JP2014515040A - 生体直交型薬物活性化 - Google Patents

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Abstract

本発明は、治療のために、プロドラッグ活性化方法に関し、お互いに生体直交型反応性を示す非生体反応性化学基を用いるものである。本発明はまた、プロドラッグキットに関し、少なくとも１つのプロドラッグ、及び少なくとも１つのアクチベータを含み、前記プロドラッグは薬物と、第１の生体直交型反応基（前記トリガー）を含み、及び前記アクチベータは第２の生体直交型反応基を含む。本発明はまた、前記方法及びキットで使用される標的治療に関する。本発明は特に、抗体−薬物共役物及び二及び三特異的抗体誘導体を含む。

Description

本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化に基づく治療方法に関する。本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化に基づく治療方法に関する。
医学分野において、ヒト又は動物の体内の特定の場所で活性化されるプロドラッグなどの不活性化化合物の使用はよく知られている。また、プロドラッグなどの不活性化物の標的化（ターゲット）送達は広く研究されている。多くの努力が薬物送達システムに向けられており、これは薬物の放出を、選択的に標的位置（サイト）及び／又は望ましい時間（タイミング）に有効に行うものである。１つの方法は、局所的及び特異的に酵素活性により特異的に（全身性）プロドラッグを活性化することである。しかし多くの場合に、興味の対象となる標的サイトは好適な過剰発現酵素を持たない。他の方法は、酵素を標的化組織に、抗体指向酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）と呼ばれる技術で送達するものである。この方法では、酵素は、腫瘍サイトに、腫瘍関連抗原に結合する抗体と共役することで、標的化される。前記共役物の全身投与、前記標的での局在化及び非結合共役物の脱離後、設計されたプロドラッグが全身に投与され局所的に活性化される。この方法は、内因性酵素によっては達成されてはならない反応触媒を必要とする。これらの要求に応じる非哺乳類由来の酵素は、非常に免疫原性であり得るものであって、実際繰り返し投与を不可能にする。又は、プロドラッグは疾患サイトに標的化され、次に疾患特異的又は非特異的内因性活性化プロセスを受ける（例えば、ｐＨ、酵素、チオール含有化合物など）。
標的化抗がん治療は、従来のがん化学療法に比較して、低減された非特異的毒性及び改善された有効性を持つように設計される。この方法は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の、がん細胞への高能力の共役小分子治療物を特異的に送達する強力な標的化能力により実施される。毒性の問題に対応する試みで、化学療法剤（医薬）は、抗体又はタンパク質レセプターリガンドなどの標的化分子と結合し、これは腫瘍細胞に高い特異性で結合し、抗体−薬物共役物（ＡＤＣ）又は免疫共役物と参照される化合物を形成する。理論上では免疫共役物の毒性は低いが、というのはこれらは前記細胞毒性薬物を、前記特定に細胞表面抗原又はレセプターを発現する腫瘍に直接向けられるからである。この戦略の成功は限定的であったが、その理由のひとつとしては、細胞毒性薬物が大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドと共役する際に不活性化又は活性低下を起こす傾向があるからである。免疫共役物の有望な進展は、リンカーを介して抗体へ結合された（リンクされた）細胞毒性薬物であり、これは腫瘍サイト又は腫瘍細胞内部で開裂する（（Ｓｅｎｔｅｒｅｔａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、１４：５２９−５３７）。理想的には、前記ｍＡｂは、腫瘍細胞上の実質的に発現し、正常組織には限定的に発現する抗原への特異的結合である。特異性は、そうでなければ臨床応用のためには毒性すぎる薬物の利用を可能にする。この分野での最近の研究のほとんどが、高度に強力な毒性試薬の使用に向けられている。これは、条件付き安定性を与え、薬物送達が循環中ではなく、腫瘍結合後に起こるようなリンカー技術の開発を必要とする。
共役物として前記薬物は不活性であるが、標的に局在化されると前記薬物が、例えばｐＨ又は酵素により放出され、これは標的特異的であり、かつまたより一般的となり得る。前記薬物放出は、腫瘍細胞内の低ｐＨ、低酸素、特定酵素などの外部機構により活性化され得るが、一般にはより選択的薬物放出は、細胞内、ほとんどはリソソーマル放出機構を通じて達成され得るものであって、最初に内在化されるべき前記抗体共役物を必要とする（例えば、グルタチオン、プロテアーゼ、カタボリズム）。特定の細胞内放出機構（例えばグルタチオン、カテプシン）は通常は、その性質に依存するが親薬物が前記細胞を逃げ出して近隣の細胞を攻撃する結果となり得る。このことは、抗体−薬物共役物の範囲についての重要な作用機構として示され、特に異種のレセプター発現性又は不十分なｍＡｂ浸透性を持つ腫瘍ではそうである。開裂可能なリンカーの例は：ヒドラゾン（酸不安定）、ペプチドリンカー（カセプシンＢ開裂可能）、立体障害性ジスルフィド部分（チオール開裂可能）である。又は非開裂可能リンカーがｍＡｂ−薬物共役物で使用され得る。これらの構成物は、カタボリズムでその薬物を放出し、その結果薬物分子はなお１つのアミノ酸に結合されていると考えられる。薬物のほんの一部のみがかかる共役物として活性化を取り戻す。又はこれらのアミノ酸結合薬物は細胞を逃げ出すことができない。それでも、前記リンカーが安定である場合、これらの構成物は一般に、最も安全と考えられ、及び前記薬物及び標的に依存して非常に有効であり得る。
現在の抗体−薬物共役物放出戦略は限界を持つ。細胞外薬物放出機構は通常は、大きく非特異的であり（ｐＨ感受性リンカー）毒性を与える結果となる。細胞内放出は、前記ｍＡｂ−薬物の効率（例えばレセプター−介在内在化）に依存し、一方いくつかの癌は、十分な高複製数で存在する癌特異的及び効果的な内在化標的を持たない。細胞内放出はさらに、十分高濃度で、活性化酵素（プロテアーゼ）又は分子（グルタチオンなどのチオール）の存在に依存する。細胞内放出の次に、前記薬物は、ある場合には、前記細胞から標的近隣細胞へ逃げ出す。この効果は、全ての細胞が十分な量の標的レセプターを発現していない不均一な腫瘍には有利であると考えられる。さらに、薬物を浸透させることが難しい腫瘍において重要なことは、対流を妨げる高間質圧である。これは特に、ｍＡｂ（共役物）などの大きな構成物について問題となる。この機構はまた、結合サイトバリアが生じる場合に重要となる。標的化試薬が血管系に放出され、レセプターに結合すると、前記腫瘍内での動きは制限される。血管周囲空間内で制限されるｍＡｂ共役物の可能性はその標的の親和性に比例する。前記浸透性は、前記ｍＡｂ投与量の増加により改善されるが、この方法は、例えば肝臓への毒性を制限する投与量により制限される。さらには、死亡中細胞から出る抗原が、腫瘍間質空間に存在し、そこでこれらｍＡｂ−共役物がその標的細胞に結合することを妨げ得る。また、多くの標的が、非効率的内在によって妨害され、及び異なる薬物は同様にはｍＡｂへリンクされ得ない。さらには、前記標的内で内因性要素で選択的開裂され一方で、前記標的への途中での内因性要素には安定化である（特に、全ｍＡｂの遅い脱離の場合）ようにリンカーを設計することは手間がかかる。その結果として、最適化された、薬物、リンカー、ｍＡｂ及び標的の組み合わせが選択され、それぞれの場合により最適化されることが必要となる。
効果的なプロドラッグ方法から利益となり得る他の応用分野は、Ｔ−細胞係合抗体構成物（例えば、二−又は三特異的抗体断片）であり、これは免疫システムに係合することで癌に作用する。活性化Ｔ細胞をがん細胞と直接接触させることは、がん細胞を殺す強力な方法を与えることであると、長く考えられてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６６（２００８）５２６−５３１）。このために作成されてきた多くに二特異性抗体において、大部分は２つの抗体結合サイトからなり、１つのサイトは腫瘍を標的とし、他のサイトはＴ細胞を標的とする（Ｔｈａｋｕｒｅｔａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１０、１２（３）、３４０−３４９）。しかし、活性Ｔ細胞結合サイトを含む二特異性抗体では末梢Ｔ細胞結合が生じ得る。これは、前記共役物が前記腫瘍へ近づくことを妨げるだけでなく、またサイトカイン・ストームを起こしてＴ細胞を枯渇させ得る。光活性化可能な抗−Ｔ細胞抗体であって、必要とされる際及び場所でのみ、ＵＶ光の照射に続いて回復される（即ち、腫瘍結合アームを介して腫瘍局在化化後）前記抗−Ｔ細胞抗体は、これらの問題を解決するために使用されていきた。抗ヒトＣＤ３（Ｔ細胞標的化）抗体は、光開裂性１−（２−ニトロフェノール）エタノール（ＮＰＥ）コーティングにより可逆的に抑制された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６６（２００８）５２６−５３１）。しかし、光系活性化は、光が浸透し得る身体の領域に制限され、転移性癌などの全身性疾患を治療するために変更することは容易ではない。
プロドラッグ方法から利益を得る強く関連する構成物は、三特異性Ｔ細胞係合抗体構成物であり、これは例えば癌標的化試薬に加えてＣＤ３及びＣＤ２８Ｔ細胞係合部分を持つ。かかる構成物は、ＣＤ３又はＣＤ２８のいずれか又は両方が結合する領域として使用するには毒性が高く、マスクする必要性がある。
標的化薬物を選択的かつ予想可能に前記標的サイトで活性化し、さらに均一な浸透性及び標的化に依存せず、さらに前記標的への途中及び標的内で変化させる内因性パラメータに依存せず、及び指標、患者ごとに依存しない、活性化できることが望ましい。
現在のプロドラッグ活性化の欠点を解消するために、非生物的、生体直行型化学反応、即ちＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を使用して前記プロドラッグの活性化を引き起こすことが提案されている（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ ２００８、１９、７１４−７１８）。簡単に、導入された概念では、前記プロドラッグは薬物とトリガーの共役物であり、この薬物−トリガー共役物は、例えば酵素や特定のｐＨなどの内因性要素では活性化されず、前記アクチベータ、即ち前記プロドラッグ内のトリガー部分と反応する成分の制御された投与により、前記トリガーから薬物を放出する（又は逆に、薬物からトリガーを放出するが、この放出プロセスの別の見方である）。この概念の提案されたＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ方法は、しかし、十分作用しないことが分かり、応用分野も、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応により実行される放出機構に特定の性質からみて限定的である。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を使用する他の欠点は、反応速度が限定されていることであり、これらの反応のリン化合物が酸化に不安定であることである。従って、非生物的、生体直交型反応で、生理的条件で安定で、お互いに対してより反応性であり、及び種々の機構の手段により結合された薬物放出を誘導することができる反応物を提供し、それにより、非常に広い活性化薬物放出方法を提供することが望ましい。
選択的プロドラッグ活性化の内因性活性化機構（例えばｐＨ、酵素）に依存しない生体適合性化学反応の使用は、がん治療の強力な新規なツールとなる。必要なときに必要な位置でプロドラッグを選択的に活性化することは、癌を含めて身体内に多くのプロセスを広く制御することが可能になる。抗腫瘍抗体治療などの治療は、それにより、より特異的となり、正常細胞と腫瘍との違いを増加させ、望ましい副作用を低減させる。Ｔ細胞係合抗癌抗体においては、本発明は、不活性抗体構成物（即ちこれは次にプロドラッグ）の全身投与及び腫瘍標的化を可能にし、さらに標的毒性を低減させることを可能にする。十分な腫瘍への取り込みと非標的化領域からの脱離に続いて、腫瘍結合抗体はアクチベータの投与により活性化され、これは前記抗体又は特定の抗体領域の前記トリガーと反応し、その結果トリガーを脱離して前記Ｔ細胞結合機能を回復させる。この結果、Ｔ細胞活性化及び抗癌作用が起こることとなる（即ち、これは次に薬物放出である）。
Ｓｅｎｔｅｒｅｔａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、１４：５２９−５３７ Ｔｈａｋｕｒｅｔａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１０、１２（３）、３４０−３４９） Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３６６（２００８）５２６−５３１ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ２００８、１９、７１４−７１８
本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化に基づく治療方法に関する。本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化に基づく治療方法に関する。
１又は複数の前記要求に対応するために、本発明はプロドラッグの投与及び活性化のためのキットを提供し、前記キットは、薬物が、直接又は間接的に、トリガー部分に結合された（リンクされた）薬物及び前記トリガー部分のためのアクチベータを含み、前記トリガー部分がジエノフィル、及び前記アクチベータがジエンを含み、前記ジエノフィルが式（１ａ）を満たす。
Figure 2014515040
 ここで、Ｔ、Ｆは独立してＨ、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩからなる群から選択される置換基を表し；
Ａ及びＰは独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり（ただし、少なくとも１つはＣＲａＸＤである）；
ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、又はＯ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、であり、
ここで、ｐ＝０又は１であり；
（ＬＤ）ｎは場合によりリンカーであり、ｎ＝０又は１であり、好ましくはＴＲにＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してリンク（結合され）、ここでこれらの原子は前記リンカーの一部であり、直線及び／又は分岐して配置された複数単位からなり；
Ｙ、Ｚ、Ｑ、Ｘは一緒になって、芳香族基又は部分に縮合する４−員環の脂肪族性又はヘテロ脂肪族性部分であり；
それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキル、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
それぞれのＲｂは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、Ｒ’ＣＯ−アルキルからなる群から選択され、Ｒ’はＨ、アルキル又はアリールであり；
それぞれのＲｃは独立してＨ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨからなる群から選択され；
ここで２以上のＲａ、ｂ、ｃ、部分がともに環を形成し得るものであり；
ＤＤは１又は複数の治療部分又は薬物であり、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、これらの原子が前記治療部分の一部である。
他の側面では、本発明はプロドラッグを提供し、これは前記式（１ａ）を満たすトランス−シクロオクテン部分に、直接又は間接的に結合した薬物を含む。
他の側面では、本発明はプロドラッグへ薬物を変性させる方法を提供し、前記プロドラッグは、非生体、生体直交型反応で引き起こされるものであり、前記方法は、薬物を準備し、前記薬物を式（１ａ）を満たす環状部分に化学的に結合するステップを含む。
さらに他の側面では、本発明は治療の方法を提供し、薬物で変化させ得る疾患に罹患する患者が、前記患者にトリガー部分を含むプロドラッグを投与し、アクチベータの投与に予知その活性化の後、前記薬物が放出されるものであり、前記トリガー部分が式（１ａ）を満たす環構造を含む。
さらに他の側面では、本発明は８−員環非芳香族環モノ−アルキニリレン部分（好ましくはシクロオクテン部分及びより好ましくはトランス−シクロオクテン部分）を含み、前記部分が、動物又はヒトのプロドラッグ治療で使用するための薬物に結合されている。
他の側面では、本発明はジエンの使用、好ましくはテトラジンの、生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に担持された物質の放出のためのアクチベータとしての使用である。これに関連して本発明はまた、生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合された物質の放出のためのアクチベータとしてのテトラジンの使用、及び生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合された物質の放出を活性化するための方法を含み、ここでテトラジンがアクチベータとして使用される。
他の側面では、本発明は、式（１ａ）を満たす化合物とジエン、好ましくはテトラジンとの間の電子要求ディールスアルダー反応を、生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合され、共有結合形で投与される物質の放出のための使用に関する。
レトロディールスアルダー反応
前記ジエノフィル（１ａ）及びジエンは、逆電子要求ディールスアルダー反応の可能性をもつ。前記アクチベータと前記トリガーとの前記レトロディールスアルダー反応により前記プロドラッグの活性化（アクティベーション）が前記薬物の放出を起こす。
以下の反応式は、（３、６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジンジエン及びトランス−シクロオクテンジエノフィルとの［４＋２］ディールスアルダー反応を、続いて、生成物と二窒素が形成される逆ディールスアルダー反応の式を示す。トランスシクロオクテン誘導体は、古典的なディールスアルダー反応のように電子吸引基を持たず、この型のディールスアルダー反応は古典的な反応とは区別され、しばしば「逆電子要求ディールスアルダー反応」と言われている。以下の記載では、両方の反応ステップの順序、即ち最初のディールスアルダーシクロ付加（通常は逆電子要求ディールスアルダー反応）で続くレトロディールスアルダー反応は、短く「レトロディールスアルダー反応」又は「レトロＤＡ」と参照される。以下「ｒＤＡ」と省略され得る。
前記反応の生成物は、レトロディールスアルダー反応付加物又はｒＤＡ付加物である。
Figure 2014515040
一般に、本発明は、薬物が、式（１ａ）を満たすトランス−シクロオクテン誘導体から、テトラジン誘導体などの適合性のあるジエンとのシクロ付加反応から放出され得る、という認識に基づく。式（１ａ）のジエノフィルは、それが実質的に任意のジエンと反応（及び薬物放出に影響する）という利点を持つ。
理論に縛られることなく、本発明者は、前記レトロディールスアルダー付加物の分子構造は、このｒＤＡ付加物内での同時の脱離又は環化反応が前記薬物を放出する、と考えている。特に、本発明者は、好適に変化させたｒＤＡ成分がｒＤＡ付加物を導き、前記ジエノフィルの前記薬物への結合が前記ジエンの孤立電子対の存在で開裂される、と考えている。
プロドラッグ活性化においてレトロディールスアルダー反応の一般概念はスキーム１に示される。
スキーム１：
Figure 2014515040
 前記スキームで、「ＴＣＯ」とはトランス−シクロオクテンを意味する。用語トランス−シクロオクテンは、ここでは、１又は複数のヘテロ原子を含むように使用され、特に式（１ａ）を満たす構造を意味する。広い意味で、本発明者は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応に基づいて行った試み以外に、プロドラッグのためのトリガー部分としてＴＣＯを選択することは、薬物（活性）部分をプロドラッグ（活性化可能）部分に導入るための有用なツールを提供する、ことを見出し、前記活性化は、前記ジエノフィル（トリガー）とジエン（アクチベータ）との強力な、非生物的、生体直交型反応、例えば前記ディールスアルダー反応により生じ、かつ前記プロドラッグは薬物−ジエノフィル共役物である。
理解されるべきことは、スキーム１で、レトロディールスアルダー付加物で、最終生成物同様に、前記指標ＴＣＯ基及び前記指標ジエン基が、それらの基が前記レトロディールスアルダー反応で変換された後でそれぞれ前記ＴＣＯ及びジエン基の残基である、ということである。
非生物的、生体直交型化学反応の適用を成功させるために必要なことは、２つの関与する官能基がその反応性を微調整されて、共存する官能性との干渉を防止することである。理想的には、前記反応相手は、非生物的で、生理的条件で反応性であり、お互いにのみ反応性であって、その細胞／生理的環境を無視できる（生体直交性）ものである。生理的環境で課される選択性の要求は、ほとんどの従来の反応を除外する。
前記逆電子要求ディールスアルダー反応は、しかし、低濃度及び準当量条件で動物内で有効であることが示された（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５−３３７８）。本発明での前記反応相手は、歪ずみのかかったトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）誘導体であり、好適なジエンは、テトラジン誘導体などである。ＴＣＯ及びテトラジンとのシクロ付加反応は迅速に進行し、これは次にレトロディールスアルダー反応で二窒素を放出して再構成されジヒドロピリダジン共役物を形成する。これとその互変異性体は、前記レトロディールスアルダー付加物である。
本発明者は、式（１ａ）の前記ＴＣＯの構造は、前記ＴＣＯジエノフィル内に利用可能な二重結合とジエンを含む反応の結果それに結合された薬物の放出を引き起こすために非常に優れていることを認識するに至った。
これを可能にする特徴は、
（ａ）前記ＲＤＡの性質であり、二重結合の再構成を含み、脱離カスケードを引き起こすために使用され得る；
（ｂ）ｒＤＡ付加物の性質であり、ジヒドロピリダジン基を持ち、これは非芳香族であり（又は他の非芳香族基）、脱離反応で再構成されて共役二重結合を形成するか、芳香族基（例えばピリダジン）を形成する；
（ｃ）ｒＤＡ付加物の性質であり、これはジヒドロピリダジン基を持ち、これは弱塩基であり、従って脱離反応を触媒し得るものである。
広い意味で、本発明は、式（１ａ）のジエノフィルを用いて、前記ｒＤＡ反応が、ｒＤＡ付加物同様に、生体直交型反応で引き起こされる薬物放出を可能とする有効なプラットフォームを提供するものである。
前記反応は生体直交型であるという事実及び多くの反応選択肢が前記反応物相手に存在するということは、当業者には明らかである。例えば前記ｒＤＡ反応はプレターゲット医薬の分野で知られている。国際公開第２０１０／１１９３８２号、国際公開第２０１０／１１９３８９号及び国際公開第２０１０／０５１５３０号を参照文献とする。本発明は前記反応の完全に異なる使用を提供するものであるが、理解されるべきことは、前記標的化で使用されるｒＤＡ反応物対として利用可能な種々の構造可能性はまた、本発明の分野で利用可能である、ということである。
本発明で使用される前記ジエノフィルトリガー部分は、トランス−シクロオクテン環を含み、前記環は場合により１又は複数のヘテロ原子を含む。以下読みやすさのために、この８員環部分をトランス−シクロオクテン部分とし、「ＴＣＯ」と省略する。理解されるべきことは、本質は、ジエノフィルとして作用し、反応によりその共役された薬物から放出される前記８員環の可能性にある、ということである。当業者は、前記ジエノフィル活性が、前記環の全ての炭素の存在に依存することは必要ではないという事実を知っているが、これはヘテロ環モノアルケニレン８−員環もジエノフィル活性を持つことが知られてるからである。
従って、一般には本発明は、薬物置換トランスシクロオクテンに厳密に限定されるものではない。有機化学の当業者は、他の８員環系ジエノフィルが存在し、これはトランスシクロオクテンと同様に同じ環内二重結合を持つが、前記環のいずれかに１又は複数のヘテロ原子を持つ、ということを認識している。即ち、本発明は一般に、８員環非芳香族性環状アルケニレン部分を持ち、好ましくはシクロオクテン部分であり、かつより好ましくはトランスシクロオクテン部分であり、共役された薬物を含む、ものである。
インビボ作用がしばしば僅かな構造変化で変化される例えば医薬的活性物質を含む場合、本発明は、前記薬物共役の好適な設計と組み合わせられる正しい化学反応性を何よりもまず要求する。従って、可能な構造は、当業者にとってこれらがジエノフィルとして反応可能であることをよく知っているものに拡張される。
留意すべきことは、命名法に依存して、前記ＴＣＯジエノフィルはまた、Ｅ−シクロオクテンとして記載される、ということである。従来の命名法を参照して、理解されるべきことは、前記シクロオクテン環の置換の結果として、前記構造の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテン異性体が形式的にＺ−異性体として記載されることになる、ということである。本発明では、本発明の任意の置換体は、形式的に「Ｚ」又は「Ｅ」、「シス」また「トランス」異性体であろうと、無置換トランスシクロオクテン、又は無置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体として考える。用語「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）はＥ−シクロオクテン同様に交換可能に使用され、又置換が形式的に対応する命名法を要求する場合でも本発明の全てのジエノフィルについて維持される。即ち、本発明は、以下番号付けされたように炭素原子１と６がＥ−（エントゲーゲン）又はトランス配置である。
Figure 2014515040
 本発明はさらに、具体的な実施態様に関して説明され、図面を参照するが本発明はこれらに限定されるものではなく特許請求の範囲にのみ限定されるものでる。不定冠詞また定冠詞「ひとつの」、「前記」を伴って使用される限定的又は非限定的物の単数名詞形は、特に記載がない限り複数を含む。記載された図面は模式的でありなんらを限定するものではない。図面において、ある要素のサイズは誇張されており、説明することを目的とするだけのものである。特許請求の範囲の全ての参照番号は、本発明を限定するものではない。
さらに留意されるべきことは、明細書や特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、列記される手段に限定されるべきではなく、他の要素やステップを含むことを除外するものではない。従って、表現「手段Ａ及びＢを含む装置」とは、部品ＡとＢのみからなる装置に限定されるべきではない。これは、本発明においては、関連する部品がＡ及びＢであることのみを意味する。
以下いくつかの化学式で、「アルキル」及び「アリール」が参照される。
ここで、「アルキル」は、それぞれ独立して、１０炭素原子までの脂肪族、直鎖、分岐、飽和、不飽和及び／又は環状ヒドロカルビル基を示し、１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含むことができ、「アリール」は、それぞれ独立して、２０炭素原子までの芳香族基又はヘテロ芳香族基を示し、置換されていてよく、及び１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含むことができる。「アリール」基はまた、「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」基（簡単な例ではベンジル基）を含む。「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」及び「アリールアルキル」が含む炭素原子の数は、かかる用語の前に指定されることで示される（即ち、Ｃ１−１０アルキルは、前記アルキルが１から１０の炭素原子を含み得ることを意味する）。本発明のある化合物は、キラル中心及び互変異性体を含み、及び全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及び互変異性は、それらの混合物も含めて本発明の範囲に含まれる。いくつかの式で、基又は置換基は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」などの文字で参照され、種々の（数字付き）「Ｒ」基で参照される。これらの文字の定義は、それぞれの式について読まれるべきものであり、即ち異なる式ではこれらの文字は特に断りがない限り、それぞれ独立して、異なる意味を持ち得る。
