CN103889459B - 生物正交药物活化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗的前药活化方法，其中使用相互间表现生物正交反应性的非生物反应性化学基团。本发明还涉及前药药盒，其包含至少一种前药和至少一种活化剂，其中所述前药包含药物和第一生物正交反应基团(触发剂)，并且其中所述活化剂包含第二生物正交反应基团。本发明还涉及在上述方法和药盒中使用的靶向治疗。本发明特别涉及抗体‑药物缀合物以及双特异性和三特异性抗体衍生物。

Description

生物正交药物活化
发明领域
本发明涉及基于通过非生物的生物正交化学反应(abiotic,bio-orthogonalchemical reaction)活化的无活性药物(inactivated drug)(如前药)的治疗方法。
发明背景
在医学领域，使用在人体或动物体内特定部位活化的无活性化合物(如前药)是广为人知的。另外，无活性药物(如前药)的靶向递送也已有深入研究。已对有效药物在靶位和/或期望的时间选择性释放的药物递送系统的研究投入了大量精力。一种方法为通过局部和特定的酶活性特异性地选择性活化(全身性)前药。然而，很多情况下，关注的靶位缺乏适合的过表达酶。另一种方法为通过称作抗体导向酶前药疗法(antibody-directedenzyme prodrug therapy,ADEPT)的技术将酶运送到靶组织。在该途径中，酶通过与抗体(与肿瘤相关抗原结合)缀合来靶向至肿瘤部位。在全身性给药该缀合物，其在靶点集中并清除未结合的缀合物后，将设计的前药全身性给药并局部活化。该方法需要必定不被内源酶催化完成的反应。满足这些要求的非哺乳动物来源的酶很可能为高免疫原性，这使其不能重复给药。或者，前药可靶向疾病部位，然后经历疾病特异性或非特异性内源性活化过程(如pH、酶、含巯基化合物)。
靶向抗癌治疗被设计为相对于常规癌症化学疗法降低非特异性毒性并且提高有效性。该途径通过单克隆抗体(mAbs)的强大靶向能力以特异性地将高活性的缀合小分子治疗剂递送至癌细胞来实现。在尝试处理毒性问题中，已将化学治疗剂(药物)与靶向分子(如与肿瘤细胞高度特异性结合的抗体或蛋白质受体配体)连接，以形成被称作抗体-药物缀合物(ADC)或免疫缀合物(immunoconjugate)的化合物。理论上免疫缀合物应为低毒性，因为它们将细胞毒性药物靶向至表达特定细胞表面抗原或受体的肿瘤。该策略已 实现有限的成功，部分因为当将毒性药物缀合至大的抗体或蛋白质受体配体上时，所述细胞毒性药物倾向于为无活性或低活性。免疫缀合物的有前景的进展已将细胞毒性药物通过连接基(linker)连接至抗体，所述连接基在肿瘤部位或肿瘤细胞内部断裂(Senter等人，CurrentOpinion in Chemical Biology 2010,14:529–537)。理想地，mAb会特异性与抗原结合，所述抗原在肿瘤细胞上大量表达，但在正常组织有限表达。特别使那些对于临床应用毒性过大的药物得以使用。多数该领域的近期工作集中于高活性细胞毒性剂的使用。这需要连接基技术的研发，该连接基技术提供条件稳定性，从而其在与肿瘤结合后进行药物的释放，而不是在循环中进行。
药物作为缀合物是无活性的，但当其在靶点集中后，药物通过如pH或酶释放，这可为靶点特异性的，但也可为更普遍的。药物释放可由细胞外机制(如肿瘤组织中的低pH、缺氧、特定酶)实现，但通常可通过需要抗体缀合物首先内化的细胞内(大多为溶酶体)释放机制(如谷胱甘肽、蛋白酶、分解代谢)来实现更有选择性的药物释放。特定的细胞内释放机制(如谷胱甘肽、组织蛋白酶)通常(根据其性质)生成母体药物，其可逃出细胞并攻击附近细胞。这被看作是一些抗体-药物缀合物的重要作用机制，特别是在有不同受体表达的肿瘤或mAb穿透性较差的肿瘤中。可裂解的连接基的实例为：腙(对酸不稳定)、肽连接基(组织蛋白酶B可裂解)、有位阻的二硫基团(巯基可裂解)。此外，不可裂解的连接基也可用于mAb-药物缀合物。这些构建体在分解代谢时释放它们的药物，可能生成仍连接至一个氨基酸上的药物分子。仅一部分药物作为这样的缀合物会恢复它们的活性。此外，这些氨基酸-连接的药物不能逃离细胞。然而，由于该连接基是稳定的，因此这些构建体通常被认为是最安全的并且根据药物和靶点可为非常有效的。
目前的抗体-药物缀合物释放策略有它们的局限性。细胞外药物释放机制通常太无特异性(如pH敏感连接基)，其导致毒性。细胞内释放依赖于mAb-药物的效率(如受体调节的内化)，然而数种癌症缺乏以足够高重复数存在的癌症特异性且有效地内化的靶点。细胞内释放还依赖以足够高的量存在的活化酶(蛋白酶)或分子(巯基化合物，如谷胱甘肽)。细胞内释放后，在特定情况下，药物可从细胞逃离至靶点附近细胞。在不是每个细胞表达足够高量的靶受体的异源性肿瘤(heterogeneous tumor)中，这种效果被认为 是有利的。在由于如升高的组织间隙压(其阻碍对流流动)而难以穿透的肿瘤中，这也是重要的。这对于大的如mAb(缀合物)的构建体特别是问题。在有结合部位屏障存在的情况下，这种机制也是至关重要的。一旦靶向剂离开脉管系统并且与受体结合，它在肿瘤内的运动会受限制。mAb缀合物被限制在血管周空间的可能性与其对它的靶点的亲和力有关。可通过增加mAb剂量改善穿透，然而这种途径受如在肝中的毒性剂量的限制。此外，从死细胞脱落的抗原可存在于肿瘤间质空间，在此它们可阻止mAb缀合物与它们的靶细胞结合。另外，许多靶点受无效内化阻碍，并且不同的药物不能以相同的方式连接至mAb。此外，已证明设计由靶点中的内源性元素选择性裂解，同时对于到靶点途中的内源性元素稳定(特别对于完整mAb清除慢的情况)的连接基是麻烦的。因此，最优的药物、连接基、mAb和靶点的组合需要基于个例选择并优化。
另一个可受益于有效前药途径的应用领域为T细胞结合抗体构建体(T-cellengaging antibody construct)(如双特异性或三特异性抗体片段)领域，其通过使免疫系统参与而作用于癌症。早已考虑到使活化的T细胞与癌细胞直接接触提供杀死癌细胞的有效方法(Thompson等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 366(2008)526–531)。在大量为此构建的双特异性抗体中，大部分包含两个抗体结合位点，一个位点靶向肿瘤，并且另一个靶向T细胞(Thakur等人，Current Opinion in MolecularTherapeutics 2010,12(3),340-349)。然而，对于包含活性T细胞结合位点的双特异性抗体，会发生周围的T细胞结合。这不仅阻碍了缀合物到达肿瘤，还导致细胞因子风暴和T细胞耗竭。光活化的抗T细胞抗体被用来克服这些问题，其中所述抗T细胞活性仅在其需要的时间和位置(即通过肿瘤结合臂在肿瘤集中后)用紫外线辐射后恢复。抗-人CD3(T细胞靶向)抗体可用光裂解的1-(2-硝基苯基)乙醇(NPE)包衣可逆地抑制(Thompson等人,Biochemical and Biophysical Research Communications 366(2008)526–531)。然而，基于光的活化限制于身体上光可穿透的部位，并且不容易修改以治疗全身性疾病(如转移癌)。可受益于前药途径的密切相关构建体为三特异性T细胞结合的抗体构建体，例如除了癌症靶向剂的CD3-和CD28 T细胞结 合基团(T-cell engaging moiety)。这样的构建体毒性太大不能像这样使用，并且CD3或CD28或者两者的结合域需要掩蔽。
以下是期望的：可选择性地且可预期地在靶位活化靶向药物，而不依赖于同源穿透和靶向，并且不依赖于在到靶点的途中和在靶点内可能变化以及不同病症和不同患者可能变化的内源性参数。
为了避免目前前药活化的缺点，在Bioconjugate Chem 2008,19,714-718中已提出利用非生物的生物正交化学反应(也就是Staudinger反应)引发前药的活化。简而言之，在所引出的概念中，前药为药物和触发剂的缀合物，该药物-触发剂缀合物不是内源性(如酶或特定的pH)活化，而是通过活化剂(即与前药中的触发基团(Trigger moiety)反应的物质)的受控的给药来活化，从而引发药物从触发剂的释放(或者反之亦然，从药物释放触发剂，但是人们可观察该释放过程)。然而结果证明对于此概念，Staudinger方法效果不好，并且鉴于利用Staudinger反应的释放机制的特定本质，其适用性是有限的。使用Staudinger反应的其它缺点为它们有限的反应速率，以及这些反应膦组分的氧化不稳定性。因此，期望提供用于非生物的生物正交反应的反应物，其在生理条件下稳定，相互间更易反应，并且可通过多种机制引发结合药物的释放，从而提供更通用的活化药物释放方法。
在癌症治疗中，使用不依赖于内源性活化机制(如pH、酶)的生物相容性化学反应用于选择性前药活化是强大的新工具。在需要的时间和位置的前药选择性活化可控制体内的许多过程，包括癌症。从而疗法(如抗肿瘤抗体疗法)可变得更具特异性，提供正常细胞和肿瘤间的增强的治疗对比，以减少不良副作用。在T-细胞结合的抗癌抗体的内容中，本发明提供失活抗体构建体(即前药)的全身性给药和肿瘤靶向，减少偏离靶点的毒性。在肿瘤充分摄取并且抗体在非靶点区域清楚后，通过给药活化剂将肿瘤结合抗体活化，活化剂与触发剂或者抗体或特定抗体域上的触发剂反应，导致触发剂的移除以及T细胞结合功能的恢复。这导致了T细胞的活化和抗癌作用(即这为药物释放)。
发明概述
为了更好地满足一个或多个上述期望，一方面，本发明提供双烯作为用于在生理环境中释放连接至反式-环辛烯的物质的活化剂的用途。与此相关，本发明还涉及用作活化剂的双烯，其用于在生理环境下释放连接至反式-环辛烯的物质，并且本发明还涉及在生理环境下激活连接至反式-环辛烯的物质的释放的方法，其中双烯用作活化剂。
另一方面，本发明还提供反式-环辛烯与双烯间的反电子需求的Diels-Alder反应作为用于在生理环境中释放结合物质的化学工具的用途。
另一方面，本发明为用于前药的给药和活化的药盒，所述药盒包含直接或间接连接至触发基团的药物和所述触发基团的活化剂，其中所述触发基团包含亲双烯体，并且所述活化剂包含双烯，所述亲双烯体包含反式-环辛烯环，所述环任选地含有一个或多个杂原子，并且选择所述双烯以使其能够与所述亲双烯体以反电子需求的Diels-Alder反应的形式反应。通过触发剂与活化剂的逆Diels-Alder反应来活化前药，导致药物的释放。
另一方面，本发明提供包含药物化合物的前药，所述药物化合物直接或间接连接至反式-环辛烯基团。
再一方面，本发明提供将药物化合物修饰为可通过非生物的生物正交反应触发的前药的方法，所述方法包括提供药物以及将所述药物化学连接至反式-环辛烯基团的步骤。
再一方面，本发明提供治疗方法，其中通过向患有可通过药物调节的疾病的患者给药包含在其活化后所述药物会被释放的触发基团的前药来治疗所述患者，其中所述触发基团包含反式-环辛烯环，所述环任选地包含一个或多个杂原子，并且选择所述双烯以便能与所述亲双烯体以反电子需求的Diels-Alder反应的形式反应。
另一方面，本发明提供包含八元非芳族环状单烯基团(优选环辛烯基团，更优选反式-环辛烯基团)的化合物，其用于动物或人中的前药疗法，所述基团包含与药物连接的键。
逆Diels-Alder反应(retro Diels-Alder reaction)
下面给出的反应路线为(3,6)-二-(2-吡啶基)-s-四嗪双烯和反式-环辛烯亲双烯体的[4+2]Diels-Alder反应，然后进行逆Diels-Alder反应，其中形成 产物和双氮。反应产物可互变异构化，这也如该路线所示。因为反式-环辛烯衍生物不包含如在经典DielsAlder反应中的吸电子基团，该类型Diels Alder反应区别于经典的Diels Alder反应，通常称作“反电子需求的Diels-Alder反应”。在下文中，两个反应步骤顺序(即开始的Diels-Alder环加成(通常为反电子需求的Diels Alder环加成)和随后的逆Diels Alder反应)会被简称作“逆Diels Alder反应”或“逆-DA”。有时会缩写为“rDA”反应。从而反应产物为逆Diels-Alder加成化合物或rDA加成化合物。
附图说明
图1示出在多柔比星(Dox)、经四嗪7活化和未经四嗪7活化的前药38以及单独的四嗪7的存在下对A431肿瘤细胞进行的细胞增殖试验。
图2为结合至牛下颌粘蛋白(BSM)I-S型的(A)125I-CC49和(B) 125I-CC49的尺寸排阻放射色谱图。
图3为(A)177Lu-CC49-TCO和(B)在牛下颌粘蛋白(BSM)I-S型存在下的177Lu-CC49-TCO与四嗪反应1小时前以及(C)与四嗪反应1小时后的尺寸排阻放射色谱图。
图4示出在多柔比星(Dox)以及经四嗪29(10μM)活化和未经四嗪29活化的前药50的存在下对A431肿瘤细胞进行的细胞增殖试验。
图5为结合肿瘤的T-细胞结合三链抗体的活化的示意图。
发明详述
在广义上，本发明是基于以下认识：当反式-环辛烯衍生物与适合的双烯(如四嗪衍生物)环加成后，药物可从所述反式-环辛烯衍生物释放。不希望被理论束缚，发明人相信所述逆Diels-Alder加成化合物的分子结构可使得该rDA加成化合物内发生自发性消除(spontaneous elimination)反应或环 化反应以释放药物。特别地，发明人相信适当地修饰rDA组分生成rDA加成化合物，其中亲双烯体上连接药物的键在双烯的孤电子对存在下断裂。
本发明首次提供反式-环辛烯与双烯间的反电子需求的Diels-Alder反应作为用于在生理环境中释放结合物质的化学工具的用途。应当理解，基于本说明书，所述物质结合至TCO。在该方面中，本发明应看作与具体化学结构无关。在广义上，本发明证明生物正交化学(即rDA反应)用于新颖且不可预料的目的的用途，所述目的即以可触发生物正交反应的方式释放结合形式的化学物质(如药物)，从而提供所述化学物质。术语“使用反电子需求的Diels-Alder反应”不应以严格意义理解为仅指其中使该反应的两个反应物(其中亲双烯体具有与其结合的药物)结合的阶段。然而应当理解，“使用该反应”还暗示人们应以与反应物(即所述亲双烯体)之一结合的药物开始。
在前药活化中使用逆-Diels Alder反应的一般概念如路线1中说明。
路线1：
在本发明中，术语“双烯”(包括上述路线中的双烯)表示包含至少2个共轭双键的杂环基团。如包含于活化剂中的双烯可为包含第三双键的环结构(如四嗪，其为本发明的优选活化剂)的一部分。
在上述路线中，“TCO”表示反式-环辛烯。在此使用的术语反式-环辛烯可能包含一个或多个杂原子，并且特别指满足式(1a)的结构。广义上讲，除了在Staudinger反应基础上做出的尝试外，发明人发现，选择TCO作为前药触发基团提供了使得药物(活性)基团变为前药(可活化)基团的通用工具，其中通过亲双烯体(触发剂)与双烯(活化剂)的强效的非生物的生物正交反 应(也就是前面提到的逆Diels-Alder反应)进行活化，并且其中所述前药为药物-亲双烯体缀合物。
从路线1中会理解，在逆Diels-Alder加成化合物和终产物中，所示的TCO基团和所示的双烯基团分别是TCO和双烯基团在逆Diels-Alder反应中转化后的基团。
成功应用非生物的生物正交化学反应的要求为两个参加的官能团具有经过细致调整的反应性，这样避免了共存官能团的干扰。理想地，反应的参加者为非生物的、在生理条件下可反应的、并且不管它们的细胞/生理环境仅相互可反应(生物正交)的。生物环境对于选择性的需求排除了大部分常规反应的使用。
然而，已证明反电子需求的Diels-Alder反应在动物中低浓度和半-等摩尔条件下的用途(R.Rossin等人,Angewandte Chemie Int Ed 2010,49,3375-3378)。本发明的反应参加者为有张力的(strained)反式-环辛烯(TCO)衍生物和适合的双烯如四嗪衍生物。TCO和四嗪的环加成反应得到中间体，然后其通过逆-Diels–Alder环加成中排除双氮来重排，以形成二氢哒嗪缀合物。该物质及其互变异构体为逆Diels-Alder加成化合物。
本发明的发明人已非显而易见地认识到，TCO的结构非常适合引发与其连接的药物的释放(作为TCO亲双烯体中可用的双键和双烯参与的反应的结果)。认为使其成为可能的特点为(a)rDA反应的性质，所述rDA反应包括双键的重排，这可用于引起消除级联；(b)具有二氢哒嗪基团的rDA加成化合物的性质，所述加成化合物为非芳族的(或另一个非芳族基团)，并且其可通过消除反应重排以形成共轭双键或形成芳族基团(如哒嗪)，(c)可能具有弱碱性的二氢哒嗪基团并因此可能催化消除反应的rDA加成化合物的性质，以及(d)rDA加成化合物的双环性质，这使从所得的双环基团的双烯部分至所述双环基团的TCO部分上的取代基能够形成桥(因此为另外的环)。
因此要强调本发明的范围远远超越具体的化学结构。广义上讲，本发明利用了以下认识：亲双烯体的rDA反应以及rDA加成化合物体现了在生物正交反应中能够引起药物释放的通用平台。
本领域技术人员清楚该反应为生物正交的和对于反应对(reaction pair)存在多种结构选择的事实。如：rDA反应是预靶向药物(pre-targeted medicine) 领域已知的。参考如WO 2010/119382、WO 2010/119389和WO2010/051530。应当理解，尽管本发明呈现该反应完全不同的用途，但如在预靶向中使用的可用于rDA反应对的多种结构可能性在本发明领域也是可用的。
本发明中所用的亲双烯体触发基团包含反式-环辛烯环，该环任选地包含一个或多个杂原子。在下文中，为了易读性，该八元环基团会被定义为反式-环辛烯基团，或者缩写为“TCO”基团。应当理解，实质上在于八元环作为亲双烯体以及反应时从其缀合的药物释放的的可能性。本领域技术人员熟悉以下事实：亲双烯体活性不是必须依赖于环中所有碳原子的存在，因为杂环单烯烃八元环也已知具有亲双烯体活性。
从而，总体上讲，本发明不严格限于药物-取代的反式-环辛烯。有机化学领域技术人员会知道，存在其它八元环系亲双烯体，其包含与反式-环辛烯相同的环内双键，但其可在环上其它位置具有一个或多个杂原子。即本发明一般涉及八元非芳族环状烯基团，优选环辛烯基团，并且更优选反式-环辛烯基团，其包含缀合的药物。
不同于例如药物活性物质的情况(其中体内作用经常随小的结构变化而变化)，本发明首先且首要地要求合适的化学反应性与合适的药物-缀合物设计的组合。从而，可能的结构扩展到本领域技术人员熟悉的作为亲双烯体反应的那些。
应当注意，根据命名法的选择，TCO亲双烯体也可被表示为E-环辛烯。参考常规命名法会理解，作为环辛烯环上取代的结果，根据取代基的位置和分子量，相同的环辛烯异构体可形式上变为用Z-异构体表示。在本发明中，本发明的任意取代变体(不管形式上为“E”或“Z”，或者“顺式”或“反式”异构体)均会被认作是未取代的反式-环辛烯或未取代的E-环辛烯的衍生物。术语“反式-环辛烯”(TCO)和E-环辛烯可互换使用，并且对于本发明的所有亲双烯体均保持，即使在取代基形式上要求相反命名法的情况下也保持。即本发明涉及环辛烯，其中如下编号的碳原子1和6为E(异侧)式位置或反式位置。
本发明会参照具体实施方案并参考具体图进一步说明，但本发明不限于此，而仅由权利要求限定。权利要求中的任意参考标记不应被解释为限制范围。描述的图仅为示意性且非限制性的。在图中为了说明目的，一些要素的尺寸可扩大并且不是按比例画。除非另外明确说明，当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词(如“a”、“an”、“the”)时，包括该名词的复数。
此外应注意，说明书和权利要求中使用的术语“包含/包括”不应解释为受限于之后所列的方式；它不排除其它要素或步骤。从而，表述“包含装置A和B的设备”的范围不应限制为仅由组件A和B组成的设备。其意指对于本发明，所述设备有重要意义的组件仅为A和B。
在下面数个化学式中涉及“烷基”和“芳基”。就“烷基”而言，其各自独立地表示至多10个碳原子的脂族的直链的、支链的、饱和的、不饱和的和/或环状的烃基，可能包含1-10个如O、N或S的杂原子，并且“芳基”各自独立地表示至多20个碳原子的芳族或杂芳族基团，其可能被取代，并且可能包含1-10个如O、N、P或者S的杂原子。“芳基”还包括“烷基芳基”或“芳基烷基”(简单实例：苄基)。“烷基”、“芳基”、“烷基芳基”和“芳基烷基”包含的碳原子数目可通过这些术语之前的标号表示(即C1-10烷基意指所述烷基可包含1-10个碳原子)。本发明的某些化合物具有手性中心和/或互变异构体，并且所有对映异构体、非对映异构体和互变异构体及其混合物均在本发明的范围内。在多个结构式中，基团或取代基用字母(如“A”、“B”、“X”、“Y”)和多个(编号的)“R”基团表示。这些字母的定义参考各个结构式解释，即除非另外说明，在不同结构式中，这些字母可各自独立地具有不同的含义。
在本文描述的本发明的所有实施方案中，烷基优选低级烷基(C1-4烷基),并且芳基各自优选为苯基。
前期工作(R.Rossin等人，Angewandte Chemie Int Ed 2010,49,3375-3378)证明了反电子需求的Diels-Alder反应对于预靶向放射免疫显象术的用途。(3,6)-二-(2-吡啶基)-s-四嗪衍生物和E-环辛烯间发生特定环加成实例，然后进行逆Diels Alder反应，其中形成产物和氮气。因为反式-环辛烯衍生物不包含如在经典Diels Alder反应中的吸电子基团，该类型的Diels Alder反应区别于经典的Diels Alder反应，经常称作“反电子需求的Diels-Alder反应”。在下文中，这两个反应步骤顺序(即开始的Diels-Alder环加成(通常为反电子需求的Diels Alder环加成)和随后的逆Diels Alder反应)简称作“逆Diels Alder反应”。
逆Diels-Alder反应
逆Diels-Alder偶联化学一般包括一对反应物，其偶联以形成不稳定中间体，该中间体通过逆Diels-Alder反应消除作为唯一副产物的小分子(根据起始化合物其可为如N2、CO2、RCN)以形成逆Diels-Alder加成化合物。一对反应物包含：适合的双烯(例如四嗪衍生物，如缺电子四嗪)作为一个反应物(即一个生物正交反应基团)，和适合的亲双烯体(如有张力的环辛烯(TCO))作为另一个反应物(即另一个生物正交反应基团)。
如缺电子(取代的)四嗪与TCO基团极快的反应生成了连接中间体(ligationintermediate)，其通过在[4+2]逆Diels-Alder环加成中消除作为唯一副产物的N2重排为二氢哒嗪逆Diels-Alder加成化合物。在水溶液环境中，起始形成的4,5-二氢哒嗪产物可互变异构为1,4-二氢哒嗪产物。
这两个反应物质是非生物的，并且在体内不经历快速代谢或副反应。它们是生物正交的，如它们在生理介质中选择性相互反应。从而，本发明的化合物和方法可在活有机体中使用。此外，反应性基团较小，并且可在生物样品或活有机体中引入而不显著改变其中生物分子的尺寸。关于反电子需求的Diels-Alder反应和反应性物质对的行为的参考包括：Thalhammer,F；Wallfahrer,U；Sauer,J,Tetrahedron Letters,1990,31(47),6851-6854；Wijnen,JW；Zavarise,S；Engberts,JBFN,Journal Of Organic Chemistry,1996,61,2001-2005；Blackman,ML；Royzen,M；Fox,JM,Journal Of The American Chemical Society,2008,130(41),13518-19),R.Rossin,P.Renart Verkerk,Sandra M.van den Bosch,R.C.M.Vulders,l.Verel,J.Lub,M.S.Robillard, Angew Chem Int Ed 2010,49,3375,N.K.Devaraj,R.Upadhyay,J.B.Haun,S.A.Hilderbrand,R.Weissleder,Angew Chem IntEd 2009,48,7013,和Devaraj等人,Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,1-5。
