ES2106553T5 - Composiciones anti-angiogenicas y metodos de uso. - Google Patents

Composiciones anti-angiogenicas y metodos de uso. Download PDF

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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UN FACTOR ANTIANGIOGENICO Y UN PORTADOR POLIMERICO. EJEMPLOS REPRESENTATIVOS DE FACTORES ANTIANGIOGENICOS INCLUYEN EL FACTOR ANTIINVASIVO, ACIDOS RETINOICOS Y DERIVADOS DE LOS MISMOS, Y TAXOL. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA EMBOLIZAR LOS VASOS SANGUINEOS Y ELIMINAR LAS OBSTRUCCIONES BILIARES, URETRALES, ESOFAGICAS Y TRAQUEO/BRONQUIALES.

Description

Composiciones anti-angiogénicas y métodos de uso.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a composiciones y métodos para tratar el cáncer y otras enfermedades dependientes de la angiogénesis, y más específicamente, a composiciones que contienen factores antiangiogénicos y vehículos polímeros, stents (prótesis dilatables) que han sido revestidos con tales composiciones, así como métodos para utilizar estos stents y composiciones.
Fundamentos de la invención
El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, y responde de más de una quinta parte de la mortalidad total. En resumen, el cáncer se caracteriza por la división incontrolada de una población de células que, en la mayoría de los casos, conduce a la formación de uno o más tumores. Aunque el cáncer se diagnostica en general más fácilmente que en el pasado, muchas formas, aun cuando se detecten precozmente, son todavía incurables.
Se utilizan actualmente una diversidad de métodos para tratar el cáncer, que incluyen por ejemplo diversos procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, si se tratan exclusivamente con cirugía, muchos pacientes (en particular aquéllos que padecen ciertos tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, de cerebro, de colon y hepático) sufrirán una recurrencia del cáncer. Además de la cirugía, muchos cánceres se tratan también con una combinación de terapias que implican fármacos quimioterapéuticos citotóxicos (p. ej., vincristina, vinblastina, cisplatino, metotrexato, 5-FU, etc.) y/o terapia de radiación. Una dificultad con este enfoque, sin embargo, es que los agentes radioterapéuticos y quimioterapéuticos son tóxicos para los tejidos normales, y a menudo producen efectos secundarios amenazantes para la vida. Además, estos métodos tienen a menudo tasas de fallo/remisión extremadamente altas.
Además de las terapias quirúrgica, química y de radiación, otros especialistas han intentado utilizar el propio sistema inmune del individuo con objeto de eliminar las células cancerosas. Por ejemplo, algunos han sugerido el uso de componentes bacterianos o víricos como adyuvantes con objeto de estimular el sistema inmune para destruir las células tumorales (Véase en general "Principles of Cancer Biotherapy", Oldham (compilador), Raven Press, Nueva York , 1987.) Tales agentes se han considerado generalmente útiles como adyuvantes y como estimulantes inespecíficos en modelos de tumor en animales, pero hasta ahora no se ha demostrado que sean eficaces generalmente en los seres humanos.
Las linfoquinas se han utilizado también en el tratamiento del cáncer. En resumen, las linfoquinas son secretadas por una diversidad de células, y tienen generalmente cierto efecto sobre células específicas en la generación de una respuesta inmune. Ejemplos de linfoquinas incluyen las interleuquinas (IL) -1, -2, -3, y -4, así como factores estimulantes de colonias tales como G-CSF, GM-CSF, y M-CSF. Recientemente, un grupo ha utilizado IL-2 para estimular los glóbulos rojos periféricos con objeto de expandir y producir grandes cantidades de células que son citotóxicas para las células tumorales (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 313: 1485-1492, 1985).
Otros investigadores han sugerido el uso de anticuerpos en el tratamiento del cáncer. Resumidamente, pueden desarrollarse anticuerpos que reconocen ciertos antígenos superficiales de las células que son únicos, o más frecuentes en las células cancerosas en comparación con las células normales. Estos anticuerpos, o "balas mágicas", pueden utilizarse sea solos o conjugados con una toxina con objeto de bombardear y destruir específicamente las células tumorales (Dillman, "Antibody Therapy", Principles of Cancer Biotherapy, Oldham (compilador), Raven Press. Ltd., Nueva York, 1987). Sin embargo, una dificultad es que la mayoría de los anticuerpos monoclonales son de origen murino, y por consiguiente su hipersensibilidad contra el anticuerpo murino puede limitar su eficacia, en particular después de terapias repetidas. Efectos secundarios comunes incluyen fiebre, fiebres intermitentes, erupciones en la piel, artritis, y parálisis nerviosas.
Una dificultad adicional de los presentes métodos es que el control de recurrencias locales y enfermedades locales sigue siendo un reto principal en el tratamiento de las enfermedades malignas. En particular, un total de 630.000 pacientes anualmente (en los Estados Unidos) tienen enfermedad localizada (sin evidencia alguna de propagación metastásica distante) en el momento de su presentación; esto representa el 64% de todos aquellos pacientes a los que se diagnostica enfermedad maligna (ésta no incluye el cáncer de piel distinto del melanoma o carcinoma in situ). Para la gran mayoría de estos pacientes, la resección quirúrgica de la enfermedad representa la probabilidad máxima de curación, y de hecho 428.000 se curarán después del tratamiento inicial. Desgraciadamente, 202.000 (o el 32% de todos los pacientes con enfermedades localizadas) sufrirán recaída después del tratamiento inicial. De aquellos que recaen, el número que recaerá debido a recurrencia local de la enfermedad asciende a 133.000 pacientes anualmente (o el 21% de todos aquéllos con enfermedad localizada). El número que recaerá debido a metástasis distantes de la enfermedad es 68.000 pacientes anualmente (11% de todos aquéllos con enfermedad localizada). Otros 102.139 pacientes morirán anualmente como resultado directo de imposibilidad de controlar el crecimiento local de la enfermedad.
El caso más evidente de este problema es el del cáncer de mama, que afecta anualmente a 186.000 mujeres en los Estados Unidos y cuya tasa de mortalidad se ha mantenido inalterada desde hace 50 años. La resección quirúrgica de la enfermedad por mastectomía radical, mastectomía radical modificada, o lumpectomía sigue siendo el soporte de tratamiento de esta condición. Desgraciadamente, el 39% de las pacientes tratadas con lumpectomía exclusivamente desarrollarán una recurrencia local de la enfermedad, y sorprendentemente, lo harán 25% de aquéllas en las cuales se encuentra que el margen de resección está exento de tumor histológicamente. Una proporción tan grande como el 90% de estas recurrencias locales se producirán a una distancia no mayor que 2 cm del sitio de escisión previo.
Análogamente, en 1991, más de 113.000 muertes y 238.600 nuevos casos de metástasis en hígado se consignaron solamente en Norteamérica. El tiempo medio de supervivencia para los pacientes con metástasis en hígado es sólo de 6,6 meses una vez que se han desarrollado lesiones hepáticas. Tratamientos no quirúrgicos para las metástasis hepáticas incluyen quimioterapia sistémica, radiación, quimioembolización, quimoterapia arterial hepática, y radiación intraarterial. Sin embargo, a pesar de la evidencia de que tales tratamientos pueden reducir transitoriamente el tamaño de las lesiones hepáticas (p. ej., la quimioterapia sistémica y la quimioterapia arterial hepática reducen inicialmente las lesiones en 15-20%, y 80% de los pacientes, respectivamente), las lesiones reaparecen invariablemente. La resección quirúrgica de las metástasis en hígado representa la única posibilidad de curación, pero dicho procedimiento es posible solamente en el 5% de los pacientes con metástasis, y sólo en el 15-20% de los pacientes con cáncer hepático primario.
Un método que se ha intentado para el tratamiento de los tumores con éxito limitado es la embolización terapéutica. Resumidamente, los vasos sanguíneos que alimentan un tumor se bloquean deliberadamente por inyección de un material embólico en los vasos. En este sentido, se han intentado una diversidad de materiales, con inclusión de sustancias autólogas tales como grasas, coágulo sanguíneo, y fragmentos musculares triturados, así como materiales artificiales tales como lana, algodón, bolas de acero, perlas de material plástico o de vidrio, polvo de tántalo, compuestos de silicona, partículas radiactivas, esponja de gelatina absorbible estéril (Sterispon, Gelfoam), celulosa oxidada (Oxycel), espiras de acero, alcohol, duramáter humana liofilizada (Lyodura), colágeno microfibrilar (Avitene), fibrillas de colágeno (Tachotop), esponja de poli(alcohol vinílico) (PVA; Ivalon), esferas de silicio impregnadas con bario (Biss) y balones desechables. El tamaño de las metástasis en hígado puede reducirse temporalmente utilizando tales métodos, pero los tumores responden típicamente provocando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el tumor.
Un problema relacionado con la formación de tumores es el desarrollo de bloqueos cancerosos que inhiben el flujo de material a través de los conductos corporales, tales como los conductos biliares, la tráquea, el esófago, la vasculatura y la uretra. Se ha desarrollado un dispositivo, el stent, con objeto de mantener abiertos los conductos que han sido bloqueados por tumores u otras sustancias. Ejemplos representativos de stents comunes incluyen el stent Wallstent, el stent Strecker, el stent Gianturco y el Stent Palmaz. El problema principal con los stents, sin embargo, es que los mismos no impiden el crecimiento hacia adentro del tumor o material inflamatorio a través de los intersticios del stent. Si este material alcanza el interior de un stent y compromete el lumen del mismo, puede dar como resultado la obstrucción del conducto corporal en el cual se ha insertado aquél. Adicionalmente, la presencia de un stent en el cuerpo puede inducir la penetración de tejido reactivo o inflamatorio (p. ej., vasos sanguíneos, fibroplastos, glóbulos blancos de la sangre) en el lumen del stent, dando como resultado un cierre parcial o completo de dicho stent.
El documento EP-A-0 470 569 describe un agente de incorporación intravascular que comprende un factor anti-angiogénico en un vehículo polímero. El documento WO-A-9111193 describe un implante que comprende un agente anti-angiogénico para suministro controlado del agente. El documento WO-A-9212717 describe un medicamento que comprende una tetraciclina como agente anti-angiogénico que puede utilizarse con un agente quimoterapéutico tal como taxol. El documento WO-A-9112779 se refiere a prótesis liberadoras de fármacos intraluminales.
La presente descripción proporciona composiciones y métodos adecuados para tratar cánceres y otras enfermedades dependientes de la angiogénesis que abordan los problemas asociados con los procedimientos expuestos anteriormente, y proporciona adicionalmente otras ventajas afines.
Sumario de la invención
Expuesta brevemente, la presente descripción se refiere a composiciones anti-angiogénicas, así como a métodos y dispositivos que utilizan tales composiciones para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades dependientes de la angiogénesis. Se describen composiciones (a las que se hace referencia en lo sucesivo como "composiciones anti-angiogénicas") que comprenden (a) un factor anti-angiogénico y (b) un vehículo polímero. Las moléculas que se utilizan dentro del alcance de la presente invención como factores anti-angiogénicos son taxol, análogos de taxol y derivados de taxol. Análogamente, pueden utilizarse una gran diversidad de vehículos polímeros, ejemplos representativos de los cuales incluyen poli(etileno-acetato de vinilo) reticulado con 40% de acetato de vinilo, poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona-ácido poliláctico, copolímeros de poli(etileno-acetato de vinilo) reticulado con 40% de acetato de vinilo y ácido poliláctico, y copolímeros de ácido poliláctico y policaprolactona. En una realización, la composición tiene un tamaño medio de 15 a 200 \mum.
Se describen métodos para embolizar un vaso sanguíneo, que comprenden el paso de suministrar al vaso una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica (como se ha descrito anteriormente), de tal modo que el vaso sanguíneo se ocluye eficazmente. En una realización, la composición anti-angiogénica se suministra a un vaso sanguíneo que alimenta un tumor.
Según la presente invención se proporciona un stent de acuerdo con la reivindicación 1. En otros aspectos de la presente invención, se proporcionan tales stents para uso en un método de expansión del lumen de un conducto corporal, que comprende insertar un stent en el conducto, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición antiangiogénica como se ha descrito anteriormente, tal que el conducto se expande. En diversas realizaciones de la invención, tales métodos incluyen la eliminación de obstrucciones biliares, que comprenden insertar un stent biliar en un conducto biliar; eliminación de obstrucciones uretrales, que comprenden insertar un stent uretral en el interior de la uretra; eliminación de obstrucciones esofágicas, que comprenden insertar un stent esofágico en el esófago, y eliminación de obstrucciones traqueo-bronquiales, que comprenden insertar un stent traqueo-bronquial en la tráquea o los bronquios. En cada una de estas realizaciones, el stent tiene una estructura generalmente tubular, cuya superficie está revestida con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente.
Se describen métodos para tratar sitios de extirpación de tumores, que comprenden administrar una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente a los bordes de resección de un tumor subsiguientemente a la extirpación, de tal modo que se inhibe la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en dicho sitio. Se describen métodos para tratamiento de neovascularización de la córnea, que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente a la córnea, de tal modo que se inhibe la formación de vasos sanguíneos. En una realización, la composición anti-angiogénica comprende adicionalmente un corticosteroide tópico.
Dentro de otro aspecto de la presente descripción, se proporciona una composición para la fabricación de un medicamento para tratar la artritis, comprendiendo la composición un agente anti-angiogénico. Se describe un método de inhibición de la angiogénesis, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende taxol a un paciente con una enfermedad no tumorígena dependiente de la angiogénesis, tal que se inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos. En otros aspectos, se describen métodos para embolizar vasos sanguíneos en enfermedades no tumorígenas dependientes de la angiogénesis, que comprenden suministrar al vaso una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende taxol, de tal modo que se ocluye eficazmente el vaso sanguíneo.
Se describen métodos para expandir el lumen de un conducto corporal, que comprenden insertar un stent en el conducto, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición que comprende taxol, de tal modo que se expande el conducto. Se proporcionan métodos para eliminar obstrucciones biliares, que comprenden insertar un stent biliar en un conducto biliar; para eliminar obstrucciones uretrales, que comprenden insertar un stent uretral en la uretra; para eliminar obstrucciones esofágicas, que comprenden insertar un stent esofágico en el esófago; y para eliminar obstrucciones traqueo-bronquiales, que comprenden insertar un stent traqueo-bronquial en la tráquea o los bronquios. Dentro de cada una de estas realizaciones, el stent tiene una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición que comprende taxol.
Se proporcionan métodos para tratar un sitio de extirpación de un tumor, que comprenden administrar una composición que comprende taxol al borde de resección de un tumor subsiguientemente a la extirpación de tal modo que se inhibe la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en dicho sitio. Se proporcionan métodos para tratar la neovascularización de la córnea, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende taxol a la córnea, de tal modo que se inhibe la formación de nuevos vasos.
Se proporcionan productos farmacéuticos, que comprenden (a) taxol, en un envase, y (b) una noticia asociada con el envase en forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora de la fabricación, uso, o venta de productos farmacéuticos, noticia que refleja la aprobación por la agencia del taxol, para administración humana o veterinaria con objeto de tratar enfermedades no tumorígenas dependientes de la angiogénesis. Resumidamente, la Ley Federal requiere que el uso de un agente farmacéutico en la terapia de los seres humanos sea aprobado por una agencia del Gobierno Federal. La responsabilidad para la aplicación de dicha ley corresponde (en los Estados Unidos) a la Food and Drug Administration, que expide regulaciones apropiadas para la consecución de dicha aprobación, detalladas en 21 U.S.C. \NAK\NAK 301-392. Se proporciona también la regulación de materiales biológicos que comprenden productos fabricados a partir de tejidos animales, bajo 42 U.S.C. \NAK 262. Se requiere aprobación similar para la mayoría de los países, aunque los reglamentos pueden variar de un país a otro.
La presente descripción proporciona además el uso de taxol para la fabricación de un medicamento para angiogénesis.
Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes recurriendo a la descripción detallada siguiente y los dibujos adjuntos. Adicionalmente, se exponen más adelante diversas referencias que describen con más detalle ciertos procedimientos o composiciones, y se incorporan en su totalidad por referencia.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es una fotografía que muestra un cultivo de huevo sin cáscara el día 6. La Figura 1B es una imagen digitalizada presentada por ordenador, tomada con un estereomicroscopio de capilares vivos sin teñir (1040x). La Figura 1C es una impresión de corrosión que muestra microvasculaturas de CAM que son alimentadas por vasos mayores subyacentes (flechas; 1300x). La Figura 1D representa una sección de material plástico de 0,5 mm de espesor cortada transversalmente a través de la CAM, y registrada al nivel del microscopio óptico. Esta fotografía muestra la composición de la CAM, con inclusión de un ectodermo (Ec) exterior bicapa, un mesodermo (M) que contiene capilares (flechas) y células adventicias dispersas, y un endodermo (En) monocapa (400x). La Figura 1E es una fotografía al nivel del microscopio electrónico (3500x) en la cual se presenta una estructura capilar típica que muestra células endoteliales de pared delgada (puntas de flecha) y un pericito asociado.
Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D son una serie de imágenes digitalizadas de cuatro CAMs diferentes sin teñir, tomadas después de una exposición de 48 horas a taxol.
Las Figuras 3A, 3B y 3C son una serie de fotografías de secciones de material plástico de 0,5 mm de espesor cortadas transversalmente a través de una CAM tratada con taxol en tres localizaciones diferentes dentro de la zona avascular.
Las Figuras 4A, 4B y 4C son series de micrografías electrónicas que se tomaron de localizaciones similares a la de las Figuras 3A, 3B y 3C (respectivamente) anteriores.
La Figura 5 es un gráfico de barras que representa la distribución de tamaños de microesferas por número (5% ELVAX con 10 mg de sodio-suramina en 5% PVA).
La Figura 6 es un gráfico de barras que representa la distribución de tamaños de microesferas en peso (5% ELVAX con 10 mg de sodio-suramina en 5% PVA).
La Figura 7 es un gráfico lineal que representa el peso de encapsulación de sodio-suramina en 1 ml de 5% ELVAX.
La Figura 8 es un gráfico lineal que representa el porcentaje de encapsulación de sodio-suramina en ELVAX.
La Figura 9 es un gráfico de barras que representa la disminución de tamaños de microesferas de 5% ELVAX que contienen 10 mg de sodio-suramina producidas en 5% PVA que contiene 10% de NaCl.
La Figura 10 es un gráfico de barras que representa la distribución de tamaños en peso de microesferas de 5% PLL que contienen 10 mg de sodio-suramina producidas en 5% PVA que contiene 10% NaCl.
La Figura 11 es un gráfico de barras que representa la distribución de tamaños en número de microesferas 5% PLL que contienen 10 mg de sodio-suramina producidas en 5% PVA que contiene 10% NaCl.
La Figura 12 es un gráfico lineal que representa la evolución en el tiempo de la liberación de sodio-suramina.
La Figura 13 es una ilustración de una realización representativa de embolización de tumor hepático.
La Figura 14 es una ilustración de la inserción de un stent representativo revestido con una composición anti-angiogénica de la presente invención.
La Figura 15A es un gráfico que muestra el efecto de la relación de mezcla de polímeros EVA:PLA después de la agregación de microesferas. La Figura 15B es una micrografía electrónica de barrido que muestra el tamaño de las microesferas "pequeñas". La Figura 15C es una micrografía electrónica de barrido que muestra el tamaño de las microesferas "grandes". La Figura 15D es un gráfico que representa la evolución en el tiempo de la liberación in vitro de taxol a partir de 0,6% peso/volumen de microesferas de mezclas de polímeros EVA:PLA 50:50 en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) a 37ºC. Los círculos vacíos son microesferas de tamaño "pequeño", y los círculos llenos son microesferas de tamaño "grande". La Figura 15E es una fotografía de una CAM que muestra los resultados de liberación de taxol por microesferas ("MS"). La Figura 15F es una fotografía similar a la de 15E con aumento mayor.
La Figura 16 es un gráfico que muestra los perfiles de tasa de liberación a partir de microesferas de policaprolactona que contienen 1%, 2%, 5% o 10% de taxol en solución salina tamponada con fosfato a 37ºC. La Figura 16B es una fotografía que muestra una CAM tratada con microesferas de control. La Figura 16C es una fotografía que muestra una CAM tratada con microesferas cargadas con 5% de taxol.
Las Figuras 17A y 17B, respectivamente, son dos gráficos que muestran la liberación de taxol a partir de películas EVA, y el porcentaje de taxol que queda en las mismas películas a lo largo del tiempo. La Figura 17C es un gráfico que muestra el hinchamiento de películas EVA/F127 sin cantidad alguna de taxol a lo largo del tiempo. La Figura 17D es un gráfico que muestra el hinchamiento de películas EVA/Span 80 sin taxol a lo largo del tiempo. La Figura 17E es un gráfico que representa una curva de esfuerzo en función de la deformación para diversas mezclas EVA/F127.
Las Figuras 18A y 18B son dos gráficos que muestran el punto de fusión de mezclas de polímeros PCL/MePEG en función del % de MePEG en la formulación (18A), y el porcentaje de aumento en el tiempo necesario para que la pasta de PCL a 60ºC comience a solidificarse en función de la cantidad de MePEG en la formulación (18B). La Figura 18C es un gráfico que representa la fragilidad de mezclas de polímeros PCL/MePEG variables. La Figura 18D es un gráfico que muestra el porcentaje de cambio de peso a lo largo del tiempo para mezclas de polímeros con diversas concentraciones de MePEG. La Figura 18E es un gráfico que representa la tasa de liberación de taxol a lo largo del tiempo a partir de diversas mezclas de polímero cargadas con 1% de taxol. Las Figuras 18F y 18G son gráficos que representan el efecto de cantidades variables de taxol sobre la cantidad total de taxol liberada de una mezcla 20% MePEG/PCL. La Figura 18H es un gráfico que representa el efecto de MePEG sobre la resistencia a la tracción de un polímero MePEG/PCL.
La Figura 19A es una fotografía que muestra una termopasta de control (sin cargar) sobre una CAM. La Figura 19B es una fotografía de termopasta cargada con 20% de taxol en una CAM.
Las Figuras 20A y 20B son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta de control (sin cargar). Las Figuras 20C y 20D son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta cargada con taxol.
La Figura 21A es un gráfico que muestra el efecto de taxol/PCL sobre el crecimiento de un tumor. Las Figuras 21B y 21C son dos fotografías que muestran el efecto de termopastas de control, cargada con 10% de taxol, y cargada con 20% de taxol sobre el crecimiento de un tumor.
La Figura 22A es una fotografía de la sinovia de una articulación inyectada con PBS. La Figura 22B es una fotografía de una sinovia de una articulación inyectada con microesferas. La Figura 22C es una fotografía de un cartílago de articulaciones inyectadas con PBS, y la Figura 22D es una fotografía de un cartílago de articulaciones inyectadas con microesferas.
Descripción detallada de la invención
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención utiliza factores anti-angiogénicos. El método para determinar la actividad anti-angiogénica de un factor dado es el ensayo con membrana corioalantoica de pollo ("CAM"). En resumen, como se describe con mayor detalle más adelante en los ejemplos 2A y 2C, se quita una porción de la cáscara de un huevo de pollo recién fertilizado y se coloca sobre la membrana un disco de metil-celulosa que contiene una muestra del factor anti-angiogénico a ensayar. Después de varios días (p. ej., 48 horas), puede determinarse fácilmente la inhibición del crecimiento vascular por la muestra a ensayar mediante visualización de la membrana corioalantoica de pollo en la región que rodea el disco de metil-celulosa. La inhibición del crecimiento vascular puede determinarse también cuantitativamente, por ejemplo, por determinación del número y tamaño de vasos sanguíneos alrededor del disco de metil-celulosa, en comparación de un disco de metil-celulosa de control. Factores anti-angiogénicos particularmente preferidos adecuados para uso dentro de la presente invención inhiben completamente la formación de nuevos vasos sanguíneos en el ensayo descrito anteriormente.
Se describen también una diversidad de ensayos que se pueden utilizar para determinar la eficacia de los factores anti-angiogénicos in vivo, con inclusión, por ejemplo, de modelos de ratón que han sido desarrollados para este propósito (véase Roberston et al., Cancer. Res. 51: 1339-1344, 1991). Adicionalmente, una diversidad de ensayos in vivo representativos referentes a diversos aspectos de la invención descrita en esta memoria, se describen con mayor detalle más adelante en los Ejemplos 5 a 7, y 17 a 19.
Como se ha indicado anteriormente, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden un factor anti-angiogénico y un vehículo polímero. De manera resumida, pueden utilizarse fácilmente una gran diversidad de factores anti-angiogénicos dentro del contexto de la presente descripción. Ejemplos representativos incluyen Factor Anti-Invasivo, ácido retinoico y sus derivados, taxol, y miembros del grupo constituido por Suramina, Inhibidor-1 de Tejidos de Metaloproteinasa-a, Inhibidor-2 de Tejidos de Metaloproteinasas, Inhibidor.1 del Activador del Plasminógeno e Inhibidor-2 del Activador del Plasminógeno. Estos y otros factores anti-angiogénicos se expondrán con mayor detalle más adelante.
Resumidamente, se sabe que el Factor Anti-Invasivo, o "AIF", que se prepara a partir de extractos de cartílago, contiene constituyentes que son responsables de la inhibición del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Estos constituyentes comprende una familia de 7 proteínas de peso molecular bajo (< 50.000 daltons) (Kuettner y Pauli, "Inhibition of neovascularization by a cartilage factor" en Development of the Vascular System, Pitman Books (Ciba Foundation Symposium 100), pp. 163-173, 1983), que incluyen una diversidad de proteínas que tienen efectos inhibidores contra una diversidad de proteasas (Eisentein et al, Am. J. Pathol. 81: 337-346, 1975; Langer et al., Science 193: 70-72, 1976; y Horton et al., Science 199: 1342-1345, 1978. Puede prepararse fácilmente AIF adecuado para uso en la presente invención utilizando métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., Eisentein et al., supra; Kuettner y Pauli, supra; y Lager et al., supra). Constituyentes purificados de AIF tales como el Inhibidor Derivado de los Cartílagos ("CDI") (véase Moses et al., Science 248: 1408-1410, 1990) pueden prepararse y utilizarse también fácilmente dentro del contexto de la presente invención.
