DE69133285T2

DE69133285T2 - Gentechnologische modifikation der kartoffel um amylopektintypische stärke herzustellen

Info

Publication number: DE69133285T2
Application number: DE69133285T
Authority: DE
Inventors: Per Hofvander; T. Per PERSSON; Anneli Tallberg; Olle Wikström
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2011-12-21
Also published as: DE69133538D1; JP2003034702A; NO932227L; CA2098171A1; EP0921191A1; CA2098171C; DK0921191T3; LV13228B; DE69133285T3; FI932804A; KR100210352B1; PL169848B1; ATE243752T1; EP0563189A1; EP0563189B2; NO932227D0; DE69133538T2; DE69133285D1; SE9004096D0; ES2195999T5

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine gentechnische Modifikation der Kartoffel, resultierend in der Bildung von praktisch nur der Amylopektinstärke in der Kartoffel. Die gentechnische Modifikation beinhaltet die Insertion von Genfragmenten in der Kartoffel, wobei die Genfragmente Teile der Leadersequenz, des Translationsstarts, des Translationsendes und der Trailersequenz als auch der kodierenden und nicht kodierenden (d. h. Exons und Introns) Teile der Gene der körnergebundenen Stärkesynthase, inseriert in der Antisense-Richtung umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Stärke in verschiedenen Formen ist von großer Wichtigkeit in der Lebensmittel- und Papierindustrie. In der Zukunft hat Stärke ebenfalls ein großes Potential zur Herstellung von natürlich abbaubaren Polymeren, zum Beispiel für die Verwendung als Verpackungsmaterial. Viele verschiedene Stärkeprodukte sind bekannt, welche durch Derivatisierung von natürlicher Stärke hergestellt werden, welche unter anderem von Mais und Kartoffel stammt. Die Stärke von Kartoffeln bzw. Mais konkurriert in den meisten Marktbereichen.
In der Kartoffelknolle ist Stärke der größte Feststoffanteil. Etwa ein 1/4 bis 1/5 der Stärke in der Kartoffel ist Amylose, während der restliche Teil der Stärke Amylopektin ist. Diese zwei Bestandteile der Stärke haben verschiedene Anwendungsbereiche, und daher ist die Möglichkeit der Herstellung entweder von reiner Amylose oder reinem Amylopektin sehr interessant. Die zwei Stärkebestandteile können aus herkömmlicher Stärke hergestellt werden, was eine Anzahl von Verarbeitungsschritten erfordert und konsequenterweise teuer und kompliziert ist.
Es wurde nun gezeigt, dass es durch die Gentechnik möglich ist, die Kartoffel so zu modifizieren, dass die Knolle lediglich Stärke hauptsächlich von einem oder dem anderen Typ herstellt. Im Ergebnis wird eine Stärkequalität erhalten, welche in den Bereichen konkurrieren kann, in welchen Kartoffelstärke normalerweise nicht zur Zeit verwendet wird. Stärke von derartigen Kartoffeln, welche auf gentechnische Art und Weise modifiziert wurde, hat ein großes Potential als Lebensmittelzusatzstoff, da es nicht einem chemischen Modifikationsvorgang unterworfen wurde.
Stärkesynthese
Die Synthese von Stärke und die Regulation davon, werden zur Zeit mit großem Interesse untersucht, sowohl auf der Ebene der Grundlagenforschung als auch für die industrielle Anwendung. Obwohl viel bekannt ist über die Beteiligung bestimmter Enzyme bei der Transformation von Saccharose in Stärke, wurde die Biosynthese der Stärke bis jetzt nicht aufgeklärt. Durch Untersuchungen, vor allem in Mais, wurde es jedoch möglich, Teile der Synthesewege und der an diesen Reaktionen teilnehmenden Enzyme aufzuklären. Die wichtigsten stärkesynthetisierenden Enzyme zur Herstellung der Stärkekörner sind die Stärkesynthase und das verzweigende Enzym. Im Mais wurden bisher drei Formen der Stärkesynthase nachgewiesen und untersucht, wobei zwei von ihnen löslich und eines von ihnen in Verbindung mit den Stärkekörnern unlöslich ist. Das verzweigende Enzym besteht ebenfalls aus drei Formeln, welche vermutlich durch drei verschiedene Gene kodiert werden (Mac Donald & Preiss, 1985; Preiss, 1988).
Das waxy-Gen im Mais
Die Synthese des Stärkebestandteils Amylose tritt im Wesentlichen durch die Wirkung der Stärkesynthase Alpha-1,4-D-glucan-4-alpha-glucosyltransferase (EC 2.4.1.21) auf, welche mit den Stärkekörnern in der wachsenden Zelle verbunden ist. Das für dieses körnergebundene Enzym kodierende Gen wird "waxy" genannt (= wx⁺), während das Enzym "GBSS" (granule-bound starch synthase; an Körner gebundene Stärkesynthase) genannt wird.
Der waxy-Ort im Mais wurde ausführlich sowohl genetisch als auch biochemisch charakterisiert. Das waxy-Gen auf Chromosom 9 steuert die Herstellung von Amylose im Endosperm, Pollen und im Embryosack. Die im Endosperm gebildete Stärke in normalem Mais mit dem wx⁺-Allel besteht aus 25% Amylose und 75% Amylopektin. Es wurde eine mutierte Form von Mais gefunden, in welcher das Endosperm eine Mutation im wx⁺-Gen enthält, und daher keine funktionelle GBSS synthetisiert wird. Das Endosperm von diesem mutierten Mais enthält daher lediglich Amylopektin als den Stärkebestandteil. Die sogenannte Waxy-Mutante enthält folglich weder GBSS noch Amylose (Echt & Schwartz, 1981).
Das GBSS-Protein wird durch das wx+-Gen im Zellkern kodiert, wird aber in den Amyloplast transportiert und aktiviert. Das Vorläuferprotein enthält daher zwei Bestandteile, nämlich ein 7-kD-Transit-Peptid, welches das Protein durch die Amyloplastmembran transferiert, und das eigentliche Protein, welches 58 kD ist. Die kodierende Region des wx⁺-Gens im Mais ist 3,7 kb lang und umfasst 14 Exons und 13 Introns. Eine Anzahl der Regulationssignale in der Promotorregion sind bekannt, und zwei verschiedene Polyadenylierungssequenzen wurden beschrieben (Klösgen et al., 1986; Schwartz-Sommer et al., 1984; Shure et al., 1983).
Das Amylose-Enzym in der Kartoffel
In der Kartoffel wurde ein 60-kD-Protein identifiziert, welches das hauptsächliche körnergebundene Protein darstellt. Da Antikörper gegen dieses Kartoffelenzym mit GBSS vom Mais kreuzreagieren, wird angenommen, dass es die an Körner gebundene Synthase ist (Vos-Scheperkeuter et al., 1986). Das Gen der Kartoffel GBSS wurde jedoch bisher nicht in dem gleichen Ausmaß wie das waxy-Gen im Mais charakterisiert, weder in Bezug auf den Ort noch die Struktur.
Natürlich auftretende waxy-Mutanten wurden neben dem Mais für Gerste, Reis und Hirse beschrieben. In der Kartoffel wurde keine natürliche Mutante gefunden, aber eine Mutante wurde durch Röntgenbestrahlung von Blättern einer monohaploiden Pflanze (n = 12) erzeugt (Visser et al., 1987). Stärke isoliert aus Knollen dieser Mutante enthält weder das GBSS-Protein noch Amylose. Diese Mutante wird durch ein einfaches rezessives Gen bestimmt und wird amf genannt. Sie kann mit waxy-Mutanten anderer Pflanzenarten verglichen werden, da sowohl das GBSS-Protein als auch Amylose fehlen. Die Stabilität der Chromosomenanzahl ist jedoch verschlechtert, da diese zu der natürlichen Anzahl (n = 48) geviertelt ist, welches negative Wirkungen auf die Kartoffelpflanzen haben kann (Jacobsen et al., 1990).
Hemmung der Amylose-Herstellung
Die Herstellung von Amylose kann drastisch durch Hemmung der an Körner gebundenen Stärkesynthase (GBSS) reduziert werden, welche die Bildung von Amylose katalysiert. Diese Hemmung resultiert in der Stärke, welche hauptsächlich Amylopektin ist.
Die Hemmung der Bildung des Enzyms kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, zum Beispiel durch:

– mutagene Behandlung, welche in einer Modifikation der für die Bildung des Enzyms kodierenden Gensequenz resultiert,
– Einfügen eines Transposons in die für das Enzym kodierende Gensequenz,
– gentechnische Modifikation, so dass das für das Enzym kodierende Gen nicht exprimiert wird, zum Beispiel Antisense-Genhemmung.

Die 1 stellt eine spezifische Unterdrückung einer normalen Genexpression dar, in der ein komplementäres Antisense-Nukleotid mit mRNA eines Zielgens hybridisiert. Das Antisense-Nukleotid ist folglich Antisense-RNA, welche in vivo von einer "umgedrehten" Gensequenz transkribiert wird (Izant, 1989).
Durch Verwendung der Antisense-Technik wurden verschiedene Genfunktionen in Pflanzen gehemmt. Das Antisense-Konstrukt für Chalcon-Synthase, Polygalacturonase und Phosphinotricinacetyltransferase wurde verwendet, um das entsprechende Enzym in den Pflanzenarten Petunie, Tomate und Tabak zu hemmen.
Hemmung von Amylose in der Kartoffel
In der Kartoffel wurden vorher Experimente durchgeführt, um die Synthese der an Körner gebundenen Stärkesynthase (GBSS-Protein) mit einem Antisense-Konstrukt entsprechend dem für GBSS kodierenden Gen zu hemmen (dieses Gen wird hiernach als das "GBSS-Gen" bezeichnet). Hergersberger (1988) beschreibt ein Verfahren, durch welches ein cDNA-Klon für das GBSS-Gen in der Kartoffel mittels eines cDNA-Klons für das wx+-Gen im Mais isoliert wurde. Ein Antisense-Konstrukt, basierend auf dem gesamten cDNA-Klon wurde in Blattscheiben der Tomate mittels Agrobacterium tumefaciens transferiert. In Mikroknollen, induziert in vitro aus regenerierten Kartoffeltrieben, wurde eine schwankende und sehr schwache Reduktion des Amylosegehalts beobachtet, und in einem Diagramm gezeigt. Eine komplette Charakterisierung des GBSS-Gens wird nicht zur Verfügung gestellt.
Das Gen für das GBSS-Protein in der Kartoffel wurde ferner dahingehend charakterisiert, dass ein genomischer wx⁺-Klon durch Restriktionsanalyse untersucht wurde. Jedoch wurde die DNA-Sequenz des Klons nicht bestimmt (Visser et al., 1989).
Weitere Experimente mit einem Antisense-Konstrukt, welches dem GBSS-Gen in der Kartoffel entspricht, wurden berichtet. Das Antisense-Konstrukt, welches auf einem cDNA-Klon zusammen mit einem CaMV-35S-Promotor basiert, wurde transformiert mittels Agrobacterium rhizogenes. Gemäß der Information, resultierte die Transformation in einem niederen Amylosegehalt in der Kartoffel, jedoch wurden keine Werte angegeben (Flavell, 1990).
Keines der Verfahren, welches bisher zur gentechnischen Modifikation der Kartoffel verwendet wurde, hat in einer Kartoffel mit praktisch keiner Stärke vom Amylosetyp resultiert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, eine praktisch vollständige Unterdrückung der Bildung von Amylose in Kartoffelknollen zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wurde die Funktion des GBSS-Gens und folglich die Amyloseproduktion in Kartoffeln unter Verwendung eines vollständig neuen Antisense-Konstrukts gehemmt. Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antisense-Fragments wird das genomische GBSS-Gen als eine Basis genutzt, um eine Hemmung von GBSS und folglich der Amyloseproduktion zu erreichen, welche so wirkungsvoll wie möglich ist. Die erfindungsgemäßen Antisense-Konstrukte umfassen sowohl kodierende als auch nichtkodierende Teile des GBSS-Gens, welche Sequenzen in der Region entsprechen, welche sowohl eine Promotor- als auch Leadersequenz, einen Translationsstart, ein Translationsende und eine Trailersequenz in der Antisense-Richtung umfassen. Für eine gewebsspezifische Expression, d. h. die Amyloseproduktion sollte nur in den Kartoffelknollen gehemmt werden, werden Promotoren verwendet, welche spezifisch in der Kartoffelknolle aktiv sind. Im Ergebnis wird die Stärkezusammensetzung in anderen Teilen der Pflanze nicht beeinträchtigt, welches anderenfalls negative Nebenwirkungen ergeben würde.
Die Erfindung umfasst folglich ein Fragment, welches im Wesentlichen eine der in den SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 genannten Nukleotidsequenzen hat.
Jedoch können die Sequenzen von diesen erwähnten durch eine oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abweichen, ohne die Wirkung des Fragments zu beeinträchtigen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls einen kartoffelknollenspezifischen Promotor mit 987 bp, welcher zu dem erfindungsgemäßen Gen gehört, welches für eine an Körner gebundene Stärkesynthase kodiert. Weder der Promotor noch das entsprechende Gen wurden vorher charakterisiert. Die Promotorsequenz mit 987 bp wird in der SEQ ID No. 4 dargestellt, während die Gensequenz in der SEQ ID No. 5 dargestellt ist. Ebenfalls können die Promotor- und Gensequenzen von den angegebenen durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abweichen, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Vektoren, welche die Antisense-Fragmente und die Antisense-Konstrukte gemäß der Erfindung enthalten.