应当理解，广义上讲，根据本发明，之前提到的逆Diels-Alder偶联和随后的药物活化化学可适用于基本上任意一对可在前药疗法中使用的分子、基团或结构片段。即，这样的反应对中的一个包含连接至亲双烯体(触发剂)的药物。另一个为与所述亲双烯体的反应中使用的互补的双烯。
触发剂
所述前药包含用DD表示的直接或间接连接至用TR表示的触发基团的药物，其中所述触发基团为亲双烯体。所述亲双烯体广义上讲为八元非芳族环状烯烃基团(优选环辛烯基团，并且更优选为反式-环辛烯基团)。任选地，反式-环辛烯(TCO)基团包含至少两个基本上固定在同一平面的环外键，和/或它包含任选存在的至少一个在直立键位置(axialposition)而不是平伏键位置(equatorial position)的取代基。有机化学领域的技术人员会理解，术语“基本上固定在相同的平面”指通常认为键固定在同一平面的键合理论。这样的固定在同一平面的代表性实例包括双键和有张力的稠环。如至少两个环外键可为连接至氧的双键(即C＝O)的两个键。至少两个环外键也可为相邻两个碳原子上的单键，条件是这些键共同为呈现基本上平面结构的稠环(即稠合至TCO环)的一部分，随后在基本上一个或同一平面中固定所述两个单键。后者的实例包括有张力的环，如环丙基和环丁基。不希望被理论束缚，发明人相信在同一平面中至少两个环外键的存在会产生至少部分平的TCO环，这可在逆-Diels-Alder反应中产生更高的反应性。
所述TCO优选满足下式(1a)：
对于通过级联消除机制起作用的触发剂TR，A和P各自独立地为CRa 2或CRaXD，条件是A和P中的至少一个为CRaXD。XD为(O-C(O))p-(LD)n-(DD)、S-C(O)-(LD)n-(DD)、O-C(S)-(LD)n-(DD)、S-C(S)-(LD)n-(DD)、O-S(O)-(LD)n-(DD)， 其中p＝0或1，(LD)n为任选的连接基(其中n＝0或1)，其优选地通过S、N、NH或O连接至TR，其中所述S、N、NH或O为连接基的一部分，其可由多个以线性和/或支化式排列的单元组成。DD为一个或多个治疗基团或药物，其优选地通过S、N、NH或O连接，其中所述S、N、NH或O为所述治疗基团的一部分。优选地，XD为(O-C(O))p-(LD)n-(DD)，其中p＝0或1，优选为1，并且n＝0或1。
对于通过环化消除机制起作用的触发剂TR，A和P各自独立地为CRa 2或CRaXD，条件是A和P中的至少一个为CRaXD。XD为O-C(O)-(LD)n-(DD)、S-C(O)-(LD)n-(DD)、O-C(S)-(LD)n-(DD)、S-C(S)-(LD)n-(DD)、NRd-C(O)-(LD)n-(DD)、NRd-C(S)-(LD)n-(DD)、C(O)-(LD)n-(DD)、C(S)-(LD)n-(DD)。(LD)n为任选的连接基(其中n＝0或1)，其优选地通过S、N、NH或O连接至TR，并且其可由多个以线性和/或支化式排列的单元组成。DD为一个或多个治疗基团或药物，其优选通过S、N、NH或O连接，其中所述S、N、NH或O为所述治疗基团的一部分。优选地，XD为NRd-C(O)-(LD)n-(DD)或C(O)-(LD)n-(DD)，其中n＝0或1。
优选地，当DD通过NH结合至TR或LD时，所述NH为来自DD的伯胺(-NH2)基团，并且当DD通过N结合时，所述N为来自DD的仲胺(-NH-)基团。类似地，优选地，当DD通过O或S结合时，所述O或S分别为来自DD的羟基(-OH)基团或巯基(-SH)基团。
还优选地，DD中包含的所述S、N、NH或O基团结合至DD的脂肪碳或芳族碳。
优选地，当LD通过NH结合至TR时，所述NH为来自LD的伯胺(-NH2)基团，并且当LD通过N结合时，所述N为来自LD的仲胺(-NH-)基团。类似地，优选地，当LD通过O或S结合时，所述O或S分别为来自LD的羟基(-OH)基团或巯基(-SH)基团。
还优选地，LD中包含的所述S、N、NH或O基团结合至LD的脂肪碳或芳族碳。
提及本发明中的连接基LD，其可以是能够或不能自切除(self-immolative)的或其组合，并且其可由多个自切除单元组成。
作为进一步说明，如果p＝0且n＝0(对于级联消除机制而言)，则药物物质DD直接构成消除反应的离去基团，并且如果p＝0且n＝1，则自切除连 接基构成消除反应的离去基团。连接基LD和药物DD的结合位置和方式是技术人员已知的(参见例如，Papot等人,Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry,2008,8,618-637)。然而，自切除连接基LD的代表性但非限制性实例为苄基衍生物，如以下所画的那些。右侧展示了具有多个单元的自切除连接基的实例；该连接基不仅会降解为CO2和一个4-氨基苄基醇单元，还会降解为一个1,3-二甲基咪唑烷-2-酮单元。
在一关注的实施方案中，Y、Z、X、Q各自独立地选自CRa 2、C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、S、SO、SO2、O、NRb和SiRc 2，并且Y、Z、X和Q中的至多三个选自C＝CRa 2、C＝O、C＝S和C＝NRb，其中两个R基团可共同形成环，并且条件是不存在选自O-O、O-NRb、S-NRb、O-S、O-S(O)、O-S(O)2和S-S的相邻原子对，并且使得Si只与CRa 2或O相邻。
在一优选实施方案中，式(1a)的TCO为全碳环。在另一优选实施方案中，式(1a)的TCO为环中具有1-3个氧原子(优选具有一个氧原子)的杂环碳环。
在另一关注的实施方案中，PQ、QX、XZ、ZY、YA键中的一个为稠环的一部分或由CRa＝CRa组成，使得两个环外键被固定在同一平面中，并且条件是PQ和YA不是芳族5-元环或6-元环、或者共轭7-元环、或者CRa＝CRa的一部分；当不是稠环一部分时，P和A独立地为CRa 2或CRaXD，条件是P和A中的至少一个为CRaXD；当稠环的一部分P和A独立地为CRa或CXD时，条件是至少一个为CXD；其余基团(Y、Z、X、Q)相互独立地为CRa 2、C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、S、SO、SO2、O、NRb、SiRc 2，使得至多一个基团为C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb，并且不存在选自O-O、O-NRb、S-NRb、O-S、O-S(O)、O-S(O)2和S-S的相邻原子对，并且使得Si(如果存在)与CRa 2或O相邻，并且CRa 2＝CRa 2键(如果存在)与CRa 2或C＝CRa 2相邻。
T、F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br或I的取代基；
在一些实施方案中存在稠环，导致两个环外键固定在基本相同的平面中。它们选自如下定义的稠合3-元环、稠合4-元环、稠合双环7-元环、稠合芳族5-元环、稠合芳族6-元环和稠合平面共轭7-元环：
稠合3-元环为：
其中E、G为上面提到的8-元环的一部分，并且可稠合至PQ、QP、QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ、YA、AY，使得P、A为CRa或CXD，并且使得CXD只可存在于A和P中。
E-G为CRa-CRa或CRa-CXD，并且D为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、NRb、O、S，或者E-G为CRa-N或CXD-N，并且D为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、NRbO或S。
稠合4-元环为：
E、G为上面提到的8-元环的一部分，并且可稠合至PQ、QP、QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ、YA、AY，使得P、A为C、CRa或CXD，并且使得CXD只可存在于A和P中。
E和G为CRa、CXD或N，并且D、M相互独立地为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb，但不存在相邻的O-O或S-S基团；或者E-D为C＝CRa并且G为N、CRa、CXD并且M为CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb；或者E-D为C＝N并且G为N、CRa、CXD并且M为CRa 2、S、SO、SO2、O；或者D-M为CRa＝CRa并且E和G各自独立地为CRa、CXD或N；或者D-M为CRa＝N并且E为CRa、CXD、N，并且G为CRa或CXD；或者E为C，G为CRa、CXD或N，并且D和M为CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb，或者C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2中的至多1个，但不存在相邻的O-O或S-S基团；或者E和G为C，并且D和M相互独立地为CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb，但不存在相邻的O-O或S-S基团。
稠合双环7-元环为：
E、G为上面提到的8-元环的一部分，并且可稠合至PQ、QP、QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ、YA、AY，使得P、A为C、CRa或CXD，并且使得CXD只可存在于A和P中；
E、G为C、CRa、CXD或N；K、L为CRa；D、M形成CRa＝CRa或CRa＝N，或者D、M相互独立地为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb，但不存在相邻的O-O、S-S、N-S基团；J为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb；具有至多两个含N基团；或者
E、G为C、CRa、CXD；K为N并且L为CRa；D、M形成CRa＝CRa键或者D、M相互独立地为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2、NRb，但不存在相邻的O-O、S-S、N-S基团；J为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2、S、SO、SO2、O、NRb；具有至多两个含N基团；或者
E、G为C、CRa、CXD；K和L为N；D、M、J相互独立地为CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、C＝CRa 2基团；
稠合芳族5-元环为：
E、G为上述8-元环的一部分，并且可稠合至QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ。
E、G为C；L、K或M基团中的一个为O、NRb、S，并且其余两个基团相互独立地为CRa或N；或者，
E为C并且G为N。L、K、M相互独立地为CRa或N。
稠合芳族6-元环为：
E、G为上述8-元环的一部分，并且可稠合至QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ。
E、G为C。L、K、D、M相互独立地为CRa或N。
稠合平面共轭7-元环为：
E、G为上述8-元环的一部分，并且可稠合至QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ。
E、G为C；L、K、D、M为CRa；J为S、O、CRa 2、NRb。
如上所示的Ra各自独立地为H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”、CR’NR”，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；
如上所示的Rb各自独立地选自H、烷基、芳基、O-芳基、O-烷基、OH、C(＝O)NR’R”(其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基)、R’CO-烷基(其中R’为H、烷基和芳基)；
如上所示的Rc各自独立地选自H、烷基、芳基、O-烷基、O-芳基、OH；
如上所示的Rd各自为H、C1-6烷基和C1-6芳基；
其中两个或更多个Ra、Rb、Rc基团可共同形成环；
在上述全部实施方案中，任选地，A、P、Q、Y、X和Z中的一个，或者包含它们的取代基或稠环，或者自切除连接基LD，或者药物DD任选地通过一个或多个间隔基(spacer)SP结合至一个或多个靶向剂TT或掩蔽基团MM。
如上所述的TCO的合成对本领域技术人员而言是容易获取的。特别地，这也适用于在张力环烯烃环中具有一个或多个杂原子的的TCO。这方面的参考包括Cere等人，Journalof Organic Chemistry 1980,45,261和Prevost等人，Journal of the AmericanChemical Society 2009,131,14182。
在一个优选实施方案中，所述反式-环辛烯基团满足式(1b)：
其中，除了任选存在至多两个固定在同一平面的环外键之外，Ra各自独立地表示H，或者在最多四种情况中表示选自下列的取代基：烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”、CR’NR”，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；
如上所示的Re各自独立地选自H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、PO3H、NO、NO2、CN、CF3、CF2-R’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”、CR’NR”，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；其中两个Ra、Re基团可共同形成环；
任选地，包含在连接基基团中的一个Ra、Re任选地通过间隔基SP连接至靶向剂TT或掩蔽基团MM，并且其中T和F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br和I的取代基，并且XD如上述对于式(1a)所定义。
优选地，各个Ra、Re独立地选自H、烷基、O-烷基、O-芳基、OH、C(＝O)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为烷基和芳基；
在前述亲双烯体中，优选地，所述至少两个固定在同一平面的环外键选自(a)稠合环丁基环的单键，(b)稠合芳环的杂化键，(c)结合至氧的环外双键，以及(d)结合至碳的环外双键。
在另一优选实施方案中，所述亲双烯体为选自下列结构的化合物：
-----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、,LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
-----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
-----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
对于如下讨论的通过级联消除机制进行的活化，优选的亲双烯体为上述的亚组，也就是：
-----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
-----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
TCO作为载体的用途
在其全部实施方案中，本发明还涉及满足式(1a)的反式-环辛烯作为治疗化合物的载体的用途。如上所讨论，广义上讲，将反式-环辛烯认作TCO， 优选全碳环或包含一个或两个杂原子的环。治疗化合物为药物或旨在具有治疗用途的其它化合物或基团。根据本发明此方面的TCO作为载体的用途不涉及治疗化合物的治疗活性。事实上，如果治疗化合物是意图开发为药物的药物物质(实践中其中许多会失败)，在测试药物时仍可使用TCO作为载体。在这个意义上，具有载体能力的TCO以相同方式被视作药物赋形剂，用作将药物引入个体时的载体。
将TCO用作载体具有下述优势：它能够向个体给药由可与双烯(特别是四嗪)进行生物正交反应的基团运载的药物。这提供了有力的工具，不仅影响运载入体内的药物的结果，还跟踪其结果(如通过使标记的双烯与其反应)，或者改变其结果(如通过使pK调节剂与其结合)。这都基于使双烯与TCO在上面讨论的rDA反应中反应的可能性。所述载体优选与下面讨论的活化剂反应，以便引起在此充分讨论的治疗化合物从TCO的释放。
活化剂
活化剂包含生物正交反应基团，其中所述活化剂的生物正交反应基团为双烯。双烯与其它生物正交反应基团(触发剂，其为亲双烯体(参见前文))反应。选择活化剂的双烯以便能够与触发剂的亲双烯体通过进行Diels-Alder环加成然后进行逆Diels-Alder反应来进行反应，从而得到逆Diels-Alder加成化合物。然后该中间体加成化合物释放一个或多个药物，其中所述药物释放可由多种与逆Diels-Alder加成化合物的具体分子结构有关的环境或条件导致。
在其它优选实施方案中，选择所述活化剂以引发两种药物释放机制中的一个，所述药物释放机制中的一个为通过分子内环化，另一个为通过消除或级联消除。
通过分子内环化的药物释放
在本发明的一个优选实施方案中，通过逆Diels-Alder加成化合物内的分子内环化引起所述一种或多种药物的释放：源自所述活化剂(即源自所述双烯)的亲核位点与源自所述前药(即源自所述亲双烯体触发基团，特别是源自该触发基团中的XD基团，参见前文)的亲电位点，从而形成环，并且从 而将药物作为离去基团释放。由于在所述逆Diels-Alder加成化合物内，已使亲核位点和亲电位点极为贴近的集中，所述分子内反应有效且有效率地进行。另外，环状结构的形成也是分子内反应发生的驱动力，从而也可促使离去基团的有效释放，即药物的释放。在逆Diels-Alder反应之前，亲核位点和亲电位点之间的反应不是有效率的，因为那时的反应为分子间反应，此外不涉及环状结构的形成。
上述实例说明了逆Diels-Alder加成化合物内的环化反应可如何导致药物物质的释放。所述药物释放的驱动力为逆Diels-Alder加成化合物内亲核位点(在此处为所述四嗪活化剂3-和6-位的氨基)和亲电位点(在此为酯羰基)的极度贴近，以使这些反应性物质具有高的局部浓度。此外，稳定的6元环物质的形成可驱动环化，其中这种环形成可进一步通过稠合的环辛烯和二氢哒嗪环的构象(预排布(pre-organize)需要形成的6元环中6个原子中的5个)增强。在任意情况和任意方式中检查该方法，药物物质(在此为醇“药物-OH”)有效地从逆Diels-Alder加成化合物移除，而它不从单独的前药移除。
以下也是可能的：亲核位点通过对亲电位点的亲核进攻辅助驱除药物物质，随后药物释放，但是不真正形成(稳定的)环状结构。在该情况中，未形成环结构，并且亲核位点保持完整，例如因为该环结构是短暂存在并不稳定的，并且随着亲核位点的再形成而裂开。
在该本发明第一优选的实施方案中，所述活化剂为带有一个或多个亲核位点的双烯，其中该亲核位点可为本领域已知的任意亲核基团。人们必须考虑到在(人)体内存在的条件下(这样的条件例如pH＝约7.4的生理条件，或者例如在恶性组织中普遍的条件(pH值可能低于7.4)下)，所述亲核位点必须能够用作亲核体。亲核位点的非限制性实例为氨基、醇(或羟基)、巯基、 羧化物、酰胺、脲、硫脲、膦或N-氧化物基团。从这些中，最优选的为氨基、巯基或醇基，因为这些通常性质上最亲核，并且因此最有效。
氨基可为伯氨基(R1-NH2)、仲氨基(R1R2NH)或叔氨基(R1R2R3N)，优选为伯氨基或仲氨基；更一般地，氮原子优选带有一个或两个氢原子。所述氨基性质上可为脂肪族、苄型、烯丙型或芳族。可将所述氨基亲核位点置于杂环或杂芳环中，例如特别是在5-、6-或7-元结构中。实例为咪唑、三唑、吡咯或吡啶杂芳环。此外，可将所述亲核氮原子与其它如N、O、S或P原子的杂原子相邻放置，这样，所述氨基可为如羟基-氨基、肼基或磷氮基(phosphazene)的一部分。
醇或羟基(R1-OH)可为脂肪族、苄型或烯丙型醇，并且可为伯醇、仲醇或叔醇，优选为伯醇。所述醇性质上也可为芳族的，所以R1基团可表示任意(杂)芳基；则醇为酚基。羟基也可为羟基-氨基的一部分，所以所述亲核氧原子与N原子相邻放置。
巯基或硫醇基(R1-SH)可为脂肪族、苄型或烯丙型巯基，并且可为伯巯基、仲巯基或叔巯基，优选为伯巯基。所述巯基性质上也可为芳族的，所以R1基团可表示任意(杂)芳基。由于在生理条件下，证明所述巯基去质子化，使它们更亲核，所以它们是有吸引力的亲核体。
羧化物基团为去质子化的羧酸基团(R1-COOH)，并且确实，在生理条件下，这些基团以羧化物的形式存在，使得这些基团有些亲核。R1基团的性质可为脂肪族的或芳族的。
酰胺基团可为普通酰胺基团(R1-CO-NH-R2)或亚磺酰胺基团(R1-SO2-NH-R2)，其中氮原子带有氢原子，其作为亲核原子起作用。关注的酰胺基团为其中R2-基团为芳族的那些；这些基团可更容易地去质子化，使得酰胺更亲核。以此类推，特别关注的脲基(R1-NR3-CX-NH-R2)为其中R2-基团为芳族的那些，因为这些基团相邻氮原子上的质子可更容易地去质子化，使得该位点更亲核。R3基团可为H、脂肪族的或芳族的。X可为氧(普通脲)或者硫(硫脲)。硫脲也是特别受关注的脲，因为在这些基团中，硫原子可用作亲核位点。
膦基团(PR1R2R3)也为亲核基团。优选的膦为其中R1、R2和R3中至少2个，优选全部3个性质为芳族的，因为这些膦更稳定，并且最不易于氧化。
N-氧化物也称作亲核体，其中氧原子为亲核原子。特定实例为其中氮原子为芳族基团一部分的那些，例如吡啶-氧化物。
双烯
活化剂为双烯。本领域技术人员知道在逆Diels-Alder反应中反应的双烯的价值。包含于活化剂中的双烯可为包含第三双键的环(如四嗪，其为本发明的优选活化剂)的一部分。
通常，所述活化剂为包含杂环结构的分子，所述环结构包含双烯基团。本领域技术人员熟悉双烯基团的概念，并且双烯基团由四个原子(称作PQRS)的序列组成，所述原子键合，以具有被单键分隔开的2个双键(即P＝Q-R＝S)。
优选的双烯如下参照式(2)-(4)给出。这些双烯中存在一个或多个亲核位点，并且所述一个或多个亲核位点可存在于给定的R1和/或R2和/或A和/或B和/或X和/或Y基团中。所述一个或多个亲核位点优选存在于R1和/或R2基团中。
在式(2)中，R1选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R”、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基；A和B各自独立地选自烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N+O-、N+R，其中N+R中的R为烷基，条件是A和B不都为碳；X选自O、N-烷基和C＝O；并且Y为CR，其中CR中的R选自H、烷基、芳基、C(＝O)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)OR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基。
特别适合作为环辛烯的反应配体的双烯如式(3)给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N-烷基、N-芳基、C＝O和CN-烷基；B为O或S；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”、R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-。
