PL169848B1

PL169848B1 - Sposób hamowania tworzenia sie amylozy w ziemniakach PL

Info

Publication number: PL169848B1
Application number: PL91299928A
Authority: PL
Inventors: Per Hofvander; Per T Persson; Anneli Tallberg; Olle Wikstroem
Original assignee: Amylogene Hb
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1996-09-30
Also published as: HU218824B; EP0563189B1; EP0921191A1; FI932804A7; ES2268748T3; DK0563189T4; HUT66754A; JP2004097219A; SE467358B; DK0563189T3; DK0921191T3; DE69133285D1; US6784338B1; DE69133285T2; EP1734123A1; WO1992011376A1; FI932804A0; HU9301792D0; DE69133285T3; ES2195999T3

Abstract

Sposób hamowania tworzenia sie amylozy w ziemniakach, znamienny tym, ze prowadzi sie modyfikacje ziemniaka technika inzynierii genetycznej poprzez wprowa- dzenie do genomu tkanki ziemniaka konstrukcji genowej zawierajacej fragment genu ziemniaka kodujacy powstawanie syntetazy skrobi zwiazanej z ziarnami (gen GBSS) wlaczony w kierunku antysensowym, posiadajacy sekwencje nukleotydowa przedstawio- na na fig. 7 jako ID nr 1 lub na fig. 8 A-D jako ID nr 2, lub na fig. 9 jako ID nr 3, oraz promotor wybrany sposród CaMV 35S, patatyny I i promotora GBSS. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania tworzenia się amylozy w ziemniakach.

Modyfikacja ziemniaka techniką inżynierii genetycznej według wynalazku prowadzi do wytworzenia w ziemniakach w zasadzie wyłącznie skrobi typu amylopektyny. Modyfikacja ta polega na wprowadzeniu do ziemniaka fragmentów genowych, na które to fragmenty składają się: części sekwencji liderowej, początku translacji, końca translacji i sekwencji przyczepionej oraz kodujące i niekodujące (to znaczy egzony i introny) części genu dla syntetazy skrobi związanej z ziarnami skrobi, włączone w kierunku antysensownym.

Skrobia w różnych jej formach ma ogromne znaczenie w przemyśle spożywczym i papierniczym. W przyszłości będzie miała również ogromne potencjalne zastosowanie do produkcji polimerów ulegających degradacji przeznaczonych np. na materiały opakowaniowe. Znanych jest wiele różnych produktów skrobiowych wytwarzanych przez derywatyzację skrobi naturalnej pochodzącej między innymi z kukurydzy i z ziemniaków. Skrobia ziemniaczana i kukurydziana współzawodniczą ze sobą na głównych obszarach rynków zbytu.

W bulwie ziemniaczanej skrobia stanowi największą część substancji stałych. W skrobi ziemniaczanej około 1/4 do 1/5 zawartości stanowi amyloza, a resztę - amylopektyna. Te dwa składniki skrobi mają odmienne zastosowania, a zatem, możliwość wytwarzania albo czystej amylozy albo czystej amylopektyny jest bardzo interesujące. Te dwa składniki skrobi można wytwarzać ze zwykłej skrobi; wymaga to jednak wieloetapowego procesu przetwarzania i w konsekwencji jest kosztowne i skomplikowane.

Obecnie okazało się, że metodą inżynierii genetycznej możliwa jest taka modyfikacja ziemniaka, w której bulwy wytwarzają głównie jeden lub drugi typ skrobi. W wyniku, uzyskuje się skrobię o takiej jakości, że może ona współzawodniczyć w takich dziedzinach, w których dotychczas skrobia ziemniaczana nie była stosowana. Skrobia z ziemniaków modyfikowanych techniką inżynierii genetycznej ma ogromne potencjalne znaczenie jako dodatek do żywności, gdyż nie poddaje się jej żadnym procesom obróbki chemicznej.

Synteza skrobi

Synteza skrobi i procesy jej regulacji są obecnie wnikliwie badane zarówno na poziomie badań podstawowych jak i ze względu na zastosowanie przemysłowe. Jakkolwiek zebrano już wiele wiadomości na temat udziału pewnych enzymów w transformacji sacharozy do skrobi, biosynteza skrobi nie została jeszcze wyjaśniona. Wykonując badania przede wszystkim na kukurydzy udało się jednak wyjaśnić część dróg syntezy i określić enzymy biorące udział w tych reakcjach. Najważniejszymi enzymami syntetyzującymi skrobię z następnym wytwarzaniem ziaren skrobi jest syntetaza skrobi oraz enzym rozgałęziający. W kukurydzy, dotychczas stwierdzono obecność i zbadano trzy formy syntetazy skrobi, z których dwie są rozpuszczalne, a jedna występuje w formie nierozpuszczalnej, związanej z

169 848 ziarnami skrobi. Również enzym rozgałęziający składa się z trzech form, prawdopodobnie kodowanych przez trzy różne geny (Mac Donald i Preiss, 1985; Preiss, 1988).

Gen woskowy w kukurydzy

Synteza składnika skrobi, amylozy zasadniczo przebiega w wyniku działania syntetazy skrobi, α-1,4-D-glukano-4-a-glukozylo-transferazy (EC 2,4,1,21), która jest związana z ziarnami skrobi w komórce wzrostowej. Gen kodujący ten enzym związany z ziarnami zwany jest genem woskowym (=wx+), a sam enzym zwany jest enzymem GBSS (synteza skrobi związana z ziarnami).

Locus woskowy w kukurydzyjest dokładnie scharakteryzowany zarówno pod względem genetycznym jak i biochemicznym. Gen woskowy na chromosomie 9 kontroluje wytwarzanie amylozy w bielmie, pyłkach i w woreczku zalążkowym. Skrobia wytwarzana w bielmie w zwykłej kukurydzy z allelem wx+ składa się z 25% amylozy i 75 % amylopektyny. Znaleziono zmutowaną formę kukurydzy, w której bielmo zawiera mutację zlokalizowaną w genie wx+, w związku z czym niejest w niej syntetyzowany funkcjonalny enzym GBSS. Bielmo tej zmutowanej kukurydzy zawiera w zasadzie amylopektynę jako jedyny składnik skrobi. Ten tak zwany mutant woskowy nie zawiera ani GBSS ani amylozy (Echt i Schwartz, 1981).

Białko GBSS jest kodowane przez gen wx+ w jądrze komórkowym ale jest transportowane do końca aktywnego w amyloplastach. Preproteina składa się z dwu komponentów: peptydu przejściowego o wielkości 7 kD, który transportuje białko przez membranę amyloplastu oraz rzeczywistego białka o wielkości 58 kD. Region kodujący genu wx+ w kukurydzy ma długość 3,7 kilozasad i posiada 14 egzonów i 13 intronów. Znanych jest wiele sygnałów regulujących w regionie promotora a dwie różne sekwencje poliadenylacji zostały opisane (Klosgen i wsp., 1986; Schwartz-Sommer i wsp., 1984 oraz Shure i wsp., 1983).

Enzym amylozowy w ziemniakach

W ziemniakach zidentyfikowano białko o wielkości 60 kD będące głównym składnikiem białka związanego z ziarnami skrobi. Ponieważ przeciwciała przeciw temu enzymowi ziemniaków reagują krzyżowo z GBSS z kukurydzy, przypuszcza się, że jest to syntetaza skrobi związana z ziarnami. (Vos-Scheperkeuter i wsp., 1986). Jednak gen dla GBSS w ziemniakach nie został dotychczas scharakteryzowany w tym samym stopniu co gen woskowy w kukurydzy ani pod względem lokalizacji ani struktury.

Oprócz kukurydzy, naturalnie występujące mutanty woskowe opisano w jęczmieniu, ryżu i w sorgu. W ziemniakach nie znaleziono żadnego naturalnego mutanta, ale wytworzono mutant przez działanie promieniowaniem X na liście rośliny monohaploidalnej (n = 12) (Visser i wsp., 1987). Skrobia wyizolowana z bulw tego mutanta nie zawiera ani białka GBSS ani amylozy. Ten mutant jest uwarunkowany obecnością zwykłego genu recesywnego; nosi on nazwę amf. Można go porównać do mutantów woskowych innych gatunków roślin, gdyż nie ma w nim ani białka GBSS ani amylozy. Stałość liczby chromosomów jest w nim jednak osłabiona, gdyż jest ona czterokrotnie większa od naturalnej (n = 48), co może mieć negatywny wpływ na rośliny ziemniaka (Jacobsen i wsp., 1990).

Hamowanie wytwarzania amylozy

Syntezę amylozy można drastycznie ograniczyć przez inhibicję syntetazy związanej z ziarnami (GBSS), która katalizuje tworzenie się amylozy. W wyniku tego hamowania skrobia zawiera głównie amylopektynę.

Hamowanie powstawania enzymu można przeprowadzić kilkoma sposobami, np. przez:

- traktowanie mutagenem, co prowadzi do modyfikacji sekwencji genu kodującej tworzenie się tego enzymu;

- wprowadzenie transpozonu do sekwencji genu kodującej ten enzym;

- modyfikację techniką inżynierii genetycznej w taki sposób, że gen kodujący ten enzym nie ulega ekspresji, np. jest hamowany techniką antysensowną.

