PT1159974E - Composições anti-angiogénicas e métodos de utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES ANTI-ANGIOGÉNICAS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

Campo Técnico

Genericamente a presente invenção refere-se a composições e métodos para tratar cancro e outras doenças angiogénico-dependentes, e, mais especificamente, a composições que compreendem taxol como factor anti-angiogénico e transportadores poliméricos.

Antecedentes da Invenção 0 cancro é a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos e responsável por mais de um quinto da mortalidade total. Abreviadamente, o cancro caracteriza-se pela divisão descontrolada de uma população de células que, mais tipicamente, conduz à formação de um ou mais tumores. Apesar do cancro ser em geral diagnosticado mais rapidamente do que no passado, muitas formas, mesmo quando precocemente detectadas, ainda são incuráveis.

Actualmente é utilizada uma variedade de métodos para tratar o cancro incluindo, por exemplo, vários procedimentos cirúrgicos. Contudo, muitos pacientes (particularmente aqueles com determinados tipos de cancro, tais como o cancro da mama, do cérebro, do cólon e hepático), quando tratados exclusivamente com cirurgia experimentaram a recorrência do cancro. Adicionalmente à cirurgia, muitos cancros são também tratados com uma combinação de terapias que envolvem substâncias quimioterapêuticas citotóxicas (por exemplo, vincristina, vinblastina, cisplatina, metotrexato, 5-FU, etc.) e/ou terapia por radiação. Uma dificuldade com esta abordagem, 2 contudo, é que os agentes radioterapêuticos e quimioterapêuticos são tóxicos para os tecidos normais e frequentemente dão origem a efeitos secundários que ameaçam a vida. Além disso, estas abordagens frequentemente têm taxas de fracasso/remissão extremamente altas.

Em suplemento às terapias cirúrgicas, químicas e por radiação, outros tentaram utilizar o sistema imunitário do próprio indivíduo de modo a eliminar células cancerosas. Por exemplo, alguns sugeriram o uso de componentes bacterianos ou virais como adjuvantes de modo a estimular o sistema imunitário a destruir as células tumorais. (Para uma abordagem geral ver "Principies of Câncer Biotherapy", Oldham (ed.), Raven Press, Nova Iorque, 1987). Genericamente, tais agentes têm sido úteis como adjuvantes e como estimulantes não específicos em modelos de tumores animais, mas ainda não provaram ser, no geral, eficazes em humanos.

Também têm sido utilizados linfócitos no tratamento do cancro. Resumidamente, os linfócitos são segregados por uma variedade de células e, geralmente, têm um efeito em células específicas na produção de uma resposta imunitária. Os exemplos de linfócitos incluem Interleucina (IL)-l, -2, -3, e -4, assim como factores estimulantes de colónias, tais como G-CSF, GM-CSF, e M-CSF. Recentemente, um grupo utilizou IL-2 para estimular células sanguíneas periféricas de modo a expandir e produzir grandes quantidades de células que são citotóxicas para as células tumorais (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 313: 1485-1492, 1985).

Outros sugeriram o uso de anticorpos no tratamento do cancro. Resumidamente, podem ser desenvolvidos anticorpos 3 que reconheçam determinados antigenes de superfície da célula que sejam ou únicos ou mais prevalentes nas células cancerosas, comparativamente com células normais. Estes anticorpos, ou "balas mágicas", podem ser utilizados, quer isoladamente, quer conjugados com uma toxina de modo a alvejar e a matar especificamente células tumorais (Dillman, "Antibody Therapy", Principies of Câncer Biotherapy, Oldham (ed.), Raven Press, Ltd., Nova Iorque, 1987). Contudo, uma dificuldade é que a maior parte dos anticorpos monoclonais são de origem murina e, assim, uma hipersensibilidade contra os anticorpos murinos pode limitar a sua eficácia, particularmente após terapias repetidas. Os efeitos secundários comuns incluem febre, transpiração e calafrios, erupções cutâneas, artrite e paralisias nervosas.

Uma dificuldade adicional do presente método é que a recorrência local e o controlo da doença local permanece um desafio principal no tratamento da malignidade. Em particular, um total de 630 000 pacientes anualmente (nos E.U.A.) tem doença localizada (sem evidência de alastramento metástico distante) no momento desta apresentação; isto representa 64% de todos os pacientes diagnosticados com malignidade (isto não inclui cancro da pele não-melanoma ou carcinoma in situ) . Para a grande maioria destes pacientes, a ressecção cirúrgica da doença representa a maior oportunidade de cura e de facto 428 000 ficaram curados após o tratamento inicial - 428 000. Infelizmente, 202 000 (ou 32% de todos os pacientes com doença localizada) irão recair após o tratamento inicial. Daqueles que recaiem, o número dos que irão recair devido à recorrência local da doença eleva-se a 133 000 pacientes anualmente (ou 21% de todos aqueles com doença localizada). 4 0 número dos que irão recair devido a metástases distantes da doença é de 68 000 pacientes anualmente (11% de todos aqueles com doença localizada). Outros 102 139 pacientes anualmente irão morrer como resultado directo de uma incapacidade de controlar o crescimento local da doença.

Em nenhuma outra situação este problema é mais evidente do que no cancro da mama, que afecta 186 000 mulheres anualmente nos E.U.A. e cuja taxa de mortalidade tem permanecido imutável nos últimos 50 anos. A ressecção cirúrgica da doença através da mastectomia radical, mastectomia radical modificada, ou lumpectomia permanece o cerne do tratamento nesta condição. Infelizmente, 39% dos pacientes tratados retirando-se o inchaço isoladamente irão desenvolver uma recorrência local da doença e, surpreendentemente, tal também irá acontecer para 25% daqueles cujas margens da ressecção foram diagnosticadas histologicamente como estando livres de células tumorais. Destas recorrências locais, tantas como 90% irão ocorrer nos 2 cm envolventes do ponto de excisão prévio.

Similarmente, em 1991, mais de 113 000 mortes e 238 600 novos casos de metástases no figado foram registados só na América do Norte. O tempo de sobrevivência médio para pacientes com metástases no figado é de apenas 6,6 meses uma vez que se tenham desenvolvido lesões no figado. O tratamento não-cirúrgico para metástases hepáticas inclui quimioterapia sistémica, radiação, quimioembolização, quimioterapia arterial hepática, e radiação intra-arterial. No entanto, apesar da evidência de que tais tratamentos transitoriamente conseguem diminuir o tamanho das lesões hepáticas (por exemplo, a quimioterapia sistémica e a quimioterapia arterial hepática inicialmente reduzem as 5 lesões em 15-20% e em 80% dos pacientes, respectivamente) , as lesões reocorrem invariavelmente. A ressecção cirúrgica das metástases do fígado representa a única possibilidade para uma cura, mas tal procedimento apenas é possível para 5% dos pacientes com metástases, e apenas 15-20% dos pacientes com cancro hepático primário.

Um método que tem sido tentado para o tratamento de tumores com um sucesso limitado é a embolização terapêutica. Resumidamente, vasos sanguíneos que alimentam um tumor são bloqueados deliberadamente através da injecção de um material embólico para dentro dos vasos. Uma variedade de materiais tem sido experimentada com este objectivo, incluindo substâncias autólogas, tais como gordura, coágulo sanguíneo e fragmentos de músculo retalhados, assim como materiais artificiais tais como lã, algodão, esferas de aço, contas de plástico ou vidro, pó de tântalo, compostos de silicone, partículas radioactivas, esponja de gelatina estéril absorvível (Sterispon, Gelfoam) celulose oxidada (Oxycel), espirais em aço, álcool, dura-máter humana liofilizada (Lyodura), colagénio microfibrilar (Aviten), fibrilas de colagénio (Tachotop), esponja de álcool polivinílico (PVA; Ivalon), esferas de silicone impregnadas de bário (Biss) e balões destacáveis. O tamanho das metástases do fígado pode ser temporariamente diminuído utilizando tais métodos, mas os tumores tipicamente respondem causando o crescimento de novos vasos sanguíneos para dentro do tumor.

Um problema relacionado com a formação de tumores é o desenvolvimento de bloqueios cancerosos que inibem o fluxo de material através das passagens corporais, tais como os canais biliares, traqueia, esófago, vasculatura e uretra. 6

Um dispositivo, o stent, tem sido desenvolvido de modo a manter abertas as passagens que tenham sido bloqueadas por tumores ou outras substâncias. Os exemplos representativos de stents comuns incluem o Walstent, stent Strecker, stent Gianturco e o stent Palmaz. 0 maior problema com os stents, contudo, é que não previnem o crescimento para dentro através dos interstícios do stent do tumor ou do material inflamatório. Se este material alcança o interior de um stent e compromete o lúmen do stent, isto pode resultar num bloqueio da passagem corporal dentro da qual foi inserido. Adicionalmente, a presença de um stent no corpo pode induzir a que o tecido reactivo ou inflamatório (por exemplo, vasos sanguíneos fibroplastos, glóbulos brancos sanguíneos) entre no lúmen do stent, resultando num encerramento parcial ou completo do stent. A presente invenção fornece composições e métodos adequados para tratar cancros e outras doenças angiogénico-dependentes que abordam os problemas associados com os procedimentos acima discutidos e ainda fornece outras vantagens.

Sumário da Invenção 0 objectivo da invenção é definido nas reivindicações. Resumindo, a presente invenção fornece composições anti-angiogénicas adequadas para o tratamento de cancro e outras doenças angiogénico-dependentes. No âmbito da invenção, são providenciadas composições (a partir de agora designadas por "composições anti-angiogénicas") que compreendem (a) taxol como um factor anti-angiogénico e (b) um transportador polimérico. Uma ampla variedade de transportadores poliméricos pode ser utilizada, exemplos representativos dos quais incluem poli (acetato de 7 etinovinilo) em ligação cruzada com 40% de acetato de vinilo, poli (ácido láctico-glicólico), ácido poliláctilo de policaprolactona, copolímeros de poli (acetato de etinovinilo) em ligação cruzada com 40% de acetato de vinilo e ácido poliláctilo e copolímeros de ácido poliláctico e de policaprolactona. Numa forma de realização da invenção, a composição tem um tamanho médio de 15 a 200pm. A invenção pode ser usada para embolizar um vaso sanguíneo, através da libertação para dentro do vaso uma de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição anti-angiogénica (como descrita acima), de tal forma que o vaso sanguíneo seja efectivamente tapado. A composição anti-angiogénica pode ser libertada num vaso sanguíneo que alimenta um tumor.

Podem ser fornecidos stents que compreendem uma estrutura geralmente tubular, tendo a superfície sido revestida com uma ou mais composições anti-angiogénicas. O lúmen de uma passagem corporal, pode ser expandido através da inserção do stent dentro da passagem, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura sendo revestida por uma composição anti-angiogénica como descrita acima, de tal forma que a passagem seja expandida. As obstruções biliares podem ser eliminadas, através da inserção de um stent biliar numa passagem biliar; a para eliminar as obstruções uretrais compreendendo com a inserção de um stent uretral numa uretra; para eliminar obstruções do esófago com a inserção de um stent esofágico num esófago; e eliminar as obstruções da traqueia/brônquios com a inserção de um stent traqueal/bronquial na traqueia ou brônquios. Em cada um destes casos, o stent tem uma 8 estrutura geralmente tubular, cuja superfície é revestida por uma composição anti-angiogénica, conforme acima descrito. A presente invenção pode ser usada para o tratamento de locais de excisão tumor, compreendendo a administração de uma composição anti-angiogénica como acima descrita nas margens de ressecção de um tumor subsequente à excisão, de tal modo que a recorrência local de cancro e a formação de novos vasos sanguíneos no local seja inibida. São revelados métodos para tratar a neovascularização córnea, compreendendo o passo de administrar uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica como acima descrito na córnea, de tal modo que a formação de vasos sanguíneos seja inibida. A composição anti-angiogénica pode compreender ainda um corticosteróide tópico. São revelados métodos para a inibição da angiogénese em pacientes com doenças angiogénico-dependentes não-tumurogénicas, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição compreendendo taxol a um paciente com uma doença angiogénico-dependente não-tumurogénica, de tal modo que a formação de novos vasos sanguíneos seja inibida. Noutros aspectos, são revelados métodos para embolizar vasos sanguíneos em doenças angiogénico-dependentes não-tumorogénicas, compreendendo a libertação no vaso sanguíneo de uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição compreendendo taxol, de tal modo que o vaso sanguíneo seja efectivamente ocludido. 9

Num outro aspecto, são revelados métodos para expansão do lúmen de uma passagem corporal, compreendendo a inserção de um stent para dentro da passagem, tendo o stent uma estrutura geralmente tubular, sendo a superfície desta estrutura revestida com uma composição compreendendo taxol, de tal forma que a passagem seja expandida. São fornecidos métodos para eliminar obstruções biliares, compreendendo a inserção de um stent biliar para dentro de uma passagem biliar; para eliminar obstruções uretrais, compreendendo a inserção de um stent uretral para dentro de uma uretra; para eliminar obstruções esofágicas, compreendendo a inserção de um stent esofágico para dentro de um esófago; e para eliminar obstruções da traqueia/brônquios, compreendendo a inserção de um stent traqueal/bronquial para dentro da traqueia ou brônquios. Em cada uma destes casos, o stent tem uma estrutura geralmente tubular, a superfície desta estrutura sendo revestida por uma composição compreendendo taxol. São fornecidos métodos para o tratamento de um local de excisão de um tumor, incluindo a administração de uma composição compreendendo taxol na margem de ressecção de um tumor subsequente à excisão, de tal modo que a recorrência local de cancro e a formação de novos vasos sanguíneos no local seja inibida. São fornecidos métodos para tratar a neovascularização córnea, incluindo a administração na córnea de uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição compreendendo taxol, de tal forma que a formação de novos vasos seja inibida.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, são fornecidos produtos farmacêuticos, compreendendo (a) taxol, num recipiente, e (b) informação associada ao recipiente 10 numa forma prescrita por uma agência governamental regulando a manufactura, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cuja informação seja reflexiva da aprovação pela agência do uso de taxol para administração humana ou veterinária para tratar doenças angiogénico-dependentes não-tumorogénicas. Em suma, a Lei Federal requer que o uso de um agente farmacêutico na terapia de humanos seja aprovado por uma agência do governo Federal. A responsabilidade pela implantação (nos Estados Unidos) pertence ao Food and Drug Administration, que emite regulamentações apropriadas para garantir tal aprovação, apresentadas detalhadamente em 21 U.S.C. §§ 301-392. Também é fornecida regulamentação para materiais biológicos compreendendo produtos feitos a partir de tecidos de animais em 42 U.S.C. § 262. Uma aprovação semelhante é necessária na maior parte dos países, embora as regulamentações possam variar de país para país.

Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes mediante referência à descrição detalhada que se segue e figuras anexas. Adicionalmente, são apresentadas abaixo várias referências, que descrevem mais detalhadamente determinados procedimentos ou composições.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA é uma fotografia que mostra uma cultura de ovos sem casca no 6o dia. A Figura 1B é uma imagem digitalizada apresentada por computador de capilares vivos sem corante, tirada por um estereomicroscópio (1040x). A Figura 1C é uma fundição por corrosão, que mostra a microvasculatura CAM, que é alimentada por vasos maiores subjacentes (setas; 1300x) . A Figura 1D representa uma plástica de 0,5 mm de espessura em corte transversal ao longo da CAM e gravada ao 11 nível do microscópio óptico. Esta fotografia mostra a composição da CAM, incluindo uma ectoderme de dupla camada exterior (Ec) , uma mesoderme (M) contendo capilares (setas) e células adventícias dispersas, e uma endoderme de camada única (En) (400x). A Figura 1E é uma fotografia ao nível do microscópio electrónico (3500x) na qual a estrutura capilar típica é apresentada mostrando células endoteliais de paredes finas (ponta das setas) e um pericito associado.

As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D são uma série de imagens digitalizadas de quatro CAMs diferentes sem corante, tiradas após 48 horas de exposição ao taxol.

As Figuras 3A, 3B e 3C são uma série de fotografias de secções plásticas de 0,5 mm de espessura em corte transversal ao longo da CAM tratada com taxol em três locais diferentes dentro da zona vascular.

As figuras 4A, 4B e 4C são séries de micrografias electrónicas, que foram tiradas em locais similares aos das figuras 3A, 3B e 3C (respectivamente) acima. A Figura 5 é um gráfico de barras, que representa a distribuição de tamanhos das microesferas por número (ELVAX a 5% com 10 mg de suramina de soido em PVA a 5%). A Figura 6 é um gráfico de barras que representa a distribuição de tamanhos das microesferas por peso (ELVAX a 5% com 10 mg de suramina de sódio em PVA a 5%). A Figura 7 é um gráfico de linhas, que representa o peso de encapsulação da suramina de sódio em 1 mL de ELVAX a 5%. 12 A Figura 8 é um gráfico de linhas, que representa a percentagem de encapsulação da suramina de sódio em ELVAX. A Figura 9 é um gráfico de barras, que representa a distribuição de tamanhos das microesferas ELVAX a 5% contendo 10 mg de suramina de sódio feitas em PVA a 5% contendo 10% de NaCl. A Figura 10 é um gráfico de barras, que representa a distribuição de tamanhos por peso de microesferas PLL a 5% contendo 10% de NaCl. A Figura 11 é um gráfico de barras, que representa a distribuição de tamanhos por número de microesferas PLL a 5% contendo 10% de NaCl. A Figura 12 é um gráfico de linhas, que representa o curso de tempo da libertação da suramina de sódio. A Figura 13 é uma ilustração de uma modalidade representativa de embolização de tumor hepático. A Figura 14 é uma ilustração da inserção de um stent representativo impregnado com uma composição anti-angiogénica da presente invenção. A Figura 15A é um gráfico, que mostra o efeito da razão da combinação polimérica EVA: PLA sobre a agregação das microesferas. A Figura 15B é uma micrografia de scanning electrónica, que mostra o tamanho de microesferas "pequenas". A Figura 15C é uma micrografia de scanning electrónica, que mostra o tamanho de microesferas "grandes". A Figura 15D é um gráfico que representa o curso 13 de tempo da libertação de taxol in vitro a partir de microsferas de combinação polimérica EVA: PLA 50:50 impregnadas de taxol a 0,6% p/v para a solução salina de fosfato tamponizada (pH 7,4) a 37°C. Os círculos abertos são microsferas de "pequena" dimensão, e os círculos fechados são microsferas de "grande" dimensão. A Figura 15E é uma fotografia de uma CAM que mostra os resultados da libertação de taxol pelas microsferas ("MS"). A Figura 15F é uma fotografia similar à 15E ampliada. A Figura 16 é um gráfico que mostra os perfis da taxa de libertação das microsferas de policaprolactona contendo taxol a 1%, 2%, 5% ou 10% em solução salina de fosfato tamponizada a 37°C. A Figura 16B é uma fotografia que mostra uma CAM tratada com microsferas de controlo. A Figura 16C é uma fotografia que mostra uma CAM tratada com microsferas impregnadas de taxol a 5%.

As Figuras 17A e 17B, respectivamente, são dois gráficos que mostram a libertação do taxol a partir de filmes EVA e a percentagem de taxol restante nesses mesmos filmes ao longo do tempo. A Figura 17C é gráfico que mostra o inchaço de filmes EVA/F127 sem taxol ao longo do tempo. A Figura 17D é um gráfico que mostra o inchaço de filmes EVA/Span 80 sem taxol ao longo do tempo. A Figura 17E é um gráfico que representa uma curva de tensão vs contorção para várias combinações EVA/F127.

As Figuras 18A e 18B são dois gráficos que mostram o ponto de fusão de combinações poliméricas PCL/MePEG como função da % de MePEG na formulação (18A) e o aumento de percentagem em tempo necessário para a pasta de PCL a 60°C começar a solidificar como função da quantidade de MePEG na 14 formulação (18B). A Figura 18C é um gráfico que representa a fragilidade de várias combinações poliméricas de PCL/MePEG. A Figura 18D é um gráfico, que representa a percentagem de mudança de peso ao longo do tempo para combinações poliméricas de várias concentrações de MePFG. A Figura 18E é um gráfico que representa a taxa de libertação do taxol ao longo do tempo a partir de várias combinações poliméricas impregnadas com taxol a 1%. As Figuras 18F e 18G são gráficos que representam o efeito de quantidades variáveis de taxol na quantidade total de taxol libertado de uma combinação MePEG a 20%. A Figura 18H é um gráfico que representa o efeito do MePEG na resistência à tensão de um polímero MePEG/PCL. A Figura 19A é uma fotografia que mostra termopasta de controlo (não-impregnada) numa CAM. A Figura 19B é uma fotografia de termopasta impregnada de taxol a 20% numa CAM.

As Figuras 20A e 20B são duas fotografias de uma CAM tendo um tumor tratado com uma termopasta de controlo (não-impregnada) . As Figuras 20C e 20D são duas fotografias de uma CAM tendo um tumor tratado com uma termopasta impregnada de taxol. A Figura 21A é um gráfico que mostra o efeito do taxol/PCL no crescimento tumoral. As Figuras 21B e 21C são duas fotografias que mostram efeito das termopastas de controlo e impregnadas com taxol a 10% e a 20% no crescimento tumoral. A Figura 22A é uma fotografia da sinóvia de uma articulação injectada com PBS. A Figura 22B é uma fotografia da sinóvia 15 de uma articulação injectada com microsferas. A Figura 22C é uma fotografia da cartilagem de articulações injectadas com PBS, e a Figura 22D é uma fotografia da cartilagem de articulações injectadas com microsferas.

Descrição Detalhada da Invenção

Como referido acima, a presente invenção fornece composições, que utilizam factores anti-angiogénicos. Os factores anti-angiogénicos devem ser entendidos como incluindo qualquer proteína, peptídeo, produto químico ou qualquer outra molécula que actue para inibir o crescimento vascular. Existe uma variedade de métodos que podem ser prontamente utilizados para determinar a actividade anti-angiogénica de um dado factor, incluindo, por exemplo, ensaios da membrana corioalantóide de pinto (CAM - chick chorioallantoic membrane). Resumidamente, tal como descrito abaixo em pormenor, nos exemplos 2A e 2C, remove-se uma parte da casca de ovo de galinha, acabado de fertilizar e coloca-se na membrana um disco de metilcelulose contendo uma mostra do factor anti-angiogénico a testar. Após alguns dias (por exemplo, 48 horas), é possível determinar prontamente a inibição do crescimento vascular pela amostra a testar, através da visualização da membrana corioalantóide de pinto, na região que circunda o disco de metilcelulose. A inibição do crescimento vascular pode também ser determinada quantitativamente, por exemplo, pela determinação do número e tamanho dos vasos sanguíneos na vizinhança do disco de metilcelulose, em comparação com um disco de metilcelulose de controlo. Os factores anti-angiogénicos particularmente preferidos, adequados para utilização na presente invenção, inibem completamente a formação de novos vasos sanguíneos no ensaio acima descrito. 16

Pode também ser utilizada uma variedade de ensaios para determinar a eficácia de factores anti-angiogénicos in vivo incluindo por exemplo, modelos desenvolvidos para este fim em ratinhos (ver Robertson et al., Câncer Res. 51:1339-1344, 1991). Além disto, foram descritos abaixo em maior pormenor, nos exemplos 5 a 7 e 17 a 19, uma variedade de ensaios in vivo representativos, relacionados com vários aspectos das invenções aqui descritas.

Como acima descrito, a presente invenção proporciona composições compreendendo taxol como factor anti-angiogénico e um transportador polimérico. É conhecida uma enorme variedade de factores anti-angiogénicos, que incluem Factor Anti-Invasivo, ácido retinóico e seus derivados, e membros do grupo que consiste na Suramina, Tecido Inibidor da Metaloproteinase -1, Tecido Inibidor da Metaloproteinase-2, Inibidor do activador do Plasminogénio-1 e Inibidor do Activador do Plasminogénio-2. Estes e outros factores anti-angiogénicos serão discutidos abaixo mais pormenorizadamente.

Abreviadamente, sabe-se que o Factor Anti-Invasivo ou "AIF" (Anti-Invasive Factor), o qual é preparado a partir de extractos de cartilagem, contém constituintes que são responsáveis pelo crescimento de novos vasos sanguíneos. Estes constituintes compreendem uma família de 7 proteínas de baixo peso molecular (<50 000 daltons) (Kuettner and Pauli, "Inhibition of Neovascularization by a cartilage factor" em Development of the Vascular System, Pitman Books (Ciba Foundation Symposium 100), pp. 63-173, 1983), incluindo uma série de proteínas que têm efeito inibidor contra uma série de proteases (Eisentein et al., Arn. J. 17

Pathol 81:337 346,: 1975; Langer et al., Science 193:70-72, 1976; e Horton et al. Science 199:1342-1345, 1978). O AIF conveniente para utilização dentro da presente invenção poderá ser prontamente preparado utilizando técnicas conhecidas na arte (e.g., Eisentein et ai., supra; Kuettner and Pauli, supra; e Langer et al., supra). Constituintes purificados de AIF tais como Inibidor Derivado de Cartilagem ("CDI" Cartilage-Derived Inhibitor) (ver Moses et al., Science 248:1408-1410, 1990), também podem ser prontamente preparados e utilizados dentro do contexto da presente invenção.