Los ácidos retinoicos alteran el metabolismo de los componentes de la matriz extracelular, dando como resultado la inhibición de la angiogénesis. La adición de análogos de prolina, esteroides angiostáticos o heparina puede utilizarse con objeto de aumentar de manera sinérgica el efecto anti-angiogénico del ácido transretinoico. El ácido retinoico, así como sus derivados que pueden utilizarse también en el contexto de la presente invención, pueden obtenerse fácilmente a partir de fuentes comerciales, que incluyen por ejemplo Sigma Chemical Co. (#R2625).
El taxol es un diterpenoide altamente derivatizado (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 2325, 1971) que se ha obtenido a partir de la corteza recolectada y secada de Taxus brevifolia (tejo del Pacífico) y Taxomyces Andreanae y Endophytic Fungus del tejo del Pacífico. (Stierle et al., Science 60: 214-216, 1993). Generalmente, el taxol actúa para estabilizar las estructuras microtubulares por fijación de tubulina para formar husillos mitóticos anormales. "Taxol" (término que debe entenderse que incluye en esta memoria análogos y derivados de taxol tales como, por ejemplo, baccatina y taxotero) puede prepararse fácilmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica (véanse también los documentos WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; y las patentes de EE.UU. Nums. 5.294.637, 5.283.253, 5.279.949, 5.374.137, 5.202.448, 5.200.534, 5.229.526 y EP 590267) u obtenidos a partir de una diversidad de fuentes comerciales, que incluyen por ejemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 - de Taxus brevifolia).
La suramina es un compuesto de naftilurea polisulfonado que se utiliza típicamente como agente tripanocida. En resumen, la suramina bloquea la fijación específica a la superficie de las células de diversos factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas ("PDGF"), el factor de crecimiento epidérmico ("EGF"), el factor de crecimiento transformante ("TGF-\beta"), el factor del crecimiento afín a la insulina ("IGF-1") y el factor del crecimiento de los fibroblastos ("\betaFGF"). La suramina se puede preparar de acuerdo con técnicas conocidas, o puede obtenerse fácilmente a partir de una diversidad de fuentes comerciales, con inclusión, por ejemplo, de Mobay Chemical Co., Nueva York (véase Gagliardi et al., Cancer Res. 52: 5073-5075, 1992; y Coffey, Jr., et al., J. of Cell. Phys. 132: 143-148, 1987).
El Inhibidor-1 de los Tejidos de Metaloproteinasa ("TIMP") es secretado por células endoteliales que secretan también MTPasas. TIMP está glicosilado y tiene un peso molecular de 28,5 kDa. TIMP-1 regula la angiogénesis por fijación a metaloproteinasas activadas, suprimiendo con ello la invasión de los vasos sanguíneos en la matriz extracelular. El Inhibidor-2 de los Tejidos de Metaloproteinasas ("TIMP-2") puede utilizarse también para inhibir la angiogénesis. Resumidamente, TIMP-2 es una proteína no glicosilada de 21 kDa que se fija a las metaloproteinasas tanto en la forma activa como en la forma latente de proenzima. Tanto TIMP-1 como TIMP-2 pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales tales como Synergen, Boulder, Colorado.
El Inhibidor-1 del Activador del Plasminógeno (PA) es una glicoproteína de 50 kDa que está presente en las plaquetas de la sangre, y puede ser sintetizada también por células endoteliales y células musculares. PAI-1 inhibe el activador del plasminógeno de t-PA y uroquinasa en el sitio basolateral del endotelio, y regula adicionalmente el proceso de fibrinólisis. El Inhibidor-2 del Activador del Plasminógeno (PAI-2) se encuentra generalmente sólo en la sangre en ciertas circunstancias tales como en la gestación, y en presencia de tumores. Resumidamente, PAI-2 es una proteína de 56 kDa que es secretada por monocitos y macrófagos. Se cree que regula la actividad fibrinolítica, y en particular inhibe el activador de plasminógeno de uroquinasa y el activador del plasminógeno tisular, evitando con ello la fibrinólisis.
Una gran diversidad de otros factores anti-angiogénicos pueden utilizarse también dentro del contexto de la presente descripción. Ejemplos representativos incluyen el Factor 4 de las Plaquetas (Sigma Chemical Co., #F1385); el Sulfato de Protamina (Clupeína) (Sigma Chemical Co., #P4505); Derivados de Quitina Sulfatados (preparados a partir de caparazones de cangrejo reina), (Sigma Chemical Co., #PC641; Murata et al., Cancer Res. 51: 22-26, 1991); el Complejo de Polisacáridos Sulfatados-Peptidoglicanos (SP-PG) (la función de este compuesto puede ser intensificada por la presencia de esteroides tales como estrógeno y citrato de tamoxifeno); Staurosporina (Sigma Chemical Co., #S4400); Moduladores del Metabolismo de la Matriz, con inclusión, por ejemplo, de análogos de prolina {[(ácido L-azetidina-2-carboxílico (LACA) (Sigma Chemical Co., #A0760)), cishidroxiprolina, d,L-3,4-deshidroprolina (Sigma Chemical Co., #D0265), Tiaprolina (Sigma Chemical Co., #T0631)], \alpha,\alpha-dipiridilo (Sigma Chemical Co., #D7505), fumarato de \beta-aminopropionitrilo (Sigma Chemical Co., #A3134)]}; MDL 27032 (4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; Merion Merrel Dow Research Institute); Metotrexato (Sigma Chemical Co., #A6700; Hirata et al., Arthritis and Rheumatism 32: 1065-1073, 1989); Mitoxantrona (Polverini y Novak, Biochem. Biophys. Res. Comm. 140: 901-907); Heparina (Folkman, Bio. Phar. 34: 905-909, 1985; Sigma Chemical Co., #P8754); Interferones (p. ej., Sigma Chemical Co., #13265); suero de 2-macroglobulina (Sigma Chemical Co., #M7151); ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); Quimiostatina (Sigma Chemical Co., #C7268; Tomkinson et al., Biochem J. 286: 475-480, 1992); Tetradecasulfato de \beta-ciclodextrina (Sigma Chemical Co., #C4767); Eponemicina; Estramustina (disponible de Sigma; Wang y Stearns Cancer Res. 48: 6262-6271, 1988); Fumagillina (Sigma Chemical Co., #F6771; Patente de Canadá Nº 2.024.306; Ingber et al., Nature 348: 555-557, 1990); Tiomalato de Oro y Sodio ("GST"; Sigma: G4022; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); D-Penicilamina ("CDPT"; Sigma Chemical Co., #P4875 o P5000(HCl)); suero \beta-1-anticolagenasa; \alpha-2-antiplasmina (Sigma Chem. Co.: A0914; Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4): 1659-1664, 1987); Bisantreno (National Cancer Institute); Lobenzarit disódico (sal disódica de ácido N-(2)-carboxifenil-4-cloroantranílico o "CCA"; Takeuchi et al., Agents Actions 36: 312-316, 1992); Talidomida, esteroide angiostático, AGM-1470, carboxiaminolmidazol, inhibidores de metaloproteinasas tales como BB94 y el péptido CDPGYIGSR-NH_{2} (SECUENCIA ID NO. 1) (Iwaki Glass, Tokio, Japón).
Las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención pueden comprender adicionalmente una gran diversidad de compuestos además del factor anti-angiogénico y el vehículo polímero. Por ejemplo, las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención pueden también, en ciertas realizaciones de la invención, comprender uno o más antibióticos, anti-inflamatorios, agentes anti-víricos, agentes anti-fúngicos, y/o agentes anti-protozoos. Ejemplos representativos de antibióticos incluidos en las composiciones descritas en esta invención incluyen: penicilinas, cefalosporinas tales como cefadroxil, cefazolina, ceflaclor; aminoglicósidos tales como gentamicina y tobramicina; sulfonamidas tales como sulfametoxazol; y metronidazol. Ejemplos representativos de anti-inflamatorios incluyen; esteroides tales como prednisona, prednisolona, hidrocortisona, hormona adrenocorticotrópica y sulfasalazina; y fármacos anti-inflamatorios no esteroidales ("NSAIDS") tales como aspirina, ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, indometacina y fenilbutazona. Ejemplos representativos de agentes antivíricos incluyen aciclovir, ganciclovir y zidovudina. Ejemplos representativos de agentes antifúngicos incluyen: nistatina, cetoconazol, griseofulvina, flucitosina, miconazol y clotrimazol. Ejemplos representativos de agentes antiprotozoo incluyen: isetionato de pentamidina, quinina, cloroquina y mefloquina.
Las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención pueden contener también una o más hormonas tales como hormona tiroidea, estrógeno, progesterona, cortisona y/u hormona del crecimiento, otras moléculas biológicamente activas tales como insulina, así como citoquinas P_{H1} (p. ej., Interleuquinas-2, -12 y -15, \gamma-interferón o T_{H2} (p. ej., Interleuquinas-4 y -10)
Las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención pueden comprender también ingredientes adicionales tales como agentes tensioactivos (hidrófilos o hidrófobos; véase ejemplo 13), agentes anti-neoplásicos o quimioterapéuticos (p. ej., 5-fluorouracilo, vinblastina, doxirrubicina, adriamicina o tamoxifeno), agentes radiactivos (p. ej., Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 y Bi-212) o toxinas (p. ej., ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, proteína antivírica de fitolaca, tritina, toxina Shigella, y exotoxina A de Pseudomonas).
Como se ha indicado anteriormente, las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención comprenden un factor anti-angiogénico y un vehículo polímero. Además de la extensa serie de factores anti-angiogénicos y otros compuestos expuestos anteriormente, las composiciones anti-angiogénicas de la presente invención pueden incluir una gran diversidad de vehículos polímeros, con inclusión, por ejemplo, de composiciones tanto biodegradables como no biodegradables. Ejemplos representativos de composiciones biodegradables incluyen albúmina, gelatina, almidón, celulosa, dextranos, polisacáridos, fibrinógeno, poli(d,l-lactida), poli-(d,l-lactida-co-glicolida), poli-(glicolida), poli-(hidroxibutirato), poli-(alquilcarbonato) y poli-(ortoésteres) (véase generalmente, Illum, L., Davids, S.S. (compiladores) "Polymers in controlled Drug Delivery", Wright, Bristol, 1987, Arshady, J. Controlled Release 17: 1-22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173-196, 1990); Holland et al., J. Controlled Release 4: 155-0180, 1986). Ejemplos representativos de polímeros no degradables incluyen copolímeros EVA, caucho de silicona y poli(metacrilato de metilo). Vehículos polímeros particularmente preferidos incluyen copolímero EVA (p. ej., ELVAX 40, poli(etileno-acetato de vinilo) reticulado con 40% de acetato de vinilo; DuPont), poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, ácido poliláctico, copolímeros de poli(etileno-acetato de vinilo) reticulados con 40% de acetato de vinilo y ácido poliláctico, y copolímeros de ácido poliláctico y policaprolactona.
Los vehículos polímeros pueden adaptarse en una diversidad de formas, con inclusión, por ejemplo, de nanoesferas o microesferas, dispositivos en forma de varilla, glóbulos, placas, o cápsulas (véase, p. ej., Goodell et al., Am. J. Hosp. Pharm. 43: 1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", en Biomedical polymers, Polymeric materials and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E.P., Nakagim, A. (compiladores) Academic Press. pp. 113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69: 265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sci. 72: 1181-1185, 1983; y Bawa et al., J. Controlled release 1: 259-267, 1985).
Preferiblemente, las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención (que comprenden uno o más factores anti-angiogénicos, y un vehículo polímero) se adaptan de una manera apropiada al uso propuesto. Dentro de aspectos preferidos de la presente invención, la composición anti-angiogénica debe ser biocompatible, y liberar uno o más factores anti-angiogénicos a lo largo de un período de varias semanas a meses. Adicionalmente, las composiciones anti-angiogénicas de la presente invención deberían ser preferiblemente estables durante varios meses y susceptibles de producirse y mantenerse en condiciones estériles.
Dentro de ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones anti-angiogénicas pueden adaptarse en cualquier tamaño comprendido entre nanoesferas y microesferas (p. ej., de 0,1 \mum a 500 \mum) dependiendo del uso particular. Por ejemplo, cuando se utilizan para el propósito de embolización de un tumor (como se expone más adelante), es generalmente preferible adaptar la composición anti-angiogénica en microesferas de tamaño comprendido entre 15 y 500 \mum, preferiblemente entre 15 y 200 \mum, y muy preferiblemente entre 25 y 150 \mum. Tales nanopartículas pueden aplicarse también fácilmente como una "pulverización", que se solidifica en una película o revestimiento. Las nanopartículas (denominadas también "nanoesferas") se pueden preparar en una extensa serie de tamaños, que incluyen por ejemplo, desde 0,1 \mum a 3 \mum, de 10 \mum a 30 \mum, y de 30 \mum a 100 \mum (véase ejemplo 8).
Las composiciones anti-angiogénicas se pueden preparar también, dada la descripción que se proporciona en esta memoria, para una diversidad de otras aplicaciones. Por ejemplo, para la administración de composiciones anti-angiogénicas a la córnea, las composiciones de la presente invención se pueden incorporar en polímeros como nanopartículas (véase generalmente, Kreuter J. Controlled Release 16: 169-176, 1991; Couvreur y Vauthier, J. Controlled Release 17: 187-198, 1991). Tales nanopartículas puede aplicarse también fácilmente como una "pulverización", que se solidifica para dar una película o revestimiento. Las nanopartículas (denominadas también "nanoesferas") se pueden preparar en una extensa serie de tamaños, que incluyen, por ejemplo, desde 0,1 \mum a 3 \mum, desde 10 \mum a 30 \mum y desde 30 \mum a 100 \mum (véase el Ejemplo 8).
Las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención se pueden preparar también en una diversidad de formas de "pasta" o gel. Por ejemplo, en una realización de la invención, se proporcionan composiciones anti-angiogénicas que son líquidas a una temperatura (p. ej., temperatura mayor que 37ºC, tal como 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC o 60ºC), y sólidas o semi-sólidas a otra temperatura (p. ej., temperatura ambiente del cuerpo, o cualquier temperatura inferior a 37ºC). Tales "termopastas" se pueden fabricar fácilmente dada la descripción proporcionada en esta memoria (véanse, p. ej., los ejemplos 10 y 14).
En otros aspectos adicionales de la invención, las composiciones anti-angiogénicas para usar en la presente invención pueden conformarse como una película. Preferiblemente, tales películas tienen un espesor generalmente menor que 5, 4, 3, 2 ó 1 mm, más preferiblemente menor que 0,75 mm o 0,5 mm de espesor, y tienen muy preferiblemente un espesor menor que 500 \mum a 100 \mum. Tales películas son preferiblemente flexibles con una resistencia a la tracción satisfactoria (p. ej. mayor que 50, preferiblemente mayor que 100 y más preferiblemente > 150 ó 200 N/cm^{2}), propiedades satisfactorias de adhesión (es decir, se adhieren fácilmente a las superficies mojadas o húmedas), y tienen permeabilidad controlada. Ejemplos representativos de tales películas se exponen más adelante en los Ejemplos (véase, p. ej., Ejemplo 13).
Ejemplos representativos de la incorporación de factores anti-angiogénicos tal como en un vehículo polímero se describen con mayor detalle más adelante en los ejemplos 3, 4, y 8-15.
Embolización arterial
Además de las composiciones descritas anteriormente, la presente descripción proporciona también una diversidad de métodos que utilizan las composiciones anti-angiogénicas descritas anteriormente. En particular, dentro de un aspecto de la presente descripción se proporcionan métodos para embolizar un vaso sanguíneo, que comprenden el paso de suministrar al vaso una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica (como se ha descrito anteriormente), tal que el vaso sanguíneo se ocluye eficazmente. Cantidades terapéuticamente eficaces adecuadas para ocluir vasos sanguíneos pueden ser determinadas fácilmente dada la descripción que se proporciona más adelante, y como se describe en el Ejemplo 6. En una realización particularmente preferida, la composición anti-angiogénica se suministra a un vaso sanguíneo que alimenta un tumor (véase Figura 13).
Resumidamente, existen cierto número de situaciones clínicas (p. ej., hemorragias, desarrollo de tumores) en las que es deseable reducir o anular el suministro de sangre a un órgano o región. Como se describe con mayor detalle más adelante, esto puede realizarse por inyección de composiciones anti-angiogénicas de la presente descripción en un vaso sanguíneo deseado a través de un catéter posicionado selectivamente (véase Figura 13). La composición viaja por el torrente sanguíneo hasta que queda retenida en forma de cuña en la vasculatura, ocluyendo con ello físicamente (o químicamente) el vaso sanguíneo. El flujo sanguíneo reducido o anulado al área seleccionada da como resultado el infarto (muerte celular debida a un suministro inadecuado de oxígeno y nutrientes) o pérdida reducida de sangre de un vaso lesionado.
Para uso en terapia de embolización, las composiciones anti-angiogénicas de la presente descripción son preferiblemente no tóxicas, trombogénicas, fáciles de inyectar a lo largo de catéteres vasculares, radio-opacas, de efecto rápido y permanente, estériles, y fácilmente disponibles en formas o tamaños diferentes en el momento del procedimiento. Adicionalmente, las composiciones dan preferiblemente como resultado la liberación lenta (idealmente, a lo largo de un período de varias semanas a meses) de un factor anti-angiogénico. Composiciones anti-angiogénicas particularmente preferidas deben tener un tamaño predecible de 15-200 \mum después de ser inyectadas en el sistema vascular. Preferiblemente, aquéllas no deben aglutinarse en partículas mayores sea en solución o una vez inyectadas. Adicionalmente, las composiciones preferibles no deben cambiar de forma o propiedades físicas durante el almacenamiento antes de su utilización.
La terapia de embolización puede utilizarse al menos de tres maneras principales para contribuir al manejo de las neoplasias: (1) tratamiento definitivo de tumores (usualmente benignos); (2) para embolización preoperativa; y (3) para embolización paliativa. Resumidamente, los tumores benignos pueden tratarse algunas veces con éxito por terapia de embolización exclusiva. Ejemplos de dichos tumores incluyen tumores simples de origen vascular (p. ej., hemangiomas), tumores endocrinos tales como adenomas paratiroideos, y tumores óseos benignos.
Para otros tumores (p. ej., adenocarcinoma renal), puede emplearse embolización preparativa horas o días antes de la resección quirúrgica con objeto de reducir la pérdida de sangre durante la operación, acortar la duración de la operación, y reducir el riesgo de diseminación de células malignas viables por manipulación quirúrgica del tumor. Muchos tumores pueden ser embolizados con éxito preoperativamente, con inclusión por ejemplo de tumores nasofaríngeos, tumores del glomus yugular, meningiomas, quimiodectomas, y neuromas vagales.
La embolización puede utilizarse también como un modo primario de tratamiento para enfermedades malignas inoperables, con objeto de prolongar el tiempo de supervivencia de los pacientes con enfermedad avanzada. La embolización puede producir una mejora acusada en la calidad de vida de los pacientes con tumores malignos por aliviar los síntomas desagradables tales como hemorragias, obstrucción venosa y compresión traqueal. El mayor beneficio de la embolización paliativa de los tumores, sin embargo, puede verse en pacientes que sufren de los efectos humorales de los tumores malignos endocrinos, en los cuales las metástasis procedentes de tumores carcinoides y otras neoplasias endocrinas tales como insulinomas y glucagonomas pueden ser de crecimiento lento, y sin embargo causar gran angustia en virtud de los síndromes endrocrinos que producen los mismos.
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En general, la terapia de embolización utilizando composiciones anti-angiogénicas de la presente descripción se realiza típicamente de manera similar, con indiferencia del sitio. De forma resumida, se realiza primeramente una angiografía (una representación del trazado de los vasos sanguíneos) del área a embolizar por inyección de contraste radio-opaco a través de un catéter insertado en una arteria o vena (dependiendo del sitio a embolizar) mientras que se toma una imagen de rayos X. El catéter puede insertarse percutáneamente o por cirugía. El vaso sanguíneo se emboliza luego haciendo refluir las composiciones anti-angiogénicas de la presente invención a través del catéter, hasta que se observa que cesa el flujo. La oclusión puede confirmarse por repetición del angiograma.
La terapia de embolización da generalmente como resultado la distribución de composiciones que contienen factores anti-angiogénicos a través de los intersticios de la masa tumoral o vascular a tratar. El volumen físico de las partículas embólicas que obstruyen el lumen arterial da como resultado la oclusión del suministro de sangre. Además de este efecto, la presencia de uno o varios factores anti-angiogénicos impide la formación de nuevos vasos sanguíneos para suministrar a la masa tumoral o vascular, intensificando el efecto desvitalizador de la interrupción del suministro de sangre.
Por consiguiente, debería ser evidente que una gran diversidad de tumores pueden ser embolizados utilizando las composiciones de la presente descripción. Resumidamente, los tumores se dividen típicamente en dos clases: benignos y malignos. En un tumor benigno, las células mantienen sus características diferenciadas y no se dividen de manera totalmente descontrolada. Adicionalmente, el tumor está localizado y no produce metástasis. En un tumor maligno, las células se vuelven no diferenciadas, no responden a las señales de crecimiento corporal y hormonales, y se multiplican de manera incontrolada; el tumor es invasivo y capaz de propagarse a sitios distantes (producir metástasis).
En un aspecto de la presente descripción, pueden tratarse las metástasis (tumores secundarios) del hígado utilizando terapia de embolización. Resumidamente, se inserta un catéter por la arteria femoral o braquial y se hace avanzar hasta el interior de la arteria hepática dirigiéndolo a través del sistema arterial bajo guiamiento fluoroscópico. El catéter se hace avanzar hasta el interior del árbol arterial hepático tan lejos como sea necesario para lograr el bloqueo completo de los vasos sanguíneos que suministran al o a los tumores, respetando al mismo tiempo en la mayor medida posible las ramas arteriales que suministran las estructuras normales. Idealmente, ésta será una rama segmental de la arteria hepática, pero podría ser que la arteria hepática entera distal al origen de la arteria gastroduodenal, o incluso múltiples arterias separadas, necesiten ser bloqueadas dependiendo de la extensión del tumor y del suministro de sangre individual. Una vez que se alcanza la posición deseada del catéter, la arteria se emboliza por inyección de composiciones anti-angiogénicas (como se han descrito anteriormente) a través del catéter arterial hasta que cesa el flujo en la arteria a bloquear, preferiblemente incluso después de observación durante 5 minutos. La oclusión de la arteria puede confirmarse por inyección de contraste radio-opaco a través del catéter y demostración por fluoroscopía o mediante película de rayos X de que el vaso que previamente se llenaba con el contraste ya no lo hace. Puede repetirse el mismo procedimiento con cada arteria alimentadora a ocluir.
Como se ha indicado anteriormente, utilizando composiciones de la presente descripción pueden embolizarse tumores tanto benignos como malignos. Ejemplos representativos de tumores hepáticos benignos incluyen Adenoma Hepatocelular, Hemangioma Cavernoso, e Hiperplasia Focal Nodular. Pueden tratarse también otros tumores benignos, que son más raros y a menudo no tienen manifestaciones clínicas. Estos incluyen Adenomas de Conductor Biliares, Cistadenomas de Conductos Biliares, Fibromas, Lipomas, Leiomiomas, Mesoteliomas, Teratomas, Mixomas, e Hiperplasia Nodular Regenerativa.
Los Tumores Hepáticos Malignos se subdividen generalmente en dos categorías: primarios y secundarios. Los tumores primarios proceden directamente del tejido en el que se encuentran. Así, un tumor hepático primario se deriva originalmente de las células que constituyen el tejido hepático (tales como hepatocitos y células biliares). Ejemplos representativos de enfermedades malignas hepáticas primarias que se pueden tratar por embolización arterial incluyen Carcinoma hepatocelular, Colangiocarcinoma, Angiosarcoma, Cistadeno-carcinoma, Carcinoma de células escamosas, y Hepatoblastoma.
Un tumor secundario, o metástasis, es un tumor que se originó en otro lugar del cuerpo pero que se ha propagado ahora a un órgano distante. Las rutas comunes para la metástasis son crecimiento directo en estructuras adyacentes, propagación a través de los sistemas vascular o linfático, y progresión a lo largo de planos tisulares y espacios corporales (fluido peritoneal, fluido cerebroespinal, etc.). Los tumores hepáticos secundarios son una de las causas más comunes de muerte en los pacientes de cáncer y son con mucho y de lejos la forma más común de tumor hepático. Aunque virtualmente cualquier enfermedad maligna puede producir metástasis en el hígado, los tumores que se propagan con mayor probabilidad en el hígado incluyen: cáncer de estómago, colon y páncreas; melanoma; tumores de pulmón, orofaringe, y vejiga; linfoma de Hodgkin y diferente al Hodgkin; tumores de mama, ovario y próstata. Cada uno de los tumores primarios citados anteriormente presenta numerosos tipos diferentes de tumor que pueden ser tratados por embolización arterial (por ejemplo, existen más de 32 tipos diferentes de cáncer de ovario).
Como se ha indicado anteriormente, la terapia de embolización con empleo de composiciones anti-angiogénicas de la presente descripción puede aplicarse también a una diversidad de otras situaciones clínicas en las cuales se desea ocluir vasos sanguíneos. En un aspecto de la presente descripción, puede tratarse la malformación arteriovenosa por administración de una de las composiciones descritas anteriormente. Resumidamente, las malformaciones arteriovenosas (malformaciones vasculares) se refieren a un grupo de enfermedades en las cuales existe al menos una (y en la mayoría de los casos, muchas) comunicación(es) anormal(es) entre arterias y venas dando como resultado una masa local semejante a un tumor compuesta predominantemente por vasos sanguíneos. Dicha enfermedad puede ser congénita o adquirida.