特别适合作为对于环辛烯的反应配体的另一个双烯如式(4)给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO、NO2、OR’、SR’、CN、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2OR’、PO3R’R”、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、 NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N、C-烷基、C-芳基和N+O-；B为N；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-。
根据本发明，特别有用的双烯为如式(5)、(6)和(7)分别给出的1,2-二嗪、1,2,4-三嗪和1,2,4,5-四嗪衍生物。这些二嗪、三嗪或四嗪中存在一个或多个亲核位点，并且所述一个或多个亲核位点可存在于给定的R1和/或R2和/或X和/或Y基团中。所述一个或多个亲核位点优选存在于R1和/或R2基团中。
1,2-二嗪在(5)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；X和Y各自独立地选自O、N-烷基、N-芳基、C＝O、CN-烷基、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基，其中X-Y可为单键或双键，并且其中X和Y可在除六元 二嗪外的二级环结构中连接。优选地，X-Y表示酯基(X＝O且Y＝C＝O；X-Y为单键)或者X-Y表示环烷基(X＝CR’且Y＝CR”；X-Y为单键；R’和R”连接)，优选为环丙烷环，这样R’和R”在1,2-二嗪外的第一碳原子处相互连接。
1,2,4-三嗪在(6)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；X选自CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基。
1,2,4,5-四嗪在(7)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO、NO2、OR’、SR’、CN、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2OR’、PO3R’R”、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基。
由于缺电子1,2-二嗪(5)、1,2,4-三嗪(6)或1,2,4,5-四嗪(7)对亲双烯体通常更有反应性，因此这样的双烯是特别令人关注的。当二嗪、三嗪或四嗪被通常不认为是供电子的基团或结构片段取代或被吸电子基团取代时，其为缺电子的。例如，R1和/或R2可表示选自下列的取代基：H、烷基、NO2、F、Cl、CF3、CN、COOR、CONHR、CONR2、COR、SO2R、SO2OR、SO2NR2、PO3R2、NO、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、2,4-咪唑基、2,5-咪唑基或苯基，所述取代基任选被一个或多个吸电子基团(如NO2、F、Cl、CF3、CN、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、COR、SO2R、SO2OR、SO2NR2、PO3R2、NO、Ar)取代，其中R为H或烷基，并且Ar表示芳族基团，特别是苯基、吡啶基或萘基。
式(7)的1,2,4,5-四嗪作为活化剂双烯是最优选的，因为这些分子在逆Diels-Alder反应中与亲双烯体(如优选的TCO亲双烯体)是最易反应的，甚至当R1和/或R2基团不必须是吸电子时，并且甚至当R1和/或R2实际上是供电子时。供电子基团例如OH、OR’、SH、SR’、NH2、NHR’、NR'R”、NHC(＝O)R”、NR’C(＝O)R”、NHC(＝S)R”、NR’C(＝S)R”、NHSO2R”、NR’SO2R”，并且R’和R”各自独立地为烷基或芳基。其它供电子基团的实例为一个或多个如上表所列的供电子基团与其结合的苯基，特别是当在苯基的2-、4-和/或6-位取代时。
1,2,4,5-四嗪本质上可为不对称的或对称的，即式(7)中的R1和R2基团可分别为不同基团或相同基团。对称的1,2,4,5-四嗪为最优选的，因为那样逆Diels-Alder反应会生成逆Diels-Alder二氢-哒嗪加成化合物，所述二氢-哒嗪环两侧都带有在环化反应中可为活性的亲核位点。
1,2,4,5-四嗪的每个R1和R2基团带有一个亲核位点是优选的。
1,2,4,5-四嗪的亲核位点以逆Diels-Alder加成化合物内的分子内环化反应生成具有低环张力的环结构的形式放置是优选的。环张力由由于特定环内的连接性必须采用的高能键角所导致。如本领域中已知，每种环结构类型(可能存在杂原子或不饱和键)从较小环至较大环会有其自身环张力变化顺序。然而，一般说来，大多数5-、6-和可能的7-元环以及更大的环(如12-和13-元环)的环张力小，而3-、4-、9-和10-元环的环张力通常大或更大。例如，环丙烷、环丁烷和环壬烷的环张力分别为120、110和50kJ/mol，而环戊烷和环己烷的环张力分别为25和几乎0kJ/mol，环十二烷的环张力也小。因此，如从四嗪环数起，亲核原子置于1,2,4,5-四嗪的3-和/或6-取代基(即式(7)中的R1和/或R2基团)的第1(或α)位、第2(或β)位或第3(或γ)位的1,2,4,5-四嗪是最优选的，因为这些情况中可环化为5-、6-或7-元环。亲核位点在R1和/或R2基团的第7、第8或第9原子也是优选的，因为这些 情况适合环化为12-或13-元环。为了说明该定义，在以下画出3,6-二氨基-1,2,4,5-四嗪(氮在α位)、3,6-二-(2,5-咪唑基)-1,2,4,5-四嗪(氮在β位)、3,6-二-(2-氨基乙基)-1,2,4,5-四嗪(氮在γ位)和3,6-二-(6-氨基己氧基)-1,2,4,5-四嗪(氮在第8位)。
在下文中，带有亲核位点的1,2,4,5-四嗪的具体实例会通过定义式(7)中R1和R2基团来强调。首先列出对称四嗪(即R1与R2相同)。然后，会讨论并给出不对称1,2,4,5-四嗪(即R1与R2不同)的实例。
对称四嗪的实例为：R1＝R2＝OH、SH、NH2、NHR'、NH-CO-R'、NH-SO-R'、NH-SO2-R'，其中R'表示烷基或芳基，优选为甲基、乙基、苯基或甲苯基。其中R1＝R2＝OH、SH、NH2或NHR'的对称四嗪是优选的。注意在这些实例中，亲核位点位于从四嗪环数R1和R2基团的第1(α)原子。
对称四嗪的其它实例为连接有苄醇、苄巯基或苄氨基的那些，其中R1＝R2＝CH2OH(或CHR'OH、CR'R”OH)、CH2SH(或CHR'SH、CR'R”SH)、CH2NH2(或CHR'NH2、CR'R”NH2)、CH2NHR”'(或CHR'NHR”'、CR'R”NHR”')，其中R'和R”各自独立地表示C1-C6烷基链，并且其中R”'表示C1-C6烷基链或芳基，优选为苯基。这些中，R1＝R2＝CH2OH、CH2SH、CH2NH2和CH2NHR”'是优选的，其中那时R”'为甲基、乙基或苯基。对称四 嗪的其它实例还是其中R1＝R2＝NH-NH2(或NR'-NH2、NR'-NHR”)、O-NH2(或O-NHR')、NH-OH(或NR'-OH、NH-OR')的那些，其中R'和R”各自独立地表示C1-6烷基链或芳基，优选各自独立地表示甲基、乙基、丙基或苯基。更优选的为简单的NH-NH2、O-NH2和NH-OH基团。注意在这些实例中，亲核位点位于从四嗪环数R1和R2基团(或在第1α-原子上)的第2(β)原子。
对称四嗪的其它实例为连接有自身带有亲核位点的杂(芳)环的那些，如R1＝R2＝2,4-咪唑基、2,5-咪唑基、2,3-吡唑基、3,4-吡唑基、2-吡咯基、3-吡咯基、2,3,4-三唑基、2,3,5-三唑基、2,3,4,5-四唑基。这些杂(芳)环可任选地被C1-6烷基基团取代。从以下这些所画的结构得到实例；也包括这些分子的其它互变异构形式。
对称四嗪的其它实例还是其中R1和R2为带有亲核位点的芳基的那些，所述芳基优选为苯基、吡啶基或嘧啶基。这些芳基可任选地被C1-6烷基基团取代。亲核位点可例如为-NH2、-NHR'、-OH、-SH或-CH2NH2、CH2NHR'、-CH2OH CH2SH，其中R'可表示C1-6烷基或苯基。因此，具体实例为R1＝R2＝2-氨基苯基、3-氨基苯基、4-氨基苯基、2-氨基-6-吡啶基、3-氨基-6-吡啶基、4-氨基-6-吡啶基或2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-羟基-6- 吡啶基、3-羟基-6-吡啶基、4-羟基-6-吡啶基或2-巯基苯基、3-巯基苯基、4-巯基苯基、2-巯基-6-吡啶基、3-巯基-6-吡啶基、4-巯基-6-吡啶基或2-(氨基亚甲基)-苯基、3-(氨基亚甲基)-苯基、4-(氨基亚甲基)-苯基、2-(氨基亚甲基)-6-吡啶基、3-(氨基亚甲基)-6-吡啶基、4-(氨基亚甲基)-6-吡啶基或2-(羟基亚甲基)-苯基、3-(羟基亚甲基)-苯基、4-(羟基亚甲基)-苯基、2-(羟基亚甲基)-6-吡啶基、3-(羟基亚甲基)-6-吡啶基、4-(羟基亚甲基)-6-吡啶基或2-(巯基亚甲基)-苯基、3-(巯基亚甲基)-苯基、4-(巯基亚甲基)-苯基、2-(巯基亚甲基)-6-吡啶基、3-(巯基亚甲基)-6-吡啶基、4-(巯基亚甲基)-6-吡啶基。在以下可见这些芳基2-位连接有亲核基团的结构中的一些；或者连接位于其它位置中的一个也是可能的。
此外，对称四嗪的其它实例为其中R1和R2为带有亲核位点的烷基的那些。这些烷基可为C2-12线性的、支化的或环状的，并且可包含1-3个如N、O或S的杂原子。亲核位点可例如为-NH2、-NHR'、-OH、-SH，其中R'可表示C1-6烷基或苯基。因此，具体实例为R1＝R2＝2-氨基-乙基、4-氨基-丁基、6-氨基-己基、2-氨基-乙氧基、4-氨基-丁氧基、6-氨基-己氧基、2-氨基-乙基硫氧基、4-氨基-丁基硫氧基、6-氨基-己基硫氧基或2-羟基-乙基、4-羟基-丁基、6-羟基-己基、2-羟基-乙氧基、4-羟基-丁氧基、6-羟基-己氧基、2-羟基-乙基硫氧基、4-羟基-丁基硫氧基、6-羟基-己基硫氧基或2-巯基-乙基、4-巯基-丁基、6-巯基-己基、2-巯基-乙氧基,4-巯基-丁氧基、6- 巯基-己氧基、2-巯基-乙基硫氧基,4-巯基-丁基硫氧基、6-巯基-己基硫氧基或2-吡咯烷基或2-哌啶基或N-哌嗪基。为了说明，参见以下所画的亚乙基间隔的结构。当然，除了所画的亚乙基(或所提到的亚丁基或亚己基)间隔基的其它间隔基也是可能的。
在考虑不对称的1,2,4,5-四嗪的情况中，人们可选择上述对于式(7)的对称四嗪所强调和列出的R1和R2基团的任意组合，条件当然是R1和R2不同。因此，R1和R2都有亲核位点。参见下列一些画出的实例结构。
然而，在考虑不对称的1,2,4,5-四嗪的情况中，上述对于对称1,2,4,5-四嗪所列出的R1基团优选与以下R2基团组合：不一定带有亲核位点，通常不认为是供电子的，并且优选为吸电子的，以及选自以下的基团：H、烷基(优选甲基)、芳基(优选为任选地被一个或多个如NO2、F、Cl、CF3、CN、COOH、COOR'、CONH2、CONHR'、CONR'R”、CHO、COR'、SO2R'、SO2OR'、NO或R'的吸电子基团取代的2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基或者苯基)、CF3、CF2-R’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、S(＝O)R’、 S(＝O)2R’、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为芳基或烷基。更优选地，所述R2基团选自H、甲基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、苯基、CONH2、CONHR'、CONR'R”，R’和R”各自独立地为芳基或烷基，优选甲基或乙基。参见下列一些画出的实例结构。
通过(级联)消除反应的药物释放
在本发明的另一优选实施方案中，所述一个或多个药物的释放由逆Diels-Alder加成化合物的分子内消除反应导致。该消除反应可为简单的单步反应，或者它可为包含一个或多个中间体结构的多步反应。这些中间体有时稳定，或者可能立即降解为热力学终产物或下一步中间体结构。但当包括数个步骤时，可称为级联反应。在任意情况下，不管它为简单过程或级联过程，消除反应的结果为药物从逆Diels-Alder加成化合物释放。不希望被理论束缚，两种组分的设计(即双烯活化剂和亲双烯体触发剂)是这样以致电子在逆Diels-Alder加成化合物内的电子分布是不利的，从而必须发生这些电子的重排。这种情况引发了分子内(级联)消除反应的发生，并且其从而诱导了药物的释放。在逆Diels-Alder反应前，消除反应和药物从前药释放的发生是低效的或不能发生，因为像这样的前药自身是相对稳定的。消除只可在活化剂和前药反应，并且组装如逆Diels-Alder加成化合物后发生。
不希望被理论束缚，上述两个实例说明了逆Diels-Alder加成化合物中电子的不利分布如何可通过消除反应解除，从而释放药物。在一个方案中，消除过程产生终产物A，其中该产物具有在逆Diels-Alder加成化合物中尚不存在的共轭双键。物质A可互变异构为终产物B，或者可重排以形成终产物C。然后，逆Diels-Alder加成化合物中的非芳香的二氢哒嗪环转化为终产物C中的芳香哒嗪环。技术人员会理解，逆Diels-Alder加成化合物中的电子分布相对于终产物(不管是A或B或C)中的电子分布通常为不利的。从而，形成比逆Diels-Alder加成化合物更稳定的物质是(级联)消除反应的驱动力。在任意情况和任意反式中检查该方法，药物(在此为胺“药物-NH2”)有效地从逆Diels-Alder加成化合物移除，而它不从单独的前药移除。
以下路线描述了对于级联消除除了上述两种外的其它可能释放机制。不希望被理论束缚，下列实例说明了逆Diels-Alder加成化合物中电子的不 利分布如何可通过消除反应解除，从而释放药物。该方法可通过多种等价的变化改进。此处rDA反应产生互变异构体A和B，其可相互变换。互变异构体B可导致消除为产物C并且从而变为D。
在本发明第二实施方案中，所述活化剂也为双烯。本领域技术人员知道在逆Diels-Alder反应中反应的双烯的价值。优选的双烯如下参照式(8)-(10)给出。
在式(8)中，R1选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R”、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、NR’C(＝O)NR”R”、 NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基；A和B各自独立地选自烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N+O-、N+R，并且R为烷基，并且条件是A和B不都为碳；X选自O、N-烷基和C＝O，并且Y为CR且R为选自H、烷基、芳基、C(＝O)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)OR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基。
特别适合作为环辛烯的反应配体的双烯如式(9)给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N-烷基、N-芳基、C＝O和CN-烷基；B为O或S；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-。
特别适合作为对于环辛烯的反应配体的另一个双烯如式(10)给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO、NO2、OR’、SR’、CN、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2OR’、PO3R'R”、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N、C-烷基、C-芳基和N+O-；B为N；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”、R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-。
根据本发明，特别有用的双烯为如式(11)、(12)和(13)分别给出1,2-二嗪、1,2,4-三嗪和1,2,4,5-四嗪衍生物。
1,2-二嗪在(11)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；X和Y各自独立地选自O、N-烷基,N-芳基、C＝O、CN-烷基、CH、 C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，并且R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基并且R”’独立地为芳基或烷基，其中X-Y可为单键或双键，并且其中X和Y可在除6元二嗪的二级环结构中连接。优选地，X-Y表示酯基(X＝O且Y＝C＝O；X-Y为单键)或者X-Y表示环烷基(X＝CR’且Y＝CR”；X-Y为单键；R’和R”连接)，优选为环丙烷环，使得R’和R”在1,2-二嗪外的第一碳原子处相互连接。
1,2,4-三嗪在(12)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；X选自CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基。
1,2,4,5-四嗪在(13)中给出，其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO、NO2、OR’、SR’、CN、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2OR’、PO3R'R”、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基。
由于缺电子1,2-二嗪(11)、1,2,4-三嗪(12)或1,2,4,5-四嗪(13)跟亲双烯体通常更有反应性，其作为这样的双烯是特别令人关注的。当二嗪、三嗪或四嗪被通常不认为是供电子的基团或结构片段取代，或被吸电子基团取代时，其为缺电子。例如，R1和/或R2可表示选自下列的取代基：H、烷基、NO2、F、Cl、CF3、CN、COOR、CONHR、CONR2、COR、SO2R、SO2OR、SO2NR2、PO3R2、NO、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、2,4-咪唑基、2,5-咪唑基或苯基，所述取代基任选被一个或多个吸电子基团(如NO2、F、Cl、CF3、CN、COOR、CONHR、CONR、COR、SO2R、SO2OR、SO2NR2、PO3R2、NO、Ar)取代,其中R为H或C1-C6烷基，并且Ar表示芳族基团，特别是苯基、吡啶基或萘基。
式(13)的1,2,4,5-四嗪作为活化剂双烯是最优选的，因为这些分子在逆Diels-Alder反应中与亲双烯体(如优选的TCO亲双烯体)是最易反应的，甚至当R1和/或R2基团不必须是吸电子时，并且甚至当R1和/或R2实际上是供电子时。供电子基团例如OH、OR’、SH、SR’、NH2、NHR’、NR'R”、NHC(＝O)R”、NR’C(＝O)R”、NHC(＝S)R”、NR’C(＝S)R”、NHSO2R”、NR’SO2R”，并且R’和R”各自独立地为烷基或芳基。其它供电子基团的实例为一个或多个如上表所列的供电子基团与其结合的苯基，特别是当在苯基的2-、4-和/或6-位取代时。
根据本发明，具有两个吸电子基团的1,2,4,5-四嗪或那些具有一个吸电子基团和一个既不是吸电子也不是供电子的基团的1,2,4,5-四嗪被称作缺电子的。相似的，具有两个供电子基团的1,2,4,5-四嗪或那些具有一个供电子基团和一个既不是吸电子也不是供电子的基团的1,2,4,5-四嗪被称作富电子。具有两个既不是吸电子也不是供电子基团的1,2,4,5-四嗪或者那些具有一个吸电子基团和一个供电子基团的1,2,4,5-四嗪既不缺电子也不富电子。
1,2,4,5-四嗪本质上可为不对称的或对称的，即式(7)中的R1和R2基团可分别为不同基团或相同基团。对称的1,2,4,5-四嗪是更方便的，因为这些活化剂易通过合成方法获得。
我们已检测了数种1,2,4,5-四嗪关于它们作为活化剂来从前药通过消除过程释放模型药物化合物(如苯酚)的能力，并且我们已发现缺电子、富电子、或既不缺电子也不富电子的四嗪能够诱导药物释放。此外，对称四嗪和不 对称四嗪都是有效的。
缺电子1,2,4,5-四嗪和既不缺电子也不富电子的1,2,4,5-四嗪在逆Diels-Alder反应中与亲双烯体(如TCO)通常更易反应，所以这两种1,2,4,5-四嗪相对于富电子1,2,4,5-四嗪是更优选的，即使后者也能够诱导前药中药物的释放。
在下文中，根据本发明第二实施方案的1,2,4,5-四嗪活化剂的具体实例会通过定义式(13)中R1和R2基团来强调。
具有缺电子基团的对称缺电子1,2,4,5-四嗪例如R1＝R2＝H、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,4-嘧啶基、2,6-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,3,4-三嗪基(triazyl)或2,3,5-三嗪基的那些。其它实例为R1＝R2＝在苯基的2-、3-或4-位，或者在3-和5-位，或者在2-和4-位，或者在2-和6-位具有取代基的苯基，所述取代基为COOH或COOMe羧化物(carboxylate)或者CN腈，或者CONH2、CONHCH3或CON(CH3)2酰胺、或者SO3H或SO3Na磺酸盐、或者SO2NH2、SO2NHCH3或SO2N(CH3)2磺酰胺、或者PO3H2或PO3Na2膦酸盐。其它取代方式也是可能的，包括使用不同的取代基，只要四嗪保持对称。参见以下这些结构的一些实例。
具有供电子基团的对称富电子1,2,4,5-四嗪例如其中R1＝R2＝OH、OR'、SH、SR'、NH2、NHR'、NR'2、NH-CO-R'、NH-SO-R'、NH-SO2-R'、2-吡咯基、3-吡咯基、2-噻吩基、3-噻吩基的那些，其中R'表示甲基、乙基、苯基或甲苯基。其它实例为其中R1＝R2＝具有OH、OR'、SH、SR'、NH2、NHR'、NR'2、NH-CO-R'、NR”-CO-R'、NH-SO-R'或NH-SO2-R'取代基的苯 基，其中R'表示甲基、乙基、苯基或甲苯基，其中R”表示甲基或乙基，并且其中在2-或3-或4-或2-和3-或2-和4-或2-和5-或2-和6-或3-和4-或3-和5-或3-、4-和5-位上进行取代的那些。参见以下这些结构的一些实例。
具有既不吸电子也不供电子基团的对称的1,2,4,5-四嗪例如其中R1＝R2＝苯基、甲基、乙基、(异)丙基、2,4-咪唑基、2,5-咪唑基、2,3-吡唑基(pyrazyl)或3,4-吡唑基的那些。其它实例为其中R1＝R2＝杂(芳)环(如噁唑环、异噁唑环、噻唑环或噁唑啉环)的那些。其它实例为其中R1＝R2＝具有一个吸电子取代基和一个供电子取代基的苯基，其中所述吸电子取代基选自COOH、COOMe、CN、CONH2、CONHCH3、CON(CH3)2、SO3H、SO3Na、SO2NH2、SO2NHCH3、SO2N(CH3)2、PO3H2或PO3Na2，并且所述供电子取代基选自OH、OR'、SH、SR'、NH2、NHR'、NR'2、NH-CO-R'、NR”-CO-R'、NH-SO-R'、NH-SO2-R'取代基，其中R'表示甲基、乙基、苯基或甲苯基并且其中R”表示甲基或乙基。可在2-和3-、2-和4-、2-和5-、2-和6、3-和4-以及3-和5-位上进行取代。然而其它实例为其中R1＝R2＝具有一个供电子取代基的吡啶基或嘧啶基，所述供电子取代基选自OH、OR'、SH、SR'、NH2、NHR'、NR'2、NH-CO-R'、NR”-CO-R'、NH-SO-R'或NH-SO2-R'取代基，其中R'表示甲基、乙基、苯基或甲苯基，并且其中R”表示甲基或乙基。参见下列一些实例。
