WO2008075483A1 - Ｌ－アミノ酸の製造法 - Google Patents

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WO2008075483A1
WO2008075483A1 PCT/JP2007/067387 JP2007067387W WO2008075483A1 WO 2008075483 A1 WO2008075483 A1 WO 2008075483A1 JP 2007067387 W JP2007067387 W JP 2007067387W WO 2008075483 A1 WO2008075483 A1 WO 2008075483A1
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gene
strain
seq
amino acid
plasmid
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PCT/JP2007/067387
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihiko Hara
Hiroshi Izui
Jun Nakamura
Ranko Nishi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L amino acids such as L glutamic acid using microorganisms.
  • L-glutamic acid is industrially useful as a seasoning raw material, and other L-amino acids are used as additives for animal feeds, health food ingredients, amino acid infusions, and the like.
  • wild-type bacteria wild strains
  • auxotrophic strains derived from wild strains
  • L-glutamic acid is produced by fermentation using a so-called coryneform bacterium belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, and Microbataterum, or an L-glutamic acid-producing bacterium or a mutant thereof.
  • Non-Patent Document 1 Other methods for producing L-glutamic acid by fermentation using other strains include methods using microorganisms such as Bacillus genus, Streptomyces genus, Penicillium genus (see, for example, Patent Document 1), Syudumonas genus, Earth Methods using microorganisms such as Lacta, Serratia, Candida (see, for example, Patent Document 2), microorganisms such as Bacillus, Syudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (currently Enterobacter aerogenes) Methods (for example, see Patent Document 3), methods using mutant strains of Escherichia coli (for example, see Patent Document 4), and the like are known.
  • a method for producing L-glutamic acid using a microorganism belonging to the genus Klebsiella, Ervinia, Pantothea, or Enteropacter is also disclosed (for example, see Patent Documents 5 to 7).
  • SDH succinate dehydrogenase
  • Non-patent Document 2 a succinate dehydrogenase-deficient strain is also known in Escherichia coli belonging to the intestinal bacterial group (Non-patent Document 2), but its relationship with L-glutamic acid production has not been known.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 3,220,929
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 3,563,857
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 32-9393
  • Patent Document 4 JP-A-5-244970
  • Patent Document 5 JP 2000-106869 Koyuki
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-189169
  • Patent Document 7 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-189175
  • Patent Document 8 U.S. Pat.No. 5,168,056
  • Patent Document 9 U.S. Pat.No. 5,776,736
  • Patent Document 10 U.S. Pat.No. 5,906,925
  • Patent Document 11 Japanese Patent Publication No. 7-121228
  • Patent Document 12 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-189175
  • Patent Document 13 European Patent Application Publication No. 771879
  • Patent Document 14 European Patent Application Publication No. 0952221
  • Patent Document 15 European Patent Application Publication No. 1078989
  • Non-Patent Document 1 Kunihiko Akashi et al. Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, 195-215, 198 6
  • Non-Patent Document 2 J Gen Microbiol. 1978 Jul; 107 (1): 1-13
  • An object of the present invention is to provide a bacterium capable of efficiently producing an L amino acid such as L-glutamic acid and a method for efficiently producing an L amino acid using the bacterium.
  • the present invention is as follows.
  • a microorganism having L-amino acid-producing ability and modified so that succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketognoletarate dehydrogenase activity are reduced is cultured in a medium, and L-amino acid is produced and accumulated in the medium or in the cell body.
  • Succinate dehydrogenase activity or ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase by reducing the expression level of the gene encoding succinate dehydrogenase or ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase or destroying these genes The method, wherein the activity is reduced.
  • succinate dehydrogenase is one or more genes selected from sdhA gene, sdhB gene, sdhC gene and sdhD gene.
  • microorganism is a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae, or a coryneform bacterium.
  • amino acid power is an L amino acid biosynthesized using glutamic acid or L-glutamic acid as a precursor.
  • L-amino acid power is selected from L-arginine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, and L-glutamine.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a helper plasmid RSF-Red-TER.
  • FIG. 2 shows the construction of helper plasmid RSF-Red-TER.
  • the method of the present invention uses a microorganism having L amino acid-producing ability and modified so that succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity are reduced.
  • L is a method for producing amino acids.
  • the microorganism used in the present invention can be obtained by using a microorganism having L amino acid-producing ability as a parent strain and modifying the microorganism so that succinate dehydrogenase and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activities are reduced.
  • the microorganism used in the present invention is modified so that the succinate dehydrogenase and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activities are reduced.
  • the obtained microorganism can be obtained as a parent strain by imparting or enhancing L-amino acid-producing ability.
  • the microorganism used in the present invention may inherently have L-amino acid-producing ability, or may have been given L-amino acid-producing ability by breeding using a mutation method or recombinant DNA technology. But it's okay.
  • the “L amino acid-producing ability” means having the ability to produce L-amino acid to the extent that it can be recovered from the cells or the medium when the microorganism used in the present invention is cultured in the medium. Preferably, it has the ability to produce a larger amount of L amino acid than a wild strain or an unmodified strain cultured under the same conditions.
  • L-amino acids include L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-serine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-gnoletamine, L-arginine, L-cysteine (cystine), Examples include L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-glycine, L-alanine, L-proline, L-ornitine, L-citrulline, and L-homoserine, but L-glutamic acid or L-glutamic acid as a precursor L Particularly preferred are amino acids such as L-glutamic acid, L-gnoretamine, L-proline, L-arginine, L-ornitine, and L-sitorelin.
  • microorganisms used in the production method of the present invention include microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae such as bacteria belonging to the genus Escherichia, Pantoea, and Enteropacter, Corynebacterium glutamicum, Brevibaterium. Powers including coryneform bacteria such as Mentum and Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis are not limited to these.
  • the “coryneform bacterium” has been conventionally classified into the genus Brevibaterium, but includes bacteria that are currently classified into the genus Corynebatarum (Int. J. Syst. Bacteriol. , 41, 255 (1991)), and also contains bacteria of the genus Brevibaterium which are very closely related to the genus Corynebataterium. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • Corynebacterium 'samoaminogenes Corynebacterium fifciens Corynebacteria no, Kiuris
  • ATCC American 'type ⁇ Culture ⁇ Collection
  • the microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae used in the present invention belong to the genus Escherichia, Enterobata, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Enorevinia, Sanoremonella, Morganella, etc., and L amino acids As long as it has the ability to produce, there is no particular limitation. Specifically, those belonging to the family Enterobacteriaceae can be used according to the classification described in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy / wgetorg?
  • the parent strain of the bacterium belonging to the genus Escherichia is not particularly limited. And others (Neidhardt, FC et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Ameri can Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1) can be used. Among them, for example, Escherichia coli is mentioned. Specific examples of Escherichia coli include Escherichia coli W31 10 (ATC C 27325) and Escherichia coli MG 1655 (ATCC 47076) derived from the prototype wild type K12 strain.
  • Pantoea bacteria, Erbinia bacteria, and Enteropacter bacteria are categorized as ⁇ proteobacteria and are taxonomically closely related (J Gen Appl Microbiol 1997 355_ «5, International Journal of systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067).
  • some bacteria belonging to the genus Enteropacter have been reclassified as Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa by DNA-DNA hybridization experiments and the like.
  • the bacteria belonging to the genus Elvinia are reclassified as Pantoea ananas and Pantoea's Stuarti. (See International Journal of Systematic Bacteriology Jan 1993; 43 (1) ⁇ ⁇ ⁇ 162-173).
  • bacteria belonging to the genus Enteropacter include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etc. 0, specifically, European Patent Application Publication No. 952221
  • the representative strains of the genus Enteropacter include the Enteropactor 'Agglomerans ATCC 12287 strain.
  • Pantoea ananatis Pantoea stewartii
  • Pantoea agglomerans Pantoea citrea
  • Specific examples include the following strains:
  • Pantoea Ananatis AJ 13355 (FERM BP-6614) (European Patent Application Publication No. 0952221)
  • Pantoea Ananatis AJ 13356 (FERM BP-6615) (European Patent Application Publication No. 0952221) These strains have been re-established in Pantoea Ananatis by the analysis of the nucleotide sequence of 16S rRNA, as described above, as described in European Patent Application Publication No. 0952221 as Enteropactor-Agglomerans. It is classified.
  • Examples of the genus Erwinia include Erwinia 'Amiguchi Bola' and Erwinia 'power rotobora.
  • Examples of the Klebsiella bacterium include Klebsiella' planticola. Specifically, the following strains are mentioned.
  • L-amino acid biosynthetic enzymes whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more.
  • imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.
  • an auxotrophic mutant, an analog-resistant strain, or a metabolically controlled mutant having L amino acid-producing ability the parent strain or wild-type strain is subjected to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N Methyl-N'—Nitrowe N Ditrosoguanidine etc.
  • normal mutation treatment that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N Methyl-N'—Nitrowe N Ditrosoguanidine etc.
  • mutant strains obtained by treating with the above, etc. it is possible to obtain by selecting those exhibiting auxotrophy, analog resistance, or metabolically controlled mutations and having the ability to produce L amino acids.
  • An L-amino acid-producing bacterium can also be obtained by enhancing the enzyme activity of an L-amino acid biosynthesis enzyme by genetic recombination.
  • Examples of a method for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability by breeding include a method of modifying so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-glutamic acid biosynthesis is enhanced.
  • L Enzymes involved in glutamate biosynthesis include, for example, glutamate dehydrogenase (gdhA), glutamine synthetase (g 1 ⁇ ), glutamate synthase (gltAB), isocitrate dehydrogenase (icdA), aconite hydratase (acnA, acnB), and ken Acid synthase (gltA), phosphoenolpyruvate strength lupoxylase (ppc), pyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase (ace EF, lpdA), pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA
  • a DNA fragment containing these genes is used as an appropriate plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication and replication function of the plasmid in a microorganism. This is achieved by introducing the amplified plasmid introduced into the gene, or by making multiple copies of these genes by joining, transferring, etc. on the chromosome, and introducing mutations into the promoter region of these genes. (See the international pamphlet W095 / 34672).
  • the promoter for expressing these genes only needs to function in coryneform bacteria.
  • the promoter may be a proper promoter or the promoter of the gene itself to be used, or may be modified.
  • the expression level of the gene can also be controlled by selecting a promoter that functions strongly in coryneform bacteria, or by bringing the 3510 region of the promoter closer to the consensus sequence.
  • Microorganisms modified so as to enhance the expression of citrate synthase gene, isocitrate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase gene, and / or glutamate dehydrogenase gene by the method as described above include WO00 / 18935 pamphlet, European patent Examples thereof include microorganisms described in Japanese Patent Application Publication No. 1010755.
  • the modification for imparting L-glutamic acid-producing ability may be carried out by reducing or eliminating the activity of the enzyme that catalyzes the reaction that generates the other compound by branching the biosynthesis pathway of L-glutamic acid.
  • Enzymes that catalyze reactions that branch off from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce compounds other than L-Daltamate include isocitrate lyase, acetohydroxyacid synthase, acetolactic acid synthase, acetyl acetyl transferase, lactic acid Examples include dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1 pyrroline 5-carboxylate dehydrogenase, and acetyl CoA hydride (WO2006 / 057450).
  • the activity of the enzyme as described above can be reduced or eliminated by a method similar to the method for reducing the succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity described below.
  • D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase and / or funolectoose 6-phosphate phosphoketolase examples include a method of introducing a gene encoding fructose-6-phosphate phosphoketolase (referred to collectively as phosphoketolase).
  • microorganisms with increased phosphoketolase activity include the following microorganisms: Brevibacterium ratatofamentum ATCC13869 A sucA (pVK9_x),
  • L-gnoretamic acid The ability to produce L-gnoretamic acid is defined as 6 phosphodanoleconate dehydratase activity or 2 keto
  • microorganisms having increased 6-phosphodarconate dehydratase activity and 2-ketose 3 deoxy-6 phosphodarconate aldolase activity include the microorganisms disclosed in JP-A-2003-274988.
  • L-glutamic acid-producing ability can also be imparted by amplifying the yhfK gene, which is an L-glutamic acid excretion gene (WO2005 / 085419).
  • the L-glutamic acid-producing microorganism used in the present invention has the ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration of L-glutamic acid in a liquid medium when cultured under acidic conditions (hereinafter referred to as acidic conditions).
  • acidic conditions a liquid medium when cultured under acidic conditions
  • Microorganisms having the ability to accumulate L-glutamic acid in the present invention For example, by obtaining a strain with improved resistance to L-glutamic acid in a low pH environment by the method described in European Publication No. 1078989, the ability to accumulate an amount of L-glutamic acid exceeding the saturation concentration is imparted. be able to.
  • microorganisms capable of accumulating L-glutamic acid under acidic conditions include Pantoea Ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6 615), AJ1360 Zhu (FERM BP-7207) (see European Patent Application Publication No. 0952221), SC17sucA strain, SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain, NP106 strain, NA Zhu, and the like.
  • Pantoea Ananatis AJ13355 is a strain that was isolated from the soil of Soda, Shizuoka Prefecture, as a strain that can grow on a medium containing L-dartamic acid and a carbon source at low pH.
  • AJ13356 is a strain in which the a KGDH-E1 subunit gene (sucA) of AJ 13355 strain is deleted.
  • Pantoair Ananatis AJ13355 and AJ13356 shares were established on February 19, 1998, at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (now the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, patent product deposit center, address zip code 305 -8566 Deposited at Ibaraki Prefecture Tsukuba Sakai Higashi 1-chome 1-Chuo 6) under the accession numbers FERM P-16644 and FERM P-16645 respectively. It was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on 11 January 2011 and has been given the accession numbers FERM BP-6614 and FERM BP-6615.
  • L-gnoretamic acid-producing bacteria of Pantoea ananatis include bacteria belonging to the genus Pantoea that have lost ketogonoletate dehydrogenase (a KGDH) activity or have reduced a KGDH activity.
  • Such strains include the aforementioned AJ13356 strain and SC17sucA (US Pat. No. 6,596,517), which is a sucA gene-deficient strain derived from the SC17 strain, which was also selected as a mucous low-producing mutant.
  • the SC17sucA strain was granted the private number AJ417.
  • Patent Biological Deposit Center (address zip code 305-8566 Tsukuba Sakaihigashi, Ibaraki Pref. No. 6) is deposited under the accession number FERM BP-08646.
  • the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain contains, in addition to the SC17sucA strain, a citrate synthase gene (gltA), a phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppsA), and a glutamate dehydrogenase gene (gdhA) derived from Escherichia coli.
  • a citrate synthase gene gltA
  • ppsA phosphoenolpyruvate carboxylase gene
  • gdhA glutamate dehydrogenase gene
  • AJ1360 Zhu was selected from the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain as a strain resistant to high concentrations of L-glutamic acid at low pH.
  • the NP106 strain is a strain obtained by removing the plasmid RSFCPG + pSTVCB from AJ1360 vermilion.
  • a method for imparting resistance to an organic acid analog or a respiratory inhibitor, or a method for imparting sensitivity to a cell wall synthesis inhibitor may be mentioned.
  • a method of imparting monofluoroacetic acid resistance Japanese Patent Laid-Open No.
  • resistant bacteria include the following strains.
  • microorganisms capable of producing L-glutamine include bacteria with enhanced glutamate dehydrogenase activity, bacteria with enhanced glutamine synthetase (glnA) activity, and bacteria with disrupted dullaminase gene (European patent application) (Publication Nos. 1229121 and 1424398). Enhancement of glutamine synthetase activity can also be achieved by destruction of glutamine adenyltransferase (glnE) or PII regulatory protein (glnB).
  • glnE glutamine adenyltransferase
  • glnB PII regulatory protein
  • strains belonging to the genus Escherichia and having a mutant glutamine synthetase in which the tyrosine residue at position 397 of glutamine synthetase is substituted with another amino acid residue can be exemplified as suitable L-glutamine-producing bacteria (US patent application). (Publication No. 2003-0148474).
  • Brevibacterium 'flavum AJ 11573 (FERM P-5492; JP 56-161495) Brevibacterium flavum AJ 11576 (FERM BP-10381; JP 56-161495) Brevibacterium' flavum AJ12212 (FERM P -8123; JP-A 61-202694)
  • Examples of microorganisms having L proline-producing ability include bacteria that retain ⁇ daltamyl kinase that has been desensitized to feedback inhibition by L proline and bacteria that have weakened the L proline degradation system.
  • a method for modifying bacteria using DNA encoding ⁇ -glutamyl kinase desensitized to feedback inhibition by L-proline is described in Dandekar, AM, Uratsu, SL, J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988). Is disclosed.
  • Examples of a method for obtaining a bacterium with a weakened L-proline degradation system include a method for introducing a mutation that reduces enzyme activity into the proline dehydrogenase gene.
  • bacteria having L proline-producing ability examples include Escherichia coli NRRL B-12403 strain and NRRL B-12404 strain (UK Patent 2075056), V PM B-8012 strain (US Patent Publication 2002-0058315), and Retains plasmid variants disclosed in German Patent No. 3127361 and plasmid variants disclosed in Bloom FR et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) And the like.
  • microorganisms having L-proline-producing ability preferably include Escherichia coli 702 strain (VKPMB-8011), which is a strain resistant to 3,4-dehydroxyproline and azatidine-2-carboxylate.
  • 702ilvA strain VKPMB-8012 strain
  • Escherichia coli that has enhanced the activity of the protein encoded by b2 682 and b2683, bl242 or b3434 gene (JP 2002 — No. 300874).
  • L-proline-producing bacteria of coryneform bacteria include DL-3, 4-dehydroproline resistant strains (F ERM BP-1219, US Pat. No. 4,224,409), and citrate synthase activity is 1.4 times higher than its parent strain. Examples include strains that have increased (FERM P-5332, FERM P_5333, FERM P_5342, FERMP-534 3 Patent No. 1426823), and strains that have been given acetic acid requirement (FERM P-5931).
  • Examples of microorganisms capable of producing L-mouth isine include, for example, Escherichia coli H-9068 strain (ATCC 21530) and H-907 0 which are resistant to 4-azaleucine or 5,5,5-trifluoroleucine. Strain (FERM BP-4704) and H-9072 (FERM BP-4706) (US Pat. No. 5,744,331), and Escherichia coli (European patent) that retains isopropyl malate synthase that has been desensitized to feedback inhibition by L-mouth isine 1067191), Escherichia coli AJ11478 (US Pat. No.
  • L-tissue isin producing strains of coryneform bacteria include 2 thiazolealanine and ⁇ -hydroxyleucine resistant strains (JP-A 8-266295), valine analog resistant strains (JP-A 63-24839 2), Phosphorus auxotrophic strain (Japanese Patent Publication No. 38-4395), S— (2 aminoethyl) L Cystein ( ⁇ C) resistant strain (Japanese Patent Publication No. 51-37347), phenylalanine, valine, isoleucine auxotrophic strain (Japanese Patent Publication No. 54- 36233).
  • Escherichia coli JM15 strain (US Pat. No. 6,218, 168) transformed with a cysE gene allele encoding serine acetyltransferase desensitized to feedback inhibition
  • Escherichia coli W3110 strain (US Pat. No. 5,972,663) overexpressing a gene that codes for a protein that excludes cytotoxic substances
  • Escherichia coli (JP-A-11-155571) with reduced cysteine desulhydrase activity.
  • Amplified Cysteine Leglon Transcription Activator Encoded by cysB Gene Examples include Escherichia coli W3110 strain (WO01 / 27307).
  • Examples of microorganisms capable of producing L isoleucine include mutant strains of Escherichia bacteria exhibiting 6-dimethylaminopurine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 5-304969), L isoleucine hydroxamate, tiisoleucine, and DL ethionine.
  • a mutant strain resistant to arginine hydroxamate Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882
  • a recombinant strain in which a threonine deaminase gene and a acetohydroxy acid synthase gene are amplified Japanese Patent Laid-Open No. 2-458, Japanese Patent Laid-Open No. 2-42988, Kaihei 8-47397.
  • L-isoleucine-producing bacteria of coryneform bacteria include coryneform bacteria (JP 2001-169788) in which a brnE gene that encodes a branched-chain amino acid excretion protein is amplified, and protoplast fusion with L-lysine-producing bacteria.
  • Coryneform bacterium with the ability to produce isoleucine JP-A-6-74293
  • coryneform bacterium with enhanced homoserine dehydrogenase JP-A 62-91193
  • JP-A 62-195293 A-ketomalone resistant strain
  • Japanese Patent Laid-Open No. 61-15695 Japanese Patent Laid-Open No. 61-15695
  • methyllysine resistant strain Japanese Patent Laid-Open No. 61-15696.
  • L-valine can be imparted, for example, by increasing the activity of L-valine synthase encoded by the ilvGMEDA operon, particularly the acetate hydroxylate synthase encoded by the ilvG gene (special Fairness 02-748418).
  • the L-valine synthase may be released from feedback inhibition by L-parin.
  • the ability to produce L-norin can also be conferred by reducing the expression of the acetate lactate synthase III gene (ilvIH gene).
  • L-parin-producing ability can be imparted by imparting amino acid analog resistance to bacteria.
  • bacteria examples include mutant strains (FERM P-1841, FERM, which require L-isoleucine and L-methionine requirement and have B1 life on D-ribose, purine nucleoside or pyrimidine ribonucleoside, for example. P-5556; Japanese Patent Laid-Open No. 53-025034) and mutants showing resistance to polyketides (FERM P-9325; Patent No. 01934507).
  • Examples of L-valine-producing bacteria also include a mutant strain having an aminoacyl t-RNA synthetase mutation (US Patent No. 5,658,766).
  • E. coli VL1970 having a mutation in the ileS gene encoding isoleucine tRNA synthetase can be used.
  • E. coli VL197 0, June 24, 1988, Lucian ⁇ National ⁇ Collection ⁇ Industrial 'My It has been deposited with Kroonoreganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) under the accession number VKPM B-4411.
  • a mutant strain (WO96 / 06926) that requires lipoic acid for growth and / or lacks H + -ATPase can be used as a parent strain.
  • L-parin-producing bacteria of coryneform bacteria include strains modified so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-valic acid biosynthesis is enhanced.
  • the enzyme involved in L-valinate biosynthesis include ilvBNC operon, ie, acetohydroxy acid synthase encoding ilvBN and isomeroreductase (ilvCX International Publication Pamphlet WO 00-50624).
  • ilvBNC operon is regulated by operon expression by L-noline and / or L-isoleucine and / or L-soutine isine, it is necessary to release the categorization to release the suppression of the expression by L-valine produced. Is desirable.
  • L Aranin The microorganism having an ability to produce, for example, H + -ATP ase activity coryneform bacterium (Appl Microbiol Biotechnol 2001 Nov; 57 (4).: 534_40) deficient Ya Asuparagin acid ⁇ over decarboxylase gene And coryneform bacteria (Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-163383).
  • Microorganisms having L-arginine-producing ability include ⁇ -methylmethionine, ⁇ -fluo-feruylalanin, D-arginine, arginine hydroxamic acid, AEC (S— (2-aminoethyl) monocysteine), a —methylserine, / 3 Examples thereof include Escherichia coli mutant strains having resistance to -2-chelalanine or sulfaguanidine (see JP-A-56-106598). Further, Escherichia coli 237 strain (Russian patent application No.
  • L-arginine biosynthetic enzymes include N-acetyl glutamate synthase (argA), N-acetyl tiltyl phosphate reductase (argC), ornithine acetyl transferase (argj), N-acetyl.
  • Glutamate kinase argB
  • Acetyl ornithine transaminase argD
  • Acetyl ornithine deacetylase argE
  • Ornithine strength rumoyltransferase argF
  • Argininosuccinate synthase argG
  • Argininosuccinate lyase argH
  • carAB ruvamoyl phosphate synthase
  • argA N-acetyl glutamate synthase
  • the L-arginine-producing bacteria of coryneform bacteria are not particularly limited as long as they have L-arginine-producing ability, but coryneform bacteria wild strains such as sulfa drugs, 2-thiazolalanine or ⁇ -amino ⁇ -hydroxyvaleric acid, etc. Coryneform bacteria resistant to drugs; 2 In addition to thiazolealanin resistance, L-histidine, L-proline, L-threonine, L-isoleucine, L-methionine or L-tryptophan-requiring coryneform bacteria No.
