JP2018058902A - 生体直交型薬物活性化 - Google Patents

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Abstract

【課題】 均一な浸透性及び標的化に依存せず、且つ、さらに標的への途中及び標的内で、及び指標ごとに、及び患者ごとに変化し得る内因性パラメータに依存せず、標的化薬物を選択的かつ予想可能に標的サイトで活性化できることが望ましい。【解決手段】 本発明は、治療のためのプロドラッグ活性化方法に関し、お互いに生体直交型反応性を示す非生体反応性化学基を用いるものである。本発明はまた、少なくとも１つのプロドラッグと、少なくとも１つのアクチベータとを含むプロドラッグキットに関し、ここで前記プロドラッグは薬物と、第１の生体直交型反応基（前記トリガー）とを含み、及び前記アクチベータは第２の生体直交型反応基を含む。本発明はまた、前記方法及びキットにおいて使用される標的化治療に関する。本発明は特に、抗体−薬物共役物に、及び二及び三特異的抗体誘導体に関わる。【選択図】 なし

Description

本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化薬物に基づく治療方法に関する。
医学分野において、ヒト又は動物の体内の特定の場所で活性化されるプロドラッグなどの不活性化合物の使用はよく知られている。また、プロドラッグなどの不活性化物の標的化（ターゲット化）送達は広く研究されている。多くの努力が薬物送達システムに向けられており、これは標的位置（サイト）において及び／又は望ましい時間（タイミング）において薬物放出選択性をもたらすものである。１つの方法は、局所的及び特異的な酵素活性により特異的に（全身性）プロドラッグを選択的に活性化することである。しかし多くの場合に、興味の対象となる標的サイトは好適な過剰発現酵素を持たない。他の方法は、酵素を標的化組織に、抗体指向酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）と呼ばれる技術で移送するものである。この方法では、酵素は、腫瘍サイトに、腫瘍関連抗原に結合する抗体と共役することで、標的化される。共役物(conjugate)の全身投与、標的での局在化及び非結合共役物の排除(clearance)後、設計されたプロドラッグが全身に投与され局所的に活性化される。この方法は、内因性酵素によっては達成されてはならない反応の触媒作用を必要とする。これらの要求に応じる非哺乳類由来の酵素は、非常に免疫原性であり得るものであって、実際繰り返し投与を不可能にする。又は、プロドラッグは疾患サイトに標的化されることができ、次に疾患特異的又は非特異的内因性活性化プロセスを受ける（例えば、ｐＨ、酵素、チオール含有化合物など）。
標的化抗がん治療は、従来のがん化学療法に比較して、非特異的毒性を低減するように及び有効性を改善するように設計される。この方法は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の、がん細胞への高能力の共役小分子治療剤を特異的に送達する強力な標的化能力により具体化される。毒性の問題に対応する試みで、化学療法剤（薬物）は、抗体又はタンパク質レセプターリガンドなどの標的化分子とカップリング結合し、これは腫瘍細胞に高い特異性で結合し、抗体−薬物共役物（ＡＤＣ）又は免疫共役物と呼ばれる化合物を形成する。理論上では免疫共役物の毒性は低いが、というのはこれらは細胞毒性薬物を、特定の細胞表面抗原又はレセプターを発現する腫瘍に向けるからである。この戦略の成功は限定的であったが、その理由のひとつとしては、細胞毒性薬物が大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドと共役する際に不活性化又は活性低下を起こす傾向があるからである。免疫共役物の有望な進展は、リンカーを介して抗体へ結合された（リンクされた）細胞毒性薬物であり、これは腫瘍サイト又は腫瘍細胞内部で開裂する（Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、１４：５２９−５３７）。理想的には、ｍＡｂは、腫瘍細胞上で実質的に発現するが、正常組織上では限定的に発現する抗原に特異的に結合する。特異性は、そうでなければ臨床応用のためには毒性すぎる薬物の利用を可能にする。この分野での最近の研究のほとんどが、高度に強力な細胞毒性試薬の使用に向けられていた。これは、条件付き安定性を与え、それにより薬物送達が循環中ではなく、腫瘍結合後に起こるようなリンカー技術の開発を必要とする。
共役物として薬物は不活性であるが、標的に局在化されると薬物が、例えばｐＨ又は酵素により放出され、これは標的特異的(specific)であり得るが、またより一般的(generic)となり得る。薬物放出は、腫瘍組織内の低ｐＨ、低酸素、特定酵素などの細胞外機構により活性化され得るが、一般にはより選択的な薬物放出は、細胞内、ほとんどはリソソーマル放出機構（例えば、グルタチオン、プロテアーゼ、カタボリズム）を通じて達成され得るものであって、最初に内在化されるべき抗体共役物を必要とする。特定の細胞内放出機構（例えばグルタチオン、カテプシン）は通常は、その性質に依存するが親薬物が細胞を逃げ出して近隣の細胞を攻撃する結果となり得る。このことは、抗体−薬物共役物の範囲についての重要な作用機序として見なされ、特に異種のレセプター発現性又は不十分なｍＡｂ浸透性を持つ腫瘍ではそうである。開裂可能なリンカーの例は：ヒドラゾン（酸不安定）、ペプチドリンカー（カテプシンＢ開裂可能）、立体障害性ジスルフィド部分（チオール開裂可能）である。非開裂可能リンカーもまたｍＡｂ−薬物共役物で使用され得る。これらの構成物は、カタボリズムでその薬物を放出し、その結果薬物分子はなお１つのアミノ酸に結合されていると考えられる。薬物のサブセットのみがかかる共役物として活性を取り戻す。また、これらのアミノ酸結合薬物は細胞を逃げ出すことができない。それでも、リンカーが安定である場合、これらの構成物は一般に、最も安全と考えられ、及び薬物及び標的に依存して非常に有効であり得る。
現在の抗体−薬物共役物放出戦略は限界を持つ。細胞外薬物放出機構は通常は、あまりに非特異的であり（ｐＨ感受性リンカーと同様に）毒性を与える結果となる。細胞内放出は、ｍＡｂ−薬物の効率（例えばレセプター−介在内在化）に依存し、一方いくつかの癌は、十分な高複製数で存在する癌特異的及び効率的な内在化標的を持たない。細胞内放出はさらに、十分高用量での、活性化酵素（プロテアーゼ）又は分子（グルタチオンなどのチオール）の存在に依存する。細胞内放出の次に、薬物は、ある場合には、細胞から標的近隣細胞へ逃げ出す。この効果は、全ての細胞が十分な量の標的レセプターを発現しているわけではない不均一な腫瘍において有利であると考えられる。例えば、対流を妨げる上昇した間質圧のせいで薬物を浸透させることが難しい腫瘍において、それはさらに重要である。これは特に、ｍＡｂ（共役物）などの大きな構成物について問題となる。この機構はまた、結合サイトバリアが生じる場合に重要となる。一度標的化試薬が血管系を離れ、レセプターに結合すると、腫瘍内でのその動きは制限される。血管周囲空間内で制限されるｍＡｂ共役物の可能性はその標的に対するその親和性に比例する。浸透性は、ｍＡｂ投与量の増加により改善されるが、この方法は、例えば肝臓への毒性を制限する投与量により制限される。さらには、死につつある細胞から出る抗原が、腫瘍間質空間に存在し、そこでこれらは、ｍＡｂ−共役物がその標的細胞に結合することを妨げ得る。また、多くの標的が、無効な内在化によって妨害され、及び異なる薬物は同じやりかたでｍＡｂへリンクされ得ない。さらには、標的内で内因性要素により選択的開裂される一方で、標的への途中での内因性要素に対して安定である（特に、全ｍＡｂをゆっくり排除する場合）ようにリンカーを設計することは手間がかかることが証明されてきた。その結果として、最適な薬物、リンカー、ｍＡｂ及び標的の組み合わせがケースバイケースを基本に選択され、最適化されることが必要となる。
効果的なプロドラッグ方法から利益を得られる他の応用分野は、Ｔ−細胞係合抗体構成物（例えば、二−又は三特異的抗体断片）（これらは免疫システムに係合することで癌に作用する）の分野である。活性化Ｔ細胞をがん細胞と直接接触させることは、がん細胞を殺す強力な方法を与えることであると、長く考えられてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６６（２００８）５２６−５３１）。これをするために作成されてきた多くの二特異性抗体において、大部分は２つの抗体結合サイトから構成され、その一方のサイトは腫瘍を標的とし、他方のサイトはＴ細胞を標的とする（Ｔｈａｋｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１０、１２（３）、３４０−３４９）。しかし、活性Ｔ細胞結合サイトを含む二特異性抗体では末梢Ｔ細胞結合が生じ得る。これは、共役物が腫瘍へ近づくことを妨げるだけでなく、またサイトカイン・ストーム及びＴ細胞の枯渇を起こし得る。必要とされる際及び場所でのみ（即ち、腫瘍結合アームを介して腫瘍局在化後）、その中でＵＶ光の照射に続いて抗Ｔ細胞活性が回復される光活性化可能な抗−Ｔ細胞抗体は、これらの問題を解決するために使用されてきた。抗ヒトＣＤ３（Ｔ細胞標的化）抗体は、光開裂性１−（２−ニトロフェニル）エタノール（ＮＰＥ）コーティングにより可逆的に抑制された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６６（２００８）５２６−５３１）。しかし、光系活性化は、光が浸透し得る身体の領域に制限され、転移性癌などの全身性疾患を治療するために変更することは容易ではない。
プロドラッグ方法から利益を得る強く関連する構成物は、三特異性Ｔ細胞係合抗体構成物であり、これは癌標的化試薬に加えて例えばＣＤ３及びＣＤ２８Ｔ細胞係合部分を持つ。かかる構成物は、そのまま使用するには毒性が高く、且つＣＤ３もしくはＣＤ２８のいずれか又は両方の結合領域はマスクされる必要がある。
均一な浸透性及び標的化に依存せず、且つ、さらに標的への途中及び標的内で、及び指標ごとに、及び患者ごとに変化し得る内因性パラメータに依存せず、標的化薬物を選択的かつ予想可能に標的サイトで活性化できることが望ましい。
現在のプロドラッグ活性化の欠点を解消するために、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００８，１９，７１４−７１８において、非生物的、生体直行型化学反応、即ちＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を使用してプロドラッグの活性化を引き起こすことが提案されている。簡単に、導入された概念では、プロドラッグは薬物とトリガーとの共役物であり、この薬物−トリガー共役物は、例えば酵素や特定のｐＨにより内因的に活性化されるのではなく、トリガーから薬物の放出を誘導するため（又は逆に、薬物からトリガーを放出するが、この放出プロセスの別の見方である）、アクチベータ、即ちプロドラッグ内でトリガー部分と反応する化学種(species)、の制御された投与により、活性化される。この概念の提案されたＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ方法は、しかし、十分作用しないことが分かり、応用分野も、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応により課せられる放出機構に特定の性質からみて限定的である。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を使用する他の欠点は、反応速度が限定されていることであり、及びこれらの反応のホスフィン成分が酸化に不安定であることである。従って、生理的条件で安定で、お互いに対してより反応性であり、及び種々の機構の手段により結合された薬物の放出を誘導することができる非生物的、生体直交型反応のための反応物質を提供すること、それにより、非常に汎用性のある活性化薬物放出方法を提供することが望ましい。
選択的プロドラッグ活性化のための内因性活性化機構（例えばｐＨ、酵素）に依存しない生体適合性化学反応の使用は、がん治療の強力な新規なツールとなる。必要なときに必要な位置でプロドラッグを選択的に活性化することは、癌を含めて身体内で多くのプロセスを制御することを可能にする。抗腫瘍抗体治療などの治療は、従ってより特異的となり、正常細胞と腫瘍との間の増大した治療コントラストをもたらし、望まない副作用を低減させる。Ｔ細胞係合抗癌抗体においては、本発明は、不活性抗体構成物（即ちこれは従ってプロドラッグである）の全身投与及び腫瘍標的化を可能にし、さらに非特異的な(オフターゲットの，off-target)毒性を低減させることを可能にする。十分な腫瘍への取り込みと非標的化領域からの排除に際し、腫瘍結合抗体はアクチベータの投与により活性化され、これは抗体又は特定の抗体領域上の１以上のトリガーと反応し、その結果トリガーは除去されてＴ細胞結合機能は回復される。これは、Ｔ細胞活性化及び抗癌作用をもたらす（即ち、これはこの場合薬物放出である）。
Ｓｅｎｔｅｒｅｔａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、１４：５２９−５３７ Ｔｈａｋｕｒｅｔａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１０、１２（３）、３４０−３４９） Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３６６（２００８）５２６−５３１ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ２００８、１９、７１４−７１８
本発明は、非生物的、生体直交型化学反応の手段により活性化される、プロドラッグなどの不活性化薬物に基づく治療方法に関する。
１又は複数の前記要求により良く対応するために、本発明はプロドラッグの投与及び活性化のためのキットを提供し、前記キットは、トリガー部分に、直接にもしくは間接的に結合された（リンクされた）薬物、及び前記トリガー部分のためのアクチベータを含み、前記トリガー部分がジエノフィルを含み、及び前記アクチベータがジエンを含み、前記ジエノフィルが式（１ａ）を満たす。：
式（１ａ）中、Ｔ、Ｆはそれぞれ独立してＨ、又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩからなる群から選択される置換基を表し；
Ａ及びＰはそれぞれ独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり（ただし、少なくとも１つはＣＲａＸＤである）；
ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、又はＯ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここで、ｐ＝０又は１であり；
（ＬＤ）ｎは任意のリンカーであり、ｎ＝０又は１であり、好ましくはＴＲにＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してリンク（結合され）、ここでこれらの原子は、直線及び／又は分岐して配置された複数単位からなり得る前記リンカーの一部であり；
Ｙ、Ｚ、Ｑ、Ｘは一緒になって、任意には１つ又はそれ以上の芳香族部分に縮合する４−員の脂肪族性又はヘテロ脂肪族性部分を形成し；
それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
それぞれのＲｂは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルである）、Ｒ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル及びアリールである）からなる群から選択され；
それぞれのＲｃは独立してＨ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨからなる群から選択され；
ここで２以上のＲａ、ｂ、ｃ、部分が一緒になって１つの環を形成し得るものであり；
ＤＤは１又は複数の治療部分又は薬物であり、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、ここでこれらの原子が前記治療部分の一部である。
他の側面では、本発明はプロドラッグを提供し、これは前記式（１ａ）を満たすトランス−シクロオクテン部分に、直接又は間接的に結合した薬物化合物を含む。
さらに別の側面では、本発明はプロドラッグへ薬物化合物を変性させる方法を提供し、前記プロドラッグは、非生物的、生体直交型反応でトリガーされ得るものであり、当該方法は、薬物を準備するステップと、前記薬物を式（１ａ）を満たす環状部分に化学的に結合するステップとを含む。
さらに他の側面では、本発明は治療の方法を提供する。当該方法において、薬物で調節され得る疾患に罹患する患者は、活性化の後にアクチベータの投与により薬物が放出されるトリガー部分を有するプロドラッグを前記患者に投与することにより治療される。ここで前記トリガー部分が式（１ａ）を満たす環構造を含む。
さらに他の側面では、本発明は８−員非芳香族環モノ−アルケニレン部分（好ましくはシクロオクテン部分及びより好ましくはトランス−シクロオクテン部分）を含む化合物であり、前記部分は、動物又はヒトのプロドラッグ治療で使用するための薬物への結合を含む。
別の側面では、本発明はジエンの、好ましくはテトラジンの、生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合された物質の放出のためのアクチベータとしての使用である。これに関連して本発明はまた、生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合された物質の放出のためのアクチベータとしての使用のためのテトラジン、及び生理的環境下で、式（１ａ）を満たす化合物に結合された物質の放出を活性化するための方法に関する。ここでテトラジンがアクチベータとして使用される。
別の側面では、本発明は、式（１ａ）を満たす化合物とジエン、好ましくはテトラジンとの間の逆電子要求ディールスアルダー反応の使用を、式（１ａ）を満たす化合物に結合され、共有結合形で投与される物質の生理的環境下での放出のための化学ツールとして提供する。
レトロディールスアルダー反応
前記式（１ａ）のジエノフィル及び前記ジエンは、逆電子要求ディールスアルダー反応において反応可能である。前記アクチベータと前記トリガーとの前記レトロディールスアルダー反応により前記プロドラッグの活性化（アクティベーション）が前記薬物の放出を起こす。
以下に、（３，６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジンジエンとトランス−シクロオクテンジエノフィルとの［４＋２］ディールスアルダー反応、続いて、生成物と二窒素が形成されるレトロディールスアルダー反応、についての反応スキームを示す。反応生成物は互変異性体を生じてよく、且つこれはスキーム内に示される。トランスシクロオクテン誘導体は、古典的なディールスアルダー反応におけるように電子吸引基を含まず、この型のディールスアルダー反応は古典的な反応とは区別され、しばしば「逆電子要求ディールスアルダー反応」と言われている。以下の記載では、両方の反応ステップの順序、即ち最初のディールスアルダー環付加（典型的には逆電子要求ディールスアルダー環付加）及び続くレトロディールスアルダー反応は、短く「レトロディールスアルダー反応」又は「レトロＤＡ」と称する。時には「ｒＤＡ」と省略され得る。前記反応の生成物は、従ってレトロディールスアルダー反応付加物又はｒＤＡ付加物である。
一般的に、本発明は、薬物が、式（１ａ）を満たすトランス−シクロオクテン誘導体から、テトラジン誘導体などの適合性のあるジエンとの環付加反応の際に放出され得る、という認識に基づく。式（１ａ）のジエノフィルは、それが実質的にいずれのジエンと反応する（及び薬物放出を生じる）という利点を持つ。
理論に縛られることを望まないが、本発明者は、レトロディールスアルダー付加物の分子構造は、このｒＤＡ付加物内での自然脱離反応が薬物を放出するようなものである、と考えている。特に、本発明者は、好適に変性されたｒＤＡ成分がｒＤＡ付加物を導き、ジエノフィルにおける薬物への結合がジエンの孤立電子対の存在により不安定化する、と考えている。
プロドラッグ活性化においてレトロディールスアルダー反応を使用する一般概念はスキーム１に示される。
スキーム１：
このスキームで、「ＴＣＯ」とはトランス−シクロオクテンを意味する。用語トランス−シクロオクテンは、ここでは、１又は複数のヘテロ原子を含む可能性があるとして使用され、特に式（１ａ）を満たす構造を意味する。広い意味で、本発明者は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応に基づいて行った試み以外に、プロドラッグのためのトリガー部分としてＴＣＯを選択することは、薬物（活性）部分をプロドラッグ（活性化可能）部分にするための汎用性の高いツールを提供する、ことを見出し、ここで活性化は、ジエノフィル（トリガー）とジエン（アクチベータ）との強力な、非生物的、生体直交型反応、即ち前述のレトロディールスアルダー反応により生じ、かつプロドラッグは薬物−ジエノフィル共役物である。
理解されるべきことは、スキーム１で、レトロディールスアルダー付加物において、並びに最終生成物において、示されたＴＣＯ基及び示されたジエン基は、それらの基がレトロディールスアルダー反応で変換された後のそれぞれＴＣＯ及びジエン基の残基である、ということである。
非生物的、生体直交型化学反応の適用を成功させるために必要なことは、２つの関与する官能基がその反応性を微調整されて、共存する官能性との干渉を防止することである。理想的には、反応相手は、非生物的で、生理的条件で反応性であり、お互いにのみ反応性であって、その細胞／生理的環境を無視できる（生体直交性）ものである。生理的環境で課される選択性の要求は、ほとんどの従来の反応の使用を除外する。
逆電子要求ディールスアルダー反応は、しかし、低濃度及び準当量条件で動物における有用性が証明された（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５−３３７８）。本発明の対象となる反応相手は、歪みのかかったトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）誘導体、及び好適なジエン、例えばテトラジン誘導体などである。ＴＣＯとテトラジンとの環付加反応は中間体をもたらし、この中間体は次にレトロディールスアルダー環付加反応で二窒素の排除により再構成されジヒドロピリダジン共役物を形成する。これとその互変異性体は、レトロディールスアルダー付加物である。
本発明者は、一段と優れた式（１ａ）のＴＣＯの構造は、ＴＣＯジエノフィル内に利用可能な二重結合とジエンとを含む反応の結果、それ（ＴＣＯ）に結合された薬物の放出を引き起こすために適しているという非自明な認識に至った。これを可能にすると思われる特徴は、
（ａ）、二重結合の再構成を含み、脱離カスケードを引き起こすために使用され得る、ｒＤＡ反応の性質；
（ｂ）非芳香族（又は別の非芳香族基）であるジヒドロピリダジン基を持ち、且つ、脱離反応で再構成されて共役二重結合を形成するか、又は芳香族基（例えばピリダジン）を形成する、ｒＤＡ付加物の性質；
（ｃ）弱塩基であるジヒドロピリダジン基を持ち、及び従って脱離反応を触媒し得るものである、ｒＤＡ付加物の性質；
である。
広い意味で、本発明は、式（１ａ）のジエノフィルを用いるｒＤＡ反応、並びにｒＤＡ付加物は、生体直交型反応で引き起こされる薬物放出を可能とする多用途のプラットフォームを具体化するという認識を使用する。
反応は生体直交型であるという事実及び多くの構造選択肢が反応対のために存在するということは、当業者には明らかである。例えばｒＤＡ反応はプレターゲット医薬の分野で知られている。国際公開第２０１０／１１９３８２号、国際公開第２０１０／１１９３８９号及び国際公開第２０１０／０５１５３０号を参照する。本発明は反応の完全に異なる使用を提供するものであるが、理解されるべきことは、プレ標的化で使用されるようにｒＤＡ反応対のために利用可能な種々の構造可能性はまた、本発明の分野で利用可能である、ということである。
本発明で使用されるジエノフィルトリガー部分は、トランス−シクロオクテン環を含み、環は場合により１又は複数のヘテロ原子を含む。以下、この８員環部分をトランス−シクロオクテン部分と定義し、読みやすさのために「ＴＣＯ」部分と略記する。理解されるべきことは、本質は、ジエノフィルとして作用する、且つ反応の際その共役された薬物から放出される前記８員環の可能性にある、ということである。当業者は、ジエノフィル活性が、環内の全ての炭素原子の存在に必ずしも依存しないという事実を知っているが、これはヘテロ環モノアルケニレン８−員環もジエノフィル活性を持つことが知られているからである。
従って、一般には本発明は、薬物置換トランスシクロオクテンに厳密に限定されるものではない。有機化学の当業者は、その他の８員環系ジエノフィルが存在し、これらはトランスシクロオクテンと同じ環内二重結合を持つが、環内のいずれの場所にも１又は複数のヘテロ原子を持ち得る、ということを認識している。即ち、本発明は一般に、共役された薬物を有する、８員環非芳香族性環状アルケニレン部分、好ましくはシクロオクテン部分、及びより好ましくはトランスシクロオクテン部分に関わる。
インビボ作用がしばしば僅かな構造変化で変化される例えば医薬的活性物質の場合以外、本発明は、薬物共役物の好適な設計と組み合わせられる正しい化学反応性を何よりもまず要求する。従って、可能な構造は、当業者にとってこれらがジエノフィルとして反応性であることをよく知っているものに拡張される。
留意すべきことは、命名法の選択に依存して、ＴＣＯジエノフィルはまた、Ｅ−シクロオクテンとして記載され得る、ということである。従来の命名法を参照して、理解されるべきことは、シクロオクテン環の置換の結果として、置換基の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテン異性体が形式的にＺ−異性体として記載されることになり得る、ということである。本発明では、本発明のいずれの置換体は、形式的に「Ｚ」もしくは「Ｅ」、又は「シス」もしくは「トランス」異性体であろうと、無置換トランスシクロオクテン、又は無置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体として考える。用語「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）はＥ−シクロオクテン同様に交換可能に使用され、且つ、当該用語は、置換基が形式的に反対の命名法を要求する場合でも本発明の全てのジエノフィルについて維持される。即ち、本発明は、以下番号付けされたように炭素原子１と６とがＥ（エントゲーゲン, entgegen）即ちトランス配置にあるシクロオクテンに関わる。
本発明はさらに、特有の実施態様に関して、且つ特定の図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく特許請求の範囲にのみ限定されるものでる。請求項内のいずれの参照記号も、範囲を限定するものとして解釈されない。記載された図面はもっぱら模式的であり何も限定するものではない。図面において、ある要素のサイズは誇張されており、説明目的のため、スケール通りに描かれていない。名詞単数形を意味する不定冠詞または定冠詞が使用される場合（例えば「ひとつの」、「前記」）、特に記載がない限り、これはその名詞の複数を含む。
さらに留意されるべきことは、明細書や特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、その後に列挙される手段に限定されるべきではなく、他の要素やステップを除外するものではない。従って、表現「手段Ａ及びＢを含む装置」とは、部品ＡとＢのみからなる装置に限定されるべきではない。これは、本発明においては、当該装置についてただ関連するだけの部品がＡ及びＢであることを意味する。
以下いくつかの化学式で、「アルキル」及び「アリール」が参照される。ここで、「アルキル」は、それぞれ独立して、１０炭素原子までの脂肪族、直鎖、分岐、飽和、不飽和及び／又は環状ヒドロカルビル基を示し、１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含むことができ、「アリール」は、それぞれ独立して、２０炭素原子までの芳香族基又はヘテロ芳香族基を示し、置換されていてよく、及び１〜１０のＯ、Ｎ、Ｐ又はＳなどのヘテロ原子を含むことができる。「アリール」基はまた、「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」基（簡単な例ではベンジル基）を含む。「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」及び「アリールアルキル」が含む炭素原子の数は、かかる用語の前に表示することで示される（即ち、Ｃ１−１０アルキルは、アルキルが１から１０の炭素原子を含み得ることを意味する）。本発明のある化合物は、キラル中心及び互変異性体を有し、且つ、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及び互変異性、並びにそれらの混合物は本発明の範囲内にある。いくつかの式で、基又は置換基は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」、及び種々の（数字付き）「Ｒ」基などの文字を参照して示される。これらの文字の定義は、それぞれの式について読まれるべきものであり、即ち異なる式ではこれらの文字は特に断りがない限り、それぞれ独立して、異なる意味を持ち得る。
ここで記載される本発明の全ての実施態様では、アルキルは好ましくは低級アルキル（Ｃ１−４アルキル）であり、それぞれのアリールは好ましくはフェニルである。