En una realización de la descripción, puede tratarse una malformación arteriovenosa por inserción de un catéter a través de la arteria femoral o braquial, y avance del mismo a lo largo de la arteria de alimentación bajo guiamiento fluoroscópico. El catéter se hace avanzar preferiblemente tan lejos como sea necesario hasta lograr el bloqueo completo del o de los vasos sanguíneos que suministran la malformación vascular, mientras que se respetan en la mayor medida posible las ramas arteriales que suministran las estructuras normales (idealmente esta será una sola arteria, pero en muchos casos pueden precisar ser ocluidas múltiples arterias separadas, dependiendo de la extensión de la malformación vascular y de su suministro de sangre individual). Una vez que se ha alcanzado la posición deseada del catéter, puede embolizarse cada arteria utilizando composiciones anti-angiogénicas de la presente invención.
En otro aspecto de la descripción, la embolización puede realizarse a fin de tratar condiciones de sangrado excesivo. Por ejemplo, la menorragia (hemorragia excesiva con la menstruación) puede tratarse fácilmente por embolización de las arterias uterinas. Resumidamente, las arterias uterinas son ramas bilaterales de las arterias ilíacas internas. En una realización de la invención, puede insertarse un catéter por la arteria femoral o braquial, y hacerse avanzar a lo largo de cada arteria uterina por conducción a través del sistema arterial bajo guiamiento fluoroscópico. El catéter debe hacerse avanzar tan lejos como sea necesario para lograr el bloqueo completo de los vasos sanguíneos que conducen al útero, respetando al mismo tiempo la mayor cantidad posible de ramas arteriales que procedan de la arteria uterina y suministren estructuras normales. Idealmente puede embolizarse una sola arteria uterina en cada lado, pero ocasionalmente puede ser necesario bloquear múltiples arterias separadas, dependiendo del suministro de sangre individual. Una vez que se ha alcanzado la posición deseada del catéter, cada arteria puede embolizarse por administración de las composiciones anti-angiogénicas que se han descrito anteriormente.
De manera análoga, puede realizarse la embolización arterial en una diversidad de otras condiciones, con inclusión, por ejemplo, de hemorragia aguda, anormalidades vasculares, trastornos del sistema nervioso central, e hiperesplenismo.
Uso de las composiciones anti-angiogénicas como revestimientos para stents
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona stents que comprenden una estructura generalmente tubular (que incluye, por ejemplo, formas espirales), cuya superficie está revestida con una composición como se ha descrito anteriormente. Resumidamente, un stent es un entramado, usualmente de forma cilíndrica, que puede insertarse en un conducto corporal (p. ej., los conductos biliares), que se ha estrechado por un proceso de enfermedad (p. ej., crecimiento hacia adentro por un tumor) con objeto de impedir el cierre o la reoclusión del conducto. Los stents actúan manteniendo abiertas físicamente las paredes del conducto corporal en el cual se insertan.
Pueden utilizarse una diversidad de stents dentro del contexto de la presente invención, con inclusión, por ejemplo, de stents esofágicos, stents vasculares, stents biliares, stents pancreáticos, stents uretéricos y uretrales, stents lacrimales, stents de las trompas de Eustaquio, stents de las trompas de Falopio, y stents traqueo-bronquiales.
Los stents pueden obtenerse fácilmente de fuentes comerciales, o pueden construirse de acuerdo con técnicas bien conocidas. Ejemplos representativos de stents incluyen los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.776.337, titulada "Expandable Intraluminal Graft, and Method and Apparatus for Implanting and Expandable Intraluminar Graft", patente de EE.UU. Nº 5.176.626, titulada "Indwelling Stent", patente de EE.UU. Nº 5.147.370 titulada "Nitinol Stent for Hollow Body Conduits", patente de EE.UU. Nº 5.064.435, titulada "Shell-Expanding Prosthesis Having Stable Axial Length", patente de EE.UU. Nº 5.052.998 titulada "Indwelling Stent and Method of Use", y patente de EE.UU. Nº 5.041.126 titulada "Endovascular Stent and Delivery System", todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad en esta memoria.
Los stents pueden revestirse con composiciones anti-angiogénicas o factores anti-angiogénicos para usar en la presente invención utilizando una diversidad de métodos, que incluyen por ejemplo: (a) por fijación directa al stent de una composición anti-angiogénica (p. ej., bien sea por pulverización del stent con una película polímero/fármaco, o bien por inmersión del stent en una solución polímero/fármaco), (b) por revestimiento del stent con una sustancia tal como un hidrogel que absorberá a su vez la composición anti-angiogénica (o el factor anti-angiogénico indicado anteriormente), (c) por entretejido de un hilo revestido con la composición anti-angiogénica (o el polímero propiamente dicho conformado en un hilo) en la estructura del stent, (d) por inserción del stent en un manguito o malla que está constituido por o revestido con una composición anti-angiogénica, o (e) construcción del stent propiamente dicho con una composición anti-angiogénica. En realizaciones preferidas de la invención, la composición debe adherirse firmemente al stent durante el almacenamiento y en el momento de la inserción, y no debe desprenderse del stent cuando el diámetro se expande desde su tamaño colapsado a su tamaño plenamente expandido. Asimismo, preferiblemente, la composición anti-angiogénica no debería degradarse durante el almacenamiento, antes de la inserción, o cuando se calienta a la temperatura del cuerpo después de la expansión en el interior del cuerpo. Adicionalmente, aquélla debería revestir preferiblemente el stent suave y uniformemente, con una distribución uniforme de inhibidor de la angiogénesis, en tanto que no cambiarse el contorno del stent. En realizaciones preferidas de la invención, la composición anti-angiogénica debería proporcionar una liberación uniforme, predecible y prolongada del factor anti-angiogénico en el tejido que rodea el stent una vez que se ha desplegado aquélla. Para stents vasculares, además de las propiedades anteriores, la composición no debe hacer que el stent sea trombógeno (es decir no debe hacer que se formen coágulos de sangre), o causar turbulencia significativa en el flujo sanguíneo (más de la que podría esperarse que causara el stent propiamente dicho si careciera de revestimiento).
Dentro de otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para expandir el lumen de un conducto corporal, que comprenden insertar un stent en el conducto, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición anti-angiogénica (o bien, un factor anti-angiogénico aislado), de tal modo que el conducto se expande. Se describen a continuación una diversidad de realizaciones en las cuales el lumen de un conducto corporal se expande con objeto de eliminar una obstrucción biliar, esofágica, traqueo-bronquial, uretral o vascular. Adicionalmente, se describe un ejemplo representativo con mayor detalle en el Ejemplo 7.
Generalmente, los stents se insertan de una manera similar con indiferencia del sitio o la enfermedad que se esté tratando. De modo resumido, se realiza generalmente en primer lugar un examen previo a la inserción, usualmente un procedimiento de diagnóstico con formación de imagen, endoscopia, o visualización directa en el momento de la cirugía, a fin de determinar el posicionamiento apropiado para la inserción del stent. Se hace avanzar luego un alambre de guía a lo largo de la lesión o sitio de inserción propuesto, y se hace pasar sobre éste un catéter de suministro que permite que se inserte un stent en su forma colapsada. Típicamente, los stents son susceptibles de ser comprimidos, de tal modo que pueden insertarse a través de cavidades minúsculas mediante pequeños catéteres, y se expanden luego a un diámetro mayor una vez que se encuentran en la localización deseada. Una vez expandido, el stent fuerza físicamente las paredes del conducto separándolas, y mantiene abierto el conducto. Como tales, los stents son susceptibles de inserción a través de una abertura pequeña, y sin embargo son todavía capaces de mantener abierta una cavidad o conducto de diámetro grande. El stent puede ser auto-expandible (p. ej., los stents Wallstent y Gianturco), expandible mediante balón (p. ej., el stent Palmaz y el stent Strecker), o implantarse por un cambio de temperatura (p. ej., el stent Nitinol).
Los stents se maniobran típicamente in situ bajo control radiológico o visual directo, teniendo cuidado particularmente de colocar el stent exactamente a través del estrechamiento en el órgano de que se trate. Se retira luego el catéter de direccionamiento, dejando el stent en pie por sí mismo como un andamio. Un examen post-inserción, usualmente un examen por rayos X, se utiliza a menudo para confirmar el posicionamiento apropiado.
En una realización preferida de la descripción, se proporcionan métodos para eliminar obstrucciones biliares, que comprenden insertar un stent biliar en un conducto biliar, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se elimina la obstrucción biliar. Resumidamente, el crecimiento del tumor del conducto común de la bilis da como resultado una ictericia colestática progresiva que es incompatible con la vida. Generalmente, el sistema biliar que drena la bilis del hígado al duodeno se extruye la mayoría de las veces por (1) un tumor compuesto de células de los conductos biliares (colangiocarcinoma), (2) un tumor que invade el conducto biliar (p. ej., carcinoma pancreático), o (3) un tumor que ejerce presión extrínseca y comprime el conducto biliar (p. ej., nódulos linfáticos engrosados).
Tanto los tumores biliares primarios, como otros tumores que causan compresión del árbol biliar pueden tratarse utilizando los stents descritos en esta memoria. Un ejemplo de tumores biliares primarios son los adenocarcinomas (que se denominan también tumores de Klatskin cuando se encuentran en la bifurcación del conducto hepático común). Se hace referencia también a estos tumores como carcinomas biliares, coledocolangiocarcinomas, o adenocarcinomas del sistema biliar. Los tumores benignos que afectan al conducto biliar (p. ej., adenoma del sistema biliar), y, en casos raros, carcinomas de células escamosas del conducto biliar y adenocarcinomas de la vesícula biliar, pueden causar también compresión del árbol biliar, y por consiguiente, dar como resultado obstrucción biliar.
La compresión del árbol biliar es debida muy comúnmente a tumores de hígado y páncreas que comprimen y obstruyen por esta razón los conductos. La mayoría de los tumores del páncreas proceden de células de los conductos pancreáticos. Esta es una forma de cáncer sumamente fatal (5% de todas las muertes por cáncer; 26.000 nuevos casos cada año en los EE.UU.) con un promedio de 6 meses de supervivencia y una tasa de supervivencia anual de solamente 10%. Cuando estos tumores están localizados en la cabeza del páncreas, los mismos causan frecuentemente obstrucción biliar, y esto va significativamente en detrimento de la calidad de vida del paciente. Si bien se hace referencia generalmente a todos los tipos de tumores pancreáticos como "carcinoma del páncreas", existen subtipos histológicos que incluyen: adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, cistadeno-carcinoma, y carcinoma de células acinares. Los tumores hepáticos, como se ha expuesto anteriormente, pueden causar también compresión del árbol biliar, y por consiguiente pueden causar obstrucción de los conductos biliares.
En una realización de la descripción, se inserta primeramente un stent biliar en un conducto biliar de una de una de varias maneras: desde el extremo superior por inserción de una aguja a través de la pared abdominal y a través del hígado (un colangiograma transhepático percutáneo o "PTC"); desde el extremo inferior por canulación del conducto biliar a través de un endoscopio insertado a través de la boca, el estómago, o el duodeno (un colangiograma retrógrado endoscópico o "ERCP"); o por incisión directa durante un procedimiento quirúrgico. Un examen previo a la inserción, PTC, ERCP, o visualización directa en el momento de la cirugía debería realizarse generalmente para determinar la posición apropiada para la inserción del stent. Se hace avanzar luego un alambre de guía a lo largo de la lesión, y se hace pasar sobre éste un catéter de suministro para permitir que el stent se inserte en su forma colapsada. Si el examen de diagnóstico fue un PTC, el alambre de guía y el catéter de suministro se insertarán a través de la pared abdominal, mientras que si el examen original fue un ERCP, el stent se colocará a través de la boca. El stent se posiciona luego bajo control radiológico, endoscópico, o visual directo, teniendo cuidado en particular para situarlo precisamente a través del estrechamiento en el conducto biliar. El catéter de direccionamiento se retirará dejando el stent en pie como un entramado que mantiene abierto el conducto biliar. Se realizará un colangiograma ulterior para comprobar que el stent está posicionado adecuadamente.
En otra realización adicional de la descripción, se proporcionan métodos para eliminar obstrucciones esofágicas, que comprenden insertar un stent esofágico en un esófago, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se elimina la obstrucción esofágica. Resumidamente, el esófago es el tubo hueco que transporta los alimentos y los líquidos desde la boca al estómago. El cáncer del esófago o invasión por cáncer originado en órganos adyacentes (p. ej., cáncer del estómago o pulmón) da como resultado la incapacidad de tragar los alimentos o la saliva. En esta realización, debe hacerse usualmente un examen previo a la inserción, usualmente una ingestión de bario o endoscopia con objeto de determinar la posición apropiada para la inserción del stent. A continuación puede posicionarse un catéter o endoscopio a través de la boca, y se hace avanzar un alambre de guía hasta el bloqueo. Se hace pasar un catéter de direccionamiento del stent sobre el alambre de guía bajo control radiológico o endoscópico, y se sitúa un stent exactamente a través del estrechamiento en el esófago. Puede utilizarse un examen post-inserción, usualmente un examen por rayos X con ingestión de bario, para confirmar el posicionamiento apropiado.
En otras realizaciones de la descripción, se proporcionan métodos para eliminar obstrucciones traqueo-bronquiales, que comprenden insertar un stent traqueo-bronquial en la tráquea o los bronquios, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, cuya superficie está revestida con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se elimina la obstrucción traqueo-bronquial. Resumidamente, la tráquea y los bronquios son tubos que transportan aire desde la boca y la nariz a los pulmones. La obstrucción de la tráquea por cáncer, invasión por cáncer originado en órganos adyacentes (p. ej., cáncer del pulmón), o colapso de la tráquea a los bronquios debido a condromalacia (debilitamiento de los anillos cartilaginosos) da como resultado la imposibilidad de respirar. En esta realización de la invención, el examen previo a la inserción, usualmente una endoscopia, debería realizarse generalmente con objeto de determinar la posición apropiada para inserción del stent. Se posiciona luego un catéter o endoscopio a través de la boca, y se hace avanzar un alambre de guía a través de la obstrucción. Se hace pasar luego un catéter de direccionamiento a lo largo del alambre de guía con objeto de permitir la inserción de un stent colapsado. El stent se sitúa bajo control radiológico o endoscopio con objeto de colocarlo exactamente a través del estrechamiento. El catéter de direccionamiento puede retirarse luego dejando el stent en pie como un entramado sobre sí mismo. Un examen post-inserción, usualmente una broncoscopia, puede utilizarse para confirmar el posicionamiento apropiado.
En otra realización de la descripción, se proporcionan métodos par eliminar obstrucciones uretrales, que comprenden insertar un stent uretral en la uretra, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se elimina la obstrucción uretral. Resumidamente, la uretra es el tubo que drena la vejiga a través del pene. El estrechamiento extrínseco de la uretra al pasar a través de la próstata, debido a hipertrofia de la próstata, se produce prácticamente en todos los hombres a partir de la edad de 60 años y causa una dificultad progresiva al orinar. En esta realización, debe hacerse por regla general primeramente un examen previo a la inserción, usualmente una endoscopia o uretrograma, con objeto de determinar la posición apropiada para la inserción del stent, que se encuentra por encima del esfínter urinario externo en el extremo inferior, y próxima al nivel del cuello de la vejiga en el extremo superior. Se posiciona luego un endoscopio o catéter a través de la abertura del pene y se hace avanzar un alambre de guía por el interior hasta la vejiga. Se hace pasar luego un catéter de direccionamiento sobre el alambre de guía con objeto de permitir la inserción del stent. Se retira luego el catéter de direccionamiento, y se expande el stent en su lugar. Puede utilizarse
un examen post-inserción, usualmente endoscopia o uretrograma retrógrado, para confirmar la posición apropiada.
En otra realización de la descripción, se proporcionan métodos para eliminar obstrucciones vasculares, que comprenden insertar un stent vascular en un vaso sanguíneo, teniendo el stent una estructura generalmente tubular, estando revestida la superficie de la estructura con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se elimina la obstrucción vascular. Resumidamente, los stents pueden situarse en una extensa serie de vasos sanguíneos, tanto arterias como venas, para evitar la estenosis recurrente en el sitio de angioplastias fracasadas, para tratar estrechamientos que podrían fallar fácilmente si se trataran con angioplastia, y para tratar estrechamientos post-quirúrgicos (p. ej., estenosis de injertos de diálisis). Ejemplos representativos de sitios adecuados incluyen las arterias ilíaca, renal, y coronaria, la vena cava superior, y en injertos de diálisis. En una realización, se realiza primeramente una angiografía con objeto de localizar el sitio para la colocación del stent. Esto se realiza típicamente por inyección de contraste radio-opaco a través de un catéter insertado en una arteria o vena a medida que se toma una imagen de rayos X. Puede insertarse luego un catéter sea percutáneamente o por cirugía en la arteria femoral, arteria braquial, vena femoral o vena braquial, y hacerse avanzar por el interior del vaso sanguíneo apropiado conduciéndolo a través del sistema vascular bajo guiamiento fluoroscópico. Puede posicionarse luego un stent a través de la estenosis vascular. Puede utilizarse también un angiograma post-inserción con objeto de confirmar el posicionamiento apropiado.
Uso de composiciones anti-angiogénicas en procedimientos quirúrgicos
Como se ha indicado anteriormente, las composiciones anti-angiogénicas pueden utilizarse en una gran diversidad de procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, en un aspecto de la presente descripción puede utilizarse una composición anti-angiogénica (en la forma de, por ejemplo, una pulverización o película) para revestir o pulverizar un área antes de la extirpación de un tumor, con objeto de aislar los tejidos normales circundantes del tejido maligno, y/o para prevenir la propagación de la enfermedad a los tejidos circundantes. En otros aspectos de la presente descripción, pueden suministrarse composiciones anti-angiogénicas (p. ej., en la forma de una pulverización) por procedimientos endoscópicos con objeto de revestir los tumores, o inhibir la angiogénesis en una localización deseada. En otros aspectos adicionales de la presente descripción, pueden utilizarse mallas quirúrgicas que se han revestido con composiciones anti-angiogénicas de la presente invención, en cualquier procedimiento en el cual pudiera utilizarse una malla quirúrgica. Por ejemplo, en una realización de la descripción, puede utilizarse una malla quirúrgica cargada con una composición anti-angiogénica durante la cirugía de resección de cáncer abdominal (p. ej., subsiguientemente a la resección de colon) con objeto de proporcionar soporte a la estructura, y para liberar una cantidad del factor anti-angiogénico.
En aspectos adicionales de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar sitios de extirpación de tumores, que comprenden administrar una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente a los bordes de resección de un tumor subsiguientemente a la extirpación, de tal modo que se inhiba la recurrencia local de cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio. En una realización de la descripción, la o las composiciones anti-angiogénicas (o factor(es) anti-angiogénico(s) solo(s)) se administran directamente al sitio de extirpación del tumor (p. ej., se aplican por frotamiento, toque o revestimiento de otro modo de los bordes de resección del tumor con la o las composiciones o factor(es) anti-angiogénicas(os). Alternativamente, la o las composiciones o factores anti-angiogénicas(os) pueden incorporarse en pastas quirúrgicas conocidas antes de la administración. En realizaciones particularmente preferidas de la descripción, las composiciones anti-angiogénicas se aplican después de resecciones hepáticas de enfermedades malignas, y después de operaciones neuroquirúrgicas.
En un aspecto de la presente descripción, las composiciones anti-angiogénicas (como se han descrito anteriormente) pueden administrarse al borde de resección de una gran diversidad de tumores, incluyendo, por ejemplo, tumores de pulmón, colon, cerebro y hepáticos. Por ejemplo, en una realización de la descripción, se pueden administrar composiciones anti-angiogénicas al sitio de un tumor neurológico subsiguientemente a la extirpación, de tal modo que se inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos en dicho sitio. De manera resumida, el cerebro está muy localizado funcionalmente; es decir, cada región anatómica específica está especializada en la realización de una función específica. Por esta razón, la localización de la patología cerebral es a menudo más importante que el tipo. Una lesión relativamente pequeña en un área clave puede ser mucho más devastadora que una lesión mucho mayor en un área menos importante. Análogamente, una lesión en la superficie del cerebro puede ser fácil de resecar quirúrgicamente, mientras que el mismo tumor localizado en profundidad en el cerebro puede no serlo (sería necesario cortar a través de demasiadas estructuras vitales para alcanzarlo). Asimismo, incluso los tumores benignos pueden ser peligrosos por varias razones: los mismos pueden crecer en un área clave y causar lesiones importantes; aun cuando podrían curarse por resección quirúrgica, ésta puede ser no ser posible; y por último, si se dejan sin control, los mismos pueden causar una presión intracraneal incrementada. El cráneo es un espacio cerrado no susceptible de expansión. Por esta razón, si algo se encuentra en crecimiento en una localización, alguna otra parte tiene que estar siendo comprimida en otra localización - el resultado es una presión incrementada en el cráneo o presión intracraneal incrementada. Si se mantiene sin tratar una condición de este tipo, pueden comprimirse las estructuras vitales, dando como resultado la muerte. La incidencia de enfermedades malignas del CNS (sistema nervioso central) es 8-16 por 100.000. El pronóstico de la enfermedad maligna primaria del cerebro es funesto, con una supervivencia media menor que un año, incluso después de la resección quirúrgica. Estos tumores, especialmente gliomas, son predominantemente una enfermedad local que reaparece a una distancia no mayor que 2 cm del foco original de la enfermedad después de la eliminación quirúrgica.
Ejemplos representativos de tumores cerebrales que pueden tratarse utilizando las composiciones y métodos descritos en esta memoria incluyen Tumores Gliales (tales como Astrocitoma Anaplástico, Glioblastoma Multiforme, Astrocitoma Pilocítico, Oligodendroglioma, Ependimoma, Ependimoma Mixopapilar, Subependimoma, Papiloma del Plexo Coroideo); Tumores Neuronales (p. ej., Neuroblastoma, Ganglioneuroblastoma, Ganglioneuroma, y Meduloblastoma); Tumores de la Glándula Pineal (p. ej., Pineoblastoma y Pineocitoma); Tumores Meníngeos (p. ej., Meningioma, Hemangiopericitoma Meníngeo, Sarcoma Meníngeo); Tumores de las Células de la Vaina Nerviosa (p. ej., Schwanoma (Neurolemoma) y Neurofibroma); Linfomas (p. ej., Linfoma de Hodgkin y distinto al de Hodgkin (con inclusión de numerosos subtipos, tanto primarios como secundarios); Tumores de Malformación (p. ej., Craneofaringioma, Quistes Epidermoides, Quistes Dermoides y Quistes Coloides); y Tumores Metastásicos (que pueden derivarse prácticamente de cualquier tumor, siendo los más comunes los de tumores de pulmón, mama, melanoma, riñón, y del tracto gastrointestinal).
Otros usos terapéuticos de las composiciones anti-angiogénicas
Además de tumores, numerosas otras enfermedades no tumorígenas dependientes de la angiogénesis que se caracterizan por el crecimiento anormal de los vasos sanguíneos pueden tratarse también con las composiciones anti-angiogénicas, o factores anti-angiogénicos usados en la presente invención. Ejemplos representativos de tales enfermedades no tumorígenas dependientes de la angiogénesis incluyen neovascularización de la córnea, escaras hipertróficas y queloides, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, malformaciones arteriovenosas (expuestas anteriormente), placas ateroscleróticas, curación retardada de las heridas, articulaciones hemofílicas, fracturas no consolidadas, síndrome de Osler-Weber, psoriasis, granuloma piógeno, escleroderma, tracoma, menorragia (expuesta anteriormente) y adherencias vasculares.
En particular, en un aspecto de la presente descripción se proporcionan métodos para tratar la neovascularización de la córnea (con inclusión de la neovascularización de injertos de córnea), que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica (como se ha descrito anteriormente) a la córnea, de tal modo que se inhibe la formación de vasos sanguíneos. Resumidamente, la córnea es un tejido que carece normalmente de vasos sanguíneos. En ciertas condiciones patológicas, sin embargo, se pueden extender capilares al interior de la córnea desde el plexo vascular pericorneal del limbo. Cuando se vasculariza la córnea, la misma se vuelve también turbia, dando como resultado una disminución de la agudeza visual del paciente. La pérdida visual puede llegar a ser completa si la córnea se opacifica totalmente.
Los vasos sanguíneos pueden entrar en la córnea en una diversidad de patrones y profundidades, dependiendo del proceso que incita la neovascularización. Estos patrones se han definido tradicionalmente por los oftalmólogos en los tipos siguientes: pannus trachomatosus, pannus leprosus, pannus phylctenulosus, pannus degenerativus y glaucomatous pannus. El estroma corneal puede ser invadido también por ramas de la arteria ciliar anterior (lo que se denomina vascularización intersticial) que causa varias lesiones clínicas distintas: lazos terminales, un patrón "en cepillo", una forma de sombrilla, una forma de retículo, arcadas intersticiales (a partir de los vasos episclerales), y vasos irregulares aberrantes.
Una gran diversidad de trastornos pueden dar como resultado la neovascularización de la córnea, con inclusión por ejemplo de infecciones corneales (p. ej., tracoma, queratitis por herpes símplex, leishmaniasis y oncocerciasis), procesos inmunológicos (p. ej., rechazo de injertos y síndrome de Stevens-Johnson), quemaduras por álcalis, traumatismos, inflamación (de cualquier causa), estados de deficiencia tóxicos y de la nutrición, y como complicación del uso de lentes de contacto.
Si bien la causa de la neovascularización de la córnea puede variar, la respuesta de la córnea a la agresión y el crecimiento vascular subsiguiente hacia el interior es similar cualquiera que sea la causa. Resumidamente, la localización de la lesión parece ser importante dado que solamente aquellas lesiones situadas dentro de una distancia crítica del limbo incitarán una respuesta angiogénica. Esto se debe probablemente al hecho de que los factores angiogénicos responsables de provocar la invasión vascular se crean en el sitio de la lesión, y tienen que difundirse hasta el sitio de los vasos sanguíneos más próximos (el limbo) con objeto de ejercer su efecto. Más allá de una cierta distancia del limbo, esto no sería ya posible y el endotelio límbico no se vería inducido a crecer hacia el interior de la córnea. Varios factores angiogénicos están implicados probablemente en este proceso, muchos de los cuales son productos de la respuesta inflamatoria. De hecho, la neovascularización de la córnea parece ocurrir solamente en asociación con un infiltrado de células inflamatorias, y el grado de angiogénesis es proporcional a la extensión de la reacción inflamatoria. El edema de la córnea facilita además el crecimiento de los vasos sanguíneos hacia el interior por debilitación del entramado estromático de la córnea y proporcionar una vía de acceso de "resistencia mínima" a través de la cual pueden crecer los capilares.
