TW201040265A - Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments - Google Patents

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201040265 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於包含全長抗體及單鏈Fab片段之多特異 性、尤其雙特異性抗體、其產生方法、含有該等抗體之醫 藥組合物、及其用途。 【先前技術】 最近幾年已研發出眾多種多特異性重組抗體形式，例如 融合（例如）IgG抗體形式及單鏈結構域之四價雙特異性抗 體（例如，參見 Coloma，M.J.等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163 ; WO 2001/077342 ;及 Morrison, S.L·,

Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234)。 亦已研發出若干種不再保留抗體核心結構（IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM)之其他新形式，例如雙鏈抗體、三鏈抗體 或四鏈抗體、微小抗體、若干種單鏈形式（scFv、雙 scFv)，其能結合兩種或更多種抗原（Holliger，P.等人， Nature Biotech 23 (2005) 1 126-1 136 ； Fischer, N., Leger, 0., Pathobiology 74 (2007) 3-14 ； Shen, J.等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74 ; Wu, C.等人， Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。 所有該等形式皆使用連接體來融合抗體核心（IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)或融合 (例如）兩個 Fab 片段或 scFv (Fischer, N_，L0ger, 0·， Pathobiology 74 (2007) 3-14)。必須牢記，可藉由維持與 天然抗體之高度相似性來保留經由Fc受體結合介導之效應 146953.doc 201040265 子功能（例如補體依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞 毒性（ADCC))。 在WO 2007/024715中報導雙可變結構域免疫球蛋白，其 為經改造多價多特異性結合蛋白。製備生物活性抗體二聚 體之方法報導於US 6,897,044中。具有至少四個經由肽連 接體彼此連接之可變結構域的多價Fv抗體構成物報導於US 7,129,330中。二聚及多聚抗原結合結構報導於US 2005/0079170中。包含三個或四個藉由連接結構彼此共價 結合之Fab片段的三價或四價單特異性抗原結合蛋白報導 於US 6,511，663中，該蛋白並非天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導四價雙特異性抗體，其可在原核及真 核細胞中有效表現且可用於治療性及診斷性方法。一種自 包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體與並非經由至 少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體的混合物分離該兩種類型 之多肽二聚體或優先合成該經由至少一個鏈間二硫鍵連接 之二聚體的方法報導於US 2005/0163782中。雙特異性四 價受體報導於US 5,959,083中。具有三個或更多個功能性 抗原結合位點之經改造抗體報導於WO 2001/077342中。 多特異性及多價抗原結合多肽報導於WO 1997/001580 中。WO 1992/004053報導通常自結合相同抗原決定簇之 IgG類單株抗體製備之均偶合物，其係藉由合成性交聯共 價連接。對抗原具有高親合力之寡聚單株抗體報導於WO 1991/06305中，其中分泌具有兩個或更多個免疫球蛋白單 體之募聚物（通常為IgG類），該等單體結合在一起形成四 146953.doc 201040265 價或六價IgG分子。綿羊源抗體及經改造抗體構成物報導 於118 6,3 50,860中’其可用於治療具有致病性干擾素丫活性 之疾病。在US 2005/0100543中報導可乾向構成物’其係 雙特異性抗體之多價載體，即可靶向構成物之每個分子皆 可用作兩個或更多個雙特異性抗體之載體。遺傳改造雙特 異性四價抗體報導於WO 1995/009917中。在WO 2007/109254 中報導經穩定結合分子’其由經穩定^⑺組成或包含該經 穩定scFv。

Muller, D.等人，Handbook of Therapeutic antibodies， 第III部分，第2章（2008) 345-378係關於雙特異性抗體’例 如經由重鏈C端之肽連接體融合兩個scFv片段之全長抗體 (亦參見 WO 1995/009917)。Hust, M·等人’ BMC Biotechnology (2007) 7係關於單鏈Fab (scFab)片段。 然而，鑒於多特異性抗體之不同問題及態樣（例如藥代 動力學及生物學特性、穩定性、凝集、表現產率）’業内 需要其他替代性多特異性抗體形式。尤其在WO 1995/009917 及 Mtiller D·等人，Handbook of Therapeutic antibodies，第 III部分，第2章（2008) 345-378中報導之經遺傳改造之雙特 異性四價抗體僅顯示極低表現產率。 【發明内容】 本發明之第一態樣係多特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 b) —或多個特異性結合1至4個其他抗原（較佳地特異性 146953.doc 201040265 結合1個其他抗原）之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 本發明一較佳態樣係多特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 b) 1至4個特異性結合1至4個其他抗原（較佳地特異性結 合一個其他抗原）之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 該多特異性抗體較佳包含一個或兩個結合第二抗原之單 鏈Fab片段（雙特異性抗體）。 該多特異性抗體較佳包含兩個結合第二抗原之單鏈Fab 片段（雙特異性抗體）。 該多特異性抗體較佳包含兩個結合第二抗原及第三抗原 之單鏈Fab片段（三特異性抗體）。 本發明另一態樣係編碼該多特異性抗體鏈之核酸分子， 其中單鏈Fab片段與該全長抗體重鏈或輕鏈之c或N端融 合。 本發明之又一態樣係包含該多特異性抗體之醫藥組合 物。 本發明多特異性抗體顯示有價值之特性，例如相對於 (例如）經由重鏈C端之肽連接體融合有兩個scpv片段之全 長抗體具有高穩定性、低凝集傾向（例如，參見實例2)(參 146953.doc 201040265 見 WO 1995/009917或 Miiller, D.等人，Handbook of Therapeutic antibodies，第 III部分，第 2 章（2008) 345-3 78)。本發明多 特異性抗體一方面由於其與不同抗原結合而顯示新特性， 且另一方面由於其具有良好穩定性、低凝集性及有價值的 ' 藥代動力學與生物學特性而適於產生及醫藥調配。由於其 、 具有Ig核心及在哺乳動物表現系統中產生之能力，故其仍 保留天然抗體之特性，例如ADCC及CDC。 【實施方式】 ❹ 本發明之第一態樣係多特異性抗體，其包含 a) 特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 b) —或多個特異性結合1至4個其他抗原（較佳地特異性 結合1個其他抗原）之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 Q 本發明一較佳態樣係多特異性抗體，其包含 a)特異性結合第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 ' b) 1至4個特異性結合1至4個其他抗原（較佳地特異性結 ' 合一個其他抗原）之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 在一實施例中，一或兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab 片段經由該全長抗體重鏈或輕鏈C端之肽連接物與該全長 146953.doc 201040265 抗體融合。 在一實施例中，一或兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab 片段經由該全長抗體重鏈c端之肽連接物與該全長抗體融 合。 在一實施例中，一或兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab 片段經由該全長抗體輕鏈C端之肽連接物與該全長抗體融 合。 在一實施例中，兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab片段 經由該全長抗體各重鏈或輕鏈C端之肽連接物與該全長抗 體融合。 在貫把例中，兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab片段 經由该全長抗體各重鏈C端之肽連接物與該全長抗體融 合0 在一實施例中，兩個結合第二抗原之相同單鏈Fab片段 經由該全長抗體各輕鏈C端之肽連接物與該全長抗體融 合。 術語「全長抗體」表示由兩個「全長抗體重鏈」及兩個 「全長抗體輕鏈」組成之抗體（參見圖丨）。「全長抗體重 鏈」係在N端至C端方向上由以下組成之多肽：抗體重鏈 可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域1 (CH1)、抗體鉸 鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定 結構域3 (CH3) ’縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;且在抗體 為IgE亞類之情形下視需要包括抗體重鏈恆定結構域4 (CH4)。「全長抗體重鏈」較佳為在n端至c端方向上由 146953.doc 201040265 VH、CH1、HR、CH2及CH3組成之多肽。「全長抗體輕 鏈」係在N端至c端方向上由以下組成之多肽：抗體輕鏈 可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域（CL)，縮寫為 VL-CL。抗體輕鏈恆定結構域（CL)可為κ (kappa)或人 (lambda)。兩個全長抗體鏈經由CL結構域與cm結構域之 - 間及全長抗體重鏈鉸鏈區之間之多肽内二硫鍵連接在一 起。典型全長抗體之實例係天然抗體，例如IgG(例如IgG q 1及1gG2)、、！gA、bD、及IgE。本發明全長抗體可來 自單一物種（例如人類），或其可為嵌合抗體或人類化抗 體。本發明全長抗體包含兩個各自由VH及VL對形成之抗 原結合位點，二者可特異性結合相同抗原。該全長抗體重 鏈或輕鏈之C端表示該重鏈或輕鏈c端之最後一個胺基 酸。该全長抗體重鏈或輕鏈之N端表示該重鏈或輕鏈n端 之最後一個胺基酸。 「單鏈Fab片段」（參見圖2)係由以下組成之多肽：抗體 Q 重鏈可變結構域（VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕 鏈可變結構域（VL)、抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體， 其中該等抗體結構域及該連接體在N端至C端方向上具有 以下順序中之一種：a) VH-CH1-連接體-VL-CL，b) VL-• CL-連接體-VH-CH1，c) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 d) VL- CH1-連接體-VH-CL ;且其中該連接體係具有至少30個胺 基酸、較佳具有介於32與50個之間之胺基酸的多肽。經由 CL結構域與CH1結構域之間之天然二硫鍵來穩定該等單鏈 Fab片段a) vh-CHI-連接體-VL-CL、b) VL-CL-連接體-VH- 146953.doc 201040265 CHI、c) VH-CL-連接體-VL-CH1 及 d) VL-CH1-連接體-VH- CL。術語「N端」表示N端之最後一個胺基酸。術語「C 端」表示C端之最後一個胺基酸。 在一較佳實施例中，在該單鏈Fab片段中，該等抗體結 構域及該連接體在N端至C端方向上具有以下順序中之一 種： a) VH-CH1-連接體-VL-CL，或 b) VL-CL-連接體-VH-CH1，更佳為VL-CL-連接體-VH-CH1。 在另一較佳實施例中，在該單鏈Fab片段中，該等抗體 結構域及該連接體在N端至C端方向上具有以下順序中之 一種： b) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 b) VL-CH1-連接體-VH- CL。 視需要，在該單鏈Fab片段中，除CL結構域與CH1結構 域之間之天然二硫鍵以外，抗體重鏈可變結構域（VH)及抗 體輕鏈可變結構域（VL)亦藉由在以下位置之間引入二硫鍵 而經二硫鍵穩定： i) 重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1〇〇位， Π)重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii)重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域1 〇〇位（始終 根據Kabat之EU索引來編號）。 該單鏈Fab片段之進一步二硫鍵穩定係藉由在單鏈Fab片 段之可變結構域VH與VL之間引入二硫鍵來達成。引入非 天然·一硫橋來穩定早鍵F v之技術闡述於（例如）以下文獻 146953.doc -10- 201040265 中：WO 94/029350 ; Rajagopal，V.等人，Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59 ; Kobayashi，H.等人，Nuclear Medicine & Biology，第 25 卷（1998) 387-393 ;或 Schmidt，M.等人， Oncogene 18 (1999) 1711-1721。在一實施例中，本發明抗 體中所包括單鏈Fab片段可變結構域之間之可選二硫鍵介 於重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1〇0位之間。在 一實施例中，本發明抗體中所包括單鏈Fab片段可變結構 域之間之可選二硫鍵介於重鏈可變結構域105位與輕鏈可 〇 變結構域43位之間（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 在一實施例中，在單鏈Fab片段可變結構域VH與VL之間 未經該可選二硫鍵穩定之單鏈Fab片段較佳。 本發明所用術語「肽連接物」表示胺基酸序列較佳具有 合成來源之肽。使用本發明該等肽連接物來融合單鏈Fab 片段與全長抗體之C或N端以形成本發明多特異性抗體。 §亥等b)中之肽連接物之胺基酸序列較佳長至少5個胺基 Q 酸’較佳長5至100個胺基酸’更佳長1〇至5〇個胺基酸。在 一貝施例中’該肽連接物係（GxS)n或（GxS)nGm，其中G= 甘胺酸’ S-絲胺酸，且（x=3，n=3、4、5或6，且m=0、 1、2或 3)或（χ=4，n=2、3、4或亏且^^、i、2或 3)，較佳 地x=4且n=2或3，更佳地x=4, n=2。在一實施例中，該肽 連接物係（G4S)2。 本發明所用術語「連接體」表示胺基酸序列較佳具有合 成來源之肽。使用本發明該等肽來連接a) VH-CH1與VL- CL、b) VL-CL 與 VH-CH1、c) VH-CL與 VL-CH1 或 d) VL- 146953.doc -11 · 201040265 CH1與VH-CL，從而形成以下本發明單鏈Fab片段：a) vh-CH1-連接體 _VL-CL、b) VL-CL-連接體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CHl 或 d) VL-CH1-連接體-VH-CL。單鏈 Fab 片段之内之該連接體係胺基酸序列長度為至少3 〇個胺基 酸、長度較佳為32至50個胺基酸之肽。在一實施例中，該 連接體係（GxS)n ’其中G=甘胺酸，S =絲胺酸（χ =3，n=8、 9 或 10且 m=0、1、2 或 3)或（χ=4且 n=6、7 或 8 且 m=0、1、2 或3)，較佳地x=4，n=6或7且m=〇、}、2或3，更佳地 x-4，n-7且m=2。在一實施例中，該連接體係（G4S)6G2。 在同一時間b)中之單鏈Fab片段僅有一者可與該全長抗 體重鏈或輕鏈之各C或N端融合。因此，最多8個單鏈Fab 片段可與該全長抗體融合。本發明多特異性抗體較佳包含 1至4個單鏈Fab片段。本發明多特異性抗體更佳包含兩個 相同單鏈Fab片段（VL_CL_連接體_VH CH1較佳），該二者 與忒a)中之全長抗體的兩條重鏈之兩個c端融合或與兩條 輕鏈之兩個C端融合。該融合產生兩個相同融合肽⑴重 鏈及單鏈Fab片段或ii)輕鏈及單鏈Fab片段），其與〇全 長抗體之輕鍵或重鍵丘类王目LV :¾ tL a 尺蟪，、衣現以產生本發明多特異性抗體 (參見圖3 '4及5)。 在另-較佳實施例中’本發明多特異性抗體包含兩個相 同單鏈Fab片段（較佳VH_cm_連接體_vl_cl)，該二者與^ 中之該全長抗體的兩條重鏈之兩個N端融合或與兩條輕鏈 之兩個㈣㉔合。該融合產生兩個相同融合肽⑴重鍵及單 鏈Μ片段或ii)輕鏈及單鏈Fab片段），其與〇全長抗體之輕 146953.doc 201040265 鏈或重鏈共表現以產生本發明多特異性抗體。 本發明多特異性抗體之兩部分皆包含抗原結合位點（本 發明全長抗體包含兩個抗原結合位點，各單鏈Fab片段包 含一個抗原結合位點）。本文所用術語「結合位點」或 「抗原結合位點」表示本發明該多特異性抗體中實際上特 • 異性結合各抗原之區域。全長抗體或單鏈Fab片段中之抗 原結合位點各由一對抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體重鏈 ❹ 可變結構域（VH)組成所形成。 特異性結合所欲抗原（例如EGFR)之抗原結合位點可源 自：a)針對該抗原之已知抗體（例如抗egfr抗體），或b)藉 由特別使用抗原蛋白或其核酸或片段之重新免疫方法或藉 由噬菌體呈現法獲得之新抗體或抗體片段。 本發明抗體之抗原結合位點含有六個互補決定區 (CDRs)，不同程度地貢獻結合位點對抗原之親和力。有三 個重鏈可變結構域CDRs (CDRm、CDRH2及CDRH3)及三