在考虑不对称的1,2,4,5-四嗪的情况中，人们可选择上述对于式(13)的对称四嗪所强调和列出的R1和R2基团的任意组合，条件当然是R1和R2不同。优选的不对称1,2,4,5-四嗪为基团R1或R2中至少一个本质上为吸电子的那些。参见下列一些画出的实例结构。
对于活化剂的进一步考虑
在上文中，就本发明的两种优选实施方案而言描述并定义了活化剂，并且对于两种实施方案，1,2-二嗪、1,2,4-三嗪和1,2,4,5-四嗪，特别是1,2,4,5-四嗪是优选的双烯活化剂。以下会强调活化剂的一些相关特点，从此也可明确，对于每个具体应用来设计正确的活化剂分子式有众多选择。
根据本发明，活化剂(如1,2,4,5-四嗪)具有有用且有利的药理性质和药物代谢动力学性质，表明活化剂为无毒的或至少毒性足够低，产生毒性也 足够低的代谢产物，在生理溶液中足够可溶，可在水溶液中或药学中通常使用的其它制剂中应用，并且具有合适的log D值(log D值反映在生理pH下活化剂分子的亲水/疏水平衡)。如本领域已知，log D值可为负的(亲水分子)或正的(疏水分子)，在此log D值变得越低或越高，则该分子分别为更亲水或更疏水。对于多数分子，可充分地预测log D值，并且可在活化剂设计中通过添加或移除极性或非极性基团来调节log D值。参见以下一些活化剂的设计以及它们对应的log D计算值(pH＝7.4)。注意添加甲基、环烯基、吡啶、胺、醇或磺酸盐基团或删除苯基调节了logD值，并且可获得非常宽的log D值范围。
给出的log D数值为基于在0.1M Na+/K+ Cl-的水溶液，由与“VG”(Viswanadhan,V.N.；Ghose,A.K.；Revankar,G.R.；Robins,R.K.,J.Chem.Inf.Comput.Sci.,1989,29,163-172)、'KLOP'(根据Klopman,G.；Li,Ju-Yun.；Wang, S.；Dimayuga,M.:J.Chem.Inf.Comput.Sci.,1994,34,752)以及'PHYS'(根据 数据库)方法同样重要的加权法计算得出的。
本发明的活化剂对于前药具有合适的反应性，并且这可通过使双烯(特别是1,2,4,5-四嗪)足够缺电子来调节。足够的反应性会确保活化剂一接触前药就发生快速的逆Diels-Alder反应。
本发明的活化剂具有良好的生物利用度，表明它可用于在(人)体内实现其预期目的(在主要靶点(Primary Target)有效接触前药)。因此，活化剂不显著附着于非靶点的血液组分或组织。活化剂可设计为结合至血液中存在的白蛋白上(如本领域已知，这样以便增加血液循环时间)，但是它同时应从血流有效释放以便能够到达前药。因此，血液结合和血液释放应为适合的平衡。活化剂的血液循环时间也可通过增加活化剂的分子量来增加，如通过使聚乙二醇(PEG)基团连接活化剂(“聚乙二醇化”)。或者，活化剂的PK/PD可通过将活化剂结合至另一基团(如聚合物、蛋白质、(短)肽、碳水化合物)来调节。
本发明的活化剂可为多聚体，这样多个双烯基团可结合至分子骨架，特别是如多官能团分子、碳水化合物、聚合物、树枝状高分子、蛋白质或肽，在此这些骨架优选为水溶性的。可用的骨架的实例为(多官能团的)聚乙二醇、聚丙烯亚胺(PPI)树枝状高分子、PAMAM树枝状高分子、乙二醇系树枝状高分子、肝素衍生物、透明质酸衍生物或血清白蛋白(如HSA)。
根据前药的位置(如细胞内或细胞外；靶向的具体器官)，将活化剂设计为能够有效到达该前药。因此，可例如通过改变其log D值、其反应性或其电荷来使活化剂适应。甚至活化剂可用靶向剂(如蛋白质、肽和/或糖基团)处理(engineer)，以便可主动而非被动到达主要靶点。在应用靶向剂的情况中，优选其为简单基团(即短肽或单糖)。
根据本发明，可应用不同活化剂的混合物。这对于药物释放特性的调节可能是相关的。
根据本发明，会引发和调节在主要靶点的药物释放的活化剂还可用向其提供额外功能的基团修饰以供体内和/或体外研究或应用。例如，活化剂可用染料基团或荧光基团修饰(参见例如S.Hilderbrand等人,Bioconjugate Chem.,2008,19,2297-2299，3-(4-benzylamino)-1,2,4,5-tetrazine that is amidated with the near-infrared(NIR)fluorophore VT680)，或者它们可用显像探针官能化，其中这些探针可用于显像模式(如核成像技术PET或SPECT)中。这样，活化剂不仅引发药物释放，而且可在(人)体内定位，并且从而可用于前药在(人)体内的定位。因此，可检测药物释放的位置和量。例如，活化剂可用DOTA(或DTPA)配体修饰，其中这些配体非常适合与111In3+-离子络合以进行核成像。在其它实例中，活化剂可连接至123I或18F基团上，已知其分别用于SPECT或PET成像。此外，当与如β-发射同位素(如Lu-177或Y-90)联合使用时，前药活化可与局部放射疗法以前靶向形式结合。
基于本领域基本常识，对于本领域技术人员而言，上述活化剂的合成路线是容易获得的。四嗪的合成路线的参考文献包括Lions等人,J.Org.Chem.,1965,30,318-319；Horwitz等人,J.Am.Chem.Soc.,1958,80,3155-3159；Hapiot等人,New.J.Chem.,2004,28,387-392,Kaim等人,Z.Naturforsch.,1995,50b,123-127。
前药
前药为药物DD和触发剂TR的缀合物，从而其包含在其从触发剂释放后发挥治疗作用的药物。这样的前药可任选地具有对于疾病靶点的特异性。
前药的通式如下式(14a)和(14b)所示：
基团YM可为靶向剂TT或掩蔽剂MM；SP为间隔基；TR为触发剂，LD连接基并且DD为药物。
对于药物从靶向剂释放的应用：YM为靶向剂TT。
式(14a):k＝1；m,r≥1；t,n≥0。
式(14b):k＝1；m,n,r≥1；t≥0。
对于需掩蔽药物未掩蔽的应用：YM为掩蔽基团MM；
式(14a)和(14b):r＝1；m≥1；k,n,t≥0。
尽管为了明确而在上式中已删除，但DD还可任选地通过SP包含TT和/或MM。
可在本发明相关的前药中使用的药物包括但不限于：抗体、抗体衍生物、抗体片段(如Fab2、Fab、scFV、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody))、抗体(片段)融合物(如双特异性mAb片段和三特异性mAb片段)、蛋白质、适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖，以及肽、类肽、甾族化合物、有机药物化合物、毒素、激素、病毒、整个细胞、噬菌体。适合本发明的代表性药物包括但不限于双特异性mAb片段和三特异性mAb片段、免疫毒素(包括如蓖麻毒蛋白A、白喉毒素、霍乱毒素)。其它实施方案使用auristatin、美坦辛、卡奇霉素、多卡米星、美登木素(maytansinoid)DM1和DM4、auristatin MMAE、CC1065及其类似物、喜树碱及其类似物、SN-38及其类似物；抗增殖/抗肿瘤剂、抗生素、细胞因子、抗炎剂、抗病毒剂、抗高血压剂、化学增敏剂和放射增敏剂。在其它实施方案中，释放的药物DD自身为前药，其被设计为释放另一个药物DD。药物任选地包含任选地通过稳定的或不稳定的连接基连接的膜转位基团(金刚烷胺(adamantine)，聚-赖氨酸/精氨酸，TAT)和/或靶向剂(靶向如肿瘤细胞受体)。
用作与TCO衍生物的缀合并且在与活化剂的逆Diels Alder反应时释放的示例性药物包括但不限于：细胞毒药物，特别是用于癌症治疗的那些。这样的药物通常包括DNA损伤剂、抗代谢剂、天然产物及其类似物。细胞毒素剂的代表性种类包括酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合酶抑制剂、DNA烷化剂、辐射增敏剂、DNA嵌入剂、DNA切断剂、抗微管蛋白剂、拓扑异构酶抑制剂、铂系药物、蒽环类抗生素药物家族、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒核苷、紫杉烷、lexitropsin、蝶啶药物家族、烯二炔(diynene)、鬼臼毒素、多拉司他汀、美登木素、分化诱导剂和紫杉醇。这些种类中特别有用的成员为，例如多卡米星、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲基叶酸(methopterin)、二氯甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶DNA小沟结合剂、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、环氧长春碱、leurosideine、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素C、丝裂霉素A、caminomycin、氨基蝶呤、他利霉素、鬼臼毒素及其衍生物(如依托泊甙或磷酸依托泊苷、长春碱、长春新碱、长春地辛、紫杉醇、视黄酸泰索帝、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱、卡奇霉素、埃斯波霉素、烯-二炔(ene-diynes),及其类似物)。
示例性药物包括多拉司他汀及其类似物，其包括：多拉司他汀A(美国专利4,486,414)、多拉司他汀B(美国专利4,486,414)、多拉司他汀10(美国专利4,486,444、5,410,024、5,504,191、5,521,284、5,530,097、5,599,902、5,635,483、5,663,149、5,665,860、5,780,588、6,034,065、6,323,315)、多拉司他汀13(美国专利4,986,988)、多拉司他汀14(美国专利5,138,036)、多拉司他汀15(美国专利4,879,278)、多拉司他汀16(美国专利6,239,104)、多拉司他汀17(美国专利6,239,104)和多拉司他汀18(美国专利6,239,104)，每个专利以其整体援引加入本文。
在本发明的示例性实施方案中，药物部分为丝裂霉素、长春花生物碱、紫杉醇、蒽环类抗生素、卡奇霉素、美登木素或auristatin。
应当理解，为了制备本发明的缀合物，也可对期望化合物进行化学修饰以使该化合物的反应更方便。包含用于与TCO偶联的氨基官能团的药物包括丝裂霉素-C、丝裂霉素-A、柔红霉素、多柔比星、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素、9-氨基喜树碱、N8-乙酰基亚精胺、1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、他利霉素、阿糖胞苷、多拉司他汀(包括auristatin)及其衍生物。
包含用于与TCO偶联的羟基官能团的药物包括依托泊甙、喜树碱、紫杉醇、埃斯波霉素、1,8-二氢-双环[7.3.1]十三-4-9-二烯-2,6-二炔-13-酮(美国专利第5,198,560号)、鬼臼毒素、anguidine、长春新碱、长春碱、吗啉-多柔比星、正-(5,5-二乙酰氧基-戊基)多柔比星及其衍生物。
包含用于与TCO偶联的巯基官能团的药物包括埃斯波霉素和6-巯基嘌呤及其衍生物。
应当理解，药物可任选地通过连接基LD或自切除连接基LD或者其组合连接至TCO衍生物，并且所述连接基可由多个(自切除或非自切除)单元组成。
还应当理解，一个或多个靶向剂TT或掩蔽基团MM可任选地通过一个或多个间隔基SP任选地连接至药物DD、触发剂TR或连接基LD上。
数种药物可被可成像标记替代以检测药物靶向和释放。
根据本发明的另一具体实施方案，选择前药以靶向和/或应对疾病如癌症、炎症、感染、心血管疾病(如血栓、粥样硬化病变)、缺氧部位(如卒中、肿瘤、心血管病症、脑疾病、凋亡、血管发生)、器官和报告基因/酶。
根据一个实施方案，前药和/或活化剂可为多聚体化合物，其包含多个药物和/或生物正交反应基团。这些多聚体化合物可为聚合物、树状聚合物、脂质体、聚合物颗粒或者其它聚合构建体。
在前药中，药物DD和触发剂TR(TCO衍生物)可相互直接连接。它们也可通过连接基或自切除连接基LD相互连接。应当理解，本发明包括亲双烯体触发剂连接至药物的任意可能方式。这同样适用于任选的靶向剂TT或掩蔽剂MM与前药的连接。影响与这些药物的结合的方法(例如在蛋白质的情况中，通过反应性的氨基酸(如赖氨酸或半胱氨酸))为本领域技术人员已知的。
应当理解，药物基团以在形成逆Diels-Alder加成化合物后，药物最终能够释放的方式与TCO连接。通常，这意味着药物和TCO间的键(或者在连接基的情况中，TCO和连接基LD间的键，或者在自切除连接基LD的情况中，连接基和TCO间的键以及药物和连接基间的键)应为可断裂的。药物和任选的连接基主要通过杂原子连接，优选通过O、N、NH或S连接。所述可断裂键优选选自氨基甲酸酯键、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、醚键、酯键、胺键、酰胺键、硫醚键、硫酯键、亚砜键和亚磺酰氨基键。
从而在本发明中，连接基概念可类似地适用于本领域技术人员已知的那些。大多报道的前药由三种组分组成：触发剂、连接基和母体药物，任选地，靶向分子连接至连接基或触发剂。触发剂(其可为如位点专一性酶或pH不稳定基团的底物)经常通过自消除连接基连接至母体药物。加入连接基以促使触发剂的酶裂解，增加活性位点的可达性，并且降低来自连接药物的位阻。连接基也有助于直接将很多前药与相同触发剂结合使用。此外，连接基调节前药的稳定性、药代动力学、器官分布、酶识别和释放动力学。触发剂活化/脱除后，连接基必须自发消除以释放母体药物。根据连接的药物，连接基或其一部分可保留在药物上而不损害其作用。总体概念如路线2所描述。
路线2：
两种自消除连接基值得注意：a)电子级联连接基(electronic cascade linker)；b)环化连接基。级联连接基中最突出的实例为如路线3所示的在抗肿瘤剂9-氨基喜树碱的β-葡糖苷酸前药的1,6-消除间隔基。通过酶β-葡糖苷酸酶(在特定肿瘤坏死区域存在)将芳族羟基官能团去掩蔽，然后该基团变为供电子基团并引发脱除离去基团的电子级联，除去CO2后释放游离药物。该基于醌-甲基化物重排的级联也可由未掩蔽的胺或硫醇的孤电子对而非羟基的孤电子对引发。水捕获形成的醌-甲基化物质以形成苯酚衍生物。
路线3：
一些其它触发剂-连接基概念如路线4所描述。A中的触发剂被血浆酯酶(plasmatic esterase)活化。叔丁基酯的水解得到游离芳族羟基，这启动了醌-甲基化物级联。该构建体已通过缀合至抗体(R)来靶向。在B中，将头孢菌素通过β-内酰胺酶水解用作触发剂。根据其离去基团的性质，内酰胺 环的水解可导致药物取代基的脱除。药物已通过酯、酰胺、硫化物、胺和氨基甲酸酯连接基结合。芳族环化系连接基的两个实例为C和D。在C中，通过青霉素G-酰胺酶的裂解导致羰基上的氨基的分子内进攻，从而释放药物。D显示磷酸酶敏感的前药。通过人碱性磷酸酶裂解磷酸酯得到羟基，其通过释放药物而反应为内酰胺。在E中展示了通过将硝基还原为氨基来触发的前药的实例。该还原可在NADPH的存在下通过硝基还原酶进行。此外，已知许多在缺氧(肿瘤)组织中还原的杂环硝基构建体(F)，因此，其可在无酶帮助下引发级联。其它在前药疗法中使用的触发剂对纤溶酶、酪氨酸羟化酶(在神经细胞瘤中高表达)、酪氨酸酶或组织蛋白酶B敏感。
路线4：X＝O、N、S
TCO-触发剂和活化剂的组合及其之间的反应
药物(不管是否通过连接基)优选连接至TCO环中与双键相邻的碳原子上。
如上所提到，选择TCO作为触发基团可在可用的药物释放机制中提供良好的通用性。优选的机制基于a)电子级联介导释放，b)分子内环化介导释放。
下列路线描述了说明多种机制的非限制性实例，基于用于活化前药的rDA反应的选择可应用所述多种机制。注意，在胺官能化药物释放的情况中，其可为如伯胺或肿胺、苯胺、咪唑或吡咯型药物，从而药物离去基团性质可变化。如果应用对应的水解稳定的TCO前药，则释放无其它官能度的药物也是可能的(如巯基官能化药物)。所画的稠环产物可或不可互变异构为其它更有利的互变异构体。
上述实例环化后生成5-元环，酯或酰胺取代的TCO使羟基或氨基官能化的药物从逆Diels-Alder加成化合物释放。四嗪活化剂的亲核位点在3-和6-基团的第1(α)位上。
上述实例环化后生成6-元环，氨基甲酸酯、酯或酰胺取代的TCO使氨基或羟基官能化的药物从逆Diels-Alder加成化合物释放。四嗪活化剂的亲核位点在3-和6-基团的第1(α)位或第2(β)位上。
上述实例环化后生成7-元环，氨基甲酸酯、酯或酰胺取代的TCO使氨基官能化或羟基官能化的药物释放。四嗪活化剂的亲核位点在3-和6-基团的第2(β)位或第3(γ)位上。
上述实例环化后生成8-元环，氨基甲酸酯取代的TCO使氨基或羟基官能化的药物从加成化合物释放。四嗪活化剂的亲核位点在3-和6-基团的第3(γ)位上。
上述实例环化后生成12-元环，氨基甲酸酯取代的TCO使氨基或羟基官能化的药物从加成化合物释放。四嗪活化剂的亲核位点在3-和6-基团的第7位上。
在此之下，TCO前药和四嗪活化剂的一些非限制性组合对级联消除诱发的从逆Diels-Alder加成化合物释放的可能性进行说明。注意，在胺官能化药物释放的情况中，其可为如伯胺或肿胺、苯胺、咪唑或吡咯型药物，所以药物离去基团性质可变化。如果应用对应的水解方法下稳定的TCO前药，释放无其它官能度的药物也是可能的(如巯基官能化药物)。所画的稠环产物可或不可互变异构为其它更有利的互变异构体。
上面氨基甲酸乙酯(或氨基甲酸酯)取代的TCO的实例中，从加成化合物释放了胺官能化的药物。四嗪活化剂为对称且缺电子的。
上面氨基甲酸乙酯(或氨基甲酸酯)取代的TCO的实例中，从加成化合物释放了胺官能化的药物。四嗪活化剂为不对称且缺电子的。注意，除了应用对称四嗪已形成的立体异构体，使用不对称的四嗪导致逆Diels-Alder加成化合物区域异构体(regiomer)的形成。
上面氨基甲酸乙酯(或氨基甲酸酯)TCO的实例中，从加成化合物释放 了胺官能化的药物。四嗪活化剂为对称且富电子的。
在一个优选实施方案中，药物以抗体-毒素缀合物的形式提供。该缀合物具有与以上相同的TCO基团，以便使生物正交化学活化毒素能够释放。在另一实施方案中，药物是用来与肿瘤细胞结合并恢复和活化T细胞的双特异性或三特异性抗体衍生物，其T细胞结合功能通过如上描述的与TCO基团连接而失活。所述TCO基团再使生物正交化学活化的药物能够活化。
靶向
本发明的药盒和方法非常适合用于药物的靶向递送。
如本发明中使用的“主要靶点”涉及用于治疗的靶向剂的靶点。例如，主要靶点可为在生物、组织或细胞中存在的任意分子。靶点包括细胞表面靶点，如受体、糖蛋白；结构蛋白，如淀粉质斑块；丰富的细胞外靶点，如间质；细胞外基质靶点如生长因子以及朊酶；细胞内靶点，如高尔基体表面、线粒体表面、RNA、DNA、酶、细胞信号通路组分和/或异物，如病原体(例如病毒、细菌、真菌、酵母菌或其的部分)。主要靶点的实例包括如蛋白质的化合物，所述蛋白质的存在或表达水平与在特定病症中表达水平上调或下调的特定组织或细胞种类相关。根据本发明的一个具体实施方案，主要靶点为如(内化或非内化)受体的蛋白质。
根据本发明，主要靶点可选自人体或动物体内或者病原体或寄生虫上的任意适合的靶点，例如细胞(如细胞膜和细胞壁)、受体(如细胞膜受体)、细胞内结构(如高尔基体或线粒体、酶、受体、DNA、RNA、病毒或病毒颗粒、抗体、蛋白质、碳水化合物、单糖、多糖、细胞因子、激素、甾族化合物、生长抑素受体、单胺氧化酶、毒蕈碱受体、心肌交感神经系统、白三烯受体(如在白细胞上)、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)、叶酸受体、凋亡标志物(marker)、(抗)血管发生标志物、胃泌素受体、多巴胺能系统、5-羟色胺能系统、GABA能系统、肾上腺素系统、胆碱能系统、阿片受体、GPIIb/IIIa受体和其它血栓相关系统、纤维蛋白、降钙素受体、促吞噬肽受体、整合素受体、纤连蛋白、VEGF/EGF和VEGF/EGF受体、TAG72、CEA、CD19、CD20、CD22、CD40、CD45、CD74、CD79、CD105、CD138、CD174、CD227、CD326、CD340、MUC1、MUC16、GPNMB、PSMA、生长因子 (Cripto)、腱糖蛋白(Tenascin C)、黑皮质素-1受体、CD44v6、G250、HLA DR、ED-B、TMEFF2、EphB2、EphA2、FAP、间皮素、GD2、CAIX、5T4、基质金属蛋白酶(MMP)、P/E/L-选择蛋白受体、LDL受体、P-糖蛋白、神经降压肽受体、神经肽受体、P物质受体、NK受体、CCK受体、σ受体、白细胞介素受体、单纯疱疹病毒酪氨酸激酶、人酪氨酸激酶)。为了能够对上述所列主要靶点特定靶向，靶向剂TT可包含的化合物包括但不限于抗体、抗体片段(如Fab2、Fab、scFV)、双链抗体、三链抗体、VHH、抗体(片段)融合物(如双特异mAb片段和三特异mAb片段)、蛋白质、肽(如奥曲肽及其衍生物、VIP、MSH、LHRH、趋化肽、铃蟾肽、弹性蛋白)、模拟肽、碳水化合物、单糖、多糖、病毒、整体细胞、药物、聚合物、脂质体、化学治疗剂、受体激动剂和拮抗剂、细胞因子、激素、甾族化合物。本发明上下文包括的有机化合物的实例为或衍生自雌激素(如雌二醇)、雄激素、孕激素、皮质类甾醇、甲氨蝶呤、叶酸和胆固醇。在一个优选的实施方案中，靶向剂TT为抗体。根据本发明的一个具体实施方案，主要靶点为受体，并且使用了可特异性结合至主要靶点的靶向剂。适合的靶向剂包括但不限于受体的配体或其仍结合至受体的部分，如在受体结合蛋白质配体中的受体结合肽。蛋白质性质的靶向剂的其它实例包括干扰素(如α干扰素、β干扰素和γ干扰素)、白细胞介素和蛋白质生长因子(例如肿瘤生长因子(如α肿瘤生长因子、β肿瘤生长因子)、血小板源性生长因子(PDGF))、uPAR靶向蛋白、载脂蛋白、LDL、钙磷脂结合蛋白Ⅴ、内皮他丁和血管他丁。靶向剂的其它实例包括如与主要靶点互补的DNA、RNA、PNA和LNA。
根据本发明的另一具体实施方案，选择主要靶点和靶向剂以得到对疾病(如癌症、炎症、感染、心血管疾病(如血栓、粥样硬化病变)、缺氧部位(如卒中、肿瘤、心血管病症、脑疾病、凋亡、血管发生))、器官和报告基因/酶的特异性靶向或提高的靶向。这可通过选择具有组织特异性表达、细胞特异性表达或疾病特异性表达的主要靶点来实现。例如，膜叶酸受体调节叶酸及其类似物(如甲氨蝶呤)的细胞内蓄积。在正常组织中表达被限制，但在多种肿瘤细胞类型中，受体过表达。
掩蔽基团
掩蔽基团MM可为蛋白质、肽、聚合物、聚乙二醇、碳水化合物、有机构建体，其进一步掩蔽连接的药物DD或前药。这种掩蔽可基于如位阻，但是它也可基于与药物DD的非共价相互作用。这样的掩蔽基团还可用于影响药物DD或前药的体内性质(如血液清除；免疫系统识别)。
间隔基
间隔基SP包括但不限于具有2-200，特别是3-113，并且优选5-50个重复单元的聚乙二醇(PEG)链。其它实例为生物聚合物片段，如寡肽或多肽或者聚乳酸。其它优选的实例如实施例9中所示。
给药
在本发明的内容中，通常首先给药前药，并且在前药到达主要靶点前会花费一定时间。这段时间会由不用的应用而不同，并且可为几分钟、几天或几周。选定的时间过后，给药活化剂，其会寻找前药并与其反应，并且从而会在主要靶点活化药物的释放。