初期の研究（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５−３３７８）は、前（プレ）標的化放射線免疫イメージングのための逆電子要求ディールスアルダー反応の有用性を証明した。この特定の環付加反応は、（３，６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジン誘導体とＥ−シクロオクテンとの間で生じ、引き続くレトロディールスアルダー反応において生成物と窒素を形成する。トランスシクロオクテン誘導体は、古典的なディールスアルダー反応におけるように電子吸引基を含まないことから、このタイプのディールスアルダー反応は、古典的な反応とは区別され、しばしば、「逆電子要求ディールスアルダー反応」と称する。以下の記載において、一連の両方の反応ステップ、即ち最初のディールスアルダー環付加（典型的には逆電子要求ディールスアルダー環付加）及び続くレトロディールスアルダー反応は、短く「レトロディールスアルダー反応」とよばれる。
レトロディールスアルダー反応
レトロディールスアルダーカップリング化学は一般には、一対の反応物質を含む。当該一対の反応物質がカップリングして不安定な中間体を形成し、この中間体がレトロディールスアルダー反応による唯一の副生成物として小分子（出発化合物に依存して、例えばＮ２、ＣＯ２、ＲＣＮなど）を脱離して、レトロディールスアルダー付加物を形成する。当該一対の反応物質は、一方の反応物質として（即ち一方の生体直交型反応基）、例えば電子不足テトラジンなどのテトラジン誘導体などの好適なジエンと、及び他方の反応物質として（即ち、他方の生体直交型反応基）、好適なジエノフィル例えば歪みのかかったトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）を有する。
例えば電子不足（置換）テトラジンとＴＣＯ部分との非常に速い反応は、ライゲーション(ligation)中間体を形成し、これは、［４＋２］レトロディールスアルダー環付加における唯一の副生成物としてのＮ２を脱離することによりジヒドロピリダジンレトロディールスアルダー付加物に転位される(rearranges)。水性環境では、最初に形成される４，５−ジヒドロピリダジン生成物は、１，４−ジヒドロピリダジン生成物に互変異性化し得る。
２つの反応性化学種は、非生物的であり、インビボで迅速な代謝や副反応を受けない。これらは生体直交型であり、例えばこれらは、生理的媒体中で選択的に互いと反応する。従って、本発明の化合物及び方法は、生存生物中で使用され得る。さらには、反応基は比較的小さく、生物サンプル中、又は生存生物中に、それらの中の生体分子のサイズを大きく変更することなく導入することを可能にする。逆電子要求ディールスアルダー反応及び一対の反応性化学種の挙動についての参照文献は：Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４；Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５；Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９）、Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．ＲｅｎａｒｔＶｅｒｋｅｒｋ、ＳａｎｄｒａＭ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、ｌ．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５、Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ、Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ、Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ、Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ、Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２００９、４８、７０１３、及びＤｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、１−５、である。
理解されるべきことは、広い意味で、本発明により、前述のレトロディールスアルダーカップリング及び続く薬物活性化化学は、基本的にプロドラッグ治療に使用され得る分子、基又は部分のいずれの一対にも適用できる、ということである。即ち、かかる一対の一方は、ジエノフィル（トリガー）に結合される（リンクされる）薬物を含む。対のもう一方は、前記ジエノフィルとの反応に使用するための相補的ジエンであり得る。
トリガー
プロドラッグは、ＴＲとして示されるトリガー部分に、直接又は間接的に結合されたＤＤとして示される薬物（Ｄｒｕｇ）を含み、トリガー部分はジエノフィルである。ジエノフィルは、広い意味で、８員環非芳香族性環状アルケニレン部分（好ましくはシクロオクテン部分、及びより好ましくはトランスシクロオクテン部分）である。場合により、トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）部分は、実質的に同一面内に固定される少なくとも２つの環外結合を含み、及び／又はＴＣＯ部分は場合により、アキシアル位に少なくとも１つの置換基を含み、及びエクアトリアル位には含まない。有機化学の当業者は、用語「実質的に同一面内に固定される」とは、結合理論を意味すると理解する。その結合理論によれば、結合が同一面内に固定されると通常考えられる。かかる同一面内での固定の典型例は、二重結合及び歪みのかかった縮合環を含む。例えば、少なくとも２つの環外結合は、酸素への二重結合の結合２個（即ちＣ＝Ｏ）であり得る。少なくとも２つの環外結合はまた、２つの隣接する炭素原子における一重結合であり得、但し、これらの結合が一緒になって縮合環の一部分であり（即ちＴＣＯ環に縮合される）、縮合環は実質的に平面構造を有し、それにより前記２つの一重結合を実質的に１つの同一面内で固定する場合である。後者の例は、シクロプロピル及びシクロブチルなどの歪みのかかった環を含む。理論に縛られること望まないが、本発明者は、同一面内の少なくとも２つの環外結合の存在は、ＴＣＯ環の少なくとも部分的な平坦化をもたらし、これによりレトロディールスアルダーにおけるより高い反応性を導くことを可能にすると確信する。
本発明では、ＴＣＯは次の式（１ａ）を満たす。：
Ａ及びＰはそれぞれ独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり、ただし少なくとも１つはＣＲａＸＤである。ＸＤは、（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、であり、ここでｐ＝０又は１、（ＬＤ）ｎは任意のリンカーであり、ｎ＝０又は１、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してＴＲに結合され、これらの原子はリンカーの一部であり、前記リンカーは、直線的に及び／又は分岐させて配置される複数のユニットからなり得る。ＤＤは、１又は複数の治療部分又は薬物であり、好ましくはＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、これらの原子は治療部分の一部である。好ましくは、ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここでｐ＝０又は１、好ましくは１であり、及びｎ＝０又は１である。
好ましくは、ＤＤがＴＲ又はＬＤにＮＨを介して結合される場合、このＮＨはＤＤからの一級アミン（−ＮＨ２）残基であり、及びＤＤがＮを介して結合される場合には、このＮはＤＤからの二級アミン（−ＮＨ−）残基である。同様に、好ましくは、ＤＤがＯ又はＳを介して結合される場合には、前記Ｏ又はＳは、それぞれ、ＤＤからのヒドロキシル（−ＯＨ）残基又はスルフヒドリル（−ＳＨ）残基である。
さらに好ましくは、ＤＤに含まれる前記Ｓ、Ｎ、ＮＨ、又はＯ部分がＤＤの脂肪族性又は芳香族性炭素に結合されている。
好ましくはＬＤがＴＲにＮＨを介して結合される場合、このＮＨはＬＤからの一級アミン（−ＮＨ２）残基であり、及びＬＤがＮを介して結合されている場合には、このＮはＬＤからの二級アミン（−ＮＨ−）残基である。同様に、好ましくは、ＬＤがＯ又はＳを介して結合される場合には、前記Ｏ又はＳは、それぞれ、ＬＤからのヒドロキシル（−ＯＨ）残基又はスルフヒドリル（−ＳＨ）残基である。
さらに好ましくは、ＬＤに含まれるＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯ部分がＬＤの脂肪族性又は芳香族性炭素に結合されている。
本発明においてリンカーＬＤが参照される場合、これは自壊性であるか又はそうでないか、又はそれらの組み合わせであり得るものであり、及び複数の自壊性ユニットからなることができる。
さらなる明確化のため、ｐ＝０及びｎ＝０である場合、薬物種ＤＤは直接、脱離反応の脱離基を構成し、且つ、ｐ＝０及びｎ＝１である場合、自壊性リンカーは脱離反応の脱離基を構成する。リンカーＬＤと薬物ＤＤの結合の位置及び方法は当業者に知られている（例えば、Ｐａｐｏｔ ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、８、６１８−６３７を参照）。それにもかかわらず、自壊性リンカーＬＤの典型的であるが、非限定的な例はベンジル誘導体、例えば以下に示されるものである。右側に、複数のユニットを持つ自壊性リンカーの一例が示され、このリンカーは、ＣＯ２と４−アミノベンジルアルコールの１ユニットにだけでなく、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−オンの１ユニットにも分解する。
(式中、ＸはＯ又はＳ又はＮＨ又はＮＲであり、ここでＲはアルキル又はアリールである)
ひとつの興味深い実施態様において、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑはそれぞれ独立して、ＣＲａ ２、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ及びＳｉＲｃ ２、からなる群から選択され、Ｙ、Ｚ、Ｘ、及びＱの最大３つがＣ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ及びＣ＝ＮＲｂからなる群から選択され、ここで２つのＲ部分は一緒になって１つの環を形成してよく、及び但し、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲｂ、Ｓ−ＮＲｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）２及びＳ−Ｓ、からなる群から選択された隣接する原子の対が存在せず、及びそれにより、ＳｉはＣＲａ ２又はＯにのみ隣接する。
好ましい実施態様では、式（１ａ）のＴＣＯは全て炭素環である。他の好ましい実施態様では、式（１ａ）のＴＣＯはヘテロ環式炭素環であり、環に１から３の酸素原子を、及び好ましくは１つの酸素原子を含む。
もう一つの興味深い実施態様では、結合ＰＱ、ＱＸ、ＸＺ、ＺＹ、ＹＡの一つが縮合環の部分であるか、又はＣＲａ＝ＣＲａからなり、それにより、２つの環外結合が同一面内に固定され、及びただしＰＱ及びＹＡは芳香族５−又は６−員環の部分、共役７員環の部分、又はＣＲａ＝ＣＲａの部分ではなく；
縮合環の部分ではない場合には、Ｐ及びＡは独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり、ただし少なくとも１つはＣＲａＸＤであり；
縮合環の部分である場合には、Ｐ及びＡは独立してＣＲａ又はＣＸＤであり、ただし少なくとも１つはＣＸＤであり；
残りの基（Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑ）はお互いに独立して、ＣＲａ ２、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ、ＳｉＲｃ ２であり、それにより、多くとも１つの基がＣ＝ＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂであり、且つ、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲｂ、Ｓ−ＮＲｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）２、及びＳ−Ｓからなる群から選択された隣接する原子の対が存在せず、及びそれにより、Ｓｉは、存在するならばＣＲａ ２又はＯに隣接し、及びＣＲａ ２＝ＣＲａ ２結合は、存在するならばＣＲａ ２又はＣ＝ＣＲａ ２基に隣接し；
Ｔ、Ｆはそれぞれ独立してＨを、又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩからなる群から選択される置換基を表す。
いくつかの実施態様では縮合環が存在することにより、２つの環外結合が実質的に同一面内に固定される結果となる。これらは、以下に定義されるような縮合３−員環、縮合４−員環、縮合二環式７−員環、縮合芳香族５−員環、縮合芳香族６−員環及び縮合平面共役７−員環から選択される。
縮合３−員環は：
である。
ここでＥ、Ｇは前記８−員環の部分であり、且つ、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得、それによりＰ、ＡはＣＲａ又はＣＸＤであり、及びそれによりＣＸＤはＡ及びＰにおいてのみ存在し得る。
Ｅ−ＧはＣＲａ−ＣＲａ又はＣＲａ−ＣＸＤであり、及びＤはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、ＮＲｂ、Ｏ、Ｓであるか；又は
Ｅ−ＧはＣＲａ−Ｎ又はＣＸＤ−Ｎであり、及びＤはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、ＮＲｂＯ、又はＳである。
縮合４−員環は：
である。
ここで、Ｅ−Ｇは前記８−員環の部分であり、且つ、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得、それによりＰ、ＡはＣ、ＣＲａ又はＣＸＤであり、及びそれによりＣＸＤはＡ及びＰにおいてのみに存在し得る。
Ｅ及びＧはＣＲａ、ＣＸＤ又はＮであり、且つ、Ｄ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接Ｏ−Ｏ又はＳ−Ｓ基ではないか；又は、
Ｅ−ＤはＣ＝ＣＲａであり、且つ、ＧはＮ、ＣＲａ、ＣＸＤであり、且つ、ＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであり；又は、
Ｅ−ＤはＣ＝Ｎであり、及びＧはＮ、ＣＲａ、ＣＸＤであり、及びＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏであり；又は、
Ｄ−ＭはＣＲａ＝ＣＲａであり、且つ、Ｅ及びＧはそれぞれ独立してＣＲａ、ＣＸＤ又はＮであり；又は、
Ｄ−ＭはＣＲａ＝Ｎであり、且つ、ＥはＣＲａ、ＣＸＤ、Ｎであり、且つ、ＧはＣＲａ又はＣＸＤであり；又は、
ＥはＣであり、ＧはＣＲａ、ＣＸＤ又はＮであり、且つ、Ｄ、ＭはＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであり、又はＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２の多くとも１つであるが、しかし隣接するＯ−Ｏ又はＳ−Ｓ基ではなく；又は
Ｅ及びＧはＣ及びＤであり、且つ、Ｄ及びＭはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、又はＳ−Ｓ基ではない。
縮合７−員環は：
である。
Ｅ−Ｇは前記８−員環の部分であり、且つ、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得、それによりＰ、ＡはＣ、ＣＲａ又はＣＸＤであり、及びそれによりＣＸＤはＡ及びＰにおいてのみ存在し得；
Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤ又はＮであり；Ｋ、ＬはＣＲａであり；Ｄ、ＭはＣＲａ＝ＣＲａ又はＣＲａ＝Ｎを形成し、又はＤ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基ではなく；ＪはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ；多くとも２個のＮ基であり；又は、
Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤであり；ＫはＮであり、且つＬはＣＲａであり；Ｄ、ＭはＣＲａ＝ＣＲａ結合を形成し、又はＤ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、ＮＲｂであるが、隣接するＯ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基ではなく、；ＪはＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＲｂ；多くとも２個のＮ基であり；又は、
Ｅ、ＧはＣ、ＣＲａ、ＣＸＤであり；Ｋ及びＬはＮであり；Ｄ、Ｍ、Ｊはお互いに独立してＣＲａ ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲｂ、Ｃ＝ＣＲａ ２基である。；
縮合５−員環は：
である。
Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合され得る。
Ｅ及びＧはＣであり；基Ｌ、Ｋ、又はＭの１つはＯ、ＮＲｂ、Ｓであり、且つ、残りの２つの基はお互いに独立してＣＲａ又はＮであり；又はＥはＣであり、且つＧはＮであり；Ｌ、Ｋ、Ｍは互いに独立してＣＲａ又Ｎである。
縮合６−員環は：
である。
Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合され得る。
Ｅ、ＧはＣであり；Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｍはお互いに独立してＣＲａ又はＮである。
縮合平面共役７−員環は：
である。
Ｅ、Ｇは前記８−員環の部分であり、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺに縮合し得る。
Ｅ、ＧはＣであり；Ｌ、Ｋ、Ｄ、ＭはＣＲａであり；ＪはＳ、Ｏ、ＣＲａ ２、ＮＲｂである。
前記示されるそれぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’であり得、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
前記示されるそれぞれのＲｂは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキル、Ｒ’ＣＯ−アルキルであり、ここでＲ’はＨ、アルキル及びアリールであり；
前記示されるそれぞれのＲｃは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨからなる群から選択され；
ここで２以上のＲａ、ｂ、ｃ部分は一緒になって環を形成し得るものであり；
好ましくは、それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びここでＲ’’’が独立してアルキル又はアリールである。
前記全ての実施態様で、場合によりＡ、Ｐ、Ｑ、Ｙ、Ｘ、及びＺ又はその置換体、又はその部分の縮合環、又は自壊性リンカーＬＤ、又は薬物ＤＤのひとつは、場合により１つもしくは複数のスペーサーＳＰを介して１又は複数の標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭに結合される。
前記ＴＣＯの合成は当業者には十分利用可能なものである。これはまた、歪みのあるシクロアルケン環において１又は複数のヘテロ原子を有するＴＣＯについても明らかに該当する。これに関する参照文献は、Ｃｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８０、４５、２６１及びＰｒｅｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９、１３１、１４１８２を含む。
好ましい実施態様では、トランスシクロオクテン部分は式（１ｂ）を満たす。：
ここで、同一面内に固定される多くとも２つの環外結合の任意的存在に加えて、それぞれのＲａは独立してＨを表し、又は多くとも４つの場合、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択される置換基を表し、ここでそれぞれのＲ’及びＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
前記のそれぞれのＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
ここで２つのＲａ、ｄ部分は一緒になって１つの環を形成し得るものであり；
場合によりひとつのＲａ、ｄが、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭへのリンカー部分内に場合によりスペーサーＳＰを介して含まれ、及び
ここでＴ及びＦがそれぞれ独立してＨを表し、又は、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される置換基を表し、及びＸＤは式（１ａ）に関して上で定義された通りである。
好ましくはそれぞれのＲａ及びそれぞれのＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びここでＲ’’’は独立してアルキル又はアリールである。
前記ジエノフィルにおいて、好ましくは、同一面内に固定される少なくとも２つの環外結合が、（ａ）縮合シクロブチル環の一重結合、（ｂ）縮合芳香族環の混成結合、（ｃ）酸素ヘの環外二重結合、及び（ｄ）炭素への環外二重結合からなる群から選択される。
１つの又は２つのＸＤ部分を含むＴＣＯは、複数異性体からなるものであってよく、またＴＣＯにおける置換基（例えばＸＤ）についてエクアトリアル対アキシアル配位を含んでいてよい。これに関連しては、それぞれ（１ＲＳ、２ＲＳ）及び（１ＳＲ、２ＲＳ）として識別される、トランス−オクタ−２−エン−オールのエクアトリアル及びアキシアル異性体の合成及び特徴が記載されているＷｈｉｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６を参照する。これらの異性体では、ＯＨ置換基は、エクアトリアル又はアキシアルのいずれかの位置で置換されている。
好ましい実施態様では、ＸＤが、アキシアル位又はエクアトリアル位いずれかである得る場合のプロドラッグについて、ＸＤはアキシアル位である。
カスケード脱離機構で進行すると考えられる薬物放出のため、場合により選択される好ましいジエノフィルは、次の構造から選択される。：
（点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
波線は、結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
（点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
波線は結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
（点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
波線は結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
キャリア（担体）としてのＴＣＯの使用
本発明はまた、式（１ａ）を満たすトランスシクロオクテンの、全ての実施態様で、治療化合物のキャリアとしての使用を含む。トランスシクロオクテンは、前記の通り広い意味でＴＣＯとして、好ましくは全てが炭素の環として読まれるべきであり、又は１又は２のヘテロ原子を含む。治療化合物は薬物又はその他の化合物であり、又は治療応用を持つことが意図されている部分である。本発明のこの側面でのキャリアとしてのＴＣＯの使用は、治療化合物の治療活性とは関連しない。事実、治療化合物が薬物として開発されることが意図される薬物質である場合、それらの多くは実際には失敗し得るものであるが、なおキャリアとしてのＴＣＯの応用は薬物の試験において有用である。この意味で、キャリアのその能力においてＴＣＯは、医薬賦形剤と同様であると考えられ、薬物を被験者に導入する場合にキャリアとして作用する。
キャリアとしてのＴＣＯの使用は、ジエン、特にテトラジンとの生体直交型反応に開放されている部分により担持された薬物を被験者へ投与することを可能にするという利点がある。これは、身体内へ運ばれる薬物の運命に影響を与えるためだけでなく、その運命に続く（例えばラベル化ジエンをそれに反応させることが可能になる）又はその運命を変化させる（例えば、ｐＫ変性剤をそれに結合させることが可能になる）ために強力なツールを提供することとなる。これは、前記説明したｒＤＡ反応でＴＣＯとジエンを反応させることを可能にするということに全て基づく。キャリアは好ましくは以下に説明するアクチベータと反応させ、それにより、本書で十分に説明するように、ＴＣＯから治療化合物の放出を引き起こす。
アクチベータ
アクチベータは、生体直交型反応基を含み、ここでアクチベータのこの生体直交型反応基はジエンである。このジエンは、他の生体直交型反応基、トリガー、及び即ちジエノフィルと反応する（上記参照）。アクチベータのジエンは、トリガーのジエノフィルと反応可能であるように、ディールスアルダー環付加反応、続いてレトロディールスアルダー反応を受けることにより、レトロディールスアルダー付加物を与えることができるように選択される。この中間体付加物は次に１つ又は複数の薬物を放出し、そこでこの薬物放出は、種々の環境や条件下で引き起こされるが、これはレトロディールスアルダー付加物の特定の分子構造に関連する。理論に縛られることを望まないが、本発明者は、アクチベータは、脱離又はカスケード脱離を介して（レトロディールスアルダー付加物内で分子内脱離反応を介して）薬物放出を引き起こすように選択されると考えている。この脱離反応は単純な一段階反応であり得るが、又は、１又は複数の中間体構造を含む複数段階反応であり得る。これらの中間体は、ある時間安定であるか、又は即時に分解して熱力学的最終生成物となるか、又は次の中間体構造となる。いくつかのステップが関与する場合、これをカスケード反応と呼ぶことができる。単純プロセス又はカスケードプロセスのいずれの場合にも、脱離反応の結果は、薬物がレトロディールスアルダー付加物から放出されるということである。理論に縛られることを望まないが、両方の成分（即ち、ジエンアクチベータ及びジエノフィルトリガー）の設計は、レトロディールスアルダー付加物内の電子分布が好ましくないようにし、それにより、これらの電子の転位(rearrangement)が必ず生じる。この状況は分子内（カスケード）脱離反応を引き起こして、従って１つもしくは複数の薬物の放出に導くものである。プロドラッグ自体は比較的安定であるので、プロドラッグ内での脱離反応の発生及びプロドラッグからの薬物放出は、効率的でないか、又はレトロディールスアルダー反応の前に行うのは不可能である。脱離は、アクチベータ及びプロドラッグが反応して、レトロディールスアルダー付加物内で構築された後にだけ行うことができる。
理論に縛られることを望まないが、前記２つの例は、レトロディールスアルダー付加物内の好ましくない電子分布が脱離反応によりどのようにして緩和され、それにより薬物を放出するのかを説明する。ひとつのシナリオでは、脱離プロセスは最終生成物Ａを生成し、この生成物は、二重結合の共役を持ち、これはレトロディールスアルダー付加物には存在しなかった。化学種Ａは最終生成物Ｂと互変異性であるか、又は転位して最終生成物Ｃを形成する。次に、レトロディールスアルダー付加物の非芳香族性ジヒドロピリダジン環が、最終生成物Ｃでの芳香族性ピリダジン環に変換される。当業者は、レトロディールスアルダー付加物における電子分布は一般には、最終生成物、Ａ、Ｂ又はＣのいずれかにおける電子分布よりも好ましくない、ということを理解する。従って、レトロディールスアルダー付加物よりも安定な化学種の形成が、（カスケード）脱離反応の駆動力である。いずれの場合においても、及びプロセスをどのように見るかによらず、薬物化学種（ここではアミン「ｄｒｕｇ−ＮＨ２」）は、効果的にレトロディールスアルダー付加物から放出されるが、プロドラッグ単独からは放出されることはない。
以下のスキームは、上述の２つに加えて、カスケード脱離のための別の可能な放出機構を示す。理論に縛られることを望まないが、以下の例は、レトロディールスアルダー付加物内の好ましくない電子分布が、脱離反応によりどのように緩和され、それにより薬物を放出するかを説明する。このプロセスは、全てが平衡となる種々の互変異性を介して進行し得る。ここで、ｒＤＡ反応は、互変異性体Ａ及びＢを生成し、これらは互いに交換可能である。互変異性体Ｂは、脱離反応により生成物Ｃとなり、その後Ｄとなる。
アクチベータはジエンである。当業者は、レトロディールスアルダー反応で反応性を示すジエンの豊富さを認識する。アクチベータに含まれるジエンは、テトラジン（本発明による好ましいアクチベータである）などの第３の二重結合を含む環構造の部分であり得る。
一般的にアクチベータは、少なくとも２つの共役二重結合を持つヘテロ環部分を含む分子である。
好ましいジエンは以下式（２）〜（４）で与えられる。
式（２）において、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、；
Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル−置換炭素、アリール−置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒからなる群から選択され、ここでＲはアルキルであり、ただしＡ及びＢは共に炭素ではない；
ＸはＯ、Ｎ−アルキル、及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及び
ＹはＣＲであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はお互いに独立してＨ、アリール又はアルキルである。
シクロオクテンのための反応相手として特に好適なジエンは式（３）で与えられ、
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；
Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；