169 848

Figura 1 przedstawia specyficzną supresję normalnej ekspresji genu polegającą na tym, że poddaje się hybrydyzacji komplementarny nukleotyd antysensowny z mRNA dla genu docelowego. Ten antysensowny nukleotyd jest zatem antysensownym RNA, którego transkrypcja zachodzi in vivo z odwróconej sekwencji genu (Izant, 1989).

Stosując technikę antysensowną hamowano wiele różnych funkcji genu w roślinach. Antysensowne konstrukcje dla syntetazy chalkonowej, poligalakturonazy i acetylotransferazy fosfinotrycyny stosowano do hamowania odpowiednich enzymów w petunii, pomidorach i w tytoniu.

Hamowanie wytwarzania amylozy w ziemniakach

W ziemniakach, prowadzono próby hamowania biosyntezy syntetazy skrobi związanej z ziarnami (białko GBSS) za pomocą konstrukcji antysensownej odpowiadającej genowi kodującemu GBSS (ten gen jest nazywany w dalszej części opisu genem GBSS), Hergersberger (1988) opisał sposób, w którym klon cDNA dla genu GBSS w ziemniakach izoluje się za pomocą klonu cDNA dla genu wx+ kukurydzy. Konstrukcję antysensowną opartą na całym klonie cDNA przenosi się do krążków liści ziemniaka stosując w tym celu Agrobacterium tumefaciens. W mikrobulwach indukowanych in vitro z regenerowanych pędów ziemniaka obserwowano zmienne, bardzo słabe zmniejszenie zawartości amylozy, co jest przedstawione na wykresie. Nie przeprowadzono całkowitej charakteryzacji genu GBSS.

Gen dla białka GBSS w ziemniakach został scharakteryzowany w taki sposób, że genomowy klon wx+ został oznaczony przez analizę restrykcyjną. Nie oznaczono jednak sekwencji DNA tego klonu (Visser i wsp., 1989).

Są doniesienia o dalszych badaniach z udziałem antysensownych konstrukcji odpowiadających genowi GBSS w ziemniakach. Taką antysensowną konstrukcję, opartą na klonie cDNA łącznie z promotorem CaMV 35S transformowano za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes. Według informacji, w wyniku transformacji uzyskano niższą zawartość amylozy w ziemniakach ale uznano, że nie ma to żadnej wartości (Flavell, 1990).

Żaden z dotychczas stosowanych sposobów modyfikacji technikami inżynierii genetycznej ziemniaka nie doprowadził praktycznie do uzyskania skrobi bez amylozy.

Stwierdzono, że jest możliwe praktycznie całkowite hamowanie wytwarzania amylozy w bulwach ziemniaka.

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania tworzenia się amylozy w ziemniakach polegający na tym, że prowadzi się modyfikację ziemniaka techniką inżynierii genetycznej poprzez wprowadzenie do genomu tkanki ziemniaka konstrukcji genowej zawierającej fragment genu ziemniaka kodujący powstawanie syntetazy skrobi związanej z ziarnami (gen GBSS) włączony w kierunku antysensownym, posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja ID nr 1, ID nr 2 albo ID nr 3 oraz promotor wybrany spośród CaMV 35S, patatyny I i promotora GBSS.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku funkcję genu GBSS a zatem i wytwarzanie amylozy w ziemniaku hamuje się przez zastosowanie całkowicie nowych konstrukcji antysensownych. Podstawą do konstruowania fragmentów antysensownych w celu uzyskania hamowania GBSS i w konsekwencji zahamowania produkcji amylozy, jest genomowy gen GBSS, co jest sposobem możliwie najskuteczniejszym. Konstrukcje antysensowne zawierają, włączone w kierunku antysensownym, zarówno części kodujące jak i niekodujące genu GBSS korespondujące z sekwencjami w regionie zawierającym sekwencje promotora, liderową, początku translacji, końca translacji i sekwencji przyczepionej.

W celu uzyskania ekspresji specyficznej tkankowo, co oznacza, że produkcja amylozy powinna być hamowana jedynie w bulwach ziemniaczanych, stosuje się promotory, których aktywność jest właściwa dla bulw ziemniaczanych. W ten sposób skład skrobi w innych częściach rośliny nie jest naruszony, gdyż w przeciwnym przypadku mogłoby to mieć ujemne skutki uboczne.

Tak więc stosowany fragment zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych jako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2 albo sekwencja ID nr 3. Skład tych sekwencji może jednak odbiegać od przedstawionego o jedną lub więcej nie sąsiadujących ze sobą par zasad, o ile nie zmienia to funkcji tych fragmentów.

169 848

Stosowany promotor specyficzny dla bulw ziemniaczanych zawiera 987 par zasad i należy do genu kodującego syntetazę skrobi związaną z ziarnami. Ani ten promotor ani odpowiedni gen nie zostały dotychczas scharakteryzowane. Sekwencja promotora o wielkości 987 par zasad jest podana w sekwencji ID nr 4, natomiast sekwencja samego genu jest przedstawiona w sekwencji ID nr 5. Również sekwencje promotora i genu mogą odbiegać od przedstawionych o jedną lub więcej nie sąsiadujących ze sobą par zasad, o ile nie wpływa to na ich funkcje.

Sposób według wynalazku powoduje hamowanie tworzenia się amylozy w ziemniakach, dzięki czemu w ziemniakach powstaje głównie skrobia typu amylopektyny.

Sposób według wynalazku jest bardziej szczegółowo opisany w odniesieniu do załączonych rysunków, na których fig. 1 przedstawia zasadę antysensownego hamowania genu, fig. 2 przedstawia wyniki analizy restrykcyjnej genu GBSS ziemniaka, fig. 3 przedstawia dwa nowe binarne wektory pHo3 i pHo4, fig. 4 przedstawia konstrukcje antysensowne pHoxwA, pHoxwB i pHoxwD, fig. 5 przedstawia konstrukcje antysensowne pHoxwF i pHoxwG, a fig. 6 przedstawia konstrukcje antysensowne pHoxwK i pHoxwL.

Ponadto sekwencje różnych fragmentów DNA są przedstawione na rysunkach jako sekwencje ID o numerach: ID nr 1 - fig. 7, ID nr 2 - fig. 8 A, B, C, D; ID nr 3 - fig. 9; ID nr 4 - fig. 10 oraz ID nr 5 - fig. 11A-11F. Dopuszcza się odchylenia w tych sekwencjach o jedną lub więcej nie sąsiadujących ze sobą par zasad.

W praktycznym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się następujące materiały:

Szczepy bakteryjne:

E.coli DH5alfa i DH5alfaF' IO(BRL); E.coli JM105 (Pharmacia); A. tumefaciens LBA4404 (Clontech).

Wektory: M13mpl8 i mpl9 (Pharmacia), pBI101 i pBI121 (Clontech); pBI240,7 (M. W. Bevan); plazmidy pUC (Pharmacia).

Enzymy: Enzymy restrykcyjne i łącznik Eco RI (BRL); zestaw do ligacji DNA o nazwie UNION™ (Clontech); zestaw do sekwencjonowania DNA o nazwie Sequenase™ (USB); ligaza DNA T4 (Pharmacia).

Powyższe materiały stosuje się zgodnie ze wskazówkami podanymi przez producentów. Bank genomowy

Na zamówienie zgłaszającego bank genomowy w EMBL3 został przygotowany przez firmę Clontech z użyciem liści ziemniaków odmiany Bintje jako materiału wyjściowego.

Identyfikacja i izolowanie genu GBSS

Dokonuje się skriningu banku genomowego na obecność genu GBSS ziemniaka za pośrednictwem klonów cDNA dla końców 5' i 3' tego genu (klony cDNA uzyskano od M. Hergersberger’a z Instytutu Maxa Pianka w Kolonii) według przepisu podanego przez firmę Clontech.

Z tego banku genomowego identyfikuje się i izoluje się pełnej długości klon genu GBSS ziemniaka, wx311. Oznaczono, że początek genu GBSS znajduje się przy fragmencie EcoRI, nazwanym fragmentem w (3,95 kilozasad). Koniec genu GBSS oznaczono również na fragmencie EcoRI, który nazwano fragmentem x (5,0 kilozasad). Izoluje się również fragment Bglll-Spel, nazwany fragmentem m (3,9 kilozasad). Zawiera on sekwencje zarówno z fragmentu w jak i z fragmentu x. Dokonuje się subklonowania fragmentów w, m i x w plazmidzie pUC13 (Viera, 1982; Yanisch-Peron i wsp., 1985) nadając im odpowiednio nazwy: pSw, pSm i pSx (fig. 2).