本发明的组分可通过不同的途径给药，包括静脉注射、腹膜内给药、口服给药、直肠给药和吸入给药。适合用于这些不同给药途径的制剂为技术人员已知的。本发明的前药或活化剂可与药学可接受载体共同给药。在此使用的适合的药学可接受载体涉及对于医学或兽医学目的适合的载体，其为无毒的，否则不能接受。这样的载体是本领域熟知的，并且包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。制剂应适合给药的方式。
应当理解，给药的化学实体(也就是前药和活化剂)可为不改变所述化学实体的化学功能性的修饰形式，如其盐、水合物或溶剂合物。
在循环中前药的活化是不期望的以及前药的自然清除是不充分的情况下，在给药前药后并且在给药活化剂前，优选通过清除剂的方式移除过量的前药。清除剂是为了与要从循环移除的过量的给药物质(在本情况中为前药)结合或络合而向个体给药的物质、化合物或基团。清除剂可直接从循环移除。尽管如技术人员已知存在从循环分泌的其它方式，所述移除通常通过基于肝受体的机制实现。在本发明中，用于移除循环前药的清除剂优选 包含例如如上所讨论的能够与前药的TCO基团反应的双烯结构。
实施例
下列实施例说明本发明或本发明的方面，并且不用来定义或限制本发明及其权利要求的范围。
方法：在Varian Mercury谱仪(1H-NMR：400MHz；13C-NMR：100MHz)，298K下记录1H-NMR谱和13C-NMR谱。在室温下从TMS向低场以ppm报告化学位移。用于分裂模式的缩写为s＝单峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，并且br＝宽峰。在Perkin Elmer 1600 FT-IR(UATR)上记录IR谱。使用联接至二极管阵列检测器(Finnigan Surveyor PDA Plus检测器，Thermo Electron Corporation)和离子阱(LCQ Fleet,Thermo Scientific)的ShimadzuLC-10 AD VP系列HPLC进行LC-MS。使用Alltech Alltima HP C183μ柱，进样量为1-4μL，流速为0.2mL min-1，并且使用代表性梯度(10分钟内从5％至100％，100％下再保持3分钟)的CH3CN/H2O(均包含0.1％甲酸)，在25℃下进行分析。使用联接至两个Shimadzu LC-8A泵和Shimadzu SPD-10AV VP紫外-可见光检测器的Shimadzu SCL-10A VP，在PhenomenexGemini 5μC18 110A柱上进行制备RP-HPLC(含0.1％甲酸的CH3CN/H2O)。在装备有Gabi放射性检测器的Agilent 1200系统上进行体积排阻(SEC)HPLC。将样品装载到Superdex-20010/300 GL柱(GE Healthcare Life Sciences)上，并用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)以0.35-0.5mL/分钟的流速洗脱。紫外波长预设为260nm和280nm。抗体溶液的浓度用NanoDrop1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)分别从322nm和280nm的吸光度测定。
原料：所有试剂、化学品、原料和溶剂均从商业来源获得，并且以获得时的形式使用：从Biosolve,Merck and Cambridge Isotope Laboratories获得(氘化)溶剂；并且从Aldrich、Acros、ABCR、Merck and Fluka获得化学品、原料和试剂。所有溶剂为分析纯试剂(AR)品质。根据文献步骤(Y.H.Choe,C.D.Conover,D.Wu,M.Royzen,Y.Gervacio,V.Borowski,M.Mehlig,R.B.Greenwald,J.Controlled Release 2002,79,55-70)合成4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)-2,6-二甲基苯酚。盐酸多柔比星从Avachem Scientific获 得。
实施例1
四嗪活化剂的合成
一般操作
除了下面具体描述的四嗪外，还制备了一系列的其它四嗪。使用Pinner型反应，将合适的腈与肼反应以制备二氢1,2,4,5-四嗪中间体。如本领域已知，脒也被用作反应物来代替腈。在该反应中使用硫也是已知的，在一些情况中，这有助于二氢1,2,4,5-四嗪的形成。氧化该中间体得到四嗪双烯活化剂。下面的反应描述了一些制备的四嗪，并且说明了一些制备和分离四嗪的可能性(如溶剂的使用、浓度、温度、反应物的当量、氧化的选择等)。其它本领域已知的方法也可用于制备四嗪或其它活化剂。
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)的合成
将2-氰基吡啶(10.00g,96.0mmol)和水合肼(15.1g；300mmol)在90℃，惰性气氛下搅拌过夜。将混浊的混合物冷却至室温，过滤，并且随后洗涤，真空干燥，以得到橙黄色固体形式的粗品二氢四嗪1(7.35g；65％)。
将二氢四嗪(1,100mg；0.419mmol)悬浮于乙酸(3mL)中，并且加入亚硝酸钠(87mg；1.26mmol)。立即观察到从橙黄色到暗红色的颜色变化，并且将氧化产物通过过滤分离。将残渣用水(10mL)洗涤并在真空中干燥以得到紫色固体形式的标题化合物(2,92mg；93％)。
1H NMR(CDCl3):δ＝9.00(d,2H),8.76(d,2H),8.02(t,2H),7.60(dd,2H)ppm。13CNMR(CDCl3):δ＝163.9,151.1,150.1,137.5,126.6,124.5ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰，m/z＝237.00(M+H+),λmax＝296和528nm。
3-(5-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(5)的合成
将2-氰基吡啶(5.00g,48.0mmol)、5-氨基-2-氰基吡啶(5.72g；48.0mmol)和水合肼(15.1g；300mmol)在90℃，惰性气氛下搅拌过夜。将混浊的混合物冷却至室温，过滤，并且随后用水(20mL)和乙醇(20mL)洗涤残渣，并真空干燥。将橙色固体悬浮于丙酮(200mL)中，注入在硅胶(20克)上，并且使用梯度(0％至70％)的丙酮和庚烷色谱分析，以橙色固体形式得到二氢四嗪3(1.46g；12％收率)。
将二氢四嗪(3,90mg；0.355mmol)溶解于THF(1mL)中，并且加入乙酸酐(54.4mg；0.533mmol)。将该溶液在惰性气氛中加热至回流，持续18小时。通过过滤分离橙色固体，并且用THF(3mL)洗涤以提供乙酰氨基的二氢四嗪(4,90mg；86％收率)。
将乙酰胺(4,50mg；0.169mmol)悬浮于乙酸(1mL)中，并且加入亚硝酸钠(35mg；0.508mmol)。观察到从橙色到暗红色的即时颜色变化，并且氧化产物通过过滤分离。残渣用水(5mL)洗涤并在真空中干燥以得到紫色固体形式的标题化合物(5,42mg；84％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝9.03(d,1H),8.93(d,1H),8.61(dd,2H),8.42(dd,1H),8.16(dt,1H),7.73(dd,1H),2.17(s,3H)ppm。13C NMR(DMSO-d6):δ＝169.5,163.0,162.8,150.6,150.2,143.8,141.2,138.5,137.8,126.6,126.1,124.9,124.2,24.1ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝293.9(M+H+),λmax＝323和529nm。
3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7)的合成
在氩气的惰性气氛下，将2-氰基吡啶(500mg,4.8mmol)、盐酸乙脒(2.00g,21.2mmol)和硫(155mg,4.8mmol)在乙醇(5mL)中搅拌。加入水合肼(2.76g；55.2mmol)并且将混合物在20℃下搅拌过夜。将浑浊的混合物过滤，并且滤液蒸发至干燥，以得到2.9g的橙色粗产物6。
随后，将6(800mg)悬浮于THF(3mL)和乙酸(4mL)的混合物中。将NaNO2(2.0g；29.0mmol)在水(3mL)中的溶液在0℃下加入。观察到其瞬间变色为红色/紫色悬浮液。0℃下搅拌5分钟后，加入氯仿和水。紫色的氯仿层用水洗涤两次，然后浓缩。将固体残渣在氯仿和己烷的1:1混合物中搅拌，然后过滤。浓缩滤液，并且将粗产物用硅柱色谱法(氯仿/丙酮混合物用作洗脱液)纯化，得到纯产物(7,48mg,21％总收率,从2-氰基吡啶计算)。
1H NMR(CDCl3):δ＝8.96(d,1H),8.65(d,1H),7.99(t,1H),7.56(dd,1H),3.17(s,3H)ppm。13C NMR(CDCl3):δ＝168.1,163.6,150.9,150.3,137.4,126.3,123.9,21.4ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝174.3(M+H+),λmax＝274和524nm。
3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9)的合成
将2-氨基苯甲腈(1.00g；8.46mmol)溶解于乙醇(3mL)中，并且加入水合肼(2.06g；41.2mmol)。将混合物冷却至0℃并且加入硫(0.17g；5.30mmol)。搅拌持续15分钟，随后将混合物在90℃下加热。3小时后，过滤 分离黄色沉淀，用乙醇(10mL)洗涤，并且随后用氯仿研磨两次(2次，10mL)，以得到黄色中间体8(343mg,30％)。
将中间体8(105mg；0.394mmol)溶解于乙醇(15mL)中，并且50℃下将氧气鼓泡通入溶液中。几分钟内，颜色从黄色变为暗黄色/红色，并且形成了沉淀。2小时后，过滤沉淀，用乙醇洗涤并且干燥以得到暗红色晶体形式的产物9(89mg,86％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝8.39(d,2H),7.32(t,2H),7.04(s,4H),6.93(d,2H),6.75(t,2H)ppm。13C NMR(DMSO-d6):δ＝162.7,149.6,133.0,129.0,117.1,115.8,111.6ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝265.4(M+H+),λmax＝237,293,403和535nm。
3,6-双(4-羟基苯基)-1,2,4,5-四嗪(11)的合成
将4-羟基苯甲腈(1.06g；8.90mmol)溶解在水合肼(3.09g；61.7mmol)中,并且混合物加热至90℃，持续16小时。过滤黄色沉淀，并且其用水(25mL)和乙醇(10mL)洗涤，以得到黄色粉末形式的粗中间体10(870mg；62％)。
将中间体(10，173mg；0.645mmol)悬浮于乙醇(10mL)中，并且50℃下将氧气鼓泡通入该混合物中。几分钟内，颜色从黄色变为暗黄色/红色。6小时后，过滤沉淀，用乙醇洗涤并且干燥以得到暗红色晶体形式的产物11(136mg,80％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝10.35(br.s,2H),8.36(d,4H),7.02(d,4H)ppm。 13C NMR(DMSO-d6):δ＝162.6,161.5,129.2,122.6,116.3ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝267.1(M+H+),λmax＝235,330和535nm。
3,6-双(4-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(13)的合成
将4-氨基苯甲腈(1.00g；8.46mmol)溶解于乙醇(3mL)中，并且随后加入水合肼(2.12g；42.2mmol)和硫(0.176g；5.5mmol)。将混合物在90℃下加热持续90分钟。过滤分离黄色沉淀，用乙醇(10mL)洗涤，并且随后用丙酮(12mL)研磨，以得到黄色中间体12(190mg,17％)。
将中间体12(50mg；0.188mmol)溶解于DMSO(1mL)中，并且20℃下，将氧气鼓泡通入该溶液。5小时后，将反应混合物倒入盐水(13mL)中，并且过滤红色沉淀，用水(10mL)洗涤，并且真空干燥。将红色粉末通过用丙酮(15mL)研磨进一步纯化，以得到红色固体形式的产物13(13.7mg,27％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝8.17(d,2H),7.75(d,2H),6.02(s,4H)ppm。13C NMR(DMSO-d6):δ＝162.3,152.8,128.5,118.3,113.8ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝265.2(M+H+),λmax＝241,370和530nm。
3,6-双(3-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(15)的合成
将3-氨基苯甲腈(1.00g；8.460mmol)溶解在水合肼(2.50mL；51.4mmol)中，并且将混合物加热至90℃，持续3天。加入水(5mL)，并且过滤黄色沉淀，并用水(15mL)和乙醇(10mL)洗涤，以得到橙色粉末形式的粗中间体14(910mg；81％)。将中间体14(50mg；0.188mmol)悬浮于乙醇(4mL)中， 并且50℃下将氧气鼓泡通入该混合物中。几分钟内，颜色从黄色变为红色。16小时后，过滤沉淀，并用乙醇洗涤以得到红色粉末形式的产物15(31mg,62％)。
1H NMR(DMSO-d6):δ＝7.77(s,2H),7.66(d,2H),7.30(t,2H),6.85(d,2H),5.53(s,4H)ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝265.2(M+H+),λmax＝240,296和527nm。
3,6-双(氨基甲基)-1,2,4,5-四嗪(20)的合成
将Boc-氨基乙腈(1.00g；6.40mmol)溶解于甲醇(10mL)中，并且加入甲醇钠(0.145mL 25％的甲醇溶液；0.64mmol)。将混合物在20℃下搅拌18小时，随后加入氯化铵(0.34g；6.40mmol)，并且将混合物在20℃下搅拌3天。将溶液在乙醚(40mL)中沉淀，通过过滤收集沉淀，并且干燥以得到盐酸脒17。
将盐酸脒(17，241mg；1.15mmol)溶解在水合肼(3mL；61.9mmol)中,并且将该溶液在20℃下搅拌16小时。然后将其用水(10mL)稀释，并且通过离心法收集沉淀并干燥。将无色固体溶解于乙酸(1.5mL)中，并且加入亚硝酸钠(28mg；0.41mmol)。将粉色混合物搅拌15分钟，并且随后加入氯仿(15mL)和饱和碳酸氢钠(30mL)。分离有机层并且用水(15mL)洗涤，硫酸钠干燥，并且蒸发至干燥，以得到粉色固体形式的Boc保护四嗪(19,70mg；35％)。将该化合物(12mg；0.035mmol)溶解于氯仿(1mL)中并加入TFA(1mL)。将混合物搅拌15分钟，并且在乙醚(15mL)中沉淀。过滤粉色沉淀，洗涤并干燥，以得到标题化合物的TFA盐(20,10mg,78％)。
1H NMR(D2O):δ＝5.06(s,4H)ppm。13C NMR(D2O):δ＝164.5,41.1 ppm。HPLC-MS/PDA:色谱图中一个峰,m/z＝141(M+H+),λmax＝267和517nm。
2,2',2”-(10-(2-氧代-2-(6-氧代-6-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)己基氨基)乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(27)和2,2',2”-(10-(2-氧代-2-(11-氧代-11-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)十一基氨基)乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(28)的合成
将5-氨基-2-氰基吡啶21(1.02g；8.60mmol)、N-Boc-6-氨基-己酸22(0.99g；4.30mmol)、DCC(1.77g；8.60mmol)、DMAP(1.05g；8.60mmol)和PPTS(0.37g；1.47mmol)悬浮于氯仿(15mL)中。将混合物在室温下搅拌18小时，然后蒸发至干燥，并在乙腈(20mL)中搅拌。通过过滤移除沉淀，并将滤液蒸发至干燥，在氯仿(20mL)中溶解，并且分别用柠檬酸水溶液(15mL0.5M)、碳酸氢钾水溶液(15mL,1M)和水(15mL)洗涤。有机层用硫酸钠干 燥并蒸发至干燥。粗产物通过柱色谱法纯化(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯＝1:1)以得到白色固体形式的产物23(0.95g；61％)。
MS(ESI,m/z):C17H25N4O3 +([M+H]+)理论值：333.19，实测值：333.17。
将6-(6-氰基吡啶-3-基氨基)-6-氧代己基氨基甲酸叔丁基酯23(0.70g；2.1mmol)、2-氰基吡啶(0.87g；8.4mmol)、水合肼(1.25g；20mmol)溶解在乙醇(2mL)中，并且加入硫(0.22g；7mmol)。将混合物在70℃，氩气的惰性气氛下搅拌2小时，然后在50℃下持续16小时。橙色悬浮液用氯仿(10mL)稀释，并且所得溶液用水洗涤(2次，15mL)。有机层用硫酸钠干燥并蒸发至干燥。粗产物通过柱色谱法(二氧化硅，氯仿/丙酮＝4:1)纯化以得到橙色固体形式的产物24(0.65g；66％)。MS(ESI,m/z):C23H31N8O3 +([M+H]+)理论值：467.25实测值：467.33。
将6-氧代-6-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)己基氨基甲酸叔丁酯24(0.30g；0.64mmol)溶解于THF(1.5mL)中，并且加入乙酸(2mL)。将亚硝酸钠(0.25g；3.62mmol)溶解于水(1mL)中，并且滴加。将红色溶液倒入碳酸氢钾水溶液(50mL；1M)中，并且用氯仿(50mL)萃取。有机层用水(50mL)洗涤，并用硫酸钠干燥，并且蒸发至干燥，以得到紫色固体形式的产物25(0.25g；83％)。
MS(ESI,m/z):C23H29N8O3 +([M+H]+)理论值：465.23实测值：465.42。
将6-氧代-6-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)己基氨基甲酸叔丁酯25(66mg；0.14mmol)溶解于氯仿(6mL)中，并且加入TFA(6mL)。将溶液在室温下搅拌2小时，并随后蒸发至干燥，以得到产物26的TFA盐(52mg；100％)。MS(ESI,m/z):C18H21N8O+([M+H]+)理论值：365.19实测值：365.33。
将6-氨基-N-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)乙酰胺26(52mg；0.14mmol)溶解于DMF(2.5mL)中，并且加入DIPEA(320mg；2.0mmol)。加入N-羟基琥珀酰亚胺活化的DOTA(161mg；0.2mmol)，并且将混合物在室温下搅拌5小时。将溶液蒸发至干燥，粗产物溶解于乙腈和水的混合物中，并用制备型RP-HPLC纯化。冻干后得到粉色松散固体形式的纯产物27(80mg,76％收率)。
1H-NMR(30％乙腈-d3in D2O):δ＝8.90(m,2H,ArH),8.68(d,1H,ArH), 8.60(dd,1H,ArH),8.31(m,1H,ArH),8.24(t,1H,ArH),7.82(t,1H,ArH),3.80(br s,6H,NCH2COOH),3.72(br s,2H,NCH2CONH),3.34-3.23(br m,18H,NCH2CH2N,CH2NHCO),2.49(t,2H,NHCOCH2),1.70(m,2H,NHCOCH2CH2),1.59(m,2H,CH2CH2NHCO),1.41(m,2H,CH2CH2CH2NHCO)ppm。13C-NMR(30％乙腈-d3in D2O):δ＝175.5,171.5(br),162.6,162.5,150.1,148.1,142.9,141.6,139.6,138.4,128.0,127.9,125.4,124.8,55.4,54.3(br),49.4(br),39.4,36.5,28.2,25.9,24.6ppm。ESI-MS:m/z C34H47N12O8 +([M+H]+):751.37；实测值[M+H]+751.58,[M+Na]+773.50,[M+2H]2+376.42,[M+3H]3+251.33.FT-IR(ATR):υ＝3263,3094,2941,2862,1667,1637,1582,1540,1460,1431,1395,1324,1296,1272,1251,1226,1198,1128,1087,1060,1020,992,977,920,860,831,798,782,742,718,679,663cm-1。
对于28，使用与2,2',2”-(10-(2-氧代-2-(6-氧代-6-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)己基氨基)乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(27)的所述合成类似的步骤。冻干后得到粉色松散固体形式的纯产物28(90mg,78％收率)。
1H-NMR(DMSO-d6):δ＝10.65(s,1H,NH),9.06(d,1H,ArH),8.93(d,1H,ArH),8.61(t,2H,ArH),8.44(dd,1H,ArH),8.16(t,2H,ArH,NH),7.73(dd,1H,ArH),3.51(br s,6H,NCH2COOH),3.28(br s,2H,NCH2CONH),3.06(q,2H,CH2NHCO),3.34-3.23(br m,16H,NCH2CH2N),2.43(t,2H,NHCOCH2),1.64(m,2H,NHCOCH2CH2),1.42(m,2H,CH2CH2NHCO),1.38-1.22(m,12H,CH2)ppm。13C-NMR(DMSO-d6):δ＝173.0,171.0(br),169.1(br),163.5,163.2,151.0,150.6,144.2,141.7,139.1,138.2,127.0,126.5,125.3,124.6,57.3(br),55.2(br),50.7,39.0,36.8,29.5,29.4,29.3,29.19,29.17,29.1,26.9,25.3ppm。ESI-MS:m/zC39H57N12O8 +理论值([M+H]+):821.44；实测值[M+Na]+843.58,[M+H]+821.58,[M+2H]2+411.42,[M+3H]3+274.67.FT-IR(ATR):υ＝3261,3067,2925,2851,1633,1583,1541,1458,1433,1394,1324,1298,1270,1249,1228,1200,1165,1128,1088,1059,1016,991,920,885,860,832,798,782,764,742,719,687,661cm-1.