  • coryneform bacteria resistant to ketomalonic acid, fluoromalonic acid or monofluoroacetic acid JP 57-18989
  • coryneform bacteria resistant to argininol JP 62-24075
  • And coryneform bacteria JP-A-2-86995 resistant to X guanidine (X is a fatty acid or fatty chain derivative).
  • the coryneform bacterium having L-arginine-producing ability is a mutant strain resistant to 5-azauracil, 6-azauracil, 2-thiouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-azacytosine, 6-azacytosine and the like; arginine hydroxamate , 2 mutants resistant to thiouracil, mutations resistant to arginine hydroxamate and 6-azauracil Strain (Japanese Patent Laid-Open No. 49-126819); a mutant strain resistant to histidine analogs or tributophan analogs (Japanese Patent Laid-Open No.
  • coryneform bacteria having L-arginine-producing ability include the following strains.
  • L-citrulline and L-ornithine share the same biosynthetic pathway as L-arginine, and include N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetyltiltamyl phosphate reductase (argC), ornithine. Providing these abilities by increasing the enzyme activities of acetyltransferase (argj), N-acetylglutamate kinase (argB), acetyl olnitine transaminase (argD), and acetyl olnitine deacetylase (argE). Power S can be. (International Publication 2006-35831 Pamphlet)
  • microorganisms having L-lysine-producing ability include L-lysine having L-lysine-producing ability.
  • Gin analogue resistant strain or metabolic control mutant strain specifically, Escherichia coli AJ11442 strain (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see JP-A-56-18596 and US Pat. No. 4,434,170) And Escherichia coli VL61 Zhu (JP 2000-189180 A).
  • Escherichia coli AJ11442 strain (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see JP-A-56-18596 and US Pat. No. 4,434,170)
  • Escherichia coli VL61 Zhu JP 2000-189180 A
  • WC196 strain see International Publication No. 96/1 7930
  • the WC196 strain was bred by conferring AEC (S- (2-aminoethyl) cysteine) resistance to the W3110 strain derived from Escherichia coli K-12.
  • This strain was named Escherichia coli AJ13069, and on December 6, 1994, the National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biodeposition Center, T 305-8566 Japan) No. 1 in Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Kokubu, Ibaraki Prefecture, No. 6), deposited under the deposit number FERM P-14690, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on September 29, 1995, and deposited under the deposit number FERM BP- 5252 is granted.
  • AEC S- (2-aminoethyl) cysteine
  • AEC S- (2-aminoethyl) cystine (hereinafter abbreviated as “AEC”) resistant mutant strain (Brevibacterium) Umm 'Ratatofamentum AJ11082 (NRRL B-11470), etc .: JP-B 56-1914, JP-B 56-1915, JP-B 57-14157, JP-B 57-14158, JP-B 57 -30474, JP-B 58-10075, JP-B 59_4993, JP-B 61-35840, JP-B 62-24074, JP-B 62-36673, JP-B 5-11958 Gazettes, Japanese Patent Publication No.
  • a microorganism to which L-lysine-producing ability is imparted can also be obtained by increasing the enzyme activity of the L-lysine biosynthesis system. Such an increase in enzyme activity can be achieved by increasing the copy number of the gene encoding the enzyme in the cell and modifying the expression regulatory sequence.
  • L-lysine biosynthesis enzymes include dihydrodipicolinate synthase gene (dapA), aspartokinase gene (lysC), dihydrodipicolinate reductase gene (dapB), diaminopimelate decarboxylase gene (lysA), diaminopimelate dehydrogenase gene (ddh) (international publication 96/40934 pamphlet), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppc) (JP-A-60-87788), aspartate aminotransferase gene ( aspC) (Japanese Patent Publication No.
  • diaminopimerin epimerase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-135066), aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd) (International Publication No. 00/61723 pamphlet)
  • Diaminovimelic acid pathway enzyme gene such as homoaconitic acid hydrator Gene Gene enzymes etc. (JP 2000- 157276 JP), etc. aminoadipic acid pathway and the like.
  • the Aspartokinase III gene should not be subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • the lysC gene modified so as not to receive such feedback inhibition can be obtained by the method described in US Pat. No. 5,932,453.
  • microorganisms having L-lysine-producing ability may have reduced or deficient activity of enzymes that catalyze reactions that produce compounds other than L-lysine, and enzyme activities that function negatively in L-lysine production.
  • enzymes include homoserine dehydrogenase, lysine decaenase.
  • Lupoxylase (cadA, ldcC), malicenzyme, and the strains in which the activity of the enzyme is reduced or deficient are disclosed in International Publication No. W095 / 23864, WO96 / 17930 pamphlet, W02 005/010175 pamphlet, etc. It is described in.
  • a microorganism having an ability to produce L-tribtophan is preferably a bacterium in which one or more of anthranilate synthase activity, phosphodariserate dehydrogenase activity or tryptophan synthase activity is enhanced. Since anthranilate synthase and phosphodariserate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L tryptophan and L-serine, respectively, the enzyme activity can be enhanced by retaining a desensitized mutant enzyme.
  • the anthranilate synthase gene (trpE) and / or the phosphodalylate dehydrogenase gene (serA) is mutated so as not to receive feedback inhibition, and the obtained mutant gene is transformed into bacteria.
  • a bacterium that retains the desensitizing enzyme can be obtained. More specifically, such a bacterium is a plasmid PGH5 (international) that has a mutant serA encoding a desensitized phosphodalylate dehydrogenase in Escherichia coli SV164, which holds a desensitized anthranilate synthase.
  • Examples include transformed strains obtained by introducing Public Publication No. 94/08031 pamphlet).
  • the ability to produce L-tryptophan can also be imparted by introducing a recombinant DNA containing a tryptophan operon.
  • a recombinant DNA containing a tryptophan operon include Escherichia coli into which a tryptophan operon containing a gene encoding a desensitized anthranilic acid synthase has been introduced (JP 57-71397, JP 62-244382). US Pat. No. 4,371,6 14).
  • trpBA tryptophan synthase-encoding gene
  • Tryptophan synthase consists of ⁇ and / 3 subunits and is encoded by trpA and trpB, respectively.
  • L tryptophan-producing ability may be imparted by introducing trpR coding for tryptophan operon repressor, or by introducing a mutation that reduces repressor activity into trpR.
  • US Pat. No. 4,371,614, International Publication No. WO2005 / 0 56776 pamphlet [0079]
  • malate synthase, isocitrate triase, isocitrate dehydrogenase kinase / phosphatase operon (ace operon), or bacteria with enhanced expression of operon are also suitable.
  • L Tribtophan producing bacteria Specifically, the ace operon promoter is not repressed by the repressor iclR, or such a bacterium that is desired to be derepressed is achieved by disrupting the iclR gene. be able to.
  • a strain containing Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL B-12 263] strain having a characteristic of L phenylalanin and L-tyrosine, and a plasmid containing a tryptophan operon AGX6 (pGX50) aroP CNRRL B — 12264] strain carrying pGX50 (see US Pat. No. 4,371,614).
  • Coryneform bacteria having the ability to produce L-tryptophan include corynebataterium 'glutamicum AJ12118 (FERM BP-478 patent 01681002), which is resistant to sulfaguanidine, and a coryneform bacterium introduced with a tryptophan operon ( JP-A-S63240794) and coryneform bacteria into which a gene encoding shikimate kinase derived from coryneform bacteria has been introduced (JP-A 0199 4749) can be used.
  • L-tryptophan, L-phenylalanine, and L-tyrosine are all aromatic amino acids and share a biosynthetic system, and the gene encoding an aromatic amino acid biosynthetic enzyme is deoxya.
  • Rabinohepturonic acid phosphate synthase (aroG), 3-dehydroquinate synthase (aroB), shikimate dehydrogenase (aroE), shikimate kinase (aroL), 5-enolate pyruvine shikimate 3-phosphate Synthase (aroA) and chorismate synthase (aroC).
  • aroG Rabinohepturonic acid phosphate synthase
  • aroB 3-dehydroquinate synthase
  • aroE shikimate dehydrogenase
  • aroL shikimate kinase
  • 5-enolate pyruvine shikimate 3-phosphate Synthase (aroA) and chorismate
  • Microorganisms capable of producing L-phenylalanine include Escherichia coli AJ12739 (tyrA :: TnlO, tyrR) (V PM B_8197), which lacks tyrA and tyrR, and E. which retains the mutant pheA34 gene.
  • coli HW1089 ATCC 55371) (US Pat.No. 5,354,672)
  • E. coli MWEC101-b KR8903681
  • E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 US Pat.
  • Strains belonging to the genus Escherichia such as 4,407,952), but are not limited thereto.
  • coli ⁇ coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566)
  • E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP— 12659)
  • the coryneform bacterium producing felanuaranin includes corynebataterium daltamicam BPS-13 strain (FERM BP-1777, 77 (FERM BP-) with reduced phosphoenolpyruvate carboxylase or pyruvate kinase activity. 2062) and 78 (FERM BP-2063) (European Patent Publication No. 331145 JP 02303495), tyrosine-requiring strain (JP 05049489), etc.
  • Preferable microorganisms having L-threonine-producing ability include microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae with enhanced L-threonine biosynthesis enzymes.
  • the genes encoding L-threonine biosynthetic enzymes include aspartokinase III gene (lysC), aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd), aspartokinase I gene (thrA) encoded by the thr operon, Examples include homoserine kinase gene (thrB) and threonine synthase gene (thrC).
  • the inside of Katsuko is an abbreviation for the gene. Two or more of these genes may be introduced.
  • L-threonine biosynthetic genes may be introduced into Escherichia bacteria with suppressed threonine degradation! /.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia in which threonine degradation is suppressed include, for example, TD H6 strain lacking threonine dehydrogenase activity (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-346578).
  • TD H6 strain lacking threonine dehydrogenase activity Japanese Patent Laid-Open No. 2001-346578.
  • L-threonine-producing bacteria it is desirable to modify the L-threonine biosynthetic gene so that it is not subject to feedback inhibition by L-threonine.
  • the thrA, thrB, and thrC genes constitute the threonine operon.
  • the threonine operon forms an attenuator structure, and the expression of the threonine operon inhibits isoleucine and threonine in the culture medium. In response, expression is suppressed by attenuation. This modification can be achieved by removing the leader region or the attenuation region of the attenuation region.
  • a unique promoter exists upstream of the threonine operon, it may be replaced with a non-natural promoter (see pamphlet of WO98 / 04715), or the expression of a gene involved in threonine biosynthesis is A threonine operon as governed by a repressor and promoter may be constructed.
  • a threonine operon as governed by a repressor and promoter may be constructed.
  • a strain resistant to a-amino- ⁇ -hydroxyvaleric acid (AHV) should be selected. Is also possible.
  • the threonine operon modified so that it is not subject to feedback inhibition by L-threonine has an increased copy number in the host, or is linked to a strong promoter and the expression level is improved. It is preferable.
  • the increase in copy number can be achieved by transferring the threonine operon on the genome by transposon, Mu-phage, etc. in addition to amplification by plasmid.
  • L-threonine biosynthetic enzyme it is also preferable to enhance the genes involved in glycolysis, TCA cycle, respiratory chain, genes controlling gene expression, and sugar uptake genes.
  • these genes that are effective for L-threonine production include transhydronase (pntAB) gene (European patent 733712), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (p mark C) (International publication 95/06114 pamphlet) , Phosphoenolpyruvate Examples thereof include a synthase gene (pps) (European Patent No. 877090), and a pyruvate carboxylase gene (International Publication No. 99/18228, European Application No. 1092776) of a coryneform bacterium or a Bacillus bacterium.
  • a gene conferring resistance to L-threonine a gene conferring resistance to L-homoserine, or to confer L-threonine resistance and L-homoserine resistance to the host.
  • genes that confer resistance include the rhtA gene (Res. Microbio 1. 154: 123-135 (2003)), the rhtB gene (European Patent Application Publication No. 0994190), and the rht C gene (European Patent Application Publication No. 1013765). No. specification), yfiK, yeaS gene (European Patent Application Publication No. 1016710 specification).
  • the methods described in European Patent Application Publication No. 0994190 and International Publication No. 90/04636 can be referred to.
  • Examples of microorganisms capable of producing L-threonine include Escherichia coli VKPM B-3996 (see US Pat. No. 5,175,107). This VKPM B-3996 share was registered with Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika on November 19, 1987 in Russian National 'Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika. Deposited under 3996.
  • This VKP M B-3996 strain is also a threonine in the broad vector plasmid pAY C32 (see Chistorerdov, ⁇ .
  • Escherichia coli B-5318 strain (see European Patent No. 0593792) can also be exemplified as a bacterium imparted with a suitable L-threonine-producing ability.
  • B-5318 shares were registered with Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Gnetika on 19 November 1987 under the registration number VKPM B-5318. Originally deposited. Also this VKPM B-5318 The strain is a non-isoleucine-requiring strain, and is a threonine operon that lacks the intrinsic transcriptional regulatory region of the lambda phage downstream of the N-terminal portion of the temperature-sensitive C1 repressor, PR promoter and Cro protein.
  • the L-amino acid-producing bacterium used in the present invention has a gene that is involved in sugar uptake, sugar metabolism (glycolysis), and energy metabolism in addition to a gene encoding a specific biosynthetic enzyme. May be.
  • genes involved in sugar metabolism include genes encoding glycolytic enzymes and sugar uptake genes.
  • the glucose 6-phosphate isomerase gene (pgi; International Publication No. 01/02542 pamphlet), Phosphoenolpyruvate synthase gene (pps; published in European application 877090), phosphodalcomtase gene (pgm; published internationally 03/04598 pamphlet), fructose niphosphate aldolase gene (ftp; published internationally 03/04664 pan) Frets), pyruvate kinase gene (pykF; WO 03/008609 pamphlet), transaldolase gene (talB; WO 03/008611 pamphlet), fumarase gene (fom; WO 01/02545 pamphlet) , Phosphoenolpyruvate synthase gene (pps; published European application 877090 pamphlet), non-PTS sucrose removal Inclusive gene gene (csc; European
  • genes involved in energy metabolism include transhydrogenase genes (pntAB;
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism having an L-amino acid-producing ability as described above, and modified so that succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity are reduced.
  • ⁇ 1 2> Decrease in succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity
  • “enzyme activity is reduced” means that succinate dehydrogenase activity and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity are low compared to an unmodified strain such as a parent strain or a wild strain. Including disappearing completely! /.
  • Succinate dehydrogenase (hereinafter sometimes referred to as “SDH”) is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction of EC: 1.3.99.1.
  • the SDH activity means an activity that catalyzes this reaction.
  • SDH is composed of three or four subunit structural forces, depending on the microbial species.
  • SDH is composed of the following subunits (the gene name that encodes the subunit in Katsuko), and depending on the species, membrane anchor protein is encoded by sdhC alone or by sdhC and sdhD! / There is something.
  • SDHA flavoprotein subunit (sdhA)
  • SDHB Fe_S protein suounit sdhB
  • SDHC membrane anchor protein (sdhC)
  • SDHD membrane anchor protein (sdhD)
  • the SDH subunit complex may have both SDH and fumarate reductase activities.
  • the SDH subunit complex of coryneform bacteria has both SDH and fumarate reductase activities (WO2005 / 021770).
  • SDH activity can be confirmed by measuring the reduction of 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as an index.
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • genes encoding each of the SDH subunits and the operons containing them may be collectively referred to as “genes encoding SDH”.
  • the gene encoding SDH of coryneform bacteria includes, for example, the sdh operon of Corynebaterum glutamicum (GenBank accession No. NCgl0359 (sdhC) NCgl0360 (sdhA) NCg 10361 (sdhB)), and the sdh operon of Brevibaterium flavum (JP 2005-095169, EP1672077A1) are disclosed.
  • ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (hereinafter sometimes referred to as “a _KGDH” ⁇ ) activity means that a-ketoglutarate (2-oxodaltaric acid) is oxidatively decarboxylated and succinylated.
  • Lou CoA the reaction to produce (succin y preparative CoA) means an activity to catalyze.
  • the above reaction consists of a-GDH (Elo: a-ketoglutarate dehydrogenase, EC: 1.2.4.2), dihydrolipoamide S-succininotransferase (E2o: dihydrolipoamide-S-succinyltransfera se; EC: 2.3.
  • dihydrolipoamide dehydrogenase Catalyzed by three enzymes E3: dihydrolipoamide dehydrog enase; EC: 1.8.1.4. That is, these three types of subunits catalyze the following reactions, and the activity that catalyzes the combined reaction of these three reactions is called a-KGDH activity! Confirmation of a-KGDH activity is measured by the force S measured according to the method of Shiio et al. (Isamu Shio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44 (8), 1897-1904, 1980).
  • NAD protein N6- (lipoyl) lysine + NADH +
  • ⁇ -KGDH is also called oxoglutarate dehydrogenase or 2-oxoglutarate dehydrogenase.
  • sucA and sucB of Pantoea ananatis and the sucC gene present downstream are shown in SEQ ID NOs: 7 to 11 .
  • sucA, sucB and sucC genes encoding Escherichia coli ⁇ -KGDH are disclosed in GenBank NP.415254 and NP_415255, respectively.
  • the Elo subunit is encoded by the odhA gene (also referred to as sucA gene, registered as NCgll084 of GenBank Accession No. NC_003450), and the E3 subunit is encoded by the lpd gene (GenBank Accession No. Y16642).
  • the E2o subunit is encoded by the odhA gene as a bifunctional protein along with the Elo subunit (see Usuda et al., Microbiology 1996 142, 334 7-3354), or a GenBank Accession other than the odhA gene. It is presumed to be encoded by a gene registered as NCgl2126 of No. NC_003450. Therefore, in the present invention, the odhA gene may encode E2o together with a force that is a gene encoding the Elo subunit.
  • nucleotide sequence of the odhA gene of Brevibateratum 'Ratatofmentum' and the amino acid sequence of the Elo subunit are shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively.
  • nucleotide sequence of NCgl2126 of GenBank Accession No. NC.003450 and the amino acid sequence of the E2o subunit encoded by the same sequence are shown in SEQ ID NOs: 14 and 15, respectively.
  • genes encoding each of the ⁇ -KGDH subunits and gene clusters containing them may be collectively referred to as “genes encoding ⁇ -KGDH”. Reducing each enzyme activity can be performed, for example, by the following method.
  • the genes encoding SDH or ⁇ -KGDH are used to modify these genes per cell relative to the parental or wild type.
  • the enzyme activity per molecule of the enzyme protein may be reduced or lost.
  • the number of enzyme protein molecules can be reduced by reducing the expression level of the gene encoding the enzyme.
  • the decrease in the gene expression level includes a decrease in the transcription level of mRNA transcribed from the gene and a decrease in the translation amount of the mRNA.
  • the gene encoding SDH to be modified may be one or more of the genes encoding any of the subunits of SDH, or the entire operon. Mutations may be introduced into genes encoding units (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD).
  • the gene encoding a-KGDH to be modified may be one or more of the genes encoding any of the subunits of a-KGDH, or the entire gene cluster.
  • a gene encoding the Elo subunit (sucA or odhA) or a gene encoding the E2o subunit (sucB) is preferable.
  • each remains The variant of the gene is a homologue of each gene, for example, the chromosome of a microorganism such as Enterobacteriaceae or coryneform bacterium, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 7, 12, 14, 73, or 81, for example.
  • SDH a protein having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-4, 6, 74-76, 78-80, and as subunits of ⁇ -KGDH, SEQ ID NOs: 8-11, 13, Examples include proteins having any of the amino acid sequences 15 and 81, but the codons used differ depending on the bacterial strain, and there may be differences in the base sequence of each gene. These amino acid sequences may encode amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, unless otherwise changed.
  • severeal means, for example,;!-20, preferably 1-; 10, more preferably 1-5.
  • a conservative mutation is a polar amino acid between Phe, T rp and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, lie and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • it is an acid, it is between Gln and Asn.
  • it is a basic amino acid, it is between Lys, Arg, and His.
  • it is an acidic amino acid, it is an amino acid having a hydroxyl group between Asp and Glu.
  • conservative mutations are conservative substitutions, which are considered conservative substitutions: Ala to Ser or Thr substitution, Arg to Gln, His or Lys substitution, Asn to Glu Gin, Lys, His or Asp substitution, Asp to Asn, Glu or Gin substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gin force to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution Glu to Asn, Gin, Lys or Asp, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gin, Arg or Tyr, lie to Leu, Met, Val or Phe, Substitution from Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, lie or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala substitution, Trp to Phe or Tyr substitution, Tyr to His, Phe or Trp substitution, and , Substitution of Val to Met, lie or Le
  • the variants of each gene include those base sequences or coding regions consisting only of genes having the base sequence of each coding region in the base sequence of SEQ ID NO: 1, 7, 12, 14, 73, 77, or 81. It may be DNA I that hybridizes under stringent conditions with a probe IJ that is complementary to the base sequence, or a probe that can be prepared from the base sequence! /. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, DNAs having high homology, for example, DNAs having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • each other and Haiburidizu, it homologous than low! /, DNA with each other Haiburidizu Shinano! /, conditions, there! / is a condition of washing Rere of typical Southern hybridization Daizeshiyon 6 0. c, 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS, preferably (or, 60 ° C, 0. 1 X SSC, 0. 1% SDS, more preferably, 68.C, 0. 1 X SSC, 0. Examples include conditions of washing once, more preferably 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature corresponding to 1% SDS.
  • the length of the probe is a force appropriately selected according to the hybridization conditions. Is from 100 bp to 1 Kbp.
  • gene modification involves deletion of part or all of the gene coding region on the chromosome, or modification of an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. Etc. are achieved.
  • expression level of a gene can also be reduced by modifying an untranslated region other than the expression regulatory sequence.
  • the entire gene may be deleted, including sequences before and after the gene on the chromosome.
  • amino acid substitution missense mutation
  • termination codon is introduced (nonsense mutation), or 1 to 2 base addition / deletion is performed.
  • sucA and sucB genes are present upstream of the sdh operon, and by introducing a mutation that reduces the expression level of the sdh operon, the expression levels of the sucA and sucB genes are reduced. Such a mutation is also included in the present invention.
  • modified by gene recombination refers to an expression regulatory sequence of a gene on a chromosome, such as a promoter region, a coding region, or a non-coding region using homologous recombination. This refers to reducing the enzyme activity in the cell by deleting a part or all of the above, or by inserting another sequence into these regions. In the present invention, it is preferable that the gene is modified to such an extent that the gene inactivation is not restored by natural mutation.
  • the modification is such that SDH activity and ⁇ -KGDH activity are decreased, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or normal using a mutation agent such as N-methyl ⁇ 'nitro-N-nitrosoguanidine, etc. It may be modified by mutation treatment.
  • the modification of the expression regulatory sequence is preferably 1 base or more, more preferably 2 bases or more, and particularly preferably 3 bases or more.
  • the deletion region can be any of the ⁇ terminal region, the internal region, and the C-terminal region. It may be the entire code area. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Further, it is preferable that the reading frames upstream and downstream of the region to be deleted do not coincide.
  • any region of the gene may be used.
  • the sequence inserted into 1S has a longer direction and can reliably inactivate the gene encoding the enzyme.
  • the sequences before and after the insertion site preferably do not match the reading frame.
  • the other sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the function of the enzyme protein, and examples thereof include an antibiotic resistance gene and a transposon carrying a gene useful for L-glutamic acid production.
  • a deletion-type gene that lacks a partial sequence of the gene and is modified so as not to produce a normally functioning enzyme protein is produced.
  • the gene on the chromosome is replaced with the deleted gene.
  • the enzyme protein encoded by the deletion-type gene it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type enzyme protein, and its function is reduced or lost. Gene disruption by gene replacement using such homologous recombination has already occurred.
  • a strain resistant to the ⁇ Red gene product for example, Pantoea ananatis SC17 (0) strain
  • SC17 (0) shares were registered with the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VPM), GNU Genetika on 21 September 2005, Russian VN National Collection of Industrial Microorganisms (VPM), GNU Genetika. Deposited under B-9246.
