，化学反应很好。
然而，人们希望开发出更好的IEDDA反应。
在IEDDA反应中实现高结构释放率仍然是体内和体外的挑战。具体而言，希望携带亲二烯和二烯的构建体之间的反应在体外和/或体内产生高的构建体释放产率。
此外，在IEDDA反应中实现快速结构释放仍然是体内和体外的挑战。具体而言，希望携带亲二烯和二烯的构建体之间的反应在体外和/或体内产生快速的构建体释放。
通常情况下，四嗪类药物通常释放量较高，其活性低于已成功用于体内点击接合的四嗪类药物。这些反应性更强的四嗪类化合物的点击偶联产率较高，但点击释放产率较低。上述研究在R.M.Versteegen，R.Rossin，W.ten Hoeve，H.M.Janssen，M.S.Robilard，应用化学(Angew.Chem.)；Int.Ed.；2013，52，14112-14116(R.M.Versteegen,R.Rossin,W.tenHoeve,H.M.Janssen,M.S.Robillard,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112-14116)表明，例如3,6-二-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(3,6-bis-(2-pyridyl)-1,2,4,5-tetrazine)具有较高的点击接合率和产率，但在PBS/MeCN(3：1)中只有7％或在血清中只有12％的点击释放产率非常差。
此外，对于释放率高的四嗪，例如3,6-双甲基-1,2,4,5-四嗪(3,6-bis-methyl-1,2,4,5-tetrazine)，这种释放通常需要几个小时，并且通常表现出最大80-90％的释放(R.M.Versteegen，R.Rossin，W.ten Hoeve，H.M.Janssen，M.S.Robilard，应用化学(Angew.Chem.)；Int.Ed.2013,52,14112-14116(R.M.Versteegen,R.Rossin,W.ten Hoeve,H.M.Janssen,M.S.Robillard,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112-14116))。
至少出于这些原因，人们希望在体外和/或体内提高四嗪基序的点击释放率和产率，四嗪基序对亲二烯类具有相对高的反应性(即高点击接合产率)。
另一个期望是提高四嗪类药物的点击释放率和可能的点击释放率，并在体外和/或体内具有相对良好的点击偶联和/或释放率。
另一个期望是提高体外和/或体内对亲二烯类低反应性四嗪的点击释放率，最好也是点击释放率。
另一个期望是实现高点击接合产率与含有亲二烯的构建物的结合，以及体外和体内的高构建物释放产率。
另一个期望是实现与亲二烯丙基的高点击偶联反应速率、含有亲二烯丙基和四嗪的构建体之间的高点击偶联产率、高构建体释放产率和高构建体释放速率(优选在体外和体内)的组合。
之前的研究试图通过改造二烯而不是亲二烯来满足上述需求，以提供更高的偶联产率，或增加释放产率/速率，或两者兼而有之。
之前的一项研究(R.Rossin，S.M.J.van Duijnhoven，W.ten Hoeve，H.M.Janssen，L.H.J.Kleijn，F.J.M.Hoeben，R.M.Versteegen，M.S.Robillad，Bioconj.Chem.，2016，27，1697-1706)表明，将10kDa右旋糖酐与3-甲基-6-(2-吡啶基)-四嗪或3-甲基-6-(亚甲基)-四嗪(3-methyl-6-(2-pyridyl)-tetrazine or a 3-methyl-6-(methylene)-tetrazine)连接可获得高的点击偶联产率在体内，但在体外和体内，药物释放都不理想。
另一针对体外反应的出版物(Fan等人，Angew.Chem.Int.Ed.，2016，5514046-14050)表明，小的不对称四嗪与TCO的偶联反应性高于对称的双烷基四嗪，但点击释放率仍然不是定量的。
其他出版物，Carlson等人，美国化学会志；2018，140，3603-3612(Carlson etal.,J.Am.Chem.Soc.2018,140,3603-3612)和(Sarris等人，化学；2018，24，18075-18081(Sarris et al,Chemistry 2018,24,18075-18081)表明，含有羧酸或胺基的双烷基四嗪可以提高点击释放率，但这些四嗪在与TCO的点击偶联中相对不活跃。
希望开发出能够解决上述一个或多个问题和/或期望的化合物。
发明内容
在一个方面，本发明涉及化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物满足式19：
Figure BDA0003509271520000051
Figure BDA0003509271520000061
其中R48选自于由-OH、-OC(O)Cl、-OC(O)O-N-琥珀酰亚胺基(-OC(O)O-N-succinimidyl)、-OC(O)O-4-硝基苯基(-OC(O)O-4-nitrophenyl)、-OC(O)O-四氟苯基(-OC(O)O-tetrafluorophenyl)、-OC(O)O-五氟苯基(-OC(O)O-pentafluorophenyl)、-OC(O)-(SP)kCA、-OC(S)-(SP)kCA、-SC(O)-(SP)kCA、-SC(S)-(SP)kCA、-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA、-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA、及-(SP)kCA-所组成的群组；
r为范围0至2的整数；每个s独立地为0或1；每个i独立地为范围0至4的一整数，优选为0或1；j为范围0至4的一整数，优选为0或1；每个k独立地为0或1；LC是一可自分解连接基，以及SP是一间隔基；每个CA及CB独立地选自于由有机分子及无机分子所组成的群组；其中条件(a)-(c)中的至少一个被满足：
(a)X1、X2、X3、X4、X5中的至少一个是CR47YT1；YT1相对于Ha被定位为顺式；
(b)X3是YT3；以及
(c)选自于X1、X2、X3、X4、X5的2个相邻X部分是一稠合环的一部分，所述稠合环的部分满足式(20a)-(20g)中的一个：
Figure BDA0003509271520000062
Figure BDA0003509271520000071
YT2相对于8元亲二烯环被定位为顺式；其中Xa及Xb是式19的8元环的一部分，使得Xa-Xb或Xb-Xa是X1-X2、X2-X3、X3-X4或X4-X5；
对于式20a-20c，Xa及Xb为CR47，优选为CH；对于式20d-20g，Xa及Xb独立地为CR47或N，优选为CR47，更优选为CH；X6及X8各自独立地选自于由YT3、C(R47)YT2、C(R47)2、O、S、C(O)、C(S)及S(O)2所组成的群组；X7选自于由YT3及ZT所组成的群组；当X6为YT3时，则X7为ZT；当X7为YT3时，则X6及X8各自独立地选自于由C(R47)YT2、C(R47)2、O及S所组成的群组；优选为C(R47)YT2或C(R47)2；其中所述满足式20g的稠合环(fused ring)包含至少一YT2或YT3部分；
对于式20b及20f，直接连接到相同碳上的2个R47可以一起为＝C-(R47)2、＝S或＝O；
在X1-X2、X2-X3、X3-X4及X4-X5不是-O-O-、-N-N-、-O-N-或-N-O-的条件下；
从Xa及Xb至所述式20a-20g的稠合环的其馀部分的直接键相对于彼此为顺式，并且相对于Ha为顺式，所述式20a-20g的稠合环稠合至所述8元亲二烯体环；
优选地，没有相邻的原子对为-O-O-是所述式20a-20g的稠合环的一部分；
YT1选自于由OH、SH、N(R38)2、C(O)OH、C(S)OH、C(O)SH、C(S)SH、ON(R38)2、SO4H、SO3H、SO2H、PO4H2、PO3H、PO2H及C(N)N(R38)2所组成的群组；
YT2选自于由OH、SH及N(R38)2所组成的群组；
YT3是NR38，并且C(O)、C(S)、S(O)或S(O)2不在YT3的旁侧；
所述其余的X1、X2、X3、X4、X5独立地选自于由C(R47)2及O所组成的群组，使得X1、X2、X3、X4、X5中的最多2个是O、NR38或N；
其中，当R48是-OC(O)-(SP)kCA、-OC(S)-(SP)kCA、-SC(O)-(SP)kCA或-SC(S)-(SP)kCA时，SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)结合到R48的-OC(O)-、-OC(S)-、-SC(O)-或-SC(S)，通过选自于由O、C、S及N所组成的群组的一原子，优选选自于二级或三级N，其中所述原子是SP或CA的一部分，
其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为0时，SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)在所述式19的反环辛烯环(trans-cyclooctene ring)的烯丙基(allylic)位置上与R48的-O-或-S-的部分结合，通过选自于由-C(O)-及-C(S)-所组成的群组的一基团，其中所述基团是SP或CA的一部分；
其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为1时，LC在所述式19的反环辛烯环的烯丙基位置上与-O-或-S-的部分结合，通过选自于由-C(YC2)YC1-以及碳原子，优选芳族碳所组成的群组的一基团，其中所述基团是LC的一部分；
其中YC1选自于由-O-、-S-及-NR36-所组成的群组；
其中YC2选自于由O及S所组成的群组；其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为1时，则SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)与LC结合，通过选自于由-O-、-S-及-N-所组成的群组的部分，优选选自于二级或三级N，其中所述部分是SP或CA的一部分；
其中，当R48为-(SP)kCA时，则SP(k>0时)或CA(k＝0时)通过-O-原子或-S-原子结合到所述式19的反环辛烯的烯丙基位置，其中所述-O-原子或所述-S-原子是SP或CA的一部分，
其中ZT选自于由C1-C12亚烷基(alkylene groups)、C2-C12亚烯基、C7-C12亚炔基(alkynylene groups)、C6亚芳基(arylene groups)、C4-C5杂亚芳基(heteroarylenegroups)、C3-C8亚环烷基(cycloalkylene groups)、C5-C8亚环烯基(cycloalkenylenegroups)、C5-C12烷基(杂)亚芳基(alkyl(hetero)arylene groups)、C5-C12(杂)芳基亚烷基((hetero)arylalkylene groups)、C4-C12烷基亚环烷基(alkylcycloalkylene groups)及C4-C12环烷基亚烷基(cycloalkylalkylene groups)所组成的群组，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基任选地被选自于由-(SP)i-CB，其中i独立地为范围从0至4的一整数、-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-Si(R37)3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由-O-、-S-、-NR37-、-P-及-Si-所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化(quaternized)；
其中R37及R36的每一个独立地选自于由氢、-(SP)i-CB，其中i独立地为范围0至4的一整数、C1-C24烷基(alkyl groups)、C2-C24烯基(alkenyl groups)、C2-C24炔基(alkynylgroups)、C6-C24芳基(aryl groups)、C2-C24杂芳基(heteroaryl groups)、C3-C24环烷基(cycloalkyl groups)、C5-C24环烯基(cycloalkenyl groups)、C12-C24环炔基(cycloalkynyl groups)、C3-C24(环)烷基(杂)芳基((cyclo)alkyl(hetero)aryl groups)、C3-C24(杂)芳基(环)烷基((hetero)aryl(cyclo)alkyl)、C4-C24(环)烯基(杂)芳基((cyclo)alkenyl(hetero)aryl groups)、C4-C24(杂)芳基(环)烯基((hetero)aryl(cyclo)alkenylgroups)、C4-C24(环)炔基(杂)芳基((cyclo)alkynyl(hetero)aryl groups)、C4-C24(杂)芳基(环)炔基((hetero)aryl(cyclo)alkynyl groups)、C4-C24烷基环烷基(alkylcycloalkylgroups)及C4-C24环烷基烷基(cycloalkylalkyl groups)所组成的群组；其中i为范围0至4的一整数，优选i为1；
其中不为氢的R37及R36基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中在R38不通过C(O)、C(S)、S(O)或S(O)2连接到所述分子的其馀部分的条件下，R38独立地选自于R37及R36所列的群组；
其中每个R47独立地选自于由氢、-(SP)i-CB、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、-S(＝O)2N(R37)2、-OC(＝O)R37、-SC(＝O)R37、-OC(＝S)R37、-SC(＝S)R37、-NR37C(＝O)-R37、-NR37C(＝S)-R37、-NR37C(＝O)O-R37、-NR37C(＝S)O-R37、-NR37C(＝O)S-R37、-NR37C(＝S)S-R37、-OC(＝O)N(R37)2、-SC(＝O)N(R37)2、-OC(＝S)N(R37)2、-SC(＝S)N(R37)2、-NR37C(＝O)N(R37)2、-NR37C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)R37、-C(＝S)R37、-C(＝O)N(R37)2、-C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)O-R37、-C(＝O)S-R37、-C(＝S)O-R37、-C(＝S)S-R37、-S(O)R37、-S(O)2R37、-NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基及C4-C24环烷基烷基所组成的群组；
其中，优选i是范围0至1的一整数；
其中，烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、环烷基烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中2个R37、R38、R47基团任选地包含在一环中；以及
其中2个R37、R38、R47基团任选地包含在一环中，以形成稠合到所述八元反式环(eight-membered trans-ring)的一环。
在另一方面中，本发明涉及包含根据本发明的化合物和二烯(diene)、优选四嗪(tetrazine)的组合。
在又一方面中，本发明涉及本发明化合物或根据本发明用作药剂的组合物。
在另一方面，本发明涉及用于治疗受试者(优选人类)疾病的本发明化合物或根据本发明的组合，其中所述疾病选自于由癌症、中枢神经系统疾病、感染、炎症及心血管疾病所组成的群组。
在另一方面，本发明涉及一种用于从根据本发明的化合物中释放分子的非治疗性方法，所述非治疗性方法包括将根据本文定义的式(19)的化合物与本文定义的二烯接触的步骤。
在另一方面，本发明涉及一种非治疗性方法，用于在受试者(优选人)中成像根据本发明的化合物，所述非治疗性方法包括以下步骤：
(a)向受试者施用如本文所定义的式(19)化合物，其包含标记；
(b)根据存在于受试者中的式(19)对化合物成像；
其中所述标记选自由放射性核素、荧光染料和磷光染料组成的群组。
在另一方面中，本发明涉及根据本发明的化合物或根据本发明的组合用于在受试者(优选人)中成像的非治疗性用途，其中所述化合物，或在所述组合的情况下，所述根据式(19)的化合物和二烯中的至少一种，包括从放射性核素、荧光染料和磷光染料中选择的标记。
在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的化合物或根据本发明的组合用于释放分子的非治疗性用途，优选在体外。
附图说明
图1描绘了本发明的优选实施方式。在这两个板中，一个ADC用于癌症患者，并允许其循环并与癌细胞上的靶细胞结合。在自由循环的ADC从循环中充分清除后，例如在注射后2天，给药活化剂并全身分配，允许与癌症结合的前药或ADC的触发物发生反应，释放药物，之后药物可以穿透并杀死邻近的癌细胞；板A显示氨基甲酸酯连接药物的裂解，板B显示乙醚连接药物的裂解；
图2描绘了本发明的优选实施方式。向癌症患者施用包含双特异性(抗肿瘤和抗CD3)抗体和掩蔽部分(阻断蛋白)的抗体构建体，并允许其循环并结合到癌细胞上的靶点。在自由循环的构建物充分清除循环后，例如在注射后2天，将活化剂投与并系统分配，允许与癌症结合的前药的触发物发生反应，释放掩膜，之后T细胞结合双特异性抗体，导致肿瘤杀伤；
图3描述了功能性细胞穿膜肽(cell penetration peptide，CPP)在靶点的体内组装，导致触发的CPP诱导的药物内化。
图4描述了在靶点对CPP进行体内揭秘，从而触发CPP诱导的药物内化；
图5描述了本发明在放射免疫治疗中的用途，给药放射性标记抗体，使其循环并结合内生化癌症受体，并在发生充分内生化后给药一种活化剂，将放射性标记(例如，包含放射性螯合物的部分)从抗体中裂解，导致血液和非靶组织中的放射性物质迅速被肾脏清除，但肿瘤细胞内部的放射性物质则无法清除；
图6描述了本发明化合物用于与例如药物进行位点特异性抗体结合以生产ADC的用途；以及
图7描述了使用TCO构建物进行的体外实验的结果，所述构建物包含淬灭荧光团(quenched fluorophore)和本发明的活化剂对象；构建物和活化剂在PBS、细胞培养基和人血浆中快速反应、释放和消除荧光团，在溶液中产生可检测的荧光增加。
具体实施方式
本发明基于明智的见解，即根据本发明的化合物、组合物及试剂盒(kit)更好地解决了上述一种或多种期望。这是令人惊讶的，至少因为这些期望是通过亲二烯(dienophile)的特定特征来满足的，而不是背景艺术所关注的二烯(diene)。
在一方面中，根据本发明的化合物、组合物及试剂盒的使用，导致高释放产率及/或快速释放。
在另一方面，根据本发明的化合物、组合物及试剂盒的使用，导致快速释放。
在另一方面，根据本发明的化合物、组合物及试剂盒的使用，导致快速点击偶联(click-conjugation)以及高释放产率及/或释放速率。
在广义上，本发明基于根据本文所述的根据式(19)的化合物来满足一个或多个上述期望及/或解决一个或多个上述问题的明智见解。
在另一方面，发现了根据本文所述的根据式(19)的化合物与如本文所定义的二烯的组合满足一个或多个上述期望及/或解决一个或多个上述问题。
在又一方面，发现了包含根据本发明的组合的试剂盒满足一个或多个上述期望及/或解决一个或多个上述问题。
在另一方面，发现了根据本发明的组合及根据本发明的试剂盒可用于患者或动物的治疗或成像。
在又一方面，发现根据本发明的化合物、根据本发明的组合物以及和根据本发明的试剂盒可用于体外及/或体内的生物正交反应(bioorthogonal reaction)。
在不希望受理论约束下，本发明人认为，当与二烯接触时，与已知的TCOs相比，特别是与缺少所述YT1、YT2及/或YT3基团的相同的TCO相比，在根据式(19)的结构中，如本文所定义的YT1、YT2及/或YT3基团的存在导致更高的点击释放产率及/或点击释放速率。在仍然不希望受理论约束下，发明人目前认为这是二氢哒嗪(dihydropyridazine)互变异构体(tautomer)中间体失稳效应(destabilizing effect)的结果，尤其是TCO与四嗪偶联(conjugation)时形成的4,5-及/或1,4-二氢哒嗪互变异构体中间体。
此外，发现如本文所述的根据式(19)的化合物在与产生高点击错合(conjugation)产率及速率的二烯接触时，产生高点击释放产率及释放速率。
参考方案1A中的一个例子并且不希望受制于理论，发明人认为在形成4,5-二氢哒嗪互变异构体3后，YT1部分(例如：OH、NH2)与顺式定位的Ha形成氢键，诱导1,4-二氢哒嗪中间体4的去质子化及互变异构化，然后通过途径A及/或B消除CA。途径A包括提供游离CA5及随后6的1,4-消除。途径B包含YT1对CA通过氨基甲酸酯接头(linker)所连接的碳的亲核攻击，导致CA的环化介导的释放以及7及8的形成。发明人认为，适当定位的YT1、YT2及YT3部分导致通过这些途径中的1个或2个进行快速及高产率的释放。
Figure BDA0003509271520000151
方案1A。本发明提出的IEDDA哒嗪(pyridazine)消除机制。
定义：
将关于特定实施方式并参考某些附图进一步描述本发明，但本发明不限于此，而仅由权利要求书限制。权利要求中的任何参考符号不应被解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性的并且是非限制性的。在附图中，一些元件的尺寸可能被夸大，并且出于说明目的未按比例绘制。指单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一(a)”或“一(an)”、“所述(the)”，其包括所述名词的复数形式，除非另有明确说明。
如在本说明书和权利要求中使用的动词“包括(comprise)”及其词形变化以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。
此外，不定冠词“一(a)”或“一(an)”对元件的引用不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且只有一个元件。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常表示“至少一个”。
因此，表述“包括装置A及B的装置”的范围不应限于仅由组件A及B组成的装置。这意味着对于本发明，所述装置的唯一相关组件是A及B。
本说明书和权利要求中公开的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且这些化合物可以存在不同的非对映异构体及/或对映异构体。除非另有说明，否则本说明书及权利要求书中对任何化合物的描述意在包括所有非对映异构体及其混合物。因此，应当理解，如果在本文中指出了特定的立体异构体，则所述化合物限于特定的立体异构体。例如，在式(19)中，YT2相对于8元亲二烯环(8-membered dienophile ring)为顺式。这包括仍然是顺式的对映异构体，但不包括YT2相对于8元亲二烯环为反式的立体异构体。
此外，除非另有说明，否则本说明书及权利要求书中对任何化合物的描述意在包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他。当化合物的结构被描述为特定对映异构体时，应当理解，除非另有说明，否则本申请的发明不限于此特定的对映异构体。当化合物的结构被描述为特定的非对映异构体时，应当理解，除非另有说明，否则本申请的发明不限于此特定的非对映异构体。
这些化合物可以以不同的互变异构形式存在。除非另有说明，否则根据本发明的化合物意在包括所有互变异构形式。当化合物的结构被描述为特定的互变异构体时，应当理解，除非另有说明，否则本申请的发明不限于此特定的互变异构体。
本说明书及权利要求中公开的化合物还可以作为外型(exo)对映异构体及内型(endo)对映异构体存在。除非另有说明，否则说明书及权利要求书中对任何化合物的描述意在包括化合物的单独的外型及单独的内型非对映异构体，以及它们的混合物。当化合物的结构被描述为特定的内型或外型非对映异构体时，应当理解，除非另有说明，否则本申请的发明不限于此特定的内型或外型非对映异构体。
本说明书及权利要求中公开的化合物还可以作为反式及顺式非对映异构体存在。除非另有说明，否则说明书及权利要求书中对任何化合物的描述意在包括化合物的单独的反式及单独的顺式非对映异构体，以及它们的混合物。当化合物的结构被描述为特定的顺式或反式非对映异构体时，应当理解，除非另有说明，否则本申请的发明不限于此特定的顺式或反式非对映异构体。
对于式(19)，其中YT2相对于8元亲二烯环被定位为顺式；“顺式(syn)”是指YT2与8元亲二烯环位于稠合到8元亲二烯环的环的同一侧。本领域技术人员将理解，顺式定位的YT2面向8元亲二烯而不是背向，并且也可以定义为相对于8元亲二烯环位于内。特别是指YT2面向Xa及Xb侧翼的X部分，其选自X1、X2、X3、X4、X5。为清楚起见，“面向”被理解为“靠近”。此外，为了清楚起见，“定位的顺式”是指YT2相对于Xa及Xb侧翼的X部分被定位为顺式，并且选自X1、X2、X3、X4、X5。此外，为了清楚起见，这意味着YT2相对于从Xa及Xb到8元亲二烯环的其余部分的直接键而言被定位为顺式。
除非另有说明，本发明的化合物及/或其基团可以被质子化或去质子化。可以理解，一种化合物可能带有多个相反符号的电荷。例如，在含有胺及羧酸的化合物中，胺可以被质子化，同时羧酸被去质子化。
在几个化学式中，基团或取代基用字母表示，例如“A”、“B”、“X”、“Y”和各种(编号的)“R”基团。此外，重复单元的数量可以用字母表示，例如在-(CH2)n-中的n。这些字母的定义将参考每个公式来阅读，即在不同的公式中，这些字母各自独立地可以具有不同的含义，除非另有说明。
在以下几个化学式和文本中，提及“烷基”、“杂烷基”、“芳基”、“杂芳基”、“烯基”、“炔基”、“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“芳烃基”等。这些基团所具有的碳原子数，不包括在如下定义的任何任选取代基中的碳原子，可以通过在这些术语之前的名称来表示(例如，“C1-C8烷基”是指所述烷基可以具有1至8个碳原子)。为避免疑义，被-OCH3基团取代的丁基称为C4烷基，因为取代基中的碳原子不包括在碳数中。
未取代的烷基具有通式CnH2n+1，并且可以是直链或支链的。任选地，烷基被本文中进一步规定的一个或多个取代基取代。烷基的示例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。除非另有说明，烷基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。在优选的实施方式中，最多2个杂原子可以是连续的，例如在-CH2-NH-OCH3及-CH2-O-Si(CH3)3中。在一些优选实施方式中，杂原子不直接彼此结合。杂烷基的示例包括-CH2CH2-O-CH3、-CH2CH2-NH-CH3、-CH2CH2-S(O)-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3。在优选的实施方式中，C1-C4烷基包含至多2个杂原子。
环烷基(cycloalkyl group)是环状烷基(cyclic alkyl group)。未取代的环烷基包含至少3个碳原子，并且具有通式CnH2n-1。任选地，环烷基被本文中进一步规定的一个或多个取代基取代。环烷基的示例包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。除非另有说明，环烷基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。
烯基包含一个或多个碳-碳双键，并且可以是直链或支链的。包含1个C-C双键的未取代的烯基，并且具有通式CnH2n-1。包含2个C-C双键的未取代的烯基具有通式CnH2n-3。烯基可包含末端碳-碳双键及/或内部碳-碳双键。末端烯基是其中碳-碳双键位于碳链的末端位置的烯基。烯基还可以包含2个或更多个碳-碳双键。烯基的示例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、叔丁烯基、1,3-丁二烯基、1,3-戊二烯基等。除非另有说明，否则烯基可以任选地被一个或多个独立选择地如下定义的取代基取代。除非另有说明，烯基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。
炔基包含一个或多个碳-碳三键，并且可以是直链或支链的。包含1个C-C三键的未取代的炔基具有通式CnH2n-3。炔基可包含末端碳-碳三键及/或内部碳-碳三键。末端炔基是其中碳-碳三键位于碳链的末端位置的炔基。炔基还可以包含2个或更多个碳-碳三键。除非另有说明，否则炔基可任选地被一个或多个独立选择的如下定义的取代基取代。炔基的示例包括乙炔基、丙炔基、异丙炔基、叔丁炔基等。除非另有说明，否则炔基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。
芳基是指包含6至24个碳原子，更优选6至12个碳原子的芳烃环系统，并且可以包括单环及多环结构。芳基为多环结构时，优选为双环结构。任选地，芳基可以被本文件中进一步规定的一个或多个取代基取代。芳基的示例是苯基及萘基。
芳烷基及烷基芳基(alkylaryl group)包含至少7个碳原子，并且可以包括单环和双环结构。任选地，芳烷基及烷基芳基可以被本文件中进一步规定的一个或多个取代基取代。芳基烷基例如是苄基。烷基芳基例如是4-叔丁基苯基(4-tert-butylphenyl)。
优选地，杂芳基包含5至16个碳原子，并且含有1至5个杂原子。杂芳基包含至少2个碳原子(即至少C2)及一个或多个杂原子N、O、P或S。杂芳基可具有单环或双环结构。任选地，杂芳基可以被本文件中进一步规定的一个或多个取代基取代。合适的杂芳基的示例包括吡啶基、喹啉基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、吡咯基、呋喃基、三唑基、苯并呋喃基、吲哚基、嘌呤基、苯并恶唑基、噻吩基、磷酰基及恶唑基。
杂芳基烷基(heteroarylalkyl group)及烷基杂芳基(alkylheteroaryl group)包含至少3个碳原子(即至少C3)，并且可以包括单环及双环结构。任选地，杂芳基可以被本文中进一步规定的一个或多个取代基取代。
在芳基表示为(杂)芳基的情况下，此标记意在包括芳基及杂芳基。类似地，烷基(杂)芳基意味着包括烷基芳基及烷基杂芳基，并且(杂)芳基烷基意味着包括芳基烷基及杂芳基烷基。C2-C24(杂)芳基因此被解释为包括C2-C24杂芳基及C6-C24芳基。类似地，C3-C24烷基(杂)芳基意味着包括C7-C24烷基芳基及C3-C2烷基杂芳基，C3-C2(杂)芳基烷基意味着包括C7-C24芳烷基及C3-C2杂芳基烷基。
环烯基(cycloalkenyl group)是环状烯基(cyclic alkenyl group)。包含1个双键的未取代的环烯基具有通式CnH2n-3。任选地，环烯基被本文中进一步规定的一个或多个取代基取代。环烯基的一个例子是环戊烯基。除非另有说明，否则环烯基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。
环炔基(cycloalkynyl group)是环状炔基(cyclic alkynyl group)。包含1个三键的未取代的环炔基具有通式CnH2n-5。任选地，环炔基被本文中进一步规定的一个或多个取代基取代。环炔基的一个例子是环辛炔基。除非另有说明，环炔基任选地包含一个或多个独立地选自于由O、NR5、S、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，并且N原子任选地被季铵化。当提及(杂)芳基时，此标记意在包括芳基及杂芳基。烷基(杂)芳基是指烷基芳基及烷基杂芳基。(杂)芳烷基是指芳烷基及杂芳烷基。一般来说，当(杂)((hetero))放在基团之前时，它既指没有前缀杂(hetero-)的基团的变体，也指带有前缀杂的基团。
在本文中，前缀杂(hetero-)表示此基团包含一个或多个选自于由O、N、S、P及Si所组成的群组的杂原子。应当理解，根据定义，具有前缀杂的基团包含杂原子。因此，应当理解，如果具有前缀杂的基团是定义为任选包含杂原子的基团列表的一部分，那么对于具有前缀杂的基团，包含杂原子不是任选的，而是根据定义的情况。
在此，应当理解，当前缀杂用于基团的组合时，前缀杂仅指直接放置之前的基团。例如，杂芳基烷基表示杂芳基与烷基的组合，而不是杂芳基与杂烷基的组合。因此，应当理解，根据定义(见上文)，当前缀杂用于作为被指示可选地包含杂原子的组的列表的一部分的组的组合时，只有在没有前缀杂的组合中的基团包含杂原子是可选的，因为对于前缀杂的组合中的基团不是可选的。例如，如果杂芳基烷基是指示任选包含杂原子的基团列表的一部分，则根据定义，杂芳基部分被认为包含杂原子，而对于烷基部分，则是任选包含杂原子。
在本文中，前缀环(cyclo-)表示基团是环的。应当理解，当前缀环用于基团的组合时，前缀环仅指其直接放置之前的一个基团。例如，亚环烷基亚烯基(cycloalkylalkenylene)是指亚环烷基(参见以下后缀烯(-ene)的定义)与亚烯基的组合，而不是亚环烷基与亚环烯基的组合。
一般来说，当环放在一基团之前时，它既指不带前缀环的基团的变体，也指带前缀环的基团。
在本文中，后缀烯(-ene)表示二价基团，即此基团与至少2个其他部分连接。亚烷基的一个例子是丙烯(-CH2-CH2-CH2-)，它在2个末端都与另一个部分相连。可以理解，如果具有后缀烯的基团在一个位置被-H取代，则此基团与没有后缀的基团相同。例如，被-H取代的亚烷基与烷基相同。即，在一个末端被-H取代的丙烯(-CH2-CH2-CH2-)，-CH2-CH2-CH2-H，在逻辑上与丙基-CH2-CH2-CH3相同。
在本文中，当基团的组合以后缀烯列出时，它是指二价基团，即此基团与至少2个其他部分连接，其中此组合的每个基团包含1个与这2个部分之一的连接。因此，例如烷基亚芳基(alkylarylene)被理解为亚芳基与亚烷基的组合。烷基亚芳基的例子是-苯基-CH2-，芳基亚烷基(arylalkylene)的例子是-CH2-苯基-。
在本文中，后缀三基(triyl)表示三价基团，即此基团与至少三个其他部分相连。下面描述了芳三基(arenetriyl)的一个示例：
Figure BDA0003509271520000221
其中摆动线表示与主要化合物的不同基团的键。
应当理解，如果具有后缀三基的基团在一个位置被-H取代，则此基团与具有后缀烯的二价基团相同。例如，被-H取代的芳三基与亚芳基相同。类似地，应理解如果具有后缀三基的基团在2个位置被-H取代，则此基团与一价基团相同。例如，被2个-H取代的芳三基与芳基相同。
应理解，如果基团，例如烷基，包含杂原子，则此基团与此基团的杂变体相同。例如，如果烷基包含杂原子，则此基团与杂烷基相同。类似地，如果芳基包含杂原子，则此基团与杂芳基相同。应理解，“包含”及其词性变化在本文中意指当基团包含杂原子时，此杂原子是此基团的主链的一部分。例如，含有N的C2亚烷基是指-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-及-CH2-CH2-NH-。
除非另有说明，基团可在非末端(terminal)位置或在一个或多个末端位置包含杂原子。在这种情况下，“末端”是指组内的末端位置，而不一定是整个化合物的末端位置。例如，如果一个亚乙基含有一个氮原子，这可能是指-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-及-CH2-CH2-NH-。例如，如果乙基含有氮原子，这可以指-NH-CH2-CH3、-CH2-NH-CH3及-CH2-CH2-NH2。
在此，应理解环状化合物(即：芳基、环烷基、环烯基等)应理解为单环、多环或支链的。应当理解，环状化合物的碳原子数不仅是指一个环中的碳原子数，而且碳原子可以包含在多个环中。这些环可以稠合到主环上或取代到主环上。例如，任选含有杂原子的C10芳基尤其可以指萘基(稠合环)或是例如联吡啶基团(bipyridyl group)(被取代的环，均含有N原子)。
除非另有说明，(杂)烷基、(杂)烯基、(杂)炔基、(杂)环烷基、(杂)环烯基、(杂)环炔基、(杂)烷基环烷基、(杂)烷基环烯基(杂)烷基环炔基、(杂)环烷基烷基、(杂)环烯基烷基、(杂)环炔基烷基、(杂)烯基环烷基、(杂)烯基环烯基、(杂)烯基环炔基、(杂)环烷基烯基、(杂)环烯基烯基、(杂)环炔基烯基、(杂)炔基环烷基、(杂)炔基环烯基、(杂)炔基环炔基、(杂)环烷基炔基、(杂)环烯基炔基、(杂)环炔基炔基、(杂)芳基、(杂)芳基烷基、(杂)芳基烯基、(杂)芳基炔基、烷基(杂)芳基、烯基(杂)芳基、炔基(杂)芳基、环烷基(杂)芳基、环烯基(杂)芳基、环炔基(杂)芳基、(杂)芳基环烷基、(杂)芳基环烯基、(杂)芳基环炔基、(杂)亚烷基、(杂)亚烯基、(杂)亚炔基、(杂)亚环烷基、(杂)亚环烯基、(杂)亚环亚烷基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基、(杂)芳基亚炔基、烯基(杂)亚芳基、炔基(杂)亚芳基、(杂)芳烃三基、(杂)环烷三基、(杂)环烯三基及(杂)环炔三基任选地被一个或多个独立地选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR5、-SR5、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基烷基、C4-C24(杂)芳基烯基、C4-C24(杂)芳基炔基、C4-C24烯基(杂)芳基、C4-C24炔基(杂)芳基、C4-C24烷基环烷基、C6-C24烷基环烯基、C13-C24烷基环炔基、C4-C24环烷基烷基、C6-C24环烯基烷基、C13-C24环炔基烷基、C5-C24烯基环烷基、C7-C24烯基环烯基、C14-C24烯基环炔基、C5-C24环烷基烯基、C7-C24环烯基烯基、C14-C24环炔基烯基、C5-C24炔基环烷基、C7-C24炔基环烯基、C14-C24炔基环炔基、C5-C24环烷基炔基、C7-C24环烯基炔基、C14-C24环炔基炔基、C5-C24环烷基(杂)芳基、C7-C24环烯基(杂)芳基、C14-C24环炔基(杂)芳基、C5-C24(杂)芳基环烷基、C7-C24(杂)芳基环烯基及C14-C24(杂)芳基环炔基所组成的群组的一个或多个取代基取代。除非另有说明，本文公开的取代基任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR5、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。优选地，这些取代基任选地包含一个或多个选自O、S及NR5的杂原子。
在优选的实施方式中，取代基选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR5、-SR5、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C12环炔基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12(杂)芳基烯基、C4-C12(杂)芳基炔基、C4-C12烯基(杂)芳基、C4-C12炔基(杂)芳基、C4-C12烷基环烷基、C6-C12烷基环烯基、C13-C16烷基环炔基、C4-C12环烷基烷基、C6-C12环烯基烷基、C13-C16环炔基烷基、C5-C12烯基环烷基、C7-C12烯基环烯基、C14-C16烯基环炔基、C5-C12环烷基烯基、C7-C12环烯基烯基、C14-C16环炔基烯基、C5-C12炔基环烷基、C7-C12炔基环烯基、C14-C16炔基环炔基、C5-C12环烷基炔基、C7-C12环烯基炔基、C14-C16环炔基炔基、C5-C12环烷基(杂)芳基、C7-C12环烯基(杂)芳基、C14-C16环炔基(杂)芳基、C5-C12(杂)芳基环烷基、C7-C12(杂)芳基环烯基及C14-C16(杂)芳基环炔基所组成的群组。
在优选的实施方式中，取代基选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR5、-SR5、C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C6-C7芳基、C2-C7杂芳基、C3-C7环烷基、C5-C7环烯基、C12环炔基、C3-C7烷基(杂)芳基、C3-C7(杂)芳基烷基、C4-C7(杂)芳基烯基、C4-C7(杂)芳基炔基、C4-C7烯基(杂)芳基、C4-C7炔基(杂)芳基、C4-C7烷基环烷基、C6-C7烷基环烯基、C13-C16烷基环炔基、C4-C7环烷基烷基、C6-C7环烯基烷基、C13-C16环炔基烷基、C5-C7烯基环烷基、C7-C7烯基环烯基、C14-C16烯基环炔基、C5-C7环烷基烯基、C7-C8环烯基烯基、C14-C16环炔基烯基、C5-C7炔基环烷基、C7-C8炔基环烯基、C14-C16炔基环炔基、C5-C7环烷基炔基、C7-C8环烯基炔基、C14-C16环炔基炔基、C5-C7环烷基(杂)芳基、C7-C8环烯基(杂)芳基、C14-C16环炔基(杂)芳基、C5-C7(杂)芳基环烷基、C7-C8(杂)芳基环烯基、C14-C16(杂)芳基环炔基、C4-C8(杂)芳基烯基、C4-C8(杂)芳基炔基、C4-C8烯基(杂)芳基、C4-C8炔基(杂)芳基、C5-C9环烷基(杂)芳基、C7-C11环烯基(杂)芳基、C14-C18环炔基(杂)芳基、C5-C9(杂)芳基环烷基、C7-C11(杂)芳基环烯基及C14-C18(杂)芳基环炔基所组成的群组。
除非另有说明，本文公开的任何非环状基团均被理解为线性或分支。特别地，(杂)烷基、(杂)烯基、(杂)炔基、(杂)亚烷基、(杂)亚烯基、(杂)亚炔基等是直链或支链的，除非另有说明。
通用术语“糖(sugar)”在本文中用于表示单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)及岩藻糖(Fuc)。术语“糖衍生物(sugar derivative)”在本文中用于表示单糖的衍生物，即包含取代基及/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖及糖酸，例如氨基葡萄糖(GlcNH2)、半乳糖胺(GalNH2)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸(Sia)，也称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)及N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(ldoA)。
糖可以没有进一步的取代，然后它被理解为单糖。糖可以进一步被其一个或多个羟基取代，然后它被理解为二糖或寡糖。二糖包含2个连接在一起的单糖部分。寡糖链可以是直链或支链的，并且可以包含3至10个单糖部分。
术语“蛋白质”在本文中以其正常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然氨基酸，但也可包含非天然氨基酸。本文中的术语“蛋白质”被理解为包括抗体及抗体片段。
术语“肽”在本文中以其正常的科学含义使用。在本文中，肽被认为包含2至9个范围内的许多氨基酸。
术语“类肽(peptoids)”在本文中以其正常的科学含义使用。
抗体是一种蛋白质，通常由免疫系统产生，能够识别及结合特定抗原。虽然衍生自IgG抗体的抗体或免疫球蛋白特别适用于本发明，但可以选择来自任何类别或亚类的免疫球蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。合适地，免疫球蛋白属于IgG类，包括但不限于能够特异性结合抗原上的特定表位的IgG亚类(IgG1、2、3及4)或IgM类。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼化(camelized)单域抗体、重组抗体、抗独特型抗体、抗体融合物、多特异性抗体、抗体片段，例如，Fv、VHH、Fab、F(ab)2、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、单链可变片段抗体(scFv)、串联/双-scFv、Fc、pFc'、scFv-Fc、二硫化物Fv(dsFv)、双特异性抗体(bc-scFv)，例如BiTE抗体、三特异性抗体衍生物，例如，三功能抗体(tribodies)、骆驼抗体(camelid antibodies)、微型抗体(minibodies,)、纳米抗体、重表面抗体、人源化抗体、全人抗体、单域抗体(sdAb，也称为NanobodyTM)、嵌合体抗体、包含至少一个人恒定区的嵌合抗体、双亲和抗体(dual-affinity antibodies)，例如双亲和重定位蛋白(DARTTM)，及其多聚体及衍生物，例如二价或多价单链可变片段(例如，di-scFvs、tri-scFvs)，包括但不限于微型抗体、双抗体、三抗体、三抗体、四抗体等，以及多价抗体。参考生物技术趋势(Trends in Biotechnology)；2015，33，2，65；趋势生物技术(TrendsBiotechnol)；2012，30，575-582；癌症基因(Canc.Gen.Prot.；2013，10，1-18；以及生物药物(BioDrugs)；2014，28，331-343，其内容通过引用并入本文。“抗体片段”是指免疫球蛋白可变区的至少一部分，其结合其靶标，即抗原结合区。其他实施方式使用抗体模拟物作为药物或靶向剂TT，例如但不限于Affimers、Anticalins、Avimers、Alphabody、Affibodies、DARPins及其多聚体及衍生物；参考生物技术趋势(Trends in Biotechnology)；2015，33，2，65，其内容通过引用并入本文。为避免疑问，在本发明的上下文中，除非另有说明，否则术语“抗体”意在涵盖本段中概述的所有抗体变体、片段、衍生物、融合体、类似物及模拟物(mimetics)。
接头(linker)在本文中定义为连接化合物的2个或更多个元件的部分。例如，在生物偶联物(bioconjugate)中，生物分子与靶向部分通过接头彼此共价连接。
生物分子(biomolecule)在本文中定义为可从自然界分离的任何分子或由较小分子结构单元组成的任何分子，这些较小分子结构单元是源自大自然的大分子结构的组成部分，特别是核酸、蛋白质、聚糖及脂质。生物分子的实例包括酶、(非催化)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质及激素。
如本文所用，有机分子定义为包含C-H键的分子。应当理解，本文使用的“有机分子(organic molecule)”包括生物分子，例如核酸(寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA)、肽、蛋白质(特别是抗体)、碳水化合物(单糖、寡糖及多糖)、适体(aptamer)、激素、毒素、类固醇、细胞因子和脂质；如本文所定义的有机小分子、聚合物(特别是聚乙二醇)、LNA及PNA、氨基酸、类肽、包含放射性核素的分子、荧光染料、药物、树脂(特别是聚苯乙烯及琼脂糖)；珠、颗粒(特别是聚合体、脂质体及珠)、凝胶、表面、有机金属化合物、金属错合物(metal complex)、细胞及其组合。
如本文所用，无机分子被定义为不是有机分子的任何分子，即不包含C-H键。应当理解，本文所用的“无机分子”包括表面(特别是芯片、晶片、金、金属、二氧化硅基表面，例如玻璃)；颗粒如珠(特别是磁珠、金珠)、二氧化硅基颗粒、聚合物基材料、氧化铁颗粒；碳纳米管；碳的同素异形体(特别是富勒烯(Fullerene)，例如巴克明斯特富勒烯(Buckminsterfullerene)；石墨、石墨烯、金刚石、蓝丝黛尔石(Lonsdaleite)、Q-碳、线性炔属碳、无定形碳及碳纳米管)；药物(特别是顺铂(cisplatin))；金属错合物；及其组合。
如本文所用，“粒子(particle)”优选地定义为微粒或纳米粒子。
术语“其盐(salt thereof)”是指当酸质子，通常是酸的质子，被阳离子如金属阳离子或有机阳离子等取代时形成的化合物。术语“其盐”还意味着胺质子化时形成的化合物。在适用的情况下，盐是药学上可接受的盐，尽管对于不打算施用于患者的盐来说这不是必需的。例如，在化合物的盐中，化合物可以被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，其中无机酸或有机酸的偶联碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的(pharmaceutically accepted)”盐是指对给予患者如哺乳动物可接受的盐(对于给定的剂量方案，具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子盐)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。
“药学上可接受的盐(Pharmaceutically acceptable salt)”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的多种有机及无机抗衡离子，包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
分配系数的对数，即Log P，在本文中用作化合物疏水性的量度。通常，Log P定义为：
Figure BDA0003509271520000281
本领域技术人员知道无需过度实验即可确定化合物分配系数的方法。或者，技术人员知道软件可用于可靠地估计对数P值，例如作为
Figure BDA0003509271520000291
软件或在线可用工具中的函数。
统一的原子质量单位或Da(Dalton)在本文中缩写为Da。本领域技术人员知道，Da是分子量的常规单位，并且1Da相当于1g/mol(克每摩尔)。
应当理解，在本文中，术语“部分(moiety)”及“基团”在指代分子的一部分时可互换使用。
应当理解，当杂原子表示为-X(R')2-时，其中X是杂原子，并且R'是某个部分，那么这表示2个部分R'连接到杂原子上。
可以理解，当一个基团被表示为，例如，-((R51)2-R52)2-或类似的标记时，其中R51及R52是某些部分，那么这表示首先，在选择单个R51及R52部分之前，它应该写成如-R51-R51-R52-R51-R51-R52-，而不是首先选择部分R51及R52然后写出式子。
逆电子需求狄尔斯-阿尔德(inverse-electron-demand Diels Alder,IEDDA)反应：
已建立的IEDDA偶联化学通常涉及一对反应物，它们包含作为一种反应物(即：一个生物正交反应基团)的合适的二烯，例如四嗪的衍生物，例如缺电子四嗪及作为其他反应物(即其他生物正交反应基团)的合适的亲二烯，例如反式环辛烯(trans-cyclooctene,TCO)。(取代的)四嗪，特别是缺电子四嗪与TCO部分的异常快速反应导致中间体通过消除作为唯一副产物的N2重排为二氢哒嗪Diels-Alder加合物(adduct)。最初形成的4,5-二氢哒嗪(4,5-dihydropyridazine)产物可互变异构为1,4-或2,5-二氢哒嗪产物，尤其是在水性环境中。下面给出了(3,6)-二-(2-吡啶基)-s-四嗪二烯以及反式环辛烯亲二烯(trans-cyclooctene dienophile)之间的[4+2]IEDDA反应，然后是逆Diels Alder反应，其中生成产物及氮气。由于反式环辛烯衍生物不包含经典Diels Alder反应中的吸电子基团，因此这种类型的Diels Alder反应与经典反应不同，通常被称为“逆电子需求Diels Alder(IEDDA)反应”。在下文中，2个反应步骤的顺序，即最初的Diels-Alder环加成(通常是逆电子需求Diels Alder环加成)以及随后的逆Diels Alder反应简称为“逆电子需求Diels Alder反应”或“逆电子需求Diels Alder偶联”或“IEDDA”。然后反应的产物是IEDDA加合物或偶联物(conjugate)。这在下面的方案1中进行了说明。
Figure BDA0003509271520000301
方案1：IEDDA偶联反应
这两种活性物质是非生物的，在体外或体内不会发生快速代谢或副反应。它们是生物正交的，例如，它们在生理介质中选择性地相互反应。因此，本发明的化合物和方法可用于活生物体中。此外，反应性基团相对较小，可以引入生物样品或活生物体中，而不会显着改变其中生物分子的大小。关于逆电子需求Diels-Alder反应和这对反应物种的行为的参考文献包括：Thalhammer等人,Tetrahedron Lett.,1990,31,47,6851-6854；Wijnen等人,J.Org.Chem.,1996,61,2001-2005；Blackman等人,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,41,13518-19；Rossin等人,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,3375；Devaraj等人,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,7013；Devaraj等人,Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,1-5。
IEDDA-哒嗪消除反应(The IEDDA Pyridazine Elimination Reaction)：
下文中，包含在本发明的组合物和试剂盒中的亲二烯(dienophile)、TCO可称为“触发物”。亲二烯在烯丙基位置连接到构建体-A。此外，用于IEDDA哒嗪消除反应的四嗪可称为“活化剂”。本发明中的术语构建体-A用于表示任何物质、载体、生物或化学基团，其希望首先使其处于束缚(或掩蔽)状态，并且能够促使其从此状态释放。
发明人之前证明，从四嗪(活化剂)和在烯丙基位置含有氨基甲酸酯连接药物(阿霉素，构建体-A)的TCO衍生的二氢哒嗪产品易于消除CO2和含胺药物，最终提供芳香哒嗪。
在不希望受到理论约束的情况下，发明人认为活化剂通过IEDDA加合物(即二氢哒嗪)内的级联机制引发构建体-A释放。级联反应机制可以是简单的一步反应，也可以包含在涉及一个或多个中间结构的多个步骤中。这些中间体可能会稳定一段时间，或者可能会立即降解为热力学终产物或下一个中间体结构。在任何情况下，无论是简单的还是多步骤的过程，级联机制的结果是构建体-A从IEDDA加合物中释放出来。在不希望受到理论约束的情况下，二烯烃的设计使得电子在IEDDA加合物中的分布是不利的，因此这些电子必须发生重排。这种情况引发级联机制，因此诱导结构-A的释放。具体而言，在不希望受到理论约束的情况下，发明人认为，包含在各种二氢哒嗪互变异构体中的NH部分，例如1,4-二氢哒嗪互变异构体，IEDDA加合物的键合物可以引发电子级联反应，即电子在几个键上的协同或连续移动，从而导致构建体-A的释放。在和/或构建体-A中发生级联反应时，触发物的释放不是有效的，或者不能在IEDDA反应之前发生，作为触发构造，共轭本身是相对稳定的。级联反应只能在活化剂和触发结构偶联物反应并组装在IEDDA加合物中后发生。
参考下面的方案2，在不希望受到理论约束的情况下，发明人认为哒嗪消除发生在1,4-二氢哒嗪互变异构体4中。在形成4,5-二氢哒嗪3后，互变异构产生中间体4和7，其中2,5-二氢哒嗪7不能消除CA。相反，它可以缓慢转化为芳香族8，芳香族8也不能消除CA，或者可以互变异构回中间体3。当形成4时，CA几乎瞬间被消除，提供游离CA 8作为胺，以及哒嗪消除产物5和6。这种消除反应在从TCO触发物分解碳酸盐、酯和醚时同样有效(Versteegen等人，Angew.Chem.Int.Ed.，2018，57，10494)。方案2中的触发物还可以选择性地绑定到构建体B(CB)，在这种情况下，它不能从触发物中释放。因此，可以通过IEDDA-哒嗪消除法将构建体A从构建体B中分离出来。
Figure BDA0003509271520000321
方案二：提出了IEDDA哒嗪消除机制。
在优选实施方式中，本发明中使用的亲二烯触发部分包含反式环辛烯环。在此，为了易读性，此八元环部分将被定义为反式环辛烯部分，或缩写为“TCO”部分。可以理解的是，其本质在于八元环作为亲二烯环并在反应时从其共轭结构释放的可能性。
本发明的亲二烯和四嗪能够以逆电子需求的Diels-Alder反应(IEDDA)进行反应。触发物与活化剂的IEDDA反应通过电子级联消除(称为“哒嗪消除”)导致构建体-A释放。当活化剂与能够消除构建体-a的触发物反应时，反应和构建体-A消除的组合过程称为“IEDDA哒嗪消除”。
本发明提供一种构建体-A-共轭触发物，其与活化剂反应，导致触发物从构建体-A分裂。在一个突出的实施方式中，这导致构建体-A从构建体-B分裂。在另一个实施方式中，触发物分裂导致一个构建体A从另一个构建体A分裂，两者都可以从连接到触发物的自分解接头中释放。在另一个实施方式中，触发裂解导致一个或多个构建体A从一个或多个构建体-B裂解。构建体-B是结合到亲二烯的结构，并且不能从亲二烯释放，除非它通过也结合构建体-A的间隔基或自相对连接基结合到烯丙基位置。在优选实施方式中，触发物用作两种分子物种之间的可逆共价键。
下面的方案3a是根据本发明的结构释放的一般方案，其中被释放的结构称为构建体-A(CA)，并且其中另一个结构，构建体-B(CB)可以任选地结合到亲二烯，但不通过烯丙基位置，其中构建体-B不能从亲二烯释放。
Figure BDA0003509271520000331
方案3a：根据本发明的释放构建体-A的IEDDA哒嗪消除反应的总体方案。
下面的方案3b是根据本发明另一实施方式的结构释放的一般方案，其中构建体-B(CB)通过也结合构建体-A，其中，当间隔基或自分解接头从烯丙基位置释放时，构建体-B和构建体A从触发物和彼此释放。
Figure BDA0003509271520000341
方案3b：根据本发明另一实施方式的用于从构建体-B释放构建体-A的IEDDA哒嗪消除反应的总体方案。
构建体释放是通过嗜二烯菌(触发物)与二烯(活化剂)的强大、非生物、生物正交反应发生的，即。前面提到的艾达。蒙蔽或束缚结构是一种亲双烯共轭结构。可能构建体A通过自分解接头连接到一个或多个附加构建体A。应理解，在IEDDA加合物以及释放后的最终产物的方案3中，所示亲二烯和所示二烯分别是在IEDDA反应中转化后亲二烯和二烯的残基。
CA和CB之间的区别在于，在触发物与二烯反应时，CB和持有CB的部分之间的键不会断裂，而CA和持有CA的部分之间的键会在触发物与二烯反应时断裂。本领域技术人员将理解，持有CA和CB的部分指的是触发物，或绑定到触发物的自分解接头LC。为清楚起见，当CB与结合至触发物的LC结合时，持有CB的LC将在与二烯反应时从触发物中释放，但CB不会从释放的LC中释放。同样，如果CB直接与触发物结合，CB在与二烯反应时不会从触发物中释放。本领域技术人员将理解，当需要将一个构建体(1)与另一个构建体(2)分离时，必须满足以下要求之一：
1)一个CA是构建体1，另一个CA是构建体2；
2)构建体1是CA，构建体2是CB；
3)构建体1和2都是CB，前提是一个CB直接绑定到触发物，另一个绑定到LC，或者一个CB部分绑定到与另一个CB部分不同的LC部分。
在一个方面，本发明提供了四嗪作为活化剂的用途，用于在化学、生物或生理环境中释放连接到TCO的构建体。关于此，本发明还涉及一种四嗪，作为在化学、生物或生理环境中释放与TCO相关物质的活化剂。该反应是生物正交的，并且反应对存在许多结构选择，这一事实对于技术人员来说是清楚的。例如，IEDDA反应在生物结合、诊断和预靶向药物领域是已知的。参考例如WO 2010/119382、WO 2010/119389和WO 2010/051530。虽然本发明呈现了该反应的完全不同的用途，但应理解，在例如预靶向中使用的IEDDA反应对的各种结构可能性也可在本发明领域中获得。