〇 個輕鏈可變結構域CDRS(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR 及框架區（FRS)之範圍係由與胺基酸序列之彙編資料庫比 對決疋，其中該等區域已根據序列間之變異性界定。 抗體特異性係指抗體對抗原之特定表位之選擇性識別。 例如，天然抗體具有單特異性。本文所用術語「多特異 性」抗體表示具有兩個或更多個抗原結合位點之抗體，該 等結合位點中至少兩個結合不同抗原或相同抗原之不同表 位。本發明「雙特異性抗體」係具有兩種不同抗原結合特 異性之抗體。例如，本發明抗體對至少兩種不同抗原具有 146953.doc 13· 201040265

多特異性，即作兔I #马第一抗原之EGFR及作為第二抗原之 IGF -1R。在木路日日 由 赞月—實施例中，本發明多特異性抗體具有 雙特異I·生在本發明另一實施例中本發明多特異性抗體 具有三特異性。 本文所用術„吾「單特異性」抗體表示具有一或多個結合 位點之抗體，§亥等結合位點各自結合相同抗原上之相同表 位。 本中4案所用術語「價」表示抗體分子中存在特定數量 之結合位點。例如’天然抗體或本發明全長抗體具有兩個 結合位點且為二價抗體。因此，術語「三價」、「四 4貝」及五價」分別表示在抗體分子中存在兩個結合位 點、一個結合位點、四個結合位點、五個結合位點、及六 個結合位點。本發明多特異性抗體至少為「三價」。其較 佳為「三價」、「四價」、「五價」或「六價」，更佳為 「三價」或「四價」。 本發明抗體具有三個或更多個結合位點且為多特異性， 較佳為雙特異性或三特異性。本發明多特異性抗體甚至在 2在三個以上結合位點（即抗體為四價、五價或六價或多 價）之情形下亦可具有雙特異性。對於具有兩個以上抗原 結合位點之抗體而言，某些結合位點可相同，只要該蛋白 具有針對兩個不同抗原之結合位點即可。 本發明之另一實施例係多特異性抗體，其包含 a)特異性結合第一抗原且由以下組成之全長抗體： aa)兩個相同抗體重鏈，其在N端至匸端方 J工田以 146953.doc 14 201040265 下組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆 定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈 恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab)兩個相同抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以 下組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈 恆定結構域（CL) (VL-CL);及 b) 1至4個特異性結合1至4種其他抗原（較佳特異性結合 〇 一種其他抗原）之單鏈Fab片段， 其中該等單鏈Fab片段係由抗體重鏈可變結構域（VH) 及抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域 (VL)、抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體組成，且 其中該等抗體結構域及該連接體在N端至C端方向上 具有以下順序中之一種： ba) VH-CH1-連接體-VL-CL、bb) VL-CL-連接體-Q VH-CH1、be) VH-CL-連接體 _VL-CH1 或 bd) VL- CH1-連接體 _VH-CL ; 其中該連接體係具有至少30個胺基酸、較佳具有 介於32與50個之間之胺基酸的肽； 且其中該b)中之單鏈F ab片段經由該a)中之全長抗體 的重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融 合； 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有 介於10與50個之間之胺基酸之肽。 146953.doc •15- 201040265 在此實施例内，較佳一個或兩個、更佳兩個特異性結合 第二抗原之單鏈Fab片段ba) VH-CH1-連接體-VL-CL或bb) VL-CL-連接體-VH-CHl(bb) VL-CL-連接體-VH-CH1 較佳） 經由該全長抗體重鏈C端之肽連接物與該全長抗體融合， 且該等單鏈Fab片段未經二硫鍵穩定。 本發明一實施例係本發明多特異性抗體，其中一個或兩 個特異性結合第二抗原之單鏈Fab片段經由該全長抗體重 鏈C端之肽連接物與該全長抗體融合（雙特異性抗體）。 本發明多特異性抗體較佳包含兩個結合第二抗原之相同 單鏈Fab片段，該二者皆與重鏈融合或該二者融合輕鏈C或 N端（雙特異性抗體）。 本發明一實施例係本發明多特異性抗體，其中兩個結合 第二抗原之相同單鏈Fab片段VL-CL-連接體-VH-CH1或 VH-CH1-連接體-VL-CL(VL-CL-連接體-VH-CH1較佳）以其 N端經由該全長抗體中兩條重鏈之兩個C端或兩條輕鏈之 兩個C端之肽連接物與該全長抗體融合（四價雙特異性抗 體）。在一較佳實施例中，本發明該多特異性抗體（較佳該 四價雙特異性抗體）含有全長IgG及上述本發明兩個相同單 鏈Fab片段且特異性結合人類IGF-1R以及人類EGFR。該等 分子較佳係基於人類抗-IGF-1R抗體<IGF-1R> HUMAB純 系 18(DSM ACC 2587 ; WO 2005/005635，縮寫為 <IGF-1R>純系 18 或 <IGF-1R> AK18)及人類化 <EGFR>ICR62(WO 2006/082515，縮寫為<EGFR>ICR62)之抗原結合位點。該 等分子同時靶定腫瘤細胞上之兩種受體酪胺酸激酶且干擾 146953.doc -16- 201040265 該兩種激酶之作用。此雙重活性產生相對於僅干擾該等受 體中之一者之抗體顯著改良之抗腫瘤活性。該等分子之設 計、組成、產生及表徵展示於實例1-6中。 因此，在一實施例中，本發明此一多特異性抗體之特徵 在於 i) 該全長抗體特異性結合IGF1R且在重鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 1 之 CDR3 區、SEQ ID NO: 2 之 CDR2 區、及SEQ ID NO:3之CDR1區，且在輕鏈可變結構 域中包含 SEQ ID NO: 4 之 CDR3 區、SEQ ID NO:5 之 CDR2 區、及 SEQ ID NO:6之 CDR1區；及 ii) 該單鏈Fab片段特異性結合EGFR且在重鏈可變結構 域中包含 SEQ ID NO: 9 之 CDR3 區、SEQ ID NO: 10 之CDR2區、及SEQ ID NO: 11之CDR1區，且在輕鏈 可變結構域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3區、SEQ IDNO: 13 之 CDR2 區、及 SEQIDNO: 14之 CDR1 區。 在一實施例中，本發明此一多特異性抗體之特徵在於 i) 該全長抗體特異性結合IGF-1R且包含SEQ ID NO: 7 作為重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 8作為輕 鏈可變結構域，及 ii) 該單鏈Fab片段特異性結合EGFR且包含SEQ ID NO: 15作為重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 16作為 輕鏈可變結構域。 在一實施例中，本發明此一多特異性抗體之特徵在於 i)該全長抗體特異性結合EGFR且在重鏈可變結構域中 146953.doc -17- 201040265 包含 SEQ ID NO: 9 之 CDR3 區、SEQ ID NO: ι〇 之 CDR2區、及SEQ ID NO: 11之CDR1區，且在輕鏈可 變結構域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3區、SEQ ID NO: 13之CDR2區、及 SEQ ID NO: 14之CDR1區；及 ii)該單鏈Fab片段特異性結合IGF-1R且在重鏈可變結構 域中包含 SEQ ID NO: 1 之 CDR3 區、SEQ ID NO: 2 之 CDR2區、及SEQ ID NO:3之CDR1區，且在輕鏈可變 結構域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3區、SEQ ID NO:5之 CDR2 區、及 SEQIDN0:62CDRlg。 在一實施例中，本發明此一多特異性抗體之特徵在於 i) 該全長抗體特異性結合EGFR且包含SEQ ID NO: 15 作為重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 16作為輕 鏈可變結構域，及 ii) 該單鏈Fab片段特異性結合IGF1R且包含SEQ ID NO: 7作為重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 8作為輕 鏈可變結構域。 本發明一實施例係本發明多特異性抗體，其中兩個結合 第二抗原之相同單鏈Fab片段VL-CL-連接體-VH-CH1或 VH-CH1 -連接體-VL-CL(VL-CL-連接體-VH-CH1較佳）以其 C端經由該全長抗體中兩條重鏈之兩個N端或兩條輕鏈之 兩個N端之肽連接物與該全長抗體融合。 本發明一實施例係本發明多特異性抗體，其中一個結合 第二抗原之單鏈Fab片段經由該全長抗體中一條重鏈或一 條輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。本發明一 146953.doc -18- 201040265 實施例係本發明多特異性抗體，其中一個結合第二抗原之 單鏈Fab片鉸經由該全長抗體中一條重鏈或一條輕鏈n端之 肽連接物與该全長抗體融合。本發明一實施例係本發明多 特異性抗體，其中一個結合第二抗原之單鏈Fab片段經由 該全長抗體中一條重鏈或一條輕鏈c端之肽連接物與該全 長抗體融合（例如，參見圖6)。 本發明多特異性抗體較佳包含兩個結合第二抗原及第三 ❹ 抗原之單鏈Fab片段（三特異性抗體）(例如，參見圖7)。 在本發明另一態樣中，本發明多特異性抗體包含 a) 結合第一抗原之全長抗體，其由兩個相同抗體重鏈 VH-CH1-HR-CH2-CH3及兩個相同抗體輕鏈vl-CL組 成；及 b) 1至4個結合1至4個其他抗原之單鏈Fab片段ba) νΉ_ CH1 -連接體 _vl-CL 或 bb)VL-CL-連接體- VH-CHl， 其中s玄4單鏈Fab片段經由該全長抗體重鏈及輕鏈c Q 或N端之肽連接物與該全長抗體連接。 本發明全長抗體包含一或多個免疫球蛋白種類之免疫球 蛋白恒定區。免疫球蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、