ここで記載される本発明の全ての実施態様では、アルキルは好ましくは低級アルキルであり（Ｃ１−４アルキル）であり、それぞれのアリールは好ましくはフェニルである。初期の研究で、前（プレ）標的化放射線免疫イメージングのために前記逆電子要求ディールスアルダー反応の利用が示された（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５−３３７８）。この特定のシクロ付加反応は、（３、６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジン誘導体とＥ−シクロオクテンとの間で生じ、続いてレトロディールスアルダー反応が起こって前記生成物と窒素を形成する。前記トランスシクロオクテン誘導体は、古典的なディールスアルダー反応として電子吸引基を含まないことから、このタイプのディールスアルダー反応は、古典的な反応とは区別され、しばしば、「逆電子要求ディールスアルダー反応」と参照されている。以下の記載で、両方の反応ステップをの順序、即ち前記最初のディールスアルダーシクロ付加（通常は逆電子要求ディールスアルダーシクロ付加）及び続くレトロディールスアルダー反応は短く「レトロディールスアルダー反応」と参照される。
レトロディールスアルダー反応
レトロディールスアルダーカップリング化学は一般には、一組の反応物がカップリングして不安定な中間体を形成し、この中間体がレトロディールスアルダー反応による唯一の副生成物として小分子（出発物に依存して、例えばＮ２、ＣＯ２、ＲＣＮなど）を放出して、レトロディールスアルダー付加物を形成する。一組の反応物は、１つの反応物として（即ち一つの生体直交型反応基）、例えば電子不足テトラジンなどのテトラジン誘導体などの好適なジエンと、他の反応物として（即ち、他の生体直交型反応基）、好適にはジエノフィルであり例えば歪ずみのかかったシクロ（ＴＣＯ）である。
例えば電子不足（置換）テトラジンとＴＣＯ部分との非常に早い反応は、接続中間体を形成し、これは、［４＋２］レトロディールスアルダーシクロ付加の唯一の副生成物としてのＮ２を放出してジヒドロピリダジンレトロディールスアルダー付加物に再配置される。水生環境では、前記最初に形成される４、５−ジヒドロピリダジン生成物は、１、４−ジヒドロピリダジン生成物に互変異性化し得る。
前記２つの反応種は、非生物的であり、インビボで迅速な代謝や副反応を受けない。これらは生体直交型であり、即ちこれらは、生理的媒体中で選択的にそれぞれと反応する。従って、本発明の前記化合物及び方法は、生きている有機体中で使用され得る。さらには、前記反応基は比較的小さく、生物的サンプル中、又は生きている有機体中に、それらの中の分子のサイズを大きく変更することなく導入することを可能にする。前記逆電子要求ディールスアルダー反応及び前記一組に反応物の挙動についての参照文献は：Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４；Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５；Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９）、Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．ＲｅｎａｒｔＶｅｒｋｅｒｋ、ＳａｎｄｒａＭ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、ｌ．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５、Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ、Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ、Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ、Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ、Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２００９、４８、７０１３、及びＤｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、１−５、である。
理解されるべきことは、広い意味で、本発明により、前記レトロディールスアルダーカップリング及び続く薬物活性化化学は、基本的に全ての分子、基又は部分の組に適用でき、これらはプロドラッグ治療に使用され得るものである、ということである。即ち、かかる一組の１つは、ジエノフィル（トリガー）に結合される（リンクされる）薬物を含む。前記他の一つは、前記ジエノフィルとの反応に使用するための相補的ジエンである得る。
トリガー
前記プロドラッグは、ＴＲとして示されるトリガー部分に、直接又は間接的に結合されたＤＤとして示される薬物（Ｄｒｕｇ）を含み、前記トリガー部分はジエノフィルである。前記ジエノフィルは、広い意味で、８員環非芳香族性環状アルケニレン部分（好ましくはシクロオクテン部分、及びより好ましくはトランスシクロオクテン）である。場合により、前記トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）部分は、同じ面内に実質的に固定される少なくとも２つの環内結合を持ち、及び／又はこれは場合により、前記アキシャル位置で少なくとも１つの置換基を持ち、エカトリアル位置には持たない。有機化学の当業者は、用語「実質的に同じ面内に固定される」とは、結合が通常は同じ面内に固定されるという結合理論を意味することを理解する。通常はかかる同じ面内での固定の例は、二重結合及び歪のかかった縮合環を含む。例えば、前記少なくとも２つの結合は、酸素の結合する二重結合（即ちＣ＝Ｏ）であり得る。前記少なくとも２つの環内結合はまた、２つの隣接する炭素元素の一重結合であり得る、これは、これらの結合が一緒になって縮合環（即ち前記ＴＣＯ環に縮合される）の一部分であり、実質的に平面構造が仮定され、それにより前記２つの一重結合が実質的に１つの同じ面で固定される場合である。後者の例は、シクロプロピル及びシクロブチルなどの歪ずみのかかった環を含む。理論に縛られることなく本発明者は、同じ面内の少なくとも２つの環内結合の存在は、前記ＴＣＯ環を少なくとも部分的に平坦化させ、これにより前記レトロディールスアルダーのより高い反応性を導くことを可能にする。
本発明では前記ＴＣＯは次の式（１ａ）を満たす。
Figure 2014515040
 Ａ及びＰはそれぞれ独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり、ただし少なくとも１つはＣＲａＸＤである。ＸＤは、（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、であり、ここでｐ＝０又は１、（ＬＤ）ｎは選択的なリンカーであり、ｎ＝０又は１、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してＴＲに結合され、これらの原子は前記リンカーの一部であり、直線的及び／又は分岐させて配置される複数のユニットからなる。ＤＤは、１又は複数の治療部分又は薬物であり、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、これらの原子は前記治療部分の一部である。好ましくは、ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここでｐ＝０又は１であり、好ましくは１、及びｎ＝０又は１である。
好ましくは、ＤＤがＴＲ又はＬＤにＮＨを介して結合される場合、このＮＨはＤＤからの一級アミン（−ＮＨ２）残基であり、及びＤＤがＮを介して結合される場合には、前記ＮはＤＤからの二級アミン（−ＮＨ−）残基である。同様に、好ましくは、ＤＤがＯ又はＳを介して結合される場合には、前記Ｏ又はＳは、それぞれ、ＤＤからのヒドロキシル（−ＯＨ）残基又はスルフヒドリル（−ＳＨ）残基である。
さらに好ましくは、ＤＤに含まれる前記Ｓ、Ｎ、ＮＨ、又はＯ部分がＤＤの脂肪族性又は芳香族性炭素に結合されている。
好ましくはＬＤがＴＲにＮＨを介して結合されてる場合、このＮＨはＬＤからの一級アミン（−ＮＨ２）残基であり、及びＬＤを介して結合されている場合には、このＮはＬＤからの二級アミン（−ＮＨ−）残基である。同様に、好ましくは、ＬＤがＯ又はＳを介して結合される場合には、前記Ｏ又はＳは、それぞれ、ＬＤからのヒドロキシル（−ＯＨ）残基又はスルフヒドリル（−ＳＨ）残基である。
さらに好ましくは、ＬＤに含まれる前記Ｓ、Ｎ、ＮＨ、又はＯ部分がＤＤの脂肪族性又は芳香族性炭素に結合されている。
本発明においてリンカーＬＤが参照される場合、これは自壊性であるか又はそうでないか、又はそれらの組み合わせであり得るものであり、及び複数の自壊性ユニットからなることができる。
さらに明確にする方法で、ｐ＝０及びｎ＝０である場合、薬物ＤＤは直接前記脱離反応の脱離基を構成し、及びｐ＝０及びｎ＝１の場合、前記自壊性リンカーは前記脱離反応の脱離基を構成する。リンカーＬＤと薬物ＤＤの結合位置及び方法は当業者に知られている（例えば、Ｐａｐｏｔ ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、８、６１８−６３７を参照）。それにもかかわらず、自壊性リンカーＬＤの典型的な、限定的ではない例はベンジル誘導体であり例えば以下に示される。右側に、複数のユニットを持つ自壊性リンカーが示され、このリンカーは、ＣＯ２と４−アミノベンジルアルコールに分解するだけでなく、また１、３−ジメチルイミダゾリジン−２−オンユニットへ分解する。
Figure 2014515040
 ひとつの興味ある実施態様では、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑはそれぞれ独立して、ＣＲａ ２、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ及びＳｉＲｃ ２、からなる群から選択され、Ｙ、Ｚ、Ｘ、及びＱの最大３つがＣ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ及びＣ＝ＮＲｂからなる群から選択され、多くともＹ、Ｚ、Ｘ、及びＱの３つがＣ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、及びＣ＝ＮＲｂからなる群から選択され、ここで２つのＲ基は一緒になって環を形成し、及び隣接する原子の対が存在しない限り、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲｂ、Ｓ−ＮＲｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）２及びＳ−Ｓ、からなる群から選択され、ＳｉはＣＲａ ２又はＯにのみ隣接する。
好ましい実施態様では、式（１ａ）の前記ＴＣＯは全て炭素環である。他の好ましい実施態様では、前記式（１ａ）のＴＣＯはヘテロ環炭素環であり、前記環に１から３の酸素原子を含み好ましくは１つの酸素原子を含む。
他の実施態様では、結合ＰＱ、ＱＸ、ＸＺ、ＺＹ、ＹＡの一つが縮合環の部分か、ＣＲａ＝ＣＲａからなり、２つの環外結合が前記同じ面に固定され、及びただしＰＱ及びＹＡは芳香族５−又は６−員環の部分、共役７員環の部分又はＣＲａ＝ＣＲａの部分でもなく；縮合環の部分ではない場合には、Ｐ及びＡは独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤ 、であり、ただし少なくとも１つはＣＲａＸＤであり；縮合環の部分ではない場合には、Ｐ及びＡは独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤ 、あり、ただし少なくとも１つはＣＲａＸＤであり；前記残る基（Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑ）はお互いに独立して、ＣＲａ ２、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ、ＳｉＲｃ ２であり、多くとも１つの基がＣ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂであり、隣接する原子対が存在せずＯ−Ｏ、Ｏ−ＮＲｂ、Ｓ−ＮＲｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）２、及びＳ−Ｓからなる群から選択され、存在すればＳｉは、ＣＲａ ２又はＯに隣接し、及びＣＲａ ２＝ＣＲａ ２は、存在すればＣＲａ ２又はＣ＝ＣＲａ ２基に隣接し；Ｔ、Ｆはそれぞれ独立してＨ、又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩからなる群から選択される置換基を表す。
いくつかの実施態様では縮合環は、２つの外部環結合が実質的に同じ面に固定される結果となる。これらは、縮合３−員環、縮合４−員環、縮合二７−員環、縮合芳香族５−員環、縮合芳香族６−員環及び縮合平面共役７−員環から選択され以下に示される。
縮合３−員環は：
Figure 2014515040
 であり、ここでＥ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得るものであり、Ｐ、ＡはＣＲａ又はＣＸＤ、及びＣＸＤはＡ及びＰにのみ存在する。Ｅ−ＧはＣＲａ−ＣＲａ又はＣＲａ−ＣＸＤ、及びＤはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、ＮＲｂ、Ｏ、Ｓ、又はＥ−ＧはＣＲａ−Ｎ又はＣＸＤ−Ｎ、及びＤはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、ＮＲｂＯ、又はＳである。
縮合４−員環は：
Figure 2014515040
 であり、ここで、Ｅ−Ｇは前記８−員環の部分であり、及びＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得るものであり、Ｐ、ＡはＣ、ＣＲａ又はＣＸＤ、及びＣＸＤはＡ及びＰのみに存在し得る。Ｅ及びＧはＣＲａ、ＣＸＤ又はＮ、及びＤ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接Ｏ−Ｏ又はＳ−Ｓ基ではない；又は、Ｅ−ＤはＣ＝ＣＲａ及びＧはＮ、ＣＲａ、ＣＸＤ及びＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであり；又は、Ｅ−ＤはＣ＝Ｎ及びＧはＮ、ＣＲａ、ＣＸＤ及びＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏであり；又は、Ｄ−ＭはＣＲａ＝ＣＲａ及びＥ及びＧはそれぞれ独立してＣＲａ、ＣＸＤ又はＮであり；又は、Ｄ−ＭはＣＲａ＝Ｎ及びＥはＣＲａ、ＣＸＤ、Ｎ、及びＧはＣＲａ又はＣＸＤ；であり；又は、ＥはＣ、ＧはＣＲａ、ＣＸＤ又はＮ、及びＤ及びＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ、又は多くともＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２の１つであるが、しかし隣接するＯ−Ｏ又はＳ−Ｓ基ではなく；又はＥ及びＧはＣ及びＤ及びＭはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、又はＳ−Ｓ基ではない。
縮合７−員環は：
Figure 2014515040
 であり、Ｅ−Ｇは前記８−員環の部分であり、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合できるものであり、Ｐ、ＡはＣ、ＣＲａ又はＣＸＤ、及びＣＸＤはＡ及びＰにのみ存在し；Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤ又はＮ；Ｋ、ＬはＣＲａ；Ｄ、ＭはＣＲａ＝ＣＲａ又はＣＲａ＝Ｎを形成し、又はＤ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基ではなく；ＪはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであり；少なくとも２Ｎ基であり；又は、Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤ；ＫはＮ及びＬはＣＲａ；Ｄ、ＭはＣＲａ＝ＣＲａ結合を形成し又はＤ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基ではなく、；ＪはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであり；少なくとも２Ｎ基であり；又は、Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤ；Ｋ及びＬはＮ；Ｄ、Ｍ、Ｊはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２基であり；
縮合５−員環は：
Figure 2014515040
 であり、Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合され得る。Ｅ及びＧはＣである。基Ｌ、Ｋ、又はＭの１つはＯ、ＮＲｂ、Ｓであり、残りの２つはお互いに独立してＣＲａ又はＮであり；又はＥはＣであり、ＧはＮであり；Ｌ、Ｋ、Ｍは独立してＣＲａ又Ｎである。
縮合６−員環は：
Figure 2014515040
 であり、Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合され得る。Ｅ、ＧがＣである。Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ又はＮである。
縮合平面共役７−員環は：
Figure 2014515040
 であり、Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合し得る。Ｅ、ＧはＣであり；Ｌ、Ｋ、Ｄ、ＭはＣＲａであり；ＪはＳ、Ｏ、ＣＲａ ２、ＮＲｂである。前記示されるそれぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’であり、それぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキル、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；前記示されるそれぞれのＲｂは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキル、Ｒ’ＣＯ−アルキルであり、Ｒ’はＨ、アルキル及びアリールであり；前記示されるそれぞれのＲｃは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨからなる群から選択され；ここで２以上のＲａ、ｂ、ｃ部分は共に環を形成し得るものであり；好ましくは、それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’が独立してアルキル又は又はアリールである。
前記全ての実施態様で、場合によりＡ、Ｐ、Ｑ、Ｙ、Ｘ、及びＺ又はその置換体、又はその部分の縮合環、又は自壊性リンカーＬＤ、又は薬物ＤＤのひとつは、場合によりスペーサーＳＰを介して１又は複数の標的化試薬ＴＴ又はマスキング試薬ＭＭに結合される。
前記ＴＣＯの合成は当業者には十分利用可能なものである。これはまた、前記歪のあるシクロアルケン環で１又は複数のヘテロ元素をＴＣＯについても明示的に保持される。これについては参照文献を参照すること（Ｃｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８０、４５、２６１及びＰｒｅｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９、１３１、１４１８２）。
好ましい実施態様では、前記トランスシクロオクテン部分は式（１ｂ）を満たす。
Figure 2014515040
 ここで、前記同じ面に固定される多くとも２つの環外結合の選択的存在に加えて、それぞれのＲａは独立してＨ、又は最大４つの場合、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択される置換基であり、ここでそれぞれのＲ’及びＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキル、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；前記のそれぞれのＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；ここで２つのＲａ、ｄ部分は環を形成し得るものであり；場合によりひとつのＲａ、ｄが、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭ、へのリンカー部分に場合によりスペーサーＳＰ、を介して含まれ、及びＴ及びＦがそれぞれ独立してＨであり、又は、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される置換基であり、及びＸＤは式（１ａ）で定められる。
好ましくはそれぞれのＲａ及びＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアルキル又はアリールである。
前記ジエノフィルにおいて、好ましくは、同じ面に固定される少なくとも２つの環外結合が、（ａ）縮合シクロブチル環の一重結合、（ｂ）縮合芳香族環の混成結合、（ｃ）酸素ヘの環外二重結合、及び（ｄ）炭素への環外二重結合からなる群から選択される。
１又は又は２つのＸＤ部分を含む前記ＴＣＯは、複数異性体からなるものであってよく、またＴＣＯのＸＤのエカトリアル対アキシャル位置の置換を含んでいてよい。これに関連しては、次に文献が参照され、それぞれ（１ＲＳ、２ＲＳ）及び（１ＳＲ、２ＲＳ）として識別される、トランス−オクタ−２−エン−オールのエカトリアル及びアキシャル異性体の合成及び特徴が記載されている（Ｗｈｉｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６）。これらの異性体では、ＯＨ置換基は、エカトリアル又はアキシャルのいずれかの位置で置換されている。
好ましい実施態様では、ＸＤが、アキシャル又はエカトリアル位置にいずれかである得る場合のプロドラッグについて、ＸＤはアキシャル位置である。
カスケード脱離機構で進行すると考えられる薬物放出について場合により選択される好ましいジエノフィルは、次に構造から選択される。
Figure 2014515040
 （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
Figure 2014515040
 （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
Figure 2014515040
 （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
キャリア（担体）としてのＴＣＯの使用
本発明はまた、式（１ａ）を満たすトランスシクロオクテンの、全ての実施態様で、治療化合物のキャリアとしての使用を含む。前記トランスシクロオクテンは、前記の通り広い意味でＴＣＯと記載されており、好ましくは全ての炭素環又は１又は２のヘテロ原子を含む。治療化合物は薬物又はその他の化合物であり、又は治療応用を持つことが意図されている部分である。本発明のこの側面でのキャリアとしてのＴＣＯの使用は、前記治療化合物の治療活性とは関連しない。事実、前記治療化合物が薬物として開発されることが意図される薬物質である場合、多くの場合実際には失敗し得るものであるがなおキャリアとしてのＴＣＯの応用は前記薬物の試験において有用である。この意味で、キャリアの許容性での前記ＴＣＯは、医薬賦形剤と同様であると考えられ、薬物を被験者に導入する場合にキャリアとして作用する。
キャリアとしてのＴＣＯの使用は、ジエンと特定のテトラジンとの生体直交型反応を開始する部分により担持された薬物を被験者へ投与することを可能にするという利点がある。これは、身体への担持された薬物の運命に影響を与えるためだけでなく、その運命に続いて（例えば続いてラベル化ジエンをそれに反応させることが可能になる）又はその運命を変化させる（例えば、ｐＫ変性剤をそれに結合させることが可能になる）ために強力なツールを提供することとなる。これは、前記説明したｒＤＡ反応で前記ＴＣＯとジエンを反応させることを可能にするということに基づく。前記キャリアは好ましくは以下説明するアクチベータと反応させ、以下説明するように、前記ＴＣＯから前記治療化合物の放出を引き起こす。
アクチベータ
前記アクチベータは、生体直交型反応基を持ち、ここでこのアクチベータの生体直交型反応基はジエンである。このジエンは、他の生体直交型反応基、トリガー、ここではジエノフィルと反応する（逆も可能）。前記アクチベータのジエンは、前記トリガーのジエノフィルと、ディールスアルダーシクロ付加反応、続いてレトロディールスアルダー反応により、レトロディールスアルダー付加物を与えることができるように選択される。この中間的付加物は次に前記薬物を放出し、そこでこの薬物放出は、種々の環境や条件下で引き起こされるが、これは前記レトロディールスアルダー付加物の特定の分子構造に関連する。理論に縛られるものではなく、本発明者は、アクチベータは、脱離又はカスケード脱離（レトロディールスアルダー付加物内で分子内脱離反応により）を介して薬物放出を引き起こすように選択されると考えている。この脱離反応は単純な一段階であり得るが、１又は複数の中間体構造を含む複数段階であり得る。これらの中間体は、ある時間安定であるか、又は即時に分解して熱力学的最終生成物となるか、又は次の中間体構造となる。いくつかのステップが関与する場合、これをカスケード反応と呼ぶ。単純又はカスケードプロセスのいずれの場合にも、脱離反応の結果は、前記薬物が前記レトロディールスアルダー付加物から放出される結果となる。理論に縛られることなく、両方の成分（即ち、ジエンアクチベータ及びジエノフィルトリガー）の設計は、前記レトロディールスアルダー付加物内の電子分布が好ましくなく、これらの電子の再配列を起こす必要があるようにする。この状況は前記分子内（カスケード）脱離反応を引き起こして、前記薬物の放出に導くものである。前記プロドラッグ自体が比較的安定である場合には、前記プロドラッグ内での脱離反応の発生と薬物放出はそれほど効果的ではない。前記脱離は、前記アクチベータ予備プロドラッグが反応して、前記レトロディールスアルダー付加物を構成した後に生じることができる。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
 理論に縛られることなく、前記２つの例は、前記レトロディールスアルダー付加物の好ましくない電子配置がどのようにして脱離反応を行いそれにより薬物を放出するのかを説明する。ひとつのシナリオでは、前記脱離プロセスは最終生成物Ａを生成し、この生成物は、二重結合の共役を持ち、これは前記レトロディールスアルダー付加物には存在しない。種Ａは最終生成物Ｂと互変異性であるか、又は再配列して最終生成物Ｃを形成する。次に、前記レトロディールスアルダー付加物の前記非芳香族性ジヒドロピリダジン環が、前記最終生成物Ｃでの前記芳香族性ピリダジン環に変換される。当業者は、前記レトロディールスアルダー付加物の電子分布は一般には、前記最終生成物、Ａ、Ｂ又はＣのいずれよりも好ましくない、ということを理解する。従って、前記レトロディールスアルダー付加物よりも安定な種の形成が、前記脱離（カスケード）反応の駆動力である。前記プロセスをどのように見るかによらず、いずれの場合でも前記薬物種（ここでは前記アミン「ｄｒｕｇ−ＮＨ２」）は、効果的に前記レトロディールスアルダー付加物から放出され、前記プロドラッグからは放出されることはない。
以下のスキームは、前記２つの説明したスキームに加えて、他の可能な前記カスケード脱離反応を示す。理論に縛られることなく、以下の例は、どのようにして、前記レトロディールスアルダー付加物に好ましくない電子配置が、脱離反応で開放され、それにより前記薬物を放出するかを説明する。このプロセスは、全てが平衡となる種々の互変異性を介して進行し得る。ここで、前記ＲＤＡ反応は、互変異性体Ａ及びＢを生成し、これらは互いに交換可能である。互変異性体Ｂは、脱離反応により生成物Ｃとなり、これによりＤとなる。
Figure 2014515040
 前記アクチベータはジエンである。当業者は、前記レトロディールスアルダー反応で反応性を示す多くのジエンを認識する。前記アクチベータに含まれるジエンは、テトラジン（本発明による好ましいアクチベータである）などの第３の二重結合を含む環構造の部分であり得る。
一般的に前記アクチベータは、少なくとも２つの共役二重結合を持つヘテロ環部分を含む分子である。好ましいジエンは以下式（２）〜（４）で与えられる。
Figure 2014515040
 ここで、式（２）において、Ｒ１は、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル−置換炭素、アリール−置換炭素、窒素Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒからなる群から選択され、ここでＲはアルキルであり、ただしＡ及びＢは共に炭素ではない；ＸはＯ、Ｎ−アルキル、及びＣ＝Ｏであり、及びＹはＣＲであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキルである。
シクロオクテンについて反応相手として好適なジエンは式（３）で与えられ、
Figure 2014515040
 ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
シクロオクテンとの反応相手として特に好適な他のジエンは式（４）のジエンであり、
Figure 2014515040
 ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；ＡはＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル及び、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’ｈじゃそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
本発明によれば、特に有用なジエンは、それぞれ式（５）、（６）、（７）で与えられる、１、２−ジアジン、１、２、４−トリアジン及び１、２、４、５−テトラジン誘導体である。
Figure 2014515040
 前記１、２−ジアジンは式（５）に与えられ、ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｏ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ−アルキル、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり、ここでＸ−Ｙは一重結合又は二重結合であり、Ｘ及びＹは、前記６−員環ジアジンから離れた第２の環に結合され得る。好ましくは、Ｘ−Ｙがエステル基（Ｘ＝Ｏ及びＹ＝Ｃ＝Ｏ；Ｘ−Ｙは一重結合）又はＸ−Ｙはシクロアルカン基を表し（Ｘ＝ＣＲ’及びＹ＝ＣＲ’’であり；Ｘ−Ｙは一重結合であり；Ｒ’及びＲ’’は結合されている）、好ましくはシクロプロパン環であり、そこでＲ’及びＲ’’は、前記１、２−ジアジンの外で前記第１の炭素でお互いに結合されている。
前記１、２、４−トリアジンは式（６）に与えられており、ここで、Ｒ１及びＲ２はお互いに独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキル又はであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
前記１、２、４、５−テトラジンは式（７）で与えられており、ここでＲ１及びＲ２かそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
電子不足１、２−ジアジン（５）、１、２、４−トリアジン（６）又は１、２、４、５−テトラジン（７）は特に興味があり、かかるジエンは一般にはジエノフィルに対しより高い反応性を持つからである。
ジ−、トリ−又はテトラ−アジンは、それらが、一般に電子供与体とはされない基又は部分で置換されるか、又は電子吸引基で置換される場合に、電子不足である。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、Ｈ、アルキル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル、２、４−イミダゾール、２、５−イミダゾール又はフェニールからなる群から選択され、場合により、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、Ａｒなどの１又は複数の電子吸引基で置換され、そこでＲはＨ又はアルキルであり、及びＡｒは芳香族性基であり、特にフェニール、ピリジル又はナフチルである。
式（７）の前記１、２、４、５−テトラジンは、アクチベータジエンとして最も好ましく、というのはこれら分子は、前記好ましいＴＣＯジエノフィルなどのジエノフィルとのレトロディールスアルダー反応で最も反応性が高いからであり、たとえＲ１及び／又はＲ２基は電子吸引基をもつことが必要ではない場合でも、またＲ１及び／又はＲ２が実際に電子供与性であっても、そうである。例えば電子供与基は、ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＨＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’’であり、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してアルキル又はアリールである。他の電子供与基の例は、前記リストで記載されるような１又は複数の電子供与基で置換されたフェニール基であり、特に前記フェニール基の２−、４−及び／又は６−位置で置換される場合である。
本発明によれば、２つの電子吸引残基を持つ１、２、４、５−テトラジン又は、１つの電子吸引残基を持ち、１つの電子吸引も電子供与でもない残基を持つものは電子不足と呼ばれる。同様に、２つの電子供与残基を持つ１、２、４、５−テトラジン又は、１つの電子供与残基を持ち、１つの電子吸引も電子供与でもない残基を持つものは電子十分と呼ばれる。２つの残基が共に電子吸引での電子供与でもない１、２、４、５−テトラジン、又は、１つの電気吸引残基と１つの電子供与残基を持つものは、電子不足でも電子十分でもない。
前記１、２、４、５−テトラジンは、非対称的でも対称的でもよく、即ち式（７）のＲ１及びＲ２基は、異なっていても同一であってもよい。対称的１、２、４、５−テトラジンは、これらのアクチベータとしてより便利であり、より合成手順に容易にアクセスすることができる。
我々は、モデル医薬化合物（例えばベンジルアミン）を脱離（カスケード）反応によりプロドラッグから放出させるアクチベータとしての能力について、いくつかの１、２、４、５−テトラジンを試験し、電子不足、電子十分又は電子不足でも電子十分でもないテトラジンが前記薬物放出を導くことが可能であることを見出した。さらには、非対称的テトラジンが対称的テトラジンと同様に効果的であった。
電子不足１、２、４、５−テトラジン及び、電子不足でも電子十分でもない１、２、４、５−テトラジンは、一般にジエノフィル（ＴＣＯなどの）とレトロディールスアルダー反応でより反応性であり、それはたとえ後者がまたプロドラッグ中で薬物放出を誘導することができるものであってもである。
以下の説明で、本発明の第２の側面による１、２、４、５−テトラジンアクチベータの具体的な実施例が、式（７）でのＲ１及びＲ２残基を定めることで強調される。
電子吸引基を持つ対称的電子不足１、２、４、５−テトラジンは例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、４−ピリミジル、２、６−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、３、４−トリアジル又は２、３、５−トリアジルのものである。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニールの場合であって、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＭｅカルボキシレート、又はＣＮニトリル、又はＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ３又はＣＯＮ（ＣＨ３）２アミド、又はＳＯ３Ｈ又はＳＯ３Ｎａスルホネート、又はＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣＨ３又はＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２スルホンアミド、又はＰＯ３Ｈ２又はＰＯ３Ｎａ２ホスホネートを、フェニール基の２−、３−又は４−位置、又はフェニール基の３−及び５−位置、又は２−及び４−位置、又は２、−及び６−位置に持つ、フェニール基の場合である。他の置換体パターンも可能であり、異なる置換基がテトラジンを対称的とする限り使用され得る。以下これらの構造を示す。
Figure 2014515040
 電子供与基を持つ対称的１、２、４、５−テトラジンは、例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’、２−ピリジル、３−ピリジル、２−チオフェン、３−チオフェンを持つものであり、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニール又はトルイル基である。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニールをもつものであり、ここでフェニールはＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’で置換され、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニール又はトルイル基であり、ここでＲ’’はメチル又はエチル基であり、及びここで前記置換は、２−又は３−又は４−又は２−及び３−又は２−及び４−又は２−及び５−又は２−及び６−又は３−及び４−又は３−及び５−又は３−、４−及び−位置である。これらの構造は以下に示される。
Figure 2014515040
 電子供与基も電子吸引基も持たない対称的１、２、４、５−テトラジンは、例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニール、メチル、エチル、（イソ）プロピル、２、４−イミダジル、２、５−イミダジル、２、３−ピリジル又は３、４−ピラジルのものである。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝ヘテロ（芳香族性）環を持つものであり、例えばオキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール又はチアゾリン環である。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニールを持つものであり、このフェニールは、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＮ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＯＮ（ＣＨ３）２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３Ｎａ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣＨ３、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＰＯ３Ｈ２又はＰＯ３Ｎａ２から選択される１つの電子吸引置換基と、ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’置換基から選択される１つの電子供与基を持ち、ここでＲ’は、メチル、エチル、フェニール又はトルイル基であり、ここでＲ’’はメチル又はエチルである。置換は、２−及び３−、２−及び４−、２、−及び５−、２−及び６−、３−及び４−、及び３−及び５−位置である。さらに他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝ピラジル又はピリミジルのものであり、１つの電子供与基が、ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’置換基から選択され、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニール又はトルイル基であり、ここでＲ’’はメチル又はエチル基である。いくつかの例が以下示される。
Figure 2014515040
 非対称的１、２、４、５−テトラジンが考慮される場合には、所与のＲ１及びＲ２残基の任意の組み合わせが選択され、これらは式（１３）による対称的テトラジンについて前記列記されているものである、ただし、もちろんＲ１及びＲ２は異なっている。好ましい非対称的１、２、４、５−テトラジンは、少なくとも１つの残基Ｒ１又はＲ２が電子吸引性である。いくつかの例が示される。
Figure 2014515040
 アクチベータについてのさらなる考察
１、２−ジアジン、１、２、４−トリアジン及び１、２、４、５−テトラジン、特に１、２、４、５−テトラジンが好ましいジエンアクチベータである。以下には前記アクチベータのいくつかの関連ある構造が強調され、そこで、全ての特定に応用のために適切なアクチベータを設計するために多くの選択肢があることが明らかとなる。
本発明によれば、前記アクチベータ、例えば１、２、４、５−テトラジンは、有用で有益な薬理学的及び薬理動態学的特性を持ち、これは次のことを意味する、即ち、前記アクチベータは非毒性又は少なくとも十分低い毒性であり、また十分低い毒性代謝物を生成し、生理的溶液に十分溶解性であり、薬学的に通常使用される水性又は他の処方中で使用でき、及び適切なｌｏｇＤ値を持つ（ここでこの値は、生理的ｐＨでの前記アクチベータの親水性／疎水性バランスを反映する）ということである。当該技術分野で知られているように、ｌｏｇＤ値は負（親水性分子）又は正（疎水性分子）であり得るが、ここでｌｏｇＤ値がより低い又はより高いと、それぞれの分子がより親水性又はより疎水性となる。ｌｏｇＤ値はほとんどの分子でかなり正確に予想でき、アクチベータのｌｏｇＤ値は、その設計において極性又は非極性基を加えたり除いたりして調節可能である。以下、計算されたｌｏｇＤ値（ｐＨ＝７．４）に対応するいくつかのアクチベータ設計を示す。留意すべきことは、メチル、シクロアルケン、ピリジン、アミン、アルコール又はスルフォネート基を加えること、又はフェニール基を除くことは、ｌｏｇＤ値を変更し、非常に広い範囲のｌｏｇＤ値を得ることを可能にする、ということである。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
 前記与えられたｌｏｇＤ数は、加重方法から、「ＶＧ」（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ、Ｖ．Ｎ．；Ｇｈｏｓｅ、Ａ．Ｋ．；Ｒｅｖａｎｋａｒ、Ｇ．Ｒ．；Ｒｏｂｉｎｓ、Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．、１９８９、２９、１６３−１７２）、「ＫＬＯＰ」（Ｋｌｏｐｍａｎ、Ｇ．；Ｌｉ、Ｊｕ−Ｙｕｎ．；Ｗａｎｇ、Ｓ．；Ｄｉｍａｙｕｇａ、Ｍ．：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．、１９９４、３４、７５２）及び「ＰＨＹＳ］（ＰＨＹＳＰＲＯＰ（Ｃ）データベース）法を等しく重視して、０．１ＭのＮａ＋／Ｋ＋Ｃｌ−中で水溶液にもとづいて計算された。
本発明によるアクチベータは、前記プロドラッグに適切な反応性を持ち、これは前記ジエン、特に前記１、２、４、５−テトラジンを十分電子不足にすることが可能となる。十分な反応性は、前記プロドラッグが前記アクチベータに到達するとすぐに迅速なレトロディールスアルダー反応が生じることを保証する。
本発明によるアクチベータは、優れた生体利用性を持ち、これは、意図された目的を実行するために（ヒト）身体内で利用可能であることを意味し：前記プロドラッグが前記第１ターゲットに効果的に到達することを意味する。従って、前記アクチベータは、非標的物ではない血液成分、組織に大きく接着しない。前記アクチベータは、血液中に存在するアルブミンタンパク質へ結合するように設計され得るが（血液循環時間を増加させるため）、同時に前記プロドラッグに到達することが可能な血液流から効果的に放出されるべきである。従って、血液結合及び血液放出は適切にバランスされるべきである。アクチベータの血液循環時間はまた、前記アクチベータの分子量を大きくすることで増加され得る、例えば前記アクチベータにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をつけることによる（ペグ化）。又は、前記アクチベータの前記ＰＫＰＤが、前記アクチベータに、ポリマー、タンパク質、（短い）ペプチド、炭水化物などを共役させることで変更され得る。
本発明によるアクチベータは、マルチマー性であってよく、複数のジエン部分が分子足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、特に例えば多官能性分子、炭水化物、ポリマー、デンドリマー、タンパク質又はペプチドに結合され、ここでこれらの足場は好ましくは水溶性である。使用され得る足場の例は（多官能性）ポリエチレングリコール、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、ＰＭＭＡデンロシマー、グリコール系デンドリマー、ヘパリン誘導体、ヒアルロン酸誘導体又はＨＳＡなどの血清アルブミンタンパク質である。
前記プロドラッグの位置に依存して（例えば細胞内又は細胞外；標的化される特定の器官など）前記アクチベータはこのプロドラッグに効果的に到達することができるように設計される。従って、前記アクチベータは例えば、そのｌｏｇＤ値、反応性又は電荷を変化させることで個別化され得る。前記アクチベータはさらに、標的化試薬を伴うことも可能であり（例えばタンパク質、ペプチド及び／又は糖部分）、前記第１のターゲットが受動的ではなく能動的に到達され得る。標的化試薬が使用される場合には、好ましくは、それは単純な部分である（即ち、短いペプチドや単純な糖）。
本発明によれば、異なるアクチベータの混合物が使用され得る。これは薬物の放出プロフィールを制御するために関連し得る。
本発明による前記アクチベータは前記第１のターゲットで薬物放出を生じさせ制御するが、さらに前記アクチベータに、インビトロ及び／又はインビボ研究のため又は応用のために、追加の機能を与える部分で変性させることができる。
本発明による前記アクチベータは前記第１のターゲットで薬物放出を生じさせ制御するが、さらに前記アクチベータに、インビトロ及び／又はインビボ研究のため又は応用のために、追加の機能を与える部分で変性させることができる。例えば、前記アクチベータは、蛍光部分の色素部分で変性され（例えばＳ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００８、１９、２２９７−２２９９ ｆｏｒ ３−（４−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−１、２、４、５−ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｓ ａｍｉｄａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ（ＮＩＲ） ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ＶＴ６８０）、又はイメージングプローブで機能化され得るものであり、ここでこれらのプローブはＰＥＴ又はＳＰＥＣＴなどの核イメージング技術イメージングなどのイメージングモダリティで有用であり得る。この方法で、前記アクチベータは薬物放出を引き起こすだけでなくまた、前記（ヒト）身体内部に局在化され、それにより前記プロドラッグを前記（ヒト）身体内部に局在化させるために使用され得る。従って、薬物放出の位置と量はモニターされ得る。例えば、前記アクチベータは、ＤＯＴＡ（又はＤＴＰＡ）リガンドで変性され得るが、これらのリガンドは、核イメージングのための１１１Ｉｎ３＋−イオンと錯体化するために理想的に好適なものである。他の例では、前記アクチベータは、１２３Ｉ又は１８Ｆ部分と結合され得るが、これはそれぞれＳＰＥＣＴ又はＰＥＴイメージングでの使用について確立されている。さらに、例えばＬｕ−１７７、又はＹ−９０などのベータ線放射性同位体と組み合わせて使用する際に、プロドラッグ活性化は、前標的化フォーマット内で局所的放射線治療と組み合わせることが可能である。
好ましいアクチベータは：
Figure 2014515040
 式（８ａ）及び（８ｂ）で与えられる１、２、４、５−テトラジンであり、ここでそれぞれのＲ１及びそれぞれのＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
他の好ましいアクチベータは
Figure 2014515040
 であり、前記アクチベータは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ＰＥＧ又はポリマーなどの望ましい部分に結合され得る。好ましくはこれらのアクチベータは次の式の一つを満たす。
Figure 2014515040
 （ここでＲ＝結合されたペプチド、タンパク質、炭水化物、ＰＥＧ、ポリマーを表す。）
プロドラッグは薬物ＤＤ及びトリガーＴＲの共役物であり、従って、トリガーから放出後治療作用が可能になる薬物を含む。かかるプロドラッグは場合により疾患標的に特異性を持つ。
プロドラッグの一般式は式（９ａ）及び（９ｂ）に示される。
Figure 2014515040
 前記部分ＹＭは、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭのいずれかであり得る；ＳＰはスペーサーであり、；ＴＲはトリガーであり、ＬＤはリンカー、及びＤＤは薬物である。
薬物が標的化試薬から放出される応用では：
ＹＭは標的化試薬ＴＴ；
式（１４ａ）：ｋ＝１；ｍ、ｒ≧１；ｔ、ｎ≧０；
式（１４ｂ）：ｋ＝１；ｍ、ｎ、ｒ≧１；ｔ≧０である。
マスク薬物がマスクされていない応用では：ＹＭはマスキング部分ＭＭ；
式（９ａ）及び（９ｂ）：ｒ＝１；ｍ≧１；ｋ、ｎ、ｔ≧０である。
前記式では単純化のための省略されいるが、ＤＤはさらに場合によりＳＰを介してＴＴ及び／又はＭＭを含むことができる。
本発明に関連するプロドラッグで使用され得る薬物は、限定されるものではないが、：抗体、抗体誘導体、抗体断片、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、抗体（断片）融合体（例えば二重特的及び三重特異的ｍＡｂ断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、同様にペプチド、ペプトイド、ステロイド、有機薬物化合物、トキシン、ホルモン、ウイルス、全細胞、ファージが含まれる。本発明が含む典型的薬物には、限定されるものではないが：二重特異的及び三重特異的ｍＡｂ断片、例えばリシンＡ、ジフテリアトキシン、コレラトキシンを含む免疫トキシンが含まれる。他の実施態様は、アウリスタチン、メイタンシン、カリケアマイシン、ディオカルマイシン、マイタンシノイドＤＭ１及びＤＭ４、アウリスタチンＭＭＡＥ、ＣＣ１０６５及びその類似体、カンプトセチンとその類似体、ＳＮ−３８及びその類似体；抗増殖／抗腫瘍薬、構成物質、サイトカイン、抗炎症性薬、抗ウイルス剤、降圧剤、化学増感剤及び放射線増感剤が含まれる。他の実施態様では、放出薬物ＤＤはそれ自体さらに薬物ＤＤを放出するように設計されたプロドラッグである。薬物は場合により、膜転移部分（アダマンチン、ポリリシン／アルギニン、ＴＡＴ）及び／又は標的化試薬（腫瘍細胞レセプターに対する）を含み、これらは場合により安定な又は不安定なリンカーで結合されている。
ＴＣＯ融合体への共役物としての使用のための薬物、及び前記アクチベータとのレトロディールスアルダー反応で放出されるべき薬物は、限定されるものではないが：細胞毒性薬物、特に癌治療で使用されるものが含まれる。かかる薬物は、一般に、ＤＮＡ損傷剤、抗代謝剤、天然物質及びそれらの類似体が含まれる。細胞毒性剤の例示的分類は、ジヒドロホーレートレダクターゼインヒビター、及びチミディレートシンターゼインヒビターなどの酵素インヒビター、ＤＮＡアルキレーター、放射線増感剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ開裂剤、抗チューブリン剤、トポイソメラーゼインヒビター、白金系薬物、アントラサイクリンファミリー薬物、ビンカ薬物、ミノマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性タキサン、レキシトロプシン、プテリジンファミリー薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、マイタンシノイド、識別導入剤及びタキソールが含まれる。これらの分類で特に有用なものは、例えば、デュオカルマイシン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシルＤＮＡマイナーグルーブバインダー、６−メルカプトプリン、サイトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトマイシンＣ、ミトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体（エトポシド又はエトポシドフォスフェート）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトセシン、カリキアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン及びそれらの類似体を含む。
例示的薬物は、ドラスタチン及びその類似体を含みこれには：ドラスタチンＡ（米国特許第４、４８６、４１４号）、ドラスタチンＢ（米国特許第４、４８６、４１４号）、ドラスタチン１０（米国特許第４、４８６、４４４号、５、４１０、０２４号、５、５０４、１９１号、５、５２１、２８４号、５、５３０、０９７号、５、５９９、９０２号、５、６３５、４８３号、５、６６３、１４９号、５、６６５、８６０号、５、７８０、５８８号、６、０３４、０６５号、６、３２３、３１５号）、ドラスタチン１３（米国特許第４、９８６、９８８号）、ドラスタチン１４（米国特許第５、１３８、０３６号）、ドラスタチン１５（米国特許第４、８７９、２７８号）、ドラスタチン１６（米国特許第６、２３９、１０４号）、ドラスタチン１７（米国特許第６、２３９、１０４号）、及びドラスタチン１８（米国特許第６、２３９、１０４号）が含まれ、これらの特許文献の全内容は全て参照されて本明細書に援用される。
本発明の例示的実施態様では、前記薬物部分は、マイトマイシン、ビンカアルカロイド、タキソール、アントラサイクリン、カリケアマイシン、メイタンシノイド又はアウリスタチンである。
理解されるべきことは、本発明の共役物を製造する目的で、前記化合物の反応をより簡便にするために化学変性がまた、望ましい化合物になされ得る、ということである。前記ＴＣＯへカップリングさせるアミン官能基を含む薬物は、ミトマイシン−Ｃ、ミトマイシン−Ａ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、９−アミノカンプトセチン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）１、２−ジメタンスルフォニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、ドラスタチン（アウリスタチンを含む）及びその誘導体を含む。
ＴＣＯにカップリングするためのヒドロキシ官能基を含む薬物は、エトプシド、カンプトセチン、タキソール、エスペラミシン、１、８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４−９−ジエン−２、６−ジイイン−１３−オン（米国特許第５、１９８、５６０号）、ポドフィロトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルフォリン−ドキソルビシン、ｎ−（５、５−ジアセトキシ−ペンチル）ドキソルビシン及びその誘導体を含む。
ＴＣＯへカップリングするためのスルフヒドリル官能基を含む薬物は、エスペラマイシン及び６−メルカプトプリン及びその誘導体である。
理解されるべきことは、前記薬物は場合により、リンカーＬＤ又は自壊性リンカーＬＤ、又はこの組み合わせを介して結合され得るものであり、複数のユニットを含む（自壊性又は非自壊性）、ということである。
理解されるべきことは、１又は複数の標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭが、場合により、スペーサーＳＰを介して薬ＤＤ、トリガーＴＲ又はリンカーＬＤに結合され得る。
いくつかの薬物は、薬物標的化及び放出を測定するためにイメージング可能なラベルで置換され得る。
本発明のさらなる具体的な実施態様によれば、前記プロドラッグは次のように選択される、即ち、癌、炎症、感染、心血管疾患（例えば血栓アテローム性動脈硬化症）、低酸素（例えば心筋梗塞）、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、器官及びレポーター遺伝子／酵素などの疾患に標的化又は対処するように選択される。
ひとつの実施態様によると、前記プロドラッグ及び／又はアクチベータは、マルチマー性化合物であり、複数の薬物及び／又は生体直交型反応部分を持ち得る。これらのマルチマー性化合物は、ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ポリマー粒子又は他のポリマー性構成物であり得る。
前記プロドラッグでは、薬物ＤＤ及びトリガーＴＲ−前記ＴＣＯ誘導体−は直接お互いに結合される。れらはまた、お互いに、リンカー又は自壊性リンカーＬＤを介して結合され得る。理解されるべきことは、本発明は、ジエノフィルトリガーが前記薬物に結合される全ての考え得る方法を含む、ということである。このことは、選択的な標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭをプロドラッグへ接続するためについても同様である。例えばタンパク質の場合にリジン又はシステインなどの反応性アミノ酸を介してこれらの薬物へ効果的に共役させる方法は、当業者に知られている。
理解されるべきことは、前記薬物部分は、前記薬物が、前記レトロディールスアルダー付加物の形成後、最終的に放出されるようにＴＣＯに結合される、ということである。一般的には、このことは、前記薬物とＴＣＯ間の結合、又はリンカーＬＤの場合には前記ＴＣＯと前記リンカーＬＤ、との間の結合、又は自壊性ＬＤ、この場合には前記リンカーとＴＣＯ間の結合及び前記薬物と前記リンカーの間の結合は、開裂可能であるべきであることを意味する。主に、前記薬物と場合によるリンカーはヘテロ原子、好ましくはＯ、Ｎ、ＮＨ、又はＳを介して結合される。記開裂結合は、好ましくは、カーバメイト、チオカーバメイト、カーボネート、エーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、チオエステル、スルホキシド及びスルホンアミド結合である。