Charakteryzacja genu GBSS w ziemniakach

Gen GBSS w ziemniakach charakteryzuje się metodą analizy restrykcyjnej i za pomocą sond cDNA, oznaczając koniec 5' i koniec 3' tego genu GBSS bardziej dokładnie (fig. 2). W subkłonach pSw i pSx w wektorach M13mp18 i mpl9 jak również w plazmidzie pUC19 oznacza się sekwencję genu GBSS metodą Sangera i wsp. (1977) wychodząc do końca 5' (patrz sekwencja ID nr 5).

169 848

Region promotora oznacza się we fragmencie Bglll-Nsil (sekwencja ID nr 4). Początek transkrypcji i translacji oznacza się na częściowo nakładającym się fragmencie Bg1lIHindIII. Region terminatora oznacza się z kolei we fragmencie Spel-HindIII.

Konstrukcje antysensowne dla genu GBSS w ziemniaku

Fragmenty genu GBSS (sekwencje ID nr 1, nr 2 i nr 3; fig. 2) oznacza się w następujący sposób:

W wyniku trawienia pSw enzymami restrykcyjnymi NsiI i HindIII uzyskuje się fragment I (sekwencja ID nr 1), który po subklonowaniu do pUC19 oznacza się symbolem 19NH35. Dalsze trawienie tego 19NH35 enzymami HpaI-SstI daje fragment zawierający 342 pary zasad z genu GBSS. Ten fragment zawiera sekwencję liderową, początek translacji i pierwsze 125 par zasad regionu kodującego.

Trawienie pSm enzymami HpaI i NsiI daje fragment II (sekwencja ID nr 2), który subklonuje się do pJRD184 (Heusterspreute i wsp., 1987), nadając mu oznaczenie pjRDmitt. Dalsze trawienie pjRDmitt enzymami HpaI-SstI daje fragment zawierający 2549 par zasad z genu GBSS. Ten fragment zawiera egzony i introny ze środkowej części genu.

W wyniku trawienia pSx restryktazami SstI i Spel uzyskuje się fragment III (sekwencja ID nr 3), który subklonuje się do plazmidu pBluescript (Melton i wsp., 1984) nadając mu oznaczenie pBlue3'. Dalsze trawienie pBlue3' enzymami BamHI-Sstl daje fragment zawierający 492 par zasad genu GBSS. Ten fragment zawiera ostatni intron i egzon, koniec translacji i 278 par zasad sekwencji przyczepionej.

Konstrukcje antysensowne z fragmentem I (fig. 4)

W celu uzyskania konstrukcji antysensownej pHoxwA, dokonuje się insercji, w kierunku antysensownym, fragmentu HpaI-SstI z 19NH35 do binarnego wektora pBI121 (Jefferson i wsp., 1987) rozszczepionego za pomocą SmaI-SstI. Transkrypcję tego antysensownego fragmentu inicjuje się promotorem CaMV 35S i kończy się za pomocą terminatora NOS (terminatora syntetazy nopaliny).

Dla wytworzenia konstrukcji antysensownej pHoxwB dokonuje się insercji w kierunku antysensownym fragmentu HpaI-SstI z 19NH35 do binarnego wektora pHo4 (fig. 3) rozszczepionego uprzednio enzymami SmaI-SstI. Promotor patatyny I specyficzny dla bulw ziemniaka pochodzi z wektora pBI240,7 otrzymanego od M. Bevan’a z Institute of Plant Science Research z Norwich. Transkrypcję tego antysensownego fragmentu inicuje się promotorem patatyny I i kończy terminatorem NOS.

W celu uzyskania konstrukcji antysensownej pHoxwD, dokonuje się insercji w kierunku antysensownym fragmentu HpaI-SstI z 19NH35 do binarnego wektora pHo3 (fig. 3) uprzednio rozszczepionego enzymami Smal-Sstl. Plazmid pHo3 jest nowym wektorem binarnym skonstruowanym na bazie pBI101. Ten wektor, który zawiera promotor (sekwencja ID nr 4), czyli promotor GBSS obecnie scharakteryzowanego genu GBSS ziemniaków rozszczepia się restryktazami SmaI i SstI i dokonuje się insercji w kierunku antysensownym fragmentu HpaI-SstI z 19NH35. Transkrypcję tego antysensownego fragmentu inicjuje się jego własnym promotorem GBSS i kończy terminatorem NOS. Oznacza to, że transkrypcja tego antysensownego fragmentu przebiega jedynie w bulwach ziemniaczanych, gdyż promotor GBSS taki jak promotor patatyny I jest specyficzny dla bulw.

Konstrukcje antysensowne z fragmentem II (fig. 5)

W celu uzyskania konstrukcji antysensownej pHoxwF, dokonuje się insercji fragmentu HpaI-SstI z plazmidu pjRDmitt w kierunku antysensownym do binarnego wektora pHo4 rozszczepionego uprzednio enzymami SmaI-SstI. Transkrypcję tego antysensownego fragmentu inicuje się promotorem patatyny I i kończy się terminatorem NOS.

Dla wytworzenia antysensownej konstrukcji pHoxwG, dokonuje się insercji w kierunku antysensownym fragmentu HpaI-SstI z plazmidu pjRDmitt do binarnego wektora pHo3 rozszczepionego enzymami SmaI-SstI. Transkrypcja tego antysensownego fragmentu jest inicjowana przez jego własny promotor GBSS a kończona przez terminator NOS.

169 848

Antysensowne konstrukcje zawierające fragment III (fig. 6)

Konstrukcję antysensowną pHoxwK przygotowuje się w ten sposób, że fragment BamI-SstI z plazmidu pBlue3' włącza się w kierunku antysensownym do binarnego wektora pHo4 rozszczepionego uprzednio enzymami BamHI-SstI. Jako inicjator transkrypcji tego antysensownego fragmentu stosuje się promotor patatyny I a jako terminator transkrypcji - terminator NOS.

Konstrukcję antysensowną pHoxwL wytwarza się przez insercję w kierunku antysensownym fragmentu BamHI-SstI z plazmidu pBlue3 do binarnego wektora pHo3 rozszczepionego uprzednio enzymami BamHI-SstI. Transkrypcję tego antysensownego fragmentu iniciuje się za pomocą jego własnego promotora GBSS a kończy za pomocą terminatora NOS.

Utworzone konstrukcje antysensowne (fig. 4,5 i 6) transformuje się do Agrobacterium tumefaciens, szczep LBA4404 metodą bezpośredniej transformacji przez zamrażanie i rozmrażanie (Hoekema i wsp., 1983; An i wsp., 1988).

T ransformowanie

Uzyskane konstrukcje antysensowne przenosi się do bakterii, dogodnie metodą zamrażania - odmrażania (An i wsp., 1988). Przeniesienie rekombinantowej bakterii do tkanki ziemniaka zachodzi na drodze inkubacji tkanki ziemniaka z rekombinantową bakterią w odpowiedniej pożywce po uprzednim, pewnym rodzaju uszkodzeniu tej tkanki. Podczas inkubacji, T-DNA z bakterii wchodzi do DNA gospodarza roślinnego. Po inkubacji bakterie zabija się i tkankę ziemniaka przenosi się do stałego podłoża do hodowli kallusa i prowadzi się inkubację hodując kallus.

Po szeregu hodowli na dalszych odpowiednich pożywkach tworzą się odroślą, które wycina się z tkanki ziemniaka.

Następnie prowadzi się testy na ekspresję tych antysensownych konstrukcji i ich przeniesienie do genomu ziemniaka metodami np. hybrydyzacji Southern’a i hybrydyzacji Northern’a (Maniatis i wsp., 1982). Ilość kopii konstrukcji antysensownych, które zostały przeniesione oznacza się metodą hybrydyzacji Southern’a.

Oznaczanie ekspresji na poziomie białka dogodnie prowadzi się na mikrobulwach wyhodowanych in vitro na transformowanych odroślach, co pozwala na przeprowadzenie oznaczenia tak szybko jak to tylko możliwe.

Charakteryzacja białka GBSS

Wpływ konstrukcji antysensownych na funkcje genu GBSS w odniesieniu do aktywności białka GBSS oznacza się przez ekstrakcję skrobi z mikrobulw i jej analizę pod względem obecności białka GBSS. Jeśli gen GBSS pełni swe funkcje, wówczas w elektroforezie prowadzonej na żelu poliakryloamidowym (Hovenkamp-Hermelink i wsp., 1987), białko GBSS daje oddzielne pasmo przy 60 kD. Jeśli nie zachodzi ekspresja genu GBSS, to znaczy, jeśli w pełni zachodzi ekspresja antysensownego genu GBSS hamując powstawanie białka GBSS, wówczas na żelu nie uwidocznia się pasmo o wielkości 60 kD.

Charakterystyka skrobi

Skład skrobi w mikrobulwach jest identyczny z tym, jaki występuje w zwykłych bulwach ziemniaka, a więc wpływ konstrukcji antysensownych na wytwarzanie amylozy oznacza się w mikrobulwach. Proporcję amylozy do amylopektyny oznacza się spektrofotometrycznie (np. metodą opisaną przez Hovenkamp-Hermelink’a i wsp., 1988).