A continuación de la reacción inflamatoria inicial, el crecimiento de los capilares hacia el interior de la córnea procede de la misma manera que ocurre en otros tejidos. Las células endoteliales normalmente en reposo de los capilares y vénulas límbicos se ven estimuladas para dividirse y migrar. Las células endoteliales se proyectan alejándose de sus vasos de origen, digieren la membrana basal circundante y el tejido a través del cual se desplazan, y migran hacia la fuente del estímulo angiogénico. Las ramificaciones con extremos ciegos adquieren un lumen y se anastomosan luego unas con otras para formar lazos capilares. El resultado final es el establecimiento de un plexo vascular en el interior del estroma corneal.
Las composiciones anti-angiogénicas usadas en la presente invención son útiles por bloquear los efectos estimuladores de los promotores de la angiogénesis, reducir la división de las células endoteliales, reducir la migración de las células endoteliales, y disminuir la actividad de las enzimas proteolíticas secretadas por el endotelio.
En realizaciones particularmente preferidas de la descripción, puede prepararse un factor anti-angiogénico para administración tópica en solución salina (combinado con cualquiera de los conservantes y agentes antimicrobianos utilizados comúnmente en preparaciones oculares), y administrarse en forma de colirio. La solución del factor anti-angiogénico se puede preparar en su forma pura y puede administrarse varias veces al día. Alternativamente, composiciones anti-angiogénicas, preparadas como se ha descrito anteriormente, se pueden administrar también directamente a la córnea. En realizaciones preferidas, la composición anti-angiogénica se prepara con un polímero muco-adhesivo que se fija a la córnea. En realizaciones adicionales, los factores anti-angiogénicos o composiciones anti-angiogénicas pueden utilizarse como una ayuda a la terapia convencional con esteroides.
La terapia tópica puede ser útil también profilácticamente en lesiones de la córnea que se sabe tienen una elevada probabilidad de inducir una respuesta angiogénica (tales como quemaduras por productos químicos). En estos casos el tratamiento, probablemente en combinación con esteroides, puede iniciarse inmediatamente para ayudar a prevenir las complicaciones subsiguientes.
En otras realizaciones, las composiciones anti-angiogénicas descritas con anterioridad pueden ser inyectadas directamente en el estroma de la córnea por un oftalmólogo bajo guiamiento con ayuda del microscopio. El sitio preferido de inyección puede variar con la morfología de la lesión individual, pero la meta de la administración sería poner la composición en el frente de avance de la vasculatura (es decir, intercalado entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En la mayoría de los casos, esto implicaría inyección perilímbica en la córnea para "proteger" la córnea contra el avance de los vasos sanguíneos. Este método puede ser utilizado también poco tiempo después de una agresión en la córnea con objeto de prevenir profilácticamente la neovascularización de la córnea. En esta situación, el material podría inyectarse en la córnea perilímbica intercalado entre la lesión corneal y su suministro potencial de sangre límbica no deseado. Tales métodos pueden ser utilizados también de una manera similar para evitar la invasión capilar de córneas trasplantadas. En una forma de liberación prolongada, podrían requerirse solamente inyecciones 2-3 veces al año. Podría añadirse también un esteroide a la solución de inyección para reducir la inflamación resultante de la inyección propiamente dicha.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratamiento de escaras hipertróficas y queloides que comprenden el paso de administrar una de las composiciones anti-angiogénicas descritas anteriormente a una escara hipertrófica o queloide.
Resumidamente, la curación de las heridas y la formación de escaras ocurre en tres fases: inflamación, proliferación, y maduración. La primera fase, inflamación, se produce en repuesta a una agresión que es suficientemente grave para lesionar la piel. Durante esta fase, que dura 3 a 4 días, la sangre y el fluido tisular forman un coágulo adhesivo y una malla de fibrina que sirve para fijar entre sí las superficies de la herida. Esto va seguido luego por una fase proliferativa en la cual se produce el crecimiento de capilares y tejido conjuntivo hacia el interior desde los bordes de la herida, y el cierre del defecto de la piel. Por último, una vez que ha cesado la proliferación de capilares y fibroblastos, comienza el proceso de maduración, en el cual la escara se contrae y se haced menos celular, menos vascular, y aparece aplastada y blanca. Esta fase final puede durar entre 6 y 12 meses.
Si se produce demasiada cantidad de tejido conjuntivo y la herida se mantiene persistentemente celular, la escara puede volverse roja y levantarse. Si la escara se mantiene dentro de los límites de la herida original, se hace referencia a la misma como escara hipertrófica, pero si se extiende más allá de la escara original y hacia el tejido circundante, se hace referencia a la lesión como un queloide. Las escaras hipertróficas y los queloides se producen durante las fases segunda y tercera de formación de la escara. Las heridas graves son particularmente propensas a la proliferación endotelial y fibroblástica excesiva, en las que se incluyen quemaduras, heridas abiertas, y heridas infectadas. En las escaras hipertróficas, se produce cierto grado de maduración y una mejora gradual. En cambio, en el caso de los queloides, se produce un tumor real que puede hacerse muy grande. En tales casos ocurre rara vez una mejora espontánea.
Por esta razón, en una realización de la presente descripción, o bien factores anti-angiogénicos solos, o composiciones anti-angiogénicas como se han descrito anteriormente, se inyectan directamente en una escara hipertrófica o queloide con objeto de evitar la progresión de estas lesiones. La frecuencia de las inyecciones dependerá de la cinética de liberación del polímero utilizado (si está presente), y de la respuesta clínica. Esta terapia es particularmente valiosa en el tratamiento profiláctico de condiciones que se sabe dan como resultado el desarrollo de escaras hipertróficas y queloides (p. ej., quemaduras), y se inicia preferiblemente después que la fase proliferativa ha tenido tiempo para progresar (aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de la escara hipertrófica o queloide.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar el glaucoma neovascular, que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica al ojo, de tal modo que se inhibe la formación de vasos sanguíneos.
Resumidamente, el glaucoma neovascular es una condición patológica en la cual se desarrollan capilares nuevos en el iris del ojo. La angiogénesis se origina usualmente desde los vasos localizados en el borde pupilar, y progresa a través de la raíz del iris y hacia el interior de la red trabecular. Fibroblastos y otros elementos de tejido conjuntivo están asociados con el crecimiento capilar y se desarrolla una membrana fibrovascular que se extiende a través de la superficie anterior del iris. Con el tiempo, este tejido alcanza el ángulo de la cámara anterior en el cual forma sinequias. Estas sinequias, a su vez, se aglutinan, forman escaras, y se contraen para cerrar finalmente el ángulo de la cámara anterior. La formación de escara impide el drenaje adecuado de humor acuoso a través del ángulo y hacia el interior de la red trabecular, dando como resultado un aumento de la presión intraocular que puede conducir a ceguera.
El glaucoma neovascular se produce generalmente como una complicación de enfermedades en las cuales es predominante la isquemia retinal. En particular, aproximadamente una tercera parte de los pacientes con este trastorno presentan retinopatía diabética y 28% tienen oclusión de la vena retinal central. Otras causas incluyen desprendimiento crónico de retina, glaucoma en fase final, enfermedad obstructiva de la arteria carótida, fibroplasia retrolental, anemia de células falciformes, tumores intraoculares, y fístulas cavernosas carotídeas. En sus etapas iniciales, el glaucoma neovascular puede ser diagnosticado por biomicroscopía con lámpara de hendidura de gran aumento, en la que aquél revela pequeños capilares dilatados y desorganizados (que gotean fluoresceína) en la superficie del iris. La gonioscopia posterior demuestra una obliteración progresiva del ángulo de la cámara anterior por bandas fibrovasculares. Mientras el ángulo de la cámara anterior está todavía abierto, pueden servir de ayuda terapias conservadoras. Sin embargo, una vez que el ángulo se cierra es precisa la intervención quirúrgica con objeto de aliviar la presión.
Por consiguiente, en una realización de la descripción, factores anti-angiogénicos (sea solos o en una composición anti-angiogénica, como se ha descrito anteriormente) pueden ser administrados tópicamente al ojo con objeto de tratar las formas precoces de glaucoma neovascular.
En otras realizaciones de la descripción, pueden implantarse composiciones anti-angiogénicas por inyección de la composición en la región del ángulo de la cámara anterior. Esto proporciona un aumento localizado y sostenido del factor anti-angiogénico, e impide el crecimiento de vasos sanguíneos hacia el interior del área. Las composiciones anti-angiogénicas implantadas o inyectadas que se aplican entre los capilares del iris que avanzan y el ángulo de la cámara anterior pueden "defender" el ángulo abierto contra la neovascularización. Dado que los capilares no crecerán dentro de un radio significativo de la composición anti-angiogénica, podría mantenerse la permeabilidad del ángulo. En otras realizaciones, la composición anti-angiogénica puede disponerse también en cualquier localización tal que el factor anti-angiogénico se libere continuamente en el humor acuoso. Esto aumentaría la concentración del factor anti-angiogénico en el interior del humor, que baña a su vez la superficie del iris y sus capilares anormales, proporcionando con ello otro mecanismo para el suministro de la medicación. Estas modalidades terapéuticas pueden ser útiles también profilácticamente y en combinación con tratamientos existentes.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar la retinopatía diabética proliferativa, que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica a los ojos, tal que se inhibe la formación de vasos sanguíneos.
Resumidamente, se piensa que la patología de la retinopatía diabética es similar a la descrita anteriormente para el glaucoma neovascular. En particular, se cree que la retinopatía diabética básica se convierte en retinopatía diabética proliferativa bajo la influencia de la hipoxia retinal. Generalmente, el tejido neovascular se ramifica desde el nervio óptico (usualmente a una distancia menor de 10 mm del borde), y desde la superficie de la retina hacia regiones en las cuales la perfusión del tejido es deficiente. Inicialmente, los capilares crecen entre la membrana interna limitante de la retina y la superficie posterior del cuerpo vítreo. Con el tiempo, los vasos crecen hacia el interior del cuerpo vítreo y a través de la membrana interna limitante. A medida que se contrae el cuerpo vítreo, se aplica tracción a los vasos, lo que da a menudo como resultado el desgarro de los vasos y la opacificación del cuerpo vítreo debido a hemorragia. La tracción fibrosa debida a la cicatrización en la retina puede producir también desprendimiento de retina.
La terapia convencional de elección es la fotocoagulación panretinal para reducir el tejido retinal, y disminuir con ello las demandas de oxígeno de la retina. Aunque inicialmente es eficaz, existe una elevada tasa de recaída con formación de nuevas lesiones en otras partes de la retina. Las complicaciones de esta terapia incluyen una disminución de la visión periférica de hasta el 50% de los pacientes, abrasiones mecánicas de la córnea, formación de cataratas inducida por los rayos láser, glaucoma agudo, y estimulación de crecimiento neovascular subretinal (que puede dar como resultado la pérdida de visión). Como resultado, este procedimiento se lleva a cabo únicamente cuando están presentes factores de riesgo elevados, y la relación riesgo-beneficio está claramente a favor de la intervención.
Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferidas de la descripción, la retinopatía diabética proliferativa puede tratarse por inyección de uno o varios factores anti-angiogénicos (o composición anti-angiogénica) en el humor acuoso o el cuerpo vítreo, con objeto de aumentar la concentración local del factor anti-angiogénico en la retina. Preferiblemente, este tratamiento debería iniciarse antes de la adquisición de una enfermedad grave que requiera fotocoagulación. En otras realizaciones de la invención, las arterias que alimentan las lesiones neovasculares pueden ser embolizadas (utilizando composiciones anti-angiogénicas, como se ha descrito anteriormente).
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar la fibroplasia retrolental, que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un factor anti-angiogénico (o composición anti-angiogénica) al ojo, de tal modo que se inhibe la formación de vasos sanguíneos.
Resumidamente, la fibroplasia retrolental es una condición que se produce en niños prematuros que reciben terapia de oxígeno. La vasculatura periférica de la retina, particularmente en el lado temporal, no llega a formarse completamente hasta el final de la vida fetal. Se piensa que el oxígeno excesivo (incluso niveles que serían fisiológicos en el fondo) y la formación de radicales libres de oxígeno son importantes por causar daño a los vasos sanguíneos de la retina inmadura. Estos vasos se estrechan, y luego llegan a obliterarse estructuralmente como resultado de la exposición al oxígeno. Como consecuencia, la retina periférica no logra vascularizarse y sobreviene una isquemia retinal. En respuesta a la isquemia, se induce neovascularización en la unión de la retina normal y la isquémica.
En el 75% de los casos, estos vasos regresan espontáneamente. Sin embargo, en el 25% restante se produce un crecimiento capilar continuado, contracción del componente fibrovascular, y tracción tanto sobre los vasos como sobre la retina. Esto da como resultado hemorragia en el cuerpo vítreo y/o desprendimiento de retina que pueden conducir a ceguera. El glaucoma neovascular con cierre del ángulo es también una complicación de esta condición.
Dado que en muchas ocasiones es imposible determinar qué casos se resolverán espontáneamente y cuales aumentarán de gravedad, el tratamiento convencional (es decir, la cirugía) se inicia generalmente sólo en pacientes con enfermedad declarada y una patología bien desarrollada. Este enfoque de "esperar y ver" excluye la intervención precoz, y permite la progresión de la enfermedad en el 25% de los individuos que siguen una evolución complicada. Por consiguiente, en una realización de la descripción, la administración tópica de factores anti-angiogénicos (o composiciones anti-angiogénicas, como se ha descrito anteriormente) puede realizarse en niños que corren un riesgo elevado de desarrollar esta condición en un intento de reprimir la incidencia de la progresión de la fibroplasia retrolental. En otras realizaciones, pueden utilizarse inyecciones intravítreas y/o implantes intraoculares de una composición anti-angiogénica. Tales métodos se prefieren particularmente en los casos de enfermedad establecida,con objeto de reducir la necesidad de cirugía.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar la artritis reumatoide, que comprenden el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición anti-angiogénica a una articulación, a fin de inhibir la formación de vasos sanguíneos.
Resumidamente, en la artritis reumatoide la lesión articular se debe a una combinación de inflamación (con inclusión de glóbulos blancos de la sangre y productos de los glóbulos blancos de la sangre) y desarrollo de tejido de pannus (un tejido compuesto de tejido neovascular, tejido conjuntivo, y células inflamatorias). Generalmente, la inflamación crónica en sí misma es insuficiente para dar como resultado la lesión de la superficie articular, pero se crea un déficit permanente una vez que el tejido fibrovascular digiere el tejido cartilaginoso.
En una realización preferida de la descripción, pueden administrarse factores anti-angiogénicos (con inclusión de composiciones anti-angiogénicas, como se ha descrito anteriormente) por inyección intra-articular, como una pasta quirúrgica, o como un agente oral (p. ej., que contenga el factor anti-angiogénico talidomida), con objeto de inhibir la formación de vasos sanguíneos en el interior de la articulación. Un ejemplo representativo de un método de este tipo se expone con mayor detalle más adelante en el Ejemplo 19.
Como se ha indicado anteriormente, en otro aspecto adicional de la presente descripción, se proporcionan injertos vasculares que comprenden un tubo sintético, cuya superficie está revestida con una composición anti-angiogénica como se ha descrito anteriormente. De manera resumida, los injertos vasculares son tubos sintéticos, hechos usualmente de Dacron o Gortex, insertados quirúrgicamente para salvar en derivación las obstrucciones arteriales, en la mayoría de los casos desde la aorta a la femoral, o desde la femoral a la arteria poplítea. Un problema fundamental que complica particularmente los injertos de derivación femoral-poplítea es la formación de una reacción subendotelial semejante a una escara en la pared del vaso sanguíneo denominado hiperplasia neoíntima, que estrecha el lumen en el interior y adyacente a ambos extremos del injerto, y que puede ser progresiva. Un injerto revestido con o que contenga factores anti-angiogénicos (o composiciones anti-angiogénicas, como se ha descrito anteriormente) puede utilizarse para limitar la formación de hiperplasia neoíntima en ambos extremos del injerto. El injerto puede situarse entonces quirúrgicamente por técnicas de derivación convencionales.
Las composiciones anti-angiogénicas usadas en la presente invención pueden utilizarse también de diversas otras maneras. Por ejemplo, aquéllas pueden incorporarse en suturas quirúrgicas con objeto de prevenir los granulomas punteados, pueden implantarse en el útero (de la misma manera que un DIU) para el tratamiento de la menorragia o como forma de control femenino de la natalidad, administrarse como un fluido para lavado peritoneal o para implantación peritoneal en el tratamiento de la endometriosis, unirse a un anticuerpo monoclonal dirigido contra células endoteliales activadas como forma de quimioterapia sistémica, o utilizarse en la formación de imágenes de diagnóstico cuando se unen a un anticuerpo monoclonal marcado radiactivamente, que reconoce las células endoteliales activadas.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación, los ejemplos 1, 3, 5, 6, 17, 18 y 19 no son ilustrativos de la invención reivindicada.
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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de factor anti-invasivo
Se extirpan la cintura escapular y el cráneo de una lija, se rascan luego con un escalpelo con objeto de separar totalmente los músculos y el tejido conjuntivo asociado del cartílago. El cartílago se homogeneíza luego con un triturador de tejidos, y se extrae por agitación continua a la temperatura ambiente durante 2 a 5 días en una solución que contiene hidrocloruro de guanidio 2,0 M y MES 0,02 M a pH 6,0.
Al cabo de 2 a 5 días, se hace pasar el extracto de cartílago a través de una red de tela metálica con objeto de separar los constituyentes de mayor tamaño. El filtrado se pasa luego a través de una unidad de ultrafiltración Amicon que utiliza cartuchos enrollados en espiral, con un punto de corte por peso molecular de 100.000. El filtrado (que contiene proteínas con un peso molecular menor que 100.000 daltons) se dializa luego contra tampón MES 0,02 M (pH 6) con una unidad de ultrafiltración Amicon que retiene las proteínas con un peso molecular mayor que 3.000 daltons. Utilizando este método, se separan las proteínas y constituyentes de peso molecular bajo, así como cantidades excesivas de hidrocloruro de guanidio. El dializado se concentra hasta una concentración final de 9 mg/ml.
Ejemplo 2 Análisis de diversos agentes en cuanto a actividad anti-angiogénica A. Ensayos de la Membrana Corioalantoica de Pollo ("CAM")
Se incubaron durante 3 días embriones fertilizados de pollo doméstico antes del cultivo sin cáscara. En este procedimiento, los contenidos de los huevos se vaciaron retirando la cáscara localizada alrededor de la cámara de aire. Se cortó luego la membrana interior de la cáscara y se perforó el extremo opuesto de la cáscara para permitir que el contenido del huevo se deslizara suavemente desde el extremo romo. Los contenidos de los huevos se vaciaron en tazas de vidrio con fondo redondo esterilizadas y se cubrieron con tapas de cápsulas de petri. Estas se pusieron luego en una incubadora a 90% de humedad relativa y 3% de CO_{2}, y se incubaron durante 3 días.
Se mezcló taxol (Sigma, St. Louis, MI) a concentraciones de 1, 5, 10 y 30 \mug por parte alícuota de 10 \mul de metilcelulosa acuosa al 0,5%. Dado que el taxol es insoluble en agua, se utilizaron perlas de vidrio para producir partículas finas. Se secaron partes alícuotas de 10 microlitros de esta solución sobre Parafilm durante 1 hora, formando discos de 2 mm de diámetro. Los discos secados que contenían taxol se pusieron luego cuidadosamente en el borde en crecimiento de cada CAM el día 6 de la incubación. Se obtuvieron controles poniendo discos de metilcelulosa exenta de taxol sobre las CAMs durante el mismo trascurso de tiempo. Después de una exposición de 2 días (día 8 de incubación) la vasculatura se examinó con ayuda de un estereomicroscopio. se inyectó en la CAM Liposyn II, una solución blanca opaca, para aumentar la visibilidad de los detalles vasculares. Se obtuvieron imágenes de la vasculatura de los embriones vivos sin teñir utilizando un estereomicroscopio Zeiss que estaba conectado con una cámara de vídeo (Dage-MTI Inc., Michigan City, IN). Estas señales de vídeo se exhibieron luego con 160 aumentos y se capturaron utilizando un sistema de análisis de imágenes (Vidas, Kontron; Etching, Alemania). Se obtuvieron luego negativos de las imágenes en un registrador de gráficos (Modelo 3000; Matrix Instruments, Orangeburg, NY).
Las membranas de los embriones de pollo de 8 días sin cáscara se inundaron con aldehído glutárico al 2% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M; se inyectó un fijador adicional bajo la CAM. Después de 10 minutos in situ, se retiró la CAM y se puso en fijador nuevo durante 2 horas a la temperatura ambiente. El tejido se lavó luego durante la noche en tampón de cacodilato que contenía 6% de sacarosa. Las áreas de interés se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% durante 1,5 horas a 4ºC. Los tejidos se deshidrataron luego en una serie graduada de etanoles, se sometieron a intercambio de disolvente con óxido de propileno, y se embebieron en resina Spurr. Se cortaron secciones delgadas con una cuchilla de diamante, se pusieron sobre rejillas de cobre, se tiñeron, y se examinaron en un microscopio electrónico Joel 1200EX. Análogamente, se cortaron secciones de 0,5 mm y se tiñeron con azul de tolueno para microscopía óptica.
El día 11 del desarrollo, se utilizaron los embriones de pollo para la técnica de impresión de corrosión. Se inyectó resina Mercox (Ted Pella, Inc., Redding, CA) en la vasculatura de la CAM utilizando una aguja hipodérmica de calibre 30. El material de impresión estaba constituido por 2,5 gramos de polímero Mercox CL-2B y 0,05 gramos de catalizador (peróxido de benzoílo al 55%) que tenía un tiempo de polimerización de 5 minutos. Después de la inyección, se dejó que el material plástico se endureciera in situ durante una hora a la temperatura ambiente y luego durante la noche en un horno a 65ºC. Se puso luego la CAM en solución acuosa al 50% de hidróxido de sodio para digerir todos los componentes orgánicos. Las impresiones de material plástico se lavaron extensamente en agua destilada, se secaron al aire, se revistieron con oro/paladio y se examinaron con el microscopio electrónico de barrido Philips 501B.
Los resultados de los experimentos anteriores se muestran en las Figuras 1-4. Resumidamente, las características generales del cultivo normal de huevo de pollo sin cáscara se muestran en la Figura 1A. El día 6 de la incubación, el embrión está posicionado centralmente respecto a una red en expansión radial de vasos sanguíneos; la CAM se desarrolla adyacentemente al embrión. Estos vasos en crecimiento están unidos estrechamente a la superficie y son fácilmente visibles, haciendo que este sistema sea un modelo idealizado para el estudio de la angiogénesis. Pueden obtenerse imágenes de las redes capilares vivas de la CAM sin teñir por medios no invasivos con un estereomicroscopio. La Figura 1B ilustra un área vascular de este tipo en la cual se registraron los elementos celulares de la sangre en el interior de los capilares con el uso de una interfase vídeo/ordenador. La arquitectura tridimensional de dichas redes capilares de la CAM se muestra por el método de impresión de corrosión y se observa en el microscopio electrónico de barrido (Figura 1C). Estas piezas moldeadas revelaron vasos subyacentes que se proyectan hacia la superficie de la CAM en la cual forman una monocapa de capilares de anastomosis.
Secciones transversales a través de la CAM muestran un ectodermo exterior constituido por una doble capa de células, una capa mesodérmica más ancha que contiene capilares que se encuentran bajo el ectodermo, células adventicias, y una capa simple interna de células endodérmicas (Figura 1D). Al nivel del microscopio electrónico, se manifiestan los detalles estructurales típicos de los capilares de la CAM. Típicamente, estos vasos se encuentran en asociación estrecha con la capa celular interna del ectodermo (Figura 1E).
Después de 48 horas de exposición a taxol a concentraciones de 1, 5, 10 ó 30 \mug, se examinó cada CAM en condiciones vivas con un estereomicroscopio equipado con una interfase vídeo/ordenador con objeto de evaluar los efectos sobre la angiogénesis. Esta preparación de imágenes se utilizó con un aumento de 160 veces, que permitió la visualización directa de las células de la sangre en el interior de los capilares; con ello pudo evaluarse y registrarse fácilmente el flujo sanguíneo en las áreas de interés. Para este estudio, la inhibición de la angiogénesis se definió como un área de la CAM desprovista de una red de capilares con diámetros comprendidos entre 2 y 6 mm. Las áreas de inhibición carecían de flujo sanguíneo vascular y por consiguiente se observaron únicamente en condiciones experimentales de metilcelulosa que contenía taxol; en las condiciones de control de discos que carecían de taxol no se produjo efecto alguno sobre el sistema capilar en desarrollo. Los datos experimentales, dependientes de la dosis, de los efectos de taxol a concentraciones diferentes se muestran en la Tabla II.
TABLA II
1
Las CAMs típicas tratadas con taxol (Figuras 2A y 2B) se muestran con el disco de metilcelulosa transparente posicionado centralmente sobre la zona avascular que mide 6 mm de diámetro. A un aumento ligeramente mayor, la periferia de dichas zonas avasculares es claramente evidente (Figura 2C); los vasos funcionales circundantes se redirigían en muchos casos alejándose de la fuente de taxol (Figuras 2C y 2D). Tal redirecciamiento angular del flujo sanguíneo no se observó nunca en condiciones normales. Otra característica de los efectos del taxol era la formación de islas de sangre dentro de la zona avascular, que representaban la agregación de células de la sangre.