  • Strains with reduced ⁇ -KGDH activity can be obtained by the method (1) described above, or can be obtained by the following method using nutritional requirements.
  • microbial cells were subjected to normal mutation treatment (eg, 250 ⁇ ⁇ / 1111, 30 ° C, 20 minutes) with N-methyl-N, 12-trowel N-trosoguanidine, and then a solid medium. Cultivate above to form colonies. From this, a strain with reduced a-K GDH activity can be isolated by isolating mutant strains that cannot grow on a medium containing L-glutamic acid as a single carbon source and single nitrogen source by the replica method.
  • strains with reduced a-KGDH activity include the following strains.
  • the ⁇ -KGDH activity-reduced strain requires succinic acid for growth due to the decreased supply of succinyucci CoA.
  • succinic acid requirement is restored in double deficient strains of ⁇ -KGDH and SDH (J Gen Microbiol. 1978 Jul; 107 (l): 1-13). Therefore, a strain with reduced ⁇ -KGDH and SDH activity can be obtained by selecting a strain with a restored succinic acid requirement from a strain with reduced ⁇ -KGDH activity S.
  • a strain with reduced a-KGDH activity is plated on a minimal medium containing no succinic acid to form colonies.
  • strains with reduced a-KGDH activity that can grow on minimal medium without succinic acid There is a mutation in the gene that codes for SDH!
  • L-amino acids can be produced by culturing the above microorganisms in a medium, producing and accumulating L-amino acids in the medium or in the cells, and collecting the L-amino acids from the medium or the cells.
  • the medium used for the culture a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. Synthetic media or natural media! /, And deviations can be used.
  • the carbon and nitrogen sources used in the medium are those that can be used by the strain being cultured!
  • the carbon source saccharides such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, starch hydrolysate, molasses and the like can be used.
  • organic acids such as acetic acid and citrate, ethanol, etc. Alcohols can also be used alone or in combination with other carbon sources.
  • ammonia salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, and the like can be used.
  • organic micronutrients amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, peptone containing these, casamino acids, yeast extracts, soybean protein degradation products, etc. can be used, and nutritional requirements that require amino acids for growth. When using mutants, it is preferable to supplement the required nutrients.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
  • the culture is preferably carried out by aeration culture at a fermentation temperature of 20 to 45 ° C and a pH of 3 to 9.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances, ammonia gas, etc. can be used for pH adjustment.
  • L amino acid accumulates in the culture solution or in the fungus body.
  • a liquid medium adjusted to conditions where L-glutamic acid is precipitated is used to precipitate L-glutamic acid in the medium.
  • Culture can also be performed to accumulate.
  • the conditions under which L-glutamic acid precipitates are, for example, ⁇ 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably ⁇ 4.3 to 4.0, and particularly preferably ⁇ 4.0.
  • PH is preferably 5.0 to 4.0, more preferably 4.5 to 4.0, and still more preferably 4.3 in order to achieve both the improvement of the growth of L and the efficient precipitation of L-glutamic acid. It is desirable to be -4.0.
  • the culture at the above pH may be the whole period or a part of the culture.
  • the method for collecting L-amino acid from the culture broth after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, it is collected by removing microbial cells from the culture solution and then concentrating crystallization or ion exchange chromatography.
  • L-glutamic acid precipitated in the culture solution can be collected by centrifugation or filtration. In this case, L-glutamic acid dissolved in the medium may be crystallized and then isolated together! /.
  • Trehalose may be added to the medium and cultured.
  • the concentration of trehalose contained in the medium is preferably 0.1 g / L or more, preferably 0.2 g / L or more, more preferably 0.5 g / L or more.
  • coryneform bacteria it is preferable to add 0.5 g / L or more, preferably 0.75 g / L or more, more preferably 2 g / L or more.
  • the trehalose added to the medium may dissolve crystalline trehalose, or may use trehalose contained in the mother liquor after recovering the target substance from the fermentation solution produced in the fermentation process.
  • trehalose in the medium may be produced as a by-product in the fermentation broth according to the present invention.
  • betaine N-methylglycine, N-N-dimethylglycine, NNN-trimethylglycine, [2-Hide mouth kichetil] trimethylmonmonium
  • betaine N-methylglycine, N-N-dimethylglycine, NNN-trimethylglycine, [2-Hide mouth kichetil] trimethylmonmonium
  • Productivity is improved. It is preferable to add 0.1 g / L or more, preferably 0.25 g / L or more, more preferably 0.5 g / L or more.
  • This plasmid can be used in a wide range of hosts with different genetic backgrounds. The reasons are as follows: 1) It has many Gram-negative and Gram-positive bacteria and the RSF1010 broad host range plasmid replicon that can be stably maintained even in plants (Scholz, et al., 1989). Buchanan- Wollaston et al., 1987), 2) The ⁇ Red, gam, bet and exo genes are in the regulation of the PlacUV5 promoter, recognized by many bacterial RNA polymerases (see, for example, Brunschwig, E. et al. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (199 2); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)), 3) Autoregulator P-lad, And
  • the prn-independent transcription terminator (TrrnB) of the rrnB operon of lacUV5 escherichia coli reduces the basal expression level of the ⁇ Red gene (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). Furthermore, the RSF-Red-TER plasmid contains a levansucrase gene (sacB), which allows the plasmid to be recovered from the cells in a medium containing sucrose.
  • sacB levansucrase gene
  • Cells transformed with the RSF-Red-TER helper plasmid are IPTG (isopropyl _ / 3-D-thiogalactopyranoside, ImM) and an appropriate antibiotic (chloramphenicol 25 g / ml or kanamycin 40 g / ml) in LB medium containing a very low growth rates, the efficiency of the lambda Red-mediated recombination ( ⁇ Red-mediated recombination) is extremely low! if observed, (10 8).
  • Pantoea ananatis SC17 strain (US Pat. No. 6,596,517) was introduced by RSF-Red-TER plasmid by electopore positioning. After 18 hours of cultivation, approximately 10 6 transformants were obtained, and up to 10 clones were large in size. Yes, the rest were all very small. After 18 hours of culture, large colonies were about 2 mm and small colonies were about 0.2 mm. Even when the culture was extended to 24 hours, the small colonies continued to grow, and the large colonies continued to grow.
  • One of the large colony Pantoea ananatis mutants B1 live for the expression of all three genes of the ⁇ Red gene (gam, bet and exo) was used for further analysis.
  • RSF-Red-TER plasmid DNA was isolated from one large colony clone and several small colony clones and retransformed into Escherichia coli MG1655 to produce the active product of the Red gene. The ability of the plasmid to be synthesized was examined. Control experiments for Red-dependent integration in the resulting transformants showed that only plasmids isolated from large colony clones resulted in the expression of the ⁇ Red gene required for Red-dependent integration. .
  • the RSF-Red-TER plasmid can induce the expression of the Red gene by the lad gene on the plasmid.
  • Two induction conditions were investigated. In the first group, IPTG (lmM) was added 1 hour before electoral position, and in the second group, IPTG was added at the beginning of the culture for the preparation of electorizable cells. Progeny growth rates of cells carrying RSF-Red-TER from large colony clones were significantly lower than strains without the SC17 plasmid. The addition of IPTG only slightly reduced the growth rate of these cultures. On the other hand, the progenies of small colony clones grow very slowly without the addition of IPTG. did.
  • helper plasmid RSF-Red-TER The construction scheme of the helper plasmid RSF-Red-TER is shown in FIG.
  • the RSFsacBPlacMCS vector was designed.
  • DNA fragments containing the structural part of the cat gene of the PACYC184 plasmid and the sacB gene of Bacillus subtilis were amplified by PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 19, 20, 21, and 22, respectively.
  • Each of these oligonucleotides contains convenient BglII, Sad, Xbal, and BamHI restriction enzyme sites at the 5 'end that are necessary for further cloning. Yes.
  • the obtained 1.5 kb sacB fragment was converted to the Xbal-BamH of the pMW119_Plad vector obtained earlier.
  • This vector describes the pMW118-P lad vector
  • this vector contains a polylinker site from pMW219 instead of the pMW218 plasmid.
  • pMW-P 1 lac adsacBcat contains the PlacUV5-lacI_sacB-cat fragment.
  • pMW_P ladsacBcat was digested with Bglll and the DNA polymerase
  • the 3.8 kb Bglll-Sad fragment of the IsacBcat plasmid was eluted from a 1% agarose gel and ligated to the RSF1010 vector treated with Pstl and Sad.
  • Escherichia coli TG1 was transformed with the ligation mixture and plated on LB medium containing chloramphenicol (50 mg / L). Restriction enzyme analysis was performed on the plasmid isolated from the grown clones to obtain RSFsacB plasmid.
  • the sequences of SEQ ID NOs: 23 and 24 are used.
  • a DNA fragment containing the P lac lac promoter was amplified by PCR using oligonucleotides as primers and the pMW119-P lad plasmid as a saddle type.
  • the resulting 146 bp fragment was Sad
  • PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 27 and 24 as primers and the chromosome of Escherichia coli BW3350 as a saddle was carried out by PCR using the P promoter and Trm lacUV5.
  • a DNA fragment containing the B terminator was amplified. Treat these fragments with Kpnl Connected. Thereafter, a 0.5 kb fragment containing both P and TrmB was obtained by PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 24 and 28 as primers.
  • the obtained DNA fragment was digested with EcoRI, treated with DNA polymerase I Klenow fragment to make blunt ends, cut with BamHI, and ligated with the large Ecll36II_BamHI fragment of RSFsacBPlacMCS vector.
  • the resulting plasmid was named RSF-Red-TER.
  • the pMWl 18- (lattL-Km r _lattR) plasmid was constructed by replacing the MWl 18-attL-Tc-attR (WO2005 / 01017 5) plasmid strength, et al., tetracycline resistance marker gene with the kanamycin resistance gene of the pUC4K plasmid. did. Therefore, P and MW118-attL-Tc-at tR EcoRI-Hindlll large fragment of plasmid was ligated to two fragments of HindIII-PstI of pUC4K plasmid (676 bp) and E coRI-HindIII (585bp). The basic pMW118-attL-Tc_attR was obtained by linking the following four fragments.
  • AttL (sequence) obtained by PCR amplification using primers P1 (SEQ ID NO: 29) and P2 (SEQ ID NO: 30) from the region corresponding to attL of the chromosome of Escherichia coli W3350 (including prophage) Bglll-EcoRI fragment (114 bp) with number 31). These primers contain secondary recognition sites for Bglll and EcoRI.
  • AttR (sequence) obtained by PCR amplification using primers P3 (SEQ ID NO: 32) and P2 (SEQ ID NO: 33) from the region corresponding to attR of the chromosome of Escherichia coli W3350 (including prophage) Pstl-Hindlll fragment (182bp) with number 34). These primers contain secondary recognition sites for Pstl and Hindlll.
  • Bglll-Pstl small fragment (363 bp) of transcription terminator ter_rrnB. This fragment was obtained by PCR amplification of the corresponding region of Escherichia coli MG1655 chromosome using primers P7 and P8 (SEQ ID NOs: 37 and 38). These primers contain secondary recognition sites for Pstl and Bglll and Pstl.
  • pML-MCS plasmid (Mashko, SV et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no. 5, 3-20) is digested with Xbal and BamHI, then the large fragment (3342 bp) containing the ter_thrL terminator Ligated with Xbal-BamHI fragment (68bp).
  • a fragment containing this ter_thrL terminator was obtained by PCR using primers P9 and P10 (SEQ ID NOs: 40 and 41) in the corresponding region of Escherichia coli MG1655 chromosome. In this way, pML-ter_thrL plasmid was obtained. These primers contain secondary recognition sites for Pstl and Xbal and BamHI! / ⁇
  • pML-ter_thrL plasmid was digested with Kpnl and Xbal, then treated with DNA polymerase I Klenow fragment and ligated with pBR322 EcoR to Van91I small fragment (1317bp) with tetracycline resistance gene to obtain pML-Tc_ter_thrL plasmid .
  • PBR322 was digested with EcoRI and Van91I and then treated with DNA polymerase I Klenow fragment.
  • Plasmid RSFPPG was constructed by amplifying the L-glutamic acid biosynthesis gene, prpC gene (International Publication No. 2006/051660, pamphlet), ppc gene, and gdh (European Application Publication No. 0999282).
  • Primer 1 SEQ ID NO: 42
  • primer 2 SEQ ID NO: 43
  • PCR was carried out using RSFCPG in a cage shape to obtain a fragment of about 14.9 kb.
  • PCR was performed using primer 3 (SEQ ID NO: 44) and primer 4 (SEQ ID NO: 45), using the chromosomal DNA of Ecoli W3110 strain as a saddle to obtain a fragment of about 1.2 kb.
  • E. coli ME8330 a citrate synthase (CS) deficient strain, was transformed with this plasmid mixture, and M9 minimal medium (glucose 5 g, magnesium sulfate) containing 50 mg / L uracil, 5 mg / L thiamine-HC1 was transformed.
  • M9 minimal medium glucose 5 g, magnesium sulfate
  • 2 mM monopotassium phosphate 3 g, sodium chloride 0.5 g, ammonium chloride lg phosphate disodium 6 g in a medium containing 1 L of pure water.
  • a plasmid was extracted from the emerging strain and designated RSFPPG.
  • the plasmid RSFPPG was introduced into Pantoea ananatis NP106 strain, which is an L-glutamic acid-producing bacterium, to construct an L-glutamic acid-producing NP106 / RSFPPG (this strain is referred to as “NA Zhu”).
  • the NP106 strain was obtained as follows. Pantoea Ananatis AJ1 360 Zhu exemplified above is cultured overnight in LBGM9 liquid medium at 34 ° C, diluted to 100-200 colonies per plate, and LBGM9 plate containing tetracycline 12.5mg / L We applied to. The colonies that emerged were replicated on an LBGM9 plate containing tetracycline 12.5 mg / L and chloramphenicol 25 mg / L, and a strain that became chloramphenicol sensitive was selected, and a strain from which pSTVCB had dropped was obtained and named G106S. did.
  • the G106S strain was cultured with shaking in LBGM9 liquid medium at 34 ° C overnight, diluted to 100 to 200 colonies per plate, and applied to an LBGM9 plate containing no drug. The colonies that emerged were replicated on LBGM9 plates containing tetracycline 12.5mg / L and LBGM9 plates containing no drugs. Tetracycline-sensitive strains were selected, and a strain with RSFCPG S deletion was obtained and named NP106. .
  • the NP106 strain thus obtained is a strain that does not have both the two plasmids RSFCPG and pSTVCB carried by AJ1360 Zhu.
  • SC17 (0) was transformed with RSF-Red-TER to obtain SC17 (0) / RSF-Red_TER strain.
  • the same strain is cultured overnight in L medium containing 25 mg / L chloramphenicol (medium containing 10 g of Batatotryptone, 5 g of yeast extract, and 5 g of NaCl in 1 L of pure water, ⁇ ⁇ 7.0).
  • L medium containing 25 mg / L chloramphenicol (medium containing 10 g of Batatotryptone, 5 g of yeast extract, and 5 g of NaCl in 1 L of pure water, ⁇ ⁇ 7.0).
  • a 1/100 amount of LOOmL L medium containing 25mg / L chloramphenicol and ImM isopropyl- / 3_D_tiogalatatoviranoside was inoculated and cultured at 34 ° C for 3 hours.
  • the cells prepared in this way are collected, washed 3 times with ice-cold 10% glycerol, and finally suspended in 0.5 mL of 10% glycerol as a competent cell.
  • Fragment 1 OOng was introduced using GENE PULSER II (BioRad) under the conditions of an electric field strength of 18 kV, a capacitor capacity of 25 F, and a resistance of 200 ⁇ .
  • To the cell suspension add ice-cold SOC medium (batatryptone 20 g / L, yeast extratate 5 g / L, NaCl 0.5 g / L, glucose 10 g / L) at 34 ° C.
  • Chromosomes were extracted from this sdhA gene-deficient strain using Edge Biosystems Bacterial Genomic DNA Purification Kit.
  • the NAI strain was cultured overnight in an agar medium in which the above-mentioned minimum medium components and 12.5 mg / L tetracycline were added to L medium.
  • the cells are scraped with ase, washed with ice-cooled 10% glycerol three times, and 10% glycerol is added to the cells to a final volume of 500 ⁇ L and suspended. A cell.
  • 600 ng of the chromosomal DNA described above was introduced into this complex cell under conditions of an electric field strength of 17.5 kV, a capacitor capacity of 25 F, and a resistance value of 200 ⁇ using GENE PULSER II (BioRad).
  • GENE PULSER II BioRad
  • NA Zhu lacks the sucA gene that encodes the El subunit of ⁇ -KGDH.
  • the sucA gene of SC17 (0) / RSF-Red_TER strain has no mutation.
  • the sdhA gene and the sucA gene are very close together, and when the sdhA gene-deficient strain is transformed with chromosomal DNA, the wild-type sucA gene is also transferred at a certain rate along with the sdhA mutation. Therefore, two types of NA1 sdhA-deficient strains obtained include those that are deficient in the sucA gene and those that have reverted to the wild type.
  • the region corresponding to the mutation site of NA1's sucA gene is amplified by PCR, and the ability of sucA gene is restored or the sucA gene returns to the wild type, using as an index whether or not it can be cleaved by restriction enzyme Bglll.
  • restriction enzyme Bglll restriction enzyme
  • sucAsdhA double-deficient strains were inoculated into a test tube into which 5 mL of the medium having the composition shown below was injected, Culture was performed for 18 hours. NA Zhu, a sucA single-deficient strain, hardly grew on the same medium, and L-glutamic acid accumulation remained at about 3.3 g / L, whereas sdhA-deficient strain obtained 13.2 g / L L-glutamic acid accumulation. The result was much higher than that of the sucA single-deficient strain.
  • sucAsdhA double-deficient strains can accumulate 14.7 g / L of L-glutamate, have higher L-glutamate production capacity than sucA and sdhA deficient each, and greatly improve growth. Was confirmed.
  • Yeast Extract (Difco) 2g / L Canorescium pantothenate 18mg / L
  • Brevibacterium flavum ATCC 14067 strain from (currently (or Corynebacterium glutamicum ⁇ this minute), lacking odhA gene and is replaced with 837 of the G force S A of yggB gene (SEQ ID NO: 56), promoters of gdh gene
  • the ability to use ⁇ ⁇ ⁇ flavum ATCC14067 as the parent strain was the same as that of C. glutamicum ATCC1303 2 and lact ⁇ lactofermentum ATCC13869 as the parent strain. Strains can be constructed.
  • a plasmid pBS3 A sucA47 for deleting odhA was constructed. PCR was performed using the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 48 and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 49 as primers and the chromosomal DNA of B. flavum ATCC1 4067 strain as a saddle to prepare an N-terminal fragment. Similarly, a C-terminal fragment was prepared using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51 as primers.
  • PCR was performed using a mixture of equal amounts of N-terminal fragment and C-terminal fragment as a cage, and using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 (with a BamH sequence) added as primers, A fragment lacking the coding region of the odhA gene was obtained.
  • the obtained mutant odhA fragment was treated with BamHI and placed at the BamHI site of pBS3 (International Publication 2006/070944 pamphlet).
  • the obtained plasmid was designated as pBS3 ⁇ sucA47.
  • CM-Dex agar medium (glucose 5 g / l, polypeptone 10 g / l, yeast extract 10 g / l) containing pBS3 ⁇ sucA47 in ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ flavum ATCC14067 and kanamycin 25 5 g / ml by electric pulse method , H PO lg / l, MgSO ⁇ 7 ⁇ ⁇ 0.4g / l, FeSO ⁇ 7 ⁇ ⁇ 0.01g / U MnSO ⁇ 4— 5 ⁇ ⁇ 0
  • a suspension of ATCC14067-pBS3 ⁇ sucA strain cultured overnight in CM_Dex liquid medium was added to a suspension of S 10 agar (sucrose 100 g / l, polypeptone 10 g / l, yeast extract 10 g / l, KH PO lg / 1
  • a strain showing kanamycin sensitivity was selected and further purified on a CM-Dex agar medium.
  • Chromosome DNA was prepared from these strains, and PCR was performed using the synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 as primers, and a strain in which an amplified fragment of about 1.9 Kb was confirmed was designated as 8L3 strain.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of strain 8L3 as a saddle and the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 (added with Sad sequence) as primers.
  • sequence of the amplified fragment was determined, it was shown that the alanine at position 111 of SEQ ID NO: 57 was replaced with threonine!
  • 8L3 was a double mutant in which this mutation was accidentally introduced when odhA deficiency was introduced.
  • the ATCC14067yggB8 strain is known as a strain having the same yggB mutation as 8L3 (International Publication 2006/070944 Pamphlet).
  • a plasmid pBS4gdh3 for introducing a mutation into the promoter region of gdh was constructed.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of B. lactofermentum ATCC13869 strain as a saddle to prepare an N-terminal fragment.
  • a C-terminal fragment was prepared using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63 as primers. Next, mix the same amount of N-terminal fragment and C-terminal fragment.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65 (with Smd sequence added) as primers to obtain fragments in which mutations were introduced into the promoter region of the gdh gene.
  • the obtained mutant gdh fragment was treated with Smal and inserted into the Smal site of pBS4S (International Publication 2006/070 944 pamphlet), and the resulting plasmid was designated as pBS4gdh3.
  • pBS4gdh3 was introduced into the 8L3 strain by an electric pulse method, and applied to a CM-Dex agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin. After culturing at 31.5 ° C for 3 days, the growing strain was isolated as strain 8L3_pBS4gdh3 in which pBS4gdh3 was inserted into the chromosome. Next, a suspension of 8L3_pBS4gdh3 strain cultured overnight in CM-Dex liquid medium was spread on S10 agar medium and cultured at 31.5 ° C. Among the appearing colonies, a strain showing kanamycin sensitivity was selected and further purified on CM-Dex agar medium. Chromosomal DNA was prepared from these strains, and the sequence upstream of the gdh coding region was determined. The strain having the sequence shown in SEQ ID NO: 66 was designated as 8L3G strain.
  • Plasmid pBS3 A sdh47 for deletion of sdhA was constructed. PCR was carried out using the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 67 and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 68 as primers and the chromosomal DNA of B. flavum ATCC14067 strain as a saddle to prepare an N-terminal fragment. Similarly, a C-terminal fragment was prepared using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70 as primers.
  • PCR was carried out using a mixture of equal amounts of N-terminal fragment and C-terminal fragment as a saddle type, and using the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 as primers, and the coding region of the sdhA gene was deleted. A fragment was obtained.
  • the obtained mutant sdhA fragment was treated with B ⁇ HI and inserted into the BamHI site of pBS3 (International Publication No. 2006/070944 Pamphlet), and the resulting plasmid was designated as pBS3 ⁇ sdhA47.
  • pBS3 ⁇ sdhA47 was introduced into the 8L3G strain by an electric pulse method, and applied to a CM-Dex agar medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin. After culturing at 31.5 ° C for 2 days, the growing strain was isolated as strain 8L3G_pBS3 ⁇ sdhA in which pBS 3 ⁇ sdhA47 was inserted into the chromosome. Then, a suspension of 8L3 G-pBS3 ⁇ sdhA strain cultured overnight in CM-Dex liquid medium was applied onto S10 agar medium and cultured at 31.5 ° C.
  • a strain showing kanamycin sensitivity was selected and further purified on CM-Dex agar medium. Chromosomal DNA is prepared from these strains, and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 (with B ⁇ M sequence added) is applied. A strain in which an amplified fragment of about 1 Kb was confirmed by PCR was used as an 8L3G A SDH strain.
  • each of these strains was placed on one CM-Dex plate medium. After cell culture, all of the cells were scraped from the plate, inoculated into a jar injected with 300 mL of the medium having the composition shown below, and cultured at 31.5 ° C. The pH during the culture was controlled to 7.2 using ammonia gas, and aeration and agitation were controlled so that the dissolved oxygen concentration was maintained at 5% or higher.