In anderen Gesichtspunkten umfasst die Erfindung Zellen, Pflanzen, Knollen, Mikroknollen und Samen, deren Genom die erfindungsgemäßen Fragmente, inseriert in der Antisense-Richtung, enthält.
In noch weiteren Gesichtspunkten umfasst die Erfindung Stärke vom Amylopektintyp sowohl, nativ als auch derivatisiert.
Schließlich umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Unterdrückung der Amylosebildung in der Kartoffel, wodurch hauptsächlich Stärke vom Amylopektintyp in der Kartoffel gebildet wird. Die Erfindung wird nun ausführlicher mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben, in welchen
die 1 das Prinzip der Antisense-Genhemmung darstellt,
die 2 das Ergebnis der Restriktionsanalyse des Kartoffel-GBSS-Gens zeigt,
die 3 die zwei neuen binären Vektoren pHo3 und pHo4 zeigt,
die 4 die Antisense-Konstrukte pHoxwA, pHoxwB und pHoxwD zeigt,
die 5 die Antisense-Konstrukte pHoxwF und pHoxwG zeigt, und
die 6 die Antisense-Konstrukte pHoxwK und pHoxwL zeigt.
Überdies werden die Sequenzen der verschiedenen erfindungsgemäßen DNA-Fragmente in den SEQ ID No. 1, 2, 3, 4 und 5 gezeigt. Es kann Abweichungen von diesen Sequenzen in einem oder mehreren nicht benachbarten Basenpaaren geben.
MATERIALIEN
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wurden die folgenden Materialien verwendet: Bakterienstämme: E. coli DH5alfa und DH5alfaF'IQ(BRL). E. coli JM105 (Pharmacia). A. tumefaciens LBA4404 (Clontech).
Vektoren: M13mp18 und mp19 (Pharmacia). pBI101 und pBI121 (Clontech). pBI240.7 (M. W. Bevan). pUC-Plasmide (Pharmacia).
Enzyme: Restriktionsenzyme und EcoRI-Linker (BRL). UNION^TM DNA Ligation Kit (Clontech). Sequenase^TM DNA Sequencing Kit (USB). T₄-DNA-Ligase (Pharmacia).
Die vorher erwähnten Materialien werden gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
Genomische Bibliothek
Eine genomische Bibliothek in EMBL3 wurde durch Clontech im Auftrag des Anmelders hergestellt, wobei Blätter der Kartoffel Bintje als ein Ausgangsmaterial verwendet wurden.
Identifikation und Isolation des GBSS-Gens
Die genomische Bibliothek wurde auf das Kartoffel-GBSS-Gen mittels cDNA-Klonen für sowohl das 5'- und das 3'-Ende des Gens untersucht (wobei die cDNA-Klone von M. Hergersberger, Max-Plank-Institut in Köln, erhalten wurden) gemäß einem Protokoll von Clontech.
Ein Klon des Kartoffel-GBSS-Gens mit voller Länge, wx311, wurde identifiziert und aus der genomischen Bibliothek isoliert. Der Start des GBSS-Gens wurde in einem EcoRI-Fragment nachgewiesen, welches als Fragment w bezeichnet wird (3,95 kb). Das Ende des GBSS-Gens wurde ebenfalls in einem EcoRI-Fragment nachgewiesen, welches als Fragment x bezeichnet wurde (5,0 kb). Ein BgIII-SpeI-Fragment, welches als Fragment m bezeichnet wurde (3,9 kb), wurde ebenfalls isoliert und teilt Sequenzen sowohl mit dem Fragment w als auch mit dem Fragment x. Die Fragmente w, m und x wurden in pUC13 subkloniert (Viera, 1982: Yanisch-Peron et al., 1985) und wurden als pSw, pSm bzw. pSx bezeichnet (2).
Charakterisierung des GBSS-Gens in der Kartoffel
Das GBSS-Gen in der Kartoffel wurde durch Restriktionsanalyse und cDNA-Sonden charakterisiert, wobei die 5'- und 3'-Enden des GBSS-Gens genauer bestimmt wurden (2). Die Sequenzierung nach Sanger et al., 1977, des GBSS-Gens wurde an Subklonen von pSw und pSx in M13mp18 und mp19 als auch pUC19, beginnend etwa am 5'-Ende, durchgeführt (siehe SEQ ID No. 5).
Die Promotor-Region wurde in einem BglII-NsiI-Fragment nachgewiesen (siehe SEQ ID No. 4). Der Transkriptions- und Translationsstart wurde in einem überlappenden BglII-HindIII-Fragment nachgewiesen. Die Terminator-Region wurde wiederum in einem SpeI-HindIII-Fragment nachgewiesen.
Antisense-Konstrukte für das GBSS-Gen in der Kartoffel
Die erfindungsgemäßen GBSS-Genfragmente (siehe SEQ ID No. 1, 2 und 3, und 2) wurden in der folgenden Art und Weise nachgewiesen.
Die Restriktion von pSw mit NsiI und HindIII ergab Fragment I (SEQ ID No. 1), welches subkloniert in pUC19 als 19NH35 bezeichnet wurde. Weitere Restriktion von 19NH35 mit HpaI-SstI ergab ein Fragment, welches 342 bp des erfindungsgemäßen GBSS-Gens enthielt. Dieses Fragment umfasste die Leadersequenz, den Translationsstart und die ersten 125 bp des kodierenden Bereichs.