従って、本発明では、リンカー概念は当業者に同様に適用され得るものである。ほとんどの報告されたプロドラッグは、３つの成分からなり：トリガー、親薬物、場合により標的化分子が前記リンカー又はトリガーに結合されている。前記トリガーは、例えばサイト特異的酵素であってよく、又はｐＨ不安定基であってよく、しばしば自己脱離リンカーを介して前記親薬物に結合されている。このリンカーは、前記トリガーの酵素的開裂を容易にし、活性サイトへの接近を改善し、結合薬物からの立体障害を低減するために導入される。またリンカーは、同じトリガーと組み合わせてプロドラッグの広い範囲の簡単な使用を容易にする。さらには、前記リンカーはプロドラッグ安定性、薬理学的動力学、器官分布、酵素認識及び放出動力学を変更する。トリガー活性化／除去後、前記リンカーは同時に脱離して前記親薬物を放出することが必要である。結合された薬物に依存して前記リンカー又はその部分は、その作用を損なうことなく薬物上に残り得る。一般的概念がスキーム２に示される。
スキーム２：
Figure 2014515040
 自己脱離リンカーの２つのタイプが区別され、（ａ）電子カスケードリンカーと、（ｂ）環化リンカーである。カスケードリンカーの最も有望な例は、スキーム３で示される、β−グルクロニドプロドラッグ抗癌剤９−アミノカンプトセシンにおける、１、６−脱離スペーサーである。酵素β−グルクロニダーゼ（ある壊死腫瘍領域に存在する）による芳香族性ヒドロキシ官能基の脱マスク後、この基は電子供与基となり、電子カスケードを起こして、前記脱離基を放出し、ＣＯ２を放出した後遊離薬物を放出する。キノン−メチド再配列に基づくカスケードは、また、マスクされていないアミンまた、ヒドロキシル基の代わりのチオール基の孤立電子対により引き起こされ得る。形成されるキノン−メチド種は、水に捕捉されフェニール誘導体を形成する。
スキーム３：
Figure 2014515040
 いくつかの他のトリガー−リンカー概念がスキーム４に示される。Ａ内の前記トリガーは血漿エステラーゼで活性化される。ｔｅｒｔ−ブチルエステルの加水分解は遊離の芳香族性ヒドロキシル基を与え、キノン−メチドカスケードを開始させる。この構成物は、抗体（Ｒ）への共役により標的化された。Ｂでは、セファロスポリンの、β−ラクタマーゼ酵素により加水分解がトリガーとして使用される。ラクタム環の加水分解は、その脱離基の性質により前記置換薬物基を放出させ得る。薬物は、エステル、アミド、スルフィド、アミン及びカーバメートリンクにより共役された。芳香族性環化系リンカーの２つの例はＣ及びＤである。Ｃでは、ペニシリンＧ−アミダーゼにより開裂が、前記カルボニルへのアミンの攻撃を起こさせ薬物を放出させる。Ｄは、ホスファターゼ感受性プロドラッグを示す。ヒトアルカリホスファターゼによるリン酸エステル開裂は、ヒドロキシルを与え、ラクタムと反応して薬物を放出させる。Ｅでは、ニトロ基のアミン基への還元により引き起こされるプロドラッグの例を示す。この還元は、ＮＡＤＰＨの存在下でニトロレダクターゼにより実行され得る。他のプロドラッグ治療で使用されるトリガーは、プラスミン、チロシンヒドロキシラーゼ（神経芽細胞腫に高発現）、チロシナーゼ又はカセプシンＢに感受性である。さらに、低酸素（腫瘍）組織で還元される知られた（Ｆ）いくつかのヘテロ環ニトロ構成物が、それにより酵素の助けなくカスケードを開始し得る。
スキーム４：Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ
Figure 2014515040
 ＴＣＯトリガーとアクチベータの組み合わせと反応
前記薬物はリンカーを介しても介していなくても、好ましくは、前記ＴＣＯ環の二重結合に隣接する炭素結合の結合される。
以下、ＴＣＯプロドラッグとテトラジンアクチベータのいくつかの限定的でない組み合わせが、カスケード脱離反応由来の前記レトロディールスアルダー付加物からの薬物放出の可能性を示す。アミン官能性薬物の放出の場合には、これは、例えば一級又は二級アミン、アニリン、イミダゾール又はピロールタイプの薬物であり、前記薬物は脱離基の性質により変わる、ということである。対応する加水分解に安定なＴＣＯプロドラッグの場合に適用され得る他の官能基を持つ薬物放出はまた可能である（例えばチオール官能基化薬物）。示される縮合環生成物は、他のより好ましい互変異性であってもよく、そうでなくてもよい。
Figure 2014515040
 ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、前記付加物からアミン官能基化薬物を放出する。前記テトラジンアクチベータは対称的であり、電子不足である。
Figure 2014515040
 ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、前記付加物からアミン官能基薬物を放出させる。記テトラジンアクチベータは非対称的であり電子不足である。留意すべきことは、非対称的テトラジンの使用は、レトロディールスアルダー付加物レジオマーを形成することであり、これは対称的テトラジンを使用する場合に既に形成される立体異性体とは異なる、ということである。
Figure 2014515040
 ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、前記付加物からアミン官能基薬物を放出させる。前記テトラジンアクチベータは対称的であり電子十分である。
標的化（ターゲット化）
本発明のキット及び方法は、薬物の標的化送達への使用に非常に適する。
本発明で使用される「第１の標的」は、治療のための標的化試薬の標的に関する。例えば、第１の標的は、有機体、組織又は細胞に存在する分子であり得る。標的には、細胞標的が含まれ、例えばレセプター、糖タンパク質；構造タンパク質、例えばアミロイドプラーク；間質、細胞外マトリックス標的（例えば成長因子及びプロテアーゼ）などの豊富な細胞外標的；例えばゴルジ体表面、ミトコンドリア表面の細胞表面内標的、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞信号伝達系経路成分；及び／又は身体外部、例えばウイルス、細菌、真菌、酵母又はそれらの断片が含まれる。第１の標的の例は、例えばタンパク質であり、その存在又は発現量がある組織や細胞型に関連し、又はその発現量がある疾患でアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされているタンパク質である。本発明の具体的な実施態様によると、前記第１の標的は、（内在性又は非内在性）レセプターなどのタンパク質である。
本発明によると、前記第１の標的は、ヒト又は動物身体内の、又は病原体又は寄生虫の任意の好適な標的から選択され得るものであり、例えば、細胞膜及び細胞壁などの細胞、細胞膜レセプターなどのレセプター、ゴルジ体又はミトコンドリアなどの細胞内構造物、酵素、レセプター、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイリス又はウイリス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチンレセプター、モノアミンオキシダーゼ、ムスカリニンレセプター、心筋交感神経神経系、ロイコサイトなどのロイコトリエンレセプター、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（μＰＡＲ）、ホレートレセプター、アポトーシスマーカー、（抗体−）血管新生マーカー、ガストリンレセプター、ドパミン作動系、セロトニン作動系ＧＡＢＡ作動系、アドレナリン作動系、コリン作動系、オピオイドレセプター、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター及び他の血栓関連レセプター、フィブリン、カルシトニンレセプター、タフシンレセプター、インテグリンレセ、フィブロネクチン、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ及びＶＥＧＦ／ＥＧＦレセ及び、ＴＡＧ７２、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＴｅｎａｓｃｉｎＣ、メラノコルチン−１レセプター、ＣＤ４４ｖ６、Ｇ２５０、ＨＬＡＤＲ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、メソテリン、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌ−セレクチンレセプター、ＬＤＬレセプター、Ｐ−糖タンパク質、ニューロテンシンレセプター、ニューロタンパク質レセプター、物質Ｐレセプター、ＮＫレセプター、ＣＣＫレセプター、シグマレセプター、インターロイキンレセプター、ヘルペスシンプレクスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼ、から選択される。前記列記された第１の標的の具体的な標的化を可能にするために、前記標的化試薬ＴＴは、限定されるものではないが、次の、抗体、Ｆａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、ＶＨＨ、抗体（断片）融合（例えば二特異的及び三特異的ｍＡｂ断片）、タンパク質、オクトレオチドなどのペプチド及びその誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣物、炭水化物、単糖類、多糖類、ウイルス、全細胞、薬物、ポリマー、リポソーム、薬物治療剤、レセプターアゴニスト及びアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイドを含む化合物を含み得る。本発明の範囲に含まれる有機化合物の例は、エステラジオール、アンドロゲン、プロゲストロン、コルチコステロイド、メトトレキサート、葉酸及びコレストロールなど、又はこれらから誘導される。好ましい実施態様では、前記標的化試薬ＴＴは抗体である。本発明の具体的な実施態様によると、前記第１の標的は、レセプターであり、前記第１の標的に特異的に結合し得る標的化試薬が使用される。好適な標的化試薬は、限定されるものではないが、レセプター又はその部分などのリガンドであり、前記部分はなお前記レセプターに結合し得るものであり、例えば、レセプター結合タンパク質リガンドの場合にはレセプター結合ペプチドである。標的化試薬の他の例は、例えば前記第１の標的と相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。タンパク質性の標的化試薬の他の例は、例えばアルファ、ベータ及びガンマインターフェロン、インターロイキンなどのインターフェロン、及び例えばアルファ、ベータ腫瘍成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などのタンパク質成長因子、μＰＡＲ標的化タンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン及びアンジオスタチンなどのタンパク質成長因子を含む。標的化試薬の他の例は、例えば前記第１の標的と相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。
本発明のさらに具体的な実施態様によると、前記第１の標的化試薬は、癌、炎症、感染、例えば血栓などの心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脳卒中などの低酸素サイト、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管形成、臓器、及びレポーター遺伝子／酵素などの組織又は疾患の結果又は特異的増加の結果となるように選択される。これは、組織、細胞又は疾患特異的発現を持つ第１の標的を選択することで達成され得る。例えば、膜葉酸レセプターは、メトキシレートなどの葉酸及びその類似体の細胞蓄積を媒介する。発現は正常細胞では制限されているが、種々の腫瘍細胞型では過剰発現されている。
マスキング部分
マスキング部分ＭＭは、タンパク質、ペプチド、ポリマー、ポリエチレングリコール、炭水化物、有機構成物であり、これらはさらに結合された薬物ＤＤ又はプロドラッグを封止する。この封止は、例えば立体障害に基づくものであり得るがまた、前記薬物ＤＤとの非共役結合相互作用に基づくものであり得る。かかるマスキング部分はまた、ＤＤ又はプロドラッグのインビボでの性質（例えば血液からの除去；免疫系による認識）に影響するために使用され得る。
スペーサー
スペーサーＳＰは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、２から２００、好ましくは３から１１３、及び特に好ましくは５から５０の繰り返し単位を持つ。他の例は、生体ポリマー断片であり、例えばオリゴ又は多糖類又はポリアクチドである。さらには好ましい例は実施例１１に示される。
投与
本発明において、前記プロドラッグは通常は最初に投与され、ある時間後に前記プロドラッグが第１の標的に到達する。この時間間隔は応用により異なり、分から日又は週にわたる。選択された時間が経過した後、前記アクチベータが投与され、これは前記プロドラッグを見つけて反応し、それにより前記第１の標的で薬物を活性化し放出する。
本発明の組成物は、静脈注射、腹腔内注射、経口投与、直腸投与及び吸入により投与され得る。これらの投与形に好適な製剤は当業者に知られている。本発明によるプロドラッグ又はアクチベータは、薬学的に許容され得るキャリアと共に投与され得る。前記処方物は、投与方法に適合化されるべきである。ここで使用され得る好適な薬物キャリアは、医学的又は獣医学的目的の好適には毒性でなく許容されないものではない。かかるキャリアは当業者にはよく知られており、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせを含む。
理解されるべきことは、例えばプロドラッグやアクチベータなどの投与される化学物質は、その塩、水和物又は溶媒和などの前記化学物質の化学的機能を変化させない、変性物であり得るということである。
前記プロドラッグ投与後、かつ前記アクチベータ投与の前に、循環中のプロドラッグ活性化が望ましくない場合及び天然プロドラッグ除去が不十分である場合には、過剰のプロドラッグを除去剤の手段に除去することが好ましい。除去剤は、過剰物が循環系から除去される投与された試薬に結合又は錯体形成させる目的で被験者に投与される試薬、化合物又は部分である。前記除去剤は、循環系から除去するために向けられる得るものである。本発明においては、循環系のプロドラッグを除去するための除去剤は、前記のようにジエン部分を持ち、前記プロドラッグのＴＣＯ部分と反応し得るものである。これは一般的には、肝臓レセプター系機構により達成され得るが、循環系から分泌される他の方法も当業者には知られている。
以下の実施例は、本発明の側面を説明するものであり、本発明の範囲又は特許請求の範囲を定め又は限定するものではない。
方法
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ（１Ｈ−ＮＭＲは１００ＭＨｚで、１３Ｃ−ＮＭＲは４００ＭＨｚで測定）スペクトル装置を用いて２９８Ｋで測定した。化学シフトは室温で、ＴＭＳから低磁場ｐｐｍで表した。分裂については次の略号を使用した、即ち、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット及びｂｒ＝ブロードである。Ｉｒスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ１６００ＦＴ−ＩＲ（ＵＡＴＲ）で測定した。ＬＣ−ＭＳは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ ＡＤ ＶＰシリーズＨＰＬＣで、ダイオードアレイ検出器（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡ Ｐｌｕｓ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＩｏｎ−Ｔｒａｐ（ＬＣＱ Ｆｌｅｅｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。分析は、Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｌｌｔｉｍａ ＨＰＣ１８３μカラムを用いて、注入容量１−４μＬとし、流速は０．２ｍＬ／分及び通常は、２５℃で、Ｈ２Ｏ中ＣＨ３ＣＮ（共に０．１％ギ酸を含む）のグラジエント（５％から１００％へ１０分間で、１００％でさらに３分間保持）を用いて行った。分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ５μＣ１８１１０Ａカラムで、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰと２つのＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−８Ａポンプ及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０ＡＶ ＶＰ紫外−可視光検出器を用いて行った。サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００システムとＧａｂｉ放射線検出器を用いて行った。前記サンプルは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で０．３５〜０．５ｍＬ／分で溶出させた。ＵＶ波長は２６０ｎｍと２８０ｎｍに設定した。抗体溶液の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３２２ｎｍ及び２８０ｎｍでのそれぞれの吸光度から決定された。
材料
全ての試薬、化学物、材料及び溶媒は、市販品から入手しそのまま使用した：重水化溶媒は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから；及び試薬、化学物、材料及び溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、ＡＢＣＲ、Ｍｅｒｃｋ及びＦｌｕｋａから入手した。全ての溶媒は、ＡＲ品質であった。４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−２、６−ジメチルフェノールは文献に従って合成した（Ｙ．Ｈ．Ｃｈｏｅ、Ｃ．Ｄ．Ｃｏｎｏｖｅｒ、Ｄ．Ｗｕ、Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｙ．Ｇｅｒｖａｃｉｏ、Ｖ．Ｂｏｒｏｗｓｋｉ、Ｍ．Ｍｅｈｌｉｇ、Ｒ．Ｂ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ２００２、７９、５５−７０）。ドキソルビシン塩化水素はＡｖａｃｈｅｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
実施例１：
テトラジンアクチベータの合成
一般的手順
以下詳細に説明するテトラジンとは別に一連のテトラジンを合成した。ピナー型反応が使用され、適当なニトリルをヒドラジンと反応させ、ジヒドロ１、２、４、５−テトラジン中間体を合成した。当業者に知られているようにニトリルの代わりにアミジンを反応物として使用した。この反応で硫黄の使用は、ある場合にはこれによりジヒドロ１、２、４、５−テトラジンの形成を促進することが知られている。この中間体の酸化によりテトラジンジエンアクチベータが得られる。以下の反応は、いくつかのテトラジンの合成及び、いくつかの可能なテトラジンの合成と単離を説明する（例えば、溶媒、濃度、温度、反応物の当量、酸化反応の選択など）。当技術分野で知られる他の方法も、他のアクチベータを合成するために使用され得る。
３、６−ビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（２）の合成
Figure 2014515040
 ２−シアノピリジン（１０．００ｇ、９６．０ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１５．１ｇ；３００ｍｍｏｌ）を一晩不活性雰囲気下で９０℃で撹拌した。濁った混合物を室温に冷却し、ろ過して残渣を続いて水（２０ｍＬ）及びエタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、さらに真空で乾燥しで、粗ジヒドロテトラジン１をオレンジ色固体として得た（７．３５ｇ；６５％）。
前記ジヒドロテトラジン（１、１００ｍｇ；０．４１９ｍｍｏｌ）を酢酸（３ｍＬ）に分散させ、次に亜硝酸ナトリウム（８７ｍｇ；１．２６ｍｍｏｌ）を添加した。すぐにオレンジ色から暗赤色への変化が観測され、酸化生成物をろ過して単離された。前記残渣を水（１０ｍＬ）で洗浄し、次に真空乾燥して、紫色固体として表題の化合物を得た（２、９２ｍｇ；９３％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝９．００（ｄ、２Ｈ）、８．７６（ｄ、２Ｈ）、８．０２（ｔ、２Ｈ）、７．６０（ｄｄ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６３．９、１５１．１、１５０．１、１３７．５、１２６．６、１２４．５ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２３７．００（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２９６及び５２８ｎｍ。
３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（５）の合成
Figure 2014515040
 ２−シアノピリジン（５．００ｇ、４８．０ｍｍｏｌ）、５−アミノ−２−シアノピリジン（５．７２ｇ；４８．０ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１５．１ｇ；３００ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で９０℃で一晩撹拌した。濁った混合物を室温に冷却し、ろ過し、及び残渣を水（２０ｍＬ）及びエタノール（２０ｍＬ）で洗浄し真空で乾燥した。オレンジ色の固体をアセトン（２００ｍＬ）に分散させ、これをシリカゲル（２０グラム）に吸収させ、次にアセトンとヘプタンのグラジエント（０％から７０％）を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、ジヒドロテトラジン３を、オレンジ色固体として得た（１．４６ｇ；収率１２％）。
前記ジヒドロテトラジン（３、９０ｍｇ；０．３５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解し、次に無水アセトン（５４．４ｍｇ；０．５３３ｍｍｏｌ）を加えた。前記溶液を加熱して、１８時間不活性雰囲気下で還流させた。オレンジ色沈殿をろ過して分離し、ＴＨＦ（３ｍＬ）で洗浄してジヒドロテトラジンのアセタミドを得た（４、９０ｍｇ；収率８６％）。
アセタミド４（５０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を酢酸（１ｍＬ）に分散させ、次の亜硝酸ナトリウム（３５ｍｇ；０．５０８ｍｍｏｌ）を添加した。すぐにオレンジ色から暗赤色への変化が観測され、前記酸化生成物をろ過して分離した。前記残渣を水（５ｍＬ）で洗浄し、次の真空で乾燥して、表記の化合を紫色固体として得た（５、４２ｍｇ；８４％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．０３（ｄ、１Ｈ）、８．９３（ｄ、１Ｈ）、８．６１（ｄｄ、２Ｈ）、８．４２（ｄｄ、１Ｈ）、８．１６（ｄｔ、１Ｈ）、７．７３（ｄｄ、１Ｈ）、２．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６９．５、１６３．０、１６２．８、１５０．６、１５０．２、１４３．８、１４１．２、１３８．５、１３７．８、１２６．６、１２６．１、１２４．９、１２４．２、２４．１ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２９３．９（Ｍ＋Ｈ＋）、lｍａｘ＝３２３及び５２９ｎｍ．
３−（２−ピリジン）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７）の合成
Figure 2014515040
 ２−シアノピリジン（５００ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、アセタミジン塩化水素（２．００ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）及び硫黄（１５５ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）で、アルゴン不活性雰囲気下撹拌した。ヒドラジン水和物（２．７６ｇ；５５．２ｍｍｏｌ）を添加し、次に混合物を２０℃で一晩撹拌した。濁った混合物をろ過し、ろ液を蒸発乾燥させてオレンジ色固体粗生成物６を収量２．９ｇ得た。
続いて、６（８００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）と酢酸（４ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。水（３ｍＬ）中のＮａＮＯ２（２．０ｇ；２９．０ｍｍｏｌ）溶液を０℃で添加した。すぐに赤／紫色懸濁物への変化を観測した。０℃で撹拌５分後、クロロホルムを添加した。紫色クロロホルム層を２回水で洗浄し次に濃縮した。固体残渣を、１：１のクロロホルムとヘキサンの混合物中で撹拌し、次にろ過した。ろ液を濃縮し、溶出液としてクロロホルム／アセトン混合物を用いて粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、精製生成物（７、４８ｍｇ、２−シアノピリジンから計算した合計収率２１％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．９６（ｄ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、１Ｈ）、７．９９（ｔ、１Ｈ）、７．５６（ｄｄ、１Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６８．１、１６３．６、１５０．９、１５０．３、１３７．４、１２６．３、１２３．９、２１．４ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラフィーでゃ１ｔのピーク、ｍ／ｚ＝１７４．３（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２７４及び５２４ｎｍ．
３、６−ビス（２−アミノフェノール）−１、２、４、５−テトラジン（９）の合成
Figure 2014515040
 ２−アミノベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６ｍｍｏｌ）をエタノール（３ｍＬ）中に溶解し、及びヒドラジン水和物（２．０６ｇ；４１．２ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を０℃に冷却し、硫黄（０．１７ｇ；５．３０ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を１５分間続け、次に前記混合物を９０℃に加熱した。３時間後、黄色沈殿を過で分離し、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、次にクロロホルムで２回取り出し（２回、１０ｍＬ）て黄色中間物８（３４３ｍｇ、３０％）を得た。
中間物８（１０５ｍｇ；０．３９４ｍｍｏｌ）をエタノール（１５ｍＬ）に溶解し、次に５０℃でこの溶液中に酸素を吹き込んだ。数分で意図が黄色から暗オレンジ／赤色に変化し沈殿が生成した。２時間後、沈殿をろ過し、エタノールで洗浄し、乾燥して前記生成物９を暗赤色結晶として得た（８９ｍｇ、８６％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．３９（ｄ、２Ｈ）、７．３２（ｔ、２Ｈ）、７．０４（ｓ、４Ｈ）、６．９３（ｄ、２Ｈ）、６．７５（ｔ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．７、１４９．６、１３３．０、１２９．０、１１７．１、１１５．８、１１１．６ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラフィーで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．４（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２３７、２９３、４０３及び５３５ｎｍ。
３、６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１１）の合成
Figure 2014515040
 ４−ヒドロキシベンゾニトリル（１．０６ｇ；８．９０ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（３．０９ｇ；６１．７ｍｍｏｌ）に溶解し、前記混合物を９０℃で１６時間加熱した。黄色沈殿をろ過して水（２５ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）で洗浄して粗生成物中間物１０を黄色粉末として得た（８７０ｍｇ；６２％）。