Os ácidos retinóicos alteram o metabolismo dos componentes da matriz extracelular, tendo como resultado a inibição da angiogenese. A adição de análogos de prolina, de esteróides angiostáticos ou de heparina pode ser utilizada de modo a incrementar sinergeticamente o efeito antiangiogénico do ácido trans-retinóico. O ácido retinóico, assim como os seus derivados que possam também ser utilizados no contexto da presente invenção, podem ser prontamente obtidos a partir de fontes comerciais, incluindo, por exemplo, Sigma Chemical Co. (#R2625). O Taxol é um diterpenoide altamente derivatizado (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93:23-25, 1971) que foi obtido a partir da cortiça colhida e seca de Taxus brevifolia (Pacific Yew.) e de Taxomyces andreanae e de Endophytic Fungus de Pacific Yew. (Stierle et al., Science 60:214-216, 1993). Geralmente, o taxol actua para estabilizar as estruturas microtubulares ligando-se à tubulina para formar fusos mitóticos anormais. "Taxol" (que deve ser aqui compreendido como incluindo análogos e derivados do taxol, tais como, por exemplo, bacatina e taxotero) pode ser 18 prontamente preparado utilizando técnicas que são do conhecimento daqueles que são peritos na arte (ver também WO 94/.07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, Patentes Americanas U.S. N.° 5 294 637, 5 283 253, 5 279 949, 5 274 137, 5 202 448, 5 200 534, 5 229 526 e EP 590 267) ou obtido a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 - a partir de Taxus brevifolia) . A Suramina é um composto de naftilureia polisulfonada que é tipicamente usada como agente tripanocida. Resumidamente, a Suramina bloqueia a ligação especifica de vários factores de crescimento à superfície celular, tais como factor derivado de crescimento de plaquetas (platelet derived growth factor ("PDGF")), factor de crescimento epidérmico (epidermal growth factor ("EGF")), factor de crescimento transformante (transforming growth factor ("TGF-β")), factor de crescimento do tipo insulina (insulin-like growth factor ("IGF-1")) e factor de crescimento do fibroblasto (fibroblast growth factor ("β-FGF)) A Suramina pode ser preparada de acordo com técnicas conhecidas ou prontamente obtida, a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, por exemplo, Mobay Chemical Co., Nova Iorque, (ver Gagliardi et al., Câncer Res. 52:5073- 5075, 1992; e Coffey, Jr. et al., J. of Cell. Phys. 132:143-148, 1987). O Tecido Inibidor de Metaloproteinases-1 ("TIMP") é segregado pelas células endoteliais, as quais segregam também MTPases. O TIMP é glicosilado e tem um peso molecular de 28,5 kDa. TIMP-1 regula a angiogénese através da ligação a metaloproteinases activadas, suprimindo desta forma, a invasão de vasos sanguíneos para dentro da matriz 19 extracelular. 0 Tecido Inibidor de Metaloproteinases-2 ("TIMP 2") também pode ser utilizado para inibir a angiogénese. Resumidamente, TIMP-2 é uma proteína não glicosilada de 21 kDa que se liga a metaloproteinases nas suas formas de proenzimas, tanto activas como latentes. Tanto TIMP-1 como TIMP-2 podem ser obtidos a partir de fontes comerciais tais como Synergen, Boulder, Colorado. 0 Inibidor do Activador do Plasminogénio-1 (PA) é uma glicoproteína de 50 kDa que está presente nas plaquetas do sangue e pode também ser sintetisada pelas células endoteliais e musculares. PAI-1 inibe t-PA e a urocinase do activador de plasminogénio na região basolateral do endotélio e regulando adicionalmente o processo de fibrinólise. O Inibidor do Activador do Plasminogénio-2 (PAI-2) encontra-se normalmente apenas no sangue em determinadas circunstâncias tais como, durante a gravidez e na presença de tumores. Abreviadamente, PAI-2 é uma proteína de 56 kDa que é segregada por monocitos e por macrofagos. Acredita-se que regula a actividade fibrinolítica e, em particular, que inibe a urocinase do activador do plasminogénio e o activador do plasminogénio do tecido, evitando dessa forma a fibrinólise.

Outros factores anti-angiogénicos de exemplos significativos incluem o Factor 4 das Plaquetas (Sigma Chemical Co., #F1385); Sulfato de Protamina (Clupeine) (Sigma Chemical Co., #P4505); Derivados de Quitina Sulfatada (preparados a partir de conchas de caranguejo-rainha), (Sigma Chemical Co, #C3641; Murata et al., Câncer Res., 51: 22-26, 1991); Complexo Peptidoglicano Polissacárido Sulfatado (Sulphated Polysaccharide Peptidoglycan Complex) (SP-PG) (a função deste composto 20 pode ser aumentada pela presença de esteróides tais como estrogénio e citrato de tamoxifeno) ; Estaurosporina (Sigmá Chemical Co., #S4400); Moduladores do Metabolismo da Matriz, incluindo, por exemplo, análogos de prolina {[(Ácido carboxilico L-Azetidino-2 (LACA) (Sigma Chemical Co., #A0760)), cis-hidroxiprolina, d,L-3,4- desidroprolina (Sigma Chemical Co., #D0265), tioprolina (Sigma Chemical Co., #T0631))]a,a- ipiridil (Sigma Chemical Co., #D7505), fumarato de β-aminopropionitrilo (Sigma Chemical Co., #A3134)]}; MDL 27032 (4-propil-5- (4-piridinil)-2 (3H)-oxazolona; Merion Merrel Dow Research Institute); Metatrexato (Sigma Chemical Co., #A6770; Hirata et al., Arthritis and Rheumatism 32: 1065-1073, 1989); Mitoxantrona (Polverini e Novak, Biochem. Biophys. Res. Comm. 140:901-907); Heparina (Folkman, Bio. Phar. 34: 905-909, 1985; Sigma Chemical Co., #P8754); Interferões (e.g., Sigma Chemical Co., #13265); soro. 2-Macroglobolina (Sigma Chemical Co., #M7151); ChIMP (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); Quimostatina (Sigma Chemical Co., #C7268; Tomkinson et al.,Biochem. J. 286:475-480, 1992); Tetradecassulfato de β-Ciclodextrina (Sigam Chemical C°., #C4767); Eponemicina; Estramustina (disponível na Sigm; Wang e Stearns Câncer Res, 48: 6262-6271, 1998); Fumaguilina (Sigma Chemical Co. #F6771; Canadian Oatent N° 2 024 306; Ingber et al., Nature 348:555-557, 1990); Tiomalato de Ouro de Sódio (Gold Sodium Thiomalate "GST"; Matsubara e Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); (D-Penicilamina ("CDPT"; Sigma Chemical Co., #P4875 ou P5000 (HCI)); soro de β-1-anticolagenase; α-2-antiplasmina (Sigma Chemical Co., #A0914; Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4): 1659-1664, 1987); Bisantreno (National Câncer Institute); Lobenzarit de dissódio (ácido N-(2)-carboxifenil-4-cloro-antronílico dissódio ou "CCA"; 21

Takeuchi et ai., Agents Actions 36: 312-316, 1992); Talidomida, esteróides Angiostáticos; AGM-1470, carboxiaminolmidazole, inibidores de metaloproteinase tais como BB94 e O peptídeo CDPGYGSR- NH2 (SEQUÊNCIA ID NO.l) (Iwaki Glass, Tóquio, Japão).

Composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção podem, adicionalmente, compreender uma ampla variedade de compostos em adição ao taxol como factor anti-angiogénico e ao transportador polimérico. Por exemplo, composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção podem, também, em determinadas modalidades da invenção, compreender ainda um ou mais antibióticos, excepto aqueles indicados nas reivindicações, anti-inflamatórios, agentes anti-virais, agentes anti-fúngicos e/ou agentes anti-protozoários. Exemplos representativos de antibióticos incluídos nas composições aqui descritas, incluem: penicilinas; cefalosporinas tais como cefadroxil, cefazolina, cefaclor; aminoglicosídeos tais como gentamicina e tobramicina; sulfonamidas tais como sulfametoxazole; e matronidazole. Exemplos representativos de anti-inflamatórios incluem: esteróides tais como prednisona, prednisolona, hidrocortisona, hormona adrenocorticópica e sulfasalazina; e substâncias anti-inflamatórias não-esteróides (non steroidal anti-inflamatory drugs (NSAIDS)) tais como a aspirina, ibuprofeno, naproxeno, fenoporfeno, indometacina e fenilbutazona. Exemplos representativos de agentes anti-virais incluem: acyclovir, ganciclovir, zidovudina. Exemplos representativos de agentes anti-fúngicos incluem: nistatina, ketoconazol, griseofulvina, flucitosina, miconazol, clotrimazol. Exemplos representativos de agentes 22 anti-protozoários incluem: isotionato de pentanidino, quinino, cloroquina e mefloquina.

Composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção podem também conter uma ou mais hormonas tais como a hormona da tiróide, estrogénio, progesterona, cortisona e/ou hormona do crescimento, outras moléculas biologicamente activas tais como a insulina, assim como THl (por exemplo, interleucinas -2, -12, e -15), interferões gamma ou TH2 (por exemplo, interleucinas -4, -10) citocinas.

Composições anti-angiogénicas da presente invenção podem também compreender ingredientes adicionais tais como surfactantes (tanto hidrofilicos corno hidrofóbicos; ver Exemplo 13), agentes anti-neoplásticos ou quimoterapêuticos (por exemplo, 5-fluoruracilo, vinblastina, doxorrubicina, adriamicina ou tamoxifeno), agentes radioactivos (por exemplo, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, 1-123, 1-125, 1-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 e Bi-212) ou toxinas (por exemplo, ricina, abrina, toxina da difteria, toxina da cólera, gelonina, proteina anti-viral de erva dos cancros, tritina, toxina de Shigella e exotoxina A de Pseudomonas) .

Como referido acima, as composições anti-angiogénicas da presente invenção compreendem taxol como um factor anti-angiogénico e um transportador polimérico não biodegradável. As composições anti-angiogénicas da presente invenção podem incluir uma larga variedade de transportadores poliméricos, incluindo, por exemplo, ambas as composições biodegradáveis e não biodegradáveis. Exemplos representativos de composições biodegradáveis 23 incluem albumina, gelatina, amido, celulose, dextranos, polissacarideos, fibrinogénio, poli (d, 1 lactideo), poli(d, 1 lactideo-co-glicolideo), poli(glicolideo), poli(hidroxibutirato), poli (alquilcarbonato) e poli(orto-ésteres) (para uma abordagem geral ver, Illum, L., Davids, S.S. (eds.) "Polimers in controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17: 1- 22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173-196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155-0180, 1986). Exemplos representativos de polímeros não degradáveis incluem co-polímeros EVA, borracha de silicone e poli(metil-meta-acrilato). Transportadores poliméricos particularmente preferidos incluem co-polimero EVA (e.g., ELVAX 40, poli(acetato de etilenovinilo) em ligação cruzada com 40% de acetato de vinilo; DuPont), poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, ácido poliláctico, co-polímeros de poli(acetato de etilenovinilo) em ligação cruzada com 40% de acetato de vinho e ácido poliláctico, e co-polimeros de ácido poliláctico e policaprolactona.

Transportadores poliméricos podem ser feitos numa variedade de formas, que incluem, por exemplo, como nanosferas ou microsferas, dispositivos em forma de haste, pellets, chapas, ou cápsulas (ver, e.g., Goodell et al., Am. J. Hosp. Pharm. 43: 1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", em Biomedical polymers, Polymeric materiais and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E.P., Nakagim, A. (eds.) Academic Press, pp. 113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sei. 69: 265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sei. 72: 1181-1185, 1983; e Bawa et al., J. Controlled Release 1: 259-267, 1985). 24

Preferivelmente, composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção são feitas do modo apropriado para o fim a que se destinam. Dentro dos aspectos preferidos da presente invenção, a composição anti-angiogénica deve ser biocompativel, e libertar o factor anti-angiogénico durante um periodo de várias semanas a meses. Adicionalmente, composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção devem, preferencialmente, ser estáveis durante vários meses e capazes de serem produzidos e armazenados sob condições de esterilidade.

Dentro de certos aspectos da presente invenção, composições anti-angiogénicas podem ser feitas em qualquer tamanho desde nanosferas até microsferas (por exemplo, desde 0,1 ym até 500 ym dependendo do uso particular. Por exemplo, quando usado com o propósito de embolizar o tumor (como discutido abaixo), é normalmente preferido fazer a composição anti-angiogénica em microsferas entre 15 e 500 ym preferivelmente entre 15 e 200 ym, e mais preferivelmente, entre 25 e 150 ym. Tais nanopartículas podem também ser prontamente aplicadas como um "spray", o qual solidifica num filme ou revestimento. Nanopartículas (também chamadas "nanosferas") podem ser preparadas numa ampla gama de tamanhos, incluindo, por exemplo, de 0,1 ym a 3 ym, de 10 ym a 30 ym, e de 30 ym a 100 ym (ver Exemplo 8) .

As composições anti-giogénicas podem também ser preparadas, dada a revelação que aqui foi feita, para uma variedade de outras aplicações. Por exemplo, para a administração de composições anti-angiogénicas na córnea, as composições da presente invenção podem ser incorpadas em polímeros como nanopartículas (para uma abordagem geral ver, Kreuter J. 25

Controlled Release 16: 169-176, 1991; Couvreur e Vauthier, J. Controlled Release 17: 187-198, 1991). Tais nanopartículas podem ser prontamente aplicadas como um "spray", o qual solidifica num filme ou revestimento. Nanopartículas (também chamadas "nanosferas") podem ser preparadas numa ampla gama de tamanhos, incluindo, por exemplo, de 0,1 pm a 3 pm, de 10 pm a 30 pm, e de 30 pm a 100 pm (ver Exemplo 8).

As composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção podem também ser preparadas numa variedade de formas de "pasta" ou gel. Por exemplo, numa modalidade da invenção, são providenciadas composições anti-angiogénicas, as quais são líquidas a uma dada temperatura (por exemplo, temperatura superior a 37°C, tal como 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, ou 60°C), e sólidas ou semi-sólidas a uma outra temperatura (por exemplo, temperatura corporal ambiente, ou qualquer temperatura inferior a 37°C). Tais "termopastas" podem ser prontamente feitas segundo a revelação aqui fornecida (ver, por exemplo, Exemplos 10 e 14) .

Ainda noutros aspectos da invenção, as composições anti-angiogénicas utilizadas na presente invenção podem ser formadas como um filme. Preferivelmente, tais filmes são normalmente menores do que 5, 4, 3, 2 ou 1, mm de espessura, mais preferivelmente menor do que 0,75 mm ou 0,5 mm de espessura, e ainda mais preferivelmente menor do que 500 pm a 100 pm de espessura. Tais filmes são de preferência flexíveis com uma boa força de tensão (por exemplo, maior do que 50, preferivelmente maior do que 100, e mais preferivelmente maior do que 150 ou 200 N/cm2), boas propriedades adesivas (i.e., pronta adesão a superfícies húmidas ou molhadas), e ter uma permeabilidade controlada. 26

Exemplos representativos de tais filmes são apresentados abaixo nos Exemplos (ver por exemplo, Exemplo 13) .

Exemplos representativos da incorporação do factor anti-angiogénico, tais como num transportador polimérico são descritos em maior detalhe abaixo nos Exemplos 4 e 8-15.

Embolização Arterial

Os métodos da presente invenção podem ser usados para embolizar um vaso sanguíneo, compreendendo o passo de libertação para um vaso de uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica (como descrito acima) , de tal forma que o vaso sanguíneo seja efectivamente ocludido. Quantidades terapeuticamente efectivas adequadas para a oclusão de vasos sanguíneos podem ser prontamente determinadas dada a revelação abaixo apresentada, e como descrito no Exemplo 6. Numa modalidade particularmente preferida, a composição anti-angiogénica é libertada num vaso sanguíneo que alimenta um tumor (ver Figura 13).

Resumidamente, existe um número de situações clínicas (por exemplo, hemorragia, desenvolvimento de tumor) em que é desejável reduzir ou abolir o fornecimento de sangue a um orgão ou região. Como descrito em maior detalhe abaixo, isto pode ser conseguido através da injecção de composições anti-angiogénicas da presente invenção para dentro de um vaso sanguíneo desejado através de um cateter selectivamente posicionado (ver Figura 13) . A composição desloca-se via corrente sanguínea até se tornar encaixada na vasculatura, desta forma fisicamente (ou quimicamente) ocludindo o vaso sanguíneo. 0 fluxo sanguíneo reduzido ou abolido para a área seleccionada resulta em enfarte (morte 27 celular devido a um fornecimento de oxigénio e nutrientes desadequado) ou perda de sangue reduzida de um vaso danificado.

Para uso na terapia de embolização as composições anti angiogénicas da presente invenção são preferivelmente não tóxicas, trombogénicas, fáceis de injectar nos cateteres vasculares, radiopacas, rápidas e de efeito permanente, estéreis e rapidamente disponíveis em diferentes formas ou tamanhos na altura do procedimento. Adicionalmente, a composições resultam preferivelmente numa libertação lenta (idealmente, ao longo de um período de várias semanas ou meses) do factor anti-angiogénico. Composições anti-angiogénicas particularmente preferidas devem ter um tamanho previsível de 15-200 ym após serem injectadas no sistema vascular. Preferivelmente, não devem agrupar-se em partículas maiores quer em solução quer uma vez injectadas. Adicionalmente, composições preferíveis não devem mudar de forma ou propriedades físicas durante o armazenamento anterior ao uso. A terapia de embolização pode ser utilizada pelo menos de três modos principais para auxiliar no manejo de neoplasmas: (1) tratamento definitivo de tumores (usualmente benignos); (2) na embolização pré-operatória; e (3) na embolização paliativa. Em suma, tumores benignos podem por vezes ser tratados com sucesso pela terapia de embolização isoladamente. Exemplos de tais tumores incluem simples tumores de origem vascular (por exemplo, hemangiomas), tumores endócrinos tais como adenomas paratiroidais, e tumores benignos nos ossos. 28

Para outros tumores (por exemplo, adenocarcinoma renal), pode ser empregue embolização pré-operatória horas ou dias antes da ressecção cirúrgica de forma a reduzir a perda de sangue operatória, encurtar a duração da operação, e reduzir o risco de disseminação de células malignas viáveis pela manipulação cirúrgica do tumor. Muitos tumores podem ser embolizados pré-operatoriamente com sucesso, incluindo, por exemplo, tumores nasofaríngeos, tumores glómico-jugulares, meningiomas, quimiodectomas e neurinomas do vago. A embolização pode também ser utilizada como um modo primário de tratamento em malignidades inoperáveis, de forma a prolongar o tempo de sobrevivência de pacientes com doença avançada. A embolização pode produzir uma melhoria acentuada na qualidade de vida de pacientes com tumores malignos aliviando sintomas desagradáveis tais como hemorragias, obstrução venosa e compressão da traqueia. 0 maior beneficio da embolização paliativa de tumores, contudo, pode ser observado em pacientes sofrendo dos efeitos humorais dos tumores endócrinos malignos, nos quais as metástases partindo de tumores carcinóides e outros neoplasmas endócrinos tais como as insulinomas e glucagonomas podem crescer lentamente, e contudo causar grande sofrimento em virtude dos síndromas endócrinos que produzem.

Geralmente, a terapia de embolização utilizando composições anti-angiogénicas da presente invenção é tipicamente executada de modo similar, independentemente da localização. Resumidamente, primeiro é executada uma angiografia (um mapa das estradas dos vasos sanguíneos) da área a ser embolizada injectando um contraste radiopaco 29 através de um cateter inserido numa artéria ou veia (dependendo do local a ser embolizado) enquanto é feito um raio-X. 0 cateter pode ser inserido quer percutaneamente ou cirurgicamente. 0 vaso sanguíneo é então embolizado pelo refluxo das composições anti-angiogénicas da presente invenção através do cateter, até se observar a paragem do fluxo. A oclusão pode ser confirmada repetindo o angiograma. A terapia de embolização resulta geralmente na distribuição de composições contendo factores anti-angiogénicos ao longo dos interstícios do tumor ou massa vascular a ser tratada. A massa física das partículas embólicas obstruindo o lúmen arterial resulta na oclusão do fornecimento de sangue. Adicionalmente a este efeito, a presença de um factor(es) anti-angiogénico(s) previne a formação de novos vasos sanguíneos que alimentem o tumor ou a massa vascular, aumentando o efeito de desvitalização do corte do fornecimento de sangue.

Deste modo, deverá ser evidente que uma vasta variedade de tumores pode ser embolizada utilizando as composições da presente invenção. Resumidamente, os tumores são tipicamente divididos em duas classes: benignos e malignos. Num tumor benigno as células retêm as suas características diferenciadas e não se dividem de um modo completamente descontrolado. Adicionalmente, o tumor é localizado e não-metástico. Num tumor maligno, as células tornam-se indiferenciadas, não respondem ao crescimento corporal e sinais hormonais, e multiplicam-se de forma descontrolada; o tumor é invasivo e capaz de se difundir para locais distantes (formação de metástases). 30

No âmbito da presente invenção, podem ser tratadas metástases (tumores secundários) do fígado utilizando a terapia de embolização. Resumidamente, é inserido um cateter via artéria femoral ou braquial que avança para dentro da artéria hepática pela condução através do sistema arterial sob orientação fluoroscópica. O cateter avança para dentro da árvore arterial hepática tão longe quanto possível para permitir um bloqueio completo dos vasos sanguíneos que abastecem o(s) tumor(es) enquanto poupam, tantas quantas possíveis, ramificações arteriais que abastecem estruturas normais. Idealmente, isto acontece para uma ramificação segmentária da artéria hepática, mas pode acontecer que toda a artéria hepática distai à origem da artéria gastroduodenal, ou mesmo múltiplas artérias separadas, precisem de ser bloqueadas dependendo da extensão do tumor e do seu fornecimento de sangue individual, lima vez que a posição do cateter desejada seja obtida, a artéria é embolizada injectando composições anti-angiogénicas (como descrito acima) através do cateter arterial até cessar o fluxo na artéria a ser bloqueada, preferivelmente, mesmo após a observação durante 5 minutos. A oclusão da artéria pode ser confirmada injectando contraste radiopaco através do cateter e demonstrando por fluoroscopia ou filme de raio X que o vaso que previamente ficava cheio de contraste já não o faz. O mesmo procedimento pode ser repetido com cada artéria, de abastecimento a ser ocludida.

Como notado acima, quer os tumores benignos quer os tumores malignos podem ser embolizados utilizando composições da presente invenção. Exemplos representativos de tumores benignos hepáticos incluem Adenoma Hepatocelular, Hemangioma Cavernoso e Hiperplasia Nodular Focal. Outros 31 tumores benignos, que são mais raros e frequentemente não têm manifestações clinicas podem também ser tratados. Estes incluem Adenomas dos Canais Biliares, Cistadenomas dos Canais Biliares, Fibromas, Lipomas, Leiomiornas, Mesoteliomas, Teratomas, Mixomas, Hiperplasia Regenerativa Nodular.

Tumores Hepáticos Malignos são geralmente subdivididos em duas categorias: primários e secundários. Os tumores primários surgem directamente a partir do tecido no qual são descobertos. Assim, um tumor do fígado primário deriva originalmente das células que constituem o tecido do fígado (tais como, hepatocitos e células biliares) . Exemplos representativos de malignidade hepática primária que pode ser tratada através da embolização arterial incluem Carcinoma Hepatocelular, Colangiocarcinoma, Angiossarcoma, Cistadenocarcinoma, Carcinoma das Células Escamosas e Hepatoblastoma.

Um tumor secundário, ou metástase, é um tumor que teve origem noutro local do corpo mas que agora se propagou para um orgão distante. Os caminhos comuns da metástase são o crescimento directo para estruturas adjacentes, a propagação através do sistema vascular ou linfático e enveredar ao longo dos tecidos lisos e espaços corporais (fluído peritoneal, fluido cerebroespinhal, etc.). Tumores hepáticos secundários são uma das causas de morte mais comuns em pacientes cancerosos e são de longe a forma mais comum de tumor no fígado. Embora, virtualmente, qualquer malignidade possa metastizar para o fígado, os tumores com maior probabilidade de se propagarem para o fígado incluem: cancro do estômago, cólon e pâncreas; melanoma; tumores dos pulmões, orofaringe e bexiga; linfoma de Hodgkin e não- 32

Hodgkin; tumores da mama, ovário, e próstata. Cada um dos tumores primários acima mencionados tem numerosos tipos diferentes de tumor os quais podem ser tratados por embolização arterial (por exemplo, existem mais de 32 tipos diferentes de cancro do ovário).

Como notado acima, terapia por embolização utilizando composições anti-angiogénicas da presente invenção pode também ser aplicada a uma variedade de outras situações clinicas em que seja desejável a oclusão de vasos sanguíneos. Noutro aspecto da presente invenção, a malformação arteriovenosa pode ser tratada através da administração de uma das composições acima descritas. Resumidamente, malformações arteriovenosas (malformações vasculares) designa um grupo de doenças em que ocorre pelo menos uma (e mais tipicamente várias) comunicações anormais entre artérias e veias resultando numa massa local semelhante a um tumor, composta predominantemente por vasos sanguíneos. Tal doença pode ser congénita ou adquirida.

No âmbito da invenção, uma malformação arteriovenosa pode ser tratada inserindo um cateter via artéria femoral ou braquial, fazendo-a avançar para dentro da artéria abastecedora sob orientação fluoroscópica. 0 cateter avança preferivelmente tão longe quanto necessário para permitir o bloqueio completo dos vasos sanguíneos que abastecem a malformação vascular, enquanto poupam tantas ramificações arteriais que abastecem estruturas normais quantas possíveis (idealmente será uma única artéria, mas com maior frequência múltiplas artérias separadas podem necessitar de ser ocludidas, dependendo da extensão da malformação vascular e de seu abastecimento individual de sangue) . Uma vez que a posição desejada do cateter seja obtida, cada 33 artéria pode ser embolizada utilizando as composições anti-angiogénicas da presente invenção.