  • L glutamate accumulation at 12.5 hours in culture is higher in 8L3G A SDH, which is a sucAsdhA double-deficient strain than in 8L3G strain, which is a single sucA-deficient strain.
  • the 8L3G A SDH strain was 16.5 g / L, while the 8L3G ⁇ SDH strain was 19 g / L, a result much higher than the 8L3G strain, which is a sucA-deficient strain. From these results, it was shown that it is effective in L-glutamic acid production to simultaneously delete sucA and sdhA in coryneform bacteria.
  • Adjust to pH 4.0 with aqueous ammonia sterilize at 120 ° C for 15 minutes, and adjust to pH 7.2 with ammonia gas immediately before cultivation.
  • SEQ ID NO: 1 Pantoea 'Ananatis sdh operon nucleotide sequence (SDHD, SDHA, SDH B amino acid sequence shown together)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid arrangement of SDHD IJ
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of SDHA
  • SEQ ID NO: 4 SDHB amino acid sequence IJ
  • SEQ ID NO: 5 Pantoea Ananatis sdh operon nucleotide sequence (SDHC amino acid sequence)
  • SEQ ID NO: 7 Base sequence of Pantoea ananatis ⁇ - KGDH subunit gene and neighboring genes
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence (part) of succinate dehydrogenase ironsulfur protein
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of ⁇ -KGDH Elo subunit
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of ⁇ -KGDH E2o subunit
  • SEQ ID NO: 11 part of succinyl-CoA synthetase ⁇ subunit
  • SEQ ID NO: 12 Nucleotide sequence of odhA gene of Brevipacterum ratatofarmentum
  • SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence of Elo subunit encoded by odhA
  • SEQ ID NO: 14 Nucleotide sequence of the gene (NCgl2126 of GenBank Accession No. NC 003450) encoding the E2o subunit of Brevibateratum 'Ratatomentumum
  • SEQ ID NO: 15 Amino acid sequence of E2o subunit encoded by NCgl2126
  • SEQ ID NO: 16 Pantoea ananatis hisD gene base sequence
  • SEQ ID NO: 17 Primer for amplification of fragment for integration of Km f gene into hisD gene
  • SEQ ID NO: 18 Primer for amplification of fragment for integration of Km f gene into hisD gene
  • SEQ ID NO: 19 For amplification of cat gene Primer
  • SEQ ID NO: 20 Primer for cat gene amplification
  • SEQ ID NO: 21 primer for amplifying sacB gene
  • SEQ ID NO: 22 primer for amplifying sacB gene
  • SEQ ID NO: 23 Primer for DNA fragment amplification containing P promoter
  • SEQ ID NO: 24 Primer for amplifying DNA fragment containing P promoter
  • SEQ ID NO: 25 Primer for amplification of DNA fragment containing Red a ⁇ gene and tL3 SEQ ID NO: 26: Primer for amplification of DNA fragment containing Red a ⁇ gene and tL3 SEQ ID NO: 27: For amplification of DNA fragment containing P promoter and TrmB Primer
  • SEQ ID NO 2 8 P promoter and DNA fragment amplification primer comprising TrmB
  • SEQ ID NO: 29 attL amplification primer
  • SEQ ID NO: 30 primer for attL amplification
  • SEQ ID NO: 31 nucleotide sequence of attL
  • SEQ ID NO: 32 primer for attR amplification
  • SEQ ID NO: 33 primer for attR amplification
  • SEQ ID NO: 34 nucleotide sequence of attR
  • SEQ ID NO: 35 Primer for DNA fragment amplification containing bla gene
  • SEQ ID NO: 36 Primer for DNA fragment amplification containing bla gene
  • SEQ ID NO: 37 DNA fragment amplification primer containing ter_rrnB
  • SEQ ID NO: 38 DNA fragment amplification primer containing ter_rrnB
  • SEQ ID NO: 39 Base sequence of DNA fragment containing ter_thrL terminator SEQ ID NO: 40: Primer for DNA fragment amplification containing ter_thrL terminator SEQ ID NO: 41: Primer for DNA fragment amplification containing ter_thrL terminator SEQ ID NO: 42: ORF of gltA gene Primer for amplifying the other part SEQ ID NO: 43: Primer for amplifying the part other than the ORF of the gltA gene SEQ ID NO: 44: Primer for prpC gene amplification
  • SEQ ID NO: 45 primer for prpC gene amplification
  • SEQ ID NO: 46 DNA fragment amplification primer for sdhA disruption
  • SEQ ID NO: 47 DNA fragment amplification primer for sdhA disruption
  • SEQ ID NO: 48 primer for amplifying sucA gene upstream fragment
  • SEQ ID NO: 49 Primer for amplification of sucA gene upstream fragment
  • SEQ ID NO: 50 primer for amplifying downstream fragment of sucA gene
  • SEQ ID NO: 51 Primer for amplification of sucA gene downstream fragment
  • SEQ ID NO: 52 primer for amplifying sucA gene
  • SEQ ID NO: 53 primer for amplifying sucA gene
  • SEQ ID NO: 54 yggB gene amplification primer
  • SEQ ID NO: 55 primer for yggB gene amplification
  • SEQ ID NO: 56 base sequence of yggB gene
  • SEQ ID NO: 57 Amino acid sequence of YggB
  • SEQ ID NO: 58 Nucleotide sequence of mutant yggB gene
  • SEQ ID NO: 59 Amino acid sequence of mutant YggB
  • SEQ ID NO: 60 primer for upstream amplification of gdh gene (mutation introduction)
  • SEQ ID NO: 61 primer for upstream amplification of gdh gene
  • SEQ ID NO: 62 primer for downstream amplification of gdh gene
  • SEQ ID NO: 63 primer for downstream amplification of gdh gene (mutation introduction)
  • SEQ ID NO: 64 primer for amplifying gdh gene
  • SEQ ID NO: 65 primer for amplifying gdh gene
  • SEQ ID NO: 66 nucleotide sequence upstream of the mutant gdh gene coding region
  • SEQ ID NO: 67 primer for upstream amplification of sdhA gene
  • SEQ ID NO: 68 primer for upstream amplification of sdhA gene (mutation introduction)
  • SEQ ID NO: 69 primer for downstream amplification of sdhA gene
  • SEQ ID NO: 70 primer for downstream amplification of sdhA gene (mutation introduction)
  • SEQ ID NO: 71 primer for amplifying sdhA gene
  • SEQ ID NO: 72 primer for amplifying sdhA gene
  • SEQ ID NO: 73 nucleotide sequence of sdh operon of C. glutamicum ATCC13032 (along with amino acid sequences of SDHC, SDHA, SDHB)
  • SEQ ID NO: 74 amino acid arrangement of SDHC IJ
  • SEQ ID NO: 75 Amino acid sequence of SDHA
  • SEQ ID NO: 76 amino acid arrangement of SDAB IJ
  • SEQ ID NO: 77 base sequence of sdh operon of B. lactofermentum ATCC13869 (along with amino acid sequences of SDHC, SD HA, SDHB)
  • SEQ ID NO: 78 SDHC amino acid sequence IJ
  • SEQ ID NO: 79 Amino acid sequence of SDHA
  • SEQ ID NO: 80 SDHB amino acid sequence IJ
  • L-amino acids such as L-glutamic acid can be fermented and produced efficiently.

Abstract

　Ｌ－アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及びα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、Ｌ－アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ－アミノ酸を採取することにより、Ｌ－アミノ酸を製造する。                                                

Description

明 細 書
L一アミノ酸の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物を用いた L グルタミン酸等の L アミノ酸の製造法に関する。 L グルタミン酸は調味料原料等として、他の L アミノ酸は動物飼料用の添加物、健 康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
背景技術
[0002] 細菌を用いた発酵法によって L アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型細 菌（野生株)を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株 力 種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要 求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
[0003] 例えば、 L—グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミ クロバタテリゥム属に属するいわゆるコリネ型細菌の L グルタミン酸生産菌またはそ れらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献 1参照）。そ の他の菌株を用いた発酵法による L—グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、 ストレプトミセス属、ぺニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献 1参 照）、シユードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物 を用いる方法 (例えば、特許文献 2参照）、バチルス属、シユードモナス属、セラチア 属、ァェロバクタ一.ァエロゲネス（現ェンテロバクタ一.ァエロゲネス）等の微生物を 用いる方法 (例えば、特許文献 3参照）、ェシエリヒア'コリの変異株を用いる方法 (例 えば、特許文献 4参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニァ属又は パントテア属、ェンテロパクター属に属する微生物を用いた L グルタミン酸の製造 法も開示されて!/、る (例えば、特許文献 5〜 7参照）。
[0004] 近年は、 目的物質の発酵生産に組換え DNA技術を用いることが行われている。例 えば、 L アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文 献 8、特許文献 9)、又は L アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特 許文献 10)によって、細菌の L アミノ酸生産性を向上させることが行われている。 [0005] 例えば、 L—グルタミン酸生産では、コリネバタテリゥム属またはブレビバタテリゥム 属細菌において、ェシエリヒア'コリ又はコリネバタテリゥム 'グノレタミクム由来のクェン 酸シンターゼをコードする遺伝子の導入力 S、コリネ型細菌の L グルタミン酸生産能 の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献 11参照）。またコリ ネ型細菌由来のクェン酸シンターゼ遺伝子のェンテロバクター属、クレブシエラ属、 セラチア属、エルビニァ属、又はェシエリヒア属に属する腸内細菌への導入力 L グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文 献 12参照）。
[0006] また、微生物の α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ a - GDH)を欠損させること により、著量の L グルタミン酸を生産することが知られている（特許文献 13、特許文 献 14、特許文献 15)。
[0007] コハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH)は、コハク酸からフマル酸への反応を触媒する酵 素であり、コリネ型細菌では本酵素遺伝子を欠損することにより微量の L グルタミン 酸を生成することが報告されて!/、る（特許文献 16)。
一方、腸内細菌群に属するェシエリヒア'コリ（Esherichia coli)においてもコハク酸デ ヒドロゲナーゼ欠損株は知られているが（非特許文献 2)、 L グルタミン酸生産との 関連は知られていなかった。
[0008] また、 α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損したェシエリヒア'コリはコハク酸要 求性となる力 S、 SDHとの 2重欠損とすることでコハク酸要求性が回復することが知られ ている（非特許文献 2)。し力、し、 α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとコハク酸デヒド ログナーゼの二重欠損が L グルタミン酸等の L アミノ酸製造へ及ぼす効果は知ら れていない。
特許文献 1 :米国特許第 3, 220, 929号明細書
特許文献 2 :米国特許第 3, 563, 857号明細書
特許文献 3：特公昭 32— 9393号公報
特許文献 4 :特開平 5— 244970号公報
特許文献 5：特開 2000— 106869号公幸
特許文献 6 :特開 2000— 189169号公報 特許文献 7 :特開 2000— 189175号公報
特許文献 8 :米国特許第 5, 168, 056号明細書
特許文献 9 :米国特許第 5, 776, 736号明細書
特許文献 10 :米国特許第 5, 906, 925号明細書
特許文献 11 :特公平 7— 121228号公報
特許文献 12：特開 2000— 189175号公報
特許文献 13：欧州特許出願公開 771879号公報
特許文献 14：欧州特許出願公開 0952221号公報
特許文献 15：欧州特許出願公開 1078989号公報
特許文献 16：欧州特許出願公開 1106684号公報
非特許文献 1 :明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、 195〜215頁、 198 6年
非特許文献 2 : J Gen Microbiol. 1978 Jul; 107(1): 1-13
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、 L グルタミン酸等の L アミノ酸を効率よく生産することのできる細菌を 提供すること、及び該細菌を用いて L アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する ことを課題とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コハク酸デヒド ロゲナーゼ活性及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように細菌 を改変することにより、 L グルタミン酸等の L アミノ酸の生産性が向上することを見 出し、本発明を完成するに至った。
[0011] すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1) L アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及び α ケトグノレタル 酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、 L アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体より L アミノ酸を 採取する、 L アミノ酸の製造法。 (2)コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又は α—ケトグルタル酸デヒドロゲ ナーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊す ることにより、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又は α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ 活性が低下した、前記方法。
(3)コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が sdhA遺伝子、 sdhB遺伝子、 sd hC遺伝子及び sdhD遺伝子から選択される 1又は 2以上の遺伝子である前記方法。
(4) aーケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子力 sucA遺伝子、 odh A遺伝子、及び sucB遺伝子から選択される 1又は 2以上の遺伝子である、前記方法
(5)前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、またはコリネ型細菌である、前記方法
(6)前記アミノ酸力 グルタミン酸又は L グルタミン酸を前駆体として生合成され る L アミノ酸である前記方法。
(7)前記 L—アミノ酸力 L—アルギニン、 L—プロリン、 L—オル二チン、 Lーシトルリ ン、及び L グルタミンから選択される前記方法。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]ヘルパープラスミド RSF-Red-TERの構造を示す図。
[図 2]ヘルパープラスミド RSF-Red-TERの構築を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、本発明を詳細に説明する。
< 1〉本発明に用いる微生物
本発明の方法は、 L アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及び α ーケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を用いた
L アミノ酸の製造法である。
[0014] 本発明に用いる微生物は、 L アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、コハク 酸デヒドロゲナーゼ及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように 改変することによって得ること力できる。また、本発明に用いる微生物は、コハク酸デ ヒドロゲナーゼ及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変さ れた微生物を親株とし、 L アミノ酸生産能を付与又は増強することによって得ること ができる。
[0015] 本発明に用いる微生物は、本来的に L アミノ酸生産能を有するものであってもよ いし、変異法や組換え DNA技術などを利用した育種により L アミノ酸生産能を付 与されたものであってもよレ、。
[0016] ここで「L アミノ酸生産能」とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、 L アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。 好ましくは、同条件で培養された野生株又は非改変株よりも、多量の L アミノ酸を生 産する能力を有することをレ、う。
[0017] L アミノ酸としては、 L リジン、 L グルタミン酸、 L スレオニン、 L バリン、 L— ロイシン、 L イソロイシン、 L セリン、 L ァスパラギン酸、 L ァスパラギン、 L グ ノレタミン、 L アルギニン、 L システィン（シスチン）、 L メチォニン、 L フエニルァ ラニン、 L トリプトファン、 Lーチロシン、 L グリシン、 Lーァラニン、 L プロリン、 L オル二チン、 Lーシトルリン、 L—ホモセリンが挙げられるが、 L—グルタミン酸又は L グルタミン酸を前駆体とする L アミノ酸が好ましぐ特に L グルタミン酸、 Lーグ ノレタミン、 L プロリン、 L アルギニン、 L オル二チン、 L シトノレリンが好ましい。
[0018] 本発明の製造法において使用される微生物としては、細菌、例えばェシエリヒア属 、パントエア属、ェンテロパクター属等の腸内細菌科に属する微生物や、コリネバクテ リウム 'グルタミカム、ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム等のコリネ型細菌、バチ ルス ·サブチリス等のバチルス属細菌が挙げられる力 これらに制限されない。
[0019] 本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバタテリゥム属に分類されていた が、現在コリネバタテリゥム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41， 2 55(1991))、またコリネバタテリゥム属と非常に近縁なブレビバタテリゥム属細菌を含む 。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
[0020] コリネバタテリゥム.ァセトァシドフィラム
コリネバタテリゥム.ァセトグルタミカム
コリネバタテリゥム 'アル力ノリティカム
コリネバタテリゥム .カルナェ コリネバタテリゥム.ダルタミカム
コリネバクテリゥム.リリウム
コリネバタテリゥム .メラセコーラ
コリネバクテリウム'サ一モアミノゲネス（コリネバクテリゥム.エフイシエンス) コリネバクテリゥム.ノ、ーキユリス
ブレビバタテリゥム.ディバリカタム
ブレビバタテリゥム 'フラバム
ブレビバタテリゥム.インマリオフィラム
ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム（コリネバクテリゥム 'グルタミカム） ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム
ブレビバタテリゥム.サッカロリティカム
ブレビバタテリゥム .チォゲ二タリス
コリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム ·アルノくム
ブレビパクテリゥム 'セリヌム
ミクロバタテリゥム.アンモニアフィラム
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバタテリゥム 'ァセトァシドフィラム ATCC 13870
コリネバクテリウム'ァセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリゥム'カルナェ ATCC15991
コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060 コリネバタテリゥム.リリウム ATCC15990
コリネバクテリゥム.メラセコーラ ATCC 17965
コリネバタテリゥム.サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP - 1539) コリネバタテリゥム.ノヽーキユリス ATCC13868
ブレビパクテリゥム.ディバリカタム ATCC 14020
ブレビバタテリゥム.フラバム ATCC13826, ATCC14067 ブレビバタテリゥム.インマリオフィラム ATCC 14068
ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム ATCC13869 (コリネバタテリゥム.ダルタミ力 ム ATCC13869)
ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム ATCC13825
ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバタテリゥム .チォゲ二タリス ATCC19240
コリネバタテリゥム.アンモニアゲネス ATCC6871、 ATCC6872
ブレビバタテリゥム 'アルバム ATCC15111
ブレビバタテリゥム 'セリヌム ATCC15112
ミクロバタテリゥム.アンモニアフィラム ATCC15354
[0022] これらを入手するには、例えばアメリカン 'タイプ ·カルチヤ一 ·コレクション (ATCC:
住所 P.O. Box 1549， Manassas, VA 20108， 1, United States of America)より分譲を 受けること力 Sできる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、こ の登録番号を利用して分譲を受けることができる（http：〃 www.atc org/)。各菌株に 対応する登録番号はアメリカン'タイプ'カルチャー 'コレクションのカタログに記載さ れている。また、 AJ12340株は、 1987年 10月 27日付けで通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託セン ター）（〒 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM BP- 1539の受託番号でブダペスト条約に基づ!/、て寄託されて!/、る。
[0023] 本発明に用いる腸内細菌科に属する微生物としては、ェシエリヒア属、ェンテロバタ ター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エノレビ二ァ属、サノレモネラ属、モ ルガネラ属などに属し、 L アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限 定されない。具体的には NCBI (National Center for Biotechnology Information)デー タベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&k e印 =l&srchmode=l&unlock)。腸内細菌科の親株としては、中でもェシエリヒア属細菌 、ェンテロパクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
[0024] ェシエリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトノヽルト らの著書 (Neidhardt, F. C.et al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Ameri can Society for Microbiology, Washington D . C. , 1029 table 1 ) に挙げられるものが 利用できる。その中では、例えばェシエリヒア'コリが挙げられる。ェシエリヒア'コリとし ては具体的には、プロトタイプの野生株 K12株由来のェシエリヒア'コリ W31 10 (ATC C 27325)、ェシエリヒア'コリ MG 1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
[0025] 特に、パントエア属細菌、エルビニァ属細菌、ェンテロパクター属細菌は、 Ί プロ テオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である (J Gen Appl Microbiol 1997
Figure imgf000009_0001
355_«5り丄、 International Journal of systematic Bacteriology ，Oct. 1997，p l061- 1067)。近年、 DNA-DNAハイブリダィゼーシヨン実験等により、ェ ンテロパクター属に属する細菌には、パントエア'アグロメランス（Pantoea agglomeran s)又はパントエア.デイスバーサ (Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある。 (International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3)·ρ.337—345， )また 、エルビニァ属に属する細菌にはパントエア.アナナス（Pantoea ananas)、パントエア 'スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology Jan 1993;43(1)·ρ· 162- 173参照）。
[0026] ェンテロパクター属細菌としては、ェンテロパクター ·アグロメランス (Enterobacter a gglomeransリ、ェンテロノくクタ一 'ァェログネス (Enterobacter aerogenes)等; 0、举げら れる。具体的には、欧州特許出願公開 952221号明細書に例示された菌株を使用す ること力 S出来る。ェンテロパクター属の代表的な株として、ェンテロパクター 'アグロメ ランス ATCC 12287株が挙げられる。
[0027] パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア .アナナティス（Pantoea ananati s)、パントエア.スチューアルティ（Pantoea stewartii)パントエア'アグロメランス、パン トエア.シトレア（pantoea citrea)が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられ
[0028] パントエア ·アナナティス AJ 13355株（FERM BP-6614) (欧州特許出願公開 0952221 号明細書）
パントエア ·アナナティス AJ 13356株（FERM BP-6615) (欧州特許出願公開 0952221 号明細書） 尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開 0952221号明細書にはェンテロパクター- アグロメランスとして記載されている力 S、現在では、上記のとおり、 16S rRNAの塩基配 列解析などにより、パントエア ·アナナティスに再分類されている。
[0029] エルビニァ属細菌としては、エルビニァ 'アミ口ボーラ、エルビニァ '力ロトボーラが挙 げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ'プランティコーラが挙げられる。 具体的には、下記の菌株が挙げられる。
[0030] エルビニァ 'ァミロボーラ ATCC 15580株
エルビニァ '力ロトボーラ ATCC 15713株
クレブシエラ ·プランティコーラ AJ 13399株（FERM BP-6600) (欧州特許出願公開 955 368号明細書）
クレブシエラ .プランティコーラ AJ 13410株（FERM BP-6617) (欧州特許出願公開 955 368号明細書）
[0031] < 1 1〉L アミノ酸生産能の付与又は増強
以下、上記のような微生物に L アミノ酸生産能を付与する方法、又は上記のような 微生物の L アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