IgD、及IgE同種型，且在IgG及IgA情形下包括其亞型。在 一較佳實施例中，本發明全長抗體具有IgG類抗體之恆定 結構域結構。 本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指 具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變 146953.doc •19· 201040265 區（即結合區）及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部 分的抗體，其通常係藉由重組DNA技術來製備。包含鼠類 可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明所涵蓋之其 他杈佳形式之「嵌合抗體」係彼等恆定區已相對於原始抗 體進行修飾或改變從而尤其在Clq結合及/或以受體（FcR) 結合方面獲得本發明特性者。該等嵌合抗體亦稱作「種類 轉換抗體」。嵌合抗體係免疫球蛋白基因之表現產物，該 等免疫球蛋白基因包含編碼免疫球蛋白可變區之dn a片段 及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA片段。製備嵌合抗體之方 法涉及業内熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如， 參見 Morrison, S.L.等人，proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238及 US 5,204,244。 術語「人類化抗體」係指框架區或「互補決定區」 (CDR)已經修飾而包含與親代免疫球蛋白cdr相比具有不 同特異性之免疫球蛋白CDR的抗體。在一較佳實施例中， 將鼠類CDR移植入人類抗體之框架區中以製備「人類化抗 體」。例如，參見 Riechmann, L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268- 270。尤佳CDR對應於嵌合抗體中彼等代表可識別上述抗 原之序列者。本發明所涵蓋之其他形式之r人類化抗體」 係彼等悝定區已相對於原始抗體進行額外修飾或改變從而 尤其在Clq結合及/或Fc受體（FcR)結合方面獲得本發明特 性者。 本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系 146953.doc -20- 201040265 免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體已為 當月丨】業内所熟知（van Dijk，M.A.及van de Winkel，J.G.， Cun·· Opin. chem· Biol· 5 (2001) 368-374)。亦可在轉基因 動物（例如小鼠）中產生人類抗體，該等轉基因動物在免疫 後能在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生全譜系之人類 抗體或所選人類抗體。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉 移至該等種系之突變小鼠中使得可在抗原激發後產生人類 抗體（例如，參見 Jakobovits，A.等人，Proc. Natl Acad Ο

Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，Α.等人， Nature 362 (1993) 255-258 ; Brueggemann，M.等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在嗔菌體呈現文 庫中產生（Hoogenboom, H.R.及 Winter，G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks，J.D.等人，J. Mol· Biol. 222 (1991) 581-597)。亦可使用Cole等人及B〇erner等人之技術 來製備人類單株抗體（C〇le，S.P.C.等人，Monoci〇nal ◎ Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, (1985) 77-96 ;及 Boerner，P.等人，j. Immunol· 147 (1991) 86 95) 〇 如已提及之本發明嵌合及人類化抗體，本文所用術語「人 類抗體」亦包含該等恆定區中經修飾從而尤其在Clq結合 及/或FcR結合方面獲得本發明特性之抗體，例如藉由「種 類轉換」來修飾’即，使F c部分發生改變或突變（例如自 IgGl 變為 IgG4及 /或 IgGl/IgG4 突變）。 在本發明多特異性抗體包含一個或三個產生異二聚融合 肽之單鏈Fab片段之情形下（或在兩個不同單鏈片段皆附接 146953.doc -21· 201040265 至重鏈或輕鏈C或N端之情形下），本發明該全長抗體之 CH3結構域可藉由「隆凸_孔洞結合（kn〇b_int〇_h〇les)」技 術來改變，該技術以若干實例詳細闡述於（例如）以下文獻 中：WO 96/027011 ; Ridgway，J.B·等人，Pr〇tein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant，A.Μ.等人 ’ Nat Bi〇techn〇l 16 (1998) 677-681。在此方法中，兩個CH3結構域之交互 作用表面經改變以增強兩條含有該兩個CH3結構域之重鏈 之異二聚作用。兩個CH3結構域（兩條重鏈中）之每一者皆 可為「隆凸」，而另一者為「孔洞」。引入二硫橋可穩定 異一聚體（Merchant, A.M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681，· Atwell，S.等人，J. Mol. Bi〇1 27〇 (1997) 26 35) 並提南產率。 因此，在本發明一態樣中，本發明該多特異性抗體僅包 含一個單鏈Fab片段且特徵另外在於 條重鏈之CH3結構域及另一條重鏈之CH3結構域各自 在包含抗體CH3結構域間之初始介面之介面處相遇； 其中該介面經改變以促進二價雙特異性抗體之形成，其 中該改變之特徵在於： a) —條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在該二價雙特異性抗體内，在遇到一條重鏈之 C Η 3結構域之初始介面的另一條重鏈之c h 3結構域的初始 介面内， 胺基酸殘基經具有奢交大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從 而在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定 146953.doc 201040265 位於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔中， 及 b)另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在該三價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結 構域之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， '胺基酸殘基經具有較小侧鏈體積之胺基酸殘基替代，由 此在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3結構域之介面内之突出物。 〇 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y) '色胺酸 (W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（〇作為胺基 ◎ 酸’從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。 在一較佳實施例中，該多特異性抗體僅包含一個單鏈 Fab片段且係三價雙特異性抗體。該三價雙特異性抗體在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞 ' 鏈」之CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦 可藉由（例如）在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突 變且在「孔洞鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C 大變來使用CH3結構域之間之另一鍵間二硫橋（Merchant, Α·Μ等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另 146953.doc •23· 201040265 一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域 中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域 中之另一者中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變； 或該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含 Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包 含 S354C、T366S、L368A、Y407V突變（一個 CH3結構域中 之額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或 S3 54C突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat之EU索引來編 號）。但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術， 如EP 1870459A1所述。該三價雙特異性抗體之較佳實例 係：在「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K370E突 變且在「孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E3 57K突 變（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體（僅包含一 個單鏈Fab片段之多特異性抗體）在「隆凸鏈」之CH3結構 域中包含T3 66W突變且在「孔洞鏈」之CH3結構域中包含 T366S、L368A、Y407V突變，且另外在「隆凸鏈」之CH3 結構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3 結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體（僅包含一 個Fab片段之多特異性抗體）在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T3 66W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變；或該三價雙 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 146953.doc -24- 201040265 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S3 54C、T3 66S、L3 68A、Y407V 突變，且另外在「隆凸 鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞 鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 因此，本發明一實施例係本發明多特異性抗體，其中一 個結合第二抗原之單鏈Fab月段經由該全長抗體中一條重 鏈或一條輕鏈之C或N端（較佳為一條重鏈之C端）之肽連接 物與該全長抗體融合，其中該全長抗體在兩個CH3結構域 中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含T366S、L368A、Y407V突變。本發明之另一實 施例係本發明多特異性抗體，其中一個結合第二抗原之單 鏈Fab片段經由該全長抗體中一條重鏈或一條輕鏈之C或N 端（較佳為一條重鏈之C端）之肽連接物與該全長抗體融 合，其中該全長抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含 Y349C、T3 66W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包 含 S3 54C、T3 66S、L368A、Y407V突變（例如，參見圖 6)。 本發明之另一實施例係本發明多特異性抗體，其中一個結 合第二抗原之單鏈Fab片段經由該全長抗體中一條重鏈或 一條輕鏈之C或N端（較佳為一條重鏈之C端）之肽連接物與 該全長抗體融合，其中該全長抗體在兩個CH3結構域中之 一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之 另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V 突變（例 如，參見圖6)。 本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括所有藉由重組 146953.doc -25- 201040265 方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，例如自諸如 NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉 基因動物（例如小鼠）分離之抗體、或使用轉染至宿主細胞 中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈 重排形式之可變及恆定區。本發明之重組人類抗體已發生 體内體細胞超突變。因此，重組抗體之VH及vl區之胺基 酸序列雖然源自人類種系VH及VL序列且與之相關，但並 非天然存在於活體内人類抗體種系譜中。 本文所用「可變結構域」（輕鏈可變結構域（VL)、重鏈 了變區（VH))表示直接參與抗體與抗原結合之輕鍵及重鏈 對中之母一者。人類輕鏈及重鏈可變結構域具有相同通用 結構，且每一結構域包含四個序列高度保守之框架區 (FR)，其經由三個「超變區」（或互補決定區，CDR)連 接。框架區採用β-摺疊構象且CDR可形成連接β_摺疊結構 之環。各鏈中之CDR藉由框架區來保持其三維結構，並與 另一鏈中之CDR—起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈 之CDR3區在本發明抗體之結合特異性/親和性方面具有特 別重要之作用，且由此提供本發明之又一目的。 本文所用術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分」係 指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含來自 「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或 「FR」區係彼等除本文所定義超變區殘基以外的可變結構 域區。因此，抗體之輕鏈及重鏈自Ν端至C端包含結構域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。各鏈上之 146953.doc •26· 201040265 CDR係藉由該等框架胺基酸來間隔。具體而言，重鏈之 CDR3係對抗原結合作用最大之區域。CDR及FR區係根據 Kabat 專人（Sequences of Proteins of Immunological Interest ’ 第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health ’ Bethesda ’ MD. (1991))之標準定義來確定。 本文所用術語「結合」或「特異性結合」係指在體外分 析中抗體與抗原表位之結合，較佳係在電漿共振分析 (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)中與純化野生型 抗原之結合。結合親和力定義為術語ka(抗體/抗原複合物 中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及KD (kD/ka)。結 合或特異性結合意指結合親和力（KD)為10·8 mol/1或更低， 較佳為10_9 Μ至10·13 mol/Ι。因此，本發明多特異性抗體以 1(T8 mol/1或更低、較佳1〇_9 Μ至10·13 mol/1之結合親和力 (KD)與各特異性抗原特異性結合。 可藉由BIAcore 分析（GE-Healthcare Uppsala, Sweden)來 研究抗體與FcyRIII之結合。結合親和力定義為術語ka(抗 體/抗原複合物中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及 KD (kD/ka)。 術語「表位」包括能特異性結合抗體之任何多肽決定 簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子之化學活性表 面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，且在 某些實施例中可具有特定的三維結構特徵及/或比電荷特 徵。表位係抗原中結合抗體之區域。 在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或高分子複合混 146953.doc 27· 201040265 合物中優先識別其靶抗原時，認為該抗體可特異性結合該 抗原。 本申請案中所用術語「恆定區」表示抗體中除可變區以 外之結構域的總和。恆定區並非直接參與抗原結合，而是 表現出各種效應子功能。端視抗體重鏈恆定區之胺基酸序 列’可將抗體分為以下幾類：IgA、igD、igE、lgG及 IgM ’且其中若干種類可進一步分為多個亞類，例如 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4、IgAl 及 IgA2。對應於不同抗 體種類之重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε及γ。在所有五種抗 體種類中可發現之輕鏈恆定區（CL)稱作K (kappa)及λ (lambda) ° 本申請案中所用術語「得自人類來源之恆定區」表示 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類人類抗體之重鏈恆定區及/ 或輕鏈κ或λ恆定區。該等恆定區為當前業内所熟知且由 (例如）Kabat，Ε_Α·所闡述（例如，參見Johnson，G.及Wu, T.T. > Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ； Kabat, E.A. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 72 (1975) 2785-2788)。