No âmbito da invenção, pode realizar-se urna embolização de forma a tratar condições de sangramento excessivo. Por exemplo, a menorragia (sangramento excessivo com a menstruação): pode ser prontamente tratada através da embolização de artérias uterinas. Resumidamente, as artérias uterinas são ramificações das artérias ilíacas internas bilateralrnente. Numa forma de realização da invenção, um cateter pode ser inserido via a artéria femoral ou braquial que avança para dentro da artéria uterina pela condução através do sistema arterial sob orientação fluoroscópica. 0 cateter deve ser avançado tão longe quanto necessário para permitir um bloqueio completo dos vasos sanguíneos para o útero, enquanto poupam tantas ramificações arteriais que surgem da artéria uterina e abastecem estruturas normais, quantas possíveis. Idealmente uma única artéria uterina de cada lado pode sem embolizada, mas ocasionalmente múltiplas artérias separadas, podem necessitar de ser bloqueadas dependendo do fornecimento de sangue individual. Uma vez conseguida a posição desejada do cateter seja obtida, cada artéria pode ser embolizada através da administração das composições anti-angiogénicas, como descrito acima.

De modo similar, pode realizar-se a embolização arterial numa variedade de outras condições, incluindo por exemplo, hemorragia aguda, anomalias vasculares, desordens no sistema nervoso central, hiperesplenismo.

Uso de Composições Anti-angiogénicas para Revestimento de Stents 34

Como notado acima, a presente invenção também pode ser usada para fornecer stents compreendendo uma estrutura geralmente tubular (que inclui, por exemplo, formas em espiral) cuja superfície está revestida com uma composição como acima descrito. Resumidamente, um stent é uma armação, usualmente de forma cilíndrica, que pode ser inserido numa passagem corporal (por exemplo, canais biliares) que tenha sido reduzida por um processo de doença (por exemplo, crescimento para dentro por um tumor) de forma a evitar o encerramento ou o re-encerramento da passagem. Os stents actuam fisicamente mantendo abertas as paredes da passagem corporal na qual estão inseridos.

Uma variedade de stents pode ser utilizada incluindo por exemplo, stents esofágicos, stents vasculares, stents biliares, stents pancreáticos, stents uretéricos e uretrais, stents lacrimais, stents de trompas de Eustáquio, stents de trompas de Falópio, e stents traquiais/bronquiais.

Os stents podem ser prontamente obtidos a partir de fontes comerciais, ou construídos de acordo com técnicas bem conhecidas. Exemplos representativos de stents incluem aqueles descritos na patente U.S. N°4,776,337, intitulada "Expandable Intraluminal Graft, and Method and Apparatus for Implanting and Expandable Intralumina Graft", patente U.S. 5,176,626, intitulada "Indwelling Stent" patente U.S. 5,147,370, intitulada "Nitinol Stent for Hollow Body Conduits", patente U.S. 5,064,435, intitulada "Self-Expanding Prosthesis Having Stable Axial Lenght", patente U.S. 5,052,998, intitulada "Indwelling Stent and Method of Use", e patente U.S 5,041,126, intitulada "Endovascular 35

Stent and Delivery System", todas elas sendo aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Os stents podem ser revestidos com composições anti-angiogénicas ou factores anti-angiogénicos de acordo com a presente invenção revestindo o stent com uma substância tal como um hidrogel que irá por sua vez absorver a composição anti-angiogénica (ou factor anti-angiogénico acima referido). É preferível que a composição adira firmemente ao stent durante o armazenamento e no momento da inserção, e não deve ser desalojada do stent quando o diâmetro é expandido do seu tamanho em colapso para o seu tamanho em expansão total. A composição anti-angiogénica preferivelmente também não se deve degradar durante o armazenamento, anteriormente à inserção, ou quando aquecida à temperatura corporal após expansão dentro do corpo. Adicionalmente, ela deve preferivelmente revestir o stent suave e regularmente com urna distribuição uniforme do inibidor angiogénico, sem modificar o contorno do stent. A composição anti-angiogénica deve fornecer uma libertação uniforme, previsível, prolongada do factor anti-angiogénico no tecido circundante do stent uma vez que este tenha sido disposto. Para stents vasculares, adicionalmente às propriedades acima referidas, a composição não deve tornar o stent trombogénico (causando a formação de coágulos sanguíneos), ou causar turbulência significativa no fluxo sanguíneo (mais do que se esperaria que o próprio stent causasse se não estivesse revestido). São fornecidos métodos para a expansão do lúmen de uma passagem corporal, compreendendo a inserção de um stent na passagem, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura estando revestida com uma 36 composição anti-angiogénica (ou um factor anti-angiogénico isoladamente), de tal forma que a passagem seja expandida. Uma variedade de situações são descritas abaixo nas quais o lúmen de uma passagem corporal é expandido de modo a eliminar uma obstrução biliar, esofágica, traquial/bronquial, uretral, ou vascular. Adicionalmente, um exemplo representativo é descrito mais detalhadamente abaixo no Exemplo 7.

Geralmente os stents devem ser inseridos de forma similar independentemente da localização ou doença a ser tratada. Em suma, um exame pré-inserção, usualmente um procedimento de diagnóstico por imagem, endoscopia, ou visualização directa no momento da cirurgia, é geralmente efectuado primeiro de forma a determinar o posicionamento adequado para a inserção do stent. Um arame condutor é então avançado através da lesão ou local de inserção proposto, e sobre este passa-se um cateter distribuidor que permite que seja introduzido um stent na sua forma em colapso. Tipicamente, é possível comprimir stents, de forma a que possam ser inseridos através de cavidades mínimas via pequenos cateteres e então expandidos para um diâmetro maior uma vez que estejam no local desejado. Uma vez expandido, o stent força fisicamente as paredes da passagem afastando-as e mantem-nas afastadas. Como tal, eles são capazes de inserção via uma pequena abertura, e ainda assim são capazes de manter aberta uma cavidade ou passagem de grande diâmetro. 0 stent pode ser de autoexpansão (por exemplo, Wallstent e Gianturco Stents), expansível em balão (por exemplo, stent Palmaz e stent Strecker), ou implantado por uma mudança na temperatura (por exemplo, stent Nitinol). 37

Os stents são tipicamente colocados no lugar sob controlo radiológico ou visual directo, tendo um cuidado particular em colocar o stent precisamente de um lado ao outro do estreitamento no órgão a ser tratado. 0 cateter dispensador é então removido deixando o stent posicionado por si próprio como uma armação. Um exame pós inserção, usualmente um raio X, é frequentemente utilizado para confirmar o posicionamento adequado. São fornecidos métodos para eliminar obstruções biliares, compreendendo a inserção de um stent biliar numa passagem biliar, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura sendo revestida por uma composição como acima descrito, de tal forma que a obstrução biliar é eliminada. Em resumo, o sobrecrescimento de um tumor do canal biliar comum resulta na icterícia colestática progressiva que é incompatível com a vida. Geralmente, o sistema biliar que drena bílis do fígado para o duodeno é com maior frequência obstruído por (1) um tumor composto por células do canal biliar (colangiocarcinoma), (2) um tumor que invade o canal biliar (e.g., carcinoma pancreático), ou (3) um tumor que exerce pressão extrínseca e comprime o canal biliar (por exemplo, nódulos linfáticos alargados).

Quer os tumores biliares primários, assim, como outros tumores que causam compressão da árvore biliar podem ser tratados utilizando os stents aqui descritos. Um exemplo de tumores biliares primários são os adenocarcinomas (que também são chamados de: tumores de Klatskin quando se encontram na bifurcação do canal hepático comum). Estes tumores também são designados de carcinomas biliares, coledocolangiocarcinomas ou adenocarcinomas do sistema 38 biliar: Tumores benignos que afectam o canal biliar (e.g., adenoma do sistema biliar) e, em casos raros, carcinomas celulares escamosos do canal biliar e adenocarcinomas da vesícula biliar, podem também causar compressão da árvore biliar e, deste modo, resultar em obstrução biliar.

Compressão da árvore biliar é com maior frequência devida a tumores do fígado e pâncreas que comprimem e, assim, obstruem os canais. A maioria dos tumores do pâncreas desenvolvem-se a partir de células dos canais pancreáticos. Esta é uma forma de cancro altamente fatal (5% de todas as mortes por cancro; 26 000 novos casos por ano nos E.U.A.) com uma média de 6 meses de sobrevivência e uma taxa de 1 ano de sobrevivência de apenas 10%. Quando estes tumores estão localizados na cabeça do pâncreas, eles causam frequentemente obstrução biliar e isto diminui significativamente a qualidade de vida do paciente. Enquanto todos os tipos de tumores pancráticos são geralmente designados de "carcinoma do pâncreas", existem subtipos histológicos, incluindo: adenocarcinoma, carcinoma adeno-escamoso, cistadeno-carcinoma e carcinoma celular acinoso. Tumores hepáticos, como discutido acima, podem também causar compressão da árvore biliar, e assim, causar obstrução dos canais biliares.

Um stent biliar deve ser primeiramente inserido numa passagem biliar de uma entre várias maneiras: a partir da extremidade de cima inserindo uma agulha através da parede abdominal e através do fígado (um colangiograma trans-hepático percutâneo ou "PTC" (percutaneous transhepatic cholangiogram)); a partir da extremidade de baixo inserindo uma cânula no canal biliar por meio de um endoscópio inserido pela boca, estômago ou duodeno (um colangiograma 39 retrógrado endoscópico ou "ERCP" (endoscopic retro cholangiogram)); ou por incisão directa durante um procedimento cirúrgico. Um exame pré-inserção PTC, ERCP ou visualização directa no momento da cirurgia deve geralmente ser executado para determinar a posição apropriada para a inserção do stent. Um arame condutor é então avançado através da lesão e sobre este passa-se um cateter distribuidor, para permitir a inserção do stent na sua forma colapsada. Se o exame diagnóstico foi um PTC, o arame condutor e o cateter distribuidor serão inseridos via parede abdominal, enquanto se o exame original foi um ERCP o stent será colocado via bocal. 0 stent é então posicionado sob controlo radiológico, endoscópico ou visual directo tendo um cuidado particular em colocá-lo precisamente ao longo do estreitamento do canal biliar. 0 cateter distribuidor será removido deixando o stent posicionado como uma armação que mantém o canal biliar aberto. Um colangiograrna posterior será executado para documentar se o stent está apropriadamente posicionado. São fornecidos métodos para eliminar obstruções esofágicas, compreendendo a inserção de um stent esofágico num esófago, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura sendo revestida por uma composição anti-angiogénica como acima descrito, de tal forma que a obstrução esofágica é eliminada. Em resumo, o esófago é o canal oco que transporta comida e líquidos da boca para o estômago. 0 cancro do esófago ou invasão cancerosa surgindo em orgão adjacentes (por exemplo, cancro do estômago ou do pulmão) resulta na impossibilidade de engolir comida ou saliva. Nesta modalidade, um exame pré-inserção, usualmente deglutição de bário ou endoscopia, deve geralmente ser executado de forma a determinar a posição apropriada para a 40 inserção do stent. Um cateter ou endoscópio pode então ser colocado na boca e um arame condutor é avançado sobre o bloqueio. Um cateter dispensador de stent é passado sobre o arame condutor sob controlo radiológico ou endoscópico e um stent é colocado precisamente ao longo do estreitamento no esófago. Um exame pós-inserção, usualmente raio X com deglutição de bário, pode ser utilizado para confirmar o posicionamento apropriado. São fornecidos métodos para eliminar obstruções traqueais/bronquiais, compreendendo a inserção de um stent traqueal/bronquial na traqueia ou brônquios, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da qual está revestida por uma composição anti-angiogénica como acima descrito, de tal forma que a obstrução traqueal/bronquial é eliminada. Em resumo, a traqueia e os brônquios são canais que transportam ar da boca e nariz para os pulmões. O bloqueio da traqueia pelo cancro, invasão cancerosa surgindo em orgâo adjacentes (por exemplo, cancro do pulmão), ou colapso da traqueia ou brônquios devido a condromalacia (enfraquecimento do anel de cartilagem) resulta na incapacidade de respirar. Nesta modalidade da invenção, um exame pré-inserção, usualmente uma endoscopia, deve geralmente ser executado de forma a determinar a posição apropriada para a inserção do stent. Um cateter ou endoscópio é então posicionado através da boca e um arame condutor é avançado para o bloqueio. Um cateter dispensador é então passado sobre o arame condutor de forma a permitir que um stent colapsado seja inserido. O stent é colocado sob controlo radiológico ou edoscópico de forma a ser colocado precisamente ao longo do estreitamento. O cateter dispensador pode então ser removido deixando o stent posicionado como uma armação por si próprio. Um exame pós- 41 inserção, usualmente uma broncoscopia, pode ser utilizado para confirmar o posicionamento apropriado. São fornecidos métodos para eliminar obstruções uretrais, compreendendo a inserção de um stent uretral numa uretra, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura sendo revestida por uma composição anti-angiogénica como acima descrito, de tal forma que a obstrução uretral é eliminada. Em resumo, a uretra é o tubo que drena a bexiga através do pénis. 0 estreitamento extrínseco da uretra enquanto ela passa através da próstata, devido à hipertrofia da próstata ocorre virtualmente em todos os homens após os 60 anos e causa uma dificuldade progressiva em urinar. Nesta modalidade, um exame pré- inserção, usualmente uma endoscopia ou uretrograma, deve geralmente ser executado primeiro de forma a determinar a posição apropriada para a inserção do stent, que se situa acima do esfincter urinário externo na extremidade inferior e perto do fluxo com o colo da bexiga na extremidade superior. Um endoscópio ou cateter é então posicionado através da abertura peniana e um arame condutor é avançado para dentro da bexiga. Um cateter distribuidor é então passado sobre o arame condutor de forma a permitir a inserção do stent. O cateter distribuidor é então removido e o stent é expandido para o local. Um exame pós-inserção, usualmente endoscopia ou uretrograma retrogrado, pode ser utilizado para confirmar o posicionamento apropriado. São providenciados métodos para eliminar obstruções vasculares, compreendendo a inserção de um stent vascular num vaso sanguíneo, o stent tendo uma estrutura geralmente tubular, a superfície da estrutura sendo revestida por uma composição anti-angiogénica como acima descrito, de tal 42 forma que a obstrução vascular é eliminada. Em resumo, podem ser colocados stents numa ampla variedade de vasos sanguíneos, quer artérias, quer veias, para prevenir a estenose recorrente no local de angioplastias falhadas, para tratar estreitamentos que provavelmente falhariam se tratados com angioplastia e para tratar estreitamentos pós-cirúrgicos (por exemplo, estenose de enxerto para diálise). Exemplos representativos de localizações adequadas incluem as artérias ilíaca, renais e coronária, a veia cava superior e em enxertos para diálise. Numa modalidade, é primeiro executada uma angiografia de forma a localizar o local para a colocação do stent. Isto é tipicamente obtido injectando contraste radiopaco, através de um cateter inserido numa artéria ou veia enquanto é feito um raio X. Um cateter pode então ser inserido quer percutaneamente ou cirurgicamente para dentro da artéria femoral, da artéria braquial, ou veia femoral ou veia braquial e avançado para dentro do vaso sanguíneo apropriado pela condução através do sistema vascular sob orientação fluoroscópica. Um stent pode então ser posicionado ao longo da estenose vascular. Um angiograma pós-inserção pode também ser utilizado de forma a confirmar o posicionamento apropriado.

Utilização_de_Composições_Anti-anqiogénicas_em

Procedimentos Cirúrgicos

Como referido acima, composições anti-angiogénicas podem ser utilizadas numa ampla variedade de procedimentos cirúrgicos. Por exemplo, uma composição anti-angiogénica (na forma de, por exemplo, um spray ou filme) pode ser utilizada para revestir ou pulverizar uma área antes da remoção de um tumor, de modo a isolar tecidos circundantes normais do tecido maligno, e/ou para prevenir o alastramento da doença aos tecidos vizinhos. As composições 43 anti-angiogénicas (por exemplo, sob a forma de um spray) podem ser fornecidas via procedimentos endoscópicos de modo a revestir tumores, ou inibir a angiogénese num local desejado. As malhas cirúrgicas que tenham sido revestidas com composições anti-angiogénicas da presente invenção podem ser utilizadas em qualquer procedimento no qual uma malha cirúrgica possa ser utilizada. Por exemplo, uma malha cirúrgica carregada com uma composição anti-angiogénica pode ser utilizada durante uma cirurgia de ressecção ao cancro abdominal (por exemplo, subsequente à ressecção do cólon) de modo a providenciar um suporte à estrutura, e para libertar uma quantidade do factor anti-angiogénico. São providenciados métodos para tratar locais de excisão de tumores, compreendendo a administração de uma composição anti-angiogénica, como descrito acima, às margens da ressecção de um tumor subsequente à excisão, de tal forma que a recorrência local do cancro e a formação de novos vasos sanguíneos no local é inibida. Numa modalidade da invenção, a(s) composição(ões) anti-angiogénica(s) (ou factores anti-angiogénicos sozinhos) são administradas directamente ao local de excisão do tumor (e.g., aplicado por enxugamento, escovamento ou, doutro modo, revestindo as margens de ressecção do tumor com a(s) composição(ões) ou factor(es) anti-angiogénico(s)). Alternativamente, a(s) , composição(ões) ou factor (es) anti-angiogénico (s) pode ser incorporados em pastas cirúrgicas conhecidas antes da administração. As composições anti-angiogénicas são preferivelmente aplicadas após ressecções hepáticas para malignidade e após operações neuro-cirúrgicas.

As composições anti-angiogénicas (como descrito acima) podem ser administradas à margem de ressecção de uma ampla 44 variedade de tumores, incluindo por exemplo, tumores da mama, do cólon, do cérebro e hepáticos. Por exemplo, podem ser administradas composições anti-angiogénicas ao local de um tumor neurológico subsequente à excisão, de tal forma que a formação de novos vasos sanguíneos no local seja inibida. Resumidamente, o cérebro é altamente e funcionalmente localizado: i.e., cada região anatómica especifica é especializada para efectuar uma função especifica. Deste modo, a localização da patologia cerebral é frequentemente mais importante do que o tipo. Uma lesão relativamente pequena numa área chave pode ser de longe mais devastadora do que uma lesão muito maior numa área de menor importância. Similarmente, uma lesão na superfície do cérebro pode ser fácil de resseccionar cirurgicamente; enquanto o mesmo tumor localizado profundamente no cérebro pode não o ser (ter-se-ia que cortar através de demasiadas estruturas vitais para lhe chegar). Também, mesmo tumores benignos podem ser perigosos por diversas razões: eles podem crescer numa área chave e causar danos significativos; mesmo se eles pudessem ser curados por ressecção cirúrgica isto poderia não ser possível; e finalmente, se deixados por verificar eles podem causar um aumento da pressão intracraniana. 0 crânio é um espaço fechado incapaz de expansão. Deste modo, se algo está a crescer num local, então algo deverá estar à ser comprimido noutro local - o resultado é um aumento da pressão no crânio ou um aumento da pressão intracraniana. Se tal condição for deixada sem tratamento, estruturas vitais podem ser comprimidas resultando em morte. A incidência em malignidades do SNC (sistema nervoso central) é de 8-16 por 100 000. O prognóstico da malignidade primária do cérebro é sombrio, com um tempo de sobrevivência médio de menos de um ano, mesmo após ressecção cirúrgica. Estes tumores, 45 especialmente gliomas são predominantemente uma doença local que recorre no espaço de 2 cm do foco original da doença após remoção cirúrgica.

Exemplos representativos de tumores cerebrais que podem ser tratados utilizando as composições e métodos aqui descritos incluem: Tumores Gliais (tais como Astrocitoma Anaplástico, Glioblastoma Multiforme, Astrocitoma Pilocitico, Oligodendroglioma, Ependimoma, Ependimoma Mixopapilar, Subependimoma, Papiloma do Plexo Coroideu); Tumores Neuronais (por exemplo, Neuroblastoma, Ganglioneuroblastoma, Ganglioneuroma e Meduloblastoma); Tumores da Glândula Pineal (por exemplo, Pineoblastoma, Pineocitoma); Tumores Meninqeos (Meningioma, Hemangiopericitoma Meningeo, Sarcoma Meningeo): Tumores das Bainhas das Células Nervosas (por exemplo, Schwanoma (Neurolemoma) e Neurofibroma); Linfomas (por exemplo, Linfoma de Hodgkin e Linfoma Não-Hodgkin (incluindo numerosos subtipos, quer primários quer secundários); Tumores Malformativos (por exemplo, Craniofaringioma, Quistos Epidermóides, Quistos Dermóides e Quistos Colóides); e tumores Metastáticos (que podem ser derivados virtualmente de qualquer tumor, os mais comuns derivando de tumores do pulmão, mama, melanoma, rim e do tracto gastrointestinal) . OUTROS USOS TERAPÊUTICOS DAS COMPOSIÇÕES ANTI-ANGIOGÉNICAS Além dos tumores, numerosas outras doenças angiogénico- dependentes não-tumorogénicas que se caracterizam pelo crescimento anormal de vasos sanguíneos podem também ser tratadas com as composições anti-angiogénicas da presente invenção. Exemplos representativos de tais doenças angiogénico-dependentes não-tumorogénicas incluem 46 neovascularização córnea, cicatrizes e quelóides hipertróficas, retinopatia diabética proliferativa, artrite reumatóide, malformações arteriovenosas (acima discutidas), placas ateroscleróticas, cicatrização retardada, articulações hemofílicas, fracturas não unidas, síndroma de Osler-Weber, psoríase, granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma, menorragia (acima discutida) e adesões vasculares.

Em particular, são fornecidos métodos para tratar a neovascularização córnea (incluindo neovascularização córnea de enxertos), através de uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica (como acima descrito) à córnea, de tal modo que a formação de vasos sanguíneos seja inibida. Resumidamente, a córnea é um tecido que normalmente carece de vasos sanguíneos. Em determinadas condições patológicas, contudo, podem estender-se capilares para dentro da córnea a partir do plexo vascular pericorneal do limbo. Quando a córnea se torna vascularizada, também se torna enevoada, resultando num declínio da acuidade visual do paciente. A perda visual pode tornar-se completa se a córnea ficar completamente opaca.

Os vasos sanguíneos podem entrar na córnea numa variedade de padrões e profundidades, dependendo do processo que incita a neovascularização. Estes padrões têm sido tradicionalmente definidos pelos oftalmologistas nos seguintes tipos: pano tracomatoso, pano leproso, pano filctenuloso, pano degenerativo e pano glaucomatoso. 0 estroma córneo pode também ser invadido por ramificações da artéria ciliar anterior (designada vascularização intersticial) que causa várias lesões clínicas distintas: curvas terminais, um padrão "tipo-escova", uma forma em 47 umbela, uma forma látice, arcadas intersticiais (a partir de vasos episclerais) e vasos irregulares aberrantes.

Uma ampla variedade de desordens pode resultar em neovascularização córnea, incluindo, por exemplo, infecções córneas (por exemplo, tracoma, queratite de herpes simplex, leishmaniose e oncocerciase), processos imunológicos (por exemplo, rejeição de enxertos e síndroma de Stevens-Johnson), queimaduras alcalinas, trauma, inflamação (de qualquer causa), estados de deficiência tóxica e nutricional e como uma complicação do uso de lentes de contacto.

Enquanto a causa da neovascularização córnea pode variar, a resposta da córnea ao insulto e ao subsequente crescimento vascular para dentro é similar, independentemente da causa. Resumidamente, a localização do dano parece ser importante já que apenas aquelas lesões situadas a uma distância crítica do limbo irão incitar uma resposta angiogénica. Isto deve-se provavelmente ao facto de que os factores angiogénicos responsáveis por incitarem à invasão vascular são criados no local da lesão e devem difundir-se para o local dos vasos sanguíneos mais próximos (o limbo) de forma a exercer o seu efeito. Decorrida uma determinada distância a partir do limbo, isto já não será possível e o endotélio límbico não será induzido a crescer para dentro da córnea. É provável que vários factores angiogénicos estejam envolvidos neste processo, muitos dos quais são produto da resposta inflamatória. De facto, a neovascularização da córnea parece apenas ocorrer em associação com um infiltrado celular inflamatório e o grau de angiogéneze é proporcional à extensão da reacção inflamatória. O edema córneo facilita adicionalmente o crescimento para dentro 48 dos vasos sanguíneos libertando a estrutura do estroma córneo, e fornecendo uma via de "resistência mínima" através da qual os capilares podem crescer. A seguir à reacção inflamatória inicial, o crescimento capilar para dentro da córnea ocorre da mesma forma que ocorre em outros tecidos. As células endoteliais normalmente inactivas dos capilares e veias límbicas são estimuladas a dividir-se e a migrar. As células endoteliais projectam-se para além dos vasos de origem, digerem a membrana pavimentosa circundante e o tecido através do qual irão circular, e migrar em direcção à fonte de estímulo angiogénico. As germinações da extremidade cega adquirem um lúmen e unem-se por anastomose para formar curvas capilares. 0 resultado final é o estabelecimento de um plexo vascular dentro do estroma córneo.

Composições anti-angiogénicas da presente invenção são úteis pelo bloqueio dos efeitos estimuladores dos promotores angiogénicos, reduzindo a divisão celular endotelial, diminuindo a migração celular endotelial, e diminuindo a actividade das enzimas proteolíticas segregadas pelo endotélio.