除了例如药物活性物质的情况，其中体外或体内作用通常随着微小的结构变化而改变，本发明首先需要正确的化学反应性，并结合预期用途的足够稳定性。因此，可能的结构延伸至技术人员熟悉的结构，这些结构作为亲双烯类反应。
式(19)化合物：
在式(19)中，r是一个介于0到2之间的整数。在优选实施方式中，r是0。在优选实施方式中，r是1。在优选实施方式中，r是2。在公式(19)中，每个s分别为0或1。在优选实施方式中，s是0。在优选实施方式中，s是1。在公式(19)中，每个i独立地是0到4范围内的整数，最好是0或1。在式(19)中，j是范围为0到4、优选0到2、更优选0或1的整数。在公式(19)中，每个k独立地表示为0或1。
在优选实施方式中，在式(19)中仅满足条件(a)。
在优选实施方式中，在式(19)中，仅满足条件(b)。
在优选实施方式中，在式(19)中仅满足条件(c)。
在优选实施方式中，当在式(19)中任选地将两个R37、R38、R47基团包含在一个环中以形成与八元反式环稠合的环时，与八元反式环稠合的该环如WO 2012/156919A1中所定义，其通过引用整体并入本文。更优选地，稠合到八元反式环的环如WO 2012/156919 A1第15页第25行至第18页第9行所定义。
ZT：
ZT选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基、C7-C12亚烯基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C8环亚烷基、C5-C8环亚烷基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)亚芳基、C4-C12亚烷基、C4-C12环烷基亚烷基，其中所述亚烷基、烯基、炔基、(杂)芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基亚烷基、环烷基，任选地用选自以下组的部分取代，所述组包括-(SP)i-CB，其中i独立地为0至4范围内的整数，优选i为0或1、-Cl、-F、-Br、-i、-OR37、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2和-Si(R37)3，并且任选地包含一个或多个选自-O-、-S-、-NR37-、-P-和-Si-的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，ZT选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C7亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C6环亚烷基、C5-C8环亚烯基、C5-C8烷基(杂)亚芳基、C5-C8(杂)亚芳基、C4-C8亚烷基、C4-C8环烷基亚烷基，其中所述亚烷基、烯基、炔基、(杂)芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基亚烷基、环烷基、，任选地用选自以下组的部分取代，所述组包括-(SP)i-CB，其中i独立地为0至4范围内的整数，优选i为0或1、-Cl、-F、-Br、-i、-OR37、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2和-Si(R37)3，并且任选地包含一个或多个选自-O-、-S-、-NR37-、-P-和-Si-的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，ZT选自由C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C3亚炔基、C3杂亚芳基和C3环亚烷基组成的组，其中所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚芳基和环亚烷基，任选地用选自以下组的部分取代，所述组包括-(SP)i-CB，其中i独立地为0至4范围内的整数，优选i为0或1、-Cl、-F、-Br、-i、-OR37、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2和-Si(R37)3，并且任选地包含一个或多个选自-O-、-S-、-NR37-、-P-和-Si-的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。在优选实施方式中，ZT基团未被取代。在优选实施方式中，ZT基团不包含杂原子。
R48：
优选地，R48是-OC(O)-(SP)kCA，并且SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)通过从O、C、S和N组成的组中选择的原子，优选二级或三级N，结合到R48的-OC(O)-上，其中所述原子是SP或CA的一部分。优选地，R48是-O-LC-(SP)kCA，SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)通过从-O-、-S-和-N-组成的组中选择的部分结合到LC，优选二级或三级N，其中所述部分是SP或CA的一部分。优选R48轴向定位在8元亲二烯环上。优选R48相对于Ha定位为反式。
其他优选实施方式：
在优选实施方式中，YT1为OH、N(R38)2、C(O)OH、O-N(R38)2、SH，更优选OH、N(R38)2，O-N(R38)2，更优选OH、N(R38)2，最优选YT1为OH。在其他优选实施方式中，YT1为N(R38)2，更优选NR38H，最优选NH2。在优选实施方式中，不存在YT2和YT3，并且YT1是OH，N(R38)2，C(O)OH，O-N(R38)2，更优选OH，N(R38)2，最优选YT1是OH。在优选实施方式中，YT2为OH。在优选实施方式中，不存在YT1和YT3，且YT2为OH。优选X1和X5不是O。
在优选实施方式中，当存在满足式(20a)-(20f)中任一式的熔融环时，不存在与8元亲二烯环熔融的其他环。
在优选实施方式中，R37、R38、R47基团不是OH、SH、N(R38)2、O-N(R38)2、C(N)N(R38)2。在优选实施方式中，R37、R38、R47基团不是OH、SH、N(R38)2、C(O)OH、C(S)OH、C(O)SH、C(S)SH、O-N(R38)2、SO4H、SO3H、SO2H、PO4H2、PO3H、PO2H、C(N)N(R38)2。
在优选实施方式中，式(19)化合物包含最多三个部分，每个部分独立地选自由YT1、YT2、YT3组成的组，更优选最多两个部分，甚至更优选一个部分。
在优选实施方式中，X2、X3、X4之一为CR47YT1，最优选X3或X4为CR47YT1。在优选实施方式中，X2、X3、X4之一为CR47YT1，最优选X3或X4为CR47YT1，其余X1、X2、X3、X4、X5为C(R47)2，优选CH2。在优选实施方式中，X2、X3、X4中的两个为CR47YT1，其余X1、X2、X3、X4、X5为C(R47)2，优选CH2。在优选实施方式中，X3为YT3，其余X1、X2、X3、X4、X5为C(R47)2，优选CH2。在优选实施方式中，X2和X3是满足式(20a)-(20g)之一的稠合环的一部分，剩余的X1、X2、X3、X4、X5是C(R47)2，优选CH2。
在优选实施方式中，X3和X4是满足式(20a)-(20g)之一的稠合环的一部分，其余X1、X2、X3、X4、X5为C(R47)2，优选CH2。
在优选实施方式中，稠合环满足式(20a)。在优选实施方式中，稠合环满足式(20b)。在优选实施方式中，稠合环满足式(20c)。
对于式(20g)，当X6和X8均为YT3时，X7最好不是C1亚烷基。对于式(20g)，优选X6和X8均为YT3，优选NR38，且X7为C2亚烷基。对于式(20g)，优选X6和X8均为C(R47)2，优选CH2，且X7为YT3，优选NR38。
在优选实施方式中，Xa和Xb为CH。在优选实施方式中，稠合环满足式(20a)，且Xa和Xb为CH。
在一个优选的实施方式中，包含在X1、X2、X3、X4及X5中的R37、R38、R47中最多4个(即X1-X5的总数，不是每个部分X)不是H，优选最多3个不是H，更优选最多2个不是H，最优选最多1个不是H。
优选地，当包含在X1、X2、X3、X4及X5中的2个R37、R38、R47基团包含在环中以形成稠合到八元反式环的环时，这些环稠合到八元反式环是C3-C7亚环烷基及C4-C7亚环烯基，任选地被取代并含有如R47所述的杂原子。
在优选的实施方式中，CA及/或CB通过如本文定义的R32的残基与分子的其余部分结合，其中优选地，所述R32的残基等于或包含在间隔基(spacer)中。
本领域技术人员将理解“R32的残基”是指R32与另一个化学基团的缀合反应产物，从而在CA及/或CB与触发物(Trigger)、间隔基或LC之间形成偶联物。
在其他实施方式中，CA及/或CB通过本文定义的CM2与分子的其余部分结合，其中优选CM2等于或包含在间隔基中。
在其他实施方式中，CA及/或CB通过本文定义的CX与分子的其余部分结合，其中优选CX等于或包含在间隔基中。
在优选的实施方式中，部分CX、CM2及所述R32的残基包含在CA及/或CB中。
在优选的实施方式中，CM2选自于由胺、酰胺、硫代酰胺、氨基氧基、醚、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、磺酰胺及磺基氨基甲酸酯所组成的群组。
在优选实施方式中，CM2等于R10。
在优选实施方式中，CM2等于CX。在优选实施方式中，CM2是：
Figure BDA0003509271520000401
Figure BDA0003509271520000411
其中虚线表示与CA或CB的键或朝向CA或CB的键，而摆动线表示与亲二烯的其余部分的键。在其他实施方式中，摆动线表示与CA或CB的键或朝向CA或CB的键，而虚线表示与亲二烯的其余部分的键。
在优选实施方式中，CX是：
Figure BDA0003509271520000412
Figure BDA0003509271520000421
其中虚线表示与CA或CB的键或朝向CA或CB的键，而摆动线表示与亲二烯的其余部分的键。在其他实施方式中，摆动线表示与CA或CB的键或朝向CA或CB的键，而虚线表示与亲二烯的其余部分的键。
参考以上以CM2及CX为例的方案，在优选的实施方式中，当CA或CB是蛋白质，例如抗体时，虚线表示与CA或CB的键或朝向CA或CB的键。
在优选的实施方式中，当k或i为0时，CA及/或CB通过选自于由-O-、-C(R6)2-、-NR6-、-C(O)-及-S-所组成的群组的部分连接至式19的其余部分，其中所述部分是CA及/或CB的一部分。
在优选的实施方式中，当k或i至少为1时，CA及/或CB通过选自于由-O-、-C(R6)2-、-NR6-、-C(O)-及-S-所组成的群组的部分连接至SP，其中所述部分是CA及/或CB的一部分，并且SP通过选自于由-O-、-C(R6)2-、-NR6-、-C(O)-及-S-所组成的群组的部分与式19的其余部分连接，其中所述部分是SP的一部分。
在优选的实施方式中，至多3个CB包含在式(19)的结构中，更优选至多2个，最优选至多1个CB包含在式(19)的结构中。
在一优选的实施方式中，CA及/或CB在与式(19)化合物的其余部分缀合之前包含至少一个选自于由-OH、-NHR'、-CO2H、-SH、-SS-、-SCH3--N3、末端炔基、末端烯基、-C(O)R'、C8-C12(杂)环炔基、C3-C4环烯基、硝酮、氧化腈、(亚氨基)雪梨酮((imino)sydnone)、异腈、(氧杂)降冰片烯((oxa)norbornene)及四嗪所组成的群组的部分，所述部分用于与包含亲二烯及R32的部分缀合以形成满足式(19)的化合物，并且包含CM2或CX部分。
在优选实施方式中，CA及/或CB通过CM2与式(19)化合物的其余部分结合，CM2选自于由胺、酰胺、硫代酰胺、氨氧基、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、磺酰胺及磺胺甲酸所组成的群组。
在优选实施方式中，CM2等于R10。
在一优选实施方式中，当CA及/或CB通过-SH或-S-S-缀合时，CM2选自于：
Figure BDA0003509271520000431
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
在一优选的实施方式中，当部分CA、CB或给药试剂通过-SMe-缀合时，则CM2是：
Figure BDA0003509271520000441
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA、CB或给药剂的键。
在一优选实施方式中，当CA或CB通过-NR'-缀合时，CM2选自于由以下组成的群组：
Figure BDA0003509271520000442
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
在一优选的实施方式中，当CA或CB通过衍生自-C(O)R'或-C(O)R'-部分的-C-缀合时，CM2选自于：
Figure BDA0003509271520000443
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
在一优选的实施方式中，当CA或CB通过衍生自-C(O)OH部分的-C(O)-缀合时，CM2选自于：
Figure BDA0003509271520000451
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
在一优选的实施方式中，当CA或CB通过-O-缀合时，CM2选自于由以下组成的群组：
Figure BDA0003509271520000452
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
在一优选的实施方式中，当CA或CB通过-N3缀合时，所述-N3与包含炔基的R32反应，则所得CX包含三唑环，其中每个CX独立地选自于由以下组成的群组：
Figure BDA0003509271520000453
Figure BDA0003509271520000461
及
Figure BDA0003509271520000462
其中摆动线表示与分子其余部分的键，并且其中虚线表示与CA或CB的键。
R6：
优选地，每个R6独立地选自于由氢、-(SP)1-CB、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基及C4-C24环烷基烷基；其中i为0至4范围内的整数，优选i为0或1；不是氢的R6基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R6单独选自于由氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基及C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中不为氢的R6基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R6选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C8烷基环烷基、C4-C8环烷基烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基及C5-C10(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中不为氢的R6基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R6选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基和C4-6(杂)芳基所组成的群组，其中对于R6，烷基、烯基及(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2及-NO2所组成的群组的部分取代，并且任选地包含至多两个选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化。
在优选的实施方式中，R6选自于氢、C1-C3烷基、C2-C3烯基及C4-6(杂)芳基所组成的群组，其中对于R6，烷基、烯基及(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2及-NO2所组成的群组的部分取代，并且任选地包含至多两个选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化。
在优选的实施方式中，不是氢的R6基团未被取代。在优选的实施方式中，不是氢的R6基团不包含杂原子。在优选的实施方式中，R6基团是氢。
R7：
在优选的实施方式中，每个R7独立地选自于由氢、-(SP)i-CB、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基及C4-C24环烷基烷基所组成的群组；其中i是范围0至4的整数，优选i是0或1；其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、及环烷基烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R7独立地选自于由氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基及C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、环烷基(杂)芳基及(杂)芳基环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R7独立地选自于由氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C10烷基环烷基、C4-C10环烷基烷基、C5-C10(环烷基(杂)芳基及C5-C10(杂)芳基环烷基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、环烷基(杂)芳基及(杂)芳基环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R7独立地选自于由氢及C1-C3烷基、C2-C3烯基及C4-6(杂)芳基所组成的群组，其中烷基、烯基及(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、＝NH、-N(CH3)2、-S(O)2CH3及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选被至多一个选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-及-Si-的杂原子中断，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R7优选选自于由氢、甲基、-CH2-CH2-N(CH3)2及-CH2-CH2-S(O)2-CH3所组成的群组。在优选的实施方式中，不是氢的R7基团未被取代。在优选的实施方式中，不是氢的R7基团不包含杂原子。在优选的实施方式中，R7基团是氢。
R8及R9：
优选地，R8及R9如R7所定义。在优选的实施方式中，至少一个或所有R8是-H。在优选的实施方式中，至少一个或所有R8是-CH 3。在优选的实施方式中，至少一个或所有R9是-H。在优选的实施方式中，至少一个或所有R9是-CH3。
R32：
R32是缀合(conjugation)部分，其是可用于结合(binding)、缀合(conjugation)或偶联(coupling)构建体的化学基团，例如构建体-B或间隔基团(Spacer)、连接基团LC、触发物(Trigger)或其他感兴趣的分子或构建体。本领域技术人员知道可用于化学选择性或非选择性或酶促偶联或缀合一个分子或构建到另一个的无数方法。
在优选的实施方式中，R32是允许与包含天然及/或非天然氨基酸的蛋白质缀合的部分。适用于缀合的部分是技术人员已知的。例如在O.Boutureira,G.J.L.Bernardes,Chem.Rev.,2015,115,2174-2195。
在特别有利的实施方式中，R32选自于由N-马来酰亚胺基(N-maleimidyl group)、卤代N-烷基酰胺基(halogenated N-alkylamido group)、磺酰氧基N-烷基酰胺基(sulfonyloxy N-alkylamido group)、乙烯基砜基(vinyl sulfone group)、(活化的)羧酸、苯磺酰卤化物(benzenesulfonyl halide)、酯基、碳酸酯基、磺酰基卤化物基(sulfonylhalide group)、硫醇基或其衍生物、C2-6烯基、C2-6炔基、C7-18环炔基、C5-18杂环炔基、双环[6.1.0]non-4-yn-9-yl]基(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-yl]group)、C3-12环烯基、叠氮基、膦基、氧化腈基(nitrile oxide group)、硝酮基(nitrone group)、腈亚胺基、异腈基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟基氨基((O-alkyl)hydroxylamino group)、肼基、卤代N-马来酰亚胺基(halogenated N-maleimidylgroup)、芳氧基马来酰亚胺(aryloxymaleimides)、二苯硫酚马来酰亚胺(dithiophenolmaleimides)、溴和二溴哒嗪二酮(bromo-anddibromopyridazinediones)、2,5-二溴己二酰胺基(2,5-dibromohexanediamide group)、炔酮基(alkynone group)、3-芳基丙腈基(3-arylpropiolonitrile group)、1,1-双(磺酰基甲基)-甲基羰基(1,1-bis(sulfonylmethyl)-methylcarbonyl group)或其消除衍生物、羰基卤化物基(carbonyl halide group)、丙二酰胺(allenamide group)、1,2-醌基(1,2-quinone group)、异硫氰酸酯基(isothiocyanate group)、异氰酸酯基(isocyanategroup)、醛基、三嗪基(triazine group)、四嗪基(tetrazine group)、方酸(squaricacid)、2-亚氨基-2-甲氧基乙基(2-imino-2-methoxyethyl group)、(氧杂)降冰片烯基((oxa)norbornene group)、(亚氨基)氢化萘酮((imino)sydnones)、甲磺酰基苯恶二唑基(methylsulfonyl phenyloxadiazole group)、氨基氧基(aminooxy group)、2-氨基苯甲酰胺肟基(2-amino benzamidoxime group)、乙炔基膦酰胺酯(ethynylphosphonamidates)、在Pictet-Spengler连接和肼基-Pictet-Spengler(hydrazino-Pictet-Spengler,HIPS)连接中反应的基团、DNA嵌入剂及光交联剂所组成的群组。
在优选的实施方式中，R32是通过N-马来酰亚胺基(N-maleimidyl group)的N原子与根据式(19)的化合物的其余部分连接的N-马来酰亚胺基。
在其他优选的实施方式中，R32选自于由羟基、胺基、卤素、乙烯基吡啶基(vinylpyridine group)、二硫基、吡啶基二硫基(pyridyl disulfide group)、磺酰氧基(sulfonyloxy group)、巯基乙酰胺基(mercaptoacetamide group)、酸酐基(anhydridegroup)、磺酰化羟基乙酰胺基(sulfonylated hydroxyacetamido group)、磺酰氯(sulfonyl chloride)、氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸盐(hydrazinecarboxylate)及芳基肼(arylhydrazide)所组成的群组。
在其他实施方式中，R32是可以通过酶例如分选酶(sortase)或微管蛋白酪氨酸连接酶(Tubulin tyrosine ligase)与另一基团连接的基团。
R36：
在一优选的实施方式中，R36如R37所定义。
在式(19)中，R36优选选自于由氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基及C4-6(杂)芳基所组成的群组，其中烷基、烯基及(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2及-NO2所组成的群组的部分取代，并且任选地包含至多两个选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化。
在优选的实施方式中，不是氢的R36基团未被取代。在优选的实施方式中，不是氢的R36基团不包含杂原子。
R37：
优选地，每个R37独立地选自于由氢、-(SP)i-CB、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基及C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中i是范围0至4的整数，优选1，其中不为氢的R37基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地含有一个或多个选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，每个R37独立地选自于由氢、-(SP)i-CB、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C8烷基环烷基、C4-C8环烷基烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基及C5-C10(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中i是范围0至4的整数，优选1，其中不为氢的R37基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地含有一个或多个选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，不是氢的R37基团未被取代。在优选的实施方式中，不是氢的R37基团不包含杂原子。
R47：
在优选的实施方式中，每个R47独立地选自于由氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、-(SP)i-CB、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基及C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中i是范围0至4的整数，优选1；其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、环烷基(杂)芳基及(杂)芳基环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R47独立地选自于由氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、-(SP)i-CB、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C10烷基环烷基、C4-C10环烷基烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基基团及C5-C10(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中i是范围0至4的整数，优选1；其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、环烷基(杂)芳基及(杂)芳基环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在一优选的实施方式中，R47是满足式(2x)及(2y)中任一个的部分：
Figure BDA0003509271520000551
其中在式(2x)及(2y)中，摆动线表示与分子其余部分的键。在式(2y)中，CM2与构建体-B(CB)偶联，优选靶向剂(targeting agent)，优选选自于由蛋白质、抗体、类肽及肽所组成的群组。
在一优选的实施方式中，式(19)中，如果X3为CR47YT1且X1、X2、X4及X5为CH2，则X3中的R47不满足式(2x)或(2y)。
R33：
在优选的实施方式中，每个单独的R33选自于由C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基、C2-C12亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C8亚环烷基、C5-C8亚环烷基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基、C4-C12环烷基亚烷基所组成的群组，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基基团、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基任选被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R')2、＝O、＝NR'、-SR'、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-Si(R')3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由-O-、-S-、-NR'-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化，N原子任选地被季铵化。
在特别有利的实施方式中，每个单独的R33选自于由C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基及C2-C6亚炔基所组成的群组，更优选地选自于由C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基及C2-C3亚炔基所组成的群组；其中优选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基及亚环亚烷基任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR5、P及Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
R35：
在优选的实施方式中，每个单独的R35选自于由C1-C8亚烷基、C2-C8亚烯基、C2-C8亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C6亚环烷基、C5-C8亚环烯基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基、C4-C12环烷基亚烷基所组成的群组，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、I、-OR'、-N(R')2、＝O、＝NR'、-SR'、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-Si(R')3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或更多选自于由-O-、-S-、-NR'-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化，N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个单独的R35选自于由C1-C4亚烷基、C2-C4亚烯基、C2-C4亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C6亚环烷基所组成的群组，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基及亚环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、I、-OR'、-N(R')2、＝O、＝NR'、-SR'、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-Si(R')3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或更多选自于由-O-、-S-、-NR'-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化，N原子任选地被季铵化。
R'：
在优选的实施方式中，每个R'独立地选自于由氢、C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C6亚环烷基、C5-C8亚环烷基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基及C4-C12环烷基亚烷基所组成的群组。
在优选的实施方式中，每个R'独立地选自于由氢、C1-C4亚烷基、C2-C4亚烯基、C2-C4亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C6亚环烷基、C5-C8亚环烯基、C5-C8烷基(杂)亚芳基、C5-C8(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基及C4-C8环烷基亚烷基所组成的群组。
除非另有说明，否则对于R'，亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或更多选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-及-Si所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化。
在一优选的实施方式中，R'如对R37所定义。
在一优选的实施方式中，关于CM2、CX以及CA及CB的偶联，R'如对R37所定义。
R”：
在优选的实施方式中，每个R”独立地选自于由以下所组成的群组：
Figure BDA0003509271520000581
其中摆动线描绘了当t4为0时，与乙二醇基团或任选地与与R32相邻的R33的键，虚线描绘了与R33或G的键。
在优选的实施方式中，R”是-CH2-C(O)NR'-或-CH2-NR'、N、C5-C6芳烃三基、C4-C5杂芳烃三基、C3-C6环烷三基及C4-C6环烯三基，其中芳烃三基、杂芳烃三基、环烷三基及环烯三基任选地进一步被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR'、-N(R')2、-SR'、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-CF3所组成的群组的基团取代，并且任选地包含一个或多个选自于由-O-、-S-、-NR'-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化，其中N原子任选被季铵化。优选地，G是CR'。
L：
在优选的实施方式中，L选自于由-CH2-OCH3、-CH2-OH、-CH2-C(O)OH、-C(O)OH。在优选的实施方式中，L优选是-CH2-OCH3。
t1、t2、t3、t4、t5：
在优选实施方式中，t1为0。在其他实施方式中，t1为1。在优选实施方式中，t2为0。在其他实施方式中，t2为1。在优选实施方式中，t3为0至12范围内的整数。优选地，t3是范围1至10的整数，更优选范围2至8的整数。在特别有利的实施方式中，t3为4且y为1。在优选实施方式中，t4为0。在其他实施方式中，t4为1。在优选实施方式中，t5为范围6至48、优选15至40、更优选17至35、甚至更优选20至30、最优选22至28的整数。特别优选的实施方式，t5为23。
反式环辛烯(trans-cycloocetone)：
在一优选的实施方式中，本发明使用的亲二烯触发部分包括反式环辛烯环，具体是指满足式(19)的结构，此环任选地包括一个或多个杂原子。本领域技术人员熟悉亲二烯活性不一定取决于环中所有碳原子的存在这一事实，因为杂环单亚烯基八元环(heterocyclic monoalkenylene eight-membered ring)也已知具有亲二烯活性。
因此，一般而言，本发明不限于严格的反式环辛烯。有机化学领域的技术人员将意识到存在其他基于八元环的亲二烯，其包含与反式环辛烯相同的环内双键，但其在环的其他位置可具有一个或多个杂原子。即，本发明通常涉及八元非芳族环状烯烃部分，优选环辛烯部分，更优选反式环辛烯部分。
应该注意的是，根据命名法的选择，TCO亲二烯也可以表示为E-环辛烯。参考常规命名法，应当理解，由于环辛烯环上的取代，取决于取代基的位置及分子量，相同的环辛烯异构体可以正式地表示为Z-异构体。在本发明中，本发明的任何取代变体，无论形式上是否为“E”或“Z”或“顺式”或“反式”异构体，都会被视为未取代的反式环辛烯或未取代的E-环辛烯的衍生物。术语“反式环辛烯(trans-cyclooctene)”(TCO)以及E-环辛烯可互换使用，并且对于根据本发明的所有亲二烯保持不变，即使在取代基形式上需要相反的命名法的情况下也是如此。即，本发明涉及环辛烯，其中式4b中编号如下的碳原子1及6位于E(entgegen)或反式位置。
Figure BDA0003509271520000601
TCO可以由多种异构体组成，还包括TCO上取代基(例如：R48)的赤道与轴向定位。在这方面，参考Whitham等人；化学学会会刊(J.Chem.Soc.(C))；1971，883-896，描述了trans-cyclo-oct-2-en-ol的赤道及轴向异构体的合成及表征，分别被确定为(1RS,2RS)及(1SR,2RS)。在这些异构体中，OH取代基位于赤道或轴向位置。在优选实施方式中，对于R48可以处于轴向或赤道位置的TCO结构，R48处于轴向位置。
反式环辛烯或E-环辛烯衍生物非常适合作为触发物(Trigger)，特别是考虑到它们的高反应性。任选地，反式环辛烯(TCO)部分包含至少两个固定在基本相同平面中的环外键，及/或其任选地包含至少一个在轴向位置而不是赤道位置的取代基。有机化学领域的技术人员将理解，术语“基本上固定在同一平面内(fixed in substantially the sameplane)”是指键合理论，根据此理论，键通常被认为是固定在同一平面内。这种固定在同一平面上的典型例子包括双键及应变稠合环(strained fused ring)。例如，至少两个环外键可以是双键与氧的两个键(即，C＝O)。至少两个环外键也可以是两个相邻碳原子上的单键，条件是这些键一起是稠合环(即，稠合到TCO环)的一部分，此稠合环呈现基本平坦的结构，从而将所述两个单键固定在基本上是同一个平面。后者的例子包括应变环，例如环丙基及环丁基。不希望受理论束缚，发明人相信在同一平面中存在至少两个环外键将导致TCO环至少部分变平，这可导致IEDDA反应中的更高反应性。提供进一步指导的背景参考是WO2013/153254。
用于本发明的亲二烯可由技术人员基于已知的合成环辛烯及相应的含杂原子的环的合成路线来合成。本领域技术人员还知道可以使用Grubbs催化剂通过闭环复分解反应(ring closing metathesis reaction)合成的大量环辛烯衍生物。如上所述，TCO可能在环中包含一个或多个杂原子。这对于本领域技术人员来说是足够容易获得的，例如WO2016025480。例如，参考：TCO中硫醚的存在(presence of a thioether in TCO)：Cere等人；J.Org.Chem.；1980，45，261。此外，例如，TCO中的-O-SiR2-O部分(-O-SiR2-O moiety inTCO)：Prevost等人；J.Am.Chem.Soc.；2009,131,14182。烯丙基定位的离去基团(R48)是醚、酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯的TCO合成参考：Versteegen等人；Angew.Chem.Int.Ed.；2018,57,10494以及Steiger等人Chem Comm；2017,53,1378。示例性化合物包括以下结构，如下文参考文献所示。在环辛烯衍生物被描述为Z-环辛烯的情况下，认为其可以转化为E-环辛烯类似物。
Figure BDA0003509271520000621
本发明的优选触发物包括：
Figure BDA0003509271520000631
本发明进一步优选的触发物包括：
Figure BDA0003509271520000632
构建体(Construct)-A(CA)及构建体-B(CB)：
构建体A及构建体B包括但不限于小分子、有机分子、金属配位化合物、包含放射性核素的分子、包含放射性金属的螯合物、无机分子、有机金属分子、生物分子、聚合物、树脂、颗粒(例如：微米及纳米粒子)、脂质体、胶束、聚合体、凝胶、表面、细胞、生物组织及病原体。
在优选的前药或体内实施方式中，CA选自于由药物、靶向剂(Targeting Agent)、标记物(Label)、给药剂(Administration Agent)及掩蔽部分(Masking Moieties)所组成的群组。优选地，CA是药物，优选如本文定义的药物。
在一些优选的前药或体内实施方式中，CB选自于由药物、靶向剂、标记物、给药剂及掩蔽部分所组成的群组。优选地，CB选自于由靶向剂及掩蔽部分所组成的群组。
在优选的实施方式中，式(19)的化合物包含至少一种标记物及至少一种给药剂，并且优选满足条件(i)-(iii)中的至少一种：
(i)至少一个CA是标记物，并且至少一个CA是给药剂；
(ii)至少一个CA是标记物，并且至少一个CB是给药剂；
(iii)至少一个CA是给药剂，并且至少一个CB是标记；
对于所有条件(i)-(iii)：前提是如果X1-X5包含给药剂，并且至少一个CA是标记物，则X1-X5不包含与至少一个CA相同的标记物；附带条件是，如果至少一个CA是标记物，并且X1-X5包含与至少一个CA相同的标记物，则X1-X5不包含给药剂；如果包含在R48中的至少一个CB是给药剂，那么包含在R48中的另一个CB不是标记物。在优选实施方式中，仅满足条件(i)。在优选实施方式中，仅满足条件(ii)。在优选实施方式中，仅满足条件(iii)。在一优选实施方式中，条件(i)及(ii)都满足。在一优选实施方式中，条件(i)及(iii)都满足。在一优选实施方式中，条件(ii)及(iii)都满足。在一个优选实施方式中，满足所有3个条件(i)-(iii)。
在优选的体外实施方式中，CA及CB包括但不限于小分子、有机分子(包括荧光染料)、金属配位化合物、包含放射性核素的分子、包含放射性金属的螯合物、无机分子、有机金属分子、生物分子、药物、聚合物、树脂(例如：聚苯乙烯、琼脂糖)、颗粒(例如：珠(bead)、磁珠、金、二氧化硅基颗粒和材料、聚合物和聚合物基材料、玻璃、氧化铁颗粒、微粒及纳米颗粒，例如脂质体及聚合物体)、凝胶、表面(例如：载玻片、芯片、晶片、金、金属、二氧化硅基、聚合物、塑料、树脂)、细胞、生物组织、病原体(病毒、细菌、真菌、酵母)。构建体可以例如包括上述构建体的组合。生物分子的例子包括：碳水化合物、生物素、肽、类肽、脂质、蛋白质、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、LNA、适体、激素、毒素、类固醇、细胞因子、抗体、抗体片段(例如：Fab2、Fab、scFV、双抗体、三抗体、VHH)、抗体(片段)融合(例如：双特异性及三特异性单抗片段)。
在优选的体外实施方式中，CA及CB也可以是R32或如本文定义的包含R32的部分，其中R32可用于结合另外的CA及CB。例如，CA可以是R32，它是一种马来酰亚胺(maleimide)或光交联剂，通过间隔基(Spacer)SP与TR结合。马来酰亚胺或光交联剂可用于进一步将TR与蛋白质结合。在这个特定的实施方式中，CA及CB是生物分子结合部分。
在优选的实施方式中，每个CA及CB独立地选自于由有机分子、无机分子、有机金属分子、树脂、珠、玻璃、微粒、纳米颗粒、凝胶、表面及细胞所组成的群组。优选地，每个CA及CB独立地选自于由有机分子及无机分子所组成的群组。
在优选的实施方式中，每个CA及CB独立地选自于由小分子、蛋白质、碳水化合物、肽、拟肽、寡糖、包含放射性核素的分子、荧光染料、无机分子、有机金属分子、聚合物、脂质、寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、LNA、药物、树脂、珠子、玻璃、微粒、纳米颗粒、凝胶、表面及细胞所组成的群组。
优选地，小分子是有机小分子。优选地，小分子具有至多2kDa的分子量，更优选至多1kDa、更优选至多750Da、更优选至多500Da、最优选至多300Da。优选地，小分子具有至少15Da、更优选至少50Da、更优选至少75Da、最优选至少100Da的分子量。
应当理解，“包含放射性核素的分子”包括螯合放射性核素的螯合剂。
在另一个优选的实施方式中，每个CA及CB独立地是根据如本文所定义的式(5)的部分。
构建触发组合物：
构建触发物包括单个构建体或多个构建体构建体CA及触发物TR的偶联(conjugate)。可选地，触发物进一步链接到单个构建体或多个构建体CB。
构建触发物的通式如下式5a)及(5b)所示。为免生疑问，由于YC是LC及CA的一部分，YC在式(5a)及(5b)中没有单独表示。
Figure BDA0003509271520000661
CA是构建体A，CB是构建体B，SP是间隔基；TR是触发物；LC是连接基团(接头)(linker)。式(5a)：b、c、e、f、g、h≥0；a、d≥1。式(5b)：c、e、f、g、h≥0；a、b、d≥1。
在触发物-构建体(Trigger-Construct)偶联中，构建体CA及触发物TR-TCO衍生物可以直接相互关联。它们也可以通过自分解接头(self-immolative linker)LC相互结合，其可以由多个(自分解或非自分解)单元组成。参考式5a及5b，当LC包含非自分解单元时，此单元等于间隔基SP且c≥1。应理解，本发明包括将二烯触发物连接到一个或多个构建体CA的任何可能的方式。这同样适用于将一个或多个构建体CB连接到触发物或连接基团LC。这同样适用于一个或多个间隔基SP可选连接到触发物或连接基团LC。影响共轭的方法，例如在蛋白质的情况下，通过反应性氨基酸如赖氨酸或半胱氨酸，对本领域技术人员来说是已知的。示例性缀合方法在下文关于间隔基的部分中进行了概述。
可以理解的是，构建体CA与TCO的连接方式是，构建体CA最终能够在IEDDA加合物形成后被释放。通常，这意味着构建体CA及TCO之间的键，或者在自分解连接基团LC的情况下，连接基团与TCO之间以及构建体CA与连接基团之间的键应该是可切割的。主要地，构建体CA与任选的连接基团通过杂原子连接，优选通过O、N、NH或S。可切割键优选选自于由氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、酰胺、硫酯键所组成的群组。
应当理解，一个CB可以用多个触发物进行修饰。例如，抗体可以通过与4个氨基酸残基缀合而用4个TCO-药物构建体修饰，其中CA是药物。
同样，应当理解，一个CA可以用一个以上的触发物进行修饰。例如，可以通过将4个氨基酸残基缀合至4个TCO-聚乙二醇构建体来掩蔽蛋白质药物，其中聚乙二醇是CB。
此外，应当理解，一个CA可以用多于一个触发物进行修饰，其中至少一个触发物链接至靶向剂，即CB，并且至少一个触发物链接至掩蔽部分(Masking Moiety)，即CB，其中CA可以是药物，最好是蛋白质。
间隔基(Spacer)SP：
应当理解，当在本文中陈述“每个单独的SP在所有末端(end)连接到结构的其余部分”时，这是指间隔基SP连接结构内的多个部分的事实，因此，根据定义，间隔基具有多个末端。间隔基SP可以通过可以各自单独选择的不同或相同的部分连接到每个单独的部分。通常，这些连接部分被视为间隔基SP本身的一部分。如果间隔基SP连接结构内的两个部分，“所有末端(all ends)”应解释为“两端(both ends)”。例如，如果间隔基将反式环辛烯部分连接到构建体A，则“分子的其余部分(the remainder of the molecule)”是指反式环辛烯部分及构建体A，而间隔基与反式环辛烯部分之间的连接部分及构建体A(即，在两端)可以被单独选择。
在一个优选的实施方式中，间隔基SP可以由一个或多个线性排列及/或支化的间隔基单元SU组成，并且可以连接到一个或多个CB部分及/或一个或多个LC或TR部分。垫片可用于将CB连接到一个TR(以下示例A；参考式5a及5b：f、e、a＝1)或多个TR(以下示例B及C；参考式5a及5b：f、e＝1；a≥1)，但它也可用于调制性质，例如CB-TR-CA偶联物的药代动力学性质(以下示例D；参考式5a及5b：一个或多个c、e、g、h≥1)。因此，间隔基单元不一定将两个实体连接在一起，它也可以仅绑定到一个组件，例如。TR或LC。或者，间隔基可包含将CB与TR连接的间隔基单元，并且另外可包含仅与间隔基结合并用于调节偶联物的性质的另一间隔基单元(以下示例F；参考式5a及5b：e≥1)。间隔基也可以由两种不同类型的SU结构组成，例如与肽连接的PEG，或与亚烷基部分连接的PEG(以下示例E；参考式5a及5b；e≥1)。为了清楚起见，示例B描述了通过使用多价支链SU来支化的SU。示例C描述了通过使用线性SU聚合物(例如：肽)来支化的SU，其侧链残基用作缀合基团。
Figure BDA0003509271520000691
间隔基可以以类似的设计绑定到活化剂，例如上面示例A-F中所描述的。
间隔基单元包括但不限于氨基酸、核苷、核苷酸及生物聚合物片段，例如寡或多肽、寡或多肽、寡或聚丙交酯、或寡或多碳水化合物，重复单元从2到200，特别是2到113，优选2到50，更优选2到24，更优选2到12个变化。示例性优选的生物聚合物SU是肽。其他示例是烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环烷基、亚环烷基、环烯基、亚环烯基、环炔基、亚环炔基、芳基、亚芳基、烷基芳基、烷基亚芳基、芳烷基、芳基亚烷基、芳基烯基、芳基亚烯基、芳基炔基(arylalkynyl)、芳基炔基(arylalkynylene)、聚乙烯氨基、多胺，其可以是取代的或未取代的、直链的或支链的，可以包含另外的环状部分及/或杂原子，优选O、N及S，更优选O；其中在优选实施方式中，这些示例SU包含至多50个碳原子，更优选至多25个碳原子，更优选至多10个碳原子。在一些优选的实施方式中，SU独立地选自于由(CH2)r、(C3-C8碳环)、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、亚芳基-(CH2)r、(CH2)r-(C3-C8碳环)、(C3-C8碳环)-(CH2)r、(C3-C8杂环)、(CH2)r-(C3-C8杂环)、(C3-C8杂环)-(CH2)r、-(CH2)rC(O)NR4(CH2)r、(CH2CH2O)r,(CH2CH2O)rCH2,(CH2)rC(O)NR4(CH2CH2O)r、(CH2)rC(O)NR4(CH2CH2O)rCH2,(CH2CH2O)rC(O)NR4(CH2CH2O)r、(CH2CH2O)rC(O)NR4(CH2CH2O)rCH2、(CH2CH2O)rC(O)NR4CH2所组成的群组；其中r独立地为1-10的整数，并且R4如本文所定义。
间隔基单元SU的其他示例是直链或支链聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙烯二醇(PPG)链，其变化范围为2到200，尤其是2到113，优选2到50，更优选2到24，更优选2到12个重复单元。优选的是，当聚亚烷基二醇如PEG及PPG聚合物仅通过聚合物链的一端结合时，另一端以-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CO2H终止。
其他聚合物间隔基单元是聚合物及共聚物，例如聚-(2-恶唑啉)(poly-(2-oxazoline))、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide)，HPMA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚谷氨酸(PG)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲醛(poly(1-hydroxymethylethylenehydroxymethyl-formal)，PHF)。其他示例性聚合物是多糖、糖多糖、糖脂、多糖苷、聚缩醛、聚缩酮、聚酰胺、聚醚、聚酯。天然存在的多糖的例子是可用作SU的是纤维素、直链淀粉、葡聚糖、糊精、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜聚糖、菊粉、果胶、支链淀粉、糖原、立克辛聚糖、琼脂糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、海藻酸及肝素。在其他示例性实施方式中，聚合物SU包含聚缩醛/聚缩酮以及选自于由聚丙烯酸酯、聚乙烯基聚合物、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺、低聚物的亲水聚合物的共聚物肽、多肽及其衍生物所组成的群组。示例性的优选聚合SU是PEG、HPMA、PLA、PLGA、PVP、PHF、葡聚糖、寡肽及多肽。
在本发明的一些方面，用于SU的聚合物的分子量范围为2至200kDa、2至100kDa、2至80kDa、2至60kDa、2至40kDa、2至20kDa、3到15kDa、5到10kDa、500Da到5kDa。
其他示例性SU是树枝状大分子，例如聚(丙烯亚胺)(PPI)树枝状大分子、PAMAM树枝状大分子及二醇基树枝状大分子。
本发明的SU明确包括但不限于用可商购的交联剂例如BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB制备的偶联物、SMPH、磺基(sulfo)-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB及SVSB、DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3及BM(PEO)4。
为了构建支链间隔基，可以使用基于一种或几种天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛或聚胺残基或其组合的SU，它们共同提供了支链所需的功能。例如，丝氨酸具有3个官能基，即酸、氨基及羟基，并且可以被视为组合的氨基酸及氨基醇残基，以起到支链SU的作用。其他示例性氨基酸是赖氨酸和酪氨酸。
在优选实施方式中，间隔基由1个间隔基单元组成，因此在那些情况下SP等于SU。在优选实施方式中，间隔基由2个、3个或4个间隔基单元组成。
在一些方面，SP具有2至200kDa、2至100kDa、2至80kDa、2至60kDa、2至40kDa、2至20kDa、3至15kDa，5至10kDa、500Da至5kDa。在本发明的一些方面，SP的质量不超过5000Da、不超过4000Da、不超过3000Da、不超过2000Da、不超过1000Da、不超过800Da、不超过500Da、不超过300Da、不超过200Da。在一些方面，SP的质量从100Da至200Da，从300Da到5000Da。在某些方面，SP的质量从30、50或100Da至1000Da，从约30、50或100Da至500Da。
在优选的实施方式中，SP是选自于由C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基、C2-C12亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C8亚环烷基、C5-C8亚环烷基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基、C4-C12环烷基亚烷基所组成的群组，其中为亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基的SP任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR'、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37及-Si(R37)3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由-O-、-S-、-NR37-、-P-及-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，SP包含一个或多个部分CM2、CX或R32的残基，如本文所述。在优选的实施方式中，所述CM2、CX或R32的残基将SP连接到CB、CA、LC、TR或另一个SP。
Linker LC(连接基团)：
LC是一种可选的自分解(self-immolative)连接基团，它可以由多个线性及/或支链排列的单元组成，并且可以释放一个或多个CA部分。
进一步说明，如果r为0，则物种CA直接构成释放反应的离去基，如果r>0，则自分解连接基团LC构成释放反应的离去基。可能的LC结构、其用途、连接基团LC的位置及连接方式、构建体CA及CB以及TR是本领域技术人员已知的，参见例如Papot等人；抗癌剂医学化学(Anticancer Agents Med.)；2008,8,618-637。然而，自分解连接基团LC的优选但非限制性示例是苄基衍生物，如下文所示。有两种主要的自分解机制：电子级联消除及环化介导的消除。下面左边的优选示例通过级联机制起作用，其中触发物的烯丙基碳与连接到所述碳上的-O-或-S-之间的键被裂解，并且例如YC1的电子对NR6的电子对转移到苄基部分，导致电子级联并形成4-羟基苄醇、CO2及释放的CA。中间的优选示例通过环化机制起作用，其中在触发物一侧与NR6键的断裂导致胺对羰基的亲核攻击，形成5-环1,3-二甲基咪唑啉-2-one(5-ring1,3-dimethylimidazolidin-2-one)以及释放CA。右边的优选示例结合了这两种机制，此连接机团不仅会降解为CO2以及一个4-羟基苯甲醇(4-hydroxybenzylalcohol)单元(当YC1为O时)，还会降解为一个1,3-二甲基咪唑啉-2-one(1,3-dimethylimidazolidin-2-one)单元。
Figure BDA0003509271520000731
其中摆动线表示与反式环辛烯的烯丙基位置上的-O-或-S-的键，双虚线表示与CA的键。
通过取代上述自分解连接基团LC的苄基，可以调整由对环化及/或级联释放的空间和/或电子效应引起的构建体CA的释放速率。制备此类取代的苄基衍生物的合成程序是技术人员已知的，参见例如Greenwald等人，J.Med.Chem.，1999,42,3657-3667以及Thornthwaite等人，Polym.Chem.，2011,2,773-790。下面绘制了一些具有不同释放速率的优选取代苄基衍生物。