前記中間物（１０、１７３ｍｇ；０．６４５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中に懸濁させ、この混合物中に５０℃で酸素を吹き込んだ。色は、数分で黄色から暗オレンジ／赤色に変化した。６時間後、沈殿をろ過し、エタノールで洗浄し、乾燥して生成物１１を暗赤色結晶として得た（１３６ｍｇ、８０％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．３５（ｂｒ．ｓ、２Ｈ）、８．３６（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．６、１６１．５、１２９．２、１２２．６、１１６．３ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６７．１（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２３５、３３０及び５３５ｎｍ。
３、６−ビス（４−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１３）の合成
Figure 2014515040
 ４−アミノベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６ｍｍｏｌ）をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、次にヒドラジン水和物（２．１２ｇ；４２．２ｍｍｏｌ）と硫黄（０．１７６ｇ；５．５ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を９０℃で９０分間加熱し、黄色沈殿をろ過して分離し、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、次にアセトン（１２ｍＬ）で取り出して黄色中間物１２を得た（１９０ｍｇ、１７％）。
中間物１２（５０ｍｇ；０．１８８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、次にこの溶液中に酸素を２０℃で吹き込んだ。５分後、反応混合物を食塩水（１３ｍＬ）に入れて、沈殿をろ過して分離し、さらにアセトン（１５ｍＬ）で取り出し精製して生成物１３を赤色固体として得た（１３．７ｍｇ、２７％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．１７（ｄ、２Ｈ）、７．７５（ｄ、２Ｈ）、６．０２（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．３、１５２．８、１２８．５、１１８．３、１１３．８ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラフィーで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２４１、３７０及び５３０ｎｍ。
３、６−ビス（３−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１５）の合成
Figure 2014515040
 ３−アミベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６０ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（２．５０ｍＬ；５１．４ｍｍｏｌ）に溶解し、次に混合物を９０℃で３日間加熱した。
水（５ｍＬ）を添加し、次に黄色沈殿をろ過して分離し、水（１５ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）で洗浄して粗中間物１４を黄色粉末として得た（９１０ｍｇ；８１％）。
中間物１４（５０ｍｇ；０．１８８ｍｍｏｌ）をエタノール（４ｍＬ）中に懸濁させ、次にこの混合物中に５０℃で酸素を吹き込んだ。数分で黄色から赤色に色変化した。１６時間後、沈殿をろ過して分離し、エタノールで洗浄して生成物１５を赤色粉末として得た（３１ｍｇ、６２％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．７７（ｓ、２Ｈ）、７．６６（ｄ、２Ｈ）、７．３０（ｔ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、２Ｈ）、５．５３（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラフで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２４０、２９６及び５２７ｎｍ。
３、６−ビス（アミノメチル）−１、２、４、５−テトラジン（２０）の合成
Figure 2014515040
 Ｂｏｃ−アミノアセトニトリル（１．００ｇ；６．４０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（２５％ＭｅＯＨ中０．１４５ｍＬ；０．６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１８時間撹拌し、次に塩化アンモニウム（０．３４ｇ；６．４０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２０℃で３日間撹拌した。前記溶液をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で沈殿させ、次に沈殿をろ過して集め、洗浄し乾燥させてアミジン塩化水素１７を得た。
前記アミジン塩化水素（１７、２４１ｍｇ；１．１５ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（３ｍＬ；６１．９ｍｍｏｌ）に溶解し、次に前記溶液を２０℃で１６時間撹拌した。次にこれを水（１０ｍＬ）で希釈し、沈殿を遠心分離で集めて乾燥した。無色固体を酢酸（１．５ｍＬ）に溶解して、次に亜硝酸ナトリウム（２８ｍｇ；０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。ピンク色混合物を１５分間撹拌し、次にクロロホルム（１５ｍＬ）及び飽和炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）を添加した。オレンジ色層を分離し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、次に蒸発させて乾燥してＢｏｃ−保護化テトラジンをピンク色固体として得た（１９、７０ｍｇ；３５％）。この化合（１２ｍｇ；０．０３５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解して、次ぎにＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。混合物を１５分間撹拌して、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で沈殿させた。ピンク色沈殿をろ過して分離し、洗浄、乾燥して表題の化合をＴＦＡ塩として得た（２０、１０ｍｇ、７８％）。
１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝５．０６（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝１６４．５、４１．１ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝１４１（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２６７及び５１７ｎｍ。
２、２’、２’’−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７−トリイル）三酢酸（２７）及び２、２’、２’’−（１０−（２−オキソ−２−（１１−オキソ−１１−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ウンデシルアミノ）エチル）−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７−トリイル）三酢酸（２８）の合成
Figure 2014515040
 ５−アミノ−２−シアノピリジン２１（１．０２ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸２２（０．９９ｇ；４．３０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．７７ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０５ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、及びＰＰＴＳ（０．３７ｇ；１．４７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５ｍＬ）中に懸濁させた。混合物を室温で１８時間撹拌し、温度を上げて乾燥させ、次にアセトニトリル（２０ｍＬ）中で撹拌した。沈殿をろ過して除き、次にろ液を蒸発させて乾燥し、クロロホルム（２０ｍＬ）に溶解して、次に水溶液クエン酸（１５ｍＬ０．５Ｍ）、水溶性炭酸水素カリウム（１５ｍＬ、１Ｍ）及び水（１５ｍＬ）のそれぞれで洗浄した。得られたオレンジ層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）で精製して生成物２３を白色固体として得た（０．９５ｇ；６１％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ１７Ｈ２５Ｎ４Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３３３．１９、Ｆｏｕｎｄ：３３３．１７。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ１７Ｈ２５Ｎ４Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３３３．１９、実測値：３３３．１７。
Ｔｅｒｔ−ブチル６−（６−シアノピリジン−３−イルアミノ）−６−オキソヘキシルカーバメート２３（０．７０ｇ；２．１ｍｍｏｌ）、２−シアノピリジン（０．８７ｇ；８．４ｍｍｏｌ）、ヒドラジン水和物（１．２５ｇ；２０ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解し、次に硫黄（０．２２ｇ；７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を７０℃で、アルゴン不活性雰囲気下で２時間撹拌し、次に５０℃で１６時間撹拌した。オレンジの懸濁物をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈し、次に得られた溶液を水（２回、１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／アセトン＝４：１）で精製して。生成物２４をオレンジ色固体として得た（０．６５ｇ；６６％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ２３Ｈ３１Ｎ８Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：４６７．２５、実測値：４６７．３３。
Ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２−ジヒドロ−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカーバメート２４（０．３０ｇ；０．６４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、酢酸（２ｍＬ）を添加した。亜硝酸ナトリウム（０．２５ｇ；３．６２ｍｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解、滴下した。赤色溶液を水溶性炭酸水素カリウム（５０ｍＬ；１Ｍ）に入れて、次に生成物をクロロホルム（５０ｍＬ）で抽出した。オレンジ色層を水（５０ｍＬ）で洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させて、生成物を紫固体として得た（０．２５ｇ；８３％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ２３Ｈ２９Ｎ８Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：４６５．２３、実測値：４６５．４２。
ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカーバメート２５（６６ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）を（６ｍＬ）に溶解し、次にＴＦＡ（６ｍＬ）を添加した。溶液を室温で２時間撹拌し、次に蒸発乾燥させて生成物２６をＴＦＡ塩として得た（５２ｍｇ；１００％）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ１８Ｈ２１Ｎ８Ｏ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３６５．１９、実測値：３６５．３３。
６−アミノ−Ｎ−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）ヘキサンアミド２６（５２ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に溶解し、次にＤＩＰＥＡを添加した（３２０ｍｇ；２．０ｍｍｏｌ）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＤＯＴＡ（１６１ｍｇ；０．２ｍｍｏｌ）を添加し、次に混合物を室温で５時間撹拌した。溶液を蒸発乾燥させ、粗生成物をアセトニトリルと水の混合物に溶解し、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、精製された紫生成物２７を、ピンクの綿状固体として得た（８０ｍｇ、収率７６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中３０％アセトニトリル−ｄ３）：δ＝８．９０（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、８．６８（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．６０（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．３１（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．２４（ｔ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．８２（ｔ、１Ｈ、ＡｒＨ）、３．８０（ｂｒｓ、６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．７２（ｂｒｓ、２Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＮＨ）、３．３４−３．２３（ｂｒｍ、１８Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、２．４９（ｔ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２）、１．７０（ｍ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）、１．５９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、１．４１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中３０％アセトニトリル−ｄ３）：δ＝１７５．５、１７１．５（ｂｒ）、１６２．６、１６２．５、１５０．１、１４８．１、１４２．９、１４１．６、１３９．６、１３８．４、１２８．０、１２７．９、１２５．４、１２４．８、５５．４、５４．３（ｂｒ）、４９．４（ｂｒ）、３９．４、３６．５、２８．２、２５．９、２４．６ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ、Ｃ３４Ｈ４７Ｎ１２Ｏ８ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：７５１．３７；実測値［Ｍ＋Ｈ］＋７５１．５８、［Ｍ＋Ｎａ］＋７７３．５０、［Ｍ＋２Ｈ］２＋３７６．４２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋２５１．３３。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝３２６３、３０９４、２９４１、２８６２、１６６７、１６３７、１５８２、１５４０、１４６０、１４３１、１３９５、１３２４、１２９６、１２７２、１２５１、１２２６、１１９８、１１２８、１０８７、１０６０、１０２０、９９２、９７７、９２０、８６０、８３１、７９８、７８２、７４２、７１８、６７９、６６３ｃｍ−１。
２８については、２、２’、２’’−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７−トリイル）三酢酸（２７）の合成と同じ合成手順を用いた。凍結乾燥後、精製生成物２８をピンク色綿状固体として得た（９０ｍｇ、収率７８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．６５（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、９．０６（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．９３（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．６１（ｔ、２Ｈ、ＡｒＨ）、８．４４（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１６（ｔ、２Ｈ、ＡｒＨ、ＮＨ）、７．７３（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、３．５１（ｂｒｓ、６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２８（ｂｒｓ、２Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＮＨ）、３．０６（ｑ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、３．３４−３．２３（ｂｒｍ、１６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、２．４３（ｔ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２）、１．６４（ｍ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、１．３８−１．２２（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２）ｐｐｍ．。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１７３．０、１７１．０（ｂｒ）、１６９．１（ｂｒ）、１６３．５、１６３．２、１５１．０、１５０．６、１４４．２、１４１．７、１３９．１、１３８．２、１２７．０、１２６．５、１２５．３、１２４．６、５７．３（ｂｒ）、５５．２（ｂｒ）、５０．７、３９．０、３６．８、２９．５、２９．４、２９．３、２９．１９、２９．１７、２９．１、２６．９、２５．３ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ計算値Ｃ３９Ｈ５７Ｎ１２Ｏ８ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：８２１．４４；実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋８４３．５８、［Ｍ＋Ｈ］＋８２１．５８、［Ｍ＋２Ｈ］２＋４１１．４２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋２７４．６７。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝３２６１、３０６７、２９２５、２８５１、１６３３、１５８３、１５４１、１４５８、１４３３、１３９４、１３２４、１２９８、１２７０、１２４９、１２２８、１２００、１１６５、１１２８、１０８８、１０５９、１０１６、９９１、９２０、８８５、８６０、８３２、７９８、７８２、７６４、７４２、７１９、６８７、６６１ｃｍ−１。
ＤＯＴＡ−テトラジンアクチベータ２９
Figure 2014515040
 前記テトラジン２９はＲｏｂｉｌｌａｒｄらにより詳細に記載されている（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、１２２、３４４７−３４５０）。これはまた、本発明のアクチベータとして使用され得る構造の一例である。１、２、４、５−テトラジン部分の２−ピリジル基の１つのアミド官能基は電気供与基であり、又両方のピリジン基は電子吸引性であると考えられている。前記テトラジンは従ってやや電子不足とみられる。
アクチベータ２９は好適な好ましい薬物的性質を示す：２９は、ＰＢＳ溶液中で安定であり、２時間以内ではほとんど分解されず、一晩インキュベーション後でもなおほとんど変化しない；マウスでは血液除去（クリアランス）が１０分である；マウスでの部分分布容量（Ｖｄ）は、細胞内に有意に入らないことから全細胞外水画分に対応する。アクチベータ２９は、ＤＯＴＡリガンドを含み、かかるリガンドは、種々のイメージングモダリティ（例えばＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ）で有用である。従って、アクチベータ２９は、薬物放出に好適のみならず、同時にイメージング目的でも使用され得る。事実、アクチベータ２９は、１１１Ｉｎ３＋と錯体化後、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングプローブとして使用されてきた。さらに詳細については、Ｒｏｂｉｌｌａｒｄらの文献を参照のこと（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、１２２、３４４７−３４５０）。
留意すべきことは、アクチベータ２７から２９に含まれるアミノ−１、２、４、５−テトラジン部分は、糖、ＰＥＧ、ポリマー、ペプチド（ＲＧＤ又はｃ−ＲＧＤなど）、タンパク質、蛍光分子又は色素分子などの一連の追加官能基と共役するために使用され得る、ということである。
実施例２
（Ｅ）−シクロオクテンモデルプロドラッグ及びプロドラッグ
（Ｅ）−シクロオクテン−２−オール（３１）、（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）、及び（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバマート（３３）の合成
Figure 2014515040
 （Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール（３１）の合成
（Ｚ）−シクロオクタ−２−エノール２０（２．３６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）及びメチルベンゾエート（１．８ｍＬ、１．９４ｇ、１４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）のジエチルエーテル／ヘプタン１：２（５００ｍＬ）溶液を３２時間照射し、一方でそれをシリカ／硝酸銀１０：１（４１ｇ）、シリカ（０．５ｃｍ）及びサンド（０．５ｃｍ）を充填したカラムを通じて連続的に導入した。前記カラムは、照射の間暗所に置かれた。前記カラムはジクロロメタン（１５０ｍＬ）で未反応出発物を溶出した。前記シリカを、ジクロロメタン／１２．５％水溶性アンモニア１：１（３ｘ１００ｍＬ）と共に撹拌した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して真空乾燥して粗生成物３１を灰色油状物として得た。前記油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ペンタン／ジエチルエーテル１０％から５０％）で精製して（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（主（ｍａｊｏｒ）異性体、第２画分、４４０ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ、２４．９％）を無色油状物として、及び（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（副（ｍｉｎｏｒ）異性体、第１画分、３２５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ、１８．４％）を無色油状物として得た。前記主ジアステレオマーは、Ｇ．Ｈ．Ｗｈｉｔｈａｍ、Ｍ．ＷｒｉｇｈｔによるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９７１、８８３に記載された、異なる経路で製造された（１ＲＳ、２ＲＳ）−トランス−シクロオクタ−２−エン−１−オールと同一である。前記副ジアステレオマーは、Ｇ．Ｈ．Ｗｈｉｔｈａｍ、Ｍ．Ｗｒｉｇｈｔが異なる経路で合成された（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９７１、８８６）（１ＳＲ、２ＲＳ）−トランス−シクロオクタ−２−エン−１−オールと同一である。副異性体：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７１−０．８２（ｍ、１Ｈ）、１．０５−１．１７（ｍ、１Ｈ）、１．４３−１．７２（ｍ、４Ｈ）、１．８０−２．０９（ｍ、４Ｈ）、２．４５−２．５２（ｍ、１Ｈ）、４．６１（ｓ、１Ｈ）、５．５４−５．６１（ｍ、１Ｈ）、５．９０−６．００（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２３．３５、２９．４２、３６．０８、３６．２７、４３．４０、７１．４０、１３０．７８、１３５．３９ｐｐｍ。主異性体：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．６４−０．９０（ｍ、２Ｈ）、１．３１−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．６６−１．９５（ｍ、４Ｈ）、２．０６−２．１４（ｍ、１Ｈ）、２．２２−２．３７（ｍ、１Ｈ）、２．７８（ｂｒ、１Ｈ）、４．１５−４．２３（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２７．８３、２９．２８、３０．５２、３５．５８、３６．０５、４４．４８、１３１．８６、１３６．００ｐｐｍ。