Las alteraciones morfológicas asociadas de la CAM tratada con taxol son fácilmente evidentes tanto al nivel del microscopio óptico como del microscopio electrónico. Por conveniencia de presentación, se muestran tres fases distintas de transición general del estado normal al estado avascular. Cerca de la periferia de la zona avascular, la CAM está identificada por una abundancia de células mitóticas en el interior de las tres capas germinales (Figuras 3A y 4A). Esta división mitótica intensificada era también una observación consistente para las células capilares endoteliales. Sin embargo, las células endoteliales se mantenían intactas en la unión sin extravasación alguna de células sanguíneas. Con una degradación adicional, la CAM se caracteriza por la rotura y disolución de los capilares (Figuras 3B y 4B). Las presuntas células endoteliales, detenidas típicamente en mitosis, mantienen todavía una relación espacial estrecha con las células sanguíneas y se encuentran subyacentes al ectodermo; sin embargo, estas células no están enlazadas formando uniones. La porción más central de la zona avascular se caracterizaba por una capa ectodérmica y endodérmica engrosada (Figuras 3C y 4C). Aunque estas capas estaban engrosadas, las uniones celulares se mantenían intactas y las capas mantenían sus características estructurales. Dentro del mesodermo, eran abundantes las células dispersas detenidas mitóticamente; estas células no exhibían la polarización de las células endoteliales observada en la fase anterior. Asimismo, a todo lo largo de esta región avascular, eran comunes las células degenerativas como se observaba al microscopio electrónico por las vacuolas y restos celulares densos (Figura 4C).
En resumen, este estudio demostró que 48 horas después de la aplicación de taxol a la CAM, se inhibía la angiogénesis. La inhibición de los vasos sanguíneos formaba una zona avascular que se representaba por tres fases de transición del efecto del taxol. El área central, más afectada de la zona avascular contenía capilares rotos con glóbulos rojos extravasados; esto indicaba que no existían uniones intercelulares entre las células endoteliales. Las células del endodermo y ectodermo mantenían sus uniones intercelulares y por consiguiente estas capas germinales se mantenían intactas; sin embargo, las mismas estaban ligeramente engrosadas. A medida que se aproximaba el área vascular normal, los vasos sanguíneos retenían sus complejos de unión y por consiguiente se mantenían también intactos. En la periferia de la zona tratada con taxol, se inhibía adicionalmente el crecimiento de los vasos sanguíneos, lo cual era evidente por la redirección o efecto de "acodamiento" típico de los vasos sanguíneos (Figura 2D).
Las zonas avasculares tratadas con taxol revelaban también una abundancia de células detenidas en mitosis en la totalidad de las tres capas germinales de la CAM; esto era exclusivo del taxol, dado que ningún estudio previo ha ilustrado un suceso de este tipo. Al ser detenidas en mitosis, la células endoteliales no podían desempeñar sus funciones metabólicas normales implicadas en la angiogénesis. En comparación, la zona avascular formada por suramina y acetato de cortisona no produce células detenidas mitóticamente en la CAM; las mismas impedían solamente el crecimiento ulterior de los vasos sanguíneos en el área tratada. Por esta razón, aunque los agentes son anti-angiogénicos, existen muchos puntos en los cuales puede localizarse el proceso de angiogénesis.
Los autores de la invención observaron también los efectos del taxol a lo largo de la duración de 48 horas y comprobaron que la inhibición de la angiogénesis se produce en una fase tan temprana como 9 hora después de la aplicación. Las secciones histológicas revelaron una morfología similar como se ve en la primera fase de transición de la zona avascular al cabo de 48 horas ilustrada en la Figura 3a y 4a. Asimismo, los autores observaron el proceso de revascularización en la zona avascular previamente observada. Se ha encontrado que la zona avascular formada por heparina y esteroides angiostáticos se revascularizó 60 horas después de la aplicación. En el estudio de los autores de la invención, la zonas avasculares tratadas con taxol no se revascularizaban durante al menos 7 días después de la aplicación, lo que implicaba un efecto más potente a largo plazo.
Ejemplo 3 Encapsulación de suramina
Un mililitro de ELVAX al 5% (poli(etileno-acetato de vinilo) reticulado con acetato de vinilo al 5%) en diclorometano ("DCM") se mezcla con un peso fijo de suramina sódica molida sub-microscópicamente. Esta mezcla se inyecta en 5 ml de poli(alcohol vinílico ("PVA") al 5% en agua en un tubo de ensayo de 30 ml con fondo plano. Tubos que contienen pesos diferentes del fármaco se suspenden luego en un baño de agua para muestras múltiples a 40ºC durante 90 minutos con agitación automática. Se retiran las mezclas, y se toman muestras de las microesferas para análisis de tamaños. Los tubos se centrifugan a 1000 g durante 5 min. El sobrenadante de PVA se retira y se recoge para análisis (fármaco no encapsulado). Las microesferas se lavan luego (con agitación turbulenta) en 5 ml de agua y se centrifugan de nuevo. El lavado de 5 ml se recoge para análisis (fármaco unido a la superficie). Las microesferas se mojan luego en 50 \mul de metanol, y se agitan de modo turbulento en 1 ml de DCM para disolver el ELVAX. Las microesferas se calientan luego a 40ºC, y se añaden lentamente 5 ml de agua a 50ºC con agitación. Este procedimiento da como resultado la evaporación inmediata del DCM, causando con ello la liberación de la suramina sódica en los 5 ml de agua. Las tres muestras de 5 ml se ensayaron luego en cuanto a contenido de fármaco.
La suramina sódica absorbe uv/vis con un valor lambda máximo de 312 nm. La absorción es lineal en el intervalo de 0 a 100 \mug/ml tanto en agua como en PVA al 5%. El fármaco emite fluorescencia intensa con un máximo de excitación a 312 nm, y un máximo de emisión a 400 nm. Esta fluorescencia es cuantificable en el intervalo de 0 a 25 \mug/ml.
Los resultados se muestran en las Figuras 5-10. Resumidamente, la distribución de tamaños de las microesferas parece no verse afectada por la inclusión del fármaco en el DCM (véanse las Figuras 5 y 6). Pueden obtenerse rendimientos satisfactorios de microesferas en el intervalo de 20 a 60 \mum.
La encapsulación de suramina es muy baja (< 1%) (véase Figura 8). Sin embargo, a medida que se aumenta el peso de fármaco en el DCM, la cantidad total de fármaco encapsulado aumentaba, aunque disminuía el % de encapsulación. Como se muestra en la Figura 7, pueden encapsularse 50 \mug de fármaco en 50 mg de ELVAX. La encapsulación de suramina sódica en PVA al 5% que contenía 10% de NaCl se muestra en las Figuras 9-10.
Ejemplo 4 Encapsulación de taxol
Se disuelven 500 microgramos de taxol o bacatina (un análogo de taxol, disponible de Inflazyme Pharmaceuticals Inc., Vancouver, Columbia Británica, Canadá) en 1 ml de una mezcla 50:50 ELVAX:ácido poli-l-láctico en DCM. Se preparan luego microesferas en una máquina de disolución (Analizador de Disolución de 6 Husillos, Vanderkamp, Van Kell Industries Inc., EE.UU.) por triplicado a 200 rpm, 42ºC, durante 3 horas. Las microesferas así preparadas se lavan dos veces en agua y se clasifican por tamaños en el microscopio.
La determinación de la encapsulación de taxol se realiza en un ensayo uv/vis (uv/vis lambda max. a 237 nm, ensayo de fluorescencia a excitación 237, emisión a 325 nm; los resultados de fluorescencia se presentan entre corchetes []). Utilizando los procedimientos descritos anteriormente, pueden encapsularse 58 \mug (\pm 12 \mug) [75 \mug (\pm 25 \mug)] de taxol a partir de un total de 500 \mug de material de partida. Esto representa 12% (\pm 2,4%) [15% (\pm 5%)] del peso original, o 1,2% (\pm 0,25%) [1,5% (\pm0,5%)] en peso del polímero. Después de 18 horas de volteo en un horno a 37ºC, se había liberado 10,3% (\pm 10%) [6% (\pm5,6%)] del taxol total a partir de las microesferas.
El caso de la bacatina, pueden encapsularse 100 \pm 15 \mug [83 \pm 23 \mug) de bacatina a partir de un total de 500 \mug de material de partida. Esto representa un 20% (\pm 3%) [17% (\pm 5%)] del peso original de bacatina, y 2% (\pm 0,3%) [1,7% (\pm 0,5%)] en peso del polímero. Después de 18 horas de volteo en un horno a 37ºC, se libera el 55% (\pm 13%) [60% (\pm23%)] de la bacatina a partir de las microesferas.
Ejemplo 5 Análisis de una pasta quirúrgica que contiene composiciones anti-angiogénicas
Ratas Fisher con un peso aproximado de 300 gramos se anestesian, y se practica una incisión abdominal transversal superior de 1 cm. Se inyectan 2 décimas de mililitro de solución salina que contiene 1 x 10^{6} células de gliosarcoma 9L vivas (eluidas inmediatamente antes de su empleo a partir de un cultivo de tejidos) en dos de los cinco lóbulos hepáticos por perforación con una aguja de calibre 27 de un cm a través de la cápsula hepática. La herida abdominal se cierra con sutura reabsorbible 6,0 y grapas para piel y se termina la GA.
Después de 2 semanas, los depósitos de tumor medirán aproximadamente 1 cm. En este momento, se resecan ambos tumores hepáticos y el margen limpio del hígado se recubre con un agente hemostático. Se dividen las ratas en dos grupos: a la mitad se administra vehículo polímero exclusivamente, y la otra mitad recibe una composición anti-angiogénica.
Se sacrifican las ratas, 2, 7, 14, 21 y 84 días después de la resección hepática. En particular, las ratas se someten a eutanasia por inyección de Euthanyl en la vena dorsal del rabo. Se extirpan el hígado, el bazo, y ambos pulmones, y se lleva a cabo el análisis histológico con objeto de estudiar los tumores para comprobación de la actividad anti-angiogénica.
Ejemplo 6 Embolización de las arterias de la rata
Se anestesian ratas Fisher con un peso aproximado de 300 gramos Utilizando procedimientos asépticos, se practica una incisión abdominal transversal superior de 1 cm, y se identifica el hígado. Se inyectan dos décimas de mililitro de solución salina que contiene un millón de células de gliosarcoma 9L vivas (eluidas inmediatamente antes del cultivo de tejidos) en cada uno de los 5 lóbulos hepáticos por perforación de 1 cm con una aguja del calibre 27 a través de la cápsula hepática. Se inyecta una décima de mililitro de solución salina normal en la aguja a medida que se retira la misma para asegurar que no se produce diseminación alguna de células en la cavidad peritoneal. Se pone un tapón de Gelfoam en cada uno de los sitios de perforación para asegurar la hemostasia. Se cierra la herida abdominal con sutura reabsorbible 6,0 con grapas para piel, y se termina la anestesia. Se devuelve la rata a la instalación de cuidado de animales de modo que reciba una dieta estándar durante 14 días, en cuyo momento cada depósito tumoral medirá 1 cm de diámetro. Se repite el mismo procedimiento utilizando ratas Westar y una línea de células de Cáncer de Colon (Radiologic Oncology Lab, M.D. Anderson, Houston, Texas). En este caso, se requieren tres semanas después de la inyección para que los depósitos de tumor midan 1 cm de diámetro cada uno.
Después de 2 ó 3 semanas, dependiendo de la especie de rata, se sigue el mismo procedimiento general de anestesia y se realiza una incisión abdominal en la línea media. Se arranca del golpe el duodeno y se identifica y moviliza la arteria gastroduodenal. Se ponen sujeciones por encima y por debajo de un punto de corte en la porción media de la arteria gastroduodenal (GDA), y se introduce un tubo de polietileno de 0,97 mm de manera retrógrada en la arteria utilizando un microscopio de cirugía. La sujeción por debajo del punto de inserción ligará la arteria, mientras que la situada por encima fijará el catéter en su lugar. Se realiza la angiografía por inyección de 0,5 ml de material de contraste radio- opaco al 60% a través del catéter a medida que se toma una imagen por rayos X. Se emboliza luego la arteria hepática mediante un reflujo de partículas que miden 15-200 \mum a través del catéter de la arteria gastroduodenal hasta que se aprecia que el flujo, observado mediante el microscopio de cirugía, cesa durante al menos 30 segundos. La oclusión de la artera hepática se confirma repitiendo un angiograma a través del catéter GDA. Utilizando este procedimiento, la mitad de las ratas reciben partículas de 15-200 \mum de polímero solo, y la otra mitad reciben partículas de 15-200 \mum de la composición polímero-factor anti-angiogénico. La ligadura GDA superior se aprieta para ocluir la GDA a medida que se retira el catéter con objeto de asegurar la hemostasia, y la arteria hepática (aunque embolizada) se deja intacta. El abdomen se cierra con sutura absorbible 6.0 y pinzas quirúrgicas.
Las ratas se sacrifican posteriormente a los 2, 7, 14, 21 y 84 días después de la embolización con objeto de determinar la eficacia del factor anti-angiogénico. Resumidamente, se administra un anestésico general, y utilizando precauciones asépticas, se realiza una incisión en la línea media. La GDA se moviliza de nuevo, y después de aplicar una ligadura cerca de la unión de la GDA y la arteria hepática (es decir, muy por encima del sitio del corte previo), se inserta un tubo de polietileno de 0,97 mm a través del corte del vaso y se realiza la angiografía. La rata se somete luego a eutanasia por inyección de Euthanyl en la vena dorsal del rabo. Una vez confirmada la eutanasia, se extirpa el hígado como un todo junto con el estómago, el bazo y ambos pulmones.
Se realiza el análisis histológico en un portaobjetos preparado teñido con tinte de hematoxilina y eosina ("H y E"). De modo resumido, los pulmones se seccionan a intervalos de 1 cm para evaluar el paso de material embólico a través de las venas hepáticas y hacia el interior del lado derecho de la circulación. El estómago y el bazo se seccionan también con objeto de evaluar la inmovilización inadvertida del reflujo de partículas al acceso celíaco de la circulación colateral.
Ejemplo 7 Trasplante de stents biliares en ratas
Se administra un anestésico general a ratas Fisher de 300 gramos. Se practica luego una incisión transversal de 1 cm en el abdomen superior, y se identifica el hígado. En el lóbulo más superficial, se inyectan 0,2 ml de solución salina que contiene un millón de células de gliosarcoma 9 L (eluidas de un cultivo de tejidos inmediatamente antes de su empleo) a través de una aguja de calibre 27 hasta una profundidad de 1 cm en el interior de la cápsula hepática. Se realiza la hemostasia después de la retirada de la aguja aplicando un tapón de Gelfoam en los sitios de punción. Se inyecta solución salina a medida que se retira la aguja para asegurar que no se produce diseminación alguna de células al interior de la cavidad peritoneal o a lo largo del avance de la aguja. Se termina la anestesia general, y el animal se devuelve al centro de cuidados animales y se somete a una dieta normal.
Dos semanas más tarde, se administra un anestésico general, y utilizando precauciones asépticas, se identifica el lóbulo hepático que contiene el tumor a través de una incisión en la línea media. Se inserta luego una aguja angiográfica de calibre 16 a través de la cápsula hepática en el interior del tumor, se pasa un alambre de guía de 0,97 mm a través de la aguja, y se retira la aguja a lo largo del alambre de guía. Se pasa un dilatador francés número 5 sobre la guía al interior del tumor y se retira. Se hace pasar luego un catéter de direccionamiento francés número 5 a lo largo del alambre que contiene un dispositivo Wallstent de acero inoxidable auto-expandible (de 5 mm de diámetro y 1 cm de longitud). Se despliega el stent en el tumor y se retira el catéter de suministro con el alambre de guía. Un tercio de las ratas tienen un stent de acero inoxidable convencional insertado en el tumor, un tercio un stent de acero inoxidable revestido con polímero, y un tercio un stent revestido con el compuesto polímero-factor anti-angiogénico. Se termina la anestesia general y se devuelve la rata a la instalación de cuidado de animales.
Se realiza un examen abdominal ordinario por rayos X al cabo de 2 días con objeto de evaluar el grado de apertura del stent. Se sacrifican las ratas a los 2, 7, 14, 28 y 56 días después de la inserción del stent por inyección de Euthanyl, y se extirpan sus hígados en bloque una vez que se ha confirmado la eutanasia. Después de fijación en formaldehído durante 48 horas, se secciona el hígado a intervalos de 0,5 mm; con inclusión de un corte transversal del stent utilizando una cuchilla nueva para cada rodaja. Las secciones histológicas teñidas con H y E se analizan luego para evaluar el grado de crecimiento del tumor hacia el interior del lumen del stent.
Ejemplo 8 Fabricación de microesferas
El equipo que se prefiere para la fabricación de las microesferas descritas más adelante incluye: vaso de filtración en caliente con camisa de agua de 200 ml (Kimax o Pyrex), baño de agua circulante Haake, agitador de cabeza y controlador con diámetro de 5 cm (4 paletas, agitador de acero inoxidable de tipo hélice - marca Fisher), vaso de filtración en caliente de vidrio de 500 ml, placa caliente/agitador (marca Corning), cuatro tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml (Nalgene), viales de centelleo de vidrio con tapas de inserción de plástico, centrífuga de sobremesa (GPR Beckman), centrífuga de alta velocidad - modelo de suelo (JS 21 Beckman), balanza analítica Mettler (AJ 100, 0,1 mg), balanza digital de carga superior Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipeteador automático (Gilson). Los reactivos incluyen policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington Pennsylvania, EE.UU.), etileno-acetato de vinilo "lavado" ("EVA" lavado para separar el antioxidante BHT), poli(ácido (DL)-láctico) ("PLA" - peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), poli(alcohol vinílico) ("PVA" - peso molecular 124.000 a 186.000, hidrolizado al 99%; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, EE.UU.), diclorometano ("DCM" o "cloruro de metileno", calidad para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés high performance liquid chromatography), Fisher Scientific), y agua destilada.
A. Preparación de soluciones de polímero al 5% (peso/volumen)
Dependiendo de la solución de polímero que se prepare, se pesan directamente 1,00 g de PCL o PLA, o 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavado en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Se añaden luego 20 mililitros de DCM y se tapa fuertemente el vial. Se guarda el vial a la temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora (puede utilizarse agitación ocasional mediante sacudidas), o hasta que se ha disuelto totalmente el polímero (la solución debe ser transparente). La solución puede guardarse a la temperatura ambiente durante al menos dos semanas.
B. Preparación de solución madre de PVA al 5% (peso/volumen)
Se pesan directamente 25 gramos de PVA en un vaso de vidrio para filtración en caliente de 600 ml. Se añaden 500 mililitros de agua destilada, junto con una barra de agitación de 7,5 cm revestida con Teflon. Se tapa el vaso de filtración en caliente con vidrio para reducir las pérdidas por evaporación, y se introduce en un vaso de filtración en caliente de vidrio de 2000 ml que contiene 300 ml de agua (que actúa como baño de agua). Se agita el PVA a 300 rpm a 85ºC (placa caliente/agitador Corning) durante 2 horas o hasta que se disuelve por completo. La disolución del PVA puede determinarse por inspección visual; la solución debe ser transparente. La solución se transfiere luego a un recipiente de almacenamiento de vidrio con tapón roscado, y se guarda a 4ºC durante un máximo de dos meses. Sin embargo, la solución debe calentarse a la temperatura ambiente antes de su utilización o dilución.
C. Procedimiento para producción de microesferas
Sobre la base del tamaño de las microesferas que se fabriquen (véase Tabla 1), se ponen 100 ml de la solución de PVA (concentraciones dadas en la Tabla III) en el vaso de filtración en caliente de 200 ml con camisa de agua. Se conecta el baño de agua de circulación Haake con este vaso de filtración en caliente y se deja que el contenido alcance el equilibrio a 27ºC (\pm 10ºC) durante 10 minutos. Sobre la base del tamaño de las microesferas que se fabriquen (véase Tabla III), se ajusta la velocidad de marcha del agitador de cabeza, y la paleta del agitador de cabeza se introduce hasta la mitad de la altura en la solución de PVA. Se pone luego en marcha el agitador, y se añaden gota a gota 10 ml de solución de polímero (la solución de polímero utilizada está basada en el tipo de microesferas que se produzcan) en el PVA mantenido en agitación durante un período de 2 minutos utilizando un pipeteador automático de 5 ml. Al cabo de 3 minutos se ajusta la velocidad de agitación (véase Tabla III), y se agita la solución durante 2,5 horas más. Se retira luego la paleta de agitación de la preparación de microesferas, y se enjuaga con 10 ml de agua destilada a fin de tal modo que la solución de enjuagado escurra en la preparación de microesferas. La preparación de microesferas se vierte luego en un vaso de filtración en caliente de 500 ml, y el baño de agua encamisado se lava con 70 ml de agua destilada, que se deja escurrir también en la preparación de microesferas. La preparación de microesferas de 180 ml se agita luego con una varilla de vidrio, y se vierten cantidades iguales en 4 tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Se tapan luego los tubos, y se centrifugan durante 10 minutos (fuerza dada en la Tabla 1). Se utiliza luego un pipeteador automático de 5 ml o aspiración a vacío para extraer 45 ml de la solución de TVA de cada sedimento de microesferas.
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TABLA III Concentraciones de PVA, velocidades de agitación, y requerimientos de fuerza centrífuga para cada intervalo de diámetro de las microesferas
2
Se añaden luego 5 mililitros de agua destilada a cada tubo de centrífuga, que se agita luego tumultuosamente para suspender de nuevo las microesferas. Las cuatro suspensiones de microesferas se reúnen luego en un solo tubo de centrífuga junto con 20 ml de agua destilada, y se centrifugan durante otros 10 minutos (fuerza dada en la Tabla 1). Este procedimiento se repite dos veces más durante para un total de tres lavados. Las microesferas se centrifugan luego una última vez, y se resuspenden en 10 ml de agua destilada. Después del lavado final, la preparación de microesferas se transfiere a un vial de centelleo de vidrio, pesado previamente. Se tapa el vial, y se deja durante la noche a la temperatura ambiente (25ºC) con objeto de permitir que las microesferas se separen por sedimentación bajo la acción de la gravedad. Las microesferas que están comprendidas en el intervalo de tamaños de 0,1 \mum a 3 \mum no se separan por sedimentación bajo la acción de la gravedad, por lo que permanecen en la suspensión de 10 ml.
D. Secado de las microesferas de 10 \mum a 30 \mum o de 30 \mum a 100 \mum de diámetro
Después que las microesferas se han sedimentado a la temperatura ambiente durante la noche, se utiliza un pipeteador automático de 5 ml o aspiración a vacío para extraer el sobrenadante de las microesferas sedimentadas. Se dejan secar las microesferas en el vial destapado en un extractor durante un período de una semana o hasta que están completamente secas (hasta peso constante del vial). Puede realizarse un secado más rápido dejando el vial destapado expuesto a una corriente lenta de nitrógeno gaseoso (caudal, aprox. 10 ml/min) en la vitrina de humos. Cuando está completamente seco (peso constante del vial), se pesa el vial y se tapa. El vial tapado y etiquetado se guarda a la temperatura ambiente en un extractor. Las microesferas se guardan normalmente no más de 3 meses.
E. Secado de las microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum de diámetro
Las microesferas de este intervalo de tamaño no se sedimentarán, por lo que se mantienen en suspensión a 4ºC durante un máximo de 4 semanas. Para determinar la concentración de microesferas en la suspensión de 10 ml, se pipetea una muestra de 200 \mul de la suspensión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml previamente pesado. El tubo se centrifuga luego a 10.000 g (microcentrífuga de sobremesa Eppendorf), se separa el sobrenadante, y se deja secar el tubo a 50ºC durante la noche. Se pesa luego de nuevo el tubo con objeto de determinar el peso de microesferas secas contenidas en el tubo.
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F. Fabricación de microesferas cargadas con taxol
Con objeto de preparar microesferas que contengan taxol, se pone directamente una cantidad apropiada de taxol pesado (basada en el porcentaje de taxol a encapsular) en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Se añaden luego 10 mililitros de una solución de polímero apropiada al vial que contiene el taxol, que se agita luego de modo turbulento hasta que se ha disuelto el taxol.
Las microesferas que contienen taxol pueden producirse luego esencialmente como se ha descrito con anterioridad en los pasos (C) a (E).
Ejemplo 9 Fabricación del revestimiento del stent
Los reactivos y el equipo que se utilizan en los experimentos siguientes incluyen stents de calidad médica obtenidos comercialmente de una diversidad de fabricantes (p. ej., el stent "Strecker"), y aparato de contención, vial de centelleo de vidrio de 20 ml con tapón (tipo de inserción de plástico), atomizador TLC, depósito de nitrógeno gaseoso, tubos de ensayo de vidrio (diversos tamaños desde 1 ml y superiores), vasos para filtración en caliente de vidrio (diversos tamaños), pipeta Pasteur, pinzas, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences), Taxol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., pureza 95%), etileno-acetato de vinilo ("EVA" - lavado - véase anteriormente), poli(ácido (DL)láctico) ("PLA" - peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), diclorometano ("DCM" - calidad HPLC, Fisher Scientific).
A. Procedimiento para Stents Pulverizados
Lo que sigue describe un método típico que utiliza un stent de hilo metálico interestratificado rizado, de 3 mm de diámetro y aproximadamente 3 cm de longitud. Para stents de diámetro mayor, se utilizan volúmenes mayores de solución polímero/fármaco.
Se pesa una cantidad suficiente de polímero directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se añade cantidad suficiente de DCM hasta alcanzar una solución al 2% peso/volumen. Se tapa el vial y se mezcla la solución para disolver el polímero (agitación a mano). Se dispone el stent en orientación vertical. Esto puede realizarse utilizando una pieza de nailon y fijando el stent a un soporte de retorta. Se posiciona este aparato de retención del stent 15 a 30 cm por encima del suelo de la vitrina de humos en un soporte adecuado (p. ej., un vaso de filtración en caliente de vidrio de 2000 ml invertido) a fin de permitir una pulverización horizontal. Utilizando una pipeta automática, se transfiere un volumen adecuado (5 ml como mínimo) de la solución de polímero al 2% a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml separado. Se añade una cantidad apropiada de taxol a la solución y se disuelve el mismo mediante sacudidas a mano del vial tapado.