进行环化的自分解连接基团包括但不限于取代及未取代的氨基丁酸酰胺、适当取代的双环[2.2.1]及双环[2.2.2]环系统、2-氨基苯基丙酸酰胺(2-aminophenylpropionicacid amide)及基于三甲基锁(trimethyl lock-based)的连接基团，参见例如Chem.Biol.，1995,2,223；J.Am.Chem.Soc.，1972,94,5815；J.Org.Chem.1990,55,5867，其内容通过引用并入本文。优选地，对于通过环化释放CA的LC，CA的其余部分通过硫的芳族氧与LC结合。可以理解，例如芳香氧是指直接连接到芳香基团上的氧。
LC的其他优选示例可见WO2009017394(A1)、US7375078、WO2015038426A1、WO2004043493、Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492–7509，其内容通过引用并入本文。
在本发明的一些方面中，LC的质量不超过1000Da、不超过500Da、不超过400Da、不超过300Da，或从10、50或100到1000Da、从10、50、100到400Da、从10、50、100到300Da、从10、50、100到200Da，例如，10到1000Da，例如50到500Da，例如100到400Da。
本领域技术人员将知道，一个LC可以连接到另一个与CA结合的LC，其中活化剂与触发物TR反应后，LC-LC-CA从TR中释放出来，导致LC部分以及CA部分的自分解释放。关于本文公开的式LC，将TR连接到另一个LC的LC不释放CA，而是释放通过YC1结合并进一步连接到CA的LC。
在一个优选的实施方式中，LC选自于游由第I组、第II组及第III组的连接基团所组成的群组。
根据第I组的连接基团是：
Figure BDA0003509271520000741
，其中摆动线还可以表示与-S-在反式环辛烯的烯丙基位置上的结合，其中U、V、W、Z各自独立地选自于由-CR7-及-N-所组成的群组；其中e是0或1；其中X选自于由-O-、-S-及-NR6-所组成的群组；其中优选每个R8及R9独立地选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基以及C4-6(杂)芳基所组成的群组；其中对于R8及R9，烷基、烯基及(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2及-NO2所组成的群组的部分取代，并且任选地含有至多2个选自于由-O-、-S-、-NH-、-P-和-Si-所组成的群组的杂原子，其中N、S及P原子任选被氧化；其中对于根据第I组的连接基团，CA通过选自于由-O-、-N-、-C-及-S-所组成的群组的部分连接至LC，优选选自于由仲胺及叔胺所组成的群组，其中所述部分是CA的一部分。优选地，对于第I组的连接基团，R8及R9都是氢。
根据第II组的连接基团是：
Figure BDA0003509271520000751
，其中所述摆动线还可指示反式环辛烯烯的烯丙基位置上与-S-的键，其中m是介于0和2之间的整数，优选m是0；其中e为0或1；其中，对于根据第II组的接头，CA通过选自-O-、-N-、-C-和-S-组的部分连接至LC，优选选自由仲胺和叔胺组成的组，其中所述部分为CA的一部分。对于第II组的接头，优选R8和R9均为氢。优选地，对于第II组的连接物，R7为甲基或异丙基。
根据第III组的连接基团是：
Figure BDA0003509271520000752
其中，所述摆动线还可指示与反式环辛烯烯烯丙基位置上的-S-的键，其中对于根据第III组的接头，CA通过选自与C4-6(杂)芳基结合的-O-和-S-，优选-O-或-S-的组的部分连接到LC，其中所述部分是CA的一部分，其中优选地，每个R6独立地选自由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基和C4-6(杂)芳基组成的基团，其中对于R6，烷基、烯基和(杂)芳基任选地被选自-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2和-NO2的基团的部分取代，并且任选地包含从-O-、-S-、-NH-、-P-和-Si-组成的组中选择的最多两个杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中优选地，每个R7独立地从氢和C1-C3烷基、C2-C3烯基组成的组中选择，以及C4-6(杂)芳基，其中对于R7而言，烷基、烯基和(杂)芳基任选地被选自由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、＝NH、-N(CH3)2、-S(O)2CH3和-SH组成的组中的一部分取代，并且任选地被选自由-O-、和-H组成的组中的最多一个杂原子打断，-S-、-NH-、-P-和-Si-，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化，其中R7优选地从氢、甲基、-CH2-CH2-N(CH3)2和-CH2-CH2-S(O)2-CH3组成的组中选择。
优选地，对于第III组的连接物，R6为氢。优选地，对于第III组的连接基团，R6为甲基。
包含在所述第I、II和III组中的R6、R7、R8、R9也可任选地为-(SP)i-CB。
对于根据第I组和第II组的所有连接基团，YC1选自由-O-、-S-和-NR6-组成的组，优选-NR6-。对于第三组中的所有连接基团，YC1为-NR6-。对于根据第I、II和III组的所有连接基团，YC2选自O和S组成的组，优选O。
当两个LC相互连接时，在反式环辛烯的烯丙基位置连接到-O-或-S-的LC从I组和II组的连接物组成的组中选择，在反式环辛烯的烯丙基位置连接到-O-或-S-的LC和CA之间的LC从第III组中选择，第III组结构中的摆动线则表示与反式环辛烯烯丙基位置的-O-或-S-连接的LC的键，而不是与反式环辛烯环上的烯丙基-O-或-S-的键，然后，第I组和第II组结构中的双虚线表示在反式环辛烯烯烯丙基位置连接到-O-或-S-的LC与CA之间的LC键，而不是与CA键。
在优选实施方式中，LC选自由根据第IV、V、VI和VII组的连接基团组成的组，其中根据第IV组的连接基团为：
Figure BDA0003509271520000771
，其中摆动线还可指示反式环辛烯烯烯丙基位置上的-S-键，其中CA通过从-O-和-S-组成的基团中选择的部分连接到LC，优选从-O-C5-8-芳基和-S-C5-8-芳基组成的基团中选择，其中所述部分是CA的一部分。
第V组的连接基团为：
Figure BDA0003509271520000772
，其中所述摆动线还可指示与反式环辛烯烯烯丙基位置上的-S-的键，其中CA通过从-O-和-S-组成的基团中选择的部分连接到LC，其中所述部分是CA的一部分。在第V组的第一接头中，R7优选为–(CH2)2-N(CH3)2。
第VI组的连接基团为：
Figure BDA0003509271520000781
，其中，摆动线还可指示反式环辛烯烯烯丙基位置上的-S-键，其中CA通过从-O-、-N-和-S-组成的基团中选择的部分连接到LC，优选仲胺或叔胺，其中所述部分是CA的一部分。
第VII组的连接基团为：
Figure BDA0003509271520000782
，其中，摆动线还可指示反式环辛烯烯烯丙基位置上与-S-的键，其中CA通过从-O-、-N-和-S-组成的组中选择的部分连接到LC，优选从仲胺和叔胺组成的组中选择，其中所述部分是CA的一部分，其中，当在一个LC内显示多条双虚线时，独立选择每个CA部分。
对于第IV组、第V组、第VI组和第VII组中的所有接头，YC1从-O-、-S-和-NR6-组成的群组中选择。
对于第IV-VII组，优选R6和R7如本文所定义，更优选如第I-III组所定义。对于第I-VII组，I为0到4范围内的整数，优选0或1，其中j为0或1。优选地，第I-VII组中任一组中使用的R6、R7、R8、R9不被取代。R6、R7、R8、R9如本文所定义。优选地，R6是氢。优选地，R7是氢。优选地，R8是氢。优选地，R9是氢。
靶向(Targeting)：
本发明的试剂盒非常适合用于靶向成像、靶向递送药物和治疗辐射，以及用于体外选择性生物分子或组织结合。
本发明中使用的“主要靶向”优选涉及用于治疗的靶向剂的靶标。在其他实施方式中，它涉及用于成像治疗诊断学、诊断学或体外研究的靶标。例如，主要目标可以是存在于生物体、组织或细胞中的任何分子。目标包括细胞表面目标，例如受体，糖蛋白；结构蛋白，例如淀粉样斑块；丰富的细胞外靶点如基质靶点、肿瘤微环境靶点、细胞外基质靶点如生长因子和蛋白酶；细胞内靶标，例如高尔基体表面、线粒体表面、RNA、DNA、酶、细胞信号通路成分；和/或异物，例如病原体，例如病毒、细菌、真菌、酵母或其部分。主要靶标的实例包括诸如蛋白质之类的化合物，其存在或表达水平与某种组织或细胞类型相关，或者其表达水平在某种疾病中被上调或下调。根据本发明的一个具体实施方式，主要靶标是蛋白质，例如(内化或非内化)受体。
此外，优选的主要目标是血液，即延长化合物的血液循环，和/或减少向其他组织的外渗。例如，可以通过将聚乙二醇(PEG)连接到化合物上来靶向血液。这通常会增加血液循环时间。例如，通过将化合物连接到500nm PLGA颗粒上，偶联物不会轻易地从血液中溢出到其他组织(例如肌肉)中，除非它通过肝脏和脾脏快速吸收和清除。器官，如肝脏，也可能是主要目标。例如，己糖可以附着在化合物上以特异性靶向肝脏。
另一个主要目标通常是免疫系统。根据本发明，主要靶标可以选自人或动物体内或病原体或寄生虫上的任何合适的靶标，例如寄生虫。一组包括细胞如细胞膜和细胞壁、受体如细胞膜受体、细胞内结构如高尔基体或线粒体、酶、受体、DNA、RNA、病毒或病毒颗粒、抗体、蛋白质、碳水化合物、单糖、多糖、细胞因子、激素、类固醇、生长抑素受体、单胺氧化酶、毒蕈碱受体、心肌交感神经系统、白三烯受体，例如对白细胞、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)、叶酸受体、细胞凋亡标记物、(抗)血管生成标记物、胃泌素受体、多巴胺能系统、5-羟色胺能系统、GABA能系统、肾上腺素能系统、胆碱能系统、阿片受体、GPIIb/IIIa受体和其他血栓相关受体、纤维蛋白、降钙素受体、促凝素受体、整合素受体、纤连蛋白、VEGF/EGF和VEGF/EGF受体、TAG72、CEA、A33、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD40、CD45、CD56,CD74,CD79,CD105,CD123,CD138,CD163,CD174,CD184,CD227,CD269,CD326,CD340,CD352,MUC1,MUC16,GPNMB,PSMA,Cripto,Tenascin C,Melanocortin-1receptor,CD44v6,G250,HLA DR、ED-A、ED-B、TMEFF2、EphB2、EphA2、FAP、间皮素、GD2、CAIX、5T4、基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM-9、P/E/L-选择素受体、LDL受体、P-糖蛋白、神经降压素受体、神经肽受体、P物质受体、NK受体、CCK受体、σ受体、白细胞介素受体、单纯疱疹病毒酪氨酸激酶,人酪氨酸激酶,MSR1,FAP,CXCR,肿瘤内皮标志物(TEM),cMET,IGFR,FGFR,GPA33,hCG,HER2,HER3,CA19,TAM,LGALS3BP,nectin-4,IFGR,,PD1,PDL1、AGS-5、AGS-16、内唾液酸、ETBR、TM4SF1、BCMA、GPC2、TROP-2、AXL、HLA-DR、B7-H3、MTX3、MTX5、EFNA4、NOTCH、组织因子(TF)、PDGFR、GITR、OX40、RIG、MDA-5、NLRP1、NLRP3、AIM2、IDO、MEK、cGAS、NKG2A。
根据本发明的另一个具体实施方式，选择主要靶标和靶向剂以导致对组织或疾病，例如癌症、炎症、感染、心血管疾病，例如脑血管病的特异性或增加的靶向性。血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧部位，例如中风、肿瘤、心血管疾病、脑疾病、细胞凋亡、血管生成、器官和报告基因/酶。这可以通过选择具有组织、细胞或疾病特异性表达的主要目标来实现。例如，膜叶酸受体介导叶酸及其类似物(如甲氨蝶呤)的细胞内积累。在正常组织中表达有限，但受体在各种肿瘤细胞类型中过度表达。
在优选实施方式中，主要目标等于治疗目标。应当理解，治疗靶标是药物靶向以提供治疗效果的实体。
靶向剂(Targeting Agent)TT：
靶向剂TT与主要靶点结合。为了允许对上述主要靶点进行特异性靶向，靶向剂TT可包含化合物，包括但不限于抗体、抗体衍生物、抗体片段、抗体(片段)融合(例如双特异性和三特异性单克隆抗体片段或衍生物)、蛋白质、肽，例如奥曲肽和衍生物、VIP、MSH、LHRH、趋化肽、细胞穿膜肽、膜易位部分、蛙皮素、弹性蛋白、肽模拟物、有机化合物、无机化合物、碳水化合物、单糖、低聚糖、多糖、寡核苷酸、适体、病毒、全细胞、噬菌体、药物、聚合物、脂质体、化疗剂、，受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、类固醇、毒素。在本发明的上下文中设想的有机化合物的实例是染料、针对CAIX和PSMA的化合物、雌激素，例如雌二醇、雄激素、孕激素、皮质类固醇、甲氨蝶呤、叶酸和胆固醇，或源于这些化合物。
根据本发明的特定实施方式，主要靶点是受体，并且使用能够特异性结合到主要靶点的靶向剂。合适的靶向剂包括但不限于这种受体的配体或其仍与受体结合的部分，例如在受体结合蛋白配体的情况下的受体结合肽。蛋白质性质的靶向制剂的其他示例包括胰岛素、转铁蛋白、纤维蛋白原γ片段、血小板反应蛋白、克劳丁、载脂蛋白E、抗体分子，例如ABY-025、锚蛋白重复蛋白、锚蛋白样重复蛋白、干扰素，例如α、β和γ干扰素、白细胞介素、淋巴因子、，集落刺激因子和蛋白质生长因子，如肿瘤生长因子，如α、β肿瘤生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、uPAR靶向蛋白、载脂蛋白、LDL、膜联蛋白V、内皮抑素和血管抑素。靶向剂的替代示例包括DNA、RNA、PNA和LNA，它们例如与主要靶点互补。
作为靶向剂的肽的实例包括LHRH受体靶向肽、EC-1肽、RGD肽、HER2靶向肽、PSMA靶向肽、生长抑素靶向肽、蛙皮素。靶向药物的其他例子包括脂质沉积蛋白，如抗胆碱药。一个特定的实施方式使用AffibodiesTM和多聚体及衍生物。
在优选实施方式中，TT是抗体。在优选实施方式中，TT选自抗体和抗体衍生物，例如抗体片段、片段融合、蛋白质、肽、肽模拟物、有机分子、染料、荧光分子、酶底物。
在优选实施方式中，作为有机分子的TT具有小于2000Da、更优选小于1500Da、更优选小于1000Da、甚至更优选小于500Da的分子量。
在另一优选实施方式中，TT选自抗体片段、片段融合物和不包含Fc结构域的其他抗体衍生物。
在另一个实施方式中，TT是聚合物，并且凭借EPR效应在主要目标处累积。本实施方式中使用的典型聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚谷氨酸(PG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(1-羟甲基乙烯-羟甲基甲醛(PHF)。其他实例系聚缩醛/聚缩酮与亲水性聚合物之共聚物，该亲水性聚合物选自由聚丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚酯、聚正交酯、聚酰胺、寡肽、多肽及其衍生物组成之群。其他例子包括寡肽、多肽、多糖和多糖，如右旋糖酐和透明质酸。通常，合适的聚合物为聚乙二醇(PEG)，优选具有2至4000范围内的多个重复单元，且分子量在200Da至100000Da范围内。
此外，还参考了G.Pasut，F.M.Veronese，Prog.Polym.Sci.2007，32933–961。
其他TT'是纳米颗粒、微粒、脂质体、胶束、多聚体、树状大分子、生物分子、肽、类肽、蛋白质、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、脂质体、脂质体、白蛋白、白蛋白结合部分、染料、荧光分子和酶底物。
在其他实施方式中，TT选自氨基酸、核苷、核苷酸、碳水化合物和生物聚合物片段，例如寡聚或多肽、寡聚或多肽、寡聚或聚乳酸，或寡聚或多聚碳水化合物、寡聚核苷酸，范围从2到200，尤其是2到113，优选2到50，更优选2至24个且更优选2至12个重复单元。
在本发明的一些方面中，聚合物TT部分的分子量范围为2至200kDa、2至100kDa、2至80kDa、2至60kDa、2至40kDa、2至20kDa、3至15kDa、5至10kDa、500道尔顿至5kDa。
其他示例性TT部分是树状大分子，例如聚(丙烯亚胺)(PPI)树状大分子、PAMAM树状大分子和基于乙二醇的树状大分子。
在优选实施方式中，靶向剂TT定位或保留在身体的特定系统、组织或器官中，例如血液循环、淋巴系统、神经系统、消化系统、RES系统或诸如心脏或肾脏的器官中。例如，微粒会在肝脏中定位，大的亲水性聚合物会在循环中滞留。同样，使用白蛋白结合部分作为TT将导致血液循环中的滞留时间延长。
在优选实施方式中，TT用于修饰其所连接部分的药代动力学。这可包括但不限于延迟所述部分的血液清除，影响所述部分的分布体积(例如减少或增加分布体积)，影响所述部分的代谢，和/或影响(优选避免)所述部分粘附或摄取到非靶组织。这方面的示例性TT是聚合物、肽、类蛋白、树状大分子、蛋白质、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、脂质体、脂质体、胶束、纳米粒子、微粒、白蛋白、白蛋白结合部分，以及小到中等大小的有机分子，例如类固醇和染料。通常，合适的聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)。
根据本发明的另一个具体实施方式，选择主要靶点和靶向剂以导致组织或疾病(例如癌症、炎症、感染、心血管疾病，例如血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧部位，例如中风、肿瘤、，心血管疾病、脑疾病、细胞凋亡、血管生成、器官和报告基因/酶。这可以通过选择具有组织、细胞或疾病特异性表达的主要靶点来实现。例如，CC49抗体靶向TAG72，TAG72在正常组织中的表达有限，但受体在各种实体瘤细胞类型中过度表达。
在一个实施方式中，针对给定细胞群，靶向剂与细胞表面分子(例如细胞表面受体或抗原)特异性结合或复合。在TT与受体特异性结合或络合后，细胞允许摄取前药，然后将前药内化到细胞中。随后施用的活化剂将进入细胞并激活前药，在细胞内释放药物。在另一实施方式中，针对给定细胞群，靶向剂与细胞表面分子(例如细胞表面受体或抗原)特异性结合或复合。TT与受体特异性结合或络合后，细胞不允许摄取前药。随后施用的活化剂将激活细胞外部的前药，之后释放的药物将进入细胞。
如本文所用，与细胞表面分子、细胞外基质靶点或另一靶点“特异性结合或复合”或“靶点”的TT优先通过分子间力与靶点结合。例如，配体可优先与解离常数(Kd或Kd)小于约50nm、小于约5nm或小于约500pm的目标物结合。
在一些实施方式中，TT可以是细胞穿透部分，例如细胞穿膜肽。在优选实施方式中，TT可以是非功能性的，其在触发物与活化剂反应时变为功能性的。在一个特别优选的实施方式中，所述非功能性TT是细胞穿膜肽的一部分，所述部分在触发物与活化剂反应时与细胞穿膜肽的另一部分结合。在另一优选实施方式中，在触发物与活化剂反应时，TT，优选细胞穿膜肽被揭穿。
在其他实施方式中，TT是聚合物、颗粒、凝胶、生物分子或上述TT部分的另一种，局部注射以产生前药或活化剂的局部贮存，其随后可分别与活化剂或前药反应。
在另一个实施方式中，靶向剂TT是固体材料，例如但不限于聚合物、金属、陶瓷，其中该固体材料是或包含在药筒、贮存器(reservoir)、贮存器(depot)中，其中优选所述药筒、贮存器(reservoir)、贮存器(depot)用于体内药物释放。
在一些实施方式中，靶向剂TT还充当药物，表示为DD。在特别优选的实施方式中，TT通过结合主要靶点充当药物DD。在其他优选实施方式中，TT在触发物被切割后充当DD。
优选的是，当TT包含在本发明的实施方式中时，它等于CB。
掩蔽部分(Masking moieties)：
如上文所述，为了避免当前前药活化的缺点，例如低释放产率和/或缓慢反应，使用本发明化合物的IEDDA哒嗪消除可用于激发掩蔽药物的掩蔽部分的释放。在这种类型的前药中，掩蔽部分通过触发物连接到药物上，并且该触发物不是通过酶或特定pH等内源性激活的，而是通过受控的活化剂给药，即与前药中的触发物部分反应的物种，诱导掩蔽部分或药物从触发物中释放(或反之亦然，从掩蔽部分或药物中释放触发物，然而人们可能会看到这种释放过程)，从而激活药物。
本发明提供一种用于给药和激活前药的试剂盒，该试剂盒包括直接或间接共价连接到触发部分的掩蔽部分(表示为MM)和触发部分的活化剂，触发部分又直接或间接共价连接到表示为DD的药物，其中，所述触发部分包含满足式(19)的亲二烯酮，所述活化剂包含满足式(4)、(4a)或(6)-(14)中任一式的四嗪。
在另一方面，本发明提供了一种前药，其包含直接或间接连接到满足上述式(19)的亲二烯基部分的掩蔽部分MM。
在又一方面，本发明提供了一种用一个或多个掩蔽部分MM修饰药物DD的方法，此掩蔽部分MM提供可通过非生物生物正交反应激活的前药，该方法包括提供掩蔽部分和药物，并将掩蔽部分和药物化学连接到满足式(19)的亲双烯部分的步骤。
在又一个方面，本发明提供了一种治疗方法，其中，通过向所述患者施用前药来治疗患有可被药物调节的疾病的患者，前药包括连接到掩蔽部分MM的触发部分和药物DD，在通过施用活化剂激活后，满足式(4)、(4a)或(6)-(14)中任一式，将释放掩蔽部分，激活药物，其中所述触发部分包含满足式(19)的亲二烯结构。
在另一个方面，本发明是一种包含亲二烯基部分的化合物，所述部分包含与掩蔽部分MM的连接，用于动物或人类的前药治疗。
在另一方面，本发明是使用二烯作为活化剂，在生理环境中释放共价连接到满足式(19)的化合物的物质。与此相关，本发明还涉及一种二烯烃，用作在生理环境中释放与满足式(19)的化合物连接的物质的活化剂，以及一种在生理环境中激活与满足式(19)的化合物连接的物质释放的方法，其中四嗪用作活化剂。
在另一个方面中，本发明展示了满足式(19)的化合物和亲二烯(优选反式环辛烯)之间的逆电子需求Diels-Alder反应作为在生理环境中释放以共价结合形式投与的物质的化学工具的用途，其中所述物质与满足式(19)的化合物结合。
为免生疑问，在本发明中，从抗体(即药物)中去除MM，术语“可激活抗体”和“前药”的含义相同。
为免生疑问，在本发明的上下文中，其中从药物中移除MM，药物本身可以选择性地结合到一个或多个主要靶点，而无需使用额外的靶向剂TT。在这种情况下，主要靶点优选为治疗靶点。
在优选实施方式中，药物包含靶向剂TT，以便该前药可结合一个主要靶点。在激活和清除MM后，药物会结合另一个主要靶点，这可能是一个治疗靶点。
在优选实施方式中，药物包含一个或多个TT部分，针对一个或不同的主要靶点。
为免生疑问，在使用掩蔽部分的情况下，主要靶点和治疗靶点互换使用。
为免生疑问，一种药物结构可以被一个以上的掩蔽部分修饰。
在优选实施方式中，本发明的可激活抗体或前药用于癌症治疗。在优选实施方式中，本发明的可激活抗体或前药用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病，例如类风湿性关节炎。在优选实施方式中，本发明的可激活抗体或前药用于治疗纤维性疾病，例如特发性肺纤维化。
本发明的可激活抗体或前体药物的主要靶点的示例性类别包括但不限于细胞表面受体和分泌蛋白(例如生长因子)、可溶性酶、结构蛋白(例如胶原蛋白、纤维连接蛋白)等。在优选实施方式中，主要靶点是细胞外靶点。在优选实施方式中，主要靶点是细胞内靶点。
在另一个实施方式中，该药物为双特异性或三特异性抗体衍生物，用于结合肿瘤细胞并招募和激活免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)，其免疫效应细胞结合功能通过与如上所述的亲二烯基部分连接而被掩盖和失活。后者，再次用于生物正交化学活化药物活化。
当DD为CB时，首选DD不通过其抗原结合域连接到前药的剩余部分。最好DD是CA。
掩蔽部分MM例如可以是抗体、蛋白质、肽、聚合物、聚乙二醇、丙二醇碳水化合物、适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖、碳水化合物，以及进一步掩蔽结合药物DD或前药的肽、类肽、类固醇、有机分子或其组合。这种掩蔽可以基于例如空间位阻，但也可以基于与药物DD的非共价相互作用。这种掩蔽部分也可用于影响药物DD或前药的体内性质(例如血液清除率、生物分布、免疫系统识别)。
在优选实施方式中，掩蔽部分是白蛋白结合部分。在优选实施方式中，掩蔽部分等于靶向剂。在优选实施方式中，掩蔽部分结合到靶向剂。在优选实施方式中，药物DD为CA，用多个MM为CB进行修饰，其中至少一个结合MM为TT。在优选实施方式中，当CA为DD时，DD不通过间隔基SP绑定到TR。
在优选实施方式中，TR本身可作为掩蔽部分，前提是CA为DD。为清楚起见，在这些实施方式中，不附着MM的TR的大小足以掩蔽药物DD与其主要靶点，在本文中，其优选为治疗靶点。
修饰的DD的MM可以降低DD通过变构或立体方式结合其目标的能力。
在特定实施方式中，MM是肽，并且不包含与基于抗体的DD的基于天然蛋白质的结合伙伴超过50％的氨基酸序列相似性。
在优选实施方式中，MM是长度在2到40个氨基酸之间的肽。
在一个实施方式中，MM降低DD结合其目标的能力，使得当DD与MM结合时朝向目标的离解常数至少大于DD与MM结合时朝向目标的离解常数的100倍。在另一个实施方式中，MM与DD的耦合将DD绑定其目标的能力降低至少90％。
在优选实施方式中，掩蔽DD中的MM将DD结合目标的能力降低至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，与未掩蔽DD绑定目标的能力相比。DD结合靶标的能力的降低可以通过例如使用体外置换分析来确定，例如WO2009/025846和WO2010/081173中描述的抗体DD。
在优选实施方式中，掩蔽DD中包含的DD是抗体，其明确包括全长抗体、其抗原结合片段、抗体衍生物抗体类似物、抗体模拟物和抗体或抗体衍生物的融合。
在某些实施方式中，MM不是抗体的天然结合伙伴。在优选实施方式中，MM不包含或基本上不包含与抗体的任何天然结合伙伴的同源性。在优选实施方式中，与抗体的任何天然结合伙伴类似，MM不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在优选实施方式中，MM与抗体的任何天然结合伙伴的相同程度不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在优选实施方式中，MM与抗体的任何天然结合伙伴的相同性不超过50％。在优选实施方式中，MM与抗体的任何天然结合伙伴的相同性不超过25％。在优选实施方式中，MM与抗体的任何天然结合伙伴的相同性不超过20％。在优选实施方式中，MM与抗体的任何天然结合伙伴的相同性不超过10％。
在前药中，MM和触发物TR(亲二烯衍生物)可以直接相互连接。它们也可以通过间隔基SP或自分解接头LC相互绑定。应当理解，本发明包括二烯触发物连接到MM的任何可想象的方式。可以理解的是，MM与亲二烯的连接方式是，MM最终能够在形成IEDDA加合物后从DD中释放。通常，这意味着DD和亲二烯之间的键，或者如果是自分解接头LC，则LC和亲二烯之间以及DD和LC之间的键应该是可裂解的。或者，这意味着MM和亲二烯之间的键，或者在自分解接头LC的情况下，LC和亲二烯之间以及MM和LC之间的键应该是可裂解的。
在优选实施方式中，包含在掩蔽抗体中的抗体是多抗原靶向抗体，其至少包括结合第一主要靶点的第一抗体或抗原结合片段或其模拟物，以及结合第二主要靶点的第二抗体或抗原结合片段或其模拟物。在优选实施方式中，包含在掩蔽抗体中的抗体是多抗原靶向抗体，包括结合第一主要靶点的第一抗体或抗原结合片段或其模拟物，结合第二主要靶点的第二抗体或抗原结合片段或其模拟物，以及结合第三主要靶点的第三抗体或抗原结合片段或其模拟物。在优选实施方式中，多抗原靶向抗体结合两个或多个不同的主要靶点。在优选实施方式中，多抗原靶向抗体将两个或多个不同的表位结合在同一主要靶点上。在优选实施方式中，多抗原靶向抗体结合两个或多个不同靶点和同一主要靶点上两个或多个不同表位的组合。在优选实施方式中，掩蔽的多抗原靶向抗体包括一个MM组，或两个或多个MM组。应当理解，优选地，至少一个主要靶点是治疗靶点。
在多特异性可激活抗体的优选实施方式中，单链抗体可融合到IgG可激活抗体的重链的羧基末端、IgG可激活抗体的轻链的羧基末端或IgG可激活抗体的轻链和重链的羧基末端。在多特异性可激活抗体的优选实施方式中，单链抗体可融合到IgG可激活抗体的重链的氨基末端、IgG可激活抗体的轻链的氨基末端或IgG可激活抗体的轻链和重链的氨基末端。在多特异性可激活抗体的优选实施方式中，单链抗体可融合到IgG可激活抗体的一个或多个羧基末端和一个或多个氨基末端的任何组合。本领域技术人员已知制备多特异性抗体的方法。此外，还参考了Weilde等人，癌症基因组学和蛋白质组学2013，10，1-18(Weilde etal.,Cancer Genomics&Proteomics 2013,10,1-18)；Weidle等人，肿瘤学研讨会2014，41，5，653-660(Weidle et al.,Seminars in Oncology 2014,41,5,653-660)；Jachimowicz等人，生物药物(2014)28:331–343(Jachimowicz et al.,BioDrugs(2014)28:331–343)，其内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，连接到TR的MM连接到IgG的抗原结合域并掩蔽该抗原结合域。在优选实施方式中，连接到TR的MM连接到至少一个单链抗体的抗原结合域并掩蔽其。在优选实施方式中，连接到TR的MM连接到并掩蔽IgG的抗原结合域，连接到TR的MM连接到并掩蔽至少一个单链抗体的抗原结合域。
在优选实施方式中，MM具有离解常数，即平衡状态下的离解常数Kd，用于结合抗体，其大于抗体与其主要靶点结合的Kd。在优选实施方式中，MM具有与抗体结合的Kd，其大约等于抗体与其主要靶点结合的Kd。在优选实施方式中，MM具有与抗体结合的Kd，其小于抗体与其主要靶点结合的Kd。在优选实施方式中，MM具有与抗体结合的Kd，其不超过抗体与其主要靶点结合的Kd的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1000倍。在优选实施方式中，MM与抗体结合的Kd比抗体与其主要靶点结合的Kd大1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1000、20-100、20-1000或100-1000倍。
在优选实施方式中，MM与抗体结合的亲和力大于抗体与其主要靶点结合的亲和力。在优选实施方式中，MM具有与抗体结合的亲和力，其大约等于抗体与其主要靶点结合的亲和力。在优选实施方式中，MM与抗体结合的亲和力小于抗体与其主要靶标结合的亲和力。在优选实施方式中，MM与抗体结合的亲和力比抗体与其主要靶点结合的亲和力低2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1000倍。在优选实施方式中，MM与抗体结合的亲和力比抗体与其主要靶点结合的亲和力小1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1000、20-100、20-1000或100-1000倍。在优选实施方式中，MM与抗体结合的亲和力比抗体与其主要靶点结合的亲和力小2至20倍。
在优选实施方式中，未与抗体共价连接且与抗体等摩尔浓度的MM不会抑制抗体与其主要靶点的结合。在优选实施方式中，当前药处于裂解状态时，MM不干扰或竞争与抗体结合到主要靶点。
在优选实施方式中，抗体具有约100nM或更小的离解常数，用于结合到其主要靶点。在优选实施方式中，抗体具有约10nM或更小的离解常数，用于结合到其主要靶点。在优选实施方式中，抗体具有约1nM或更小的离解常数，用于结合到其主要靶点。在优选实施方式中，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联MM时，抗体的解离常数(Kd)至少比未向其主要靶点偶联MM时抗体的Kd大20倍。在优选实施方式中，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联MM时，抗体的Kd至少比未向其主要靶点偶联MM时抗体的Kd大40倍。在优选实施方式中，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联MM时，抗体的Kd至少是未向其主要靶点偶联MM时抗体的Kd的100倍。在优选实施方式中，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联至MM时，抗体的Kd至少是未向其主要靶点偶联至MM时抗体的Kd的1000倍。在优选实施方式中，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联至MM时，抗体的Kd至少是未向其主要靶点偶联至MM时抗体的Kd的10000倍。在优选实施方式中，例如当使用如下文所定义的非结合性立体MM时，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶点的能力，使得当向其主要靶点偶联MM时，抗体的Kd至少是未向其主要靶点偶联MM时抗体的Kd的100000倍。在优选实施方式中，例如当使用如下文所定义的非结合性立体MM时，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶标的能力，使得当抗体与MM偶联时朝向其主要靶标的Kd至少是未与MM偶联时朝向其主要靶标的Kd的1000000倍。在优选实施方式中，例如当使用如下文所定义的非结合性立体MM时，MM的偶联降低了抗体结合其主要靶标的能力，使得当抗体与MM偶联时朝向其主要靶标的Kd至少是未与MM偶联时朝向其主要靶标的Kd的10000000倍。
可使用掩蔽部分用于与本发明相关的前药的示例性药物包括但不限于：抗体、抗体衍生物、抗体片段、蛋白质、适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖、碳水化合物，以及肽、类蛋白、类固醇、毒素、激素、病毒、全细胞、，噬菌体。在优选实施方式中，药物为低至中等分子量化合物，优选有机化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da，更优选约300至约1000Da)。
在一个实施方式中，抗体用作药物。虽然从IgG抗体衍生的抗体或免疫球蛋白特别适合于在本发明中使用，但可以选择来自任何类别或亚类别的免疫球蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。适当地，免疫球蛋白属于IgG类，包括但不限于能够特异性结合抗原上特定表位的IgG亚类(IgG1、2、3和4)或IgM类。抗体可以是来自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼化单域抗体、重组抗体、抗独特型抗体、多特异性抗体、抗体片段，例如Fv、VHH、Fab、F(ab)2、Fab'，Fab'-SH、F(ab')2、单链可变片段抗体(scFv)，串联/双单链抗体、Fc、pFc'，单链抗体Fc、二硫键抗体(dsFv)、双特异性抗体(bc-scFv)，如叮咬抗体、骆驼抗体、小体、纳米体、重表面抗体、人源化抗体、全人类抗体、单域抗体(sdAb，也称为纳米体TM)、嵌合抗体，包含至少一个人类恒定区的嵌合抗体、双亲和力抗体，例如双亲和力重定目标蛋白(DARTTM)，以及多聚体及其衍生物，例如二价或多价单链可变片段(例如双单链抗体、三单链抗体)，包括但不限于小体、diabodies、tribodies、tribodies、，四体等，以及多价抗体。参考Trends in Biotechnology 2015,33,2,65、Trends Biotechnology.2012,30,575–582和Canc.Gen.Prot.2013 10,1-18以及BioDrugs 2014,28,331–343，其内容通过引用并入本文。其他实施方式使用抗体模拟物作为药物，例如但不限于附着体、抗盐、亲和体、α体、附着体、darpin和多聚体及其衍生物；参考Trends in Biotechnology 2015，33，2，65，其内容通过引用并入本文。“抗体片段”是指免疫球蛋白可变区中至少一部分与其靶结合，即抗原结合区。多聚体可以是线性连接的，也可以是支链的，并且可以从单个载体衍生，或者化学连接，或者非共价连接。本领域已知制作上述结构的方法。为免生疑问，在本发明的上下文中，术语“抗体”意指包括本段中概述的所有抗体变体、片段、衍生物、融合、类似物和模拟物，除非另有规定。
本发明适用的典型药物包括但不限于：蛋白质、肽、寡糖、寡核苷酸、单特异性、双特异性和三特异性抗体以及抗体片段或蛋白质融合，优选双特异性和三特异性。在优选实施方式中，可激活抗体或衍生物被配制为前双特异性T细胞接合器(BITE)分子的一部分。
其他实施方式使用免疫毒素，其是毒素和抗体之间的融合物或结合物。免疫毒素中的典型毒素包括霍乱毒素、蓖麻毒素A(ricin A)、gelonin、皂甙、布干宁(bouganin)、蓖麻毒素、阿布林(abrin)、白喉毒素、葡萄球菌肠毒素、芽孢杆菌Cyt2Aa1毒素、假单胞菌外毒素PE38、假单胞菌外毒素PE38KDEL、颗粒相关丝氨酸蛋白酶颗粒酶B、人类核糖核酸酶(RNase)，或其他促凋亡的人类蛋白质。可并入融合构建体中的其他示例性细胞毒性人类蛋白质是半胱天冬酶3、半胱天冬酶6和BH3相互作用域死亡激动剂(BID)。目前的免疫毒素存在免疫原性和毒性问题，尤其是对血管内皮细胞。用MM(如PEG或肽)掩蔽目标毒素，并在掩蔽的免疫毒素与目标结合后移除MM，有望大大降低毒性和免疫原性问题。
其他实施方式使用免疫细胞因子，免疫细胞因子是细胞因子和抗体之间的融合物或结合物。用于癌症治疗的典型细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和TNF。用于自身免疫性疾病的一种典型细胞因子是抗炎性IL-10。用MM(如PEG或肽)掩蔽靶细胞因子，并在被掩蔽的免疫细胞因子与靶细胞结合后移除MM，有望大大降低毒性问题。其他实施方式使用小型到中型有机药物。
在优选实施方式中，未掩蔽药物是多特异性的，并且与两个或多个相同或不同的主要靶点结合。在优选实施方式中，多特异性药物包含一个或多个(掩蔽的)抗体(也称为结合部分)，其设计用于与免疫效应细胞结合。在优选实施方式中，蒙蔽的多特异性前药包含一个或多个(蒙蔽的)抗体，其设计用于与白细胞结合。在优选实施方式中，蒙蔽的多特异性前药包含一个或多个(蒙蔽的)抗体，其设计用于与T细胞结合。在优选实施方式中，蒙蔽的多特异性前药包含一个或多个(蒙蔽的)抗体，其与白细胞上的表面抗原结合，例如T细胞、自然杀伤(NK)细胞、髓系单核细胞、巨噬细胞和/或另一免疫效应细胞上的表面抗原。在优选实施方式中，免疫效应细胞是白细胞、T细胞、NK细胞或单核细胞。
在示例性多特异性掩蔽前药中，前药包含用于癌症受体(例如TAG72)的抗体(即靶向剂)、T细胞上的CD3抗体和T细胞上的CD28抗体，其中CD3抗体或CD28抗体或两者均被MM掩蔽。另一实例系可激活抗体，其包含针对癌症受体之抗体及针对T细胞上CD3之抗体，其中针对CD3之抗体由MM掩蔽。另一实例系具有针对癌症受体之抗体及针对T细胞上CD28之抗体之前药，其中针对CD28之抗体由MM掩蔽。另一实例系具有针对癌症受体之抗体及针对NK细胞之CD16a抗体之前药，其中针对CD16a之抗体由MM掩蔽。在另一个实施方式中，未掩蔽药物结合两个不同的免疫细胞，并且可选地另外结合一个肿瘤细胞。所述多特异性抗体衍生物可以例如通过融合或结合抗体、抗体片段(例如Fab、Fabs、单链抗体、骆驼抗体重链片段和蛋白质)来制备。
在一些优选实施方式中，MM减少药物与主要靶点的结合，等于从CD3、CD28、PD-L1、PD-1、LAG-3、TIGIT、TIM-3、B7H4、Vista、CTLA-4聚唾液酸和相应凝集素中选择的治疗靶点。在其他优选实施方式中，MM掩蔽T细胞激动剂、NK细胞激动剂、DC细胞激动剂。
在免疫效应细胞结合蒙蔽的多特异性前药的优选实施方式中，例如结合多特异性可激活抗体的T细胞，前药中包含的至少一种抗体是靶向剂，并结合主要靶点，该主要靶点通常是肿瘤细胞或其他与疾病相关的细胞类型表面上存在的抗原，例如但不限于EGFR、erbB2、EpCAM、PD-L1、B7H3或CD71(转铁蛋白受体)，以及包含在前药中的至少一种其他抗体结合通常是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、髓系单核细胞、巨噬细胞和/或其他免疫效应细胞(例如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、，CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。在优选实施方式中，优选靶向CD3抗原为CD3ε或CD3ε(epsilon)。
本发明的一个实施方式是一种多特异性可激活抗体，其包括针对肿瘤靶点的抗体靶向剂和另一种激动剂抗体，即药物，其针对在活化T细胞或NK细胞表面上表达的共刺激受体，其中所述激动剂抗体被掩盖。共刺激受体的示例包括但不限于CD27、CD137、GITR、HVEM、NKG2D、OX40。在本实施方式中，一旦前药与肿瘤结合并被激活，它将以肿瘤依赖性的方式有效交联并激活T细胞或NK细胞表达的共刺激受体，以增强T细胞或NK细胞的活性，这些T细胞或NK细胞通过其内源性T细胞或NK细胞激活受体对任何肿瘤抗原作出反应。这些T细胞或NK细胞共刺激受体的激活依赖性将使激活的多特异性前体药物的活性集中于肿瘤特异性T细胞，而不激活独立于其抗原特异性的所有T细胞。
本发明的一个实施方式是针对以T细胞过度刺激为特征的疾病的多特异性可激活抗体，例如但不限于自身免疫性疾病或炎症性疾病微环境。所述前药包括针对靶点的抗体，例如IgG或scFv，所述靶点包含在自身免疫或炎症疾病中T细胞靶向的组织中表达的表面抗原，以及针对T细胞或NK细胞表面表达的抑制性受体的抗体，例如IgG或scFv，其中所述T细胞或NK细胞抑制抗体被掩蔽。抑制性受体的示例包括但不限于BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK表达的KIR。自身免疫疾病中T细胞靶向的组织抗原的实例包括但不限于在多发性硬化症中在髓鞘或神经细胞上表达的表面抗原，或在1型糖尿病中在胰岛细胞上表达的表面抗原。在该实施方式中，前药定位于处于自身免疫攻击或炎症的组织，由活化剂激活，并与T细胞或NK细胞抑制受体共同结合，以抑制通过其内源性TCR或激活受体对任何疾病组织靶向抗原作出反应的自反应性T细胞的活性。
专利WO2015/013671中列出了本发明药物中包含的结合部分的其他非限制性示例性主要靶点，其内容通过引用并入本文。
在另一个实施方式中，此药物为掩蔽疫苗，其可在体内的所需时间和/或所选位置(例如皮下和/或淋巴结附近)被揭穿。在另一个实施方式中，药物是掩蔽抗原，例如，掩蔽肽，其任选地存在于主要组织相容性复合体(MHC)中，并且可在身体中的所需时间和/或所选位置(例如皮下和/或淋巴结附近)揭穿。
此前药还可包含另一连接药物，其在靶向结合时通过蛋白酶、pH、硫醇或分解代谢释放。在Polakis，Pharmacol.Rev.2016，68，3-19中的抗体-药物结合物综述中提供了示例。本发明进一步设想，在揭开前药的一个或多个部分时，前药可诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。本发明还设想前药可诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，而不依赖于前药的一个或多个部分的揭开。
一些实施方式使用如所述的额外药物抗增殖/抗肿瘤剂、抗生素、细胞因子、抗炎剂、抗病毒剂、抗高血压剂、化学增敏剂、放射增敏剂、DNA损伤剂、抗代谢物、天然产物及其类似物。药物最好是蛋白质或抗体。
药物：
可用于与本发明相关的前药或可失活的药物中的药物(DD)是医药活性化合物。在优选实施方式中，医药活性化合物选自细胞毒素、抗增殖/抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗生素、抗炎剂、化学增敏剂、放射增敏剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗血管生成因子、，酶抑制剂。
在优选实施方式中，这些药物活性化合物选自于由抗体、抗体衍生物、抗体片段、蛋白质、适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖、碳水化合物以及肽、类蛋白、类固醇、毒素、激素、细胞因子、趋化因子所组成的群组。
在优选实施方式中，这些药物为低至中等分子量化合物，优选有机化合物(例如，约200至约2500Da，优选约300至约1750Da，更优选约300至约1000Da)。
用作TCO偶联物并在与活化剂发生IEDDA反应时释放的示例性细胞毒性药物类型，例如用于癌症治疗，包括但不限于DNA损伤剂、DNA交联剂、DNA粘合剂、DNA烷基化剂、DNA插层剂、DNA裂解剂、微管稳定剂和失稳剂，拓扑异构酶抑制剂、辐射增敏剂、抗代谢物、天然产物及其类似物、肽、寡核苷酸、酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂。
示例包括但不限于秋水仙碱、长春碱、蒽环类药物(例如阿霉素、表阿霉素、伊达柔比星、柔红霉素)、喜树碱、紫杉烷、紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春花碱、杯霉素、细管溶素、细管溶素M、隐藻素、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤、伊立替康、，烯二炔类、鹅膏苷类、德布加宁类、达卡霉素类、CC1065及其类似物、双碳霉素类、美坦辛类、美坦辛类、多拉他汀类、金盏花素类、吡咯苯二氮卓类和二聚体(PBDs)、吲哚苯二氮卓类和二聚体、吡啶苯二氮卓类和二聚体、丝裂霉素(如丝裂霉素C、丝裂霉素A、卡霉素)、美法仑、亮松香、亮松香、放线菌素、塔利霉素、列克次体霉素、博莱霉素、鬼臼毒素、足叶乙甙、足叶乙甙磷酸盐、staurosporin、esperamicin、蝶呤类药物、SN-38及其类似物、铂类药物、细胞毒性核苷。
其他示例性药物类别包括血管生成抑制剂、细胞周期进展抑制剂、P13K/m-TOR/AKT通路抑制剂、MAPK信号通路抑制剂、激酶抑制剂、蛋白质伴侣抑制剂、HDAC抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号通路抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。
auristatin的示例包括多拉他汀10(dolastatin 10)、一甲基auristatin E(MMAE)、auristatin F、一甲基auristatin F(MMAF)、auristatin F羟丙酰胺(AF HPA)、auristatin F苯二胺(AFP)、auristatin D(MMAD)、auristatin PE、auristatin EB、auristatin EFP、auristatin TP和auristatin AQ。美国公开2003/0083263、2011/0020343和2011/0070248中也描述了合适的auristatin；PCT申请公告编号：WO09/117531、WO2005/081711、WO04/010957；WO02/088172和WO01/24763，以及美国专利号7498298；6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,124,431；6,034,065；5,780,588；5,767,237；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,879,278；4,816,444；以及4486414，其全部披露内容通过引用并入本文。
示例性药物包括多司他丁(dolastatin)及其类似物，包括：多司他丁A(美国专利号4486414)、多司他丁B(美国专利号4486414)、多司他丁10(美国专利号4486444、5410024、5504191、5521284、5530097、5599902、5635483、5663149、5665860、5780588、6034065、6323315)，多拉司他丁13(美国专利号4986988)、多拉司他丁14(美国专利号5138036)、多拉司他丁15(美国专利号4879278)、多拉司他丁16(美国专利号6239104)、多拉司他丁17(美国专利号6239104)和多拉司他丁18(美国专利号6239104)，每项专利均通过引用完整并入本文。
美国专利号4424219中描述了示例性的美坦辛烯、美坦辛烯类化合物(如DM-1和DM-4)或美坦辛烯类类似物，包括美坦辛醇和美坦辛醇类似物；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；5,208,020；5,416,064；5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,333,410；6,441,163；6716821和7276497。其他例子包括美坦辛(mertansine)和安萨米霉素(ansamitocin)。
明确包括二聚体和类似物的吡咯苯并二氮杂卓(PBD)包括但不限于Denny，Exp.Opin.Ther.Patents，10(4)：459-474(2000)；Hartley等人，Opin InvestigDrugs.2011，20(6)：733-44；Antonow等人，Chem Rev.2011,111(4),2815-64中描述的那些。文献中描述了典型的吲哚苯二氮卓类化合物。文献中描述了典型的吡啶基苯二氮卓类化合物。
Calicheamicins包括enediynes、esperamicin以及美国专利号5714586和5739116中所述的药物。
双卡霉素及其类似物的实例包括CC1065、双卡霉素SA、双卡霉素A、双卡霉素B1、双卡霉素B2、双卡霉素C1、双卡霉素C2、双卡霉素D、双卡霉素DU-86、KW-2189、阿多霉素、比泽林、卡泽林、塞科-阿多霉素、CPI、CBI。其他示例包括，例如，美国专利号5070092；5,101,092；5,187,186；5,475,092；5,595,499；5,846,545；6,534,660；6,548,530；6,586,618；6,660,742；6,756,397；7,049,316；7,553,816；8,815,226；US20150104407；2014年5月2日提交的61/988011和2014年6月11日提交的62/010972；其中每一项的披露全部并入本文。
示例性长春新碱包括长春新碱、长春花碱、长春花碱和长春花碱，以及在美国公开号2002/0103136和2010/0305149以及美国专利号7303749中公开的那些，其全部公开内容通过引用并入本文。
示例性埃博噻隆化合物包括埃博噻隆A、B、C、D、E和F及其衍生物。例如，美国专利号6956036中描述了合适的埃博噻隆化合物及其衍生物；6,989,450；6,121,029；6,117,659；6,096,757；6,043,372；5,969,145；5886026；和WO97/19086；WO98/08849；WO98/22461；WO98/25929；WO98/38192；WO99/01124；WO99/02514；WO99/03848；WO99/07692；WO99/27890；和WO99/28324；其披露内容全部通过引用并入本文。
美国专利号6680311和6747021中描述了示例性隐藻毒素化合物；其披露内容全部通过引用并入本文。典型的铂化合物包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、依普罗铂、奥马铂、四铂。示例性DNA结合或烷基化药物包括CC-1065及其类似物、蒽环类、卡利霉素、达卡霉素、二尖瓣霉素、吡咯苯二氮卓类、吲哚苯二氮卓类、吡啶苯二氮卓类等。示范性微管稳定和失稳剂包括紫杉烷化合物，例如紫杉醇、多西紫杉醇、特西紫杉醇和卡巴唑；美檀素类、金盏花素及其类似物、长春花生物碱衍生物、埃坡霉素和隐藻素。示例性拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱和喜树碱衍生物、喜树碱类似物和非天然喜树碱，例如，CPT-11、SN-38、拓扑替康、9-氨基喜树碱、rubitecan、gimatecan、karenitecin、silatecan、lurtotecan、exatecan、diflometotecan、belotecan、lurtotecan和S39625。可用于本发明的其他喜树碱化合物包括例如J.Med中所述的化合物。化学。，29:2358-2363(1986)；医学博士。化学。，23:554(1980)；J.医学化学。，30:1774(1987).血管生成抑制剂包括但不限于MetAP2抑制剂、VEGF抑制剂、PIGF抑制剂、VGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、MetAP2抑制剂。典型的VGFR和PDGFR抑制剂包括索拉非尼、舒尼替尼和瓦他拉尼。示范性MetAP2抑制剂包括富马吉洛类似物，即包括富马吉林核心结构的化合物。示例性细胞周期进展抑制剂包括CDK抑制剂，例如BMS-387032和PD0332991；Rho激酶抑制剂，例如AZD7762；极光激酶抑制剂，例如AZD1152、MLN8054和MLN8237；PLK抑制剂，例如BI 2536、BI6727、GSK461364、ON-01910；以及KSP抑制剂，例如SB743921、SB 715992、MK-0731、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。示例性P13K/m-TOR/AKT信号通路抑制剂包括磷酸肌醇3-激酶(P13K)抑制剂、GSK-3抑制剂、ATM抑制剂、DNA-PK抑制剂和PDK-1抑制剂。示例性P13激酶在美国专利号6608053中公开，包括BEZ235、BGT226、BKM120、CAL263、去甲氧基病毒肽、GDC-0941、GSK615、IC87114、LY294002、Palomid529、perifosine、PF-04691502、PX-866、SAR245408、SAR245409、SF1126、Wortmannin、XL147和XL765。示例性AKT抑制剂包括但不限于AT7867。典型的MAPK信号通路抑制剂包括MEK、Ras、JNK、B-Raf和p38 MAPK抑制剂。美国专利号7517944中公开了示例性MEK抑制剂，包括GDC-0973、GSK1120212、MSC1936369B、AS703026、RO5126766和RO4987655、PD0325901、AZD6244、AZD8330和GDC-0973。示例性B-raf抑制剂包括CDC-0879、PLX-4032和SB590885。示例性Bp38 MAPK抑制剂包括BIRB796、LY2228820和SB 202190。典型的受体酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于AEE788(NVP-AEE 788)、BIBW2992(阿法替尼)、拉帕替尼、厄洛替尼(塔尔塞瓦)、吉非替尼(伊瑞沙)、AP24534(波那替尼)、ABT-869(利尼替尼)、AZD2171、CHR-258(多维替尼)、舒尼替尼(苏坦)、索拉非尼(奈沙瓦)和瓦他利尼。典型的蛋白质伴侣抑制剂包括HSP90抑制剂。示例性抑制剂包括17AAG衍生物、BIIB021、BIIB028、SNX-5422、NVP-AUY-922和KW-2478。典型的HDAC抑制剂包括Belinostat(PXD101)、CUDC-101、Droxinostat、ITF2357(Givinostat、Gavinostat)、JNJ-26481585、LAQ824(NVP-LAQ824、Dacinostat)、LBH-589(Panobinostat)、MC1568、MGCD0103(Mocetinostat)、MS-275(Entinostat)、PCI-24781、焦沙胺(NSC 696085)、SB939、曲菌抑素A和伏立诺stat(SAHA)。示例性PARP抑制剂包括伊尼帕利(BSI 201)、奥拉帕利(AZD-2281)、ABT-888(Veliparib)、AG014699、CEP9722、MK 4827、KU-0059436(AZD2281)、LT-673、3-氨基苯甲酰胺、A-966492和AZD2461。典型的Wnt/Hedgehog信号通路抑制剂包括vismodegib、环丙胺和XAV-939。典型的RNA聚合酶抑制剂包括阿马毒素。典型的鹅膏毒素包括α鹅膏毒素、β鹅膏毒素、γ鹅膏毒素、埃塔鹅膏毒素、鹅膏蛋白、鹅膏酸、鹅膏酰胺、鹅膏酮和鹅膏蛋白原。典型的免疫调节剂包括APRIL、细胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、干扰素γ、GMCSF、NDV-GMCSF，以及STING的激动剂和拮抗剂、TLR的激动剂和拮抗剂，包括TLR1/2、TLR3、TLR4、TLR7/8、TLR9、TLR12、GITR的激动剂和拮抗剂、CD3、CD28、CD40、PD1、PDL1、RIG、，MDA-5、NLRP1、NLRP3、AIM2、IDO、MEK、cGAS和CD25、NKG2A。其他示例性药物包括嘌呤霉素、托贝替康、根霉素、棘球霉素、Combrestatin、netropsin、estramustine、cemadotin、discodermolide、eleutherobin、米托蒽醌、吡咯苯并咪唑(PBI)、γ-干扰素、Thialanostatin(A)和类似物、CDK11、免疫毒素，包括例如蓖麻毒素A、白喉毒素、霍乱毒素。
在本发明的示例性实施方式中，药物部分是密托霉素化合物、长春花生物碱化合物、紫杉醇或类似物、蒽环类化合物、卡利霉素化合物、美坦西诺类化合物、金盏花素化合物、杜卡霉素化合物、SN38或类似物、吡咯苯并氮杂卓化合物、吲哚苯并氮杂卓化合物，吡啶基苯二氮卓化合物、微管溶素化合物、非天然喜树碱化合物、DNA结合药物、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、P13激酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或其类似物。
在一个优选实施方式中，该药物为非天然喜树碱化合物、长春花生物碱、激酶抑制剂(例如P13激酶抑制剂：GDC-0941和PI-103)、MEK抑制剂、KSP抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、PARP抑制剂、多西紫杉醇、紫杉醇、多柔比星、多拉他汀、杯霉素、SN38、吡咯苯二氮卓、，吡啶基苯二氮卓类、吲哚苯并二氮卓类、DNA结合药物、美坦辛类DM1和DM4、auristatin MMAE、CC1065及其类似物、喜树碱及其类似物、SN-38及其类似物。
在另一个优选实施方式中，药物选自DNA结合药物和微管试剂，包括吡咯苯并二氮杂卓类、吲哚苯并二氮杂卓类、吡啶苯二氮杂卓类、美坦辛类、美坦辛类、金司他丁类、微管溶素类、双碳霉素类、蒽环类、紫杉烷类。在另一个优选实施方式中，该药物选自秋水仙碱、长春碱、微管溶素、伊立替康、抑制肽、鹅膏苷和德布加宁。
在另一优选实施方式中，药物为放射性部分，所述部分包含用于放射治疗的放射性同位素。用于治疗的放射性核素最好是从24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra,225Ac及227Th。