[0032] L アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、 L アミノ酸のアナログ耐 性株又は代謝制御変異株の取得や、 L アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強さ れた組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はェシエリヒア属細菌等のアミノ酸生 産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株)学会 出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、第 77〜； 100頁参照）。ここで、 L アミノ酸 生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の 性質は、単独でもよぐ 2種又は 3種以上であってもよい。また、発現が増強される L— アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、 2種又は 3種以上であってもよい。さらに、 栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増 強が組み合わされてもよい。
[0033] L アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御 変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわち X線や紫外 線の照射、または N メチルー N'—二トロー N 二トロソグァ二ジン等の変異剤処理 などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代 謝制御変異を示し、かつ L アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得る こと力 Sできる。また L—アミノ酸生産菌は、遺伝子組換えによって、 L—アミノ酸の生合 成系酵素の酵素活性を増強することによつても行うことが出来る。
[0034] 以下、 L アミノ酸生産能を付与する方法、及び L アミノ酸生産能が付与された 微生物について例示する。
[0035] 育種によって L グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、 例えば、 L グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強 するように改変する方法を挙げることができる。 L グルタミン酸生合成に関与する酵 素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA)、グルタミンシンテターゼ (g 1ηΑ)、グルタミン酸シンターゼ (gltAB)、イソクェン酸デヒドロゲナーゼ (icdA)、アコニット 酸ヒドラターゼ (acnA, acnB)、クェン酸シンターゼ (gltA)、ホスホェノールピルビン酸力 ルポキシラーゼ (ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ (ace EF， lpdA)、ピルビン酸キナーゼ (pykA, pykF)、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ（ ppsA)、エノラーゼ (eno)、ホスホグリセノレムターゼ (pgmA, pgml)、ホスホグリセリン酸キ ナーゼ (pgk)、ダリセルアルデヒドー3—リン酸デヒドロゲナーゼ (gapA)、トリオースリン 酸イソメラーゼ (tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ (ftp)、ホスホフルクトキナーゼ (pikA, ρ¾Β)、グルコースリン酸イソメラーゼ (pgi)、メチルクェン酸シンターゼ（prpC) などが挙げられる。尚、酵素名の後のカツコ内は、遺伝子名である（以下の記載にお いても同様)。
[0036] これらの遺伝子の発現を増強するための方法としては、これらの遺伝子を含む DN A断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺 伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、ま たは、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれ らの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国 際公開パンフレット W095/34672号参照）。
[0037] 上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子 を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればい かなるプロモーターであっても良ぐ用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよ いし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選 択することや、プロモーターの 35 10領域をコンセンサス配列に近づけることによ つても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クェン酸シン ターゼ遺伝子、イソクェン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、 及び/又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された 微生物としては、 WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開 1010755号明細書 等に記載された微生物が例示できる。
[0038] L グルタミン酸生産能を付与するための改変は、 L グルタミン酸の生合成経路 力 分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損さ せることにより行ってもよい。 L—グルタミン酸の生合成経路から分岐して L ダルタミ ン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクェン酸リアーゼ、 ァセトヒドロキシ酸シンターゼ、ァセト乳酸シンターゼ、ギ酸ァセチルトランスフェラー ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、 1 ピロリン 5—カル ボキシレートデヒドロゲナーゼ、ァセチル CoAハイド口ラーゼ（WO2006/057450)など が挙げられる。
[0039] 上記のような酵素の活性を低下または欠損させることは、後述のコハク酸デヒドロゲ ナーゼ活性及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるのと同様の 方法によって、行うこと力 Sできる。
[0040] さらにコリネ型細菌において L グルタミン酸生産能を付与する方法として、 yggB遺 伝子 (NCgl 1221 ; NP_600492. Reports smaU-conductance... [gi: 19552490])を増幅す る方法、コード領域内に変異を導入した変異型 yggB遺伝子を導入する方法を用いる ことも可能である（WO2006/070944)。
[0041] また、 L グルタミン酸生産能を向上させる方法として、 D キシルロース一 5 リン 酸フ才スフ才ケ卜ラーゼ (D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase )及び/又はフノレク トース一 6—リン酸ホスホケトラーゼ（fructose— 6— phosphate phosphoketolase)をコード する遺伝子（これらを併せてホスホケトラーゼと呼ぶ）を導入する方法が挙げられる。 例えば、ホスホケトラーゼ活性が上昇した微生物としては、以下の微生物が挙げら ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム ATCC13869 A sucA(pVK9_x )、
ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム ATCC13869 A sucA(pVK9_PS2_xpkA)
[0042] Lーグノレタミン酸生産能は、 6 ホスホダノレコン酸デヒドラターゼ活性もしくは 2 ケト
3—デォキシー 6—ホスホダルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性 を増強させることによつても付与すること力 S出来る。 6—ホスホダルコン酸デヒドラター ゼ活性、 2 ケトー 3 デォキシー 6 ホスホダルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させ た微生物としては、特開 2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。ま た、 L-グルタミン酸生産能は、 L-グルタミン酸排出遺伝子である yhfK遺伝子を増幅 することによつても付与することができる（WO2005/085419)。
[0043] また、本発明に用いる L グルタミン酸生産微生物としては、酸性条件下で培養し たときに液体培地中に L グルタミン酸の飽和濃度を越える量の L グルタミン酸を 蓄積する能力（以下、酸性条件下での L—グルタミン酸蓄積能ということがある）を有 する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報 1078989号記載の方法によ り、低 pH環境下で L グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することによ り、飽和濃度を超える量の L グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
[0044] 本来的に酸性条件下での L グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的に は、パントエア ·アナナティス AJ13355株（FERM BP-6614)、 AJ13356株（FERM BP-6 615)、 AJ1360 朱（FERM BP-7207) (以上、欧州特許出願公開 0952221号明細書参 照）、 SC17sucA株、 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、 NP106株、及び NA 朱などが 挙げられる。
パントエア.アナナティス AJ13355株は、静岡県磐田巿の土壌から、低 pHで L ダル タミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。 AJ13356 は、 AJ 13355株の a KGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA)を欠損させた株である。 パントエア.アナナティス AJ13355株及び AJ13356株は、平成 10年 2月 19日に、通 産省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現名称、産業技術総合研究所特許生 物寄託センター、住所郵便番号 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に、それぞれ受託番号 FERM P-16644、及び FERM P-16645として寄託され、平成 11年1月 11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP- 6614、及び FERM BP-6615が付与されている。尚、これらの株は、分離された当時は ェンテロノくクタ一'アグロメランス (Enterobacter agglomerans)と同定され、ェンテロバ クタ一 ·アグロメランス AJ13354、 AJ13355として寄託されたが、近年 16S rRNAの塩基 配列解析などにより、パントエア'アナナティス (Pantoea ananatis)に再分類されてい る（後記実施例参照）。また、後述する AJ13601も、同様にェンテロパクター 'アグロメ ランスとして前記寄託機関に寄託されている力 本明細書ではパントエア ·アナナティ スと記述する。 AJ13601は、 1999年 8月 18日に工業技術院生命工学工業技術研究 所 (現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所郵便番号 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P-17156として寄託さ れ、 2000年 7月 6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FER M BP-7207が付与されている。
[0045] また、パントエア'アナナティスの Lーグノレタミン酸生産菌として、 ケトグノレタレート デヒドロゲナーゼ（a KGDH)活性が欠損した、または、 a KGDH活性が低下したパン トエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、前述の AJ13356株、及び AJ 13355株力も粘液質低生産変異株として選択された SC 17株由来の sucA遺伝子欠 損株である SC17sucA (米国特許第 6,596,517号)がある。 SC17sucA株は、ブライべート ナンバー AJ417株が付与され、 2004年 2月 26日に産業技術総合研究所特許生物寄 託センター（住所郵便番号 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 受託番号 FERM BP-08646として寄託されている。
[0046] また、前記 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、 SC17sucA株に、ェシエリヒア'コリ由 来のクェン酸シンターゼ遺伝子（gltA)、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ 遺伝子（ppsA)、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA)を含むプラスミド R SFCPG、並びに、ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム由来のクェン酸シンターゼ 遺伝子（gltA)を含むプラスミド pSTVCBを導入して得た株である。 AJ1360 朱は、この SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低 pH下で高濃度の L—グルタミン酸に耐性を示 す株として選択された株である。また、 NP106株は、実施例に記載したように、 AJ1360 朱からプラスミド RSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。 [0047] L グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや 呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を 付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルォロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭 50-113209)、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭 57-065198)、 ゥレアーゼを弱化させる方法（特開昭 52-038088)、マロン酸耐性を付与する方法（特 開昭 52-038088)、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開 昭 56-1889)、 HOQNO耐性を付与する方法（特開昭 56-140895)、 α _ケトマロン酸耐 性を付与する方法（特開昭 57-2689)、グァニジン耐性を付与する方法（特開昭 56-35 981)、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平 4-88994)などが挙げられ
[0048] このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバタテリゥム.フラバム AJ3949 (FERMBP-2632 ;特開昭 50-113209参照） コリネバタテリゥム.グルタミカム AJ11628 (FERM Ρ-5736；特開昭 57-065198参照） ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11355(FERM P-5007；特開昭 56-1889号公報参照） コリネバタテリゥム.ダルタミカム AJ11368(FERM P-5020；特開昭 56-1889号公報参 照）
ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11217(FERM P-4318；特開昭 57-2689号公報参照） コリネバタテリゥム.ダルタミカム AJ11218(FERM P-4319；特開昭 57-2689号公報参 照）
ブレビバクテリウム'フラバム AJ11564(FERM P-5472；特開昭 56-140895公報参照） ブレビバタテリゥム.フラバム AJ11439(FERM P-5136；特開昭 56-35981号公報参照） コリネバタテリゥム .グルタミカム H7684(FERM BP-3004；特開平 04-88994号公報参 照）
ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ11426 (FERM P-5123；特開平 56-048890 号公報参照）
コリネバタテリゥム ·グルタミカム AJ11440 (FERM P-5137；特開平 56-048890号公報 参照）
ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ11796 (FERM P-6402；特開平 58-158192 号公報参照）
[0049] L グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナ ーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ (glnA)活性を強化した細菌、ダル タミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開 1229121号、 1424398号 明細書)。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラ ーゼ（glnE)の破壊、 PII制御タンパク質（glnB)の破壊によっても達成できる。また、ェ シエリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの 397位のチロシン残基が他のアミノ酸残 基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適な L グルタミン 生産菌として例示できる（米国特許出願公開第 2003-0148474号明細書)。
[0050] L グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、 6-ジァゾ -5-ォキソ-ノ ルロイシン耐性を付与する方法（特開平 3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチォ ニンスルホキシド耐性を付与する方法 (特開昭 61-202694)、 a -ケトマレイン酸耐性を 付与する方法（特開昭 56-151495)などが挙げられる。 L グルタミン生産能を有する コリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム'フラバム AJ 11573 (FERM P-5492；特開昭 56-161495) ブレビバタテリゥム.フラバム AJ 11576 (FERM BP-10381；特開昭 56-161495) ブレビバクテリウム'フラバム AJ12212 (FERM P-8123；特開昭 61-202694)
[0051] L プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、 L プロリンによるフィードバ ック阻害が解除された Ί ダルタミルキナーゼを保持する細菌や L プロリン分解系 が弱化した細菌が挙げられる。 L プロリンによるフィードバック阻害が解除された γ ーグルタミルキナーゼをコードする DNAを用いて細菌を改変する方法は、 Dandekar, A.M. , Uratsu, S.L. , J. Bacteriol. , 170， 12， 5943-5 (1988)に開示されている。また、 L プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナ ーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。 L プロリン 生産能を有する細菌の例としては、ェシエリヒア'コリ NRRL B-12403株及び NRRL B- 12404株（英国特許 2075056)， V PM B-8012株（米国特許公開 2002-0058315)，お よび、ドイツ特許 3127361号に開示されたプラスミド変異体や Bloom F.R.らの文献（T he 15th Miami winter symposium, 1983， p.34)に開示されたプラスミド変異体を保持 する菌株などが挙げられる。
[0052] また、 L—プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、 3,4-デヒドロキシプ 口リン、及びァザチジン一 2—カルボキシレートに耐性な株であるェシエリヒア'コリ 702 株（VKPMB-8011)や、 702株の ilvA欠損株である 702ilvA株（VKPMB-8012株）や、 b2 682および b2683、 bl242又は b3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強し たェシエリヒア'コリ等も挙げられる（特開 2002— 300874号公報)。
コリネ型細菌の L プロリン生産菌としては、 DL— 3, 4—デヒドロプロリン耐性株（F ERM BP-1219.米国特許 4224409号公報）、クェン酸合成酵素活性がその親株の 1. 4倍以上に上昇した株（FERM P-5332、 FERM P_5333、 FERM P_5342、 FERMP-534 3 特許 1426823号）、酢酸要求性が付与された株（FERM P-5931)が挙げられる。
[0053] L一口イシン生産能を有する微生物としては、例えば、 4-ァザロイシンまたは 5,5,5- トリフルォロロイシンに耐性を示すェシエリヒア.コリ H-9068株 (ATCC 21530)、 H-907 0株（FERM BP-4704)および H-9072株（FERM BP-4706) (米国特許 5,744,331)，お よび L一口イシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンター ゼを保持するェシエリヒア'コリ（欧州特許 1067191)、 β -2-チェ二ルァラニン及び 0 - ヒドロキシロイシンに耐性を示すェシエリヒア.コリ AJ11478株（米国特許 5,763,231)、 ェシエリヒア.コリ 57株（VKPM Β-7386,ロシア特許 Νο·2140450)などが挙げられる。
[0054] コリネ型細菌の L一口イシン生産菌としては、 2 チアゾールァラニンかつ β ハイ ドロキシロイシン耐性株（特開平 8-266295)、バリンアナログ耐性株（特開昭 63-24839 2)、ノ リン要求性株（特公昭 38-4395)、 S—（2 アミノエチル） L システィン (ΑΕ C)耐性株（特公昭 51-37347)、フエ二ルァラニン、バリン、イソロイシン要求性株（特 公昭 54-36233)が挙げられる。
[0055] L システィン生産能を有する微生物としては、フィードバック阻害が解除されたセ リンァセチルトランスフェラーゼをコードする cysE遺伝子アレルで形質転換されたェシ エリヒア'コリ JM15株 (米国特許 6,218, 168)、細胞毒性物質を排除するタンパク質をコ ードする遺伝子を過剰発現するェシエリヒア'コリ W3110株（米国特許 5,972,663)、シ スティンデスルフヒドラーゼ活性を低下させたェシエリヒア'コリ（特開平 11— 155571) 、 cysB遺伝子によってコードされるシスティンレグロンの転写活性化因子を増幅した ェシエリヒア ·コリ W3110株（WO01/27307)などが挙げられる。
[0056] L イソロイシン生産能を有する微生物としては、例えば、 6-ジメチルァミノプリン耐 性を示すェシエリヒア属細菌の変異株（特開平 5-304969)、 L イソロイシンヒドロキサ メート、チアイソロイシン、 DL ェチォニンまたはアルギニンヒドロキサメートに耐性を 示す変異株（特開平 5-130882)、スレオニンデアミナーゼ遺伝子及びァセトヒドロキシ 酸シンターゼ遺伝子が増幅された組換え株（特開平 2-458、特開平 2-42988、特開平 8-47397)などが挙げられる。
[0057] コリネ型細菌の L イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコ ードする brnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開 2001-169788)、 L リジン生産菌 とのプロトプラスト融合により L イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭 6 2-74293)、ホモセリンデヒドロゲナーゼを 強化したコリネ型細菌（特開昭 62-91193) 、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭 62-195293)、 aーケトマロン耐性株（ 特開昭 61-15695)、メチルリジン耐性株（特開昭 61-15696)が挙げられる。
[0058] Lーバリン生産能は、例えば、 ilvGMEDAオペロンによってコードされる Lーバリン合 成酵素、特に ilvG遺伝子によってコードされるァセトヒドロキシレートシンターゼの活 性を増加させることによって付与することができる（特公平 02-748418)。 Lーバリン合 成酵素は L—パリンによるフィードバック阻害が解除されたものであってもよい。 L- ノ リン生産能は、ァセトラクテートシンターゼ III遺伝子 (ilvIH遺伝子)の発現を低下さ せることによつても付与すること力 Sできる。
[0059] さらに、細菌にアミノ酸アナログ耐性を付与することによって L パリン生産能を付 与することもできる。そのような細菌の例としては、例えば、 L—イソロイシン及び Lーメ チォニン要求 1·生であり、 D リボース、プリンヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオ シドに B1生を示す変異株（FERM P-1841 , FERM P-5556;特開昭 53— 025034)ゃポ リケチド耐性を示す変異株（FERM P-9325;特許第 01934507号）が挙げられる。
[0060] Lーバリン生産菌の例としては、アミノアシル t-RNAシンテターゼの変異を有する変 異株 (米国特許第 5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシン tRNAシンテターゼ をコードする ileS遺伝子に変異を有する E. coli VL1970が使用できる。 E. coli VL197 0は、 1988年 6月 24日、ルシアン ·ナショナル ·コレクション ·ォブ ·インダストリアル 'マイ クロオノレガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545， Russia)に、受 託番号 VKPM B-4411で寄託されている。
[0061] さらに、生育にリポ酸を要求する、及び/または、 H+-ATPaseを欠失している変異株 (WO96/06926)を親株として用いることができる。
[0062] コリネ型細菌の L パリン生産菌としては、例えば、 Lーバリン酸生合成に関与する 酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる 。 L バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、 ilvBNCオペロン、すなわち il vBNをコードするァセトヒドロキシ酸シンタ一ゼやイソメロリダクターゼ (ilvCX 国際公開 パンフレット WO00-50624号 ）が挙げられる。尚、 ilvBNCオペロンは、 Lーノ リン及び /又は L イソロイシン及び/又は L一口イシンによるオペロンの発現調節を受けるの で、生成する Lーバリンによる発現抑制を解除するためにァテニユエーシヨンを解除 することが望ましい。
[0063] Lーァラニン生産能を有する微生物としては、例えば、 H+-ATPase活性が欠損した コリネ型細菌（Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534_40)ゃァスパラギン酸 βーデカルボキシラーゼ遺伝子が増幅されたコリネ型細菌（特開平 07-163383)など が挙げられる。
[0064] L アルギニン生産能を有する微生物としては、 α メチルメチォニン、 ρ フルォ 口フエ二ルァラニン、 D アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、 AEC (S— (2—アミ ノエチル）一システィン）、 a—メチルセリン、 /3—2—チェ二ルァラニン、又はスルフ ァグァ二ジンに耐性を有するェシエリヒア .コリ変異株（特開昭 56-106598号公報参照 )等が挙げられる。また、 L アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し 、かつ、高い活性を有する N ァセチルグルタミン酸シンターゼを保持する L アル ギニン生産菌である、ェシエリヒア'コリ 237株（ロシア特許出願第 2000117677号)も、 好適な L—アルギニン生産株である。同株は、 2000年 4月 10日にロシアン'ナショナ ノレ.コレクション.ォブ.インダストリアル.マイクロオーガニズム（Russian National Colle ction of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika)に VKPM B— 7925の受託 番号で寄託され、 2001年 5月 18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された 。 237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させた L アルギニン生産菌である、ェシェ リヒア 'コリ 382株（特開 2002-017342号公報）を用いることもできる。ェシエリヒア'コリ 38 2株 ί 、 2000年 4月丄 0日 ίこ Russian National Collection of Industrial Microorganisms ^ V PM)に VKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
[0065] また L アルギニン生産能を有する微生物として、 L アルギニン生合成に関与す る酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例え ば、 L—アルギニン生合成系酵素しては、 N ァセチルグルタミン酸シンターゼ（argA )、 N ァセチルダルタミルリン酸レダクターゼ（argC)、オル二チンァセチルトランスフ エラーゼ（argj)、 N-ァセチルグルタミン酸キナーゼ（argB)、ァセチルオル二チントラン スアミナーゼ（argD)、ァセチルオル二チンデァセチラーゼ（argE)オル二チン力ルバ モイルトランスフェラーゼ（argF)、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG)、アルギニノコ ハク酸リアーゼ（argH)力ルバモイルリン酸シンターゼ（carAB)から選ばれる 1種又は 2 種以上が挙げられる。 N-ァセチルグルタミン酸シンターゼ（argA)は、野生型の 15位 〜； 19位に相当するアミノ酸配列が置換された L アルギニンによるフィードバック阻 害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開 1170361号 明細書)。
[0066] コリネ型細菌の L アルギニン生産菌としては、 L アルギニン生産能を有するもの であれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、 2—チアゾールァラ ニン又は α アミノー βーヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌； 2 チアゾールァラニン耐性に加えて、 L—ヒスチジン、 L—プロリン、 Lースレオニン、 L イソロイシン、 L メチォニンまたは L トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌 (特開昭 54-4409号）；ケトマロン酸、フルォロマロン酸又はモノフルォロ酢酸に耐性を 有するコリネ型細菌（特開昭 57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細 菌（特開昭 62-24075号）；または、 X グァニジン (Xは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体） に耐性を有するコリネ型細菌（特開平 2-186995号)等が挙げられる。
[0067] また、 L アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、 5 ァザゥラシル、 6 ァザゥ ラシル、 2 チォゥラシル、 5 フルォロウラシル、 5 ブロモウラシル、 5 ァザシトシ ン、 6 ァザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、 2 チォゥラシ ルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び 6—ァザゥラシルに耐性な変異 株（特開昭 49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリブトファンアナログに耐性な変 異株（特開昭 52-114092号）；メチ二オン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソ口イシ イン、リジン、アデユン、グァユンまたはゥラシルほたはゥラシル前駆体）の少なくとも 一つに要求性を有する変異株（特開昭 52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに 耐性な変異株（特公昭 51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な 変異株（特開昭 58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニス ト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭 52-8729号）；アル ギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、 D アルギニン、カナバニン耐— 性、アルギニンヒドロキサメート及び 6 ァザゥラシル耐性の変異株（特開昭 53-14328 8号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭 53-3586号)等として育種することがで きる。
L アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株 が挙げられる。
[0068] ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ11169 (FERM P-4161)
ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム AJ12092 (FERM P-7273)
ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ11336 (FERM P-4939)
ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ11345 (FERM P-4948)
ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム AJ12430 (FERM BP-2228)
[0069] さらにアルギニンリブレッサーである ArgRを欠損した株 (米国特許出願公開 2002-00 45223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株 (米国特許出願公開 2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