ＢはＯ又はＳであり；
Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
シクロオクテンのための反応相手として特に好適な別のジエンは式（４）のジエンであり、
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
ＡはＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
ＢはＮであり；
Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル及び、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
本発明によれば、特に有用なジエンは、それぞれ式（５）、（６）、（７）で与えられる、１，２−ジアジン、１，２，４−トリアジン及び１，２，４，５−テトラジン誘導体である。
１，２−ジアジンは式（５）で与えられ、
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；
Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｏ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ−アルキル、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり、
ここでＸ−Ｙは一重結合又は二重結合であり、及びここでＸ及びＹは、６−員環ジアジンから離れた第２の環に結合され得る。好ましくは、Ｘ−Ｙはエステル基（Ｘ＝Ｏ及びＹ＝Ｃ＝Ｏ；Ｘ−Ｙは一重結合）を表し、又はＸ−Ｙはシクロアルカン基（Ｘ＝ＣＲ’及びＹ＝ＣＲ’’であり；Ｘ−Ｙは一重結合であり；Ｒ’及びＲ’’は結合されている）、好ましくはシクロプロパン環を表し、それによりＲ’及びＲ’’は、１，２−ジアジン環の外で第１の炭素でお互いに結合されている。
１，２，４−トリアジンは式（６）で与えられ、
ここで、Ｒ１及びＲ２はお互いに独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキル又はであり；
Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
１，２，４，５−テトラジンは式（７）で与えられ、
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
電子不足１，２−ジアジン（５）、１，２，４−トリアジン（６）又は１，２，４，５−テトラジン（７）は特に興味深い。かかるジエンは一般にはジエノフィルに対しより高い反応性を持つからである。
ジ−、トリ−又はテトラ−アジンは、それらが、一般に電子供与体とはされない基又は部分で置換されるか、又は電子吸引基で置換される場合に、電子不足である。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、Ｈ、アルキル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル、２，４−イミダゾール、２，５−イミダジル又はフェニルからなる群から選択される置換基を表し、場合により、１又は複数の電子吸引基、例えばＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、Ａｒで置換され、そこでＲはＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、及びＡｒは芳香族性基、特にフェニル、ピリジル又はナフチルを表す。
式（７）の１，２，４，５−テトラジンは、アクチベータジエンとして最も好ましく、というのは、これら分子は、好ましいＴＣＯジエノフィルなどのジエノフィルとのレトロディールスアルダー反応で最も反応性が高いからであり、たとえＲ１及び／又はＲ２基は必ずしも電子吸引性ではない場合でも、及びたとえＲ１及び／又はＲ２が実際に電子供与性であっても、そうである。電子供与基は、例えばＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＨＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’’であり、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してアルキル又はアリール基である。他の電子供与基の例は、前記リストで記載されるような１又は複数の電子供与基に接続されているフェニル基であり、特にフェニル基の２−，４−及び／又は６−位置で置換される場合である。
本発明によれば、２つの電子吸引残基を持つ１，２，４，５−テトラジン、又は１つの電子吸引残基、及び電子吸引性でも電子供与性でもない１つの残基を持つものは電子不足と呼ばれる。同様に、２つの電子供与残基を持つ１，２，４，５−テトラジン、又は１つの電子供与残基、及び電子吸引性でも電子供与性でもない１つの残基を持つものは電子十分と呼ばれる。共に電子吸引性でも電子供与性でもない２つの残基を有する１，２，４，５−テトラジン、又は、１つの電気吸引残基と１つの電子供与残基とを持つものは、電子不足でもなく電子十分でもない。
１，２，４，５−テトラジンは、非対称的でも対称的でもよく、即ち式（７）におけるＲ１及びＲ２基は、それぞれ異なる基でも同一の基であってもよい。対称的１，２，４，５−テトラジンは、より便利である。なぜなら、これらアクチベータは、合成手順を介してより容易にアクセス可能だからである。
我々は、モデル薬物化合物（例えばベンジルアミン）を脱離（カスケード）プロセスを介してプロドラッグから放出させるアクチベータとしての能力について、いくつかの１，２，４，５−テトラジンを試験した。そして、電子不足であるテトラジン、電子十分であるテトラジン又は電子不足でも電子十分でもないテトラジンが薬物放出を導くことが可能であることを見出した。さらには、対称テトラジン並びに非対称的テトラジンが同様に効果的であった。
電子不足１，２，４，５−テトラジン及び、電子不足でも電子十分でもない１，２，４，５−テトラジンは、一般にジエノフィル（ＴＣＯなどの）とのレトロディールスアルダー反応においてより反応性であり、従って、これら２つの種類の１，２，４，５−テトラジンは、電子十分１，２，４，５−テトラジンよりも好ましく、それはたとえ後者がまたプロドラッグ中で薬物放出を誘導することができるものであってもそうである。
以下の段落で、本発明の第２の側面による１，２，４，５−テトラジンアクチベータの具体的な実施例が、式（７）におけるＲ１及びＲ２残基を定義することで強調される。
電子吸引基を持つ対称的電子不足１，２，４，５−テトラジンは例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，４−ピリミジル、２，６−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，３，４−トリアジル又は２，３，５−トリアジルを有するものである。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニルを有するものであって、ここで当該フェニルの２位、３位もしくは４位に、又は当該フェニル基の３位及び５位に、又は２位及び４位に、又は２位及び６位に、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＭｅカルボキシレートを有する、又はＣＮニトリルを有する、又はＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ３又はＣＯＮ（ＣＨ３）２アミドを有する、又はＳＯ３Ｈ又はＳＯ３Ｎａスルホネートを有する、又はＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣＨ３又はＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２スルホンアミドを有する、又はＰＯ３Ｈ２又はＰＯ３Ｎａ２ホスホネート置換基を有するものである。テトラジンが対称的のままである限り、様々な置換基の使用を含む、他の置換体パターンも可能である。これらの構造の例について以下を参照。
電子供与残基を持つ対称的電子十分な１，２，４，５−テトラジンは、例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’、２−ピリル(pyrryl)、３−ピリル、２−チオフェン、３−チオフェンを持つものであり、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニル又はトルイル基を表す。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニルを有するもつものであって、当該フェニルは（１又は複数の）ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’置換基を有し、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニル又はトルイル基であり、ここでＲ’’はメチル又はエチル基を表し、及びここで置換は、２−又は３−又は４−又は２−及び３−又は２−及び４−又は２−及び５−又は２−及び６−又は３−及び４−又は３−及び５−又は３−、４−及び５−位で行われる。これらの構造の例については以下を参照。
電子吸引性でも電子供与性でもない残基を有する対称的１，２，４，５−テトラジンは、例えば、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニル、メチル、エチル、（イソ）プロピル、２，４−イミダジル、２，５−イミダジル、２，３−ピラジル又は３，４−ピラジルを有するものである。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝ヘテロ（芳香族性）環、例えばオキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール又はチアゾリン環を有するものである。他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝フェニルを持つものであり、このフェニルは、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＮ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＯＮ（ＣＨ３）２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３Ｎａ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣＨ３、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＰＯ３Ｈ２又はＰＯ３Ｎａ２から選択される１つの電子吸引置換基と、ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’置換基から選択される１つの電子供与置換基とを持ち、ここでＲ’は、メチル、エチル、フェニル又はトルイル基を表し、ここでＲ’’はメチル又はエチル基を表す。置換は、２−及び３−、２−及び４−、２、−及び５−、２−及び６、３−及び４−、及び３−及び５−位で行われ得る。さらに他の例は、Ｒ１＝Ｒ２＝ピリジル又はピリミジル部分であるものであって、当該ピリジル又はピリミジル部分は、ＯＨ、ＯＲ’、ＳＨ、ＳＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、ＮＲ’’−ＣＯ−Ｒ’、ＮＨ−ＳＯ−Ｒ’又はＮＨ−ＳＯ２−Ｒ’置換基から選択される電子供与置換基を有し、ここでＲ’はメチル、エチル、フェニル又はトルイル基を表し、及びここでＲ’’はメチル又はエチル基を表す。いくつかの例について以下を参照。
非対称的１，２，４，５−テトラジンが考慮される場合には、所与のＲ１及びＲ２残基のいずれかの組み合わせを選択することができ、これらは式（７）による対称的テトラジンについて上で強調され列記されているものである、ただし、もちろんＲ１及びＲ２は異なっている。好ましい非対称的１，２，４，５−テトラジンは、残基Ｒ１又はＲ２の少なくとも一方が本質的に電子吸引性である。いくつかの例が下に示される。
アクチベータについてのさらなる考察
好ましいアクティベータは、１，２−ジアジン、１，２，４−トリアジン及び１，２，４，５−テトラジンであり、特に１，２，４，５−テトラジンが好ましいジエンアクチベータである。以下にはアクチベータのいくつかの関連ある構造が強調され、そこで、全ての特定の応用のために適切なアクチベータ配合物を設計するために多くの選択肢があることが明らかとなる。
本発明によれば、アクチベータ、例えば１，２，４，５−テトラジンは、有用で有益な薬理学的及び薬理動態学的特性を持ち、これは次のことを意味する、即ち、アクチベータは非毒性又は少なくとも十分低い毒性であり、また十分低い毒性代謝物を生成し、生理的溶液に十分溶解性であり、薬学的に通常使用される水性又は他の処方中で使用でき、及び適切なｌｏｇＤ値を持つ（ここでこの値は、生理的ｐＨでのアクチベータの親水性／疎水性バランスを反映する）ということである。当該技術分野で知られているように、ｌｏｇＤ値は負（親水性分子）又は正（疎水性分子）であり得るが、ここでｌｏｇＤ値がより低い又はより高いと、それぞれの分子がより親水性又はより疎水性となる。ｌｏｇＤ値はほとんどの分子でかなり適切に予想でき、アクチベータのｌｏｇＤ値は、その設計において極性基又は非極性基を加えたり除いたりして調節可能である。以下、対応する計算されたｌｏｇＤ値（ｐＨ＝７．４）を有するいくつかのアクチベータ設計を示す。留意すべきことは、メチル、シクロアルケン、ピリジン、アミン、アルコール又はスルフォネート基を加えること、又はフェニル基を除くことは、ｌｏｇＤ値を変更することであり、及び非常に広い範囲のｌｏｇＤ値を得やすい、ということである。
前記与えられたｌｏｇＤ数は、「ＶＧ」（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ、Ｖ．Ｎ．；Ｇｈｏｓｅ、Ａ．Ｋ．；Ｒｅｖａｎｋａｒ、Ｇ．Ｒ．；Ｒｏｂｉｎｓ、Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．、１９８９、２９、１６３−１７２）、「ＫＬＯＰ」（Ｋｌｏｐｍａｎ、Ｇ．；Ｌｉ、Ｊｕ−Ｙｕｎ．；Ｗａｎｇ、Ｓ．；Ｄｉｍａｙｕｇａ、Ｍ．：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．、１９９４、３４、７５２による）及び「ＰＨＹＳ］（ＰＨＹＳＰＲＯＰ（登録商標）データベースによる）方法の同等の重み(importance)で、重み付けした方法から、Ｎａ＋／Ｋ＋Ｃｌ−中の０．１Ｍの水溶液にもとづいて計算された。
本発明によるアクチベータは、プロドラッグに対して適切な反応性を持ち、これはジエン、特に１，２，４，５−テトラジンを十分電子不足にすることにより制御可能となる。十分な反応性は、プロドラッグがアクチベータにより到達するとすぐにプロドラッグとの迅速なレトロディールスアルダー反応を保証する。
本発明によるアクチベータは、優れた生体利用性を持ち、これは、意図された目的を実行するために（ヒト）身体内で利用可能であることを意味し：プロドラッグが第１ターゲットに効果的に到達することを意味する。従って、アクチベータは、非標的物ではない血液成分に、又は組織に大きく接着しない。アクチベータは、血液中に存在するアルブミンタンパク質へ結合するように設計され得るが（当該技術において知られているように、血液循環時間を増加させるため）、同時にプロドラッグに到達することが可能な血液流から効果的に放出されるべきである。従って、血液結合及び血液放出は適切にバランスされるべきである。アクチベータの血液循環時間はまた、アクチベータの分子量を大きくすることで増加され得る、例えばアクチベータにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をつけることによる（ペグ化）。又は、アクチベータのＰＫＰＤが、アクチベータを、別の部分、例えばポリマー、タンパク質、（短い）ペプチド、炭水化物などに共役させることにより変更され得る。
本発明によるアクチベータは、マルチマー性であってよく、それにより、複数のジエン部分が分子足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に、特に例えば多官能性分子、炭水化物、ポリマー、デンドリマー、タンパク質又はペプチドに結合されてよく、ここでこれらの足場は好ましくは水溶性である。使用され得る足場の例は、（多官能性）ポリエチレングリコール、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、グリコール系デンドリマー、ヘパリン誘導体、ヒアルロン酸誘導体、又はＨＳＡなどの血清アルブミンタンパク質である。
プロドラッグの位置に依存して（例えば細胞内又は細胞外；標的化される特定の器官など）、アクチベータはこのプロドラッグに効果的に到達することができるように設計される。従って、アクチベータは例えば、そのｌｏｇＤ値、反応性又は電荷を変化させることで個別化され得る。アクチベータはさらに、標的化試薬（例えばタンパク質、ペプチド及び／又は糖部分）で操作されることも可能であり、それにより、第１のターゲットが受動的ではなく能動的に到達され得る。標的化試薬が使用される場合には、好ましくは、それは単純な部分である（即ち、短いペプチドや単純な糖）。
本発明によれば、異なるアクチベータの混合物が使用され得る。これは薬物の放出プロフィールを制御するために関連し得る。
本発明により第１のターゲットで薬物放出を生じさせ制御するアクチベータは、さらにアクチベータに、インビトロ及び／又はインビボ研究のため又は応用のために、追加の機能を与える部分で変性させることができる。
例えば、アクチベータは、色素部分又は蛍光部分で変性されてよく（例えば、近赤外（ＮＩＲ）蛍光体ＶＴ６８０でアミド化された３−（４−ベンジルアミノ）−１，２，４，５−テトラジンの場合、Ｓ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００８、１９、２２９７−２２９９を参照）、又はイメージングプローブで機能化され得るものであり、ここでこれらのプローブはＰＥＴ又はＳＰＥＣＴなどの核イメージング技術イメージングなどのイメージングモダリティで有用であり得る。この方法で、アクチベータは薬物放出を引き起こすだけでなくまた、（ヒト）身体内部に局在化され、それによりプロドラッグを（ヒト）身体内部に局在化させるために使用され得る。従って、薬物放出の位置と量はモニターされ得る。例えば、アクチベータは、ＤＯＴＡ（又はＤＴＰＡ）リガンドで変性され得るが、これらのリガンドは、核イメージングのための１１１Ｉｎ３＋−イオンとの錯体化に理想的には適している。他の例では、アクチベータは、それぞれＳＰＥＣＴ又はＰＥＴイメージングでの使用について確立されている１２３Ｉ又は１８Ｆ部分と結合され得る。さらに、例えばＬｕ−１７７、又はＹ−９０などのベータ線放射性同位体と組み合わせて使用する際に、プロドラッグ活性化は、前標的化フォーマット内で局所的放射線治療と組み合わせることが可能である。
好ましいアクチベータは：
式（８ａ）及び（８ｂ）で与えられる１，２，４，５−テトラジンであり、ここでそれぞれのＲ１及びそれぞれのＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである。
他の好ましいアクチベータは：
である。
アクチベータは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ＰＥＧ又はポリマーなどの望ましい部分への結合を有し得る。好ましくはこれらのアクチベータは次の式の一つを満たす。
（ここでＲ＝ペプチド、タンパク質、炭水化物、ＰＥＧ、ポリマー（への結合）を表す。）
プロドラッグ
プロドラッグは薬物ＤＤ及びトリガーＴＲの共役物であり、従って、トリガーから放出後治療作用が可能になる薬物を含む。かかるプロドラッグは場合により疾患標的に特異性を持つ。
プロドラッグの一般式は式（９ａ）及び（９ｂ）に示される。
部分ＹＭは、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭのいずれかであり得る；
ＳＰはスペーサーであり、；
ＴＲはトリガーであり、
ＬＤはリンカーであり、及び
ＤＤは薬物である。
薬物が標的化試薬から放出される応用では：
ＹＭは標的化試薬ＴＴであり；
式（９ａ）： ｋ＝１；ｍ、ｒ≧１；ｔ、ｎ≧０；
式（９ｂ）： ｋ＝１；ｍ、ｎ、ｒ≧１；ｔ≧０である。
マスク薬物がマスクされていない応用では：
ＹＭはマスキング部分ＭＭであり；
式（９ａ）及び（９ｂ）： ｒ＝１；ｍ≧１；ｋ、ｎ、ｔ≧０である。
前記式では単純化のため省略されているが、ＤＤはさらに場合によりＳＰを介してＴＴ及び／又はＭＭを含むことができる。
本発明に関連するプロドラッグで使用され得る薬物は、限定されるものではないが、：
抗体、抗体誘導体、抗体断片、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、抗体（断片）融合体（例えば二重特異性及び三重特異性ｍＡｂ断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、並びにペプチド、ペプトイド、ステロイド、有機薬物化合物、トキシン、ホルモン、ウイルス、全細胞、ファージが含まれる。本発明が好適である典型的薬物には、限定されるものではないが：
二重特異的及び三重特異的ｍＡｂ断片、例えばリシンＡ、ジフテリアトキシン、コレラトキシンを含む免疫トキシンが含まれる。他の実施態様は、アウリスタチン、メイタンシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、メイタンシノイドＤＭ１及びＤＭ４、アウリスタチンＭＭＡＥ、ＣＣ１０６５及びその類似体、カンプトテシンとその類似体、ＳＮ−３８及びその類似体；抗増殖／抗腫瘍薬、抗生物質、サイトカイン、抗炎症性薬、抗ウイルス剤、降圧剤、化学増感剤及び放射線増感剤を使用する。他の実施態様では、放出された薬物ＤＤはそれ自体さらに薬物ＤＤを放出するように設計されたプロドラッグである。薬物は場合により、膜転移部分（アダマンチン、ポリリジン／アルギニン、ＴＡＴ）及び／又は標的化試薬（腫瘍細胞レセプターに対する）を含み、これらは場合により安定な又は不安定なリンカーで結合されている。
ＴＣＯ誘導体への共役物としての使用のため、及びアクチベータとのレトロディールスアルダー反応で放出されるべき例示的薬物は、限定されるものではないが：
細胞毒性薬物、特に癌治療で使用されるものが含まれる。かかる薬物は、一般に、ＤＮＡ損傷剤、抗代謝剤、天然物質及びそれらの類似体が含まれる。細胞毒性剤の例示的分類は、ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、及びチミジル酸シンターゼインヒビターなどの酵素インヒビター、ＤＮＡアルキル化剤、放射線増感剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ開裂剤、抗チューブリン剤、トポイソメラーゼインヒビター、白金系薬物、アントラサイクリンファミリー薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン、レキシトロプシン、プテリジンファミリー薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤及びタキソールが含まれる。これらの分類で特に有用なものは、例えば、デュオカルマイシン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシルＤＮＡマイナーグルーブバインダー、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン(leurosine)、ロイロシダイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体（エトポシド又はエトポシドフォスフェート）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテール（商品名taxotere）レチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラミシン、エンジイン及びそれらの類似体を含む。
例示的薬物は、ドラスタチン及びその類似体を含み、これらには：
ドラスタチンＡ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチンＢ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチン１０（米国特許第４，４８６，４４４号、５，４１０，０２４号、５，５０４，１９１号、５，５２１，２８４号、５，５３０，０９７号、５，５９９，９０２号、５，６３５，４８３号、５，６６３，１４９号、５，６６５，８６０号、５，７８０，５８８号、６，０３４，０６５号、６，３２３，３１５号）、ドラスタチン１３（米国特許第４，９８６，９８８号）、ドラスタチン１４（米国特許第５，１３８，０３６号）、ドラスタチン１５（米国特許第４，８７９，２７８号）、ドラスタチン１６（米国特許第６，２３９，１０４号）、ドラスタチン１７（米国特許第６，２３９，１０４号）、及びドラスタチン１８（米国特許第６，２３９，１０４号）が含まれ、これらの特許文献の全内容は全て参照されて本明細書に援用される。
本発明の例示的実施態様では、薬物部分は、マイトマイシン、ビンカアルカロイド、タキソール、アントラサイクリン、カリケアマイシン、メイタンシノイド又はアウリスタチンである。
理解されるべきことは、本発明の共役物を製造する目的で、化合物の反応をより都合よくするために、化学変性がまた、望ましい化合物に対してなされ得る、ということである。ＴＣＯへカップリングさせるためのアミン官能基を含む薬物は、マイトマイシン−Ｃ、マイトマイシン−Ａ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、９−アミノカンプトテシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）１，２−ジメタンスルフォニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、ドラスタチン（アウリスタチンを含む）及びその誘導体を含む。
ＴＣＯにカップリングするためのヒドロキシ官能基を含む薬物は、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４−９−ジエン−２，６−ジイイン−１３−オン（米国特許第５，、１９８，５６０号）、ポドフィロトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルフォリン−ドキソルビシン、ｎ−（５，５−ジアセトキシ−ペンチル）ドキソルビシン及びその誘導体を含む。
ＴＣＯへカップリングするためのスルフヒドリル官能基を含む薬物は、エスペラミシン及び６−メルカプトプリン及びその誘導体を含む。
理解されるべきことは、薬物は場合により、リンカーＬＤもしくは自壊性リンカーＬＤ、又はこの組み合わせを介して結合され得るものであり、及び複数の（自壊性又は非自壊性）ユニットからなってよい、ということである。
さらに理解されるべきことは、１又は複数の標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭが、場合により、１つ又は複数のスペーサーＳＰを介して薬ＤＤ、トリガーＴＲ又はリンカーＬＤに結合され得ることである。
いくつかの薬物は、薬物標的化及び放出を測定するためにイメージング可能なラベルで置換され得る。
本発明のさらなる特定の実施態様によれば、プロドラッグは、疾患、例えば癌、炎症、感染、心血管疾患（例えば血栓、アテローム性動脈硬化症）、低酸素サイト（例えば心筋梗塞）、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、器官及びレポーター遺伝子／酵素などに標的化又は対処するように選択される。
ひとつの実施態様によると、プロドラッグ及び／又はアクチベータは、マルチマー性化合物であり、複数の薬物及び／又は生体直交型反応部分を持ち得る。これらのマルチマー性化合物は、ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ポリマー粒子又は他のポリマー性構成物であり得る。
プロドラッグでは、薬物ＤＤ及びトリガーＴＲ−ＴＣＯ誘導体−は直接お互いに結合される。それらはまた、お互いに、リンカー又は自壊性リンカーＬＤを介して結合され得る。理解されるべきことは、本発明は、ジエノフィルトリガーが薬物に結合されるいずれの考え得る方法をも含む、ということである。このことは、任意の標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭをプロドラッグへ接続する場合についても同様である。例えばタンパク質の場合にリジン又はシステインなどの反応性アミノ酸を介してこれらの薬物への共役に影響を与える方法は、当業者に知られている。
理解されるべきことは、薬物部分は、薬物が、レトロディールスアルダー付加物の形成後、最終的に放出されるようにＴＣＯに結合される、ということである。一般的には、このことは、薬物とＴＣＯとの間の結合、又はリンカーＬＤの場合にはＴＣＯとリンカーＬＤとの間の結合、又は自壊性ＬＤの場合にはリンカーとＴＣＯとの間の結合及び薬物とリンカーとの間の結合は、開裂可能であるべきであることを意味する。主に、薬物及び任意のリンカーは、ヘテロ原子を介して、好ましくはＯ、Ｎ、ＮＨ、又はＳを介して結合される。開裂性結合は、好ましくは、カーバメイト、チオカーバメイト、カーボネート、エーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、チオエステル、スルホキシド及びスルホンアミド結合からなる群から選択される。