Em modalidades particularmente preferidas da invenção, o factor anti-angiogénico pode ser preparado para administração tópica em solução salina (combinado com qualquer dos conservante e agentes anti-microbiais normalmente usados em preparações oculares) e administrada na forma de gotas para os olhos. A solução do factor anti-angiogénico pode ser preparada na sua forma pura e administrada várias vezes ao dia. Alternativamente, composições anti-angiogénicas, preparadas como descrito 49 acima, podem também ser administradas directamente sobre a córnea. Numa das modalidades preferidas, a composição anti-angiogénica é preparada com um polímero muco-adesivo o qual se liga à córnea. Os factores anti-angiogénicos ou composições anti-angiogénicas podem ser utilizadas como um complemento à terapia esteróide convencional. A terapia tópica pode também ser profilacticamente útil em lesões córneas que são conhecidas por terem uma elevada probabilidade de indução de uma resposta angiogénica (tal como queimaduras químicas). Nestes casos, o tratamento provavelmente em combinação com esteróides, pode ser instituído imediatamente para ajudar a prevenir complicações subsequentes.

As composições anti-angiogénicas acima descritas podem ser injectadas directamente para dentro do estroma córneo por um oftalmologista sob orientação microscópica. O local preferido para a injecção pode variar com a morfologia da lesão individual, mas o objectivo da administração será colocar a composição na frente de avanço da vasculatura (por exemplo, disseminada entre os vasos sanguíneos e a córnea normal). Na maioria dos casos isto envolveria injecção córnea perilímbica para "proteger" a córnea do avanço dos vasos sanguíneos. Este método pode também ser utilizado pouco tempo após uma agressão à córnea, de forma a profilacticamente prevenir a neovascularização córnea. Nesta situação o material pode ser injectado na córnea perilímbica disseminado entre a lesão córnea e o seu fornecimento de sangue límbico potencial indesejado. Tais métodos podem também ser utilizados de uma forma similar para prevenir a invasão capilar de córneas transplantadas. Numa forma de libertação sustida, podem ser necessárias 50 injecções apenas 2-3 vezes ao ano. Também pode ser adicionado um esteróide à solução de injecção para reduzir a inflamação resultante da própria injecção. São fornecidos métodos para tratar cicatrizes hipertróficas e quelóides, compreendendo o passo de administrar uma das composições anti-angiogénicas acima descritas a um quelóide ou cicatriz hipertrófica.

Resumidamente, a cura de ferimentos e a formação de cicatriz ocorre em três fases: inflamação, proliferação e maturação. A primeira fase, inflamação, ocorre em resposta a uma agressão que é suficientemente severa para romper a pele. Durante esta fase, que dura de 3 a 4 dias, o sangue e o fluido de tecido formam um coágulo adesivo e rede fibrinosa que serve para unir as superfícies do ferimento. Isto é então seguido por uma fase proliferativa na qual se dá um crescimento interno de capilares e tecido conjuntivo a partir das margens do ferimento e fecho da falha na pele. Finalmente, uma vez que a proliferação capilar e fibroblástica tenha terminado, inicia-se o processo de maturação, no qual a cicatriz se contrai e se torna menos celular, menos vascular e toma um aspecto plano e branco. Esta fase final pode durar entre 6 a 12 meses.

Se for produzido demasiado tecido conectivo e o ferimento permanecer persistentemente celular, a cicatriz pode tornar-se encarnada e saliente. Se a cicatriz permanecer nas fronteiras do ferimento original é designada de cicatriz hipertróf ica, mas se se estender para além da cicatriz original e para dentro do tecido circundante, a lesão designa-se de quelóide. Cicatrizes hipertróficas e quelóides são produzidos durante a segunda e terceira fase 51 de cicatrização. Vários tipos de ferimentos tendem particularmente para a excessiva proliferação endotelial e fibroblástica, incluindo queimaduras, feridas abertas, e ferimentos infectados. Nas cicatrizes hipertróficas ocorre algum grau de maturação e tem lugar uma melhoria gradual. Contudo, no caso dos quelóides, é produzido um verdadeiro tumor que se pode tornar bastante grande. Uma melhoria espontânea em tais casos raramente ocorre.

Assim, as composições anti-angiogénicas, como acima descrito, devem ser directamente injectadas na cicatriz hipertrófica ou quelóide, de forma a evitar a progressão destas lesões. A frequência das injecções irá depender da cinética de libertação do polímero usado (caso esteja presente) e da resposta clínica. Esta terapia tem particular valor no tratamento profilático de condições que são conhecidas por resultar no desenvolvimento de cicatrizes hipertróficas e quelóides (e.g., queimaduras) e inicia-se preferivelmente após a fase proliferativa ter tido tempo de progredir (aproximadamente 14 dias após a lesão inicial), mas antes do desenvolvimento da cicatriz hipertrófica ou quelóide. São fornecidos métodos para tratar glaucoma neovascular, compreendendo o passo de administrar uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica ao olho, de tal forma que a formação de vasos sanguíneos seja inibida.

Resumidamente, o glaucoma neovascular é uma condição patológica na qual se desenvolvem novos capilares na íris do olho. A angiogénese usualmente tem origem nos vasos localizados na margem pupilar e progride ao longo da raiz 52 da íris e para dentro da malha trabecular. Fibroblastos e outros elementos do tecido conjuntivo estão associados com o crescimento capilar e desenvolve-se uma membrana fibrovascular que se estende ao longo da superfície anterior da íris. Eventualmente, este tecido atinge o ângulo da câmara anterior onde se forma a sinéquia. Estas sinéquias por seu lado coalescem, cicatrizam e contraiem-se para finalmente fecharem o ângulo da câmara anterior. A formação de cicatriz impede a drenagem adequada do humor aquoso através do ângulo e para dentro da malha trabecular; resultando num aumento da pressão intra-ocular que pode provocar cegueira. 0 glaucoma neovascular geralmente ocorre como uma complicação de doenças nas quais a isquémia retinal é predominante. Em particular, cerca de um terço dos pacientes com esta desordem têm retinopatia diabética e 28% têm oclusão da veia retinal central. Outras causas incluem deslocamento retinal crónico, glaucoma terminal, doença obstrutiva da artéria carótida, fibroplasia retrolenticular, anemia hemolítica, tumores intra-oculares e fístulas cavernosas da carótida. Na sua fase inicial, o glaucoma neovascular pode ser diagnosticado através da biomicroscopia de lâmpada de fenda de alta ampliação, na qual revela pequenos capilares dilatados e desorganizados (que vertem fluoresceína) na superfície da íris. Gonioscopia posterior demonstra obliteração progressiva do ângulo da câmara anterior por bandas fibrovasculares. Enquanto o ângulo da câmara anterior ainda está aberto, podem ser úteis terapias conservadoras. Contudo, uma vez que o ângulo feche é necessária uma intervenção cirúrgica de forma a aliviar a pressão. 53

Assim, as composições anti-angiogénica, como acima descritas, podem ser administrados topicamente ao olho de forma a tratar formas precoces de glaucoma neovascular.

Podem ser implantadas composições anti-angiogénicas por injecção da composição na região do ângulo da câmara anterior. Isto fornece um aumento localizado sustentado de factor anti-angiogénico e evita o avanço de vasos sanguíneos para dentro dessa área. Composições anti-angiogénicas implantadas ou injectadas, que são colocadas entre os capilares da íris que aumentam e o ângulo da câmara anterior, podem "defender" o ângulo aberto da neovascularização. Já que os capilares não irão crescer num raio significativo da composição anti-angiogénica, pode ser mantida a evidência do ângulo. A composição anti-angiogénica pode também ser colocada em qualquer localização, de tal forma que o factor anti-angiogénico é continuamente libertado no humor aquoso. Isto iria aumentar a concentração do factor anti-angiogénico dentro do humor, que por sua vez banha a superfície da íris e os seus capilares anormais, fornecendo assim outro mecanismo através do qual o medicamento é libertado. Estas modalidades terapêuticas podem também ser úteis profilacticamente e em combinação com outros tratamentos existentes. São fornecidos métodos para tratar a retinopatia diabética proliferativa, compreendendo o passo de administrar uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica aos olhos, de tal forma que a formação de vasos sanguíneos seja inibida. 54

Resumidamente, pensa-se que a patologia de retinopatia diabética seja similar ao que foi acima descrito para o glaucoma neovascular. Em particular, pensa-se que uma retinopatia diabética de base se possa converter numa retinopatia diabética proliferativa sob a influência de hipoxia retinal. Geralmente, o tecido neovascular emerge do nervo óptico (usualmente a 10 mm da margem) e da superfície da retina em regiões em que a perfusão de tecido é escassa. Inicialmente, os capilares crescem entre a membrana limitante interna da retina e a superfície posterior do vítreo. Eventualmente, os vasos crescem para dentro do vítreo e através da membrana limitante interna. À medida que o vítreo se contrai é exercida tracção sobre os vasos, resultando frequentemente em corte dos vasos e cegueira do vítreo devido a hemorragia. A tracção fibrosa derivada da cicatrização na retina também pode produzir deslocamento da retina. A terapia convencional de escolha é a fotocoagulação panretinal para diminuir o tecido retinal e desse modo diminuir a exigência de oxigénio da retina. Embora inicialmente eficaz, tem uma alta taxa de recaída com formação de novas lesões noutras partes da retina. Complicações desta terapia incluem uma diminuição na visão periférica em 50% dos pacientes, abrasões mecânicas da córnea, formação de cataratas induzidas pelo laser, glaucoma agudo e estimulação do crescimento neovascular subretinal (que pode resultar em perda de visão) Assim, este procedimento é executado apenas quando estão presentes vários factores de risco e a razão risco-benefício é claramente a favor da intervenção. 55

Deste modo, a retinopatia diabética proliferativa pode ser tratada através da injecção de um factor(es) anti-angiogénico (s) (ou composição anti-angiogénica) para dentro do humor aquoso ou do vitreo, de forma a aumentar a concentração local de factor anti-angiogénico na retina. Este tratamento deve ser iniciado, preferivelmente, antes do desenvolvimento de doença grave requerendo fotocoagulação. As artérias que alimentam lesões neovasculares também podem ser embolizadas (utilizando composições anti-angiogénicas, como acima descrito). São fornecidos métodos para tratar fibroplasia retrolenticular, compreendendo o passo de administrar uma quantidade terapeuticamente efectiva de um factor anti-angiogénico (ou unia composição anti-angiogénica) ao olho, de tal forma que a formação de vasos sanguíneas seja inibida.

Resumidamente, fibroplasia retrolenticular é uma condição que ocorre em crianças prematuras que recebem oxigenoterapia. A vasculatura retinal periférica, particularmente no lado temporal, não se forma completamente até ao final da vida fetal. Oxigénio excessivo (mesmo niveis que seriam fisiológicos a termo) e a formação de radicais livres de oxigénio são considerados como sendo importantes por causar danos aos vasos sanguíneos da retina imatura. Estes vasos contraiem-se e então tornam-se estruturalmente obliterados à exposição ao oxigénio. Consequentemente, a retina periférica falha em vascularizar e segue-se a isquémia retinal. Em resposta à isquémia, é induzida a neovascularização na junção da retina normal e isquémica. 56

Em 75% dos casos estes vasos regridem espontaneamente. Contudo, nos 25% restantes existe um crescimento capilar continuado, contracção do componente fibrovascular e tracção quer nos vasos quer na retina. Isto resulta em hemorragia vítrea e/ou deslocamento retinal que pode conduzir à cegueira. Glaucoma neovascular de ângulo fechado também é uma complicação desta condição.

Como é frequentemente impossível determinar que casos é que se irão resolver espontaneamente e quais irão progredir em gravidade, um tratamento convencional (i.e., cirurgia) é geralmente iniciado apenas em pacientes com doença confirmada e uma patologia bem desenvolvida. Esta abordagem "esperar para ver" impede a intervenção precoce e permite a progressão da doença nos 25% que seguem uma evolução complicada. Deste modo, a administração tópica de factores anti-angiogénicos (ou composições anti-angiogénicas, como descrito acima) pode ser efectuada em crianças que estão em alto risco de desenvolver esta condição numa tentativa de reduzir a incidência da progressão da fibroplasia retrolenticular. Noutras modalidades, podem ser também utilizadas injecções intravítreas e/ou implantes intra-oculares de uma composição anti-angiogénica. Tais métodos são particularmente preferidos em casos de doença confirmada, de forma a reduzir a necessidade de cirurgia. São fornecidos métodos para tratar artrite reumatóide, compreendendo o passo de administrar uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma composição anti-angiogénica a uma articulação, de tal forma que a formação de vasos sanguíneos seja inibida. 57

Resumidamente, na artrite reumatóide o dano articular deve-se a uma combinação de inflamação (incluindo glóbulos brancos e derivados dos glóbulos brancos) e desenvolvimento do tecido do pano (um tecido composto de tecido neovascular, tecido conjuntivo e células inflamatórias). Geralmente, inflamação crónica em si própria é insuficiente para resultar em dano da superfície da articulação, mas é criado um défice permanente uma vez que o tecido fibrovascular digere o tecido da cartilagem.

As composições anti-angiogénicas, como acima descritas, podem ser administrados por injecção intra-articular, como uma pasta cirúrgica, ou como um agente oral (por exemplo, contendo a talidomida como factor anti-angiogénico), de forma a inibir a formação de vasos sanguíneos dentro da articulação. Um exemplo representativo de tal método é apresentado mais detalhadamente abaixo no Exemplo 19.

Como acima referido, são fornecidos enxertos vasculares compreendendo um canal sintético, cuja superfície está revestida por uma composição anti-angiogénica como acima descrito. Resumidamente, enxertos vasculares são canais sintéticos, usualmente feitos de Dacron ou Gortex, inseridos cirurgicamente para realizar um bypass em obstruções arteriais, mais frequentemente a partir da aorta para a artéria femoral ou da artéria femoral para a artéria popliteal. Um problema fundamental que complica particularmente os enxertos de bypass femoral-popliteal é a formação de uma reacção tipo cicatriz subendotelial na parede do vaso sanguíneo denominada hiperplasia neointimal, que estreita o lúmen dentro e adjacente a ambas as extremidades do enxerto e que pode ser progressiva. Um enxerto revestido com ou contendo factores anti- 58 angiogénicos (ou composições anti-angiogénicos, como acima descrito) pode ser utilizado para limitar a formação de hiperplasia neointimal em ambas as extremidades do enxerto. 0 enxerto pode então ser cirurgicamente colocado por técnicas convencionais de colocação de bypass.

As composições anti-angiogénicas da presente invenção podem também ser utilizadas numa variedade de outras formas. Por exemplo, podem ser incorporadas em suturas cirúrgicas de forma a prevenir granulomas associados a pontos, implantadas no útero (do mesmo modo que um DIU) para o tratamento da menorragia ou como uma forma de controlo da natalidade feminina, administradas quer sob a forma de um fluido de lavagem peritoneal ou para implante peritoneal no tratamento da endometriose, ligadas a um anticorpo monoclonal direccionado contra células endoteliais activadas como uma forma de quimioterapia sistémica, ou utilizadas no diagnóstico por imagem quando ligado a um anticorpo monoclonal radioactivamente marcado o qual reconhece as células endoteliais activadas.

Os exemplos seguintes são apresentados de modo ilustrativo, e não de modo limitativo. EXEMPLOS EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE FACTOR ANTI-INVASIVO A posta dianteira e o crânio de um cação são excisados, depois raspados com um bisturi de forma a remover todo o músculo e tecido conjuntivo associado a partir da cartilagem. A cartilagem é então homogeneizada com um 59 moinho de tecido e extraída por movimento contínuo à temperatura ambiente durante 2 a 5 dias numa solução contendo 2,0 M de hidrocloreto de guanidinio e 0,02 M de MES num pH de 6,0.

Após 2 a 5 dias, o extracto de cartilagem é passado através de um filtro de gaze de forma a remover os constituintes mais grosseiros. O filtrado é então passado através de uma unidade de ultrafiltração Amicon que utiliza cartuchos de membranas em espiral com um corte de peso molecular de 100 000. O filtrado (contendo proteínas com um peso molecular de menos de 100 000 daltons) é então dialisado contra um tampão de 0,02 M MES (pH 6) com uma unidade de ultrafiltração Amicon que retém proteínas com um peso molecular superior a 3 000 daltons. Utilizando este método, proteínas e constituintes de baixo peso molecular são removidos, assim como excessivas quantidades de HCI de guanidinio. O dialisado é concentrado numa concentração final de 9 mg/mL. EXEMPLO 2

ANÁLISE DE VÁRIOS AGENTES PARA ACTIVIDADE ANTI-ANGIOGÉNICA A. Ensaios da Membrana CorioalaNtóide de Pinto ("Cam") Embriões fertilizados de pinto doméstico foram incubados durante 3 dias antes da cultura sem casca. Neste procedimento, os conteúdos do ovo foram esvaziados por remoção da casca localizada em redor do espaço aéreo. A membrana da casca interior foi então desunida e a extremidade oposta da casca foi perfurada para permitir que os conteúdos do ovo deslizem suavemente pela ponta furada. Os conteúdos do ovo foram esvaziados para dentro de tigelas de vidro esterilizadas de fundo redondo e cobertas com 60 tampas de placas de petri. Estas foram então colocadas numa incubadora com uma humidade relativa de 90% e 3% de C02 e incubadas durante 3 dias.

Foi misturado Taxol (Sigma, St. Louis, MI) em concentrações de 1, 5, 10, 30 mg por aliquota de 10 mL de metilcelulose a 0,5% aquosa. Já que o taxol e insolúvel na água, foram utilizadas contas de vidro para produzir partículas finas. Alíquotas de dez microlitros desta solução foram secadas em parafilme durante 1 hora formando discos de 2 mm de diâmetro. Os discos secos contendo taxol foram então cuidadosamente colocados na extremidade crescente de cada CAM no 6o dia de incubação. Obtiveram-se controlos colocando discos de metilcelulose sem taxol nos CAMs durante o mesmo período de tempo. Após uma exposição de 2 dias (8o dia de incubação) a vasculatura foi examinada com a ajuda de um estereomicroscópio. Foi injectado Lyposin II, uma solução opaca branca, na CAM para aumentar a visibilidade dos detalhes vasculares. A vasculatura de embriões vivos sem corante foi visualizada usando um estereomicroscópio Zeiss que foi conjugado com uma câmara de vídeo (Dage-MTI Inc., Cidade de Michigan, IN). Estes sinais de vídeo foram então exibidos numa ampliação de 160 vezes e capturados usando um sistema de análise de imagem (Vidas, Kontron; Etching, Alemanha). Foram então feitos negativos das imagens num gravador de gráficos (Modelo 3000; Matrix Intruments, Orangeburg, NY) .

As membranas de um embrião sem casca de 8 dias de idade foram submersas em glutaraldeído a 2% num tampão cacodilato de Na 0,1 M; fixante adicional foi injectado sob a CAM. Após 10 minutos in situ, a CAM foi removida e colocada em fixante fresco durante 2 horas à temperatura ambiente. O 61 tecido foi então deixado a lavar durante noite em tampão cacodilato contendo sacarose a 6%. As áreas de interesse foram fixadas posteriormente em 1% de tetróxido de ósmio durante 1,5 horas a 4°C. Os tecidos foram então desidratados numa série de graus de etanol, com permuta de solvente com óxido de propileno e embebido em resina Spurr. Secções finas foram cortadas com uma faca de diamante, colocadas em grelhas de cobre, coradas e examinadas num microscópio electrónico Joel 1200EX. Similarmente, foram cortadas secções de 0,5 mm e coradas com tolueno azul para microscopia óptica.

No 11° dia de desenvolvimento, os embriões de pinto foram usados para a técnica de fundição por corrosão. Foi injectada resina Mercox (Ted Pella, Inc., Redding, CA) para dentro da vasculatura CAM utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 30. O material de fusão consistia em 2.5 gramas de polímero CL-2B Mercox e 0,05 gramas de catalisador (55% de peróxido de benzoílo) tendo um tempo de polimerizaçâo de 5 minutos. Após a injecção, deixou-se ficar o plástico in situ durante uma hora à temperatura ambiente e em seguida durante a noite numa estufa a 65°C. A CAM foi então colocada numa solução aquosa de hidróxido de sódio a 50% para digerir todos os componentes orgânicos. Os plásticos fundidos foram lavados extensivamente em água destilada, secados com ar, revestidos com ouro/paládio, e observados com o microscópio electrónico de varrimento Philips 501B.

Os resultados das experiências acima são apresentados nas Figuras 1-4. Em resumo, as características gerais da cultura de ovos sem casca de pinto normal são apresentadas na Figura IA. No 6o dia de incubação, o embrião está centralmente posicionado numa rede de vasos sanguíneos em 62 expansão radial; a CAM desenvolve-se adjacentemente ao embrião. Estes vasos crescentes situam-se perto da superfície e são imediatamente visíveis tornando este sistema um modelo idealizado para o estudo da angiogénese. Redes capilares vivas e sem corante da CAM podem ser visualizadas de forma não invasiva com um estereomicroscópio. A Figura 1B ilustra uma tal área vascular na qual os elementos celulares do sangue dentro dos capilares foram gravados com o uso de uma interface vídeo/computador. A arquitectura tri-dimensional de tais redes capilares de CAM é apresentada através do método de fundição por corrosão e visualizado no microscópio electrónico de varrimento (Figura 1C) . Estas fusões revelaram vasos subjacentes que se projectam em direcção à superfície da CAM onde formam uma única camada de capilares anastomóticos.

Secções transversais da CAM mostram uma ectoderme exterior consistindo de uma dupla camada de células, uma camada mesodermal mais espessa contendo capilares subjacentes à ectoderme, células adventícias, e uma camada celular endodérmica interna, única (Figura 1D). Ao nível do microscópio electrónico, são demonstrados os detalhes estruturais típicos dos capilares da CAM. Tipicamente, estes vasos situam-se em associação próxima com a camada de células interna da ectoderme (Figura 1E).

Após 48 horas de exposição a taxol em concentrações de 1, 5, 10 ou 30 mg cada CAM foi examinada in vivo com um estereomicroscópio equipado com uma interface de câmara de vídeo/computador de forma a avaliar os efeitos na angiogénese. Esta estrutura de imagem foi usada numa ampliação de 160 vezes que permitia a visualização directa 63

das células sanguíneas dentro dos capilares; deste modo, o fluxo sanguíneo em áreas de interesse poderia ser facilmente avaliado e gravado. Neste estudo, a inibição da angiogénese foi definida como uma área da CAM desprovida de uma rede capilar variando de 2 a 6 mm de diâmetro. As áreas de inibição carecem de fluxo sanguíneo vascular e, assim, foram apenas observadas sob condições experimentais de metilcelulose contendo taxol; sob condições de controlo de discos carecendo de taxol não houve qualquer efeito no desenvolvimento do sistema capilar. Os dados experimentais, segundo as doses, dos efeitos do taxol em concentrações diferentes são apresentados na Tabela II

TABELA II

Inibição Angiogénica por Taxol Concentração Taxol pg Embriões Avaliados (Positivo/Total) % de Inibição 30 31/31 100 10 16/21 76 5 18/25 72 1 6/15 40 Controlo 0/30 0 São apresentadas CAMs típicas tratadas com taxol (Figuras 2A e 2B) com o disco de metilcelulose transparente posicionado centralmente sobre a zona avascular medindo 6mm de diâmetro. Numa amplificação ligeiramente maior, a periferia de tais zonas avasculares é claramente evidente (Figura 2C) ; os vasos funcionais circundantes foram frequentemente redireccionados para longe da fonte de taxol (Figuras 2C e 2D) . Tal redireccionamento angular do fluxo sanguíneo nunca foi observado em condições normais. Outra característica dos efeitos do taxol foi a formação de ilhas sanguíneas dentro da zona avascular representando a agregação de células sanguíneas. 64

As alterações morfológicas associadas da CAM tratada com taxol são imediatamente evidentes tanto ao nível do microscópio óptico como no electrónico. Por conveniência de apresentação, são apresentadas três fases distintas da transição geral do estado normal para o estado avascular. Perto da periferia da zona avascular a CAM é marcada com contraste por uma abundância de células mitóticas entre todas as três camadas germinais (Figuras 3A e 4A) . Esta divisão mitótica realçada foi também uma observação consistente para as células endoteliais capilares. Contudo, as células endoteliais permaneceram juncionalmente intactas sem extravasamento das células sanguíneas. Com degradação posterior, a CAM caracteriza-se pelo colapso e dissolução dos capilares (Figuras 3B e 4B) . As células endoteliais presumptivas, tipicamente envolvidas na mitose, ainda mantêm uma relação espacial próxima com as células sanguíneas e permancem subjacentes à ectoderme; contudo, estas células não estão juncionalmente ligadas. A porção mais central da zona avascular foi caracterizada por uma camada ectodermal e endodermal espessada (Figuras 3C e 4C). Embora estas camadas tenham sido espessadas, as junções celulares permaneceram intactas e as camadas mantiveram as suas características estruturais. Dentro da mesoderme, células dispersas mitoticamente envolvidas eram abundantes; estas células não exibiram a polarização celular endotelial observada na fase anterior. Além disso, ao longo desta região avascular eram comuns células degenerativas como indicado através do vacuólo de densidade electrónica e fragmentos celulares (Figura 4C) .

Em suma, este estudo demonstrou que 48 horas após a aplicação do taxol à CAM, a angiogénese foi inibida. A inibição de vasos sanguíneos formou uma zona avascular, que 65 foi representada por três fases transicionais do efeito do taxol. A área central, a mais afectada da zona avascular continha capilares rebentados com glóbulos vermelhos extravasados; isto indicava que as junções intercelulares entre as células endoteliais estavam ausentes. As células da endoderme e da ectoderme mantiveram as suas junções intercelulares e por conseguinte estas camadas germinais permaneceram intactas; contudo, estavam ligeiramente adensadas. À medida que se aproximava a área vascular normal, os vasos sanguíneos retinham os seus complexos juncionais e assim também permaneciam intactos. Na periferia da zona tratada com taxol, o crescimento adicional dos vasos sanguíneos foi inibido, o que se tornou evidente pelo típico efeito de redireccionamento ou "cotovelamento" dos vasos sanguíneos (Figura 24D).