[0070] Lーシトルリン、 L—オル二チンも L—アルギニンと生合成経路が共通しており、 N- ァセチルグルタミン酸シンターゼ（argA)、 N ァセチルダルタミルリン酸レダクターゼ (argC)、オル二チンァセチルトランスフェラーゼ（argj)、 N-ァセチルグルタミン酸キナ ーゼ（argB)、ァセチルオル二チントランスアミナーゼ（argD)、ァセチルオル二チンデ ァセチラーゼ (argE)の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与する こと力 Sできる。 （国際公開 2006-35831号パンフレット）
[0071] L リジン生産能を有する微生物としては、例えば、 L リジン生産能を有する Lーリ ジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株、具体的には、ェシエリヒア .コリ AJ11442株 (FERM BP-1543, NRRL B-12185；特開昭 56-18596号公報及び米国特許第 434617 0号明細書参照）、ェシエリヒア'コリ VL61 朱（特開 2000— 189180号公報）等が挙げ られる。また、ェシエリヒア'コリの L リジン生産菌として、 WC196株（国際公開第 96/1 7930号パンフレット参照）を用いることも出来る。 WC196株は、ェシエリヒア'コリ K-12 由来の W3110株に AEC(S—（2—アミノエチル） システィン)耐性を付与することによ つて育種されたものである。同株は、ェシエリヒア'コリ AJ13069株と命名され、平成 6 年 12月 6日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター、 T 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番地 1 中央第 6)に受託番号 FERM P-14690として寄託され、平成 7年 9月 29日にブ ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-5252が付与されて いる。
コリネ型細菌の L リジン生産菌としては、 L リジン生産能を有するコリネ型細菌と しては、 S— (2—アミノエチル） システィン (以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（ ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ11082 (NRRL B-11470)株など：特公昭 56- 1914号公報、特公昭 56-1915号公報、特公昭 57-14157号公報、特公昭 57-14158号 公報、特公昭 57-30474号公報、特公昭 58-10075号公報、特公昭 59_4993号公報、 特公昭 61-35840号公報、特公昭 62-24074号公報、特公昭 62-36673号公報、特公 平 5-11958号公報、特公平 7-112437号公報、特公平 7-112438号公報参照）；その生 育に L ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭 48-28078号公報、特公 昭 56-6499号公報参照）； AECに耐性を示し、更に L ロイシン、 L ホモセリン、 L— プロリン、 Lーセリン、 L—アルギニン、 Lーァラニン、 Lーノ リン等のアミノ酸を要求す る変異株 (米国特許第 3708395号及び第 3825472号明細書参照）； DL— aーァミノ - ε—力プロラタタム、 α —ァミノ一ラウリルラタタム、ァスパラギン酸一アナログ、スル ファ剤、キノイド、 Ν ラウロイルロイシンに耐性を示す L リジン生産変異株;ォキザ 口酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示す L リジン生産変異株（特開昭 50-53588号公報、特開昭 50-31093号公報、特開昭 52- 102498号公報、特開昭 53-9394号公報、特開昭 53-86089号公報、特開昭 55_9783 号公報、特開昭 55-9759号公報、特開昭 56-32995号公報、特開昭 56-39778号公報 、特公昭 53-43591号公報、特公昭 53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求 する L リジン生産変異株（特開昭 55-9784号公報、特開昭 56_8692号公報）；フルォ 口ピルビン酸または 34°C以上の温度に対して感受性を示す L リジン生産変異株（ 特開昭 55-9783号公報、特開昭 53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し 、 L リジンを生産するブレビバタテリゥム属またはコリネバタテリゥム属の生産変異株 (米国特許第 4411997号明細書）などが挙げられる。
[0073] また、 L リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによつても、 L リジン生産能 が付与された微生物を得ることが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコード する遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、発現調節配列を改変することによ つて、達成できる。
[0074] L リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素 遺伝子（dapA)、ァスパルトキナーゼ遺伝子 (lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ 遺伝子 (dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子 (lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロ ゲナーゼ遺伝子 (ddh) (以上、国際公開第 96/40934号パンフレット）、ホスホェノール ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 (ppc) (特開昭 60-87788号公報）、ァスパラギン 酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子 (aspC) (特公平 6-102028号公報）、ジアミノピメリン 酸ェピメラーゼ遺伝子 (dapF) (特開 2003-135066号公報）、ァスパラギン酸セミアルデ ヒド脱水素酵素遺伝子（asd) (国際公開第 00/61723号パンフレット)等のジアミノビメリ ン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開 2000- 157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。
また、ァスパルトキナ一ゼ III遺伝子（lysC)は、 L リジンによるフィ一ドバック阻害を 受けなレ、ように改変した遺伝子を用いることが望ましレ、。このようなフィ ドバック阻害 を受けないように改変した lysC遺伝子は、米国特許 5,932,453号明細書に記載の方 法により取得できる。
[0075] さらに、 L リジン生産能を有する微生物は、 L リジン以外の化合物を生成する反 応を触媒する酵素の活性や、 L リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または 欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカ ルポキシラーゼ（cadA, ldcC)、マリックェンザィムがあり、該酵素の活性が低下または 欠損した株は、国際公開第 W095/23864号、第 WO96/17930号パンフレット、第 W02 005/010175号パンフレットなどに記載されている。
[0076] L トリブトファン生産能を有する微生物として好ましいものは、アントラニル酸合成 酵素活性、ホスホダリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ 活性のうち、 1又は 2以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素 及びホスホダリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれ L トリプトファン及び Lーセリン によるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより 、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素 遺伝子（trpE)、及び/又はホスホダリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA)を、フィ ードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を細菌に導入する ことによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌 としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するェシエリヒア'コリ SV164に、脱感作型ホスホダリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型 serAを持 つプラスミド PGH5 (国際公開第 94/08031号パンフレット参照）を導入することによって 得られる形質転換株が挙げられる。
[0077] また、トリプトファンオペロンを含む組換え DNAを導入することによつても L—トリプト ファン生産能を付与することができる。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵 素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたェシエリヒア.コリが 挙げられる（特開昭 57-71397号公報、特開昭 62-244382号公報、米国特許第 4,371,6 14明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする 遺伝子 (trpBA)の発現を強化することによつても、 L トリブトファン生産能を向上又 は付与することカできる。トリプトファンシンターゼは、 α及び /3サブユニットからなり、 それぞれ trpA、 trpBによってコードされている。
[0078] また、トリプトファンオペロンのリプレッサーをコードする trpRを欠損させる力、、または t rpRにリプレッサーの活性が低下するような変異を導入することによって L トリプトフ アン生産能を付与してもよい（米国特許第 4,371,614号公報、国際公開第 WO2005/0 56776号パンフレット）。 [0079] また、マレートシンターゼ.イソシトレートリアーゼ.イソシトレートデヒドロゲナーゼキ ナーゼ /フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現する力、、又は同ォ ペロンの発現が強化された細菌も好適な L トリブトファン生産菌である。具体的には 、 aceオペロンのプロモーターがリプレッサーである iclRによって抑制を受けないこと、 又は抑制が解除されていることが望ましぐこのような細菌は iclR遺伝子を破壊するこ とによって、達成することができる。
aceオペロンの発現が強化された細菌は、 aceオペロンを含む DNAを強力なプロモ 一ターに連結し、これをプラスミドや相同組換えによって、細菌内に導入することや、 トランスポゾンによって上記 DNAを多コピー存在させることによって達成できる。
[0080] さらに、 L トリプトファン生産能を有する微生物として、 L フエ二ルァラニン及び L ーチロシン要求性の形質を有する菌株ェシエリヒア.コリ AGX17(pGX44)〔NRRL B-12 263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミド pGX50を保持する AGX6(pGX50) aroP CNRRL B_12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げら れる。
[0081] L—トリプトファン生産能を有するコリネ型細菌としてはサルファグァ二ジンに耐性株 であるコリネバタテリゥム 'グルタミクム AJ12118 (FERM BP-478 特許 01681002号）、 トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開 S63240794号公報）、コリネ型 細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開 0199 4749号公報）を用いることができる。
[0082] L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラニン、 Lーチロシンは共に芳香族アミノ酸で生合 成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、 デォキシァラビノーヘプッロン酸リン酸シンターゼ (aroG)、 3—デヒドロキネートシンタ ーゼ（aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ (aroE)、シキミ酸キナーゼ（aroL)、 5—エノー ル酸ピルビンシキミ酸 3—リン酸シンターゼ（aroA)、コリスミ酸シンターゼ (aroC)が挙 げられる。 （欧州出願公開 763127号明細書)従って、これらの酵素をコードする遺伝 子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産 能を向上させること力 Sできる。また、これらの遺伝子はチロシンリブレッサーによって制 御されることが知られており（tyrR)、 tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族ァ ミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許 763127号明細書参照）。
[0083] L—フエ二ルァラニン生産能を有する微生物としては、 tyrA，tyrRが欠損したェシエリ ヒア.コリ AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (V PM B_8197)、変異型 pheA34遺伝子を保持 する E.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、 E. coli MWEC101-b (KR8903681)、 E.coli NRRL B- 12141， NRRL B- 12145， NRRL B- 12146及び NRRL B -12147 (米国特許第 4,407,952号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられるが、 これらに限定されない。また、 Ε· coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566) 、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP— 12659)、 E. coli K-12 [W3110 (ty rA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及び AJ 12604と命名された Ε· coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP- 3579)も使用できる (EP 488424 Bl)。また、 フエ二ルァラニン排出遺伝子である yddG、 yedA増幅株（国際公開第 03/044192号パ ンフレット、米国特許出願公開 2003/0148473 A1及び 2003/0157667 A1)が挙げられ
[0084] コリネ型細菌のフエ二ルァラニン生産菌としては、ホスホェノールピルビン酸カルボ キシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバタテリゥム'ダルタミカム BPS-13株 (FERM BP-1777, 77 (FERM BP-2062)及び 78 (FERM BP-2063) (欧 州特許公開公報 331145号 JP 02303495)、チロシン要求性株（JP 05049489)等を使 用すること力 Sでさる。
[0085] Lースレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、 Lースレオニン生合成 系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。 Lースレオニン生合成 系酵素をコ―ドする遺伝子としては、ァスノ ルトキナ―ゼ III遺伝子（lysC)、 ァスパラギ ン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd)、 thrオペロンにコードされるァスパ ルトキナーゼ I遺伝子（thrA)、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB)、スレオニンシンター ゼ遺伝子 (thrC)が挙げられる。カツコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺 伝子は 2種類以上導入してもよい。 Lースレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分 解が抑制されたェシエリヒア属細菌に導入してもよ!/、。スレオニン分解が抑制された ェシエリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損した TD H6株（特開 2001— 346578号）等が挙げられる。 [0086] Lースレオニン生合成系酵素は、最終産物の Lースレオニンによって酵素活性が抑 制される。従って、 Lースレオニン生産菌を構築するためには、 Lースレオニンによる フィードバック阻害を受けないように L スレオニン生合成系遺伝子を改変することが 望ましい。また、上記 thrA、 thrB、 thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成している 、スレオニンオペロンは、ァテニユエ ター構造を形成しており、スレオニンオペ口 ンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、ァテニユエーシヨン により発現が抑制される。この改変は、ァテニユエーシヨン領域のリーダー配列あるい は、ァテニユエ一ターを除去することにより達成出来る。 (Lynn, S. P., Burton, W. S.， Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I. , and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987);国際公開第 02/26993号パンフレット；国際公開第 2005/049808号パン フレット参 ffi)
[0087] スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロ モーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成 関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配さ れるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。 （欧州特許第 0593792号明細書参照 )また、 L スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにェシエリヒア属細菌を 改変するために、 a -amino- β - hydroxyvaleric acid (AHV)に耐性な菌株を選抜 することも可能である。
[0088] このように Lースレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレ ォニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモータ 一に連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドに よる増幅の他、トランスポゾン、 Mu—ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転 移させることによつても達成出来る。
[0089] Lースレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、 TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝 子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適で ある。これらの Lースレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ (pntAB)遺伝子（欧州特許 733712号明細書）、ホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラーゼ遺伝子（p印 C) (国際公開 95/06114号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸 シンターゼ遺伝子（pps) (欧州特許 877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス 属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開 99/18228号パンフレット、欧 州出願公開 1092776号明細書）が挙げられる。
[0090] また、 Lースレオニンに耐性を付与する遺伝子、 L—ホモセリンに耐性を付与する遺 伝子の発現を強化することや、宿主に Lースレオニン耐性、 L—ホモセリン耐性を付 与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、 rhtA遺伝子 (Res. Microbio 1. 154: 123 - 135 (2003))、 rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第 0994190号明細書）、 rht C遺伝子（欧州特許出願公開第 1013765号明細書）、 yfiK、 yeaS遺伝子（欧州特許出 願公開第 1016710号明細書）力 S挙げられる。また宿主に Lースレオニン耐性を付与す る方法は、欧州特許出願公開第 0994190号明細書や、国際公開第 90/04636号パン フレット記載の方法を参照出来る。
[0091] Lースレオニン生産能を有する微生物として、ェシエリヒア'コリ VKPM B-3996株（米 国特許第 5, 175, 107号明細書参照）を例示することも出来る。この VKPM B-3996株は 、 1987年 11月 19日にロシアン ·ナショナル 'コレクション ·ォブ ·インダストリアル 'マイ クロオーカニズム (Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU Genetika )に登録番号 VKPM B-3996のもとに寄託されている。また、この VKP M B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミド pAY C32 (Chistorerdov, Α. Υ·， and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16， 161-167 (1986)を参照 のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン： thrABC)を揷入して得ら れたプラスミド PVIC40 (国際公開第 90/04636号パンフレット）を保持して!/、る。この pVI C40においては、スレオニンオペロン中の thrAがコードするァスバルトキナーゼ I ホ モセリンデヒドロゲナーゼ Iの、 Lースレオニンによるフィードバック阻害が解除されて いる。
[0092] また、ェシエリヒア'コリ B-5318株 (欧州特許第 0593792号明細書参照)も好適な L スレオニン生産能が付与された細菌として例示することができる。 B-5318株は、 1987 年 11月 19日にロシアン ·ナショナル ·コレクション ·ォブ ·インダストリアル ·マイクロォー 力ニスム (Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNU G enetika )に登録番号 VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこの VKPM B-5318 株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性 C1リプレッサー 、 PRプロモーターおよび Croタンパク質の N末端部分の下流に、本来持つ転写調節 領域であるァテニユエ一ター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン 生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージ のリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミド DNAを保持して!/ヽる。
[0093] 本発明に用いる L アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以 外に、糖の取り込み、糖代謝 (解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅さ れていてもよい。
[0094] 糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込 み遺伝子が挙げられ、グルコース 6 リン酸イソメラーゼ遺伝子 (pgi ;国際公開第 01/ 02542号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願 公開 877090号明細書）、ホスホダルコムターゼ遺伝子（pgm ;国際公開 03/04598号パ ンフレット）、フルクトースニリン酸アルドラーゼ遺伝子（ftp;国際公開 03/04664号パン フレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開 03/008609号パンフレット）、ト ランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開 03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺 伝子（fom;国際公開 01/02545号パンフレット）、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ 遺伝子（pps;欧州出願公開 877090号パンフレット）、 non-PTSシュクロース取り込み遺 伝子遺伝子（csc;欧州出願公開 149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（ scrABオペロン；国際公開第 90/04636号パンフレット）が挙げられる。
[0095] エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子 (pntAB;
米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロム bo型ォキシダーゼ（cytochrome bo type o xidase)遺伝子 (cyoB欧州特許出願公開 1070376号明細書)が挙げられる。
[0096] 本発明に用いる微生物は、上記のような L アミノ酸生産能を有する微生物であつ て、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及び αケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低 下するように改変された微生物である。
[0097] < 1 2〉コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活 性の低下 本発明において、「酵素活性が低下する」とは、非改変株、例えば親株又は野生株 に比べてコハク酸デヒドロゲナーゼ活性、及び α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ 活性が低!/、ことを意味し、酵素活性が完全に消失して!/、ることを含む。
[0098] コハク酸デヒドロゲナーゼ（以下、「SDH」と記載することがある）は、 EC: 1.3.99.1の以 下の反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明において、 SDH活性とは、この反 応を触媒する活性を意味する。
[0099] コハク酸 + FAD ^フマノレ酸 + FADH
[0100] SDHは、微生物種によって、 3つまたは 4つのサブユニット構造力、ら構成されており
、これらのうち少なくとも 1種のタンパク質を正常に機能しないように改変することによ つて達成できる。具体的には、 SDHは以下のサブユニット（カツコ内はサブユニットを コードする遺伝子名）から構成されており、種によっては membrane anchor proteinを s dhC単独で、あるいは sdhCと sdhDでコードして!/、るものがある。
[0101] SDHA： flavoprotein subunit (sdhA)
SDHB： Fe_S protein suounit sdhB)
SDHC： membrane anchor protein (sdhC)
SDHD： membrane anchor protein (sdhD)
[0102] また、 SDHサブユニット複合体は、 SDHとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有して いる場合がある。例えば、コリネ型細菌の SDHサブユニット複合体は、 SDHとフマル酸 レダクターゼの両方の活性を有してレ、る（WO2005/021770)。
[0103] SDH活性の確認は、 2，6-dichloroindophenol (DCIP)の還元を指標として測定するこ とで行うこと力 Sできる。具体的な方法は Tatsuki urokawa and Junshi Sakamoto, Arch
Microbiol (2005) 183: 317-324に記載されている。
本発明においては、 SDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含 むオペロンを総称して「SDHをコードする遺伝子」と!/、うことがある。
[0104] 腸内細菌の SDHをコードする遺伝子として、パントエア ·アナナティスの遺伝子の塩 基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号 1〜6に示す。
[0105] コリネ型細菌の SDHをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバタテリゥム ·グルタ ミカムの sdhオペロン（GenBank accession No.NCgl0359 (sdhC) NCgl0360(sdhA) NCg 10361(sdhB))、及びブレビバタテリゥム 'フラバムの sdhオペロン（特開 2005-095169号 、 EP1672077A1)の配列が開示されている。
[0106] コリネ型細菌の SDHをコードする遺伝子として、コリネバタテリゥム.ダルタミカム ATC C 13032の遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号 73〜7 6に、ブレビバタテリゥム.ラタトフアーメンタム（コリネバクテリゥム.グルタミカム） ATCC 13869の遺伝子の塩基配列及び各サブユニットを配列番号 77〜80に示す。
[0107] 本発明において、 α —ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「a _KGDH」<^いうこ とがある）活性とは、 aーケトグルタル酸（2—ォキソダルタル酸)を酸化的に脱炭酸し 、サクシ二ルー CoA(succinyト CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記 反応は、 a - GDH (Elo : a— ketoglutarate dehydrogenase, EC: 1.2.4.2)、ジヒドロリ ポアミド S―サクシニノレトランスフェラーゼ (E2o： dihydrolipoamide-S-succinyltransfera se; EC:2.3. 1.61)、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3 : dihydrolipoamide dehydrog enase; EC: 1.8.1.4)の 3種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの 3種類のサ ブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら 3つの反応を合わせた反応を触媒 する活性を a -KGDH活性と!/、う。 a -KGDH活性の確認は、 Shiioらの方法（Isamu Shi io and Kyoko Ujigawa- Takeda, Agric.Biol.Chem.，44(8)，1897- 1904, 1980)に従って測 定すること力 Sでさる。
[0108] Eio: 2_oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
= [dihydrolipoyllysine-resiaue succinyltransrerase] ¾-succinyidihydrolipoyllysine + CO
E2o： CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine = succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl) lysine + NAD = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH +
H+
[0109] なお、 α -KGDHは、ォキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenas e)、 2-ォキソグノレタノレ酸デヒドロゲナーゼ（2- oxoglutarate dehydrogenase)とも呼ばれ
[0110] 腸内細菌科、例えばパントエア ·アナナティスでは、この 3種それぞれの酵素活性を 有するサブユニットタンパク質が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各 々sucA、 sucB及び lpdによってコードされ、 sucA、 sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロ ゲナーゼアイロンースルファープロテイン遺伝子（sdhB)の下流に存在して!/、る（米国 特許第 6,331,419号)。尚、同特許には、これらの遺伝子はェンテロパクター 'アグロメ ランス AJ13355の遺伝子として記載されている力 S、同菌株は、後にパントエア.ァナナ テイスに再分類されている。
[0111] 腸内細菌の α -KGDHをコードする遺伝子として、パントエア'アナナティスの sucA、 sucB及び下流に存在する sucC遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配 列を、配列番号 7〜11に示す。また、ェシエリヒア'コリの α -KGDHをコードする sucA 、 sucB及び sucC遺伝子は、それぞれ GenBank NP.415254, NP_415255に開示されて いる。
[0112] また、コリネ型細菌では、 Eloサブユニットは odhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれる 。 GenBank Accession No. NC_003450の NCgll084として登録されている）によってコ ードされ、 E3サブユニットは lpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642)によってコ ードされている。一方、 E2oサブユニットは、 Eloサブユニットとともに 2機能性タンパク 質として odhA遺伝子にコードされているか（Usuda et al.， Microbiology 1996 142， 334 7-3354参照）、あるいは odhA遺伝子とは別の GenBank Accession No. NC_003450の NCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。 従って、本発明においては、 odhA遺伝子は、 Eloサブユニットをコードする遺伝子で ある力 併せて E2oをコードしていてもよい。