従って、本発明では、リンカー概念は当業者に知られているものに類似して適用され得る。ほとんどの報告されたプロドラッグは、３つの成分：トリガー、リンカー、及び親薬物からなり、場合により標的化分子がリンカー又はトリガーいずれかに結合されている。例えばサイト特異的酵素のための置換基、又はｐＨ不安定基であってよいトリガーは、しばしば自己脱離リンカーを介して親薬物に結合されている。このリンカーは、トリガーの酵素的開裂を容易にするために導入され、活性サイトへの接近を改善し、且つ結合薬物からの立体障害を低減する。またリンカーは、同じトリガーと組み合わせてプロドラッグの広い範囲の簡単な使用を容易にする。さらには、リンカーはプロドラッグ安定性、薬理学的動力学、器官分布、酵素認識及び放出動力学を変更する。トリガー活性化／除去後、リンカーは自発的に脱離して親薬物を放出することが必要である。結合された薬物に依存してリンカー又はその部分は、その作用を損なうことなく薬物上に残り得る。一般的概念がスキーム２に示される。
スキーム２：
自己脱離リンカーの２つのタイプ、（ａ）電子カスケードリンカーと、（ｂ）環化リンカーとが区別され得る。カスケードリンカーの最も傑出した例は、スキーム３で示される、抗癌剤９−アミノカンプトテシンのβ−グルクロニドプロドラッグにおける、１，６−脱離スペーサーである。酵素β−グルクロニダーゼ（ある壊死腫瘍領域に存在する）による芳香族性ヒドロキシ官能基の脱マスク後、この基は電子供与基となり、電子カスケードを起こして、脱離基の排除をもたらし、ＣＯ２の脱離後遊離薬物を放出する。キノン−メチド転位に基づくこのカスケードは、また、マスクされていないアミンの孤立電子対、又はヒドロキシル基の代わりのチオール基の孤立電子対により引き起こされ得る。形成されるキノン−メチド化学種は、水に捕捉されフェノール誘導体を形成する。
スキーム３：
いくつかの他のトリガー−リンカー概念がスキーム４に示される。Ａ内のトリガーは血漿エステラーゼで活性化される。ｔｅｒｔ−ブチルエステルの加水分解は遊離の芳香族性ヒドロキシル基を与え、キノン−メチドカスケードを開始させる。この構成物は、抗体（Ｒ）への共役により標的化された。Ｂでは、セファロスポリンの、β−ラクタマーゼ酵素による加水分解がトリガーとして使用される。ラクタム環の加水分解は、その脱離基の性質により薬物置換基を排除させ得る。薬物は、エステル、アミド、スルフィド、アミン及びカーバメートリンクを介して共役された。芳香族性環化系リンカーの２つの例はＣ及びＤである。Ｃでは、ペニシリンＧ−アミダーゼによる開裂が、カルボニルへのアミンの分子内攻撃を起こさせ薬物を放出させる。Ｄは、ホスファターゼ感受性プロドラッグを示す。ヒトアルカリホスファターゼによるリン酸エステル開裂は、ヒドロキシルを与え、ヒドロキシルは薬物を放出することによりラクタムへと反応する。Ｅでは、ニトロ基のアミン基への還元によりトリガーされるプロドラッグの例を示す。この還元は、ＮＡＤＰＨの存在下でニトロレダクターゼにより実行され得る。その上さらに、多数のヘテロ環式ニトロ構造物は、知られた（Ｆ）であり、（Ｆ）は低酸素（腫瘍）組織内で還元され、及び従って酵素の助けなしにカスケードを開始し得る。プロドラッグ治療で使用される他のトリガーは、プラスミン、チロシンヒドロキシラーゼ（神経芽細胞腫に高発現）、チロシナーゼ又はカテプシンＢに感受性である。
スキーム４：Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ
ＴＣＯトリガーとアクチベータとの組み合わせ及び反応
薬物はリンカーを介しても介していなくても、好ましくは、ＴＣＯ環の二重結合に隣接する炭素原子に結合される。
以下、ＴＣＯプロドラッグとテトラジンアクチベータのいくつかの限定的でない組み合わせが、レトロディールスアルダー付加物からのカスケード脱離反応誘導された薬物放出の可能性を示す。アミン官能性薬物の放出の場合には、これらは、例えば一級又は二級アミン、アニリン、イミダゾール又はピロールタイプの薬物であり、従って薬物は脱離基の性質が様々であり得る、ということに留意する。対応する加水分解に安定なＴＣＯプロドラッグが適用される場合、他の官能基を持つ薬物放出もまた可能である（例えばチオール官能基化薬物）。示される縮合環生成物は、他のより好ましい互変異性体へと互変異性体化されていても、されていなくてもよい。
ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、付加物からアミン官能性薬物の放出を与える。テトラジンアクチベータは対称的であり、電子不足である。
ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、付加物からアミン官能基薬物の放出を与える。テトラジンアクチベータは非対称的であり電子不足である。留意すべきことは、対称的テトラジンを使用する場合に既に形成されている立体異性体とは別に、非対称的テトラジンの使用は、レトロディールスアルダー付加物レジオマー(regiomers)を形成する、ということである。
ウレタン（又はカーバメート）置換ＴＣＯの前記例は、付加物からアミン官能性薬物の放出を与える。テトラジンアクチベータは対称的であり電子十分である。
好ましい一実施形態において、薬物は抗体−トキシン共役物の形態で提供される。生体直交型化学的に活性化されたトキシンを放出可能なように、共役物は上で確認されるようなＴＣＯ部分を備えている。もう一つの実施形態において、薬物は、腫瘍細胞に結合し、及びＴ細胞をリクルートし及び活性化するのに役立つ二重もしくは三重特異性抗体誘導体である。薬物のＴ細胞結合機能は、上に記載されるようにＴＣＯ部分へ結合されることにより不活性化される。後者は、再び生体直交型化学的に活性化された薬物を活性化可能にするのに役立つ。
標的化（ターゲット化）
本発明のキット及び方法は、薬物の標的化送達への使用に非常に適する。
本発明で使用される「第１の標的」は、治療のための標的化試薬の標的に関する。例えば、第１の標的は、有機体、組織又は細胞に存在するいずれの分子であり得る。標的には、細胞表面標的が含まれ、例えばレセプター、糖タンパク質；構造タンパク質、例えばアミロイドプラーク；ストローマ（stroma）、細胞外マトリックス標的（例えば成長因子及びプロテアーゼ）などの豊富な細胞外標的；細胞内標的、例えばゴルジ体表面、ミトコンドリア表面、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞信号伝達系経路成分；及び／又は異物、例えばウイルス、細菌、真菌、酵母又はそれらの部分などの病原体が含まれる。第１の標的の例は、化合物例えばタンパク質などの化合物を含み、その存在又は発現量がある組織や細胞型に関連し、又はその発現量がある疾患においてアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされている。本発明の具体的な実施態様によると、第１の標的は、（内在性又は非内在性）レセプターなどのタンパク質である。
本発明によると、第１の標的は、ヒト又は動物身体内の、又は病原体又は寄生虫におけるいずれか好適な標的から選択され得るものであり、例えば、細胞膜及び細胞壁などの細胞、細胞膜レセプターなどのレセプター、ゴルジ体又はミトコンドリアなどの細胞内構造物、酵素、レセプター、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス又はウイルス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチンレセプター、モノアミンオキシダーゼ、ムスカリニンレセプター、心筋交感神経系、例えばロイコサイトにおけるロイコトリエンレセプター、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（μＰＡＲ）、葉酸レセプター、アポトーシスマーカー、（抗−）血管新生マーカー、ガストリンレセプター、ドパミン作動系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動系、アドレナリン作動系、コリン作動系、オピオイドレセプター、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター及び他の血栓関連レセプター、フィブリン、カルシトニンレセプター、タフトシンレセプター、インテグリンレセプター、フィブロネクチン、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ及びＶＥＧＦ／ＥＧＦレセプター、ＴＡＧ７２、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、テネイシンＣ、メラノコルチン−１レセプター、ＣＤ４４ｖ６、Ｇ２５０、ＨＬＡ ＤＲ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、メソテリン、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌ−セレクチンレセプター、ＬＤＬレセプター、Ｐ−糖タンパク質、ニューロテンシンレセプター、ニューロペプチドレセプター、物質Ｐレセプター、ＮＫレセプター、ＣＣＫレセプター、シグマレセプター、インターロイキンレセプター、ヘルペスシンプレクスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼを有するグループから選択され得る。前記列記された第１の標的の具体的な標的化を可能にするために、標的化試薬ＴＴは、限定されるものではないが、次の、抗体、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、ＶＨＨ、抗体（断片）融合（例えば二特異的及び三特異的ｍＡｂ断片）、タンパク質、ペプチド、例えばオクトレオチド及びその誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣物、炭水化物、単糖類、多糖類、ウイルス、全細胞、薬物、ポリマー、リポソーム、薬物治療剤、レセプターアゴニスト及びアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイドを含む化合物を含み得る。本発明の文脈内に想定される有機化合物の例は、エストロゲン、例えばエステラジオール、アンドロゲン、プロゲスチン、コルチコステロイド、メトトレキサート、葉酸及びコレストロールなどであるか、又はこれらから誘導される。好ましい実施態様では、標的化試薬ＴＴは抗体である。本発明の特定の実施態様によると、第１の標的は、レセプターであり、第１の標的に特異的に結合し得る標的化試薬が使用される。好適な標的化試薬は、限定されるものではないが、レセプター又はその部分などのリガンドであり、部分はなおレセプターに結合するものであり、例えば、レセプター結合タンパク質リガンドの場合にはレセプター結合ペプチドである。タンパク質性の標的化試薬の他の例は、インターフェロン、例えばアルファ、ベータ、及びガンマインターフェロン、インターロイキン、及びタンパク質成長因子、例えば腫瘍成長因子、例えばアルファ、ベータ腫瘍成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡＲ標的化タンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン、及びアンジオスタチンを含む。標的化試薬の代替例は、例えば第１の標的と相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。
本発明のさらに特定の実施態様によると、第１の標的及び標的化試薬は、癌、炎症、感染、例えば血栓などの心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脳卒中などの低酸素サイト、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管形成、臓器、及びレポーター遺伝子／酵素などの組織又は疾患の特異的もしくは増加した標的化をもたらすように選択される。これは、組織、細胞又は疾患特異的発現を持つ第１の標的を選択することで達成され得る。例えば、膜葉酸レセプターは、葉酸及びその類似体、例えばメトトレキサートの細胞内蓄積を媒介する。発現は正常細胞では制限されているが、種々の腫瘍細胞型では過剰発現されている。
マスキング部分
マスキング部分ＭＭは、タンパク質、ペプチド、ポリマー、ポリエチレングリコール、炭水化物、有機構成物であり得、これらはさらに結合された薬物ＤＤ又はプロドラッグを封止する。この封止は、例えば立体障害に基づくものであり得るがまた、薬物ＤＤとの非共有結合相互作用に基づくものであり得る。かかるマスキング部分はまた、ＤＤ又はプロドラッグのインビボでの特性（例えば血中クリアランス(blood clearance)；免疫系による認識）に影響するために使用され得る。
スペーサー
スペーサーＳＰは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含み、２から２００、好ましくは３から１１３、及び特に好ましくは５から５０の繰り返し単位を持つ。他の例は、生体ポリマー断片であり、例えばオリゴもしくはポリペプチド又はポリラクチドである。さらには好ましい例は実施例１１に示される。
投与
本発明の文脈において、プロドラッグは通常は最初に投与され、プロドラッグが第１の標的に到達するまでにある一定の時間を要する。この時間間隔は応用により異なり、数分、数日又は数週間かもしれない。選択された時間が経過した後、アクチベータが投与され、これはプロドラッグを見つけて反応し、それにより第１の標的において薬物放出を活性化する。
本発明の組成物は、静脈注射、腹腔内注射、経口投与、直腸投与及び吸入を包含する様々なルートを介して投与され得る。これら異なるタイプの投与に好適な製剤は当業者に知られている。本発明によるプロドラッグ又はアクチベータは、薬学的に許容され得るキャリアと共に投与され得る。ここで使用され得る好適な薬学的キャリアは、医学的又は獣医学的目的の好適なキャリアであり、毒性ではなく、あるいは非許容性ではない。かかるキャリアは当業者にはよく知られており、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせを含む。配合物は、投与モードに適合されるべきである。
理解されるべきことは、投与される化学物質、即ちプロドラッグ及びアクチベータは、前記化学物質の、例えばその塩、水和物又は溶媒和などの、化学的官能性を変化させない、変性形態であり得るということである。
プロドラッグ投与後、かつアクチベータ投与の前に、循環中のプロドラッグ活性化が望ましくない場合及び天然プロドラッグ除去が不十分である場合には、過剰のプロドラッグを清澄化剤により除去することが好ましい。清澄化剤は、その過剰が循環系から除去されるべき、投与された試薬（この場合プロドラッグ）に結合又は錯体形成させる目的で被験者に投与される試薬、化合物又は部分である。清澄化剤は、循環系から除去するために向けられる得るものである。後者は、一般的には肝臓レセプター系機構により達成され得るが、循環系からの分泌のその他の方法が、当業者に知られているように存在する。本発明において、循環するプロドラッグを除去するための清澄化剤は、好ましくは、例えば上で考察したようにプロドラッグのＴＣＯ部分と反応し得るジエン部分を含む。
以下の実施例は、本発明又は本発明の側面を説明するものであり、本発明の範囲又は特許請求の範囲を定めたり、限定するためのものではない。
方法
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ（１Ｈ−ＮＭＲについては４００ＭＨｚで、１３Ｃ−ＮＭＲについては１００ＭＨｚで測定）スペクトル装置を用いて２９８Ｋで記録した。化学シフトは室温で、ＴＭＳから低磁場側にｐｐｍで表した。分裂パターンについては次の略号を使用した、即ち、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット及びｂｒ＝ブロードである。ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ１６００ＦＴ−ＩＲ（ＵＡＴＲ）で記録した。ＬＣ−ＭＳは、ダイオードアレイ検出器（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡ Ｐｌｕｓ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に結合したＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ ＡＤ ＶＰシリーズＨＰＬＣ及びＩｏｎ−Ｔｒａｐ（ＬＣＱ Ｆｌｅｅｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。分析は、Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｌｌｔｉｍａ ＨＰ Ｃ１８３μカラムを用いて、注入容量１−４μＬとし、流速は０．２ｍＬ／分及び典型的には、２５℃で、Ｈ２Ｏ中ＣＨ３ＣＮ（共に０．１％ギ酸を含む）のグラジエント（５％から１００％へ１０分間で、１００％でさらに３分間保持）で行った。分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ５μＣ１８１１０Ａカラムで、２つのＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−８Ａポンプに結合したＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰとＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０ＡＶ ＶＰ紫外−可視光検出器とを用いて行った。サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射線検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００システムにおいて行った。サンプルは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、１０ｍＭのリン酸緩衝液により、ｐＨ７．４で０．３５〜０．５ｍＬ／分で溶出させた。ＵＶ波長は２６０ｎｍと２８０ｎｍにあらかじめ設定した。抗体溶液の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３２２ｎｍ及び２８０ｎｍでのそれぞれの吸光度から決定された。
材料
全ての試薬、化学製品(chemicals)、材料及び溶媒は、市販品から入手しそのまま使用した：（重水素化）溶媒は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから；及び化学製品、材料及び試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、ＡＢＣＲ、Ｍｅｒｃｋ及びＦｌｕｋａから入手した。全ての溶媒は、ＡＲ品質であった。４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−２，６−ジメチルフェノールは文献手順に従って合成した（Ｙ．Ｈ．Ｃｈｏｅ、Ｃ．Ｄ．Ｃｏｎｏｖｅｒ、Ｄ．Ｗｕ、Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｙ．Ｇｅｒｖａｃｉｏ、Ｖ．Ｂｏｒｏｗｓｋｉ、Ｍ．Ｍｅｈｌｉｇ、Ｒ．Ｂ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ２００２、７９、５５−７０）。ドキソルビシン塩酸塩はＡｖａｃｈｅｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
実施例１：
テトラジンアクチベータの合成
一般的手順
以下詳細に説明するテトラジンとは別に一連のその他のテトラジンを合成した。ピナー型反応が使用され、適当なニトリルをヒドラジンと反応させ、ジヒドロ１，２，４，５−テトラジン中間体を合成した。当該技術で知られているようにニトリルの代わりにアミジンを反応物として使用した。この反応で硫黄の使用は、ある場合にはこれによりジヒドロ１，２，４，５−テトラジンの形成を促進することが知られている。この中間体の酸化によりテトラジンジエンアクチベータが得られる。以下の反応は、合成されたテトラジンのいくつかを説明し、及び、テトラジンを合成及び単離する可能性のいくつか（例えば、溶媒の使用、濃度、温度、反応物の当量、酸化反応の選択など）を説明する。当技術分野で知られる他の方法も、テトラジンもしくは他のアクチベータを合成するために使用され得る。
３，６−ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（２）の合成
２−シアノピリジン（１０．００ｇ、９６．０ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１５．１ｇ；３００ｍｍｏｌ）を一晩不活性雰囲気下、９０℃で撹拌した。濁った混合物を室温に冷却し、ろ過し、残渣を続いて水（２０ｍＬ）及びエタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、さらに真空で乾燥して、粗ジヒドロテトラジン１をオレンジ色固体として得た（７．３５ｇ；６５％）。
ジヒドロテトラジン（１、１００ｍｇ；０．４１９ｍｍｏｌ）を酢酸（３ｍＬ）に分散させ、次に亜硝酸ナトリウム（８７ｍｇ；１．２６ｍｍｏｌ）を添加した。すぐにオレンジ色から暗赤色への変化が観測され、酸化生成物をろ過して単離した。残渣を水（１０ｍＬ）で洗浄し、次に真空乾燥して、紫色固体として表題の化合物を得た（２、９２ｍｇ；９３％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝９．００（ｄ、２Ｈ）、８．７６（ｄ、２Ｈ）、８．０２（ｔ、２Ｈ）、７．６０（ｄｄ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６３．９、１５１．１、１５０．１、１３７．５、１２６．６、１２４．５ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２３７．００（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２９６及び５２８ｎｍ。
３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（５）の合成
２−シアノピリジン（５．００ｇ、４８．０ｍｍｏｌ）、５−アミノ−２−シアノピリジン（５．７２ｇ；４８．０ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１５．１ｇ；３００ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下、９０℃で一晩撹拌した。濁った混合物を室温に冷却し、ろ過し、及び残渣を水（２０ｍＬ）及びエタノール（２０ｍＬ）で引き続き洗浄し、真空で乾燥した。オレンジ色の固体をアセトン（２００ｍＬ）に分散させ、これをシリカゲル（２０グラム）に含浸させ、次にアセトンとヘプタンのグラジエント（０％〜７０％）を用いてクロマトグラフィーを行い、ジヒドロテトラジン３を、オレンジ色固体として得た（１．４６ｇ；収率１２％）。
ジヒドロテトラジン（３、９０ｍｇ；０．３５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解し、次に無水酢酸（５４．４ｍｇ；０．５３３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を加熱して、１８時間不活性雰囲気下で還流させた。オレンジ色沈殿をろ過して分離し、ＴＨＦ（３ｍＬ）で洗浄してジヒドロテトラジンのアセタミドを得た（４、９０ｍｇ；収率８６％）。
アセタミド４（５０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を酢酸（１ｍＬ）に分散させ、亜硝酸ナトリウム（３５ｍｇ；０．５０８ｍｍｏｌ）を添加した。すぐにオレンジ色から暗赤色への変化が観測され、酸化生成物をろ過して分離した。残渣を水（５ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥して、表記の化合物を紫色固体として得た（５、４２ｍｇ；８４％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．０３（ｄ、１Ｈ）、８．９３（ｄ、１Ｈ）、８．６１（ｄｄ、２Ｈ）、８．４２（ｄｄ、１Ｈ）、８．１６（ｄｔ、１Ｈ）、７．７３（ｄｄ、１Ｈ）、２．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６９．５、１６３．０、１６２．８、１５０．６、１５０．２、１４３．８、１４１．２、１３８．５、１３７．８、１２６．６、１２６．１、１２４．９、１２４．２、２４．１ｐｐｍ． ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２９３．９（Ｍ＋Ｈ＋）、lｍａｘ＝３２３及び５２９ｎｍ．
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７）の合成
２−シアノピリジン（５００ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、アセタミジン塩酸塩（２．００ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）及び硫黄（１５５ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）で、アルゴンの不活性雰囲気下、撹拌した。ヒドラジン水和物（２．７６ｇ；５５．２ｍｍｏｌ）を添加し、次に混合物を２０℃で一晩撹拌した。濁った混合物をろ過し、ろ液を蒸発乾燥させてオレンジ色固体粗生成物６の収量２．９ｇを得た。
続いて、６（８００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）と酢酸（４ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。水（３ｍＬ）中のＮａＮＯ２（２．０ｇ；２９．０ｍｍｏｌ）溶液を０℃で添加した。すぐに赤／紫色懸濁物への着色を観測した。０℃で撹拌５分後、クロロホルムと水とを添加した。紫色クロロホルム層を２回水で洗浄し、次に濃縮した。固体残渣を、クロロホルムとヘキサンの１：１混合物中で撹拌し、次にろ過した。ろ液を濃縮し、溶出液としてクロロホルム／アセトン混合物を用いるシリカカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製して、純粋生成物を得た（７、４８ｍｇ、２−シアノピリジンから計算した合計収率２１％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．９６（ｄ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、１Ｈ）、７．９９（ｔ、１Ｈ）、７．５６（ｄｄ、１Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ． １３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６８．１、１６３．６、１５０．９、１５０．３、１３７．４、１２６．３、１２３．９、２１．４ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムにおいて１ピーク、ｍ／ｚ＝１７４．３（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２７４及び５２４ｎｍ．
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９）の合成
２−アミノベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６ｍｍｏｌ）をエタノール（３ｍＬ）中に溶解し、及びヒドラジン水和物（２．０６ｇ；４１．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃に冷却し、硫黄（０．１７ｇ；５．３０ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を１５分間続け、引き続き混合物を９０℃に加熱した。３時間後、黄色沈殿を濾過により単離し、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、引き続きクロロホルムで２回粉砕し（２回、１０ｍＬ）、黄色中間体８（３４３ｍｇ、３０％）を得た。
中間体８（１０５ｍｇ；０．３９４ｍｍｏｌ）をエタノール（１５ｍＬ）に溶解し、次に５０℃でこの溶液中に酸素を吹き込んだ。数分で色が黄色から暗オレンジ／赤色に変化し沈殿が生成した。２時間後、沈殿をろ過し、エタノールで洗浄し、乾燥して生成物９を暗赤色結晶として得た（８９ｍｇ、８６％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．３９（ｄ、２Ｈ）、７．３２（ｔ、２Ｈ）、７．０４（ｓ、４Ｈ）、６．９３（ｄ、２Ｈ）、６．７５（ｔ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．７、１４９．６、１３３．０、１２９．０、１１７．１、１１５．８、１１１．６ｐｐｍ． ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．４（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２３７、２９３、４０３及び５３５ｎｍ。
３，６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１１）の合成
４−ヒドロキシベンゾニトリル（１．０６ｇ；８．９０ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（３．０９ｇ；６１．７ｍｍｏｌ）に溶解し、混合物を９０℃で１６時間加熱した。黄色沈殿をろ過して水（２５ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）で洗浄して粗生成物中間体１０を黄色粉末として得た（８７０ｍｇ；６２％）。