当放射性部分旨在包含金属(例如177Lu)时，该放射性部分优选以螯合物的形式提供。在这种情况下，放射性部分优选包括能够与这种金属形成配位络合物的结构部分。本文的一个很好的例子是从1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(H4dota)衍生的大环镧系(III)螯合物。
在优选实施方式中，所述部分是从DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"-tetraacetic acid)、NOTA(1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid)、TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'-tetraacetic acid)、OTTA(N1-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine-N1,N2,N3,N3-tetraacetic acid)、去铁胺或DFO(N'-[5-[[4-[[5-(acetylhydroxyamino)pentyl]amino]-1,4-dioxobutyl]hydroxyamino]pentyl]-N-(5-aminopentyl)-N-hydroxybutanediamide)和HYNIC(肼酰亚胺)、DOTAM、TACN、石棺、3,4-霍珀基螯合剂组成的组中选择的螯合部分。
在其他实施方式中，放射性部分包含由非金属放射性核素(例如131I)结合的前列环基团(即苯酚)。
在另一实施方式中，使用两种或两种以上不同药物的组合。在优选实施方式中，释放的药物本身是设计用于释放进一步药物的前药。在优选实施方式中，释放的药物本身是设计成与另一部分(例如另一前药)偶联以形成活性药物的前药。在优选实施方式中，药物在触发物与活化剂反应后提高了治疗效果。在一些实施方式中，药物在触发物与活化剂反应后降低了治疗效果。
药物任选地包括(a部分)膜易位部分(例如金刚氨酸、聚赖氨酸/精氨酸、TAT、人乳铁蛋白)和/或靶向剂(针对例如肿瘤细胞受体)，任选地通过稳定或不稳定的连接物连接。典型参考文献包括：生物化学科学趋势(Trends in Biochemical Sciences),2015,.40,12,749；J.Am.Chem.Soc.2015,137,12153-12160；Pharmaceutical Research,2007,24,11,1977)。
将进一步理解，除了可连接到触发物或连接器LC的一个或多个靶向剂(或CB)之外，靶向剂TT可任选地通过间隔基SP连接到药物。在一些实施方式中，在触发物与活化剂反应后，附着于药物的所述TT的靶向效力增加，其中优选所述药物为CB，其中优选所述活化剂包含TT，其中任选地，所述活化剂中包含的所述TT的靶向效力在触发物与活化剂反应后增加。
或者，将进一步理解，靶向剂(或CB)可包含一种或多种通过其他类型的连接物结合到靶向剂的额外药物，例如可通过蛋白酶、pH、硫醇或分解代谢进行切割。
本发明进一步设想，当靶向剂是适当选择的抗体或抗体衍生物时，该靶向剂可诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
几种药物可包含或被可成像标记取代，以测量药物靶向性和释放。
应理解，也可对所需化合物进行化学修饰，以使该化合物的反应更方便，从而制备本发明的偶联物。
含有用于偶联到TCO的胺官能团的药物包括丝裂霉素C、丝裂霉素A、柔红霉素、阿霉素、氨基蝶呤、放线菌素、博莱霉素、9-氨基喜树碱、N8乙酰亚精胺、1-(2氯乙基)1,2-二甲基磺酰肼、塔利霉素、阿糖胞苷、多拉他汀(包括金司他丁)及其衍生物。
含有羟基官能团以偶联到TCO的药物包括足叶乙甙、喜树碱、紫杉醇、依斯帕米星、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三碳-4-9-二烯-2,6-二炔-13-酮(美国专利号5198560)、鬼臼毒素、胍、长春新碱、长春花碱、吗啉-阿霉素、n-(5-二乙酰氧基-戊基)阿霉素及其衍生物。含有巯基官能团以偶联到TCO的药物包括依散霉素和6-甲卡普尿苷及其衍生物。
可以理解的是，药物可以通过自分解连接剂LC或其组合选择性地连接到TCO衍生物，并且可以由多个(自分解或非自分解)单元组成。
根据本发明的另一个具体实施方式，选择前药以靶向和/或治疗疾病，例如癌症、炎症、感染、心血管疾病，例如血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧部位，例如中风、肿瘤、心血管疾病、脑疾乱、凋亡、血管生成、器官、，和报告基因/酶。
在前药中，构建体A和TCO衍生物可以直接相互连接。它们也可以通过链接器或自分解链接器彼此绑定。应当理解，本发明包括亲双烯TCO连接到构象-A的任何可想象方式。在优选实施方式中，构象-A是药物。本领域技术人员已知影响与这些药物结合的方法，例如在蛋白质的情况下通过赖氨酸或半胱氨酸等反应性氨基酸。
标记：
式(19)化合物优选包含能够提供所需诊断、成像和/或放射治疗效果的标记。
在优选实施方式中，标记选自以下组：MRI可成像结构、包含自旋标记的部分、包含光学标记的部分、超声响应结构、X射线响应部分、包含放射性核素的部分、荧光染料、发光染料、FRET染料、顺磁离子、，超顺磁性粒子和肽。
尤其是对于成像应用，优选标记为可检测标记。本文使用的“可检测标记”涉及式(19)化合物的一部分，其允许在存在于细胞、组织或生物体中时检测式(19)化合物。在本发明的上下文中设想的一种可检测标记是对比度提供标记。在本发明的上下文中设想了不同类型的可检测标记，并在下文中描述。
因此，根据本发明的特定实施方式，本发明的化合物、组合、试剂盒和方法用于成像，尤其是医学成像。为了识别主要目标和/或评估式(19)化合物的生物分布，使用可检测标记。
用于成像的优选可检测标记是在传统成像系统中使用的对比度提供部分，例如MRI可成像结构、包含自旋标记的部分、包含光学标记的部分、超声响应结构、X射线响应部分、包含放射性核素、(生物)发光和FRET型染料的部分。
此外，在本发明的上下文中设想的优选可检测标记包括但不一定限于荧光分子，例如自荧光分子、与试剂接触时发出荧光的分子、放射性部分或络合物；生物素，例如，通过亲和素结合生物素来检测；荧光标记、包含顺磁性金属的MRI成像结构、成像试剂，例如美国专利中所述的试剂。编号4741900和5326856)等。
优选地，包含在成像标记中的放射性核素是从3H、11C、13N、15O、18F、19F、44Sc、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、and 203Pb。更优选地，包含在成像标记中的放射性核素是从18F、44Sc、64Cu、68Ga、89Zr、99mTc、111In、123I、124I组成的组中选择的同位素。
其他元素和同位素，例如用于治疗的元素和同位素，也可用于某些应用中的成像。
在优选实施方式中，MRI可成像部分为顺磁离子或超顺磁粒子。顺磁离子优选地是选自Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl组的元素。超声响应部分可包含微气泡，其外壳由磷脂和/或(可生物降解)聚合物组成，和/或人血清白蛋白。微气泡可以充满氟化气体或液体。
X射线响应部分包括但不限于碘、钡、硫酸钡、胃格拉芬，或可包括填充有碘化合物和/或硫酸钡的囊泡、脂质体或聚合物胶囊。
此外，在本发明的上下文中设想的可检测标记还包括可通过抗体结合来检测的肽或多肽，例如，通过结合可检测的标记抗体或通过三明治型分析检测结合抗体。在一个实施方式中，可检测标记包括小尺寸有机PET和SPECT放射性同位素，例如18F、11C、123I或124I。由于体积小，有机PET或SPECT放射性同位素非常适合监测细胞内事件，因为它们一般不会对靶向剂的性质，尤其是其膜转运产生很大影响。
在优选实施方式中，尤其是当式(19)化合物用于治疗应用时，所述标记为治疗标记，所述标记包含用于放射治疗的放射性同位素。用于治疗的放射性核素最好是从24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th。更优选地，包含在治疗标记中的放射性核素是从90Y、111In、131I、177Lu、186Re、188Re、211At、212Pb、213Bi、225Ac及227Th组成的组中选择的同位素。
当标记旨在包含金属时，例如用于SPECT成像的111In，优选以螯合物的形式提供。在这种情况下，标记优选包括能够与这种金属形成配位络合物的结构部分。本文的一个很好的例子是从1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(H4dota)衍生的大环镧系(III)螯合物。
在优选实施方式中，标记是从以下组成的组中选择的：一组包括以下组成的组：或-OR37、-N(R37)2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、C1-C24烷基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24烷基、C24杂芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(杂)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(杂)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基和C4-C24环烷基；R37基团、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、环烷烷基所含的烷基环烷基被选自于由3H、11C、13N、15O、18F、19F、44Sc、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、203Pb、24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th所组成的群组的至少一种同位素取代及/或螯合；并且任选地进一步被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37和-SR37所组成的群组中的一个或多个杂原子取代，并且任选地包含选自由O、S、NR37、P和Si组成的组中的一个或多个杂原子，P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在另一优选实施方式中，标记是从以下组成的群组中选择的，包括：-OR37、-N(R37)2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C12环烷基、C5-C12烷基、C12杂芳基、C3-C12(杂)芳基(环)烷基、C4-C12(杂)烯基(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基(环)烯基、C4-C12(杂)炔基(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基(环)炔基、C4-C12烷基环烷基和C4-C12环烷基；R37基团、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、环烷烷基所含的烷基环烷基被选自于由3H、11C、13N、15O、18F、19F、44Sc、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、203Pb、24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th所组成的群组的至少一种同位素取代及/或螯合；并且任选地进一步被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37和-SR37组成的群组中的一个或多个杂原子取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P和Si所组成的群组中的一个或多个杂原子，并且P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，每个标记独立地选自于由以下所组成的群组：-OR37、-N(R37)2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6芳基、C2-C6杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C8环炔基、C3-C6(环)烷基(杂)芳基、C3-C6(杂)芳基(环)烷基、C4-C6(环)烯基(杂)芳基、C4-C6(杂)芳基(环)烯基、C4-C6(环)炔基(杂)芳基、C4-C6(杂)芳基(环)炔基、C4-C6烷基环烷基和C4-C6环烷基烷基；R37基团、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、环烷烷基所含的烷基环烷基被选自由3H、11C、13N、15O、18F、19F、44Sc、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、203Pb、24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th所组成的群组的至少一种同位素取代及/或螯合；并且任选地进一步被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37和-SR37组成的群组中的一个或多个杂原子取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P和Si所组成的群组中的一个或多个杂原子，并且P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，标记源自假肢组。本领域技术人员将理解，假肢组是可以用放射性核素(如131I)进行放射性标记从而形成标记的前体。
在另一优选实施方式中，标记选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C12-C12环炔基、C3-C12(环)烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基(环)烷基、C4-C12(杂)烯基(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基(环)烯基、C4-C12(杂)炔基(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基(环)炔基、C4-C12烷基环烷基和C4-C12环烷基；所述基团包括从3H、11C、13N、15O、18F、19F、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、120I、123I、124I、125I、32P、33P、131I、211At所组成的群组中选择的至少一种同位素，并且任选地进一步被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37和-SR37组成的群组中的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组中的一个或多个杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，标记包含螯合部分。在优选实施方式中，标记是从DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N，N'，N'，N”-四乙酸)的偶联物组成的组中选择的螯合部分，多塔加酸酐(2,2′，2“-(10-(2,6-二氧三氢-2H-吡喃-3-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸)，NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N，N'，N'-三乙酸)，TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N，N'，N'，N'-四乙酸)，OTTA(N1-(对异硫氰酸苯基)-二乙烯三胺-N2，N3，N3)，去铁胺或DFO(N'-[5-[4-[5-(乙酰羟胺基)戊基]氨基]-1,4-二氧丁基]羟胺基]戊基]-N-(5-氨基戊基)-N-羟基丁二酰胺)和DFO衍生物DFO*，以及HYNIC(肼酰亚胺)；螯合部分螯合选自于由44Sc、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113In、114In、117Sn、122Xe、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、203Pb、24Na、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th所组成的群组的金属。
在优选实施方式中，金属螯合物包含乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙二胺四乙酸(DTPA)的无环衍生物：
Figure BDA0003509271520001131
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一优选实施方式中，金属螯合物包含含有羧基吡啶基团的无环螯合剂：
Figure BDA0003509271520001141
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一优选实施方式中，金属螯合物包含1,4,7,10-四氮十二烷(1,4,7,10-tetraazadodecane)(环烯)的环衍生物：
Figure BDA0003509271520001142
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一优选实施方式中，金属螯合物包含1,4,7-三氮杂环壬烷(1,4,7-triazacyclononane)(TACN)的衍生物：
Figure BDA0003509271520001151
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一个优选实施方式中，金属螯合物包含含有N和O杂原子的大环螯合剂：
Figure BDA0003509271520001152
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一个优选实施方式中，金属螯合物包含隐匿剂石棺剂(cryptand agentsarcophagine)(Sar)的衍生物：
Figure BDA0003509271520001161
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一优选实施方式中，金属螯合物包含含有异羟肟基的线性或环状螯合剂：
Figure BDA0003509271520001162
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在又一优选实施方式中，金属螯合物包含含有3-羟基-4-吡啶酮(3,4-HOPO)基团和衍生物的线性或环状螯合剂：
Figure BDA0003509271520001163
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在另一个优选实施方式中，金属螯合物包含含有N、S和P杂原子的线性或环状螯合剂：
Figure BDA0003509271520001171
，其中虚线表示与分子M其余部分的键，M表示从99mTc、186Re和188Re组成的组中选择的放射性核素。
在另一优选实施方式中，金属螯合物包含甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和丙氨酸残基：
Figure BDA0003509271520001172
，其中虚线表示与分子M其余部分的键，M表示从99mTc、186Re和188Re组成的组中选择的放射性核素。
在另一个优选实施方式中，金属螯合物包含肼酮酸衍生物(HYNIC)和共配体：
Figure BDA0003509271520001181
，其中虚线表示与分子M其余部分的键，M表示从99mTc、186Re和188Re组成的组中选择的放射性核素。
在另一优选实施方式中，螯合物包含羰基和含有N、O和S杂原子或环戊二烯基的螯合剂：
Figure BDA0003509271520001182
，其中虚线表示与分子M其余部分的键，M表示从99mTc、186Re和188Re组成的组中选择的放射性核素。
在本发明的一些优选实施方式中，标记包含18F，并且可由技术人员基于使用已知标记的合成子或假肢基团的已知合成路线来制备。含有18F标记的几个非限制性示例如下所示：
Figure BDA0003509271520001191
，其中虚线表示与分子其余部分的键。
在本发明的优选实施方式中，标记包含从123I、124I、125I、131I和211At组成的组中选择的至少一种同位素；由技术人员基于已知的合成路线使用假肢基团合成。下面描述了此类标记的几个优选实施方式：
Figure BDA0003509271520001192
，其中虚线表示与分子其余部分的键，X表示123I、124I、125I、131I或211At。
在本发明的又一优选实施方式中，标记包含从123I、124I、125I、131I及211At组成的组中选择的至少一种同位素；由技术人员基于已知的合成路线，使用十硼酸氯(2-)基合成：
Figure BDA0003509271520001201
其中虚线表示与分子其余部分的键，X表示123I、124I、125I、131I或211At。
给药剂(Administration Agent)：
给药剂可以是希望用成像或放射治疗标记对其进行修改并且希望在注射后的特定时间移除其成像或放射治疗标记的任何构造。在对受试者(尤其是人类受试者)体内的某个部位(如肿瘤)进行靶向成像和放射治疗的情况下尤其如此。唯一的要求是，它可以提供一个触发物TR，它是标记的进一步链接器。触发物与给药剂的精确连接将取决于两者的分子结构，但应注意的是，这通常不会对本领域技术人员提出特别的挑战，因为存在许多已证实的用于各种生物分子的共轭方法和连接部分。所述连接可以任选地经由诸如聚乙二醇(PEG)链的间隔基。
通常，给药剂可以绑定到本文定义的主目标。所述主要靶点可以是靶向剂结合的靶点，也可以是药物发挥作用的治疗靶点。在优选实施方式中，主要靶点为治疗靶点，靶向剂为药物并结合所述主要靶点。
在优选实施方式中，给药剂是如本文所定义的靶向代理。
优选地，给药剂选自由蛋白质、类肽和肽组成的组。最优选地，给药剂是抗体。
在另一优选实施方式中，给药剂选自抗体、抗体药物结合物、抗体衍生物、抗体片段、蛋白质、聚合物、聚合物药物结合物、含药物的脂质体和多聚体、纳米粒、微粒、适配子、寡肽、寡核苷酸、，寡糖、碳水化合物以及肽、类肽、类固醇、毒素、激素、细胞因子和趋化因子。
在其他优选实施方式中，给药剂等同于靶向剂，并且靶向剂用治疗性放射性同位素进行放射性标记，以便将治疗性辐射靶向表达主要靶点的组织。
在其他优选实施方式中，给药剂等于靶向剂，并且靶向剂用诊断放射性同位素进行放射性标记，以便成像表达主要靶点的组织。
在优选实施方式中，给药剂是抗体，更优选包含FcRn结合域的抗体，更优选完整IgG抗体。
在其他优选实施方式中，给药剂是包含白蛋白结合部分的抗体。在其他优选实施方式中，给药剂是包含白蛋白结合部分的蛋白质。在其他优选实施方式中，给药剂等于药物。在其他优选实施方式中，给药剂等同于药物，并且为了成像体内药物分布，使用本发明标记药物。
可用于与本发明有关的给药剂中的药物是药学活性化合物，例如抗体、抗体-药物结合物、抗体衍生物、抗体片段、蛋白质、生物分子、聚合物-药物结合物、含药物的脂质体和聚合物体、适配体、寡肽、寡核苷酸、，寡糖、碳水化合物以及肽、类肽、类固醇、毒素、激素、细胞因子和趋化因子。可使用的其他药物为低至中等分子量化合物，优选有机化合物(例如，约200至约2500Da，优选约300至约1750Da，更优选约300至约1000Da)。
在优选实施方式中，医药活性化合物或药物选自细胞毒素、抗增殖/抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗生素、抗炎剂、化学增敏剂、放射增敏剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗血管生成因子、，和酶抑制剂。
在其他优选实施方式中，药物被设计为在中枢神经系统中起作用，例如在阿尔茨海默病和帕金森病的情况下，例如针对β淀粉样蛋白和Tau蛋白的抗体。
例如用于癌症治疗的示例性细胞毒性药物类型包括但不限于DNA损伤剂、DNA交联剂、DNA粘合剂、DNA烷基化剂、DNA插层剂、DNA裂解剂、微管稳定剂和失稳剂、拓扑异构酶抑制剂、辐射增敏剂、抗代谢物、，天然产物及其类似物、肽、寡核苷酸、酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂。
示例性免疫调节剂是针对PD-L1、PD-1、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3、B7H4、Vista、CTLA-4、APRIL、细胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TNF、干扰素γ、GMCSF、NDV-GMCSF，以及STING的激动剂和拮抗剂、TLR的激动剂和拮抗剂，包括TLR1/2、TLR3、TLR4、TLR7/8、TLR9、TLR12、GITR、CD3、CD28、CD40、CD74、CTLA4、OX40、PD1、PDL1、RIG、MDA-5、NLRP1、NLRP3、AIM2、IDO、MEK、cGAS和CD25、NKG2A的激动剂和拮抗剂。
应当理解，也可以对给药剂进行化学修饰，以使该化合物的反应更方便，从而制备本发明的偶联物。
在优选实施方式中，在与式(19)化合物的剩余物共轭之前的给药剂包含选自-OH、-NHR'、-CO2H、-SH、-S-S-、-SCH3--N3、末端炔基、末端烯基、-C(O)R'，C8-C12(杂)环炔基、硝酮、腈氧化物、(亚氨基)悉尼酮、异腈和(oxa)降冰片烯四嗪，其中R'等于R37，所述部分用于共轭到包含亲二烯烃、标记和R32的部分，以形成满足式(19)的化合物，并包含CM2或CX部分。
在优选实施方式中，给药剂通过选自胺、酰胺、硫代酰胺、氨基氧基、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲、磺酰胺和磺胺甲酸酯的CM2与式(19)化合物的剩余部分结合。在优选实施方式中，CM2等于本文定义的R10。优选地，如上文关于CM2和CX所述耦合给药剂。
优选地，使用与式(19)相同的其他部分修饰给药剂，优选抗体，但这些其他部分不包含给药剂(因为第一次提到的给药剂已经偶联到所述部分)。在优选实施方式中，给药剂(优选抗体)在1至8个位置、更优选1至6个位置、甚至更优选1至4个位置与本段中定义的其他部分偶联。
关于式(19)化合物的进一步实施方式
在优选实施方式中，在本发明化合物中，给药剂包含抗体，且优选给药剂为抗体。
在优选实施方式中，在本发明化合物中，标记是放射性标记，优选螯合放射性同位素的螯合部分。
二烯(Diene)：
根据本发明的组合包含根据式(19)的化合物和二烯，优选四嗪。在优选实施方式中，所述组合为试剂盒的形式。
根据本发明的四嗪化合物在本文中可称为“活化剂”。四嗪通常与另一个生物正交反应基团反应，即亲二烯(见上文)。选择活化剂的二烯，以便能够通过进行Diels-Alder环加成反应，然后进行逆Diels-Alder反应，从而与TCO的亲二烯反应，得到IEDDA加合物。然后，该中间加合物释放结构-A，该释放可由与IEDDA加合物的特定分子结构相关的各种情况或条件引起。
用于从式(19)结构释放一个或多个部分R48的化合物在本文中称为活化剂。
在优选实施方式中，活化剂为四嗪。四嗪是二烯，对亲二烯具有高度反应性，尤其是TCO结构(见上文)。选择活化剂的二烯，以便能够通过经历Diels-Alder环加成反应，然后进行逆Diels-Alder反应，从而与亲二烯烃(例如TCO)反应，得到IEDDA加合物。然后，这种中间加合物释放结构-A。
基于本领域的标准知识，本领域技术人员通常可以容易地获得四嗪的合成路线。四嗪合成路线的参考文献包括Lions等人,J.Org.Chem.,1965,30,318-319；Horwitz等人,J.Am.Chem.Soc.,1958,80,3155-3159；Hapiot等人,New J.Chem.,2004,28,387-392；Kaim等人,Z.Naturforsch.,1995,50b,123-127；Yang等人,Angew.Chem.2012,124,5312-5315；Mao等人,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,1106-1109；Qu等人Angew.Chem.Int.Ed.2018,57,12057-12061；Selvaraj等人,Tetrahedron Lett.2014,55,4795-4797；Fan等人,Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,14046-14050。
优选地，活化剂是满足式(4)的四嗪，并且优选地包括其医药上可接受的盐：
Figure BDA0003509271520001241
其中每个部分Q1和Q2独立地选自于由以下所组成的群组：
氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基及环烷基烷基。
在式(4)中，非H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3的Q1和Q2基团任选地被取代，优选地用选自-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37和-SR37的基团中的部分取代，以及任选地包含一个或多个选自O、S、NR37、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。优选地，每个单独的Q1和Q2基团包含最多4个取代基，更优选地最多3个取代基，甚至更优选地最多2个取代基，以及最优选地最多1个取代基。
在式(4)中，Q1和Q2基团任选地结合至聚合物、颗粒、肽、类肽、树状大分子、蛋白质、适体、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、脂质、类固醇、脂质体、靶向剂TT、R87、白蛋白结合部分和螯合部分、包含放射性核素的部分或药物DD。
在式(4)中，优选地，部分Q1和Q2中的至少一个不是氢。
在式(4)中，优选地，每个部分Q1和Q2独立地选自氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基和C4-C24环烷基烷基。
在优选的实施方式中，不是氢的Q1和Q2基团未被取代。
在一个优选的实施方式中，式(4)中的Q1和Q2选自氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C8烷基、C2-C8烯基,C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基。
在一个优选的实施方式中，式(4)中的Q1和Q2选自氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C10烷基环烷基、C4-C10环烷基烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基和C5-C10(杂)芳基环烷基。
在一个优选的实施方式中，式(4)中的Q1和Q2选自氢、C1-C8烷基、苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、2,5-嘧啶基、3,5-嘧啶基和2,4-嘧啶基；Q1和Q2不是氢，任选被选自-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基,C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环o)炔基、C4-C24烷基环烷基和C4-C24环烷基烷基；优选具有选自-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基；更优选具有选自-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3 -、-NO2、-CF3、-SR37、S(＝O)2N(R37)2、OC(＝O)R37、SC(＝O)R37、OC(＝S)R37、SC(＝S)R37、NR37C(＝O)-R37、NR37C(＝S)-R37、NR37C(＝O)O-R37、NR37C(＝S)O-R37、NR37C(＝O)S-R37、NR37C(＝S)S-R37、OC(＝O)N(R37)2、SC(＝O)N(R37)2、OC(＝S)N(R37)2、SC(＝S)N(R37)2、NR37C(＝O)N(R37)2、NR37C(＝S)N(R37)2、C(＝O)R37、C(＝S)R37、C(＝O)N(R37)2、C(＝S)N(R37)2、C(＝O)O-R37、C(＝O)S-R37、C(＝S)O-R37、C(＝S)S-R37、S(O)R37、-S(O)2R37、NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基烷基、C4-C10烷基环烷基、C4-C10环烷基烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基和C5-C10(杂)芳基环烷基。
在优选实施方式中，在式(4)中：
(a)Q1和Q2独立地选自2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基；
(b)Q1选自2,6-嘧啶、2,5-嘧啶、3,5-嘧啶和2,4-嘧啶；Q2为(杂)烷基；或
(c)Q1是苯基，Q2是氢；
(d)Q1为苯基，Q2为苯基；
(e)Q1为苯基，Q2为C1-C8烷基；
(f)Q1和Q2为C1-C8烷基；
在(a)-(f)中，所有不属于氢的Q1和Q2都被上一段中定义的选择性取代。
在优选实施方式中，活化剂可以是多聚体化合物，其包含如本文所定义的多个二烯。这些多聚体化合物包括但不限于生物分子、蛋白质、肽、类蛋白、聚合物、树状大分子、脂质体、胶束、颗粒、聚合物颗粒或其他聚合物结构。
优选四嗪：
式(4a)：
优选四嗪符合式(4a)，且优选包括其医药上可接受的盐：
Figure BDA0003509271520001281
式(4a)，其中每一部分Q1和Q2独立地选自氢和根据式(5)的部分组成的基团：
Figure BDA0003509271520001291
其中虚线表示与分子剩余部分的键，其中R10、R11和R12如本文所定义。
在优选实施方式中，式(5)中的每个f是从0到24的范围内独立选择的整数，优选在1到12的范围内，更优选在2到6的范围内，甚至更优选在1到3的范围内。在优选实施方式中，f是1。在其他优选实施方式中，f是12到24范围内的整数。在优选实施方式中，在式(5)中，g是0到12范围内的整数，优选1到6范围内的整数，更优选2到4范围内的整数。在优选实施方式中，在式(5)中，每个h独立地为0或1。在优选实施方式中，g是0，f是1。在优选实施方式中，g是1，f是1。
如果根据本发明的化合物包含一个以上满足式(5)的部分，则每个g、h和f都是独立选择的。
在优选实施方式中，根据式(5)的部分任选地被根据式(5)的另一独立选择部分取代。在优选实施方式中，根据式(5)的部分不被根据式(5)的另一独立选择的部分取代。
在优选实施方式中，根据式(5)的部分为R87，如下文进一步定义。
在优选实施方式中，根据式(5)的部分满足下文进一步所示的来自基团RM的分子。
优选式(4a)中的部分Q1和Q2中的至少一个不是氢。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1选自C6-C24芳基和C2-C24杂芳基组成的基团，并且任选地进一步被式(5)中的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1选自C6-C24芳基和C2-C24杂芳基组成的基团，并且任选地进一步被式(5)中的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个，式(4a)中的Q2选自C6-C24芳基和C2-C24杂芳基组成的基团，并任选地进一步被式(5)中的一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1选自C6芳基和C3-C5杂芳基组成的基团，并任选地进一步被式(5)中的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个。在此，优选的杂芳基为2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、2,4-咪唑基、2,5-咪唑基、苯基、2,3-吡唑基、3,4-吡唑基、恶唑基、异恶唑、噻唑啉、2-吡咯基、3-吡咯基、2-噻吩和3-噻吩。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1为C3-C5杂芳基，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且Q2为C3-C5杂芳基，并且任选地进一步被根据式(5)的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分。在此，优选的杂芳基为2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、2,4-咪唑基、2,5-咪唑基、苯基、2,3-吡唑基、3,4-吡唑基、恶唑基、异恶唑、噻唑啉、2-吡咯基、3-吡咯基、2-噻吩和3-噻吩。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1为C3-C5杂芳基，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且Q2为H。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1是苯环，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且Q2是-H。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1是苯环，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且Q2是苯环，并且任选地进一步被至少一个根据式(5)的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1是苯环，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且Q2选自C6芳基和C3-5杂芳基组成的基团，并且任选地进一步被至少一个根据式(5)的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1为C1-C12烷基，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，以及从C6芳基和C3-5杂芳基组成的基团中选择的Q2，并且任选地进一步被至少一个根据式(5)的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分。
在优选实施方式中，式(4a)中的Q1为C1-C12烷基，并且任选地进一步被根据式(5)的至少一个部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分，并且式(4a)中的Q2为C1-C12烷基，并且任选地进一步被至少一个根据式(5)的部分取代，优选不超过两个，更优选不超过一个根据式(5)的部分。
在优选实施方式中，Q2等于Q1。
R10：
在优选的实施方式中，每个R10独立地选自-O-、-S-、-SS-、-NR4-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR4-、-OC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-、-OC(O)NR4-、-NR4C(O)-、-NR4C(O)O-、-NR4C(O)NR4-、-SC(O)-、-C(O)S-、-SC(O)O-、-OC(O)S-、-SC(O)NR4-、-NR4C(O)S-、-S(O)-、-S(O)2-、-OS(O)2-、-S(O2)O-、-OS(O)2O-、-OS(O)2NR4-、-NR4S(O)2O-、-C(O)NR4S(O)2NR4-、-OC(O)NR4S(O)2NR4-、-OS(O)-、-OS(O)O-、-OS(O)NR4-、-ONR4C(O)-、-ONR4C(O)O-、-ONR4C(O)NR4-、-NR4OC(O)-、-NR4OC(O)O-、-NR4OC(O)NR4-、-ONR4C(S)-、-ONR4C(S)O-、-ONR4C(S)NR4-、-NR4OC(S)-、-NR4OC(S)O-、-NR4OC(S)NR4-、-OC(S)-、-C(S)O-,-OC(S)O-、-OC(S)NR4-、-NR4C(S)-、-NR4C(S)O-、-SS(O)2-、-S(O)2S-、-OS(O2)S-、-SS(O)2O-、-NR4OS(O)-、-NR4OS(O)O-、-NR4OS(O)NR4-、-NR4OS(O)2-、-NR4OS(O)2O-、-NR4OS(O)2NR4-、-ONR4S(O)-、-ONR4S(O)O-、-ONR4S(O)NR4-、-ONR4S(O)2O-、-ONR4S(O)2NR4-、-ONR4S(O)2-、-OP(O)(R4)2-、-SP(O)(R4)2-、-NR4P(O)(R4)2-及其组合，其中R4如本文所述定义。在优选的实施方式中，每个R10独立地选自-O-、-S-、-SS-、-NR4-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR4-、-OC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)NR4-、-NR4C(O)-、-NR4C(O)O-、-NR4C(O)NR4-、-SC(O)-、-C(O)S-、-SC(O)O-、-OC(O)S-、-SC(O)NR4-、-NR4C(O)S-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4S(O)2NR4-、-OC(O)NR4S(O)2NR4-、-OC(S)-、-C(S)O-、-OC(S)O-、-OC(S)NR4-、-NR4C(S)-、-NR4C(S)O-、-SS(O)2-。
优选地，与R10相关的每个R4单独地选自氢和C1-C4烷基。
R11：
在优选的实施方式中，每个R11独立地选自C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C2-C24亚炔基、C6-C24亚芳基、C2-C24杂亚芳基、C3-C24亚环烷基、C5-C24亚环烯基和C12-C24亚环炔基，其中优选亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基和亚环炔基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36的杂原子、P和Si，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R11独立地选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基、C2-C12亚炔基、C6-C12亚芳基、C2-C12杂亚芳基、C3-C12亚环烷基、C5-C12亚环烯基和C12亚环亚烷基；其中优选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基和亚环亚烷基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，每个R11独立地选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C6-C6亚芳基、C2-C6杂亚芳基、C3-C6亚环烷基和C5-C6亚环烯基；其中优选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基和亚环亚烷基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R11基团任选地进一步被一个或多个选自-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR36、-SR36、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳烷基、C4-C24(杂)芳基烯基、C4-C24(杂)芳基炔基、C4-C24烯基(杂)芳基、C4-C24炔基(杂)芳基、C4-C24烷基环烷基、C6-C24烷基环烯基、C13-C24烷基环炔基、C4-C24环烷基烷基、C6-C24环烯基烷基、C13-C24环炔基烷基、C5-C24烯基环烷基、C7-C24烯基环烯基、C14-C24烯基环炔基、C5-C24环烷基烯基、C7-C24环烯基烯基、C14-C24环炔基烯基、C5-C24炔基环烷基、C7-C24炔基环烯基、C14-C24炔基环炔基、C5-C24环烷基炔基、C7-C24环烯基炔基、C14-C24环炔基炔基、C5-C24环烷基(杂)C7-C24环烯基(杂)芳基、C14-C24环炔基(杂)芳基、C5-C24(杂)芳基环烷基、C7-C24(杂)芳基环烯基和C14-C24(杂)芳基环炔基的取代基取代，其中取代基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R11基团任选地进一步被一个或多个选自-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR36、-SR36、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C12环炔基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳烷基、C4-C12(杂)芳基烯基、C4-C12(杂)芳基炔基、C4-C12烯基(杂)芳基、C4-C12炔基(杂)芳基、C4-C12烷基环烷基、C6-C12烷基环烯基、C13-C18烷基环炔基、C4-C12环烷基烷基、C6-C12环烯基烷基、C13-C18环炔基烷基、C5-C12烯基环烷基、C7-C12烯基环烯基、C14-C16烯基环炔基、C5-C12环烷基烯基、C7-C12环烯基烯基、C14-C16 c环炔基烯基、C5-C12炔基环烷基、C7-C12炔基环烯基、C14-C16炔基环炔基、C5-C12环烷基炔基、C7-C12环烯基炔基、C14-C16环炔基炔基、C5-C12环烷基(杂)芳基、C7-C12环烯基(杂)芳基、C14-C16环炔基(杂)芳基、C5-C12(杂)芳基环烷基、C7-C12(杂)芳基环烯基和C14-C16(杂)芳基环炔基的取代基取代，其中取代基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R11基团任选地进一步被一个或多个选自-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR36、-SR36、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6芳基、C2-C6杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C6烷基(杂)芳基、C3-C6(杂)芳基烷基、C4-C6(杂)芳基烯基、C4-C6(杂)芳基炔基、C4-C6烯基(杂)芳基,C4-C6炔基(杂)芳基,C4-C6烷基环烷基,C6烷基环烯基,C4-C6环烷基烷基,C6环烯基烷基,C5-C6烯基环烷基,C7烯基环烯基,C5-C6环烷基烯基,C7环烯基烯基、C5-C6炔基环烷基、C7炔基环烯基、C5-C6环烷基炔基、C5-C6环烷基(杂)芳基和C5-C6(杂)芳基环烷基的取代基取代。本文中的取代基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选的实施方式中，R11基团任选地进一步被一个或多个选自-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR36、-SR36、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6芳基、C2-C6杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烯基、C3-C7烷基(杂)芳基、C3-C7(杂)芳基烷基、C4-C8(杂)芳基烯基、C4-C8(杂)芳基炔基、C4-C8烯基(杂)芳基、C4-C8炔基(杂)芳基,C4-C6烷基环烷基,C6-C7烷基环烯基,C4-C6环烷基烷基,C6-C7环烯基烷基,C5-C6烯基环烷基,C7-C8烯基环烯基,C5-C6环烷基烯基、C7-C8环烯基烯基、C5-C6炔基环烷基、C7-C8炔基环烯基、C5-C6环烷基炔基、C5-C9环烷基(杂)芳基和C5-C6(杂)芳基环烷基的取代基取代，其中取代基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，当f>2时，R11独立地选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C6-C6亚芳基、C2-C6杂亚芳基、C3-C6亚环烷基和C5-C6亚环烯基；其中优选亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基和亚环亚烷基任选地包含一个或多个选自O、S、NR36、P和Si的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在一个优选的实施方式中，R11取代基不含杂原子。在一个优选的实施方式中，R11基团未被取代。在另一个优选的实施方式中，R11基团不包含杂原子。
R12：
R12选自-H、-OH、-NH2、-N3、-Cl、-Br、-F、-I、聚合物、颗粒、肽、类蛋白、树状大分子、蛋白质、生物分子、适体、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、脂质、类固醇、脂质体、胶束、靶向剂TT、R87、药物DD、成像部分，白蛋白结合部分和螯合部分。
R12中使用的螯合部分的非限制性示例包括
DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid)，
DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"-tetraacetic acid)，
NOTA(1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid)，
TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'-tetraacetic acid)，
OTTA(N1-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine-N1,N2,N3,N3-tetraacetic acid),deferoxamine or DFO(N'-[5-[[4-[[5-(acetylhydroxyamino)pentyl]amino]-1,4-dioxobutyl]hydroxyamino]pentyl]-N-(5-aminopentyl)-N-hydroxybutanediamide)或HYNIC(hydrazinonicotinamide)。
在优选实施方式中，当R12是聚合物、颗粒、肽、类蛋白、树状大分子、蛋白质、生物分子、寡核苷酸、寡糖、脂质体、脂质体、胶束、靶向剂TT或R87时，f最多为2，最好最多为1。
式(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)：
在本发明的优选实施方式中，四嗪符合式(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)或(13)中的任一式：
Figure BDA0003509271520001361
其中，每个部分Q、Q1、Q2、Q3和Q4独立地选自氢和根据本文定义的式(5)的部分所组成的群组；其中R1、R2和R3如本文所定义。
在优选实施方式中，在根据式(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4所组成的群组中选择的最多一个部分为氢。
在优选实施方式中，在根据式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的最多两个部分为氢。
在优选实施方式中，在根据式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的最多三个部分为氢。在优选实施方式中，在根据式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的所有部分均为氢。
在优选实施方式中，在根据式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的最多一个部分不是氢。
在优选实施方式中，在根据式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中任一式的四嗪中，从Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的最多两个部分不是氢。
分子量：
优选地，对于本文公开的包含基团Q、Q1、Q2、Q3、Q4或-(CH2)y-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的所有化合物，这些基团中的至少一个具有100Da至3000Da范围内的分子量。优选地，这些基团中的至少一个具有100Da至2000Da范围内的分子量。更优选地，这些基团中的至少一个具有100Da至1500Da范围内的分子量，甚至更优选150Da至1500Da范围内的分子量。甚至更优选地，这些基团中的至少一个的分子量在150Da到1000Da的范围内，最优选在200Da到1000Da的范围内。
优选地，对于本文公开的包含基团Q、Q1、Q2、Q3、Q4或-(CH2)y-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的所有化合物，这些基团中没有一个的分子量超过3000Da，尤其是在活化剂需要有效地外渗到组织中的情况下。
基团-(CH2)y-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3：
在优选实施方式中，y是1到12、优选1到10、更优选1到8、甚至更优选2到6、最优选2到4范围内的整数。在优选实施方式中，y是至少2，优选y是至少3。在优选实施方式中，p是0或1，其中每个p是独立被选择的。在优选实施方式中，每个n是从0到24、优选从1到12、更优选从1到6、甚至更优选从1到3的范围内独立选择的整数，最优选n是0或1。在优选实施方式中，n优选为12到24之间的整数。在优选实施方式中，n是1。
在优选实施方式中，整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3为R87。在优选实施方式中，整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的分子量在100Da至3000Da范围内。优选地，整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的分子量在100Da到2000Da的范围内。更优选地，整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的分子量在100Da至1500Da范围内，甚至更优选在150Da至1500Da范围内。甚至更优选地，整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3的分子量在150Da到1000Da的范围内，最优选在200Da到1000Da的范围内。
优选当n>2时，R2独立地选自于由C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C6亚芳基、C2-C6杂亚芳基、C3-C6环亚烷基和C5-C6环亚烯基所组成的群组的基团；并且其中优选地，所述亚烷基、烯基、炔基、环烯基、环烯基和环炔基任选地包含选自于由O、S、NR36、P和Si所组成的群组中的一个或多个杂原子，其中所述N、S和P原子任选地被氧化，其中N个原子可选地被季胺化。
在优选实施方式中，R87或整个基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3满足下面所示的来自基团RM的分子：
RM：
Figure BDA0003509271520001391
Figure BDA0003509271520001401
，其中所述摆动线表示与本文所公开的四嗪基团或基团R1或R2的键。
在优选实施方式中，基团-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3满足来自基团RM的分子，其中应理解，当n大于1时，-((R1)p-R2)n-(R1)p-R3可在基团-(R1)p-R2)之前，以形成基团-((R1)p-R2)-((R1)p-R2)n-1-(R1)p-R3。可以理解的是，这源于如何写出重复单元的定义，即在独立选择R1、p和R2之前，首先将-((R1)p-R2)2-写为-(R1)p-R2-(R1)p-R2-。
R1、R2、R3：
R1与R10的定义相同。R2与R11的定义相同。R3与R12的定义相同。
R4：
优选地，每个R4独立地选自于由氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烷基和C12-C24环烷基所组成的群组的基团。
在优选实施方式中，每个R4独立地选自于由氢、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基和C12环炔基所组成的群组的基团。
在优选实施方式中，每个R4独立地选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6芳基、C2-C6杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基和C8环炔基所组成的群组的基团。