DOTA-四嗪活化剂29
上述四嗪29已在Robillard等人Angew.Chem.,2010,122,3447-3450中详细描述。它也作为可用作本发明活化剂的示例结构。1,2,4,5-四嗪基团的2-吡啶基之一上的酰胺官能团为供电子基团，而两个吡啶基均可看做吸电子基团。因此该四嗪可被认为是稍缺电子。
活化剂29表现出适合的且有利的药理性质：29在PBS溶液中较稳定，2小时内基本不降解，并且过夜孵育后大部分原料仍未改变；在小鼠中，它具有10分钟的血液清除半衰期；小鼠中它的部分分布容积(Vd)与总细胞外水隔室(extracellular watercompartment)相对应，因为它不显著进入细胞。活化剂29包含DOTA配体，并且这样的配体在多种显像模式(如MRI,SPECT)中是起作用的。因此，活化剂29不仅对于药物释放是适合的，它同时可用于成像目的。实际上，活化剂29已在与111In3+络合后被用作SPECT/CT显像探针。更多细节参见Robillard等人,Angew.Chem.,2010,122,3447-3450。
注意，活化剂27-29中包含的氨基-1,2,4,5-四嗪基团可用于与一些其它官能团(如糖、PEG、聚合物、肽(如RGD或c-RGD)、蛋白质、荧光分子或染料分子)结合。
实施例2
(E)-环辛烯模型前药和前药的合成
(E)-环辛-2-烯醇(31)、(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)和(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33)的合成
(E)-环辛-2-烯醇(31)的合成
将(Z)-环辛-2-烯醇30(2.36g,14.0mmol)和苯甲酸甲酯(1.8mL,1.94g,14.3mmol,1.0当量)在乙醚/庚烷1:2(500mL)的溶液中照射32小时，同时将其连续引导通过填充有二氧化硅/硝酸银10:1(41g)、氧化硅(0.5cm)和砂(0.5cm)的柱子。在照射时，将柱子放置于黑暗中。柱子用二氯甲烷(250mL)洗脱得到不反应的原料。二氧化硅在二氯甲烷/12.5％氨水1:1(3x 100mL)中搅拌。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发以得到灰色油形式的粗产物31。所述油通过柱色谱法(二氧化硅，洗脱液：戊烷/乙醚10％-50％)纯化以得到无色油形式的(E)-环辛-2-烯醇31(主要异构体，第二部分，440mg,3.49mmol,24.9％)和无色油形式的(E)-环辛-2-烯醇31(次要异构体，第一部分，325mg,2.58mmol,18.4％)。主要非对映异构体与通过G.H.Whitham,M.Wright,J.Chem.Soc.(C)1971,883中的不同路线制备的(1RS,2RS)-反式-环辛-2-烯-1-醇相同。次要非对映异构体与通过G.H.Whitham,M.Wright,J.Chem.Soc.(C)1971,886中的不同路线制备的(1SR,2RS)-反式-环辛-2-烯-1-醇相同。次要异构体：1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.71-0.82(m,1H),1.05-1.17(m,1H),1.43-1.72(m,4H),1.80-2.09(m,4H),2.45-2.52(m,1H),4.61(s,1H),5.54-5.61(m,1H),5.90-6.00(m,1H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75 MHz)δ＝23.35,29.42,36.08,36.27,43.40,71.40,130.78,135.39ppm。主要异构体：1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.64-0.90(m,2H),1.31-1.51(m,2H),1.66-1.95(m,4H),2.06-2.14(m,1H),2.22-2.37(m,1H),2.78(br,1H),4.15-4.23(m,1H),5.45-5.65(m,2H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75MHz)δ＝27.83,29.28,30.52,35.58,36.05,44.48,131.86,136.00ppm。
注意：参考Whitham等人，J.Chem.Soc.(C),1971,883-896，其记载了反式-环辛-2-烯醇的平伏键(equatorial)异构体和直立键异构体的合成和表征，分别鉴定为(1RS,2RS)和(1SR,2RS)。在这些异构体中，OH取代基或在平伏键或直立键位置。上述主要和次要异构体分别指平伏键构型异构体和直立键异构体。下面全部实施例，主要/平伏键和次要/直立键对于反式-环辛-2-烯醇可互换使用，并且该表征基于上面提到的母体化合物反式-环辛-2-烯醇的表征。
(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(主要异构体)(32)的合成
向(E)-环辛-2-烯醇31(主要异构体，100mg,0.792mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入异氰酸苄酯(101μL,110mg,0.826mmol,1.04当量)和一滴三乙胺。将烧瓶用铝箔覆盖，并且将溶液在室温下，氮气气氛中搅拌过夜。蒸发反应混合物主要得到原料。加入异氰酸苄酯(200μL,220mg,1.65mmol,2.08当量)和一滴三乙胺的二氯甲烷(6mL)溶液，并且溶液室温下搅拌过夜，50℃搅拌1小时，25–30℃搅拌持续周末。挥发物通过短程蒸馏(bulb-to-bulbdistillation)(50℃,2小时)移除。将残渣通过柱色谱法纯化以得到白色固体形式的氨基甲酸酯32(101mg,0.389mmol,49.2％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.81-0.86(m,2H),1.35-1.55(m,2H),1.82-1.99(m,4H),2.21-2.30(m,1H),2.38-2.47(m,1H),4.36(d,5.8Hz,2H),4.96(br,1H),5.08-5.20(m,1H),5.48-5.57(m,1H),5.71-5.82(m,1H),7.26-7.36(M,5H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75MHz)δ＝27.69,29.25,35.68,35.76,35.83,41.32,44.53,78.33,100.02,127.65,127.78,128.86,132.03,133.31,138.88ppm。
(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(次要异构体)(32)的合成
向(E)-环辛-2-烯醇31(次要异构体，100mg,0.792mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入异氰酸苄酯(101μL,110mg,0.826mmol,1.04当量)和一滴三乙胺。将烧瓶用铝箔覆盖，并且将溶液在室温下，氮气气氛中搅拌过夜。蒸发反应混合物主要得到原料。加入异氰酸苄酯(200μL,220mg,1.65mmol,2.08当量)和一滴三乙胺的二氯甲烷(6mL)溶液，并且溶液室温下搅拌过夜，50℃搅拌1小时，25–30℃搅拌持续周末。挥发物通过短程蒸馏(bulb-to-bulbdistillation)(50℃,2小时)移除。将残渣通过柱色谱法纯化以得到白色固体形式的氨基甲酸酯32(43mg,0.166mmol,20.9％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.74-0.93(m,2H),1.01-1.14(m,1H),1.41-1.57(m,1H),1.62-1.76,2H),1.84-2.12(m,3H),2.46-2.49(m,1H),4.40(d,J＝6.0Hz,2H),5.05(br,1H),5.40(s,1H),5.52-5.59(m,1H),5.79-5.89(m,1H),7.31-7.36(m,5H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75MHz)δ＝24.34,29.33,36.13,36.20,40.97,45.30,74.33,127.67,127.85,128.87,131.72,131.99,138.87,156.11ppm。
(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(主要异构体)(33)的合成
向(E)-环辛-2-烯醇31(主要异构体，260mg,2.06mmol)的二氯甲烷(12mL)溶液中加入二氯甲烷(3mL)中的3,5-二甲基苯基异氰酸酯(305μL,318mg,2.16mmol,1.05当量)和数滴三乙胺。将烧瓶用铝箔覆盖，并且将溶液在29℃下，氮气气氛中搅拌4晚。蒸发反应混合物得到0.57g灰白色固体。将残渣通过柱色谱法(二氧化硅，30mL洗脱液，乙酸乙酯/庚烷5％-10％)纯化得到部分纯化的氨基甲酸酯33(94mg)。将产物进一步通过柱色谱法(二氧化硅，30mL洗脱液，乙酸乙酯/庚烷5％)纯化以得到白色固体形式的氨基甲酸酯33(72mg,0.263mmol,12.8％收率,包含大约10％Z-异构体)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.79-0.98(m,2H),1.28-2.02(m,4H),1.80-2.07(m,3H),2.30(s,6H),2.42-2.50(m,1H),5.13-5.22(m,1H),5.55-5.87(m,2H),6.49(br,1H),6.71(s,1H),7.04(s,2H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75MHz)δ＝21.61,27.67,29.24,35.70,35.84,41.21,79.34,116.59, 125.22,131.83,133.51,138.11,138.50,153.43ppm。
(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(次要异构体)(33)的合成
向(E)-环辛-2-烯醇31(次要异构体，还包含Z异构体，260mg,2.06mmol)的二氯甲烷(12mL)溶液中加入二氯甲烷(3mL)中的3,5-二甲基苯基异氰酸酯(305μL,318mg,2.16mmol,1.05当量)和数滴三乙胺。将烧瓶用铝箔覆盖，并且将溶液在30℃下，氮气气氛中搅拌2晚，并在50℃下过夜搅拌。蒸发反应混合物得到0.54g黄色固体。将残渣通过柱色谱法(二氧化硅，40mL洗脱液，乙酸乙酯/庚烷5％)纯化得到部分纯化的氨基甲酸酯33(20mg)。将产物进一步在真空(0.08mbar)中，40℃下纯化，持续3小时，并在室温下过夜以得到淡黄色半固体形式的氨基甲酸酯33(11mg,0.040mmol,2.0％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ＝0.78-0.90(m,1H),1.07-2.18(m,8H),2.30(s,6H),2.45-2.53(m,1H),5.42(s,1H),5.56-5.62(m,1H),5.83-5.94(m,1H),6.60(s,1H),6.71(s,1H),7.03(s,2H)ppm。13C-NMR(CDCl3,75MHz)δ＝21.64,24.42,29.43,36.77,40.19,74.46,116.47,118.77,125.35,131.34,132.31,138.00,138.91ppm。
(E)-环辛-2-烯-1-基(4-硝基苯基)氨基甲酸酯(34)的合成
将次要异构体(E)-环辛-2-烯醇31(304mg,2.41mmol)在15mL二氯甲烷中的溶液在冰中冷却。加入4-(N,N-二甲基氨基)吡啶(1.16g,9.50mmol)，然后加入4-硝基氯甲酸苯酯(0.90g,4.46mmol)。将溶液过夜搅拌，然后倒在20g二氧化硅柱上。用二氯甲烷洗脱，然后用包含5％TBME的二氯甲烷洗脱。将产物部分合并，并且旋转蒸发以得到凝固油形式的次要异构体34(338mg,1.16mmol,48％)。
以此类推，从10mL二氯甲烷中的主要异构体(E)-环辛-2-烯醇31(259 mg,2.06mmol)，与4-(N,N-二甲基氨基)吡啶(1.11g,9.09mmol)和4-硝基氯甲酸苯酯(0.85g,4.22mmol)得到凝固油形式的主要异构体34(234mg,0.80mmol,39％)。
次要异构体34的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.9(m,1H),1.25(m,1H),1.5–2.2(m,6H),2.25(dd,1H),2.6(m,1H),5.45(s,1H),5.6(dd,1H),6.0(m,1H),7.4(d,2H),8.3(d,2H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ＝24.0,29.0,36.0,36.0,40.6(所有CH2),79.0,122.0,125.8,129.8,133.2(所有CH),145.4,151.8,156.0(C和C＝O)ppm。
主要异构体34的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–1.0(m,2H),1.4–2.1(m,6H),2.35(m,1H),2.45(m,1H),5.2(m,1H),5.65(m,1H),5.85(m,1H),7.4(d,2H),8.3(d,2H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ＝27.8,29.0,35.8,36.0,40.4(所有CH2),83.0,121.8,125.0,130.4,134.4(所有CH),145.8,152.0,156.0(C和C＝O)ppm。
(E)-环辛-2-烯-1-基(4-(羟甲基)苯基)氨基甲酸酯(35)的合成
将衍生自次要异构体醇31(136mg,0.467mmol)的PNP衍生物34溶解于7.5g THF中。加入二异丙基乙胺(182mg,1.41mmol)，然后加入1-羟基苯并三唑(24mg,0.178mmol)和4-氨基苯甲醇(94mg,0.76mmol)。将混合物在暗处，约30℃下搅拌6天。将溶剂通过旋转蒸发移除，并且残渣在20g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加TBME量的二氯甲烷作为洗脱液。产物用约5％TBME洗脱。将产物部分旋转蒸发得到黏稠油形式的产物：次要异构体35(112mg,0.407mmol,87％)。
以此类推，6.0g THF中的衍生自主要异构体31的PNP衍生物34(145mg,0.498mmol)与二异丙基乙胺(210mg,1.63mmol)、1-羟基苯并三唑(34mg,0.251mmol)和4-氨基苯甲醇(128mg,1.04mmol)在约30℃下反应3天。旋转蒸发并色谱法分离得到粘稠油形式的产物主要异构体35(110mg,0.40mmol,80％)。
次要异构体35的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8(m,1H),1.1(m,1H),1.45(m,1H),1.6–2.2(m,6H),2.4(m,1H),4.6(s,2H),5.4(s,1H),5.55(dd,1H),5.85(m,1H),7.15(bs,1H),7.2-7.4(AB,4H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ＝24.2,29.0,36.0,36.0,41.0,65.0(CH2),75.0,119.0,128.0,131.0,132.6(所有CH),136.0,138.0,153.6(C和C＝O)ppm。
主要异构体35的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–1.0(m,2H),1.4–2.1(m,6H),2.3(m,1H),2.45(m,1H),4.65(s,2H),5.2(m,1H),5.6(m,1H),5.8(m,1H),6.6(bs,1H),7.45–7.65(AB,4H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ＝27.4,29.2,35.8,36.0,41.2,65.0(所有CH2),79.8,119.0,128.2,132.0,134.0(所有CH),136.0,137.8,153.6(C和C＝O)ppm。
次要异构体(E)-2-(4-(((环辛-2-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯基)-2-((((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氧基)乙酸乙酯(37)的合成
将衍生自次要异构体醇31的PNP衍生物34(300mg,1.03mmol)溶解于10.3g THF中。加入二异丙基乙胺(362mg,2.80mmol)，然后加入1-羟基苯并三唑(75mg,0.556mmol)和2-(4-氨基苯基)-2-羟基乙酸乙酯(325mg,1.67mmol,如WO 2009109998中所记载制备)。将混合物在暗处，约30℃下搅拌6天。将溶剂通过旋转蒸发移除，并且残渣在21g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加TBME量的二氯甲烷作为洗脱液。将产物用约5％TBME洗脱。旋转蒸发产物部分得到粘稠油形式的次要异构体(E)-2-(4-(((环辛-2-烯-1-基氧)羰基)氨基)苯基)-2-羟基乙酸乙酯(36)(350mg,1.01mmol,99％)。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8(m,1H),1.1(m,1H),1.2(t,3H),1.4–2.2(m,7H),2.5(m,1H),4.1–4.3(2q,2H),5.1(s,1H),5.45(s,1H),5.55(dd,1H),5.85(m,1H),6.7(bs,1H),7.3-7.45(AB,4H)ppm。
将上述得到的产物36(80mg,0.23mmol)溶解于4.1g乙腈中。
加入二异丙基乙胺(215mg,1.67mmol)，然后加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(217mg,0.85mmol)。将该溶液在约30℃下搅拌2天，溶剂通过旋转蒸发移除，并且残渣在16g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加TBME量的二氯甲烷作为洗脱液。将产物用约20％TBME洗脱。旋转蒸发产物部分得到粘稠油形式的次要异构体(E)-2-(4-(((环辛-2-烯-1-基氧)羰基)氨基)苯基)-2-((((2,5-二氧代吡咯-1-基)氧)羰基)氧)乙酸乙酯(37)(60mg,0.123mmol,53％)。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8(m,1H),1.1(m,1H),1.2(t,3H),1.4–2.2(m,7H),2.5(m,1H),2.6(s,4H),4.15–4.3(2q,2H),5.4(s,1H),5.55(dd,1H),5.8(s)and 5.85(m)(2H),6.7(bs,1H),7.35-7.5(AB,4H)ppm。
(E)-环辛烯多柔比星前药(38)的合成
将衍生自次要异构体醇31的PNP衍生物34(20mg,0.0687mmol)溶解于3.0g DMF中。加入二异丙基乙胺(80mg,0.62mmol)，然后加入(45mg,0.0776mmol)。将混合物在暗处，约30℃下搅拌3天。将溶剂在高真空下移除，并且残渣在17g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加甲醇量的二氯甲烷作为洗脱液。将产物部分旋转蒸发，所得的残渣与5mL TBME搅拌。然后加入15mL庚烷并过滤得到次要异构体38(27mg,0.039mmol,50％)。滤液中包含额外量的产物。
以此类推，7.2g DMF中的衍生自主要异构体醇31的PNP-衍生物34(22mg,0.0756mmol)与二异丙基乙胺(80mg,0.62mmol)和盐酸多柔比星(47.7mg,0.0822mmol)反应，然后高真空下移除溶剂，色谱分离，并用TBME/庚烷处理，得到主要异构体38(21mg,0.030mmol,30％)。滤液中包含额外量的产物。
次要异构体38的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.7–2.0(m)and 1.35(d)(18H),2.2(m,2H),2.4(m,2H),3.0–3.4(dd,2H),3.65(s,1H),3.9(m,1H),4.1(s+m,4H),4.8(s,1H),5.05(m,1H),5.2–5.85(m,2H),7.4(d,1H),7.8(t,1H),8.05(d,1H)ppm。
主要异构体38的1H-NMR(CDCl3):δ＝0.7–2.0(m)and 1.35(d)(18H),2.2(m,2H),2.4(m,2H),3.0–3.4(dd,2H),3.65(s,1H),3.9(m,1H),4.1(s+m,4H),4.8(s,1H),5.0(m,1H),5.3–5.8(m,2H),7.4(d,1H),7.8(t,1H),8.05(d,1H)ppm。MS:694.3(M-1).