Die Restriktion von pSm mit HpaI und NsiI ergab Fragment II (SEQ ID No. 2), welches subkloniert in pJRD184 (Heusterspreute et al., 1987) als pJRDmitt bezeichnet wurde. Weitere Restriktion von pJRDmitt mit HpaI-SstI ergab ein Fragment, welches 2549 bp des erfindungsgemäßen GBSS-Gens enthielt. Dieses Fragment umfasste Exons und Introns aus der Mitte des Gens.
Die Restriktion von pSx mit SstI und SpeI ergab Fragment III (SEQ ID No. 3), welches subkloniert in pBluescript (Melton et al., 1984) als pBlue3' bezeichnet wurde. Weitere Restriktion von pBlue3' mit BamHI-SstI ergab ein Fragment, welches 492 bp des erfindungsgemäßen GBSS-Gens enthielt. Dieses Fragment umfasste das letzte Intron und Exon, das Translationsende und 278 bp der Trailersequenz.
Antisense-Konstrukte mit Fragment I (4)
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwA wurde das HpaI-SstI-Fragment aus 19NH35 in der Antisense-Richtung in den mit SmaI-SstI gespaltenen, binären Vektor pBI121 inseriert (Jefferson et al., 1987). Die Transkription des Antisense-Fragments wurde dann durch den CaMV-35S-Promotor initiiert und wird durch den NOS-Terminator terminiert (NOS = Nopalinsynthase).
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwB wurde das HpaI-SstI-Fragment aus 19NH35 in der Antisense-Richtung in den mit SmaI-SstI gespaltenen, binären Vektor pHo4 (3) inseriert. Der Patatin-I-Promotor, welcher in der Kartoffel knollenspezifisch ist, kommt vom Vektor pBI240.7, erhalten von M. Bevan, Institute of Plant Science Research, Norwich. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch den Patatin-I-Promotor initiiert und durch den NOS-Terminator terminiert.
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwD, wurde das HpaI-SstI-Fragment aus 19NH35 in der Antisense-Richtung in den mit SmaI-SstI gespaltenen binären Vektor pHo3 (3) inseriert. pHo3 ist ein neuer binärer Vektor, welcher auf der Grundlage von pBI101 konstruiert wurde. Dieser Vektor enthält den erfindungsgemäßen Promotor (siehe SEQ ID No. 4) (GBSS-Promotor) des nun charakterisierten erfindungsgemäßen Kartoffel-GBSS-Gens, wurde mit SmaI und SstI restriktionsgespalten, wobei das HpaI-SstI-Fragment aus 19NH35 in der Antisense-Richtung inseriert wurde. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch seinen eigenen GBSS-Promotor initiiert und wird durch den NOS-Terminator terminiert. Dies bedeutet, dass das Antisense-Fragment nur in der Kartoffelknolle transkribiert wird, da der GBSS-Promotor wie der Patatin-I-Promotor knollenspezifisch ist.
Antisense-Konstrukt mit Fragment II (5):
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwF wird das HpaI-SstI-Fragment aus pJRDmitt in der Antisense-Richtung in den mit SmaI-SstI gespaltenen, binären Vektor pHo4 inseriert. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch den Patatin-I-Promotor initiiert und durch den NOS-Terminator terminiert.
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwG wurde das HpaI-SstI-Fragment aus pJRDmitt in der Antisense-Richtung in den mit SmaI-SstI gespaltenen, binären Vektor pHo3 inseriert. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch seinen eigenen GBSS-Promotor initiiert und durch den NOS-Terminator terminiert.
Antisense-Konstrukte mit Fragment III (6):
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwK wurde das BamHI-SstI-Fragment aus pBlue3' in der Antisense-Richtung in den mit BamHI-SstI gespaltenen, binären Vektor pHo4 inseriert. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch den Patatin-I-Promotor initiiert und durch den NOS-Terminator terminiert.
Für das Antisense-Konstrukt pHoxwL wurde das BamHI-SstI-Fragment aus pBlue3' in der Antisense-Richtung in den mit BamHI-SstI gespaltenen, binären Vektor pHo3 inseriert. Die Transkription des Antisense-Fragments wird dann durch seinen eigenen GBSS-Promotor initiiert und durch den NOS-Terminator terminiert.
Die gebildeten Antisense-Konstrukte (4, 5, 6) wurden in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 durch direkte Transformation mit dem "Frier-Auftau"-Verfahren transformiert (Hoekama et al., 1983; An et al., 1988).
Transformation
Die Antisense-Konstrukte werden geeigneterweise durch das "Frier-Auftau"-Verfahren in Bakterien transferiert (An et al., 1988). Die Übertragung des rekombinanten Bakteriums auf Kartoffelgewebe erfolgte durch die Inkubation des Kartoffelgewebes mit dem rekombinanten Bakterium in einem geeigneten Medium, nachdem einige Arten von Verletzung des Kartoffelgewebes durchgeführt wurden. Während der Inkubation fügt sich T-DNA aus dem Bakterium in die DNA der Wirtspflanze ein. Nach der Inkubation werden die Bakterien getötet und das Kartoffelgewebe auf ein Feststoffmedium zur Kallusinduktion übertragen, und wird zum Wachstum des Kallus inkubiert.