优选地，不为氢的R4基团任选地包含从O、S、NR5、P和Si组成的基团中选择的一个或多个杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，不为氢的R4基团任选地进一步被一个或多个选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR5、-SR5、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C2C24烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基烷基、C4-C24(杂)芳基烷基、C4-C24(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基、C4-C24烯基(杂)芳基、C4-C24炔基(杂)芳基、C4-C24烷基环，C6-C24烷基环烯基、C13-C24烷基环烯基、C4-C24环烷基、C6-C24环烯基、C13-C24环烯基烷基、C5-C24烯基环烯基烷基、C7-C24烯基环烯基、C14-C24烯基环烯基、C5-C24环烯基、C7-C24烯基环烯基、，C14-C24环炔基烷基、C5-C24炔基环烷基、C7-C24炔基环炔基、C14-C24炔基环炔基、C5-C24环炔基、C7-C24环炔基烷基、C14-C24环炔基烷基、C5-C24环烷基(杂)芳基、C7-C24环炔基(杂)芳基、C14-C24环炔基(杂)芳基、C5-C24(杂)芳基环烷基、C7-C24(杂)芳基环烯基和C14-C24(杂)芳基环炔基所组成的群组的取代基取代；其中所述取代基任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR5、P和Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
优选地，不为氢的R4基团任选地进一步被一个或多个选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR5、-SR5、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6芳基、C2-C4杂芳基、C3-C4环烷基、C5-C4环烯基、C12环炔基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基、C4-C12(杂)芳基、C4-C12烯基(杂)芳基、C4-C12炔(杂)芳基、C4-C12烷基环烷基、C6-C12烷基环烯基、，C13-C12烷基环炔基、C4-C12环烷基烷基、C6-C12环炔基、C13环炔基、C5-C12烯基环烷基、C7-C12烯基环炔基、C14烯基环炔基、C5-C12环炔基、C7-C12环炔基、C14环炔基、C5-C12炔基环烷基、C7-C12炔基环烷基、C14-C12炔基环烷基、C5-C12环烷基炔基、C7-C12环烷基炔基、C14环烷基炔基、C5-C12环烷基(杂)芳基、C7-C12环烷基(杂)芳基、C14环烷基(杂)芳基、C5-C12(杂)芳基环烷基、C7-C12(杂)芳基环烯基及C14(杂)芳基环炔基所组成的群组的取代基取代；其中所述取代基任选地包含一个或多个选自于由O、S、NR5、P和Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，R4取代基不含杂原子。在优选实施方式中，R4基团未被取代。在另一优选实施方式中，R4基团不包含杂原子。
R5：
优选地，每个R5独立地选自于由氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烷基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，
其中，非氢的R5基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH和-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NH、P和Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，R5基团不被取代。在另一优选实施方式中，R5基团不含杂原子。
部分Q、Q1、Q2、Q3、Q4：
在优选实施方式中，g是0到12、优选0到10、更优选0到8、甚至更优选1到6、最优选2到4范围内的整数。在其他优选实施方式中，g是0。如果从一种化合物中由Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的一个以上部分满足式(5)，则每个g都是独立选择的。在优选实施方式中，h是0或1。如果从一种化合物中由Q、Q1、Q2、Q3和Q4组成的组中选择的一个以上部分满足式(5)，则每个h独立选择。在优选实施方式中，属于部分Q、Q1、Q2、Q3或Q4的每个f是从0到24、优选1到12、更优选1到6、甚至更优选1到3、最优选f是0或1的范围内独立选择的整数。在优选实施方式中，f优选为12到24之间的整数。在其他优选实施方式中，f是1。
在优选实施方式中，-((R10)h-R11)f-(R10)h-R12基团满足上文所示的来自RM基团的分子。
在优选实施方式中，基团-((R10)h-R11)f-(R10)h-R12满足来自基团RM的分子，其中应理解，当f大于1时，例如-((R10)h-R11)f-1-(R10)h-R12可在基团-(R10)h-R11-之前加上基团-(R10)h-R11-以形成基团-(R10)h-R11-((R10)h-R11)f-1-(R10)h-R12。可以理解，这源于如何写出重复单元的定义，即在独立选择R10、h和R11之前，首先将-((R10)h-R11)2-写为-(R10)h-R11-(R10)h-R11-。
式(14)：
在优选实施方式中，活化剂为满足式(14)的四嗪：
Figure BDA0003509271520001431
式(14)，且优选包括其医药上可接受的盐，
其中，Ya选自由Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7组成的组：
Figure BDA0003509271520001441
其中，Yb选自Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、氢、X47和–(SP)D–R87组成的组；其中D是0或1；其中，当Ya为Y6时，则Y-b为氢，其中每个Q1和Q5分别选自X45、氢、X47和–(SP)D–R87组成的组；其中每个Q2和Q4分别从X46、氢、X47和–(SP)D–R87组成的组中选择；其中每个Q3分别从氢、X47和–(SP)D–R87组成的组中选择；其中，优选地，式(14)化合物包含至少一个X45或X46基团，其中每个X45分别选自于由N(X50)2、C(X51)2N(X50)2、NX50C(O)X51、NX50C(S)X51,OH,SH,C(O)OH,C(S)OH、C(O)SH、C(S)SH,NX50C(O)OX51、NX50C(S)OX51-、NX50C(O)SX51-、NX50C(S)SX51-,NX50C(O)N(X51)2,NX50C(S)N(X51)2、NX50SO2X51-,NX50SO3X51-、NX50OX51、SO3H及PO3H2所组成的群组；其中，每个X46分别选自于由N(X50)2、C(X51)2N(X50)2、NX50C(O)X51,NX50C(S)X51、OH、SH、C(O)OH、C(S)OH、C(O)SH、C(S)SH、NX50C(O)OX51、NX50C(S)OX51、NX50C(O)SX51-、NX50C(S)SX51-、NX50C(O)N(X51)2、NX50C(S)N(X51)2、NX50SO2X51、NX50SO3X51、NX50OX51、SO3H及PO3H2所组成的群组；其中每个X50和X51分别从氢、X48和–(SP)D–R87组成的组中选择；其中每个X48优选独立地选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基和C4-6(杂)芳基组成的基团；其中，对于X48，烷基、烯基和(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2和-NO2所组成的群组的部分取代；并且任选地包含至多两个选自-O-、-S-、-NH-、-P-和-Si-的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中每个X47选自于由-F、-Cl、-Br、-I、-OX49、-N(X49)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SX49、S(＝O)2N(X49)2,OC(＝O)X49、SC(＝O)X49、OC(＝S)X49、SC(＝S)X49,NX49C(＝O)-X49、NX49C(＝S)-X49、NX49C(＝O)O-X49、NX49C(＝S)O-X49、NX49C(＝O)S-X49、NX49C(＝S)S-X49、OC(＝O)N(X49)2、SC(＝O)N(X49)2、OC(＝S)N(X49)2、SC(＝S)N(X49)2、NX49C(＝O)N(X49)2、NX49C(＝S)N(X49)2,C(＝O)X49、C(＝S)X49、C(＝O)N(X49)2、C(＝S)N(X49)2、C(＝O)O-X49、C(＝O)S-X49、C(＝S)O-X49、C(＝S)S-X49、-S(O)X49、-S(O)2X49、NX49S(O)2X49、-ON(X49)2、-NX49OX49、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基,C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基环烷基、环烷基烷基、环烷基(杂)芳基和(杂)芳基环烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OX49、-N(X49)2、-SO3X49、-PO3(X49)2、-PO4(X49)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NX49和-SX49所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NX49、P和Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选被氧化，其中N原子任选地被季铵化；其中X49选自于由氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基烷基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中不为氢的X49基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH和-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P和Si的杂原子所组成的群组，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化，其中，Q1、Q2、Q3、Q4和Q5中优选至多两个，更优选至多一个是R87；其中根据式(14)的化合物优选对于每个单独的Ya和Yb包含至多四个R87基团，更优选至多两个R87基团，最优选至多一个R87；其中根据式(14)的化合物优选包含至少一个R87；其中优选地对于每个单独的Ya和Yb至多三个，更优选地至多两个Q1、Q2、Q3、Q4和Q5不是氢；其中优选地对于每个单独的Ya和Yb，Q1、Q2、Q3、Q4和Q5中的至多两个是X45或X46，其中优选地对于每个单独的Ya和Yb，Q1、Q2、Q4和Q5中的一个是X45或X46，其中优选Ya和Yb均包含至少一个X45或X46，其中优选Ya和Yb均包含一个X45或X46，其中优选Ya和Yb均包含一个X45或X46，由此Ya中包含的X45与X45相同包含在Yb中，和/或包含在Ya中的X46与包含在Yb中的X46相同，其中优选Ya和Yb都独立地选择Y1，或者都独立地选择Y2，或者都独立地选择Y3，或者都独立地选择Y4，或两者都独立选择Y5；或两者都独立选择Y7。
在优选实施方式中，在式(14)中，当Q1为X47或–(SP)D–R87时，则对于Q1，X47和–(SP)D–R87不是符合X45定义的基团。在优选实施方式中，在式(14)中，当Q5是X47或–(SP)D–R87时，对于Q5，X47和–(SP)D–R87不是符合X45定义的基团。在优选实施方式中，在式(14)中，当Q2为X47或–(SP)D–R87时，则对于Q2，X47和–(SP)D–R87不是符合X46定义的基团。在优选实施方式中，在式(14)中，当Q4为X47或–(SP)D–R87时，则对于Q4，X47和–(SP)D–R87不是符合X46定义的基团。
在优选实施方式中，Ya等于Yb。
在优选实施方式中，Ya选自Y1、Y2、Y3、Y4或Y5，Yb为氢、X47或–(SP)D–R87。在优选实施方式中，Ya选自Y1、Y2、Y3、Y4或Y5，Yb为氢。在优选实施方式中，根据式(14)的化合物不包含–(SP)D–R87。
在优选实施方式中，X50为氢。
在优选实施方式中，当X45或X46为N(X50)2时，一个X50为氢，一个X50为X48或–(SP)D–R87。
在优选实施方式中，式(14)不包括X46。在优选实施方式中，式(14)中的两个Q1均为X45。在优选实施方式中，式(14)中的两个Q2均为X46。在优选实施方式中，式(14)中的两个Q5均为X45。在优选实施方式中，式(14)中的Q4均为X46。
X45：
在优选实施方式中，每个X45分别从以下组中选择：N(X50)2、NX50C(O)X51、NX50C(S)X51、OH、SH、NX50C(O)OX51-、NX50C(S)OX51-、NX50C(O)SX51、NX50C(S)SX51、NX50C(O)N(X51)2、NX50C(S)N(X51)2、NX50SO2X51、NX50SO3X51、NX50OX51。
在优选实施方式中，每个X45分别选自于由N(X50)2、NX50C(O)X51、NX50C(S)X51、OH及SH所组成的群组。
在优选实施方式中，每个X45分别选自于由NX50C(O)OX51-、NX50C(S)OX51-、NX50C(O)SX51、NX50C(S)SX51、NX50C(O)N(X51)2、NX50C(S)N(X51)2、NX50SO2X51、NX50SO3X51、NX50OX51所组成的群组。
在优选实施方式中，X45选自于由NHX50、C(X51)2NH2、CHX51NH2、CH2N(X50)2、CH2NHX50、NHC(O)X51、NHC(S)X51、OH及SH所组成的群组。
在优选实施方式中，X45是NHX50。在优选实施方式中，X45是C(X51)2NH2。在优选实施方式中，X45为CHX51NH2。在优选实施方式中，X45是CH2N(X50)2。在优选实施方式中，X45是CH2NHX50。在优选实施方式中，X45为NH2。在优选实施方式中，X45为CH2NH2。在优选实施方式中，X45是NHC(O)X51。在优选实施方式中，X45是NHC(S)X51。在优选实施方式中，X45是OH。在优选实施方式中，X45是SH。
X46：
在优选实施方式中，X46分别从由N(X50)2、NX50C(O)X51、NX50C(O)OX51-、及NX50C(O)N(X51)2所组成的群组中选择。在优选实施方式中，X46从N(X50)2及NX50C(O)X51所组成的群组中选择。在优选实施方式中，X46选自于由NHX50和NHC(O)X51所组成的群组。在优选实施方式中，X46是NHX50。在优选实施方式中，X46为NH2。在优选实施方式中，X46是NHC(O)X51。
X47：
在优选实施方式中，每个X47分别选自于由F、-OH、-NH2、-SO3-、-NO2、-CF3、-SH、C1-C6烷基、C6芳基、C4-C5杂芳基、C5-C8烷基(杂)芳基、C5-C8(杂)芳基烷基、C4-C8烷基环烷基和C4-C8环烷基。在更优选的实施方式中，每个X47分别选自F、-SO3-、-NO2、-CF3、C1-C6烷基、C6芳基、C4-C5杂芳基、C5-C8烷基(杂)芳基、C5-C8(杂)芳烷基、C4-C8烷基环烷基和C4-C8环烷基所组成的群组。在优选实施方式中，X47取代基不含杂原子。在优选实施方式中，X47基团未被取代。在另一优选实施方式中，X47基团不包含杂原子。
X48：
在优选实施方式中，每个X48独立地选自由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基和C4-6(杂)芳基所组成的群组。对于X48，烷基、烯基和(杂)芳基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、＝O、-SH、-SO3H、-PO3H、-PO4H2和-NO2所组成的群组的部分取代；并且任选地包含从-O-、-S-、-NH-、-P-和-Si-组成的组中选择的最多两个杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化。
在优选实施方式中，X48为C1-C4烷基。在优选实施方式中，X48取代基不含杂原子。在优选实施方式中，X48基团不被取代。在另一优选实施方式中，X48基团不包含杂原子。
X49：
在优选实施方式中，X49选自于由氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C12芳基、C2-C12杂芳基、C3-C8环烷基、C5-C8环烷基、C3-C12烷基(杂)芳基、C3-C12(杂)芳基、C4-C12烷基环烷基、C4-C12环烷基、C5-C12环烷基(杂)芳基和C5-C12(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中不为氢的X49基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2和-NO2、-CF3、＝O、＝NH和-SH所组成的群组的部分取代，以及任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P和Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，X49选自于由氢、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C6-C8芳基、C2-C8杂芳基、C3-C6环烷基、C5-C6环烷基、C3-C10烷基(杂)芳基、C3-C10(杂)芳基、C4-C8烷基环烷基、C4-C8环烷基、C5-C10环烷基(杂)芳基和C5-C10(杂)芳基环烷基所组成的群组，其中不为氢的X49基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH和-SH所组成的群组的部分取代，以及任选地包含一个或多个选自于由O、S、NH、P和Si所组成的群组的杂原子，其中N、S和P原子任选地被氧化，其中N原子任选地被季铵化。
在优选实施方式中，X49取代基不含杂原子。在优选实施方式中，X49基团未被取代。
在另一优选实施方式中，X49基团不包含杂原子。
X50：
在优选实施方式中，每个X50分别从氢、X48和–(SP)D–R87所组成的群组中选择。在优选实施方式中，X50是X48。在优选实施方式中，X50为–(SP)D–R87。在优选实施方式中，X50是H。
X51：
在优选实施方式中，每个X51分别从氢、X48和–(SP)D–R87所组成的群组中选择。在优选实施方式中，X51是X48。在优选实施方式中，X51为–(SP)D–R87。在优选实施方式中，X51是H。
Q1：
在优选实施方式中，在式(14)中，Q1选自于由氢、X47和–(SP)D–R87所组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q1为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q1为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q1为–(SP)D–R87，且优选Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q2：
在优选实施方式中，式(14)中的Q2选自于由氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q2为氢。在优选实施方式中，Q2为式(14)X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q2为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q3：
在优选实施方式中，式(14)中的Q3选自于由氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q3为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q3是X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q3为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q4：
在优选实施方式中，式(14)中的Q4选自于由氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q4为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q4为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q4为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q5：
在优选实施方式中，式(14)中的Q5选自于氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q5为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q5为X47。在优选实施方式中，Q5为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q6、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q6：
在优选实施方式中，式(14)中的Q6选自氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q6为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q6为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q6为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q7、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q7：
在优选实施方式中，式(14)中的Q7选自氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q7为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q7是X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q7为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q8、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q8：
在优选实施方式中，式(14)中的Q8选自氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q8为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q8为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q8为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q9和Q10为X45、X46或氢。
Q9：
在优选实施方式中，式(14)中的Q9选自氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q9为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q9为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q9为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8和Q10为X45、X46或氢。
Q10：
在优选实施方式中，式(14)中的Q10选自氢、X47和–(SP)D–R87组成的群组。在优选实施方式中，式(14)中的Q10为氢。在优选实施方式中，式(14)中的Q10为X47。在优选实施方式中，式(14)中的Q10为–(SP)D–R87，且优选Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8和Q9为X45、X46或氢。
R87：
优选地，R87具有至少100Da、更优选地至少200Da、更优选地至少300Da、更优选地至少400Da、更优选地至少500Da和最优选地至少1kDa的分子量。
优选地，R87具有最多100kDa、更优选地最多75kDa、更优选地最多50kDa、更优选地最多25kDa、更优选地最多10kDa和最优选地最多3kDa的分子量。
优选地，R87的分子量在100Da到3000Da的范围内。优选地，R87具有至少60kDa、优选至少100kDa的分子量。优选至少200kDa，最优选至少500kDa。
在优选实施方式中，R87是聚合物，更优选聚乙二醇。在另一优选实施方式中，R87是碳水化合物。在另一优选实施方式中，R87是肽或蛋白质，更优选是抗体。
应当理解，就本发明而言，R87优选为调节根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的药代动力学的部分。因此，优选地，R87是药代动力学调节部分(PK部分)。R87的功能包括但不限于延迟所述化合物的清除，影响所述化合物的分布体积(例如减少或增加分布体积)，影响所述化合物的生物分布，实现对其与触发物的反应的空间控制，影响(更具体地避免)所述化合物的代谢，和/或影响(更具体地避免)所述化合物对组织的(不希望的)粘附或(不希望的)摄取。熟练的人非常了解这些群体，以及如何综合这些群体。
在优选实施方式中，R87用于增加血液循环时间，增加与触发物的反应时间。
在优选实施方式中，R87用于调节本发明亲二烯酮和根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物之间反应产物的药代动力学。
在不希望受到理论约束的情况下，据信根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的四嗪部分在生物正交反应中的功能和性能不受R87性质的显着影响。
在优选实施方式中，每个PK部分分别选自生物分子、聚合物、肽、类蛋白、树状大分子、蛋白质、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、适配子、类固醇、脂质、白蛋白、白蛋白结合部分、染料部分、荧光部分、成像探针和靶向剂(TT)；其中R87通过间隔基(SP)任选地结合到四嗪。通常，如R87的合适聚合物为聚乙二醇(PEG)。这种合适的PEG包括在2至4000范围内具有多个重复单元的PEG，以及在200Da至100000Da范围内具有分子量的PEG。
在优选实施方式中，R87是根据式(5)的部分。
在优选实施方式中，R87是根据式(5)的部分，并且直接连接到根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的其余部分，例如，在R87和式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的Ya或Yb部分的剩余部分之间没有间隔基SP。
在优选实施方式中，R87是根据式(5)的部分，并且直接连接到根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的其余部分，例如，在R87和式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的Ya或Yb部分的其余部分之间没有间隔基SP，如果连接到X45或X46的胺官能团，则式(5)中的z不是0。
在优选实施方式中，R87通过本文定义的间隔基SP连接到根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的剩余部分。
在优选实施方式中，R87任选地通过本文定义的间隔基SP连接到根据式(4)、(4a)和(6)-(14)中任一式的化合物的剩余部分，并且每个R87基团分别选自于由生物分子、聚合物、肽、类蛋白、树状大分子、蛋白质、碳水化合物、寡核苷酸、寡糖、脂质、胶束、脂质体、多聚体、颗粒、纳米粒子、微粒、珠粒、凝胶、树脂、金属络合物、有机金属部分、白蛋白、白蛋白结合部分、染料部分、荧光部分、成像探针和靶向剂(TT)所组成的群组。
在优选实施方式中，本发明化合物的一个或多个拷贝(copies)，即四嗪，可与R87基团共轭，R87基团为凝胶、树脂、聚合物。
在优选实施方式中，本发明化合物的一个或多个拷贝可与R87共轭，R87是选择性激活前药和体内选定位置的靶向剂。
在优选实施方式中，本发明化合物的一个或多个拷贝可与作为膜易位部分(例如金刚氨酸、聚赖氨酸/精氨酸、TAT、人乳铁蛋白)的R87结合以达到细胞内前药。关于这些部分的典型参考文献包括：《生物化学科学趋势》(Trends in Biochemical Sciences),2015,.40,12,749；J.Am.Chem.Soc.2015,137,12153-12160；Pharmaceutical Research,2007,24,11,1977。
关于在细胞环境中的应用，例如在体内，取决于触发结构的位置(例如细胞内或细胞外)，活化剂被设计为能够有效地到达该触发结构。因此，活化剂可以例如通过改变其对数P值、反应性或电荷来定制，这可以选择性地通过R87实现。
根据一个优选实施方式，活化剂可以是多聚体化合物，其包含多个四嗪，任选地结合到一个R87。这些多聚体化合物可以是但不限于生物分子、肽、类蛋白、蛋白质、寡核苷酸、寡糖、多聚体、珠粒、凝胶、聚合物、树状大分子、脂质体、胶束、颗粒、纳米颗粒、微粒、聚合物颗粒或其他聚合物结构。
在优选实施方式中，本发明的四嗪化合物包含成像部分而不是R87。在其他实施方式中，R87是或包含成像部分。在该优选实施方式中，成像部分以与R87相同的方式结合到本发明化合物的剩余部分。在该实施方式中，R87等于成像部分。在优选实施方式中，本发明化合物可包含一个或多个成像部分和一个或多个R87基团。
在优选实施方式中，R87是或包含成像部分。首选成像部分为放射性核素螯合物络合物、放射性标记分子(例如带有18F、124I)和荧光染料。在优选实施方式中，R87是包含至少一种18F同位素的成像部分。
在优选实施方式中，R87包含螯合部分，优选如本文所述的螯合部分。
在优选实施方式中，R87包括但不限于氨基酸、核苷、核苷酸、碳水化合物和生物聚合物片段，例如寡聚或多肽、寡聚或多肽、寡聚或聚乳酸、寡聚或多聚碳水化合物、寡聚核苷酸，范围为2到200，尤其是2到113，优选2到50，更优选2至24个且更优选2至12个重复单元。
在要求活化剂具有细胞外分布体积的实施方式中，优选活化剂的对数P为最多2、优选最多1、更优选最多0、甚至更优选最多-1。
在要求活化剂具有细胞内分布体积的实施方式中，优选活化剂的对数P为至少-1、优选至少0、更优选至少1、甚至更优选至少2。
在要求活化剂具有胞外分布体积的实施方式中，优选活化剂在pH 7下具有负净电荷。
在要求活化剂具有细胞内分布体积的实施方式中，优选活化剂的分子量小于1000Da，优选小于500Da。
在要求活化剂具有细胞外分布体积的实施方式中，优选活化剂具有大于500Da、优选大于1kDa、更优选大于2kDa的分子量。
在要求活化剂具有缓慢或低效的循环外渗的实施方式中，优选活化剂具有大于5kDa、优选大于60kDa、更优选大于150kDa、甚至更优选大于500kDa的分子量。
在优选实施方式中，R87为聚合物。这包括线性或支链聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙烯二醇(PPG)链，其变化范围为2到200，尤其是2到113，优选2到50，更优选2到24，更优选2到12个重复单元。优选的是，当聚亚烷基二醇(例如PEG和PPG聚合物)仅通过聚合物链的一端结合时，另一端以-OCH3、-OCH2CH3、OCH2CO2H终止。
其他聚合物R87基团为聚合物和共聚物，例如聚-(2-恶唑啉)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚谷氨酸(PG)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(1-羟甲基乙烯-羟甲基甲酸甲酯(PHF)。其他示例性聚合物为多糖、多糖、糖脂、聚糖苷、聚缩醛、聚缩酮、聚酰胺、聚醚、聚酯。可使用的天然多糖的示例包括纤维素、直链淀粉、葡聚糖、糊精、左旋聚糖、褐藻糖胶、卡拉胶、菊粉、支链淀粉、糖原、柠檬酸、琼脂糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质酸、海藻酸和肝素。在其他示例性实施方式中，聚合物是聚缩醛/聚缩酮和亲水性聚合物的共聚物，该亲水性聚合物选自聚丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚酯、聚正交酯、聚酰胺、寡肽、多肽及其衍生物。示例性优选聚合物R87基团为PEG、HPMA、PLA、PLGA、PVP、PHF、葡聚糖、寡肽和多肽。
在本发明的一些方面中，聚合物R87基团的分子量范围为2至200kDa、2至100kDa、2至80kDa、2至60kDa、2至40kDa、2至20kDa、3至15kDa、5至10kDa、500道尔顿至5kDa。
其他示例性R87基团为树状大分子，例如聚(丙烯亚胺)(PPI)树状大分子、PAMAM树状大分子和基于乙二醇的树状大分子。
在优选实施方式中，本发明的四嗪化合物包含药物DD而不是R87。在该优选实施方式中，药物以与R87相同的方式结合到本发明化合物的剩余部分。在本实施方式中，R87等于药物。在优选实施方式中，本发明化合物可包含一种或多种药物和一种或多种R87基团。在优选实施方式中，药物是四嗪与触发物反应后成为药物的前药。在优选实施方式中，药物是包含治疗性放射性核素、优选放射性螯合物复合物的部分。在其他优选实施方式中，包含治疗性放射性核素的部分是包含131I的有机分子。
在优选实施方式中，本发明的四嗪化合物包含成像部分而不是R87。在其他实施方式中，R87是或包含成像部分。在体内前药激活的情况下，包含成像部分的四嗪活化剂可用于激活前药，同时测量前药激活的程度。在该优选实施方式中，成像部分以与R87相同的方式结合到本发明化合物的剩余部分。在该实施方式中，R87等于成像部分。在优选实施方式中，本发明化合物可包含一个或多个成像部分和一个或多个R87基团。
优选成像部分是包含诊断放射性核素的部分，例如放射性核素螯合物络合物、放射性标记分子(例如18F、124I)和荧光染料。
在优选实施方式中，R87是或包含包含至少一种18F同位素的成像探针。
在优选实施方式中，R87等于基团RM。
在优选实施方式中，R87用于增加血液循环时间，增加与触发物的反应时间。
在要求活化剂具有细胞外分布体积的实施方式中，优选活化剂的对数P为最多2、优选最多1、更优选最多0、甚至更优选最多-1。
在要求活化剂具有细胞内分布体积的实施方式中，优选活化剂的对数P为至少-1、优选至少0、更优选至少1、甚至更优选至少2。
在要求活化剂具有胞外分布体积的实施方式中，优选该试剂在pH 7下具有负净电荷。
在要求活化剂具有细胞内分布体积的实施方式中，优选该试剂的分子量小于1000Da，优选小于500Da。
在要求活化剂具有胞外分布体积的实施方式中，优选该试剂具有大于500Da、优选大于1kDa、更优选大于2kDa的分子量。
在要求活化剂从循环中缓慢或低效地外渗到组织中的实施方式中，优选活化剂的分子量大于5kDa、优选大于60kDa、更优选大于150kDa、甚至更优选大于500kDa。
在活化剂不具有细胞渗透性的优选实施方式中，R87为蛋白质或聚合物。
在优选实施方式中，R87由于其大尺寸和/或通过存在清除导向基团而减少活化剂从血液向靶组织的外渗。例如，作为PLGA微粒的R87将允许在循环中与给药剂进行有效的IEDDA反应，但会阻碍活化剂有效外渗到肿瘤组织中，并会导致肝脏快速清除。同样，R87是一种经约10个半乳糖部分(即清除导向基团)修饰以确保肝脏快速摄取的白蛋白蛋白，在血液中提供有效的IEDDA反应，而不会或很少模拟肿瘤组织的外渗。参考Rossin等人,J.Nucl.Med.2013,4,11,1989-1995。类似地，R87可以是一个小部分，包含一个清除导向基团，有利于血液中的IEDDA反应，而不是肿瘤组织中的IEDDA反应。
相反，如果需要全身细胞外标记切割，R87可以是20或40kDa PEG或白蛋白或白蛋白结合部分，确保在循环中的长期保留，可选地与基于EPR的肿瘤组织靶向结合。
在一个实施方式中，给药剂针对给定细胞群与细胞表面分子(例如细胞表面受体或抗原)特异性结合或复合。在与受体特异性结合或复合后，细胞允许摄取给药剂，然后将其内化到细胞中。随后施用的活化剂将进入细胞并切割施用剂，在细胞内释放标记。在另一个实施方式中，给药剂针对给定细胞群与细胞表面分子(例如细胞表面受体或抗原)特异性结合或复合。在特异性结合或络合受体后，细胞不允许摄取给药剂。随后施用的活化剂将在细胞外部切割施用剂。
在以相同或不同主要目标的顺序成像程序为中心的图像循环实施方式中，优选的是活化剂系统地起作用(即在整个身体中)。在其他图像循环实施方式中，优选活化剂包含R87，其是TT并且选择性地在被成像的主要目标处切割标记。
治疗用途：
在优选的实施方式中，化合物、组合物和试剂盒用作药物。或者，所述化合物、组合物和试剂盒用于治疗患者的方法中，所述方法包括将包含在所述化合物、组合物和试剂盒中的化合物施用于受试者。
前药配置和使用：
前药是药物和TCO的偶联物并且包含在从TCO释放构建体-A后能够增加治疗作用的药物。这样的前药可以任选地对疾病靶标具有特异性。
对于式19，每个构建体A和每个构建体B独立地选自药物、靶向剂和掩蔽部分，条件是至少一种药物包含在式(19)的结构中。
在一个优选的实施方式中，CA是药物DD。在一个优选的实施方式中，当CB是靶向剂或掩蔽部分时，CA是DD。在一个优选的实施方式中，当CB是DD时，CA是掩蔽部分或靶向剂。在优选实施方式中，当CA是DD时，DD不通过间隔基SP绑定到TR或LC。在一个优选的实施方式中，至多一个CB包含在式(19)的结构中。在优选的实施方式中，触发物(TR)切割导致一个CA从一个CB切割。在另一个实施方式中，当一个LC与两个CA部分结合时，触发物裂解导致一个CA从另一个CA裂解，其中一个或两个CA可以在与二烯反应时从触发物中释放，并且其中一个CA是TT或MM另一个是DD。任选地，一种或多种CB可以另外存在并且可以独立地为TT/MM或药物。在优选的实施方式中，触发切割导致一个CA从两个或更多个CB切割。在优选的实施方式中，触发裂解导致一个CB从两个或更多个CA裂解。在优选实施方式中，触发物仅绑定到一个CA和一个CB。在其他优选实施方式中，触发物与两个CA部分结合而没有CB部分。在其他优选的实施方式中，触发物与一个CA部分结合而没有CB部分。在其他优选实施方式中，亲二烯体不包含CB部分。
在其中要从TT或MM释放DD以确保从TT或MM有效切割DD的优选实施方式中，如果有多个CB部分通过X1-X5与触发物结合，那么所有这些CB部分共同是TT/MM或DD。如果有一个或多个通过X1-X5结合的CB和一个通过LC结合的CB，则可以独立于与X1-X5结合的CB部分选择通过LC结合的CB。
如果有多个CA部分与触发物结合，通过一个接头LC(参考式19：r是1或2)结合多个CA部分，每个CA可以独立地是TT/MM或药物。
在优选实施方式中，CB不包含在X5中。
在一个优选的实施方式中，靶向前药是抗体-药物偶联物(ADC)。IEDDA哒嗪通过活化剂消除TCO来激活前药导致药物释放(图1)。在一个优选的实施方式中，包含在所述ADC中的药物是低至中等分子量的化合物，优选有机化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da，更优选约300至约1000Da)。
希望能够在靶位点选择性和可预测地激活靶向前药如ADC，而不依赖于同质渗透和靶向，以及可能在到达靶点的途中和靶点内变化的内源性激活参数(例如pH、酶)，以及从适应症到适应症以及从患者到患者。使用不依赖于选择性前药激活的内源性激活机制的生物相容性化学反应将代表癌症治疗中的强大新工具。它将范围扩大到癌症相关受体和细胞外基质靶标，这些受体不能提供ADC的有效内化，因此无法用当前的ADC方法解决。此外，在需要时和在需要时对前药的外来和选择性激活导致对前药激活、细胞内和细胞外的增强控制。最后，这种方法将最大化旁观者效应，使药物更有效地渗透到整个肿瘤组织中。
受益于有效前药方法的其他领域是基于蛋白质的疗法和免疫疗法，例如双特异性T细胞结合抗体构建体，它通过结合癌细胞和参与免疫系统来作用于癌症(Trends inBiotechnology 2015,33,2,65)。含有活性T细胞结合位点的抗体构建体遭受外周T细胞结合。这不仅可以防止偶联物进入肿瘤，还可以导致细胞因子风暴和T细胞耗竭。可光激活的抗T细胞抗体，即T细胞导向的前药，其中抗T细胞活性仅在需要时(即通过肿瘤结合臂定位肿瘤后)在照射后恢复用紫外线，已被用来克服这些问题(Thompson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.366(2008)526–531)。然而，基于光的激活仅限于光可以穿透的身体区域，并且不易用于治疗全身性疾病，例如转移性癌症。
可以从前药方法中受益的其他蛋白质是免疫毒素和免疫细胞因子，它们分别具有免疫原性和一般毒性。
亲水性聚合物(如聚乙二醇、肽和蛋白质)已被用作各种底物(如蛋白质、药物和脂质体)的可切割掩蔽部分，以降低其系统活性。然而，使用的切割策略是生物的(pH、硫醇、酶)，与ADC领域中使用的一样，具有相同的缺点。
为了避免当前前药活化的缺点，本发明利用非生物、生物正交化学反应来促使药物从前药(例如ADC)中释放。在这种类型的ADC中，在一个优选的实施方式中，药物通过触发物连接到抗体(或另一种类型的靶向剂)上，并且该触发物不被例如内源性激活。酶或特定pH值，但通过活化剂的受控给药，即与ADC中的触发部分反应的物质，以诱导药物从触发中释放(反之亦然，触发从药物中释放，但是可以查看此发布过程)(图1)。
在另一个优选的实施方式中，前药包含通过触发物与掩蔽部分结合的药物。活化剂的施用诱导药物从掩蔽部分释放，导致药物的活化。在一个具体的实施方式中，将对肿瘤靶标具有特异性的蛋白质与对T细胞上的CD3受体具有特异性的蛋白质融合，其中CD3结合结构域通过在结构域附近的半胱氨酸与包含掩蔽的触发物的缀合来掩蔽部分。在被掩蔽的双特异性蛋白与肿瘤结合后，给予活化剂导致CD3结构域的暴露和与T细胞的结合(图2)。
在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种用于前药给药和活化的试剂盒，该试剂盒包含一种药物，表示为CA，通过接头LC直接或间接连接到触发部分TR，其中TR或LC与构建体-B、CB(即靶向剂TT或掩蔽部分MM)和触发部分的活化剂结合，其中触发部分包含亲二烯体且活化剂包含二烯，亲二烯体满足式(19)。
在优选的实施方式中，CB是药物，CA是靶向剂或掩蔽部分。
在又一方面，本发明提供将药物化合物修饰成可由非生物、生物正交反应触发的前药的方法，该方法包括提供药物和将药物与满足的TCO部分化学连接的步骤公式(19)。在又一个方面，本发明提供了一种治疗方法，其中通过向所述患者施用包含药物、触发部分和靶向剂的前药来治疗患有可由药物调节的疾病的患者在通过施用活化剂激活后，药物将被释放，其中触发部分包含满足式(19)的结构。
在另一个方面，本发明是包含TCO部分的化合物，所述部分包含与药物的连接，用于动物或人的前药治疗。
另一方面，本发明是四嗪作为活化剂在生理环境中释放与满足式(19)的化合物共价连接的物质的用途。与此相关，本发明还涉及用作在生理环境中释放与满足式(19)的化合物相连的物质的活化剂的四嗪，以及在生理环境中用于活化的方法，释放与满足式(19)的化合物连接的物质，其中四嗪用作活化剂。
在优选的实施方式中，前药是药物和触发物的偶联物，因此包含在从触发物释放后优选能够增加治疗作用的药物。在前药靶向主要靶点的实施方式中，例如抗体药物偶联物的情况，前药可包含靶向剂TT，其与触发物或LC结合。
根据本发明的另一个具体实施方式，选择前药以靶向和/或解决疾病，例如癌症、炎症、自身免疫疾病、感染、心血管疾病，例如，血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧部位，例如中风、肿瘤、心血管疾病、脑疾病、细胞凋亡、血管生成、器官和报告基因/酶。
根据一个实施方式，前药和/或活化剂可以是但不限于多聚体化合物，包括多种药物和/或生物正交反应部分。这些多聚体化合物可以是聚合物、树枝状大分子、脂质体、聚合物颗粒或其他聚合物结构。
优选地，包含在前药中的任选LC是自我牺牲的，提供药物的无痕释放。
应当理解，一个TT，即CA或CB，可以用一个以上的Trigger进行修改。例如，抗体可以通过与四个氨基酸残基缀合而用四个TCO-药物构建体修饰，其中优选当CB是TT时，CA是药物，并且其中当CA是TT时，CB或另一个CA是药物。
应当理解，一个DD，即CA或CB，可以用一个以上的Trigger进行修改。例如，蛋白质药物可以通过与多个氨基酸残基缀合而用多个TCO-MM构建体修饰，其中优选当CB是MM时CA是药物，并且其中当CA是MM时CB或另一个CA是一种药物。
在其他实施方式中，用本发明的化合物消除IEDDA哒嗪用于在体内靶位点产生细胞穿透药物。参考图3，在一个具体实施方式中，含有8个连续精氨酸残基的细胞穿膜肽(CPP)由含有4个精氨酸残基的2个肽组装而成，其作为四聚体不表现出细胞穿透(Bode等人,Chem.Sci.,2019,10,701)。在图3的板1中，含有与四精氨酸部分(TT)结合的可点击切割接头的肿瘤靶向抗体与全身给药的含有药物和另一个四精氨酸部分(TT)的四嗪反应。反应导致形成与8个精氨酸残基相连的药物，然后可以穿透周围的细胞。在图3的板2中，显示了相同的概念，药物通过不同的位置结合。在图3的第3组中，含有与四精氨酸部分(TT)结合的可点击切割接头的肿瘤靶向抗体，该部分进一步与药物连接。抗体药物偶联物与全身给药的含有另一个四精氨酸部分(TT)的四嗪反应。反应导致与8个精氨酸残基相连的药物的形成和释放，然后可以穿透周围的细胞。
在其他实施方式中，用本发明的化合物消除IEDDA哒嗪用于揭示导致药物在体内靶位点处细胞穿透的细胞穿膜肽。参考图4，在一个具体实施方式中，含有10个连续精氨酸残基的聚阳离子细胞穿膜肽(CPP)被含有10个谷氨酸残基并且通过TCO接头与聚精氨酸接头连接的聚阴离子聚谷氨酸肽掩蔽。参考(Duijnhoven等人,J Nucl Med 2011,52,279)。在图4，第1组中，含有与可点击切割的TCO接头连接的聚阴离子肽的肿瘤靶向抗体又与进一步与药物连接的聚精氨酸肽结合，与全身给药的四嗪反应，导致释放一种与聚精氨酸肽相连的药物，然后可以穿透周围的细胞。在图2中，另外用掩蔽的聚精氨酸肽修饰的肿瘤结合抗体-药物偶联物(ADC)与全身施用的四嗪反应，导致聚精氨酸肽的暴露和ADC的内化。在板3中，用掩蔽的聚精氨酸肽修饰的肿瘤结合抗体与全身给药的四嗪药物偶联物反应，导致聚精氨酸肽及其与四嗪药物的伴随偶联物的暴露和释放，导致内化说的药。在第4组中，用掩蔽的聚精氨酸肽修饰的肿瘤结合抗体与全身给药的四嗪-药物偶联物反应，导致聚精氨酸肽和四嗪-药物的伴随偶联物暴露于抗体，导致内化原位形成的ADC。在一些优选的实施方式中，聚阴离子和聚阳离子肽具有8个氨基酸的长度。在其中本发明用于揭示导致药物在体内靶位点处细胞穿透的细胞穿膜肽的一些优选实施方式中，所述药物是或包含治疗性放射性部分。
在其他实施方式中，用本发明的化合物消除IEDDA哒嗪用于体内组装药物。在一个示例性实施方式中，并且在与上述使用的CPP类似的方法中，作为前药的药物是CB并且TT是CA。在与主要目标结合后，与作为前药的药物结合的活化剂被施用并与主要目标上的触发物反应。这导致两个前药部分同时结合，形成活性药物，并从TT释放药物。
在其他实施方式中，前药包含通过TR结合到聚合物、凝胶、固体材料(例如可植入药物贮库的)或生物分子反应性部分例如R32的药物，并且该前药直接施用到/靠近区域兴趣(例如肿瘤)，导致前药的局部固定，随后可以通过局部或全身施用活化剂来激活。相反，在其他实施方式中，活化剂与作为聚合物、凝胶、固体材料(例如可植入药物贮库的)或生物分子反应性部分(例如R32)的R87结合，并直接施用到/靠近兴趣区域(例如肿瘤)，导致活化剂的局部固定，其可以局部激活随后(局部或全身)施用的前药(例如，没有TT)。在另一个实施方式中，与靶向剂结合的活化剂被全身施用并允许与主要靶标结合，之后非靶向或靶向前药被全身施用并在主要靶标处被激活。在一些实施方式中，前药由两种结构组成，它们是相同或不同的药物DD，并且一种或两种DD在TR裂解时被激活。在一些实施方式中，前药包含两种不同的DD，其中一种DD除了作为DD之外还用作靶向剂TT。在一个特别优选的实施方式中，一个或两个DD在TR切割时被激活。
在其他实施方式中，活化剂用于激活靶向结合的前药，例如肿瘤结合ADC，包含药物，例如治疗性放射性部分(例如与四嗪缀合的177Lu-DOTA螯合复合物)以增强释放药物的治疗效果。例如，已知治疗性辐射(例如β发射)可刺激抗癌免疫反应。通过释放抗癌药物并同时激活免疫系统，可以获得更大的抗癌效果。在优选的实施方式中，释放的药物是细胞毒性分子，将与治疗辐射(低或高剂量)组合。在优选的实施方式中，释放的药物是辐射增敏剂，与治疗辐射(低或高剂量)组合。在其他实施方式中，释放的药物是免疫调节剂(例如，TLR激动剂或细胞因子)，以与治疗辐射(低或高剂量)组合。
在一个优选的实施方式中，前药是放射增敏剂药物。然后，优选将该前药与放射性标记的二烯组合。因此，在前药和放射性标记的二烯之间发生反应时，放射增敏剂被释放，并且来自放射性标记的二烯的辐射可以增强。
在另一个实施方式中，前药包含通过TR与药物结合的TT，其中药物是或包含治疗性放射性部分，并且其中任选地在靶位点释放放射性部分，例如在靶位。与放射性部分保持与TT结合的情况相比，肿瘤可能会导致更深和更均匀的放射性穿透和分布。
药物失活：
在其他实施方式中，用本发明化合物消除IEDDA哒嗪用于在体内使药物失活。在这些实施方式中，式(19)化合物可称为可失活药物。在这些实施方式中，允许药物在体内循环并发挥其治疗作用，并且在最佳间隔后，通过施用四嗪使药物失活，导致药物的裂解及其失活，减少不期望的副作用。可以以这种方式失活的示例性药物包括生物分子，其中一个(生物)分子通过触发物(如CA或CB)连接到另一个(生物)分子，并且该(生物)分子-(生物)分子偶联物具有治疗活性，而裂解的生物分子则没有。典型的药物偶联物是蛋白质-蛋白质、肽-肽、蛋白质-肽、蛋白质-有机分子和有机分子-有机分子偶联物。
因此，式(19)化合物可以是药物和TCO的结合物，并且其包含活性药物(例如CA)，其治疗活性在从TCO释放构建体-A后降低。在此实施方式中，式(19)化合物具有治疗活性，而在IEDDA反应后获得的化合物的治疗活性较低，或者甚至不具有显着的治疗活性。
在此实施方式中，药物可如本文针对其他实施方式所述，尤其是关于前药，偶联至式(19)化合物的剩余部分。
在优选实施方式中，药物失活是在空间上控制的，而不是在时间上控制的，或者是在时间上控制的之外控制的。例如，活化剂可被特定地施用到不希望系统施用药物起作用的身体部位，例如特定器官，而药物在其他部位/系统地保持活性。相反地，可以系统地施用活化剂以使循环中的药物失活，同时在特定位置(例如器官或疾病部位)保持药物活性。
在一些实施方式中，药物由两种结构物组成，它们是相同或不同的药物DD，并且一种或两种DD在TR裂解时失活。在优选实施方式中，施用TT-TR-DD结合物导致药物在靶组织中积累和治疗活性，之后，在所需的时间和/或位置施用四嗪，以从TT中切割DD，从而降低主要靶点的治疗或毒性作用。
给药前药或可失活药物：
在优选实施方式中，当将前药或可失活药物和活化剂施用于活体系统(例如动物或人类)时，首先施用(前)药物，并且在前药达到主要靶点之前将需要一定时间段。这段时间可能因申请不同而有所不同，可能是几分钟、几天或几周。在选择的时间段过后，给药活化剂，发现(Pro)药物并与之反应，从而(去)激活(Pro)药物和/或在主要靶点释放药物。在一些优选实施方式中，(Pro)药物和活化剂的施用之间的时间间隔在10分钟到4周之间。在一些优选实施方式中，施用(前)药物和活化剂之间的时间间隔为1小时至2周、优选1小时至168小时、更优选1小时至120小时、甚至更优选1小时至96小时、最优选3小时至72小时。
本发明的化合物和组合可以通过不同的途径施用，包括但不限于静脉或皮下注射、腹腔内注射、局部注射、口服给药、直肠给药和吸入。本领域技术人员已知适合于这些不同类型给药的配方。(Pro)根据本发明的药物或活化剂可与药学上可接受的载体一起施用。本文所用的合适的药物载体涉及适合于医疗或兽医目的的载体，其无毒或不可接受。此类载体在本领域中是众所周知的，并包括例如生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。其制定应与管理模式相适应。
可以理解的是，管理的化学实体。(前)药物和活化剂可以是不改变所述化学实体(例如盐、水合物或其溶剂化物)的化学功能性的改性形式。
在施用前药之后和施用活化剂之前，当循环中的前药活化是不希望的，并且当天然前药清除不足时，优选通过清除剂去除多余的前药。清除剂是给受试者施用的一种药剂、化合物或部分，其目的是与被施用的药剂(在本例中为前药)结合或络合，其中多余的将从循环中去除。清除剂能够被引导从循环中移除。后者通常是通过基于肝脏受体的机制实现的，尽管如技术人员所知，存在其他从循环中分泌的方式。在本发明中，用于去除循环前药的清除剂优选包括亲二烯基部分，例如如上所述，能够与前药的四嗪部分反应。
在优选实施方式中，首先施用活化剂，然后施用(前)药物，其中施用两种组分之间的时间间隔范围为1分钟到12周，优选1分钟到2周，优选10分钟到3天。
在优选实施方式中，同时施用(前)药物和活化剂。要么作为两个独立的给药，要么作为联合给药。
在又一个实施方式中，在给药之前(前)药物和活化剂彼此反应，然后给药所得反应混合物，其中反应开始和给药之间的时间间隔为1分钟到3天，优选1分钟到1天，更优选1分钟到3小时。
在体内从生物分子中切割成像和放射治疗标记：
本发明的化合物、组合物和试剂盒可用于快速降低受试者体内的放射性核素含量。具体而言，本发明的化合物、组合和试剂盒可用于在清除过程中增加显像剂或放疗剂的靶-非靶比率，更具体地说，可用于更快地达到这种增加。在本申请中，式(19)化合物包含标记(优选包含放射性核素的分子)和给药剂(优选抗体)，其在与二烯反应后可分离。即，标记和给药剂中的一个是R48的一部分，另一个绑定到X1-X5中的任何一个，或者标记和给药剂都是R48的一部分，但都连接到自分解链接器。
在首选实施方式中，其中主要靶点是内化受体，并且希望在血液中而不是在主要靶点上选择性地从给药剂上切割标记，活化剂优先设计为不渗透细胞。在所述实施方式中，其中所述标记是螯合物，那么所述活化剂可以是内化的或非内化的，因为所述裂解的螯合物不能逃逸目标细胞。
在优选实施方式中，其中所述主要靶点是非内化受体，并且希望在血液中而不是在主要靶点处切割所述标记，所述活化剂优选地被设计为不易渗透到组织中并迅速清除，以最小化在主要靶点处的反应，同时在血液中实现切割。
在优选实施方式中，活化剂不渗透细胞，以增加存在于非靶点(例如血液)中的式(19)化合物的选择性裂解。
在优选实施方式中，活化剂的性质(例如，细胞通透性和外渗水平)通过适当选择的R87基团(参见infra)实现。
优选地，活化剂与体内相关组织中存在的给药剂的反应导致放射性降低至少20％，更优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％。
在一个方面，本发明涉及用作药物的本发明化合物、组合物或试剂盒。或者，本发明试剂盒用于治疗或成像患者的方法，所述方法包括向受试者施用本发明试剂盒中包含的化合物。
在另一方面，本发明涉及本发明的化合物、组合物或试剂盒，用于治疗疾病，优选癌症，治疗受试者，优选人类。最好是放射治疗。
本发明还涉及本文定义的受试者治疗方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向受试者施用如本文所定义的式(19)化合物；
(b)向所述受试者施用本文定义的活化剂；
优选地，该方法用于治疗所述受试者中的癌症。
在另一个实施方式中，首先执行步骤(b)，允许活化剂积聚在需要免受辐射的非目标组织中；步骤(a)进行，使辐射靶向目标组织，同时通过预定位活化剂在非目标组织中切割和去除标记。同样，与全身静脉注射相比，活化剂可以局部注射，即直接注射到需要保护的组织中。
本发明的一个突出应用是针对内化癌受体(如HER2)的放射免疫疗法。在这种方法中，HER2靶向抗体曲妥珠单抗(Tmab)用例如三种TCO螯合物结构修饰，如下所示。TCO螯合物构建物(NHS-TCO-DOTA)包含用于赖氨酸结合的活性酯、TCO接头和用于117Lu标记的DOTA螯合物，后者是一种治疗性β发射体。在对Tmab进行117Lu标记并静脉注射(i.v.)后，允许117LuTmab循环，在乳腺癌或卵巢癌部位结合HER2靶点，允许时间内化(约2天)，然后静脉注射含有四嗪的活化剂，从自由循环的Tmab中切割117Lu-DOTA结构，导致通过肾脏快速清除117Lu-DOTA结构，并大幅减少骨髓的辐射剂量。通常，活化剂是亲水性的，因此不具有细胞渗透性，因此不会在靶细胞内切割117Lu Tmab。然而，即使活化剂是细胞通透性的，并且在靶细胞内切割117Lu-Tmab，通常释放的117Lu-DOTA仍将被捕获在细胞内。
Figure BDA0003509271520001701
此外，如果活化剂在肿瘤中的摄取量较低或较慢，则非内化癌症受体也可以用作上述示例中的主要靶点。例如，活化剂可包含直径约为500nm的可生物降解PLGA颗粒核心，用四嗪部分改性。这种颗粒将通过肝脏从血液中快速清除，确保其只能与循环中含有TCO的结构物反应，并且不会在肿瘤中积聚，如之前对四嗪清除剂Rossin等人所述，J.Nucl。医学；2013,4,11,1989-1995；以及WO2012085789A1]。对于成像应用，可接受在靶点处缓慢累积，在这种情况下，可使用白蛋白结合部分或蛋白质或聚合物(例如PEG)修饰四嗪，最大限度地提高其在循环中的保留率，从而促进其在循环中与TCO构体的反应。
在本发明的另一个实施方式中，随后施用式(19)化合物和活化剂允许调节释放标记的血液循环和排泄途径。
在117Lu Tmab RIT的情况下，在细胞内化后，注入一种活化剂，其包含例如用短PEG聚合物官能化的四嗪，并结合TCO触发物，导致TCO和抗体之间的键断裂。随后，携带PEG的177Lu DOTA螯合物在循环中释放，并通过PEG通过肾脏清除。
Figure BDA0003509271520001711
在类似的方法中，活化剂不是线性或支化聚合物，而是携带一个或多个影响释放部分清除途径的官能团。例如，包含四嗪和几个半乳糖基团的活化剂将产生一个释放的部分，该部分与肝细胞中的Ashwell受体结合，从而导致标记物的快速肝胆清除。
在本发明的另一优选实施方式中，靶向剂是肽、抗体片段或携带可成像或治疗性放射性螯合物的小分子，其特异性地积聚在肿瘤或另一病变组织中并内化到靶细胞中，但也非特异性地保留在非靶器官中，例如但不限于肾脏、唾液腺和泪腺(如RGD肽和PSMA的情况，见下文)。在这种方法中，标记(例如177Lu或225Ac标记的DOTA或89Zr标记的DFO)通过TCO触发物与靶向部分连接。静脉注射给药剂后，以及该给药剂在病变组织中累积并内化到靶细胞后(例如，注射后4至24小时)，患者静脉注射活化剂。活化剂在非靶器官中特异性地结合给药剂上的TCO触发物，并释放标记，从而诱导放射性通过尿液从这些器官流出。这降低了输送到非靶器官的放射性剂量，从而增加了本发明目标给药剂的治疗指数，并降低了在核成像程序中对患者产生毒性副作用的可能性。
Figure BDA0003509271520001721