IgG4亞類之抗體顯示降低之Fc受體（FcyRIIIa)結合，同 時其他IgG亞類之抗體顯示較強結合。然而，Pro23 8、 Asp265、Asp270、Asn297(喪失 Fc碳水化合物）、Pro329、 Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、及His435係在改變後 亦可提供降低之Fc受體結合之殘基（Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund, J.等人，FASEB 146953.doc -28 - 201040265 J. 9 (1995) 1 15-119 ; Morgan，Α·等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0 307 434)。 在一實施例中，本發明抗體相對於IgGl抗體及全長親代 抗體具有降低之FcR結合，其在FcR結合方面屬於IgG4亞 類或IgGl或IgG2亞類且在S228、L234、L235及/或D265處 具有突變，及/或含有PVA236突變。在一實施例中，全長 親代抗體中之突變係S228P、L234A、L235A、L235E及/或 PVA236。在另一實施例中，全長親代抗體中之突變係 IgG4 S228P及IgGl L234A及L235A。重鏈恆定區展示於 SEQ ID NO: 17及1 8中。在一實施例中，全長親代抗體之 重鏈恆定區係具有L234A及L235A突變之SEQ ID NO: 17。 在另一實施例中，全長親代抗體之重鏈恆定區係具有 S228P突變之SEQ ID NO: 18。在另一實施例中，全長親代 抗體之輕鏈恆定區係SEQ ID NO: 19之κ輕鏈區或λ輕鏈 區。全長親代抗體之重鏈恆定區較佳係具有S228P突變之 SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 18。 抗體恆定區直接參與adcc(抗體依賴性細胞介導細胞毒 性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體活化（CDC)係藉由 使補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類之恆定區結合來起 始。Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定 義之蛋白質間交互作用來引發。該等恆定區結合位點為當 前業内所知且闡述於（例如）以下文獻中：Lukas, T.，J.等 人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse，R.及 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ； Burton, 146953.doc -29- 201040265 D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J.E.等 人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E.E.等 人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M·等 人，J· Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan，Α·等人， Immunology 86 (1995) 319-324 ;及EP 0 307 434 ° 該等恆 定區結合位點之特徵在於（例如）胺基酸L234、L235、 D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據 Kabat之EU索引來編號）。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指人類靶細胞 在效應子細胞存在下由本發明抗體溶解。較佳在效應子細 胞存在下藉由用本發明抗體處理抗原表現細胞之製劑來量 測ADCC，該等效應子細胞例如剛分離之PBMC或自血沉 棕黃層純化之效應子細胞，例如單核細胞或天然殺傷（NK) 細胞或持久生長NK細胞系。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示藉由使補體因 子Clq與大多數IgG抗體亞類之Fc部分結合來起始之過程。 Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定義之 蛋白質間交互作用來引發。該等Fc部分結合位點為當前業 内已知（參見上文）。該等Fc部分結合位點之特徵在於（例 如）胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331、及P329(根據Kabat之EU索引來編號）。 IgGl、IgG2及IgG3亞類抗體通常顯示包括Clq及C3結合在 内之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合Clq及/或 C3。 146953.doc -30· 201040265 在另一實施例中，本發明多特異性抗體之特徵在於，該 全長抗體屬於人類IgGl亞類或屬於人類IgGl亞類且具有突 變 L234A及 L235A。 在另一實施例中，本發明多特異性抗體之特徵在於該全 長抗體屬於人類IgG2亞類。 在另一實施例中，本發明多特異性抗體之特徵在於該全 長抗體屬於人類IgG3亞類。 在另一實施例中，本發明多特異性抗體之特徵在於該全 長抗體屬於人類IgG4亞類或人類IgG4亞類且具有額外突變 S228P 。 較佳地，本發明多特異性抗體之特徵在於，該全長抗體 屬於人類IgGl亞類或屬於人類IgG4亞類且具有額外突變 S228P ° 在另一實施例中，本發明多特異性抗體之特徵在於，該 全長抗體以可增強對人類Fc-γ受體Ilia之親和力之方式經 修飾（藉由Fc區中之突變或藉由糖改造），從而提高其介導 ADCC之能力。藉由降低岩藻糖之量來增強抗體ADCC之 方法闡述於（例如）以下文獻中：WO 2005/018572、WO 2006/1 16260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739 ； Niwa, R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ; Shinkawa, Τ·等 Λ > J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473 ； WO 03/055993 146953.doc -31- 201040265 或US 2005/〇249722。因此，在本發明一實施例中，本發 明多特異性抗體之特徵在於，該全長抗體係非岩藻糖化之 IgGl或IgG3同種型，其中岩藻糖之量佔Asn297處募糖（糖） 總量之60%或更低（意指在Fc區中之Asn297處至少40%或更 多募糖經非岩藻糖化）。 本發明抗體係藉由重組方式來產生。因此，本發明一態 樣係編碼本發明抗體之核酸，且另一態樣係包含該編碼本 發明抗體之核酸之細胞。用於重組製造之方法廣泛為當前 業内所知且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質及隨後分 離抗體以及通常將其純化至醫藥上可接受之純度。對於上 述抗體在宿主細胞中之表現，藉由標準方法將編碼各經修 飾輕鏈及重鏈的核酸插入表現載體中。在適宜原核或真核 宿主細胞（例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293 細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌（E.coli) 細胞）中進行表現，且自該等細胞（上清液或溶解後細胞）回 收抗體。重組產生抗體之通用方法已為當前業内所熟知且 闡述於（例如）以下綜述文獻中：Makrides, S.C.，Protein

Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ; Kaufman，R.J.，Mol_ Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ; Werner，R.G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 = 本發明多特異性抗體適合藉由習用免疫球蛋白純化程序 自培養基分離，該等程序例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠 (Sepharose)法、羥基填灰石層析法、凝膠電泳、透析或親 146953.doc • 32- 201040265 和層析法。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序輕 易地分離及測序。雜交瘤細胞可用作該DNA及RNA之來 源。分離後，DNA可插入表現載體中，隨後轉染至原本不 產生免疫球蛋白之宿主細胞（例如HEK 293細胞、CHO細 胞、或骨髓瘤細胞）中，以在宿主細胞中獲得重組單株抗 體之合成。 多特異性抗體之胺基酸序列變體（或突變體）係藉由適當 〇 核苦酸變化'引入該抗體DNA或藉由核苷酸合成製備。然 而’該等修飾僅能在極有限範圍内（例如上文所述）實施。 舉例而s ’該等修飾不改變上述抗體特徵，諸如IgG同型 及抗原結合等，但可提高重組產生之產率、蛋白質穩定 性’或有利於純化。 本案中所用術語「宿主細胞」表示任何種類可經改造以 生成本發明抗體之細胞系統。在一個實施例中，使用 HEK293細胞及ch〇細胞作為宿主細胞。 〇 本文所用表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」 可互換使用且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉 化體」及「轉化細胞」包括原代細胞及源自其之培養物而 不論轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能因特 意或無意的突變而不完全相同。本發明包括對於原始轉化 細胞篩選具有相同功能或生物活性之變體子代。若意欲使 用區別名稱，可由上下文明瞭。 在NS0細胞中之表現闡述於例如Barnes，L M•等人， Cytotechnoiogy 32 (2000) 1〇9_123 ; Bw，lm 等人， 146953.doc -33- 201040265

Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時表現闡述於例 如 Durocher，Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 中。 可變結構域之選殖闡述於Orlandi, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P.等人， Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L.等人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87。較佳瞬時表現系統（HEK 293)闡述於Schlaeger, E.-J.及 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ;及

Schlaeger，E.-J·，J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 中〇 舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、 (視需要）操縱子序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞 可利用啟動子、增強子及多聚腺苷酸化信號。 當一核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸係 「可操作連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列 之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌 前導序列之DNA可操作連接至該多肽之DNA ;若啟動子或 增強子可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操 作連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點之定位有助於 轉譯，則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列。一 般而言，「可操作連接」意指所連接DNA序列係鄰接序列 且在分泌前導序列情況下係鄰接序列且處於閱讀框内。然 而，增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合可完 成連接。若不存在該等位點，則根據習用慣例可使用合成 146953.doc -34- 201040265 性寡核苷酸銜接子或連接體。 藉由標準技術實施抗體純化以消除細胞組份或其他污染 物（例如其他細胞核酸或蛋白質），該等技術包括鹼/SDS處 理、CsCl區帶法、管柱層析法、壤脂糖凝膠電泳法、及其 他業内熟知方法。參見Ausubel, F等人編輯，Current Protocols in Molecular Bi〇l〇gy> Greene Publishing and Wiley lnterscience，New Y〇rk (1987卜已有多種不同方法 ❹ 被人們所接受且廣泛用於蛋白質純化，例如使用微生物蛋 白質實轭之親和層析（例如蛋白質A或蛋白質G親和層析）、 離子交換層析（例如陽離子交換（羧甲基樹脂）、陰離子交換 (胺基乙基樹脂）及混合型交換）、嗜硫菌吸附（例如使用p_ 巯基乙醇及其他SH配體）、疏水作用或芳香族吸附層析（例 如使用本基_缓脂糖、乳雜_親芳烴（aren〇philiC)樹脂、或 間-胺基本基硼酸）、金屬螯合親和層析（例如使用 Cu(II)-親和性材料）、尺寸排除層析及電泳方法（例如凝膠 Q 電泳、毛細管電泳）(Vijayalakshmi, M.A.，Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。 本文所用術語「轉化」係指將載體/核酸轉移至宿主細 胞中之過程。右使用不具有牢固細胞壁障壁之細胞作為宿 主細胞’則可藉由例如磷酸鈣沉澱法來實施轉染，如

Graham，F.L.及 van der Eb，A.J.，Virology 52 (1973) 456- 467中所述。然而，亦可使用將DNA引入細胞中之其他方 法’例如細胞核注射或原生質體融合。若使用原核細胞或 含有牢固細胞壁構造之細胞，則一種轉染方法係（例如）使 146953.doc -35- 201040265 用亂化約進行弼處理，如Cohen, S.N.等人，pnAS. ό9 (1972) 2110-2114所述。 本文所用「表現」係指將核酸轉錄為mRN Α之過程及/或 隨後將經轉錄mRNA(亦稱作轉錄物）轉譯為肽、多肽或蛋 白質之過程。轉錄物及所編碼多肽共稱為基因產物。若多 核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括 mRNA之剪接。 「載體」係核酸分子，具體而言為自主複製的核酸分 子，其將插入核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞 之間。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞（例如 染色體整合）之載體、主要用於複製〇>|八或111^八之複製載 體、及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。該術 語亦包括可提供不止一種上述功能之載體。 「表現載體」係在引入適宜宿主細胞時可轉錄並轉譯為 多肽之多核苦酸。「表現系統」通常係指包括可用於產2 期望表現產物之表現載體的適宜宿主細胞。 現已發現’本發明多特異性抗體具有經改良特徵，例如 生物學或藥理學活性、藥代動力學特性或毒性。其可用於 (例如）治療諸如癌症等疾病。