留意：参考文献は、ＷｈｉｔｈａｍらのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６であり、これにはトランス−シクロ−オクタ−２−エン−オール、これは（１ＲＳ、２ＲＳ）及び（１ＳＲ、２ＲＳ）それぞれと同一である、エカトリアル及びアキシャル異性体の合成及び性質が記載されている。これらの異性体で、前記ＯＨ置換基は、エカトリアル又はアキシャルのいずれかである。前記主及び副異性体は、それぞれエカトリアル及びアキシャル異性体を意味する。以下の実施例を通じて、主／エカトリアル及び副／アキシャルはトランス−シクロ−オクタ−２−エン−オールについて相互に交換可能に使用され、及びこの特徴は、親化合物トランス−シクロオクタ−２−エノールの前記特徴に基づくものである。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（主異性体）（３２）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（主異性体１００ｍｇ、０．７９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６ｍＬ）溶液中にベンジルイソシアネート（１０１μＬ、１１０ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ、１．０４当量）及びトリメチルアミンを滴下した。前記フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、前記溶液を室温で窒素雰囲気下一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて主に出発材料を得た。ベンジルイソシアネート（２００μＬ、２２０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、２．０８当量）及び一滴のトリエチルアミンをジクロロメタン（６ｍＬ）に添加し、前記溶液を室温で一晩撹拌し、５０℃で１時間、及び２５から３５℃で一週間撹拌した。揮発物をバルブ−バルブ蒸留（５０℃、２時間）で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、カーバメート３２（１０１ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、４９．２％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．８１−０．８６（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．８２−１．９９（ｍ、４Ｈ）、２．２１−２．３０（ｍ、１Ｈ）、２．３８−２．４７（ｍ、１Ｈ）、４．３６（ｄ、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．９６（ｂｒ、１Ｈ）、５．０８−５．２０（ｍ、１Ｈ）、５．４８−５．５７（ｍ、１Ｈ）、５．７１−５．８２（ｍ、１Ｈ）、７．２６−７．３６（Ｍ、５Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２７．６９、２９．２５、３５．６８、３５．７６、３５．８３、４１．３２、４４．５３、７８．３３、１００．０２、１２７．６５、１２７．７８、１２８．８６、１３２．０３、１３３．３１、１３８．８８ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（副異性体）（３２）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（副異性体１００ｍｇ、０．７９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６ｍＬ）中にベンジルイソシアネート（１０１μＬ、１１０ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ、１．０４当量）及びトリエチルアミン一滴を添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下で室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて主に出発材料を得た。ベンジルイソシアネート（２００μＬ、２２０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、２．０８当量）及び一滴のトリエチルアミンをジクロロメタン（６ｍＬ）に添加し、前記溶液を室温で一晩撹拌し、５０℃で１時間、及び２５から３５℃で一週間撹拌した。揮発物をバルブ−バルブ蒸留（５０℃、２時間）で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、カーバメート３２（４３ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ、２０．９％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７４−０．９３（ｍ、２Ｈ）、１．０１−１．１４（ｍ、１Ｈ）、１．４１−１．５７（ｍ、１Ｈ）、１．６２−１．７６、２Ｈ）、１．８４−２．１２（ｍ、３Ｈ）、２．４６−２．４９（ｍ、１Ｈ）、４．４０（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、５．０５（ｂｒ、１Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、５．５２−５．５９（ｍ、１Ｈ）、５．７９−５．８９（ｍ、１Ｈ）、７．３１−７．３６（ｍ、５Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２４．３４、２９．３３、３６．１３、３６．２０、４０．９７、４５．３０、７４．３３、１２７．６７、１２７．８５、１２８．８７、１３１．７２、１３１．９９、１３８．８７、１５６．１１ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（主異性体）（３３）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（主異性体２６０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１２ｍＬ）中にジクロロメタン（３ｍＬ）中の３、５−ジメチルフェニルイソシアネート（３０５μＬ、３１８ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びトリエチルアミン数滴を添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下で２９℃で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させ、０．５７ｇのやや白色固体を得た。前記残渣をクロマトグラフィー（シリカ、３０ｍＬ、溶出酢酸エチル／ヘプタン５から１０％）して部分的に精製されたカーバメート３３を得た（９４ｍｇ）。前記生成物をさらにカラムクロマトグラフィー（シリカ、３０ｍＬ、溶出液酢酸エチル／ヘプタン５％）で精製し、カーバメート３３を白色固体として得た（７２ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ、収率１２．８％、約１０％のＺ−異性体を含む）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７９−０．９８（ｍ、２Ｈ）、１．２８−２．０２（ｍ、４Ｈ）、１．８０−２．０７（ｍ、３Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．４２−２．５０（ｍ、１Ｈ）、５．１３−５．２２（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８７（ｍ、２Ｈ）、６．４９（ｂｒ、１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）、７．０４（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２１．６１、２７．６７、２９．２４、３５．７０、３５．８４、４１．２１、７９．３４、１１６．５９、１２５．２２、１３１．８３、１３３．５１、１３８．１１、１３８．５０、１５３．４３ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（副異性体）（３３）
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（副異性体、Ｚ異性体も含む、２６０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１２ｍＬ）溶液中に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中の３、５−ジメチルフェニルイソシアネート（３０５μＬ、３１８ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．０５当量）と数滴のトリエチルアミンを添加した。前記フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下、３０℃で２晩撹拌し、５０℃で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて０．５４ｇの黄色固体を得た。前記残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、４０ｍＬ、溶出液酢酸エチル／ヘプタン５％）で精製し、部分的に精製されたカーバメート３３を得た（２０ｍｇ）。生成物をさらに真空中（０．０８ミリバール）で４０℃で３時間及び室温で一晩精製して、カーバメート３３（１１ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、２．０％）を淡黄色半固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７８−０．９０（ｍ、１Ｈ）、１．０７−２．１８（ｍ、８Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．４５−２．５３（ｍ、１Ｈ）、５．４２（ｓ、１Ｈ）、５．５６−５．６２（ｍ、１Ｈ）、５．８３−５．９４（ｍ、１Ｈ）、６．６０（ｓ、１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）、７．０３（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２１．６４、２４．４２、２９．４３、３６．７７、４０．１９、７４．４６、１１６．４７、１１８．７７、１２５．３５、１３１．３４、１３２．３１、１３８．００、１３８．９１ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボナート（３４）の合成
Figure 2014515040
 副（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（３０４ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）の１５ｍＬジクロロメタン溶液を、氷冷した。４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１．１６ｇ、９．５０ｍｍｏｌ）を添加し、次に４−ニトロフェニルクロロホーメート（０．９０ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を一晩撹拌し、次にこれを２０ｇシリカカラムに載せた。ジクロロメタンで溶出し、次に５％ＴＢＭＥを含有するジクロロメタンで溶出した。生成物画分を合わせてロータリーエバポレーターで蒸発させて、副３４を固化油状物として得た（３３８ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、４８％）。同様に、主（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（２５９ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）の１０ｍＬジクロロメタン、４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１．１１ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）及び４−ニトロフェニルクロロホーメート（０．８５ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）を用いて、主−３４を固化油状物として得た（２３４ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、３９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ、副３４（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９（ｍ、１Ｈ）、１．２５（ｍ、１Ｈ）、１．５−２．２（ｍ、６Ｈ）、２．２５（ｄｄ、１Ｈ）、２．６（ｍ、１Ｈ）、５．４５（ｓ、１Ｈ）、５．６（ｄｄ、１Ｈ）、６．０（ｍ、１Ｈ）、７．４（ｄ、２Ｈ）、８．３（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δδ＝２４．０、２９．０、３６．０、３６．０、４０．６（全てのＣＨ２）、７９．０、１２２．０、１２５．８、１２９．８、１３３．２（全てのＣＨ）、１４５．４、１５１．８、１５６．０（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、主３４（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．０（ｍ、２Ｈ）、１．４−２．１（ｍ、６Ｈ）、２．３５（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、５．２（ｍ、１Ｈ）、５．６５（ｍ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、７．４（ｄ、２Ｈ）、８．３（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２７．８、２９．０、３５．８、３６．０、４０．４（全てのＣＨ２）、８３．０、１２１．８、１２５．０、１３０．４、１３４．４（全てのＣＨ）、１４５．８、１５２．０、１５６．０（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）カーバメート（３５）の合成
Figure 2014515040
 前記副アルコー３１（１３６ｍｇ、０．４６７ｍｍｏｌ）から誘導される前記ＰＮＰ−誘導体３４は７．５ｇＴＨＦ中に溶解された。ジイシプロピルエチルアミン（１８２ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を添加し、次に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２４ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）及び４−アミノベンジルアルコール（９４ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所で約３０℃で６日間撹拌した。前記溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を２０ｇのシリカクロマトグラフィーした（溶出液として、ジクロロメタンにＴＢＭＥをを徐々に増やした）。生成物を約５％ＴＢＭＥで溶出した。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、生成物副３５を粘性油状物として得た（１１２ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ、８７％）。
同様に、６．０ｇＴＨＦ中の前記主アルコール３１（１４５ｍｇ、０．４９８ｍｍｏｌ）から誘導された前記ＰＮＰ−誘導体３４を、ジイソプロピルエチルアミン（２１０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３４ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）及び４−アミノベンジルアルコール（１２８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）と３日間約３０℃で反応させた。ロータリーエバポレーターで蒸発させ、クロマトグラフィーにより、生成物主３５を粘性油状物として得た（１１０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、８０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ、副−３５（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．４５（ｍ、１Ｈ）、１．６−２．２（ｍ、６Ｈ）、２．４（ｍ、１Ｈ）、４．６（ｓ、２Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、７．１５（ｂｓ、１Ｈ）、７．２−７．４（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２４．２、２９．０、３６．０、３６．０、４１．０、６５．０（全てＣＨ２）、７５．０、１１９．０、１２８．０、１３１．０、１３２．６（全てのＣＨ）、１３６．０、１３８．０、１５３．６（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、主−３５（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．０（ｍ、２Ｈ）、１．４−２．１（ｍ、６Ｈ）、２．３（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、４．６５（ｓ、２Ｈ）、５．２（ｍ、１Ｈ）、５．６（ｍ、１Ｈ）、５．８（ｍ、１Ｈ）、６．６（ｂｓ、１Ｈ）、７．４５−７．６５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２７．４、２９．２、３５．８、３６．０、４１．２、６５．０（全てのＣＨ２）、７９．８、１１９．０、１２８．２、１３２．０、１３４．０（全てのＣＨ）、１３６．０、１３７．８、１５３．６（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
副（Ｅ）−エチル ２−（４−（（（シクロクオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−２−（（（（２、５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）オキシ）アセテート（３７）の合成
Figure 2014515040
 主アルコール３１（３００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）から誘導される前記ＰＮＰ−３誘導体３４を１０．３ｇのＴＨＦに溶解する。ジイソプロピルエチルアミン（３６２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を添加し、次に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７５ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）とエチル２−（４−アミノフェニル）−２−ヒドロキシアセテート（３２５ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、国際公開第２００９１０９９９８号に記載の方法で製造した）を添加した。混合物を暗所で３０℃で６日間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残渣を２１ｇのシリカで、溶出液ジクロロメタン（徐々にＴＢＭＥを増やしていった）でクロマトグラフィーした。生成物は５％ＴＢＭＥで行った。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、副（Ｅ）−エチル２−（４−（（（シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボノニル）アミノ）フェニル）−２−ヒドロキシアセテート（３６）を粘性油状物として得た（３５０ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ、９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．２（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．２（ｍ、７Ｈ）、２．５（ｍ、１Ｈ）、４．１−４．３（２ｑ、２Ｈ）、５．１（ｓ、１Ｈ）、５．４５（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、６．７（ｂｓ、１Ｈ）、７．３−７．４５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ。
得られた生成物３６（８０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を４．１ｇのアセトニトリルに溶解させた。ジイソプロピイルアミン（２１５ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加し、次にＮ、Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（２１７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２日間３０℃で撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残渣を１６ｇのシリカで、溶出液ジクロロメタン（徐々にＴＢＭＥを増やす）を用いてクロマトグラフィーを行った。生成物は約２０％ＴＭＢＥで溶出した。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、生成物副−（Ｅ）−エチル２−（４−（（（シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−２−（（（（２、５−ジオキシピロロジン−１−イル）オキシ）カルボニル）オキシ）アセテート（３７）を粘性油状物として得た（６０ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、５３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．２（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．２（ｍ、７Ｈ）、２．５（ｍ、１Ｈ）、２．６（ｓ、４Ｈ）、４．１５−４．３（２ｑ、２Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８（ｓ）及び５．８５（ｍ）（２Ｈ）、６．７（ｂｓ、１Ｈ）、７．３５−７．５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクテンドキソルビシンプロドラッグ（３８）の合成
Figure 2014515040
 前記副アルコール３１（２０ｍｇ、０．０６８７ｍｍｏｌ）からの前記ＰＮＰ−誘導体３４を３．０ｇのＤＭＦに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を添加し、次にドキソリビシン塩化水素（４５ｍｇ、０．０７７６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所で３０℃で３日間撹拌した。溶媒を高真空下蒸発させ、残渣を１７ｇのシリカを用いて、溶出液ジクロロメタン（徐々にメタノールを増やしていった）でクロマトグラフィーを行った。前記精製物の画分をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残渣を５ｍＬＴＭＢＥとともに撹拌した。１５ｍＬヘプタンを添加後、副−３８を得た（２７ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、５０％）。ろ液には生成物が含まれていた。
同様に、７．２ｇのＤＭＦ中の主アルコール３１（２２ｍｇ、０．０７５６ｍｍｏｌ）からのＮＰＮ−誘導体３４から、ジイソプロピルエチルアミン（８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びドキソルビシン塩化水素（４７．７ｍｇ、０．０８２２ｍｍｏｌ）を添加、次に高真空下で溶媒を蒸発させて、クロマトグラフィーを行い、ＴＢＭＥ／ヘプタン処理して、主−３８が得られた（２１ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、３０％）。ろ液には生成物がさらに含まれていた。
１Ｈ−ＮＭＲ、副−３８（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．７−２．０（ｍ）及び１．３５（ｄ）（１８Ｈ）、２．２（ｍ、２Ｈ）、２．４（ｍ、２Ｈ）、３．０−３．４（ｄｄ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、１Ｈ）、３．９（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ＋ｍ、４Ｈ）、４．８（ｓ、１Ｈ）、５．０５（ｍ、１Ｈ）、５．２−５．８５（ｍ、２Ｈ）、７．４（ｄ、１Ｈ）、７．８（ｔ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、１Ｈ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、主−３８（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．７−２．０（ｍ）ａｎｄ１．３５（ｄ）（１８Ｈ）、２．２（ｍ、２Ｈ）、２．４（ｍ、２Ｈ）、３．０−３．４（ｄｄ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、１Ｈ）、３．９（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ＋ｍ、４Ｈ）、４．８（ｓ、１Ｈ）、５．０（ｍ、１Ｈ）、５．３−５．８（ｍ、２Ｈ）、７．４（ｄ、１Ｈ）、７．８（ｔ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、１Ｈ）ｐｐｍ。ＭＳ：６９４．３（Ｍ−１）。
（Ｅ）−シクロオクテン−ドキソルビシンプロドラッグ４６の合成
Figure 2014515040
 ｎ−ブチルリチウム（９７ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｎ、０．２４２ｍｏｌ）を１００ｍＬ中のジイソプロピルエチルアミン（２３．６６ｇ、０．２３４ｍｏｌ）に温度−２０℃で加えた。溶液を冷却し、６０ｍＬＴＨＦ中のシクロオクタ−２−エノン（３９、２３．０７ｇ、０．１８５ｍｏｌ）を、２０分かけて、−６５℃から−８０℃で添加した。溶液を１時間−６７℃から−７２℃で撹拌した。エチルブロモアセテート（４５．４ｇ、０．２７２ｍｏｌ）を４０ｍＬのＴＨＦに溶解し、これを２５分かけて−６３℃から−７５℃で添加された。得られた混合物を３時間−５５℃から−７０℃で撹拌した。ヘプタン（５０ｍＬ）を−６０℃で添加し、次に１００ｍＬの（冷却）水中の４０ｇの塩化アンモニウムを添加し、次に温度を−７０℃から−３０℃へ上げた。冷却浴を外し、混合物をさらに３０分間撹拌し、温度を−１５℃とした。混合物を２００ｍＬのＴＢＭＥ及び５０ｍＬの水中に入れ、層分離させ、有機層を５０ｍＬの水で洗浄した。水層を数回１５０ｍＬＴＢＭＥで抽出した。有機層を乾燥しロータリーエバポレーターで蒸発させた。過剰のエチルブロモアセテートを高真空下、クーゲルロール装置を用いて除去した。Ｚ）−エチル２−（２−オキソシクロオクタ−３−エン−１−イル）アセテート（４０）を含む残渣は次のステップなどに使用された。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２５（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．６（ｍ、９Ｈ）、２．９（２ｄ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、１Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、６．０５−６．５（ｍ、２Ｈ）ｐｐｍ。
１８０ｍＬのＴＨＦと２０ｍＬのメタノール混合物中の前記粗製エステル４０の溶液を氷冷した。
リンタングステン酸（２５０ｍｇ）を添加し、次に温度７℃未満でナトリウムボロヒドリド（４．０ｇ、０．１０５ｍｏｌ）を一部分ごと３０分間にわたり添加した。混合物を氷冷下で９０分間撹拌し、次に２５０ｍＬ水及び２５０ｍＬトルエンを添加した。層分離した有機層を５０ｍＬ水で洗浄した。水層を２５０ｍＬトルエンで繰り返し抽出した。有機層を乾燥しロータリーエバポレーターで蒸発させた。粗製４１は十分区別できる画分を生成せず、従って全ての物質を一緒にして、２００ｍＬエタノール中の２５ｍＬの５０％水酸化ナトリウムで（さらに２５ｍＬ水を反応中に添加した）、２時間還流することで加水分解した。エタノールの大部分をロータリーエバポレーターで蒸発させた。水を適量残渣に加えた。混合物を２ｘ２００ｍＬのトルエンで抽出した。有機層を５０ｍＬの水で洗浄した。トルエン（２００ｍＬ）を前記合わせた水層に加えて、水層を濃塩酸で酸性化した。前記層を分離し、有機層を２０ｍＬの水で洗浄した。２００ｍＬのトルエンで水層から連続的に抽出した。前記２つの有機層を乾燥してロータリーエバポレーターで蒸発させた。クーゲルロール蒸留で前記ラクトン４２を２つの異性体の約２：１比の混合物として得た（７．３３ｇ、４４．１ｍｍｏｌ、シクロのオクタ−２−エノンに基づき２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．６−２．８（ｍ、１Ｈ）、４．９５（ｍ、０．３５Ｈ）、５．３５（ｍ、０．６５Ｈ）、５．６（ｍ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２４．１、２５．２、２７．０、２８．０、２９．２、２９．６、３４．４、３６．８（全てのＣＨ２）、４３．５、４７．２、８０．８、８１．９（ａｌｌＣＨ）、１２６．４、１２９．６、１３０．２、１３４．２（全てのＣＨ）、１７６．４（Ｃ＝Ｏ）、１７７．０（Ｃ＝Ｏ）ｐｐｍ。
前記得られたラクトン４２（７．３３ｇ、４４．１ｍｍｏｌ）を１０．０ｇのメチルベンゾエートと約５００ｍＬのヘプタン／エーテル（約４：１）と混合した。前記混合物を３６時間照射し、一方前記溶液は連続的に、シリカカラム（約６．９ｇ硝酸銀を含む）に埋め込まれた６９ｇの硝酸銀を通じてフラッシュクロマトされた。前記カラム材料は次に２５０ｍＬ部のヘプタン／ＴＢＭＥの比率３：１、２：１、１：１、１：２の比率でフラッシュさせ、次に４００ｍＬＴＢＭＥでフラッシュさせた。最初の２つの画分はメチルベンゾエートのみを含んでいた。最後の３区画分は２００ｍＬの１０％アンモニウムで洗浄され、乾燥してロータリーエバポレーターで蒸発させた。高真空下でほとんどのメチルベンゾエートを蒸発させた後、合わせた残渣は８００ｍｇ（Ｚ及びＥ異性体混合物とメチルベンゾエート）であった。残りカラム材料をＴＢＭＥとアンモニウムと共に撹拌し、次にろ過して相分離させた。前記固体を２回以上水層及びＴＢＭＥで処理し、次にろ過して、層分離させた。前記有機層を乾燥しロータリーエバポレーターで蒸発させて４３を３．７０ｇ（約４：１の異性体混合物、それぞれの異性体は２つのＥ−異性体を含み得る）得た（２２．２９ｍｍｏｌ、５１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７５（ｍ、１０．６Ｈ）、３．０（ｍ、０．４Ｈ）、４．４５（ｔ、０．２Ｈ）、５．０（ｍ、０．８Ｈ）、５．６（ｄｄ、０．５Ｈ）、５．６５（ｍ、０．５Ｈ）、５．８（ｍ、０．５Ｈ）、６．０５（ｍ、０．５Ｈ）ｐｐｍ。