Nach Passage über weitere geeignete Medien bildeten sich Keime, welche aus dem Kartoffelgewebe abgeschnitten wurden.
Überprüfungen und Untersuchungen der Expression der Antisense-Konstrukte und der Übertragung davon in das Kartoffelgenom wurden zum Beispiel durch Southern- und Northern-Hybridisierung durchgeführt (Maniatis et al. (1982)). Die Anzahl der Kopien des übertragenen Antisense-Konstrukts wird durch Southern-Hybridisierung nachgewiesen.
Die Untersuchung der Expression auf der Proteinebene wird geeigneterweise an Mikroknollen in vitro induziert in den transformierten Sprossen durchgeführt, was folglich eine Durchführung der Untersuchung so schnell wie möglich erlaubt.
Charakterisierung des GBSS-Proteins
Die Wirkung des Antisense-Konstrukts auf die Funktion des GBSS-Gens in Bezug auf die Aktivität des GBSS-Proteins, wird durch Extraktion von Stärke aus den Mikroknollen und ihrer Analyse in Bezug auf die Anwesenheit des GBSS-Proteins untersucht. Bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987), bildet das GBSS-Protein eine distinkte Bande bei 60 kD, falls das GBSS-Gen funktionell ist. Falls das GBSS-Gen nicht exprimiert wird, das heißt, falls das Antisense- GBSS-Gen vollständig exprimiert wird, wodurch die Bildung des GBSS-Proteins gehemmt wird, kann keine 60-kD-Bande auf dem Gel nachgewiesen werden.
Charakterisierung der Stärke
Die Zusammensetzung der Stärke in den Mikroknollen ist identisch mit der von herkömmlichen Kartoffelknollen, und daher wird die Wirkung der Antisense-Konstrukte auf die Amyloseproduktion in Mikroknollen untersucht. Der Anteil von Amylose zu Amylopektin kann durch ein spektrophotometrisches Verfahren bestimmt werden (z. B. nach Hovenkamp-Hermelink et al., 1988).
Extraktion von Amylopektin aus Amylopektin-Kartoffeln
Amylopektin wird aus den sogenannten Amylopektin-Kartoffeln (Kartoffeln, in welchen die Bildung von Amylose durch Insertion der erfindungsgemäßen Antisense-Konstrukte unterdrückt wurde) in einer bekannten Art und Weise extrahiert.
Derivatisierung von Amylopektin
Abhängig von der Endverwendung des Amylopektins können seine physikalischen und chemischen Eigenschaften durch Derivatisierung modifiziert werden. Mit Derivatisierung ist hierbei chemische, physikalische und enzymatische Behandlung und Kombinationen davon gemeint (modifizierte Stärke).
Die chemische Derivatisierung, das heißt die chemische Modifikation des Amylopektins, kann auf verschiedene Arten erfolgen, z. B. durch Oxidation, Säurehydrolyse, Dextrinisation, verschiedene Formen von Veretherung, wie etwa Kationisierung, Hydroxypropylierung und Hydroxyethylierung, verschiedene Formen von Veresterung, z. B. durch Vinylacetat, Essigsäureanhydrid oder durch Monophosphatisierung, Diphosphatisierung und Octenylsuccinierung und Kombinationen davon.
Physikalische Modifikationen des Amylopektins können zum Beispiel durch Zylindertrocknen oder Extrusion erfolgen.
Bei der enzymatischen Derivatisierung werden der Abbau (Reduktion der Viskosität) und die chemische Modifikation des Amylopektins mittels vorhandener enzymatischer Systeme durchgeführt.
Die Derivatisierung wird bei verschiedenen Temperaturen in Abhängigkeit vom erwünschten Endprodukt durchgeführt. Der herkömmliche verwendete Temperaturbereich ist 20-45°C, aber Temperaturen bis zu 180°C sind möglich.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen mit mehr Einzelheiten beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von Mikroknollen mit inserierten, erfindungsgemäßen Antisense-Konstrukten.
Die Antisense-Konstrukte (siehe 4, 5 und 6) werden in Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 durch das "Frier-Auftau"-Verfahren übertragen (An et al., 1988). Die Übertragung auf Kartoffelgewebe wird gemäß einem modifizierten Protokoll von Rocha-Sosa et al. (1989) durchgeführt.
Blattscheiben von in vitro kultivierten Kartoffelpflanzen werden in der Dunkelheit in einem flüssigen MS-Medium (Murashige & Skoog; 1962) mit 3% Saccharose und 0,5% MES zusammen mit 100 μl einer Suspension des rekombinanten Agrobacteriums auf 10 ml Medium für zwei Tage inkubiert.
Nach diesen zwei Tagen werden die Bakterien getötet. Die Blattscheiben werden auf ein Feststoffmedium zur Kallusinduktion übertragen und für 4–6 Wochen inkubiert, abhängig vom Wachstum des Kallus. Das Feststoffmedium ist wie folgt zusammengesetzt: MS + 3% Saccharose