本發明之一態樣係包含本發明抗體之醫藥組合物。本發 明另一態樣係本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本 發明另-態樣係製造包含本發明抗體之醫藥組合物之方 法。在另-態樣中，本發明提供組合物(例如醫藥組合 物），其含有與醫藥載劑調配在一起之本發明抗體。 D 146953.doc -36- 201040265 本發明-實施例係本發明多特異性、較佳雙特異性抗 體’其用於治療癌症。 本發明另-態樣係該醫藥組合物，其用於治療癌症。 本發明另U係本發明抗體之用途，其用於製造治療 癌症之樂物。 • 本發明另-態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之患 者來治療癌症患者之方法。 〇 /文所用「醫藥載劑」包括任何及所有溶劑、分散介 資〇衣抗細菌及抗真菌試劑、等渗劑及吸收延遲劑、 及生理上相容之類似試劑。較佳地，载劑適合於靜脈内、 肌内、皮下、非經腸、經脊柱或經表皮投與(例如藉由注 射或輸注）。 本發明組合物可藉由多種業内已知方法來投與。熟習此 項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式可隨期望效果而變 化。為藉由某些投與途徑投與本發明化合物，需要用某種 〇 #料塗佈該化合物或將該化合物與該材料共投與以防止該 化合物失活。舉例而言，投與個體之化合物可存於適宜載 劑中’例如脂質體或稀釋劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括 鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水性溶液或分散 液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。 該等介質及試劑於醫藥活性物質中之應用為業内已知。

本文所用片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」 意指除經腸及局部投與以外的投與模式，通常係藉由注射 來投與且包括（但不限於）靜脈内、肌内、動脈内H 146953.doc 37· 201040265 莢膜内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜腔内、經氣管、皮 下、表皮下、關節内、囊下、蛛網膜下、脊柱内、硬膜外 及胸骨内注射及輸注。 本文所用術語「癌症」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、 淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL)癌、細支氣 管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮 膚或眼内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、 月癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、結腸癌、乳 癌子呂癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道 ^ 陰戶癌、霍奇金病（Hodgkin's Disease)、食道癌、小 腸癌、内分泌系統癌症、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、 腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞 癌、膽管癌、中樞神經系統（CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹 夕貝瘤夕幵’性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、許旺細胞瘤 (schwannoma)、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、扁平細 胞在、垂體腺瘤及尤文肉瘤（Ewings sarcoma)，包括任一 ◎ 上述癌症之難治性形式，或一或多種上述癌症之組合。 °亥等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化 刀政劑。可藉由上述消毒程序及藉由引入各種抗細菌 及抗真菌劑來轉保防止存在微生物’該等抗細菌及抗真菌 劑為（例如）對羥基苯甲酸酯、氣丁醇、苯酚、山梨酸及諸 如此麵 〇 女一Γ" « 、亦可期望該等組合物包括等滲劑，例如糖、氯化 納及諸如此類。另外’可藉由引入延遲吸收之試劑（例如 146953.doc -38- 201040265 單硬月旨酸1呂及明膠）來實現可注射醫藥形式之長效吸收。 不管選擇何種投與路徑，可藉由熟習此項技術者已知之 習用方法將可以適官士人 化&形式使用之本發明化合物及/或 本發明醫藥組合物調配為醫藥上可接受之劑型。 本發明醫樂組合物中活性成份之實際劑量程度可改變， 以獲得活性成份可有效地使特定患者、組合物及投與模式 達成期望治療反應且對患者無毒性之量。所選劑量程度取

決於各種藥代動力學㈣，包括本發明所用特定化合物之 丨杈與路役、投與時間、所用特定化合物之排泄速 率。療持續時間、與所用特定化合物組合使用之其他藥 物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體 身體狀况幻建康狀況及先前病史、及醫學領域熟 知的類似因素。 組合物之無菌及流動性程度應使其可藉由注射器來遞 送。除水以外，载劑較佳為等滲緩衝鹽水溶液。 例如，可藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由在分散物情 形下、’隹持所而粒後及藉由使用表面活性劑來維持適當流動 性。在許多情形下’組合物中較佳包括等渗劑，例如糖、 多元醇（例如甘露醇或山梨醇）、及氯化鈉。 胺基酸序列說明 SEQ ID ΝΟ:1 重鏈 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 SEQ ID NO:2 重鏈 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 SEQ ID NO:3 重鏈CDR1，<IGF-1R> HUMAB-純系 18 SEQ ID N〇:4 輕鏈 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 146953.doc -39- 201040265 SEQ ID NO:5 輕鏈 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 SEQ ID NO:6 輕鏈 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 SEQ ID NO:7 重鏈可變結構域，<IGF-1R> HUMAB-純 系18 SEQ ID NO:8 輕鏈可變結構域，<IGF-1R> HUMAB-純 系18 SEQ ID NO:9 重鏈 CDR3,人類化 <EGFR>ICR62 SEQ ID NO:10 重鏈 CDR2,人類 4匕<£0?11>1€1162 SEQ ID NO:l 1 重鏈 CDR1，人類 4b<EGFR>ICR62 SEQ ID NO:12 輕鏈CDR3，人類化<EGFR>ICR62 SEQ ID NO:13 輕鏈 CDR2，人類化 <EGFR>ICR62 SEQ ID NO:14 輕鏈 CDR1,人類化 <EGFR>ICR62 SEQ ID NO:15 重鏈可變結構域，人類化<EGFR>ICR62-I-HHD SEQ ID NO:16 輕鏈可變結構域，人類化<EGFR>ICR62-I-KC SEQ ID NO:17 源自IgGl之人類重鏈恆定區 SEQ ID NO:18 源自IgG4之人類重鏈恒·定區 SEQ ID NO:19 κ輕鏈恒定區 提供以下實例、序列表及圖來幫助理解本發明，本發明 之實際範圍陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對各 程序實施修改而不偏離本發明之精神。 實驗程序 實例 146953.doc -40· 201040265 材料及通用方法 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈核苷酸序列之一般資訊 展示於以下文獻中：Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest > 第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。根據EU編號法對抗體鏈之胺基酸進行編號及描述 (Edelman, G.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 63 (1969) 78-85 ; Kabat，E.A.等人，Sequence of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。 重組DNA技術 使用標準方法來處理DNA，如以下文獻中所述： Sambrook, J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，1989。根據製造商說明書來使用分子生物學試 劑。 基因合成 自藉由化學合成製造之寡核苷酸來製備期望基因片段。 藉由募核苷酸之退火及接合（包括PCR擴增）來裝配兩側為 單數個限制性核酸内切酶裂解位點且長600 - 1800 bp之基 因片段，且隨後經由所示限制性位點（例如BamHI/BstEII、 BamHI/BsiWI、BstEII/Notl 或BsiWI/Notl)將其選殖入基於 pUC選殖載體之 pcDNA 3.1/Zeo(+) (Invitrogen)中。藉由 DNA測序來確認亞選殖基因片段之DNA序列。根據 146953.doc -41 - 201040265

Geneart (Regensburg, Germany)中所述規範對基因合成片 段進行整理。 DNA序列測定 藉由用 Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)實施之 雙鏈測序法來測定DNA序列。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 使用 GCG(Genetics Computer Group ，Madison ， Wisconsin)之軟體包（10.2 版）及 Invitrogens Vector ΝΤΙ Advance suite(9.1版）來對序列實施創建、製圖、分析、注 釋及說明。 細胞培養技術 使用標準細胞培養技術，如Current Protocols，Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及 Yamada, K.M.(編輯），John Wiley & Sons公司中所述。 免疫球蛋白變體在HEK293F細胞中之瞬時表現 根據製造商說明書藉由使用Freestyle™ 293表現系統 (Invitrogen, USA)瞬時轉染人類胚腎293-F細胞來表現多特 異性抗體。簡言之，在FreeStyleTM 293表現培養基中在 37°C/8% C02下培養懸浮FreeStyle™ 293-F細胞，且在轉染 當天將細胞以1-2 X 106活細胞/ml之密度接種於新鮮培養基 中。在 Opti-MEM® I培養基（Invitrogen，USA)中使用 333 μΐ 293fectinTM (Invitrogen，Germany)及 250 pg重鏈及輕鏈質 粒DNA以1:1莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備DNA- 146953.doc •42- 201040265 293fectinTM複合物。在轉染後7天藉由以14000 g離心30分 鐘來澄清含有雙特異性抗體之細胞培養上清液且經由無菌 濾器（0.22 μιη)過濾。在純化前將上清液儲存在-20°C下。 蛋白質測定 藉由在280 nm下測定光密度（OD)來測定純化抗體及衍生 物之蛋白質濃度，其中以320 nm下之OD作為背景校正且 使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數，如Pace，C.N. 等人，Protein Science, 4 (1995) 2411-2423 中所述。 上清液中之抗體濃度測定 藉由HPLC親和層析來量測抗體及衍生物在細胞培養上 清液中之濃度。簡言之，將含有可結合蛋白質A之抗體及 衍生物之細胞培養上清液施加至Applied Biosystems Poros A/20 管柱上之 200 mM KH2P〇4、100 mM 檸檬酸鈉（pH 7.4) 中，且在UltiMate 3000 HPLC 系統（Dionex)上用 200 mM NaCl、100 mM檸檬酸（pH 2.5)自基質洗脫。藉由UV吸光 度及峰面積積分來量化所洗脫蛋白質。使用純化標準IgGl 抗體作為標準品。 蛋白質純化 藉由使用 Protein A-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden)之親和層析及Superdex200尺寸排除層析法以兩個 步驟自上清液純化分泌抗體。簡言之，將含有雙特異性及 三特異性抗體之澄清培養上清液施加至經PBS緩衝液（10 mM Na2HP04、1 mM KH2P〇4、137 mM NaCl及 2.7 mM 〖(：卜？117.4)平衡之1^丁以？？1'〇16111八1^(5 1111)管柱上。用 146953.doc •43· 201040265

平衡緩衝液洗去未結合蛋白。用0.1 Μ檸檬酸鹽緩衝液（pH 2.8)洗脫雙特異性抗體，且用0.1 ml 1 M Tris (pH 8·5)來中 和含有蛋白質之流份。然後，彙集所洗脫蛋白質流份，用 Amicon Ultra離心過濾裝置（MWCO: 30 K，Millipore)濃縮 至 3 ml 體積並裝載至經 20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0) 平衡之Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60凝膠過淚管柱 (GE Healthcare，Sweden)上。彙集單體抗體流份，將其快 速冷凍並儲存在-8(TC下。提供數份樣品以供隨後之蛋白 質分析及表徵。 純化蛋白質之分析