Ekstrakcja amylopektyny z ziemniaków amylopektynowych

Ekstrakcję amylopektyny z tak zwanych ziemniaków amylopektynowych (ziemniaków, w których zostało zahamowane wytwarzanie amylozy przez insercję konstrukcji antysensownych według wynalazku prowadzi się w znany sposób.

169 848

Derywatyzacja amylopektyny

Zależnie od ostatecznego przeznaczenia amylopektyny, modyfikuje się jej własności fizyczne i chemiczne przez derywatyzację. Pod pojęciem derywatyzacji rozumie się tu traktowanie chemiczne, fizyczne i enzymatyczne oraz połączenia tych metod (skrobie modyfikowane).

Derywatyzację chemiczną, to jest chemiczną modyfikację amylopektyny można prowadzić w różny sposób, np. przez utlenianie, kwaśną hydrolizę, dekstrynizację, różne formy eteryfikacji, takie jak kationizacja, hydroksypropylowanie i hydroksyetylowanie, różne formy estryfikacji, np. octanem winylowym, bezwodnikiem octowym albo przez tworzenie pochodnych monofosforanowych, dwufosforanowych albo przez działanie oktenylobursztynianem lub przez połączenie tych sposobów.

Fizyczną modyfikację amylopektyny można prowadzić np. przez suszenie rurowe lub wytłaczanie.

W derywatyzacji enzymatycznej uzyskuje się degradację (zmniejszenie lepkości) i modyfikację chemiczną amylopektyny przez działanie dostępnymi układami enzymatycznymi.

Deiywatyzację prowadzi się w różnych temperaturach, zależnie od żądanego produktu końcowego. Najczęściej stosuje się zakres temperatur 20-45°C lecz możliwe jest stosowanie temperatur do 180°C.

Sposób według wynalazku jest bardziej szczegółowo opisany w poniższych przykładach.

Przykład I. Wytwarzanie mikrobulw z włączonymi konstrukcjami antysensownymi

Konstrukcje antysensowne (fig. 4, 5 i 6) przenosi się do Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 metodą zamrażania - rozmrażania (An i wsp., 1988). Przeniesienie do tkanki ziemniaka wykonuje się postępując według zmodyfikowanego przepisu podanego przez Rocha-Sosa'ę i wsp. (1989).

Krążki liści z hodowanych in vitro roślin ziemniaka inkubuje się w ciemności, w czasie 2 dni, w ciekłej pożywce MS (Murashige i Skoog, 1962) z dodatkiem 3% sacharozy i 0,5% MES łącznie z ilością 100/zł zawiesiny rekombinantowego Agrobacterium na 10 ml pożywki. Po tych dwóch dniach bakterie zabija się. Krążki liści przenosi się do stałego podłoża do inkubowania powstawania kallusa i inkubuje się przez 4-6 tygodni, zależnie od wzrostu kallusa. Stosuje się stałe podłoże o następującym składzie:

Podłoże MS + 3% sacharozy:
rybozyd zeatyny	2 mg/litr
NAA	0,02 mg/litr
GA3'	0,02 mg/litr
antybiotyk Claforan	500 mg/litr
kanamycyna	50 mg/litr
Gellan	0,25%

Następnie krążki liści przenosi się na podłoże o innym składzie hormonów, zawiera-

MS + 3% sacharozy:
NAA	5 mg/litr
BAP	0,1 mg/litr
Claforan	500 mg/litr
Kanamycyna	50 mg/litr
Gellan	0,25%

169 848

Krążki liści przechowuje się w tym podłożu przez około cztery tygodnie, po czym przenosi się je do podłoża, w którym stężenie Claforanu jest zmniejszone do 250 mg/litr. O ile zachodzi potrzeba, krążki liści przenosi się do świeżego podłoża co 4 do 5 tygodni. Po utworzeniu się odrośli, wycina się je z krążków liści i przenosi do identycznego podłoża.

Fakt przeniesienia konstrukcji antysensownej do krążków liści początkowo potwierdza się analizując ekstrakty liści z regenerowanych odrośli na aktywność glukuronidazy poprzez oznaczanie substratów metodą opisaną przez Jefferson’a i wsp. (1987). Aktywność oznacza się przez ocenę wizualną.

Następne testy ekspresji konstrukcji antysensownych i ich przeniesienia do genomu ziemniaka prowadzi się metodami hybrydyzacji Southern’a i Nouthem’a, według Maniatis’a i wsp. (1982). IIość kopii kons^kcj antysensownych, które zostały pi^^t^r^i^i^icoati oznacza się metodą hybrydyzacji Southern’a.

Po ustaleniu, że konstrukcje antysensowne zostały przeniesione do genomu ziemniaka i że zachodzi ich ekspresja, rozpoczyna się oznaczenia tej ekspresji na poziomie białka. Testy prowadzi się na mikrobulwach, których wzrost na transformowanych odroślach został indukowany in vitro. Dzięki temu unika się czekania na rozwój całkowitej rośliny ziemniaka z bulwami.

Kawałki łodyg z odrośli ziemniaka wycina się przy węzłach i umieszcza w modyfikowanym podłożu MS. Tam, po 2-3 tygodniowej inkubacji w ciemności, w temperaturze 19°C powstają mikrobulwy (Bourque i wsp., 1987). Pożywka ta ma następujący skład:

MS + 6% sacharozy
kinetyna	2,5 mg/litr
Gellan	2,5 mg/litr

Wpływ konstrukcji antysensownych na funkcję genu GBSS w odniesieniu do aktywności białka GBSS analizuje się metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym (Hovenkamp - Hermelink i wsp., 1987). Z mikrobulw ekstrahuje się skrobię i analizuje się ją na obecność białka GBSS. Jeśli gen GBSS funkcjonuje, w żelu poliakryloamidowym białko GBSS tworzy oddzielne pasmo o wielkości 60 kD. Jeśli natomiast nie zachodzi ekspresja genu GBSS, to znaczy, jeśli w pełni zachodzi ekspresja antysensownego genu GBSS, wówczas hamowane jest powstawanie białka GBSS i w żelu nie stwierdza się obecności pasma o wielkości 60 kD.

Skład skrobi, to znaczy proporcję amylozy do amylopektyny oznacza się spektrofotometrycznie, metodą Hovenkamp’a - Hermelink’a i wsp. (1988), wyliczając zawartość każdego składnika skrobi na podstawie wykresów standardowych.

Przykład II. Ekstrakcja amylopektyny z ziemniaków amylopektynowych

Ziemniak, w którym głównym składnikiem skrobi jest amylopektyna, poniżej zwany ziemniakiem amylopektynowym, modyfikowany techniką inżynierii genetycznej według wynalazku uciera się uwalniając skrobię ze ścian komórkowych.

Oddziela się ściany komórkowe (włókna) od soku owocowego i skrobi na sitach wirówki. Sok owocowy oddziela się od skrobi w dwu etapach: początkowo w hydrocyklonach a potem w specjalnie skonstruowanych pasmowych filtrach próżniowych. Następnie prowadzi się końcową rafinację w hydrocyklonach, gdzie oddziela się pozostałą ilość soku owocowego i włókna. Produkt suszy się w dwóch etapach, najpierw susząc wstępnie na filtrze próżniowym, a następnie w przepływie gorącego powietrza.

Przykład III. Chemiczna derywatyzacja amylopektyny

Amylopektynę rozrabia się z wodą użytą w takiej ilości aby jej stężenie wynosiło 20 50%. Odczyn zawiesiny doprowadza się do wartości 10,0 -12,0 i dodaje się czwartorzędowy związek amoniowy w takiej ilości, aby w końcowym produkcie osiągnąć stopień podstawienia w zakresie 0,004 - 0,2. Reakcję prowadzi się w temperaturze 20 - 45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4 - 8, po czym produkt przemywa się i suszy.

169 848

Otrzymuje się kationową pochodną skrobi, eter 2-hydroksy-3-trójmetylo-amoniowy propylo-skrobi.

Przykład IV. Chemicznaderywatyzacjaamylopektyny

Amylopektynę zarabia się wodą użytą w takiej ilości, aby jej zawartość w mieszaninie wynosiła 10-25% (wagowo). Odczyn mieszaniny doprowadza się do wartości pH 10,0 -12,0 i dodaje się czwartorzędowy związek amoniowy w takiej ilości, aby stopień podstawienia w końcowym produkcie wynosił 0,004 - 0,2. Temperaturę reakcji utrzymuje się w zakresie 20 - 45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4-8. Końcowy produkt jest eterem 2-hydroksy-3-trójmetyloamoniowym propyloskrobi.

Przykład V. Chemiczna derywatyzacja amylopektyny

Amylopektynę zarabia się wodą do stężenia 20 - 50% (wagowo), doprowadza się pH mieszaniny do wartości 5,0 -12,0 i dodaje się podchloryn sodowy w takiej ilości, aby uzyskać żądaną lepkość końcowego produktu. Temperaturę reakcji utrzymuje się w zakresie 20 45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4 - 8, po czym produkt przemywa się i suszy. Uzyskuje się utlenioną skrobię.