2 mg/l Zeatinribosid

0,02 mg/l "NAA"

0,02 mg/l "GA₃"

500 mg/l "Claforan"

50 mg/l Kanamycin

0,25% "Gellan"
Nachfolgend werden die Blattscheiben in ein Medium mit einer verschiedenen Zusammensetzung von Hormonen übertragen, mit: MS + 3% Saccharose

5 mg/l "NAA"

0,1 mg/l "BAP"

500 mg/l "Claforan"

50 mg/l Kanamycin

0,25% "Gellan
Die Blattscheiben wurden in diesem Medium für etwa 4 Wochen gelagert, wonach sie auf ein Medium übertragen wurden, in welchem die "Claforan"-Konzentration auf 250 mg/l reduziert wurde. Wenn erforderlich, werden dann die Blattscheiben alle vier oder fünf Wochen in ein frisches Medium überführt. Nach der Bildung der Sprossen werden diese von den Blattscheiben abgeschnitten und in ein identisches Medium übertragen.
Der Zustand, dass das Antisense-Konstrukt in die Blattscheiben übertragen wurde, wird zuerst durch Analyse von Blattextrakten aus den regenerierten Sprossen in Bezug auf die Glucuronidase-Aktivität mittels der Substrate beschrieben von Jefferson et al. (1987) überprüft. Die Aktivität wird durch visuelle Bewertung nachgewiesen.
Weitere Untersuchungen der Expression der Antisense-Konstrukte und der Übertragung davon in das Kartoffelgenom werden durch Southern- und Northern-Hybridisierung nach Maniatis et al. (1981) durchgeführt. Die Kopienanzahl der übertragenen Antisense-Konstrukte, wird durch Southern-Hybridisierung bestimmt.
Wenn nachgewiesen wurde, dass die Antisense-Konstrukte in das Kartoffelgenom übertragen und exprimiert werden, beginnt die Untersuchung der Expression auf der Proteinebene. Die Untersuchung wird an Mikroknollen durchgeführt, welche in vitro in den transformierten Sprossen induziert wurden, wodurch die Notwendigkeit des Abwartens der Entwicklung einer vollständigen Kartoffelpflanze mit Kartoffelknollen vermieden wird.
Stengelstücke der Kartoffelsprossen werden an den Knoten abgeschnitten und in ein modifiziertes MS-Medium verbracht. Dort bilden sie Mikroknollen nach 2–3 Wochen Inkubation in der Dunkelheit bei 19°C (Bourque et al., 1987). Das Medium ist wie folgt zusammengesetzt: MS + 6% Saccharose