回収された主異性体（以下の実施例参照）は次のデータを持つ：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７５（ｍ、１０．６Ｈ）、３．０（ｍ、０．４Ｈ）、ｔ、０．２Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、５．６（ｄｄ、０．８Ｈ）、５．６５（ｍ、０．３Ｈ）、５．８（ｍ、０．３Ｈ）、６．０５（ｍ、０．６Ｈ）ｐｐｍ。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２１．６、２５．８、３０．０、３０．４、３３．０、３４．８、３５．４、３６．０、３８．０（全てのＣＨ２）、４６．０、４７．０、８０．８、８４．０（全てのＣＨ）、１２８．２、１３１．４、１３３．０、１３４．０（全てのＣＨ）、１７７．２（Ｃ＝Ｏ）、１７７．４（Ｃ＝Ｏ）ｐｐｍ。前記シグナル比率は約２：１異性体比であった。
ジイソプロピルエチルアミン（５．９１ｇ、４５．８ｍｍｏｌ）をラクトン４３（８６５ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ）の１５ｍＬジクロロメタン中に溶解し、次にベータアラニンエチルエステル塩化水素（１．３８ｇ、８．９８ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１６日間室温で撹拌し、次にロータリーエバポレーターで蒸発させた。残渣を５０ｇのシリカを用いて、ジクロロメタンを溶出液としてクロマトグラフィーを行った。これにより出発物４３を得た（主Ｅ−異性体、Ｃ−ＮＭＲで明らかに２つの異性体の混合物であった）。さらにジクロロメタン（徐々にメタノールを増やしていく）を用いる溶出でアミド４４を得た。生成物は７５ｍＬＴＢＭＥ用いて溶出され、２５ｍＬ水中の５ｇのクエン酸及び２ｘ１０ｍＬ水を用いて洗浄した。５０ｍＬのＴＢＭＥを用いて連続的に水層を抽出した。有機層を合わせて乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させてアミド４４を得た（異性体を含む）（３６０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７（ｍ）、１．２５（ｔ）、２．４５（ｔ）（１６Ｈ）、３．５（ｑ、２Ｈ）、３．９（ｔ、０．５Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、４．３５（ｍ、０．５Ｈ）、５．５−５．９（ｍ、２Ｈ）、６．２−６．５（２ｂｔ、１Ｈ）ｐｐｍ。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（１組の異性体が濃縮された画分のシグナル）：δ＝１４．３（ＣＨ３）、２２．４、２７．８、２９．９、３３．０、３４．０、３４．１、３４．２、３４．５、３５．３、３５．３、３５．５、３５．７、３６．１、３６．２、４１．７（全てのＣＨ２）、４６．２（ＣＨ）、５１．６（ＣＨ）、６０．９（ＣＨ２）、７７．１、８０．２、１３１．２、１３１．７、１３４．２、１３５．６全てのＣＨ）、１７２．７、１７３．９、１７５．１（全てのＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
アミド４４（１１５ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ、主に１組の異性体）を４．４ｇのアセトニトリルに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（３７０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、次にＮ、Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（３５５ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を２日間約３０℃で撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残渣を１６ｇのシリカを用いて、徐々にＴＢＭＥを増やしたジクロロメタンを溶出液として用いてクロマトグラフィーを実施した。生成物は約２０％のＴＢＭＥで溶出された。生成物画分のロータリーエバポレーター蒸発により、粘性油状物としてＮＨＳカーボネート４５を得た（１５０ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ、８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．６（ｍ）、１．２５（ｔ）、２．５５（ｔ）（１６Ｈ）、２．８５（ｑ、４Ｈ）、３．５（ｑ、２Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、４．９５（ｔ、０．８Ｈ）、５．２（ｄｄ、０．２Ｈ）、５．５５−６．０（ｍ、２Ｈ）、６．４（ｂｔ、１Ｈ）ｐｐｍ。
前記得られたＮＨＳ−カーボネート４５（１５０ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）を７．５６ｇのＤＭＦに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１３２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を添加し、次にオキソルビシン塩化水素（６６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で暗所で３時間撹拌した。溶媒を高真空下除去し、残渣を１３ｇのシリカを用いて、徐々にメタノールを増やしてジクロロメタンを溶出液としてクロマトグラフィーを実施した。生成物画分のロータリーエバポレーター蒸発により、１１２ｍｇのプロドラッグ４６が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、関連するシグナルのみ与えられている）：δ＝１．２５（ｔ）、３．２（ｍ）、３．５（ｍ）、４．０５（ｓ）、４．１５（ｑ）、４．８（ｓ）、５．２−５．８（ｍ）、６．１５（ｍ）、６．２５（ｍ）、７．４（ｄ）、７．８（ｔ）、８．０（ｄ）ｐｐｍ。場合によりプロドラッグ４６は、前記エステル官能基をカルボン酸に変換させることで抗体へ共役させることが可能となり、これを次のリジン共役のためにＮＨＳエステルに変換させ得る。
副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（２、５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（４７）の合成
Figure 2014515040
 Ｎ、Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（３７２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を、撹拌された副アルコール３１（７７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、３．３３ｇアセトニトリル及びジイソプロピルエチルアミン（４１０ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）混合物へ添加した。前記混合物を２５℃で３日間撹拌し、さらに２日後１２０ｍｇのＮ、Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートを添加した。前記溶液を１５ｇのシリカを用いて、ジクロロメタン次に少量のＴＢＭＥを含むジクロロメタンを溶出液として用いてクロマトグラフィーを実施した：生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させ、生成物を固体として得た（６２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、３８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１５（ｍ、１Ｈ）、１．４５−２．１５（ｍ、６Ｈ）、２．２（ｄｄ、１Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５（ｄ、１Ｈ）、６．０（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ。
実施例３
テトラジンアクチベータの安定性と反応性
テトラジンの加水分解安定性試験
前記特定のテトラジンのＤＭＳＯ（２５ｍＭ）溶液の１０μＬをＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）（又は、水可溶性が小さい場合にはＰＢＳとアセトニトリルの混合物）に希釈させた。この溶液をろ過し、５２５ｎｍの吸収の減少をＵＶスペクトル計を用いてモニターした。加水分解速度及び半減期をこれらのデータから決定した。
トランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシャル異性体）へのテトラジンの反応性
競争実験を実施して、特定のテトラジンと、３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（５）（これは標準テトラジンとして選択された）との、トランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシャル位置ＯＨを持つ「副」異性体：ＷｈｉｔｈａｍらのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６を参照）との逆電子要求ディールスアルダー反応での反応性比率を決定した。
アセトニトリル（０．１００ｍＬ）に、ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）の特定のテトラジンの溶液の５μＬ及び、ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）の標準テトラジンの溶液の５μＬを添加した。この混合物を水（０．９ｍＬ）で希釈され、両方のテトラジンの絶対量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定した。続いて、ＤＭＳＯ中のトランス−シクロオクタ−４−エン−オール（アキシャル異性体）の溶液（２５μＬ、２．５ｍＭ）をゆっくりと添加し、次に混合物を５分間撹拌させた。さらに両方のテトラジンの絶対量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析により決定し、両方のテトラジンについて変換を計算した。これらの変換から、両方のテトラジンの反応性比（Ｒ＝ｋ２、ＴＣＯ／ｋ２、Ｒｅｆ）が、Ｉｎｇｏｌｄ及びＳｈａｗからの数学手順を用いて計算された（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９２７、２９１８−２９２６）。
以下の表は、テトラジンの反応性と安定性プロフィールは、置換基を変更することで、ある特性に調節することができることを示す。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例４
トランス−シクロオクテンモデルプロドラッグ及びプロドラッグの安定性と反応性
安定性
１０μＬの特定のトランス−シクロオクテン誘導体のジオキサン（２５ｍＭ）に溶液をＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）で希釈し、及びこの溶液を暗所、２０℃で保存した。前記ＴＣＯ化合物の運命をＨＰＬＣ−ＭＳ分析でモニターし、半減期を評価した。
トランス−シクロオクテン誘導体のビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジンへの反応性：二次反応速度定数決定
トランス−シクロオクテン誘導体のと３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（５）との、アセトニトリル中２０℃での、逆電子要求ディールスアルダー反応の速度論をＵＶ−可視スペクトル装置を用いて決定した。キュベットをアセトニトリル（３ｍＬ）で満たし２０℃で平衡した。３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（５、２．５０´１０−７ｍｏｌ）を添加し、次に前記トランス−シクロオクテン誘導体を添加した。λ＝５４０ｎｍでの吸収減衰をモニターし、この曲線から二次反応速度定数ｋ２を、二次反応と仮定して決定した。
トランス−シクロオクテン誘導体のビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジンの反応性：
競争反応
競争反応を、特定のトランス−シクロオクテン誘導体と、トランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシャル異性体）（これはトランス−シクロオクテンの標準として選択された）と、ビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（２）との逆電子要求ディールスアルダーの反応比を決定するために実行された。
アセトニトリル（０．０５ｍＬ）に、ジオキサン中の特定のトランス−シクロオクテン誘導体（５μＬ、２５ｍＭ；１．２５ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加し、ジオキサン中の「標準トランス−シクロオクテン（５μＬ、２５ｍＭ；１．２５ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。この混合物を水（０．４５ｍＬ）で希釈した。次に、ビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（２、６．２５ｘ１０−８ｍｏｌ）のアセトニトリル（０．０５ｍＬ）と水（０．４５ｍＬ）との混合物中の溶液を激しく撹拌しながらゆっくりと添加した。添加後、混合物をさらに５分間撹拌した。両方のトランス−シクロオクテン誘導体の変換を、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定し、これらの変換から、特定のトランス−シクロオクテン誘導体のの反応性比率（Ｒ＝ｋ２、ＴＣＯ／ｋ２、Ｒｅｆ）を、Ｉｎｇｏｌｄ及びＳｈａｗの文献により数学式を用いて計算した（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９２７、２９１８−２９２６）。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例５
モデルプロドラッグの活性化（アクティベーション）
この実施例は、１、２、４、５−テトラジンとモデルトランス−シクロオクテンプロドラッグの逆電子要求ディールスアルダー反応、及び続くモデル薬物（例えばベンジルアミン）の脱離反応を示す。
一般的手順：
３、６−ビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（２）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（２、５．９１ｘ１０−５ｇ；２．５ｘ１０−７ｍｏｌ）を０．２ｍＬのアセトニトリルに溶解し、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２、アキシャル位置にカーバメートを持つ異性体；６．４８ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。５分後、反応混合物を水（０．８ｍＬ）で希釈し、２０℃で１４時間撹拌した。混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は脱離生成物（アミノベンジルカーバメートのないｒＤＡ付加物）の証拠であるｍ／ｚ＝＋３１７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）を示し、ベンジルアミンの放出を示した（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）。
６−メチル−３−（４−ブタンアミド−２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン、及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 前記一般的手順に従い、両方の表記化合を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離性生物であるｍ／ｚ＝＋３３９Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）と、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−フェニル−３−（４−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 前記一般的手順に従い、両方の表記化合を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離性生物であるｍ／ｚ＝＋３３０Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）と、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−フェニル−３−（３−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 前記一般的手順に従い、両方の表記化合を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離性生物であるｍ／ｚ＝＋３３０Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）と、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−Ｈ−３−（４−アミノメチルフェニル）−１、２、４、５−テトラジン及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 前記一般的手順に従い、両方の表記化合を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離性生物であるｍ／ｚ＝＋２６８Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）と、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
３、６−ジフェニル−１、２、４、５−テトラジン及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 前記一般的手順に従い、両方の表記化合を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離性生物であるｍ／ｚ＝＋３１５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）と、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（９）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（３．３４ｍｇ；１．２６ｘ１０−５ｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、次に副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２；３．２８ｍｇ；１．２６ｘ１０−５ｍｏｌ）を添加した。５分後、反応混合物をＤ２Ｏ（０．２ｍＬ）で希釈し、次に２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物の１Ｈ−ＮＭＲはベンジルアミン生成を示した：δ＝３．８６ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、ＰｈＣＨ ２ＮＨ２）。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物（ｔｒ＝５．４５ｍｉｎ（分）：ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びベンジルアミン放出（ｔｒ＝０．８８ｍｉｎ：（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３、６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１、２、４、５−添加（１１）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１１、６．６５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を０．５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次に副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２；６．４８ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。２分後、反応混合物を水（０．５ｍＬ）で希釈し、２０℃で５時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物、ｍ／ｚ＝＋３４７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（９）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（９、６．６０ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３ｍＬ）に溶解し、混合物をＰＢＳ緩衝液で希釈した（０．７ｍＬ）。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３、アキシャル位置にカーバメートを持つ異性体；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物（ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３、５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３、６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１１）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（１１、６．６５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．２ｍＬ）に溶解し、この混合物をＰＢＳ緩衝液で希釈した（０．８ｍＬ）。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物（ｍ／ｚ＝＋３４７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３、５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３、６−ジフェニル−１、２、４、５−テトラジン及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
Figure 2014515040
 ３、６−ジフェニル−１、２、４、５−テトラジン（５．８５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３ｍＬ）に溶解し、混合物をＰＢＳ緩衝液（０．７ｍＬ）で希釈した。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物、ｍ／ｚ＝＋３１５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３、５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
Figure 2014515040
 ３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶解した。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３、５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物（ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３、５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
実施例６
ドキソルブシンプロドラッグの活性化
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
Figure 2014515040
 ３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−６ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）（ｃ＝２５μＭ）に溶解した。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８、アキシャル位置にカーバメートを持つ異性体；１．７４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で４時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物、ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びドキソルビシン放出（６９％）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））及びλｍａｘ＝４７８ｎｍを示した。比較結果を、濃度２．５及び１．０μＭで得た。
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−６ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶解した（ｃ＝２５μＭ）。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８、アキシャル位置にカーバメートを持つ異性体；１．７４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で１６時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物、ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びドキソルビシン放出（収率２０％）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））及びλｍａｘ＝４７８ｎｍを示した。
３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（９）及び副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
Figure 2014515040
 ３、６−ビス（２−アミノフェニル）−１、２、４、５−テトラジン（９、２．６４ｘ１０−６ｇ；１．００ｘ１０−８ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．１ｍＬ）に溶解した。この混合物をＰＢＳ緩衝液（０．９ｍＬ）で希釈した。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８；６．９６ｘ１０−６ｇ；１．００ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で１８時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物、ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びドキソルビシン放出（収率９０％）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））及びλｍａｘ＝４７８ｎｍを示した。
実施例７
ドキソルビシンプロドラッグ副−３８及びテトラジン７との細胞増殖アッセイ