藉由在280 nm下量測光密度（OD)使用基於胺基酸序列計 算出之莫耳消光係數來確定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃 度。藉由在存在及不存在還原劑（5 mM 1，4-二硫蘇糖醇）時 使用考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue)染色實施SDS-P AGE來分析雙特異性抗體之純度。根據製造商說明書來 使用 NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統（Invitrogen，USA)(4-20% Tris-甘胺酸凝膠）。在 200 mM KH2P〇4、250 mM KC1 (pH 7.0) 運行緩衝液中於25°C下使用Superdex 200分析型尺寸 排除管柱（GE Healthcare，Sweden)藉由 UltiMate 3000 HPLC 系統（Dionex)上之高效SEC來分析雙特異性抗體樣品之凝 集體含量。以〇·5 ml/min之流速將25 pg蛋白質注入管柱上 且經50分鐘實施等度洗脫。對於穩定性分析，製備0.1 mg/ml、1 mg/ml及3 mg/ml濃度之純化蛋白質且在4°C、 37°C下培育7天，且隨後藉由高效SEC來評估。在藉由用 146953.doc -44 - 201040265 肽-N-糖普酶 F (Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理 移除N-聚糖後，藉由奈升電喷霧Q-TOF質譜來驗證經還原 雙特異性抗體輕鏈及重鏈之胺基酸骨架之完整性。 實例1 本發明識別人類IGF1-受體以及人類EGF-受體之多特異性 抗體分子之設計 在下文中例示作為本發明一實施例之四價雙特異性抗 體，其包含結合第一抗原（IGF-1R或EGFR)之全長抗體及 結合不同第二抗原（IGF-1R或EGFR中之另一者）之兩個單 鏈Fab片段，該等單鏈Fab片段經由肽連接物與該全長抗體 連接（兩個單鏈Fab片段位於重鏈之兩個C端或位於輕鏈之 兩個C端）。該單鏈Fab片段中之抗體結構域及連接體在N端 至C端方向上具有以下順序：VL-CL-連接體-VH-CH1。 使用SEQ ID NO: 15作為<IGF-1R>抗原結合位點之重鏈 可變結構域VH。使用SEQ ID NO: 16作為<10?-111>抗原結 合位點之輕鏈可變結構域VL。 使用SEQ ID NO: 7作為<EGFRM；L原結合位點之重鏈可 變結構域VH。使用SEQ ID NO: 8作為<EGFR>抗原結合位 點之輕鏈可變結構域VL。 藉由基因合成及重組分子生物學技術以甘胺酸絲胺酸 (G4S)n單鏈連接體來連接VL-CL及VH-CH1 (包含各抗原結 合位點之VH及VL)，從而獲得單鏈Fab片段VL-CL-連接體-VH-CH1，使用（G4S)n連接體將其附接至抗體重鏈或輕鏈 之C端。 146953.doc -45- 201040265 視需要，根據前述技術將胱胺酸殘基引入單鏈Fab片段 之VH(包括Kabat 44位）及VL(包括Kabat 100位）結構域中 (例如 WO 94/029350 ; Reiter, Y.等人，Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245 ; Young, N.Μ.等人，FEBS Letters 377 (1995) 135-139 ;或Rajagopal，V.等人 ’ Protein Engineering 10 (1997) 1453-59)。 所有該等分子皆係以重組方式來製造、純化並表徵，且 評估其蛋白質表現、穩定性及生物活性。 用於生成四價雙特異性<EGFR-IGF-1R>、〈IGF-1R-EGFR>#^體之多特異性抗體設計之概述闡述於表1中。對 於此研究，使用術語「scFab-Ab」來描述不同的四價蛋白 質實體。所設計形式之代表展示於圖4及5中並列示於表1 中〇 表1-不同雙特異性抗IGF1R及抗EGFR四價抗體形式，其C 端附接有單鏈Fab片段且具有相應scFab-Ab-命名。 分子名稱(雙特 異性抗體之 ScFab-Ab- 命名） 全長抗體 骨架， 源自： 單鏈Fab 片段， 源自： 可變結構 域VH及 VL ： SEQID NO: 單鏈Fab 附接至抗 體之位置 連接體 肽連 接物 scFab 二 硫鍵 VH44/ VL100 穩 定 scFab- XGFR1 一2720 <IGF1R> <EGFR> 7,8,15,16 C端Η鏈 (g4s)6gg (G4S)2 否 scFab- XGFR1_2721 <IGF1R> <EGFR> 7,8,15,16 C端Η鏈 (G4S)6GG (G4S)2 是 scFab- XGFR1—4720 <IGF1R> <EGFR> 7,8,15,16 C端L鏈 (G4S)6GG (G4S)2 否 scFab- XGFR1 一4721 <IGF1R> <EGFR> 7,8,15,16 C端L鏈 (G4S)6GG (G4S)2 是 146953.doc -46 · 201040265 分子名稱(雙特 異性抗體之 ScFab-Ab- 命名） 全長抗體 骨架， 源自： 單鏈Fab 片段， 源自： 可變結構 域VH及 VL ： SEQID NO: 單鏈Fab 附接至抗 體之位置 連接體 肽連 接物 scFab 二 硫鍵 VH44/ VL100 穩 定 scFab- XGFR2 一2720 <EGFR> <IGF1R> 7,8,15,16 C端Η鏈 (G4S)6GG (g4s)2 否 scFab- XGFR2 2721 <EGFR> <IGF1R> 7,8,15,16 C端Η鏈 (G4S)6GG (G4S)2 是 scFab- XGFR2-4720 <EGFR> <IGF1R> 7,8,15,16 C端L鍵 (G4S)6GG (G4S)2 否 scFab- XGFR2—4721 <EGFR> <IGF1R> 7,8,15,16 C端L鏈 (g4s)6gg (G4S)2 是 實例2 雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體scFabXGFRl分子之表現及 純化 在具有原核及真核選擇標記之表現載體中構建相應雙特 異性抗體之輕鏈及重鏈。在大腸桿菌中擴增該等質粒，將 其純化，且隨後進行轉染以在HEK293F細胞（採用 Invitrogen之Freesyle系統）瞬時表現重組蛋白。在7天後， 〇 收穫HEK 293細胞上清液並藉由蛋白質A及尺寸排除層析 加以純化。在非還原性及還原性條件下藉由SDS-PAGE來 確認所有雙特異性抗體構成物之同質性。在還原性條件下 (圖8)，具有C及N端scFab融合之多肽鏈在實施SDS-PAGE 後顯示與分子量計算值類似之表觀分子量。藉由蛋白質A HPLC分析所有構成物之表現程度且其類似於「標準」IgG 之表現產率，或在某些情形下稍低。在該等未優化瞬時表 現實驗中平均蛋白質產率介於1·5 mg與10 mg蛋白質/升細 146953.doc -47- 201040265 胞培養上清液之間（圖4及5)。 經純化蛋白質之HP-尺寸排除層析分析顯示，重組分子 具有一定凝集傾向。為解決該等雙特異性抗體凝集之問 題，在額外結合部分之VH與VL之間施用二硫鍵穩定。為 此，在scFab之VH及VL内之限定位置（根據Kabat編號方案 為VH44/VL100位）引入單半胱胺酸替代。該等突變使得可 在VH與VL之間形成穩定鏈間二硫鍵，其繼而穩定所得經 二硫鍵穩定之scFab分子。在scFab中引入VH44/VL100二硫 鍵不會顯著干擾蛋白質表現程度且在某些情形下甚至可改 良表現產率（參見圖4及5)。 根據製造商說明書藉由使用FreeStyleTM 293表現系統 (Invitrogen, USA)瞬時轉染人類胚腎293-F細胞來表現雙特 異性抗體。簡言之，在FreeStyle™ 293表現培養基中在 37°C/8% C02下培養懸浮FreeStyle™ 293-F細胞，且在轉染 當天將細胞以1-2 X 106活細胞/ml之密度接種於新鮮培養基 中。在Opti-MEM® I培養基（Invitrogen，USA)中使用 333 μΐ 293fectinTM (Invitrogen，Germany)及 250 pg重键及輕鍵質 粒DNA以1:1莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備DNA-293fectinTM複合物。在轉染後7天藉由以14000 g離心30分 鐘來澄清含有重組抗體衍生物之細胞培養上清液且經由無 菌濾器（0.22 μιη)過濾。在純化前將上清液儲存在-20°C 下。 藉由使用 Protein A-SepharoseTM (GE Healthcare，Sweden) 之親和層析及Superdex200尺寸排除層析法以兩個步驟自 146953.doc -48- 201040265 上清液純化分泌抗體衍生物。簡言之，將含有雙特異性及 三特異性抗體之澄清培養上清液施加至經PBS緩衝液（10 mM Na2HP04、1 mM KH2P〇4、137 mM NaCl及 2.7 mM KC1，pH 7.4)平衡之HiTrap ProteinA HP (5 ml)管柱上。用 平衡緩衝液洗去未結合蛋白。用0.1 M檸檬酸鹽緩衝液（pH 2.8)洗脫抗體衍生物，且用0.1 ml 1 M Tris (pH 8.5)來中和 含有蛋白質之流份。然後，彙集所洗脫蛋白質流份，用 Amicon Ultra離心過濾裝置（MWCO: 30 K, Millipore)濃縮 至 3 ml 體積並裝載至經 20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡之 Superdex2_00 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過滤管柱 (GE Healthcare, Sweden)上。囊集單體抗體流份，將其快 速冷凍並儲存在-80°C下。提供數份樣品以供隨後之蛋白 質分析及表徵。純化蛋白之實例性SDS-PAGE分析及雙特 異性抗體衍生物之HP-尺寸排除層析（SEC)譜圖展示於圖8 及9中。 圖5列示在瞬時表現系統中觀察到之表現產率：所設計 所有抗體衍生物之表現及純化量皆足以用於進一步分析。 出於比較目的，製備並命名基於全長抗體之四價雙特異 性抗體，其中兩個scFv片段經由肽連接體融合在重鏈C端 來代替原本所具有之scFab，如WO 1995/0099 17及Miiller D·等人，Handbook of Therapeutic antibodies，第 III部分， 第2章，（2008) 345-378中所述。使用SEQ ID NO: 15作為 <IGF-1R>抗原結合位點之重鏈可變結構域VH。使用SEQ ID NO·. 16作為<IGF-1R>抗原結合位點之輕鏈可變結構域 146953.doc -49- 201040265 VL。使用SEQ ID NO: 7作為<EGFR>抗原結合位點之重鏈 可變結構域VH。使用SEQ ID NO: 8作為<EGFRM；l原結合 位點之輕鏈可變結構域VL。將此對照分子命名為 XGFR1_2320(且亦闡述於PCT PCT/EP2009/006782 中） 比較 實例 全長抗體 骨架， 源自： 單鍵Fab 片段，源 自： 可變結構域 VH 及 VL : SEQID NO : scFv附接至 抗體之位置 單鏈 Fv-連 接體 seFv與重鍵石" 端之間之肽 連接體/連接 物 scFv- XGFR1_ 2320 <IGF1R> <EGFR> 7,8,15,16 C端Η鏈 (g4s)3 (G4S)2 雙特異性單鏈Fv分子XGFR1-2320在純化後最終產率為 0.27 mg，而相應單鏈Fab分子XGFR1-2720之最終產率為 6.8 mg(參見圖4，化合物A)，此表明後者之產率比前者高 200倍以上。 實例3 雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體scFab-XGFR分子之穩定性 及凝集傾向 實施HP-尺寸排除層析分析來測定存於重組抗體衍生物 製劑中之凝集物之量。為此，藉由高效SEC在UltiMate 3000 HPLC系統（Dionex)上使用Superdex 200分析型尺寸排 除管柱（GE Healthcare, Sweden)來分析雙特異性抗體樣 品。圖9展示該等分析之實例。凝集物表現為出現在含有 單體抗體衍生物之流份之前的分離峰或肩峰。在此分析 中，將期望「單體」分子定義為由2個重鏈及輕鏈之異二 聚體組成，其中該兩個異二聚體上各自連接有scFab。在 146953.doc • 50- 201040265 藉由用肽-N-糖苷酶F (Roche Molecular Biochemicals)實施 酶處理來移除N-聚糖後，藉由奈升電喷霧Q-TOF質譜法來 驗證還原雙特異性抗體輕鏈及重鏈及融合蛋白之胺基酸骨 架之完整性。 在不同條件下（不同濃度及時間）對純化蛋白實施之HP-尺寸排除層析分析顯示，與正常IgG相比，含有scFab之分 子具有輕微凝集傾向。在某些分子中所觀察到之此輕微凝 集傾向可藉由在scFab分子中引入VH44/VL100鏈間二硫鍵 來改善。 實例4 雙特異性<EGFR-IGF1R>抗體scFab分子與RTK EGFR及 IGF1R之結合 比較scFab分子及不同雙特異性抗體形式scFab-XGFR之 全長IgG分子中所保留抗原結合位點之結合與衍生出該結 合分子及雙特異性抗體之「野生型」IgG之結合。藉由施 用表面電漿共振（Biacore)以及細胞-ELISA來實施該等分 析。 藉由表面電漿共振（SPR)技術使用Biacore T1 00儀器（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsla)來分析雙特異性<IGF-lR-EGFR>#iL體之結合特性。該系統在業内廣泛用於研究 分子交互作用。其使得可連續實時監測配體/分析物之結 合且由此可在不同分析設定下確定結合速率常數（ka)、解 離速率常數（kd)及平衡常數（KD)。SPR技術係基於對金塗 佈生物感測晶片表面附近之折射率之量測。折射率變化指 146953.doc -51 - 201040265 示表面上因固定化配體與所注射溶液中之分析物交互作用 而引發之質量變化。若分子結合至表面上之固定化配體， 則質量增加；若解離，則質量降低。 使用胺偶聯化學方法將捕獲性抗人類IgG抗體固定化在 ci生物感測晶片之表面上。用G1 M N•經基琥㈣亞胺與 0.1 Μ 3-(N，N-一甲胺基）丙基_N_乙基碳二亞胺之1:1混合物 以5 μΐ/min之流速活化流動細胞。注射以5 μ§/ιη1存於乙酸 鈉（pH 5.0)中之抗人類IgG抗體，獲得約2〇〇 RU之表面密 度。以相同方式處理參照對照流動細胞，但僅用媒劑緩衝 液來代替捕獲性抗體。藉由注射！ M乙醇胺/HC1 (pH 8 5) 來封阻表面。將雙特異性抗體稀釋於hbs_p中並以5 μΐ/min之流速注射。抗體之接觸時間（結合階段）為1 min， 濃度介於 1 nM與 5 nM之間。以 1.2、3.7、11.1、33.3、1〇〇 及300 nM之遞增濃度注射EGFR-ECD，IGF-1R之濃度為 0.37、1.11、3·33、1〇、30及90 nM。兩種分子之接觸時間 (結合階段）為3 min，解離時間（用運行緩衝液洗滌）為$ min，且流速為30 y/min。所有交互作用皆係在25。〇(標準 度）下進行。在每個結合循環後’分別經6〇 s以5 μΐ/min 之流速注射0,85%麟酸及5 mM氫氧化鈉之再生溶液，以移 除任何未共價鍵結之蛋白質。以一個信號/秒之速率檢測 信號。以遞增濃度注射樣品。 雙特異性抗體<IGF-1R-EGFRH^l體與EGFR及IGF1R之實 例性同時結合展示於圖10a-d中。 146953.doc -52- 201040265 表 2 :雙特異性抗體（scFab-XGFRl_2720 及 scFab-XGFR2_ 2720)對EGFR及IGF-1R之親和力（KD) 分子 KD值(對EGFR之親和力） KD值(對IGF-1R之親和力） scFab- XGFR1 一2720 2nM 2nM scFab- XGFR2—2720 0.5 nM llnM <IGF-1R> 純系18 n.a. 2nM <EGFR> ICR62 0.5 nM n.a. 亦可在培養細胞上實施基於FACS之結合及競爭性分析 來評價雙特異性抗體衍生物對暴露於細胞表面上之RTK之 結合能力。圖11展示用於測試含有scFab之雙特異性XGFR 衍生物在A549癌細胞上之結合能力之實驗設定。對於該等 細胞競爭性分析，分離並計數表現抗原EGFR以及IGF1R之 A549細胞。以1.5 X 10e5/孔將細胞接種於96孔錐形板中° 使細胞旋轉沉降（1500 rpm, 4°C，5 min)且在冰上及50 pL各 雙特異性抗體存於含有2% FCS(胎牛血清）及1 Pg/mL Alexa647標記IGFIR特異性抗體之PBS中之系列稀釋液中培 育45 min。再次使細胞旋轉沉降並用200 μί含有2% FCS之 PBS洗滌兩次。最後，使細胞再懸浮於BD細胞固定溶液 (BD Biosciences)中並在冰上培育至少1〇 min。藉由流式細 胞術（FACS Canto)測定細胞之平均螢光強度（mfi)。藉由至 少兩次一式兩份的獨立染色來測定mfi。使用FlowJo軟體 146953.doc -53· 201040265 (TreeStar)進一步處理流式細胞術譜圖。使用XLFit 4.0 (IDBS)及劑量反應一點式模型205來測定半最大結合。 該等分析之結果展示於圖12a-c中，其顯示含有scFab之 雙特異性抗體衍生物在腫瘤細胞表面上之結合功能。舉例 而言，在競爭性實驗中雙特異性抗體衍生物scFab-XGFR1_2721之IC50為0.11 pg/ml，而單特異性抗體之IC50 比其高50%以上（0.18 pg/ml)。在競爭性分析中，雙特異性 scFab-XGFR_2721衍生物相對於親代抗體之此活性增強表 明，雙特異性分子與細胞表面之結合優於單特異性抗體。 實例5 雙特異性<EGFR-IGF-1R>抗體scFab-XGFR分子使EGFR 以及IGF-1R下調 人類抗-IGF-1R 抗體 <IGF-1R> HUMAB 純系 1 8 (DSM ACC 2587)抑制IGFR1信號傳導，且人類化大鼠抗EGFR抗 體<EGFR>ICR62抑制EGFR之信號傳導。為評估不同 scFab-XGFRl變體之潛在抑制活性，分析兩種抗原受體之 下調程度。 為檢測本發明抗體對腫瘤細胞中IGF-I受體（IGF-IR)數量 之效應，用IGF-IR及EGFR特異性抗體實施時程實驗且隨 後實施ELISA分析。 以1 ml/孔將人類腫瘤細胞（H322M，5 X 105細胞/ml)接種 於6孔板中之補加有10 % FCS(PAA，目錄號E15-039)及1% PenStrep之RPMI 1640中。向每孔添加3 ml培養基並在37°C 及5% C02下將細胞培養24小時。 146953.doc -54- 201040265 小心地移除培養基並用2 ml稀釋於RPMI-VM培養基中之 100 nM XGFR抗體來替代。在對照孔中，用不含抗體之培 養基及緩衝液或含有對照抗體（<IGF_1R> HUMAB純系18 及<EGFR>ICR62，終濃度1〇〇 nM)之培養基來替代培養 基。在37°C及5% C02下培育細胞’且取各板用於在24小時 後進一步處理。 藉由抽吸小心地移除培養基並用1 ml PBS洗滌細胞。添 加3 00 μΐ/孔冷MES-溶解缓衝液（MES、10 mM Na3V04、及 Complete®蛋白酶抑制劑）。在一小時後’在冰上使用細胞 刮棒（Corning ’目錄號3 01 〇)分離細胞且將孔内含物轉移至 埃彭道夫（Eppendorf)反應管中。藉由在4°〇下以13〇〇〇 rPm 離心10分鐘來移除細胞碎片。 對於EGFR檢測 根據方案準備96孔微量滴定板（MTP)(用於人類EGFR之 DuoSet ELISA ’ RnD 系統，目錄號 DY231)。將 144 pg/ml 存於PBS中之人類EGFR山羊抗體以1:180稀釋於PBS中，且 以100 μΐ/孔添加至MTP中。在室溫下將MTP振盪培育過 夜。用補加有0.1% Tween®20之PBS將板洗滌3次，且在室 溫（RT)及振盪下用300 μΐ/孔之PBS、3% BSA及0.1% Tween®20溶液封阻1小時（h)。用補加有0.1 % Tween®20之 PBS將板洗滌3次。 使用BCA蛋白質分析套組（Pierce)來測定細胞溶解產物 中蛋白質之量，然後用補加有1〇〇 mM Na3V〇4 (1:100)及 Complete®蛋白酶抑制劑（1:20)之MES溶解缓衝液將細胞溶 146953.doc -55- 201040265 解產物調整為蛋白質濃度為0.04 mg/ml，且以100 μΐ/孔將 溶解產物添加至預先準備好之ΜΤΡ中。對於背景量測，將 1 0 0 μ 1溶解緩衝液添加至ΜΤΡ之孔中。 使用0.025 mg/ml之第二細胞溶解產物濃度，且將溶解產 物以1:2稀釋，並以100 μΐ/孔添加至預先準備好之MTP 中。在RT下將ΜΤΡ另外振盪培育2小時且隨後用具有0.1% Tween®20之PBS溶液洗滌3次。 EGFR之檢測抗體係人類EGFR山羊生物素化抗體，濃度 為 36 pg/ml，以 1:180 稀釋於 PBS、3% BSA 及 0.2% Tween®20中。以100 μΐ/孔添加並在RT下振盪培育2小時。 然後用200 μΐ/孔之具有0.1% Tween®20之PBS溶液將ΜΤΡ洗 滌三次。然後以100 μΐ/孔添加以1:200存於PBS、3% BSA 及0.2% Tween®20中之抗生蛋白鏈菌素-HRP並在RT下振盪 培育20分鐘。然後用具有0.1% Tween®20之PBS溶液將板 洗滌六次。以100 μΐ/孔添加3,3'-5,5’-四曱基聯苯胺（Roche, BM-Blue ID號：1 1484581)並在RT下振盪培育20分鐘。藉 由以25 μΐ/孔添加1 M H2S04及在RT下另外培育5分鐘來終 止顏色反應。在450 nm下量測吸光度。 對於IGF-1R檢測 藉由以100 μΐ/孔添加以1:200稀釋於PBS、3% BSA及 0.2% Tween®20中之生物素化抗體ΑΚ1 a (Genmab, Denmark) 來準備抗生蛋白鏈菌素-MTP(Roche ID.號：11965891001)。 將抗生蛋白鏈菌素-MTP在RT下振盪培育1小時，且隨後用 200 μΐ/孔之具有0.1% Tween®20之PBS溶液洗滌三次。 146953.doc -56- 201040265 使用BCA蛋白質分析套組（Pierce)來測定細胞溶解產物 中蛋白質之量，然後50 mM Tris (pH 7.4)、100 mM Na3V04 (1:100)及Complete®蛋白酶抑制劑（1:20)將細胞溶解產物調 整為蛋白質濃度為0.3 mg/ml，且以100 μΐ/孔將溶解產物添 加至預先準備好之抗生蛋白鏈菌素-ΜΤΡ中。 使用0.15 mg/ml之第二細胞溶解產物濃度且稀釋溶解產 物，並以100 μΐ/孔添加至預先準備好之抗生蛋白鏈菌素-ΜΤΡ中。對於背景量測，將100 μΐ溶解緩衝液添加至蛋白 鏈菌素-ΜΤΡ之孔中。 在RT下將ΜΤΡ另外振盪培育1小時且隨後用具有0.1% Tween®20之PBS溶液洗務3次。 IGF-1R之檢測抗體係以1:750稀釋於PBS、3% BSA及 0.2% Tween®20 中之人類 IGF-1RP 兔抗體（Santa Cruz Biotechnology，目錄號sc-713)。以100 μΐ/孔添加並在RT下 振盪培育1小時。然後用200 μΐ/孔之具有0.1°/。Tween®20之 PBS溶液將MTP洗滌三次。然後添加以1:4000存於PBS、 3% BSA及 0.2% Tween®20 中之第二抗體兔 IgG-POD(Cell signaling，目錄號7074)，以100 μΐ/孔添加並在RT下振盪 培育1小時。然後用具有0.1% Tween®20之PBS溶液將板洗 滌六次。以100 μΐ/孔添加3,3’-5,5’-四甲基聯苯胺（Roche， BM-Blue ID號：1 1484581)並在RT下振盪培育20分鐘。藉 由以25 μΐ/孔添加1 M H2S04及在RT下另外培育5分鐘來終 止顏色反應。在450 nm下量測吸光度。 在A549細胞中，含有scFab之雙特異性XGFR分子相對於 146953.doc -57- 201040265 親代單特異性抗體<EGFR>ICR62及<IGF-1R> HUMAB-純 系18下調受體之檢測結果展示於圖13及14中。雙特異性抗 體scFab-XGFR可下調EGFR以及IGF1R二者。此表明保留 了結合分子之全部功能（生物學功能）及表型介導。令人驚 訝地，圖14亦顯示雙特異性抗體scFab-XGFR_2720與單獨 使用親代<EGFR>ICR62抗體相比可表現EGFR之經改良下 調。 事實上，含有scFab之XGFR1變體在以相同莫耳濃度用 於相同分析中時顯示與野生型抗體相同或更佳之活性，此 表明scFab-XGFRl分子能干擾兩種信號傳導途徑。 實例6 scFab-XGFRl及scFab-XGFR2介導之腫瘤細胞系的體外生 長抑制 人類抗-IGF-1R 抗體 <IGF-1R> HUMAB 純系 18 (DSM ACC 2587)抑制表現IGF1R (WO 2005/005635)之腫瘤細胞 系之生長。已顯示人類化大鼠抗EGFR抗體<EGFR>ICR62 可以類似方式抑制表現EGFR (WO 2006/0825 15)之腫瘤細 胞系之生長。為評估不同scFab-XGFRl變體在腫瘤細胞系 之生長分析中的潛在抑制活性，在表現EGFR以及IGF1R之 H322M細胞中分析抑制程度。 在經聚-HEMA(聚（2-甲基丙烯酸羥乙酯））塗佈之孤中於 補加有10% FCS之RPMI 1640培養基中培養H322M細胞 (5000細胞/孔）以防止細胞黏著至塑料表面。在該等條件下 H322M細胞形成在三個維度上生長之緻密球體（稱作錨著 146953.doc -58 · 201040265 非依賴性之特性）。該等球體非常類似原位實體腫瘤之三 維組織結構及構造。在100 nM抗體存在下將球形培養物培 育7天。使用Celltiter Glow發光分析來量測生長抑制。在 用<IGF-1R> HUMAB-純系18處理H322M球形培養物時可 觀察到生長抑制。 圖15顯示，施加100 nM <IGF-1R> HUMAB-純系18可使 細胞生長降低72%，且在相同分析中施加100 nM <EGFR>ICR62可使細胞生長降低77%。同時施加兩種抗體 (二者濃度相同，皆為100 nM)使細胞活力完全下降（100% 抑制）。此表明，同時干擾兩種RTK途徑對腫瘤細胞系的 效應比僅干擾一種途徑更顯著。以100 nM之莫耳濃度施加 不同scFab-XGFRl變體可導致較高生長抑制，其比僅使用 單一分子時所觀察到者更顯著。事實上，在100 nM之抗體 濃度下，各種scFab-XGFRl變體顯示可完全（100%)抑制細 胞生長，而施加單一分子僅導致部分抑制。 因此得出結論，scFab-XGFRl分子相對於僅干擾EGFR信 號傳導或IGF 1R信號傳導之IgG具有顯著提高之生長抑制 活性。 【圖式簡單說明】 圖1 不含CH4結構域之全長抗體的示意性結構，其可 以兩對重鏈及輕鏈特異性結合第一抗原1，該等重 鏈及輕鏈以典型順序包含可變結構域及恆定結構 域。 圖2 四種特異性結合（例如）第二抗原2之可能的單鏈 146953.doc •59- 201040265