中間体（１０、１７３ｍｇ；０．６４５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中に懸濁させ、この混合物中に５０℃で酸素を吹き込んだ。色は、数分で黄色から暗オレンジ／赤色に変化した。６時間後、沈殿をろ過し、エタノールで洗浄し、乾燥して生成物１１を暗赤色結晶として得た（１３６ｍｇ、８０％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．３５（ｂｒ．ｓ、２Ｈ）、８．３６（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）ｐｐｍ． １３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．６、１６１．５、１２９．２、１２２．６、１１６．３ｐｐｍ． ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６７．１（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２３５、３３０及び５３５ｎｍ。
３，６−ビス（４−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１３）の合成
４−アミノベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６ｍｍｏｌ）をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、引き続きヒドラジン水和物（２．１２ｇ；４２．２ｍｍｏｌ）と硫黄（０．１７６ｇ；５．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を９０℃で９０分間加熱し、黄色沈殿をろ過して単離し、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、引き続きアセトン（１２ｍＬ）で粉砕し、黄色中間体１２を得た（１９０ｍｇ、１７％）。
中間体１２（５０ｍｇ；０．１８８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、次にこの溶液中に酸素を２０℃で吹き込んだ。５時間後、反応混合物を食塩水（１３ｍＬ）に入れて、且つ、赤色沈殿をろ過して分離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥した。赤色粉末をアセトン（１５ｍＬ）で粉砕することによりさらに精製して、生成物１３を赤色固体として得た（１３．７ｍｇ、２７％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．１７（ｄ、２Ｈ）、７．７５（ｄ、２Ｈ）、６．０２（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ． １３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６２．３、１５２．８、１２８．５、１１８．３、１１３．８ｐｐｍ． ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２４１、３７０及び５３０ｎｍ。
３，６−ビス（３−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１５）の合成
３−アミノベンゾニトリル（１．００ｇ；８．４６０ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（２．５０ｍＬ；５１．４ｍｍｏｌ）に溶解し、次に混合物を９０℃で３日間加熱した。水（５ｍＬ）を添加し、次に黄色沈殿をろ過して分離し、水（１５ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）で洗浄して粗中間体１４をオレンジ色粉末として得た（９１０ｍｇ；８１％）。
中間体１４（５０ｍｇ；０．１８８ｍｍｏｌ）をエタノール（４ｍＬ）中に懸濁させ、次にこの混合物中に５０℃で酸素を吹き込んだ。数分で黄色から赤色に色変化した。１６時間後、沈殿をろ過して分離し、エタノールで洗浄して生成物１５を赤色粉末として得た（３１ｍｇ、６２％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．７７（ｓ、２Ｈ）、７．６６（ｄ、２Ｈ）、７．３０（ｔ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、２Ｈ）、５．５３（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ． ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝２６５．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２４０、２９６及び５２７ｎｍ。
３，６−ビス（アミノメチル）−１，２，４，５−テトラジン（２０）の合成
Ｂｏｃ−アミノアセトニトリル（１．００ｇ；６．４０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中２５％、０．１４５ｍＬ；０．６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１８時間撹拌し、引き続き塩化アンモニウム（０．３４ｇ；６．４０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２０℃で３日間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で沈殿させ、次に沈殿をろ過して集め、洗浄し、乾燥させてアミジン塩酸塩１７を得た。
アミジン塩酸塩（１７、２４１ｍｇ；１．１５ｍｍｏｌ）をヒドラジン水和物（３ｍＬ；６１．９ｍｍｏｌ）に溶解し、次に溶液を２０℃で１６時間撹拌した。次にこれを水（１０ｍＬ）で希釈し、沈殿を遠心分離で集めて乾燥した。無色固体を酢酸（１．５ｍＬ）に溶解して、次に亜硝酸ナトリウム（２８ｍｇ；０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。ピンク色混合物を１５分間撹拌し、引き続きクロロホルム（１５ｍＬ）及び飽和重炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）を添加した。オレンジ色層を単離し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、次に蒸発させて乾燥してＢｏｃ−保護化テトラジンをピンク色固体として得た（１９、７０ｍｇ；３５％）。この化合物（１２ｍｇ；０．０３５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解して、次ぎにＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。混合物を１５分間撹拌して、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で沈殿させた。ピンク色沈殿をろ過して分離し、洗浄、乾燥して表題の化合物をＴＦＡ塩として得た（２０、１０ｍｇ、７８％）。
１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝５．０６（ｓ、４Ｈ）ｐｐｍ． １３ＣＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝１６４．５、４１．１ｐｐｍ．ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムで１ピーク、ｍ／ｚ＝１４１（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２６７及び５１７ｎｍ。
２，２’，２’’−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（２７）及び２，２’，２’’−（１０−（２−オキソ−２−（１１−オキソ−１１−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ウンデシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（２８）の合成
５−アミノ−２−シアノピリジン２１（１．０２ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸２２（０．９９ｇ；４．３０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．７７ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０５ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、及びＰＰＴＳ（０．３７ｇ；１．４７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５ｍＬ）中に懸濁させた。混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで蒸発乾燥させ、次にアセトニトリル（２０ｍＬ）中で撹拌した。沈殿をろ過して除き、次にろ液を蒸発させて乾燥し、クロロホルム（２０ｍＬ）に溶解し、次に水性クエン酸（１５ｍＬ ０．５Ｍ）、水性炭酸水素カリウム（１５ｍＬ、１Ｍ）及び水（１５ｍＬ）のそれぞれで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）で精製して生成物２３を白色固体として得た（０．９５ｇ；６１％）。
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ１７Ｈ２５Ｎ４Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３３３．１９、実測値：３３３．１７。
Ｔｅｒｔ−ブチル６−（６−シアノピリジン−３−イルアミノ）−６−オキソヘキシルカーバメート２３（０．７０ｇ；２．１ｍｍｏｌ）、２−シアノピリジン（０．８７ｇ；８．４ｍｍｏｌ）、ヒドラジン水和物（１．２５ｇ；２０ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解し、次に硫黄（０．２２ｇ；７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を７０℃で、アルゴン不活性雰囲気下で２時間撹拌し、次いで５０℃で１６時間撹拌した。オレンジの懸濁物をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈し、次に得られた溶液を水（２回、１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／アセトン＝４：１）で精製して生成物２４をオレンジ色固体として得た（０．６５ｇ；６６％）。
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ２３Ｈ３１Ｎ８Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：４６７．２５、実測値：４６７．３３。
Ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２−ジヒドロ−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカーバメート２４（０．３０ｇ；０．６４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、酢酸（２ｍＬ）を添加した。亜硝酸ナトリウム（０．２５ｇ；３．６２ｍｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解、滴下した。赤色溶液を水性炭酸水素カリウム（５０ｍＬ；１Ｍ）に注ぎ入れて、次に生成物をクロロホルム（５０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（５０ｍＬ）で洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾燥させて、生成物２５を紫色固体として得た（０．２５ｇ；８３％）。
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ２３Ｈ２９Ｎ８Ｏ３ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：４６５．２３、実測値：４６５．４２。
ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカーバメート２５（６６ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（６ｍＬ）に溶解し、次にＴＦＡ（６ｍＬ）を添加した。溶液を室温で２時間撹拌し、引き続き蒸発乾燥させて生成物２６をＴＦＡ塩として得た（５２ｍｇ；１００％）。
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ１８Ｈ２１Ｎ８Ｏ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３６５．１９、実測値：３６５．３３。
６−アミノ−Ｎ−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）ヘキサンアミド２６（５２ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に溶解し、次にＤＩＰＥＡを添加した（３２０ｍｇ；２．０ｍｍｏｌ）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＤＯＴＡ（１６１ｍｇ；０．２ｍｍｏｌ）を添加し、次に混合物を室温で５時間撹拌した。溶液を蒸発乾燥させ、粗生成物をアセトニトリルと水の混合物に溶解し、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、純粋生成物２７を、ピンクの綿状固体として得た（８０ｍｇ、収率７６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中３０％アセトニトリル−ｄ３）：δ＝８．９０（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、８．６８（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．６０（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．３１（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．２４（ｔ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．８２（ｔ、１Ｈ、ＡｒＨ）、３．８０（ｂｒ ｓ、６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．７２（ｂｒ ｓ、２Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＮＨ）、３．３４−３．２３（ｂｒｍ、１８Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、２．４９（ｔ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２）、１．７０（ｍ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）、１．５９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、１．４１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中３０％アセトニトリル−ｄ３）：δ＝１７５．５、１７１．５（ｂｒ）、１６２．６、１６２．５、１５０．１、１４８．１、１４２．９、１４１．６、１３９．６、１３８．４、１２８．０、１２７．９、１２５．４、１２４．８、５５．４、５４．３（ｂｒ）、４９．４（ｂｒ）、３９．４、３６．５、２８．２、２５．９、２４．６ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ、Ｃ３４Ｈ４７Ｎ１２Ｏ８ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：７５１．３７；実測値［Ｍ＋Ｈ］＋７５１．５８、［Ｍ＋Ｎａ］＋７７３．５０、［Ｍ＋２Ｈ］２＋３７６．４２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋２５１．３３。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝３２６３、３０９４、２９４１、２８６２、１６６７、１６３７、１５８２、１５４０、１４６０、１４３１、１３９５、１３２４、１２９６、１２７２、１２５１、１２２６、１１９８、１１２８、１０８７、１０６０、１０２０、９９２、９７７、９２０、８６０、８３１、７９８、７８２、７４２、７１８、６７９、６６３ｃｍ−１。
２８については、２，２’，２’’−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（２７）の記載された合成と同様の合成手順を用いた。凍結乾燥後、純粋生成物２８をピンク色綿状固体として得た（９０ｍｇ、収率７８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．６５（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、９．０６（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．９３（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．６１（ｔ、２Ｈ、ＡｒＨ）、８．４４（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１６（ｔ、２Ｈ、ＡｒＨ、ＮＨ）、７．７３（ｄｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、３．５１（ｂｒ ｓ、６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２８（ｂｒ ｓ、２Ｈ、ＮＣＨ２ＣＯＮＨ）、３．０６（ｑ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、３．３４−３．２３（ｂｒｍ、１６Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、２．４３（ｔ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２）、１．６４（ｍ、２Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、１．３８−１．２２（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２）ｐｐｍ。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１７３．０、１７１．０（ｂｒ）、１６９．１（ｂｒ）、１６３．５、１６３．２、１５１．０、１５０．６、１４４．２、１４１．７、１３９．１、１３８．２、１２７．０、１２６．５、１２５．３、１２４．６、５７．３（ｂｒ）、５５．２（ｂｒ）、５０．７、３９．０、３６．８、２９．５、２９．４、２９．３、２９．１９、２９．１７、２９．１、２６．９、２５．３ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ計算値Ｃ３９Ｈ５７Ｎ１２Ｏ８ ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：８２１．４４；実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋８４３．５８、［Ｍ＋Ｈ］＋８２１．５８、［Ｍ＋２Ｈ］２＋４１１．４２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋２７４．６７。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝３２６１、３０６７、２９２５、２８５１、１６３３、１５８３、１５４１、１４５８、１４３３、１３９４、１３２４、１２９８、１２７０、１２４９、１２２８、１２００、１１６５、１１２８、１０８８、１０５９、１０１６、９９１、９２０、８８５、８６０、８３２、７９８、７８２、７６４、７４２、７１９、６８７、６６１ｃｍ−１。
ＤＯＴＡ−テトラジンアクチベータ２９
上記テトラジン２９はＲｏｂｉｌｌａｒｄｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１２２，３４４７−３４５０において詳細に記載されている（）。これはまた、本発明のアクチベータとして使用され得る構造の一例である。１，２，４，５−テトラジン部分の２−ピリジル基の１つのアミド官能基は電気供与基であり、又両方のピリジン基は電子吸引性であると考えられている。テトラジンは従ってやや電子不足とみられる。
アクチベータ２９は好適な好ましい薬理的性質を示す：２９は、ＰＢＳ溶液中でかなり安定であり、２時間以内ではほとんど分解されず、一晩インキュベーション後でもなおほとんど変化しない；マウスでは血液除去（クリアランス）半減期が１０分である；マウスでの部分分布容量（Ｖｄ）は、細胞内に有意に進入しないことから全細胞外水コンパートメントに対応する。アクチベータ２９は、ＤＯＴＡリガンドを含み、かかるリガンドは、種々のイメージングモダリティ（例えばＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ）で有用である。従って、アクチベータ２９は、薬物放出に好適であるのみならず、同時にイメージング目的でも使用され得る。事実、アクチベータ２９は、１１１Ｉｎ３＋と錯体化後、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングプローブとして使用されてきた。さらに詳細については、Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１２２，３４４７−３４５０を参照のこと。
留意すべきことは、アクチベータ２７から２９に含まれるアミノ−１，２，４，５−テトラジン部分は、糖、ＰＥＧ、ポリマー、ペプチド（ＲＧＤ又はｃ−ＲＧＤなど）、タンパク質、蛍光分子又は色素分子などの一連の追加官能基と共役するために使用され得る、ということである。
実施例２
（Ｅ）−シクロオクテンモデルプロドラッグ類の合成及びプロドラッグ類
（Ｅ）−シクロオクテン−２−オール（３１）、（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）、及び（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバマート（３３）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール（３１）の合成
（Ｚ）−シクロオクタ−２−エノール３０（２．３６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）及びメチルベンゾエート（１．８ｍＬ、１．９４ｇ、１４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）のジエチルエーテル／ヘプタン１：２（５００ｍＬ）溶液を３２時間照射し、一方でそれをシリカ／硝酸銀１０：１（４１ｇ）、シリカ（０．５ｃｍ）及び砂(sand)（０．５ｃｍ）を充填したカラムを通じて連続的に導入した(lead)。カラムは、照射の間暗所に置かれた。カラムはジクロロメタン（２５０ｍＬ）で未反応出発物質を溶出した。シリカを、ジクロロメタン／１２．５％水性アンモニア１：１（３ｘ１００ｍＬ）と共に撹拌した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空乾燥して粗生成物３１を灰色油状物として得た。油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、溶離液ペンタン／ジエチルエーテル１０％から５０％）で精製して（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（メジャー（ｍａｊｏｒ）異性体、第２画分、４４０ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ、２４．９％）を無色油状物として、及び（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（マイナー（ｍｉｎｏｒ）異性体、第１画分、３２５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ、１８．４％）を無色油状物として得た。メジャージアステレオマーは、Ｇ．Ｈ．Ｗｈｉｔｈａｍ、Ｍ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９７１、８８３により、異なる経路で製造された（１ＲＳ，２ＲＳ）−トランス−シクロオクタ−２−エン−１−オールと同一である。マイナー(minor)ジアステレオマーは、Ｇ．Ｈ．Ｗｈｉｔｈａｍ、Ｍ．Ｗｒｉｇｈｔ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９７１、８８６により、異なる経路で製造された（１ＳＲ，２ＲＳ）−トランス−シクロオクタ−２−エン−１−オールと同一である。
マイナー異性体： １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７１−０．８２（ｍ、１Ｈ）、１．０５−１．１７（ｍ、１Ｈ）、１．４３−１．７２（ｍ、４Ｈ）、１．８０−２．０９（ｍ、４Ｈ）、２．４５−２．５２（ｍ、１Ｈ）、４．６１（ｓ、１Ｈ）、５．５４−５．６１（ｍ、１Ｈ）、５．９０−６．００（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２３．３５、２９．４２、３６．０８、３６．２７、４３．４０、７１．４０、１３０．７８、１３５．３９ｐｐｍ。
メジャー異性体：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．６４−０．９０（ｍ、２Ｈ）、１．３１−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．６６−１．９５（ｍ、４Ｈ）、２．０６−２．１４（ｍ、１Ｈ）、２．２２−２．３７（ｍ、１Ｈ）、２．７８（ｂｒ、１Ｈ）、４．１５−４．２３（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）ｐｐｍ．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２７．８３、２９．２８、３０．５２、３５．５８、３６．０５、４４．４８、１３１．８６、１３６．００ｐｐｍ。