(E)-环辛烯多柔比星前药(46)的合成
在-20℃温度以下，向含二异丙基乙胺(23.66g,0.234mol)的100mL THF中加入正丁基锂(97mL,在己烷中2.5N,0.242mol)。将溶液冷却，并且将溶解在60mL THF中的环辛-2-烯酮(39,23.07g,0.185mol)在-65℃到-80℃下20分钟内加入。然后将溶液在-67℃到-72℃下搅拌1小时。溶解在40mL THF中的溴乙酸乙酯(45.4g,0.272mol)在-63℃到-75℃下25分钟内加入。所得的混合物在-55℃到-70℃下搅拌3小时。-60℃下加入庚烷(50mL)，然后加入40g氯化铵在100mL水中的溶液(同时冷却)，使温度从-70℃升至-30℃。移除冷却浴，并且混合物搅拌额外30分钟，同时温度升至-15℃。将混合物倒入200mL TBME和50mL水中，分层，并且有机层用50mL水洗涤。连续的水层用250mL TBME萃取。有机层干燥并旋转蒸发。过量的溴乙酸乙酯通过升温Kugelrohr装置在高真空下移除。包含(Z)-2-(2-氧代环辛-3-烯-1-基)乙酸乙酯的残渣以这样的形式下步使用。
1H-NMR(CDCl3):δ＝1.25(t,3H),1.4–2.6(m,9H),2.9(2d,1H),3.55(m,1H),4.15(q,2H),6.05–6.5(m,2H)ppm。
将酯40的粗品在180mL THF和20mL甲醇中的溶液在冰中冷却。加入磷酸钨酸(250mg)，然后7℃温度以下，30分钟内分批加入硼氢化钠(4.0g,0.105mol)，混合物在冰中搅拌90分钟，然后加入250mL水和250mL甲苯。分层并且有机层用50mL水洗涤。连续的水层用250mL甲苯萃取。有机层干燥并旋转蒸发。粗产品41没有产生明确的部分，因此将所有物质合并，并且通过与25mL 50％氢氧化钠溶液在200mL乙醇(过程中加入另外25mL水)中回流2小时来水解。大部分乙醇通过旋转蒸发移除。向残渣中加入一些水。混合物用2x 200mL甲苯萃取。有机层用50mL水洗涤。向合并的水层中加入甲苯(200mL)，然后将其用浓盐酸酸化。分层并且有机层用20mL水洗涤。连续的水层用200mL甲苯萃取。两部分有机层干燥并旋转蒸发。Kugelrohr蒸馏得到约2:1比率的两个异构体混合物形式的内酯42(7.33g,44.1mmol,24％基于环辛-2-烯酮)。
1H-NMR(CDCl3):δ＝1.2–2.6(m,10H),2.6-2.8(m,1H),4.95(m,0.35H),5.35(m,0.65H),5.6(m,1H),5.85(m,1H)ppm。13C-NMR(CDCl3):δ＝24.1,25.2,27.0,28.0,29.2,29.6,34.4,36.8(所有CH2),43.5,47.2,80.8,81.9(所有CH),126.4,129.6,130.2,134.2(所有CH),176.4(C＝O),177.0(C＝O)ppm。
将上述得到的内酯42(7.33g,44.1mmol)与10.0g苯甲酸甲酯和约500mL庚烷/乙醚(4:1)混合。混合物照射36小时，同时溶液连续流动通过69g硝酸银浸渍的二氧化硅柱(包含约6.9g硝酸银)。柱填料然后用250mL 3:1,2:1,1:1,1:2比率的庚烷/TBME冲洗，然后用400mLTBME冲洗。前两部分仅包含苯甲酸甲酯。最后3部分用200mL 10％氨洗涤，干燥并且旋转蒸发。然后在高真空下移除大部分苯甲酸甲酯，合并的残渣重量为800mg(Z和E的混合物，以及苯甲酸甲酯)。剩下的柱填料与TBME和氨搅拌，然后过滤，并且分层。固体用水层和TBME再处理两次，然后过滤并分层。有机层干燥并旋转蒸发得到约4:1异构体混合物的433.70g，每个异构体可能由两个E-异构体(22.29mmol,51％)组成。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–2.75(m,10.6H),3.0(m,0.4H),4.45(t,0.2H), 5.0(m,0.8H),5.6(dd,0.5H),5.65(m,0.5H),5.8(m,0.5H),6.05(m,0.5H)ppm。
回收的主要异构体(参见下列实验)具有以下数据：
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–2.75(m,10.6H),3.0(m,0.4H),t,0.2H),4.95(m,1H),5.6(dd,0.8H),5.65(m,0.3H),5.8(m,0.3H),6.05(m,0.6H)ppm。
13C-NMR(CDCl3):δ＝21.6,25.8,30.0,30.4,33.0,34.8,35.4,36.0,38.0(所有CH2),46.0,47.0,80.8,84.0(所有CH),128.2,131.4,133.0,134.0(所有CH),177.2(C＝O),177.4(C＝O)ppm。信号的比例表明约2:1的异构体比例。
向内酯43(865mg,5.21mmol)在15mL二氯甲烷中的溶液加入二异丙基乙胺(5.91g,45.8mmol)，然后加入β-丙氨酸乙酯盐酸盐(1.38g,8.98mmol)。将混合物在室温下搅拌16天，然后在55℃旋转蒸发。将残渣在50g二氧化硅上使用二氯甲烷作为洗脱液色谱法分离。这得到起始内酯43(主要E-异构体，通过C-NMR似乎是两个异构体的混合物)。进一步用包含增加甲醇量的二氯甲烷洗脱得到酰胺44。将产物在75mL TBME中溶解，并且用25mL中的柠檬酸以及2x 10mL洗涤。连续的水层用50mL TBME萃取。合并的有机层干燥并且旋转蒸发以得到酰胺44(360mg,1.27mmol,24％)，其由异构体的混合物组成。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–2.7(m),1.25(t),2.45(t)(16H),3.5(q,2H),3.9(t,0.5H),4.15(q,2H),4.35(m,0.5H),5.5–5.9(m,2H),6.2–6.5(2bt,1H)ppm。
13C-NMR(CDCl3)(一组异构体中更丰富的部分的信号):δ＝14.3(CH3),22.4,27.8,29.9,33.0,34.0,34.1,34.2,34.5,35.3,35.3,35.5,35.7,36.1,36.2,41.7(所有CH2),46.2(CH),51.6(CH),60.9(CH2),77.1,80.2,131.2,131.7,134.2,135.6(所有CH),172.7,173.9,175.1(所有C＝O)ppm。
将酰胺44(115mg,0.406mmol基本上一组异构体)溶解在4.4g乙腈中。加入二异丙基乙胺(370mg,2.87mmol)，然后加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(355mg,1.38mmol)。将该溶液在约30℃下搅拌2天，溶剂通过旋转蒸发移除，并且残渣在16g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加TBME量的二氯甲烷作为洗脱液。将产物用约20％TBME洗脱。将产物部分旋转蒸发得到黏稠油形式的NHS碳酸酯45(150mg,0.353mmol,87％)。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8–2.6(m),1.25(t),2.55(t)(16H),2.85(q,4H),3.5(q,2H),4.15(q,2H),4.95(t,0.8H),5.2(dd,0.2H),5.55–6.0(m,2H),6.4(bt,1H)ppm。
将上述得到的NHS-碳酸酯45(150mg,0.353mmol)溶解于7.56g DMF中。加入二异丙基乙胺(132mg,1.02mmol)，然后加入盐酸多柔比星(66mg,0.114mmol)。将混合物在暗处，室温下搅拌3天。将溶剂在高真空下移除，并且残渣在13g二氧化硅上色谱分离，使用逐渐增加甲醇量的二氯甲烷作为洗脱液。将产物部分旋转蒸发得到112mg前药46。
1H-NMR(CDCl3,仅给出相关信号):δ＝1.25(t),3.2(m),3.5(m),4.05(s),4.15(q),4.8(s),5.2–5.8(m),6.15(m),6.25(m),7.4(d),7.8(t),8.0(d)ppm。
任选地，前药46可通过将酯官能团转化为羧酸而结合至抗体，然后可转化为NHS酯以供赖氨酸结合。
次要异构体(E)-环辛-2-烯-1-基(2,5-二氧代吡咯-1-基)碳酸酯(47)的合成
将N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(372mg,1.45mmol)加入到次要异构体醇31(77mg,0.61mmol)、3.33g乙腈和二异丙基乙胺(410mg,3.18mmol)搅拌的混合物中。混合物在25℃下搅拌3天，两天后加入另外120mg N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。溶液在15g二氧化硅上，使用二氯甲烷，然后包含少量TBME的二氯甲烷作为洗脱液，进行色谱分离。产物部分旋转蒸发以得到固体形式的产物47(62mg,0.23mmol,38％)。
1H-NMR(CDCl3):δ＝0.8(m,1H),1.15(m,1H),1.45–2.15(m,6H),2.2(dd,1H),2.55(m,1H),2.8(s,4H),5.4(s,1H),5.5(d,1H),6.0(m,1H)ppm。
实施例3
四嗪活化剂的稳定性和反应性
四嗪的水解稳定性试验
将10μL的特定四嗪在DMSO中的溶液(25mM)用PBS缓冲液(3mL)(或如果水溶性太低，用PBS和乙腈的混合物)稀释。过滤该溶液，使用紫外光谱仪监测525nm处吸收带的降低。从这些数据测定水解率和半衰期。
四嗪对反式-环辛-4-烯-1-醇(直立键异构体)的反应性
为了测定特定四嗪和3-(5-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(5)(其选作参考四嗪)在与反式-环辛-4-烯-1-醇(次要异构体，OH在直立位置，参见：Whitham等人，J.Chem.Soc.(C),1971,883-896))之间的逆-需电子Diels-Alder反应中的反应性比，进行了竞争性试验。
向乙腈(0.100mL)中加入5μL特定四嗪在DMSO中的溶液(25mM)和5μL参考四嗪在DMSO中的溶液(25mM)。将混合物用水(0.9mL)稀释，两种四嗪的绝对量通过HPLC-MS/PDA分析测定。随后，缓慢加入反式-环辛-4-烯-1-醇(直立键异构体)在DMSO(25μL 2.5mM)中的溶液，然后将混合物搅拌5分钟。再次通过HPLC-MS/PDA分析测定两种四嗪的绝对量，并且计算两种四嗪的转化率。从这些转化率，使用Ingold和Shaw(J.Chem.Soc.,1927,2918-2926)的数学方法计算两种四嗪的反应性比(R＝k2,TCO/k2,Ref)。
下表说明如何通过改变取代基来使四嗪的反应性和稳定性特征具备特定特性(specification)。
*该值在PBS和乙腈的50:50混合物中测定。
实施例4
反式-环辛烯模型前药和前药的稳定性和反应性
稳定性
将10μL的具体反式-环辛烯衍生物在二氧杂环己烷中的溶液(25mM)用PBS缓冲液(3mL)稀释，并且将该溶液在20℃下，在暗处储存。TCO化合物的结果通过HPLC-MS分析检测，并且估算其半衰期。
反式-环辛烯衍生物对双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪的反应性:二级速率常数的测定
在乙腈中，使用紫外-可见光谱法测定20℃下进行的反式-环辛烯衍生 物与3-(5-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(5)的反电子需求的Diels-Alder反应的动力学。向吸收池装入乙腈(3mL)并在20℃下平衡。加入3-(5-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(5,2.50×10-7mol)，然后加入反式-环辛烯衍生物(2.50×10- 7mol)。
检测吸收在λ＝540nm下的衰变，并且从此曲线上测定二级速率常数、k2，呈现二级反应动力学。
反式-环辛烯衍生物对双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪的反应性：竞争性试验
进行竞争性试验，以测定特定反式-环辛烯衍生物和反式-环辛-4-烯-1-醇(直立式异构体，被选作参比反式-环辛烯)在与双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)的反电子需求的Diels-Alder反应中的反应性比。
向乙腈(0.05mL)中加入特定反式-环辛烯衍生物在二氧杂环己烷中的溶液(5μL25mM；1.25×10-7mol)和参比反式-环辛烯衍生物在二氧杂环己烷中的溶液(5μL 25mM；1.25×10-7mol)。将该混合物用水(0.45mL)稀释。随后，将双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,6.2510-8mol)在乙腈(0.05mL)和水(0.45mL)的混合物中的溶液缓慢加入同时剧烈搅拌。添加完毕后，将混合物搅拌，持续另外5分钟。通过HPLC-MS/PDA分析测定两种反式-环辛烯衍生物的转化，并使用Ingold和Shaw(J.Chem.Soc.,1927,2918-2926)的数学方法从这些转化计算特定反式-环辛烯衍生物的反应性比(R＝k2,TCO/k2,Ref)。
*在乙腈中，20℃下通过紫外-可见光谱法测定
**通过竞争性试验测定
实施例5
模型前药的活化
该实施例证明1,2,4,5-四嗪与模型反式-环辛烯前药的反电子需求的Diels-Alder反应，以及随后模型药物(如苄基胺)的消除。
一般操作
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
将3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,5.91×10-5g；2.5×10-7mol)溶解于0.2mL中,并且加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32,氨基甲酸酯在直立键位置的异构体；6.48×10-5g；2.50×10-7mol)。5分钟后，将反应混合物用水(0.8mL)稀释，并且在20℃下搅拌，持续24小时。混合物的HPLC-MS分析证明了消除产物(无氨基苄基氨基甲酸酯的rDA加成化合物)的形成，消除产物的m/z＝+317Da(M+H+)，并且释放苄胺(m/z＝+108Da:M+H+).
6-甲基-3-(4-丁酰氨基-2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
根据上述一般操作，将两个标题化合物反应，并通过HPLC-MS分析证明了m/z＝+339Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺(m/z＝+108Da:M+H+)的释放。
6-苯基-3-(4-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
根据上述一般操作，将两个标题化合物反应，并通过HPLC-MS分析证明了m/z＝+330Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺(m/z＝+108Da:M+H+)的释放。
6-苯基-3-(3-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
根据上述一般操作，将两个标题化合物反应，并通过HPLC-MS分析证明了m/z＝+330Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺(m/z＝+108Da:M+H+)的释放。
6-H-3-(4-氨基甲基苯基)-1,2,4,5-四嗪和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
根据上述一般操作，将两个标题化合物反应，并通过HPLC-MS分析证明了m/z＝+268Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺(m/z＝+108Da:M+H+)的释放。
3,6-二苯基-1,2,4,5-四嗪和次要-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
根据上述一般操作，将两个标题化合物反应，并通过HPLC-MS分析证明了m/z＝+315Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺(m/z＝+108Da:M+H+)的释放。
3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
将3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(3.34mg；1.26×10-5mol)溶解在0.5mLDMSO-d6，并且加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32；3.28mg；1.26×10- 5mol)。5分钟后，将反应混合物用D2O(0.2mL)稀释，并且在20℃下搅拌，持续24小时。反应混合物的1H-NMR表明苄胺的生成：δ＝3.86ppm(s,2H,PhCH2 NH2)。该混合物的HPLC-MS分析表明消除产物的形成(tr＝5.45分钟:m/z＝+345Da(M+H+))，以及苄胺的释放：(tr＝0.88分钟:m/z＝+108Da:(M+H+))。
3,6-双(4-羟基苯基)-1,2,4,5-四嗪(11)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32)
将3,6-双(4-羟基苯基)-1,2,4,5-四嗪(11,6.65×10-5g；2.50×10-7mol)溶解于0.5mL乙腈中,并且加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基苄基氨基甲酸酯(32；6.48×10-5g；2.50×10-7mol)。2分钟后，将反应混合物用水(0.5mL)稀释，并且在20℃下搅拌，持续5小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+347Da(M+H+)的消除产物的形成，以及苄胺的释放：m/z＝+108Da(M+H+)。
3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33)
将3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9,6.60×10-5g；2.50×10-7mol)溶解在乙腈(0.3mL)中，并且将该混合物用PBS缓冲液(0.7mL)稀释。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33,氨基甲酸酯在直立键位置的异构体；6.84×10-5g；2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续20小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+345Da(M+H+)的消除产物的形成，以及3,5-二甲基苯胺的释放：m/z＝+122Da(M+H+)。
3,6-双(4-羟基苯基)-1,2,4,5-四嗪(11)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33)
将3,6-双(4-羟基苯基)-1,2,4,5-四嗪(11,6.65×10-5g；2.50×10-7mol)溶解在乙腈(0.2mL)中，并且将该混合物用PBS缓冲液(0.8mL)稀释。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33；6.84×10-5g；2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续20小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+347Da(M+H+)的消除产物的形成，以及3,5-二甲基苯胺的释放：m/z＝+122Da(M+H+)。
3,6-二苯基-1,2,4,5-四嗪和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33)
将3,6-二苯基-1,2,4,5-四嗪(5.85×10-5g；2.50×10-7mol)溶解在乙腈(0.3mL)中，并且将该混合物用PBS缓冲液(0.7mL)稀释。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33；6.84×10-5g；2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续20小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+315Da(M+H+)的消除产物的形成，以及3,5-二甲基苯胺的释放：m/z＝+122Da(M+H+)。
3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33)
将3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7,4.33×10-5g；2.50×10-7mol)溶解于PBS缓冲液(1mL)中。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基(3,5-二甲基苯基)氨基甲酸酯(33；6.84×10-5g；2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续20小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+254Da(M+H+)的消除产物的形成，以及3,5-二甲基苯胺的释放：m/z＝+122Da(M+H+)。
实施例6
多柔比星前药的活化
3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38)
将3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7,4.33×10-6g；2.50×10-8mol)溶解于PBS缓冲液(1mL)中(c＝25μM)。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38,氨基甲酸酯在直立键位置的异构体；1.74×10-5g；2.50×10-8mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续4小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+254Da(M+H+)的消除产物的形成，以及多柔比星的释放(69％收率)：m/z＝+544Da(M+H+)且λmax＝478nm。在2.5μM和1.0μM的浓度下得到类似的结果。
3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7)和主要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38)
将3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(7,4.33×10-6g；2.50×10-8mol)溶解于PBS缓冲液(1mL)中(c＝25μM)。然后加入主要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38,氨基甲酸酯在平伏键位置的异构体；1.74×10-5g；2.50×10-8mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续16小时。混合物的HPLC-MS分析表明DA-反应40％的转化率，并且证明了m/z＝+254Da(M+H+)的消除产物的形成，以及多柔比星的释放(20％收率)：m/z＝+544Da(M+H+)且λmax＝478nm。
3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9)和次要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38)
将3,6-双(2-氨基苯基)-1,2,4,5-四嗪(9,2.64×10-6g；1.00×10-8mol)溶解于乙腈(0.1mL)中。将该混合物用PBS缓冲液(0.9mL)稀释。然后加入次要-(E)-环辛-2-烯-1-基多柔比星氨基甲酸酯(38；6.96×10-6g；1.00×10-8mol)。将溶液在20℃下搅拌，持续18小时。混合物的HPLC-MS分析证明了m/z＝+345Da(M+H+)的消除产物的形成，以及多柔比星的释放(90％收率)：m/z＝+544Da(M+H+)且λmax＝478nm。
实施例7
多柔比星前药(次要-38)和四嗪7的细胞增殖试验
将在青霉素和链霉素的存在下添加有10％热失活胎牛血清和0.05％glutamax(Invitrogen)的DMEM(Invitrogen)中的A431鳞状癌细胞保持在37℃下的潮湿CO2(5％)培养箱中。在实验开始24小时前，将细胞以2500细胞/孔的密度在96孔板(Nunc)中铺板。在实验马上开始前，将多柔比星(Dox)和前药(次要-38，DMSO中1mM)以及四嗪7(PBS中10mM)按序在预热的培养基中稀释，并且将其加入孔中(每孔200μl终体积)。将前药单独添加或者与10μM或1.5mol当量(相对于前药)四嗪7联合添加。在37℃下培养72小时后，通过MTT实验检测细胞增殖。简要地说，将甲基噻唑基二苯基四唑溴鎓盐(methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide,MTT)以5mg/ml溶解于PBS中，通过0.22μm过滤，并且每孔加入25μl。37℃下培养120分钟后，将培养基轻轻地吸出。将形成的甲晶体溶解在100μl DMSO中，用酶标仪(BMG Labtech)在560nm下检测吸光度。从用GraphPadPrism(version 5.01)生成的标准化细胞生长曲线(参见图1)得到IC50值(±标准误差；参见表)细胞增殖评价表明，尽管四嗪7是无毒的(IC50>100μM)并且前药38是低毒的(IC50＝3.017±0.486μM)，但这两种组分的组合对A431细胞产生了较高的毒性(当分别使用连续稀释或定量的四嗪7时，IC50为0.137±0.012μM和0.278±0.022μM)。这确证了前药的反式-环辛烯和四嗪的逆Diels-Alder反应后释放了多柔比星。
在A431细胞系中测定的多柔比星(Dox)、经四嗪7活化和未经四嗪7活化的前药38、以及单独的四嗪7的IC50值
化合物 IC50(μM)
Dox 0.020±0.002
前药38 3.017±0.486
前药38+四嗪7(1.5当量) 0.137±0.012
前药38+四嗪7(10μM) 0.278±0.022
四嗪7 >100
实施例8
通过用(E)-环辛-2-烯-1-基NHS碳酸酯47修饰进行的抗体掩蔽，以及随后的通过与四嗪活化剂反应进行的抗体活化
抗体与次要-(E)-环辛-2-烯-1-基NHS碳酸酯47的缀合
将CC49(8mg/mL,62.5μL)在PBS中的溶液加入6.2μL DMF中，然后用1M碳酸钠缓冲液将pH调节至9。随后，加入新鲜的次要-(E)-环辛-2-烯-1-基NHS碳酸酯47溶解在干燥DMF中的溶液(5μg/μL,相对于CC49，40mol当量)，并且将所得的溶液在室温下，轻微晃动下，黑暗中培养3小时。培养后，将反应混合物用PBS稀释至500μL，并且将未反应的47通过用PBS预平衡的Zeba脱盐旋转柱(40kDa截留分子量,Pierce)消除。所得的mAb溶液浓度通过紫外-可见(Nanodrop)检测，并且产物的纯度和完整性通过SDS-PAGE评价。缀合收率用四嗪滴定来检测。将DOTA-四嗪衍生物29用加入载体的177Lu放射性标记(如之前Rossin等人,AngewChem Int Ed,2010,49,3375-3378中所记载)。将TCO修饰mAb(25μg)与PBS(50μL)中的已知过量的177Lu-DOTA-四嗪反应。在37℃下培养10分钟，然后向反应混合物中加入非还原性样品缓冲液，并且通过SDS-PAGE分析。凝胶电泳，然后用磷光成像仪检测每条泳道上的放射性分布。177Lu-DOTA-四嗪和CC49-TCO结构的反应收率从放射性mAb带的强度相对于泳道中的总放射性来估算。使用这种方法，每个CC49分子上平均发现20个TCO基团(50％缀合收率)。
CC49和CC49-TCO(47)的放射性标记
根据生产商说明，使用Bolton-Hunter方法将未修饰的CC49用125I放射性标记。简单地说，将约40MBq[125I]碘化钠用50μL PBS稀释，并且向其加入1μL Bolton-Hunter试剂(SHPP,Pierce)在DMSO中的溶液(0.1μg/μL)和25μL氯胺-T(Sigma-Aldrich)的PBS溶液(4mg/mL)。将溶液混合，持续10-20秒，然后加入5μL DMF和100μL甲苯。涡旋，然后将包含125I-SHPP的有机层转移至玻璃小瓶中，并且在轻微N2气流下，室温下干燥。然后将PBS(50μL)中的30μg CC49加入125I-SHPP包覆的玻璃小瓶中，并且用1M pH 9.6的碳酸钠缓冲液将pH调节至9。将小瓶在室温下，轻微摇动中培养， 持续约60分钟，然后用放射-ITLC评价125I-mAb标记收率(47％)。将125I-mAb粗品通过用盐溶液预平衡的Zeba脱盐旋转柱(40kDa截留分子量,Pierce)纯化，并且如通过放射-ITLC和放射-HPLC所检测，所得的125I-标记的CC49的放射化学纯度高于98％。
将每个分子运载20个TCO基团的CC49与DOTA-四嗪29(相对于mAb1mol当量)反应，所述29如Rossin等人,Angew Chem Int Ed,2010,49,3375-337)中所描述，预先用非载体添加的177Lu放射标记。孵育10分钟后，得到91％放射化学纯度(通过放射-HPLC)的177Lu-标记CC49-TCO(47)，该反应混合物不经进一步纯化而使用。
抗体活化实验
在此实施例中，我们证明了通过用TCO 47过修饰CC49，我们可显著地降低mAb与其靶点结合的能力，以及通过将过修饰的CC49-TCO结构与四嗪7反应，其靶点结合能力恢复。mAb与四嗪反应后的再活化说明了依照电子级联调节消除机制的TCO释放。
通过使用修改自之前报道方法(Lewis等人,Bioconjug Chem,2006,17,485-492)的免疫反应性实验来评价CC49结构与其靶点结合的能力。简单地说，将放射性标记的mAb结构(1μg)与20倍摩尔过量的牛下颌粘蛋白I-S型(BSM；Sigma-Aldrich)在1％BSA溶液(100μL)中反应。在37℃下培养10分钟，然后将混合物通过放射-HPLC分析(使用Superdex-200柱(GE Healthcare Biosciences)，用PBS以0.35mL/分钟洗脱)。在这些条件下，从柱上以宽峰洗脱下非TCO修饰的125I-CC49，保留时间为39分钟(图2-A)。如预期，与BSM培养后，从柱上在对应于较高分子量物质的峰(保留时间为25分钟)中洗脱下125I活性物，确证了125I-CC49与BSM的结合(100％免疫反应性；图2-B)。