Przykład VI. Fizyczna derywatyzacja amylopektyny

Amylopektynę zarabia się wodą do stężenia 20 - 50% (wagowo), po czym breję podaje się do grzanego cylindra i suszy się ją do utworzenia warstwy skrobi.

Przykład VII. Chemiczna i fizyczna derywatyzacja amylopektyny

Amylopektynę poddaje się modyfikacji chemicznej w procesach opisanych w przykładach III - V, a następnie derywatyzacji fizycznej prowadzonej według przykładu VI.

169 848

7Me

5' Gppp AUGGCAAG AAAAAAAA 3’ mRNA

Przetwarzanie Λ Transkrypcja transport i translacja

Białko powstające w procesie translacji

FIG.1

Gen, który jest celem

mRNA

Konstrukcja ant} sensowna hamuje \)pRpi-ocjo gprm odwrócony i ponownie! 5 GPPP AU GGCAAG AAAAAAAA 3¹włączony i I I I I I I I I

3' UACCGUUC 5' Antysensowny RNA

Transkrypcja in vivo

GTTGCCAT 'GAACGGTA

Promotor,

Gen antysensowny wytwarzający antysensowny RNA

169 848 ε

fO c

o

Ul

-P

E

N

Φ

Ή

E

N

U <tf

W w

o >.

υ •ri

T5

O ύί c

o •H Cn Φ Ci • E •r—i >·, φ N E W

ΓΊΤΊ >1 Φ O -H

E >4 E Ul φ 4J -H ω υ φ ui Ε φ >1 c Ν ο -Η -Ρ γΗ (ΰ >ι Ε Ε

CM

Ο

LL

169 848

18033T1SS-

18033I1SSmas— psd-j ca

Ci

169 848 m

O

LL

CQ lyooa

11SS

4-> I c c ω o E ro > CP >i fi (0 .u $ M C O b ns ω

K

>1
C >1 4-1 (0 4-> nj a M	S41
0 4J	5 X
0 £	o
0	X
	n

169 848 co

O

LU

CD

co
o
z	K
+J 1	K
c c	K
0) 0)
E W	>»
tP >n	c
ł0 4J	2e
M C	0
U4 ta	05

Ci c

ω iZ co o

o;

LU

H— t

co o

4J c

0)

E

CP ro

Ui

Ck

U o

4J o

E

O

Ul

Cm

CO co □3

O co o

W ( w C H 01 w >, >1 C «Ρ £ c o ta n

O $

x o

169 848

FIG.7

TGCATGTTTC CCTACATTCT ATTTAGAATC GTGTTGTGGT GTATAAACGT 50

TGTTTCATAT CTCATCTCAT CTATTCTGAT TTTGATTCTC TTGCCTACTG 100

TAATCGGTGA TAAATGTGAA TGCTTCCTTT CTTCTCAGAA ATCAATTTCT 150

GTTTTGTTTT TGTTCATCTG TAGCTTATTC TCTGGTAGAT TCCCCTTTTT 200

GTAGACCACA CATCAC ATG GCA AGC ATC ACA GCT TCA CAC CAC 24 3

Met Ala Ser Ile Thr Ala Ser His His

5

TTT GTG TCA AGA AGC CAA ACT TCA CTA GAC ACC AAA TCA ACC 285

Phe Val Ser Arg Ser Gin Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Thr

15 20

TTG TCA CAG ATA GGA CTC AGG AAC CAT ACT CTG ACT CAC AAT 327

Leu Ser Gin Ile Gly Leu Arg Asn His Thr Leu Thr His Asn

30 35

GGT TTA AGG GCT GTT 342

Gly Leu Arg Ala Val

169 848

FIG.8A

AAC AAG CTT	GAT Asp	GGG CTC CAA TCA ACA	ACT AAT ACT Thr Asn Thr	AAG GTA Lys Val 55	42
Asn	Lys	Leu 45	Gly	Leu Gin	Ser 50	Thr
ACA	CCC	AAG	ATG	GCA	TCC AGA	ACT	GAG	ACC AAG AGA	CCT GGA	84
Thr	Pro	Lys	Met	Ala	Ser Arg	Thr	Glu	Thr Lys Arg	Pro Gly
				60				65	70
TGC	TCA	GCT	ACC	ATT	GTT TGT	GGA	AAG	GGA ATG AAC	TTG ATC	126
Cys	Ser	Ala	Thr	Ile	Val Cys	Gly	Lys	Gly Met Asn	Leu Ile
				75				80
TTT	GTG	GGT	ACT	GAG	GTT GGT	CCT	TGG	AGC AAA ACT	GGT GGA	168
Phe	Val	Gly	Thr	Glu	Val Gly	Pro	Trp	Ser Lys Thr	Gly Gly
85					90			95
CTA	GGT	GAT	GTT	CTT	GGT GGA	CTA	CCA	CCA GCC CTT	GCA	207
Leu	Gly	Asp	Val	Leu	Gly Gly	Leu	Pro	Pro Ala Leu	Ala
	100				105			110
GTAAGTCTTT CTTTCATTTG GTTACCTACT CATTCATTAC TTATTTTGTT	257

TAGTTAGTTT CTACTGCATC AGTCTTTTTA TCATTTAG GCC CGC GGA 304

Ala Arg Gly

CAT

CGG

GTA

ATG

ACA

ATA

TCC

ccc

CGT

TAT

GAC

CAA

TAC

AAA

346

His

Arg

Val

Met

Thr

Ile

Ser

Pro

Arg

Tyr

Asp

Gin

Tyr

Lys

115

120

125

GAT	GCT TGG	GAT	ACT	GGC	GTT	GCG	GTT	GAG	GTACATCTTC	386
Asp	Ala Trp	Asp	Thr	Gly	Val	Ala	Val	Glu
	130				135

CTATATTGAT ACGGTACAAT ATTGTTCTCT TGTGATCATC TGCAG GTC AAA GTT GGA	TACATTTCCT GATTCAAGAA GAC AGC ATT GAA ATT GTT	436 481
	Val	Lys 140	Val	Gly	Asp	Ser	Ile 1 is	Glu	Ile	Val
CGT TTC	TTT CAC TGC	TAT	AAA	CGT	GGG	GTT	GAT	CGT	GTT	TTT	523
Arg Phe	Phe His Cys	Tyr	Lys	Arg	Gly	Val	Asp	Arg	Val	Phe
150			155					160
GTT GAC	CAC CCA ATG	TTC	TTG	GAG	AAA			GTAAGCATAT	560
Val Asp	His Pro Met	Phe	Leu	Glu	Lys
	165			170

169 848

FIG.8B

TATGATTATG AATCCGTCCT GAGGGATACG CAGAACAGGT CATTTTGAGT 610

ATCTTTTAAC TCTACTGGTG CTTTTACTCT TTTAAG GTT TGG GGC AAA 658

Val Trp Gly Lys 175

ACT GGT TCA AAA ATC TAT GGC CCC AAA GCT GGA CTA GAT TAT 700

Thr Gly Ser Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Ala Gly Leu Asp Tyr

180 185

CTG GAC AAT GAA CTT AGG TTC AGC TTG TTG TGT CAA 73 6

Leu Asp Asn Glu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gin

190 195 200

GTAAGTTAGT TACTCTTGAT TTTTATGTGG CATTTTACTC TTTTGTCTTT 786

AATCGTTTTT TTAACCTTGT TTTCTCAG GCA GCC CTA GAG GCA CCT 832

Ala Ala Leu Glu Ala Pro 205

AAA GTT TTG AAT TTG AAC AGT AGC AAC TAC TTC TCA GGA CCA 874

Lys Val Leu Asn Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Phe Ser Gly Pro