2,5 mg/l Kinetin

2,5 mg/l "Gellan"
Die Wirkung der Antisense-Konstrukte auf die Funktion des GBSS-Gens in Bezug auf die Aktivität des GBSS-Proteins wird mittels Elektrophorese auf Polyacrylamidgel analysiert (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987). Stärke wird aus den Mikroknollen extrahiert und in Bezug auf die Anwesenheit des GBSS-Proteins analysiert. In einem Polyacrylamidgel bildet das GBSS-Protein eine distinkte Bande bei 60 kD, falls das GBSS-Gen funktionell ist. Wenn das GBSS-Gen nicht exprimiert wird, das heißt, falls das Antisense-GBSS-Gen vollständig exprimiert wird, so dass die Bildung des GBSS-Proteins gehemmt wird, kann keine 60 kD-Bande auf dem Gel beobachtet werden.
Die Zusammensetzung der Stärke, das heißt der Anteil von Amylose zu Amylopektin, wird durch ein spektrophotometrisches Verfahren nach Hovenkamp-Hermelink et al. (1988) bestimmt, wobei der Anteil jedes Stärkebestandteils auf der Basis einer Standardkurve bestimmt wird.
Beispiel 2
Extraktion von Amylopektin aus Amylopektin-Kartoffeln
Kartoffeln, deren Hauptstärkebestandteil Amylopektin ist, im Folgenden Amylopektin-Kartoffeln genannt, erfindungsgemäß auf gentechnische Art und Weise modifiziert, werden gerieben, wobei die Stärke aus den Zellwänden abgegeben wird.
Die Zellwände (Fasern) werden von dem Fruchtsaft und der Stärke in Zentrifugensieben (Centrisiler) getrennt. Der Fruchtsaft wird von der Stärke in zwei Schritten getrennt, nämlich zuerst in Hydrozyklonen und nachfolgend in speziell aufgebauten Vakuumfiltern in Bandbauweise.
Dann wird eine abschließende Reinigung in Hydrozyklonen durchgeführt, in welchen der verbleibende Fruchtsaft und die Fasern abgetrennt werden.
Das Produkt wird in zwei Schritten getrocknet, zunächst durch Vortrocknen in einem Vakuumfilter und nachfolgend durch Endtrocknung in einem warmen Luftstrom.
Beispiel 3
Chemische Derivatisierung von Amylopektin
Amylopektin wird in Wasser zu einer Konzentration von 20-50 aufgeschlämmt. Der pH wird auf 10,0–12,0 eingestellt und eine quaternäre Ammoniumverbindung wird in einer derartigen Menge zugegeben, dass das Endprodukt einen Substitutionsgrad von 0,004–0,2 erhält. Die Reaktionstemperatur wird auf 20-45°C eingestellt. Wenn die Reaktion beendet ist, wird der pH auf 4–8 eingestellt, wonach das Produkt gewaschen und getrocknet wird. Auf diese Art und Weise wird das kationische Stärkederivat 2-Hydroxy-3-trimethylammoniumpropylether erhalten.
Beispiel 4
Chemische Derivatisierung von Amylopektin
Amylopektin wird in Wasser zu einem Wassergehalt von 10-25 Gewichts-% aufgeschlämmt. Der pH wird auf 10,0–12,0 eingestellt und eine quaternäre Ammoniumverbindung wird in einer derartigen Menge zugegeben, dass das Endprodukt einen Substitutionsgrad von 0,004–0,2 erhält. Die Reaktionstemperatur wird auf 20–45°C festgesetzt. Wenn die Reaktion beendet ist, wird der pH auf 4–8 eingestellt. Das Endprodukt ist 2-Hydroxy-3-trimethylammoniumpropylether.
Beispiel 5
Chemische Derivatisierung von Amylopektin
Amylopektin wird mit Wasser zu einer Konzentration von 20–50 Gewichts-% aufgeschlemmt. Der pH wird auf 5,0–12,0 eingestellt, und Natriumhypochlorit wird zugegeben, so dass das Endprodukt die erwünschte Viskosität erhält. Die Reaktionstemperatur wird auf 20–45°C eingestellt. Wenn die Reaktion beendet ist, wird der pH auf 4–8 eingestellt, wonach das Endprodukt gewaschen und getrocknet wird. Auf diese Art und Weise wird oxidierte Stärke erhalten.
Beispiel 6
Physikalische Derivatisierung von Amylopektin
Amylopektin wird in Wasser zu einer Konzentration von 20-50 Gewichts-% aufgeschlämmt, wonach die Aufschlämmung auf einen erwärmten Zylinder aufgetragen wird, wo es zu einem Film getrocknet wird.
Beispiel 7
Chemische und physikalische Derivatisierung von Amylopektin.
Amylopektin wird gemäß dem Verfahren behandelt, beschrieben in einem der Beispiele 3–5 für chemische Modifikation, und wird dann weiter gemäß dem Beispiel 6 für physikalische Derivatisierung behandelt.
Literaturliste