Fab片段之示意性結構 圖3 本發明多特異性抗體之示意性結構，其包含特異 性結合第一抗原1之全長抗體及兩個特異性結合第 二抗原2之單鏈Fab…雙特異性四價抗體之實例 圖4 本發明雙特異性抗體，其包含特異性結合IGF-1R 之全長抗體及兩個特異性結合EGFR之相同單鏈 Fab-ScFab-XGFRl 分子 A、B、C、及 D ;及純化後 之表現程度 A : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL)，其與重鏈C端 融合 B : scFab(VH-CH卜連接體-VL-CL，其具有額外 VH44-VL100二硫橋），其與重鏈C端融合 C : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL)，其與輕鏈C端 融合 D : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL，其具有額外 VH44-VL100二硫橋），其與輕鏈C端融合 圖5 本發明雙特異性抗體，其包含特異性結合EGFR之 全長抗體及兩個特異性結合IGF-1R之相同單鏈 Fab-ScFab-XGFR2分子A、B、C、及D A : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL)，其與重鏈C端 融合 B : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL，其具有額外 VH44-VL100二硫橋），其與重鏈C端融合 C : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL)，其與輕鏈C端 146953.doc -60- 201040265 融合 D : scFab(VH-CHl-連接體-VL-CL，其具有額外 VH44-VL100二硫橋），其與輕鏈C端融合 圖6 本發明多特異性抗體之示意性結構，其包含特異 性結合第一抗原1之全長抗體及一個特異性結合第 二抗原2之單鏈Fab—具有隆凸及孔洞之雙特異性 三價抗體之實例 圖7 本發明多特異性抗體之示意性結構，其包含特異 性結合第一抗原1之全長抗體、一個特異性結合第 二抗原2之單鏈Fab、及一個特異性結合第三抗原3 之單鏈Fab—具有隆凸及孔洞之三特異性四價抗體 之實例 圖8 含有單鏈Fab之雙特異性抗體衍生物scFab-XGFRl 之SDS-PAGE分析 1 : scFab-XGFRl—4720(未經還原） 2 : scFab-XGFRl_4721(未經還原） . 3 : scFab-XGFRl—4720(經還原） 4 : scFab-XGFRl_4721(經還原） 圖9 含有scFab之雙特異性抗體衍生物scFab-XGFRl之 ΗΡ-SEC分析 圖 9a : scFab-XGFRl-4720 ; 7.7%凝集物（標記在框 内） 圖 9b : scFab-XGFRl-4721 ; 3.5%凝集物（標記在框 内） 146953.doc -61 - 201040265 圖 10 scFab-XGFRl 及 scFab-XGFR2 與 EGFR 及 IGF1R 之 結合