As zonas avasculares tratadas com taxol também revelaram uma abundância de células envolvidas pela mitose em todas as três camadas germinais da CAM; isto só aconteceu com o taxol já que nenhum estudo anterior ilustrou tal acontecimento. Por estarem envolvidas na mitose, as células endoteliais não podiam passar pelas suas funções metabólicas normais envolvidas na angiogénese. Em comparação, a zona avascular formada pelo acetato de cortisona e suramina não produzem células mitoticamente envolvidas na CAM; apenas evitam o crescimento adicional de vasos sanguíneos para dentro da área tratada. Assim, embora os agentes sejam anti-angiogénicos, existem muitos pontos nos quais o processo angiogénico pode ser alvejado.

Também observámos os efeitos do taxol ao longo do decorrer das 48 horas e notámos que a inibição da angiogénese ocorria tão cedo como 9 horas após a aplicação. Secções 66 histológicas revelaram uma morfologia similar àquela que é vista na primeira fase de transição da zona avascular às 48 horas ilustrado na Figura 3A e 4A. Além disso, observámos o processo de revascularização na zona avascular previamente observada. Descobriu-se que a zona avascular formada por heparina e esteróides angiostáticos se tornava revascularizada 60 horas após a aplicação. No nosso estudo, as zonas avasculares tratadas com taxol não revascularizavam pelo menos até sete dias após a aplicação, implicando um efeito a longo termo mais potente. EXEMPLO 3 (exemplo comparativo)

ENCAPSULAÇÃO DA SURAMINA

Um mililitro de 5% de ELVAX (poli (acetato de etilenovinilo) em ligação cruzada com 5% acetato de vinilo) em diclorometano ("DCM") é misturado com um peso fixo de um base sub-micron de suramina de sódio. Esta mistura é injectada em 5 mL de Álcool Polivinílico ("PVA" - Polyvinyl Alcohol) a 5% em água num tubo de ensaio de 30 mL de fundo achatado. Tubos contendo diferentes pesos da substância são então suspensos num banho de água multi-amostral a 40°C durante 90 minutos com agitação automatizada. As misturas são retiradas e são tiradas amostras de microsferas para análise da dimensão. Os tubossão centrifugados a 1000 g durante 5 min. O PVA sobrenadante é removido e guardado para análise (fármaco não encapsulado). As microsferas são então lavadas (em vortex) em 5 mL água e recentrifugadas. Os 5 mL da substância lavada são guardados para análise (substância ligante de superfície). As microsferas são então humedecidas em 50 pl de metanol e levadas ao vortex com 1 mL de DCM para dissolver o ELVAX. As microsferas são então aquecidas até 40°C e são adicionados lentamente 5 mL de água a 50°C com agitação. Este procedimento resulta na 67 evaporação imediata do DCM, causando desta forma a libertação da suramina de sódio para os 5 mL de água. Todas as três amostras de 5 mL foram então analisadas para determinar o conteúdo de substância. A suramina de sódio absorve em uv/vis com um lambda máx. de 312 nm. A absorção é linear no intervalo de 0 a 100 pg/mL tanto em água como em 5% de PVA. A substância fluoresce fortemente com uma excitação máxima de 312 nm e um máximo de emissão a 400 nm. Esta fluorescência é quantificável no intervalo de 0 a 25 pg/mL.

Os resultados são apresentados nas Figuras 5-10. Resumidamente, a distribuição de dimensão das microsferas não parece ser afectada pela inclusão do fármaco no DCM (ver Figuras 5 e 6). Podem ser obtidos bons rendimentos de microsferas no intervalo de 20 a 60pm. A encapsulação da suramina é muito baixa (<1%) (ver Figura 8). Contudo, à medida que o peso da substância é aumentado no DCM a quantidade total de substância encapsulada aumenta embora a % de encapsulamento diminua. Como mostra a Figura 7, 50pg de substância podem ser encapsulados em 50 mg de ELVAX. A encapsulação de suramina de sódio em 5% de PVA contendo 10% de NaCl é apresentada nas Figuras 9-10. EXEMPLO 4

ENCAPSULAÇÃO DO TAXOL

Quinhentos microgramas quer de taxol ou de bacatina (um análogo de taxol disponível na Inflazyme Pharmaceuticals Inc., Vancouver, British Columbia, Canadá) são dissolvidos em 1 mL de uma mistura 50:50 de ELVAX: ácido poli-l-láctico em DCM. São então preparadas microsferas num aparelho de 68 dissolução (Sixspindle dissolution tester, Vanderkamp Van Kell Industries Inc., U.S.A.) em triplicado a 200 rpm, a 42°C, durante 3 horas. As microsferas preparadas deste modo são lavadas duas vezes em água e medidas no microscópio. A determinação da encapsulação do taxol é realizada num ensaio UV/Vis (UV/Vis com um lambda max de 237 nm, ensaio de flourescência a uma excitação de 237 nm, emissão a 325 nm; os resultados da fluorescência são apresentado entre parêntesis rectos []). Utilizando os procedimentos acima descritos, 58 yg (+/- 12 yg) [75 yg (+/- 25 yg)] de taxol podem ser encapsulados de um total de 500 yg de material inicial. Isto representa 12 %(+/- 2,4 %) [15% (+ 5 %) ] do peso original, ou 1,2 % (+/- 0,25 %) [1,5 % (+/- 0,5 %) ] por peso do polimero. Após 18 horas de agitação numa estufa a 370C, 10,3 % (+/- 10 %) [6% ( + /- 5,6 %)] do taxol total tinha sido libertado das microsferas.

Para a bacatina, 100 +/- 15 yg [83 +/- 23 yg] de bacatina podem ser encapsulados de um total de 500 yg de material inicial. Isto representa 20 % (+/- 3 %) [17 % (+/- 5 %)] do peso original de bacatina, e 2 % ( +/-0,3 %) [ 1,7% (+/-0,5 %) ] por peso do polimero. Após 18 horas de agitação numa estufa a 37°C, 55 % ( + /- 13 %) [60 % (+/- 23 %)] de bacatina é libertada das microsferas. EXEMPLO 5 ANÁLISE DE PASTA CIRÚRGICA CONTENDO COMPOSIÇÕES ANTI-

ANGIOGÉNICAS

Ratos Fisher pesando aproximadamente 300g são anestesiados, e é feita uma incisão abdominal superior transversal de 1 cm. Dois décimos de um mililitro de solução salina contendo 1 x 106 células de gliossarcoma 9L vivas (eluidas 69 imediatamente antes do uso a partir da cultura de tecido) são injectados em dois dos cinco lobos hepáticos espetando uma agulha, de calibre 27,1 cm para dentro da cápsula do fígado. A ferida abdominal é fechada com uma sutura reabsorvível 6,0 e agrafos para pele e a AG concluída.

Após duas semanas, os depósitos de tumor irão medir aproximadamente 1 cm. Nesta altura ambos os tumores hepáticos são resseccionados e a margem a descoberto do fígado é preenchida com um agente hemostático. Os ratos são divididos em dois grupos: a uma metade é administrado um transportador polimérico isoladamente e a outra metade recebe uma composição anti-angiogénica.

Os ratos são sacrificados 2, 7, 14, 21 e 84 dias após a ressecção hepática. Em particular, os ratos eutanizados injectando Eutanil na veia dorsal da cauda. O fígado, o baço, e ambos os pulmões são removidos, e é realizada uma análise histológica de forma a estudar os tumores à procura de evidência de actividade anti-angiogénica. EXEMPLO 6

EMBOLIZAÇÃO DE ARTÉRIAS DE RATO

Ratos Fisher pesando aproximadamente 300 g são anestesiados. Utilizando procedimentos assépticos é feita uma incisão abdominal superior transversal de 1 cm e o fígado é identificado. Dois décimos de um mililitro sw solução salina contendo 1 milhão de células de gliossarcoma 9L vivas (eluídas imediatamente antes a partir da cultura de tecido) são injectados em cada um dos cinco lobos hepáticos espetando uma agulha, de calibre 27,1 cm para dentro da cápsula do fígado. Um décimo de um mililitro de solução salina normal é injectado para dentro da agulha à 70 medida que esta é retirada para garantir que não existe qualquer derramamento de células para dentro da cavidade peritonial. Uma compressa Gelfoam é colocada em cada um dos locais de punção para garantir a hemostase. A ferida abdominal é fechada com uma sutura reabsorvivel 6,0 com agrafos para a pele e a anestesia concluída. O rato é devolvido para a instalação de cuidados animais para ter uma dieta Standard durante 14 dias, altura na qual cada depósito de tumor irá medir 1 cm de diâmtero. O mesmo procedimento é repetido utilizando ratos Westar e uma linha celular de Cancro do Cólon (Radiologic Oncology Lab, M:D: Anderso, Houston, Texas) neste caso são necessárias 3 semanas após a injecção para os depósitos de tumor medirem cada um 1 cm de diâmetro.

Após 2 ou 3 semanas, dependendo da espécie de rato, é seguido o mesmo procedimento anestésico geral e é executada uma incisão na linha média abdominal. O duodeno é desviado ao de leve e a artéria gastroduodenal é identificada e mobilizada. São colocadas ligaduras acima e abaixo do local de corte na porção média da artéria gastroduodenal (GDA) e uma tubagem de polietileno de 0,038 polegadas é introduzida de uma forma retrógada na artéria utilizando um microscópio de operação. A ligadura abaixo do ponto de inserção irá ligar a artéria, enquanto que aquela acima irá fixar o cateter no lugar. É executada uma angiografia através da injecção de 0,5 mL de material de contraste radiopaco a 60% através do cateter, enquanto é feito um raio X. A artéria hepática é então embolizada através do refluxo de partículas medindo 15 a 200 ym através do cateter da artéria gastroduodenal até que o fluxo, observado via microscópio de operação, tenha parado pelo menos há 30 segundos. A oclusão da artéria hepática é confirmada pela 71 repetição de um angiograma através do cateter GDA. Utilizando este procedimento, metade dos ratos recebe 15-200 ym de partículas de polímero isoladamente, e a outra metade recebe 15-200 ym de partículas da composição polímero-factor anti-angiogénico. A ligadura GDA superior é apertada para ocludir a GDA à medida que o cateter é retirado para garantir a hemostase e a artéria hepática (embora embolizada) permanece intacta. O abdómen é fechado com uma sutura absorvível 6,0 e agrafos cirúrgicos.

Os ratos são subsequentemente sacrificados 2, 7, 14, 21 e 84 dias após a embolização de forma a determinar a eficácia do factor anti-angiogénico. Resumidamente, é dada uma anestesia geral, e utilizando precauções assépticas é realizada uma incisão na linha média. A GDA é mobilizada outra vez e depois de colocar uma ligadura perto da junção da GDA com a artéria hepática (i.e., bem acima do local de corte anterior), é inserida uma tubagem de polietileno de 0,038 polegadas via corte do vaso e é executada uma angiografia. O rato é então eutanizado através de injeccão de Eutanil na veia dorsal da cauda. Uma vez que a eutanásia esteja confirmada, o fígado é removido em bloco (en bloc) juntamente com o estômago, o baço e ambos os pulmões. É realizada uma análise histológica numa lâmina preparada com coloração, com os corantes hematoxilina e eosina ("H e E"). Resumidamente, os pulmões são seccionados a intervalos de 1 cm para avaliar a passagem de material embólico através das veias hepáticas e para o lado direito da circulação. O estômago e baço são também seccionados de forma a avaliar imobilização inadvertida do refluxo de partículas para o acesso celíaco da circulação colateral. 72 EXEMPLO 7

TRANSPLANTE DE STENTS BILIARES EM RATOS É administrada uma anestesia geral a ratos Fisher de 300 g. É então feita uma incisão transversal de 1 cm no abdómen superior e o fígado identificado. No lobo mais superficial são injectados 0,2 mL de solução salina contendo um milhão de células de gliossarcoma 9L (eluídas a partir da cultura de tecido imediatamente antes do uso) são injectados via uma agulha de calibre 27 a uma profundidade de 1 cm para dentro da cápsula do fígado. É obtida a hemostase após a remoção da agulha colocando uma compressa de Gelfoam nos locais de punção. É injectada uma solução salina à medida que a agulha é removida para garantir que não haja derramamento de células para dentro da cavidade peritonial ou ao longo do percurso da agulha. A anestesia geral é concluída e o animal é devolvido ao centro de cuidados animais e colocado sob uma dieta normal.

Duas semanas mais tarde, é administrada uma anestesia geral e utilizando precauções assépticas, é identificado o lobo hepátoco contendo o tumor através duma incisão na linha mediana. Uma agulha angiográfica de calibre 16, é então inserida através da cápsulahepática para dentro do tumor, é passado um arame condutor de 0,038 polegadas através da aguflia e a agulha é retirada sobre o arame condutor. Um dilatador French número 5 é passado sobre o guia para dentro do tumor e retirado. Um cateter dispensador French número 5 é então passado sobre o arame contendo um Wallstent de aço inoxidável auto-expansível (5 mm de diâmetro e 1 cm de comprimento). O stent é desdobrado para dentro do tumor e o cateter dispensador de arame condutor é removido. Um terço dos ratos tem um stent de aço inoxidável convencional inserido dentro do tumor, um terço tem um 73 stent de aço inoxidável revestido com polímero e um terço tem um stent revestido com o composto polímero-factor anti-angiogénico. A anestesia geral é concluída e o rato é devolvido à instalação de cuidados animais. É realizado um raio X abdominal simples no 2o dia de forma a avaliar o grau de abertura do stent. Os ratos são sacrificados 2, 7, 14, 28 e 56 dias após a inserção do stent através da injecção de Eutanil e os seus fígados são removidos em bloco uma vez que a eutanásia esteja confirmada. Após fixação em formaldeído durante 48 horas, o fígado é seccionado em intervalos de 0,5 mm; incluindo o corte do stent transversalmente usando uma lâmina nova para cada fatia. Secções histológicas coloridas com H e E são então analisadas para avaliar o grau de crescimento interno do tumor para dentro do lúmen do stent. EXEMPLO 8

MANUFACTURA DE MICROSFERAS O equipamento que é preferido para a manufactura de microsferas descritas abaixo inclui: proveta com camisa de água de 200 mL (Kimax ou Pyrex) , banho de água circulante Haake, agitador e controlador suspensos com um diâmetro de 2 polegadas (agitador de aço inoxidável com 4 lâminas do tipo hélice - marca Fisher) , um béquer de vidro de 500 mL, manta de aquecimento com agitação (marca Corning), tubos de centrífuga 4 x 50 mL de polipropileno (Nalgene), frascos de cintilação de vidro com tampas de inserção de plástico, centrífuga de topo de mesa (GPR Beckman), ultracentrífuga -modelo de chão (JS 21 Beckman), balança analítica Mettler (AJ 100, 0,1 mg), balança digital de carga de topo Mettler (AE 163 , 0,01 mg), pipeta automática (Gilson). Reagentes 74 incluindo Policaprolactona ("PCL" - peso mol. de 10 000 a 20 000; Polysciences, Warrington Pennsylvania, USA),

Acetato de Etilenovinilo "lavado" ("EVA" lavado de modo a remover o anti-oxidante BHT), ácido poli(DL)láctilo ("PLA" - peso mol. de 15 000 a 25 000; Polysciences), Álcool polivinilico ("PVA" - peso mol. de 124 00 a 186 000; 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, USA), diclorometano ("DCM" ou "cloreto de metileno"; HPLC grade Fisher scientific) , e água destilada. A. Preparação de soluções poliméricas a 5% (p/v)

Dependendo da solução polimérica a ser preparada, 1,00 g de PCL ou PLA, ou 0,50 g de PLA e de EVA lavado, é pesado directamente para um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. São então adicionados vinte mililitros de DCM, e o frasco é firmemente fechado. O frasco é armazenado à temperatura ambiente (25°C) por uma hora (podendo ser ocasionalmente agitado), ou até que todo polímero tenha sido dissolvido (a solução deve ser límpida). A solução pode ser guardada à temperatura ambiente até duas semanas. B. Preparação de soluções Stock de PVA a 5 % (p/v)

Vinte e cinco gramas de PVA são pesadas directamente para um béquer de vidro de 600 mL. Quinhentos mililitros de água destilada são adicionados, juntamente com uma barra de agitação de 3 polegadas revestida a Teflon. O béquer é tapado com vidro para diminuir as perdas por evaporação, e colocado dentro dum béquer de vidro de 2000 mL contendo 300 mL de água (o qual actua como um banho de água) . O PVA é agitado a 300 rpm a 85°C (placa de aquecimento com aqitação Corning) durante 2 horas ou até à dissolução completa. A dissolução de PVA pode ser determinada por verificação visual; a solução deve ser límpida. A solução é então 75 transferida para um contentor de armazenamento de tampa de enroscar de vidro e armazenada a 4°C no máximo durante dois meses. A solução, no entanto, deve ser aquecida até à temperatura ambiente antes de ser usada ou diluida. C. Procedimento para a Produção de Microsferas Com base no tamanho das microsferas a serem feitas (ver Tabela 1), 100 mL da solução de PVA (concentrações dadas na Tabela III) são colocados dentro dum béquer com camisa de água de 200 mL. O banho de circulação de água Haake é ligado a este béquer e permite-se que os conteúdos equilibrem 27°C (+/- 10°C) durante 10 minutos. Com base no tamanho das microsferas a serem feitas (ver Tabela III), a velocidade inicial do agitador suspenso é estabelecida, e a lâmina do agitador suspenso é colocada mergulhada a meia altura na solução de PVA. O agitador é então ligado, e 10 mL da solução polimérica (a solução polimérica usada depende do tipo de microsferas a serem produzidas) é então adicionada gota-a-gota à solução de PVA em agitação durante um periodo de pelo menos 2 minutos utilizando uma pipeta automática de 5 mL. Após 3 minutos a velocidade de agitação é ajustada (ver Tabela III), e a solução agitada por mais 2.5 horas. A lâmina de agitação é então removida da preparação de microsferas, e passada com 10 mL de água destilada de forma a que a solução de lavagem seja escoada para a preparação de microsferas. A preparação de microsferas é então vertida para um béquer de 500 mL e o banho de água com camisa é lavado com 70 mL de água destilada, que também é deixado a escoar para a preparação de microsferas. Os 180 mL da preparação de microsferas são então agitados com uma vareta de vidro, e iguais quantidades são vertidas para quatro tubos de centrífuga de 50 mL de polipropileno. Os tubos são então rolhados e 76 centrifugados durante 10 minutos (a força é dada na Tabela 1) . Uma sucção por vácuo ou com pipeta automática de 5 mL é então utilizada para extrair 45 mL de solução de PVA de cada pellet de microsferas.

TABELA III

Concentrações de PVA, velocidades de agitação, e força centrífuga necessárias para cada gama de diâmetros das microsferas ESTÁGIO DE PRODUÇÃO GAMA DE DIÂMETROS DE MICROSFERAS 30 pm a 100 pm 10 pm a 30 pm 0,1 pm a 3 pm Concentração de PVA 2,5% (p/v) (i.e., stock diluído a 5% com água destilada) 5% (p/v) (i.e., stock não diluído) 3,5% (p/v) (i.e., stock diluído a 5% com água destilada) Velocidade de Agitação Inicial 500 rpm +/- 50 rpm 500 rpm +/-50 rpm 3000 rpm +/-200 rpm Velocidade de Agitação Ajustada 500 rpm +/- 50 rpm 500 rpm +/-50 rpm 2500 rpm +/-200 rpm Força Centrífuga 1000 g +/- 100 g (modelo topo de mesa) 1000 g +/-100 g (modelo topo de mesa) 10 000 g +/-1000 g (modelo de alta velocidade)

Cinco mililitros de água destilada são então adicionados a cada tubo de centrífuga, que é então colocado num vortex para ressuspender as microsferas. As quatro suspensões de microsferas são então combinadas num tubo de centrífuga 77 juntamente com 20 mL de água destilada, e centrifugadas por mais 10 minutos (força apresentada na Tabela 1). Este processo é repetido por duas vezes adicionais para um total de três lavagens. As microsferas são então centrifugadas uma última vez e ressuspendidas em 10 mL de água destilada. Após a lavagem final, a preparação de microsferas é transferida para um frasco de cintilação de vidro previamente pesado. O frasco é rolhado e deixado de um dia para o outro à temperatura ambiente (25°C) de forma a permitir que as microsferas sedimentem pela gravidade. Microsferas cuja dimensão cai dentro do intervalo de 0,1 ym a 3 ym não sedimentam pela gravidade, neste caso elas permanecem na suspensão de 10 mL. D. Secagem das microsferas com um diâmetro entre 10 ym a 30 ym ou 30 ym a 100 ym

Após as microsferas terem assentado de um dia para o outro à temperatura ambiente, é utilizada uma sucção por vácuo ou com pipeta automática de 5 mL para retirar o sobrenadante das microsferas sedimentadas. As microsferas são deixadas a secar no frasco destapado numa gaveta por um período de uma semana ou até estarem completamente secas (frasco a peso constante). Pode ser obtida uma secagem mais rápida deixando o frasco destapado sob uma corrente lenta de azoto gasoso (fluxo aprox. 10 mL/min.) numa hotte. Quando completamente secas (frasco a peso constante), o frasco é pesado e rolhado. O frasco rotulado e rolhado é guardado à temperatura ambiente num suporte. Normalmente, as microsferas não devem ser guardadas por mais de 3 meses. E. Secagem das microsferas com um diâmetro entre 0,1 ym e 3 ym 78

As microsferas deste intervalo de tamanhos não irão sedimentar, então são deixadas em suspensão a 4°C no máximo durante 4 semanas. Para determinar a concentração de microsferas na suspensão de 10 mL, uma amostra da suspensão de 200 μΐ é pipetada para um tubo de 1,5 mL de microcentrifuga pesado previamente. O tubo é então centrifugado a 10 000 g (microcentrifuga de topo de mesa Eppendorf), o sobrenadante é removido, e o tubo deixado a secar a 50°C durante a noite. O tubo é então repesado de modo a determinar o peso das microsferas secas dentro do tubo. F. Manufactura de Microsferas Carregadas de Taxol De modo a preparar microsferas contendo taxol, uma quantidade apropriada de taxol pesada (baseada na percentagem de taxol a ser encapsulado) é colocado directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Dez mililitros duma solução polimérica apropriada é então adicionada ao frasco contendo o taxol, o qual vai ao vortex até o taxol estar dissolvido.

Microsferas contendo taxol podem então ser produzidas essencialmente como descrito nos passos (C) a (E). EXEMPLO 9

MANUFACTURA DE REVESTIMENTO DE STENT

Os reagentes e equipamentos que são utilizados nas experiências seguintes incluem (stents médicos graduados obtidos comercialmente a partir de uma variedade de fabricantes; por exemplo, o stent "Strecker") e dispositivo de suporte, frasco de cintilação de vidro com tampa (do tipo inserção de plástico), atomizaclor TLC, tanque de gás de azoto, tubos de ensaio de vidro (várias dimensões a 79 partir de 1 mL para cima), béqueres de vidro (vários tamanhos), pipetas de Pasteur, pinças, Policaprolactona ("PCL" - peso mol. 10 000 a 20 000; Polysciences) , Taxol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., 95 % de pureza), acetato de etilenovinilo ("EVA" - lavado - ver atrás), ácido Poli (DL) láctico ("PLA" - peso mol. 15 000 a 25 000; Polysciences) diclorometano ("DCM" - grau de HPLC, Fisher Scientific). A. Procedimento para stents pulverizados O que se segue descreve um método tipico que usa um stent metálico de arame intercalado de diâmetro franzido de 3 mm de aproximadamente 3 cm de comprimento. Para stent s de diâmetro maior, são utilizados volumes maiores de soluções de polimero/substância.

Pesa-se polímero suficiente directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 mL e adiciona-se suficiente DCM para obter uma solução a 2% p/v. Tapar o frasco e misturar a solução para dissolver o polímero (agitação manual) . Montar o stent numa orientação vertical. Isto pode ser conseguido usando um pedaço de nylon e atando o stent a uma estante de retorta. Posicionar este dispositivo de suporte do stent de 6 a 12 polegadas acima do chão da hotte num suporte adequado (por exemplo, béquer de vidro de 2000 mL invertido) para permitir uma pulverização horizontal. Usando uma pipeta automática, tranferir um volume adequado (5 mL no mínimo) da solução de polímero a 2% para um frasco de cintilação de vidro de 20 mL separado. Adicionar uma quantidade apropriada de taxol à solução e dissolvê-la por agitação manual do frasco tapado. 80

Para preparar para a pulverização, remover a tampa deste frasco e mergulhar o tambor de um atomizador TLC dentro da solução de polímero. Note-se que o reservatório do atomizador não precisa de ser utilizado neste procedimento: o frasco de vidro de 20 mL actua como um reservatório. Ligar o tanque de azoto à entrada de gás do atomizador. Aumentar gradualmente a pressão até se iniciar a atomização e pulverização. Anotar a pressão e utilizar esta pressão ao longo do processo. Para pulverizar o stent usar pulverizadores oscilantes de 5 segundos com um tempo de secagem entre pulverizações de 15 segundos. Após 5 pulverizações rodar o stent 90° e pulverizar essa parte do stent. Repetir até todos os lados do stent terem sido pulverizados. Durante o tempo de secagem, prender com o dedo a linha de gás para evitar desperdício do spray. A pulverização é continuada até que uma quantidade adequada de polímero esteja depositada nos stents. A quantidade pode basear-se na aplicação específica do stent in vivo. Para determinar a quantidade, pesar o stent após a pulverização ter sido completada e o stent ter secado. Subtrair o peso original do stent do peso final, o que indica a quantidade de polímero (mais taxol) aplicada ao stent. Armazenar o stent revestido num contentor selado. B. Procedimento para stents mergulhados O que se segue descreve um método típico que usa um stent metálico de arame intercalado de diâmetro franzido de 3 mm de aproximadamente 3 cm de comprimento. Para stents de diâmetro maior, são utilizados volumes maiores de soluções de polímero/fármaco em tubos de ensaio de maiores dimensões. 81

Pesar 2 g de EVA num frasco de cintilação de vidro de 20 mL e adicionar 20 mL de DCM. Tapar o frasco e deixá-lo a dissolver durante 2 horas (agitar manualmente o frasco com frequência para auxiliar o processo de dissolução). Pesar uma quantidade conhecida de taxol directamente para dentro de um tubo de ensaio de vidro de 1 mL e adicionar 0,5 mL da solução de polímero. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, dissolver o taxol bombeando a solução de polímero suavemente. Uma vez que o taxol esteja dissolvido, segurar o tubo de ensaio numa posição quase horizontal (a solução viscosa de polímero não derramará). Usando pinças, inserir o stent no tubo até ao fim. Permitir que a solução polímero flua quase até à boca do tubo de ensaio colocando aquela num ângulo abaixo da horizontal e depois recolocando o tubo de ensaio num ângulo ligeiramente acima da horizontal. À medida que se roda lentamente o stent no tubo, removê-lo lentamente (30 segundos aproximadamente).