210 215 220

TAT G GTAATTAACA CATCCTAGTT TCAGAAAACT CCTTACTATA 918

Tyr G

TCATTGTAGG TAATCATCTT TATTTTGCCT ATTCCTGCAG GA GAG GAT 966 ly Glu Asp

225

GTT CTC TTC ATT GCC AAT GAT TGG CAC ACA GCT CTC ATT CCT 1008

Val Leu Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Ile Pro

230 235

TGC TAC TTG AAG TCA ATG TAC CAG TCC AGA GGA ATC TAC TTG 1050

Cys Tyr Leu Lys Ser Met Tyr Gin Ser Arg Gly Ile Tyr Leu

240 245 250

AAT GCC AAG GTAAAATTTC TTTGTATTCA CTCGATTGCA 108 9

Asn Ala Lys

255

CGTTACCCTG CAAATCAGTA AGGTTGTATT AATATATGAT AAATTTCACA 1139

TTGCCTCCAG GTT GCT TTC TGC ATC CAT AAC ATT GCC TAC CAA 1182

Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ala Tyr Gin 260 265

GGT CGA TTT TCT TTC TCT GAC TTC CCT CTT CTC AAT CTT CCT 1224

Gly Arg Phe Ser Phe Ser Asp Phe Pro Leu Leu Asn Leu Pro

270 275 280

GAT GAA TTC AGG GGT TCT TTT GAT TTC ATT GAT GGG TAT 1263

Asp Glu Phe Arg Gly Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr

285 290

GTATTTATGC TTGAAATCAG /CCTCCA»CT TTTGAAGCTC TTTTGATGCT 1313

169 848

FIG.8C

AGTAAATTGA GTTTTTAAAA TTTTGCAGAT ATGAG AAG CCT GTT AAG 1360

Lys Pro Val Lys 295

GGT AGG AAA ATC AAC TGG ATG AAG GCT GGG ΑΤΑ TTA GAA TCA 1402

Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ser

300 305 310

CAT AGG GTG GTT ACA GTG AGC CCA TAC TAT GCC CAA GAA CTT 1444

His Arg Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Gin Glu Leu

315 320 325

GTC TCT GCT GTT GAC AAG GGA GTT GAA TTG GAC AGT GTC CTT 1486

Val Ser Ala Val Asp Lys Gly Val Glu Leu Asp Ser Val Leu

330 335 340

CGT AAG ACT TGC ATA ACT GGG ATT GTG AAT GGC ATG GAT ACA 1528

Arg Lys Thr Cys Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Thr

345 350

CAA GAG TGG AAC CCA GCG ACT GAC AAA TAC ACA GAT GTC AAA 1570

Gin Glu Trp Asn Pro Ala Thr Asp Lys Tyr Thr Asp Val Lys

355 360 365

TAC GAT ATA ACC ACT GTAAGATAAG ATTTTTCCGA CTCCAGTATA 1615

Tyr Asp Ile Thr Thr

370

TACTAAATTA TTTTGTATGT TTATGAAATT AAAGAGTTCT TGCTAATCAA 1665

AATCTCTATA CAG GTC ATG GAC GCA AAA CCT TTA CTA AAG GAG 1708

Val Met Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu 375 380

GCT CTT CAA GCA GCA GTT GGC TTG CCT GTT GAC AAG AAG ATC 1756

Ala Leu Gin Ala Ala Val Gly Leu Pro Val Asp Lys Lys Ile

385 390 395

CCT TTG ATT GGC TTC ATC GGC AGA CTT GAG GAG CAG AAA GGT 1792

Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gin Lys Gly

400 405 410

TCA GAT ATT CTT GTT GCT GCA ATT CAC AAG TTC ATC GGA TTG 1834

Ser Asp Ile Leu Ala Val Ala Ile His Lys Phe Ile Gly Leu

415 420 425

GAT GTT CAA ATT GTA GTC CTT GTAAGTACCA AATGGACTCA 1875

Asp Val Gin Ile Val Val Leu

430

TGGTATCTCT CTTGTTGAGT TTACTTGTGC CGAAACTGAA ATTGACCTGC 1925

TACTCATCCT ATGCATCAG GGA ACT GGC AAA AAG GAG TTT GAG 1968

Gly Thr Gly Lys Lys Glu Phe Glu 435 440

169 848

FIG.8D

CAG GAG ATT GAA CAG CTC GAA GTG TTG TAC CCT AAC AAA GCT 2010

Gin Glu Ile Glu Gin Leu Glu Val Leu Tyr Pro Asn Lys Ala

445 450

AAA GGA GTG GCA AAA TTC AAT GTC CCT TTG GCT CAC ATG ATC 2052

Lys Gly Val Ala Lys Phe Asn Val Pro Leu Ala His Met Ile

455 460 465

ACT GCT GGT GCT GAT TTT ATG TTG GTT CCA AGC AGA TTT GAA 20 94

Thr Ala Gly Ala Asp Phe Met Leu Val Pro Ser Arg Phe Glu

470 475 480

CCT TGT GGT CTC ATT CAG TTA CAT GCT ATG CGA TAT GGA ACA 2136

Pro Cys Gly Leu Ile Gin Leu His Ala Met Arg Tyr Gly Thr

485 490 495

GTAAGAACCA GAAGAGCTTG TACCTTTTTA CTGAGTTTTT AAAAAAAGAA 218 6

TCATAAGACC TTGTTTTCCA TCTAAAGTTT AATAACCAAC TAAATGTTAC 2236

TGCAGCAAGC TTTTCATTTC TGAAAATTGG TTATCTGATT TTAACGTAAT 2286

CACATGTGAG TCAG GTA CCA ATC TGT GCA TCG ACT GGT GGA CTT 2330

Val Pro Ile Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu

500 505

GTT GAC ACT GTG AAA GAA GGC TAT ACT GGA TTC CAT ATG GGA 2 372

Val Asp Thr Val Lys Glu Gly Tyr Thr Gly Phe His Met Gly

510 515 520

GCC TTC AAT GTT GAA GTATGTGATT TTACATCAAT TGTGTACTTG 2417

Ala Phe Asn Val Glu

525

TACATGGTCC ATTCTCGTCT TGATATACCC CTTGTTGCAT AAACATTAAC 2467

TTATTGCTTC TTGAATTTGG TTAG TGC GAT GTT GTT GAC CCA GCT 2512

Cys Asp Val Val Asp Pro Ala 530

GAT GTG CTT AAG ATA GTA ACA ACA GTT GCT AGA GCT C Asp Val Leu Lys Ile Val Thr Thr Val Ala Arg Ala

2549

169 848

FIG .9

GAG CTC TCC TGG AAG GTAAGTGTGA ATTTGATAAT TTGCGTAGGT 45

Glu Leu Ser Trp Lys

565

ACTTCAGTTT GTTGTTCTCG TCAGCACTGA TGGATTCCAA CTGGTGTTCT 95

TGCAG GAA CCT GCC AAG AAA TGG GAG ACA TTG 127

Glu Pro Ala Lys Lys Trp Glu Thr Leu 570 575

CTA TTG GGC TTA GGA GCT TCT GGC AGT GAA CCC GGT GTT GAA 169

Leu Leu Gly Leu Gly Ala Ser Gly Ser Glu Pro Gly Val Glu

580 585 590

GGG GAA GAA ATC GCT CCA CTT GCC AAG GAA AAT GTA GCC ACT 211

Gly Glu Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Thr

595 600 605

CCT TAA ATGAGCTTTG GTTATCCTTG TTTCAACAAT AAGATCATTA 257

Pro ***

606

AGCAAACGTA TTTACTAGCG AACTATGTAG AACCCTATTA TGGGGTCTCA 307

ATCATCTACA AAATGATTGG TTTTTGCTGG GGAGCAGCAG CATATAAGGC 357

TGTAAAATCC TGGTTAATGT TTTTGTAGGT AAGGGCTATT TAAGGTGGTG 407

TGGATCAAAG TCAATAGAAA ATAGTTATTA CTAACGTTTG CAACTAAATA 457

CTTAGTAATG TAGCATAAAT AATACTAGAA CTAGT 492

169 848

FIG.10

AAGCTTTAAC GAGATAGAAA ATTATGTTAC TCCGTTTTGT TCATTACTTA 50 ACAAATGCAA CAGTATCTTG TACCAAATCC TTTCTCTCTT TTCAAACTTT 100 TCTATTTGGC TGTTGACGGA GTAATCAGGA TACAAACCAC AAGTATTTAA 150 TTGACTCCTC CGCCAGATAT TATGATTTAT GAATCCTCGA AAAGCCTATC 200 CATTAAGTCC TCATCTATGG ATATACTTGA CAGTATCTTC CTGTTTGGGT 250 ATTTTTTTTT CCTGCCAAGT GGAACGGAGA CATGTTATGA TGTATACGGG 300 AAGCTCGTTĄ AAAAAAAATA CAATAGGAAG AAATGTAACA AACATTGAAT 350 GTTGTTTTTA ACCATCCTTC CTTTAGCAGT GTATCAATTT TGTAATAGAA 4 00 CCATGCATĆT CAATCTTAAT ACTAAAATGC AACTTAATAT AGGCTAAACC 450 AAGATAAAGT AATGTATTCA ACCTTTAGAA TTGTGCATTC ATAATTAGAT 500 CTTGTTTGTC GTAAAAAATT AGAAAATATA TTTACAGTAA TTTGGAATAC 550 AAAGCTAAGG GGGAAGTAAC TAATATTCTA GTGGAGGGAG GGACCAGTAC 600 CAGTACCTAG ATATTATTTT TAATTACTAT AATAATAATT TAATTAACAC 650 GAGACATAGG AATGTCAAGT GGTAGCGTAG GAGGGAGTTG GTTTAGTTTT 700 TTAGATACTA GGAGACAGAA CCGGACGGCC CATTGCAAGG CCAAGTTGAA 750 GTCCAGCCGT GAATCAACAA AGAGAGGGCC CATAATACTG TCGATGAGCA 800 TTTCCCTATA ATACAGTGTC CACAGTTGCC TTCTGCTAAG GGATAGCCAC 850 CCGCTATTCT CTTGACACGT GTCACTGAAA CCTGCTACAA ATAAGGCAGG 900 CACCTCCTCA TTCTCACTCA CTCACTCACA CAGCTCAACA AGTGGTAACT 950 TTTACTCATC TCCTCCAATT ATTTCTGATT TCATGCA 987