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Claims

Verfahren zur Unterdrückung der Amylosebildung in Kartoffeln, gekennzeichnet durch eine gentechnisch erzeugte Modifikation der Kartoffel durch Einführen eines Genkonstrukts in das Genom des Kartoffelgewebes mit einem Fragment des Kartoffelgens, welches für die Bildung der an Körner gebundenen Stärkesynthase (granule-bound starch synthase; GBSS-Gen) kodiert, inseriert in der Antisense-Richtung, wobei das Fragment aus der Gruppe von Fragmenten ausgewählt ist, mit Nukleotidsequenzen dargestellt in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, und von diesen Fragmenten durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Fragmente, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie die Fragmente der SEQ ID No. 1 bis 3 haben, zusammen mit einem Promotor ausgewählt aus dem CaMV 35S-, dem Patatin I- und dem Kartoffel GBBS-Promotor.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie das Fragment der SEQ ID No. 1 haben.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor der Promotor für das Gen der an Körner gebundenen Stärkesynthase (GBSS) in der Kartoffel ist, wobei der Promotor ein knollenspezifischer GBSS-Promotor mit der in der SEQ ID No. 4 dargestellten Nukleotidsequenz ist, oder durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare ohne Beeinträchtigung der Promotorwirkung von dieser Nukleotidsequenz abgeleitet wurde.
Verfahren zur Herstellung von Stärke vom Amylopektintyp, gekennzeichnet durch die Trennung der Stärke von den Zellwänden und/oder Fruchtsäften der Kartoffelknollen von Kartoffeln, wobei die Kartoffel auf gentechnische Art und Weise modifiziert wurde zur Unterdrückung der Bildung von Stärke vom Amylosetyp durch Einführen eines Genkonstrukts in das Genom des Kartoffelgewebes mit einem Fragment des Kartoffelgens, welches für die Bildung der an Körner gebundenen Stärkesynthase (GBSS-Gen) kodiert, inseriert in der Antisense-Richtung, wobei das Fragment aus der Gruppe von Fragmenten ausgewählt ist bestehend aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, und von diesen Fragmenten durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Fragmente, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie die Fragmente der SEQ ID No. 1 bis 3 haben, zusammen mit einem Promotor ausgewählt aus dem CaMV 35S-, dem Patatin I- und dem Kartoffel GBSS-Promotor.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie das Fragment der SEQ ID No. 1 haben.
Verfahren zur Herstellung derivatisierter Stärke vom Amylopektintyp, gekennzeichnet durch die Trennung der Stärke von den Zellwänden und/oder Fruchtsäften der Kartoffelknollen von Kartoffeln, wobei die Kartoffel auf gentechnische Art und Weise modifiziert wurde zur Unterdrückung der Bildung von Stärke vom Amylosetyp durch Einführen eines Genkonstrukts in das Genom des Kartoffelgewebes mit einem Fragment des Kartoffelgens, welches für die Bildung der an Körner gebundenen Stärkesynthase (GBSS-Gen) kodiert, inseriert in der Antisense-Richtung, wobei das Fragment aus der Gruppe von Fragmenten ausgewählt ist bestehend aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, und von diesen Fragmenten durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Fragmente, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie die Fragmente der SEQ ID No. 1 bis 3 haben, zusammen mit einem Promotor ausgewählt aus dem CaMV 35S-, dem Patatin I und dem Kartoffel GBBS-Promotor, und nachfolgender Derivatisierung der Stärke in einer chemischen, physikalischen oder enzymatischen Art und Weise.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie das Fragment der SEQ ID No. 1 haben.
Fragment des Gens, welches für die an Körner gebundene Stärkesynthase (GBSS-Gen) in der Kartoffel kodiert, wobei das Fragment eine Nukleotidsequenz hat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, und von diesen Sequenzen durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Sequenzen.
Fragment nach Anspruch 8, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat.
Antisense-Konstrukt zur Hemmung der Expression des Gens der an Körner gebundenen Stärkesynthase in Kartoffeln, mit a) einem Promotor, b) einem Fragment des Gens, welches für die Bildung der an Körner gebundenen Stärkesynthase kodiert, im Verhältnis zu dem Promotor in der Antisense-Richtung inseriert, wobei das Fragment aus der Gruppe von Fragmenten ausgewählt ist, welche aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 besteht, und von diesen Fragmenten durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Fragmente, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie die Fragmente der SEQ ID No. 1 bis 3 haben.
Antisense-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie das Fragment der SEQ ID No. 1 haben.
Antisense-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Promotor ein knollenspezifischer GBSS-Promotor mit der in der SEQ ID No. 4 dargestellten Nukleotidsequenz ist, oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare ohne Beeinträchtigung der Promotorwirkung abgeleitete Nukleotidsequenz.
Antisense-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Promotor ausgewählt ist aus dem CaMV 35S- und dem Patatin I-Promotor.
Vektor mit einem Fragment des Gens, welches für die an Körner gebundene Stärkesynthase (granule-bound starch synthase; GBSS-Gen) in der Kartoffel kodiert, wobei das Fragment eine Nukleotidsequenz hat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, und von diesen Fragmenten durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Frgamente, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie die Fragmente der SEQ ID No. 1 bis 3 haben, und wobei das Fragment im Verhältnis zu einem Promotor in der Antisense-Richtung inseriert ist.
Vektor nach Anspruch 14, wobei das Fragment die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine davon durch ein oder mehrere nicht benachbarte Basenpaare abgeleitete Nukleotidsequenz hat, und welche die gleiche Wirkung der Unterdrückung der Amylosebildung wie das Fragment der SEQ ID No. 1 haben.
Vektor mit dem Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13.
Zelle der Kartoffelpflanze, deren Genom das Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13 umfasst.
Kartoffelpflanze, deren Genom das Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13 umfasst.
Kartoffelknollen, deren Genom das Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13 umfasst.
Samen der Kartoffelpflanze, deren Genom das Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13 umfasst.
Mikroknollen der Kartoffelpflanze, deren Genom das Antisense-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10–13 umfasst.