Ａ４３１扁平上皮癌細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及びペニシリン及びストレプトマイシン存在０．０５％グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃で、加湿ＣＯ２インキュベーター内に維持された。実験を開始する２４時間前に、細胞を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、２５００細胞／ウェル密度で植えた。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）と前記プロドラッグ副−３８（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）及び例えば７（ＰＢＳ中１０ｍＭ）を、実験開始及び前記ウェルに添加する直前に、加温培地内で連続希釈された（ウェルあたりの最終容積は２００μｌ）。前記プロドラッグを、単独又は１０μＭ又は１．５ｍｏｌ当量（前記プロドラッグに対して）のテトラジン７との組み合わせのいずれかで添加された。３７℃で７２時間インキュベーション後、細胞増殖をＭＴＴアッセイで評価した。即ち、メチルチアゾイルフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶解し、０．２２μｍを通してろ過し、それぞれのウェルに２５μｌを添加した。３７℃で１２０分間インキュベーション後、前記培地を静かに吸い取った。形成されたホルマザン結晶を１００μｌのＤＭＳＯに溶解し、前記吸収を５６０ｎｍでプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で測定した。ＩＣ５０値（±標準偏差、表参照）を標準細胞成長曲線から誘導した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ５．０１））。前記細胞増殖アッセイは、テトラジン７は毒性ではなく（ＩＣ５０＞１００±μＭ）かつプロドラッグ３８はやや毒性である（ＩＣ５０＝３．０１７±０．４８６μＭ）ことを示し、これらの２つの組み合わせはＡ４３１細胞に対しては非常に毒性（テトラジン７の連続希釈を用いるか又は一定量を用いるか、それぞれについて、０．１３７±０．０１２±μＭ及び０．２７８μ±０．０２２±μＭＩＣ５０）の結果となる。このことは、ドキソルビシンが、前記プロドラッグのトランス−シクロオクテンと前記テトラジンとの前記逆ディールスアルダー反応に続いて放出されることを確認するものである。
Ａ４３１細胞系で決定された、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、テトラジン７による活性化の有無によるプロドラッグ３８、及びテトラジン自体のＩＣ５０値
Figure 2014515040
Figure 2014515040
 実施例８
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７で変性させてマスキングした抗体、及び続くテトラジンアクチベータとの反応による抗体活性化
副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７と抗体の共役
ＰＢＳ中のＣＣ４９（８ｍｇ／ｍＬ、６２．５μＬ）を６．２μＬのＤＭＦに加え、ｐＨを９に１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を用いて調節した。次に、副−（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７を新たに乾燥ＤＭＦに溶解して添加し（５μｇ／μＬ、ＣＣ４９について４０ｍｏｌ当量）、得られた溶液を３時間室温で、暗所で静かに撹拌してインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物をＰＢＳで５００μＬに希釈し、未反応４７を、ＰＢＳで前平衡化させたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａＭＷカット、Ｐｉｅｒｃｅ）で除去した。得られたｍＡｂ溶液の濃度は、ＵＶ−ＶＩＳ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定され、生成物の純度及び完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。前記共役物収率はテトラジン滴定で決定された。ＤＯＴＡ−テトラジン誘導体２９は、前記の通り、キャリア付加１７７Ｌｕを用いて放射性ラベル化された（Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ、２０１０、４９、３３７５−３３７８）。前記ＴＣＯ−変性ｍＡｂ（１５μｇ）をＰＢＳ中の既知の過剰７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン（５０μＬ）と反応させた。３７℃で１０分間のインキュベーション後、反応混合物に非還元性サンプル緩衝液を添加してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。ゲル電気泳動後、それぞれのレーンの放射性分布を蛍光イメージャーで評価された。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンとＣＣ４９−ＴＣＯ構成物間の反応収率は、前記レーンの全放射能に関して前記放射性ｍＡｂバンドの強度から評価された。この手順で、ＣＣ４９分子あたり平均２０ＴＣＯが見出された（５０％共役収率）。
ＣＣ４９及びＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）放射性ラベル化
未変性ＣＣ４９を、製造者指示書によりＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ手順を用いて１２５Ｉで放射性ラベル化した。簡単にいうと、約４０ＭＢｑの［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウムを５０μＬのＰＢＳに溶解し、ＤＭＳＯ中の１μＬのＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（ＳＨＰＰ、Ｐｉｅｒｃｅ）（０．１μｇ／μＬ）及びＰＢＳ中の２５μＬクロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液を１０から２０秒間混合し、次に５μＬのＤＭＦ及び１００μＬのトルエンを添加した。ボルテック後、１２５Ｉ−ＳＨＰＰを含む有機相をガラスバイアルに移し、穏やかなＮ２流下で室温で乾燥した。ＰＢＳ（５０μＬ）中の３０μｇＣＣ４９を前記１２５Ｉ−ＳＨＰＰコーティングガラスバイアルに添加し、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６で、ｐＨを９に調節した。バイアルを、静かに撹拌しながら約６０分間室温でインキュベーションし、次に前記１２５Ｉ−ｍＡｂラベル化収率を放射性−ＩＴＬＣで評価した（４７％）。前記粗製１２５Ｉ−ｍＡｂを、生理食塩水で前平衡化させたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａＭＷカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）を通して精製し、得られた製１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９の放射化学純度を放射性ＩＴＬＣ及び放射性ＨＰＬＣで９８％を超えていることが決定された。
分子あたりの前記ＣＣ４９担持２０ＴＣＯ（４７）部分は、既に記載されたように非担持１７７Ｌｕで放射性ラベル化されたＤＯＴＡ−テトラジン２９（ｍＡｂに対して１当量）と反応させた（Ｒｏｓｓｉｎｅｔａｌ．、ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄ、２０１０、４９、３３７５−３３７８）。１０分間のインキュベーション後、放射性ＨＰＬＣによる１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）については９１％放射化学純度であり、これをさらに精製することなく使用した。
抗体活性化実施例
この実施例では、ＴＣＯ４７で過剰変性されることで、前記ｍＡｂの標的への結合能力が大きく減少することを示し、及び過剰に変性されたＣＣ４９−ＴＣＯ構成物をテトラジン７と反応させることで標的結合可能性が回復されることを示す。前記テトラジンとの反応により前記ｍＡｂの再活性化は、ＴＣＯ放出と、次の電子カスケード介在脱離機構を示す。
標的へのＣＣ４９構成物の結合可能性は、既に記載された方法を修正した免疫反応活性アッセイを用いて評価された（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ、２００６、１７、４８５−４９２）。簡単にいうと、前記放射性ラベル化ｍＡｂ構成物（１μｇ）を、１％ＢＳＡ溶液中（１００μＬ）の２０倍モル過剰のウシ顎下ムチンタイプＩ−Ｓ（ＢＳＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させた。３７℃での１０分間のインキュベーション後、混合物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、０．３５ｍＬ／分でＰＢＳで溶出する放射性ＨＰＬＣにより分析した。この条件で、非ＴＣＯ−変性１２５Ｉ−ＣＣ４９は３９分保持時間を持つ広いピークのカラムから溶出された（図１Ａ）。予想されるように、ＢＳＭでインキュベーション後、１２５Ｉ活性がカラムから、より高分子種（２５分保持時間）に対応して１つのピークで溶出され、これは１２５Ｉ−ＣＣ４９がＢＳＭに結合したことを確認する（１００％免疫反応活性、図１Ｂ）。
分子あたり２０ＴＣＯ４７部分を担持する前記１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９が放射性ＨＰＬＣで分析され、保持時間３１分と３６分の２つのブロードな分離されていないピークが溶出され、これらはそれぞれ全ｍＡｂ関連放射性の４３％及び５７％に対応した（図２Ａ）。この挙動は、ＴＣＯ基でのＣＣ４９過剰変性を示唆する。事実、共役後ＭＷ変化は比較的小さく、ＣＣ４９とＣＣ４９−ＴＣＯ間で保持時間（３９分から３６分）で３分の変化を起こすことはありそうもない。従って、前記カラムのより短い保持は、前記ｍＡｂへ結合した２０ＴＣＯ部分により引き起こされた立体構造の変化によると考えられる。また、カラムから３１分に溶出されるブロードなピークはｍＡｂの凝集を示すものである。その結果、１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯとＢＳＭのインキュベーション後、僅かな量（約全体の２０％）の１７７Ｌｕ活性は、前記放射性クロマトグラフィーで高分子種に関連するものであった（図２Ｂ）。前記約２０％の残留免疫活性は、全変性ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）がその標的結合可能性を失っていることを確認する。
続いて前記１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）を、３７℃でＰＢＳ中で大過剰のテトラジン７（ＴＣＯに対して５００−倍モル過剰）と反応させた。種々の時点（１時間、４時間及び２４時間）で、反応混合物の一部（１μｇｍＡｂを含む）を取り出し、ＢＳＭとインキュベーションされ、放射性ＨＰＬＣで分析された。テトラジン７の添加直後、放射性クロマトグラフィーは、ＣＣ４９−ＴＣＯによる放射活性ピークの消失、３６分では前記ピークの大きな減少及び１７７Ｌｕ−ＣＣ４９−ＴＣＯ−ＢＳＭ付加物の形成による強いピークの形成を示した（Ｒｔ＝２４分；全ｍＡｂ関連活性の７２％；図２Ｃ）。
さらに僅かなピーク面積の増加が、時間と共に観察された（テトラジン７とＣＣ４９−ＴＣＯの２４時間インキュベーション後７６％）。ＴＣＯ−４７とテトラジン７の間のレトロディールスアルダーシクロ付加に続いてＣＣ４９免疫活性の急激な増加は、前記電子カスケード媒介脱離機構の結果としてＴＣＯ放出を示す。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
 実施例９
ＴＣＯ系トリガーの製造のための例示的一般的合成経路及び重要中間体
ＬＤ及びＳＰのカッコはこれらが選択的であること意味する。この例で構成されるＴＴは場合によりＭＭで置き換えられ得る。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例１０
例示的Ｌ Ｄ 部分の構造
Figure 2014515040
 前記リンカーＬＤはまた自壊性リンカーと呼ばれておりこれは前記アクチベータと前記トリガーとの反応で前記リンカーが分子内反応により分解され薬物ＤＤを放出することを意味する。前記のいくつかはまたＳＰを含む。
実施例１１
例示的Ｓ Ｐ 部分の構造
Figure 2014515040
 （波線は結合されたプロドラッグの残り部分を示す。）
留意すべきは、前記マレイミド、活性エステル及びブロモアセタミド基は、目標部分ＴＴ及びマスキング部分ＭＭ場合によりさらにスペーサーＳＰを介してカップリングし得る、ということである。マレイミド及びブロモアセタミド基は通常チオールと反応し、一方活性エステルが通常一級及び二級アミンにカップリングするために好適である。
実施例１２
環化及びカスケード脱離で機能化する例示Ｌ Ｄ 部分を持つＴＣＯトリガーの構造
この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
Figure 2014515040
 （波線は結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴの残り部分を示す。）
実施例１３
環化脱離で機能化する示された例示Ｌ Ｄ 及び／又はＳ Ｐ 部分を持つＴＣＯトリガーの構造
前記トリガーは、ＴＴにＴＴのアミン又はチオールを介して共役されている。この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
Figure 2014515040
 実施例１４
環化及びカスケード脱離で機能化する示された例示Ｌ Ｄ 及び／又はＳ Ｐ 部分を持つＴＣＯトリガーの構造
記トリガーは、ＴＴにＴＴのアミン又はチオールを介して共役されている。この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
Figure 2014515040
 実施例１５
環化及びカスケード脱離により機能化される抗体−薬物共役物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合には標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合される。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性＃であり、通常は＃は１と１０の間である。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例１６
環化及びカスケード脱離により機能化される抗体−薬物共役物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンをＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介して標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合される。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性＃であり、通常は＃は１と１０の間である。
Figure 2014515040
 実施例１７
環化及びカスケード脱離により機能化される抗体−薬物共役物の構造
メイタンシントキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合には標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合される。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性＃であり、通常は＃は１と１０の間である。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例１８
環化脱離により機能化される、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬Ｔ Ｔ に共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介してＴＴ共役物のための反応部分に結合される。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例１９
環化脱離により機能化される、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬Ｔ Ｔ に共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
メイタンシントキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介してＴＴ共役物のための反応部分に結合される。
Figure 2014515040
 実施例２０
環化及びカスケード脱離により機能化される、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬Ｔ Ｔ に共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合にはＴＴ共役物のための反応部分に結合される。
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
Figure 2014515040
実施例２１
腫瘍結合ＣＣ４９−アウリスタチンＥ共役物の活性化
ｍＡｂ又はｍＡｂ断片としてのＣＣ４９は、前記非内在化汎固形腫瘍マーカーＴＡＧ７２へ結合する。プロドラッグ投与、腫瘍結合及び血液から除去後、前記アクチベータが注入される。前記アクチベータと前記ＴＣＯトリガーとの、前記プロドラッグ中での反応の結果、アウリスタチンＥをＣＣ４９（抗体又は抗体断片）から放出し、これは前記がん細胞を浸透して抗癌作用を発揮する。
Figure 2014515040
 実施例３２
腫瘍結合Ｔ−細胞係合三抗体の活性化
前記三抗体は、腫瘍−結合部分、ＣＤ３Ｔ−細胞係合部分、及びＣＤ２８Ｔ−細胞共刺激部分を含む。１つの分子に結合されたＣＤ３及びＣＤ２８が標的に許容されない毒性効果を生じる結果となり、前記抗−ＣＤ２８ドメインはマスキング部分ＭＭでブロックされ、これは前記ＣＤ２８結合ドメインに類似するペプチドであり、前記抗−ＣＤ２８部分への親和性を持つ。このペプチドはさらにＰＥＧ鎖ＳＰがＴＣＯトリガーを介してリンクされ、これ自体が、特別に設計されたシステインサイトへ共役されている。プロドラッグ投与、腫瘍結合及び血液からの除去後、前記アクチベータが注入される。前記アクチベータとプロドラッグのＴＣＯトリガーとの反応は、前記抗−ＣＤ２８からマスキング部分を放出させ、Ｔ−細胞のＣＤ２８共刺激、Ｔ−細胞介在抗癌作用を可能とし、また標的への毒性を防止する。
Figure 2014515040

Claims (19)

  1. プロドラッグの投与及び活性化のためのキットを提供し、前記キットは、薬物が、直接又は間接的に、トリガー部分に結合された薬物及び前記トリガー部分のためのアクチベータを含み、前記トリガー部分がジエノフィル、及び前記アクチベータがジエンを含み、前記ジエノフィルが式（１ａ）を満たす、キット。
    Figure 2014515040
     ［ここで、Ｔ、Ｆは独立してＨ、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩからなる群から選択される置換基を表し；Ａ及びＰは独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり（ただし、少なくとも１つはＣＲａＸＤである）；ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、又はＯ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、であり、ここで、ｐ＝０又は１であり；（ＬＤ）ｎは場合によりリンカーであり、ｎ＝０又は１であり、好ましくはＴＲにＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してリンク（結合され）、ここでこれらの原子は前記リンカーの一部であり、直線及び／又は分岐して配置された複数単位からなり；Ｙ、Ｚ、Ｑ、Ｘは一緒になって、芳香族基又は部分に縮合する４−員環の脂肪族性又はヘテロ脂肪族性部分であり；それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキル、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；それぞれのＲｂは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、Ｒ’ＣＯ−アルキルからなる群から選択され、Ｒ’はＨ、アルキル又はアリールであり；それぞれのＲｃは独立してＨ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨからなる群から選択され；ここで２以上のＲａ、ｂ、ｃ、部分がともに環を形成し得るものであり；ＤＤは１又は複数の治療部分又は薬物であり、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、これらの原子が前記治療部分の一部である。］
  2. 請求項１に記載のキットであり、ＸＤが（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ｐ＝０又は１、及びｎ＝０又は１である、キット。
  3. 請求項１又は２のいずれか一項に記載のキットであり、前記シクロオクテンが式（１ｂ）を満たす、キット。
    Figure 2014515040
     ［ここで、前記同じ面に固定される多くとも２つの環外結合の選択的存在に加えて、それぞれのＲａは独立してＨ、又は最大４つの場合、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択される置換基であり、ここでそれぞれのＲ’及びＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキル、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；前記のそれぞれのＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；ここで２つのＲａ、ｄ部分は環を形成し得るものであり；場合によりひとつのＲａ、ｄが、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭ、へのリンカー部分に場合によりスペーサーＳＰ、を介して含まれ、及びＴ及びＦがそれぞれ独立してＨであり、又は、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される置換基であり、及びＸＤは式（１ａ）で定められる。］
  4. 請求項３に記載のキットであり、前記ジエノフィルが次の構造から選択される、キット。
    Figure 2014515040
     （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
    Figure 2014515040
     （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
    Figure 2014515040
     （ここで点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。波線はＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示す、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
  5. 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のキットであり、前記アクチベータが、式（２）から（４）に記載のジエンから選択される、キット。
    Figure 2014515040
     ここで、Ｒ１は、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル−置換炭素、アリール−置換炭素、窒素Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒからなる群から選択され、ここでＲはアルキルであり、ただしＡ及びＢは共に炭素ではない；ＸはＯ、Ｎ−アルキル、及びＣ＝Ｏであり、及びＹはＣＲであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキルである］、
    Figure 2014515040
     ［ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢｉｓＯ又はＳであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。］、
    Figure 2014515040
     ［ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；ＡはＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。］
  6. 請求項５に記載のキットであり、前記ジエンが式（７）を満たし、テトラジンがパラ位置でＲ１及びＲ２で置換され、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル、２、４−イミダゾイル、２、５−イミダゾイル及びフェニルからなる群から選択され、場合により、１又は複数の電子吸引基で置換されている、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、及びＡｒからなる群から選択される置換基で置換され、ここでＲはＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル、及びＡｒはフェニル、ピリジル又はナフチルを表す、キット。
  7. 請求項５に記載のキットであり、前記ジエンが、式（８ａ）又は（８ｂ）のいずれかを満たす、キット。
    Figure 2014515040
     ［ここでそれぞれのＲ１及びそれぞれのＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである。］
  8. 請求項５に記載のキットであり、前記ジエンが次の化合物からなる群から選択される、キット。
    Figure 2014515040
  9. 請求項１乃至８のいずれか一項に記載のキットであり、少なくとも１つの薬物ＤＤ又はリンカーＬＤ又は前記トリガー部分ＴＲが標的試薬ＴＴ、好ましくは抗体を含む、キット。
  10. 請求項１乃至８のいずれか一項に記載のキットであり、少なくとも１つのＬＤ又はトリガー部分ＴＲがマスキング部分ＭＭ、好ましくはペプチドを含む、キット。
  11. 請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のキットであり、前記薬物が、Ｔ−細胞係合抗体構成物である、キット。
  12. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載のキットであり、前記プロドラッグが、抗体−トキシン又は抗体−薬物共役物である、キット。
  13. 請求項１乃至４のいずれか一項に記載の式（１ａ）のジエノフィル部分に、直接又は間接的に結合される薬物化合物を含む、プロドラッグ。
  14. 薬物化合物を、非生物的、生体直交型反応により引き起こされ得るプロドラッグに変換する方法であり、前記方法は薬物を準備し、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の式（１ａ）のジエノフィル部分に前記薬物を化学的に結合させることを含む、方法。
  15. 治療方法であり、薬物で変化し得る疾患に罹患する患者を、前記患者に、活性化の後に前記薬物が放出されるプロドラッグを投与することで治療し、前記トリガー部分がトランス−シクロオクテン環を含み、前記環が場合により、１又は複数のヘテロ原子を含み、前記ジエンが、逆電子要求ディールスアルダー反応で前記ジエノフィルと反応することができるように選択され、前記トリガー部分が、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の式（１ａ）を満たす、方法。
    Figure 2014515040
  16. 請求項１乃至４のいずれか一項に記載の式（１ａ）を満たす化合物であり、前記化合物が、動物又はヒトのプロドラッグ治療で使用するために、薬物への結合を含む、化合物。
    Figure 2014515040
  17. 生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合した物質の放出のための、アクチベータとしてのテトラジンの使用。
  18. 化学的に結合された形で投与される物質を、生理的環境下で、放出するための、化学的ツールとしてのテトラジンと、式（１ａ）を満たす化合物との間の逆電子要求ディールスアルダー反応の使用。
  19. 請求項１乃至４のいずれか一項に記載の式（１ａ）を満たすトランス−シクロオクテンの、治療化合物のためのキャリアとしての使用。
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