[0113] ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタムの odhA遺伝子の塩基配列及び Eloサブュ ニットのアミノ酸配列（GenBank Accession No. NC_003450の NCgll084、 WO2006/02 8298)を、配列番号 12、 13に示す。また、上記 GenBank Accession No. NC.003450 の NCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされる E2oサブユニットのアミノ酸配 列を、配列番号 14、 15に示す。
本発明においては、 α— KGDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれ らを含む遺伝子クラスターを総称して、「α— KGDHをコードする遺伝子」ということが ある。 各酵素活性を低下させることは、例えば、以下の方法により行うことができる。
[0114] (1)遺伝子組換えにより、各酵素をコードする遺伝子を破壊する方法
遺伝子組換えにより、 SDH又は α -KGDH (以下、単に「酵素」と記載することがある )をコードする遺伝子を改変することにより、親株、あるいは野生株に対して細胞あた りのこれらの遺伝子がコードする酵素タンパク質の分子の数を減少又はさせる力、、又 は酵素タンパク質分子を全く生成させなくすることができる。また、酵素タンパク質の 分子当たりの酵素活性を低下又は喪失させてもよい。酵素タンパク質分子の数は、 同酵素をコードする遺伝子の発現量を低下させることにより減少させることができる。 遺伝子の発現量の低下には、同遺伝子から転写される mRNAの転写量の低下、及び 同 mRNAの翻訳量の低下が含まれる。また、酵素タンパク質分子を全く生成させなく すること、あるいは酵素タンパク質の分子当たりの活性を低下又は喪失させることは、 同酵素をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。比較対象となる野生 株としては、パントエア'アナナティス AJ13355株、クレブシエラ'プランティコーラ AJ13 399株、コリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032、ブレビバタテリゥム'ラクトファー メンタム ATCC13869、ブレビバタテリゥム.フラバム ATCC14067等が挙げられる。
[0115] 改変する SDHをコードする遺伝子としては、 SDHの各サブユニットのいずれをコード する遺伝子の 1つ又はそれ以上であってもよぐまた、オペロン全体であってもよいが 、それぞれのサブユニット（SDHA、 SDHB、 SDHC、 SDHD)をコードする遺伝子に変異 を導入してもよい。
[0116] また、改変する a -KGDHをコードする遺伝子としては、 a -KGDHの各サブユニット のいずれをコードする遺伝子の 1つ又はそれ以上であってもよぐまた、遺伝子クラス ター全体であってもよいが、 Eloサブユニットをコードする遺伝子（sucA又は odhA)、 あるいは E2oサブユニットをコードする遺伝子（sucB)が好ましい。
[0117] 微生物が属する種又は菌株によって、 SDH又は α -KGDHの各サブユニットをコー ドする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、それらをコードする遺伝 子は酉己歹 IJ番号 1、 7、 12、 14、 73、 77、又は 81の塩基酉己歹 IJのノ リアントであってもよ い。各遺伝子のバリアントは、配列番号 1、 7、 12、 14、 73、 77、又は 81の塩基配列 を参考にして、 BLAST等によって検索出来る（http：〃 blast.genome.jp/)。また、各遺 伝子のバリアントは、各遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科やコリネ型細菌等の微生 物の染色体を铸型にして、例えば配列番号 1、 7、 12、 14、 73、又は 81の塩基配列 に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いて PCRで増幅可能な遺伝子を 含む。
SDHのサブユニットとしては、配列番号 2〜4、 6、 74—76, 78〜80のいずれかの アミノ酸配列を有するタンパク質が、 α -KGDHのサブユニットとしては、配列番号 8〜 11、 13、 15、及び 81のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが 、細菌の種ゃ菌株によって使用コドンが異なり、各遺伝子の塩基配列に差異が存在 することがあるため、コードされるタンパク質の機能が変わらない限り、これらのァミノ 酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、揷入、または付加を含む アミノ酸配列をコードしている場合がある。ここで、数個とは、例えば、；!〜 20個、好ま しくは 1〜； 10個、より好ましくは 1〜5個を意味する。上記の 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、または付加は、各タンパク質の機能が正常に維持される保存 的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、 Phe, T rp、 Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、 Leu、 lie, Val間で、極性ァ ミノ酸である場合には、 Gln、 Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、 Lys, Arg、 His 間で、酸性アミノ酸である場合には、 Asp, Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸で ある場合には、 Ser、 Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的な ものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、 Alaから Ser又は T hrへの置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置換、 Asnから Glu、 Gin, Lys、 His又は Asp への置換、 Aspから Asn、 Glu又は Ginへの置換、 Cysから Ser又は Alaへの置換、 Gin力、 ら Asn、 Glu、 Lys, His, Asp又は Argへの置換、 Gluから Asn、 Gin, Lys又は Aspへの置 換、 Glyから Proへの置換、 Hisから Asn、 Lys, Gin, Arg又は Tyrへの置換、 lieから Leu、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから Ile、 Met, Val又は Pheへの置換、 Lysから Asn、 Gl u、 Gln、 His又は Argへの置換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Pheから Trp、 Tyr, Met, lie又は Leuへの置換、 Serから Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は Alaへ の置換、 Trpから Phe又は Tyrへの置換、 Tyrから His、 Phe又は Trpへの置換、及び、 V alから Met、 lie又は Leuへの置換が挙げられる。 [0119] 各遺伝子のバリアントは、配列番号 1、 7、 12、 14、 73、 77、又は 81の塩基配列中 の各々のコード領域の塩基配列を有する遺伝子だけでなぐこれらの塩基配列又は コード領域の塩基配列に相補的な配歹 IJ、または同塩基配列から調製され得るプロ一 ブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであってもよ!/、。「ストリンジェ ントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド が形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 80% 以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 97%以上、特 に好ましくは 99%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相 同性が低!/、DNA同士がハイブリダィズしな!/、条件、ある!/、は通常のサザンハイブリ ダイゼーシヨンの洗レヽの条件である 60。c、 1 X SSC、 0. 10/0SDS、好ましく (ま、 60°C 、0. 1 X SSC、0. 1 %SDS、さらに好ましくは、 68。C、 0. 1 X SSC、0. 1 %SDSに 相当する塩濃度、温度で、 1回、より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。 プローブの長さは、ハイブリダィゼーシヨンの条件により適宜選択される力 通常には 、 100bp〜lKbpである。
[0120] 遺伝子の改変は、具体的には、染色体上の遺伝子コード領域の一部又は全部を 欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD)配列等の発現調節配列を改 変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の 改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺 伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換え により、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換 (ミスセンス変異）を導入す ること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加 · 欠失するフレームシフト変異を導入することによつても達成出来る（Journal of Biologic al (chemistry 272:8611~8D 17 (1997 J Proceedings or tne National Academy of ^cienc es,USA 95 5511-5515(1998)， Journal of Biological Chemistry 266， 20833-20839(199
D
[0121] また、腸内細菌では、 sdhオペロンの上流に sucA、 sucB遺伝子が存在し、 sdhオペ口 ンの発現量が低下するような変異を導入することにより、 sucA、 sucB遺伝子の発現量 が低下することも考えられ、このような変異も本発明に含まれる。 [0122] 本発明において、「遺伝子組換えにより改変された」とは、相同組換えを利用して、 染色体上の遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、も しくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列 を揷入することによって、細胞内の酵素活性を低下させることをいう。本発明において は、遺伝子の不活化は自然突然変異により元に戻らない程度に、遺伝子が改変され ていることが好ましい。
しかしながら、本発明においては、 SDH活性及び α -KGDH活性が低下するような 改変であれば、 X線もしくは紫外線を照射、または N メチル Ν' ニトロ N ニト 口ソグァ二ジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
[0123] 発現調節配列の改変は、好ましくは 1塩基以上、より好ましくは 2塩基以上、特に好 ましくは 3塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生する酵素タン ノ ク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、 Ν末端領域、内 部領域、 C末端領域のいずれの領域であってもよぐコード領域全体であってよい。 通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠 失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
[0124] コード領域に他の配列を揷入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよい
1S 揷入する配列は長い方力 確実に酵素をコードする遺伝子を不活化することが できる。揷入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい 。他の配列としては、酵素タンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に 制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子や L グルタミン酸生産に有用な遺 伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
[0125] 染色体上の遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠 失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作 製し、該遺伝子を含む DNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺 伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置 換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は 、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下 又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既 に確立しており、「Redドリブンインテグレーション (Red-driven integration)]と呼ばれる 方法（Datsenko, . A, and Wanner, B.し Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-66 45 (2000))、 Redドリブンインテグレーション法と λファージ由来の切り出しシステム（C ho, Ε. Η·， Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))とを 組合わせた方法 (WO2005/010175号参照）等の直鎖状 DNAを用いる方法や、温度 感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内 で複製起点を持たないスィサイドベクターを利用する方法などがある (米国特許第 63 03383号明細書、または特開平 05-007491号公報）。
[0126] 尚、 Redドリブンインテグレーションには、参考例 1に示すように、 λ Red遺伝子産物 に耐性な菌株、例えばパントエア'アナナティス SC17(0)株を好適に用いることができ る。 SC17(0)株は、 2005年 9月 21日にロシアン 'ナショナル 'コレクション'ォブ 'インダス トリアノレ ·マイグロオーカニスム (Russian National Collection of Industrial Microorgani sms (V PM), GNU Genetika )に登録番号 VKPM B-9246のもとに寄託されている。
[0127] 遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写される mRNAの量を野 生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。 mRNAの量を評価 する方法としては、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 RT— PCR等が挙げられる（Molec ular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, し old spring Harbor (U¾A), 2001 ) )。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれ でもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも 75%以下、 50%以下、 25% 以下、又は 10%以下に低下していることが望ましぐ全く発現していないことが特に好 ましい。
[0128] 遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてゥエスタ ンプロットによつ一 ィ丁つことカ¾出来る (Molecular cloning (し old spring Harbor Laborator y Press, Cold spring Harbor (USA), 2001) )。タンパク質量の低下は、野生株あるい は非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変 株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも 75%以下、 50%以下、 25% 以下、又は 10%以下以下に減少していることが望ましぐ全くタンパク質を産生してい なレ、 (完全に活性が消失してレ、る）ことが特に好ましレ、。 [0129] (2)栄養要求性を利用した a -KGDH活性低下株の取得
α -KGDH活性が低下した株は、上述の（1 )の方法によっても取得できるし、栄養要 求性を利用し、以下のような方法でも取得できる。
[0130] 例えば、微生物菌体に N メチルー N，一二トロー N 二トロソグァ二ジンによる通 常の変異処理 (例えば、 250 ^ §/1111, 30°C、 20分）を施した後、固体培地上で培 養し、コロニーを形成させる。これよりレプリカ法により、 L グルタミン酸を単一炭素 源及び単一窒素源とする培地で生育できなレ、変異株を分離することによって、 a -K GDH活性が低下した株を単離できる。
[0131] a -KGDH活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム'ラタトフアーメンタム AJ12821(FERM BP— 4172；米国特許第 5,49 2,818号参照）
ブレビバタテリゥム 'フラバム AJ12822 (FERM BP— 4173；米国特許第 5,492,818号 参照）
コリネバタテリゥム.グルタミカム AJ12823 (FERM BP— 4174 ;米国特許第 5,492,818 号参照）
ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム A S株（国際公開 95/34672号パンフレット） コリネバタテリゥム.グルタミカム OAGN、 OA2-2、 OAGN2-2 (WO2006/028298) クレブシエラ.プランティコーラ AJ 13410株（FERM BP-6617)
[0132] (3)コハク酸要求性を指標とした SDH活性低下株の取得
α -KGDH活性低下株は、 succiny卜 CoAの供給低下により、生育にコハク酸を必要 とする。一方、 α -KGDHと SDHの 2重欠損株ではコハク酸要求性が回復することが知 られている（J Gen Microbiol. 1978 Jul; 107(l): 1-13)。したがって、 α - KGDH活性力 S 低下した株から、コハク酸要求性が回復した株を選択することによって、 α -KGDH及 び SDH活性が低下した株を取得することができる。具体的には、コハク酸を含まない 最少培地に a -KGDH活性が低下した株をプレーティングし、コロニーを形成させる。 コハク酸を含まない最少培地で生育出来る a -KGDH活性が低下した株では、高頻 度で SDHをコ一ドする遺伝子に変異を有して!/、る。
[0133] < 3〉本発明の L アミノ酸の製造方法
上記のような微生物を培地中で培養し、該培地中又は菌体内に L アミノ酸を生成 、蓄積せしめ、 L アミノ酸を該培地又は菌体から採取することにより、 L アミノ酸を 製造することが出来る。
[0134] 培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、 ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地 または天然培地の!/、ずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源 は培養する菌株が利用可能であるものならば!/、ずれの種類を用いてもょレ、。
[0135] 炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マ ンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、 クェン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併 用して用いること力 Sできる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム、炭酸アン モニゥム、塩化アンモニゥム、りん酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム等のアンモニゥ ム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビ タミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス 、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異 株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましレ、。無機塩類として はりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
[0136] 培養は、好ましくは、発酵温度 20〜45°C、 pHを 3〜9に制御し、通気培養を行う。
尚、 pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア ガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは 10時間〜 120時間程 度培養することにより、培養液中又は菌体内に L アミノ酸が蓄積される。
[0137] また、 目的とする L—アミノ酸力 —グルタミン酸である場合、 L—グルタミン酸が析 出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中に L—グルタミン酸を析出 させながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。 L—グルタミン酸が析出す る条件としては、 列えば、 ρΗ5. 0〜4· 0、好ましくは pH4. 5〜4· 0、さらに好ましく は ρΗ4. 3〜4. 0、特に好ましくは ρΗ4. 0を挙げること力 Sできる。尚、酸性条件下で の生育の向上、及び、効率的な L グルタミン酸の析出を両立するためには、 pHは 好ましくは 5. 0〜4. 0、より好ましくは 4. 5〜4. 0、さらに好ましくは 4. 3〜4. 0である ことが望ましい。尚、上記 pHでの培養は、培養の全期間であってもよぐ一部であつ てもよい。
[0138] 培養終了後の培養液から L アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従つ て行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいは イオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。培地中に L—グルタミン酸が析 出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出した L—グルタミン酸は、遠心 分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解している L グルタミン酸を晶析させた後に、併せて単離してもよ!/、。
[0139] なお、培地中にトレハロースを添加して培養してもよい。培地中に含まれるトレハロ ースの濃度は、 0.1g/L以上、好ましくは 0.2g/L以上、さらに好ましくは 0.5g/L以上添 カロすること力 S好ましい。なかでも、コリネ型細菌を用いる場合には、 0.5g/L以上、好ま しくは 0.75g/L以上、さらに好ましくは 2g/L以上添加することが好ましい。培地中に添 加するトレハロースは、結晶のトレハロースを溶解してもよいし、発酵工程で出来た発 酵溶液から目的物質を回収したあとの母液に含まれるトレハロースを使用してもよい 。また、培地中のトレハロースは、発酵液中に副生物として生産されるものも本発明に p¾よれ 。
さらに、本発明においては、トレハロースに加えて、ベタイン（N-メチルグリシン、 N- N-ジメチルグリシン、 N-N-N-トリメチルグリシン、 〔2-ハイド口キシェチル〕トリメチルァ ンモニゥム）を添加することにより、さらに目的物質の生産性が向上する。 0.1g/L以上 、好ましくは 0.25g/L以上、さらに好ましくは 0.5g/L以上添加することが好ましい。 実施例
[0140] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
[0141] 〔参考例 1〕 λ Red遺伝子産物に耐性なパントエア ·アナナティス菌株の構築
パントエア.アナナティスにおいて sdhA遺伝子破壊を行うために、「Red_driven integ rationjある!/、 ( 「Red— mediated integrationjと呼はれる方法 (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 97. 6640-6645 (2000))を高効率で行うための受容菌を構築した。 [0142] まず、 λの gam、 bet及び exoの各遺伝子（以下、「 λ Red遺伝子」 )を発現する新規 なへルパープラスミド RSF-Red-TERを構築した（図 1)。詳細は、参考例 2に記載する
〇
[0143] このプラスミドは、異なる遺伝子背景を持つ広い範囲の宿主に使用できる。その理 由は、 1)これは、多くのグラム陰性菌及びグラム陽性菌、並びに植物においてさえも 安定に維持され得る RSF1010広宿主域プラスミドのレプリコンを有しており（Scholz, et al.， 1989; Buchanan- Wollaston et al.， 1987)、 2) λ Red遺伝子、 gam、 bet及び exo 遺伝子は、多くの細菌の RNAポリメラーゼによって認識される、 PlacUV5プロモーター の調節化にあり（例えば、 Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1， 35-41 (199 2); Dehio, M. et al， Gene, 215， 2， 223-229 (1998))、 3)自己調節因子 P — lad、及
lacUV5 びェシエリヒア.コリの rrnBオペロンの p非依存性転写ターミネータ一（TrrnB)は、 λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする（Skorokhodova, A.Yu et al， Biotekhnologiya (Rus), 5， 3-21 (2004))からである。さらに、 RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラ ーゼ（levansucrase)遺伝子（sacB)を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む 培地で細胞からプラスミドを回収することができる。
[0144] ェシエリヒア'コリでは、 RSF-Red-TERプラスミドにより提供される短いフランキング領 域と共に、 PCRで生成した DNA断片がインテグレートする頻度は、 pKD46へルパープ ラスミド（Datsenko, .A., Wanner, B丄.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97， 6640-6645， ( 2000))を用いた場合と同程度に高い。し力、し、 λ Red遺伝子の発現は、パントエア' アナナティスにとって毒性を示す。 RSF-Red-TERヘルパープラスミドで形質転換され た細胞は、 IPTG (イソプロピル _ /3 -D-チォガラクトピラノサイド、 ImM)及び適当な抗 生物質（クロラムフエ二コール 25 g/ml又はカナマイシン 40 g/ml)を含む LB培地で 非常に低い生育速度を示し、 λ Red介在組換え（λ Red-mediated recombination) の効率は、観察されたとしても極端に低!、（10— 8)。
[0145] λ Red遺伝子の 3つの遺伝子すベての発現に耐性なパントエア.アナナティスの変 異株を選択した。そのために、パントエア ·アナナティス SC17株 (米国特許第 6,596,51 7号）を、 RSF-Red-TERプラスミドでエレクト口ポレーシヨンにより導入した。 18時間培 養後、約 106個の形質転換株が得られ、 10クローンまではコロニーが大きいサイズで あり、残りはすべて非常に小さかった。 18時間培養後、大きいコロニーは約 2mmであ り、小さいコロニーは約 0.2mmであった。培養を 24時間まで延長しても、小さいコロニ 一はそれ以上生育しな力 た力 S、大きいコロニーは生育を続けた。 λ Red遺伝子の 3 つの遺伝子すベて（gam、 bet及び exo)の発現に B1生な、大きいコロニーのパントエア •アナナティス変異株の一つを、更なる解析に用いた。
[0146] RSF-Red-TERプラスミド DNAを、大きいコロニーのクローン 1つ、及びいくつかの小 さいコロニーのクローンから単離し、ェシエリヒア.コリ MG1655を再形質転換して、 Red 遺伝子の活性な産物を合成するプラスミドの能力を調べた。得られた形質転換体に おける Red依存的インテグレーションのコントロール実験により、大きいコロニーのクロ ーンから単離されたプラスミドのみ力 Red依存的インテグレーションに必要な λ Red 遺伝子の発現をもたらすことが示された。選択された大きいコロニーのクローンにお いて、 Red媒介インテグレーションが起るかを調べるために、 KmRマーカー及び hisD遺 伝子に相同な 40bpのフランキング領域を含み、パントエア'アナナティスの hisD遺伝 子の Smal認識部位にインテグレートするようにデザインされた、 PCRで生成した直鎖 状の DNA断片を用いて、エレクト口ポレーシヨンを行った。 2個の小さいコロニーのクロ ーンをコントロールとして用いた。パントエア'アナナティスの hisD遺伝子の塩基配列 を配列番号 16に示す。 PCRには、配列番号 17及び 18のオリゴヌクレオチドをプライ マーとして用い、 pMW118-( att-Kmf- att)プラスミドを铸型として使用した。 λ Re d遺伝子に耐性ではない 2個の小さなコロニーのクローンをコントロールとして使用し た。 pMW118_( λ attL-Km λ attR)プラスミドの構築は、参考例 3で詳述する。
[0147] RSF-Red-TERプラスミドは、同プラスミド上にある lad遺伝子によって、 Red遺伝子の 発現を誘導すること力できる。 2つの誘導条件について調べた。第 1のグループでは 、 IPTG(lmM)をエレクト口ポレーシヨンの 1時間前に添加し、第 2のグループでは、 IPT Gはエレクト口ポレーシヨン可能な細胞の調製のための培養開始時に添加した。大き いコロニーのクローンからの RSF-Red-TERを保持する細胞の後代の生育速度は、 SC 17プラスミドを持たない菌株よりも有意に低くはな力 た。 IPTGの添加により、これら の培養物の生育速度はわずかに低下しただけであった。一方、小さいコロニーのクロ ーンの後代は、 IPTG非添加で非常にゆっくり生育し、誘導すると生育は事実上停止 した。大きいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクト口ポレーシヨンした後、たくさ んの KmRクローン（短い誘導時間で 18クローン、誘導時間を延長すると約 100クロー ン）が生育した。調べた 100クローンの全ては、 His—表現型を有し、 20クローンについ て PCRで確認したところ、これらの細胞の染色体の構造が期待どおりであることが確 認された。一方、小さいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクト口ポレーシヨンして も、インテグレーションされた株は得られなかった。
[0148] 得られた大きいコロニーのクローンを、 7%スクロースを含むプレートで生育させてプ ラスミドを脱落させ、 RSF-Red-TERで再形質転換した。プラスミドを持たない株を SC1 7(0)と命名した。同株は、 2005年 9月 21にロシアン 'ナショナル 'コレクション'ォブ 'イン ダストリアノレ'マイクロオーガニズム (Russian National Collection of Industrial Microor ganisms (V PM), GNU Genetika) (住所： Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proez d. 1)に受託番号 VKPM B-9246のもとに寄託されている。
[0149] 上記再形質転換の後に生育した全てのクローンは、親株クローン SC17(0)と同様に 大きなコロニーサイズを有していた。 RSF-Red-TERプラスミドで再形質転換した SC17( 0)株における Red媒介インテグレーションの実験を行った。得られた 3つの独立した形 質転換株について、前の実験に用いたのと同じ DNA断片を用いて調べた。短い誘導 時間（エレクト口ポレーシヨン 1時間前）を採用した。各々の実験で、 10個を超える KmR クローンが生育した。試験した全てのクローンは、 His—表現型を有していた。こうして、 λ Red遺伝子の発現に耐性な SC17(0)と名付けた変異株が選択された。この菌株は 、パントエア.アナナティス染色体への Red依存的インテグレーションのための好適な 受容菌として使用できる。
[0150] 〔参考例 2〕ヘルパープラスミド RSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミド RSF-Red-TERの構築スキームを図 2に示す。
構築の最初の工程として、 RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、 PACYC184プラスミドの cat遺伝子、及びバチルス.サブチリスの sacB遺伝子の構造部 分を含む DNA断片を、それぞれ配列番号 19、 20、 21、 22のオリゴヌクレオチドを用 いて、 PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローユングに 必要な、都合のよい BglII、 Sad、 Xbal、及び BamHI制限酵素部位を 5'末端に含んで いる。得られた 1.5kbの sacB断片を、先に得た pMW119_P ladベクターの Xbal-BamH
Figure imgf000044_0001
I部位にクローニングした。このベクターは、 pMW118-P ladベクターについての記載
lac
(Skorokhodova, A.Yu et al， Biotekhnologiya (Rus), 5， 3-21 (2004))と同様にして構 築した。但し、同ベクターは、 pMW218プラスミドの代りに pMW219からのポリリンカ一 部位を含んでいる。
[0151] 次に、前記の l.Okbの cat断片を Bglll及び Sadで処理し、先の工程で得た RSF-P la lac dsacBプラスミドの BamHト Sad部位にクローニングした。得られたプラスミド pMW-P 1 lac adsacBcatは、 PlacUV5-lacI_sacB-cat断片を含んでいる。この断片を RSF1010ベクタ 一にサブクローンするために、 pMW_P ladsacBcatを Bglllで消化し、 DNAポリメラー
lac
ゼ Iクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いて Sadで切断した。 pMWP lac lac
IsacBcatプラスミドの 3.8kbの Bglll-Sad断片を 1%ァガロースゲルから溶出させ、 Pstl、 及び Sadで処理した RSF1010ベクターに連結した。ライゲーシヨン混合液でェシエリヒ ァ 'コリ TG1を形質転換し、クロラムフエ二コール（50mg/L)を含む LB培地にプレートし た。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、 RSFsacBプラス ミドを得た。 RSFsacBP MCSベクターを構築するために、配列番号 23及び 24のオリ
lac
ゴヌクレオチドをプライマーとして、 pMW119-P ladプラスミドを铸型として用いて、 P lac lac プロモーターを含む DNA断片を PCRにより増幅した。得られた 146bpの断片を Sad
UV5