Para preparar la pulverización, se retira el tapón de este vial y se sumerge el cuerpo (únicamente) de un atomizador TLC en la solución de polímero. Obsérvese que el cuerpo del atomizador no precisa ser utilizado en este procedimiento; el vial de vidrio de 20 ml actúa como depósito. Se conecta la botella de nitrógeno a la entrada de gas del atomizador. Se aumenta gradualmente la presión hasta que comienza la atomización y la pulverización. Se anota la presión y se utiliza esta presión a todo lo largo del procedimiento. Para pulverizar el stent se utilizan pulverizaciones oscilantes de 5 segundos con un tiempo de secado de 5 segundos entre pulverizaciones. Después de 5 pulverizaciones, se hace girar 90º el stent y se pulveriza dicha porción del stent. Se repite hasta que se han pulverizado todos los lados del stent. Durante el tiempo de secado, se aprieta con los dedos la tubería de gas para evitar un consumo inútil de pulverización. Se continúa la pulverización hasta que se ha depositado sobre los stents una cantidad adecuada de polímero. La cantidad puede basarse en la aplicación específica del stent in vivo. Para determinar la cantidad, se pesa el stent después que se ha completado la pulverización y se ha secado el stent. Se resta el peso original del stent del peso acabado y esto da la cantidad de polímero (más taxol) aplicada al stent. Se guarda el stent revestido en un envase herméticamente cerrado.
B. Procedimiento para Stents Sumergidos
A continuación se describe un método típico que utiliza un stent de hilo metálico intercalado y rizado de 3 mm de diámetro, con una longitud de aproximadamente 3 cm. Para stents de diámetro mayor, se utilizan volúmenes mayores de solución polímero/fármaco en tubos de ensayo de mayor tamaño.
Se pesan 2 g de EVA en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se añaden 20 ml de DCM. Se tapa el vial y se deja el mismo durante 2 horas para que se disuelva el contenido (se agita a mano frecuentemente el vial para favorecer el procedimiento de disolución). Se pesa una cantidad conocida de taxol directamente en un tubo de ensayo de vidrio de 1 ml y se añaden 0,5 ml de la solución de polímero. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, se disuelve el taxol bombeando suavemente la solución de polímero. Una vez que se ha disuelto el taxol, se mantiene el tubo de ensayo en una posición aproximadamente horizontal (la solución pegajosa de polímero no fluirá). Empleando pinzas, se inserta el stent en el interior del tubo a lo largo de todo su recorrido hasta el fondo. Se deja que la solución de polímero fluya casi hasta la boca del tubo de ensayo inclinando la boca por debajo de la horizontal y restableciendo luego el tubo de ensayo hasta un ángulo ligeramente superior a la horizontal. Mientras que se hace girar lentamente el stent en el interior del tubo, se retira lentamente el stent (aproximadamente 30 segundos).
Se mantiene el stent en posición vertical para secarlo. Algunas de las perforaciones herméticamente cerradas pueden estallar de tal modo que exista un agujero en la hoja continua de polímero. Esto puede remediarse repitiendo el procedimiento de inmersión previo, si bien la repetición del procedimiento puede conducir también a estallidos adicionales y a una acumulación general irregular de polímero. Generalmente, es mejor sumergir el stent solamente una vez y cortar una sección de stent que no tenga perforación estallada alguna. Se guarda el stent sumergido en un envase herméticamente cerrado.
Ejemplo 10 Fabricación de "pastas" quirúrgicas
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona una diversidad de composiciones de fármaco que contienen polímero que pueden utilizarse en una diversidad de situaciones clínicas. Por ejemplo, pueden producirse composiciones: (1) como una "termopasta" que se aplica a un sitio deseado en forma fluida, y se endurece para dar un sólido de la forma deseada a una temperatura especificada (p. ej., la temperatura del cuerpo); (2) como una pulverización (es decir, "nanopulverización") que puede suministrarse a un sitio deseado sea directamente o a través de un aparato especializado (p. ej., endoscopia), y que se endurece subsiguientemente para dar un sólido que se adhiere al tejido al que se aplica; (3) como una película adherente, flexible y elástica de inhibidor de angiogénesis-polímero, aplicada a un sitio deseado sea directamente o a través de un aparato especializado, y que se adhiere preferiblemente al sitio al que se aplica; y (4) como un fluido compuesto de una suspensión de microesferas en un medio portador apropiado, que se aplica a un sitio deseado sea directamente o a través de un aparato especializado, y que deja una capa de microesferas en el sitio de aplicación. Ejemplos representativos de cada una de las realizaciones anteriores se exponen con mayor detalle a continuación.
A. Procedimiento para producción de termopasta
Los reactivos y el equipo que se utilizan en los experimentos siguientes incluyen una jeringuilla de vidrio estéril (1 ml), placa caliente/agitador Corning, vial de centelleo de vidrio de 20 ml, moldes (p. ej., bandeja de DSC de 50 \mul o porción interior del tapón de tubos de centrífuga de 50 ml), escalpelo y pinzas, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, EE.UU.), y taxol (calidad Sigma, pureza 95% como mínimo).
Se pesan 5,00 g de policaprolactona directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Se introduce el vial en un vaso de filtración en caliente de 600 ml que contiene 50 ml de agua. Se caliente suavemente el vaso de filtración en caliente a 65ºC y se mantiene el mismo a dicha temperatura durante 20 minutos. Esto hace posible que el polímero funda. Se mezcla concienzudamente un peso conocido de taxol, u otro inhibidor de angiogénesis en el polímero fundido a 65ºC. Se vierte el polímero fundido en un molde previamente calentado (horno a 60ºC). Se utiliza una espátula para favorecer el procedimiento de vertido. Se deja que el molde se enfríe a fin de que solidifique el polímero. Se corta o fragmenta el polímero en pequeños trozos (aproximadamente 2 mm por 2 mm de tamaño). Estos trozos deben poder introducirse en una jeringuilla de vidrio de 1 ml. Se retira el émbolo de la jeringuilla de vidrio de 1 ml (no se retira el tapón de la punta) y se pone la misma en una balanza. Se ajusta la balanza a cero. Se introducen directamente por pesada 0,5 g de los trozos en el extremo abierto de la jeringuilla. Se coloca la jeringuilla en posición vertical (con la punta tapada hacia abajo) en un vaso de filtración en caliente de vidrio de 500 ml que contiene agua destilada a 65ºC (placa caliente Corning) de tal modo que no entre cantidad alguna de agua en el cuerpo. El polímero funde por completo en el trascurso de 10 minutos en este aparato. Cuando los trozos de polímero se han fundido, se retira el cuerpo del baño de agua, se mantiene el mismo horizontalmente y se retira el tapón. Se inserta el émbolo en el cuerpo y se comprime el polímero fundido para obtener una masa densa en el extremo de la punta del cuerpo. Se tapa la jeringuilla y se deja que la misma se enfríe a la temperatura ambiente.
Para la aplicación, la jeringuilla puede calentarse de nuevo a 60ºC y administrarse como un líquido que solidifica cuando se enfría a la temperatura del cuerpo.
B. Procedimiento para producir nanopulverización
La nanopulverización es una suspensión de pequeñas microesferas en solución salina. Si las microesferas son muy pequeñas (es decir, inferiores a 1 \mum de diámetro) forman un coloide de tal modo que la suspensión no se sedimentará por la acción de la gravedad. Como se describe con mayor detalle más adelante, puede crearse una suspensión de micropartículas de 0,1 \mum a 1 \mum adecuada para deposición sobre los tejidos mediante un aerosol bombeado con los dedos. El equipo y los materiales que pueden utilizarse para producir la nanopulverización incluyen un vaso de filtración en caliente de 200 ml con camisa de agua (Kimax o Pyrex), baño de agua circulante Haake, agitador de cabeza y controlador con 5 cm de diámetro (4 paletas, agitador de acero inoxidable de tipo hélice; marca Fisher), vaso de filtración en caliente de vidrio de 500 ml, placa caliente/agitador (marca Corning), 4 tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml (Nalgene), viales de centelleo de vidrio con tapones de inserción de plástico, centrífuga de sobremesa (Beckman), centrífuga de alta velocidad - modelo de suelo (JS 21 Beckman), balanza analítica Mettler (AJ 100, 0,1 mg), balanza de carga superior digital Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipeteador automático (Gilson), puntas de pipeta estériles, aerosol con acción de bomba (Pfeiffer Pharmaceuticals) de 20 ml, vitrina de flujo laminar, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania, EE.UU.), etileno-acetato de vinilo "lavado" (véase anteriormente) ("EVA"), poli(ácido (DL)láctico) ("PLA", peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), poli(alcohol vinílico) ("PVA" - peso molecular 124.000 a 186.000); hidrolizado al 99%; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, EE.UU.), diclorometano ("DCM" o "cloruro de metileno"; calidad HPLC, Fisher Scientific), agua destilada, solución salina estéril (Becton y Dickenson o equivalente).
1. Preparación de soluciones de polímero al 5% (peso/volumen)
Dependiendo de la solución de polímero que se prepare, se pesan 1,00 g de PCL o PLA o 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavado directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Utilizando una probeta graduada, se añaden 20 ml de DCM y se tapa fuertemente el vial. Se deja el vial a la temperatura ambiente (25ºC) durante una hora o hasta que se ha disuelto todo el polímero (puede utilizarse agitación ocasional a mano). La disolución del polímero puede determinarse por inspección visual; la solución debe ser transparente. Se etiqueta el vial con el nombre de la solución y la fecha en que se produjo. Se guardan las soluciones a la temperatura ambiente y se utilizan dentro de dos semanas.
2. Preparación de solución madre de PVA al 3,5% (peso/volumen)
La solución puede prepararse siguiendo el procedimiento dado a continuación, o por dilución de la solución madre de PVA al 5% (peso/volumen) preparada para la producción de microesferas (véase el Ejemplo 8). Resumidamente, se pesan directamente 17,5 g de PVA en un vaso de filtración en caliente de vidrio de 600 ml, y se añaden 500 ml de agua destilada. Se pone una barra de agitación de 7,5 cm revestida con teflón en el vaso de filtración en caliente. Se tapa el vaso con un vidrio de reloj para reducir las pérdidas por evaporación. Se pone el vaso en el interior de otro vaso de filtración en caliente de vidrio de 2000 ml que contiene 300 ml de agua. Este actuará como baño de agua. Se agita el PVA a 300 rpm a 85ºC (placa caliente/agitador Corning) durante 2 horas o hasta que se ha disuelto por completo. La disolución del PVA puede determinarse por inspección visual; la solución debe ser transparente. Se utiliza una pipeta para transferir la solución a un envase de almacenamiento con tapón roscado, de vidrio, y se guarda a 4ºC durante un máximo de dos meses. Esta solución debe calentarse a la temperatura ambiente antes de su empleo o dilución.
3. Procedimiento para producción de nanopulverización
Se introduce el dispositivo de agitación en una vitrina de humos. Se ponen 100 ml de la solución de PVA al 3,5% en el vaso de filtración en caliente de 200 ml con camisa de agua. . Se conecta el baño de agua Haake a este vaso de filtración en caliente y se deja que su contenido alcance el equilibrio a 27ºC (\pm 1ºC) durante 10 minutos. Se ajusta la velocidad inicial del agitador de cabeza a 3000 rpm (\pm 200 rpm). Se introduce la paleta del agitador de cabeza hasta la mitad de su altura en la solución de PVA y se pone en marcha el agitador. Se vierten gota a gota 10 ml de solución de polímero (la solución de polímero utilizada está basada en el tipo de nanopulverización que se produzca) en el PVA mantenido en agitación durante un período de 2 minutos utilizando un pipeteador automático de 5 ml. Después de 3 minutos, se ajusta la velocidad de agitación a 2500 rpm (\pm 200 rpm) y se deja el conjunto durante 2,5 horas. Al cabo de 2,5 horas, se retira la paleta de agitación de la preparación de nanopulverización y se enjuaga con 10 ml de agua destilada. Se deja que la solución de enjuagado caiga en la preparación de nanopulverización.
Se vierte la preparación de microesferas en un vaso de filtración en caliente de 500 ml. Se lava el baño de agua encamisado con 70 ml de agua destilada. Se deja que la solución de enjuagado de 70 ml caiga en la preparación de microesferas. Se agita la preparación de microesferas de 180 ml con una varilla de vidrio y se vierten cantidades iguales de la misma en cuatro tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Se tapan los tubos. Se centrifugan los tubos tapados a 10.000 g (\pm 1000 g) durante 10 minutos. Utilizando un pipeteador automático de 5 ml o aspiración a vacío, se extraen 45 ml de la solución de PVA de cada sedimento de microesferas y se desechan. Se añaden 5 ml de agua destilada a cada tubo de centrífuga y se utiliza agitación turbulenta para suspender de nuevo las microesferas en cada tubo. Utilizando 20 ml de agua destilada, se reúnen las cuatro suspensiones de microesferas en un solo tubo de centrífuga. Para lavar las microesferas, se centrifuga la preparación de nanopulverización durante 10 minutos a 10000 g (\pm 1000 g). Se decanta el sobrenadante del sedimento de microesferas. Se añaden 40 ml de agua destilada y se utiliza agitación turbulenta para suspender de nuevo las microesferas. Se repite este procedimiento dos veces más hasta un total de tres lavados. Se realiza un cuarto lavado, pero se utilizan solamente 10 ml (no 40 ml) de agua destilada cuando se resuspenden las microesferas. Después del cuarto lavado, se transfiere la preparación de microesferas a un vial de centelleo de vidrio previamente pesado.
Se tapa el vial y se deja sedimentar el mismo durante una hora a la temperatura ambiente (25ºC) a fin de permitir que las microesferas de 2 \mum y 3 \mum de diámetro se separen por sedimentación bajo la acción de la gravedad. Al cabo de 1 hora, se extraen los 9 ml de suspensión superiores utilizando un pipeteador automático de 5 ml. Se ponen los 9 ml en un tubo de centrífuga esterilizado de 50 ml con tapón. Se centrifuga la suspensión a 10000 g (\pm 1000 g) durante 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 20 ml de solución salina estéril. Se centrifuga la suspensión a 10000 g (\pm 1000 g) durante 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y se suspende de nuevo el sedimento en solución salina estéril. La cantidad de solución salina utilizada depende de la concentración final requerida de la suspensión (usualmente 10% peso/volumen). Se enjuaga concienzudamente el aparato de aerosol en solución salina estéril y se añade la suspensión de nanopulverización al aerosol.
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C. Fabricación de nanopulverización cargada con taxol
Para fabricar la nanopulverización que contiene taxol, se utiliza taxol (calidad Sigma, pureza 95%). A fin de preparar la solución madre polímero-fármaco, se pesa la cantidad apropiada de taxol directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. La cantidad apropiada se determina sobre la base del porcentaje de taxol a incluir en la nanopulverización. Por ejemplo, si se requiriese una nanopulverización que contuviera 5% de taxol, la cantidad de taxol pesada debería ser 25 mg, dado que la cantidad de polímero añadida es 10 ml de una solución de polímero al 5% en DCM (véase el paso siguiente).
Se añaden 10 ml de la solución de polímero al 5% apropiada al vial que contiene el taxol. Se tapa el vial y se agita vorticialmente o se agita de modo turbulento a mano para disolver el taxol (comprobación visual a fin de asegurar que se disuelve el taxol). Se etiqueta el vial con la fecha en que se produjo. Este debe utilizarse el día de su producción.
Se siguen los procedimientos que se han descrito anteriormente, excepto que la solución madre polímero/fármaco (p. ej., taxol) se emplea en sustitución de la solución de polímero.
D. Procedimiento para Producción de Película
El término película se refiere a un polímero conformado en una de muchas formas geométricas. La película puede ser una hoja delgada y elástica de polímero o un disco de polímero de 2 mm de espesor. Esta película está diseñada para ser aplicada sobre un tejido expuesto a fin de que cualquier fármaco encapsulado se libere del polímero durante un período de tiempo largo en el sitio del tejido. Las películas pueden fabricarse por varios procedimientos, que incluyen por ejemplo colada y pulverización.
En la técnica de colada, el polímero se funde y se vierte en un molde o se disuelve en diclorometano y se vierte en un molde. El polímero se solidifica luego a medida que se enfría o se solidifica a medida que se evapora el disolvente, respectivamente. En la técnica de pulverización, el polímero se disuelve en disolvente y se pulveriza sobre vidrio, y a medida que se evapora el disolvente el polímero solidifica sobre el vidrio. La pulverización repetida hace posible una acumulación de polímero en una película que puede desprenderse del vidrio.
Los reactivos y el equipo que se utilizaron en estos experimentos incluyen un vaso pequeño de filtración en caliente, placa caliente-agitador Corning, moldes de colada (p. ej., tapones de tubo de centrífuga de 50 ml) y aparato de retención del molde, vial de centelleo de vidrio de 20 ml con tapón (tipo de inserción de plástico), atomizador TLC, botella de nitrógeno gaseoso, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences), taxol (Sigma, pureza 95%), etanol, etileno-acetato de vinilo ("EVA") "lavado" (véase anteriormente) poli(ácido (DL)láctico) ("PLA" - peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), diclorometano (calidad HPLC, Fisher Scientific).
1. Procedimiento para producción de películas - colada en fusión
Se pesa una cantidad conocida de PCL directamente en un pequeño vaso de vidrio para filtración en caliente. Se introduce el vaso en un vaso de vidrio para filtración en caliente de mayor tamaño que contiene agua (que actúa como baño de agua) y se pone el mismo sobre la placa caliente a 70ºC durante 15 minutos o hasta que el polímero se ha fundido por completo. Se añade un peso conocido de fármaco al polímero fundido y se agita la mezcla concienzudamente. Para ayudar a la dispersión del fármaco en la PCL fundida, el fármaco puede suspenderse/disolverse en un pequeño volumen (menor que 10% del volumen de PCL fundida) de etanol 100%. Esta suspensión etanólica se mezcla luego en el polímero fundido. Se vierte el polímero fundido en un molde y se deja enfriar. Después del enfriamiento, Después del enfriamiento, se guarda la película en un recipiente.
2. Procedimiento para producción de películas - colada en disolvente
Se pesa una cantidad conocida de PCL directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se añade suficiente DCM para obtener una disolución al 10% peso/volumen. Se tapa el vial y se mezcla la solución. Se añade taxol suficiente a la solución para alcanzar la concentración final de taxol deseada. Se utiliza agitación a mano o agitación vorticial para disolver el taxol en la solución. Se deja decantar la solución durante una hora (para reducir la presencia de burbujas de aire) y se vierte luego lentamente en un molde. El molde utilizado depende de la forma requerida. Se deja el molde en la vitrina de humos durante la noche. Esto permitirá que se evapore el DCM. Se deja la película en el molde para guardarla o se desprende la misma y se guarda en un envase herméticamente cerrado.
3. Procedimiento para producción de películas - pulverización
Se pesa suficiente polímero directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se añade suficiente DCM para obtener una solución al 2% peso/volumen. Se tapa el vial y se mezcla la solución para disolver el polímero (agitación manual). Se disponen los moldes en orientación vertical en un aparato de retención de moldes adecuado en la vitrina de humos. Se coloca este aparato de retención de moldes 15 a 30 cm por encima del suelo de la vitrina de humos sobre un soporte adecuado (p. ej., un vaso de vidrio para filtración en caliente de 2000 ml invertido) a fin de permitir una pulverización horizontal. Utilizando una pipeta automática, se transfiere un volumen adecuado (5 ml como mínimo) de la solución de polímero al 2% a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml separado. Se añade suficiente taxol a la solución y se disuelve el mismo por agitación manual del vial tapado. Para preparar el dispositivo para la pulverización, se retira el tapón de este vial y se sumerge el cuerpo (únicamente) de un atomizador TLC en la solución de polímero. Nota: El depósito del atomizador no se utiliza en este procedimiento - el vial de vidrio de 20 ml actúa como depósito.
Se conecta el depósito de nitrógeno a la entrada de gas del atomizador. Se aumenta gradualmente la presión hasta que se inician la atomización y la pulverización. Se anota la presión y se utiliza esta presión a todo lo largo del procedimiento. Para pulverizar los moldes, se utilizan pulverizaciones oscilantes de 5 segundos con un tiempo de secado de 5 segundos entre pulverizaciones. Durante el tiempo de secado, se pinza con los dedos la tubería de gas a fin de evitar un consumo inútil de la pulverización. Se continúa la pulverización hasta que se ha depositado un espesor adecuado de polímero en el molde. El espesor está basado en las necesidades. Se dejan las películas pulverizadas unidas a los moldes y se guardan en envases herméticamente cerrados.
E. Procedimiento para Producción de Nanopasta
La nanopasta es una suspensión de microesferas suspendidas en un gel hidrófilo. En un aspecto de la invención, el gel o pasta puede extenderse sobre el tejido como método de localización de las esferas cargadas con el fármaco próximas al tejido diana. Al estar basada en agua, la pasta llegará a diluirse pronto con los fluidos corporales causando una disminución de la pegajosidad de la pasta y cierta tendencia de las microesferas a depositarse sobre el tejido próximo. De este modo se localiza una acumulación de fármaco encapsulado en microesferas próxima al tejido diana.
Los reactivos y el equipo que se utilizaron en estos experimentos incluyen vasos de vidrio para filtración en caliente, Carbopol 925 (calidad farmacéutica, Goodyear Chemical Co.), agua destilada, hidróxido de sodio (1 M) en solución acuosa, solución de hidróxido de sodio (5 M) en agua, microesferas en el intervalo de tamaños de 0,1 \mum a 3 \mum suspendidas en agua al 20% peso/volumen (véase anteriormente).
1. Preparación de gel de Carbopol al 5% peso/volumen
Se añade una cantidad suficiente de Carbopol a hidróxido de sodio 1M para producir una solución al 5% peso/volumen. Para disolver el Carbopol en el hidróxido de sodio 1M, se deja sedimentar la mezcla durante aproximadamente una hora. Durante este período de tiempo, se agita la mezcla utilizando una varilla de vidrio. Al cabo de una hora, se toma el pH de la mezcla. Un pH bajo indica que el Carbopol no se ha disuelto por completo. El pH que se precisa alcanzar es 7,4. Se utiliza hidróxido de sodio 5M para ajustar el pH. Esto se realiza añadiendo lentamente gotas de hidróxido de sodio 5M a la mezcla, agitando la mezcla y tomando el pH de la misma. Por lo general se necesita aproximadamente una hora para ajustar el pH a 7,4. Una vez que se ha alcanzado un pH de 7,4, se tapa el gel y se deja decantar el mismo durante 2 a 3 horas. Después de este período de tiempo, se comprueba el pH para asegurar que es todavía 7,4. Si ha cambiado, se ajusta nuevamente a pH 7,4 utilizando hidróxido de sodio 5M. Se deja decantar el gel durante una cuantas horas para asegurar que el pH se mantiene establemente en 7,4. Se repite el procedimiento hasta que se alcanza y permanece estable el pH deseado. Se etiqueta el envase con el nombre del gel y la fecha. El gel debe utilizarse para fabricar nanopasta dentro de la semana inmediatamente siguiente.
2. Procedimiento para producción de nanopasta
Se añade cantidad suficiente de microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum a agua para producir una suspensión al 20% de las microesferas. Se ponen 8 ml del gel de Carbopol al 5% peso/volumen en un vaso de vidrio para filtración en caliente. Se añaden 2 ml de la suspensión de microesferas al 20% al vaso para filtración en caliente. Utilizando una varilla de vidrio o una espátula mezcladora, se agita la mezcla para dispersar concienzudamente las microesferas en todo el gel. Esto requiere usualmente 30 minutos. Una vez que se han dispersado las microesferas en el gel, se pone la mezcla en un frasco de almacenamiento. Se guarda el frasco a 4ºC. El mismo tiene que utilizarse dentro de un período de un mes.
Ejemplo 11 Suministro controlado de taxol a partir de microesferas compuestas de una mezcla de copolímero etileno-acetato de vinilo y poli(ácido D,L-láctico). Ensayo in vivo de las microesferas en la prueba CAM
Este ejemplo describe la preparación de microesferas cargadas con taxol compuestas de una mezcla de polímero de poli(ácido D,L-láctico) (PLA) biodegradable y copolímero etileno-acetato de vinilo (EVA) no degradable. Adicionalmente, se demuestran la tasa de liberación in vitro y la actividad anti-angiogénica del taxol liberado de las microesferas dispuestas sobre una CAM.
Los reactivos que se utilizaron en estos experimentos incluyen taxol, que se adquiere de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); PLA (peso molecular 15.000-25.000) y EVA (60% de acetato d vinilo) (adquirido de Polysciences (Warrington, PA); poli(alcohol vinílico) (PVA) (peso molecular 124.000-186.000, hidrolizado al 99%, adquirido de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)) y diclorometano (DCM) (calidad HPLC, obtenido de Fisher Scientific Co.) Se utiliza en todas las operaciones agua destilada.