在本发明的又一个实施方式中，给药剂包括TCO触发物，其通过自分解接头与靶向剂和成像或治疗部分(标记)共轭。四嗪与引发剂反应，产生电子重排的中间体，导致连接剂断裂，标记从靶向剂上分离。因此，作为一个小分子，标记会迅速从受试者的血液循环中清除，尤其是通过肾脏。
Figure BDA0003509271520001731
在本发明的另一个实施方式中，施用剂包含可成像或治疗部分，该部分通过TCO触发物与靶向剂结合，该靶向剂结合存在于疾病部位和由于脱落而在循环中的特定受体或分子。脱落靶点的非限制性例子包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)受体。在存在靶脱落的情况下，与循环靶结合的给药剂是有害的，因为它会导致图像对比度损失和/或医疗干预对象的毒副作用。通过本发明的方法，将给药剂静脉注射到动物或人类受试者体内，并在疾病部位和循环中与其靶结合。在适当的时间(一天或两天)后，向受试者静脉注射四嗪活化剂，所述活化剂与循环(结合)给药剂上的TCO触发物发生特异性反应。四嗪与TCO反应后，可成像或治疗部分从给药剂中释放，并迅速从循环中清除。
在一个优选实施方式中，本发明用于减少肾脏剂量而不是骨髓剂量。在该实施方式中，作为完整IgG抗体的给药剂用225Ac标记，并允许其结合其主要靶点，例如HER2、PSMA。225Ac有一系列子体同位素，当225Ac第一次衰变时，核素与DOTA和给药剂分离，导致肾脏摄取游离子体221Fr。及时注射活化剂可导致血液中的快速反应，并通过肾脏消除DOTA-225Ac，减少肾脏的221Fr辐射剂量。
在另一个实施方式中，主要靶点是血癌细胞上的受体，即AML细胞上的CD33，并且给药剂是用DOTA-225Ac标记的抗D33单克隆抗体。在CD33结合和内化后，自由循环的单克隆抗体的DOTA-225Ac标记被切割，以降低对肾脏以及骨髓、肝脏和脾脏的辐射毒性。
此外，本发明涉及一种诊断方法，包括以下步骤：
(a)向受试者(优选人)施用如本文所定义的式(19)化合物；
(b)向所述受试者施用本文定义的活化剂；
(c)根据存在于受试者中的式(19)对化合物成像以收集数据；
(d)将所述数据与标准值进行比较；
(e)在比较过程中发现与所述标准值的显着偏差；
(f)将显着偏差归因于特定的临床表现，最好归因于癌症。
诊断方法：
本发明还涉及本文定义的式(19)化合物、本文定义的组合或本文定义的试剂盒，用于包括以下步骤的诊断方法：
(a)向受试者(优选人)施用如本文所定义的式(19)化合物；
(b)向所述受试者施用本文定义的活化剂；
(c)根据存在于受试者中的式(19)对化合物成像以收集数据；
(d)将所述数据与标准值进行比较；
(e)在比较过程中发现与所述标准值的显着偏差；
(f)将显着偏差归因于特定的临床表现，最好归因于癌症。
优选地，在诊断方法中，根据式(19)的化合物满足本文定义的条件(i)、(ii)或(iii)中的至少一个。
非治疗方法：
本发明还涉及一种非治疗性方法，用于在本文定义的受试者(优选人)中成像本文定义的式(19)化合物，所述非治疗性方法包括以下步骤：
(a)向受试者施用本文定义的式(19)化合物；
(b)向所述受试者施用本文定义的活化剂；
(c)根据主体中存在的式(19)对化合物进行成像。
在此，优选地，式(19)化合物和活化剂中的至少一种包含从放射性核素、荧光染料和磷光染料组成的组中选择的标记。
优选地，在用于成像的非治疗性方法中，根据式(19)的化合物满足本文定义的条件(i)、(ii)或(iii)中的至少一个。
在优选实施方式中，首先执行步骤(a)，其次执行步骤(b)，然后执行步骤(c)。在该实施方式中，优选地，在步骤(a)之后等待足够的时间之后执行步骤(b)，使得根据式(19)的化合物的初始剂量的显着部分，优选地至少10％，更优选地至少50％达到目标。优选地，在本实施方式中选择活化剂和/或其剂量，以确保已达到目标的根据式(19)的化合物未被大量切割，优选小于30％，更优选小于10％。这样，在步骤(b)中，在步骤(c)中成像之前，可以优化放射性核素的目标背景比。
优选地，在本实施方式中，在步骤(c)之后执行进一步的步骤(b)，以便在成像后快速减少被摄体中的放射性核素的量。
在另一个实施方式中，首先执行步骤(a)，其次执行步骤(c)，然后执行步骤(b)。这样，成像后受试者体内放射性核素的数量可以迅速减少，以减少全身辐射剂量和/或选择性地允许另一个成像程序(图像循环)。
在另一个实施方式中，首先执行步骤(b)，允许活化剂积聚在需要防止辐射或以其他方式会模糊主要目标成像的非目标组织中；第二步(a)进行，使辐射靶向目标组织，同时通过预定位活化剂在非目标组织中切割和移除标记；然后进行步骤(c)。
同样，与全身静脉注射相比，活化剂可以局部注射，即直接注射到选定的非靶组织中。
本发明还涉及用于在受试者(优选人)中成像根据本发明的化合物的非治疗性方法，所述非治疗性方法包括以下步骤：
(a)向受试者施用如本文所定义的式(19)化合物，其包含标记；
(b)根据存在于受试者中的式(19)对化合物成像；
其中所述标记选自由放射性核素、荧光染料和磷光染料组成的组。
类似的程序也可用于放射免疫治疗。
本发明可用于用曲妥珠单抗(Tmab)改善HER2的放射免疫成像。在该方法中，使用例如2种TCO-DFO螯合物结构对Tmab进行修饰，如下所示，其中Tmab通过巯基马来酰亚胺化学进行共轭。在Tmab的89Zr标记和静脉注射(i.v.)后，89Zr-Tmab允许循环，在乳腺癌或卵巢癌部位结合HER2靶点，允许内化时间(约2天)，然后静脉注射包含四嗪的活化剂，将89Zr-DFO标记从自由循环的Tmab上切割，通过肾脏快速清除89Zr-DFO结构物，并大幅改善靶区成像中的肿瘤血比。
Figure BDA0003509271520001761
在与上述HER2成像示例类似的方法中，本发明可用于正在开发的抗体药物的伴随成像，以穿过血脑屏障(BBB)治疗例如阿尔茨海默病。在这种方法中，治疗性抗体可以用附加的结合转铁蛋白受体的结构域修饰，从而导致BBB的交叉。由于只有少量会穿过BBB并结合到其主要靶点，并且大量仍会在血液中自由循环，传统的成像方法(例如用89Zr标记抗体)受到非常差的靶-非靶(T-NT)比率的阻碍。将上述可切割的DFO TCO马来酰亚胺结构物与抗阿尔茨海默病抗体结合，用89Zr标记，静脉注射，然后进行一段时间的靶向摄取，将允许在所需时间点切割自由循环的89Zr抗体，使循环抗体基本上不可见，同时在目标部位保留89Zr信号，提高T-NT比率。这种方法还允许区分已穿过BBB的89Zr抗体和已在大脑中结合但未穿过BBB的部分，或BBB受损的部分。在该实施方式中，二烯烃优选设计为其确实渗出，但不显着渗透BBB。在另一优选实施方式中，二烯烃的设计使其不会外渗到其他组织中。
在本发明的又一实施方式中，给药剂是用于磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)的大分子(例如白蛋白、葡聚糖、胶束、纳米粒子、纳米乳液或树状大分子)血池造影剂(H.Kobayashi and M.W.Brechbiel,Adv.Drug Deliv.Rev.2005,57,p.2271-1186andH.Lusic and M.W.Grinstaff,Chem.Rev.2013,113,p.1641-1666)。
对比剂携带多份螯合顺磁离子(例如用于MRI的Gd3+、Mn2+、Dy3+和Tm3+)，或用于CT的高原子序数元素(例如碘)。由于它们的高分子量，它们在血管内的半衰期很长，可以获得高质量的血管造影图像。然而，由于这些成像方式的内在敏感性较低，向患者注射大量对比剂(MRI和CT分别需要mM到M的浓度)，由于重金属和重原子在肝脏等排泄器官的长期累积，因此存在有毒副作用的风险。
本发明的MRI和CT造影剂的非限制性示例如下所示。在这些给药剂中，对比剂生成部分(标记)通过TCO触发物与支架相连。注射造影剂后和图像采集结束时，静脉注射活化剂会导致大分子支架和标记之间的键断裂。血液中释放的标记随后通过肾脏迅速消除。由于体积较小，在肝脏释放的标记会再循环到血液中，并通过肾脏清除，或者直接通过肠道快速清除。
Figure BDA0003509271520001781
施用：
当向受试者(例如动物或人)施用式(19)化合物和活化剂时，在优选实施方式中，首先施用式(19)化合物。式(19)化合物达到主要靶点，并选择性地在细胞内内化或穿过血脑屏障，需要一定的时间。该时间段可能因应用不同而不同，例如分钟或小时。在选择的时间段过去之后，施用活化剂，其与式(19)化合物反应以优选在非靶组织中使施用剂和标记解耦。在一些优选实施方式中，施用式(19)化合物和活化剂之间的时间间隔在10分钟到4周之间。在一些优选实施方式中，式(19)化合物和活化剂的施用之间的时间间隔为1小时至2周，优选1小时至168小时，更优选1小时至120小时，甚至更优选1小时至96小时，最优选3小时至72小时，更优选地仍然在4到48小时之间，并且最优选地在5到24小时之间。
本发明的化合物和组合可通过不同途径投与，包括但不限于静脉或皮下注射、腹腔内注射、局部注射、口服、直肠投与和吸入。本领域技术人员已知适合于这些不同类型给药的配方。根据本发明的式(19)化合物或活化剂可与医药上可接受的载体一起施用。本文所用的合适的药物载体涉及适合于医疗或兽医目的的载体，其无毒或不可接受。此类载体在本领域中是众所周知的，并包括例如生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。其制定应与管理模式相适应。
可以理解的是，管理的化学实体。式(19)化合物和活化剂可以是不改变所述化学实体(例如盐、水合物或其溶剂化物)的化学功能性的改性形式。
在优选实施方式中，首先施用优选包含靶向剂的活化剂，然后施用式(19)化合物。优选地，在式(19)化合物和活化剂大约同时施用的实施方式中，它们通过不同的途径施用。
受试者：
如本文所用，“受试者”指任何动物，优选哺乳动物，最优选人类。本文使用的术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、非人类灵长类动物(NHP)，例如猴子或猿、人类等，更优选人类。
非治疗性使用：
本发明还涉及如本文所定义的式(19)化合物、如本文所定义的组合或如本文所定义的试剂盒用于在受试者(优选人类)中成像的用途。在该用途中，式(19)化合物优选地包括标记和给药剂，并且更优选地，式(19)化合物满足本文定义的条件(i)-(iii)中的任一条件。
本发明涉及根据本发明的化合物或根据本发明的组合的治疗用途，用于在受试者(优选人类)中成像，其中所述化合物或在所述组合的情况下，所述根据式(19)的化合物和二烯中的至少一种，包括从放射性核素、荧光染料和磷光染料中选择的标记。
体外应用：
本发明提供了一种用于控制释放结合物(结合到任何载体或任何其他化学基团)的工具，用于多种应用，包括但不限于药物递送、化学生物学、诊断学、有机、蛋白质和材料化学、放射化学、捕获和释放树脂，生物和化学传感器、表面图案或修饰、细胞和组织培养以及生物分子操作(例如接合、交联、捕获、释放)。
特别是，释放可以在化学复杂的环境中进行，包括有机合成和材料合成、生物环境，其中包括生物分子的合成和处理条件。这包括各种化学功能、有机溶剂、水溶剂、生物介质和组织及细胞裂解物的存在。本发明优选地涉及在环境温度下的体外释放。
本发明在一个方面提供了四嗪作为活化剂的用途，用于在化学、生物或生理环境中释放连接到反式环辛烯的结构。本发明中的术语“构造”用于表示任何物质、载体或化学基团，其希望首先使其处于束缚(或掩蔽)状态，并且能够促使其从该状态释放。该构造可能以两个或多个构造的形式存在，通过自分解链接器链接。
本发明在一个方面包括一种触发物，其作为保护或掩蔽基团在有机、肽、蛋白质、生物、表面、固相化学中使用。
本发明在一个方面包括一种触发物，其作为可切割的掩膜或连接器，用于有机和生物有机合成、材料科学、化学生物学、诊断学和医学。本发明可用于操纵小分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、聚合物、聚糖、纳米颗粒和表面(例如玻片、金、树脂)。进一步的例子包括：化合物库合成、蛋白质工程、功能蛋白质组学、基于活性的蛋白质分析、酶抑制剂的靶向合成、细胞表面的化学重塑、代谢物类似物的追踪，以及活细胞中标记的生物分子的成像。其中，当用作掩模时，参考式5a和5b：f优选为0。其中，当用作连接器时，参考式5a和5b：f优选为1。
通过与活化剂的反应选择性地移除触发物，可以揭开该结构的伪装。可被保护和选择性脱保护的示例性化学部分包括但不限于胺、硫醇、羟基、羧酸、氨基氧基。
此外，活化剂可与树脂(尤其是固相合成树脂，例如聚苯乙烯)或珠结合。从而避免了脱保护步骤后溶液相纯化的需要。其中，参考式(4)、(4a)或(6)-(14)中的任何一种，R87是聚合物、树脂或珠。
A
Figure BDA0003509271520001812
Figure BDA0003509271520001811
对于蛋白质等生物分子，可在蛋白质形成后或在蛋白质合成过程中，通过基因结合经触发物修饰的氨基酸引入触发物。有许多研究表明，蛋白质中含有非天然氨基酸，包括TCO和四嗪(例如，Chalker等人；Acc Chem Res,Vol.44,No.9,2011,730–741)。例如，通过这种方式，我们可以在分子的其他地方进行生物结合化学，之后TCO掩蔽的氨基酸可以被揭开并选择性地操纵。因此，这种所谓的“标记和修饰”方法允许对单个蛋白质进行多种不同的翻译后修饰，并可扩展到复杂材料、蛋白质、细胞和组织的可控组装和裂解。可用于此类方法的掩蔽氨基酸衍生物示例如下所示。化合物A是一种氨基酸半胱氨酸，其巯基功能被TCO掩盖。释放TCO后，硫醇可用于共轭反应。除了实现选择性之外，掩盖和揭开巯基的能力还能够稳定含巯基的蛋白质，防止意外氧化和二硫化物的形成。化合物B是通过其e-胺部分与TCO共轭的氨基酸赖氨酸。化合物C是通过其e-胺部分与TCO掩蔽的氨基氧基官能团共轭的氨基酸赖氨酸。揭开伪装后，氨基氧基可以选择性地与醛和酮衍生物结合。化合物D是通过其羟基部分与TCO共轭的氨基酸丝氨酸。化合物E是通过其γ-羧酸部分与TCO共轭的氨基酸-谷氨酸。
Figure BDA0003509271520001821
在下面描述的类似实施方式中，TCO掩蔽用于稳定例如储备溶液中的蛋白质配方，以防止聚集和沉淀。为此目的，将TCO官能化，其中CB为亲水性部分，例如PEG(或例如碳水化合物部分)，并且一个或多个TCO-CB基团通过例如赖氨酸残基与蛋白质(即CA)共轭。在使用时，蛋白质溶液与产生未掩蔽父蛋白CA的活化剂接触。在这里，使用与固相合成树脂或珠结合的活化剂可能是有利的，因此避免了在未掩蔽步骤后进行溶液相纯化的需要。
Figure BDA0003509271520001831
在另一个实施方式中，触发物用作表面图案化或蚀刻中的化学可切割掩模，应用于例如空间控制的细胞和组织培养，或用于(例如蛋白质、DNA)微阵列组装。选择性去除掩膜揭示出例如游离胺或巯基部分(包含在CA中)，其可用于进一步修饰，例如用于细胞培养的外壳表面中细胞粘附肽的接合。例如，TCO可用作在细胞培养中使用的表面或表面涂覆的凝胶与细胞相互作用部分(例如整合素粘合剂)之间的可切割连接物。在该表面或该3D中进行细胞培养后，可以通过轻微的TCO裂解将细胞从表面或表面涂层凝胶中移除，而不是诉诸于剧烈的胰蛋白酶化或物理力。
Figure BDA0003509271520001841
在替代实施方式中，TCO掩膜用于在空间和/或时间上控制体外或体内生物分子的作用。例如，体外分析中特定酶的作用可以通过使用通过与一个或多个TCO口罩结合而失活的酶来控制，然后将酶与活化剂接触，然后释放TCO口罩，并提供母体活性酶(CA)。参考[Li等人，Nat.Chem.Biol.，2014，10，1003-1005；Zhang等人，ACS Central Sci.2016，2，5，325-31]。另一个在化学生物学中有用的例子是TCO保护蛋白质中的某些氨基酸残基免受酶作用，例如激酶磷酸化，从而允许在添加活化剂后对磷酸化进行空间和时间控制。或者，磷蛋白中的磷酸氨基酸可以被TCO掩蔽，以通过使用活化剂在所需时间显示，如Rothman等人(2005)J.Am使用光激活掩膜的类似方法所示。化学。Soc，127847。
在本发明的另一个方面中，触发物用作“捕获和释放”系统中的可切割连接物，例如化学生物学中使用的系统。其中，参考式5a和5b：f优选为1。
这些接头的一个应用是纯化用生物素化活性探针(ABP)标记的蛋白质。生物素化ABP通常用于富集捕获的酶，例如，通过用链霉亲和素包裹的珠子下拉。然而，这种方法的主要缺点是，从珠子中释放捕获的蛋白质的条件很苛刻(煮沸样品，无论是否存在未改性的生物素)，并且除了目标蛋白质之外，内源性生物素化蛋白质和(变性)链霉亲和素都可能最终进入样品中。此外，生物素的存在使MS/MS分析复杂化。此外，在另一个应用中，该概念可用于捕获和释放带有例如与珠或固体载体结合的抗体的整个细胞，例如用于需要健康完整细胞的FACS的进一步分析。有几个研究小组已经开发出接头系统，可以整合到ABP中，或者也可以整合到用于两步ABPP的生物正交试剂中，并且可以在亲和力下拉后以化学选择性方式切割。示例包括二硫化物、重氮苯和双芳基肼可裂解连接物(Willems L.I.等人(2011)Acc.Chem.Res.44,718-729)。然而，这些接头具有有限的生物正交性。在下面的方案中，示出了用于该应用的触发物的几个实施方式示例。除了增强的生物正交性，该方法还提供了引入新标记或亲和标记的机会，或通过四嗪活化剂与TCO的结合，保留合成手柄以进行进一步修饰。
示例A1描述了ABP通过TCO接头与生物素结合捕获酶。该复合物随后被链霉亲和素包被的珠粒结合并分离，之后连接物被活化剂切割，并且包含与IEDDA残基连接的ABP的酶被释放。在示例A2中，相同的概念用于反向触发，导致ABP酶复合物的无痕释放。示例B描述了一种类似的2步ABP方法，其中酶被叠氮化物部分功能化的ABP捕获。该复合物随后与环辛炔部分反应，环辛炔部分通过TCO连接剂与生物素连接。Weissleder-Angewandte Chemie2011中已经表明，TCO/四嗪对可以与叠氮化物-辛烯对正交使用，并且存在叠氮化物-辛烯对。在示例C中，使用B中所述的环辛炔TCO生物素探针方法捕获特定蛋白质，该蛋白质在代谢上并入叠氮化物修饰的氨基酸。示例D描述了使用通过触发物与抗体结合的磁珠对细胞进行电容化。在使用磁性作用结合和分离细胞后，通过添加活化剂在温和条件下分离细胞。示例E描述了示例A-D中的一般方法的替代方法，其中TCO将生物素标记的功能与可释放链接器的功能结合起来。在本例中，靶细胞首先被TCO修饰的抗体结合，然后添加四嗪包被的珠粒。适当选择的四嗪TCO对将提供半衰期>2小时的释放，并提供<10分钟的所需反应时间，因此在复合物通过释放连接物自动释放细胞之前，允许有足够的时间分离珠细胞复合物。
A1
Figure BDA0003509271520001861
A2
Figure BDA0003509271520001862
Figure BDA0003509271520001871
Figure BDA0003509271520001881
Figure BDA0003509271520001891
本发明的另一个方面包括作为固体载体与固体载体结合物之间的化学选择性可裂解接头(cleavable linker)的触发物。其中，参考式5a及5b:f优选为1。
在一个实施方式中，触发物用作固相合成(solid phase synthesis)中的可裂解接头。在过去的几十年中，固相合成方法已用于有机合成，首先用于肽，然后用于寡核苷酸，然后是其他有机分子。这种发展伴随着各种可裂解接头的开发，用于从固体支持树脂上分离分子。例子包括可以被酸、碱、氟离子或光化学反应裂解的接头(Maruta等人，Tetrahedron Letters 47(2006)2147–2150；Shabat等人，Chem.Eur.J 2004,10,2626)。另一种生物正交方法可以扩大兼容功能的范围。在此，固相合成树脂(如聚苯乙烯)用TCO触发物功能化，在其上合成目标分子(例如肽)。合成完成后，添加活化剂，它与触发物反应，将产物(例如肽)从树脂结合的触发物中释放到溶液中。
Figure BDA0003509271520001901
替代固相合成化合物:
Figure BDA0003509271520001911
下面直接显示的替代实施方式包括在盒(cartridge)或芯片实验室(lab on achip)装置的中选择性释放及激活表面结合的化学试剂。
Figure BDA0003509271520001912
在又一方面，触发物用作用于可逆生物分子交联和/或固定，随后释放的可切割接头。在化学生物学中的应用包括：(a)使用通过TCO连接在一起的两种蛋白质，并研究它们在例如TCO裂解前后的细胞环境；(b)在细胞中裂解蛋白质-TCO-靶向剂偶联物，以从特定的亚细胞结构域释放蛋白质；(c)在细胞中切割蛋白质靶向剂-TCO偶联物，以将蛋白质靶向特定的亚细胞结构域(参见Lim Acc Chem Res 2011)。
在另一个实施方式中，CA是掩蔽抗原(masked antigen)，例如，掩蔽肽，其包含通过触发物连接到掩膜的肽，其任选地存在于主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex，MHC)中，并且可在所需时间在体外揭穿。
在另一个实施方式中，CA是DNA或RNA，CA通过触发物连接到转染剂(即CB)，设计用于在体内或体外将DNA或RNA传递到细胞中。转染后，注入一种活化剂，所述活化剂可无痕迹地从转染剂中释放DNA或RNA。
在一个实施方式中，触发物用作生物分子生物素化剂中的可裂解接头，用于生物分子检测、分离和纯化。因此，利用生物分子反应性触发生物素偶联物将生物素裂解(可逆)附着到肽、蛋白质(例如，细胞表面蛋白质)、糖蛋白、DNA及其他生物分子上。在使用固定化亲和素或链霉亲和素亲和纯化生物素化蛋白质后，可裂解接头允许结合的生物分子轻微分离。参考下面的方案，探针A可用于蛋白质中赖氨酸残基的生物转化。当R＝SO3Na时，此试剂将保持带电并在细胞外空间中，特别适用于标记细胞膜蛋白。探针B是氨基氧基生物素试剂(aminooxy-biotin reagent)，探针C是酰肼生物素试剂(hydrazide-biotin reagent)，因此B及C可用于生物素化糖蛋白和其他具有可氧化多糖基团的分子。化合物D-F是一种光活化试剂，可使核酸和其他不具有可用于偶联的胺或巯基的分子生物素化。当暴露在强紫外线或可见光下时，D-F的芳基叠氮化物基团转化为反应性硝基烯，所述硝基烯容易与多种化学基团(例如，核酸)反应形成共价键。化合物G使抗体、含半胱氨酸的肽和其他含硫醇的分子能够简单有效地可逆生物素化。化合物H是一种试剂，可使蛋白质在巯基位置临时标记，以便日后进行光诱导共价连接，并将生物素化转移到相互作用蛋白质上，从而标记先前未知的相互作用蛋白质进行亲和纯化、检测、分析(例如，质谱、电泳或测序)。
Figure BDA0003509271520001931
D
Figure BDA0003509271520001932
E
Figure BDA0003509271520001933
F
Figure BDA0003509271520001934
Figure BDA0003509271520001935
类似地，正下方的接头可用于蛋白质标记，并使用四嗪涂层珠或树脂捕获。四嗪部分将与TCO功能化生物分子反应，允许分离，然后自动释放生物分子。适当选择的四嗪TCO对提供半衰期>2小时的释放，并提供<10分钟的所需反应时间，因此在复合物通过释放接头自动释放生物分子之前，允许有足够的时间分离复合物。
Figure BDA0003509271520001941
在另一个实施方式中，触发物用作两个生物分子之间的交联剂中的可切割连接器，用于例如生物分子检测、固定、分离和纯化，尤其是关于生物分子相互作用的应用。例如，在细胞裂解和免疫沉淀之前，细胞表面蛋白质的交联，蛋白质相互作用的固定，以允许识别微弱或短暂的蛋白质相互作用，用于免疫染色的组织固定，一步生物结合，以及将蛋白质固定在乙二醇胺涂层表面上。因此，使用生物分子反应性双官能交联剂，该交联剂包含用于生物分子(例如：肽、糖蛋白、DNA)彼此可裂解(可逆)附着的可切割触发物。例如，链接器可以用在“鸟枪(shotgun)”方法中，以捕获(捉)相互作用复合体。当使用赖氨酸反应部分时，试剂将交联任何和所有相互作用的分子，其各自的赖氨酸残基位于交联剂的间隔长度内。随后，在交联及(通常)细胞裂解后，通过免疫沉淀或通过对复合物中的目标分子之一施用特定抗体或其他探针来检测特定的相互作用复合物。参考下面直接的方案，化合物A是一种同双官能赖氨酸反应性交联剂，可用于交联例如两种蛋白质。化合物B是一种可裂解的异双官能胺反应性光交联剂，可用于无胺残基的分子(甚至DNA、多糖及其他分子)。这些异源双官能接头可以实现“两步(two-step)”反应，其中“诱饵”蛋白质可以被标记，添加到细胞中，并在所需时间(例如，在细胞刺激时，当假定发生感兴趣的相互作用时)被光激活以交联，然后通过触发物进行分离和轻度切割。化合物C是一种可裂解同双官能硫醇反应性交联剂，用于蛋白质或肽半胱氨酸之间的共价但可逆共轭。化合物D是一种可裂解异双官能硫醇和胺反应性交联剂，用于蛋白质或肽半胱氨酸和赖氨酸之间的共价但可逆共轭。化合物E是氨基酸的可裂解修饰试剂，允许蛋白质电荷发生暂时变化。
A
Figure BDA0003509271520001951
B
Figure BDA0003509271520001952
C
Figure BDA0003509271520001953
D
Figure BDA0003509271520001954
E
Figure BDA0003509271520001955
在另一个方面，触发物被用作放射性标记试剂盒，如下面的方案所示。使用与18F标记的TCO连接的珠，并添加四嗪肽衍生物，其与TCO反应产生18F-TCO四嗪肽。参考式5，f优选为1。在另一种方法中，通过TCO将肽结合到珠上，并添加18F四嗪衍生物，其与TCO反应产生18F四嗪TCO肽。
A
Figure BDA0003509271520001961
B
Figure BDA0003509271520001962
在另一实施方式中，本发明化合物用于位点特异性抗体接合。参考图6。在板1中，结合到抗体上靠近特定可结合氨基酸残基(在本例中为赖氨酸)的特定区域的肽用点击可裂解TCO接头修饰，此接头进一步连接到药物(待结合)以及用于赖氨酸结合的活性酯(例如：TFP酯)。当肽与蛋白质结合时，TFP酯将因其接近而与赖氨酸残基反应。随后，TCO连接体被四嗪切割，肽从抗体上洗掉，产生位点特异性结合抗体-药物结合物。板2显示了药物将TCO连接到活性酯的相同方法。在板3中，使用点击可裂解TCO接头修饰肽，此接头进一步连接到赖氨酸结合的活性酯(例如：TFP酯)。肽与蛋白质和赖氨酸结合后，添加四嗪药物结合物，导致肽的同时裂解以及药物结合。
在另一个方面，触发物用于诊断工具包，见下文。参考式5，f优选为1。与一个或多个淬灭荧光团共轭的固定化TCO(例如，在96孔盘中)与含有未知量四嗪部分的样品接触。在代谢工程实验中，这些四嗪之前已作为氨基酸残基并入生物分子中，或者此样品含有例如四嗪基农药(tetrazine-based pesticide)。四嗪与TCO的反应影响荧光团的释放以及去猝灭，允许通过例如紫外吸收进行读出。
Figure BDA0003509271520001971
体外实施方式中使用的构建体A及构建体B包括但不限于小分子、有机分子(包括：荧光染料)、金属配合物、包含放射性核素的分子、包含放射性的螯合物、无机分子、有机金属分子、生物分子、药物、聚合物、，树脂(如聚苯乙烯、琼脂糖)、颗粒(如微珠、磁珠、金、硅基颗粒和材料、聚合物和聚合物基材料、玻璃、氧化铁颗粒、微米和纳米颗粒(例如，脂质体、聚合物体)、凝胶、表面(例如，玻片、芯片、晶片、金、金属、硅基、聚合物、塑料、树脂)、细胞、生物组织、病原体(病毒、细菌、真菌、酵母)。这些构造可以例如包括前述构建体的组合。
生物分子的示例包括：碳水化合物、生物素、肽、类蛋白、脂质、蛋白质、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、LNA、适体、激素、毒素、类固醇、细胞因子、抗体、抗体片段(例如：Fab2、Fab、单链抗体、糖尿病、三联体、VHH)、抗体(片段)融合(例如双特异性及三特异性单克隆抗体片段)。
构建体A和构建体B也可以是R32或包含R32的部分，如本文所定义，其中R32可用于结合到另一个构建体A或B。例如，构建体A可以是R32，其为马来酰亚胺或光交联剂，通过间隔基SP与TR结合。马来酰亚胺或光交联剂可用于进一步将TR与蛋白质结合。在本实施方式中，CA和CB是生物分子结合部分。
在优选实施方式中，CA和CB通过间隔基SP结合到TR，其中SP为或包含CM2、CX或R32残基。
在优选实施方式中，构建体A是生物分子。在另一优选实施方式中，CA为生物分子，CB选自于由聚合物、树脂、颗粒、固相担体(solid support)。在另一优选实施方式中，CB为生物分子，CA选自于由聚合物、树脂、颗粒、凝胶、表面所组成的群组。在本发明的优选实施方式中，CA和/或CB等于R32基团，且所述或这些基团起生物分子结合部分的作用。用作生物分子结合部分的优选R32基团包括但不限于生物素、羧酸及其活化酯，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester)及对硝基苯酯(para-nitrophenyl ester)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、N-马来酰亚胺基、溴乙酰胺及碘乙酰胺、叠氮基、炔基，例如(杂)环炔基及末端炔基、氨基氧基、肼基及光活性基。在本发明的优选实施方式中，CA和CB等于R32，并且这些部分结合到同一生物分子上的不同位置，从而形成循环。在另一个优选实施方式中，CA为R32，其为生物分子结合部分，CB为R32，其结合到聚合物、树脂、颗粒或固体载体。在另一优选实施方式中，CB为R32，其为生物分子结合部分，CA为R32，其结合到聚合物、树脂、颗粒或固体载体。在另一实施方式中，CA或CB是或包含生物素。在优选实施方式中，触发裂解导致一个CA从两个或多个CB裂解。在优选实施方式中，触发裂解导致一个CB从两个或多个CA裂解。在优选实施方式中，触发裂解仅结合到一个CA和一个CB。在其他优选实施方式中，触发物绑定到两个CA部分，不绑定CB部分。在优选实施方式中，其中CA将从触发物释放，而不是从CB释放，则优选CB不通过LC绑定。在优选实施方式中，只有一个表面(CA或CB)绑定到触发物。
在优选实施方式中，活化剂可与表面、凝胶、树脂、尤其是固相合成树脂(例如：聚苯乙烯、Janda凝胶等)共轭。在优选实施方式中，活化剂可包含生物分子、药物或靶向剂。
在优选实施方式中，活化剂可任选地包含膜转位(membrane translocation)部分(例如：金刚氨酸、聚赖氨酸/精氨酸、TAT、人乳铁蛋白)。关于这些部分的典型参考文献包括：Trends in Biochemical Sciences,2015,.40,12,749；J.Am.Chem.Soc.2015,137,12153-12160；Pharmaceutical Research,2007,24,11,1977。
在优选实施方式中，活化剂不包含R87。
用于本发明触发偶联物的合适间隔基SP列在间隔基部分(见上文)。在优选实施方式中，间隔基具有最多50个碳原子、更优选最多25个碳原子、更优选最多10个碳原子。其他优选间隔基为PEG及PPG聚合物以及寡肽，优选范围为2到50个重复单元，更优选范围为2到24个重复单元，更优选范围为2到12个重复单元。
示例：
一般方法：
所有试剂、化学品、材料和溶剂均从商业来源获得，并在收到时使用，包括未描述的腈起始化合物(nitrile starting compound)。所有溶剂均为AR质量。[111In]铟及[89Zr]草酸锆溶液购自Curium。Zeba脱盐旋转柱(7及40kDa MW截止值(cut-off)，0.5mL)及Slide-A-Lyzer透析盒(20kDa MW截止值)购自皮尔斯蛋白质研究公司(Pierce ProteinResearch)(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific))。小鼠血浆购自创新研究公司(Innovative Research)。29-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷聚糖-1-醇(29-Amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol)购自PurePEG。根据文献(Versteegen等人，Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112–14116)程序制备3,6-二甲基-1,2,4,5-四嗪(3,6-Dimethyl-1,2,4,5-tetrazine)和(E)-环辛-2-烯-1-基(4-硝基苯)碳酸酯((E)-cyclooct-2-en-1-yl(4-nitrophenyl)carbonate)。在硅藻土凝胶(Kieselgel)F-254预涂层硅胶板上进行分析薄层色谱。在B.V.硅胶筛选装置上进行柱层析(flash：40-63μm目(mesh)，正常：60-200μm目)。在298K的Bruker Avance III HD光谱仪上记录了1H-NMR和13C-NMR光谱(1H-NMR为400MHz，13C-NMR为100MHz)。在室温时，TMS的化学位移以ppm下场报告。用于分裂模式(splitting pattern)的缩写为s＝单重态、d＝双重态、dd＝双重态、t＝三重态、q＝四重态、m＝多重态及br＝宽态。HPLC-PDA/MS使用ShimadzuLC-10AD VP系列HPLC与二极管阵列检测器(Finnigan Surveyor PDA Plus检测器，热电公司(Thermo ElectronCorporation))和离子阱(Ion-Trap)(LCQ Fleet，热电科学公司(Thermo Scientific))耦合进行。HPLC分析使用Alltech Alltima HP C18 3μ柱进行，进样量为1-4μL，流速为0.2mLmin-1，通常是在298K下，水中MeCN(均含0.1％甲酸)的梯度(10分钟内为5％至100％，再保持100％3分钟)。
在配备Superdex200色谱柱的Akta系统(GE Healthcare Life Science)上进行尺寸排除色谱(Size exclusion chromatography，SEC)。在安捷伦(Agilent)1100系统上进行无线电HPLC，此系统配备Gabi放射性检测器(Raytest)。将样品装载在Alltima C18柱(4.6×150mm，5μ)上，所述柱在1ml min-1下用含有0.1％v/v％TFA的水(a)和乙腈(B)的线性梯度洗脱(在3％B下4分钟，然后在15分钟内增加到90％B)。在用200mM EDTA在盐水溶液(111In)或0.1M柠檬酸盐pH 6.0(89Zr)中洗脱的ITLC-SG条带(Varian Inc.)上进行放射性ITLC。在这些条件下，放射性标记的产物留在基底上，而未结合的放射性核素以0.7-0.9的Rf迁移。SDS-PAGE在Mini-PROTEAN-Tetra细胞系统上进行，使用4-20％预制Mini-PROTEAN TGX凝胶和Precision Plus蛋白质全蓝预染色蛋白质标准(BioRad实验室)。通过台风FLA 7000荧光成像仪(GE Healthcare Life Science)使用AIDA软件监测ITLC条带和SDS-PAGE凝胶上的放射性分布。
除非另有说明，否则在示例1中未对合成的TCO对映体进行手性拆分。当描绘一个对映体时，合成的化合物中也存在镜像。例如，1.43以镜像立体异构体的形式存在。
Figure BDA0003509271520002011
示例1：TCO合成：
化合物1.71如前所述合成(Carlson等人，J Am Chem Soc 2018，1403603-3612)。
Figure BDA0003509271520002012
化合物1.72以TCO-2-OH为起始原料合成为1.15：
Figure BDA0003509271520002021
(Z)-5-溴代环辛烯(1.1)((Z)-5-Bromocyclooct-1-ene(1.1))：
Figure BDA0003509271520002022
将1,5-环辛二烯(450g，4.16mol)冷却至0℃。搅拌时，在1小时内加入HBr(33％在AcOH中，356mL，2.08mol)。然后，使反应混合物达到室温，搅拌过夜，并倒入冰水(1L)。加入Et2O(600毫升)，用Et2O(3×300毫升)萃取水层。使用饱和碳酸氢钠水溶液(500毫升)及盐水(300毫升)清洗结合的有机层，以Na2SO4干燥，过滤并蒸发溶剂。蒸馏得到1.1(336克，85％)。1H-NMR(200MHz,CDCl3):δ5.73–5.51(m,2H)4.31(tdd,J＝8.9,4.7,1.7Hz,1H),2.56–1.89(m,8H),1.84–1.63(m,1H),1.62–1.42(m,1H)ppm。
(Z)-Cyclooct-4-ene-1-carbonitrile(1.2)：
Figure BDA0003509271520002023
将NaCN(95％，138g，2.68mol)溶解于二甲基亚砜(DMSO)(无水，900mL)中，并在100-110℃下搅拌。在30分钟内加入溶解于二甲基亚砜(无水，200mL)中的化合物1.1(422g，2.23mol)。3小时后，将反应混合物冷却至rt并倒入冰水(5L)中。用Et2O(4x1600mL)萃取水层，使用盐水洗涤合并的有机层，以Na2SO4干燥，过滤，并在真空中去除溶剂，得到粗产物1.2(233g，77％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.76–5.56(m,2H),2.86–2.71(m,1H),2.51–1.72(m,8H),1.65–1.37(m,2H)ppm。
(Z)-Cyclooct-4-ene-1-carboxylic acid(1.3)：
Figure BDA0003509271520002031
将1.2(83.0g，614mmol)悬浮在KOH水溶液(164g，2.92mol，30％溶液)中，并在40℃下搅拌。然后，将H2O2逐滴添加到棕色反应混合物中，从而形成沉淀。60小时后，将反应混合物冷却至室温，然后缓慢倒入含水的H3PO4(40％)，同时用冰浴冷却。将所得混合物在室温下搅拌2.5小时。由于形成大量白色沉淀，反应混合物通过玻璃烧结漏斗过滤，并用Et2O清洗。滤液用Et2O(6x150mL)萃取，以Na2SO4干燥、过滤，然后蒸发溶剂。所得棕色油在DCM(500毫升)中提取，并用2M NaOH(5×200毫升)萃取。通过添加6M HCl将水层调节至pH 1，从而形成白色沉淀。用DCM(4x200ml)提取混合物，并以Na2SO4干燥结合的有机层，过滤并浓缩，得到粗化合物1.3(59.1g，62％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.86(bs,1H),5.74–5.60(m,2H),2.54–2.45(m,1H),2.45–2.32(m,1H),2.22–2.02(m,4H),1.98–1.84(m,1H),1.83–1.52(m,3H),1.50–1.34(m,1H)ppm。
(Z)-Cyclooct-4-ene-1-carboxylic acid methyl ester(1.4)：
Figure BDA0003509271520002032
将SOCl2(7.10mL，97.3mmol)逐滴添加到搅拌的甲醇(无水，90mL)中，冷却至-10℃。然后，逐滴添加化合物1.3在无水甲醇(10mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后使其达到室温。2小时后，在真空中去除MeOH，并将所得残留物吸收到EtOAc及水中(各150mL)。分离各层，并用EtOAc(2x70mL)提取水层。用饱和NaHCO3水溶液(70mL)和盐水(70mL)洗涤结合的有机层，以Na2SO4干燥、过滤，去除溶剂，得到化合物1.4(10.1g，93％)；Rf(己烷：乙酸乙酯＝3:1)＝0.87。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.78–5.56(m,2H),3.64(s,3H),2.47(m,1H),2.41–2.29(m,1H),2.20–2.06(m,3H),2.05–1.98(m,1H),1.91–1.80(m,1H),1.77–1.51(m,3H),1.45–1.32(m,1H)ppm.
(Z)-1-Hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid methyl ester(1.5)：
Figure BDA0003509271520002041
向500mL三颈圆底烧瓶中注入氩气，冷却至0℃，并添加四氢呋喃(THF)(无水，120mL)和二异丙胺(4.30mL，30.7mmol)并脱气。随后，加入n-BuLi(2.5M己烷，11.2mL，28.1mmol)，并在0℃下搅拌反应混合物35分钟。冷却至-78℃后，加入TMEDA(9.60mL，63.9mmol)，然后加入1.4(4.3g，25.6mmol)THF(无水，40mL)。搅拌30分钟后，加入无水四氢呋喃(100毫升)中的(1S)-(10樟脑磺酰)恶嗪啶((1S)-(10-camphorsulfonyl)oxaziridine)(6.45克，28.1mmol)溶液。6小时后，用饱和NH4Cl水溶液(100mL)和水(100mL)将反应混合物淬灭，并搅拌混合物直到达到10℃。添加EtOAc(150mL)，分离层，并用EtOAc(3x200mL)提取水层。将结合的有机层以Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，从而在黄色油中形成白色沉淀。蒸发溶剂，反复过滤和浓缩黄色油和白色沉淀物的混合物，最后在EtOAc中提取，并通过柱色谱法纯化(梯度：50分钟内己烷中10％至90％EtOAc)，得到1.5(2.68g，57％)，为淡黄色油。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.78(dt,J＝11.1,6.5Hz,1H),5.62–5.48(m,1H),3.76(s,3H),2.92(bs,1H),2.54–2.34(m,2H),2.22–1.99(m,3H),1.96–1.69(m,4H),1.56–1.38(m,1H)ppm；13C-NMR(101MHz,CD2Cl2):δ178.7,131.9,128.3(C＝C),77.0,52.9,38.2,32.6,24.8,24.3,23.4ppm。
(Z)-1-Hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid(1.6)：
Figure BDA0003509271520002042
将1.5(2.60g，12.1mmol)溶解在甲醇(65mL)中，并将溶液加热至60℃。缓慢添加KOH水溶液(3.6M，60mL)后，将混合物搅拌2.5小时。在真空中去除甲醇，使用2M HCl将剩余水溶液调节至pH 2，然后用DCM(5x80mL)萃取。以Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并在真空中浓缩，得到粗1.6(2.30g，96％)。Rf(己烷类：EtOAc＝3:1)＝0.25.1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.83(dt,J＝10.9,6.6Hz,1H),5.62(dt,J＝10.7,8.4Hz),2.48–2.32(m,2H),2.31–2.09(m,3H),2.05–1.84(m,3H),1.84–1.71(m,1H),1.69–1.45(m,1H)ppm；13C-NMR(101MHz,CDCl3):δ181.9,131.7,129.0,76.8,37.9,32.6,24.8,24.0,23.2ppm。
(Z)-1-Acetoxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid(1.7)：
Figure BDA0003509271520002051
将1.6(2.70g，15.9mmol)溶解在无水吡啶(25mL)中，并将溶液冷却至0℃。缓慢添加醋酸酐(12.7mL，135mmol)，然后添加DMAP铲尖(spatula tip)。反应混合物在室温下搅拌过夜，倒入冰水(200mL)中，并通过添加2M HCl调节至pH 2。在用DCM(6x100mL)萃取后，以Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并在高真空下浓缩，以获得粗1.7(3.37g，定量)。Rf(hexanes:EtOAc＝3:1+1vol％AcOH)＝0.37.1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ5.76(dt,J＝10.9,6.4Hz,1H),5.55(q,J＝9.1Hz,1H),2.48–2.36(m,2H),2.34–2.21(m,2H),2.20–2.04(m,3H),2.12(s,3H),2.03–1.94(m,1H),1.59–1.50(m,2H)ppm；13C-NMR(151MHz,CDCl3):δ178.6,170.1,131.0,128.1,83.3,35.3,29.1,24.4,23.8,23.2,21.0ppm。
5-Iodo-8-oxo-7-oxabicyclo[4.2.2]decanyl-1-acetate(1.8)：
Figure BDA0003509271520002052
将1.7(3.37g，15.9mmol)溶解于无水DCM(40mL)中，并添加NaHCO3(4.40g，52.4mmol)水溶液(40mL)。将反应混合物剧烈搅拌20分钟，然后冷却至0℃。以10分钟的间隔分6等份添加KI(7.95g，47.6mmol)和I2(8.06g，31.8mmol)的均质混合物。在0℃下搅拌10分钟后，让反应混合物达到rt。1小时后，将反应混合物倒入锥形烧瓶中，并在用冰浴冷却的同时，缓慢添加焦亚硫酸钠，直到深色消失。(小心泡沫形成过多)。接下来，分离各层，并用DCM(4x60mL)提取水层。以Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并在真空中蒸发，得到粗1.8(4.33g，82％)。1H-NMR(200MHz,CDCl3):δ5.06–4.96(m,1H),4.68–4.43(m,1H),2.69–2.22(m,7H),2.10(s,3H),2.01–1.74(m,2H),1.71–1.43(m,1H)ppm。
(Z)-8-Oxo-7-oxabicyclo[4.2.2]dec-4-enyl-1-acetate(1.9)：
Figure BDA0003509271520002061
将1.8(4.67g，13.8mmol)溶解在无水甲苯(22mL)中。添加DBU(3.57g，23.5mmol)，并在室温下搅拌反应混合物过夜。将反应混合物加热至回流6小时，从而形成黑色沉淀。将混合物冷却至室温，加入水和甲苯(各400mL)后，分离各层，并用水(2x200mL)清洗有机层。用甲苯(4x200ml)萃取水层，并以Na2SO4干燥合并的有机层，并过滤。溶剂蒸发和柱层析(梯度：0-50％乙酰乙酸在己烷中)得到1.9(1.88克，65％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.93(ddd,J＝12.1,9.2,5.0Hz,1H),5.45(ddd,J＝12.0,4.7,2.6Hz,1H),5.16(s,1H),2.54–2.33(m,3H),2.24–2.12(m,4H),2.10(s,3H),1.69–1.61(m,1H)。
(Z)-1,6-Dihydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid methyl ester(1.10)：
Figure BDA0003509271520002062
将1.9(1.00当量，1.85，8.00mmol)溶解在无水甲醇(60mL)中，并添加KHCO3(3.61g，36.1mmol)。将所得反应混合物在30℃下搅拌50小时，在真空中去除MeOH，并将残余物吸收到DCM和水中(各200mL)。分离各层，用DCM(5x70mL)提取水层，然后通过添加2M HCl将pH调节至1，然后再次用DCM(5x70mL)提取。以Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并在真空中浓缩。通过柱色谱法(梯度：15-50％己烷中的乙酸乙酯)纯化所得残留物，得到产物1.10(718mg，41％)和乙酰化产物(520mg，24％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.74(ddt,J＝10.8,7.0,1.8Hz,1H,CH＝CH),5.43(ddd,J＝11.2,7.0,2.0Hz,1H,CH＝CH),4.97(dt,J＝12.7,7.2Hz,1H),3.72(s,3H),2.56–2.34(m,1H),2.26–2.11(m,1H),2.09–1.93(m,2H),1.88–1.68(m,3H),1.46–1.31(m,1H)ppm；13C-NMR(101MHz,CD3OD):δ179.0,134.9,129.8,77.3,68.4,52.7,39.0,33.9,32.1,24.1ppm。
(E)-1,6-Dihydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid methyl ester(1.11a、1.11b；2个非对映异构体，在轴向或赤道位置释放OH)：
Figure BDA0003509271520002071
化合物1.10(0.58g，2.90mmol)在苯甲酸甲酯(0.73mL，5.79mmol)存在下，在流动系统(三颈烧瓶-泵-柱-紫外辐照石英管-回到三颈烧瓶(3-necked flask–pump–column–UV-irradiated quartz tube–back to3-necked flask))中，使用再生银(I)托西硅柱(0.57mmol/g，11g，6.26mmol)和正己烷和I-PrOH的脱气混合物进行光异构化(5:1350毫升)。22小时后，用MTBE(500毫升)清洗色谱柱。用氨水(7M甲醇溶液，350mL)洗脱并蒸发溶剂，得到一个残留物，该残留物在一小段硅胶上过滤(用MTBE中约10％甲醇洗脱)，以分离剩余的银盐。蒸发溶剂，通过柱色谱(梯度：DCM中2-20％甲醇)分离和纯化产物的两个非对映异构体，得到白色固体的轴向异构体1.11a(169mg，30％)和赤道异构体1.11b(110mg，18％)。
轴向异构体(1.11a)：1H-NMR(400MHz,MeOD):δ5.97(ddd,J＝15.2,11.2,3.4Hz,1H),5.75(dd,J＝16.5,2.4Hz,1H),4.41(dd,J＝2.7,1.3Hz,1H),3.71(s,3H),3.37(s,1H),2.47(m,1H),2.27–2.17(m,1H),2.15–1.91(m,4H),1.80–1.67(m,1H),1.61(dd,J＝15.3,6.3Hz,1H)ppm；13C-NMR(101MHz,MeOD):δ180.9,138.5,127.9,75.0,70.3,52.8,46.0,36.4,31.9,31.0ppm。
赤道异构体(1.11b)：1H-NMR(400MHz,MeOD):δ5.88(ddd,J＝15.8,11.2,4.1Hz,1H),5.43(dd,J＝16.4,9.3Hz,1H),4.13(td,J＝9.6,5.2Hz,1H),3.78(s,3H),3.37(s,1H),2.85–2.69(m,1H),2.38–2.28(m,1H),2.22–2.11(m,1H),2.11–2.02(m,1H),2.01–1.84(m,2H),1.78–1.67(m,1H),1.63–1.50(m,1H)ppm；13C-NMR(101MHz,MeOD):δ175.7,137.1,132.3,79.6,75.0,52.0,47.8,41.5,39.1,30.6ppm。
Methyl(1S,4E,6R)-1-hydroxy-6-{[(4-nitrophenoxy)carbonyl]oxy}-cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.12)：
Figure BDA0003509271520002081
将1.11a(轴向，30.0mg，0.150mmol)溶解于anh.DCM(2.5毫升)中，同时用冰浴冷却。DMAP(73.2mg，0.599mmol)和4-硝基苯基氯甲酸盐，每种都溶解在anh.DCM(1毫升)中。1.5小时后，TLC(hex：乙酰乙酸＝3：1)确认原料完全转化。反应混合物在真空中浓缩。将所得残余物置于DCM中，并通过柱层析(梯度：DCM中0-5％MTBE)进行纯化。得到1.12，为黄色油(47.7mg，87％)。1H NMR(400MHz,CD2Cl2):δ8.26(d,J＝9.2Hz,2H),7.39(d,J＝9.1Hz,2H),5.98(ddd,J＝15.5,11.3,3.5Hz,1H),5.78(dd,J＝16.6,2.3Hz,1H),5.31–5.30(m,1H),3.74(s,3H),2.63–2.42(m,1H),2.33–2.19(m,2H),2.12–1.86(m,4H),1.73(ddd,J＝15.9,6.1,1.5Hz,1H)ppm。13C NMR(101MHz,CD2Cl2):δ180.3,156.3,152.2,146.0,132.5,130.0,125.8,122.5,78.0,73.4,53.7,45.9,33.3,32.1,30.8ppm。ESI-MS:计算到：[M+Na]+388.10；观察到388.05。
Methyl(1S,4E,6R)-1-hydroxy-6-{[(2-{2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy}ethyl)carbamoyl]oxy}cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.13)：
Figure BDA0003509271520002091
1.12(35mg，0.096mmol)和NH2-PEG4-OH(22.2mg，0.115mmol)溶解在anh二甲基甲酰胺(0.7毫升)中。加入DIPEA(61.9mg，83μL，0.479mmol)，并在室温下搅拌混合物3小时。浓缩透明黄色溶液，用甲酸(15μL)酸化，在水中(+0.1％甲酸)提取，通过反相色谱法(reversed phase chromatography)(30g Biotage SNAP Ultra C18，水/MeCN，梯度洗脱，0.1％甲酸)纯化，得到1.13，为无色油(37mg，92％)。1H NMR(600MHz,CD3OD)δ5.89(ddd,J＝15.5,11.3,3.5Hz,1H),5.74(dd,J＝16.4,2.4Hz,1H),5.13(s,1H),3.72(s,3H),3.70–3.66(m,8H),3.66–3.63(m,2H),3.59(dd,J＝5.6,4.1Hz,2H),3.56(t,J＝5.5Hz,2H),3.31(t,J＝5.5Hz,2H),2.47(qd,J＝11.8,4.7Hz,1H),2.24–2.12(m,2H),2.11–2.02(m,1H),2.02–1.96(m,2H),1.86(dd,J＝15.1,6.2Hz,1H),1.70(dd,J＝15.7,6.1Hz,1H)ppm。13C NMR(151MHz,CD3OD)δ180.7,158.4,135.0,129.2,74.8,73.7,73.6,71.6,71.6,71.4,71.2,71.0,62.2,52.9,45.9,41.6,34.0,32.7,31.0ppm。ESI-MS：计算到[M+Na]+442.20；观察到442.15。
Methyl(1S,4E,6R)-1-hydroxy-6-{[(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)carbamoyl]oxy}cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.14)：
Figure BDA0003509271520002101
anhDCM中的1.12(轴向，25mg，0.125mmol)溶液和MoO2Cl2储备溶液(0.1mL，4.7mg/mL anh.DMF)混合，并在Ar气氛下添加到AMC异氰酸酯(27.6mg，0.137mmol)中，并用冰浴冷却。反应混合物在室温下搅拌过夜。随后，将混合物在水和DCM之间分配，并用DCM(3x9mL)提取水溶液层。以Na2SO4干燥合并的有机层，并且浓缩。通过柱层析(梯度：hex/EtOAc)来纯化残余物，获得1.14，为白色固体(9mg，18％)。1H NMR(600MHz,CD2Cl2)δ7.56(d,J＝8.6Hz,1H),7.49(d,J＝2.3Hz,1H),7.37(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.15(s,1H),6.15(d,J＝1.3Hz,1H),5.97–5.89(m,1H),5.79(dd,J＝16.6,2.4Hz,1H),5.34(bs,1H),3.75(s,3H),3.07(s,1H),2.51(dtd,J＝12.8,11.6,4.7Hz,1H),2.40(s,3H),2.26–2.18(m,2H),2.04(ddd,J＝14.1,12.8,4.6Hz,1H),1.98–1.90(m,3H),1.70(dd,J＝15.3,5.5Hz,1H)ppm。13C NMR(151MHz,CD2Cl2)δ180.40,161.30,155.07,152.97,152.63,142.19,133.71,129.29,126.01,115.98,114.65,113.48,106.01,73.98,73.42,53.55,45.95,33.41,32.20,30.76,18.90ppm。ESI-MS：计算到[M+H]+402.15；观察到402.18。
TCO-PEG2-AF594(1.15)：
Figure BDA0003509271520002111
在DMSO(640μL)和DIPEA(5.6μL，0.032mmol)中，将anh.DMF(0.6mL)中的1.12(2.8mg，0.008mmol)的溶液添加至AF594-PEG2-胺(5.48mg，0.006mmol)。为了实现完全转化，添加另一当量的1.12(2.8mg，0.008mmol)及DIPEA(2μL)，并在室温下搅拌反应混合物过夜。随后，浓缩暗混合物，用甲酸(2μL)酸化，在水中(+0.1％甲酸)吸收，并通过制备HPLC(水/MeCN，梯度洗脱，0.1％甲酸)纯化3次，得到所需的产物1.15(2.7mg，33％)，为紫罗兰油(violet oil)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.99(t,J＝5.6Hz,1H),8.46(s,1H),8.26–8.11(m,3H),7.26(dt,J＝7.5,3.6Hz,1H),7.20(t,J＝5.8Hz,1H),6.40(s,2H),5.84–5.70(m,1H),5.65–5.53(m,3H),5.13(s,1H),5.03(s,1H),3.62–3.57(m,6H),3.56–3.53(m,2H),3.51–3.45(m,2H),3.43(t,J＝5.9Hz,2H),3.16–3.11(m,2H),3.09(s,4H),2.87(s,6H),2.37–2.28(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.94–1.87(m,2H),1.82(dd,J＝15.7,12.1Hz,1H),1.73–1.68(m,1H),1.58(dd,J＝15.5,6.2Hz,1H)1.31(d,J＝4.4Hz,12H)ppm。ESI-MS：计算到[M+H]+1079.36；观察到1079.25.