及び Notlで消化し、 RSFsacBプラスミドの Sad-Notl大断片と連結した。その後、酉己列 番号 25及び 26のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 pKD46プラスミド（Datsenko, .A., Wanner, B丄.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97， 6640-6645，（2000))を鍀型とし用 いた PCRにより、 Red a β γ遺伝子、及び転写ターミネータ一 tL3を含む 2.3kbの D NA断片を増幅した。得られた断片を RSFsacBP MCSベクターの Pvul-Notl部位にク
lac
ローニングした。こうして、 RSFRedプラスミドをデザインした。
[0152] Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、ェシエリヒア.コリの rrnBオペロン の a 依存性転写ターミネータ一を、 cat遺伝子と P プロモーターとの間に挿入し
lacUV5
た。そのために、配列番号 27及び 24のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ェシェ リヒア ·コリ BW3350の染色体を铸型として用いた PCRにより、 P プロモーターと Trm lacUV5
Bターミネータ一を含む DNA断片を増幅した。得られたこれらの断片を Kpnlで処理し て、連結した。その後、配列番号 24及び 28のオリゴヌクレオチドをプライマーとする オリゴヌクレオチドを用いた PCRにより、 P 及び TrmBの両方を含む 0.5kb断片を、
lacUV5
増幅した。得られた DNA断片を EcoRIで消化し、 DNAポリメラーゼ Iクレノーフラグメント で処理して平滑末端化し、 BamHIで切断し、 RSFsacBPlacMCSベクターの Ecll36II_B amHI大断片と連結した。得られたプラスミドを RSF-Red-TERと命名した。
[0153] 〔参考例 3〕pMW118_( λ attL- mr- λ attR)プラスミドの構築
pMWl 18-(lattL-Kmr_lattR)プラスミドは、 MWl 18-attL-Tc-attR (WO2005/01017 5)プラスミド力、ら、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子を pUC4Kプラスミドのカナマイ シン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、 PMW118-attL-Tc-at tRプラスミドの EcoRI-Hindlll大断片を、 pUC4Kプラスミドの HindIII-PstI(676bp)及び E coRI-HindIII(585bp)の 2つの断片に連結した。基本となる pMW118-attL-Tc_attRは、 以下の 4つの断片を連結することによって得た。
[0154] 1)ェシエリヒア.コリ W3350 ( プロファージを含む）の染色体の attLに相当する領域 から、プライマー P1 (配列番号 29)及び P2 (配列番号 30)を用いた PCR増幅により得 た attL (配列番号 31)を持つ Bglll-EcoRI断片 (114bp)。これらのプライマーは、 Bglll及 び EcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。
[0155] 2)ェシエリヒア.コリ W3350 ( プロファージを含む）の染色体の attRに相当する領域 から、プライマー P3 (配列番号 32)及び P2 (配列番号 33)を用いた PCR増幅により得 た attR (配列番号 34)を持つ Pstl-Hindlll断片 (182bp)。これらのプライマーは、 Pstl及 び Hindlllのための副次的な認識部位を含んでいる。
[0156] 3 \ \¥118- 6 118の8 11- 11(1111大断片(3916 bp)Dプラスミド pMW118_ter— rmBは 、次の 3つの DNA断片を連結することによって得た。
•pMW118の Aatll-EcoRI断片を持つ大断片 (2359 bp)Dこの断片は、 pMW118を EcoRI で消化し、 DNAポリメラーゼ Iクレノーフラグメントで処理し、次いで Aatllで消化するこ とによって得た。
'アンピシリン耐性（ApR)の遺伝子 blaを持つ pUC19の Aatn-Bglll小断片 (1194 bp)Dこ の断片は、 PUC19プラスミドの相当する領域をプライマー P5及び P6 (配列番号 35及 び 36)を用いて PCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、 Pstl及び Aatll及 び Bglllのための副次的な認識部位を含んでいる。
•転写ターミネータ一 ter_rrnBの Bglll-Pstl小断片 (363bp)。この断片は、ェシエリヒア' コリ MG1655染色体の相当する領域をプライマー P7及び P8 (配列番号 37及び 38)を 用いて PCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、 Pstl及び Bglll及び Pstlの ための副次的な認識部位を含んでレ、る。
[0157] 4)テトラサイクリン耐性遺伝子及び ter_thrL転写ターミネータ一を持つ pML-Tc_ter_th rLの EcoRI-Pstl小断片 (1388bp) (配列番号 39)。 pML-Tc_ter_thrLプラスミドは、次の 2工程で得た。
•pML-MCSプラスミド (Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001， no. 5， 3-20)を Xbal及び BamHIで消化し、次いで大断片 (3342bp)を、 ter_thrLターミネータ一 を含む Xbal-BamHI断片 (68bp)と連結した。この ter_thrLターミネータ一を含む断片は 、ェシエリヒア'コリ MG1655染色体の相当する領域を、プライマー P9及び P10 (配列番 号 40及び 41)を用いた PCRにより得た。こうして pML-ter_thrLプラスミドを得た。これ らのプライマーは、 Pstl及び Xbal及び BamHIのための副次的な認識部位を含んで!/ヽ
•pML-ter_thrLプラスミドを Kpnl及び Xbalで消化し、次いで DNAポリメラーゼ Iクレノー フラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つ pBR322の EcoRト Van91I小 断片（1317bp)と連結して、 pML-Tc_ter_thrLプラスミドを得た。尚、 pBR322は、 EcoRI 及び Van91Iで消化し、次いで DNAポリメラーゼ Iクレノーフラグメントで処理した。
[0158] 〔実施例 1〕パントエア'アナナティスにおける sdhA遺伝子及び sucA遺伝子の破壊効 果
(1)グルタミン酸生産プラスミド RSFPPGの構築
L グルタミン酸生合成系遺伝子、 prpC遺伝子（国際公開 2006/051660号パンフレ ット）、 ppc遺伝子、 gdh (欧州出願公開 0999282号明細書)遺伝子を増幅したプラスミ ド RSFPPGを構築した。
[0159] RSFCPG (欧州出願公開 1233068号明細書）の gltA遺伝子の ORF以外の部分を増 幅するプライマー 1 (配列番号 42)とプライマー 2 (配列番号 43)を設計した。このブラ イマ一を用いて、 RSFCPGを鍀型に PCRを行い、約 14.9kbの断片を取得した。一方、 prpCに関してはプライマー 3 (配列番号 44)とプライマー 4 (配列番号 45)を用い、 E.c oli W3110株の染色体 DNAを铸型として PCRを行い、約 1.2kbの断片を取得した。両 P CR産物をそれぞれ BglII、 Kpnlで処理し、ライゲーシヨン後、 Ε· coli JM109株を形質転 換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このブラ スミド混合物でクェン酸シンターゼ（CS)欠損株である E. coli ME8330株を形質転換し 、 50mg/Lゥラシル、 5mg/Lチアミン- HC1を含有する M9最少培地（グルコース 5 g、硫 酸マグネシウム 2mM、リン酸一カリウム 3g、塩化ナトリウム 0.5g、塩化アンモニゥム lgリ ン酸 2ナトリウム 6gを純水 1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽 出し、これを RSFPPGとした。 L—グルタミン酸生産菌であるパントエア ·アナナティス N P106株に前記プラスミド RSFPPGを導入し、 L—グルタミン酸生産菌 NP106/RSFPPG ( 本菌株を「NA 朱」と呼ぶ）を構築した。
[0160] NP106株は、以下のようにして得られた。先に例示したパントエア ·アナナティス AJ1 360 朱を、 LBGM9液体培地で 34°Cにて終夜振とう培養を行い、 1プレートにっき 100 〜200コロニーとなるよう希釈し、テトラサイクリン 12.5mg/Lを含む LBGM9プレートに塗 布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン 12.5mg/L、及びクロラムフエニコ ール 25mg/Lを含む LBGM9プレートにレプリカし、クロラムフエ二コール感受性となつ た株を選択し、 pSTVCBが脱落した菌株を取得し、 G106Sと命名した。さらに、 G106S 株を、 LBGM9液体培地で 34°Cにて終夜振とう培養を行い、 1プレートにっき 100〜20 0コロニーとなるよう希釈し、薬剤を含まない LBGM9プレートに塗布した。出現したコロ ニーについて、テトラサイクリン 12.5mg/Lを含む LBGM9プレート及び薬剤を含まない LBGM9プレートにレプリカし、テトラサイクリン感受性となった株を選択し、 RSFCPG力 S 脱落した菌株を取得し、 NP106と命名した。こうして得られた NP106株は AJ1360 朱が 保持する 2つのプラスミド RSFCPGと pSTVCBの両方を持たない株である。
[0161] (2) sdhA遺伝子破壊株の構築
pMW-attL-Kmf-attRを铸型として、配列番号 46、 47のプライマーを用いて PCRを 行い、カナマイシン耐性遺伝子の両端にそれぞれ λ phageの attL及び attRの配列、 更にその外側にそれぞれ sdhA遺伝子の上流 50bp、下流 50bpずつの配列を付加した 遺伝子断片を増幅した。この断片を Wizard PCR Prep DNA Purification System (Pro mega社製）を用いて精製した。
[0162] 次に SC17(0)を RSF-Red-TERで形質転換し、 SC17(0)/RSF-Red_TER株を得た。同 株を 25mg/Lクロラムフエ二コールを含有する L培地（バタトトリプトン 10g、イーストェキ ストラクト 5g、 NaCl 5gを純水 1Lに含む培地、 ρΗ7·0)で終夜培養を行い、この終夜培 養液を 25mg/Lクロラムフエ二コールと ImMイソプロピル- /3 _D_チォガラタトビラノサ イドを含有する L培地 lOOmLに 1/100量接種し、 3時間 34°Cで培養を行った。こうして 作製した菌体を集菌し、氷冷した 10%グリセロールで 3回洗菌した後、最終的に 0.5mL の 10%グリセロールに懸濁したものをコンビテントセルとし、上項で調製した PCR断片 1 OOngを、 GENE PULSER II (BioRad社製）を用いて、電場強度 18kVん m、コンデンサ 一容量 25 F、抵抗ィ直 200 Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいた SO C培地（バタトトリプトン 20g/L、イーストエキストラタト 5g/L、 NaCl 0.5g/L、グルコース 10 g/L)を添加し 34°Cで 2時間振盪培養を行い、 L培地 (バタトトリプトン 10 g、イーストェ キストラタト 5 g、 NaCl 5 g、寒天 15 gを純水 1Lに含む培地 ρΗ7·0)に、最少培地成分 (1L当り、グルコース 5 g、硫酸マグネシウム 2mM、リン酸一カリウム 3g、塩化ナトリウム 0 • 5g、塩化アンモニゥム lgリン酸 2ナトリウム 6g)と 40mg/Lのカナマイシンを加えた培地 に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、 PCRにより sdhA遺伝子がカナ マイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。
[0163] この sdhA遺伝子欠損株より、 Edge Biosystems社製 Bacterial Genomic DNA Purific ation Kitを用いて染色体を抽出した。一方、 NAI株を、 L培地に前記最少培地成分と 12.5mg/Lのテトラサイクリンを添加した寒天培地にて終夜培養した。菌体をエーゼで 搔き取り、氷冷しておいた 10%グリセロールで 3回洗菌し、菌体に 10%グリセロールを最 終 500〃 Lとなるように加えて懸濁したものをコンビテントセルとした。このコンビセント セルに、前述の染色体 DNA 600ngを、 GENE PULSER II (BioRad社製）を用いて電場 強度 17.5kVん m、コンデンサー容量 25 F、抵抗値 200 Ωの条件で導入した。細胞懸 濁液に、氷冷しておいた SOC培地を添加し、 34°Cで 2時間振盪培養を行った後に、 L 培地に前記最少培地成分と 12.5mg/Lのテトラサイクリン、 40mg/Lのカナマイシンを添 加した寒天培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、 PCRにより sdh A遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。 NA 朱は、 α -KGDHの Elサブユニットをコードする sucA遺伝子を欠損している。一 方、 SC17(0)/RSF-Red_TER株の sucA遺伝子には変異は入っていない。 sdhA遺伝子 と sucA遺伝子は非常に近傍にあり、 sdhA遺伝子欠損株の染色体 DNAによる形質転 換の際に、 sdhAの変異とともにある程度の割合で野生型の sucA遺伝子も同時に移 行する。従って、取得された NA1の sdhA欠損株の中には、 sucA遺伝子が欠損してい るものと、野生型に復帰しているものの 2種類が含まれる。そこで、 NA1の sucA遺伝子 の変異箇所に相当する領域を PCRにより増幅し、制限酵素 Bglllにて切断できるかどう かを指標として、 sucAが欠損している力、、あるいは sucA遺伝子が野生型に復帰して V、るかを確認し、 sdhA単独欠損株と sucAsdhAの二重欠損株を得た。
[0164] (3) sdhA欠損株、 sucAsdhA二重欠損株の L グルタミン酸生産能の評価
次に、上項で取得した sdhA欠損株と sucAsdhA二重欠損株の L グルタミン酸生産 能の評価を行うために、これらの菌株を下記に示す組成の培地 5mLを注入した試験 管に植菌し、 18時間培養を行った。 sucA単独欠損株である NA 朱は同培地でほとん ど生育せず、 L グルタミン酸蓄積も 3.3g/L程度に留まったのに対し、 sdhA単独欠損 株では 13.2g/Lの L グルタミン酸蓄積が得られ、 sucA単独欠損株を大きく上回る結 果となった。一方、 sucAsdhA二重欠損株では 14.7g/Lの L—グルタミン酸蓄積が得ら れ、 sucA、 sdhAをそれぞれ単独に欠損した場合よりさらに高い L グルタミン酸生産 能を有し、生育も大幅に改善することが確認された。
[0165] (L グルタミン酸生産評価培地組成）
(A区）
シユークロース 30g/L
MgSO · 7Η O 0.5g/L
(Β区)
(ΝΗ ) SO 20g/L
H PO 2g/L
FeSO - 7H O 20mg/L
MnSO - 5H O 20mg/L
Yeast Extract (Difco) 2g/L パントテン酸カノレシゥム 18mg/L
(C区）
炭酸カルシウム 20g/L
A区、 B区は 115°C 10分 オートクレーブ殺菌、 C区は 180°C 3時間 乾熱滅菌 室温に冷却後 3者を混合して使用。
[0166] [表 1] 表 1
OD620nm Glu RS 収率
(x1 /51 ) (g/L) (g/L) (%)
NA1 0.034 3.3 17.1 27.1
NA1 sdhA 0.439 13.2 0.0 45.3
NA1 sucAsdhA 0.482 14.7 0.1 50.7
RS :残糖
[0167] 〔実施例 2〕コリネ型細菌における odhA遺伝子及び sdhA遺伝子の破壊効果
( 1 ) odhA遺伝子破壊株の構築
Brevibacterium flavum ATCC14067株 (現在（ま Corynebacterium glutamicum ίこ分 されている）より、 odhA遺伝子を欠損し、かつ yggB遺伝子（配列番号 56)の 837位の G 力 SAに置換され、 gdh遺伝子のプロモーターが改変された株を構築した。なお、本実 施例では Β· flavum ATCC14067株を親株として用いた力 C. glutamicum ATCC1303 2株、 Β· lactofermentum ATCC13869株を親株として用いても、同様の性質を有する 菌株を構築することができる。
[0168] まず odhAを欠損させるためのプラスミド pBS3 A sucA47を構築した。配列番号 48に 示す合成 DNAと配列番号 49に示す合成 DNAをプライマーとして、 B. flavum ATCC1 4067株の染色体 DNAを铸型として PCRを行い、 N末端側断片を調製した。同様に配 列番号 50と配列番号 51の合成 DNAをプライマーとして、 C末端側断片を調製した。 続いて N末端側断片と C末端側断片を等量混合したものを铸型として、配列番号 52 と配列番号 53の合成 DNA(BamH画己列が付加されている）をプライマーとして PCRを 行い、 odhA遺伝子のコード領域を欠失した断片を取得した。得られた変異型 odhA断 片は BamHIで処理して pBS3(国際公開 2006/070944号パンフレット)の BamHI部位に 揷入し、得られたプラスミドを pBS3 Δ sucA47とした。
[0169] 電気パルス法にて Β· flavum ATCC14067に pBS3 Δ sucA47を導入し、カナマイシン 2 5〃 g/mlを含む CM-Dex寒天培地（グルコース 5g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、 H PO lg/l、 MgSO · 7Η Ο 0.4g/l、 FeSO · 7Η Ο 0.01g/U MnSO · 4— 5Η Ο 0
2 4 4 2 4 2 4 2
.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液 1.2g/l、寒天 20g/l、 NaOHを用いて ρΗ7·5 に調整:オートクレープ 120°C20分）上に塗布した。 31.5°Cにて 2日間培養後、生育し てきた株を pBS3 Δ sucA47が染色体に揷入された株 ATCC14067_pBS3 Δ sucAとした 。続レ、て ATCC14067-pBS3 Δ sucA株を CM_Dex液体培地で一夜培養した懸濁液を S 10寒天培地（スクロース 100g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、 KH PO lg/1
2 4
、 MgSO · 7Η O 0.4g/l、 FeSO - 7H O O.Olg/U MnSO · 4— 5H O O.Olg/U尿素 3g/l、
4 2 4 2 4 2
大豆蛋白加水分解液 1.2g/l、寒天 20g/l、 NaOHを用いて pH7.5に調整：オートクレー ブ 120°C20分）上に塗布し 31.5°Cで培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン 感受性を示す株を選択し、さらに CM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株より染 色体 DNAを調製し、配列番号 52と配列番号 53に示す合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、約 1. 9Kbの増幅断片が確認された株を 8L3株とした。
[0170] 8L3株の染色体 DNAを铸型として、配列番号 54と配列番号 55の合成 DNA (Sad酉己 列が付加されて!/、る）をプライマーとして PCRを行!/、、得られた増幅断片の配列を決 定したところ、配列番号 57の 111位のァラニンがスレオニンに置換されて!/、ること力 S 示された。すなわち 8L3は odhA欠損の導入時に、偶発的にこの変異が導入された二 重変異株であった。 8L3と同じ yggB変異を有する株として、 ATCC14067yggB8株が 知られている (国際公開 2006/070944号パンフレット)。 ATCC14067yggB株に pBS3 Δ s ucA47を導入し、上記工程を経ることにより、 8L3と同様の yggB変異を有する odhA欠 損株を構築することができる。
[0171] 次に gdhのプロモーター領域に変異を導入するためのプラスミド pBS4gdh3を構築し た。配列番号 60に示す合成 DNAと配列番号 61に示す合成 DNAをプライマーとして 、 B. lactofermentum ATCC13869株の染色体 DNAを铸型として PCRを行い、 N末端側 断片を調製した。同様に配列番号 62と配列番号 63の合成 DNAをプライマーとして、 C末端側断片を調製した。続いて N末端側断片と C末端側断片を等量混合したものを 铸型として、配列番号 64と配列番号 65の合成 DNA (Smd配列が付加されている）を プライマーとして PCRを行い、 gdh遺伝子のプロモーター領域に変異が導入された断 片を取得した。得られた変異型 gdh断片は Smalで処理して pBS4S (国際公開 2006/070 944号パンフレット)の Smal部位に揷入し、得られたプラスミドを pBS4gdh3とした。
[0172] 電気パルス法にて 8L3株に pBS4gdh3を導入し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex寒天培地上に塗布した。 31.5°Cにて 3日間培養後、生育してきた株を pBS4gdh3 が染色体に揷入された株 8L3_pBS4gdh3として単離した。続!/、て 8L3_pBS4gdh3株を CM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液を S10寒天培地上に塗布し 31.5°Cで培養し た。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株を選択し、さらに CM-Dex 寒天培地上で純化した。これらの株より染色体 DNAを調製し、 gdhのコード領域上流 の配列を決定した。配列番号 66に示す配列を有する株を 8L3G株とした。
(2) SDH欠損株の構築
[0173] sdhAを欠損させるためのプラスミド pBS3 A sdh47を構築した。配列番号 67に示す合 成 DNAと配列番号 68に示す合成 DNAをプライマーとして、 B. flavum ATCC14067株 の染色体 DNAを铸型として PCRを行い、 N末端側断片を調製した。同様に配列番号 69と配列番号 70の合成 DNAをプライマーとして、 C末端側断片を調製した。続いて N 末端側断片と C末端側断片を等量混合したものを铸型として、配列番号 71と配列番 号 72の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、 sdhA遺伝子のコード領域を欠失し た断片を取得した。得られた変異型 sdhA断片は B讓 HIで処理して pBS3(国際公開 20 06/070944号パンフレット)の BamHI部位に揷入し、得られたプラスミドを pBS3 Δ sdhA4 7とした。
[0174] 電気パルス法にて 8L3G株に pBS3 Δ sdhA47を導入し、カナマイシン 25 μ g/mlを含 む CM-Dex寒天培地上に塗布した。 31.5°Cにて 2日間培養後、生育してきた株を pBS 3 Δ sdhA47が染色体に揷入された株 8L3G_pBS3 Δ sdhAとして単離した。続!/、て 8L3 G-pBS3 Δ sdhA株を CM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液を S10寒天培地上に塗 布し 31.5°Cで培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株を選 択し、さらに CM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株より染色体 DNAを調整し、 配列番号 71と配列番号 72に示す合成 DNA (B讓 M配列が付加されている）をプライ マーとして PCRを行い、約 1Kbの増幅断片が確認された株を 8L3G A SDH株とした。
[0175] (6) sdhA欠損株、 sucAsdhA二重欠損株の L グルタミン酸生産能の評価
次に、上項で取得した 8L3G株と、その SDH欠損株の 8L3G A SDH株の L—ダルタミ ン酸生産能の評価を行うために、これらの菌株を各 1枚の CM-Dexプレート培地にて ー晚培養したのち、プレートから菌体を全量かきとって下記に示す組成の培地 300m Lを注入した Jarに植菌し、 31.5°Cで培養した。培養中の pHは、アンモニアガスを用い て 7.2にコントロールし、溶存酸素濃度が 5%以上に保たれるように通気攪拌を制御し た。表 2に示すように、 sucA単独欠損株である 8L3G株より、 sucAsdhA二重欠損株で ある 8L3G A SDHの方がグルタミン酸の生産速度が高ぐ培養 12.5時間目での L グ ルタミン酸蓄積は、 8L3G A SDH株の 16.5g/Lに対し、 8L3G Δ SDH株では 19g/Lと、 su cA単独欠損株である 8L3G株を大きく上回る結果となった。これらの結果から、コリネ 型細菌においても sucAと sdhAを同時に欠損することが L—グルタミン酸生産におい て効果的であることが示された。
[0176] (L グルタミン酸生産評価培地組成）
グルコース 60g/L
MgSO · 7Η Ο 0.9g/L
4 2
Η ΡΟ 1.54g/L
3 4
ΟΗ 1.45g/L
FeSO · 7Η Ο lOmg/L
4 2
大豆加水分解物 1.54g/L (窒素分として)
ビォチン 3.2mg/L
VB1 0.67mg/L
DL-メチォニン 0.28g/L
アンモニア水で pH4.0に調整後、 120°Cで 15分滅菌し、培養直前にアンモニアガス で pH7.2に調整して培養を行う。
[0177] [表 2] 表 2
OD620nm Glu
(g/D
8L3G 36.4 16.5
8し 3GASDH 43.4 19.0 〔配列表の説明〕
配列番号 1:パントエア'アナナティスの sdhオペロンの塩基配列（SDHD、 SDHA、 SDH Bのアミノ酸配列併記）
sdhC:527〜913
sdhD:910〜1254
sdhA:1258〜3021
sdhB:3039〜3752
配列番号 2： SDHDのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 3： SDHAのアミノ酸配列
配列番号 4： SDHBのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 5：パントエア ·アナナティスの sdhオペロンの塩基配列（SDHCのアミノ酸酉己 列併記）
配列番号 6： SDHCのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 7：パントエア ·アナナティスの α -KGDHサブユニット遺伝子と近傍遺伝子 の塩基配列
sdhB: 2〜 121
sucA: 322〜3129
sucB:3145〜4368
sucC:4437〜4556
配列番号 8：サクシネートデヒドロゲナーゼアイロンースルファープロテインのアミノ酸 配列（部分）
配列番号 9: α-KGDH Eloサブユニットのアミノ酸配列 配列番号 10 : α -KGDH E2oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号 11： succinyl-CoAシンセターゼ βサブユニットの一部
配列番号 12：ブレビパクテリゥム 'ラタトフアーメンタムの odhA遺伝子の塩基配列 配列番号 13： odhAがコードする Eloサブユニットのアミノ酸配列
配列番号 14：ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタムの E2oサブユニットをコードする 遺伝子（GenBank Accession No. NC 003450の NCgl2126)の塩基配列
配列番号 15： NCgl2126がコードする E2oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号 16：パントエア ·アナナティスの hisD遺伝子の塩基配列
配列番号 17： Kmf遺伝子の hisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー 配列番号 18： Kmf遺伝子の hisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー 配列番号 19： cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号 20： cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号 21： sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号 22： sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号 23 : P プロモーターを含む DNA断片増幅用プライマー
lacLtV'5
配列番号 24： P プロモーターを含む DNA断片増幅用プライマー
lacUV5
配列番号 25 : Red a β γ遺伝子及び tL3を含む DNA断片増幅用プライマー 配列番号 26 : Red a β γ遺伝子及び tL3を含む DNA断片増幅用プライマー 配列番号 27： P プロモーターおよび TrmBを含む DNA断片増幅用プライマー
lacUV5
配列番号 28： P プロモーターおよび TrmBを含む DNA断片増幅用プライマー
lacUV5
配列番号 29： attL増幅用プライマー
配列番号 30： attL増幅用プライマー
配列番号 31： attLの塩基配列
配列番号 32： attR増幅用プライマー
配列番号 33： attR増幅用プライマー
配列番号 34： attRの塩基配列
配列番号 35： bla遺伝子を含む DNA断片増幅用プライマー
配列番号 36： bla遺伝子を含む DNA断片増幅用プライマー 配列番号 37： ter_rrnBを含む DNA断片増幅用プライマー
配列番号 38： ter_rrnBを含む DNA断片増幅用プライマー
配列番号 39： ter_thrLターミネータ一を含む DNA断片の塩基配列 配列番号 40 : ter_thrLターミネータ一を含む DNA断片増幅用プライマー 配列番号 41 : ter_thrLターミネータ一を含む DNA断片増幅用プライマー 配列番号 42： gltA遺伝子の ORF以外の部分を増幅するためのプライマー 配列番号 43： gltA遺伝子の ORF以外の部分を増幅するためのプライマー 配列番号 44： prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号 45： prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号 46： sdhA破壊のための DNA断片増幅用プライマー
配列番号 47： sdhA破壊のための DNA断片増幅用プライマー
配列番号 48： sucA遺伝子上流断片増幅用プライマー
配列番号 49： sucA遺伝子上流断片増幅用プライマー
配列番号 50： sucA遺伝子下流断片増幅用プライマー
配列番号 51： sucA遺伝子下流断片増幅用プライマー
配列番号 52： sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号 53： sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号 54 : yggB遺伝子増幅用プライマー
配列番号 55： yggB遺伝子増幅用プライマー
配列番号 56： yggB遺伝子の塩基配列
配列番号 57： YggBのアミノ酸配列
配列番号 58：変異型 yggB遺伝子の塩基配列
配列番号 59：変異型 YggBのアミノ酸配列
配列番号 60： gdh遺伝子上流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号 61： gdh遺伝子上流増幅用プライマー
配列番号 62： gdh遺伝子下流増幅用プライマー
配列番号 63： gdh遺伝子下流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号 64： gdh遺伝子増幅用プライマー 配列番号 65： gdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号 66：変異型 gdh遺伝子コード領域上流の塩基配列
配列番号 67： sdhA遺伝子上流増幅用プライマー
配列番号 68： sdhA遺伝子上流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号 69： sdhA遺伝子下流増幅用プライマー
配列番号 70： sdhA遺伝子下流増幅用プライマー（変異導入）
配列番号 71： sdhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号 72： sdhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号 73: C. glutamicum ATCC13032の sdhオペロンの塩基配列（SDHC、 SDHA, SDHBのアミノ酸配列併記）
sdhC:449〜1219
sdhA:1239〜3257
sdhB:3260〜4006
配列番号 74： SDHCのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 75： SDHAのアミノ酸配列
配列番号 76： SDABのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 77:B. lactofermentum ATCC13869の sdhオペロンの塩基配列（SDHC、 SD HA、 SDHBのアミノ酸配列併記）
sdhC:449〜1219
sdhA:1239〜3257
sdhB:3260〜4006
配列番号 78： SDHCのアミノ酸配歹 IJ
配列番号 79： SDHAのアミノ酸配列
配列番号 80： SDHBのアミノ酸配歹 IJ
産業上の利用可能性
本発明の方法を用いることにより、効率よぐ L グルタミン酸等の L アミノ酸を発 酵生産することが出来る。

Claims

請求の範囲
[1] L アミノ酸生産能を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性及び α—ケトグルタル酸 デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された微生物を培地で培養して、 Lーァ ミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体より L アミノ酸を採 取する、 L—アミノ酸の製造法。
[2] コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子又は α—ケトグルタル酸デヒドロゲナ ーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊する ことにより、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又は α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ 活性が低下した、請求項 1に記載の方法。
[3] コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が sdhA遺伝子、 sdhB遺伝子、 sdhC 遺伝子及び sdhD遺伝子から選択される 1又は 2以上の遺伝子である請求項 2に記 載の方法。
[4] a—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子力 sucA遺伝子、 odhA 遺伝子及び sucB遺伝子から選択される 1又は 2以上の遺伝子である、請求項 2又は 3に記載の方法。
[5] 前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、またはコリネ型細菌である、請求項;!〜
4の!/、ずれか一項に記載の方法。
[6] 前記アミノ酸力 SL グルタミン酸又は L グルタミン酸を前駆体として生合成される L アミノ酸である請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7] 前記 L—アミノ酸力 L—アルギニン、 L—プロリン、 L—オル二チン、 Lーシトルリン、 及び L グルタミンから選択される請求項 6に記載の方法。
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