当每个分子运载有20个TCO 47基团的177Lu标记CC49通过放射-HPLC分析时，从柱上以两个未分开的峰(保留时间为31分钟和36分钟)洗脱下mAb，分别占总mAb相关活性的43％和57％(图3-A)。这种现象说明用TCO基团对CC49的过修饰。实际上，结合后分子量的变化相对小，并且不大可能导致CC49和CC49-TCO间3分钟的保留时间变化(从39分 钟变为36分钟)。因此，在柱上更短的保留时间更像是因为连接到mAb上的20个TCO基团导致的构象变化。另外，在31分钟时从柱上洗脱下的宽峰是mAb聚集的标志。因此，在177Lu标记的CC49-TCO与BSM培养后，只有小量(总共约20％)的177Lu活性与放射色谱图中的高分子量物质相关(图3-B)。该约20％的残余免疫反应性确证了过修饰的CC49-TCO(47)已丧失了其靶点结合能力。
随后，将177Lu标记的CC49-TCO(47)与大大过量(相对于TCO，500倍摩尔过量)的四嗪在PBS中，37℃下反应。在多个时间点(1小时、4小时和24小时)取出等分部分的反应混合物(包含1μg mAb)，与BSM培养，并且通过放射-HPLC分析。加入四嗪7像1小时那样短的时间后，放射色谱图显示由于CC49-TCO聚集的放射性峰消失，36分钟的峰显著减小，并且由于177Lu-CC49-TCO-BSM加成化合物的形成生成一个强峰(Rt＝24分钟；72％的总mAb相关活性；图3-C)。
随时间的推移观察到峰面积的进一步小幅增加(CC49-TCO与四嗪7培养24小时后，76％)。TCO 47和四嗪7的逆Diels-Alder环加成后CC49免疫反应性的快速增加表明了TCO释放，其由于电子级联调节的消除机制。
实施例9
通过亲双烯体反式-环辛烯上都存在的亲核体和亲电体间的分子内反应引发药物释放的触发剂
使这些其它前药系统(相对于之前提到的环化和级联消除机制)能够选择性活化的特点为亲双烯体反应物中TCO的八元环与rDA加成化合物中八元环相比，性质上的变化。rDA加成化合物中的八元环具有显著更高的构象自由度，并且具有与rDA反应前的高度张力的TCO中的八元环相比显著不同的构象。rDA反应前的亲双烯体中的亲核位点锁定在亲双烯体的特定构象中，因而其未适合地放置以进行分子内反应，并从而释放药物物质。与此相反，由于八元环性质上的变化，该亲核位点在rDA加成化合物中适合地放置，并且会进行分子内反应，从而释放药物。
＝其余所连接的DD、LD-DD，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
实施例10.其它模型前药的活化
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)和((E)-8-氨基环辛-4-烯-1-基)氨基甲酸苯酯(48)
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,2.50×10-7mol)在PBS缓冲液(1mL)中溶解。然后，加入((E)-8-氨基环辛-4-烯-1-基)氨基甲酸苯酯(48,2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，并且反应进程通过HPLC-MS分析监测，证明几乎瞬间形成rDA-加成化合物，然后形成环状脲，m/z＝+375Da(M+H+)，并且释放苯酚：λmax＝270nm。该释放的半衰期为40分钟。
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)和((E)-2-氨基环辛-3-烯-1-基)氨基甲酸苯酯(49)
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,2.50×10-7mol)在PBS缓冲液(1mL)中溶解。然后，加入((E)-2-氨基环辛-3-烯-1-基)氨基甲酸苯酯(49,2.50×10-7mol)。将溶液在20℃下搅拌，并且反应进程通过HPLC-MS分析监测，证明几乎瞬间形成rDA-加成化合物，然后形成环状脲，m/z＝+375Da(M+H+)，并且释放苯酚：λmax＝270nm。该释放的半衰期为40分钟。
实施例11.多柔比星前药的活化
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
将3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,1.18×10-5g；5.00×10-8mol)在PBS缓冲液(1mL)中溶解。然后加入顺式-(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50,2.67×10-5g；2.50×10- 8mol)。将溶液在20℃下搅拌，并且反应进程通过HPLC-MS分析监测，证明环状脲的形成，m/z＝+375Da(M+H+)，并且释放多柔比星：m/z＝+544Da(M+H+)且λmax＝478nm。该释放的半衰期为2小时。
在37℃下进行该反应，得到多柔比星释放半衰期为40分钟。
3-(5-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(5)和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
与之前反应相同的方法。
在20℃下，1小时后，释放了30％的多柔比星。
3-(5-丁基氨基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
与之前反应相同的方法。
在20℃下，1小时后，释放了20％的多柔比星。
4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基甲胺和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
与之前反应相同的方法。
在20℃下，1小时后，释放了50％的多柔比星。
3-甲基-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(7)和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
与之前反应相同的方法。
在20℃下，1小时后，释放了52％的多柔比星。
3,6-二苯基-1,2,4,5-四嗪和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(50)
与之前反应相同的方法。
在20℃下，1小时后，释放了48％的多柔比星。
3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2)和(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(51)
将3,6-双(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(2,1.18×10-5g；5.00×10-8mol)在PBS缓冲液(1mL)中溶解。然后加入(E)-环辛烯-多柔比星缀合物(51,2.67×10-5g；2.50×10-8mol)。将溶液在20℃下搅拌，并且反应进程通过HPLC-MS分析监测，证明环状脲的形成，m/z＝+375Da(M+H+)，并且释放多柔比星：m/z＝+544Da(M+H+)且λmax＝478nm。该释放的半衰期为4天。
在37℃下进行该反应，得到半衰期为16小时。
实施例12.多柔比星前药50和四嗪29的细胞增殖试验
将在青霉素和链霉素的存在下添加有10％热失活胎牛血清和0.05％glutamax(Invitrogen)的DMEM(Invitrogen)中的A431鳞状癌细胞保持在37℃下的潮湿CO2(5％)培养箱中。在实验开始24小时前，将细胞以2000细胞/孔的密度在96孔板(Nunc)中铺板。在实验马上开始前，将多柔比星(Dox)和前药50(在DMSO中1mM)按序在预热的培养基中稀释，并且将其加入孔中(200μl终体积；t＝0)。将前药单独加入或将其与10μM四嗪合并加入。在37℃下孵育6小时，然后将培养基轻轻吸出，向每孔中加入200μL新鲜培养基，并且将细胞孵育多于66小时。在平行试验中，将四嗪29(在PBS中2mM)在预热的培养基中按序稀释(从1mM到1nM)，并将其加入到在96-孔板中的A431细胞中，将其在37℃下孵育72小时。在各个试验结束时，通过MTT试验检测细胞增殖。简要地说，将甲基噻唑基二苯基四唑溴鎓盐(methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT)以5mg/ml溶解于PBS中，通过0.22μm过滤，并且向每孔中加入25μl。在37℃下培养120分钟后，将培养基轻轻地吸出。将形成的甲臜晶体溶解在100μl DMSO中，用酶标仪(BMG Labtech)在560nm下检测吸光度。从用GraphPad Prism(版本5.01)生成的标准化细胞生长曲线(参见图4)得到IC50值(±标准误差；参见图4)。细胞增殖试验证明，当将A431细胞暴露于前药50和四嗪29的组合时，与单独的前药(IC50＝128±17nM)或单独的四嗪(IC50>100μM)相比，毒性(IC50＝49±4nM)显著提高。这确证了前药的反式-环辛烯和四嗪活化剂的逆Diels-Alder反应后释放了多柔比星。
在A431细胞系中测定的多柔比星(Dox)以及经四嗪29(10μM)活化和未经四嗪29活化的前药50的IC50值
化合物 IC50(μM)
Dox 0.038±0.003a
前药50 0.128±0.017a
前药50+四嗪29(10μM) 0.049±0.004a
四嗪29 >100b
a在37℃下孵育6小时后替换培养基；b在37℃下孵育72小时
实施例13
制备TCO系触发剂的示例性一般合成路线和关键中间体
LD和SP周围的括号表示它们是任选的。该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
实施例14
LD基团的示例性结构
连接基LD为所谓的自切除(self-immolative)连接基，意指在触发剂与活化剂反应时，所述连接基会通过分子内反应降解，从而释放药物DD。上述基团中的一些还包含SP。
实施例15
SP基团的示例性结构
＝结合的前药的其余部分
注意，顺丁烯二酰亚胺、活性酯和溴代乙酰氨基团是可任选地通过其它间隔基SP与靶向基团TT和掩蔽基团MM偶联的活性基团。顺丁烯二酰亚胺和溴代乙酰氨基团通常与硫醇反应，而活性酯通常适合与伯胺或肿胺偶联。
实施例16
具有所述示例性LD基团并且通过环化消除起作用的TCO触发剂的结构
该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
＝结合的TT或SP-TT的其余部分
实施例17具有描述的示例性LD基团并且通过环化和级联消除起作用的TCO触发剂的结构
该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
--＝结合的TT或SP-TT的其余部分
实施例18.具有所述示例性LD基团和/或SP基团并且通过环化消除起作用的TCO触发剂的结构
触发剂通过氨基或巯基缀合至TT。该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
实施例19.具有描述的示例性LD基团和/或SP基团并且通过环化和级联消除起作用的TCO触发剂的结构
触发剂通过TT的胺或硫醇缀合至TT。该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
实施例20
具有所述示例性LD基团和/或SP基团并且通过环化和级联消除起作用的TCO触发剂的结构
触发剂通过TT的胺或硫醇缀合至TT。该实施例中特定的TT可任选地被MM替代。
实施例21
抗体-药物缀合物的结构，其通过环化消除起作用
Auristatin E(MMAE)毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至目标抗体或片段(通过半胱氨酸或赖氨酸残基结合)。Ab＝抗体或抗体片段；q＝Ab修饰#并且通常为1-10。
实施例22.抗体-药物缀合物的结构，其通过环化消除起作用
美坦辛毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至目标抗体或片段(通过半胱氨酸或赖氨酸残基结合)。Ab＝抗体或抗体片段；q＝Ab修饰#并且通常为1-10。
实施例23.抗体-药物缀合物的结构，其通过环化和级联消除起作用
Auristatin E(MMAE)毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且在一些情况中通过SP结合至目标抗体或片段(通过半胱氨酸或赖氨酸基团结合)。Ab＝抗体或抗体片段；q＝Ab修饰#并且通常为1-10。
实施例24.抗体-药物缀合物的结构，其通过环化和级联消除起作用
Auristatin E(MMAE)毒素结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至目标抗体或片段(通过半胱氨酸或赖氨酸基团结合)。Ab＝抗体或抗体片段；q＝Ab修饰#并且通常为1-10。
实施例25
抗体-药物缀合物的结构，其通过环化和级联消除起作用
美坦辛毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且在一些情况中通过SP结合至目标抗体或片段(通过半胱氨酸或赖氨酸基团结合)。Ab＝抗体或抗体片段；q＝Ab修饰#并且通常为1-10。
实施例26.可如通过胺或硫醇基团缀合至靶向剂TT并且通过环化消除起作用的触发剂-药物构建体的结构
Auristatin E(MMAE)毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至用于TT缀合的反应性基团。
实施例27.可例如通过胺或硫醇基团结合至靶向剂TT并且通过环化消除起作用的触发剂-药物构建体的结构
美坦辛毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至用于TT缀合的反应性基团。
实施例28.可如通过胺或硫醇基团缀合至靶向剂TT并且通过环化和级联消除起作用的触发剂-药物构建体的结构
Auristatin E(MMAE)毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂，并且在一些情况中通过SP结合至用于TT缀合的反应性基团。
实施例29
可例如通过胺或硫醇基团结合至靶向剂TT并且通过环化和级联消除起作用的触发剂-药物构建体的结构
Auristatin E(MMAE)毒素结合至TCO触发剂，并且通过SP结合至用于TT缀合的反应性基团。
实施例30
可例如通过胺或硫醇基团结合至靶向剂TT并且通过环化和级联消除起作用的触发剂-药物构建体的结构
美坦辛毒素通过自切除连接基LD结合至TCO触发剂TR，并且在一些情况中通过SP结合至用于TT缀合的反应性基团。
实施例31
结合肿瘤的CC49-Auristatin E缀合物的活化
作为mAb或mAb片段的CC49结合非内化泛固体(pan-solid)肿瘤标志物TAG72。将前药给药后结合肿瘤并从血液清除，注射活化剂。活化剂与前药中的TCO触发剂的反应导致Auristatin E从CC49(抗体或抗体片段)释放，使其穿透癌症细胞，在其中它发挥其抗癌作用。
实施例22
结合肿瘤的T-细胞结合三链抗体的活化
三链抗体包含肿瘤结合基团、CD3T-细胞参与基团和CD28T-细胞共刺激基团。由于CD3和CD28组合入一个分子中会导致不期望的偏离靶点的毒性作用，因此通过掩蔽基团MM阻断抗-CD28域，所述掩蔽基团MM为与CD28结合域类似并且具有对于抗-CD28基团的亲和力的肽。该肽通过另一个肽或PEG链SP连接至TCO触发剂，所述TCO触发剂自身缀合至半胱氨酸(其设计为位点专一性)。将前药给药后结合肿瘤并从血液清除，注射活化剂。活化剂与前药中的TCO触发剂反应导致掩蔽基团从抗-CD28域的释放，使CD28能够共刺激T细胞，增强T细胞调节的抗癌效果，同时避免偏离靶点的毒性。

Claims (16)

1.用于前药的给药和活化的药盒，所述药盒包含直接或间接连接至触发基团的药物基团和所述触发基团的活化剂，其中所述触发基团包含亲双烯体，并且所述活化剂包含双烯，所述亲双烯体包含反式-环辛烯环，所述环任选地含有一个或多个杂原子，并且选择所述双烯以使其能够与所述亲双烯体以反电子需求的Diels-Alder反应的形式反应，所述亲双烯体包含式(1a)的结构：
其中A和P独立地为CRa 2或CRaXD，条件是A和P中的至少一个为CRaXD，XD为O-C(O)-(LD)n-(DD)、S-C(O)-(LD)n-(DD)、O-C(S)-(LD)n-(DD)、S-C(S)-(LD)n-(DD)、NRd-C(O)-(LD)n-(DD)、NRd-C(S)-(LD)n-(DD)、C(O)-(LD)n-(DD)、C(S)-(LD)n-(DD)，LD为任选的连接基，并且n＝0或1，所述LD通过S、N、NH或O连接至所述亲双烯体，其中所述S、N、NH或O为所述连接基的一部分；DD为一个或多个治疗基团或药物，其通过S、N、NH或O连接，其中所述S、N、NH或O为所述治疗基团的一部分；
其中Y、Z、X、Q各自独立地选自CRa 2、C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、S、SO、SO2、O、NRb和SiRc 2，并且Y、Z、X和Q中的至多三个选自C＝CRa 2、C＝O、C＝S和C＝NRb，其中两个R基团可共同形成环，并且条件是不存在选自O-O、O-NRb、S-NRb、O-S、O-S(O)、O-S(O)2和S-S的相邻原子对，并且使得Si只与CRa 2或O相邻；
其中Ra各自独立地选自H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”和CR’NR”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；
其中Rb各自独立地选自H，烷基，芳基，O-芳基，O-烷基，OH，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基的C(＝O)NR’R”，其中R’为H、烷基或芳基的R’CO-烷基；
其中Rc各自独立地选自H、烷基、芳基、O-烷基、O-芳基、OH；
其中Rd各自选自H、C1-6烷基和C6芳基；并且
其中T、F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br和I的取代基；并且
所述双烯选自式(2)-(4)的双烯，其中所述双烯在R1和/或R2和/或A和/或B和/或X和/或Y基团中包含至少一个亲核位点，所述亲核位点存在于R1和/或R2基团中：
其中R1选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R”、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基；A和B各自独立地选自烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N+O-、N+R，其中N+R中的R为烷基，条件是A和B不都为碳；X选自O、N-烷基和C＝O，并且Y为CR，其中CR中的R选自H、烷基、芳基、C(＝O)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)OR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基；
其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N-烷基、N-芳基、C＝O和CN-烷基；B为O或S；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-；
其中R1和R2各自独立地选自H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO、NO2、OR’、SR’、CN、C(＝O)R’、C(＝S)R’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、S(＝O)R’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2OR’、PO3R’R”、S(＝O)2NR’R”、C(＝O)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)O-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’R”、NR’C(＝O)R”、NR’C(＝S)R”、NR’C(＝O)OR”、NR’C(＝S)OR”、NR’C(＝O)SR”、NR’C(＝S)SR”、OC(＝O)NR’R”、SC(＝O)NR’R”、OC(＝S)NR’R”、SC(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)NR”R”、NR’C(＝S)NR”R”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；A选自N、C-烷基、C-芳基和N+O-；B为N；X选自N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(＝O)R’、CC(＝S)R’、CS(＝O)R’、CS(＝O)2R”’、CC(＝O)O-R’、CC(＝O)S-R’、CC(＝S)O-R’、CC(＝S)S-R’、CC(＝O)NR’R”、CC(＝S)NR’R”，R’和R”各自独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；Y选自CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-；
其中所述烷基各自独立地表示至多10个碳原子的脂族的直链的、支链的、饱和的、不饱和的和/或环状的烃基，其任选地包含1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
所述芳基各自独立地表示至多20个碳原子的芳族或杂芳族基团，其任选地被取代，并且任选地包含1-10个选自O、N、P和S的杂原子。
2.权利要求1的药盒，其中XD为O-C(O)-(LD)n-(DD)、NRd-C(O)-(LD)n-(DD)或C(O)-(LD)n-(DD)，其中n＝0或1。
3.权利要求1的药盒，其中所述环辛烯满足式(1b)：
其中，除了任选存在至多两个固定在同一平面的环外键之外，Ra各自独立地表示H，或者在最多四种情况中表示选自下列的取代基：烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”、CR’NR”，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；
如上所示的Re各自独立地选自H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、PO3H、NO、NO2、CN、CF3、CF2-R’、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”、CR’NR”，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基，且R”’独立地为芳基或烷基；其中两个Ra、Re基团可共同形成环；
其中，还任选地存在至多两个固定在同一平面的环外键；
任选地，包含在连接基基团中的一个Ra、Re任选地通过间隔基SP连接至靶向剂TT或掩蔽基团MM，并且其中T和F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br和I的取代基，并且XD如上述对于式(1a)所定义。
4.权利要求1的药盒，其中所述亲双烯体为选自下列结构的化合物：
----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM
----＝所连接的TT或SP-TT或MM或SP-MM的其余部分
＝所连接的DD、LD-DD的其余部分，其任选地包含TT或SP-TT或MM或SP-MM，
其中TT为靶向剂；MM为掩蔽基团；且SP为间隔基。
5.权利要求1的药盒，其中所述双烯选自：
6.权利要求1-5中任一项的药盒，其中所述药物DD或所述连接基LD或所述触发基团TR中的至少一个包含靶向剂TT。
7.权利要求6的药盒，其中所述靶向剂TT为抗体。
8.权利要求1-5中任一项的药盒，其中所述LD或所述触发基团TR中的至少一个包含掩蔽基团MM。
9.权利要求8的药盒，其中所述掩蔽基团MM为肽。
10.权利要求1-5中任一项的药盒，其中所述药物为T细胞结合抗体构建体。
11.权利要求1-5中任一项的药盒，其中所述前药为抗体-毒素缀合物或抗体-药物缀合物。
12.双烯作为用于在生理环境中释放连接至反式-环辛烯的物质的活化剂在制备权利要求1-11中任一项的用于前药的给药和活化的药盒中的用途，其中所述反式-环辛烯如权利要求1-4中任一项所定义，并且所述双烯如权利要求1或5中所定义。
13.反式-环辛烯和双烯在制备权利要求1-11中任一项的用于前药的给药和活化的药盒中的用途，其中所述反式-环辛烯如权利要求1-4中任一项所定义，并且所述双烯如权利要求1或5中所定义。
14.权利要求12或13的用途，其中所述双烯选自：
15.触发基团在制备用于治疗可通过药物调节的疾病的前药中的用途，其中所述触发基团具有以下结构：
其中A和P独立地为CRa 2或CRaXD，条件是A和P中的至少一个为CRaXD，XD为O-C(O)-(LD)n-(DD)、S-C(O)-(LD)n-(DD)、O-C(S)-(LD)n-(DD)、S-C(S)-(LD)n-(DD)、NRd-C(O)-(LD)n-(DD)、NRd-C(S)-(LD)n-(DD)、C(O)-(LD)n-(DD)、C(S)-(LD)n-(DD)，LD为任选存在的连接基，并且n＝0或1，所述LD通过S、N、NH或O连接至所述亲双烯体，其中所述S、N、NH或O为所述连接基的一部分；DD为一个或多个治疗基团或药物，其通过S、N、NH或O连接，其中所述S、N、NH或O为所述治疗基团的一部分；
其中Y、Z、X、Q各自独立地选自CRa 2、C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、S、SO、SO2、O、NRb和SiRc 2，并且Y、Z、X和Q中的至多三个选自C＝CRa 2、C＝O、C＝S和C＝NRb，其中两个R基团可共同形成环，并且条件是不存在选自O-O、O-NRb、S-NRb、O-S、O-S(O)、O-S(O)2和S-S的相邻原子对，并且使得Si只与CRa 2或O相邻；
其中Ra各自为H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”和CR’NR”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；
其中Rb各自独立地选自H，烷基，芳基，O-芳基，O-烷基，OH，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基的C(＝O)NR’R”，其中R’为H、烷基和芳基的R’CO-烷基；
其中Rc各自独立地选自H、烷基、芳基、O-烷基、O-芳基、OH；
其中Rd各自选自H、C1-6烷基和C6芳基；并且
其中T、F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br和I的取代基；
其中所述烷基各自独立地表示至多10个碳原子的脂族的直链的、支链的、饱和的、不饱和的和/或环状的烃基，其任选地包含1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
所述芳基各自独立地表示至多20个碳原子的芳族或杂芳族基团，其任选地被取代，并且任选地包含1-10个选自O、N、P和S的杂原子。
16.具有以下结构的化合物在制备用于治疗动物或人的前药中的用途，
其中A和P独立地为CRa 2或CRaXD，条件是A和P中的至少一个为CRaXD，XD为O-C(O)-(LD)n-(DD)、S-C(O)-(LD)n-(DD)、O-C(S)-(LD)n-(DD)、S-C(S)-(LD)n-(DD)、NRd-C(O)-(LD)n-(DD)、NRd-C(S)-(LD)n-(DD)、C(O)-(LD)n-(DD)、C(S)-(LD)n-(DD)，LD为任选存在的连接基，并且n＝0或1，所述LD通过S、N、NH或O连接至所述亲双烯体，其中所述S、N、NH或O为所述连接基的一部分；DD为一个或多个治疗基团或药物，其通过S、N、NH或O连接，其中所述S、N、NH或O为所述治疗基团的一部分；
其中Y、Z、X、Q各自独立地选自CRa 2、C＝CRa 2、C＝O、C＝S、C＝NRb、S、SO、SO2、O、NRb和SiRc 2，并且Y、Z、X和Q中的至多三个选自C＝CRa 2、C＝O、C＝S和C＝NRb，其中两个R基团可共同形成环，并且条件是不存在选自O-O、O-NRb、S-NRb、O-S、O-S(O)、O-S(O)2和S-S的相邻原子对，并且使得Si只与CRa 2或O相邻；
其中Ra各自为H、烷基、芳基、OR’、SR’、S(＝O)R”’、S(＝O)2R”’、S(＝O)2NR’R”、Si-R”’、Si-O-R”’、OC(＝O)R”’、SC(＝O)R”’、OC(＝S)R”’、SC(＝S)R”’、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO3H、PO4H、NO、NO2、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、CF2-R’、NR’R”、C(＝O)R’、C(＝S)R’、C(＝O)O-R’、C(＝S)O-R’、C(＝O)S-R’、C(＝S)S-R’、C(＝O)NR’R”、C(＝S)NR’R”、NR’C(＝O)-R”’、NR’C(＝S)-R”’、NR’C(＝O)O-R”’、NR’C(＝S)O-R”’、NR’C(＝O)S-R”’、NR’C(＝S)S-R”’、OC(＝O)NR’-R”’、SC(＝O)NR’-R”’、OC(＝S)NR’-R”’、SC(＝S)NR’-R”’、NR’C(＝O)NR”-R”、NR’C(＝S)NR”-R”和CR’NR”，其中每个R’和每个R”独立地为H、芳基或烷基，并且R”’独立地为芳基或烷基；
其中Rb各自独立地选自H，烷基，芳基，O-芳基，O-烷基，OH，其中每个R’与每个R”独立地为H、芳基或烷基的C(＝O)NR’R”，其中R’为H、烷基和芳基的R’CO-烷基；
其中Rc各自独立地选自H、烷基、芳基、O-烷基、O-芳基、OH；
其中Rd各自选自H、C1-6烷基和C6芳基；并且
其中T、F各自独立地表示H或者选自烷基、F、Cl、Br和I的取代基；
其中所述烷基各自独立地表示至多10个碳原子的脂族的直链的、支链的、饱和的、不饱和的和/或环状的烃基，其任选地包含1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
所述芳基各自独立地表示至多20个碳原子的芳族或杂芳族基团，其任选地被取代，并且任选地包含1-10个选自O、N、P和S的杂原子。
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