TCO-MMAE(1.16)：
Figure BDA0003509271520002112
向在Ar气氛下在干燥DMSO(0.5mL)中搅拌的MMAE(79mg，0.11mmol)和DIPEA(21mg，0.17mmol)的混合物添加在干燥DMSO(0.5mL)中的1.12(44mg，0.12mmol)的溶液。在室温下搅拌混合物1小时。添加额外的DIPEA(21mg，0.17mmol)，并继续搅拌过夜。由于LCMS表明转化率很低，因此添加了HOBt(22mg，0.17mmol)和DIPEA(14mg，0.12mmol)，并让混合物再搅拌48小时。以C18柱(30g C18-SiO2)进行纯化，然后进行反相色谱(5-90％ACN/H2O，含有2.5mMNH4OAc，pH 8.5)。浓缩产品组分，并通过制备型(prep)HPLC进一步纯化。得到产物1.16，为白色固体(44mg，42％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6；非对映异构体和转子异构体的混合物)δ8.47(s,1H),7.41(d,J＝7.0Hz,2H),7.35(t,J＝7.7Hz,1H),7.31(t,J＝7.7Hz,1H),7.26–7.21(m,1H),5.91–5.75(m,2H),5.27–5.21(m,1H),4.72(d,J＝8.5Hz,0.4H),4.64–4.60(m,0.8H),4.55(d,J＝7.4Hz,0.4H),4.29–4.18(m,2.8H),3.88(dd,J＝9.1,2.1Hz,0.3H),3.74–3.67(m,5H),3.60–3.54(m,0.3H),3.47–3.40(m,1.4H),3.38–3.36(m,6H),3.24–3.18(m,0.5H),3.17–3.11(m,1.4H),3.07–3.04(m,1.4H),3.03(s,1H),3.02–2.95(m,1H),2.57–2.44(m,3.4H),2.33–1.78(m,12H),1.75–1.68(m,1.4H),1.64–1.55(m,1.4H),1.49–1.39(m,1.8H),1.37–1.25(m,3H),1.20(dd,J＝6.7,5.1Hz,2H),1.15(dd,J＝13.5,6.8Hz,2H),1.05–0.86(m,20H)ppm。ESI-MS：计算到[M+H]+944.60；观察到944.50。
Ethyl 2-hydroxy-2-[4-(methylamino)phenyl]acetate(1.17)：
Figure BDA0003509271520002121
在N2下，在DMF(10mL)中，使用K2CO3(5.3g，38.4mmol)和MeI(0.6mL，9.6mmol)处理2-(4-氨基苯基)-2-羟基乙酸乙酯(Ethyl2-(4-aminophenyl)-2-hydroxyacetate)(1.5g，7.7mmol)30分钟。加入水(80mL)，然后用乙酸乙酯(3×80毫升)萃取。用盐水(2x80mL)洗涤合并的有机物，以MgSO4干燥并浓缩。在硅胶柱层析后分离出化合物1.17(EtOAc：戊烷，2：8至3：7)。产率：32％(0.51g,2.4mmol)。ESI-MS:m/z计算到C11H15NO3 209.11；观察到[M+H]+210.08.1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.23(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.6Hz,2H),5.06(s,1H),4.32-4.24(m,1H),4.22-4.14(m,1H),2.85(s,3H),1.25(t,J＝7.14Hz)ppm。
2-Hydroxy-2-[4-(methylamino)phenyl]acetic acid(1.18)：
Figure BDA0003509271520002131
将10mM NaOH(1mL，10mmol)水溶液添加到THF中的1.17(0.48g，2.3mmol)溶液中，然后在40℃下搅拌2小时。在酸化、制备型HPLC(含0.1％TFA的水/MeCN梯度)和冻干后，以78％的产率(0.52g，1.76mmol)分离出1.18的TFA盐。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.6Hz,2H),5.24(s,1H),2.96(s,3H)ppm。NOESY(400MHz，D2O)确认甲基位于苯胺胺上。
2-Hydroxy-2-{4-[({[(1R,2E,6S)-6-hydroxy-6-(methoxycarbonyl)cyclooct-2-en-1-yl]oxy}carbonyl)(methyl)amino]phenyl}acetic acid(1.19)：
Figure BDA0003509271520002132
使用1.18(34.5mg，114.1μmol)HOBt处理1.12(33.4mg，91.4μmol)。H2O(7.1mg，47.6μmol)和DiPEA(99.4μL，570.6μmol)在干燥DMF中放置16小时。经制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)和冷冻干燥后，以21％的产率(8mg，19.6mmol)分离出1.19。ESI-MS：m/z计算到C20H25NO8 407.16；观察到[M-H]-406.12。
Methyl(1S,4E,6R)-6-{[(4-{[(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)ethoxy]ethoxy}ethyl)carbamoyl](hydroxy)methyl}phenyl)(methyl)carbamoyl]oxy}-1-hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.20)：
Figure BDA0003509271520002141
将1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮(1-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-2,5-dihydro-1H-pyrrole-2,5-dione)(8.2mg，23.9μmol)、PyBOP(12.4mg，23.9μmol)和DiPEA(16μL，92μmol)的TFA盐添加到干燥MeCN中的1.19(7.5mg，18.4μmol)中。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物浓缩并放入EtOAc中。用HCl水溶液清洗后，以Na2SO4干燥有机物并浓缩，得到1.20。产率：95％(10.8mg,17.5μmol)。ESI-MS：m/z计算到C30H39N3O11 617.26；观察到：[M+H]+417.92。
TCO-mandelic-(PEG2-Mal)-DFO(1.21)：
Figure BDA0003509271520002142
在室温下，在干燥的DMSO中，使用DSC(22mg，29.2μmol)和DiPEA(10.3μL，58.8μmol)处理1.20(6mg，9.7μmol)4天。然后添加去铁胺(31.9mg，48.5μmol)，并在室温下搅拌1小时。酸化后，制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)和冻干，以11％产率(1.1mg，0.9μmol)分离出1.21，为白色粉末。ESI-MS：m/z计算到C56H85N9O20 1203.59；观察到[M-H]-1202.00。
(1S,4E,6R)-1,6-Dihydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylic acid(1.22)：
Figure BDA0003509271520002151
将1.11a(15.1mg，75μmol)溶解于甲醇(400μL)和水溶液中。添加LiOH溶液(200μL47mg溶液，2mL H2O，0.11mmol，1.5eq LiOH)。在室温下，在黑暗中搅拌溶液20小时。使用甲醇(0.5mL)和水(0.5mL)将反应混合物转移到小瓶中。轻轻搅拌添加DOWEX IR-120H树脂珠，直到pH值从碱性变为微酸。通过过滤去除珠，并在真空中去除溶剂。剩余的油用甲醇冲洗两次，并从MeCN/水1：1(2毫升)中冻干，得到1.22(14.0毫克，75微摩尔，定量)，为白色蓬松固体。1H-NMR(MeOD):δ＝5.98(m,1H),5.71(dd,1H),4.39(s,1H,),2.43(m,1H),2.22–2.03(m,3H),2.01–1.88(M,2H),1.74–1.58(m,2H)ppm。
(1S,4E,6R)-6-({[(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]carbonyl}oxy)-1-hydroxycy clooct-4-ene-1-carboxylate(1.23)：
Figure BDA0003509271520002152
将1.22(5.7mg，31μmol)和DSC(24mg，92μmol，3当量)溶解在干燥MeCN(200μL，悬浮液)中。添加DiPEA(23μL，0.13mmol)和4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine)(0.6mg，5μmol)，并在室温下、Ar下、黑暗中搅拌透明混合物20小时。在真空中去除溶剂，并用CHCl3冲洗所得油两次。在CH2Cl2中使用2％至10％丙酮的洗脱梯度进行柱层析(中和闪蒸SiO2)，得到1.23(3.5mg，8.2μmol，27％)，为无色油。1H-NMR(CDCl3):δ＝6.02(m,1H),5.78(dd,1H),5.34(s,1H,CH(O)),2.86(s,4H),2.84(s,4H,),2.58(m,1H),(m,2.41–2.00,8H)。
N-(29-{[(1S,4E,6R)-1,6-Dihydroxycyclooct-4-en-1-yl]formamido}-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-yl)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanamide(1.24)：
Figure BDA0003509271520002161
将1.22(6.3mg，34μmol)和N-(29-氨基-3.6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷酰基)-3-(2,5-二氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(N-(29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosyl)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanamide)TFA盐(28mg，38μmol)溶解在CHCl3/干DMF 2：1(375μL)中。添加DiPEA(23μL，0.13mmol)和PyBOP(20mg，37μmol)，并在室温下搅拌溶液1小时。在真空中去除溶剂，并用CHCl3冲洗所得油两次。黄色油在CHCl3(50mL)中重新溶解，并用0.1M HCl(30mL)和盐水(30mL)清洗有机层。使用CHCl3反萃一次(10毫升)合并的水溶液层。使用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并蒸发至干燥。在CHCl3中使用4％至10％甲醇的洗脱梯度进行柱层析(flash SiO2)，得到1.24(13mg，17μmol，50％)，为无色油。1H-NMR(CDCl3):δ＝6.74(br t,1H,NH),6.71(s,2H),6.59(br t,1H),6.03(m,1H),5.77(dd,1H),4.51(s,1H),3.84(t,2H),3.70–3.58(m,36H),3.54(q,2H),3.42(m,2H),2.52(t,2H),2.48(m,1H),2.26(m,1H),2.16–1.91(m,4H),1.75(m,1H),1.64(m,1H),1.46(m,1H)ppm.ESI-MS：m/z计算到C36H61N3O15 775.41；观察到[M+H]+776.33,[M+Na]+798.58。
Mal-PEG9-TCO-PEG4-DOTAGA(1.25)：
Figure BDA0003509271520002171
将1.24(4.2mg，5.4μmol)和DSC(3.5mg，13μmol)溶解在干燥的MeCN(100μL，悬浮液)中。加入DiPEA(5μL，28μmol)，并在室温下、Ar下、黑暗中搅拌透明混合物5天。在真空中去除溶剂，并用CHCl3冲洗产生的油两次。将NHS碳酸盐中间体(最大5.4μmol)溶解在干燥的DMF(200μL)中，并添加DiPEA(3μL，17μmol)。将该溶液添加到2,2'，2”-(10-(1-氨基-19-羧基-16-氧代-3,6,9,12-四氧代-15-氮杂壬烷-19-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三酰基)三乙酸(2,2',2”-(10-(1-amino-19-carboxy-16-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-15-azanonadecan-19-yl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl)triaceticacid)HCl(3.9mg，5.4μmol)中，得到悬浮液。添加水(50μL)，并在室温下搅拌透明混合物3小时。添加HCOOH(30μL)，并使用RP-MPLC纯化化合物。冻干得到1.25(1.3mg，0.9μmol，16％)，为灰白色蓬松固体。ESI-MS：m/z计算到C66H113N9O29 1495.76；观察到[M+H]+1496.50,[M-H]-1494.67。
I.Mal-PEG9-TCO-doxorubicine(1.26)：
Figure BDA0003509271520002172
在室温下，用DSC(2.7mg，10.4μmol)和DiPEA(4.6μL，26.0μmol)在干燥DMSO中处理1.24(4.0mg，5.2μmol)16小时，然后添加盐酸阿霉素(12.1mg，20.8μmol)和DiPEA(15μL，84.8μmol)并在室温下搅拌1小时。酸化后，制备型HPLC(含0.1％TFA的水/MeCN梯度)和冻干，以17％的产率(1.1mg，0.9μmol)分离出1.26，为白色粉末。ESI-MS：m/z计算到C64H88N4O271344.56；观察到[M+H2O+Na]+1385.40。
7-Oxabicyclo[4.2.2]dec-4-en-8-one(1.27)：
Figure BDA0003509271520002181
用50mL DCM、50mL水和NaHCO3(9.13g，108.6mmol)搅拌1.3(5.46g，35.4mmol)1小时。在冰上冷却混合物，并添加碘化钾(7.0g，42.2mmol)和碘(10.0g，39.4mmol)的混合物。混合物搅拌了一夜。加入50毫升DCM，然后加入一些亚硫酸氢钠，以使混合物脱色。分离各层，用DCM提取上层。干燥和旋转蒸发得到10.17克碘内酯。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.05(bs,1H),4.61(m,1H),3.02(m,1H),2.7–1.4(m,10H)ppm。用DBU(7.5g，49.3mmol)在50mL甲苯中于85℃下加热碘内酯6小时，将50mL甲苯添加到冷却的混合物中，然后用H2O洗涤，用甲苯萃取连续的H2O层。干燥和旋转蒸发得到4.80g 1.27(31.5mmol，89％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.90(m,1H),5.4(dm,1H),5.0(bs,1H),3.0(t,1H),2.5–1.4(m,8H)ppm。
Methyl(rel-1R,6S,Z)-6-hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.28)：
Figure BDA0003509271520002182
200mg钠(8.7mmol)溶于30ml甲醇中。将此溶液加入4.58g 1.27(30.0mmol)的10mL甲醇中。将溶液搅拌1小时，然后浓缩。NMR表明只有顺式异构体(OH与酯)存在。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.80(q,1H),5.50(dd,1H),4.70(m,1H),3.68(s,3H),2.45–1.4(m,9H)ppm。为了实现所需的差向异构化，用60毫升四氢呋喃和5.0克叔丁醇钾搅拌残留物1小时，然后在60℃下旋转蒸发。用75ml甲苯和15mL甲醇稀释残留物，在冰水中冷却混合物，添加5mL 37％盐酸，然后加入15mL冷水。分离各层，用50mL甲苯萃取水层。干燥和旋转蒸发，产生两种差向异构体酯的混合物(反式：4.6ppm；顺式：4.7ppm；比率1.5/1)。
残留物用4.2g氢氧化钠、50mL甲醇和15mL水回流加热1小时进行皂化。去除甲醇后，加入100毫升TBME，冷却混合物，并用37％的HCl酸化。用100mL TBME提取水层。浓缩后的酸呈粘稠油状，用50毫升甲苯回流加热1小时，将顺式异构体转化为起始内酯。蒸发溶液，并在Kugelrohr中以120℃/0.05mbar的温度加热残余物，以得到馏出物(顺式异构体形成的起始内酯)和残余物，即反式酸(2.05g，12.05mmol)，仍然存在15％的顺式异构体。
用935mg氢氧化钾(14.2mmol)回流加热残渣1小时，添加1mL乙醇酸，继续回流30分钟，然后浓缩，形成泡沫。将其与25毫升DMF混合并在冰上冷却；添加3.2g碘甲烷，并将混合物搅拌过夜。加入75毫升TBME和50毫升水，用水冲洗有机相。用甲苯萃取连续的水层。浓缩后得到粗酯，使用hept和EtOAc在硅胶上进行色谱分析，得到顺式(15％)和反式异构体(OH与酯)的混合物为1.28。产率：1.57g(8.52mmol,28％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.65(m,1H),5.55(m,1H),4.60(m,1H),3.67(s,3H),2.55(m,1H),2.4–1.4(m,8H)ppm。
Methyl(rel-1R,6S,E)-6-hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.29a(OH＝axial)and 1.29b(OH＝equatorial))：
Figure BDA0003509271520002201
对hept/EtOAc(4/1)中1.57g 1.28(8.52mmol)、2.45g苯甲酸甲酯(18.0mmol)的溶液进行紫外线照射，使其在15.2g 10％硝酸银硅胶柱上连续流动18小时。用100毫升TBME和100毫升TBME/5％甲醇洗脱柱，然后用30毫升15％氨水和TBME搅拌连续部分和柱材料。将有机层合并(这些馏分中的两种异构体没有完全分离)，干燥并浓缩(0.84g；核磁共振表明轴向TCO和赤道TCO的比例约为1:1)。用hept/EtOAc在硅胶上进行色谱分析，分离出1.29a(轴向OH)(120mg)和1.29b(赤道OH)(80mg)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)of 1.29aδ6.06(dt,1H),5.49(dd,1H),4.47(bs,1H),3.68(s,3H),2.8(m,2H),2.4–1.4(m,7H)ppm。1H-NMR(300MHz,CDCl3)of 1.29b TCO:δ5.69(m,1H),5.55(dd,1H),4.39(dt,1H),3.64(s,3H),2.47(m,1H),2.3–1.0(m,8H)ppm。
Methyl(rel-1R,6S,E)-6-((dimethylcarbamoyl)oxy)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.30)：
Figure BDA0003509271520002202
向5mL DCM中的1.29a(120mg，0.65mmol)和282mg DMAP(2.31mmol)的冷却溶液中添加274mg 4-硝基苯氯甲酸酯(4-nitrophenylchloroformate)(1.36mmol)，然后冷搅拌1小时，并在室温下搅拌2天。粗反应混合物通过硅胶柱(hept/EtOAc/NEt3)纯化，得到PNP酯中间体，其中添加1mL 2N二甲胺(THF)。搅拌2天并浓缩后，经硅胶柱层析(EtOAc/hept)分离出1.30。产率：40mg。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.89(m,1H),5.47(d,1H),5.23(s,1H),3.69(s,3H),2.95(bs,6H),2.75(m,1H),2.4–1.4(m,8H)ppm。
(rel-1R,6S,E)-6-((Dimethylcarbamoyl)oxy)cyclooct-4-ene-1-carboxylicacid(1.31)：
Figure BDA0003509271520002211
将1.30(40毫克)和LiOH水(112mg，2.67mmol)在MeOH/H2O(10mL，1mL)中搅拌过夜，然后去除MeOH，并添加30mL TBME。分离水相并用2x0.5mL水萃取有机物之后，将混合水相与30毫升TBME和670毫克柠檬酸混合。用水洗涤有机相，然后干燥和浓缩，得到25mg的1.31。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.85(m,1H),5.55(d,1H),5.40(s,1H),2.9(bs,6H),2.6(m,1H),2.4–1.3(m,8H)ppm。
(Z)-9-Azabicyclo[6.2.0]dec-4-en-10-one(1.32)：
Figure BDA0003509271520002212
在冰上将275mL环辛二烯(2.25mol)、300mL DCM和8.0g碳酸钠(75.5mmol)添加至氯磺酰异氰酸酯(chlorosulfonyl isocyanate)(101.9g，0.72mol)，在4-6℃下放置1小时。搅拌4天后，将混合物逐渐(在20分钟内)倒入150g Na2HPO4(0.843mol)、150克亚硫酸钠(1.19摩尔)和1千克冰/150毫升DCM的机械搅拌混合物中。将混合物放入冰浴中，快速搅拌15分钟后，在1小时内分部分添加65.5g NaHCO3(0.780mol)。搅拌1小时后，添加水。用水冲洗有机相，并用EtOAc萃取结合水层。对有机层进行干燥和浓缩，得到残留物，在静息4天后，将其倾析，使用hept处理并过滤，得到1.32(20.26g)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ6.0(bs,1H),5.68(m,2H),3.8(m,1H),3.3(m,1H),2.4(m,2H),2.0(m,6H)ppm。
从倾析液和通过重复操作步骤获得的组合水层中回收额外的原油，然后进行硅胶柱净化(hept/EtOAc)。总收率55.63g(0.368mol，51％)。
Methyl(1R,4Z,8S)-8-aminocyclooct-4-ene-1-carboxylate HCl(1.33)：
Figure BDA0003509271520002221
将300mL甲醇中的1.32(55.63g，0.368mol)冷却的溶液添加至亚硫酰氯(68mL，0.937mol)，持续5小时。在室温和浓缩条件下搅拌过夜后，使用TBME(200mL)搅拌所得固化油2小时。用TBME过滤和洗涤后分离出1.33。产率：54.10克(0.246摩尔，67％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.75–5.58(m,2H),3.79(s+m,4H),3.24(t,1H),2.65(m,1H),2.5–1.7(m,7H)ppm。
Methyl(1R,4Z,8S)-8-((tert-butoxycarbonyl)amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.34)：
Figure BDA0003509271520002222
在冰上将25mL DCM和100mL甲苯中的1.33(17.78g，80.9mmol)和NEt3(17.3g，171.3mmol)添加至Boc酸酐(20.1g，92.2mmol)，持续30分钟。在室温下搅拌3天后，添加50mL水，搅拌混合物15分钟。分离各层，并用40mL水清洗上层。用50毫升甲苯提取连续的水溶液。干燥和浓缩得到23.07g棕色油(81.4mmol)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.8–5.55(m,2H),5.05(m,1H),4.15(m,1H),3.72(s,3H),2.85(m,1H),2.45(m,1H),2.4–1.5(m,7H),1.43(s,9H)ppm。
Methyl(rel-1S,8S,Z)-8-((tert-butoxycarbonyl)amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.35)：
Figure BDA0003509271520002231
将75mL甲醇中的1.34缓慢加至甲醇中的46g 25wt％甲醇钠，然后搅拌过夜并浓缩。向残留物中添加TBM、冰和水，然后分离上层，并用水进行额外清洗。将TBME、15g柠檬酸和冰添加到第一水层中。分层，上层用第二层水冲洗。干燥和旋转蒸发，然后以硅胶(hept/EtOAc/NEt3)进行色谱分析，得到分离的顺式和反式异构体(NHBoc vs CO2CH3)。再次处理并纯化顺式物质，得到总收率为10.64g反式异构体(37.5mmol，46％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.7(m,2H),4.63(m,1H),4.0(m,1H),3.66(s,3H),2.75(m,1H),2.5–1.5(m,8H),1.41(s,9H)ppm.
(rel-1S,8S,Z)-8-((tert-Butoxycarbonyl)amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylic acid(1.36)：
Figure BDA0003509271520002232
在50mL水中加入1.35(10.64g，37.5mmol)和11.0g碳酸钾，并在几分钟内加入50mL甲醇，在30℃下搅拌混合物3天，然后在62℃下加热22小时，以得到澄清溶液。大部分MeOH在真空中去除，剩余溶液用2x50mL甲苯清洗。在冰中冷却合并的水层，添加100mL甲苯，并用11g柠檬酸缓慢酸化混合物。分离各层，用甲苯萃取水层。干燥和旋转蒸发得到10.3克酸。NMR显示出多个宽信号(δ6.6,5.7,5.15,4.9,4.2,4.1,3.9,2.9,2.8,2.7,2.5-1.4ppm)。
tert-ButylN-[(1S,2S,4Z,6R)-8-oxo-7-oxabicyclo[4.2.2]dec-4-en-2-yl]carbamate(1.37)：
Figure BDA0003509271520002241
将200mL DCM中1.36(31.56117.2mmol)和36.0g NaHCO3(429mmol)以及120毫升水充分搅拌1小时，然后在冰上冷却。在90分钟内添加24.97g碘化钾(150.4mmol)和36.00g碘(0.142mol)，并搅拌混合物3天。用DCM和H2O稀释后，缓慢添加6.0g亚硫酸钠，使混合物无色。
使用水冲洗有机层。使用DCM提取结合水层。干燥和浓缩得到残余物(40.9克)，溶解在200mL甲苯中。添加23.08g DBU(151.6mmol)，并在70℃下将混合物加热18小时。冷却后，添加甲苯和冰。使用水冲洗有机层，并使用甲苯提取连续的水溶液层。干燥及浓缩后得到1.37，作为粘性油(18.5克)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.83(m,1H),5.62(m,1H),5.10(m,1H),4.76(broad,1H),4.27(broad,1H),3.50(广,1H),2.73(broad,1H),2.17(m,1H),2.1–1.4(m,4H),1.43and 1.42(2s,9H)ppm。
Methyl(rel-1S,2S,6R,Z)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-6-hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.38)：
Figure BDA0003509271520002242
将30mL THF中的冷的1.37(9.47g，35.42mmol)及10mL甲醇中加至20mL甲醇中的110mg钠(4.8mmol)，并将溶液搅拌过夜(注：当使用超过1当量的碱时，酯化伴随部分差向异构化)。将溶液倒入100mL水和100mL甲苯中。层被分离，使用甲苯萃取水溶液层。使用水清洗甲苯层，干燥并浓缩，得到10.3g 1.38。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.7(m,1H),5.55(m,1H),4.6(m,2H),3.65(s,3H),2.55(m,2H),2.3(m,1H),2.1–1.5(m,5H),1.41(s,9H)ppm。
Methyl(rel-1S,2S,6R,Z)-6-hydroxy-2-(((2-(trimethylsilyl)ethoxy)-carbonyl)amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.39)：
Figure BDA0003509271520002251
将30mL DCM中的冷的1.38(2.25g，7.52)加至5mL DCM中的6.28g TFA(55.1mmol)，持续20分钟。搅拌溶液6小时，2小时后达到室温，然后在25-30℃下浓缩(4.40g)。将残留物溶解在30mL DCM中，添加5.0g NEt3(49.5mmol)，并冷却溶液。加入2.05g N-[2-(三甲基硅基)乙氧基羰基]丁二酰亚胺(N-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy]succinimide)(7.91mmol)，并将溶液搅拌过夜。使用DCM稀释溶液，使用水冲洗。使用DCM提取连续的水溶液。干燥和浓缩得到3.43g残留物，在硅胶(hept/EtOAc)上进行色谱分析。产率：1.63g of1.39(4.75mmol,63％).1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.75(m,1H),5.58(m,1H),4.66(d,1H),4.6(m,1H),4.14(bt,2H),3.65(s,3H),2.55(m,2H),2.3(m,1H),2.1–1.5(m,5H),0.95(bt,2H),0.03(s,9H)ppm。
Methyl(1S,2S,4E,6R)-6-hydroxy-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.40)：
Figure BDA0003509271520002252
在4：1hepts/EtOAc中辐照1.39(1.63g，4.75mmol)及1.65g苯甲酸甲酯(methylbenzoate)，同时通过硅胶上10％硝酸银的10g柱连续冲洗溶液。在23小时的辐照时间后，溶液不含起始化合物。使用75mL TBME洗脱(elute)柱，然后使用75mL TBME/5％甲醇洗脱。每个洗脱(eluate)使用(相同的)25mL 15wt％的氨搅拌。分离各层，使用15mL水清洗有机层，然后在真空中干燥和浓缩。NMR表明材料(0.85g)为轴向TCO 1.40。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.86(m,1H),5.52(d,1H),4.68(bs,2H),4.12(bt,2H),3.94(m,1H),3.67(m)and 3.62(s)(4H),2.95(m,1H),2.2(m,2H),1.85(m,2H),1.4(m,2H),0.95(m,2H),0.03(s,9H)ppm。
Methyl(1S,2S,4E,6R)-6-{[(4-nitrophenoxy)carbonyl]oxy}-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.41)：
Figure BDA0003509271520002261
将1.40(140mg；0.408mmol)溶解于CHCl3(10mL)中，并添加DMAP(199mg；1.63mmol)。将溶液冷却至0℃，并添加4-硝基苯基氯甲酸盐(123mg；0.612mmol)。在0℃下，在Ar下，搅拌混合物30分钟，然后使用0.5M柠檬酸水溶液(2×10mL)清洗。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱层析纯化，在n-hept中使用5％至30％的洗脱梯度。这产生了1.41白色固体(60mg)。1H-NMR(CDCl3):δ8.28(d,J＝9.1Hz,2H),7.39(d,J＝9.1Hz,2H),5.86(ddd,J＝15.5,11.6,3.7Hz,1H),5.53(d,J＝12.8Hz,1H),5.50(s,1H),4.72(d,J＝10.3Hz,1H),4.13(t,J＝8.4Hz,2H),3.98(m,10H),3.65(s,2H),3.00(dt,J＝11.5,4.3Hz,1H),2.33–2.11(br.m,3H),2.00(m,1H),1.66(m,2H),0.95(m,2H),0.03(s,9H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ13C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.82,155.41,155.30,151.46,145.42,130.42,127.72,125.31,121.72,77.50,53.80,51.90,36.04,25.52,17.71,-1.49ppm。
Methyl(1S,2S,4E,6R)-6-((dimethylcarbamoyl)oxy)-2-(((2-(trimethylsilyl)ethoxy)carbonyl)amino)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.42)：
Figure BDA0003509271520002271
将1.41(30mg；0.059mmol)溶解于THF(2mL)中。加入二甲胺在THF(0.074mL 2M；0.147mmol)中的溶液，并在20℃下搅拌混合物30分钟。将混合物蒸发至干燥，溶解于CHCl3(15mL)中，随后使用0.5M柠檬酸(2×10mL)和1M NaOH(2×10mL)洗涤。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥，得到1.42无色油(29mg)。1H-NMR(CDCl3):δ5.68(ddd,J＝15.8,11.4,3.8Hz,1H),5.50(dd,J＝16.4,2.5Hz,1H),5.43(d,J＝2.7Hz,1H),4.74(m,1H),4.12(t,J＝8.5Hz,2H),3.96(m,1H),3.63(s,2H),2.93(t,J＝5.5Hz,6H),2.20(m,2H),2.05(ddd,J＝13.7,5.6,2.1Hz,1H),1.92(ddd,J＝15.6,5.6,2.2Hz,1H),1.57(m,2H),0.95(m,2H),0.06(s,9H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ176.12,155.33,132.73,126.04,125.47,73.25,63.13,58.02,54.05,51.74,42.72,36.38,35.81,30.28,25.69,17.67,-1.51ppm。
Methyl(1S,2S,4E,6R)-2-amino-6-((dimethylcarbamoyl)oxy)cyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.43)：
Figure BDA0003509271520002272
将1.42(7.25mg；0.0175mmol)溶解在MeCN(0.5mL)中，加入KF(4.1mg；0.070mmol)，然后加入四丁基氟化铵(tetrabutylammonium fluoride)(0.053mL在THF中的1M溶液)。将混合物加热至45℃ 18小时，然后蒸发至干燥。将粗产物溶解在CHCl3(1.5mL)中，并用0.1M碳酸钠(3×1mL)洗涤。以Na2SO4上干燥有机层、过滤，并蒸发至干燥状态，以异构体混合物(4mg，无色油)的形式得到1.43。1H-NMR(CDCl3):δ5.72(ddd,J＝16.0,11.6,3.8Hz,1H),5.50(dd,J＝16.4,2.5Hz,1H),5.42(d,J＝3.0Hz,1H),3.68(s,3H),3.18(td,J＝10.1,4.7Hz,1H),2.93(s,6H),2.85(m,1H),2.03(m,2H),1.67(m,2H),1.48(m,4H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ177.67,155.44,132.17,127.19,73.46,59.79,56.41,51.60,44.63,37.07,36.40,35.83,26.03ppm。
TCO-doxorubicin(1.44)：
Figure BDA0003509271520002281
在室温下，在干燥的MeCN：DMSO中，使用盐酸阿霉素(doxorubicin HCl)(25.2mg，46.4μmol)及DiPEA(20.4μL，116μmol)处理1.41(11.8mg，23.2μmol)18小时。酸化、制备型HPLC(含0.1％TFA的水/MeCN梯度)及冷冻干燥后，以29％的产率(6.2mg，6.8μmol)将1.44分离为白色粉末。ESI-MS计算到：C44H56N2O17Si 912.33；观察到：[M-H]-911.24,[M+Na]+935.24。
TCO-doxorubicin(1.45)：
Figure BDA0003509271520002291
在50℃下，在MeCN中，使用TBAF(THF中的1M溶液，17.6μL)处理1.44(2.0mg，2.2μmol)8小时，然后进行浓缩。残余物被CHCl3吸收，用饱和NaHCO3(5x)洗涤，以Na2SO4干燥，并浓缩。产率：82％(1.4mg，1.8μmol)。通过与四嗪2.20反应，ESI-MS鉴定电离度差的1.45，从而得到质量为C27H30N6O5 518.23的预期偶联物；观察到[M+H]+519.36。
Methyl(rel-1R,2S,6R,Z)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-6-hydroxycyclooct-4-ene-1-carboxylate(1.46)：
Figure BDA0003509271520002292
在甲醇中，将50mL甲醇中的1.37(24.9g)及50mL THF添加至50mL5.4N甲醇钠，然后搅拌3天并浓缩。向残余物中添加200mL甲苯、150克冰和45克柠檬酸。使用甲苯萃取水溶液层。干燥和旋转蒸发得到部分差向异构化酯(“顺式”/“反式”，NHBoc与酯的取向，约60/40比)。以硅胶(hept/EtOAc)上对材料进行色谱分析，得到(8.86g)纯“顺式”异构体1.46。如上所述，对含有“反式”异构体的馏分进行处理及纯化，以生成更多顺式产物。总产量：12.82g,42.82mmol,41％.1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.65(m,2H),4.7(m,1H),4.55(m,1H),4.15(广,1H),3.66(s,3H),2.95(m,1H),2.4–1.5(m,6H),1.41(s,9H)ppm。
tert-Butyl((rel-1S,5R,8R,Z)-5-hydroxy-8-(hydroxymethyl)cyclooct-3-en-1-yl)carbamate(1.47)：
Figure BDA0003509271520002301
将32mL THF中的1.46(1.88g，6.28mmol)添加到甲醇(1.60克)，然后在-65℃下冷却，并且添加360mg硼氢化锂(lithium borohydride)(16.5mmol)。将混合物搅拌5小时，2小时后达到室温。添加5mL EtOAc，搅拌10分钟，添加20mL水，搅拌10分钟。添加30mL水，使用DCM萃取混合物。干燥、过滤和旋转蒸发得到1.60g泡沫(5.90mmol，94％)，在下一步中使用。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.68(dd,1H),5.50(m,1H),4.46(m,1H),3.97(m,1H),3.30(dd,1H),3.19(t,1H),2.34(m,1H),2.1(m,5H),1.85(m,1H),1.50(dd)and 1.42(s)(10H),1.24(m,1H),0.97(bd,1H)ppm。
((rel-1R,2S,6R,Z)-2-((tert-Butoxycarbonyl)amino)-6-hydroxycyclooct-4-en-1-yl)methyl methanesulfonate(1.48)：
Figure BDA0003509271520002302
将100mL THF中冷却1.47(7.67g，28.3mmol)及8.58g NEt3(85.0mmol)加至3.50g甲磺酰氯(methanesulfonyl chloride)(30.55mmol)，然后搅拌过夜。加入250mL DCM，然后加入100mL水，搅拌混合物30分钟。分离各层，使用H2O清洗有机层。使用DCM提取连续的水层。干燥和旋转蒸发得到粗产品，无需进一步纯化。NMR：以2/1的比例，在3.0和2.8ppm下2个单态。
(rel-4aR,7R,10aS,Z)-7-Hydroxy-1,4,4a,5,6,7,10,10a-octahydro-2H-cycloocta[d][1,3]oxazin-2-one(1.49)：
Figure BDA0003509271520002311
将15mL DMF中冰冷却的1.48和40mL THF分份添加到1.53g氢化钠(60％，38.3mmol)中。将混合物搅拌3天，缓慢加入5mL水。使用hept稀释混合物，使用硅胶柱(hept至EtOAc/MeOH)纯化上清液。将含有馏分的产品浓缩，用DCM/MeOH(6/1)搅拌，过滤，并用DCM洗涤固体。使用水提取滤液，使用DCM清洗并浓缩水层。使用DCM搅拌粘性半固体残留物。使用DCM过滤和洗涤得到产物(1.10g)和来自滤液(4.9g)的额外大部分纯物质。1H-NMR(300MHz,D2O):δ5.60(m,1H),5.44(m,1H),4.45(m,1H),4.13(dd,1H),4.04(dd,1H),3.57(m,1H),2.2–1.2(m,7H)ppm。13C-NMR(75MHz,D2O):δ138.1,131.0,123.7,74.9,70.1,54.3,37.0,32.6,30.5,22.4ppm.MS:198.4(M+1)。
注：此反应旨在制备Boc保护(Boc-protected)的氮杂环辛烯(azetidine cis-cyclooctene)，作为氮杂环丁烷TCO的中间体(见下文)。可以制备关键中间体Boc保护的氮杂环辛烯，但这一步骤需要进一步优化。
Figure BDA0003509271520002312
2-(Trimethylsilyl)ethyl((rel-1S,5R,8R,Z)-5-hydroxy-8-(hydroxy methyl)cyclooct-3-en-1-yl)carbamate(1.50)：
Figure BDA0003509271520002321
将1.49(粗品，4.90g)、30mL二恶烷(dioxane)中的2.4g氢氧化钠及15mL水在80℃下加热30分钟，然后完全蒸发。残留物在硅胶(DCM/NEt3，MeOH增加)上进行色谱分析，并按此使用。CDCl3中的核磁共振显示信号为5.65(m，1H)、5.4(m，1H)、4.4(m，1H)、3.75(m，2H)。
将此材料与甲醇、异丙醇和甲苯混合，得到溶液。将其在60℃下旋转蒸发以产生残留物，将其与30mL MeCN和2.50g NEt3搅拌，然后添加3.0g N-[2-(三甲基硅基)乙氧基羰基]丁二酰亚胺(N-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy]succinimide)(11.57mmol)，并将混合物搅拌3天。浓缩浑浊的溶液。残余物与DCM混合，用水冲洗。用DCM提取连续的水溶液层。干燥和浓缩后进行硅胶色谱(EtOAc/hept)。产量：880mg的1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.7(m,1H),5.55(m,1H),4.5(m,1H),4.2–4.0(m,3H),3.3(m,2H),2.1(m,2H),1.85(m,1H),1.55(m,1H),1.2(m,1H),1.05–0.8(m,5H),0.04(s,9H)ppm。13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ158.0,139.0,124.5,70.9,64.1,63.9,50.1,41.7,37.7,32.2,21.5,17.7,-1.5ppm.MS:314.5(M-1)。
2-(trimethylsilyl)ethyl N-[(1S,3E,5R,8R)-5-hydroxy-8-(hydroxymethyl)cyclooct-3-en-1-yl]carbamate(1.51)：
Figure BDA0003509271520002331
对4/1hept/EtOAc中的1.50(800mg，2.69mmol)和1.00g苯甲酸甲酯进行辐照，辐照溶液在6.5g 10％硝酸银硅胶(3.82mmol)柱上连续冲洗。总辐照时间13小时后，用60毫升TBME、60毫升TBME/5％甲醇、70毫升TBME/20％甲醇冲洗色谱柱。用同样的30毫升15％氨水连续搅拌所有馏分和柱状物5-10分钟。每层分离一次，上层干燥并浓缩。如上所述，再次处理含顺式的部分，以产生总计480mg的标题化合物。复杂的核磁共振，可能是由于两种TCO异构体和转子异构体。在4-6ppm的区域内，观察到以下信号：6.0-5.3(m)、4.9(d)、4.5(bs)、4.25(m)、4.15(m)。
(1R,2E,5S,6R)-6-({[(4-Nitrophenoxy)carbonyl]oxy}methyl)-5-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)cyclooct-2-en-1-yl 4-nitrophenylcarbonate(1.52)：
Figure BDA0003509271520002332
将1.51(424mg；1.43mmol)溶解在CHCl3(20mL)中，并添加DMAP(697mg；5.72mmol)。将溶液冷却至0℃，并添加4-硝基苯基氯甲酸盐(4-nitrophenyl chloroformate)(432mg；2.15mmol)。在0℃下，在Ar气氛下，将混合物搅拌30分钟，然后用0.5M柠檬酸水溶液(2倍于10毫升)及1M氢氧化钠溶液水溶液(2倍于10毫升)清洗。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱层析纯化，在n-hept中使用5％至60％的洗脱梯度EtOAc。这产生了白色固体(252mg)的异构体混合物形式的产物。1H-NMR(CDCl3):δ8.34–8.24(m,4H),7.40(td,J＝9.3,8.2,2.2Hz,4H),6.07–5.75(m,2H),5.57(dd,J＝16.7,2.5Hz,0H),5.42(s,0H),5.26–5.15(m,1H),5.01–4.93(m,1H),4.55–4.29(m,1H),4.24–4.11(m,3H),4.16–3.94(m,1H),2.73–2.56(m,1H),2.55–2.35(m,1H),2.30–2.13(m,1H),1.89(t,J＝6.0Hz,1H),1.79(d,J＝13.6Hz,1H),1.35–1.18(m,3H),1.03–0.92(m,2H),0.88(t,J＝6.7Hz,1H),0.04(s,9H)ppm。
(1R,2E,5S,6R)-6-{[(Dimethylcarbamoyl)oxy]methyl}-5-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)cyclooct-2-en-1-yl N,N-dimethylcarbamate(1.53)：
Figure BDA0003509271520002341
将1.52(115mg；0.25mmol)溶于THF(3mL)中。加入在THF(0.313mL 2M；0.626mmol)中的二甲胺的溶液，并在20℃下搅拌混合物30分钟。将混合物蒸发至干燥，溶解于CHCl3(15mL)中，随后用0.5M柠檬酸水溶液(2×10mL)及1M氢氧化钠水溶液(3倍于20毫升)清洗。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥，以得到标题化合物，为无色油状异构体混合物(90mg)。1H-NMR(CDCl3):δ5.85(ddd,J＝15.9,11.9,3.7Hz,1H),5.68(dd,J＝16.2,9.6Hz,1H),5.29(s,1H),5.08(td,J＝9.8,5.8Hz,1H),4.84(d,J＝9.3Hz,1H),4.39(s,1H),4.15(tt,J＝14.4,7.7Hz,4H),3.94(dd,J＝10.8,6.9Hz,1H),3.78(t,J＝9.9Hz,1H),2.99–2.86(m,20H),2.56(d,J＝11.0Hz,2H),2.35(dd,J＝12.3,6.1Hz,1H),2.30–2.14(m,1H),1.96(dd,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.15–0.91(m,4H),0.08(s,1H),0.07(s,23H)ppm。
(1S,5R,6S,E)-5-Amino-6-(((dimethylcarbamoyl)oxy)methyl)cyclooct-2-en-1-yl dimethylcarbamate(1.54)：
Figure BDA0003509271520002351
将1.53(22.5mg；0.061mmol)溶解在MeCN(1mL)中，并添加氟化钾(14.1mg；0.24mmol)，然后添加四丁基氟化铵(0.183mL在THF中的1M溶液；0.183mmol)。将混合物加热至45℃ 18小时，然后蒸发至干燥。将粗产物溶解在CHCl3(5mL)中，并用0.1M碳酸钠水溶液(3倍于1.5毫升)洗涤。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥，以得到标题化合物，为无色油状异构体混合物(12mg)。1H-NMR(CDCl3):δ6.01(ddd,J＝16.0,11.8,3.9Hz,1H),5.64(dt,J＝16.3,10.0Hz,1H),5.09(td,J＝9.7,5.7Hz,1H),4.10–3.93(m,1H),3.96–3.85(m,1H),3.53(s,1H),2.91(d,J＝3.7Hz,13H),2.43–2.20(m,2H),2.24–2.00(m,1H),2.03–1.82(m,0H),1.82–1.68(m,1H),1.68–1.49(m,1H),1.42(dtd,J＝18.9,14.4,13.4,5.0Hz,2H),1.24(d,J＝13.3Hz,0H),1.17–1.11(m,1H),1.07–0.87(m,1H)ppm.
N-(But-3-en-1-yl)-N-(3,3-diethoxypropyl)-2,2,2-trifluoroacetamide(1.55)：
Figure BDA0003509271520002352
3,3-二乙氧基丙烷-1-胺(3,3-diethoxypropan-1-amine)(11.1g，75.4mmol)、4-溴-1-丁烯(4-bromo-1-butene)(10.8g，80.0mmol)及24.0g碳酸钾(173.9mmol)在50mL DMF中在室温下搅拌45分钟，然后在60℃下搅拌3小时。浓缩后，用TBME稀释残留物，过滤，并用TBME洗涤固体。添加10.05g二苯乙酸(77.9mmol)，冷却溶液，并在10分钟内添加TFA酸酐(16.94g，80.66mmol)。在室温下搅拌溶液3小时，然后添加12.0g NaHCO3，然后添加75g冰。搅拌混合物10分钟，用50毫升水清洗有机层。使用100ml TBME提取连续的水溶液层。干燥及旋转蒸发得到19.0g残留物，并对其进行色谱分析(hept/EtOAc)，得到16g(53.4mmol，两步骤达到71％，足够纯度用于下一步骤)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.75(m,1H),5.1(m,2H),4.5(m,1H),3.65(m,2H),3.45(m,6H),2.35(q,2H),1.90(m,2H),1.20(t,6H)ppm.19F-NMR(282MHz,CDCl3):δ-69.2,-69.0ppm.
N-(But-3-en-1-yl)-2,2,2-trifluoro-N-(3-oxopropyl)acetamide(1.56)：
Figure BDA0003509271520002361
向10毫升水中加入40毫升醋酸中的1.55(16.0g)，并搅拌溶液3天。除去一些乙醇后。然后在30℃下搅拌3天，添加5mL水，并部分蒸发溶液。剩余物用水稀释，然后用甲苯萃取。用水清洗连续的甲苯层，然后干燥并旋转蒸发，得到7.95g产物(35.6mmol，3步骤达到47％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.64(2s,1H),5.6(m,1H),4.98(m,2H),3.57(m,2H),3.36(m,2H),2.73(m,2H),2.23(m,2H)ppm.13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ199.7,198.8,157(m),133.9,133.1,117.9,117.5,116.2(d),47.7,47.6,46.4,42.9,41.3,41.1,33.0ppm.