Segurar o stent em posição vertical para secar. Algumas das perfurações seladas podem estalar (pop) de forma que existe um buraco na folha contínua do polímero. Isto pode ser remediado através da repetição do procedimento de imersão anterior, contudo a repetição do procedimento também pode conduzir a estalidos adicionais e uma cobertura não-uniforme geral do polímero. Geralmente é melhor mergulhar o stent apenas uma vez e retirar uma secção do stent que não tenha perfurações saltadas. Armazenar o stent mergulhado num contentor selado. 82 EXEMPLO 10

MANUFACTURA DE "PASTAS" CIRÚRGICAS

Como referido acima a presente invenção fornece uma variedade de composições de fármacos contendo polímero que podem ser utilizadas numa variedade de situações clínicas. Por exemplo, podem ser produzidas composições: (1) como uma "termopasta" que é aplicada numa localização desejada como um fluido e que endurece transformando-se num sólido do formato desejado a uma temperatura específica (por exemplo, temperatura corporal); (2) como um spray (i.e., "nanospay"), que pode ser dispensado no local desejado quer directamente, quer através de um dispositivo especializado (por exemplo, endoscopia) , e que subsquentemente endurece tornando-se num sólido que adere ao tecido no qual é aplicado; (3) como um filme inibidor de polímero angiogénico, resiliente, flexível, aderente, aplicado no local desejado, quer directamente quer através de um dispositivo especializado e que adere preferivelmente ao local onde é aplicado; e (4) como um fluido composto por uma suspensão de microsferas num meio transportador apropriado que é aplicado no local desejado, quer directamente quer através de um dispositivo especializado e que deixa uma camada de microsferas no local de aplicação. Exemplos representativos de cada uma das modalidades acima referidas são expostos mais detalhadamente abaixo. A. Procedimento para produzir termopasta

Os reagentes e equipamento que são utilizados nas experiências que se seguem incluem uma seringa de vidro esterilizada (1 mL) , placa de aquecimento com agitação Corning, frasco de cintilação de vidro de 20 mL, moldes (por exemplo, panela DSC de 50 μΐ, porção interior da tampa 83 do tubo de centrífuga de 50 mL), escalpelo e pinças, Policaprolactona ("PCL" - peso mol. de 10 000 a 20 000/ Polyscience, Warrington, Pennsylvania, USA), e Taxol (grau de pureza mínima de 95% Sigma).

Pesar 5,00 g de policaprolactona directamente para dentro de um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Colocar o frasco dentro de um béquer de 600 mL contendo 50 mL de água. Aquecer o béquer lentamente até 65°C e mantê-lo nessa temperatura durante 20 minutos. Isto permite que o polímero derreta. Misturar completamente um peso conhecido de taxol ou outro inibidor angiogénico no polímero fundido a 65°C. Verter o polímero fundido num molde pré-aquecido (estufa a 60°C). Usar uma espátula para auxiliar o processo de vazamento. Permitir que o molde arrefeça, de forma a que o polímero solidifique. Cortar ou partir o polímero em pedaços pequenos (aproximadamente 2 mm por 2 mm de dimensão). Estes pedaços devem caber numa seringa de vidro de 1 mL. Retirar o êmbolo da seringa de vidro de 1 mL (não remover a tampa da ponta) e colocá-la numa balança. Colocar a balança a zero.

Pesar 0,5 g dos pedaços directamente dentro da extremidade aberta da seringa. Colocar a seringa de vidro direita (ponta tapada para baixo) num béquer de vidro de 500 mL contendo água destilada a 65°C (placa de aquecimento Corning) de forma a que nenhuma água entre no tambor. O polímero derrete completamente em 10 minutos neste dispositivo. Quando os pedaços de polímero tiverem fundido, remover o tambor do banho de água, segurá-lo horizontalmente e remover a tampa. Inserir o êmbolo no tambor e comprimir o polímero fundido até este se transformar numa massa viscosa na extremidade da ponta do 84 tambor. Tapar a seringa e deixá-la arrefecer à tempertaura ambiente.

Para a aplicação, a seringa pode ser reaquecida a 60° C e administrada como um liquido que solidifica quando arrefecido à temperatura do corpo. B. Procedimento para produzir nanospray

Nanospray é uma suspensão de pequenas microsferas em solução salina. Se as microsferas são muito pequenas (i.e., abaixo de 1 ym de diâmetro) formam um colóide, de modo que a suspensão não irá sedimentar sob gravidade. Como descrito mais detalhadamente abaixo, pode ser criada uma suspensão de microparticulas de 0,1 ym a 1 ym adequada para deposição no tecido através de um aerosol bombeado manualmente. Os equipamentos e materiais que podem ser utilizados para produzir nanospray incluem 1 béquer com camisa de água de 200 mL (Kimax ou Pyrex), banho de água circulante Haake, agitador e controlador suspensos com um diâmetro de 2 polegadas (agitador de aço inoxidável com 4 lâminas do tipo hélice - marca Fisher), um béquer de vidro de 500 mL, placa de aquecimento com agitação (marca Corning), tubos de centrífuga 4 x 50 mL de polipropileno (Nalgene), frascos de cintilação de vidro com tampas de inserção de plástico, centrífuga de topo de mesa (Beckman) , ultracentrífuga -modelo de chão (JS 21 Beckman), balança analítica Mettler (AJ 100, 0,1 mg), balança digital de carga de topo Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipeta automática (Gilson), pontas de pipetas estéreis, aerosol de acção por bomba (Pfeiffer Pharmaceuticals) de 20 mL, câmara de fluxo laminar, Policaprolactona ("PCL" - peso mol. de 10,000 a 20,000; Poiysciences, Warrington Pennsylvania, USA), Acetato de Etilenovinilo "lavado" ("EVA") (ver atrás), ácido 85 poli (DL)láctico ("PLA" - peso mol. de 15,000 a 25,000; Polysciences), Álcool polivinílico ("PVA" - peso mol. de 124 000 a 186 000 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, USA), diclorometano ("DCM" ou "cloreto de metileno"; grau para HPLC Fisher Scientific), e água destilada, solução salina esterilizada (Becton e Dickenson ou equivalente). 1. Preparação de soluções de polímero a 5% (p/v)

Dependendo da solução de polímero a ser preparada, pesar 1,00 g de PCL ou PLA ou 0,50 g de cada de PLA e EVA lavado directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Utilizando o cilindro de medição, adicionar 20 mL de DCM e tapar bem o frasco. Deixar o frasco à temperatura ambiente (25°C) durante 1 hora ou até todo o polímero ter dissolvido (ocasionalmente pode ser agitado manualmente). A dissolução do polímero pode ser determinada por confirmação visual; a solução deve estar límpida. Rotular o frasco com o nome da solução e a data em que foi produzida. Armazenar as soluções à temperatura ambiente e utilizar no espaço de duas semanas. 2. Preparação de solução Stock de PVA a 3,5% (p/v) A solução pode ser preparada seguindo o procedimento descrito abaixo ou através da diluição da solução stock de PVA a 5% (p/v) preparada para a produção de microsferas (ver Exemplo 8). Resunildamente, são pesados 17,5 g de PVA directamente num béquer de vidro de 600 mL e adicionam-se 500 mL de água destilada. Colocar uma barra de agitação de 3 polegadas revestida a teflon no béquer. Tapar o béquer com uma tampa de vidro para reduzir as perdas por evaporação. Colocar o béquer num béquer de vidro de 2 000 mL contendo 300 mL de água. Isto irá actuar como um banho 86 de água. Agitar o PVA a 300 rpm a 85°C (placa de aquecimento com agitação Corning) durante 2 horas ou até à dissolução completa. A dissolução de PVA pode ser determinada por verificação visual; a solução deve ser límpida. Usar uma pipeta para transferir a solução para um contentor de armazenamento de tampa de enroscar de vidro e armazenar a 4°C no máximo durante dois meses. Esta solução deve ser aquecida até à temperatura ambiente antes de ser usada ou diluída. 3. Procedimento para a produção de nanospray Colocar a montagem de agitação numa hotte. Colocar 100 mL da solução de PVA a 3,5% no béquer com camisa de água de 200 mL. Ligar o banho de água Haake a este béquer e deixar os conteúdos equilibrar a 27°C (+/- 1°C) durante 10 minutos. Colocar a velocidade inicial do agitador suspenso a 3 000 rpm ( + /- 200 rpm) . Colocar a lâmina do agitador suspenso a meia altura na solução de PVA e ligar o agitador. Adicionar gota-a-gota 10 mL da solução polimérica (a solução polimérica usada depende do tipo de nanospray a ser produzido) ao PVA em agitação durante um período de 2 minutos utilizando uma pipeta automática de 5 mL. Após 3 minutos ajustar a velocidade de agitação a 2 500 rpm (+/-200 rpm) e deixar a montagem durante 2,5 horas. Apos 2,5 horas remover a lâmina de agitação da preparação de nanospray, e passar por 10 mL de água destilada. Permitir que a solução de lavagem vá para dentro da preparação de nanospray.

Verter a preparação de microsferas para dentro de um béquer de 500 mL. Lavar o banho de água com camisa com 70 mL de água destilada. Permitir que a solução de lavagem de 70 mL vá para dentro da preparação de microsferas. Agitar a 87 preparação de 180 mL de microsferas com uma vareta de vidro, e verter iguais quantidades desta para quatro tubos de centrífuga de 50 mL de polipropileno. Rolhar os tubos. Centrifugar os tubos tapados a 10 000 g (+/-1000 g) durante 10 minutos. Usando uma pipeta automática de 5 mL ou sucção por vácuo, extrair 45 mL de solução de PVA de cada pellet de microsferas e descarregá-los. Adicionar 5 mL de água destilada a cada tubo de centrífuga e usar um vortex para ressuspender as microsferas em cada tubo. Usando 20 mL de água destilada, combinar as quatro suspensões de microsferas num tubo de centrífuga. Para lavar as microsferas, centrifugar a preparação de nanospray durante 10 minutos a 10 000 g (+/- a 1 000 g). Retirar o sobrenadante do pellet de microsferas. Adicionar 40 mL de água destilada e usar um vortex para ressuspender as microsferas. Repetir este. processo mais duas vezes para um total de três lavagens. Realizar uma quarta lavagem, mas usar apenas 10 mL (e não 40 mL) de água destilada aquando da ressuspensão das microsferas. Após a quarta lavagem, transferir a preparação de microsferas para um frasco de cintilação de vidro previamente pesado.

Tapar o frasco e deixá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente (25°C) para permitir que as microsferas de 2 pm e 3 pm de diâmetro sedimentem pela gravidade. Após 1 hora retirar do topo 9 mL de suspensão usando uma pipeta automática de 5 mL. Colocar os 9 mL num tubo de centrífuga de 50 mL estéril tapado. Centrifugar a suspensão a 10 000 g (+/- 1 000 g) durante 10 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 mL de solução salina estéril. Centrifugar a suspensão a 10 000 g (+/- 1 000 g) durante 10 minutos. Descarregar o supernadante e ressuspender o pellet em solução salina estéril. A quantidade de solução salina 88 usada depende da concentração de suspensão necessária final (usualmente 10 % p/v). Enxaguar minuciosamente o dispositivo de aerosol em solução salina estéril e adicionar a suspensão de nanospray ao aerosol. C. Manufactura de nanospray impregnado de taxol

De modo a manufacturar nanospray contendo taxol, usar Taxol (grau de pureza 95% Sigma) . Para preparar a solução stock de substância polimérica, pesar a quantidade apropriada de taxol directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 mL. A quantidade apropriada é determinada com base na percentagem de taxol a estar presente no nanospray. Por exemplo, se for requerido nanospray contendo 5% de taxol, então a quantidade de taxol a ser pesado seria 25 mg, já que a quantidade de polímero adicionado é 10 mL de um polímero a 5% em solução DCM (ver próximo passo).

Adicionar 10 mL de uma solução polimérica a 5% adequada ao frasco contendo o taxol. Tapar o frasco e levar ao vortex ou agitá-lo manualmente para dissolver o taxol (confirmar visualmente para garantir a dissolução do taxol). Rotular o frasco com a data de produção. Deve ser utilizado no dia em que é produzido.

Seguir os procedimentos acima descritos, exceptuando o facto de que a solução stock polimérica/fármaco (por exemplo, taxol) é substituída pela solução polimérica. D. Procedimento para produção de filme O termo filme refere-se a um polímero formado numa de muitas formas geométricas. O filme pode ser uma folha elástica fina de polímero ou um disco espesso compacto de polímero de 2 mm. Este filme é concebido para ser colocado 89 em tecido exposto de forma que qualquer substância encapsulada é libertada a partir do polímero durante um longo período de tempo no local de tecido. Os filmes podem ser produzidos por vários processos, incluindo por exemplo, fundição ou pulverização.

Na técnica por fundição, o polímero é quer fundido ou vertido para uma forma ou dissolvido em diclorometano e vertido para dentro de uma forma. 0 polímero então ou solidifica enquanto arrefece ou solidifica à medida que o solvente evapora, respectivarnente. Na técnica por pulverização, o polímero é dissolvido em solvente e pulverizado no vidro, à medida que o solvente evapora, o polímero solidifica no vidro. Pulverização repetida permite que o polímero se constitua num filme que pode ser descolado do vidro.

Os reagentes e equipamentos que foram utilizados nestas experiências incluem um béquer pequeno, uma placa de aquecimento com agitação Corning, moldes de fundição (por exemplo, tampas de tubos de centrífuga de 50 mL) dispositivo de suporte de molde, frasco de cintilação de vidro com tampa de 20 mL (tipo inserção de plástico), atomizador TLC, tanque de gás de Azoto, Policaprolactona (PCL - peso mol. 10 000 a 20 000; Polysciences), Taxol (pureza de 95% Sigma), Etanol, Acetato de Etilenovinilo ("EVA") "lavado" (ver atrás), Ácido Poli(DL)láctico ("PLA" - peso mol. 15 000 a 25 000; Polyscience), Diclorometano (grau para HPCL Fisher Scientific). 1. Procedimento para produção de filmes - fusão por fundição 90

Pesar uma quantidade conhecida de PCL directamente dentro de um béquer de vidro pequeno. Colocar o béquer dentro de um béquer maior contendo água (para actuar como um banho de água) e colocá-lo na placa de aquecimento a 70°C durante 15 minutos ou até ao polímero ter fundido completamente. Adicionar um peso conhecido do fármaco ao polímero fundido e agitar a mistura minuciosamente. Para auxiliar à dispersão do fármaco no PCL fundido, a substância pode ser suspensa/dissolvida num pequeno volume (< 10% do volume doPCL fundido) de 100% de etanol. Esta suspensão de etanol é então misturada no polímero fundido. Verter o polímero fundido num molde e deixá-lo arrefecer. Após o arrefecimeto, armazenar o filme num contentor. 2. Procedimento para produção de filmes. - fundição por solvente

Pesar uma quantidade conhecida de PCL directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 mL e adicionar DCM suficiente para obter uma solução a 10% p/v. Tapar o frasco e misturar a solução. Adicionar taxol suficiente à solução para obter a concentração de taxol final desejada. Usar agitação manual ou colocar em vortex para dissolver o taxol na solução. Deixar a solução assentar durante uma hora (para diminuir a presença de bolhas de ar) e depois vertê-la lentamente num molde. O molde utilizado depende da forma requerida. Colocar o molde na hotte de um dia para o outro. Isto permite que o DCM evapore. Deixar o filme no molde para armazenamento ou retirá-lo por descolamento e armazená-lo num contentor selado.

3. Procedimento para produção de filmes - pulverização Pesar uma quantidade suficiente de polímero directamente num frasco de cintilação de vidro de 20 m e adicionar DCM 91 suficiente para obter uma solução a 2% p/v. Tapar o frasco e misturar a solução para dissolver o polímero (agitação manual). Reunir os moldes numa orientação vertical num dispositivo de suporte para moldes adequado na hotte. Posicionar este dispositivo de suporte para moldes 6 a 12 polegadas acima do chão da hotte num suporte adequado (por exemplo, béquer de vidro de 2000 mL invertido) para permitir pulverização horizontal. Usando uma pipeta automática, transferir um volume adequado (no mínimo 5 mL) de solução polimérica a 2% para um frasco separado de cintilação de vidro de 20 mL. Adicionar taxol suficiente à solução e dissolvê-lo por agitação manual do frasco tapado. Para preparar a pulverização remover a tampa deste frasco e mergulhar o tambor (apenas) de um atomizador TLC na solução polimérica. Nota: o reservatório do atomizador não é utilizado neste procedimento - o frasco de vidro de 20 mL actua como reservatório.

Ligar o tanque de azoto à entrada de gás do atomizador. Aumentar a pressão gradualmente até se iniciar a atomização e pulverização. Anotar a pressão e utilizar esta pressão ao longo do procedimento. Para pulverizar os moldes utilizar sprays oscilantes de 5 segundos com um tempo de secagem entre pulverizações de 15 segundos. Durante o tempo de secagem apertar com o dedo a linha de gas para evitar desperdício de spray. A pulverização continua até uma espessura de polímero adequada estar depositada no molde. A espessura baseia-se no pedido. Deixar os filmes pulverizados agarrados aos moldes e armazenar em contentores selados. 92 E. Procedimento para a produção de nanopasta Nanopasta é uma suspensão de microsferas suspensas em gel hidrofílico. Num aspecto da invenção, o gel ou pasta podem ser untados sobre o tecido como um método de colocar as microsferas impregnadas de fármaco perto do tecido alvo. Sendo à base de água a pasta irá rapidamente ficar diluída nos fluídos corporais causando uma diminuição da viscosidade da pasta e uma tendência das microsferas em serem depositadas em tecido próximo. Um conjunto de microsferas com fármaco encapsulado é assim colocado perto do tecido alvo.

Os reagentes e instrumentos que fora utilizados nestas experiências incluem béqueres de vidro, Carbopol 925 (grau farmacêutico, Goodyear Chemical Co.), água destilada, hidróxido de sódio (1M) em solução aquosa, solução de hidróxido de sódio (5M) em solução aquosa, microsferas no intervalo de dimensão 0,1 ym a 3 ym suspensas em água a 20% p/v (ver atrás). 1. Preparação de Carbopol Gel a 5% p/v

Adicionar uma quantidade suficiente de carbopol a hidróxido de sódio 1M para obter uma solução a 5% p/v. Para dissolver o carbopol no hidróxido de sódio 1M, deixar a mistura assentar durante aproximadamente 1 hora. Durante este período de tempo, agitar a mistura usando uma vareta de vidro. Passada uma hora, medir o pH da mistura. Um pH baixo indica que o Carbopol não está completamente dissolvido. O pH que se pretende obter é de 7,4. Usar hidróxido de sódio 5M para ajustar o pH. Isto obtém-se adicionando lentamente gotas de hidróxido de sódio 5M à mistura, mexendo a mistura e medindo o seu pH. Usualmente, demora 1 hora para ajustar o pH em 7,4. Uma vez que o pH de 7,4 seja obtido, cobrir o 93 gel e deixá-lo assentar durante 2 a 3 horas. Após este período de tempo, verificar o pH para garantir que ainda está em 7,4. Se tiver mudado, voltar a ajustá-lo para 7,4 usando hidróxido de sódio 5M. Deixar o gel assentar durante algumas horas para garantir que o pH está estável em 7,4. Repetir o processo até o pH desejado ser obtido e permanecer estável. Rotular o contentor com o nome do gel e a data. 0 gel é para ser usado para produzir nanopasta dentro de uma semana. 2. Procedimento para a produção de nanopasta Adicionar suficientes microsferas de 0,1 ym a 3 ym a água para produzir uma suspensão de microsferas a 20 %. Pôr 8 mL de gel carbopol a 5% p/v num béquer de vidro. Adicionar 2 mL de suspensão de microsferas a 20% ao béquer. Utilizando uma vareta de vidro ou uma espátula de mistura, agitar a mistura até as microsferas estarem perfeitamente dispersas no gel. Isto normalmente leva 30 minutos. Uma vez que as microsferas estejam dispersas no gel, colocar a mistura num frasco de armazenagem. Guardar o frasco a 4°C. Deve ser usado no prazo de um mês. EXEMPLO 11

LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE TAXOL A PARTIR DE MICROSFERAS COMPOSTAS POR UMA COMBINAÇÃO DE CO-POLÍMERO DE ACETATO DE ETILENOVINILO E POLI (ÁCIDO D,L-LÁCTICO). TESTES IN VIVO DAS MICROSFERAS NO ENSAIO CAM

Este exemplo descreve a preparação de microsferas impregnadas com taxol compostas por uma combinação de polimero biodegradável poli(ácido d,l-láctico) (PLA) e copolímero de acetato de etilenovinilo (EVA) não degradável. Adicionalmente, são demonstradas a taxa de 94 libertação in vitro e a actividade anti-angiogénica do taxol libertado a partir das microsferas colocadas numa CAM.

Os reagentes que foram utilizados nestas experiências incluem o taxol que é adquirido na Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO); PLA (peso molecular 15 000 - 25 000) e EVA (60% de acetato de vinilo (adquirido na Polysciences (Warrington, PA) ; álcool polivinilico (PVA) (peso molecular 124 000 -186 000), 99% hidrolisado adquirido na Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)) e diclorometano (DCM) (Grau para HPCL, obtido na Fisher Scientific Co). É utilizada água destilada ao longo do processo. A. Preparação de microsferas

As microsferas são preparadas essencialmente como descrito no exemplo 8, utilizando o método de evaporação de solvente. Resumidamente, são preparadas soluções poliméricas a 5% p/v em 20 mL de DCM usando combinações de EVA:PLA entre 35:65 a 90:10. Para 5 mL de PVA a 2,5% p/v em água num frasco de vidro de 20 mL é adicionado 1 mL da solução de polímero gota-a-gota com agitação. Seis frascos similares são reunidos num dispositivo de teste suspenso para dissolução e agitação com seis posições (Vanderkamp) e agitados a 200 rpm. A temperatura dos frascos é aumentada da temperatura ambiente para 40 °C durante 15 minutos e mantida a 40 °C durante 2 horas. Os frascos são centrifugados a 500x g e as microsferas são lavadas três vezes em água. Em algumas combinações poliméricas EVA:PLA, as amostras de microsferas agregaram durante a fase de lavagem devido à remoção do agente dispersador ou emulsificante, PVA. Este efeito de agregação pode ser analisado semi-quantitativamente, já que as microsferas 95 agregadas fundidas e massa de polímero fundido flutuava na superfície da água de lavagem. Esta camada polimérica superficial é removida durante os tratamentos de lavagem e as microsferas em pellet restantes são pesadas. A percentagem de agregação é determinada a partir de % agregação = 1 - (peso das microsferas em pellet x 100 peso polimérico inicial

As microsferas impregnadas de taxol (taxol a 0,6% p/p) são preparadas dissolvendo o taxol na solução polimérica a 5% p/v em DCM. A combinação polimérica usada é 50:50 de EVA:PLA. Uma fracção de dimensão "grande" e uma fracção de dimensão "pequena" de microsferas são produzidas adicionando a solução taxol/polímero gota-a-gota em PVA a 2,5% p/v e PVA a 5% p/v, respectivamente. As dispersões são agitadas a 40°C a 200 rpm durante 2 horas, centrifugadas e lavadas 3 vezes em água como descrito anteriormente. As microsferas são secadas ao ar e as amostras são medidas usando um microscópio óptico com um micrómetro de plataforma. São contadas mais de 300 microsferas por amostra. Microsferas de controlo (sem taxol) são preparadas e medidas como descrito anteriormente. B. Eficiência de encapsulação

Pesos conhecidos de microsferas impregnadas de taxol são dissolvidos em 1 mL de DCM, 20 mL de acetonitrilo a 40 % em água a 50°C são adicionados e colocados em vortex até o DCM ter evaporado. A concentração de taxol no acetonitrilo a 40 % é determinada por HPLC usando uma fase móvel de água:metanol: acetonitrilo (37:5:58) a um fluxo de 1 mL/min (bomba isocrática Beckman), uma coluna de fase reversa C8 (Beckman) e detecção UV a 232 nm. Para determinar a 96 eficiência de recuperação deste procedimento de extracção, pesos conhecidos de taxol de 100 - 1000 yg são dissolvidos em 1 mL de DCM e sujeitos ao mesmo procedimento de extracção em triplicado como descrito anteriormente. As recuperações são sempre superiores a 85% e os valores de eficiência de encapsulação são adequadamente corrigidos. C. Estudos de libertação de fármaco

Em tubos de vidro de 15 mL com tampa de enroscar são colocados 10 mL de solução salina de fosfato tamponizada 10 mM (PBS), pH 7,4 e 35 mg de microsferas impregnadas de taxol. Os tubos são agitados a 37 °C e a determinados intervalos de tempo, centrifugados a 1500x g durante 5 minutos e o sobrenadante guardado para análise. Os pellets de microsferas são ressuspendidos em PBS fresco (10 mL) a 37°C e reincubados. As concentrações de taxol são determinadas por extracção em 1 mL de DCM seguido de evaporação para secar sob uma corrente de azoto, reconstituição em 1 mL de acetonitrilo a 40% em água e análise usando HPLC, como descrito anteriormente. D. Microscopia electrónica de varrimento (SEM)

As microsferas são colocadas em suportes para amostras revestidas com ouro aos salpicos, e são obtidas micrografias utilizando um SEM Philips 501B operando a 15 kV.