留意： Ｗｈｉｔｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６を参照すると、当該文献は、トランス−シクロ−オクタ−２−エン−オールの、（１ＲＳ，２ＲＳ）及び（１ＳＲ，２ＲＳ）とそれぞれ同定される、エクアトリアル及びアキシアル異性体の合成及び性質を記載する。これらの異性体において、ＯＨ置換基は、エクアトリアル位又はアキシアル位のいずれかである。上記メジャー(major)及びマイナー(minor)異性体は、それぞれエクアトリアル及びアキシアル異性体を意味する。以下の実施例を通じて、メジャー／エクアトリアル及びマイナー／アキシアルは、トランス−シクロ−オクタ−２−エン−オール誘導体について相互に交換可能に使用され、及びこの特徴は、親化合物トランス−シクロオクタ−２−エノールの前記特徴に基づくものである。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（メジャー異性体）（３２）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（メジャー異性体１００ｍｇ、０．７９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６ｍＬ）溶液に、ベンジルイソシアネート（１０１μＬ、１１０ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ、１．０４当量）及び１滴のトリエチルアミンを添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を室温で窒素雰囲気下一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて主に出発材料を得た。ベンジルイソシアネート（２００μＬ、２２０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、２．０８当量）、及びジクロロメタン（６ｍＬ）中一滴のトリエチルアミンを添加し、溶液を室温で一晩撹拌し、５０℃で１時間、及び２５から３５℃で週末の間撹拌した。揮発物をバルブ−バルブ(bulb-to-bulb)蒸留（５０℃、２時間）で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、カーバメート３２（１０１ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、４９．２％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．８１−０．８６（ｍ、２Ｈ）、１．３５−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．８２−１．９９（ｍ、４Ｈ）、２．２１−２．３０（ｍ、１Ｈ）、２．３８−２．４７（ｍ、１Ｈ）、４．３６（ｄ、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．９６（ｂｒ、１Ｈ）、５．０８−５．２０（ｍ、１Ｈ）、５．４８−５．５７（ｍ、１Ｈ）、５．７１−５．８２（ｍ、１Ｈ）、７．２６−７．３６（Ｍ、５Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２７．６９、２９．２５、３５．６８、３５．７６、３５．８３、４１．３２、４４．５３、７８．３３、１００．０２、１２７．６５、１２７．７８、１２８．８６、１３２．０３、１３３．３１、１３８．８８ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（マイナー異性体）（３２）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（マイナー異性体１００ｍｇ、０．７９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６ｍＬ）中溶液にベンジルイソシアネート（１０１μＬ、１１０ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ、１．０４当量）及びトリエチルアミン一滴を添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて主に出発材料を得た。ベンジルイソシアネート（２００μＬ、２２０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、２．０８当量）、及びジクロロメタン（６ｍＬ）中のトリエチルアミン一滴を添加し、溶液を室温で一晩撹拌し、５０℃で１時間、及び２５から３５℃で週末の間撹拌した。揮発物をバルブ−バルブ蒸留（５０℃、２時間）で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、カーバメート３２（４３ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ、２０．９％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７４−０．９３（ｍ、２Ｈ）、１．０１−１．１４（ｍ、１Ｈ）、１．４１−１．５７（ｍ、１Ｈ）、１．６２−１．７６、２Ｈ）、１．８４−２．１２（ｍ、３Ｈ）、２．４６−２．４９（ｍ、１Ｈ）、４．４０（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、５．０５（ｂｒ、１Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、５．５２−５．５９（ｍ、１Ｈ）、５．７９−５．８９（ｍ、１Ｈ）、７．３１−７．３６（ｍ、５Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２４．３４、２９．３３、３６．１３、３６．２０、４０．９７、４５．３０、７４．３３、１２７．６７、１２７．８５、１２８．８７、１３１．７２、１３１．９９、１３８．８７、１５６．１１ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（メジャー異性体）（３３）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（メジャー異性体２６０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１２ｍＬ）中溶液に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中の３，５−ジメチルフェニルイソシアネート（３０５μＬ、３１８ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びトリエチルアミン数滴を添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下、２９℃で四晩にわたり撹拌した。反応混合物を蒸発させ、０．５７ｇのオフホワイトの固体を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、３０ｍＬ、溶出液（eluens）酢酸エチル／ヘプタン５から１０％）により精製して、部分的に精製されたカーバメート３３を得た（９４ｍｇ）。生成物をさらにカラムクロマトグラフィー（シリカ、３０ｍＬ、溶出液酢酸エチル／ヘプタン５％）で精製し、カーバメート３３を白色固体として得た（７２ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ、収率１２．８％、約１０％のＺ−異性体を含む）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７９−０．９８（ｍ、２Ｈ）、１．２８−２．０２（ｍ、４Ｈ）、１．８０−２．０７（ｍ、３Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．４２−２．５０（ｍ、１Ｈ）、５．１３−５．２２（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８７（ｍ、２Ｈ）、６．４９（ｂｒ、１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）、７．０４（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２１．６１、２７．６７、２９．２４、３５．７０、３５．８４、４１．２１、７９．３４、１１６．５９、１２５．２２、１３１．８３、１３３．５１、１３８．１１、１３８．５０、１５３．４３ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（マイナー異性体）（３３）の合成
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（マイナー異性体、Ｚ異性体をも含む、２６０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１２ｍＬ）溶液中に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中の３，５−ジメチルフェニルイソシアネート（３０５μＬ、３１８ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．０５当量）と数滴のトリエチルアミンを添加した。フラスコをアルミニウムホイルでカバーし、溶液を窒素雰囲気下、３０℃で２晩撹拌し、５０℃で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて０．５４ｇの黄色固体を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、４０ｍＬ溶出液酢酸エチル／ヘプタン５％）で精製し、部分的に精製されたカーバメート３３を得た（２０ｍｇ）。生成物をさらに真空中（０．０８ミリバール）、４０℃で３時間及び室温で一晩精製して、カーバメート３３（１１ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、２．０％）を淡黄色半固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ＝０．７８−０．９０（ｍ、１Ｈ）、１．０７−２．１８（ｍ、８Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．４５−２．５３（ｍ、１Ｈ）、５．４２（ｓ、１Ｈ）、５．５６−５．６２（ｍ、１Ｈ）、５．８３−５．９４（ｍ、１Ｈ）、６．６０（ｓ、１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）、７．０３（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ＝２１．６４、２４．４２、２９．４３、３６．７７、４０．１９、７４．４６、１１６．４７、１１８．７７、１２５．３５、１３１．３４、１３２．３１、１３８．００、１３８．９１ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボナート（３４）の合成
マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（３０４ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）の１５ｍＬジクロロメタン溶液を、氷冷した。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１．１６ｇ、９．５０ｍｍｏｌ）を添加し、次に４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．９０ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を一晩撹拌し、次にこれを２０ｇシリカカラム上に注いだ。ジクロロメタンで溶出し、次に５％ＴＢＭＥを含有するジクロロメタンで溶出した。生成物画分を合わせてロータリーエバポレーターで蒸発させて、マイナー３４を固化油状物として得た（３３８ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、４８％）。
同様に、１０ｍＬジクロロメタン中のメジャー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エノール３１（２５９ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）から、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１．１１ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）及び４−ニトロフェニルクロロホーメート（０．８５ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）を用いて、メジャー−３４を固化油状物として得た（２３４ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、３９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ、マイナー３４（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９（ｍ、１Ｈ）、１．２５（ｍ、１Ｈ）、１．５−２．２（ｍ、６Ｈ）、２．２５（ｄｄ、１Ｈ）、２．６（ｍ、１Ｈ）、５．４５（ｓ、１Ｈ）、５．６（ｄｄ、１Ｈ）、６．０（ｍ、１Ｈ）、７．４（ｄ、２Ｈ）、８．３（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２４．０、２９．０、３６．０、３６．０、４０．６（全てＣＨ２）、７９．０、１２２．０、１２５．８、１２９．８、１３３．２（全てＣＨ）、１４５．４、１５１．８、１５６．０（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、メジャー３４（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．０（ｍ、２Ｈ）、１．４−２．１（ｍ、６Ｈ）、２．３５（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、５．２（ｍ、１Ｈ）、５．６５（ｍ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、７．４（ｄ、２Ｈ）、８．３（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２７．８、２９．０、３５．８、３６．０、４０．４（全てＣＨ２）、８３．０、１２１．８、１２５．０、１３０．４、１３４．４（全てＣＨ）、１４５．８、１５２．０、１５６．０（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）カーバメート（３５）の合成
マイナーアルコール３１（１３６ｍｇ、０．４６７ｍｍｏｌ）から誘導されるＰＮＰ−誘導体３４は７．５ｇＴＨＦ中に溶解された。ジイソプロピルエチルアミン（１８２ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２４ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）及び４−アミノベンジルアルコール（９４ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所で約３０℃で６日間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を２０ｇのシリカ上でクロマトグラフィーした（溶出液として、ＴＢＭＥを徐々に増量しながらジクロロメタンを使用する）。生成物を約５％ＴＢＭＥで溶出した。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、生成物マイナー３５を粘性油状物として残した（１１２ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ、８７％）。
同様に、６．０ｇＴＨＦ中のメジャーアルコール３１（１４５ｍｇ、０．４９８ｍｍｏｌ）から誘導されたＰＮＰ−誘導体３４を、ジイソプロピルエチルアミン（２１０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３４ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）及び４−アミノベンジルアルコール（１２８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）と３日間約３０℃で反応させた。ロータリーエバポレーターで蒸発させ、クロマトグラフィーにより、生成物メジャー３５を粘性油状物として得た（１１０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、８０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ、マイナー３５（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．４５（ｍ、１Ｈ）、１．６−２．２（ｍ、６Ｈ）、２．４（ｍ、１Ｈ）、４．６（ｓ、２Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、７．１５（ｂｓ、１Ｈ）、７．２−７．４（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２４．２、２９．０、３６．０、３６．０、４１．０、６５．０（全てＣＨ２）、７５．０、１１９．０、１２８．０、１３１．０、１３２．６（全てＣＨ）、１３６．０、１３８．０、１５３．６（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、メジャー３５（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．０（ｍ、２Ｈ）、１．４−２．１（ｍ、６Ｈ）、２．３（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、４．６５（ｓ、２Ｈ）、５．２（ｍ、１Ｈ）、５．６（ｍ、１Ｈ）、５．８（ｍ、１Ｈ）、６．６（ｂｓ、１Ｈ）、７．４５−７．６５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２７．４、２９．２、３５．８、３６．０、４１．２、６５．０（全てＣＨ２）、７９．８、１１９．０、１２８．２、１３２．０、１３４．０（全てＣＨ）、１３６．０、１３７．８、１５３．６（Ｃ及びＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
マイナー（Ｅ）−エチル ２−（４−（（（シクロクオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−２−（（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）オキシ）アセテート（３７）の合成
マイナーアルコール３１（３００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）から誘導されるＰＮＰ−３誘導体３４を１０．３ｇのＴＨＦに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（３６２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を添加し、次に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７５ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）とエチル２−（４−アミノフェニル）−２−ヒドロキシアセテート（３２５ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、国際公開第２００９１０９９９８号に記載されるように製造した）を添加した。混合物を暗所で３０℃で６日間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を２１ｇのシリカ上で、溶出液としてＴＢＭＥを徐々に増量しならジクロロメタンを使用してクロマトグラフィーした。生成物は約５％ＴＢＭＥで溶出された。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、マイナー（Ｅ）−エチル２−（４−（（（シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボノニル）アミノ）フェニル）−２−ヒドロキシアセテート（３６）を粘性油状物として得た（３５０ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ、９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．２（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．２（ｍ、７Ｈ）、２．５（ｍ、１Ｈ）、４．１−４．３（２ｑ、２Ｈ）、５．１（ｓ、１Ｈ）、５．４５（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、６．７（ｂｓ、１Ｈ）、７．３−７．４５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ。
上で得られた生成物３６（８０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を４．１ｇのアセトニトリルに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（２１５ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加し、次にＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（２１７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２日間約３０℃で撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を１６ｇのシリカ上で、溶出液として、ＴＢＭＥを徐々に増量しながらジクロロメタンを使用してクロマトグラフィーを行った。生成物は約２０％ＴＭＢＥで溶出した。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて、生成物マイナー（Ｅ）−エチル２−（４−（（（シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−２−（（（（２，５−ジオキシピロロジン−１−イル）オキシ）カルボニル）オキシ）アセテート（３７）を粘性油状物として得た（６０ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、５３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１（ｍ、１Ｈ）、１．２（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．２（ｍ、７Ｈ）、２．５（ｍ、１Ｈ）、２．６（ｓ、４Ｈ）、４．１５−４．３（２ｑ、２Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、５．８（ｓ）及び５．８５（ｍ）（２Ｈ）、６．７（ｂｓ、１Ｈ）、７．３５−７．５（ＡＢ、４Ｈ）ｐｐｍ。
（Ｅ）−シクロオクテンドキソルビシンプロドラッグ（３８）の合成
マイナーアルコール３１（２０ｍｇ、０．０６８７ｍｍｏｌ）から誘導されるＰＮＰ−誘導体３４を３．０ｇのＤＭＦに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を添加し、次にドキソルビシン塩酸塩（４５ｍｇ、０．０７７６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所で約３０℃で３日間撹拌した。溶媒を高真空下蒸発させ、残渣を１７ｇのシリカ上で、溶出液として、メタノールを徐々に増量しながらジクロロメタンを使用してクロマトグラフィーを行った。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させて得られた残渣を、５ｍＬ ＴＭＢＥとともに撹拌した。１５ｍＬヘプタンの添加及び濾過後、マイナー３８を得た（２７ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、５０％）。ろ液には追加量の生成物が含まれていた。
同様に、７．２ｇのＤＭＦ中のメジャーアルコール３１（２２ｍｇ、０．０７５６ｍｍｏｌ）から誘導されるＰＮＰ−誘導体３４から、ジイソプロピルエチルアミン（８０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びドキソルビシン塩酸塩（４７．７ｍｇ、０．０８２２ｍｍｏｌ）との反応後、高真空下での溶媒の除去、クロマトグラフィー、及びＴＢＭＥ／ヘプタン処理が続き、メジャー−３８が得られた（２１ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、３０％）。ろ液には追加量の生成物が含まれていた。
１Ｈ−ＮＭＲ、マイナー３８（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．７−２．０（ｍ）及び１．３５（ｄ）（１８Ｈ）、２．２（ｍ、２Ｈ）、２．４（ｍ、２Ｈ）、３．０−３．４（ｄｄ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、１Ｈ）、３．９（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ＋ｍ、４Ｈ）、４．８（ｓ、１Ｈ）、５．０５（ｍ、１Ｈ）、５．２−５．８５（ｍ、２Ｈ）、７．４（ｄ、１Ｈ）、７．８（ｔ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、１Ｈ）ｐｐｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ、メジャー３８（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．７−２．０（ｍ）ａｎｄ１．３５（ｄ）（１８Ｈ）、２．２（ｍ、２Ｈ）、２．４（ｍ、２Ｈ）、３．０−３．４（ｄｄ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、１Ｈ）、３．９（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ＋ｍ、４Ｈ）、４．８（ｓ、１Ｈ）、５．０（ｍ、１Ｈ）、５．３−５．８（ｍ、２Ｈ）、７．４（ｄ、１Ｈ）、７．８（ｔ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、１Ｈ）ｐｐｍ。 ＭＳ：６９４．３（Ｍ−１）。
（Ｅ）−シクロオクテン−ドキソルビシンプロドラッグ４６の合成
ｎ−ブチルリチウム（９７ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｎ、０．２４２ｍｏｌ）を１００ｍＬ中のジイソプロピルアミン（２３．６６ｇ、０．２３４ｍｏｌ）に−２０℃より低い温度で加えた。溶液を冷却し、６０ｍＬ ＴＨＦ中に溶解したシクロオクタ−２−エノン（３９、２３．０７ｇ、０．１８５ｍｏｌ）を、２０分かけて、−６５℃から−８０℃で添加した。その後、溶液を１時間−６７℃から−７２℃で撹拌した。４０ｍＬのＴＨＦに溶解したエチルブロモアセテート（４５．４ｇ、０．２７２ｍｏｌ）を、２５分かけて−６３℃から−７５℃で添加した。得られた混合物を３時間−５５℃から−７０℃で撹拌した。ヘプタン（５０ｍＬ）を−６０℃で添加し、次に１００ｍＬの（冷却しながら）水中の４０ｇの塩化アンモニウム溶液を添加し、温度を−７０℃から−３０℃へ上昇させた。冷却浴を外し、混合物をさらに３０分間撹拌し、それにより温度を−１５℃に上げた。混合物を２００ｍＬのＴＢＭＥ及び５０ｍＬの水中に注ぎ入れ、層分離させ、有機層を５０ｍＬの水で洗浄した。連続した水性層を２５０ｍＬ ＴＢＭＥで抽出した。有機層を乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。過剰のエチルブロモアセテートを高真空下、クーゲルロール装置内で温めることにより除去した。（Ｚ）−エチル２−（２−オキソシクロオクタ−３−エン−１−イル）アセテート（４０）を含む残渣は、そのまま次のステップにおいて使用された。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２５（ｔ、３Ｈ）、１．４−２．６（ｍ、９Ｈ）、２．９（２ｄ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、１Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、６．０５−６．５（ｍ、２Ｈ）ｐｐｍ。
１８０ｍＬのＴＨＦと２０ｍＬのメタノールとの混合物中の粗製エステル４０の溶液を氷冷した。リンタングステン酸（２５０ｍｇ）を添加し、次に温度７℃未満でナトリウムボロヒドリド（４．０ｇ、０．１０５ｍｏｌ）を少しずつ３０分間にわたり添加した。混合物を氷冷下で９０分間撹拌し、次に２５０ｍＬ水及び２５０ｍＬトルエンを添加した。層を分離し、有機層を５０ｍＬ水で洗浄した。連続した水性層を２５０ｍＬトルエンで抽出した。有機層を乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。粗製４１は十分区別できる画分を生成せず、従って全ての物質を一緒にして、２００ｍＬエタノール中の２５ｍＬの５０％水酸化ナトリウムで（さらに２５ｍＬ水を処理中に添加した）、２時間還流することで加水分解した。エタノールの大部分をロータリーエバポレーターで除去した。水を適量残渣に加えた。混合物を２ｘ２００ｍＬのトルエンで抽出した。有機層を５０ｍＬの水で洗浄した。トルエン（２００ｍＬ）を、濃塩酸で酸性化した合わせた水性層に加えた。層を分離し、有機層を２０ｍＬの水で洗浄した。２００ｍＬのトルエンで連続した水性層を抽出した。２つの有機層を乾燥してロータリーエバポレーターで蒸発させた。クーゲルロール蒸留でラクトン４２を２つの異性体の約２：１比の混合物として得た（７．３３ｇ、４４．１ｍｍｏｌ、シクロオクタ−２−エノンに基づき２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．６−２．８（ｍ、１Ｈ）、４．９５（ｍ、０．３５Ｈ）、５．３５（ｍ、０．６５Ｈ）、５．６（ｍ、１Ｈ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ． １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２４．１、２５．２、２７．０、２８．０、２９．２、２９．６、３４．４、３６．８（全てＣＨ２）、４３．５、４７．２、８０．８、８１．９（全てＣＨ）、１２６．４、１２９．６、１３０．２、１３４．２（全てＣＨ）、１７６．４（Ｃ＝Ｏ）、１７７．０（Ｃ＝Ｏ）ｐｐｍ。
前記得られたラクトン４２（７．３３ｇ、４４．１ｍｍｏｌ）を、１０．０ｇのメチルベンゾエート及び約５００ｍＬのヘプタン／エーテル（約４：１）と混合した。混合物を３６時間照射し、その間溶液は連続的に、６９ｇの硝酸銀を含浸させたシリカカラム（約６．９ｇ硝酸銀を含む）を通じてフラッシュされた(flushed)。カラム材料は次に比率３：１、２：１、１：１、１：２のそれぞれ(portions)２５０ｍＬのヘプタン／ＴＢＭＥで、次に４００ｍＬ ＴＢＭＥでフラッシュされた。最初の２つの画分はメチルベンゾエートのみを含んでいた。最後の３画分は２００ｍＬの１０％アンモニウムで洗浄され、乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。高真空下でほとんどのメチルベンゾエートを除去した後、合わせた残渣は８００ｍｇ（Ｚ及びＥ異性体の混合物、並びにメチルベンゾエート）と秤量された。残存するカラム材料をＴＢＭＥとアンモニウムと共に撹拌し、次にろ過し、相分離させた。固体を２回以上水性層及びＴＢＭＥで処理し、次にろ過し、層分離させた。有機層を乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、３．７０ｇの４３を約４：１の異性体混合物として得た（それぞれの異性体はおそらく２つのＥ−異性体からなる）（２２．２９ｍｍｏｌ、５１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７５（ｍ、１０．６Ｈ）、３．０（ｍ、０．４Ｈ）、４．４５（ｔ、０．２Ｈ）、５．０（ｍ、０．８Ｈ）、５．６（ｄｄ、０．５Ｈ）、５．６５（ｍ、０．５Ｈ）、５．８（ｍ、０．５Ｈ）、６．０５（ｍ、０．５Ｈ）ｐｐｍ。
回収されたメジャー異性体（以下の実験を参照）は次のデータを持つ：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７５（ｍ、１０．６Ｈ）、３．０（ｍ、０．４Ｈ）、ｔ、０．２Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、５．６（ｄｄ、０．８Ｈ）、５．６５（ｍ、０．３Ｈ）、５．８（ｍ、０．３Ｈ）、６．０５（ｍ、０．６Ｈ）ｐｐｍ。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２１．６、２５．８、３０．０、３０．４、３３．０、３４．８、３５．４、３６．０、３８．０（全てＣＨ２）、４６．０、４７．０、８０．８、８４．０（全てＣＨ）、１２８．２、１３１．４、１３３．０、１３４．０（全てＣＨ）、１７７．２（Ｃ＝Ｏ）、１７７．４（Ｃ＝Ｏ）ｐｐｍ。シグナル比率は約２：１異性体比であった。