A. Preparación de microesferas
Se preparan las microesferas esencialmente como se describe en el Ejemplo 8 utilizando el método de evaporación del disolvente. Resumidamente, se preparan soluciones de polímero al 5% peso/volumen en 20 ml de DCM utilizando mezclas de EVA:PLA entre 35:65 y 90:10. A 5 ml de PVA al 2,5% peso/volumen en agua en un vial de vidrio de 20 ml se añade gota a gota 1 ml de la solución de polímero con agitación. Se disponen seis viales similares en un aparato de ensayo de disoluciones (Vanderkamp) con agitador de cabeza de seis posiciones, y se agitan a 200 rpm. Se aumenta la temperatura de los viales desde la temperatura ambiente a 40ºC durante 15 min y se mantiene a 40ºC durante 2 horas. Los viales se centrifugan a 500 x g y las microesferas se lavan tres veces en agua. Para algunas mezclas de polímero EVA:PLA, las muestras de microesferas se agregan durante la etapa de lavado debido a la separación del agente dispersante o emulsionante, PVA. Este efecto de agregación pudo analizarse semi-cuantitativamente, dado que las microesferas agregadas se fusionaban y la masa de polímero fusionado flotaba en la superficie del agua de lavado. Esta capa de polímero superficial se desecha durante los tratamientos de lavado y las microesferas sedimentadas restantes se pesan. Se determina el % de agregación a partir de
% agregación = \frac{1 - (peso \ de \ microesferas \ sedimentadas)}{peso \ inicial \ de \ pol\text{í}mero} x 100
Se preparan microesferas cargadas con taxol (taxol al 0,6% peso/peso) por disolución del taxol en la solución del polímero al 5% peso/volumen en DCM. La mezcla de polímeros utilizada es EVA:PLA 50:50. Se producen una fracción de tamaño "grande" y una fracción de tamaño "pequeño" de microesferas por adición de la solución taxol/polímero gota a gota a PVA al 2,5% peso/volumen y PVA al 5% peso/volumen, respectivamente. Las dispersiones se agitan a 40ºC y 200 rpm durante 2 horas, se centrifugan y se lavan 3 veces en agua como se ha descrito anteriormente. Las microesferas se secan al aire y las muestras se clasifican por tamaños utilizando un microscopio óptico con un micrómetro de platina. Se cuentan más de 300 microesferas por muestra. Se preparan microesferas de control (sin taxol) y se clasifican por tamaños como se ha descrito anteriormente.
B. Eficiencia de encapsulación
Se disuelven pesos conocidos de microesferas cargadas con taxol en 1 ml de DCM, se añaden 20 ml de acetonitrilo al 40% en agua a 50ºC y se agita vorticialmente hasta que se ha evaporado el DCM. La concentración de taxol en el acetonitrilo al 40% se determina por HPLC utilizando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) a un caudal de 1 ml/min (bomba isocrática Beckman), una columna C8 de fase inversa (Beckman) y detección UV a 232 nm. Para determinar la eficiencia de recuperación de este procedimiento de extracción, se disuelven pesos conocidos de taxol desde 100 a 1000 \mug en 1 ml de DCM y se someten al mismo procedimiento de extracción por triplicado como se ha descrito anteriormente. Las recuperaciones son siempre mayores que 85% y los valores de eficiencia de encapsulación se corrigen adecuadamente.
C. Estudios de liberación de fármaco
En tubos de vidrio de 15 ml con tapón de rosca se ponen 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM, pH 7,4, y microesferas de 35 mg cargadas con taxol. Los tubos se voltean a 37ºC y, a intervalos de tiempo dados, se centrifugan a 1500 x g durante 5 min y se recupera el sobrenadante para análisis. Los sedimentos de microesferas se resuspenden en PBS reciente (10 ml) a 37ºC y se incuban de nuevo. Se determinan las concentraciones de taxol por extracción en 1 ml de DCM seguido por evaporación a sequedad en corriente de nitrógeno, reconstitución en 1 ml de acetonitrilo al 40% en agua y análisis utilizando HPLC como se ha descrito anteriormente.
D. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Se ponen las microesferas sobre contenedores de muestras, se revisten por pulverización catódica con oro y se obtienen micrografías utilizando un SEM Philips 501B que opera a 15 kV.
E. Estudios de CAM
Embriones de pollo doméstico fertilizados se incuban durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. Los contenidos de los huevos se incuban a humedad relativa 90% y 3% de CO_{2} durante 2 días. El día sexto de incubación, se ponen partes alícuotas de 1 mg de microesferas cargadas con 0,6% de taxol o microesferas de control (exentas de taxol) directamente sobre la superficie de la CAM. Después de dos días de exposición, se examina la vasculatura utilizando un estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales de vídeo se presentan luego en un ordenador y se imprime la imagen de vídeo.
F. Resultados
Las microesferas preparadas a partir de EVA al 100% se suspenden libremente en soluciones de PVA pero se agregan y unen por coalescencia o se fusionan extensamente durante el lavado subsiguiente en agua para separar el PVA. La mezcla de PVA con una proporción creciente de PLA produjo microesferas que presentaban una tendencia reducida a agregarse y unirse por coalescencia cuando se lavaban con agua, como se describe en la Figura 15A. Una mezcla 50:50 de EVA:PLA formó microesferas con estabilidad física satisfactoria, es decir que las microesferas se mantenían discretas y bien suspendidas con agregación y coalescencia insignificantes.
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Se ha determinado que la fracción de tamaño "pequeño" de las microesferas está constituida en una proporción > 95% de la muestra (en peso) por microesferas de tamaño comprendido entre 10 y 30 \mum, y para la fracción de tamaño "grande", una proporción mayor que 95% de la muestra (en peso) está constituida por microesferas de tamaño comprendido entre 30 y 100 \mum. Micrografías electrónicas de barrido representativas de microesferas EVA:PLA 50:50 cargadas con taxol en los intervalos de tamaño "pequeño" y "grande" se muestran en las Figuras 15B y 15C, respectivamente. Las microesferas son esféricas con superficie lisa y sin evidencia alguna de fármaco sólido en la superficie de las microesferas. La eficiencia de la carga de las microesferas EVA:PLA 50:50 con taxol está comprendida entre 95 y 100% para concentraciones iniciales de taxol comprendidas entre 100 y 1000 mg de taxol por 50 mg de polímero. No existe diferencia significativa alguna (ensayo t de Student, p < 0,05) entre las eficiencias de encapsulación para las microesferas "pequeñas" o "grandes".
La evolución en el tiempo de la liberación de taxol a partir de las microesferas EVA:PLA 50:50 cargadas con 0,6% peso/volumen se muestra en la Figura 15D para microesferas de tamaño "pequeño" (círculos vacíos) y de tamaño "grande" (círculos llenos). Los estudios de tasa de liberación se llevan a cabo en tubos triplicados en tres experimentos separados. Los perfiles de liberación son bifásicos, presentándose una liberación inicial rápida de taxol o fase de "estallido" durante los cuatro primeros días a partir de las microesferas de ambos intervalos de tamaño. Esto va seguido por una fase de liberación mucho más lenta. No existe diferencia significativa alguna entre las tasas de liberación de las microesferas "pequeñas" o "grandes". Entre 10 y 13% del contenido total de taxol de las microesferas se libera en 50 días.
Las microesferas cargadas con taxol (carga 0,6% peso/volumen) se ensayan utilizando la prueba CAM y los resultados se muestran en la Figura 15E. Las microesferas que contenían taxol liberaban suficiente fármaco para producir una zona carente de vascularidad en el tejido circundante (Figura 15F). Obsérvese que, inmediatamente adyacente a las microesferas ("MS" en las Figuras 15E y 15F) existe un área en la cual están completamente ausentes los vasos sanguíneos (Zona 1); más lejos de las microesferas existe un área de capilares disgregados no funcionales (Zona 2); únicamente a una distancia de aproximadamente 6 mm de las microesferas pueden volver los capilares a la normalidad. En las CAMs tratadas con microesferas de control (sin taxol) existe una arquitectura de red capilar normal.
Discusión
La quimioembolización arterial es una técnica quirúrgica invasiva. Por esta razón, idealmente, una formulación quimioembólica de un fármaco anti-angiogénico y anti-cáncer tal como taxol debería liberar el fármaco en el sitio del tumor en concentraciones suficientes para actividad durante un período de tiempo prolongado, del orden de varios meses. El polímero EVA es un compuesto no degradable y compatible con los tejidos, que ha sido utilizado extensamente para el suministro controlado de macromoléculas a lo largo de períodos de tiempo prolongados (> 100 días).
Se selecciona inicialmente EVA como biomaterial polímero para preparar las microesferas con taxol dispersado en la matriz del polímero. Sin embargo, las microesferas preparadas con EVA 100% se agregan y unen por coalescencia casi completamente durante el procedimiento de lavado.
Los polímeros y copolímeros basados en ácido láctico y ácido glicólico son fisiológicamente inertes y biocompatibles, y se degradan por hidrólisis para dar productos toxicológicamente aceptables. Los copolímeros de ácido láctico y ácidos glicólicos tienen tasas de degradación más rápidas que PLA, y las microesferas cargadas con fármaco preparadas utilizando estos copolímeros son inadecuadas para liberación controlada y prolongada durante varios meses. Dollinger y Sawan mezclaron PLA con EVA y demostraron que el tiempo de vida de degradación de PLA aumenta a medida que se incrementa la proporción de EVA en la mezcla. Dichos investigadores sugirieron que las mezclas de EVA y PLA deberían proporcionar una matriz de polímero con mejor estabilidad térmica y control de las tasas de liberación de fármaco que PLA.
La Figura 15A muestra que al aumentar la proporción de PLA en una mezcla EVA:PLA disminuía el grado de agregación de las suspensiones de microesferas. Las mezclas de 50% o menos de EVA en la matriz EVA:PLA producían suspensiones de microesferas físicamente estables en agua o PBS. Se selecciona una mezcla de EVA:PLA 50:50 para todos los estudios subsiguientes.
Pudieron prepararse fracciones de microesferas de intervalos de tamaño diferentes cambiando la concentración del emulsionante, PVA, en la fase acuosa. Se producen microesferas "pequeñas" a la concentración de PVA más alta de 5% peso/volumen, mientras que se producen microesferas "grandes" para PVA al 2,5% peso/volumen. Todas las restantes variables de la producción son iguales para ambas fracciones de tamaño de microesferas. La concentración más elevada de emulsionante dio un medio más viscoso de dispersión acuosa y produjo gotitas más pequeñas de polímero/taxol/DCM emulsionadas en la fase acuosa y por consiguiente microesferas más pequeñas. Las microesferas cargadas con taxol contenían entre 95 y 100% del taxol inicial añadido a la fase orgánica encapsulado en el interior de las microesferas sólidas. La baja solubilidad en agua del taxol favorecía el reparto en la fase orgánica que contenía el polímero.
Las tasas de liberación de taxol a partir de las microesferas EVA:PLA 50:50 son muy lentas, liberándose menos del 15% del taxol cargado en 50 días. La fase de estallido inicial de la liberación del fármaco puede ser debida a difusión del fármaco desde la región superficial de las microesferas (próxima a la superficie de las microesferas).
Se cree que el mecanismo de liberación del fármaco a partir de matrices polímeras no degradables tales como EVA implica la difusión de agua a través de la fase de fármaco dispersada en el seno del polímero, la disolución del fármaco y la difusión del soluto a través de una serie de poros interconectados, llenos de fluido. Se ha demostrado que las mezclas de EVA y PLA son inmiscibles o bicontinuas dentro de un intervalo de 30 a 70% de EVA en PLA. En estudios de degradación en tampón PBS a 37ºC, a continuación de un período de inducción o retardo, PLA se degradaba hidrolíticamente y era erosionado de la matriz de mezcla de polímeros EVA:PLA dejando un esqueleto inactivo semejante a una esponja. Aunque el período de inducción y la tasa de degradación de PLA y erosión de las matrices mezcladas dependían de la proporción de PLA en la matriz y de la historia del procedimiento, existe consistentemente poca o ninguna pérdida de PLA hasta después de 40-50 días.
Aunque puede haberse producido cierta erosión del PLA a partir de las microesferas de EVA:PLA 50:50 dentro de los 50 días del estudio de la tasa de liberación in vitro (Figura 15C), es probable que el mecanismo primario de liberación del fármaco a partir de la mezcla de polímeros sea la difusión del soluto a través de un retículo poroso en la matriz de polímero.
A la finalización del estudio de la tasa de liberación, se analizan las microesferas en cuanto a la cantidad de fármaco remanente. Los valores para el porcentaje de taxol remanente en las muestras de microesferas con 50 días de incubación son 94% \pm 9% y 89% \pm 12% para las microesferas de las fracciones de tamaño "grande" y "pequeño", respectivamente.
La microesferas cargadas con 6 mg por mg de polímero (0,6%) demostraron una inhibición acusada de la angiogénesis cuando se pusieron en la CAM del embrión de pollo (Figuras 15E y 15F).
Ejemplo 12 Encapsulación de taxol en microesferas de poli(e-caprolactona). Inhibicion de la angiogenesis en el ensayo CAM por microesferas cargadas con taxol
Este ejemplo evalúa el perfil de la tasa de liberación de taxol in vitro a partir de microesferas biodegradables de poli(e-caprolactona) y demuestra la actividad anti-angiogénica del taxol liberado de estas microesferas cuando se encuentra en la CAM.
Los reactivos que se utilizaron en estos experimentos incluyen: poli(e-caprolactona) ("PCL") (peso molecular 35.000 - 45.000; adquirida de Polysciences (Warrington, PA)); diclorometano ("DCM") de Fisher Scientific Co., Canadá; poli(alcohol vinílico) (PVA) (peso molecular 12.000 - 18.000, hidrolizado al 99%) de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.), y taxol de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A no ser que se indique otra cosa, todos los productos químicos y reactivos se utilizan tal como se reciben. Se utiliza en todos los casos agua destilada.
A. Preparación de microesferas
Se preparan las microesferas esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 8 utilizando el método de evaporación del disolvente. Resumidamente, se preparan microesferas cargadas con 5% peso/peso de taxol disolviendo 10 mg de taxol y 190 mg de PCL en 2 ml de DCM, añadiendo el todo a 100 ml de solución acuosa de PVP al 1% y agitando a 1000 rpm a 25ºC durante 2 horas. La suspensión de microesferas se centrifuga a 1000 x g durante 10 minutos (Beckman GPR), se retira el sobrenadante y se lavan tres veces las microesferas con agua. Las microesferas lavadas se secan al aire durante la noche y se guardan a la temperatura ambiente. Las microesferas de control (sin taxol) se preparan como se ha descrito anteriormente. Se preparan también microesferas que contienen 1% y 2% de taxol. Las microesferas se clasifican por tamaños utilizando un microscopio óptico con un micrómetro de platina.
B. Eficiencia de encapsulación
Se añade un peso conocido de microesferas cargadas con fármaco (aproximadamente 5 mg) en 8 ml de acetonitrilo y se añaden 2 ml de agua destilada para precipitar el polímero. La mezcla se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos y se calcula la cantidad de taxol encapsulado a partir de la absorbancia del sobrenadante medida en un espectrofotómetro UV (Espectrofotómetro con Sistema de Diodos Hewlett-Packard 8452A) a 232 nm.
C. Estudios de liberación de fármaco
Se suspenden aproximadamente 10 mg de microesferas cargadas con taxol en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato 10 mM, pH 7,4 (PBS) en tubos con tapón roscado. Los tubos se voltean de un extremo a otro a 37ºC y se retiran a intervalos de tiempo dados 19,5 ml de sobrenadante (después de dejar que las microesferas se decanten en el fondo), se filtran a través de un filtro de membrana de 0,45 mm y se retienen para análisis de taxol. Se añade a cada tubo un volumen igual de PBS para mantener condiciones sumergidas a lo largo de todo el estudio. Los filtrados se extraen con 3 x 1 ml de DCM, se evaporan los extractos en DCM a sequedad en corriente de nitrógeno, se redisuelven en 1 ml de acetonitrilo y se analizan por HPLC utilizando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) a un caudal de 1 ml.min^{-1} (Bomba Isocrática Beckman), una columna C8 de fase inversa (Beckman), y detección UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.
D. Estudios CAM
Se incuban embriones fertilizados de pollo doméstico durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. El día sexto de incubación, se ponen directamente partes alícuotas de 1 mg de microesferas cargadas con 5% de taxol o microesferas de control (sin taxol) sobre la superficie de la CAM. Después de una exposición de dos días, se examina la vasculatura utilizando un estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales de vídeo se presentan luego en un ordenador y se imprime la imagen de vídeo.
E. Microscopía electrónica de barrido
Se ponen las microesferas sobre contenedores de muestra, se someten a pulverización catódica con oro y se ponen luego en un Microscopio Electrónico de Barrido Philips 501B que opera a 15 kV.
F. Resultados
El intervalo de tamaños para las muestras de microesferas está comprendido entre 30 y 100 \mum, aunque existe evidencia en todas las cargas de microesferas cargadas con taxol o microesferas de control de algunas microesferas que caen fuera de este intervalo. La eficiencia de carga de las microesferas PCL con taxol es siempre mayor que 95% para todas las cargas de fármaco estudiadas. La microscopía electrónica de barrido demostró que las microesferas son todas ellas esféricas, y muchas de ellas mostraban una morfología de superficie rugosa o con picaduras. No parecía existir evidencia alguna de fármaco sólido en la superficie de las microesferas.
Las evoluciones en el tiempo de la liberación de taxol a partir de microesferas PCL cargadas con 1%, 2% y 5% se representan en la Figura 16A. Los perfiles de tasa de liberación son bifásicos. Existe una liberación rápida inicial de taxol o "fase de estallido" para todas las cargas de fármaco. La fase de estallido se produjo a lo largo de 1-2 días para carga con 1% y 2% de taxol y a lo largo de 3-4 días para microesferas cargadas con 5%. La fase inicial de liberación rápida va seguida por una fase de liberación de fármaco significativamente más lenta. Para las microesferas que contienen 1% o 2% de taxol no existe liberación alguna adicional de fármaco después de 21 días. Para carga con 5% de taxol, las microesferas habían liberado aproximadamente el 20% del contenido total de fármaco al cabo de 21 días.
La Figura 16B muestra CAMs tratadas con microesferas PCL de control, y la Figura 16C muestra el tratamiento con microesferas cargadas con 5% de taxol. La CAM con las microesferas de control muestra una arquitectura de retículo capilar normal. La CAM tratada con microesferas taxol-PCL exhibe una regresión vascular acusada y zonas que están desprovistas de retículo capilar.
G. Discusión
El método de evaporación del disolvente para la fabricación de microesferas cargadas con taxol produjo eficiencias de encapsulación en taxol muy altas comprendidas entre 95 y 100%. Esto es debido a la escasa solubilidad en agua del taxol y su naturaleza hidrófoba que favorecen la distribución en la fase de disolvente orgánico que contiene el polímero.
El perfil de liberación bifásico para taxol es típico del patrón de liberación de muchos fármacos a partir de matrices de polímero biodegradables. La poli(e-caprolactona) es un poliéster alifático que puede degradarse por hidrólisis en condiciones fisiológicas, carece de toxicidad y es compatible con los tejidos. La degradación de la PCL es significativamente más lenta que la de los polímeros y copolímeros de ácidos láctico y glicólico investigados extensamente, y es por consiguiente adecuada para el diseño de sistemas de suministro de fármacos a largo plazo. Se cree que la fase inicial rápida o fase de estallido de la liberación de taxol es debida a la liberación por difusión del fármaco desde la región superficial de las microesferas (próxima a la superficie de las microesferas). La liberación de taxol en la segunda fase (más lenta) de los perfiles de liberación no es debida probablemente a degradación o erosión de PCL, dado que estudios realizados han demostrado que en condiciones in vitro en agua no se produce pérdida alguna significativa de peso o erosión superficial de la PCL a lo largo de un período de 7,5 semanas. La fase más lenta de liberación de taxol es debida probablemente a disolución del fármaco en el interior de los poros llenos de fluido en la matriz de polímero y difusión a través de los poros. La mayor tasa de liberación para carga más alta de taxol es probablemente resultado de un retículo de poros más extenso en el interior de la matriz de polímero.
Se ha demostrado que las microesferas de taxol con 5% de carga liberan fármaco suficiente para producir una inhibición extensa de la angiogénesis cuando se disponen en la CAM. La inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos dio como resultado una zona avascular como se muestra en la Figura 16C.
Ejemplo 13 Películas polímeras cargadas de taxol, compuestas de etileno -acetato de vinilo y un agente tensioactivo
Se preparan dos tipos de películas esencialmente como se describe en el Ejemplo 10: películas EVA puras cargadas con taxol y películas de mezcla EVA/agente tensioactivo (a saber, Pluronic F127, Span 80 y Pluronic L101) cargadas con taxol.
Los agentes tensioactivos que se examinan son dos agentes tensioactivos hidrófobos (Span 80 y Pluronic L101) y un agente tensioactivo hidrófilo (Pluronic F127). Los agentes tensioactivos Pluronic son en sí mismos polímeros, lo cual es una propiedad atractiva dado que pueden mezclarse con EVA para optimizar diversas propiedades del suministro de fármacos. Span 80 es una molécula más pequeña que está dispersada de cierto modo en la matriz de polímero, y no forma una mezcla.
Los agentes tensioactivos serán útiles para modular las tasas de liberación de taxol a partir de películas y optimizar ciertos parámetros físicos de las películas. Un aspecto de las películas de mezcla de agentes tensioactivos que indica que las tasas de liberación de fármaco pueden controlarse es la capacidad de variar la tasa y extensión en la que el compuesto se hinchará en agua. La difusión de agua en una matriz polímero-fármaco es crítica para la liberación del fármaco a partir del vehículo. Las Figuras 17C y 17D muestran el grado de hinchamiento de las películas cuando se altera el nivel de agente tensioactivo en la mezcla. Las películas de EVA puras no se hinchan en ningún grado importante en más de 2 meses. En cambio, al aumentar el nivel de agente tensioactivo añadido al EVA es posible aumentar el grado de hinchamiento del compuesto, y al aumentar el carácter hidrófilo puede incrementarse también el hinchamiento.
Los resultados de los experimentos realizados con estas películas se muestran más adelante en las Figuras 17A-E. Resumidamente, la Figura 17A muestra la liberación de taxol (en mg) a lo largo del tiempo a partir de películas EVA puras. La Figura 17B muestra el porcentaje de fármaco que queda para las mismas películas. Como se puede ver a partir de estas dos Figuras, a medida que aumenta la carga de taxol (es decir, a medida que se incrementa el porcentaje en peso de taxol), aumentan las tasas de liberación de fármaco, mostrando la dependencia esperada respecto a la concentración. A medida que se incrementa la carga de taxol, aumenta también el porcentaje de taxol que queda en la película, lo que indica que una carga más alta puede ser más atractiva para formulaciones de liberación a largo plazo.
La resistencia física y la elasticidad de las películas se determinan en la Figura 17E. En resumen, la Figura 17E muestra las curvas esfuerzo/deformación para películas de EVA puro y de mezclas EVA-agente tensioactivo. Esta medida bruta del esfuerzo demuestra que la elasticidad de las películas se incrementa con la adición de Pluronic F127, y que la resistencia a la tracción (esfuerzo de rotura) se incrementa de una manera dependiente de la concentración con la adición de Pluronic F127. La elasticidad y la resistencia son consideraciones importantes en el diseño de una película que pueda ser manipulada para aplicaciones clínicas particulares sin causar deformación permanente del compuesto.
Los datos anteriores demuestran la capacidad de ciertos aditivos tensioactivos para controlar las tasas de liberación del fármaco y alterar las características físicas del vehículo.
Ejemplo 14 Incorporación de metoxipolietilen-glicol 350 (mepeg) en poli(e-caprolactona) para desarrollar una formulación para el suministro controlado de taxol a partir de una pasta
Los reactivos y el equipo que se utilizaron en estos experimentos incluyen metoxipolietilen-glicol 350 ("MEPEG" - Union Carbide, Danbury, CT). MEPEG es líquido a la temperatura ambiente, y tiene un punto de congelación de 10º a -5ºC.
A. Preparación de una pasta MEPEG/PCL que contiene taxol
Se prepara la pasta MePEG/PCL disolviendo primeramente una cantidad de taxol en MePEG e incorporando luego esta solución en PCL fundida. Una ventaja de este método es que no se requiere cantidad alguna de DCM.
B. Análisis del punto de fusión
El punto de fusión de las mezclas de polímeros PCL/MePEG puede determinarse por calorimetría de barrido diferencial desde 30ºC a 70ºC a un régimen de calentamiento de 2,5ºC por minuto. Los resultados de este experimento se muestran en las Figuras 18A y 18B. Resumidamente, como se muestra en la Figura 18A, el punto de fusión de la mezcla de polímeros (como se determina por análisis térmico) se reduce por la adición de MePEG de una manera dependiente de la concentración. El punto de fusión de las mezclas de polímeros en función de la concentración de MePEG se muestra en la Figura 18A. Este punto de fusión inferior se traduce también en un tiempo incrementado para que las mezclas de polímeros solidifiquen a partir de la masa fundida como se muestra en la Figura 18B. Una mezcla 30:70 de MePEG:PCL requiere más del doble de tiempo para solidificarse a partir de la masa fundida fluida que lo hace la PCL aisladamente considerada.
C. Medida de la fragilidad
La incorporación de MePEG en PCL parece producir un sólido menos quebradizo, en comparación con PCL aisladamente considerada. Como una manera "grosera" de cuantificar esto, se deja caer una aguja pesada desde una altura igual sobre mezclas de polímeros que contienen desde 0% a 30% de MePEG en PCL, y se mide luego la longitud de penetración de la aguja en el sólido. El gráfico resultante se muestra como Figura 18C. Los puntos se dan como el valor medio de cuatro determinaciones \pm 1 desviación estándar (S.D., del inglés Standard Deviation).
Para fines de comparación, se ensaya también una muestra de cera de parafina y la aguja penetró en ésta una distancia de 7,25 mm \pm 0,3 mm.
D. Medida de la liberación de taxol
Gránulos de polímero (PCL que contiene 0%, 5%, 10% o 20% de MePEG) se incuban en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a 37ºC, y se mide el % de cambio en el peso de polímero a lo largo del tiempo. Como se puede ver en la Figura 18D, la cantidad de pérdida de peso aumenta con la concentración de MePEG presente originalmente en la mezcla. Es probable que esta pérdida de peso sea debida a la liberación de MePEG a partir de la matriz del polímero en el fluido de incubación. Esto indicaría que el taxol se liberará fácilmente de una mezcla MePEG/PCL, dado que taxol se disuelve primeramente en MePEG antes de su incorporación en PCL.
E. Efecto de la variación de las cantidades de MePEG sobre la liberación de taxol
Se preparan termopastas que contienen entre 0,8% y 20% de MePEG en PCL. Estas se cargan con 1% de taxol. La liberación de taxol a lo largo del tiempo a partir de gránulos de 10 mg en tampón de PBS a 37ºC se observa utilizando HPLC. Como se muestra en la Figura 18E, la cantidad de MePEG en la formulación no afecta a la cantidad de taxol que se libera.