E. Estudos CAM

Embriões de pinto doméstico fertilizados são incubados durante 4 dias antes da cultura sem casca. Os conteúdos do ovo são incubados numa humidade relativa de 90% e 3% de CO2 durante 2 dias. No 6° dia de incubação são colocados directamente na superfície da CAM uma aliquota de 1 mg de 97 microsferas impregnadas de taxol a 0,6 % ou controlo (sem taxol). Após 2 dias de exposição a vasculatura é examinada usando um estereomicroscópio conjugado com uma câmara de vídeo; os sinais vídeo são então exibidos num computador e impressos em vídeo. F. Resultados

As microsferas preparadas a partir de EVA a 100 % são livremente suspensas em soluções de PVA mas agregadas e coalescidas ou fundidas extensivamente na lavagem subsequente em água para remover o PVA. A combinação EVA com uma proporção crescente de PLA produziu microsferas que apresentam uma tendência decrescente para agregar e coalescer quando lavadas em água, como descrito na Figura 15A. Uma combinação 50:50 de EVA:PLA formou microsferas com boa estabilidade física, isto é, as microsferas permaneceram discretas e bem suspensas com agregação e coalescência negligenciáveis. O intervalo de tamanho para fracção de microsferas de "pequena" dimensão é determinado como sendo > 95% da amostra de microsferas (por peso) entre 10 - 30 mm e para a fracção de "grande" dimensão, > 95 % da amostra (por peso) entre 30 - 100 mm. Micrografias electrónicas por varrimento representativas de microsferas de 50:50 de EVA:PLA impregnadas de taxol nos intervalos de tamanho " grande" e "pequeno" são apresentados nas Figuras 15B e 15C, respectivamente . As microsferas são esféricas com uma superfície suave e sem qualquer evidência de fármaco sólido na superfície das microsferas. A eficiência da impregnação de microsferas 50:50 de EVA:PLA com taxol situa-se entre 95 - 100 % em concentrações de taxol iniciais entre 100 - 1000 mg de taxol por 50 mg de polímero. Não existe diferença 98 significativa (teste t-Student, p < 0,05) entre as eficiências de encapsulação para as microsferas "pequenas" ou "grandes". O decurso de tempo para a libertação de taxol a partir das microsferas de 50:50 de EVA:PLA impregnadas a 0,6 % p/v é apresentado na Figura 15D para as microsferas de "pequena" dimensão (círculos abertos) e de "grande" dimensão (círculos fechados) os estudos sobre as taxas de libertação são efectuados em tubos em triplicado em 3 experiências separadas. Os perfis de libertação são bifásicos com uma libertação inicial do taxol rápida fase "explosiva" ocorrendo nos primeiros 4 dias em ambas as amplitudes de dimensão de microsferas. Isto é seguido por uma fase de libertação muito mais lenta. Não existe diferença significativa entre as taxas de libertação para as microsferas "pequenas" e grandes". Entre 10 - 13 % do conteúdo total de taxol das microsferas é libertado em 50 dias.

As microsferas impregnadas de taxol (impregnação a 0.6% p/v) são testadas usando os ensaios CAM e os resultados são apresentados na Figura 15E. As microsferas de taxol libertaram substância suficiente para produzir uma zona de avascularidade no tecido circundante (Figura 15F). Note-se que imediatamente adjacente às microsferas (nas Figuras 15E e 15F) está uma área na qual os vasos sanguíneos estão completamente ausentes (Zona 1); um pouco mais afastado das microsferas existe uma área de capilares, com rupturas, não funcionantes (Zona 2); é apenas a uma distância de aproximadamente 6 mm das microsferas que os capilares voltam ao normal. Em CAM tratadas com microsferas de 99 controlo (sem taxol) existe uma arquitetura em rede capilar normal.

Discussão A quimioembolização arterial é uma técnica cirúrgica invasiva. Por isso, idealmente, uma formulação quimioembólica de urna substância anti-angiogénica e anti-cancerígena tal como o taxol libertaria a substância no local do tumor em concentrações suficientes para actividade por um período prolongado de tempo, na ordem de vários meses. EVA é um polímero não degradável compatível com o tecido que tem sido usado extensivamente para a distribuição controlada de macromoléculas por períodos de tempo longos (> 100 dias). 0 EVA é inicialmente seleccionado como um biomaterial polimérico para a preparação de microsferas com taxol disperso na matriz de polímero. Contudo, microsferas preparadas com 100 % de EVA agregaram e coalesceram quase completamente durante o processo de lavagem.

Polímeros e copolímeros baseados em ácido láctico e ácido glicólico são fisiologicamente inertes e biocompatíveis e degradam-se por hidrólise em produtos toxicologicamente aceitáveis. Copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico têm taxas de degradação mais rápidas do que o PLA e as microsferas impregnadas de fármaco, preparadas usando estes copolímeros não são adequadas para a libertação prolongada controlada durante vários meses. Doilinger e Sawan combinaram PLA com EVA e mostraram que o tempo de vida de degradação do PLA aumenta à medida que a proporção de EVA na combinação aumenta. Estes autores sugerem que combinações de EVA e PLA devem fornecer uma matriz de 100 polímero com uma melhor estabilidade mecânica e controlo da taxa de libertação de fármaco do que o PLA. A Figura 15 mostra que aumentando a proporção de PLA numa combinação EVA: PLA diminuía a extensão da agregação das suspensões de microsferas. Combinações de 50 % ou menos de EVA na matriz EVA: PLA produzia suspensões de microsferas fisicamente estáveis em água ou PBS. Uma combinação de 50:50 de EVA: PLA é seleccionada para todos os estudos subsequentes.

Diferentes fracções de tamanho de dimensão das microsferas podem ser preparadas alterando a concentração do emulsionante, PVA, na fase aquosa. Microsferas "pequenas" são produzidas na maior concentração de PVA a 5% p/v, enquanto que as microsferas "grandes" são produzidas de PVA a 2,5% p/v. Todas as outras variáveis de produção são idênticas para ambas as fracções de tamanho das microsferas. A concentração mais alta de emulsionante fornecia um meio de dispersão aquoso mais viscoso e produzia gotas mais pequenas de polímero/taxol/DCM emulsifiçados na fase aquosa e desta forma microsferas mais pequenas. As microsferas impregnadas de taxol continham 95 - 100 % do taxol inicial adicionado à fase orgânica encapsulado nas microsferas sólidas. A baixa solubilidade em água do taxol favorece a partição na fase orgânica contendo o polímero.

Taxas de libertação do taxol das microsferas 50,50 de EVA:PLA são muito lentas com menos de 15% do taxol impregnado a ser libertado em 50 dias. A fase explosiva inicial da libertação de fármaco pode ser devida à difusão 101 de fármaco a partir da região superficial das microsferas (perto da superfície das microsferas).

Pensa-se que o mecanismo de libertação de fármaco, a partir das matrizes poliméricas não degradáveis, tais como EVA, envolve a difusão de água através da fase de fármaco disperso dentro do polímero, a dissolução de fármaco e difusão de um soluto por uma série de poros interligados cheios de fluido. Combinações de EVA e PLA têm sido mostradas como sendo imiscíveis ou bicontínuas num intervalo de 30 a 70 % de EVA em PLA. Em estudos sobre a degradação em tampão PBS a 37°C, após um período de indução ou retardamento, o PLA degradou-se hidroliticamente e desgastou-se por erosão da matrix de combinação polimérica EVA:PLA, deixando um esqueleto esponjoso inactivo. Embora o período de indução e a taxa de degradação e erosão de PLA das matrizes combinadas dependesse da proporção de PLA na matriz e na história do processo, a perda de PLA é consistentemente pequena ou inexistente até passados 40-50 dias.

Embora possa ter ocorrido alguma erosão do PLA das microsferas 50:50 EVA:PLA nos 50 dias do estudo da taxa de libertação in vitro (Figura 15C), é provável que o mecanismo primário de libertação de fármaco, a partir da combinação polimérica, seja a difusão de soluto através de uma rede porosa na matriz polimérica.

Na conclusão do estudo da taxa de libertação, as microsferas são analisadas a partir da quantidade de substância que sobra. Os valores para a percentagem de taxol restante nas amostras de microsferas no 50° dia de 102 incubação são 94% +/- 9% e 89% +/- 12% para microsferas de fracção de tamanho "grande" e "pequeno", respectivamente.

Microsferas impregnadas com 6 mg por mg de polímero (0,6%) fornecem uma inibição extensiva da angiogénese quando colocadas na CAM de pinto embrionário (Figuras 15E e 15F). EXEMPLO 12

ENCAPSULAÇÃO DE TAXOL EM MICROSFERAS POLI(E- CAPROLACTONA). INIBIÇÃO DA ANGIOGÉNESE NO ENSAIO CAM POR MICROSFERAS IMPREGNADAS DE TAXOL

Este exemplo avalia o perfil da taxa de libertação in vitro do taxol a partir de microsferas biodegradáveis de poli (e-caprolactona) e demonstra a actividade anti-angiogénica do taxol libertado destas microsferas quando colocadas na CAM. Os reagentes que foram utilizados nestas experiências incluem: poli(e-caprolactona) ("PCL") (peso molecular de 35 000 - 45 000; adquirido na Polysciences (Warrington, PA)); diclorometano ("DCM") da Fisher Scientific Co, Canadá; Álcool polivinílico ("PVA") (peso molecular de 12 000 a 18 000, 99% hidrolizado) da Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, Wis.); e taxol da Sigma Chemical Co. (St louis, MO). A menos que referido de modo contrário todos os químicos e reagentes são usados tal e qual são fornecidos. Água destilada é utilizada ao longo do processo. A. Preparação de microsferas

As microsferas são preparadas essencialmente como descrito no Exemplo 8 utilizando o método de evaporação do solvente. Resumidamente, são preparadas microsferas impregnadas de taxol a 5% p/v através da dissolução de 10 mg de taxol e 190 mg de PCL em 2 mL de DCM, adicionando a 100 mL de 103 solução aquosa PVP a 1% e agitando a 1000 rpm a 25°C durante 2 horas. A suspensão de microsferas é centrifugada a lOOOx g durante 10 minutos (Beckman GPR), o sobrenadante é removido e as microsferas são lavadas três vezes com água. As microsferas lavadas são secas ao ar durante a noite e armazenadas à temperatura ambiente. Microsferas de controlo (sem taxol) são preparadas como acima descrito. Microsferas contendo 1% e 2% de taxol são também preparadas. As microsferas são medidas usando um microscópio óptico com um micrómetro de plataforma. B. Eficiência de encapsulacão

Um peso conhecido de microsferas impregnadas de substância (cerca de 5 mg) é dissolvido em 8 mL de acetonitrilo e 2 ml de água destilada são adicionados para precipitar o polimero. A mistura é centrifugada a 1000 g durante 10 minutos e a quantidade de taxol encapsulado é calculada a partir da absorvância do sobrenadante medida num espectofotómetro UV (Hewlett-Packard 8452A Diode Array Spectrophotometer) a 232 nm. C. Estudos da libertação de fármaco

Cerca de 10 mg de microsferas impregnadas de taxol são suspensas em 20 mL de solução salina tamponada de fosfato lOmM (PBS), pH 7,4, em tubos com tampa de enroscar. Os tubos são agitados ponta-a-ponta a 37°C e a determinados intervalos de tempo são removidos 19,5 mL de sobrenadante (depois de deixar as microsferas assentar no fundo), filtrado através de um filtro de membrana de 0,45 mm e guardado para análise ao taxol. Um volume igual de PBS é reposto em cada tubo para manter as condições de imersão ao longo do estudo. Os filtrados são extraídos com DCM 3x1 mL, os extractos DCM evaporam até secarem debaixo de uma 104 corrente de azoto redissolvido em 1 mL de acetonitrilo e analisado por HPLC usando uma fase móvel de água: métanol: acetonitrilo (37:5:58) numa velocidade de fluxo de 1 mL min (Bomba isocrática Beckman), uma coluna de fase reversa C8 (Beckman), e detecção UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.

D. Estudos da CAM

Embriões de pinto doméstico fertilizados são incubados durante 4 dias antes da cultura sem casca. No 6o dia da incubação, aliquotas de lmg de microsferas impregnadas de taxol a 5% ou de controlo (sem taxol) são colocadas directamente na superfície da CAM. Após uma exposição de 2 dias a vasculatura é examinada usando um estereomicroscópio combinado com uma câmara de vídeo; os sinais vídeo são então exibidos num computador e impressos em vídeo. E. Microscopia electrónica de varrimento

As microsferas são colocadas em suportes para amostras, revestidas aos salpicos com ouro e então colocadas num microscópio electrónico de varrimento Philips 501B operando a 15 kv. F. Resultados O intervalo de tamanhos para as amostras de microsferas situa-se entre 30-100 mm, embora haja evidência em todas as massas de microsferas de controlo ou impregnadas de taxol de algumas microsferas que caem fora deste intervalo. A eficiência de impregnação de microsferas PCL com taxol é sempre maior do que 95% para todas impregnações de fármaco estudadas. Microscopia electrónica por varrimento demonstrou que as microsferas são todas esféricas e muitas exibem uma morfologia de superfície áspera ou corroída. 105

Parece não ter havido evidência de fármaco sólido na superfície das microsferas.

Os cursos de tempo da libertação de taxol de microsferas PCL impregnadas a 1%, 2%, e 5% são apresentados na Figura 16A. Os perfis da taxa de libertação são bifásicos. Há uma libertação inicial rápida do taxol ou "fase explosiva" em todas as impregnações de substância. A "fase explosiva" ocorreu 1-2 dias na impregnação de taxol a 1% e 2% e durante 3-4 dias nas microsferas impregnadas a 5%. A fase inicial de libertação rápida é seguida por uma fase de libertação de fármaco significativamente mais lenta. Para microsferas contendo taxol a 1% ou 2% não há mais libertação do fármaco após 21 dias. Na impregnação do taxol a 5% as microsferas tinham libertado cerca de 20% do conteúdo total de fármaco após 21 dias. A Figura 16B mostra CAMs tratadas com microsferas PCL de controlo e a Figura 16C mostra tratamento com microsferas impregnadas de taxol a 5%. A CAM com as microsferas de controlo apresenta uma arquitectura de rede capilar normal. A CAM tratada com microsferas PCL-taxol apresenta uma marcada regressão vascular e zonas que são desprovidas de uma rede capilar. G. Discussão O método de evaporação de solvente para manufactura de microsferas impregnadas de taxol produziu eficiências de encapsulação de taxol muito elevadas de entre 95-100%. Isto deve-se à baixa solubilidade em água do taxol e a sua natureza hidrofóbica favorecendo a partição no solvente da fase orgânica contendo o polímero. 106 O perfil de libertação bifásico para o taxol é típico do padrão de libertação para muitos fármacos a partir de matrizes poliméricas biodegradáveis. Poli(e-caprolactona) é um poliéster alifático que pode ser degradado pela hidrólise sob condições fisiológicas e é não tóxico compatível com o tecido. A degradação do PCL é significativamente mais lenta do que a dos polímeros e copolímeros de ácidos lácticos e glicólicos extensivamente investigados e é desta forma adequado para a concepção de sistemas de libertação de fármaco a longo termo. Pensa-se que a fase inicial rápida ou explosiva de libertação do taxol se deve à libertação difusional de fármaco a partir da região superficial das microsferas (perto da superfície das microsferas). Libertação de taxol na segunda fase (mais lenta) dos perfis de libertação não é provavelmente devida à degradação ou erosão do PCL já que tem sido mostrado por estudos que sob condições in vitro em água não há perda de peso significativa ou erosão da superfície do PCL num período de 7,5 semanas. A fase mais lenta da libertação de taxol é provavelmente devida à dissolução da substância em poros cheios de fluído na matriz do polímero e difusão através dos poros. A maior taxa de libertação numa mais elevada impregnação de taxol é provavelmente o resultado de uma mais extensiva rede de poros dentro da matriz do polímero.

Tem-se demonstrado que as microsferas com taxol com impregnação a 5% libertam substância suficiente para produzir uma inibição extensiva da angiogénese quando colocadas na CAM. A inibição do crecimento dos vasos sanguíneos resultou numa zona avascular como mostra a Figura 16C. 107 EXEMPLO 13

FILMES POLIMÉRICOS IMPREGNADOS DE TAXOL COMPOSTOS DE ACETATO DE ETILENOVINILO E UM SURFACTANTE

Dois tipos de filmes são preparados essencialmente como descrito no exemplo 10: filmes de EVA puro impregnados com taxol e filmes de combinação EVA/surfactante (i.e., Pluronic F127, Span 80 ePluronic L101) impregnados com taxol.

Os surfactantes a ser examinados são dois surfactantes hidrofóbicos (Span 80 e Pluronic L101) e um surfactante hidrofilico (Pluronic F127). Os surfactantes plurónicos são eles próprios polímeros, o que é uma propriedade atractiva já que podem ser combinados com EVA para optimizar várias propriedades de libertação de fármaco. Span 80 é uma molécula mais pequena que está de algum modo dispersa na matriz do polímero e que não forma uma combinação.

Os surfactantes serão úteis na modulação das taxas de libertação do taxol dos filmes e na optimização de determinados parâmetros físicos dos filmes. Um aspecto dos filmes de combinação de surfactante que indica que as taxas de libertação de fármaco podem ser controladas é a capacidade de variar a taxa e extensão na qual o componente irá aumentar de volume na água. A difusão de água numa matriz polímero-substância é crítica na libertação de substância a partir do transportador. As Figuras 17C e 17D mostram o grau de aumento de volume dos filmes à medida que o nível de surfactante na combinação é alterado. Filmes de EVA puro não aumentam de volume de modo significativo em mais de 2 meses. Contudo, aumentando o nível de surfactante adicionado ao EVA é possível aumentar o grau de inchaço do 108 composto e aumentando a hidrofilia, o inchaço também pode ser aumentado.

Resultados de experiências com estes filmes são apresentados abaixo nas Figura 17A-E. Resumidamente, a Figura 17A mostra a libertação do taxol (em mg) ao longo do tempo a partir dos filmes de EVA puro. A Figura 17B mostra a percentagem de fármaco que sobra para os mesmos filmes. Como pode ser visto a partir destas figuras, quando a impregnação de taxol aumenta (i.e., é aumentada a percentagem de taxol por peso), as taxas de libertação de fármaco aumentam, mostrando a dependência da concentração esperada. Quando a impregnação de taxol aumenta, a percentagem de taxol que fica no filme também aumenta, indicando que uma maior impregnação pode ser mais atractiva para formulações de libertação a longo prazo. A elasticidade e resistência fisica do filme são avaliadas na Figura 17E. Resumidamente, a Figura 17E apresenta curvas de tensão/contorção para filmes de EVA puro ou de combinação EVA-Surfactante. Esta medição grosseira da tensão demonstra que a elasticidade dos filmes é aumentada com a adição de Pluronic F127 e que a resistência à tensão (tensão de ruptura) é aumentada de uma maneira dependente da concentração com a adição de Pluronic F127. Elasticidade e resistência são considerações importantes na concepção de um filme que pode ser manipulado para aplicações clinicas particulares sem causar deformação permanente do composto.

Os dados acima demonstram a capacidade de alguns aditivos de surfactante para controlar as taxas de libertação do fármaco e para alterar as característricas físicas do veículo. 109 EXEMPLO 14

INCORPORAÇÃO DE METOXIPOLIETILENO GLICOL 350 (MEPEG) EM POLI(E-CAPROLACTONA) PARA DESENVOLVER DMA FORMULAÇÃO PARA A DISTRIBUIÇÃO CONTROLADA DE TAXOL A PARTIR DE UMA PASTA

Reagentes e equipamento que foram utilizados nestas experiências incluem metoxipolietileno glicol 350 ("MePEG" Union Carbide Danbury, CT). O MePEG é liquido à temperatura ambiente e tem um ponto de congelação de 10° a -5°C.

A. Preparação de uma pasta contendo taxol MePEG/PCL A pasta MePEG/PCL é preparada dissolvendo primeiro uma quantidade de taxol Em MePEG e então incorporando esta em PCL fundido. Uma vantagem deste método é que não é necessário qualquer DCM. B. Análise do ponto de fusão O ponto de fusão das combinações poliméricas PCL/MePEG pode ser determinado pela calorimetria de varrimento diferencial de 30° a 70° a uma taxa de aquecimento de 2,5 °C por minuto. Os resultados desta experiência são apresentados nas Figuras 18A e 18B. Resumidamente, como apresentado na Figura 18A o ponto de fusão da combinação de polímero (como determinado por análise térmica) é diminuído pelo MePEG de uma forma dependente da concentração. O ponto de fusão das combinações de polímero como uma função da concentração de MePEG é apresentado na Figura 18A. Este ponto de fusão mais baixo também se traduz num tempo aumentado para as combinações de polímero solidificarem a partir do fundido como apresentado na Figura 18B. Uma combinação 30:70 de 110

MePEG:PCL demora mais de o dobro do tempo a solidificar a partir do fluido fundido do que o PCL isoladamente. C. Medição da fragilidade A incorporação de MePEG em PCL parece produzir um sólido menos frágil, quando comparado com o PCL isoladamente. Como forma de quantificar isto dum modo "grosseiro", uma agulha pesada é deixada cair em combinações de polímero de igual peso contendo desde 0% a 30% de MePEG em PCL, e a distância que a agulha penetra no sólido é então medida. O gráfico resultante é apresentado na Figura 18C. Pontos são dados como a média de quatro medições +/- 1 D.P.

Com o propósito de comparação, uma amostra de cera de parafina é também testada e a agulha penetra nesta 7,25 mm +/- 0,3 mm. D. Medição da libertação de taxol

Pellets de polímero (PCL contendo 0%, 5%, 10% ou 20% de

MePEG) são incubados numa solução salina de fosfato tamponizada (PBS, pH 7,4) a 37°C, e a % de alteração no peso de polímero é medida ao longo do tempo. Como pode ser visto na Figura 18D, a quantidade de peso perdido aumenta com a concentração de MePEG originalmente presente na combinação. É provável que esta perda de peso seja devida à libertação de MePEG da matriz do polímero para o fluido de incubação. Isto indicaria que o taxol será imediatamente libertado de uma combinação MePEG/PCL já que o taxol é primeiro dissolvido em MePEG antes de ser incorporado no PCL. E. Efeitos de quantidades variáveis de MePEG na libertação de taxol 111 São feitas termopastas contendo entre 0,8% e 20% de MePEG em PCL. Estas são impregnadas com l%de taxol. A libertação de taxol ao longo do tempo a partir de 10 mg de pellets em tampão PBS a 37°C é monitorizada usando HPLC. Como mostra a Figura 18E, a quantidade de MePEG na formulação não afecta a quantidade de taxol que é libertada. F. Efeito de quantidades variáveis de taxol na quantidade total de taxol libertado a partir de uma combinação MePEG/PCL a 20% São feitas termopastas contendo MePEG a 20% em PCL e impregnadas com taxol entre 0,2% e 10%. A libertação de taxol ao longo do tempo é medida como acima descrito. Como se pode ver na Figura 18F, a quantidade de taxol libertada ao longo do tempo aumenta com o aumento da impregnação em taxol. Quando representado em função da percentagem total de taxol libertada, no entanto, a ordem é invertida (Figura 18G). Isto dá informação acerca do taxol residual que permanece na pasta e, se forem feitas inferências a cerca da validade da extrapolação destes dados, permite uma projecção do período de tempo durante o qual o taxol será libertado a partir da termopasta MePEG a 20%.

G. Análise da resistência em composições variáveis de MePEG/PCL

Foi utilizado um aparelho de teste mecânico de resistência CT-40 para medir a resistência das "tabletes" de polímero sólido de diâmetro 0,88 cm e uma espessura média de 0,560 cm. As tabletes de polímero são combinações de MePEG a concentrações de 0%, 5%, 10% ou 20% em PCL.