169 848

FIG 11A

AAGCTTTAAC GAGATAGAAA ATTATGTTAC TCCGTTTTGT TCATTACTTA 50 ACAAATGCAA CAGTATCTTG TACCAAATCC TTTCTCTCTT TTCAAACTTT 100 TCTATTTGGC TGTTGACGGA GTAATCAGGA TACAAACCAC AAGTATTTAA 150 TTGACTCCTC CGCCAGATAT TATGATTTAT GAATCCTCGA AAAGCCTATC 200 CATTAAGTCC TCATCTATGG ATATACTTGA CAGTATCTTC CTGTTTGGGT 250 ATTTTTTTTT CCTGCCAAGT GGAACGGAGA CATGTTATGA TGTATACGGG 300 AAGCTCGTTA AAAAAAAATA CAATAGGAAG AAATGTAACA AACATTGAAT 350 GTTGTTTTTA ACCATCCTTC CTTTAGCAGT GTATCAATTT TGTAATAGAA 400 CCATGCATCT CAATCTTAAT ACTAAAATGC AACTTAATAT AGGCTAAACC 450 AAGATAAAGT AATGTATTCA ACCTTTAGAA TTGTGCATTC ATAATTAGAT 500 CTTGTTTGTC GTAAAAAATT AGAAAATATA TTTACAGTAA TTTGGAATAC 550 AAAGCTAAGG GGGAAGTAAC TAATATTCTA GTGGAGGGAG GGACCAGTAC 600 CAGTACCTAG ATATTATTTT TAATTACTAT AATAATAATT TAATTAACAC 650 GAGACATAGG AATGTCAAGT GGTAGCGTAG GAGGGAGTTG GTTTAGTTTT 700 TTAGATACTA GGAGACAGAA CCGGACGGCC CATTGCAAGG CCAAGTTGAA 750 GTCCAGCCGT GAATCAACAA AGAGAGGGCC CATAATACTG TCGATGAGCA 800 TTTCCCTATA ATACAGTGTC CACAGTTGCC TTCTGCTAAG GGATAGCCAC 850 CCGCTATTCT CTTGACACGT GTCACTGAAA CCTGCTACAA ATAAGGCAGG 900 CACCTCCTCA TTCTCACTCA CTCACTCACA CAGCTCAACA AGTGGTAACT 950 TTTACTCATC TCCTCCAATT ATTTCTGATT TCATGCATGT TTCCCTACAT 1000 TCTATTATGA ATCGTGTTGT GGTGTATAAA CGTTGTTTCA TATCTCATCT 1050 CATCTATTCT GATTTTGATT CTCTTGCCTA CTGTAATCGG TGATAAATGT 1100 GAATGCTTCC TTTCTTCTCA GAAATCAATT TCTGTTTTGT TTTTGTTCAT 1150 CTGTAGCTTA TTCTCTGGTA GATTCCCCTT TTTGTAGACC ACACATCAC 1199

ATG GCA Met Ala 1

AGC Ser

ATC ACA

GCT TCA CAC CAC TTT

GTG TCA AGA AGC

1241

Ile

Thr 5

Ala

Ser

His

Phe 10

Val

Ser

Arg

Ser

CAA

ACT

TCA

CTA

GAC

ACC

AAA

TCA

ACC

TTG

TCA

CAG

ATA

GGA

1283

Gin

Thr

Ser

Leu

Asp

Thr

Lys

Ser

Thr

Leu

Ser

Gin

Ile

Gly

15

20

25

CTC

AGG

AAC

CAT

ACT

CTG

ACT

CAC

AAT

GGT

TTA

AGG

GCT

GTT

1325

Leu

Arg

Asn

His

Thr

Leu

Thr

His

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Val

30

35

40

AAC

AAG

CTT

GAT

GGG

CTC

CAA

TCA

ACA

ACT

AAT

ACT

AAG

GTA

1367

Asn

Lys

Leu

Asp

Gly

Leu

Gin

Ser

Thr

Asn

Thr

Lys

Val

45

50

55

ACA

CCC

AAG

ATG

GCA

TCC

AGA

ACT

GAG

ACC

AAG

AGA

CCT

GGA

1409

Thr

Pro

Lys

Met

Ala

Ser

Arg

Thr

Glu

Thr

Lys

Arg

Pro

Gly

60

65

70

TGC

TCA

GCT

ACC

ATT

GTT

TGT

GGA

AAG

GGA

ATG

AAC

TTG

ATC

1451

Cys

Ser

Ala

Thr

Ile

Val

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

Asn

Leu

Ile

75

80

TTT

GTG

GGT

ACT

GAG

GTT

GGT

CCT

TGG

AGC

AAA

ACT

GGT

GGA

1493

Phe

val

Gly

Thr

Glu

Val

Gly

Pro

Trp

Ser

Lys

Thr

Gly

85

90

95

169 848

FIG 11B

CTA GGT GAT GTT CTT GGT GGA CTA CCA CCA GCC CTT GCA 1532

Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Leu Ala

100 105 110

GTAAGTCTTT CTTTCATTTG GTTACCTACT CATTCATTAC TTATTTTGTT 1582

TAGTTAGTTT CTACTGCATC AGTCTTTTTA TCATTTAG GCC CGC GGA 1629

Ala Arg Gly

CAT CGG GTA ATG ACA ATA TCC CCC CGT TAT GAC CAA TAC AAA 1671

His Arg Val Met Thr Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gin Tyr Lys

115 120 125

GAT GCT TGG GAT ACT GGC GTT GCG GTT GAG GTACATCTTC 1711

Asp Ala Trp Asp Thr Gly Val Ala Val Glu

130 135

CTATATTGAT ACGGTACAAT ATTGTTCTCT TACATTTCCT GATTCAAGAA 1761

TGTGATCATC TGCAG GTC AAA GTT GGA GAC AGC ATT GAA ATT GTT 1806

Val Lys Val Gly Asp Ser Ile Glu Ile Val 140 145

CGT TTC TTT CAC TGC TAT AAA CGT GGG GTT GAT CGT GTT TTT 1848

Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe

150 155 160

GTT GAC CAC CCA ATG TTC TTG GAG AAA GTAAGCATAT 1885

Val Asp His Pro Met Phe Leu Glu Lys

165 170

TATGATTATG AATCCGTCCT GAGGGATACG CAGAACAGGT CATTTTGAGT 1935

ATCTTTTAAC TCTACTGGTG CTTTTACTCT TTTAAG GTT TGG GGC AAA 1983

Val Trp Gly Lys 175

ACT GGT TCA AAA ATC TAT GGC CCC AAA GCT GGA CTA GAT TAT 2025

Thr Gly Ser Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Ala Gly Leu Asp Tyr

180 185

CTG GAC AAT GAA CTT AGG TTC AGC TTG TTG TGT CAA 2061

Leu Asp Asn Glu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gin

190 195 200

GTAAGTTAGT TACTCTTGAT TTTTATGTGG CATTTTACTC TTTTGTCTTT 2111

AATCGTTTTT TTAACCTTGT TTTCTCAG GCA GCC CTA GAG GCA CCT 2157

Ala Ala Leu Glu Ala Pro 205

AAA GTT TTG AAT TTG AAC AGT AGC AAC TAC TTC TCA GGA CCA 2199

Lys Val Leu Asn Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Phe Ser Gly Pro