5-(N-(But-3-en-1-yl)-2,2,2-trifluoroacetamido)pent-1-en-3-yl2,2,2-trifluoroacetate(1.57)：
Figure BDA0003509271520002371
在-60至-70℃下，将75mL THF中的1.56(4.65g，20.8mmol)加至20mL 1.6N乙烯基溴化镁(N vinylmagnesium bromide)(32mmol)，持续15分钟。将混合物加热至0℃，然后将淡黄色溶液倒入16g氯化铵中，加入100mL水及100mL TBME。层被分离，并且使用TBME提取水溶液层。干燥和旋转蒸发得到5.84g残留物。三氟乙酰基似乎部分转化为OH(也在站立时)，因此它被转化为双TFA化合物。
在0℃下，将三氟乙酸酐(4.8mL，35mmol)滴加至上述粗产物的溶液中，所述粗产物在DIPEA(10mL，58mmol)及DCM(100mL)中获得。在此温度下搅拌混合物2小时，然后旋转蒸发。通过柱层析(EtOAc/het)纯化残留物，得到0.83g产物1.57。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.8(m),5.4(m)and 5.1(m)(7H),3.4(m,4H),2.36(q,2H),2.09(q,2H)ppm.13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ133.8,133.0,132.9,132.5,120.3,120.0,118.3,117.8,77.1,76.6,47.4,47.4,46.5,43.4,43.4,43.3,33.1,32.7,31.2,30.8ppm.19F-NMR(282MHz,CDCl3):δ-75.3,-75.2,-69.3,-69.0ppm。
(Z)-1-(2,2,2-三氟乙酸基)-1,2,3,4,7,8-六氢偶氮-4-基2,2,2-三氟乙酸(1.58)((Z)-1-(2,2,2-Trifluoroacetyl)-1,2,3,4,7,8-hexahydroazocin-4-yl2,2,2-trifluoroacetate(1.58))：
Figure BDA0003509271520002381
将DCM(700mL)中1.57(2.3g，6.62mmol)的溶液脱气，并置于N2下。添加Grubbs第二代催化剂(282mg，0.33mmol)，并在45℃下搅拌混合物18小时，然后在N2下，在室温下搅拌20小时。旋转蒸发溶液，通过硅胶柱色谱法，使用hept/DCM 1/2至DCM纯化残留物。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.9(m,1H),5.7(m,2H),3.75(m,2H),3.4(m,2H),2.45(m,3H),2.0(m,1H)ppm.19F-NMR(282MHz,CDCl3):δ-75.2,-68.8ppm。
2-(三甲基硅基)乙基(Z)-4-羟基-3,4,7,8-四氢偶氮-1(2H)-羧酸盐(1.59)(2-(Trimethylsilyl)ethyl(Z)-4-hydroxy-3,4,7,8-tetrahydroazocine-1(2H)-carboxylate(1.59))：
Figure BDA0003509271520002382
1.58(1.4g，4.39mmol)在回流下用550mg NaOH(13.75mmol)、5mL水及25mL MeOH加热2小时。通过旋转蒸发去除甲醇，并向残余物中添加50mL DCM及Na2SO4。过滤、重复(2x)及旋转蒸发，得到600mg氨基中间体(4.72mmol)，为固化油。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.65(m,2H),4.67(m,1H),2.93(2t,1H),2.8(m,2H),2.63(dt,1H),2.3(m,1H),2.15(m,1H),1.95(m,1H),1.6(m,1H)ppm。
将此氨基溶解于20mL DCM中，添加1.24g(12.3mmol)NEt3，然后添加1.38g N-[2-(三甲基硅基)乙氧基羰基]丁二酰亚胺(N-[2-(trimethylsilyl)ethoxy carbonyloxy]succinimide)(5.32mmol)。将溶液搅拌过夜，并在添加75mL甲苯及20mL水之前进行浓缩。分层，用水冲洗上层。使用甲苯提取连续的水溶液层。干燥及旋转蒸发，以产生一种固化油，其在硅胶(hept/EtOAc)上进行色谱分析。产量：1.59：1.11g(4.09mmol)。1H-NMR(300MHz，CDCl3，2个旋转异构体，比例约为1.5/1):δ5.75(m)及5.65(m)(2H)，4.5(m，1H)，4.18(m，2H)，3.9(2t)及3.8(2t)(1H)，3.5(m，1H)，2.9(m，2H)，2.6-2.0(m，3H)，1.58(m，1H)，1.0(m，2H)，0.0(s，9H)ppm。13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ157，156，136.3，136.1，127.3，126.7，67.5，67.5，63.5，63.4，49.2，46.2，45.4，36.5，35.6，28.2，27.8，17.9，17.8，-1.4，-1.5ppm。
2-(三甲基硅基)乙基(E)-4-羟基-3,4,7,8-四氢偶氮-1(2H)-羧酸盐(1.60)(2-(Trimethylsilyl)ethyl(E)-4-hydroxy-3,4,7,8-tetrahydroazocine-1(2H)-carboxylate(1.60))：
Figure BDA0003509271520002391
辐照4/1hept/EtOAc中的1.59(1.11g，4.09mmol)及1.36g苯甲酸甲酯(10mmol)，使用8g 10％硝酸银(4.70mmol)在硅胶上连续冲洗被辐照的溶液10小时。使用TBME、TBME/5％甲醇及TBME/20％甲醇冲洗柱。使用15mL 25％氨水/10mL水搅拌所有馏分以及柱材料10分钟。分离各层，干燥上层并浓缩产生物质(总计710mg)，所述物质由两种异构体(主要是轴向TCO 1.60，其宽单线态(singlet)为4.67)及一些少量杂质的混合物组成。1H-NMR(300MHz，CDCl3，相关信号的位置)：δ5.9(m)，5.55(dd)，4.67(bs)，4.2(m)，3.6(m)，2.6(m)，2.5-2.0(宽m)，1.9-1.6(m)，1.3(m)，1.1-0.8(m)，0.0(s)ppm。
2-(三甲基硅基)乙基(S，E)-4-((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)-3,4,7,8-四氢偶氮-1(2H)-羧酸盐(1.61)(2-(Trimethylsilyl)ethyl(S,E)-4-(((4-nitrophenoxy)carbonyl)oxy)-3,4,7,8-tetrahydroazocine-1(2H)-carbo xylate(1.61))：
Figure BDA0003509271520002401
将1.60(115mg；0.424mmol)溶解于CHCl3(10mL)中，并添加DMAP(207mg；1.69mmol)。将溶液冷却至0℃，并添加4-硝基苯基氯甲酸盐(4-nitrophenylchloroformate)(128mg；0.636mmol)。在0℃下，在Ar气氛下，搅拌混合物1小时，然后使用0.5M柠檬酸水溶液(2倍10mL)清洗。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱层析纯化，在n-hept中使用5％至25％的洗脱梯度EtOAc。这产生了两种不同异构体的馏分。首先是碳酸基团位于轴向位置的异构体(56mg无色油)，然后是碳酸基团位于赤道位置的异构体(36mg无色油)。
轴1.61：1H-NMR(CDCl3)：δ8.29(d，J＝9.3Hz，2H)，7.41(d，J＝9.3Hz，2H)，5.90(m,1H)，5.54(m，1H)，5.51(s，1H)，4.28(m，1H)，4，18(m，2H)，3.70(m，1H)，2.87-2.55(br.m，3H)，2.40(m，2H)，2.09(t，J＝15.0Hz，1H)，1.03(m，2H)，0.06(s，9H)ppm。
赤道1.61:1H-NMR(CDCl3)：δ8.29(d，J＝9.3Hz，2H)，7.40(d，J＝9.3Hz，2H)，5.82(m，1H)，5.63(m，1H)，5.28(m,1H)，4.37-4.22(m，1H)，4.27-4.12(m，2H)，3.85(m，1H)，2.67(m，2H)，2.55-2.26(br.m，4H)，1.05(m，2H)，0.06(s，9H)ppm。
2-(三甲基硅基)乙基(S，E)-4-(二甲基氨甲酰)氧基)-3,4,7,8-四氢氮嗪-1(2H)-羧酸盐(1.62)(2-(Trimethylsilyl)ethyl(S,E)-4-((dimethylcarbamoyl)oxy)-3,4,7,8-tetrahydroazocine-1(2H)-carboxylate(1.62))：
Figure BDA0003509271520002411
1.61(35mg；0.080mmol；轴向)溶解在THF(3mL)中。加入在THF(0.10mL 2M；0.20mmol)中的二甲胺的溶液，并在20℃下搅拌混合物30分钟。将混合物蒸发至干燥，溶解于CHCl3(10mL)中，随后使用0.5M柠檬酸水溶液(2倍于5mL清洗)以及1M氢氧化钠水溶液(2倍于5mL)。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并蒸发至干燥，得到1.62，为无色油(29mg)。1H-NMR(CDCl3)：δ5.70(m，1H)，5.52(dd，J＝16.4，2.0Hz，1H)，5.42(m，1H)，4.30(m，1H)，4.17(m，2H)，3.63(m，1H)，2.97(m，6H)，2.74-2.23(br.m，5H)，1.97(ddd，J＝15.8，13.0，2.7Hz，1H)，1.01(m，2H)，0.06(s，9H)ppm。13C-NMR(CDCl3)：δ156.73，156.16，155.48，155.46，136.40，135.69，127.08，126.26，125.00，122.20，73.69，73.55，63.39，63.20，56.57，55.93，47.87，46.77，39.55，37.96，36.40，36.02，35.85，35.57，30.27，17.94，17.90，-1.50，-1.52ppm。
(S，E)-1,2,3,4,7,8-六氢偶氮-4-基二甲基氨基甲酸酯(1.63)((S,E)-1,2,3,4,7,8-Hexahydroazocin-4-yl dimethylcarbamate(1.63))：
Figure BDA0003509271520002412
将1.62(7.2mg；0.021mmol，轴向)溶解在MeCN(0.5mL)中，并添加氟化钾(4.8mg；0.082mmol)，然后添加四丁基氟化铵(tetrabutylammonium fluoride)(0.062mL在THF中的1M溶液；0.062mmol)。将混合物加热至45℃ 18小时，然后蒸发至干燥。将粗产物溶解在CHCl3(1mL)中，并使用0.1M碳酸钠水溶液洗涤(3×1mL)。分离有机层，以Na2SO4干燥、过滤，并且蒸发至干燥，得到轴向1.63，为无色油(4mg)。1H-NMR(CDCl3)：δ5.79(m，1H)，5.63(m，1H)，5.46(m，1H)，3.24(m，1H)，3.03(m，1H)，2.59(m，1H)，2.41(m，1H)，2.22(m，1H)，2.02-1.76(br.m，3H)ppm。13C-NMR(CDCl3)：δ135.90，127.09，74.54，58.90，55.00，46.45，44.48，38.84，24.09，19.76，13.68ppm。
TCO阿霉素(1.64)(TCO-doxorubicin(1.64))：
Figure BDA0003509271520002421
使用盐酸阿霉素(doxorubicin HCl)(16.3mg，30μmol)及DiPEA(13.2μL，75μmol)在干MeCN：DMSO中且室温下处理1.61(6.6mg，15μmol，轴向)18小时。酸化、制备型高效液相色谱(含0.1％TFA H2O/MeCN梯度)以及冷冻干燥后，以26％的产率(3.3mg，3.9μmol)分离出1.64，为白色粉末。通过与四嗪4-({6-[6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]吡啶-3-基}氨甲酰)丁酸(tetrazine 4-({6-[6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl]pyridin-3-yl}carbamoyl)butanoic acid)反应，对电离性差的1.64进行ESI-MS鉴定，得到质量为(C58H65N7O18Si)1175.42的预期1.64-TZ偶联物(conjugate)；观察到[M-H]-1175.08，[M-2H]2-587.56。
TCO阿霉素(1.65)(TCO-doxorubicin(1.65))：
Figure BDA0003509271520002431
在45℃下，在MeCN中，使用TBAF(THF)中的1M溶液，31.4μL，31.4μmol)处理1.64(3.3mg，3.6μmol)16小时，然后进行浓缩。残余物被CHCl3吸收，使用饱和NaHCO3(5x)洗涤，在Na2SO4上干燥，并浓缩。产率：83％(2.3mg，3.0μmol)。通过与四嗪4-({6-[6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]吡啶-3-基}氨甲酰)丁酸(tetrazine4-({6-[6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl]pyridin-3-yl}carbamoyl)butanoic acid)反应，对电离性差的1.65进行ESI-MS鉴定，得到质量为C24H26N6O3446.21的预期1.65-TZ偶联物(conjugate)；观察到阿霉素(doxorubicin)释放后[M+H]+447.40。
(Z)-3a,4,5,8,9,9a-六角水力旋流器八[b]呋喃-2(3H)-酮(1.66)((Z)-3a,4,5,8,9,9a-Hexahydrocycloocta[b]furan-2(3H)-one(1.66))：
Figure BDA0003509271520002432
(Bensel等人，Chem.Ber.1975,108,2697)在50℃下，向186.3g(1.163mol)丙二酸二乙酯(diethyl malonate)中添加在400mL乙醇中的26.7g(1.16mol)钠。将所得溶液搅拌5分钟，然后添加粗环辛烯环氧化合物(79.2g，0.782mol)。将混合物在回流(reflux)下加热4天，形成固体块。冷却，加入300mL水，然后逐渐加入90g氢氧化钾(1.366mol)。将混合物在回流下加热1小时，然后去除乙醇。冷却由此产生的水溶液，并使用400mL TBME清洗，使用2x50mL水提取TBME层。将合并的水层在冰中冷却，添加300mL甲苯，然后在15-20℃下逐渐添加230mL 37％HCl。分离各层，并且使用2x300mL甲苯提取水溶液层。干燥及旋转蒸发得到100.5g固化残余物。
此固体在加热套(heating mantle)中于130℃加热，由此固体熔化。1小时后，析气几乎停止，残余物在145-160℃/0.1mbar的Kugelrohr中蒸馏，得到53.8g产物(0.324mol，41％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.67(m，2H)，4.36(m，1H)，2.72(dd，1H)，2.6-2.1(m，7H)，1.9(m，1H)，1.6-1.2(m，2H)ppm。
(rel-3aS，6S，9aR，Z)-2-氧代-2,3,3a，4,5,6,9,9a-八氢旋流器-八[b]呋喃-6-乙酸乙酯(1.67)((rel-3aS,6S,9aR,Z)-2-Oxo-2,3,3a,4,5,6,9,9a-octahydrocycloocta[b]furan-6-yl acetate(1.67))：
Figure BDA0003509271520002441
向1.66(4.61g，27.73mmol)的40mL乙酸溶液中添加醋酸钾(5.91g，60.2mmol)，搅拌混合物10分钟，然后在冰水中冷却。在30分钟内将苯基硒基溴(Phenylselenyl bromide)(6.68g，28.3mmol)分次添加到溶液中。浅棕色悬浮液形成。过周搅拌，然后倒入100mL甲苯中。用50及2x25mL水清洗混合物。使用50mL甲苯提取连续的水溶液层。干燥及旋转蒸发得到10.03g材料，将其溶解在50mL THF中，在冰中冷却，然后在10分钟内添加12mL 35％过氧化氢。搅拌溶液4小时，达到室温，并将其倒入100mL甲苯及50mL水中。分离各层，使用25mL水冲洗上层，并使用50mL甲苯提取连续的水溶液层。干燥及旋转蒸发得到7.68g，在硅胶(hept/EtOAc)上进行色谱分析。这些馏分主要由两种同分异构的乙酰氧基内酯混合而成，将最纯的馏分浓缩，使用hept及一些TBME搅拌，得到纯度为1.67(1.33g，5.93mmol，21％)的纯馏分。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.84-5.69(m，1H)，5.69-5.49(m，2H)，3.77(ddd，J＝11.4，8.5，2.3Hz，1H)，2.73(ddt，J＝13.0，8.9，2.2Hz，1H)，2.66-2.58(m，1H)，2.51(ddt，J＝13.3，11.7，4.7Hz，1H)，2.40-2.22(m，2H)，2.11-1.93(m，4H)，1.75(dd，J＝14.6，6.5Hz，1H)，1.59(dddd，J＝12.8，11.2，6.0，1.5Hz，1H)，1.53-1.36(m，1H)ppm。
(rel-3aS，6S，9aR，E)-2-氧代-2,3,3a，4,5,6,9,9a-八元水力旋流器-八[b]呋喃-6-乙酸乙酯(1.68)((rel-3aS,6S,9aR,E)-2-Oxo-2,3,3a,4,5,6,9,9a-octahydrocycloocta[b]furan-6-yl acetate(1.68))：
Figure BDA0003509271520002451
将1.67(1.20g，5.35mmol)与1.71g苯甲酸甲酯(12.6mmol)及25mg BHT(0.11mmol)混合，辐照31小时，通过10.2g硝酸银硅胶柱(6mmol硝酸银)连续冲洗溶液。
使用80mL TBME及100mL TBME/7％甲醇洗脱柱。使用7.5g氯化钠/25mL水搅拌这些馏分(fractions)以及二氧化硅。将各层分离，并用少量TBM提取水层。同样，将二氧化硅与水层、10mL水及75mL TBME一起搅拌，然后过滤，并用2x50mL TBME搅拌固体及水层。从柱材料中获得的馏分重450mg，几乎为纯轴向异构体(宽单线态(broad singlet)，5.5ppm)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.7-5.5(m)及5.50(bs)(3H)，4.08(ddd，1H)，3.15(m，1H)，2.66(dd，1H)，2.4-2.0(m)及2.10(s)(7H)，1.9(m，1H)，1.75-1.4(m，2H)ppm。
(rel-3aS，6S，9aR，E)-2-氧代-2,3,3a，4,5,6,9,9a-八烷基水力旋流器-八[b]呋喃-6-基二甲基氨基甲酸酯(1.69)((rel-3aS,6S,9aR,E)-2-Oxo-2,3,3a,4,5,6,9,9a-octahydrocycloocta[b]furan-6-yl dimethylcarbamate(1.69))：
Figure BDA0003509271520002461
向10mL THF中的1.68(225mg)加入2mL水及140mg氢氧化锂。将混合物搅拌一夜，加入10mL水，得到澄清溶液。加入50mL TBME，然后加入1.0g柠檬酸。分离各层，用10mL水冲洗上层。使用TBM提取连续的水溶液层。干燥、旋转及蒸发得到产物。核磁共振显示相关信号为5.8-5.6(m)、4.73(bs)、4.08(ddd)、3.15(m)、2.64(dd)ppm。
将中间体溶解在5mL THF中，然后添加25mL甲苯，浓缩溶液，得到135mg残留物。将其与20mL DCM混合，并添加370mg DMAP，搅拌混合物5分钟。添加460mg 4-硝基苯氯甲酸盐(4-nitrophenylchloroformate)，搅拌黄棕色混合物2小时，然后在冰水中冷却。在四氢呋喃中加入4mL 2N二甲胺(dimethylamine)，搅拌溶液1小时，达到室温。通过硅胶柱(EtOAc/hept)纯化得到产物(80mg)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.66(dd，1H)，5.56(dd，1H)，5.47(bs，1H)，4.08(ddd，1H)，3.18(m，1H)，2.94(s，6H)，2.67(dd，1H)，2.4-2.0(m)(4H)，1.9(m，1H)，1.75-1.4(m，2H)ppm。
(rel-1S，5R，6S，E)-5-羟基-6-(2-(甲氨基)-2-氧乙基)环OCT-2-en-1-基二甲基氨基甲酸酯(1.70)((rel-1S,5R,6S,E)-5-Hydroxy-6-(2-(methylamino)-2-oxoethyl)cyclooct-2-en-1-yl dimethylcarbamate(1.70))：
Figure BDA0003509271520002471
1.69(80mg)与4mL 2N甲胺在THF中搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干燥，并在真空中干燥，以黄色油(88mg)的形式得到标题化合物。1H-NMR(CDCl3)：δ5.89(d，J＝5.3Hz，1H)，5.66(dd，J＝16.4，2.3Hz，1H)，5.56(m，1H)，5.45(s，1H)，3.64(d，J＝4.7Hz，1H)，3.03(m，1H)，2.92(s，6H)，2.80(d，J＝4.7Hz，3H)，2.58(m，1H)，2.33-2.02(m，2H)，1.95(m，1H)，1,65(m，1H)，1.55(m，1H)，1.22(m，2H)ppm。
示例2：四嗪合成：
从商业来源购买的四嗪2.12及2.17。四嗪类化合物2.9、2.10、2.11、2.13、2.14、2.15、2.16、2.18、2.20是根据文献程序制备的(Rossin等人，Angew Chem Int Ed 2010,49,3375-3378；Versteegen等人，Angew Chem Int Ed 2013,52/53,14112-14116；Fan等人，Angew Chem Int Ed 2016,55,14046-14050；Carlson等人，J Am Chem Soc 2018,140,3603-3612；Sarris等人，Chem Eur J 2018,24,18075-18081)，而2.19是如WO2010119389(A2)所述制备的(其中化合物6)。
Figure BDA0003509271520002481
2,2'-(1,2,4,5-四嗪-3,6-二酰基)双(吡啶-3-醇)(2.1)(2,2'-(1,2,4,5-Tetrazine-3,6-diyl)bis(pyridin-3-ol)(2.1))：
Figure BDA0003509271520002482
将3-羟基吡啶甲腈(3-Hydroxypicolinonitrile)(100mg,0.82mmol)以及水合肼(280μL,4.9mmol,6当量)在90℃搅拌2小时。添加乙醇(4mL)，并在室温下悬浮液搅拌5分钟。过滤悬浮液，并用乙醇(5×2mL)洗涤固体。在真空中干燥固体，得到纯中间体[2H]-TZ(59mg，0.22mmol，54％)，为黄色固体。将[2H]-TZ悬浮在乙酸(6mL)中，并逐滴添加在水中(500μL)的NaNO2(75mg，1.1mmol)。在室温下搅拌悬浮液1小时，在此期间获得澄清的红色溶液，最终产生红色沉淀。添加氯仿及水(均为40mL)，并分离各层。用氯仿(2×20mL)萃取水层，并使用Na2SO4干燥合并的有机层。过滤后，将滤液蒸发至干燥，得到纯的2.1(55mg，0.21mmol，总量50％)，为红色固体。1H-NMR(DMSO-d6)：δ＝10.74(br s，2H，OH)，8.38(m，2H，ArH)，7.57(m，4H，ArH)。13C-NMR(DMSO-d6)：δ＝164.3，154.3，141.4，137.5，127.5，125.3。ESI-MS：m/z计算到C12H8N6O2 268.07；观察到[M+H]+269.17；[M+Na]+291.25。
2,2'-(1,2,4,5-四嗪-3,6-二酰基)双(吡啶-3-胺)(2.2)(2,2'-(1,2,4,5-tetrazine-3,6-diyl)bis(pyridin-3-amine)(2.2))：
Figure BDA0003509271520002491
在100℃下搅拌3-氨基吡啶腈(3-Aminopicolinonitrile)(125mg，1.0mmol)及水合肼(300μL，5.0mmol)20小时。添加冷水(2mL)，并在室温下搅拌悬浮液5分钟。过滤，使用冷水及冷乙醇洗涤固体(均为5×2mL)，并在真空中干燥，得到呈橙色固体的中间体[2H]-TZ(38mg，0.14mmol，27％)。向[2H]-TZ及PhI(OAc)2(75mg，0.23mmol)中添加二氯甲烷(1mL)，并在室温下搅拌悬浮液3小时。随着时间的推移，颜色从橙色变为红色。过滤悬浮液，使用二氯甲烷(5×1mL)洗涤固体，并在真空中干燥，得到纯2.2(31mg，0.12mmol，总含量22％)红色固体。1H-NMR(DMSO-d6)：δ＝8.13(dd，2H，ArH)，7.36(2dd，4H，ArH)，6.98(br s，4H，NH2)ppm。13C-NMR(DMSO-d6)：δ＝162.8，146.6，138.3，129.5，126.9，124.5ppm。ESI-MS：m/z计算到C12H10N8 266.10；观察到[M+H]+267.08，[2M+H]+532.92，[2M+Na]+555.00。
N、N'-(2,2'-(1,2,4,5-四嗪-3,6-二酰基)双(吡啶-3,2-二酰基))二乙胺(2.3)(N,N'-(2,2'-(1,2,4,5-Tetrazine-3,6-diyl)bis(pyridine-3,2-diyl))diacetamide(2.3))：
Figure BDA0003509271520002501
将2.3(12mg，45μmol)悬浮在醋酸酐(0.5mL)中，并在50℃下将悬浮液加热3d。将混合物沉淀在乙醚(6mL)中，并倾析溶液。使用乙醚(2mL)洗涤固体，倾析溶液，然后重复洗涤步骤。接下来，使用水(2mL)研磨固体，在12.7krpm下离心混合物1分钟，然后倾析溶液。随后将固体溶解在甲醇(1mL)中，然后通过过滤去除未溶解的杂质。滤液蒸发至干燥，所得残余物用水(2ml)研磨。在12.7krpm下离心1分钟并倾析后，在真空中干燥固体，产生2.3(0.75mg，2.1μmol，5％)紫红色固体。ESI-MS：m/z计算到C16H14N8O2 350.12；观察到[M+H]+351.17，[2M+Na]+722.92。
N-(29-羟基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷聚糖-1-基)-N'-{6-[6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]吡啶-3-基]戊二酰胺(2.4)(N-(29-Hydroxy-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-yl)-N'-{6-[6-(py ridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl]pyridin-3-yl}pentanediamide(2.4))：
Figure BDA0003509271520002502
2.20(39.9mg，109.3μmol)在CH2Cl2/DMSO中用29-氨基-3.6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷聚糖-1-醇(29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol)(50mg，109.3μmol)、PyBOP(73.9mg，142.09)及DiPEA(76.3μL，0.44mmol)处理16小时。在去除CH2Cl2、制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)及冷冻干燥后，以67％的产率(59.0mg，73.3μmol)分离出2.4。ESI-MS：m/z计算到C37H56N8O12 804.40；观察到[M+H]+805.60。
4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯酚(2.5)(4-(1,2,4,5-Tetrazin-3-yl)phenol(2.5))：
Figure BDA0003509271520002511
在Ar气氛下，在0℃下使用水合肼(hydrazine monohydrate)(18mL，371mmol)逐滴处理甲基4-羟基苯亚氨基酯盐酸(methyl4-hydroxybenziminoester HCl)(4.2g，22.38mmol)及醋酸甲脒盐(formamidine acetate salt)(7g，67.16mmol)的混合物。使反应混合物升温至室温后，再搅拌3小时。将混合物倒入冰水(120mL)，并加入亚硝酸钠(24g，58mmol)。小心加入2N HCl，直到停止释放一氧化二氮。使用EtOAc(6x150mL)萃取所得深紫红色溶液，使用MgSO4干燥合并的有机层、过滤并浓缩。水层用EtOAc穿孔3小时，穿孔物用MgSO4干燥、过滤并蒸发溶剂。合并的残留物通过反相柱色谱法纯化(梯度：3至70％MeOH/H2O)。2.5在4℃下沉淀过夜，过滤并真空干燥，得到橙色固体(457mg，12％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ10.19(s，1H)，8.43(dt，J＝9.0，1.9Hz，2H)，6.98(dt，J＝9.0，1.9Hz，2H)ppm.13CNMR(101MHz，CD3OD)：δ167.7，163.8，158.8，131.3，124.4，117.4ppm。HR-ESI-MS：计算到[M+H]+175.0614；观察到175.0614。
2-[2-(2-{2-[4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯氧基]乙氧基}乙氧基]乙氧基]乙烷-1-醇(2.6)(2-[2-(2-{2-[4-(1,2,4,5-Tetrazin-3-yl)phenoxy]ethoxy}ethoxy)ethoxy]ethan-1-ol(2.6))：
Figure BDA0003509271520002512
将2.5(40mg，0.23mmol)、四乙二醇(892mg，4.6mmol)及PPh3(120mg，0.46mmol)与甲苯(5mL)混合。在真空中去除溶剂，并用氩气对小瓶进行通风。这个过程重复了两次。残余物被2ml四氢呋喃(THF)吸收，并用730μL THF及90.2μL DIAD处理。将混合物在室温下搅拌20小时。蒸发溶剂，并通过硅胶柱色谱法(梯度：50至90％正己烷中的乙酸乙酯)纯化残留物。通过反相色谱法(reversed phase chromatography)(梯度：5至80％MeCN在H2O中)进一步纯化，得到2.6(53.1mg，66％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.05(s，1H)，8.49(d，J＝8.0Hz，2H)，7.04(d，J＝8.0Hz，2H)，4.19(t，J＝4.0Hz，2H)，3.85(t，J＝4.0Hz，2H)，3.62(m，12H)ppm.13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ166.1，163.0，157.3，130.1，124.1，115.4，72.5，70.9，70.7，70.6，70.3，69.6，67.7，61.7ppm。ESI-MS：计算到[M+H]+351.17；观察到351.22。
N-(29-羟基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷聚糖-1-基)-N'-{6-[6-(5-{4-[(29-羟基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧烷氧基-1-基)氨甲酰]丁酰胺}吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]吡啶-3-基}戊二胺(2.7)(N-(29-Hydroxy-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-yl)-N'-{6-[6-(5-{4-[(29-hydroxy-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa nonacosan-1-yl)carbamoyl]butanamido}pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl]pyridin-3-yl}pentanediamide(2.7))：
Figure BDA0003509271520002521
四嗪(Asselin,C.M等人；JACS(1997):3765-3772)(1当量)在密封容器中，在70℃氩气下，在干燥的THF中使用戊二酸酐(8当量)及DMAP(0.1当量)处理18小时。在浓缩、制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)及冻干后，得到中间体化合物。使用29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol(29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol)(3当量)、PyBOP(2.5当量)及DiPEA(6当量)在CH2Cl2/DMSO中处理中间体(1当量)16小时。在除去CH2Cl2、制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)及冻干后，分离标题化合物。
4-({[6-(6-{5-[(4-羧基丁胺基)甲基]吡啶-2-基}-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基]甲基}氨甲酰)丁酸(2.8)(4-({[6-(6-{5-[(4-Carboxybutanamido)methyl]pyridin-2-yl}-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl]methyl}carbamoyl)butanoic acid(2.8))：
Figure BDA0003509271520002531
将腈、三氟磺酸锌(0.05当量)与水合肼(hydrazine monohydrate)(2当量)在密封容器中加热，并在少量乙醇中搅拌18小时。去除挥发物，残余物在CHCl3与水之间分离，并用CHCl3(3x)萃取水层。有机层使用Na2SO4干燥、过滤，并在真空中去除挥发物。残余物溶解在CH2Cl2中，并添加PhI(OAc)2(1.5当量)。将混合物在室温下搅拌2小时。使用乙酰乙酸在CHCl3中的洗脱梯度进行柱层析(闪速(flash)SiO2)，并在第二个色谱步骤(正常SiO2)中，使用庚烷中的丙酮进行洗脱，得到Boc保护的四嗪。在浓缩及与CHCl3共蒸发之前，使用CHCl3/TFA(2/1)处理Boc保护的四嗪30分钟。去除多余的TFA后，使用戊二酸酐(5当量)及二甲基亚砜(5当量)在二甲基亚砜中在室温下处理脱保护(deprotected)的TZ中间体18小时。在制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)及冻干后，分离标题化合物。
示例3：反应性测量：
使用应用光物理公司(Applied Photophysics)的SX20停流分光光度计(SX20stopped-flow spectrophotometer)测定了四嗪类活化剂与1.13及1.71反应的二级速率常数。在37℃下，使用25μM四嗪以及50μM TCO在PBS中进行测量，重复3次，在535nm处监测。使用GraphPad棱镜分析数据。二级速率常数由吸光度-时间曲线与二级速率方程的非线性拟合确定。表1中的结果表明，本发明的TCO触发物(1.13)与已建立的TCO触发物(1.71)一样具有反应性，并且由于四嗪的电子及空间特性的差异，与各种四嗪基序表现出相同的反应性差异。重要的是，2.17及2.18反应性很强，但不属于本发明的一部分(即：1.71)的TCO触发物的释放率较低(Versteegen等人，Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112–14116)。
表1：37℃下PBS中模型TCO-CA偶联物与各种活化剂之间反应的速率常数(M-1s-1)。
Figure BDA0003509271520002541
Figure BDA0003509271520002551
采用紫外光谱法测定了TCO衍生物与四嗪2.18在20℃下、MeCN中、拟一级(pseudo-first order)条件下反应的二级速率常数。使用MeCN(3mL)填充比色环(cuvette)，并在20℃下进行平衡。添加2.18(20μL，25mM在DMSO中)的溶液，然后添加TCO(5μL 25mM在DMSO中)的溶液。对540nm处的吸收进行了监测。拟一级反应常数k1'由吸收减少的半衰期计算得出，根据k1'及四嗪的初始浓度估算二级速率常数k2：k2＝k1'/c。表2中的结果表明，高反应性四嗪2.18在本发明的各种TCO触发物及TCO-CA偶联物中表现出良好的反应性(由于溶剂效应，k2值低于表1)。
表2：在20℃下，在MeCN中测量的模型TCO触发物及TCO-CA偶联物及2.18之间反应的速率常数(M-1s-1)。
TCO k<sub>2</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
1.19 134
1.40 39
1.43 27
1.51 104
1.54 38
1.60 277
1.62 80
示例4：机制研究：
模型TCO-CA偶联物1.13(400μM)与1.1当量的活化剂2.9及2.18在100mL 10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中反应。将反应混合物在室温温育24小时，然后在溶液中通入氧气，并继续温育2天。温育后，反应混合物通过柱色谱纯化，反应产物通过1D及2D NMR分析。结果证实1.13与2.9反应形成两种释放产物(释放机制A及B结合)，而1.13与2.18反应后仅发现一种释放产物及氧化衍生物(释放机制B)。
表3：1.13与2.9反应产生的产物：
Figure BDA0003509271520002561
表4：1.13与2.18反应产生的产物：
Figure BDA0003509271520002562
Figure BDA0003509271520002571
示例5：TCO-CA偶联物的释放效率：
1.15及1.72(作为没有YT1组的对照)在25μM的浓度下与PBS(DMSO含量<1％)中的各种四嗪活化剂(50μM)在37℃下反应，48小时后通过HPLC(UV及荧光检测；10至100％MeCN水溶液，含2.5mM NH4OAc，pH8.4)对样品进行分析，以获得总体染料释放效率的终点数据(表5)。表5中的结果表明，本发明的TCO触发物(1.15)为整个四嗪范围提供了一致的(接近)定量释放，而缺乏YT1组的对照TCO(1.72)仅显示了少数四嗪的高释放率。重要的是，通常释放率低的高反应性四嗪现在可以定量释放。与Versteegen等人，Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112–14116；Sarris等人，Chem Eur J 2018,24,18075-18081相比。
表5：TCO触发物与四嗪活化剂(n＝2；±1％)反应时荧光染料(AF594)的释放(％)
Figure BDA0003509271520002572
在另一个实验中，使用一系列四嗪来评估TCO触发物的释放。将要释放的结构包括药物阿霉素(doxorubicin)及作为模型CA的甲胺。TCO-CA偶联物(10μL，在DMSO中为25mM)以MeCN(250μL)及PBS(750μL)稀释。接下来，添加四嗪活化剂溶液(DMSO中20μL 25mM)，并通过HPLC-MS/PDA评估释放。表6中的结果显示，所有测试活化剂的TCO触发物在5分钟内完全释放CA。重要的是，与2.18反应下，在1.42及1.62中未观察到任何释放，其支持式(19)，其中YT1、YT2或YT3的胺不能与羰基结合。
表6：TCO触发物以及四嗪活化剂反应时各种构建体(CA)的释放：
Figure BDA0003509271520002581
示例6：各种介质中的释放动力学：
1.14在PBS、DMEM缓冲液、全细胞生长培养基(DMEM+10％FBS)或浓度为5μM的人血浆中与石英比色槽(quartz cuvette)中的活化剂2.18(7μM)反应，同时进行磁搅拌。使用Perkin Elmer LS55荧光光谱仪监测7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin)(AMC)释放导致的荧光增加。结果显示，在PBS及培养基(纯或含有FBS)中，AMC从1.14快速释放，在1至3分钟内达到100％，而在人血浆中，AMC完全释放大约在20分钟内发生(图7)。相比之下，如果TCO触发物不是本发明的触发物，2.18会产生低释放及慢释放(Versteegen等人,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,14112–14116,Sarris et al.,Chem Eur J 2018,24,18075-18081)。
示例7：体外触发稳定性：
1.13在37℃的PBS以及人血浆中以200μM的浓度培养。12、24及48小时后的浓度通过使用活化剂2.9滴定，以及同时进行吸光度测量来确定(n＝3)。结果显示，PBS中的TCO稳定性较高(48小时后完整TCO为101±5％)，而在血浆中长时间培养1.13小时后，观察到非常轻微的TCO失活(温育24小时及48小时后，剩余完整的TCO分别为98±7％及76±9％)。
示例8：细胞存活率：
向HT-1080细胞(人纤维肉瘤)中添加连续稀释的TCO-MMAE前药1.16(100μM至0.32nM)生长培养基以及10μL活化剂2.18(50μM PBS)储备溶液(n＝3)。在37℃下培养2小时后，更新培养基，并将细胞再培养94小时。温育后，MTT分析显示，在2.18(IC50＝0.3nM)存在的情况下，以1.16温育的细胞相对于单独以1.16温育的细胞(IC50＝1.3μM)的存活率较低，证实在与活化剂反应后，TCO前药在体外释放MMAE。
示例9：抗体偶联(conjugation)及放射性标记：
使用(1)在25mM硼酸盐缓冲液pH 8.0(含1mM DTPA)中用TCEP(3当量)部分还原单抗铰链，在室温下使用1.25及1.26对单抗CC49、利妥昔单抗、西妥昔单抗及伦卡雷克斯单抗(girentuximab)进行官能基化2小时，然后(2)在+4℃(4mg mAb/mL最终浓度)下与马来酰亚胺组分(约20当量)过夜反应。根据SATA制造商(Thermo Fisher Scientific)提供的方案，使用SATA(4当量)将曲妥珠单抗与1.21及1.25缀合，然后用羟胺去保护(deprotection)，并与马来酰亚胺组分(约20当量)在+4℃(4mg mAb/mL终浓度)下温育过夜。缀合后，通过在螯合剂处理的PBS(1.21及1.26)或0.25M NH4OAc缓冲液pH 5.5(1.25)中透析(20kDa MW截留膜(cut-off membrane))纯化产物。透析后，所有单抗偶联物均通过SEC及SDS-PAGE进行表征，并使用四嗪滴定法测量每个单抗的平均2至3个TCO基团，如先前发表的Rossin等人，Angew Chem Int Ed 2010,49,3375-3378。
用TCO-DOTA衍生物(通常为50至100μg)官能基化的单抗在0.5M MES缓冲液(pH5.5)中以111In(通常为5至10MBq)在37℃下且在黑暗中进行1小时的放射性标记，获得50至70％的标记产率，如无线电-ITLC所证实。按照既定方案，Vosjan等人，Nature Protocols2010,5,739-743，用89Zr对使用TCO-DFO衍生物(通常为50至100μg)官能基化的单抗进行放射性标记，通过无线电-ITLC证实获得80至90％的标记产率。在5分钟DTPA挑战后，使用脱盐柱(desalting cartridge)(Zeba旋转柱，40kDa MW截留)纯化所有放射性标记的单抗，然后通过SEC以及SDS-PAGE进行分析，确认>95％的放射化学纯度。
示例10：在体外与各种活化剂反应时，从单抗缀合的TCO触发物中释放标记：
用111In及89Z(约10μg)放射性标记的单抗偶联物在100μL PBS中于37℃下与过量(约30当量)的活化剂或不加活化剂一起温育。温育15至24小时后，通过SEC用放射性检测器分析混合物并量化释放的标记量。表7中的结果显示，所有mAb-TCO偶联物与各种四嗪活化剂的释放均>90％，而在没有活化剂的PBS中温育显示最小释放(4至5％)。
表7：与各种活化剂一起温育15至24小时后，放射性标记的单抗偶联物(mAb-conjugate)的体外标记释放。
Figure BDA0003509271520002601
Figure BDA0003509271520002611
CC49-1.26(约10μg)也与活化剂2.4、2.17(约30当量)或没有活化剂的PBS(100μl)一起在37℃下温育。过夜温育后，通过SEC分析反应混合物，并在荧光盘读数器(fluorescence plate reader)中测量被收集的级分(fraction)(激发：490nm；发射：595nm)。结果显示了当CC49-1.26与活化剂一起温育时，与mAb-Dox偶联物(mAb-Doxconjugate)相关的荧光信号完全消失(13至15分钟Rt)，而在约20分钟处出现强烈的荧光峰，与游离Dox一致，此时。相反，当CC49-1.26在没有活化剂的PBS中温育时，在溶液中检测到最少量的游离Dox(<5％)。
示例11：用于体外以及体内应用的蛋白质-蛋白质切割：
此示例描述了本发明在体外或体内裂解蛋白质-蛋白质偶联物(conjugate)的用途。蛋白质-蛋白质键的受控切割可以例如用于蛋白质的药物的暴露，即活化。
Figure BDA0003509271520002612
蛋白质-蛋白质偶联物通过一种蛋白质与可偶联的叠氮化合物(例如：Mal-PEG-叠氮化物)的功能化来制备。另一种蛋白质通过半胱氨酸与可裂解接头(linker)BCN-TCO-Mal(见下文)结合，随后点击(click)结合到叠氮化合物功能化的蛋白质上，提供TCO连接的蛋白质-蛋白质偶联物，其可以通过四嗪活化剂按需切割。
Figure BDA0003509271520002621
接头(linker)可由市售的(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl-N-succinimidylcarbonate(BCN-NHS)制备：(a)BCN-NHS在饱和NaHCO3/MeCN中使用3-氨基-2-磺基丙酸(3-amino-2-sulfopropanoic acid)(1.5当量)处理1小时，然后制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)以及冷冻干燥；(b)在MeCN中使用PyBOP(1.2当量)以及氨基-PEG2-胺(amino-PEG2-amine)(40当量)处理酸1小时，然后制备型HPLC(含0.1％TFA的H2O/MeCN梯度)以及冻干；(c)类似于1.24的制备；(d)类似于使用1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮(1-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-2,5-dihydro-1H-pyrrole-2,5-dione)的TFA盐制备1.25。
示例12：蛋白质-蛋白质偶联(conjugation)以及随后的体外释放：
在pH约为9的PBS中，将抗TAG72抗体scFv片段(分子量约25kDa)与5摩尔当量的bisNHS TCO接头(linker)1.23反应。在+4℃下过夜温育后，SDS-PAGE证实溶液中存在两种新的蛋白质，分子量约为50及75kDa，表示通过TCO结合形成二聚体及三聚体物质。然后，在混合物中加入过量的活化剂2.17(或不含活化剂)，并在37℃下过夜温育，然后进行SDS-PAGE分析以及考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色，显示原始单抗片段25kDa条带显着增加，证明TCO裂解。相反，在没有活化剂的情况下温育的混合物显示存在原始的50以及75kDa蛋白质条带，而25kDa片段条带几乎检测不到。
示例13：CC49-1.25与活化剂2.4的体内反应性评价：
两组雌性Balb/C小鼠(n＝4)静脉注射111In标记的CC49-1.25(约0.5mg/kg，约1MBq)，1小时后注射活化剂2.4(约33.5μmol/kg)或载体。在活化剂给药前5分钟以及给药后的不同时间抽取血样。单抗注射后24小时，对小鼠实施安乐死，并在伽马计数器中测量血液及组织样本。在接受放射性标记的单抗-TCO偶联物(conjugate)和载体的小鼠中，血液中的放射性水平在6小时内下降约46％，而在同一时间窗内接受活化剂的小鼠中，循环放射性水平迅速下降89％。单抗注射后24小时，在注射载体对活化剂的组别中，仍在血液中循环的111In为12.3±1.1对1.3±0.2％ID/g，导致第二组的AUC低4.3倍。这种增强的放射性清除表明TCO触发物及循环中的活化剂之间的有效反应，然后释放标记，从而迅速从血液中消除。
示例14：在荷瘤小鼠中评价曲妥珠单抗-1.21与四嗪2.4的反应性：
向雌性Balb/C小鼠侧腹皮下注射约1000万个BT-474乳癌细胞s.c.。当肿瘤变得可触及时，向小鼠注射89Zr-曲妥珠单抗-1.21(约0.5mg/kg；约0.4MBq；n＝3)，然后在48小时后注射活化剂2.4(约33.5μmol/kg)或载体。在单抗注射后72小时对小鼠实施安乐死，并且收集血液、肿瘤及选定的非靶组织，并且在伽马计数器中进行测量。在对照组小鼠中，在单抗注射后72小时观察到高肿瘤摄取(42.3±6.1％ID/g)以及血液中持续的89Zr-曲妥珠单抗-1.21循环(15.9±1.8％ID/g)。在用2.4低放射性吸收处理的小鼠中，发现肿瘤中的放射性摄取较低(相对于对照组减少约16％)，这很可能是由于残留的细胞表面结合的曲妥珠单抗的比例。然而，在血液(1.4±0.6％ID/g)以及非靶组织中也发现了显着较低的放射性，因此导致肿瘤与器官的比率提高(表8)。
表8：使用89Zr-曲妥珠单抗-1.21预处理小鼠，随后48小时使用活化剂(activator)2.4或载体，并在注射单抗72小时后安乐死，计算肿瘤与非靶组织的比率。
载体 2.4
肿瘤/血液 2.7 25.5
肿瘤/肝脏 4.1 12.5
肿瘤/脾脏 6.5 32.4
肿瘤/肾脏 7.7 29.2
肿瘤/肌肉 24.6 64.9

Claims (14)

1.一种化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物满足式19，
Figure FDA0003714459000000011
其中R48选自于由-OH、-OC(O)Cl、-OC(O)O-N-琥珀酰亚胺基、-OC(O)O-4-硝基苯基、-OC(O)O-四氟苯基、-OC(O)O-五氟苯基、-OC(O)-(SP)kCA、-OC(S)-(SP)kCA、-SC(O)-(SP)kCA、-SC(S)-(SP)kCA、-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA、-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA、及-(SP)kCA-所组成的群组；r为范围0至2的整数；
每个s独立地为0或1；
每个i独立地为范围0至4的一整数，优选为0或1；
j为范围0至4的一整数，优选为0或1；
每个k独立地为0或1；
LC是一可自分解连接基，以及SP是一间隔基；
每个CA及CB独立地选自于由有机分子及无机分子所组成的群组；
其中条件a-c中的至少一个被满足：
(a)X1、X2、X3、X4、X5中的至少一个是CR47YT1；YT1相对于Ha被定位为顺式；
(b)X3是YT3；以及
(c)选自于X1、X2、X3、X4、X5的2个相邻X部分是一稠合环的一部分，所述稠合环的部分满足式20a-20g中的一个：
Figure FDA0003714459000000021
YT2相对于8元亲二烯环被定位为顺式；
其中Xa及Xb是式19的8元环的一部分，使得Xa-Xb或Xb-Xa是X1-X2、X2-X3、X3-X4或X4-X5；
对于式20a-20c，Xa及Xb为CR47，优选为CH；
对于式20d-20g，Xa及Xb独立地为CR47或N，优选为CR47，更优选为CH；
X6及X8各自独立地选自于由YT3、C(R47)YT2、C(R47)2、O、S、C(O)、C(S)及S(O)2所组成的群组；
X7选自于由YT3及ZT所组成的群组；
当X6为YT3时，则X7为ZT；
当X7为YT3时，则X6及X8各自独立地选自于由C(R47)YT2、C(R47)2、O及S所组成的群组；优选为C(R47)YT2或C(R47)2；
其中所述满足式20g的稠合环包含至少一YT2或YT3部分；
对于式20b及20f，直接连接到相同碳上的2个R47可以一起为＝C-(R47)2、＝S或＝O；
在X1-X2、X2-X3、X3-X4及X4-X5不是-O-O-、-N-N-、-O-N-或-N-O-的条件下；
从Xa及Xb至所述式20a-20g的稠合环的其馀部分的直接键相对于彼此为顺式，并且相对于Ha为顺式，所述式20a-20g的稠合环稠合至所述8元亲二烯体环；
优选地，没有相邻的原子对为-O-O-是所述式20a-20g的稠合环的一部分；
YT1选自于由OH、SH、N(R38)2、C(O)OH、C(S)OH、C(O)SH、C(S)SH、ON(R38)2、SO4H、SO3H、SO2H、PO4H2、PO3H、PO2H及C(N)N(R38)2所组成的群组；
YT2选自于由OH、SH及N(R38)2所组成的群组；
YT3是NR38，并且C(O)、C(S)、S(O)或S(O)2不在YT3的旁侧；
所述其余的X1、X2、X3、X4、X5独立地选自于由C(R47)2及O所组成的群组，使得X1、X2、X3、X4、X5中的最多2个是O、NR38或N；
其中，当R48是-OC(O)-(SP)kCA、-OC(S)-(SP)kCA、-SC(O)-(SP)kCA或-SC(S)-(SP)kCA时，SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)结合到R48的-OC(O)-、-OC(S)-、-SC(O)-或-SC(S)，通过选自于由O、C、S及N所组成的群组的一原子，优选选自于二级或三级N，其中所述原子是SP或CA的一部分，其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为0时，SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)在所述式19的反环辛烯环的烯丙基位置上与R48的-O-或-S-的部分结合，通过选自于由-C(O)-及-C(S)-所组成的群组的一基团，其中所述基团是SP或CA的一部分；
其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为1时，LC在所述式19的反环辛烯环的烯丙基位置上与-O-或-S-的部分结合，通过选自于由-C(YC2)YC1-以及碳原子，优选芳族碳所组成的群组的一基团，其中所述基团是LC的一部分；
其中YC1选自于由-O-、-S-及-NR36-所组成的群组；
其中YC2选自于由O及S所组成的群组；
其中，当R48是-O-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA或-S-(LC((SP)kCA)s((SP)kCA)s((SP)i-CB)j)r-(SP)kCA并且r为1时，则SP(当k>0时)或CA(当k＝0时)与LC结合，通过选自于由-O-、-S-及-N-所组成的群组的部分，优选选自于二级或三级N，其中所述部分是SP或CA的一部分；
其中，当R48为-(SP)kCA时，则SP(k>0时)或CA(k＝0时)通过-O-原子或-S-原子结合到所述式19的反环辛烯的烯丙基位置，其中所述-O-原子或所述-S-原子是SP或CA的一部分，
其中ZT选自于由C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基、C7-C12亚炔基、C6亚芳基、C4-C5杂亚芳基、C3-C8亚环烷基、C5-C8亚环烯基、C5-C12烷基(杂)亚芳基、C5-C12(杂)芳基亚烷基、C4-C12烷基亚环烷基及C4-C12环烷基亚烷基所组成的群组，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、(杂)亚芳基、亚环烷基、亚环烯基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、烷基亚环烷基、环烷基亚烷基任选地被选自于由-(SP)i-CB，其中i独立地为范围从0至4的一整数、-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、＝O、＝NR37、-SR37、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2及-Si(R37)3所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由-O-、-S-、-NR37-、-P-及-Si-所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中R37及R36的每一个独立地选自于由氢、-(SP)i-CB，其中i独立地为范围0至4的一整数、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基及C4-C24环烷基烷基所组成的群组；其中i为范围0至4的一整数，优选i为1；
其中不为氢的R37及R36基团任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3H、-PO3H、-PO4H2、-NO2、-CF3、＝O、＝NH及-SH所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NH、P及Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中在R38不通过C(O)、C(S)、S(O)或S(O)2连接到所述分子的其馀部分的条件下，R38独立地选自于R37及R36所列的群组；
其中每个R47独立地选自于由氢、-(SP)i-CB、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、-S(＝O)2N(R37)2、-OC(＝O)R37、-SC(＝O)R37、-OC(＝S)R37、-SC(＝S)R37、-NR37C(＝O)-R37、-NR37C(＝S)-R37、-NR37C(＝O)O-R37、-NR37C(＝S)O-R37、-NR37C(＝O)S-R37、-NR37C(＝S)S-R37、-OC(＝O)N(R37)2、-SC(＝O)N(R37)2、-OC(＝S)N(R37)2、-SC(＝S)N(R37)2、-NR37C(＝O)N(R37)2、-NR37C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)R37、-C(＝S)R37、-C(＝O)N(R37)2、-C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)O-R37、-C(＝O)S-R37、-C(＝S)O-R37、-C(＝S)S-R37、-S(O)R37、-S(O)2R37、-NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C6-C24芳基、C2-C24杂芳基、C3-C24环烷基、C5-C24环烯基、C12-C24环炔基、C3-C24(环)烷基(杂)芳基、C3-C24(杂)芳基(环)烷基、C4-C24(环)烯基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)烯基基、C4-C24(环)炔基(杂)芳基、C4-C24(杂)芳基(环)炔基、C4-C24烷基环烷基及C4-C24环烷基烷基所组成的群组；
其中，优选i是范围0至1的一整数；
其中，烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基、环烷基烷基任选地被选自于由-Cl、-F、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中2个R37、R38、R47基团任选地包含在一环中；以及
其中2个R37、R38、R47基团任选地包含在一环中，以形成稠合到所述八元反式环的一环。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述条件a-c中的至多一个被满足。
3.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于：所述化合物选自于由以下所组成的群组：
Figure FDA0003714459000000061
及其符合式19的对映异构体。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于：所述化合物选自于由以下所组成的群组：
Figure FDA0003714459000000071
Figure FDA0003714459000000081
---＝结合至R37、R38或R47，
或结合至R37、R38或R47的其余部分
Figure FDA0003714459000000082
---＝结合至R37、R38或R47，
或结合至R37、R38或R47的其余部分。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：如前述权利要求中任一项所述的化合物及二烯，优选四嗪。
6.如权利要求5所述的组合，其特征在于：所述二烯是满足式4的四嗪，并且优选包括其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003714459000000091
；
其中
Q1及Q2的每个部分独立地选自于由氢、-F、-Cl、-Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、-SR37、-S(＝O)2N(R37)2，-OC(＝O)R37、-SC(＝O)R37、-OC(＝S)R37、-SC(＝S)R37、-NR37C(＝O)-R37、-NR37C(＝S)-R37、-NR37C(＝O)O-R37、-NR37C(＝S)O-R37、-NR37C(＝O)S-R37、-NR37C(＝S)S-R37、-OC(＝O)N(R37)2、-SC(＝O)N(R37)2、-OC(＝S)N(R37)2、-SC(＝S)N(R37)2、-NR37C(＝O)N(R37)2、-NR37C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)R37、-C(＝S)R37、-C(＝O)N(R37)2、-C(＝S)N(R37)2、-C(＝O)O-R37、-C(＝O)S-R37、-C(＝S)O-R37、-C(＝S)S-R37、-S(O)R37、-S(O)2R37、-NR37S(O)2R37、-ON(R37)2、-NR37OR37、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基、(环)烷基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烷基、(环)烯基(杂)芳基、(杂)芳基(环)烯基、(环)炔基(杂)芳基、(杂)芳基(环)炔基、烷基环烷基及环烷基烷基所组成的群组；
其中，不是H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2、-SO3、-PO3-、-NO2、-CF3、的Q1及Q2基团任选被取代，优选被选自于由-Cl、-F、--Br、-I、-OR37、-N(R37)2、-SO3R37、-PO3(R37)2、-PO4(R37)2、-NO2、-CF3、＝O、＝NR37及-SR37所组成的群组的部分取代，并且任选地包含选自于由O、S、NR37、P及Si所组成的群组的一个或多个杂原子，其中所述N原子、所述S原子及所述P原子任选地被氧化，其中所述N原子任选地被季铵化；
其中，Q1基团及Q2基团任选地与-(SP)D-R87结合；以及
其中，其中D为0或1，并且每个R87单独地选自于由生物分子、聚合物、类肽、树枝状大分子、脂质、胶束、脂质体、聚合物囊泡、颗粒、珠、凝胶、金属络合物、有机分子、有机金属部分、白蛋白结合部分、射性核素组成部分、染料部分、螯合部分及成像探针所组成的群组；
并且优选地，Q1及Q2的部分中的至少一个不是氢。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于：Q1及Q2选自于由氢、苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、2,5-嘧啶基、3,5-嘧啶基及2,4-嘧啶基所组成的群组；并且Q1及Q2不是氢，并且如权利要求6中所定义的被任选地取代。
8.如权利要求6至7中任一项所述的组合物，其特征在于：在式4中：
a Q1及Q2选自于由2-吡啶基、3-吡啶基及4-吡啶基所组成的群组；或是(b)Q1选自于由2,6-嘧啶基、2,5-嘧啶基、3,5-嘧啶基及2,4-嘧啶基所组成的群组；并且Q2是(杂)烷基；或是
c Q1是苯基，并且Q2是氢；以及
在a-c中，所有不为氢的Q1及Q2如权利要求6中所定义的被任选地取代。
9.一种如权利要求1至4中任一项所述的化合物或如权利要求5至8中任一项所述的组合物作为药物的用途。
10.一种如权利要求1至4中任一项所述的化合物或如权利要求5至8中任一项所述的组合物，用于治疗一受试者，优选一人的一疾病，其特征在于：所述疾病选自于由癌症、中枢神经系统疾病、感染、炎症及心血管疾病所组成的群组。
11.一种非治疗方法，用于从如权利要求1至4中任一项所述的化合物释放分子，其特征在于，所述非治疗方法包含步骤：使如权利要求1至4中任一项所定义的式19的化合物接触如权利要求5至8中任一项所定义的二烯。
12.一种非治疗方法，用于使如权利要求1至4中任一项所述的化合物在一受试者，优选在一人类中成像，其特征在于，所述非治疗方法包含步骤：
(a)向所述受试者施用如权利要求1至4中任一项所定义的式19的一化合物，所述化合物包含一标记；以及
(b)对所述受试者中存在的如式19的所述化合物进行成像，其中所述标记选自于由放射性核素、荧光染料及磷光染料所组成的群组。
13.一种如权利要求1至4中任一项所述的化合物或如权利要求5至8中任一项所述的组合物的非治疗用途，其特征在于，所述非治疗用途：用于在一受试者，优选在一人类中成像，其中所述化合物，或在根据式19的所述化合物的至少一者与二烯的组合的情况下，包含选自于由放射性核素、荧光染料及磷光染料所组成的群组的一标记。
14.一种如权利要求1至4中任一项所述的化合物或如权利要求5至8中任一项所述的组合物的非治疗用途，其特征在于，所述非治疗用途：用于释放分子，优选在体外。
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