Os resultados deste teste são apresentados na Figura 18H, em que quer a resistência de tracção quer o tempo de 112 fracasso são representados como uma função da % de MePEG na combinação. A ANOVA de uma variável indicou que as espessuras de tablete dentro de cada grupo não são diferentes. Como pode ser visto a partir da Figura 18H, a adição de MePEG em PCL diminuiu a dureza do sólido resultante. EXEMPLO 15

EFEITO DA TERMOPASTA IMPREGNADA DE TAXOL IN VIVO

Embriões fertilizados de pinto doméstico foram incubados durante 4 dias antes da cultura sem casca como descrito no Exemplo 2. Os conteúdos do ovo são removidos da casca e esvaziados para tijelas de vidro de fundo redondo esterilizadas e cobertos com tampas de placas de petri. 0 taxol é incorporado em termopasta em concentrações de 5%, 10% e 20% (p/v) essencialmente como acima descrito (ver

Exemplo 10), e usado nas seguintes experiências. Termopasta cortada e seca é então aquecida a 60°C e comprimida entre duas folhas de parafilme, ficando achatada, e deixada a arrefecer. Seis embriões receberam termopasta impregnada de taxol a 20% e seis embriões receberam termopasta nâo- impregnada preparada deste modo. Um embrião em cada grupo morreu deixando 5 embriões em cada grupo, de controlo e tratado.

Termopasta não-impregnada e termopasta contendo taxol a 20% foram também aquecidas a 60°C e colocadas directamente na extremidade crescente da cada CAM no 6o dia de incubação; dois embriões de cada grupo foram tratados deste modo. 113 Não houve diferença observável nos resultados obtidos usando os diferentes métodos de administração, indicando que a temperatura da pasta no momento da aplicação não era factor a considerar no resultado.

Termopasta com taxol a 10% foi aplicada a 11 CAMs e termopasta não-impregnada a outros 11 CAMs, enquanto termopasta impregnada com taxol a 5% foi aplicada a 10 CAMs e termopasta não- impregnada a outros 10 CAMs de controlo. Após uma exposição de 2 dias (8 o dia da incubação) a vasculatura foi examinada com a ajuda de um estereomicroscópio. Liposyn II, uma solução branca opaca, foi injectada na CAM para aumentar a visibilidade dos detalhes vasculares.

Nos embriões tratados com pasta impregnada de taxol a 5%, apenas 2 animais demonstraram inibição máxima da angiogénese, enquanto os 8 restantes foram apenas marginalmente afectados. Dos animais tratados com termopasta impregnada de taxol a 10%, apenas 2 animais demonstraram inibição máxima da angiogénese, enquanto os outros 9 foram apenas marginalmente afectados. A termopasta impregnada de taxol a 2 mostrou áreas de avascularidade extensas, (ver Figura 19B) em todas as 5 CAMs que receberam este tratamento. O grau mais elevado de inibição foi definido como uma região de avascularidade cobrindo 6 mm por 6 mm de dimensão. Todas as CAMs tratadas com termopasta impregnada de taxol a 20% exibiram este grau de inibição da angiogénese.

Comparativamente, a termopasta de controlo (não-impregnada) não inibiu a angiogénese da CAM (ver Figura 19A) ; esta 114 visão de ampliação elevada (note-se que, a extremidade da pasta é vista no cimo da imagem) demonstra que os vasos adjacentes a pasta não foram afectados pela termopasta. Isto sugere que o efeito observado é devido à libertação sustida do taxol e não se deve ao próprio polímero ou a um efeito secundário, de pressão da pasta sobre a vasculatura em desenvolvimento.

Este estudo demonstra que a termopasta liberta quantidades suficientes de inibidor da angiogénese (neste caso taxol) para inibir o desenvolvimento normal da vasculatura da CAM. EXEMPLO 16

EFEITO DA TERMOPASTA IMPREGNADA DE TAXOL NO CRESCIMENTO TUMORAL E NA ANGIOGÉNESE DO TUMORAL IN VIVO

Embriões fertilizados de pinto doméstico forem incubados durante 3 dias antes de lhes serem removidas as cascas. Os conteúdos do ovo são esvaziados através da remoção da casca localizada em torno do espaço vazio, separando a membrana da casca interior, perfurando a extremidade oposta da casca e deixando os conteúdos do ovo deslizar delicadamente para fora através da ponta aberta. Os conteúdos são esvaziados para dentro de tijelas de vidro de fundo redondo esterilizadas e cobertos com tampas de placas de petri e incubados a 90& de humidade relativa e dióxido de carbono a 3% (ver Exemplo 2) . São injectadas células MDAY-D2 (um tumor linfático murino) em ratinhos e deixadas crescer até se tornarem tumores com peso entre 0,5-1,0 g. Os ratinhos são sacrificados, os locais de tumor limpos com álcool, excisados, colocados em meio de cultura de tecido estéril, e cortados aos cubos em 115 peças de lmm sob uma câmara de fluxo laminar. Antes de colocar os tumores dissecados nos embriões de pinto de 9 dias de idade, as superfícies da CAM são suavemente raspadas com uma agulha de calibre 30 para garantir a implantação do tumor. Os tumores são então colocados na CAM após 8 dias de incubação (4 dias após a remoção da casca) e deixados a crescer na CAM durante durante 4 dias para estabelecer um abastecimento vascular. Quatro embriões são preparados utilizando este método, cada embrião recebendo 3 tumores. Para estes embriões, um tumor recebe termopasta impregnada de taxol a 20%, o segundo tumor recebe terínopasta não-impregnada, e o terceiro tumor não recebe qualquer tratamento. Os tratamentos prosseguiram durante dois dias antes dos resultados serem registados.

Os tumores MDAY-D2 insertados segregam factores angiogénicos que induzem o crescimento de capilares (derivados da CAM) para dentro da massa do tumor e permitem que estes continuem a crescer em tamanho. Uma vez que todos os vasos do tumor são derivados da CAM, enquanto todas as células tumorais são derivadas do inserto, é possível avaliar o efeito de intervenções terapêuticas nestes dois processos independentemente. Este ensaio tem sido usado para determinar a eficácia da termopasta impregnada de taxol em (a) inibição da vascularização do tumor e (b) inibição do crescimento das próprias células tumorais.

Avaliação por estereomicroscópio directa in vivo e exame histológico de tecidos fixados deste estudo demonstraram o seguinte. Em tumores tratados com termopasta impregnada com taxol a 20%, houve uma redução do número de vasos sanguíneos que abasteciam o tumor (ver Figuras 20C e 20D); uma redução no número de vasos sanguíneos na periferia do 116 tumor (a área que é tipicamente a mais altamente vascularizada num tumor sólido) quando comparados com tumores de controlo. Os tumores começaram a diminuir de tamanho e massa durante os dois dias em que o estudo foi conduzido. Adicionalmente, numerosas células endoteliais foram vistas envolvidas em divisão celular indicando que a proliferação celular endotelial tinha sido afectada. Células tumorais também foram frequentemente observadas envolvidas em mitose. Todos os 4 embriões mostraram um padrão consistente com a termopasta impregnada de taxol a 20% suprimindo a vascularidade do tumor, enquanto a termopasta não- impregnada não tinha qualquer efeito.

Comparativamente, em CAMs tratadas com termopasta não impregnada, os tumores estavam bem vascularizados com um aumento no número e densidade dos vasos quando comparados com aquele do tecido circundante normal, e dramaticamente mais vasos do que foi observado em tumores tratados com pasta impregnada de taxol. Os vasos recém-formados entravam no tumor vindos de todos os ângulos, parecendo raios agarrados ao centro de uma roda (ver Figuras 20A e 20B). Os tumores de controlo continuavam a aumentar em tamanho e massa no decurso do estudo. Histologicamente, numerosos capilares de paredes delgadas dilatados foram vistos na periferia do tumor e pouco endotélio foi observado em divisão celular. O tecido do tumor estava totalmente vascularizado e viável.

Como exemplo, em dois tumores de tamanho semelhante (inicialmente, no momento da inserção) colocados na mesma CAM foram obtidos os seguintes dados. Para o tumor tratado com termopasta impregnadas de taxol a 20% o tumor media 330 mm x 597 mm; a periferia imediata do tumor tinha 14 vasos 117 sanguíneos; enquanto a massa do tumor apenas tinha 3-4 pequenos capilares. Para o tumor tratado com termopasta não-impregnada, o tumor media 623 mm x 678 mm; a periferia imediata do tumor tinha 54 vasos sanguíneos, enquanto a massa do tumor tinha 12-14 pequenos capilares. Adicionalmente, a própria CAM circundante continha muitos mais vasos sanguíneos do que a área circundante do tumor tratado com taxol.

Este estudo demonstra que a termopasta liberta quantidades suficientes de inibidor de angiogénese (neste caso taxol) para inibir a angiogénese patológica que acompanha o crescimento e desenvolvimento tumoral. Sob estas condições a angiogénese é estimulada ao máximo pelas células tumorais que produzem factores angiogénicos capazes de induzir o crescimento de capilares a partir do tecido circundante para dentro da massa do tumor. A termopasta impregnada de taxol a 20% é capaz de bloquear este processo e limitar a capacidade do tecido do tumor para manter um fornecimento de sangue adequado. Isto resulta numa diminuição na massa do tumor através de um efeito citotóxico da substância nas próprias células do tumor e por privar o tecido dos nutrientes requeridos para o crescimento e expansão. EXEMPLO 17

EFEITO DA TERMOPASTA IMPREGNADA DE INIBIDOR DE ANGIOGÉNESE NO CRESCIMENTO TUMORAL IN VIVO NUM MODELO DE TUMOR MURINO O modelo de tumor MDAY-D2 murino pode ser usado para examinar o efeito da libertação local lenta dos compostos quimioterapêuticos e anti-angiogénicos tais como o taxol no crescimento tumoral, formação de metástases a partir de tumores e sobrevivência animal. A linha celular de tumor 118 MDAY-02 cresce numa suspensão celular consistindo de Soro Fetal de Vitela a 5% em meio de alfa mem. As células são incubadas a 37°C numa atmosfera humidificada suplementada com dióxido de carbono a 5%, e são diluidas por um factor de 15 a cada 3 dias até ser obtido um número suficiente de células. A seguir ao periodo de incubação as células são examinadas ao microscópio óptico acerca da viabilidade e são então centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos. É adicionado PBS às células para obter uma diluição de 1 000 000 células por mL. Fêmeas de ratinhos DBA/2j com dez semanas de idade são aclimatizadas por 3-4 dias após a chegada. Cada ratinho é então injectado subcutaneamente no flanco lateral posterior com 100 000 células MDAY-D2 em 100 mL de PBS. Estudos anteriores mostraram que este procedimento produz um tumor visível no local da injecção em 3-4 dias, que alcançam um tamanho de 1,0-1,7 g em 14 dias, e produz metastases visíveis no fígado em 19-25 dias após a injecção. Dependendo do objectivo do estudo uma intervenção terapêutica pode ser instituída em qualquer ponto da progressão da doença.

Utilizando o modelo animal acima, 20 ratinhos são injectados com 140 000 células MDAY-D2 s.c. e deixa-se que o tumor cresça. No 5o dia os ratinhos são divididos em grupos de 5. O local do tumor foi aberto cirurgicamente com anestesia, a região local tratada com a termopasta impregnada com a substância ou termopasta de controlo sem perturbar o tecido tumoral existente, e a ferida foi fechada. Os grupos de 5 receberam ou nenhum tratamento (ferida somente fechada), ou polímero (PCL) isoladamente, termopasta impregnada com taxol a 10%, ou termopasta 119 impregnada com taxol a 20% (só 4 animais injectados) implantada adjacentemente ao local do tumor. No 16° dia, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram dissecados e examinados (grosseira e histologicamente) no que concerne ao crescimento do tumor, metastases do tumor, toxicidade local e sistémica resultantes do tratamento, efeito na cicatrização, efeito na vascularização do tumor, e condição da pasta permanecente no local de incisão.

Os pesos dos tumores de cada animal são apresentados na tabela abaixo:

TABELA IV

Pesos dos Tumores (mg) Animal n° Controlo (vazio) Controlo (PCL) Termopasta Taxol a 10% Termopasta Taxol a 20% 1 1,387 1,137 0,487 0,114 2 0,589 0,763 0, 589 0,192 3 0,461 0,525 0, 447 0,071 4 0,606 0,282 0,274 0,042 5 0,353 0,277 0,362 Média 0,6808 0,6040 0,4318 0,1048 Desv.Padrão 0,4087 0,3761 0,1202 0,0653 Valor de P 0,7647 0,358 0,036

Termopasta impregnada com taxol a 20% reduziu o crescimento do tumor em cerca de 85% (peso médio 0,105) quando comparado com os animais de controlo (peso médio de 0,681). Animais tratados com termopasta isoladamente ou termopasta contendo taxol a 10% tiveram apenas efeitos modestos no crescimento do tumor; os pesos dos tumores foram reduzidos em apenas 10% e 35% respectivamente (Figura 21A) . Por 120 conseguinte, termopasta contendo taxol a 20% foi mais efectiva na redução do crescimento do tumor do que a termopasta contendo taxol a 10% (ver Figura 21C; ver também Figura 21B). A termopasta foi detectada em alguns dos animais no local de administração. Foi detectada variação do peso de polímero entre 0,026 g a 0,078 g em 8 de 15 ratinhos. Todos os animais no grupo contendo termopasta impregnada com taxol a 20% continham algum polímero residual sugerindo que este foi menos susceptível de dissolução. Histologicamente, os tumores tratados com termopasta impregnada com taxol continham uma menor celularidade e mais necrose de tecido do que os tumores de controlo. A vasculatura foi reduzida e células endoteliais foram observadas frequentemente envolvidas em divisão celular. A termopasta impregnada com taxol parece não afectar a integridade ou celularidade da pele ou tecidas em redor do tumor. De grosso modo, a cicatrização não foi afectada. EXEMPLO 18

O USOS DE FILMES CIRÚRGICOS IMPREGNADOS DE INIBIDOR DE ANGIOGÉNESE NA PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DE METASTASES IATROGÉNICAS DAS CÉLULAS TUMORAIS DURANTE A CIRURGIA DE

RESSECÇÃO CANCEROSA

Como um composto de fármaco-polímero estéril, flexível e expandível seria útil durante os procedimentos de ressecção cancerosa. Frequentemente é desejável isolar os tecidos normais circundantes do tecido maligno durante operações de resseção para previnir alastramento iatrogénico da doença aos orgãos adjacentes através da contaminação inadvertida pelas células cancerosas. Um parafilme impregnado de 121 fármaco pode ser estendido ao longo dos tecidos normais antes da manipulação do tumor. Isto seria da maior utilidade se colocado em torno do figado e outros conteúdos abdominais durante a cirurgia de ressecção cancerosa aos intestinos para prevenir o alastramento intraperitonial da doença ao figado. Um filme biodegradável pode ser deixado in situ para fornecer protecção continuada.

Os locais de incisão são também uma localização comum para a recorrência pós-operatória da malignidade. Pensa-se que isto se deve à contaminação do sitio da ferida pelas células tumorais durante o procedimento cirúrgico. Para abordar estes assuntos, estão a ser conduzidas experiências para determinar a capacidade dos filmes impregnados de inibidor de angiogénese para prevenir este fenómeno. A.Materiais e Métodos

Preparação do Filme Cirúrgico. Filmes cirúrgicos são preparados como descrito no Exemplo 10. Filmes finos medindo aproximadamente 1 cm x 1 cm são preparados contendo quer o polímero isoladamente (PCL) ou PCL impregnado de taxol a 5%.

Modelo de Tumor Hepático em Ratos. Num estudo inicial, ratos Wistar pesando aproximadamente 300 g foram submetidos a anestesia geral e uma incisão abdominal de 3-5 cm é feita ao longo da linha média. No maior lobo hepático, é feita uma incisão de 1 cm no parênguima hepático e parte da margem do fígado é resseccionada. Uma concentração de 1 milhão de células tumorais 9L Glioma vivas (eluidas a partir de cultura de tecido imediatamente antes do procedimento) suspensas em 100 mL de solução salina de fosfato tamponizada é depositada na margem cortada do 122 fígado com uma agulha de calibre 30. O filme cirúrgico é então colocado sobre a margem cortada do fígado contendo as células tumorais e afixado no lugar com Gelfoam. Dois animais receberam filmes de PCL contendo taxol a 5%, e dois animais receberam filmes contendo apenas PCL. A parede abdominal é fechada com Dexon 3,0 e agrafos para pele. A anestesia geral é concluída e deixa-se o animal recuperar. Dez dias mais tarde os animais são sacrificados e os fígados examinados histologicamente. B. Resultados

Crescimento local de tumor é observado em dois fígados tratados com polímero isoladamente. Ambos os fígados tratados com polímero e taxol estão completamente livres de tumor quando examinados histologicamente. Também importa referir que, a cápsula do fígado regenerou e cresceu completamente sobre o filme polimérico e a superfície cortada do fígado indicava que não houve efeito significativo na cicatrização. Não há evidência de toxicidade hepática local circundando qualquer (impregnados de substância ou livres de substância) dos filmes cirúrgicos. C. Discussão

Este estudo indica que filmes cirúrgicos colocados em torno de tecido normal e locais de incisão durante a cirurgia podem ser capazes de diminuir a incidência de implantação acidental de células tumorais em tecido normal circundante durante a ressecção de tumores malignos. Isto pode ajudar a reduzir a incidência do problema significativo da recorrência local pós-operatória da doença. 123 EXEMPLO 19

INJECÇÃO INTRA-ARTICULAR DE MICROSFERAS BIODEGRADÁVEIS IMPREGNADAS DE INIBIDOR DE ANGIOGÉNESE NO TRATAMENTO DA

ARTRITE

Dano articular na artrite deve-se a uma combinação de inflamação (incluindo WBCs e produtos de WBC) e desenvolvimento de tecido pano (um tecido composto por tecido neovascular, tecido conectivo e células inflamatórias). 0 taxol foi escolhido para os estudos iniciais porque é um inibidor potente da neovascularização. Deste modo, o taxol em altas concentrações locais provará ser um agente modificador da doença na artrite.

De forma a determinar se as microsferas têm um efeito nocivo nas articulações, foram conduzidas as seguintes experiências. Resumidamente, microsferas de PCL simples e impregnadas de taxol são preparadas como descrito previamente no Exemplo 8.

Três coelhos foram injectados intra-articularmente com microsferas de 0,5-5,0 pm, 10-30 pm ou 30-80 pm num volume total de 0,2 mLs (contendo 0,5 mg de microsferas). As articulações são avalidas visualmente (clinicamente) numa base diária. Após duas semanas os animais são sacrificados e as articulações examinadas histologicamente para evidência de inflamação e deplecção de proteoglicanos.

Os modelos de artrite inflamatória e steoartrite do coelho estão a ser utilizados para avaliar o uso de microsferas na redução da sinovite e da degradação da cartilagem. A artrite degenerativa é induzida por uma ruptura parcial do ligamento cruzado e menisco do joelho. Após 4 a 6 semanas, 124 os coelhos desenvolveram erosões na cartilagem similares às observadas na osteoartrite humana. A artrite inflamatória é induzida imunizando os coelhos com albúmen de soro bovino (BSA bovine serum albumen) em Adjuvante Completo de Freund (CFA - Complete Freund's Adjuvant). Após três semanas, os coelhos contendo um titulo elevado de anti-corpos anti-BSA recebem uma injecção intra-articular de BSA (5 mg). Inchaço das articulações e sinovite pronunciada é evidente ao fim de 7 dias, uma depleção proteoglicana é observada durante 7 a 14 dias e são observadas erosões das cartilagens entre 4 a 6 semanas. A artrite inflamatória é induzida como acima descrito. Após 4 dias, são injectadas microsferas contendo taxol a 5% ou veiculo nas articulações. Um grupo de animais será sacrificado no 14° dia e outro no 28° dia. As articulações são observadas histologicamente em termos de inflamação e degradação da cartilagem. A experiência é concebida para determinar se as microsferas de taxol podem afectar a inflamação das articulações e degradação da matriz das cartilagens.

Microsferas inibidoras da angiogénese podem ainda ser examinadas num modelo osteoartritico. Resumidamente, a artrite degenerativa é induzida em coelhos como acima descrito e as articulações recebem uma injecção intra-articular de microsferas (taxol a 5°% ou apenas veiculo) no 4o dia. Os animais são sacrificados no 21° dia e no 42° dia e as articulações são examinadas histologicamente em busca de evidência de degradação da cartilagem. 125 São conduzidos estudos para avaliar inibidores de angiogénese dispensados via microsferas intra-articulares como agentes condroprotectores.

Resultados

Foram injectadas intra-articularmente microsferas de PCL não-impregnadas de diferentes tamanhos (0,5-5,0 ym, 10-30 ym ou 30-80ym) na articulação do joelho do coelho. Os resultados desta experiência são apresentados nas Figuras 22A a D. Resumidamente a Figura 22A é uma fotografia de sinóvia de articulações injectadas com PBS. A Figura 22B é uma fotografia de articulações injectadas com microsferas. A Figura 22C é uma fotografia de cartilagem de articulações injectadas com PBS, e a Figura 22D é uma fotografia de cartilagem de articulações injectadas com microsferas.

Como pode ser visto a partir destas fotografias, histologicamente, não existem diferenças significativas entre articulações gu recebem uma injecçâo de microsferas e aquelas que não recebem. Clinicamente, não houve evidência de inflamação das articulações durante os 14 dias nos quais a experiência foi conduzida. Na totalidade, não houve evidência de inflamação da articulação ou dano na cartilagem em articulações nas quais são injectadas microsferas, quando comparadas com articulações normais não-tratadas.

Conclusões

As microsferas podem ser injectadas intra-articularmente sem causar quaisquer mudanças discerniveis à superfície da articulação. Isto indica que este método pode ser um meio efectivo de dispensar agentes modificadores de doença de libertação sustida com alvo a articulações doentes, 126 enquanto minimizam a toxicidade que poderia estar associada com a administração sistémica de tais componentes biologicamente activos.

Como acima discutido, as microsferas podem ser formuladas em tamanhos específicos com uma dinâmica de libertação da substância definida. Também foi demonstrado que o taxol é um inibidor potente da angiogénese e que é libertado a partir de microsferas em quantidades suficientes para bloquear a neovasculanização no ensaio da CAM. Assim, a administração intra-articular de microsferas impregnadas de inibidor de angiogénese (por exemplo, impregnadas de taxol) deve ser capaz de bloquear a neovascularização que ocorre em doenças tais como a artrite reumatóide e conduz à destruição da cartilagem na articulação. Deste modo, as microsferas impregnadas de substância podem actuar como agentes condroprotectores que protegem a cartilagem de destruição irreversível de tecido pano neovascular invasivo. A partir da presente divulgação, será observado que, apesar de terem sido aqui descritas formas de realização especificas da invenção, com fins ilustratrivos, podem ser feitas algumas modificações à mesmas sem que haja um afastamento do âmbito da invenção. Desta forma, a invenção não de limita, a não ser nas reivindicações anexas. 127

LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Hunter, William L.

Machan, Lindsay S. Arsenault, A. Larry Burt, Helen M. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Composições anti-angiogénicas e métodos de utilização. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 (iv) MORADA DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) MORADA: SEED AND BERRY (B) RUA: 701 Fifth Avenue, 6300 Columbia Center (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington

(E) PAÍS: USA (F) CÓD. POSTAL: 98104 (v) SUPORTE INFORMÁTICO: (A) MÉDIA: diskete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: patentln Relesa #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 128

(viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO / AGENTE (A) NOME: McMasters, David D. (B) NÚMERO DE REGISTO: 33,963 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA: 110129.401

(ix) INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÃO (A) TELEFONE: (206) 622-4900 (B) TELEFAX: (206) 682-6031 (C) TELEX: 3723836 (2) INFORMAÇÃO SOBRE ID SEQ N° 1:

(i) CARACTERISTICAS SEQUENCIAIS (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoacidos (C) BICATENÁRIO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (xi) DESCRIÇÃO DA SEGUÊNCIA: N° ID SEQ:

Cyz Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5

Lisboa, 18 de Outubro 2007.

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. uma composição compreendendo: (a) paclitaxel (taxol) ou um análogo ou um derivado de paclitaxel, e (b) um transportador polimérico não biodegradável, em que a composição não inclui tetraciclinas ou tetraciclinas quimicamente modificadas, seleccionadas do grupo que consiste em tetraciclinas e derivados de tetraciclinas, selecionados do grupo que consiste em minociclina, clotetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, limeciclina, metaciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, tetraciclina, 4- dedimetilaminotetraciclina, tetraciclinonitrilo, 6-desoxi-6-demetil-4-dedimetilaminotetraciclina, 7-cloro-4-dedimetilaminotetraciclina, 7- clorotetraciclina, 5-hidroxitetraciclina, 6-demetil-7-clorotetraciclina, 6-demetil-5-desoxi-5-hidroxi-6-metilenotetraciclina, 6-alfa-benziltiometilenotetraciclina, 6- fluorodemetiltetraciclina, 2-acetil-8-hidroxi-l- tetraciclina, 6-demetil-6-desoxitetraciclina.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1 em que o referido transportador polimérico é um copolimero EVA.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido transportador polimérico é uma borracha de silicone.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido transportador polimérico é polimetilmetacrilato. 2

5. Composição de acordo com a reivindicação 1 a 4, em que o referido taxol é um taxotere.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida composição é estéril.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, na forma de partículas entre 0,1 e 500 pm.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, na forma de um filme com uma espessura entre 5mm e lOOmm.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para aplicação numa terapia.

10. Uma composição de acordo com a reivindicação 9 para aplicação em tratamento de estenose recorrente.

11. Uma composição de acordo com a reivindicação 9 para o tratamento de anti-angioqenese, controlo de neoplasmas, restenose, neovascularização corneai, cicatrizes e quelóides hipertróficas, retinopatia diabétca proliferativa, artrite reumatóide, malformações arteriovenosas, placas ateroscleróticas, cicatrização retardada de feridas, articulações de hemofílicos, fracturas sem união, síndrome Osler-Weber, psoríase, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, menorragia e aderências vasculares. Lisboa, 18 de Outubro 2007.