F. Efecto de la variación de las cantidades de taxol sobre la cantidad total de taxol liberada a partir de una mezcla 20% MePEG/PCL
Se preparan termopastas que contienen 20% de MePEG en PCL y se cargan con una cantidad comprendida entre 0,2% y 10% de taxol. La liberación de taxol a lo largo del tiempo se mide como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 18F, la cantidad de taxol liberada a lo largo del tiempo aumenta con el incremento de la carga de taxol. Cuando se representa gráficamente como el porcentaje total de taxol liberado, sin embargo, se invierte el orden (Figura 18G). Esto da información acerca del taxol residual que queda en la pasta y, si se hacen suposiciones acerca de la validez de la extrapolación de estos datos, permite una proyección del período de tiempo a lo largo del cual se liberará taxol a partir de la termopasta con 20% de MePEG.
G. Análisis de la resistencia de diversas mezclas MePEG/PCL
Se utiliza un comprobador de resistencia mecánica CT-40 para medir la resistencia de "tabletas" sólidas de polímero de 0,88 cm de diámetro y con espesor aproximado de 0,560 cm. Las tabletas de polímero son mezclas de MePEG a concentraciones de 0%, 5%, 10% o 20% en PCL.
Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 18H, en la cual se representan gráficamente la resistencia a la tracción y el tiempo hasta el fallo en función del % de MePEG en la mezcla. El método ANOVA de una sola variable indicó que los espesores de las tabletas dentro de cada grupo no difieren. Como puede verse por la Figura 18H, la adición de MePEG a PCL redujo la dureza del sólido resultante.
Ejemplo 15 Efecto de la termopasta cargada con taxol sobre la angiogénesis in vivo
Se incubaron durante 4 días embriones de pollo doméstico fertilizados antes del cultivo sin cáscara como se describe en el Ejemplo 2. Los contenidos de los huevos se separan de la cáscara, se vacían en tazas de vidrio esterilizadas con fondo redondo, y se cubren con tapas para cápsulas de petri.
El taxol se incorpora en la termopasta a concentraciones de 5%, 10%, y 20% (peso/volumen) esencialmente como se ha descrito con anterioridad (véase ejemplo 10), y se utiliza en los experimentos siguientes. La termopasta cortada y seca se calienta luego a 60ºC y se prensa entre dos hojas de Parafilm, aplastándola, y dejándola enfriar. Seis embriones recibieron termopasta cargada con 20% de taxol y 6 embriones recibieron termopasta sin cargar preparada de este modo. Un solo embrión murió en cada grupo, quedando 5 embriones tanto en el grupo de control como en el grupo tratado.
La termopasta sin cargar y la termopasta que contenía 20% de taxol se calentaron también a 60ºC y se pusieron directamente sobre el borde de crecimiento de cada CAM el día 6 de incubación; de esta manera se trataron dos embriones en cada caso.
No se observó diferencia alguna en los resultados obtenidos utilizando los diferentes métodos de administración, lo que indicaba que la temperatura de la pasta en el momento de su aplicación no era un factor que influyera en el resultado.
Se aplicó termopasta con 10% de taxol a 11 CAMs y se aplicó termopasta sin cargar a 11 CAMs adicionales, mientras que se aplicó termopasta cargada con 5% de taxol a 10 CAMs y termopasta sin cargar a otras 10 CAMs de control. Después de una exposición de 2 días (día 8 de incubación) se examinó la vasculatura con ayuda de un esteromicroscopio. Se inyectó Liposyn II, una solución opaca blanca, en la CAM para aumentar la visibilidad de los detalles vasculares.
En los embriones tratados con pasta cargada con 5% de taxol, únicamente dos animales demostraron la inhibición máxima de la angiogénesis, mientras que los 8 restantes se vieron afectados sólo marginalmente. De los animales tratados con termopasta cargada con 10% de taxol, únicamente 2 mostraban una inhibición máxima, mientras que los otros nueve se veían afectados sólo marginalmente.
La termopasta cargada con 20% de taxol contenía áreas extensas de avascularidad (véase Figura 19B) en la totalidad de las 5 CAMs que recibieron este tratamiento. El grado máximo de inhibición se definió como una región de avascularidad que cubría 6 mm x 6 mm de tamaño. La totalidad de las CAMs tratadas con termopasta cargada con 20% de taxol exhibieron este grado de inhibición de la angiogénesis.
En comparación, la termopasta de control (sin cargar) no inhibió la angiogénesis en la CAM (véase Figura 19A); esta vista con mayor aumento (obsérvese que el borde de la pasta se ve en la parte superior de la imagen) demuestra que los vasos adyacentes a la pasta no se ven afectados por la termopasta. Esto sugiere que el efecto observado es debido a la liberación sostenida de taxol y no es debido al polímero propiamente dicho o a un efecto de la presión secundaria de la pasta sobre la vasculatura en desarrollo.
Este estudio demuestra que la termopasta libera cantidades suficientes de inhibidor de la angiogénesis (en este caso taxol) para inhibir el desarrollo normal de la vasculatura de la CAM.
Ejemplo 16 Efecto de la termopasta cargada con taxol sobre el crecimiento del tumor y la angiogenesis del tumor in vivo
Se incuban durante 3 días embriones fertilizados de pollo doméstico antes de quitarles la cáscara. Los contenidos de los huevos se vacían quitando la cáscara localizada alrededor de la cámara de aire, cortando la membrana interior de la cáscara, perforando el extremo opuesto de la cáscara y dejando que el contenido del huevo se deslice suavemente hacia el exterior desde el extremo romo. Los contenidos se vacían en tazones de vidrio esterilizados con fondo redondo, se cubren con tapas de cápsulas petri y se incuban a 90% de humedad relativa y 3% de dióxido de carbono (véase
Ejemplo 2).
Se inyectan células MDAY-D2 (un tumor linfoide de murino) en ratones y se deja que se desarrollen en tumores con un peso de 0,5-1,0 g. Se sacrifican los ratones, se frotan los sitios tumorales con alcohol, se extirpan, se introducen en medios estériles de cultivo de tejidos, y se cortan en piezas en forma de dado de 1 mm en una vitrina de flujo laminar. Antes de colocar los tumores disecados en los embriones de pollo de 9 días, se raspan suavemente las superficies de la CAM con una aguja de calibre 30 para asegurar la implantación del tumor. Se introducen luego los tumores en las CAMs después de 8 días de incubación (4 días después de la eliminación de la cáscara), y se dejan crecer en la CAM durante cuatro días para establecer un suministro vascular. Se preparan cuatro embriones utilizando este método, recibiendo cada embrión 3 tumores. Para estos embriones, un tumor recibe termopasta cargada con 20% de taxol, el segundo tumor termopasta sin cargar, y el tercer tumor no recibe tratamiento alguno. Los tratamientos se continúan durante dos días antes de registrar los resultados.
Los tumores MDAY-D2 explantados secretan factores angiogénicos que inducen el crecimiento interno de capilares (derivados de la CAM) hacia el interior de la masa del tumor y permiten que la misma continúe aumentando de tamaño. Dado que todos los vasos del tumor se derivan de la CAM, mientras que todas las células tumorales se derivan del explante, es posible evaluar el efecto de las intervenciones terapéuticas sobre estos dos procesos independientemente. Este ensayo ha sido utilizado para determinar la eficacia de la termopasta cargada con taxol sobre: (a) la inhibición de la vascularización del tumor y (b) la inhibición del crecimiento de las células tumorales propiamente
dichas.
La evaluación estereomicroscópica directa in vivo y el examen histológico de los tejidos fijos a partir de este estudio demostró lo siguiente. En los tumores tratados con termopasta cargada con 20% de taxol, se produjo una reducción en el número de los vasos sanguíneos que abastecía el tumor (véanse Figuras 20C y 20D), una reducción en el número de vasos sanguíneos dentro del tumor, y una reducción en el número de vasos sanguíneos en la periferia del tumor (el área que es típicamente la más altamente vascularizada en un tumor sólido) cuando se compararon con tumores de control. Los tumores comenzaron a decrecer en tamaño y masa durante los dos días en que se llevó a cabo el estudio. Adicionalmente, se observó que numerosas células endoteliales habían cesado en su división celular, lo que indicaba que se había visto afectada la proliferación de las células endoteliales. Se observaron también frecuentemente células tumorales detenidas en mitosis. Los cuatro embriones mostraron un patrón coherente en el que la termopasta cargada con 20% de taxol reprimía la vascularidad tumoral, mientras que la termopasta sin carga no tenía efecto
alguno.
En comparación, en las CAMs tratadas con termopasta sin carga, los tumores estaban bien vascularizados con un aumento en número y densidad de vasos cuando se compararon con los del tejido circundante normal, y se observó un número espectacularmente mayor de vasos que los observados en los tumores tratados con pasta cargada con taxol. Los vasos de nueva formación entraban en el tumor desde todos los ángulos, pareciendo como radios fijados al centro de una rueda (véanse las Figuras 20A y 20B). Los tumores de control continuaban aumentando en tamaño y masa durante el curso del estudio. Histológicamente, se veían numerosos capilares dilatados de pared fina en la periferia del tumor y se apreciaron pocas células endoteliales en estado de división celular. El tejido tumoral estaba bien vascularizado y era viable en todos sus puntos.
Como ejemplo, en dos tumores de tamaño similar (inicialmente, en el momento del explante) situados en la misma CAM se obtuvieron los datos siguientes. Para el tumor tratado con termopasta cargada con 20% de taxol, el tumor medía 330 mm x 597 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 14 vasos sanguíneos, mientras que la masa del tumor tenía solamente 3-4 pequeños capilares. Para el tumor tratado con termopasta sin carga, el tamaño del tumor era 623 mm x 678 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 54 vasos sanguíneos, mientras que la masa del tumor tenía 12-14 pequeños vasos sanguíneos. Adicionalmente, la CAM circundante propiamente dicha contenía muchos más vasos sanguíneos en comparación con el área circundante del tumor tratado con taxol.
Este estudio demuestra que la termopasta libera cantidades suficientes de inhibidor de la angiogénesis (en este caso taxol) que inhiben la angiogénesis patológica que acompaña al crecimiento y desarrollo del tumor. En estas condiciones, la angiogénesis es estimulada al máximo por las células tumorales que producen factores angiogénicos capaces de inducir el crecimiento hacia adentro de capilares a partir del tejido circundante en la masa del tumor. La termopasta cargada con 20% de taxol es capaz de bloquear este proceso y limitar la capacidad del tejido tumoral para mantener un suministro adecuado de sangre. Esto da como resultado una disminución en la masa del tumor tanto por un efecto citotóxico del fármaco sobre las células tumorales propiamente dichas como por privar el tejido de los nutrientes requeridos para su crecimiento y expansión.
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Ejemplo 17 Efecto de la termopasta cargada con inhibidor de la angiogénesis sobre el crecimiento del tumor in vivo en un modelo de tumor de murino
El modelo de tumor de murino MDAY-D2 puede utilizarse para examinar el efecto de liberación lenta local de los compuestos quimioterapéuticos y anti-angiogénicos tales como taxol sobre el crecimiento del tumor, la metástasis del tumor, y la supervivencia del animal. La línea de células del tumor MDAY-D2 se deja crecer en una suspensión de células constituida por 5% de suero de ternero fetal en medio \alpha-mem. Las células se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de dióxido de carbono, y se diluyen por un factor de 15 cada tres días hasta que se obtiene un número suficiente de células. A continuación del período de incubación, las células se examinan por microscopía óptica respecto a viabilidad, y se centrifugan luego a 1500 rpm durante 5 minutos. Se añade PBS a las células para alcanzar una dilución de 1.000.000 de células por ml.
Ratones hembra DBA/2j de 10 semanas de edad se aclimatan durante 3-4 días después de su recepción. Cada ratón se inyecta luego subcutáneamente en el flanco posterolateral con 100.000 células MDAY-D2 en 100 ml de PBS. Estudios previos han demostrado que este procedimiento produce un tumor visible en el sitio de inyección en 3-4 días, alcanza un tamaño de 1,0-1,7 g a los 14 días, y produce metástasis visibles en el hígado 19-25 días después de la inyección. Dependiendo del objetivo del estudio, puede realizarse una intervención terapéutica en cualquier punto a lo largo del progreso de la enfermedad.
Utilizando el modelo animal anterior, se inyectan 20 ratones con 140.000 células MDAY-D2 subcutáneamente y se dejan crecer los tumores. El día 5, se dividen los ratones en grupos de 5. El sitio del tumor se abrió quirúrgicamente bajo anestesia, se trató la región local con la termopasta cargada con fármaco o termopasta de control sin perturbar el tejido tumoral existente, y se cerró la herida. Los grupos de 5 no recibieron tratamiento alguno (simplemente se cerró la herida), polímero (PCL) solo, termopasta cargada con 10% de taxol, o termopasta cargada con 20% de taxol (solamente se inyectaron cuatro animales) implantada adyacente al sitio del tumor. El día 16, se sacrificaron los ratones, se disecaron los tumores y se examinaron (macroscópica e histológicamente) en cuanto a crecimiento del tumor, metástasis tumorales, toxicidad local y sistémica resultante del tratamiento, efectos sobre la curación de la herida, efectos sobre la vascularidad del tumor, y condición de la pasta que quedaba en el sitio de incisión.
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Los pesos de los tumores para cada animal se muestran en la Tabla siguiente:
TABLA IV
100
La termopasta cargada con 20% de taxol redujo el crecimiento del tumor en más de un 85% (peso medio 0,105) en comparación con los animales de control (peso medio 0,681). Los animales tratados con termopasta sola o termopasta que contenía 10% de taxol tenían solamente efectos moderados sobre el crecimiento del tumor; los pesos del tumor se redujeron sólo 10% y 35% respectivamente (Figura 21A). Por consiguiente, la termopasta que contenía 20% de taxol era más eficaz en la reducción del crecimiento del tumor que la termopasta que contenía 20% de taxol (véase la Figura 21C; véase también la Figura 21B).
Se detectó termopasta en algunos de los animales en el sitio de administración. Se detectó polímero que variaba en peso entre 0,026 g y 0,078 g en 8 de 15 ratones. Cada animal del grupo que contenía termopasta cargada con 20% de taxol contenía algo de polímero residual, lo que sugería que éste era menos susceptible a la disolución. Histológicamente, los tumores tratados con termopasta cargada con taxol contenían una celularidad inferior y más necrosis de tejidos que los tumores de control. La vasculatura se redujo y se observaron frecuentemente células endoteliales detenidas en división celular. La termopasta cargada con taxol no parecía afectar a la integridad o celularidad de la piel o tejidos circundantes del tumor. Groseramente, la curación de las heridas no se veía afectada.
Ejemplo 18 El uso de películas quirúrgicas cargadas con inhibidor de la angiogénesis en la prevención de la siembra metastásica iatrogénica de células tumorales durante la cirugía de resección del cáncer
Un compuesto fármaco-polímero estéril, flexible y dilatable podría ser útil durante procedimientos de resección de cáncer. A menudo es deseable aislar los tejidos normales circundantes del tejido maligno durante operaciones de resección para evitar la propagación iatrogénica de la enfermedad a órganos adyacentes por contaminación inadvertida con células cancerosas. Una película Parafilm cargada con fármaco podría extenderse a través de los tejidos normales antes de la manipulación del tumor. Esto podría ser sumamente útil si se dispusiera alrededor del hígado y otros contenidos del abdomen durante la cirugía de resección de cáncer intestinal con objeto de evitar la propagación intraperitoneal de la enfermedad al hígado. Una película biodegradable podría dejarse in situ a fin de proporcionar protección continuada.
Los sitios de incisión son también una localización común de recurrencia post-operativa de la enfermedad maligna. Se cree que esto es debido a contaminación del sitio de la herida con células tumorales durante el procedimiento quirúrgico. Para abordar estas cuestiones, se están llevando a cabo experimentos con objeto de determinar la capacidad de las películas cargadas con inhibidor de la angiogénesis para prevenir este fenómeno.
A. Materiales y métodos
Preparación de la película quirúrgica. Se preparan películas quirúrgicas como se describe en el ejemplo 10. Se preparan Películas delgadas que miden aproximadamente 1 cm x 1 cm, que contienen polímero solo (PCL) o PCL cargada con 5% de taxol.
Modelo de tumor hepático de la rata. En un estudio inicial, se sometieron ratas Wistar que pesaban aproximadamente 300 g a anestesia general y se practica una incisión abdominal de 3-5 cm a lo largo de la línea media. En el lóbulo hepático mayor, se practica una incisión de 1 cm en el parénquima hepático y se reseca una parte del borde del hígado. Se deposita una concentración de 1 millón de células tumorales de Glioma 9L vivas (eluidas de cultivo de tejido inmediatamente antes del procedimiento) suspendidas en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato sobre el borde del corte hepático con un aguja de calibre 30. Se practica luego la cirugía sobre el borde del corte hepático que contiene las células tumorales y se fija in situ con Gelfoam. Dos animales recibieron películas PCL que contenían 5% de taxol, y dos animales recibieron películas que contenían PCL sola. La pared abdominal se cierra con Dexon 3,0 y grapas para piel. La anestesia general se termina y se deja que se recupere el animal. Diez días más tarde, se sacrifican los animales y se examinan histológicamente los hígados.
B. Resultados
Se observa el crecimiento local del tumor en los dos hígados tratados con polímero solo. Los dos hígados tratados con polímero más taxol están completamente exentos de tumor cuando se examinan histológicamente. Es también importante el hecho de que la cápsula hepática se había regenerado y desarrollado por completo sobre la película de polímero y la superficie cortada del hígado, lo que indicaba que no se produce efecto significativo alguno sobre la curación de la herida. No hay evidencia alguna de toxicidad hepática local alrededor de cualquiera de las películas quirúrgicas (cargadas con fármaco o exentas de fármaco).
C. Discusión
Este estudio indica que las películas quirúrgicas dispuestas alrededor de los tejidos normales y los sitios de incisión durante la cirugía pueden ser capaces de hacer decrecer la incidencia de la implantación accidental de células tumorales en el tejido normal circundante durante la resección de tumores malignos. Esto puede ayudar a reducir la incidencia del importante problema de la recurrencia local post-operativa de la enfermedad.
Ejemplo 19 Inyección intra-articular de microesferas biodegradables cargadas con inhibidor de la angiogénesis en el tratamiento de la artritis
El deterioro articular en la artritis es debido a una combinación de inflamación (con inclusión de WBCs y productos de WBC) y desarrollo de tejido de pannus (un tejido compuesto por tejido neovascular, tejido conjuntivo, y células inflamatorias). Se ha seleccionado el taxol para los estudios iniciales debido a que es un inhibidor potente de la neovascularización. De esta manera, el taxol en altas concentraciones locales demostrará ser un agente modificador de la enfermedad en la artritis.
Con objeto de determinar si las microesferas tienen un efecto deletéreo sobre las articulaciones, se llevan a cabo los experimentos siguientes. Resumidamente, se preparan microesferas de PCL simples y microesferas cargadas con taxol como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 8.
Se inyectan tres conejos intra-articularmente con microesferas de 0,5-5,0 \mum, 10-30 \mum o 30-80 \mum en un volumen total de 0,2 ml (que contiene 0,5 mg de microesferas). Las articulaciones se evalúan a simple vista (clínicamente) sobre una base diaria. Al cabo de dos semanas, se sacrifican los animales y se examinan las articulaciones histológicamente en cuanto a evidencia de inflamación y empobrecimiento en proteoglicanos.
Los modelos de artritis inflamatoria y osteoartritis del conejo están siendo utilizados para evaluar el uso de microesferas en la reducción de la sinovitis y la degradación de los cartílagos. La artritis degenerativa es inducida por un desgarro parcial del ligamento cruzado y el menisco de la rodilla. Al cabo de 4 a 6 semanas, los conejos desarrollan erosiones en el cartílago similares a la observada en la osteoartritis humana. La artritis inflamatoria es inducida por inmunización de los conejos con sero-albúmina de bovino (BSA) en Adyuvante Completo de Freund (CFA). Al cabo de 3 semanas, los conejos que contienen un título elevado de anticuerpo anti-BSA reciben una inyección intra-articular de BSA (5 mg). El hinchamiento de la articulación y la sinovitis acusada son evidentes al cabo de 7 días, se observa un empobrecimiento de proteoglicanos a los 7 a 14 días, y se aprecian erosiones de los cartílagos a las 4 a 6 semanas.
La artritis inflamatoria se induce como se ha descrito anteriormente. Al cabo de 4 días, se inyectan las articulaciones con microesferas que contienen 5% de taxol o vehículo. Un grupo de animales se sacrificarán el día 14 y otro grupo el día 28. Se examinan histológicamente las articulaciones en cuanto a inflamación y degradación de los cartílagos. El experimento está diseñado para determinar si las microesferas de taxol pueden afectar a la inflamación de la articulación y la degradación de la matriz de los cartílagos.
Las microesferas que contienen inhibidor de la angiogénesis pueden examinarse ulteriormente en un modelo de osteoartritis. Resumidamente, se induce artritis degenerativa en conejos como se ha descrito anteriormente, y las articulaciones reciben una inyección intra-articular de microesferas (con 5% de taxol o con vehículo exclusivamente) el día 4. Los animales se sacrifican el día 21 y el día 42, y las articulaciones se examinan histológicamente en cuanto a evidencia de degradación de los cartílagos.
Se llevan a cabo estudios para evaluar los inhibidores de la angiogénesis suministrados mediante microesferas intra-articulares como agentes condroprotectores.
Resultados
Se inyectaron microesferas de PCL sin carga de tamaños diferentes (0,5-5,0 \mum, 10-30 \mum o 30-80 \mum) intra-articularmente en la articulación de la rodilla del conejo. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 22A a D. Resumidamente, la Figura 22A es una fotografía de la sinovia de articulaciones inyectadas con PBS. La Figura 22B es una fotografía de articulaciones inyectadas con microesferas. La Figura 22C es una fotografía del cartílago de articulaciones inyectadas con PBS, y la Figura 22D es una fotografía de cartílago de articulaciones inyectadas con microesferas.
Como se puede ver por estas fotografías, histológicamente, no existe diferencia alguna entre las articulaciones que recibieron una inyección de microesferas y aquéllas que no la recibieron. Técnicamente, no había evidencia alguna de inflamación de la articulación durante los 14 días en que se llevó a cabo el experimento. Groseramente, no existe evidencia alguna de inflamación de la articulación o deterioro del cartílago en las articulaciones en que se inyectan las microesferas, en comparación con las articulaciones normales sin tratar.
Conclusiones
Pueden inyectarse intra-articularmente microesferas sin causar cambio apreciable alguno en la superficie de la articulación. Ello indica que este método puede ser un medio eficaz para suministrar una liberación prolongada y buscada deliberadamente de agentes modificaciones de la enfermedad a articulaciones enfermas, al tiempo que se minimiza la toxicidad que podría estar asociada con la administración sistémica de tales compuestos biológicamente activos.
Como se ha expuesto anteriormente, pueden formularse microesferas en tamaños específicos con cinética definida de liberación del fármaco. Se ha demostrado también que el taxol es un inhibidor potente de la angiogénesis y que el mismo se libera de las microesferas en cantidades suficientes para bloquear la neovascularización en el ensayo CAM. Por consiguiente, la administración intra-articular de microesferas cargadas con inhibidor de la angiogénesis (p. ej., cargadas con taxol) debería ser capaz de bloquear la neovascularización que se produce en enfermedades tales como la artritis reumatoide y que conduce a la destrucción de los cartílagos en la articulación. De esta manera, las microesferas cargadas con fármaco pueden actuar como agente "condroprotector" que protege el cartílago contra la destrucción irreversible por el tejido de pannus neovascular invasor.
(1) INFORMACION GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Hunter, William L.
\hskip3.9cm
Machan, Lindsay S. 
\hskip3.9cm
Arsenault, A. Larry 
\hskip3.9cm
Burt, Helen M. 
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(ii)
TITULO DE LA INVENCION: Composiciones anti-angiogénicas y métodos de uso
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(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 1
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(iv)
DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: SEED and BERRY
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(B)
CALLE: 701 Fifth Avenue, 6300 Columbia Center
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(C)
CIUDAD: Seattle
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(D)
ESTADO: Washington
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(E)
PAIS: Estados Unidos
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(F)
CODIGO POSTAL: 98104
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(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
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(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
EQUIPO LOGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
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(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE PRESENTACION:
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(C)
CLASIFICACION:
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(viii)
INFORMACION DE PROCURADOR/AGENTE
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(A)
NOMBRE: McMasters, David D.
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(B)
NUMERO DE REGISTRO: 33.963
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(C)
REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 110129.401
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(ix)
INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES:
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(A)
TELEFONO: (206) 622-4900
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(B)
TELEFAX: (206) 682-6031
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(C)
TELEX: 3723836
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(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO:1:
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(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
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(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
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(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
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(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg}

Claims (12)

1. Un stent para expandir el lumen de un conducto corporal, que comprende una estructura generalmente tubular revestida con una composición que comprende un factor anti-angiogénico y un vehículo polímero, siendo el factor anti-angiogénico mediante el ensayo CAM, y en el cual dicho factor anti-angiogénico es taxol, o un análogo o derivado del mismo.
2. Un stent de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho vehículo polímero comprende poli(caprolactona).
3. Un stent de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho vehículo polímero comprende poli(ácido láctico).
4. Un stent de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho vehículo polímero comprende poli(etileno-acetato de vinilo).
5. Un stent de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho vehículo polímero comprende un copolímero de poli(caprolactona) y poli(ácido láctico).
6. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho stent es un stent vascular.
7. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho stent es un stent biliar.
8. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho stent es un stent uretral.
9. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho stent es un stent esofágico.
10. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho stent es un stent traqueal-bronquial.
11. Un stent de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para tratamiento del estrechamiento de un conducto corporal.
12. Un stent de acuerdo con la reivindicación 11, para tratamiento o prevención de la estenosis recurrente.
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