210 215 220

169 848

FIG.11C

TAT G GTAATTAACA CATCCTAGTT TCAGAAAACT CCTTACTATA 2243

Tyr G

TCATTGTAGG TAATCATCTT TATTTTGCCT ATTCCTGCAG GA GAG GAT 2291 ly Glu Asp

225

GTT CTC TTC ATT GCC AAT GAT TGG CAC ACA GCT CTC ATT CCT 2333

Val Leu Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Ile Pro

230 235

TGC TAC TTG AAG TCA ATG TAC CAG TCC AGA GGA ATC TAC TTG 2375

Cys Tyr Leu Lys Ser Met Tyr Gin Ser Arg Gly Ile Tyr Leu

240 245 250

AAT GCC AAG GTAAAATTTC TTTGTATTCA CTCGATTGCA 2414

Asn Ala Lys

255

CGTTACCCTG CAAATCAGTA AGGTTGTATT AATATATGAT AAATTTCACA 24 64

TTGCCTCCAG GTT GCT TTC TGC ATC CAT AAC ATT GCC TAC CAA 2507

Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ala Tyr Gin

260 265

GGT CGA TTT TCT TTC TCT GAC TTC CCT CTT CTC AAT CTT CCT 2549

Gly Arg Phe Ser Phe Ser Asp Phe Pro Leu Leu Asn Leu Pro

270 275 280

GAT GAA TTC AGG GGT TCT TTT GAT TTC ATT GAT GGG TAT 2588

Asp Glu Phe Arg Gly Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr

285 290

GTATTTATGC TTGAAATCAG ACCTCCAACT TTTGAAGCTC TTTTGATGCT 2638

AGTAAATTGA GTTTTTAAAA TTTTGCAGAT ATGAG AAG CCT GTT AAG 2685

Lys Pro Val Lys 295

GGT AGG AAA ATC AAC TGG ATG AAG GCT GGG ATA TTA GAA TCA 2727

Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ser

300 305 310

CAT AGG GTG GTT ACA GTG AGC CCA TAC TAT GCC CAA GAA CTT 27 69

His Arg Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Gin Glu Leu

315 320 325

GTC TCT GCT GTT GAC AAG GGA GTT GAA TTG GAC AGT GTC CTT 2811

Val Ser Ala Val Asp Lys Gly Val Glu Leu Asp Ser Val Leu

330 335 340

CGT AAG ACT TGC ATA ACT GGG ATT GTG AAT GGC ATG GAT ACA 2853

Arg Lys Thr Cys Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Thr

345 350

169 848

FIG11D

CAA GAG TGG AAC CCA GCG ACT GAC AAA TAC ACA GAT GTC AAA 28 95

Gin Glu Trp Asn Pro Ala Thr Asp Lys Tyr Thr Asp Val Lys 355 360 365

TAC GAT ATA ACC ACT GTAAGATAAG ATTTTTCCGA CTCCAGTATA 2940

Tyr Asp Ile Thr Thr

370

TACTAAATTA TTTTGTATGT TTATGAAATT AAAGAGTTCT TGCTAATCAA 2990

AATCTCTATA CAG GTC ATG GAC GCA AAA CCT TTA CTA AAG GAG 3033

Val Met Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu 375 380

GCT CTT CAA GCA GCA GTT GGC TTG CCT GTT GAC AAG AAG ATC 3075

Ala Leu Gin Ala Ala Val Gly Leu Pro Val Asp Lys Lys Ile

385 390 395

CCT TTG ATT GGC TTC ATC GGC AGA CTT GAG GAG CAG AAA GGT 3117

Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gin Lys Gly

400 405 410

TCA GAT ATT CTT GTT GCT GCA ATT CAC AAG TTC ATC GGA TTG 3159

Ser Asp Ile Leu Ala Val Ala Ile His Lys Phe Ile Gly Leu

415 420 425

GAT GTT CAA ATT GTA GTC CTT GTAAGTACCA AATGGACTCA 3200

Asp Val Gin Ile Val Val Leu

430

TGGTATCTCT CTTGTTGAGT TTACTTGTGC CGAAACTGAA ATTGACCTGC 3250

TACTCATCCT ATGCATCAG GGA ACT GGC AAA AAG GAG TTT GAG 3293

Gly Thr Gly Lys Lys Glu Phe Glu 435 440

CAG GAG ATT GAA CAG CTC GAA GTG TTG TAC CCT AAC AAA GCT 3335

Gin Glu Ile Glu Gin Leu Glu Val Leu Tyr Pro Asn Lys Ala

445 450

AAA GGA GTG GCA AAA TTC AAT GTC CCT TTG GCT CAC ATG ATC 3377

Lys Gly Val Ala Lys Phe Asn Val Pro Leu Ala His Met Ile

455 460 465

ACT GCT GGT GCT GAT TTT ATG TTG GTT CCA AGC AGA TTT GAA 3419

Thr Ala Gly Ala Asp Phe Met Leu Val Pro Ser Arg Phe Glu

470 475 480

CCT TGT GGT CTC ATT CAG TTA CAT GCT ATG CGA TAT GGA ACA 3461

Pro Cys Gly Leu Ile Gin Leu His Ala Met Arg Tyr Gly Thr

485 490 495

GTAAGAACCA GAAGAGCTTG TACCTTTTTA CTGAGTTTTT AAAAAAAGAA 3511

TCATAAGACC TTGTTTTCCA TCTAAAGTTT AATAACCAAC TAAATGTTAC 3561

TGCAGCAAGC TTTTCATTTC TGAAAATTGG TTATCTGATT TTAACGTAAT 3611

169 848

FIG.11E

CACATGTGAG TCAG GTA CCA	ATC TGT Ile Cys 500	GCA TCG ACT GGT	GGA CTT Gly Leu 505	3655
	Val	Pro	Ala	Ser	Thr Gly
GTT	GAC ACT GTG AAA	GAA	GGC TAT	ACT	GGA	TTC CAT	ATG GGA	3697
Val	Asp Thr Val Lys	Glu	Gly Tyr	Thr	Gly	Phe His	Met Gly
	510			515			520
GCC	TTC AAT GTT GAA	GTATGTGATT TTACATCAAT TGTGTACTTG	3742
Ala	Phe Asn Val Glu
	525

TACATGGTCC ATTCTCGTCT TGATATACCC CTTGTTGCAT AAACATTAAC 3792

TTATTGCTTC TTGAATTTGG TTAG TGC GAT GTT GTT GAC CCA GCT 3837

Cys Asp Val val Asp Pro Ala 530

GAT GTG CTT	AAG ATA GTA ACA ACA GTT	GCT AGA GCT Ala Arg Ala	CTT GCA Leu Ala 545	3879
Asp	Val	Leu 535	Lys	Ile	Val	Thr	Thr 540	Val
GTC	TAT	GGC	ACC	CTC	GCA	TTT	GCT	GAG	ATG ATA AAA	AAT TGC	3921
Val	Tyr	Gly	Thr	Leu	Ala	Phe	Ala	Glu	Met Ile Lys	Asn Cys
			550					555		560
ATG	TCA	GAG	GAG	CTC	TCC	TGG	AAG	GTAAGTGTGA ATTTGATAAT	3965
Met	Ser	Glu	Glu	Leu	Ser	Trp	Lys
				565
TTGCGTAGGT ACTTCAGTTT GTTGTTCTCG TCAGCACTGA TGGATTCCAA	4015
CTGGTGTTCT TGCAG	GAA	CCT	GCC	AAG	AAA TGG GAG	ACA TTG	4057
					Glu	Pro	Ala	Lys	Lys Trp Glu	Thr Leu
						570			575
CTA	TTG	GGC	TTA	GGA	GCT	TCT	GGC	AGT	GAA CCC GGT	GTT GAA	4099
Leu	Leu	Gly	Leu	Gly	Ala	Ser	Gly	Ser	Glu Pro Gly	Val Glu
		580					585			590
GGG	GAA	GAA	ATC	GCT	CCA	CTT	GCC	AAG	GAA AAT GTA	GCC ACT	4141
Gly	Glu	Glu	Ile	Ala	Pro	Leu	Ala	Lys	Glu Asn Val	Ala Thr
			595					600		605

CCT TAA ATGAGCTTTG GTTATCCTTG TTTCAACAAT AAGATCATTA 4187

Pro ***

606

AGCAAACGTA TTTACTAGCG AACTATGTAG AACCCTATTA TGGGGTCTCA 4237

ATCATCTACA AAATGATTGG TTTTTGCTGG GGAGCAGCAG CATATAAGGC 4287

TGTAAAATCC TGGTTAATGT TTTTGTAGGT AAGGGCTATT TAAGGTGGTG 4337

TGGATCAAAG TCAATAGAAA ATAGTTATTA CTAACGTTTG CAACTAAATA 4 387

CTTAGTAATG TAGCATAAAT AATACTAGAA CTAGTAGCTA ATATATATGC 4 4 37

GTGAATTTGT TGTACCTTTT CTTGCATAAT TATTTGCAGT ACATATATAA 4 4 87

TGAAAATTAC CCAAGGAATC AATGTTTCTT GCTCCGTCCT CCTTTGATGA 4537

TTTTTTACGC AATACAGAGC TAGTGTGTTA TGTTATAAAT TTTGTTTAAA 4587

169 848

FIG.11F

AGAAGTAATC AAATTCAAAT TAGTTGTTTG GTCATATGAA AGAAGCTGCC 4 637 AGGCTAACTT TGAGGAGATG GCTATTGAAT TTCAAAATGA TTATGTGAAA 4 687 ACAATGCAAC ATCTATGTCA ATCAACACTT AAATTATTGC ATTTAGAAAG 4 7 37 ATATTTTTGA GCCCATGACA CATTCATTCA TAAAGTAAGG TAGTATGTAT 4787 GATTGAATGG ACTACAGCTC AATCAAAGCA TCTCCTTTAC ATAACGGCAC 4837 TGTCTCTTGT CTACTACTCT ATTGGTAGTA GTAGTAGTAA TTTTACAATC 4887 CAAATTGAAT AGTAATAAGA TGCTCTCTAT TTACTAAAGT AGTAGTATTA 4 937 TTCTTTCGTT ACTCTAAAGC AACAAAA 4 964

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób hamowania tworzenia się amylozy w ziemniakach, znamienny tym, że prowadzi się modyfikację ziemniaka techniką inżynierii genetycznej poprzez wprowadzenie do genomu tkanki ziemniaka konstrukcji genowej zawierającej fragment genu ziemniaka kodujący powstawanie syntetazy skrobi związanej z ziarnami (gen GBSS) włączony w kierunku antysensowym, posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 7 jako ID nr 1 lub na fig. 8 A-D jako ID nr 2, lub na fig. 9 jako ID nr 3, oraz promotor wybrany spośród CaMV 35S, patatyny I i promotora GBSS.