ジイソプロピルエチルアミン（５．９１ｇ、４５．８ｍｍｏｌ）をラクトン４３（８６５ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ）の１５ｍＬジクロロメタン溶液に添加し、次にベータアラニンエチルエステル塩酸塩（１．３８ｇ、８．９８ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１６日間室温で撹拌し、次に５５℃でロータリーエバポレーターにかけた。残渣を５０ｇのシリカ上で、ジクロロメタンを溶出液として用いてクロマトグラフィーを行った。これにより出発物ラクトン４３を得た（メジャーＥ−異性体、Ｃ−ＮＭＲで明らかに２つの異性体の混合物であった）。メタノールを増量しながら含有するジクロロメタンを用いるさらなる溶出でアミド４４を得た。生成物は７５ｍＬ ＴＢＭＥ内に取り出され、２５ｍＬ水中の５ｇのクエン酸で、及び２ｘ１０ｍＬ水を用いて洗浄した。５０ｍＬのＴＢＭＥを用いて連続した水性層を抽出した。合わせた有機層を乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、異性体混合物からなるアミド４４を得た（３６０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．７（ｍ）、１．２５（ｔ）、２．４５（ｔ）（１６Ｈ）、３．５（ｑ、２Ｈ）、３．９（ｔ、０．５Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、４．３５（ｍ、０．５Ｈ）、５．５−５．９（ｍ、２Ｈ）、６．２−６．５（２ｂｔ、１Ｈ）ｐｐｍ。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（１組の異性体を多量に含む画分のシグナル）：δ＝１４．３（ＣＨ３）、２２．４、２７．８、２９．９、３３．０、３４．０、３４．１、３４．２、３４．５、３５．３、３５．３、３５．５、３５．７、３６．１、３６．２、４１．７（全てＣＨ２）、４６．２（ＣＨ）、５１．６（ＣＨ）、６０．９（ＣＨ２）、７７．１、８０．２、１３１．２、１３１．７、１３４．２、１３５．６（全てＣＨ）、１７２．７、１７３．９、１７５．１（全てＣ＝Ｏ）ｐｐｍ。
アミド４４（１１５ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ、主に１組の異性体）を４．４ｇのアセトニトリルに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（３７０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、次にＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３５５ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を２日間約３０℃で撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を１６ｇのシリカ上で、溶出液として徐々にＴＢＭＥを増量しながらジクロロメタンを用いてクロマトグラフィーにかけた。生成物は約２０％のＴＢＭＥで溶出された。生成物画分のロータリーエバポレーター蒸発により、粘性油状物としてＮＨＳカーボネート４５を得た（１５０ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ、８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．６（ｍ）、１．２５（ｔ）、２．５５（ｔ）（１６Ｈ）、２．８５（ｑ、４Ｈ）、３．５（ｑ、２Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、４．９５（ｔ、０．８Ｈ）、５．２（ｄｄ、０．２Ｈ）、５．５５−６．０（ｍ、２Ｈ）、６．４（ｂｔ、１Ｈ）ｐｐｍ。
前記得られたＮＨＳ−カーボネート４５（１５０ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）を７．５６ｇのＤＭＦに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１３２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を添加し、次にオキソルビシン塩酸塩（６６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で暗所で３時間撹拌した。溶媒を高真空下除去し、残渣を１３ｇのシリカ上で、溶出液として徐々にメタノールを増量しながらジクロロメタンを用いてクロマトグラフィーにかけた。生成物画分のロータリーエバポレーター蒸発により、１１２ｍｇのプロドラッグ４６が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、関連するシグナルのみ与えられている）：δ＝１．２５（ｔ）、３．２（ｍ）、３．５（ｍ）、４．０５（ｓ）、４．１５（ｑ）、４．８（ｓ）、５．２−５．８（ｍ）、６．１５（ｍ）、６．２５（ｍ）、７．４（ｄ）、７．８（ｔ）、８．０（ｄ）ｐｐｍ。
場合によりプロドラッグ４６は、エステル官能基をカルボン酸に変換させることで抗体へ共役させることが可能となり、これを次いでリジン共役のためにＮＨＳエステルに変換させ得る。
マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（４７）の合成
Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３７２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を、マイナーアルコール３１（７７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、３．３３ｇアセトニトリル及びジイソプロピルエチルアミン（４１０ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）の撹拌された混合物へ添加した。混合物を２５℃で３日間撹拌し、２日後追加の１２０ｍｇのＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートを添加した。溶液を１５ｇのシリカ上で、溶出液としてジクロロメタン、及び次いで少量のＴＢＭＥを含むジクロロメタンを用いてクロマトグラフィーにかけた。生成物画分をロータリーエバポレーターで蒸発させ、生成物４７を固体として得た（６２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、３８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８（ｍ、１Ｈ）、１．１５（ｍ、１Ｈ）、１．４５−２．１５（ｍ、６Ｈ）、２．２（ｄｄ、１Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、５．４（ｓ、１Ｈ）、５．５（ｄ、１Ｈ）、６．０（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ。
実施例３
テトラジンアクチベータの安定性と反応性
テトラジンの加水分解安定性試験
特定のテトラジンのＤＭＳＯ（２５ｍＭ）溶液の１０μＬを、ＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）（又は、水可溶性が小さい場合にはＰＢＳとアセトニトリルとの混合物）で希釈した。この溶液をろ過し、５２５ｎｍにおける吸収バンドの減少を、ＵＶスペクトル法を用いてモニターした。加水分解速度及び半減期をこれらのデータから決定した。
トランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシアル異性体）へのテトラジンの反応性
競争実験を実施して、特定のテトラジンと、３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（５）（これは対照標準テトラジンとして選択された）との反応性比率を、トランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシアル位にＯＨを持つ「マイナー」異性体：ＷｈｉｔｈａｍらのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、１９７１、８８３−８９６を参照）との逆電子要求ディールスアルダー反応において決定した。
アセトニトリル（０．１００ｍＬ）に、ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）中の特定のテトラジンの溶液の５μＬ及びＤＭＳＯ（２５ｍＬ）中の対照標準テトラジンの溶液の５μＬを添加した。この混合物を水（０．９ｍＬ）で希釈し、両方のテトラジンの絶対量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定した。続いて、ＤＭＳＯ中のトランス−シクロオクタ−４−エン−オール（アキシアル異性体）の溶液（２５μＬ、２．５ｍＭ）をゆっくりと添加し、次に混合物を５分間撹拌させた。再び、両方のテトラジンの絶対量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析により決定し、両方のテトラジンについて変換を計算した。これらの変換から、両方のテトラジンの反応性比率（Ｒ＝ｋ２、ＴＣＯ／ｋ２、Ｒｅｆ）が、Ｉｎｇｏｌｄ及びＳｈａｗ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９２７、２９１８−２９２６）からの数学手順を用いて計算された。
以下の表は、テトラジンの反応性と安定性プロフィールは、置換基を変更することで、特定の仕様に調節することができることを示す。
実施例４
トランス−シクロオクテンモデルプロドラッグ及びプロドラッグの安定性と反応性
安定性
特定のトランス−シクロオクテン誘導体のジオキサン（２５ｍＭ）溶液１０μＬを、ＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）で希釈し、及びこの溶液を暗所、２０℃で保存した。ＴＣＯ化合物の運命をＨＰＬＣ−ＭＳ分析でモニターし、半減期を推定した。
トランス−シクロオクテン誘導体のビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンへの反応性：二次反応速度定数決定
２０℃のアセトニトリル内で行ったトランス−シクロオクテン誘導体と３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（５）との、逆電子要求ディールスアルダー反応の反応速度(kinetics)をＵＶ−可視スペクトロスコピーを用いて決定した。キュベットをアセトニトリル（３ｍＬ）で満たし２０℃で平衡した。３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（５、２．５０´１０−７ｍｏｌ）を添加し、次にトランス−シクロオクテン誘導体（２．５０´１０−７ｍｏｌ）を添加した。λ＝５４０ｎｍでの吸収減衰をモニターし、この曲線から二次反応速度定数ｋ２を、二次反応速度動態(kinetics)と仮定して決定した。
トランス−シクロオクテン誘導体のビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンへの反応性： 競争実験
競争実験を、特定のトランス−シクロオクテン誘導体及びトランス−シクロオクタ−４−エン−１−オール（アキシアル異性体）（これは対照標準トランス−シクロオクテンとして選択された）と、３，６−ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（２）との逆電子要求ディールスアルダー反応の反応性比率を決定するために実行された。
アセトニトリル（０．０５ｍＬ）に、ジオキサン中の特定のトランス−シクロオクテン誘導体溶液（５μＬ、２５ｍＭ；１．２５ｘ１０−７ｍｏｌ）、及びジオキサン中の対照標準トランス−シクロオクテン溶液（５μＬ、２５ｍＭ；１．２５ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。この混合物を水（０．４５ｍＬ）で希釈した。次に、３，６−ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（２、６．２５ｘ１０−８ｍｏｌ）のアセトニトリル（０．０５ｍＬ）と水（０．４５ｍＬ）との混合物中の溶液を激しく撹拌しながらゆっくりと添加した。添加後、混合物をさらに５分間撹拌した。両方のトランス−シクロオクテン誘導体の変換を、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定し、これらの変換から、特定のトランス−シクロオクテン誘導体の反応性比率（Ｒ＝ｋ２、ＴＣＯ／ｋ２、Ｒｅｆ）を、Ｉｎｇｏｌｄ及びＳｈａｗ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９２７、２９１８−２９２６）による数学的手順を用いて計算した。
実施例５
モデルプロドラッグの活性化（アクティベーション）
この実施例は、１，２，４，５−テトラジンとモデルトランス−シクロオクテンプロドラッグとの逆電子要求ディールスアルダー反応、及び続くモデル薬物（例えばベンジルアミン）の脱離反応を示す。
一般的手順：
３，６−ビス（２−ピリジニル）−１，２，４，５−テトラジン（２）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
３，６−ビス（２−ピリジニル）−１，２，４，５−テトラジン（２、５．９１ｘ１０−５ｇ；２．５ｘ１０−７ｍｏｌ）を０．２ｍＬのアセトニトリルに溶解し、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２、アキシアル位にカーバメートを持つ異性体；６．４８ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。５分後、反応混合物を水（０．８ｍＬ）で希釈し、２０℃で２４時間撹拌した。混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は脱離生成物（アミノベンジルカーバメートのないｒＤＡ付加物）の形成をｍ／ｚ＝＋３１７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、ベンジルアミンの放出を示した（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）。
６−メチル−３−（４−ブタンアミド−２−ピリジニル）−１，２，４，５−テトラジン、及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
前記一般的手順に従い、両方の表題化合物を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋３３９Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−フェニル−３−（４−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
前記一般的手順に従い、両方の表題化合物を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離生成物の形成をｍ／ｚ＝＋３３０Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−フェニル−３−（３−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
前記一般的手順に従い、両方の表題化合物を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離生成物の形成をｍ／ｚ＝＋３３０Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
６−Ｈ−３−（４−アミノメチルフェニル）−１，２，４，５−テトラジン及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
前記一般的手順に従い、両方の表題化合物を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離生成物をｍ／ｚ＝＋２６８Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
３，６−ジフェニル−１，２，４，５−テトラジン及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
前記一般的手順に従い、両方の表題化合物を反応させ、ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は脱離生成物の形成をｍ／ｚ＝＋３１５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、ベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：Ｍ＋Ｈ＋）を示した。
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（３．３４ｍｇ；１．２６ｘ１０−５ｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、次にマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２；３．２８ｍｇ；１．２６ｘ１０−５ｍｏｌ）を添加した。５分後、反応混合物をＤ２Ｏ（０．２ｍＬ）で希釈し、次に２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物の１Ｈ−ＮＭＲはベンジルアミン生成を示した：δ＝３．８６ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、ＰｈＣＨ２ＮＨ２）。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成（ｔｒ＝５．４５ｍｉｎ（分）：ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及びベンジルアミン放出（ｔｒ＝０．８８ｍｉｎ：（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３，６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１１）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２）
３，６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１１、６．６５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を０．５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次にマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルベンジルカーバメート（３２；６．４８ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。２分後、反応混合物を水（０．５ｍＬ）で希釈し、２０℃で５時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋３４７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びベンジルアミン放出（ｍ／ｚ＝＋１０８Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９、６．６０ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３ｍＬ）に溶解し、この混合物をＰＢＳ緩衝液で希釈した（０．７ｍＬ）。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３、アキシアル位置にカーバメートを持つ異性体；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成（ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３，５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３，６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１１）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
３，６−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（１１、６．６５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．２ｍＬ）に溶解し、この混合物をＰＢＳ緩衝液で希釈した（０．８ｍＬ）。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成（ｍ／ｚ＝＋３４７Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３，５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３，６−ジフェニル−１，２，４，５−テトラジン及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
３，６−ジフェニル−１，２，４，５−テトラジン（５．８５ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３ｍＬ）に溶解し、この混合物をＰＢＳ緩衝液（０．７ｍＬ）で希釈した。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋３１５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及び３，５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３）
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶解した。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イル（３，５−ジメチルフェニル）カーバメート（３３；６．８４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−７ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２０時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成（ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋））、及び３，５−ジメチルアニリン放出（ｍ／ｚ＝＋１２２Ｄａ：（Ｍ＋Ｈ＋））を示した。
実施例６
ドキソルブシンプロドラッグの活性化
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−６ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）（ｃ＝２５μＭ）に溶解した。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８、アキシアル位にカーバメートを持つ異性体；１．７４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で４時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びドキソルビシン放出（６９％収率）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）及びλｍａｘ＝４７８ｎｍ）を示した。比較可能な結果を、濃度２．５及び１．０μＭで得た。
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７）及びメジャー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（７、４．３３ｘ１０−６ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶解した（ｃ＝２５μＭ）。次に、メジャー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８、エクアトリアル位にカーバメートを持つ異性体；１．７４ｘ１０−５ｇ；２．５０ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で１６時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、ＤＡ反応の変換率４０％を示し、及び脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋２５４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びドキソルビシン放出（収率２０％）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）及びλｍａｘ＝４７８ｎｍ）を示した。
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９）及びマイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８）
３，６−ビス（２−アミノフェニル）−１，２，４，５−テトラジン（９、２．６４ｘ１０−６ｇ；１．００ｘ１０−８ｍｏｌ）をアセトニトリル（０．１ｍＬ）に溶解した。この混合物をＰＢＳ緩衝液（０．９ｍＬ）で希釈した。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルドキソルビシンカーバメート（３８；６．９６ｘ１０−６ｇ；１．００ｘ１０−８ｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で１８時間撹拌した。この混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、脱離生成物の形成を、ｍ／ｚ＝＋３４５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）により示し、及びドキソルビシン放出（収率９０％）（ｍ／ｚ＝＋５４４Ｄａ（Ｍ＋Ｈ＋）及びλｍａｘ＝４７８ｎｍ）を示した。
実施例７
ドキソルビシンプロドラッグマイナー３８及びテトラジン７との細胞増殖アッセイ
Ａ４３１扁平上皮癌細胞を、ペニシリン及びストレプトマイシン存在下、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び０．０５％グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃で、加湿ＣＯ２（５％）インキュベーター内に維持された。実験を開始する２４時間前に、細胞を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、２５００細胞／ウェル密度で植えた。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）とプロドラッグマイナー３８（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）及びテトラジン７（ＰＢＳ中１０ｍＭ）を、実験開始直前に、予め加温した培地内で連続希釈し、及びウェルに添加した（ウェルあたりの最終容積は２００μＬ）。プロドラッグは、単独で、又は１０μＭもしくは１．５ｍｏｌ当量（プロドラッグに対して）のテトラジン７との組み合わせのいずれかで添加された。３７℃で７２時間インキュベーション後、細胞増殖をＭＴＴアッセイで評価した。即ち、メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬで溶解し、０．２２μｍを通してろ過し、それぞれのウェルに２５μＬを添加した。３７℃で１２０分間インキュベーション後、培地を静かに吸引した。形成されたホルマザン結晶を１００μＬのＤＭＳＯに溶解し、吸収を５６０ｎｍでプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で測定した。ＩＣ５０値（±標準偏差、表参照）を正規化細胞成長曲線（図参照）から誘導した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ５．０１）により生成した）。細胞増殖アッセイは、テトラジン７は毒性ではなく（ＩＣ５０＞１００±μＭ）かつプロドラッグ３８はやや毒性である（ＩＣ５０＝３．０１７±０．４８６μＭ）であるのに対し、これらの２成分の組み合わせはＡ４３１細胞に対してはより高い毒性（テトラジン７の連続希釈を用いるか又は一定量を用いる場合、それぞれについて、０．１３７±０．０１２±μＭ及び０．２７８μ±０．０２２±μＭＩＣ５０）の結果となることを示す。このことは、ドキソルビシンが、プロドラッグのトランス−シクロオクテンとテトラジンとのレトロディールスアルダー反応に続いて放出されることを確認するものである。
Ａ４３１細胞系で決定された、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、テトラジン７による活性化有りのプロドラッグ３８及び無しのプロドラッグ３８、及びテトラジン単独のＩＣ５０値
ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、テトラジン７で活性化されたプロドラッグ３８、活性化されないプロドラッグ３８、及びテトラジン単独の存在下、Ａ４３１腫瘍細胞で実施された細胞増殖アッセイ
実施例８
（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７で変性させた抗体のマスキング、及び続くテトラジンアクチベータとの反応による抗体活性化
マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７と抗体の共役
ＰＢＳ中のＣＣ４９（８ｍｇ／ｍＬ、６２．５μＬ）の溶液を６．２μＬのＤＭＦに加え、ｐＨを９に１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を用いて調節した。次に、マイナー（Ｅ）−シクロオクタ−２−エン−１−イルＮＨＳカーボネート４７を新たに乾燥ＤＭＦに溶解したものを添加し（５μｇ／μＬ、ＣＣ４９について４０ｍｏｌ当量）、得られた溶液を３時間室温で、暗所で静かに振盪しながらインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物をＰＢＳで５００μＬに希釈し、未反応４７を、ＰＢＳで前平衡化させたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａ ＭＷカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）で除去した。得られたｍＡｂ溶液の濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定され、生成物の純度及び完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。共役物収率はテトラジン滴定で決定された。ＤＯＴＡ−テトラジン誘導体２９は、先に記載の通り、キャリア付加１７７Ｌｕを用いて放射性ラベル化された（Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ、２０１０、４９、３３７５−３３７８）。ＴＣＯ−変性ｍＡｂ（２５μｇ）をＰＢＳ中の既知の過剰７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン（５０μＬ）と反応させた。３７℃で１０分間のインキュベーション後、反応混合物に非還元性サンプル緩衝液を添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲル電気泳動後、それぞれのレーンの放射性分布を蛍光イメージャーで評価した。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンとＣＣ４９−ＴＣＯ構成物間の反応収率は、レーンの全放射能に関して放射性ｍＡｂバンドの強度から推測された。この手順で、ＣＣ４９分子あたり平均２０ＴＣＯ部分が見出された（５０％共役収率）。
ＣＣ４９及びＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）放射性ラベル化
未変性ＣＣ４９を、製造者指示書によりＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ手順を用いて１２５Ｉで放射性ラベル化した。簡単にいうと、約４０ＭＢｑの［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウムを５０μＬのＰＢＳで希釈し、ＤＭＳＯ中の１μＬのＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（ＳＨＰＰ、Ｐｉｅｒｃｅ）溶液（０．１μｇ／μＬ）及びＰＢＳ中の２５μＬクロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液を１０から２０秒間混合し、次に５μＬのＤＭＦ及び１００μＬのトルエンを添加した。ボルテックス後、１２５Ｉ−ＳＨＰＰを含む有機相をガラスバイアルに移し、穏やかなＮ２流下、室温で乾燥した。その後、ＰＢＳ（５０μＬ）中の３０μｇＣＣ４９を１２５Ｉ−ＳＨＰＰコーティングガラスバイアルに添加し、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６で、ｐＨを９に調節した。バイアルを、静かに撹拌しながら約６０分間室温でインキュベーションし、次に１２５Ｉ−ｍＡｂラベル化収率を放射性−ＩＴＬＣで評価した（４７％）。粗製１２５Ｉ−ｍＡｂを、生理食塩水で前平衡化させたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａ ＭＷカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）を通して精製し、放射性ＩＴＬＣ及び放射性ＨＰＬＣにより決定される通り、得られた１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９の放射化学純度は９８％を超えていた、。
分子あたり２０ＴＣＯ（４７）部分を担持するＣＣ４９は、既に記載されたようにキャリア非添加１７７Ｌｕで先に放射性ラベル化されたＤＯＴＡ−テトラジン２９（ｍＡｂに対して１モル当量）と反応させた（Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ、２０１０、４９、３３７５−３３７８）。１０分間のインキュベーション後、放射性ＨＰＬＣによる１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）については９１％放射化学純度であり、反応混合物をさらに精製することなく使用した。
抗体活性化実験
この実施例では、ＴＣＯ４７でＣＣ４９を過剰変性することで、ｍＡｂの標的への結合能力が大きく減少し得ること、及び過剰に変性されたＣＣ４９−ＴＣＯ構成物をテトラジン７と反応させることで、標的結合可能性が回復されることを示す。テトラジンとの反応によりｍＡｂの再活性化は、電子カスケード介在脱離機構の結果生じるＴＣＯ放出を示す。
標的へのＣＣ４９構成物の結合可能性は、既に記載された方法を修正した免疫反応活性アッセイを用いて評価された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００６、１７、４８５−４９２）。簡単にいうと、放射性ラベル化ｍＡｂ構成物（１μｇ）を、１％ＢＳＡ溶液中（１００μＬ）の２０倍モル過剰のウシ顎下ムチンタイプＩ−Ｓ（ＢＳＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させた。３７℃での１０分間のインキュベーション後、混合物を、０．３５ｍＬ／分でＰＢＳで溶出されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、放射性ＨＰＬＣにより分析した。これらの条件で、カラムから溶出された非ＴＣＯ−変性１２５Ｉ−ＣＣ４９は、３９分保持時間を持つ広いピークにある（図１Ａ）。予想されるように、ＢＳＭとのインキュベーション後、１２５Ｉ活性が、カラムから、より高分子量の（ＭＷ）化学種（２５分保持時間）に対応する１つのピークで溶出され、これは１２５Ｉ−ＣＣ４９がＢＳＭに結合したことを確認する（１００％免疫反応活性、図１Ｂ）。
分子あたり２０個のＴＣＯ４７部分を担持する１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９が放射性ＨＰＬＣで分析された場合、カラムからｍＡｂが、保持時間３１分と３６分の２つのブロードな分離されていない(unresolved)ピークにおいて溶出され、これらピークはそれぞれ全ｍＡｂに関連した活性の４３％及び５７％を占める（図２Ａ）。この挙動は、ＴＣＯ基でのＣＣ４９過剰変性を示唆する。事実、共役後ＭＷ変化は比較的小さく、ＣＣ４９とＣＣ４９−ＴＣＯとの間で保持時間（３９分から３６分まで）で３分の変化を起こすことはありそうもない。従って、カラムのより短い保持は、ｍＡｂへ結合した２０個のＴＣＯ部分により引き起こされた立体構造の変化によると考えられる。また、カラムから３１分に溶出されるブロードなピークはｍＡｂ凝集の兆しである。その結果、１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯとＢＳＭとのインキュベーション後、僅かな量（全体の約２０％）の１７７Ｌｕ活性は、放射性クロマトグラムで高分子量（ＭＷ）化学種に関連するものであった（図２Ｂ）。約２０％の残留免疫反応性は、過剰変性ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）がその標的結合可能性を失っていることを確認する。
続いて１７７Ｌｕ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（４７）を、３７℃でＰＢＳ中、大過剰のテトラジン７（ＴＣＯに対して５００−倍モル過剰）と反応させた。種々の時点（１時間、４時間及び２４時間）で、反応混合物のアリコート（１μｇ ｍＡｂを含む）が取り出され、ＢＳＭとインキュベーションされ、放射性ＨＰＬＣで分析された。テトラジン７の添加１時間後という短かさで、放射性クロマトグラムは、ＣＣ４９−ＴＣＯ凝集体による放射活性ピークの消失、３６分ではピークの大きな減少、及び１７７Ｌｕ−ＣＣ４９−ＴＣＯ−ＢＳＭ付加物の形成による強いピークの形成を示した（Ｒｔ＝２４分；全ｍＡｂ関連活性の７２％；図２Ｃ）。
さらに僅かなピーク面積の増加が、時間と共に観察された（テトラジン７とＣＣ４９−ＴＣＯの２４時間インキュベーション後７６％）。ＴＣＯ−４７とテトラジン７との間のレトロディールスアルダー環付加に続いてＣＣ４９免疫反応性の急激な増加は、電子カスケード媒介脱離機構の結果としてＴＣＯ放出を示す。
図１： （Ａ）１２５Ｉ−ＣＣ４９、及び
（Ｂ）ウシ顎下ムチンタイプＩ−Ｓ（ＢＳＭ）に結合した１２５Ｉ−ＣＣ４９
のサイズ排除放射性クロマトグラム。
図２：
（Ａ）１７７Ｌｕ−ＣＣ４９−ＴＣＯ、及び
（Ｂ）テトラジン７との１時間反応前の、ウシ顎下ムチンタイプＩ−Ｓ（ＢＳＭ）の存在下での１７７Ｌｕ−ＣＣ４９−ＴＣＯ、及び
（Ｃ）テトラジンとの反応１時間後の、ウシ顎下ムチンタイプＩ−Ｓ（ＢＳＭ）の存在下での１７７Ｌｕ−ＣＣ４９−ＴＣＯ
のサイズ排除放射性クロマトグラム。
実施例９
ＴＣＯ系トリガーの製造のための例示的一般的合成経路及び重要中間体
ＬＤ及びＳＰを囲むカッコはこれらが任意であること意味する。この例で構成されるＴＴは場合によりＭＭで置き換えられ得る。
実施例１０
例示的ＬＤ部分の構造
リンカーＬＤはまた自壊性リンカーと呼ばれており、これはアクチベータとトリガーとの反応でリンカーが分子内反応により分解され、それにより薬物ＤＤを放出することを意味する。前記のいくつかはまたＳＰを含む。
実施例１１
例示的ＳＰ部分の構造
（波線は結合されたプロドラッグの残り部分を示す。）
留意すべきは、マレイミド、活性エステル及びブロモアセタミド基は活性基であって、当該活性基に、目標部分ＴＴ及びマスキング部分ＭＭが、場合によりさらにスペーサーＳＰを介してカップリングし得る、ということである。マレイミド及びブロモアセタミド基は通常チオールと反応する一方、活性エステルが通常一級及び二級アミンにカップリングするために好適である。
実施例１２
カスケード脱離機構により機能する、図示された例示的ＬＤ部分を持つＴＣＯトリガーの構造
この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
（破線は結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴの残り部分を示す。）
実施例１３
カスケード脱離機構で機能する図示された例示的ＬＤ及び／又はＳＰ部分を持つＴＣＯトリガーの構造
トリガーは、ＴＴにＴＴのアミン又はチオールを介して共役されている。この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
実施例１４
カスケード脱離機構で機能する図示された例示的ＬＤ及び／又はＳＰ部分を持つＴＣＯトリガーの構造
トリガーは、ＴＴにＴＴのアミン又はチオールを介して共役されている。この例で特徴づけられるＴＴは場合によりＭＭで置換され得る。
実施例１５
カスケード脱離機構により機能する抗体−薬物共役物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合には標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合する。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性＃であり、通常は１と１０の間である。
実施例１６
カスケード脱離機構により機能する抗体−薬物共役物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンは、ＴＣＯトリガーに結合され、及びＳＰを介して標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合される。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性＃であり、通常は１と１０の間である。
実施例１７
カスケード脱離機構により機能する抗体−薬物共役物の構造
メイタンシントキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合には標的抗体又は断片（システイン又はリジン残基を介して共役）に結合する。Ａｂ＝抗体又は抗体断片；ｑ＝Ａｂ変性率であり、通常は１と１０の間である。
実施例１８
カスケード脱離機構により機能する、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬ＴＴに共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンは、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合され、及びＳＰを介す場合、ＴＴ共役のための反応性部分に結合される。
実施例１９
カスケード脱離機構により機能する、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬ＴＴに共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）トキシンをＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介してＴＴ共役のための反応性部分に結合する。
実施例２０
カスケード脱離機構により機能する、例えばアミン又はチオール部分を介して標的試薬ＴＴに共役され得るトリガー−薬物構成物の構造
メイタンシントキシンを、自壊性リンカーＬＤを介してＴＣＯトリガーに結合し、及びＳＰを介する場合にはＴＴ共役のための反応性部分に結合する。
実施例２１
腫瘍結合ＣＣ４９−アウリスタチンＥ共役物の活性化
ｍＡｂ又はｍＡｂ断片としてのＣＣ４９は、非内在化汎固形腫瘍マーカーＴＡＧ７２へ結合する。プロドラッグ投与、腫瘍結合及び血液から除去(clearance)後、アクチベータが注入される。アクチベータとプロドラッグ内のＴＣＯトリガーとの反応の結果、アウリスタチンＥをＣＣ４９（抗体又は抗体断片）から放出し、これはがん細胞を浸透して、がん細胞内で抗癌作用を発揮する。
実施例２２
腫瘍結合Ｔ−細胞係合三量体抗体(triabody)の活性化
三量体抗体は、腫瘍−結合部分、ＣＤ３Ｔ−細胞係合部分、及びＣＤ２８Ｔ−細胞共刺激部分を含む。１つの分子に結合されたＣＤ３及びＣＤ２８がオフターゲットの許容されない毒性効果を生じる結果となるので、抗−ＣＤ２８ドメインはマスキング部分ＭＭでブロックされ、これはＣＤ２８結合ドメインに類似するペプチドであり、抗−ＣＤ２８部分への親和性を持つ。このペプチドは、さらなるペプチドもしくはＰＥＧ鎖ＳＰを介してＴＣＯトリガーにリンクされ、これ自体が、サイト特異的に設計されたシステインへ共役されている。プロドラッグ投与、腫瘍結合及び血液からの除去後、アクチベータが注入される。アクチベータとプロドラッグ内のＴＣＯトリガーとの反応の結果、抗−ＣＤ２８ドメインからマスキング部分を放出させ、Ｔ−細胞のＣＤ２８共刺激、Ｔ−細胞介在抗癌作用のブーストを可能とし、またオフターゲット毒性を防止する。

Claims (24)

  1. プロドラッグの投与及び活性化のためのキットであって、前記キットは、
    直接又は間接的に、トリガー部分（ＴＲ）に結合された薬物と、
    前記トリガー部分のためのアクチベータと、
    を含み、前記トリガー部分がジエノフィルを含み、及び前記アクチベータがジエンを含み、前記ジエノフィルが以下の式（１ａ）を満たす、キット。
    ［式（１ａ）中、Ｔ、Ｆはそれぞれ独立してＨを、又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩからなる群から選択される置換基を表し；
    Ａ及びＰはそれぞれ独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり（ただし、少なくとも１つはＣＲａＸＤである）；ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）、又はＯ−Ｓ（Ｏ）−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここで、ｐ＝０又は１であり；（ＬＤ）ｎはリンカーであり、ここでｎ＝１であり、ＴＲにＳ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介してリンク（結合され）、ここでこれらの原子は前記リンカーの一部であり、直線及び／又は分岐して配置された複数単位からなり得；
    Ｙ、Ｚ、Ｑ、Ｘは一緒になって、場合により１つもしくは複数の芳香族部分に縮合した４−員環の脂肪族性又はヘテロ脂肪族性部分を形成し；
    それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    ＤＤは１又は複数の治療部分又は薬物である。］
  2. プロドラッグの投与及び活性化のためのキットであって、前記キットは、
    直接又は間接的に、トリガー部分（ＴＲ）に結合された薬物と、
    前記トリガー部分のためのアクチベータと、
    を含み、前記トリガー部分がジエノフィルを含み、及び前記アクチベータがジエンを含み、前記ジエノフィルが以下の式（１ａ）を満たす、キット。
    ［式（１ａ）中、Ｔ、Ｆはそれぞれ独立してＨを、又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩからなる群から選択される置換基を表し；
    Ａ及びＰはそれぞれ独立してＣＲａ ２又はＣＲａＸＤであり（ただし、少なくとも１つはＣＲａＸＤである）；ＸＤは（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｏ−（ＤＤ）、Ｏ−Ｃ（Ｓ）−（ＤＤ）、Ｓ−Ｃ（Ｓ）−（ＤＤ）、又はＯ−Ｓ（Ｏ）−（ＤＤ）であり、ここで、ｐ＝０又は１であり；
    Ｙ、Ｚ、Ｑ、Ｘは一緒になって、場合により１つもしくは複数の芳香族部分に縮合した４−員環の脂肪族性又はヘテロ脂肪族性部分を形成し；
    それぞれのＲａは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    ＤＤは１又は複数の治療部分又は薬物である。］
  3. 治療部分ＤＤは、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、又はＯを介して結合され、ここでこれらの原子が前記治療部分の一部である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載のキットであり、ＸＤが（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここでｐ＝０である、キット。
  5. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載のキットであり、ＸＤが（Ｏ−Ｃ（Ｏ））ｐ−（ＬＤ）ｎ−（ＤＤ）であり、ここでｐ＝１である、キット。
  6. 前記ジエノフィルが式（１ａ）に記載の構造を持ち、式中、Ｒａ、Ｔ、及びＦはＨである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のキット。
  7. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載のキットであり、前記シクロオクテンが式（１ｂ）を満たす、キット。
    ［式（１ｂ）中、それぞれのＲａは独立してＨを、又は最大４つの場合、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択される置換基を表し、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    前記のようにそれぞれのＲｄは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｒ’’’、Ｓｉ−Ｏ−Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’−Ｒ’’、ＣＲ’ＮＲ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    ここで２つのＲａ、ｄ部分は一緒になって１つの環を形成し得るものであり；
    ここでさらに、同一面内に固定された多くとも２つの環外結合が場合により存在し；
    ここで場合によりひとつのＲａ、ｄが、標的化試薬ＴＴ又はマスキング部分ＭＭへのリンカー部分内に、場合によりスペーサーＳＰを介して含まれ、及び
    ここでＴ及びＦがそれぞれ独立してＨを、又は、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択される置換基を表し、及び
    ＸＤは式（１ａ）について上に定義されたとおりである。］
  8. 式中、Ｒｄ、Ｔ及びＦはＨである、請求項７に記載のキット。
  9. 請求項７に記載のキットであり、前記ジエノフィルが次の構造から選択される化合物である、キット。
    （点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
    波線は、結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
    （点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
    波線は、結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
    （点線は、結合されたＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭの残りを示す。
    波線は、結合されたＤＤ、ＬＤ−ＤＤの残りを示し、場合によりＴＴ又はＳＰ−ＴＴ又はＭＭ又はＳＰ−ＭＭを含む。）
  10. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載のキットであり、前記アクチベータが、式（２）から（４）に記載のジエンから選択されるジエンを含む、キット。
    ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、；
    Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル−置換炭素、アリール−置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒからなる群から選択され、ここでＲはアルキルであり、ただしＡ及びＢは共に炭素ではない；
    ＸはＯ、Ｎ−アルキル、及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及び
    ＹはＣＲであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルである］、
    ［ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；
    Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ、及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；
    ＢはＯ又はＳであり；
    Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立して、アリール又はアルキルであり；
    Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。］、
    ［ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ’、ＰＯ３Ｒ’Ｒ’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでそれぞれのＲ’及びそれぞれのＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    ＡはＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
    ＢはＮであり；
    Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’からなる群から選択され、ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキルであり、及びＲ’’’は独立してアリール又はアルキルであり；
    Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。］
  11. 前記ジエンが式（４）に記載の構造を持ち、
    式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリールからなる群から選択され、
    式中、ＡはＮであり；ＢはＮであり；ＸはＮであり；且つ、ＹはＮである、請求項１０に記載のキット。
  12. 請求項１０に記載のキットであり、前記ジエンが、Ｒ１及びＲ２がパラ位で置換されたテトラジンである明細書に記載の式（７）を満たす、キット。：
    ［ここでＲ１及びＲ２がそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル、２，４−イミダジル(imidazyl)、２，５−イミダジル及びフェニルからなる群から選択された置換基を表し、場合により、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＳＯ２ＮＲ２、ＰＯ３Ｒ２、ＮＯ、及びＡｒからなる群から選択される１又は複数の電子吸引基で置換され、ここでＲはＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、及びＡｒはフェニル、ピリジル又はナフチルを表す。］
  13. 請求項１０に記載のキットであり、前記ジエンが、式（８ａ）又は（８ｂ）のいずれかを満たす、キット。
    ［ここでそれぞれのＲ１及びそれぞれのＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、及びＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、それぞれのＲ’及びそれぞれＲ’’は独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである。］
  14. 請求項１０に記載のキットであり、前記ジエンが次の化合物からなる群から選択される、キット。
  15. 請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のキットであり、前記薬物ＤＤ又は前記リンカーＬＤ又は前記トリガー部分ＴＲの少なくとも１つが標的化試薬ＴＴを含む、キット。
  16. 前記標的化試薬ＴＴが抗体、抗体断片、タンパク質又はペプチドである、請求項１５に記載のキット。
  17. 請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のキットであり、前記リンカーＬＤ又は前記トリガー部分ＴＲの少なくとも１つがマスキング部分ＭＭを含む、キット。
  18. 前記マスキング部分ＭＭがペプチドである、請求項１７に記載のキット。
  19. 請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のキットであり、前記薬物が、Ｔ−細胞係合抗体構成物である、キット。
  20. 請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のキットであり、前記プロドラッグが、抗体−トキシン又は抗体−薬物共役物である、キット。
  21. １以上のジエン部分は、ＰＥＧ、ポリマー、タンパク質、ペプチド、炭水化物、デンドリマー、又はリポソームのいずれか１つに結合される、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載のキット。
  22. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の式（１ａ）のジエノフィル部分に、直接又は間接的に結合される薬物化合物を含む、プロドラッグ。
  23. 薬物化合物を、非生物的、生体直交型反応によりトリガーされ得るプロドラッグに変性する方法であり、
    薬物を準備するステップと、
    請求項１乃至６のいずれか一項に記載の式（１ａ）のジエノフィル部分に前記薬物を化学的に結合させるステップと、を含む、方法。
  24. 動物又はヒトにおけるプロドラッグ治療のための医薬配合物であって、
    前記医薬配合物が、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の式（１ａ）：
    を満たす化合物を含み、
    前記化合物が、薬物への結合を含む、医薬配合物。
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