圖 10a : Biacore 圖-scFab-XGFRl_2720 與 EGFR 之 結合，KD=2 nM

圖 10b : Biacore 圖-scFab_XGFRl_2720與 IGF-1R之 結合，KD=2 nM

圖 10c : Biacore 圖-scFab-XGFR2_2720 與 EGFR 之 結合，KD=0.5 nM

圖 10d : Biacore 圖-scFab-XGFR2_2720與 IGF-1R之 結合，KD=11 nM 圖11圖解-藉由FACS競爭分析來分析scFab-XGFR與細 胞之結合，其中使用以下通用程序： -- 同時添加經Alexa647標記之<IGF1R> Mab (1 pg/mL) +未經標記之scFab-XGFR (100 pg/mL-0,001 pg/mL) - 在冰上培育45 min，洗滌並移除未結合抗體

- 用1% HCHO固定，然後實施FACS 圖12藉由FACS競爭分析來分析scFab-XGFR_2721及親 代<IGF1R>純系18與細胞之結合 圖 12a : <IGF-1R> 純系 18 (0,18 pg/ml) XGFR—2721 (0,15 pg/ml)之 IC50值之比較 圖12b : <IGF-1R>純系18之結合曲線（轉折點為 0，11 pg/ml)-y-軸=RLU ; x-軸=抗體濃度（pg/ml) 圖12c : scFab-XGFR_2721之結合曲線（轉折點為 146953.doc -62- 201040265 0,10 pg/ml)-y-軸=RLU ; χ-軸=抗體濃度（pg/ml) 圖13在與不同scFab-XGFR變體（100 nM)—起培育24 h 後，H322M細胞上之IGF1-R之下調 圖14在與不同scFab-XGFR變體（100 nM) —起培育24 h 後，H322M細胞上之EGFR之下調 圖15不同scFab-XGFR變體（100 nM)對H322M細胞增殖 之抑制。

146953.doc 63- 201040265 序歹0表 <11 〇> 瑞士商羅齊克雷雅公司 <12 0> 包含全長抗體及單鏈Fab片段之多重特異性抗體

<130> 26056 FT <140> 099110151 <141> 2010-04-01

<150> <151〉 09004909.9 2009-04-02 <160> 19 <170> Patentln version 3.2 <210〉 <211> <212〉 <213> 1 9 PRT 人工的 <220> <223> 重鏈 CDR3, <IGF-1R> HUMAB- -純系18 <400> 1 Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5

<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 重鏈 CDR2, <IGF-1R> HUMAB- -純系 18 <400> 2 lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> 人工的 <220> 146953·序列表.doc 201040265 <223> 重鍵CDRl, <IGF-1R>HUMAB-純系 18 <400> 3

Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 4 <211〉 10 <212> PRT <213〉人工的 <220〉 <223〉輕鏈 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 <400> 4

Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr 15 10 <210> 5 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223〉輕鏈 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-純系 18 <40〇> 5

Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR1, <IGF-1R>HUMAB-純系 18 <400> 6

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 <210〉 7 <211〉 118 <212> PRT <213> 智人 146953-序列表.doc 201040265 <400> 7

Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

❹

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg _Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110

Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> 智人 <400> 8

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly 工le Pro.Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 146953-序列表.doc 201040265

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223> 重鏈CDR3,人類化<EGFR>ICR62 <400> 9

Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 15 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉重鏈 CDR2, 化<EGFR>ICR62 <400> 10

Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15

Gly <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213〉人工的 <220〉 <223〉重鏈 CDR1,人類化<EGFR>ICR62 <400> 11 4- 146953-序列表.doc 201040265

Asp Tyr Lys lie His 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223> 輕鍵 CDR3,人類化<EGFR>ICR62 <400> 12

Leu Gin His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5

<210> 13 <211> 7 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉輕鏈 CDR2,人類化〈EGFRMCB^ <400> 13

Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDRl,人類化<EGFR>ICR62 <400> 14 Arg Ala Ser Gin Gly lie Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 重鏈可變結觀, yM® 化 <EGFR>ICR62-I Asn •HHD 〇 146953-序列表.doc 201040265 <400> 15

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Lys lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 16 <211> 108 <212〉 PRT <213〉人工的 <220> <223〉輕鍵可變結觀或，AM化<EGFR>ICR62 -I-KC <400> 16 _Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45 146953-序列表.doc 201040265

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr 100 105 <210> 17 o <211> 330 <212> PRT <213〉 智人 <400> 17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser ❹ 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 146953-序列表.doc 201040265

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 18 <211> 327 146953-序列表.doc 201040265 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 〇

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 -9- 146953-序列表.doc 201040265

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 19

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 10- 146953-序列表.doc 201040265

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 o

11- 146953-序列表.doc

Claims (1)

1. 201040265 七、申請專利範圍： 1 · 一種多特異性抗體，其包含 a) 全長抗體，其特異性結合第一抗原且由兩個抗體重 鏈及兩個抗體輕鏈組成；及 - b) 一或多個單鏈Fab片段’其結合一或多種其他抗原， , 其中b)中之該單鏈Fab片段經由3)中之該全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 2.如請求項1之多特異性抗體，其包含 〇 a)全長抗體，其特異性結合第一抗原且由兩個抗體重 鏈及兩個抗體輕鏈組成；及 b) 1至4個單鏈Fab片段，其結合1至4個其他抗原， 其中b)中之該單鏈Fab片段經由a)中之該全長抗體的 重鍵或輕鍵C或N端之狀連接物與該全長抗體融合β 3·如請求項1或2之多特異性抗體，其中一個或兩個結合第 二抗原之單鏈Fab片段經由該全長抗體重鏈c端之肽連接 物與該全長抗體融合。 ❹ 4·如請求項1或2之多特異性抗體，其中一個結合第二抗原 之早鍵F ab片段經由該全長抗體中一條重鍵或一條輕鍵 • 端之肽連接物與該全長抗體融合。 - 5·如請求項1或2之多特異性抗體，其中兩個結合第二抗原 之相同單鏈Fab片段VL-CL-連接體-VH-CH1或VH-CH1- 連接體-VL-CL以其N端經由該全長抗體中兩個重鏈之兩 個c端或兩個輕鏈之兩個c端的肽連接物與該全長抗體融 合。 146953.doc 201040265 6 _ 士明求項1或2之多特異性抗體，其中兩個結合第二抗原 之相同單鍵Fab片段VL-CL-連接體-VH-CH1或VH-CH1- 連接體-VL-CL以其C端經由該全長抗體中兩個重鏈之兩 個N端或兩個輕鏈之兩個^^端的肽連接物與該全長抗體融 合0 7. 一種醫藥組合物’其包含如請求項丨至6中任一項之抗 體。 8. 一種核酸，其編碼如請求項1至6中任一項之多特異性抗 體。 146953.doc